JP7449092B2 - 血液脳関門移動化合物及びその使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、血液脳関門を移動する化合物とその使用とに関する。より具体的には、本発明は、血液脳関門を通過する抗体又はその断片、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその断片、及びβアミロイドに結合するポリペプチド、融合タンパク質及びその組成物を含んでなってもよい化合物、並びにアルツハイマー病の治療におけるそれらの使用に関する。

発明の背景
アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患は、これら身体障害性病状態に対する有効な治療法が現在ないため、高齢化社会の負担を増大させる。アルツハイマー病（ＡＤ）は、６５歳以上の人口のおよそ１５％が罹患する不可逆的神経変性障害であり、高齢人口における進行性の知的及び認知性障害の主な原因である（Hardy et al, 2014）。

ＡＤでは、コリン作動性ニューロンの重度の喪失があり、その結果、記憶処理及び保存に関与する重要な神経伝達物質である、アセチルコリン（ＡＣｈ）のレベルが減少する。さらに、神経伝達物質であるグルタミン酸によって誘導される興奮毒性も、ＡＤの病因に関与する。したがって、グルタミン酸毒性のコリン作動性増強及び／又は阻害は、ＡＤにおける認知力を改善するかもしれない。確かに、ＡＤの治療のためにＦＤＡが承認した唯一の薬剤は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤（例えば、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン）であり、ＡＣｈの喪失を予防して特定のグルタミン酸受容体（例えば、メマンチン）を阻害する（Mangialasche et al, 2010; Ji and Ha, 2010; Savonenko et al, 2012）。しかし、これらの対症療法薬物の有益な効果は限定的で一時的なものであり、認知機能の一時的な改善をもたらすが、疾患の進行は止まらない。抗酸化剤、抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、コレステロール低下薬、及びエストロゲン療法などのその他の治療法が検討されているものの、これらの治療法はいずれも、特にＡＤ患者の記憶及び認知機能の改善に長期的な有益な効果をもたらしそうにない（Magialasche et al, 2010; Ji and Ha, 2010）。

アルツハイマー病の主要な特徴は、３９～４３アミノ酸ペプチドであるβアミロイド（Ａβ）が、凝集体及びプラークの形態で脳に蓄積することである。遺伝的、病理学的、及び生化学的研究に基づく相当数の証拠が、Ａβ、特にそのオリゴマー凝集体がＡＤ病理の発生において中心的な役割を果たすことを示唆している（Hardy et al, 2014; DeLaGarza, 2003; Selkoe and Hardy, 2016）。アミロイド仮説によれば、脳内のＡβの産生とクリアランスの慢性的な不均衡は、加齢に伴うその蓄積と凝集をもたらす。これらのＡβ凝集体は、シナプス喪失及び神経機能をもたらす一連の事象を開始すると考えられ、記憶及びその他の認知機能の進行性喪失をもたらす（Hardy et al, 2014; DeLaGarza, 2003; Selkoe and Hardy, 2016; Sengupta et al, 2016）。

前駆体タンパク質ＡＰＰからのＡβの生成は、プロテアーゼβ及びγセクレターゼによるＡＰＰの逐次タンパク質分解によって達成される（Barageb and Sonawane, 2015）。これらの酵素の阻害剤は、Ａβ産生を減少させることが示されており、ＡＤを治療するための潜在的な薬剤として開発されている（Hardy et al, 2014; Mangialasche et al, 2010; Selkoe and Hardy, 2016; Ji and Ha, 2010）。同様に、Ａβクリアランスを隔離及び／又は促進する薬剤もまた開発されている。これらの中で注目に値するのは、ＡＤワクチンによる免疫療法の開発である。能動免疫（Ａβペプチド）及び受動免疫（Ａβ抗体）はどちらも、ＡＤの遺伝子組換え動物モデルにおいて、そしてＡＤ患者が参加する臨床試験において、アミロイド沈着を予防するのに、そしてあらかじめ形成されたアミロイド斑を除去するのに、有効であることが示されている（Mangialasche et al, 2010; Ji and Ha, 2010; Morrone et al, 2015; Lannfelt et al, 2014; Selkoe and Hardy, 2016; Goure et al, 2014）。

アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解性切断を防止し、それによって脳Ａβ産生を減少させ又は抑制するβ及びγセクレターゼの阻害剤が開発されている（例えば、タレンフルビル、セマガセスタット、ベルベセスタット）。しかし、Ａβ負荷の軽減におけるそれらの治療有効性はまだ知られておらず、これらの薬物の多くは前臨床又は臨床試験において失敗している（Savonenko et al, 2012; Musiek and Holtzman, 2015）。さらに、これらの酵素は、神経細胞の発達と関連があるその他の酵素及びＮｏｔｃｈなどのシグナル伝達分子のプロセシングにも関与しているため（Savonenko et al, 2012; Musiek and Holtzman, 2015）、これらの阻害剤は、深刻な非特異的副作用をもたらすこともある。

能動免疫（Ａβワクチン、ＡＮ１７９２）及び受動免疫（例えば、バピネズマブ、ソラネズマブ、クレネズマブ、アデュカヌマブなど）などの免疫療法的アプローチは、遺伝子組換え動物におけるＡβ沈着の低減と記憶欠損の部分的除去とに、かなり効果的であることが示されている（Monsonego and Weiner, 2003; Bard et al, 2000, Sevigny J et al., 2016）。能動免疫と受動免疫の双方を用いたいくつかの臨床試験では、認知の中等度の改善を伴う脳Ａβ沈着の減少が示されている。しかし、ＡＤ患者の重度の炎症反応（髄膜脳炎症状）、血管原性浮腫、及び微小出血のために、臨床試験を中止する必要があった。これらの限界にもかかわらず、免疫療法のアプローチは、Ａβを効果的に隔離してその沈着と毒性を防ぐ薬剤が、ＡＤの進行を阻止する効果的な薬物の役割を潜在的に果たし、その進行さえ予防し得ることを示す（Rafii and Aisen, 2015, Selkoe and Hardy, 2016）。

適切な治療用分子及び診断薬の大部分は、厳密で高度に制限的な血液脳関門（ＢＢＢ）に侵入できないため、脳に由来するＡＤとその他の疾患の治療並びに早期診断は困難なままである（Abbott, 2013）。ＢＢＢは、血管を裏打ちし密着接合部を介して互いに接続する脳内皮細胞（ＢＥＣ）によって形成される、物理的なバリケードを構成する（Abbott, 2013）。ＢＥＣ間に形成される密着接合部は、ＢＢＢの完全性に不可欠であり、５００ダルトン（Ｄａ）を超える分子の傍細胞輸送を妨げる。脳内皮細胞は非常に低い飲作用率を示すことから（Abbott, 2013）、より大きな分子の経細胞輸送は、非常に特異的な受容体媒介トランスサイトーシス（ＲＭＴ）経路と、受動的な電荷ベースの吸着媒介トランスサイトーシスとに限定される（Abbott, 2013; Pardridge, 2002）。さらに、Ｐ糖タンパク質や多剤耐性タンパク質－１（ＭＤＲ－１）などの排出ポンプの高密度は、脳からの望まれない物質の除去に寄与する（Abbott, 2013）。

これらの特性は全て、脳を病原体や毒素から保護するが、ほとんどの治療薬の侵入も同等に妨げる。実際には、それらが明確に「フェリー」される、すなわち、輸送体分子と共役している場合を除いて、小分子治療薬の５％未満が薬理学的に適切な濃度（すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）標的に結合して薬理学的／治療応答を引き出すのに十分な濃度）でＢＢＢを通過し得て、より大きな治療薬は通過し得ない。ＢＢＢを越えて分子を輸送する効果的な「担体」が欠如していることから十分な量が脳にされ得ないため、神経変性疾患に対する多数の薬物が「棚上げされ」又はさらなる開発から排除されている。

ＡＤ病理の分子機構の理解はかなり進歩しているにもかかわらず、現在、病気の進行を予防又は治療し得る有効な薬物や治療法はない。さらに、大容量で高選択性のＢＢＢ「担体」の欠如のために、脳腫瘍や神経変性疾患などの脳に源を発する疾患の新たな治療法及び診断法の開発が遅れている。

発明の概要
本発明は、血液脳関門を移動する化合物又は組成物と、その使用とに関する。

本発明は、βアミロイド（βアミロイド）に結合するポリペプチドを提供する。βアミロイドに結合するポリペプチド（又はタンパク質）は、病理学的に関連したβアミロイド_１～４２（Ａβ_１～４２）凝集体に選択的に結合してもよく、本明細書でＡＢＰ又はＡＢＰ変異型と略記され言及されることもある。

本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する抗体又はその断片に連結される、ベータアミロイド（βアミロイド）結合ポリペプチド（ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型）を含む、融合タンパク質（本明細書では化合物、組成物又はコンストラクトとも称される）を提供し、本明細書におけるＢＢＢは、血液脳関門を移動する担体抗体又は断片の略語を指す。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型及びＢＢＢ担体、又はその断片を含み、融合タンパク質のＡＢＰ及びＢＢＢ構成要素は、Ｆｃ領域又はその一部を介して連結されてもよい。好ましい実施形態では、ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型とＢＢＢとを含む融合タンパク質は、Ｆｃとして知られているイムノグロブリン（immunoglobumin）タンパク質エフェクタードメイン又はその断片をさらに含み、融合タンパク質のＡＢＰ及びＢＢＢ構成要素は、Ｆｃ領域又はその部分を介して連結されてもよい。例えば、本発明のコンストラクトはリンカー（Ｌ）をさらに含んでなってもよく、Ｌは小型の連結ペプチド又はペプチド様鎖である。例えば、提供されるＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰコンストラクトは、一本鎖ポリペプチド又は二量体ポリペプチドであってもよく、ＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰを含む一本鎖ポリペプチドは、Ｆｃ二量体化によって二量体を形成してもよい。Ｆｃ二量体化は、２つのＦｃ ＣＨ３ドメイン間の大きな緊密に詰め込まれた疎水性界面の相互作用によって媒介されてもよい。例えば、本発明のコンストラクトはＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰを含んでもよい。提供されるＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトは、一本鎖ポリペプチド（一価）又は二量体ポリペプチド（二価）であってもよく、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰを含む一本鎖ポリペプチドは、融合タンパク質の二量体化を可能にするＦｃを介して二量体を形成してもよい。本発明の化合物は、融合タンパク質、コンストラクト、融合分子、製剤又は組成物と称されてもよい。

本発明の化合物は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療で使用されてもよい。

βアミロイドに結合するポリペプチドは、

ＦＳＳＭＰＤＰＶＤＰＴＴＶＴＫＴＦＫＴＲＫＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫ（配列番号２８）；
ＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＮＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩＴＨＡＲＲＩＬＱＱＳＮＲＮＡＣＮ（配列番号２９）；
ＫＴＦＫＴＲＫＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＮＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３０）；
からなる群から選択される配列を含んでもよい。

βアミロイドに結合するポリペプチドは、配列、Ｘ_１ＴＦＸ_２ＴＸ_３Ｘ_４ＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＸ_５Ｘ_６ＳＴＱＬＸ_７ＳＸ_８ＶＸ_９ＮＩ（式中、Ｘ_１＝Ｇ又はＡ、Ｘ_２＝Ｇ又はＶ、Ｘ_３＝Ｇ又はＡ、Ｘ_４＝Ｇ又はＡ、Ｘ_５＝Ｇ又はＶ、Ｘ_６＝Ｇ又はＶ、Ｘ_７＝Ｇ又はＶ、Ｘ_８＝Ｇ又はＡ、Ｘ_９＝Ｇ又はＡ）（配列番号３１）である）を含む変異型であってもよい。

特定の非限定的な実施形態では、ＡＢＰ、又はその変異型は、
ＫＴＦＫＴＲＫＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３２）；
ＫＴＦＫＴＲＫＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＧＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３３）；
ＫＴＦＫＴＲＧＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３４）；
ＫＴＦＫＴＧＧＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３５）；
ＧＴＦＧＴＧＧＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＧＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３６）；
ＫＴＦＫＴＲＫＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＧＧＳＴＶＫＮＩ（配列番号３７）；
ＫＴＦＫＴＲＫＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＧ（配列番号３８）；及び上記の配列のいずれかと実質的に同一の配列のいずれか１つから選択される配列を含んでもよい。

βアミロイド変異型に結合するポリペプチド（ＡＢＰ）は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択されるポリペプチド配列を含んでもよい。配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択される配列ポリペプチドを含むＡＢＰは、ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型と称されてもよい。本発明は、コンセンサス配列である配列番号３１を有するＡＢＰ変異配列をさらに含み、例えば、配列番号３５、又は配列番号３６、又は任意の同等に安定なポリペプチド配列であってもよい。同等に安定なポリペプチド配列は、哺乳類発現系における融合タンパク質の発現及び産生中にペプチド安定性を示す。例えば、本発明のＡＢＰ変異型は、先行技術のＡＢＰペプチドよりも改善されたペプチド安定性を示してもよい（参考文献、国際公開第２００６／１３３５６６号）。

本発明は、βアミロイドに結合する単離ポリペプチドを提供し、βアミロイドに結合する単離ポリペプチドは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８、又は同等に安定なポリペプチド配列を含む配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。

本発明は、配列番号３１、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択される、ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型を含む、融合タンパク質を提供する。非限定的な例では、ＡＢＰ変異型は、配列、ＫＴＦＫＴＧＧＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＲＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３５）；ＧＴＦＧＴＧＧＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＧＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３６）を含んでもよい。

本発明の融合タンパク質は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて移動する抗体、又はその断片を含んでもよい（上述のように、ＢＢＢは血液脳関門を移動する抗体担体の略称である）。抗体又はその断片（ＢＢＢ）は、血液脳関門を越えた移動を可能にする脳内皮細胞上の表面受容体エピトープに結合してもよい。例えば、このような表面受容体エピトープは、ＴＭＥＭ３０Ａ又はインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）エピトープ、又はそのイソ型、変異型、部分、又は断片であってもよい。

抗体、又はその断片は、
ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ２配列、ＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号３）のＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片；
ＥＹＰＳＮＦＹＡ（配列番号４）のＣＤＲ１配列、ＶＳＲＤＧＬＴＴ（配列番号５）のＣＤＲ２配列、ＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹ（配列番号６）のＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片；
ＧＧＴＶＳＰＴＡ（配列番号７）のＣＤＲ１配列、ＩＴＷＳＲＧＴＴ（配列番号８）のＣＤＲ２配列、ＡＡＳＴＦＬＲＩＬＰＥＥＳＡＹＴＹ（配列番号９）のＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片；及び
ＧＲＴＩＤＮＹＡ（配列番号１０）のＣＤＲ１配列、ＩＤＷＧＤＧＧＸ（式中、ＸはＡ又はＴ）（配列番号１１）のＣＤＲ２配列、ＡＭＡＲＱＳＲＶＮＬＤＶＡＲＹＤＹ（配列番号１２）のＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片からなる群から選択される配列を含んでもよい。

抗体、又はその断片は、

式中、Ｘ_１＝Ｄ又はＥ，Ｘ_２＝Ａ又はＥ，Ｘ_３＝Ｆ又はＶ，Ｘ_４＝Ｅ又はＧ，Ｘ_５＝Ｒ又はＬ，Ｘ_６＝Ｆ又はＷ，Ｘ_７＝Ｌ又はＶ；

式中、Ｘ_１はＥ又はＱ；Ｘ_２はＫ又はＱ；Ｘ_３はＶ又はＥ；Ｘ_４はＡ又はＰ；Ｘ_５はＶ又はＡ；Ｘ_６はＦ又はＶ；Ｘ_７はＥ又はＧ；Ｘ_８はＲ又はＬ；Ｘ_９はＦ又はＷ；Ｘ_１０はＡ又はＳ；Ｘ_１１はＭ又はＩ；Ｘ_１２はＡ又はＳ；Ｘ_１３はＶ又はＬ；Ｘ_１４はＤ又はＹ；Ｘ_１５はＶ又はＬ；Ｘ_１６はＫ又はＲ；及びＸ_１７はＱ又はＬ；

式中、Ｘ_１はＥ又はＱ；Ｘ_２はＫ又はＱ；Ｘ_３はＶ又はＥ；Ｘ_４はＡ又はＰ；Ｘ_５はＡ又はＥ；Ｘ_６はＶ又はＡ；Ｘ_７はＶ又はＦ；Ｘ_８はＧ又はＥ；Ｘ_９はＬ又はＲ；Ｘ_１０はＦ又はＷ；Ｘ_１１はＧ又はＳ；Ｘ_１２はＶ又はＹ；Ｘ_１３はＤ又はＧ；Ｘ_１４はＮ又はＳ；Ｘ_１５はＡ又はＳ；Ｘ_１６はＬ又はＶ；Ｘ_１７はＫ又はＲ；Ｘ_１８はＡ又はＳ；及びＸ_１９はＬ又はＱ；及び

式中、Ｘ_１はＥ又はＱ；Ｘ_２はＫ又はＱ；Ｘ_３はＶ又はＥ；Ｘ_４はＡ又はＰ；Ｘ_５はＶ又はＳ；Ｘ_６はＤ又はＧ；Ｘ_７はＬ又はＲ；Ｘ_８はＦ又はＷ；Ｘ_９はＡ又はＳ；Ｘ_１０はＡ又はＴ；Ｘ_１１はＡ又はＳ；Ｘ_１２はＧ又はＮ；Ｘ_１３はＭ又はＬ；Ｘ_１４はＮ又はＲ；Ｘ_１５はＥ又はＲ；Ｘ_１６はＰ又はＡ；Ｘ_１７はＳ又はＹ；及びＸ_１８はＱ又はＬ
からなる群から選択される配列を含んでもよい。

特定の非限定的な実施形態では、抗体、又はその断片は、

及び上記の配列のいずれかと実質的に同一の配列のいずれか１つから選択される配列を含んでもよい。

ＢＢＢは抗体又はその断片であってもよく、好ましい実施形態では、ＢＢＢは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であってもよい。ｓｄＡｂは、ヒト化されていてもよい。

好ましい実施形態では、抗体又はその断片（ＢＢＢ）はＦｃ又はその断片に連結されてもよく、ＢＢＢ－Ｆｃコンストラクトは二量体を形成してもよい。本発明は、ＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰを含む融合ペプチドをさらに提供し、融合ペプチドのＢＢＢ－Ｆｃ部分は、短いペプチド性リンカー（例えば、１２個未満のアミノ酸を有するリンカー）を介してＡＢＰに連結され、Ｆｃ又はＦｃ断片は、前記融合ペプチドの二量体化を可能にして二量体を提供し、したがってコンストラクトを分解から保護し、その血清半減期を延長する。Ｆｃ断片は、望ましい薬物動態を与えるために選択された任意の適切なＦｃ断片であってもよく、Ｆｃ又はＦｃ断片は、融合分子の長い半減期に寄与する。その他の好ましいＦｃ又はＦｃ断片の実施形態は、免疫学的エフェクター機能を調節、修飾又は抑制してもよい（Shields et al., 2001）。その他の非常に好ましいＦｃ断片の実施形態は、脳からの融合ペプチドのクリアランスを媒介してもよい（Caram-Salas N, 2011）。非限定的な例では、Ｆｃ又はＦｃ断片は、エフェクター機能が減弱された、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１のいずれか１つ、及びそれと実質的に同一の配列から選択される、ＦｃマウスＦｃ２ａ、又はヒトＦｃ１であってもよく、これが前記融合ペプチドに含まれる場合、脳からのアミロイドのクリアランスが促進されてもよい。

本発明の化合物において、ＢＢＢは、Ｆｃ断片、及び／又は任意の追加的な適切なリンカーＬを介して、ＡＢＰに連結されてもよい。

本発明の化合物は融合タンパク質を含み；融合タンパク質は、抗体又はその断片、Ｆｃ断片、及びβアミロイドに結合するポリペプチドを含む。融合タンパク質は、Ｆｃ断片のＮ末端に連結された抗体又はその断片を含んでもよく、βアミロイドに結合するポリペプチドは、連結ペプチド又は化学リンカーであるＬを介して、Ｆｃ断片のＣ末端に連結される。抗体又はその断片は、Ｆｃ断片のＣ末端に連結されてもよく、βアミロイドに結合するポリペプチドは、Ｆｃ断片のＮ末端に連結されてもよい。

したがって、本発明は、配列番号１３～配列番号２６からなる群から選択される抗体又はその断片；配列番号２７～配列番号３８からなる群から選択されるβアミロイドに結合するポリペプチド；及び配列番号３９～配列番号４１からなる群から選択されるＦｃ断片を含む融合タンパク質を提供する。提供されるＦｃは、エフェクター機能が減弱されたＦｃを含んでもよい。

例えば、融合タンパク質は、配列番号４２～配列番号５２又はそれと実質的に同一の配列を含んでもよい。融合タンパク質は一本鎖ポリペプチドであってもよく、融合タンパク質の一本鎖ポリペプチドは二量体ポリペプチドのためのものであってもよい。配列番号４２～配列番号５２に含まれる融合タンパク質に提供される（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）リンカーは、任意の適切なリンカー配列であってもよいことに留意されたい。例えば、強調表示されたリンカー配列（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）は、配列番号５３で例示されるように、提供される融合タンパク質の構成要素の連結を可能にする任意の同等のペプチド連結配列であってもよく、リンカーは任意のペプチド又は化学リンカーであってもよい。

一実施形態では、ＢＢＢはＦｃ断片に連結され、したがって二量体を形成してもよい。Ｆｃ断片は、エフェクター機能が減弱された、例えばマウスＦｃ２ａ又はヒトＦｃ１などの任意の適切なＦｃ断片であってもよい（Shields et al., 2001）。

本発明のＡＢＰ変異型は、配列番号３１を含んでもよく、例えば、配列番号３２～３８のいずれか１つから選択される配列であってもよい。本明細書で提供されるＡＢＰ変異型は、先行技術のＡＢＰポリペプチドに優る予想外の有意な利点を示す。より具体的には、本ＡＢＰ変異型は、安定性及び生物製造可能性の向上を示す。さらに、本明細書で提供されるリンカー及び／又はＦｃ断片を介してＢＢＢと共役した場合、本明細書で提供されるＡＢＰ又は変異型を含む本発明の化合物又は組成物は、血液脳関門の移動において相乗的且つ予想外の効力を示す。このようなＡＢＰ変異型は、本明細書で提供される選択されたＦｃ断片を介してＢＢＢと共役すると、脳からのＡβの予想外の、迅速且つ改善されたクリアランスを提供する。さらに、本明細書で提供されるＡＢＰ又はＡＢＰ変異型を含む本発明の融合タンパク質は、ＢＢＢの移動における相乗的且つ予想外の効力と、脳からのＡβの改善されたクリアランスとを示す。

したがって、βアミロイドに結合するポリペプチド（ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型体）に連結した血液脳関門移行抗体又はその断片（ＢＢＢ）、Ｆｃ（Ｆｃ）を含む治療用組成物が提供され、前記ポリペプチドは、提供される治療用組成物の安定性及び有効性の相乗的増加をもたらす。示されるように、意外なことに且つ最も顕著に、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰの単回のボーラス投与は、動物で同様の結果を達成するための遊離ＡＢＰによる３ヶ月間の複数回処置（ＡＤのマウスモデル）（図９Ａ）と比較して、処置の２４時間以内に脳Ａβ負荷を５０％減少させた（図９Ｂ）。したがって、本明細書で提供される化合物は、脳Ａβ負荷の低減において遊離ＡＢＰよりもはるかにより強力であることが示された。さらに、Ｆｃを含むこの融合タンパク質は、遊離ＡＢＰ又はＢＢＢ－ＡＢＰと比較して、実質的により長い血清半減期を提供し（国際公開第２００６／１３３５６６号）、それによって改善された治療用化合物を提供した（図１０）。

本発明のＡＢＰ変異型、及びＡＢＰを含む融合タンパク質（コンストラクト）は、先行技術の欠点を克服する。先行技術では、ＡＢＰとＢＢＢ担体のみの連結（国際公開第２００６／１３３５６６号）は、有効な分子の生成を保証しない。血清半減期の延長を目的としたＦｃを含む融合物は、血液脳関門を越えるＡＢＰの効率的な輸送を保証しない。ＢＢＢ担体とＦｃ断片とＡＢＰとを含む融合分子の特定の設計及び配合は、効率的なＢＢＢ透過性治療用化合物を提供する。提供される効率的な血液脳関門透過性治療用化合物は、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰの特別に設計された製剤を含み、製剤は、化合物の安定性と有効性の相乗的改善を示す。図９に示されるように、前記融合タンパク質コンストラクトを含む組成物では、融合組成物の安定性の予想外の増加、そして血液脳関門の移動の効率と脳からのＡβのより速いクリアランス（２４時間以内）との相乗的増加が提供される。

本明細書で提供される化合物は、化合物、融合タンパク質、製剤、組成物又はコンストラクトと称されてもよい。提供されるコンストラクトは、抗体又はその断片（ＢＢＢと略記される）、Ｆｃ断片（Ｆｃと略記される）、及びβアミロイドに結合するポリペプチド（ＡＢＰと略記される）を含んでもよい。提供されるコンストラクト又は組成物（本明細書ではＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ又はＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰと略記されることがある）は、血液脳関門移動、効力及び化合物安定性に関して先行技術で遭遇する欠点を相乗的に克服する構成要素を含む。したがって、本明細書で提供される化合物は、血液脳関門の移動における予想外の優れた効率、治療有効性及び化合物安定性を有する新規製剤を含む。

Ｆｃ融合物では血清半減期は必ずしも延長しないが、先行技術では、Ｆｃ融合物が血清半減期を延長する事例がある。さらに、Ｆｃ融合物は、血液脳関門を越えた移動を必ずしも改善しない。

本発明は、βアミロイドに結合するポリペプチドを提供し、ポリペプチド配列は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３８、及びペプチド安定性において実質的に同一の配列からなる群から選択されてもよい。

本発明は、βアミロイドに結合するポリペプチドを提供し、ポリペプチド配列がＡＢＰ又はＡＢＰ変異型と称される場合、ＡＢＰ変異配列は配列番号３１を含んでもよく、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び例えば、配列番号３１の任意の配列変異型などのペプチド安定性において実質的に同一の配列からなる群から選択されてもよい。本発明の配列番号３１を有するＡＢＰ変異型は、ポリペプチドの安定性に関する先行技術の欠点を克服する。さらに、本発明のＡＢＰを含む化合物は、改善された化合物安定性及び生物製造可能性を示す。さらに、本明細書で提供されるＡＢＰ又はＡＢＰ変異型を含む化合物は、相乗的且つ予想外の治療改善を示す。

本発明のＡＢＰ変異型は、配列番号３１～配列番号３８のいずれか１つから選択される配列、及び同等に安定なポリペプチド配列を含んでもよい。本発明のＡＢＰ変異型は先行技術のＡＢＰ配列よりも優れており、本ＡＢＰ変種ポリペプチドは改善された安定性を示す（図２Ａと図１６との比較で示されるように）。

本発明はまた、本発明のＡＢＰ又はＡＢＰ変異型を含む、融合タンパク質（化合物、コンストラクト、又は融合分子とも称される）を提供する。融合タンパク質は、Ｆｃ断片を含んでもよい。融合タンパク質は、血液脳関門を移動する抗体又はその断片と、Ｆｃ断片と、配列番号３１及び配列番号３２～３８からなる群から選択されてもよいβアミロイド結合ポリペプチド配列とを含んでもよい。提供されるＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ製剤は、脳から毒性アミロイドを除去する際に、化合物の安定性と治療効果との相乗的な改善を示す。

本明細書でＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰと称されることもある融合タンパク質又はコンストラクトは、その中に含まれる構成要素に関して配向が異なっていてもよい。本発明の化合物において、融合タンパク質は二量体を形成し（図１に示されるように）、融合ペプチドはＦｃ領域を介して二量体化する。例えば、一実施形態では、提供される化合物は、ｃ断片（Ｆｃ）のＮ末端に連結されるＢＢＢと、Ｃ末端に付着する短いペプチド性リンカーを介してＦｃ断片のＣ末端に連結されるＡＢＰ又はＡＢＰ変異型（ＡＢＰ）とを含む、融合タンパク質を含んでもよい（図１Ａ、化合物は融合タンパク質の二量体として示される）。さらなる実施形態では、提供される化合物は、Ｆｃ断片（Ｆｃ）のＣ末端に連結されるＢＢＢを含んでもよく、ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型（ＡＢＰ）は、適切なリンカー（Ｌ）を介してＦｃ断片のＮ末端に連結されてもよい（図１Ｂ）。構成１Ａでは、ＡＢＰ又はＡＢＰ変異型は、Ｆｃに融合／連結されたＮ末端（融合）又はＣ末端（化学的結合）であってもよいことに留意されたい。その他の可能な構成では、ＢＢＢはＡＢＰのＮ末端に連結され、ＡＢＰはＦｃ断片のＮ末端に連結される（図１Ｃ）。さらに別の可能な構成では、ＢＢＢはＡＢＰのＣ末端に連結され、ＡＢＰはＦｃ断片のＣ末端に連結される（図１Ｄ）。

本明細書で提供される化合物は、配列番号４２配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及びこれらの配列のいずれかと実質的に同一の配列のいずれか１つから選択される配列を含む融合タンパク質を含む。本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質（ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ又はＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ、Ｌは任意の適切なリンカーであってもよい）二量体である（図１に示され、好ましくは図１Ａ又は１Ｂに示される）」。非限定的な例では、提供される化合物又は融合タンパク質は、配列番号３５（ＡＢＰ－ＧＧ－Ｇ）又は配列番号３６（ＡＢＰ－６Ｇ）の配列を含むポリペプチド；配列番号１７（ＦＣ５－Ｈ３）の配列を含む抗体又はその断片；及び配列番号４０（ｈＦｃ１Ｘ７）の配列を含むＦｃ断片を含んでもよい。

本発明の特定の非限定的な実施形態では、化合物は、配列番号４６［ＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ１Ｘ７－Ｌ－ＡＢＰ（ＧＧ－Ｇ）］又は配列番号４７［ＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ１Ｘ７－Ｌ－ＡＢＰ（６Ｇ）］の配列を含んでもよく、式中、Ｌは任意の適切なリンカーであってもよい。

本発明の化合物は、血液脳関門を移動する。

本発明は、本明細書に記載されるような本発明の任意の化合物をコードする核酸分子を包含する。本発明の融合タンパク質の核酸分子又は化合物を含むベクターもまた、本発明の範囲に含まれる。

本発明は、本発明の化合物又は融合タンパク質と、薬理的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む組成物を包含する。

本発明の医薬組成物を含むキットもまた、本発明の範囲に含まれる。

本発明の組成物は、患者においてアルツハイマー病を治療するために使用されてもよい。

本発明の組成物は、脳Ａβレベルが増加している対象の脳内又はＣＳＦ中の毒性βアミロイド（Ａβ）レベルを減少させるために使用されてもよい。

本発明は、アルツハイマー病を治療する方法を提供し、本発明の医薬組成物は、それを必要とする対象に投与されてもよい。

本発明は、脳Ａβのレベルが増加している対象の脳内の毒性βアミロイド（Ａβ）レベルを減少させる方法を提供する。本発明の方法は、本発明の化合物をＡＤを有する患者に投与することを含む。より具体的には、本方法は、十分な量の本発明の医薬組成物を対象に反復非経口投与するステップを含む。

本発明の方法では、非経口投与は、皮下又は静脈内投与である。

本発明の方法は、本明細書で提供される組成物の反復非経口投与後に、Ａβの脳レベルが増加した対象の脳内の毒性βアミロイドレベルを減少させる。より具体的には、毒性βアミロイドレベルは、本発明の組成物の反復非経口投与の４週間以内に減少する。

本発明の方法は、本発明の組成物の非経口投与後に、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の毒性βアミロイドレベルを減少させる。より具体的には、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の毒性βアミロイドレベルは、本発明の組成物の単回非経口投与の２４時間以内に有意に減少し、有意な減少は２４時間以内に５０％に至る。

本発明は、血液脳関門透過性単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提供し、ｓｄＡｂは、ラクダ科動物ＦＣ５又はそのヒト化バージョンのどちらかである。二価形態で提示されたＦＣ５は、Ｖ_ＨＨ形態のＦＣ５と比較して、血液脳関門通過特性が改善されていることが示されている（Farrington et al., 2014）。

本発明は、生体外で血液脳関門移動を促進するＢＢＢとＦｃ断片とを含む化合物を提供し、融合分子の血清半減期を延長して、Ｆｃ融合体の血清半減期は完全ＩｇＧと同様になる。ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰの血清半減期の延長は脳全体の曝露を増加させ、これは、アルツハイマー病などの慢性疾患の治療にとって特に重要である。

ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ融合分子並びにヒト化バージョンＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰ、及びＩＧＦ１Ｒ５－Ｈ２－ＡＢＰ融合分子はＣＨＯ細胞で産生された。配列番号３１に記載される本発明のＡＢＰ変異型は、融合分子（配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）の生物製造可能性及び安定性を高める特定の点変異又は欠失をもって、系統的に再設計される。本発明のＡＢＰ変異型を含む融合分子はＡβ結合能力を維持するだけでなく、提供されたＡＢＰ変異型を含む融合分子は血液脳関門に浸透するだけでなく、例えば、投与から２４時間以内の脳からのＡβの急速なクリアランスなどの脳からのＡβのクリアランスを有利に可能にする。

例えば、ＡＢＰ（ＧＧ－Ｇ）（配列番号３５）又はＡＢＰ（６Ｇ）（配列番号３６）などの本発明のＡＢＰ変異型は、コンストラクトの安定性及び製造可能性を高めるために特異的に操作された（図１６に示されるように）。本発明のコンストラクトの向上した安定性及び生物製造可能性は、本技術分野において意義深い。したがって、本発明は、提供される融合分子の安定性及び生物製造可能性を高めるが、治療活性もまた維持する、ＡＢＰ及びＡＢＰ変異型を包含する（図１５Ａに記載されるように）。

したがって、配列番号３２～３８などの配列番号３１に記載されるような異なるＡＢＰ変異型を含む融合分子は、生体外で親ＡＢＰのＡβオリゴマー結合能を維持し（図２Ｂ、２Ｃ、１２及び１５Ａ、Ｂ、及びＣ）、生体外及び生体内の双方で親ＦＣ５のＢＢＢ浸透性を維持する（図４、５Ａ、６、７、１７Ａ、１７Ｂ、１８、及び１９）。ＡＢＰは、ラット及びイヌのＣＳＦ中に存在することで確立されたように、生体外及び生体内で例えばＦＣ５などの担体によってＢＢＢを越えて輸送される（図５及び６）。ＡＢＰ融合体はまた、野生型及びＡＤ遺伝子組換えマウスの双方で、海馬や皮質などの脳内の標的領域にも輸送され送達された（図８及び１９）。脳に送達されたＡＢＰはまた、ＣＳＦ（図９Ｃ及び１１Ａ及び１１Ｂ）及びＡＤ遺伝子組換えマウス及びラットの皮質及び海馬領域（図９Ｂ及び１１Ｃ）において、Ａβクリアランスも促進した。さらに、そして最も重要なことには、ラットＡＤモデルにおけるＡβクリアランスは、海馬の体積及び神経細胞結合性の強化と相関し（図１２Ａ及び１２Ｂ）、治療に対する望ましい薬理学的／生理学的応答が示唆された。

意外なことに且つ最も顕著に、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰの単回のボーラス投与は、動物で同様の結果を達成するための遊離ＡＢＰによる３ヶ月間の複数回処置（図９Ａ）と比較して、処置の２４時間以内に脳Ａβ負荷を５０％減少させた（図９Ｂ）。したがって、ＢＢＢ対応のＡＢＰは、脳のＡβ負荷を軽減させる上で、遊離ＡＢＰよりもはるかにより強力であることが示された。さらに、この化合物は、Ｆｃとの融合により、遊離又はＦＣ５－ＡＢＰと比較して、実質的により長い血清半減期を有し、それはより良い治療薬に必須の特徴である（図１０）。

先行技術では、ＡＢＰとＢＢＢ担体のみの連結（国際公開第２００６／１３３５６６号）は、有効な分子の生成を保証しない。血清半減期を延長するためのＦｃとの融合もまた、血液脳関門を越えるＡＢＰの効率的な輸送は保証しない。本発明の融合タンパク質コンストラクトで提供されるような、ＢＢＢ担体、Ｆｃ断片、及びＡＢＰ融合分子の適切な設計及び配合は、効率的なＢＢＢ透過性治療用化合物を提供する。

この新しい二機能性融合分子は、現在開発中の従来の治療用抗体に優る明確な利点がある。第一に、ＢＢＢ融合治療用ＡＢＰは、はるかにより高いレベルで、より速い速度で脳に浸透し、治療効果を実質的に改善する。さらに、ＡＢＰ及びＢＢＢ（例えば、ＦＣ５）は、それぞれの受容体に対する親和性が比較的低く、したがって脳からより早く除去される可能性が高いため、ＡＢＰ結合Ａβの迅速なクリアランスが促進される。より緩慢なプロセスである、Ａβクリアランスのための反応性小膠細胞／星状細胞を主に用いる治療用抗体（例えば、アデュカヌマブ）とは異なり、本発明の融合分子は、Ａβクリアランスのためにより速い血管周囲排液経路を用いる可能性が高い。これは、同様の結果を得るために複数回の反復投与による数ヶ月間の処置が必要である、遊離ＡＢＰ（図９Ｂ）及び抗体ベースの治療法と比較して、処置の２４時間以内にＣＮＳのＡβが５０％近く減少することによって裏付けられる。

さらに、本化合物は、抗体ベースの治療薬と比較して、神経炎症応答を誘発する可能性がより低い。

図面の簡単な説明
本発明のこれらの及びその他の特徴を添付の図面を参照して、例としてここで説明する。

血液脳関門を通過するアミロイド結合融合タンパク質の概略図を示す。融合タンパク質は、ＢＢＢ通過単一ドメイン抗体（ＢＢＢ又はＢＢＢ担体）、Ｆｃ断片（Ｆｃ）、及びアミロイド結合ペプチド（ＡＢＰ）を含む。図１は、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰを含む融合タンパク質の対応する二量体を示す。３つの構成要素（すなわち、ＢＢＢ、Ｆｃ、及びＡＢＰ）は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに示されるように、様々な構成で描写される。 ＣＨＯ細胞におけるＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ及びヒト化ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰ（ＡＢＰ配列番号３２）融合分子の産生を示す。図２Ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮＲ－非還元及びＲ－還元条件）によるＦＣ５融合分子の分離後のクマシーブルー染色ゲルは、組換え融合分子の産生の成功を示す。図２Ｂと２Ｃは、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット（ＷＢ）オーバーレイアッセイによる、遊離ＡＢＰ及びＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質のＡβオリゴマー結合。遊離又は融合ＡＢＰは、ＥＬＩＳＡプレート上で固定化され、Ａβに曝露された。結合Ａβは、Ａβ特異的抗体６Ｅ１０又は４Ｇ８を用いて検出された。融合分子もまたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離され、ＰＶＤＦ紙に転写され、Ａβに曝露された。結合Ａβは、上記のように特異的抗体で検出された。結果は、ＡＢＰがＢＢＢ担体との融合後に、Ａβオリゴマー結合能力を維持したことを示す。Ｍｏ：Ａβモノマー；Ｏｌｉ：Ａβオリゴマー ＡＤ－Ｔｇマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、Jackson Lab）のアミロイド沈着物へのＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰの結合の免疫組織蛍光アッセイを示す。ＡＢＰは、免疫組織蛍光アッセイで示されるように、ＡＤ－Ｔｇマウス脳内で自然に生成されたＡβ凝集体を結合する能力を維持する。野生型及びＡＤ遺伝子組換えマウスの脳切片がＩＲ８００標識されたＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰと共にインキュベートされ、結合した融合分子が蛍光顕微鏡下で視覚化された。選択的結合（明るい点）は、Ａβ沈着物を産生するＡＤ－Ｔｇマウスの脳切片で見られ、アミロイド沈着物を産生しない野生型マウスの脳切片では見られなかった。 生体外でＡＢＰとの融合後に、ＦＣ５のＢＢＢ透過性が維持されていることを示す。ＦＣ５－ＡＢＰ融合分子の血液脳関門通過は、ラット及びヒトの生体外ＢＢＢモデルで評価された。ＢＢＢを通過する融合分子は、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法（図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃ）によって、そしてＦｃ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によって検出された（図４Ｄ、３連で実施された）。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰがＦＣ５－ｍＦｃと同程度に効果的にＢＢＢを通過したのに対して、ＢＢＢ担体部分ＦＣ５のないＦｃ－ＡＢＰは、脳内皮細胞単層を横断しなかった。予測されたように、対照の単一ドメイン抗体ＥＧ２及びＡ２０．１、又は対照の完全ＩｇＧ（抗ＨＥＬ）は、血液脳関門を通過しなかった。ヒト化ＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ－ＡＢＰ融合タンパク質でも、同様の結果が得られた（図４Ｃ及び図４Ｄ）。 生体内におけるＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰの血清及びＣＳＦ薬物動態を示す。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは、示された用量（２．５、６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇ）で尾静脈注射を通じてラットに静脈内投与された。血清及びＣＳＦが連続的に採取された。ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰレベルは、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法を用いて定量化された。図５に示されように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは時間及び用量依存様式でＣＳＦ中に出現し、Ｃｍａｘは１２～２４時間であり、生体内におけるＦＣ５による脳及びＣＳＦ区画内へのＡＢＰの輸送が示唆される。血清ＰＫパラメータ（図５及び表１）は、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのα及びβ半減期が、完全ＩｇＧ（ラットＦｃを含む基準抗体）のそれと同様であることを示す。 ビーグル犬のＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰの血清及びＣＳＦＰＫプロファイルを示す。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰが１０～１２歳齢のビーグル犬に静脈内注射によって投与され、血清及びＣＳＦが連続的に採取され、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ（図６Ａ）によって、及びＦｃ特異的抗体を使用したウエスタンブロット（図６Ｂ）によって分析された。星印は、血液に汚染されたサンプルを示す（ＭＲＭ分析には示されない）。見て分かるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰはＣＳＦ中に時間依存様式で現れ、生体内でイヌの血液脳関門を通過するＦＣ５によるＡＢＰの輸送を示唆する。ＰＫパラメータ及びＣＳＦ暴露は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウエアによって分析され、以下の表２に示される。 生体内（ラットモデル）においてヒトＦｃ（ｈＦｃ）と融合しＡＢＰ（ＦＣ５－ｈＦｃ－ＡＢＰ）に化学的に連結された、ＦＣ５のＢＢＢ透過性とＣＳＦの外観を示す。ＦＣ５－ｈＦｃは、製造会社の使用説明書（ThermoFisher Scientific）に従ってヘテロ二機能性架橋剤スルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート）を使用して、ＡＢＰ－シスタミドと連結された。化学的にコンジュゲートされた分子がラットに６．２５ｍｇ／ｋｇで尾静脈を介して静脈内投与され、血清及びＣＳＦサンプルが４及び２４時間目に採取され、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭで分析された。ＦＣ５－ｈＦｃ－ＡＢＰは、ＢＢＢ担体のないＦｃ－ＡＢＰとは対照的に、ＣＳＦに時間依存様式で出現する。この化学的に連結されたコンストラクトでは、ＦｃのＣ末端に融合されているのがＡＢＰのＮ末端であり、ＡＢＰのＣ末端は遊離している融合コンストラクトとは異なり、ＡＢＰのＣ末端がＦｃ断片（ランダム領域）に連結され、Ｎ末端は遊離していることに留意すべきである。ＡＢＰの配向のこの逆転は、そのＡβ結合能力及び血液脳関門を越える輸送に影響を及ぼさなかった。 マウスにおける静脈内注射後に、様々な脳領域（皮質及び海馬）で測定されたＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのレベルを示す。１５ｍｇ／ｋｇ用量のＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰが野生型（ＷＴ）又はＡＤ遺伝子組換えマウス（ＡＤ－Ｔｇ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、Jackson Lab）の尾静脈に静脈内注射され、心臓内生理食塩水灌流の４時間後及び２４時間後に脳が採取された。海馬及び皮質組織が解剖され、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ（図８Ａ）によって、そしてＦｃ特異的抗体を使用したウエスタンブロット（図８Ｂ）によって分析された。融合分子の３つの構成要素全て（この例ではＦＣ５、Ｆｃ、及びＡＢＰ）に属する特定のペプチドが、皮質と海馬の双方でＭＲＭによって検出され、ＦＣ５担体がＡＢＰを脳の標的領域に成功裏に送達したことが示唆された。Ｆｃ又はＦｃ断片のみに融合した対照単一ドメイン抗体Ａ２０．１で典型的に測定される約５０ｎｇ／ｇ組織と比較して、測定されたレベルは、異なる時点で７５０～１４００ｎｇ／ｇ脳組織に及んだ。これはさらに、組織抽出物中のＦｃ及びＡＢＰを探索するウエスタンブロット分析によって確認された（図８Ｂ）。生理食塩水のみが投与された動物では、ウエスタンブロットによって融合分子のタンパク質シグナルは検出されなかった。脳の標的領域でウエスタンブロットによって検出されたＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰレベルの用量依存的な増加があった。 遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスにおけるＡβレベルに対するＡＢＰの効果を示す。ＡＢＰ単独（図９Ａ）又はＢＢＢ担体ＦＣ５と融合したＡＢＰ（図９Ｂ及び図９Ｃ）による処置の比較。２つの異なるＡＤ Ｔｇマウスモデル、三重遺伝子組換え（ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ、ＡＰＰ_Ｓｗｅ、及びｔａｕＰ３０１Ｌ導入遺伝子を保有する、３ＸＴｇ－ＡＤ、ｓｖ１２９／Ｃ５７ＢＬ６マウス、Dr. F.M. LaFerla, University of California）及び二重遺伝子組換え（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９及びＡＰＰ_Ｓｗｅ導入遺伝子を保有する、Jackson Lab）が使用され；マウスには、それぞれ３ヶ月間又は２ヶ月間期間にわたり、隔日で３００ｎｍｏｌ／ｋｇの遊離ＡＢＰが皮下（ｓｃ）投与された。処置期間の終了時に、脳のＡβレベルがＥＬＩＳＡで測定された。ＡＢＰ単独による処置は、２～３ヶ月の複数回の（隔日）処置後に、脳Ａβの２５～５０％の減少をもたらした（図９Ａ）。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰコンストラクトが二重遺伝子組換えＡＤマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２２０ｎｍｏｌ／ｋｇに相当）に静脈内注射され、ＥＬＩＳＡとｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭの双方によって、注射後２４時間の脳Ａβレベルが測定された。意外なことに、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰによる処置の２４時間以内に約５０％のアミロイドの減少が観察され（図９Ｂ）、Ｆｃに適切に連結されたＦＣ５によるＡＢＰの効率的な脳送達が、Ａβレベルの減少におけるＡＢＰの有効性を劇的に高めたことが示唆された。ＣＳＦ分析はまた、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ処置後２４時間以内にＡβ_１～４２レベルの有意な減少を示した（図９Ｃ）。ＭＲＭ又はＥＬＩＳＡ分析によって検出されたＡβのシグネチャペプチド又はエピトープは、ＡＢＰによって認識されるＡβエピトープから離れている／異なる（したがって、ＥＬＩＳＡ又はＭＲＭによる定量化に干渉しない）。 ＦＣ５－ＡＢＰ（Ｆｃ成分なし）と比較したＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトの血清半減期の延長の一例を示す。ＦＣ５－ＡＢＰ及びＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰは尾静脈を介してラットに注射され、様々な時点で連続血清サンプルが採取され、ＦＣ５特異的抗体を用いた直接ＥＬＩＳＡによって分析された。図１０Ａに見られるように、ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ（図１０Ｂ）と比較して、ＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトは血清中で急速に除去され（１時間未満）、Ｆｃ断片を含む分子の血清安定性の実質的な増加が示唆される。 Ｔｇラットの脳アミロイド負荷に対する、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰの効果を示す。ＡＤ－Ｔｇラットは、生理食塩水又はＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのどちらかを４週間にわたり毎週尾静脈から投与された（３０ｍｇ／ｋｇの初回負荷量及び引き続く１５ｍｇ／ｋｇの４回の週用量）。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ及びＡβのＣＳＦレベルは、ｎａｎｏＬＣ ＭＲＭによって分析された（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。４週間の処置の前後に、特定のＡβ結合剤［１８Ｆ］ＮＡＶ４６９４を使用して、ＰＥＴスキャンによって脳Ａβレベルが判定された。トレーサー注入後、６０分間の動的画像が取得され、透過スキャンが取得され、画像が再構築され、結合能（ＢＰ_ＮＤ）パラメトリックマップが作成された。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは、２４時間以内にラットにおけるＣＳＦのＡβレベルを減少させた（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。Ｔｇラットにおけるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのＣＳＦレベルとＡβとの逆相関が観察され、ＦＣ５によって脳及びＣＳＦに送達されたＡＢＰによる、Ａβの標的結合と急速なクリアランスが示唆された（図１１Ｂ）。これは、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰによる４週間の処置に続くラット脳Ａβレベルの有意な減少（３０～５０％）を明確に示したＰＥＴスキャンによって、さらに裏付けられた（図１１Ｃ）。 生理食塩水又はＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰによる処置の前後のＴｇラットの体積磁気共鳴画像法（ＭＲＩ、定常歳差運動の高速画像法を使用）及び機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）を示す。図１２Ａに示されるように、４週間の処置後、生理食塩水処置Ｔｇラット（Ｔｇ－Ｓａｌ）と比較してＡＢＰ処置Ｔｇラット（Ｔｇ－ＡＢＰ）海における海馬体積の増加が観察された。図１２Ｂに示されるように、４週間の処置後のグループ比較では、ＡＢＰで処置されたＴｇラット（Ｔｇ－ＡＢＰ）は、生理食塩水で処置されたＴｇラット（Ｔｇ－Ｓａｌ）と比較して、前帯状皮質（ＡＣＣ）の結合性が高いことが示された。 ビーグル犬のＣＳＦ中のＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰの時間及び用量依存性の出現と、Ｔｇマウス（図９Ｃ）及びＴｇラット（図１１Ａ及びＢ）に見られるようなＣＳＦのＡβレベルの減少とを示す。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰが１０～１２歳齢のビーグル犬に１５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇで静脈注射によって投与され、血清及びＣＳＦが連続的に採取され、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ及びＡβレベルがｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによって分析された。見て分かるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは、ＣＳＦ中に時間及び用量依存様式で出現した。重要なことには、Ｔｇマウス及びＴｇラットで見られるように、ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰ注射後２４時間以内にＣＳＦのＡβレベルの有意な減少があり、大型動物におけるＦＣ５担体の翻訳特性と、ＣＮＳのＡβ負荷の低減におけるＡＢＰの異種間効力が示唆される。 異なるＢＢＢ担体を使用したＡＢＰ融合分子の生成を示す。ＡＢＰ融合分子の汎用性を評価するために、ＡＢＰは、別のヒト化ＢＢＢ担体ＩＧＦ１Ｒ５（Ｈ２）と成功裏に融合された。示されるように、分子の二機能性が維持され、ＡＢＰがＡβオリゴマーに結合する能力（ＥＬＩＳＡ及びオーバーレイアッセイ）が維持され、ＩＧＦ１Ｒ５が生体外でＢＢＢモデルを越えてＡＢＰを送達する能力もまた維持された（データ未掲載）。これは、ＡＢＰが、異なるＢＢＢ通過単一ドメイン抗体と融合され、脳に送達され得ることを明確に示唆する。 異なる単一ドメイン抗体－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトによる、Ａβオリゴマーの結合を示す（図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃ）。これらのコンストラクトのいくつかでは、配列番号に示されるように、ＡＢＰは部位特異的変異又は分子のＣ末端部分の除去によって修飾されている。全てのコンストラクトは、ＥＬＩＳＡ法によって、Ａβオリゴマーの結合における同様の効力を維持した。 安定性及び生物製造可能性を改善するための特定の変異を有する、ＦＣ５－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰの生成を示す。特定の変異を担持するＦＣ５－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（配列番号３５又は配列番号３６のＡＢＰなど）がＣＨＯ細胞で産生され、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下においてＳＤＳ－ＰＧＥ上で分離され、図２に記載されるようにクマシーブルーで染色された。分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に転写され、ＦＣ５特異的、ｈＦｃ特異的、又はＡＢＰ特異的いずれかの抗体を用いて免疫ブロット法が実施された。別のセットでは、融合分子中のＡＢＰのＡβ結合もまたオーバーレイアッセイにより試験された。結合したＡβは、Ａβ特異的抗体６Ｅ１０によって検出された。見て分かるように、特定の変異を伴うＡＢＰの方法論的修飾は、還元及び非還元条件下における単一タンパク質バンドによって示されるように、生成された分子の安定性を実質的に高めた。 生体外における様々なＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクト及びＩＧＦ１Ｒ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトの血液脳関門透過性を示す。図４に記載されているように、ＢＢＢ通過は生体外ラットＢＢＢモデルで評価され、血液脳関門を通過する分子がｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法で検出された。ヒト化ＦＣ５及びＩＧＦ１Ｒ担体に融合した全てのＡＢＰ変異型は、血液脳関門を効果的に通過した。予測されたように、非ＢＢＢ透過性ｓｄＡｂであるＡ２０．１は血液脳関門を通過せず、Ａ２０．１に融合したＡＢＰもまた同様にＢＢＢを通過しなかった（図１７Ａ）。図１７Ｂでは、融合分子ＦＣ５、Ｆｃ、及びＡＢＰの３つの成分全ての「フィンガープリント」ペプチドがｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによって検出されることが示され、その結果、無傷のＦＣ５、Ｆｃ、及びＡＢＰのＢＢＢを越える移動が示唆される。 ヒト化ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰコンストラクト（ＡＢＰ、配列番号３５及び配列番号３６）が、ＦＣ５によって生体外血液脳関門を越えて無傷で輸送されることを示す。血液脳関門通過は、図４について記載されるような生体外ラットＢＢＢモデルで評価され、ＢＢＢを通過する分子は、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。図１８（１）Ａ及びＢは、ｈＦｃ及びＡＢＰ特異的抗体で探索された免疫ブロットを示す。分子サイズは、生体外血液脳関門モデルに適用された融合分子のサイズと全く同一である。図１８（１）Ｃは、ＢＢＢを通過した後の分子がＥＬＩＳＡプレート上のＦＣ５特異的抗体によって捕捉され、ＡＢＰ特異的抗体を用いて検出された、サンドイッチＥＬＩＳＡを示す。このサンドイッチＥＬＩＳＡは、生体外でラットの血液脳関門を通過した後に、ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰが無傷のままであったことを確認した。Ｃ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（ＡＢＰ、配列番号３６）で同様の結果が得られた；図１８（２）Ａ、Ｂ、及びＣ。 ヒト化ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰコンストラクト（ＡＢＰ、配列番号３５及び配列番号３６）が、ＦＣ５によって生体内血液脳関門を越えて輸送され、無傷で脳に送達されることを示す。ＦＣ５－ＡＢＰ融合分子は、図８に記載されるように、野生型及びＡＤ－Ｔｇマウスに尾静脈を介して静脈内投与され、心臓内灌流に続いて脳が採取された。脳皮質は均質化され、ＲＩＰＡ緩衝液で抽出され、抽出物は、図１８に記載されるように、ウエスタンブロット及びサンドイッチＥＬＩＳＡ分析に供された。図１９Ａは、ＡＢＰ特異的抗体で探索された免疫ブロットを示す。分子サイズは、動物に注射された融合分子のサイズと全く同じである。図１９Ｂは、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡプレート上のＦＣ５特異的抗体を用いて捕捉され、ＡＢＰ特異的抗体を用いて検出された、同一抽出物中の分子を示す。これは、ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰが生体内でＢＢＢを越えて輸送され無傷で脳に送達されるという、免疫ブロットの結果を裏付ける。 ＡＤ－Ｔｇマウス脳（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、Jackson Lab）内のＡβ沈着物に対する、ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（ＡＢＰ、配列番号３６）の内因性生体外結合（Ａ）及び生体内結合（Ｂ）の免疫組織化学的分析を示す。ＡＤ遺伝子組換えマウス由来の脳切片は、ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（ＡＢＰ、配列番号３６）と共にインキュベートされ、結合した融合分子はＨＲＰコンジュゲートＦＣ５特異的抗体を用いて視覚化された。ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰコンストラクトでは選択的結合（黒点）が見られたが、ＡＢＰのないＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７（Ａ）では見られず、脳内のＡβ沈着のＡＢＰ依存性結合（標的結合）が示唆された。アミロイド沈着を生じない野生型マウス由来の脳切片には、結合は見られなかった（データ未掲載）。ＡＤ遺伝子組換えマウスへのＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰコンストラクトの海馬内注射後（注射の４時間後）、Ａβ沈着物の同様の結合が検出された（ＡＢＰ特異的抗体を使用）。 生体内における、ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（ＡＢＰ、配列番号３２）による標的結合を示す。図２１Ａは、海馬内注射後の生体内ＡＤ遺伝子組換えマウスにおける、Ａｌｅｘａ ６４７標識ＦＣ５－ｈＦｃ－ＡＢＰコンストラクトの天然アミロイドβ（Ａβ）沈着物への結合を示す。Ａβの同定は、Ａｌｅｘａ ４８８で標識されたＡβ特異的抗体６Ｅ１０を用いて脳切片を探索し、２つのシグナルの同時局在化（Ｍｅｒｇｅ）を実証することで確認された。図２１Ｂは、ＥＬＩＳＡによる標的結合の実証を示す。野生型及びＡＤ遺伝子組換えマウスへのＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰコンストラクトの海馬内注射に続いて（注射の４時間後）、海馬体が解剖され均質化された。ＦＣ５－ＡＢＰ融合コンストラクトは、捕捉抗体としてＦＣ５抗体、検出抗体としてＡＢＰ抗体を使用する、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出された。ＡＢＰの内因性Ａβへの生体内結合は、同一サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出されたが、検出抗体としてＡβ特異的抗体が使用された。図２１Ａ及び２１Ｂから、野生型とＡＤ遺伝子組換えマウスの双方において、ＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトが注射の４時間後に無傷のままであることが明らかである。最も重要なことは、ヒトＡβを発現するＴｇマウスでは、注射されたＡＢＰはＡβに結合して複合体（ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰ^＊Ａβ）として沈降し、生体内におけるＡＢＰによるＡβ標的結合が示唆される。 非ヒト化及びヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクト間のＰＫ、ＰＤ比較を示す。ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰ又はＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１ｘ７－ＡＢＰは、図５に記載されるように１５ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射を通じてラットに静脈内投与された。血清及びＣＳＦが連続的に採取された。ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰレベルをｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法を用いて定量化した。図２２Ａに示されるように、血清及びＣＳＦのＰＫプロファイルは、非ヒト化及びヒト化コンストラクトで非常に良く似ていた。ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰ又はＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１ｘ７－ＡＢＰは、図９Ｂに記載されるように１５ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射を通じてＴｇマウスに静脈内投与された。ＣＳＦ中のＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ及びＡβレベルは、図９Ｂに記載されるようにｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによって測定された。図２２Ｂに示されるように、ＣＳＦ中の非ヒト化及びヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰのレベルは類似しており、最も重要なことには、ＣＳＦのＡβレベルの変化（減少）も非常に良く似ており、ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトのヒト化は、融合コンストラクのＰＫ及びＰＤプロファイルに影響を及ぼさなかった。

発明の詳細な説明
本発明は、血液脳関門を移動する、ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む融合タンパク質、及び前記ポリペプチドと抗体又はそれらの断片とを含む融合タンパク質を提供する。

本発明は、βアミロイド（βアミロイド）に結合するポリペプチドを提供する。βアミロイドに結合するポリペプチド（又はタンパク質）は、病理学的に関連したβアミロイド_１～４２（Ａβ_１～４２）凝集体に選択的に結合してもよく、本明細書でＡＢＰ又はＡＢＰ変異型（又は集合的にＡＢＰ）と略記され言及されることもある。

本発明は、血液脳関門を通過する抗体又はその断片に連結されたＡＢＰ又はＡＢＰ変異型を含む、融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、ＡＢＰ及びＢＢＢを含む融合タンパク質は、Ｆｃ又はその断片をさらに含み、融合タンパク質のＡＢＰ及びＢＢＢ構成要素は、Ｆｃ領域又はその一部を介して連結されてもよい。例えば、本発明のコンストラクトは、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ又はＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰを含んでもよく、式中、Ｌは任意の適切なリンカーであってもよい。提供されるＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＰＢ又はＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰコンストラクト一本鎖ポリペプチド又は二量体ポリペプチドであってもよく、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰを含む一本鎖ポリペプチドは、構成要素Ｆｃ領域を介して多量体（好ましくは二量体）を形成してもよい。

本発明は、血液脳関門を移動する化合物とその使用とに関する。より具体的には、本発明は、ＢＢＢ及びＡＢＰを含む化合物と、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療におけるそれらの使用とに関する。

血液脳関門を越えてＡＢＰを効率的に移動し、ＡＢＰの結合を通じてＡβの除去を提供し得る治療用製剤に対する必要がある。先行技術では、ＡＤの発症に関係するＡβ_１～４２オリゴマーに選択的に結合する、４０アミノ酸のＡβ結合ペプチド（ＡＢＰ）が同定された（国際公開第２００６／１３３５６６号）。このＡβ結合ペプチドは、生体外で細胞タンパク質へのＡβ結合を阻害し、Ａβ_１～４２誘導細胞毒性を阻害する（Chakravarthy et al, 2013）。このＡβ結合ペプチドは、ＡＤ遺伝子組換えマウス脳内の内のアミロイド沈着に結合し、並びに生体外でＡＤ患者由来の脳内アミロイド沈着に結合する。より重要なことには、生きたＡＤ遺伝子組換えマウス脳に直接注射された場合（Chakravarthy et al, 2014）、ＡＢＰは生体内で天然アミロイド沈着を標的化する。したがって、ＡＢＰは潜在的にＣＮＳのＡβを標的化し得て、脳からのＡβの除去を助け得て、その毒性効果を減少させる。しかし、全身投与されたＡＢＰは、ＢＢＢを通過して脳実質に単独で接近する能力が限定的である。

したがって、ＡＢＰは直接適用されるとＡβ沈着物に結合することが示されているが、Ａβに結合して脳から除去するためには、非経口投与されたＡＢＰが血液脳関門を透過する必要がある。本発明は、有利には、Ｆｃ断片を介してＦＣ５又はＩＧＦ１ＲなどのＢＢＢ透過性単一ドメイン抗体に融合されたＡＢＰを提供し、二重特異性血液脳関門透過性治療薬を提供する（Farrington et al, 2014）。本発明のＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトは二量体化されてもよく、すなわち、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ一本鎖融合タンパク質は、２つの一本鎖融合タンパク質の二量体を形成して二量体化合物を生じてもよく、二量体の各一本鎖は、ＢＢＢ、Ｆｃ断片、及びＡＢＰを含んで、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ二量体を提供する。ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ又はＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰコンストラクト及びそれらの二量体は、血液脳関門を越えるＡＢＰの効率的な移動を可能にする。したがって、ＣＳＦ及び脳実質におけるＡＢＰの結合を通じたＡβの有利な治療的除去が、本発明のコンストラクト及び方法において提供される。

ＡＢＰの脳への送達を可能にしてその有効性を改善するために、４０アミノ酸のＡＢＰポリペプチドが現在、Ｆｃ断片のＣ末端に融合されているのに対して、ＦＣ５などのＢＢＢ透過性単一ドメイン抗体（国際公開第２００２／０５７４４５号）は同一Ｆｃ断片のＮ末端に融合されて、二重特異性ＢＢＢ透過性治療薬を生じる（Farrington et al, 2014）。本発明の非限定的な実施形態では、Ｆｃ断片は、マウス（配列番号３９）又はヒト（配列番号４０；配列番４１）であってもよい。好ましい実施形態では、本発明のＦｃ断片は、エフェクター機能を減少させるように設計された（Shields et al., 2001）。例えば、Ｆｃ断片はｈＦｃ１ｘ７（配列番号４０）であってもよく、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質中のＦｃ断片は、有利には、融合タンパク質の二量体化を可能にして、血液脳関門を移動できる治療的に有効な融合分子（ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ二量体）を生じる。一実施形態では、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質は、ＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ１ｘ７－ＡＢＰ（６Ｇ）（配列番号４７）及びその二量体であってもよい。融合タンパク質は、配列番号４７又は配列番号５３中で具現化されるリンカー配列Ｌ、又は任意の適切なリンカー配列を含んでもよい。

本発明は、ベータアミロイド（βアミロイド）を結合する単離ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、配列を含んでもよい。
Ｘ_１ＴＦＸ_２ＴＸ_３Ｘ_４ＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＸ_５Ｘ_６ＳＴＱＬＸ_７ＳＸ_８ＶＸ_９ＮＩ（配列番号３１）
（式中、Ｘ_１＝Ｇ又はＡ、Ｘ_２＝Ｇ又はＶ、Ｘ_３＝Ｇ又はＡ、Ｘ_４＝Ｇ又はＡ、Ｘ_５＝Ｇ又はＶ、Ｘ_６＝Ｇ又はＶ、Ｘ_７＝Ｇ又はＶ、Ｘ_８＝Ｇ又はＡ、Ｘ_９＝Ｇ又はＡ）。

本発明のポリペプチド（ＡＢＰ及びＡＢＰ変異型）は、配列番号２７～配列番号３８又はそれと実質的に同一の配列からなる群から選択されてもよい。一実施形態では、提供されるポリペプチドは、配列番号３１と実質的に同等の配列を含むＡＢＰ変異型である。それと実質的に同等の配列は、融合分子に同等の安定性を付与してもよい。

本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて移動する抗体又はその断片と、βアミロイドに結合するポリペプチドとを含む化合物、すなわち融合タンパク質を提供する。本発明は、ＢＢＢ、βアミロイドに結合するポリペプチド、及びＦｃ含む、融合タンパク質を提供する。

当該技術分野で「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも称される「抗体」という用語は、本明細書の用法では重及び軽ポリペプチド鎖の対から構築されたタンパク質を指し；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭなどの様々なＩｇイソタイプが存在する。抗体が正しく折り畳まれると、それぞれの鎖は、より線形のポリペプチド配列によって連結された別個の球状ドメインに折り畳まれる。例えば、免疫グロブリン軽鎖が可変（Ｖ_Ｌ）及び定常（Ｃ_Ｌ）ドメインに折り畳まれる一方で、重鎖は可変（Ｖ_Ｈ）及び３つの定常（Ｃ_Ｈ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３）ドメインに折り畳まれる。重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）の相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。各ドメインは、当業者に良く知られている十分確立された構造を有する。

軽鎖及び重鎖の可変領域は標的抗原の結合に関与するため、抗体間で顕著な配列多様性を示し得る。定常領域は配列の多様性がより少なく、いくつかの天然タンパク質の結合に関与して重要な生化学的事象を誘発する。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがって、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列の可変性の大部分は、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）毎に３つ、合わせて６つの超可変領域で生じ；超可変領域は組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合と認識に寄与する。抗原に対する抗体の特異性及び親和性は、超可変領域の構造、並びにそれらのサイズ、形状、及びそれらが抗原に提示する表面の化学的性質によって決定される。超可変性の領域を同定するための様々なスキームが存在するが、最も一般的な２つがKabat及びChothia and Leskの領域である。Kabat et al（１９９１）は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの抗原結合領域での配列の可変性に基づいて、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義する。Chothia and Lesk（１９８７）は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの構造ループ領域の位置に基づいて、「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を定義する。これらの個々のスキームは、隣接し又は重複するＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義し、抗体分野の当業者はしばしば用語「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」を同義的に用いて、それらは本明細書でそのように使用されることもある。本明細書では、Kabatスキームに従ってＣＤＲ／ループが同定される。

本明細書で言及される「抗体断片」は、当該技術分野で公知の任意の適切な抗原結合抗体断片を含んでもよい。抗体断片は、天然に存在する抗体断片であってもよく、又は天然に存在する抗体の操作によって、又は組換え法を使用することによって、得られてもよい。例えば、抗体断片としては、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーで結合されたＶ_ＬとＶ_Ｈからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；単一のＶ_Ｌ又はＶ_Ｈから構成される断片）、及びこれらのいずれかの多価提供形態が挙げられるが、これに限定されるものではない。ここで記載されるような抗体断片は、断片の異なる部分を連結するために、リンカー配列、ジスルフィド結合、又はその他のタイプの共有結合を必要とすることもあり；当業者は、異なるタイプの断片の要件、及びそれらの構築のための様々なアプローチ及び様々なアプローチ（and various approaches and various approaches）に精通しているであろう。

非限定的な例では、抗体断片は、天然に存在する供給源に由来するｓｄＡｂであってもよい。ラクダ科動物由来の重鎖抗体（Hamers-Casterman et al, 1993）は軽鎖を欠いており、したがってその抗原結合部位は、Ｖ_ＨＨと称される１つのドメインからなる。ｓｄＡｂはサメでも観察されており、Ｖ_ＮＡＲと称される（Nuttall et al, 2003）。その他のｓｄＡｂは、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖配列に基づいて設計されてもよい（Jespers et al, 2004; To et al, 2005）。本明細書の用法では、「ｓｄＡｂ」という用語は、ファージディスプレイ又はその他の技術を通じて、任意の起源のＶ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_Ｌ、又はＶ_ＮＡＲリザバーから直接単離されたｓｄＡｂ；上記ｓｄＡｂに由来するｓｄＡｂ；組換え的に生成されたｓｄＡｂ；並びにヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化、ラクダ化、又は抗体工学のその他の方法による、このようなｓｄＡｂのさらなる修飾によって生成されたｓｄＡｂを含む。ｓｄＡｂの抗原結合機能及び特異性を維持する同族体、誘導体、又は断片もまた本発明に包含される。

ＳｄＡｂは、プロテアーゼ高い熱安定性、高い洗剤耐性、プロテアーゼに対する比較的高い耐性（Dumoulin et al, 2002）、及び高い生産収率（Arbabi-Ghahroudi et al, 1997）などの抗体分子にとって望ましい特性を有し；それらはまた、免疫ライブラリーからの単離によって（Li et al, 2009）、又は生体外親和性成熟によって（Davies & Riechmann, 1996）、親和性が非常に高くなるように設計され得る。非標準的なジスルフィド結合の導入などの、安定性を高めるためのさらなる修飾（Hussack et al, 2011a,b; Kim et al, 2012）もまたｓｄＡｂに導入されてもよい。

当業者は、単一ドメイン抗体の構造に精通しているであろう（例えば、Protein Data Bankの３ＤＷＴ、２Ｐ４２を参照されたい）。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンの折り畳みを維持する単一の免疫グロブリンドメインを含み；最も注目すべきは、３つのＣＤＲ／超可変ループのみが抗原結合部位を形成することである。しかし、当業者に理解されるように、抗原を結合するために全てのＣＤＲが必要とは限らないこともある。例えば、限定することは望まないが、ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つが、本発明のｓｄＡｂによる抗原の結合及び認識に寄与してもよい。ｓｄＡｂ又は可変ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称される。

本明細書に記載の抗体又はその断片は、血液脳関門を移動してもよい。脳は、血液脳関門（ＢＢＢ）として知られる特殊な内皮組織によって、身体体のその他の部分から分離されている。ＢＢＢの内皮細胞は密着接合部によって連結され、多くの治療用化合物が脳に侵入するのを効率的に妨げる。小胞輸送の低率に加えて、ＢＢＢの特定の特徴の１つは、酵素的関門の存在と、ＢＢＢの反管腔（脳）側におけるＰ－糖タンパク質をはじめとするＡＴＰ依存性輸送体の高レベルの発現であり（Gottesman and Pastani, 1993; Watanabe, 1995）、それは様々な分子を脳から血流に能動的に輸送する（Samuels, 1993）。小型（＜５００ダルトン）で疎水性（Pardridge, 1995）の分子のみが、ＢＢＢを容易に通過し得る。したがって、表面受容体に特異的に結合し、脳内皮細胞に内部移行し、リソソーム分解から逃れることによって血液脳関門を通過するトランスサイトーシスを受ける、上述したような抗体又はその断片の能力は、神経学の分野で有用である。血液脳関門を通過する抗体又はその断片は、脳組織への送達のために、治療薬などのその他の分子を輸送するために使用されてもよい。抗体又はその断片は、血液脳関門を移動することが当該技術分野で知られている、任意の適切な抗体又はその断片であってもよい。

本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を移動する抗体又はその断片を含む、化合物又は融合タンパク質を提供する。本発明の抗体又は断片は、例えば、国際公開第２００７／０３６０２１号に記載される膜貫通タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）、又はインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）エピトープ、又はそのイソ型、変異型、部分、若しくは断片に、結合してもよい。

本発明の化合物中の抗体又はその断片は、ＨＹＴＭＧ（配列番号１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号３）のＣＤＲ３配列；又は
ＥＹＰＳＮＦＹＡ（配列番号４）のＣＤＲ１配列、ＶＳＲＤＧＬＴＴ（配列番号５）のＣＤＲ２配列、ＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹ（配列番号６）のＣＤＲ３配列；又は
ＧＧＴＶＳＰＴＡ（配列番号７）のＣＤＲ１配列、ＩＴＷＳＲＧＴＴ（配列番号８）のＣＤＲ２配列、ＡＡＳＴＦＬＲＩＬＰＥＥＳＡＹＴＹ（配列番号９）のＣＤＲ３配列；又は
ＧＲＴＩＤＮＹＡ（配列番号１０）のＣＤＲ１配列、ＩＤＷＧＤＧＧＸ（式中、ＸはＡ又はＴ）（配列番号１１）のＣＤＲ２配列、ＡＭＡＲＱＳＲＶＮＬＤＶＡＲＹＤＹ（配列番号１２）のＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片
を含んでもよい。

前述したように、抗体又はその断片は、ラクダ科動物起源のｓｄＡｂであっても又はラクダ科動物Ｖ_ＨＨから誘導されてもよく、したがってラクダ科動物フレームワーク領域をベースとしてもよく；代案としては、上述したＣＤＲは、Ｖ_ＮＡＲ、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌフレームワーク領域上にグラフトされてもよい。さらに別の代案では、上述した超可変ループは、任意の起源（例えば、マウス又はヒト）のその他の各種抗体断片（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）のフレームワーク領域上に、又はその上にＣＤＲをグラフトし得る同様のサイズと性質のタンパク質タンパク質上に、グラフトされてもよい（例えば、Nicaise et al, 2004を参照されたい）。

本発明は、キメラ（又はキメラ化）、ベニア化、又はヒト化された抗体又はその断片をさらに包含する。キメラ抗体又はそれらの断片は、その中で（マウス又はラクダ科動物起源の）天然可変ドメインが、ヒト定常ドメインに連結されているコンストラクトである（Gonzales et al 2005を参照されたい ）。抗体のベニアリング又はリサーフェシングは、天然抗体又はその断片のフレームワーク領域の露出残基をヒトの対応物のアミノ酸残基で置き換えることを伴う（Padlan, 1991; Gonzales et al 2005）。抗体又は抗体断片のヒト化は、抗原結合能力又は特異性を失うことなく、配列中のアミノ酸をヒトコンセンサス配列中に見られるそのヒト対応物で置換することを含み；このアプローチは、抗体又はその断片がヒト対象に導入された場合、その免疫原性を減少させる。このプロセスでは、本明細書で定義される１つ又は複数のＣＤＲが、ヒト可変領域（Ｖ_Ｈ、又はＶ_Ｌ）に、その他のヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に、ヒト抗体断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）に、又はその上にＣＤＲを移植し得る同様のサイズと性質のヒトタンパク質に融合又は移植されてもよい（Nicaise et al, 2004）。このような場合、前記１つ又は複数の超可変ループの立体構造はおそらく保存され、ｓｄＡｂのその標的（すなわち、ＴＭＥＭ３０Ａなどの脳内皮細胞上のエピトープ、又はＩＧＦ１Ｒエピトープ）脳内皮細胞）に対する親和性及び特異性胞は、ほとんど影響を受けない。当業者に知られているように、結合及び特異性を維持するために、特定の天然アミノ酸残基をヒトフレームワークに組み込むことが必要であってもよい。ＣＤＲグラフトによるヒト化は、当該技術分野で公知であり（例えば、Tsurushita et al, 2005; Jones et al, 1986; Tempest et al, 1991; Riechmann et al, 1988; Queen et al, 1989； Gonzales et al, 2005におけるレビューを参照されたく、その中で引用される参考文献もまた参照されたい）、当業者は、このようなヒト化抗体又はその断片を調製する方法に十分精通しているであろう。

提供される抗体又はその断片は、ＦＣ５抗体のヒト化バージョン（国際公開第２００２／０５７４４５号に記載される）又はＩＧＦ１Ｒ抗体であってもよい。ＦＣ５（配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７のいずれか１つの配列を含む）、及びＩＧＦ１Ｒ（配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２６のいずれか１つの配列を含む）は、脳内皮細胞上の受容体エピトープの表面に結合し、引き続いて血液脳関門（ＢＢＢ）を移動する。ＦＣ５はまた、ＢＢＢを越える様々なサイズの分子を導く担体として機能することも示されている（例えば、国際公開第２０１１／１２７５８０号を参照されたい）。ＦＣ５の移動を媒介する抗原は、膜貫通ドメインタンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ；国際公開第２００７／０３６０２１号）として暫定的に同定され、脳内皮細胞の表面に豊富にある。

例えば、限定することは望まないが、抗体又はその断片は、以下の配列を含んでもよい。

式中、Ｘ_１＝Ｄ又はＥ，Ｘ_２＝Ａ又はＥ，Ｘ_３＝Ｆ又はＶ，Ｘ_４＝Ｅ又はＧ，Ｘ_５＝Ｒ又はＬ，Ｘ_６＝Ｆ又はＷ，Ｘ_７＝Ｌ又はＶ，又はそれと実質的に同一の配列；

式中、Ｘ_１はＥ又はＱ；Ｘ_２はＫ又はＱ；Ｘ_３はＶ又はＥ；Ｘ_４はＡ又はＰ；Ｘ_５はＶ又はＡ；Ｘ_６はＦ又はＶ；Ｘ_７はＥ又はＧ；Ｘ_８はＲ又はＬ；Ｘ_９はＦ又はＷ；Ｘ_１０はＡ又はＳ；Ｘ_１１はＭ又はＩ；Ｘ_１２はＡ又はＳ；Ｘ_１３はＶ又はＬ；Ｘ_１４はＤ又はＹ；Ｘ_１５はＶ又はＬ；Ｘ_１６はＫ又はＲ；及びＸ_１７はＱ又はＬ；又はそれと実質的に同一の配列；

式中、Ｘ_１はＥ又はＱ；Ｘ_２はＫ又はＱ；Ｘ_３はＶ又はＥ；Ｘ_４はＡ又はＰ；Ｘ_５はＡ又はＥ；Ｘ_６はＶ又はＡ；Ｘ_７はＶ又はＦ；Ｘ_８はＧ又はＥ；Ｘ_９はＬ又はＲ；Ｘ_１０はＦ又はＷ；Ｘ_１１はＧ又はＳ；Ｘ_１２はＶ又はＹ；Ｘ_１３はＤ又はＧ；Ｘ_１４はＮ又はＳ；Ｘ_１５はＡ又はＳ；Ｘ_１６はＬ又はＶ；Ｘ_１７はＫ又はＲ；Ｘ_１８はＡ又はＳ；及びＸ_１９はＬ又はＱ；又はそれと実質的に同一の配列；

式中、Ｘ_１はＥ又はＱ；Ｘ_２はＫ又はＱ；Ｘ_３はＶ又はＥ；Ｘ_４はＡ又はＰ；Ｘ_５はＶ又はＳ；Ｘ_６はＤ又はＧ；Ｘ_７はＬ又はＲ；Ｘ_８はＦ又はＷ；Ｘ_９はＡ又はＳ；Ｘ_１０はＡ又はＴ；Ｘ_１１はＡ又はＳ；Ｘ_１２はＧ又はＮ；Ｘ_１３はＭ又はＬ；Ｘ_１４はＮ又はＲ；Ｘ_１５はＥ又はＲ；Ｘ_１６はＰ又はＡ；Ｘ_１７はＳ又はＹ；及びＸ_１８はＱ又はＬ；又はそれと実質的に同一の配列。

より具体的には、どのようにも限定することは望まないが、抗体又はその断片は、

及びそれと実質的に同一の配列のいずれか１つから選択される配列を含んでもよい。抗体又はその断片は、単一ドメイン抗体であってもよい。

実質的に同一の配列は、１つ又は複数の保存的アミノ酸変異を含んでもよい。参照配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸変異が、参照配列と比較して、生理学的、化学的、物理化学的又は機能的特性に実質的な変化のない変異ペプチドをもたらしてもよいことは、当該技術分野で知られており；このような場合、参照配列と変異体配列は、「実質的に同一」のポリペプチドと見なされる。保存的アミノ酸置換は、本明細書において、同様の化学的性質（例えば、サイズ、電荷、又は極性）を有する別のアミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換として定義される。これらの保存的アミノ酸変異は、上に列挙されるＣＤＲ配列と、抗体又は断片のＣＤＲの全体的構造とを維持しながら、ｓｄＡｂのフレームワーク領域に生じてもよく；したがって、抗体の特異性と結合が維持される。

実質的に同等の配列は、１つ又は複数の保存的アミノ酸変異を含んでもよく；ここで、変異ペプチドは、ペプチドの安定性及び生物製造可能に関して実質的に同等である。実質的に同等とは、融合分子の安定性に関して同等であることを指してもよい；例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（還元及び非還元条件）で見られるような、分解産物の欠如、又は低分子量バンド。参照配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸変異が、参照配列と比較して、生理学的、化学的、物理化学的又は機能的特性に実質的な変化のない変異ペプチドをもたらしてもよいことは、当該技術分野で知られており；このような場合、参照配列と変異体配列は、「実質的に同等」のポリペプチドと見なされる。

非限定的な例では、保存的変異はアミノ酸置換であってもよい。このような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸を同一グループの別のアミノ酸で置換してもよい。「塩基性アミノ酸」という用語は、生理的ｐＨで典型的に正に荷電する、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）が挙げられる。「中性アミノ酸」という用語（「極性アミノ酸」とも）は、生理学的ｐＨで非荷電の側鎖を有する親水性アミノ酸を意味するが、それはその中で、２つの原子が共有する電子の対が、１つの原子によってより密接に保持される、少なくとも１つの結合を有する。極性アミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａβｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が挙げられる。「疎水性アミノ酸」という用語は、（「非極性アミノ酸」とも）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０より大きい疎水性示すアミノ酸を含むことが意図される。疎水性アミノ酸としては、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が挙げられる。「酸性アミノ酸」は、典型的には生理学的ｐＨで負に荷電する、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸としては、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が挙げられる。

２つの配列の類似性を評価するために、配列同一性が使用され；これは、２つの配列を残基位置間の最大の対応のために整列させた場合に、同一である残基のパーセントを計算することによって決定される。任意の既知の方法を使用して、配列同一性が計算されてもよく；例えば、コンピューターソフトウエアを使用して、配列同一性を計算できる。限定することは望まないが、配列同一性は、Swiss Institute of Bioinformaticsが管理するＮＣＢＩＢＬＡＳＴ２サービス（ca.expasy.org/tools/blast/）や、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、Ｂｌａｓｔ－Ｎ、若しくはＦＡＳＴＡ－Ｎなどのソフトウエア、又は当技術分野で知られているその他の適切なソフトウエアによって計算され得る。

本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも９０％同一であってもよく；別の例では、実質的に同一の配列は、アミノ酸レベルで本明細書に記載配列と、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、又はそれらの間の任意の百分率が同一であってもよい。重要なことには、実質的に同一の配列は、参照配列の活性及び特異性を保持している。非限定的な実施形態では、配列同一性の違いは、保存的アミノ酸変異に起因してもよい。非限定的な例では、本発明は、本明細書に記載の抗体と、少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一である配列を含む、抗体又はその断片を対象としてもよい。

本発明の化合物中の抗体又はその断片は、例えば、ヒトＦｃドメインをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｆｃドメインに連結されてもよい。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭをはじめとするが、これに限定されるものではない様々なクラスから、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２などをはじめとするが、これに限定されるものではない様々なサブクラスから、選択されてもよい。このアプローチでは、Ｆｃ遺伝子がｓｄＡｂ遺伝子と共にベクターに挿入されて、ｓｄＡｂ－Ｆｃ融合タンパク質が生成され（Bell et al, 2010; Iqbal et al, 2010）；融合タンパク質が組換え的に発現され、次に精製される。例えば、どのようにも限定することは望まないいが、多価提示形態は、Ｆｃドメインに連結されたＦＣ５－Ｈ３及びその変異体のキメラ形態を包含してもよい。このような抗体は、設計及び製造が容易であり、ｓｄＡｂの血清半減期を大幅に延長し得る（Bell et al., 2010）。

ここで記載されるような化合物のＦｃドメインは、当該技術分野で公知の任意の適切なＦｃ断片であってもよい。Ｆｃ断片は、任意の適切な起源に由来してもよく；例えば、Ｆｃはマウス又はヒト起源であってもよい。その他の好ましいＦｃ又はＦｃ断片の実施形態は、免疫学的エフェクター機能を調節、修飾又は抑制してもよい（Shields 2001）。その他の非常に好ましいＦｃ断片の実施形態は、脳からの融合ペプチドのクリアランスを媒介してもよい（Caram-Salas N, 2011）。特定の非限定的な例では、Ｆｃは、マウスＦｃ２ａ断片又はヒトＦｃ１断片であってもよい（Bell et al, 2010; Iqbal et al, 2010）。特定の非限定的な例では、多量体化コンストラクトは、本明細書に記載の単離又は精製された抗体又は断片と、配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１の配列のＦｃを含み得る。したがって、本明細書で提供されるＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質は、Ｆｃを介して二量体を形成し、二価の二機能性ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰを提供してもよい。

抗体又はその断片を含む本発明の化合物は、βアミロイドに結合するポリペプチドに連結される。リンカーは、任意のポリペプチドであってもよく、適切な長さの中性又は親水性アミノ酸を含む。非限定的な例では、長さは好ましくは１２アミノ酸未満であり、ポリペプチドはＧＧＧＳＧＧＧＳである。正しい配向のアミド又はエステル結合などの非ペプチド性形態を使用する、その他の化学リンカーが用いられてもよい。例えば、配列番号５３は、任意の適切なリンカーを含む融合タンパク質を提供し、本発明の任意の融合タンパク質、すなわち、配列番号４２～５２は、配列番５３で例示されるような任意の適切なリンカーを含んでもよい。βアミロイド（Ａβ）に結合するポリペプチドは、ＡＤ病理に関与するＡβ_１～４２凝集体などの病理学的に関連したβアミロイドに結合してもよく；ポリペプチドは、高親和性（ｎＭ範囲）でＡβに結合し、生体外で細胞タンパク質へのＡβ結合及びＡβ_１～４２誘導細胞毒性を阻害してもよく、生体外でＡＤ遺伝子組換えマウス脳内及びＡＤ患者由来の脳内のアミロイド沈着物に結合する。本発明の化合物中のポリペプチドは、逆方向ペプチドＡβ_４２～１に結合しない。

本明細書で提供される化合物では、βアミロイドに結合するポリペプチドは、（配列番号２７）；（配列番号２８）；（配列番号２９）；（配列番号３０）；（配列番号３１）；（配列番号３２）；（配列番号３３）；（配列番号３４）；（配列番号３５）；（配列番号３６）；（配列番号３７）；（配列番号３８）；及びそれと実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。「実質的に同一の」配列は、上記のとおりである。

したがって、本発明は、βアミロイドに結合するポリペプチド及びその変異型（すなわち、ＡＢＰ及びＡＢＰ変異型）を提供する。ＡＢＰ変異型は、例えば、配列番号３１を有する配列を含んでもよく、提供されるＡＢＰ変異型は、配列番号３１～配列番号３８又はそれと実質的に同等の配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。

したがって、ＡＢＰの詳細な生物物理学的特徴に基づいた、特定の系統的及び方法論的修飾を含む、ＡＢＰポリペプチド配列が提供される。ＡＢＰポリペプチドに対する特定のそして方法論的に向けられた修飾は、配列番号３１に記載されるような、本発明の新規であり自明でないＡＢＰ変異型を含む。

本明細書で提供されるペプチドは、配列番号２７～配列番号３８、及びそれと実質的に同等の配列からなる群から選択されてもよい配列を含むＡＢＰを含んでもよい。

本明細書で提供されるペプチドは、例えば、配列番号３２～配列番号３８、又は配列番号３１の同等の任意の配列のいずれか１つから選択されてもよい配列を含むＡＢＰなどのＡＢＰ変異型を含んでもよい。本明細書で提供されるＡＢＰ又はＡＢＰ変異型を含むコンストラクトは、化合物の安定性及び生物製造可能の有利な改善を示す（図１４に見られるように）。

本明細書で提供される融合タンパク質及び化合物は、改善された治療有効性を示す。より具体的には、提供される化合物は、増強された生物製造可能性のための安定なＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合分子の生成を可能にする、特に修飾されたＡＢＰを含む（ヒト哺乳類発現系での産生）。本明細書で提供されるＡＢＰへの特定の修飾は、ＡＢＰの詳細な生物物理学的特性に基づく系統的及び方法論的な修飾であった。本明細書で提供される修飾ＡＢＰは、例えば、配列番号３２～配列番号３８、及びそれと実質的に同等の配列番号３１などの配列から選択される配列を含んでもよい。本明細書で提供される化合物は、有利には、改善された安定性及び生物製造可能性、並びに脳内のＡβレベルを減少させる有効性の最も顕著な増加を示し；本発明のコンストラクトによる処置の２４時間以内に、５０％のアミロイドの減少が観察された。

本明細書では「コンジュゲートされた」とも称される「連結された」という用語は、２つの部分が、直接又は間接的に（例えば、リンカーを介して）、共有結合的に又は非共有結合的に（例えば、吸着、イオン性相互作用）連結することを意味する。共有結合は、化学的架橋反応を通じて、又は細菌、酵母、哺乳類細胞ベースのシステムなどのペプチド発現系と組み合わされた組換えＤＮＡ方法論を使用した融合を通じて、達成されてもよい。抗体又はその断片をＡβ又はＦｃに結合するポリペプチドにコンジュゲートさせる場合、適切なリンカーが使用されてもよい。例えば、適切なリンカーは、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰタンパク質融合物の構成要素のコンジュゲーションを可能にする、適切な長さの中性又は親水性アミノ酸を含む、任意のポリペプチドであってもよい。例えば、融合タンパク質の構成要素（例えば、配列番号４２～５２）をそれに応じて結合させるリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ又は（ＧＧＧＳ）_ｎリンカーを強調表示したものに限定されず、任意の適切なリンカーであってもよい（すなわち、配列番号５３の非限定的な融合タンパク質のように）。非限定的な例では、長さは好ましくは１２アミノ酸未満であり、ポリペプチドはＧＧＧＳＧＧＧＳであってもよい。正しい配向のアミド又はエステル結合などの非ペプチド性形態を使用する、その他の化学リンカーが用いられてもよい。本技術分野の当業者は、抗体又はその断片をポリペプチドに連結するリンカー又は方法を良く承知しているであろう。抗体又はその断片をポリペプチド又はＦｃに連結させる方法は、当業者に良く知られている。

本明細書で提供される化合物は、抗体又はその断片、βアミロイドに結合するポリペプチド、及びＦｃ断片を含み、連結されてコンストラクトを提供し（本明細書では化合物又は融合分子とも称される）、コンストラクトは融合タンパク質及びその二量体を含む。抗体又はその断片は、Ｆｃ断片又は適切なリンカーを介してβアミロイドに結合する、ポリペプチドに連結されてもよい。

抗体又はその断片は、配列番号１４、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、及びそれと実質的に同一の配列のいずれか１つから選択される配列を含む。抗体又はその断片は、血液脳関門を移動する。抗体又は断片はｓｄＡｂであってもよく；ｓｄＡｂはヒト化されていてもよい。

βアミロイドに結合するポリペプチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及びそれと実質的に同一の配列、及び好ましくは配列番号３１を含む配列からなる群から選択される配列を含む。

Ｆｃ断片は、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１のいずれか１つ、及びそれと実質的に同一の配列から選択される配列を含む。本発明のＦｃ断片は、エフェクター機能が減弱された任意の適切なＦｃ断片であってもよい。融合タンパク質中で提供されるＦｃ断片は、二量体構造の形成を可能にし；例えば、配列番号４２～配列番号５３からなる群から選択される配列を含む一本鎖融合タンパク質は、その中のＦｃ断片を介してコンジュゲートされた二量体構造を形成してもよい。

したがって、本発明の化合物又はコンストラクトは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列５３及びそれと実質的に同一の配列、又はその二量体構造からなる群から選択される配列を含んでもよい。

本発明は、ＢＢＢ通過単一ドメイン抗体（ＢＢＢ）、Ｆｃ断片（Ｆｃ）、及びアミロイド結合ペプチド（ＡＢＰ）を含む融合タンパク質を提供し、各部分は連結されて、図１に示される融合分子を提供してもよい。例えば、本発明の非限定的な実施形態では、ＢＢＢはＦｃのＮ末端に連結され、ＡＢＰはＦｃ断片のＣ末端に連結されてもよい（図１Ａ）。図１は、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰを含む一本鎖融合タンパク質の対応する二量体を示す。３つの構成要素（すなわち、ＢＢＢ、Ｆｃ、及びＡＢＰ）は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに示されるように、様々な構成で描写される。本発明の化合物の特定の非限定的な例では、βアミロイドに結合するポリペプチドは、配列番号３１の配列を含んでもよい。一実施形態では、ＡＢＰ変異型は、本明細書でＡＢＰ（６Ｇ）と称されるＧＴＦＧＴＧＧＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＧＧＳＴＱＬＫＳＲＶＫＮＩ（配列番号３６）の配列及びそれと実質的に同等の配列を含む。

抗体又はその断片は、
本明細書でＦＣ５－Ｈ３と称される、

の配列を含んでもよい。

抗体又はその断片は、
本明細書ではｈＦｃ１Ｘ７とも称される、

などのヒトＦｃの配列をさらに含んでなってもよい。

どのようにも限定することは望まないが、本発明の化合物は、
本明細書ではＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（６Ｇ）とも称される、

の配列を含んでもよい。

上記の表では、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質コンストラクトはまた、リンカー（Ｌ）も含んでもよいことに留意されたく、式中、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトは、本発明のＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ融合タンパク質であり、式中、Ｌは、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、又は配列番号５３のコンセンサスリンカー配列に例示されるような任意の適切なリンカーであってもよい。

本明細書ではＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ１Ｘ７－Ｌ－ＡＢＰ（６Ｇ）とも称される、配列番号４７の融合タンパク質中で提供される本発明の化合物は、その中に含まれる各構成要素のバリエーションを含んでもよく、例えば、配列番号４６に記載されように、ＡＢＰはＡＢＰ（ＧＧ－Ｇ）であってもよい。その中で提供されるリンカー配列（例えば、配列番号４２～配列番号５３中で強調表示される）は、ＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質の連結を可能にする任意のリンカーであってもよい。本発明の化合物はまた、組換え抗体又はその断片の発現、検出又は精製を補助する追加の配列も含んでもよい。当業者に知られている任意のこのような配列又はタグが、使用されてもよい。例えば、限定することは望まないが、抗体又はその断片は、標的化又はシグナル配列（例えば、ｏｍｐＡであるが、これに限定されるものではない）、検出／精製タグ（例えば、ｃ－Ｍｙｃ、Ｈｉｓ_５、又はＨｉｓ_６であるが、これに限定されるものではない）、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。別の例では、追加の配列は、Cronan et al（国際公開第９５／０４０６９号）又はVoges et al（国際公開第／２００４／０７６６７０号）によって記載されるものなどのビオチン認識部位であってもよい。これもまた当業者に知られているように、リンカー配列は、追加の配列又はタグと組み合わせて使用されてもよく、又は検出／精製タグとして機能してもよい。

本発明はまた、本明細書に記載されるような化合物をコードする核酸配列も包含する。遺伝コードの縮重を考慮すると、いくつかのヌクレオチド配列は、当業者によって容易に理解されるように、ポリペプチドをコードする効果を有するであろう。核酸配列は、様々な微生物における発現のためにコドン最適化されてもよい。本発明はまた、ここで記載されるような核酸を含むベクターも包含する。さらに、本発明は、記載されるような核酸及び／又はベクターを含む細胞を包含する。

本発明は、本明細書に記載されるような１つ又は２つ以上の化合物と、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、又は担体とを含む組成物をさらに包含する。組成物はまた、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、又は担体も含んでもよい。希釈剤、賦形剤、又は担体は、当該技術分野で公知の任意の適切な希釈剤、賦形剤、又は担体であってもよく、組成物のその他の成分、組成物の送達方法と適合性でなくてはならず、組成物の受容者にとって有害でない。組成物は、任意の適切な形態であってもよく；例えば、組成物は、懸濁形態又は粉末形態で提供されてもよい（例えば、限定されるものではないが、凍結乾燥又は封入される）。例えば、限定することは望まないが、組成物が懸濁形態で提供される場合、担体は、水、生理食塩水、適切な緩衝液、又は添加剤を含んで、溶解性及び／又は安定性が改善されてもよく；懸濁液を作成するための再構成は、抗体又はその断片の生存度を保証するために、適切なｐＨの緩衝液中で実施される。乾燥粉末はまた、安定性を改善するための添加剤、及び／又は嵩／体積を増加させるための担体も含んでもよく；例えば、限定することは望まないが、乾燥粉末組成物は、ショ糖又はトレハロースを含んでもよい。本化合物を含む適切な組成物を調製することは、当業者の能力の範囲内であろう。

本発明の化合物又は組成物がそれを必要とする対象に投与される、アルツハイマー病を治療する方法もまた提供される。静脈内、腹腔内、非経口、頭蓋内、筋肉内、皮下、口腔、又は経鼻をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の適切な投与経路が使用されてもよい。最適な投与量及び投与経路は、一般に実験的に決定される。

増加したβアミロイドレベルを有する対照の脳脊髄液（ＣＳＦ）中及び脳実質内の毒性βアミロイドレベルを減少させる方法が提供される。より具体的には、対照の脳脊髄液（ＣＳＦ）中及び脳実質内の毒性βアミロイドレベルは、本発明の組成物の単回非経口投与の２４時間という早い時期に減少する。

本発明を以下の実施例でさらに例証する。しかし、これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明の範囲をどのようにも限定するためには使用されないものと理解される。

実施例１：ＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ融合分子の構築
ａ）ＦＣ５ ｓｄＡｂ（配列番号１４）、マウスＦｃ（配列番号３９）、及びＡＢＰ（配列番号３０）、
ｂ）ＦＣ５（ＦＣ５－Ｈ３；配列番号１７）のヒト化バージョン、ヒトＦｃ（配列番号４０）、及びＡＢＰ（配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８）、
ｃ）ＩＧＦ１Ｒ－５ ｓｄＡｂ（ＩＧＦ１Ｒ－５－Ｈ２；配列番号２６）のヒト化バージョン、マウスＦｃ（配列番号３９）、及びＡＢＰ（配列番号３０）
を含む融合分子を調製した。融合タンパク質コンストラクトの概略的を図１に示す。融合タンパク質は、ＢＢＢ通過単一ドメイン抗体、Ｆｃ断片、及びアミロイド結合ペプチドを含む。

実施例２：ＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ融合分子の生成
実施例１に記載されるコンストラクトＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ及びヒト化ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰをＣＨＯ細胞内で発現させ、発現化合物をMabSelect Sureアフィニティーカラム上で精製した。

実施例１に記載されるようにＡＢＰ変異型にそれらのＣ末端で融合された、マウス又はヒトＦｃ抗体断片Ｎ末端に融合された、ＦＣ５変異型ＦＣ５及びＦＣ５－Ｈ３Ｖ_ＨＨを含むコンストラクトを調製し、発現させ精製した。

ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ変異型ＤＮＡ（ＤＮＡ合成供給業者）は、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５にクローン化させた（Durocher 2002）。プラスミドベクター（８０％）、ｐＴＴ－ＡＫＴｄｄ（１５％、タンパク質キナーゼＢの活性化変異体）、及びｐＴＴｏ－ＧＦＰ（５％、形質移入効率モニターするため）と、ＰＥＩ ＭＡＸ（Polysciences、カタログ番号２４７６５）とを混合することによって、細胞１リットルあたり１ｍｇのＤＮＡの最終濃度のためのポリプレックスを事前に形成した。ＰＥＩ：ＤＮＡ比は４：１（Ｗ：Ｗ）であり、どちらも補給Ｆ１７培地（４ｍＭグルタミン、０．１％Kolliphor）中で調製した。細胞培養物への添加前に、混合物を室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡ／ＰＥＩポリプレックス（polyplexe）の体積は、最終培養体積の１０％に相当する（すなわち（e.i.）培養物１Ｌ当たり１００ｍｌ）。形質移入の２４時間後に、１％の最終濃度のトリプトンＮ１（４０％ｗ／ｖ溶液、Organotechnie）と、０．５ｍＭバルプロ酸（２００ｍＭ溶液）とを培養物に供給した。細胞密度及び生存率、並びに生産力価（１Ｌ当たりのＦｃのｍｇ）についてを形質移入／生成をモニターし、細胞生存率が最低６５％に達したら、遠心分離によって回収した（上清）。清澄化した細胞培養培地は、５ｍｌのプロテインＡ MabSelect Sure樹脂（GE Healthcare）を充填したカラムに装入する前に、０．４５μｍメンブレンを通して濾過した。装入後、カラムを５容量のリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．１（ＰＢＳ）で洗浄し、抗体を１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０で溶出した。溶出された抗体を含む画分を貯留し、ＰＢＳで平衡化された脱塩Econo-Pacカラム（BioRad）に装入することによって、緩衝液交換を実施した。次に、脱塩抗体をMillex GP（Millipore）フィルターユニット（０．２２μｍ）に通過させて滅菌濾過し、アリコートにした。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＡβオーバーレイ：Laemmliサンプル緩衝液中で調製されたタンパク質サンプル（非還元ゲルでは７０℃、還元ゲルでは９５°Ｃで加熱した、ｓＭＥ又はＤＴＴ）は、１２％Ｔｒｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅゲル又はＴＧＸ４－１５％ゲル（BioRad）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ゲルをクマシーブルーで染色するか、或いはウエスタンブロット／Ａβオーバーレイアッセイのためにタンパク質をＰＶＤＦ又はニトロセルロース膜に転写した。疫ブロットを脱脂粉乳でブロックし、次に室温で４５分間Ａβ製剤（５０～１００ｎＭ）に曝露させ、前述のように６Ｅ１０抗体を使用して結合Ａβを検出した（Chakravarthy et al. 2013）。

ＥＬＩＳＡ：Ａβ結合アッセイをChakravarthy et al（２０１３）によって記載されるように実施した。Maxisorp ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc）は、ＰＢＳ中４°Ｃで一晩、遊離ＡＢＰ（合成）又は様々なＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトで被覆した。ウェルをＴＢＳ－Ｔ中の１％ＢＳＡで３０分間ブロックし、次にＴＢＳ－Ｔ中の単量体及び二量体（Ｍｏ）又はそれを越えるオリゴマー（Ｏｌｉ）のいずれかで主に構成されるＡβ_１－４２調製物と共に、穏やかに撹拌しながら室温で４５分間インキュベートした。３回のＴＢＳ－Ｔ洗浄に続いて、ＨＲＰコンジュゲートＡβ特異的抗体（６Ｅ１０又は４Ｇ８）をＴＢＳ－Ｔ中にてＲＴで９０分間インキュベートすることによって、結合したＡβを検出した。結合抗体は、SureBlue（商標）TMB試薬キット（KPL）を用いて、製造会社の使用説明書に従って４５０ｎｍにおける比色分析によって検出した。

組換え融合分子の産生の成功を示唆する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮＲ－非還元及びＲ－還元条件）によるＦＣ５融合分子の分離後のクマシーブルー染色ゲルを図２Ａに示す。ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット（ＷＢ）オーバーレイアッセイによる、遊離ＡＢＰ及びＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ融合タンパク質のＡβオリゴマー結合を図２Ｂ及びＣに示す。Chakravarthy et al., 2013に記載されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のサンプルを４℃で一晩コーティングし、Ａβ製剤に曝露させることによって、ＥＬＩＳＡプレート上に遊離又は融合ＡＢＰを固定した。結合ＡβをＡβ特異的抗体６Ｅ１０又は４Ｇ８を用いて検出した（Chakravarthy et al, 2013）。融合分子もまたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ紙に転写してＡβオリゴマーに曝露させた。結合Ａβを上記のように特異的抗体で検出した。結果は、ＡＢＰがＢＢＢ担体との融合後に、Ａβオリゴマー結合能力を維持したことを示す。Ｍｏ：Ａβモノマー；Ｏｌｉ：Ａβオリゴマー

実施例３：生体外でのＡＤ－Ｔｇマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、Jackson Lab）のＡβ沈着物へのＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ融合分子の結合
実施例２で生成したコンストラクトを免疫組織蛍光アッセイに供し、ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ融合分子が、記載されるようなマウス脳の天然に産生されたアミロイド沈着に結合する能力を維持しているかどうかを評価した（Chakravarthy et al., 2014）。野生型（Ｗｔ）及びＡＤ遺伝子組換え（ＡＤ－Ｔｇ）マウス由来の凍結半頭脳をＯＣＴに埋め込み、Jung CM 3000クリオスタットを使用して１０μｍ切片を調製し、－８０℃で保存した。組織切片を解凍し、かみそりの刃でＯＣＴを切片から剥離させ、Dakoタンパク質ブロッキング試薬と共に室温で３０分間インキュベートした。ブロッキング剤を除去し、切片をＴＢＳ中で穏やかに洗浄した。抗体希釈液中のＩＲ８００標識ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ（５．０μｇ／μｌ溶液の１：２５０希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、切片をＴＢＳで２回洗浄し、ミリＱ水ですすぎ、過剰なすすぎ溶液を除去し、切片にDako Fluorescent Mounting Mediaと共にカバーグラスを載せた。蛍光顕微鏡下で視覚化された切片（図３）。選択的結合（明るい点）は、Ａβ沈着物を産生するＡＤ－Ｔｇマウスの脳切片で見られ、アミロイド沈着物を産生しないＷｔマウスの脳切片では見られず、ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトのＡＢＰが、ＡＤ－Ｔｇマウス脳内で天然に産生されたＡβ凝集体に結合する能力を維持することが示唆された。提供されるＢＢＢ－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトにおいて、ＢＢＢはＦＣ５又は抗ＩＧＦ１Ｒ抗体であってもよい。

実施例４：生体外におけるＦＣ５－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ融合分子のＢＢＢ移動
生体外ラット及びヒト由来のＢＢＢモデルで、ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ融合分子のＢＢＢ通過を評価した（図４）。Ｐａｐｐ測定のための単一時点を使用して、ＢＢＢを通過する融合分子を生体外ＢＢＢ透過性アッセイでスクリーニングした。変異型の定量化をＭＲＭ－ＩＬＩＳによって実施した（図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃ）。

ＳＶ４０不死化成体ラット脳（ＳＶ－ＡＲＢＥＣ）及びヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）を使用して、記載されるような生体外血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを作製した（Garberg et al., 2005; Haqqani et al., 2013）。Ｓｖ－ＡＲＢＥＣ（８０，０００細胞／メンブレン）を１ｍｌの増殖培地中の０．１ｍｇ／ｍＬラット尾コラーゲンＩ型被覆組織培養インサート（孔サイズ１μｍ；表面積０．９ｃｍ^２、Falcon）に播種した。インサートアセンブリーの下部チャンバーは、１：１（ｖ／ｖ）比で不死化新生児ラット星状細胞－馴化培地が添加された、２ｍｌの増殖培を含んだ。等モル量（５．６μＭ）の陽性（ＦＣ５コンストラクト）又は陰性対照（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）毒素Ａ結合Ｖ_ＨＨ；及びＥＧ２、ＥＧＦＲ結合Ｖ_ＨＨ）と、実施例１からのＦｃ－ＡＢＰとを、ラット又はヒト生体外ＢＢＢモデルを通過する能力について試験した。等モル量のｓｄＡｂのＢＢＢ管腔側への曝露に続いて、反管腔側から１５、３０、及び６０分後にサンプルを採取した。次に、各サンプルのｓｄＡｂ含有量を質量分析（多重反応モニタリング－イソタイプ標識内標準；ＭＲＭ－ＩＬＩＳ）で定量化した（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。

ＭＲＭ－ＩＬＩＳ：方法は、全てHaqqani et al.（２０１３）に記載されるとおりである。簡潔に述べると、Ｖ_ＨＨのＳＲＭ（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイとしても知られる、選択された反応モニタリング）アッセイを開発するために、データ依存収集を使用して全てのイオン化可能（ionizible）ペプチドを識別するｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、各Ｖ_ＨＨを最初に分析した。各ペプチドについて、３～５個の最も強力な断片イオンを選択した。最初のＳＲＭアッセイを開発し、アトモル量の消化物（約１００～３００ａｍｏｌ）でこれらの断片をモニターした。少量で再現可能な強度比を示した（すなわち、より高い量と比較してピアソンｒ２≧０．９５を有した）断片は安定していると見なされ、最終ＳＲＭアッセイのために選択した。アッセイをさらに最適化するために、ｍ／ｚ（質量電荷比）と溶出時間が近いペプチドを選択しないように注意して、各ペプチドの溶出時間も含めた。

細胞培地又は体液（血清又は脳脊髄液（ＣＳＦ））中のＶ_ＨＨの典型的な多重ＳＲＭ分析は、既知量のＩＬＩＳ（０．１～１０ｎＭ）のスパイクを伴い、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳシステムへの１００～４００ｎｇのＣＳＦ又は培養培地タンパク質（０．３～１μＬ）又は約５０～１００ｎｇの血清タンパク質（１～３ナノリットル）の注入がそれに続いた。規定される標的の溶出時間に、各標的ペプチドイオンの前駆体ｍ／ｚをイオントラップで選択し（残りの無関係のイオンは廃棄した）、衝突誘起解離（ＣＩＤ）断片化と、検出器によるモニターのためのイオントラップ内の所望の断片イオンのみの選択とがそれに続いた。定量分析のために、ＬＴＱ（ThermoFisher）によって生成された生ファイルを標準的な質量分析データ形式ｍｚＸＭＬに変換し、ＭａｔｃｈＲｘソフトウエアの修正バージョンである、Ｑ－ＭＲＭ（Quantitative-MRM; Haqqani et al. 2013を参照されたい）と称される自社内ソフトウエアを使用して、強度を抽出した。各Ｖ_ＨＨについて、溶出時間全体にわたって、断片ｍ／ｚの０．２５Ｄａ以内の合わせた強度からなる、断片イオン毎の抽出イオンクロマトグラムを作成した。各断片の最終強度値を得るために、予想される保持時間の０．５分以内の全ての強度を合計した。Ｖ_ＨＨは、そのペプチドの少なくとも１つの断片が予想される強度比を示した場合に、サンプル中で検出可能と定義され、すなわち、最終強度値が、その対応する純粋なＶ_ＨＨの最終強度値と比較して、ｒ≧０．９５及びｐ＜０．０５の強いピアソン相関を示した。

Ｖ_ＨＨ（培地、血清、ＣＳＦ）の混合物を含むサンプルは、前述のように還元、アルキル化、及びトリプシン消化された（Haqqani et al., 2012; Gergov et al., 2003）。消化物（トリプシンペプチド）を酢酸（最終濃度５％）で酸性化し、ＬＴＱ ＸＬ ＥＴＤ又はＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＴＤ質量分析計（ThermoFisher, Waltham, MA）に接続した逆相nanoAcquity UPLC（Waters, Milford, MA）で分析した。サンプルの所望のアリコートを３００μｍ内径×０．５ｍｍ ３μｍ PepMaps Ｃ１８トラップ（ThermoFisher）に注入し負荷した後、４００ｎＬ／ｍｉｎの流量で、１分間で０％から２０％、１６分間で２０％から４６％、１分間で４６％から９５％のアセトニトリル（０．１％ギ酸中）への勾配を使用して、１００μｍ内径×１０ｃｍ １．７μｍ BEH130C18 ｎａｎｏＬＣカラム（Waters）上に溶出させた。ペプチドイオンの断片化のためのＣＩＤを使用して、ＭＳ／ＭＳ及びＳＲＭ分析のためのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって、溶出したペプチドを質量分光計内でイオン化させた。ＣＩＤは、衝突ガスとしてヘリウムを用いて、３５％の正規化された衝突エネルギー及び３０ｍｓの活性化時間で実行した。線形イオントラップへのイオン注入時間は、６×１０^３の自動ゲイン制御（ＡＧＣ）目標値及び２００ｍｓの最大蓄積時間を使用して、機器によって調節した。

見かけの透過係数の判定：定量化された値は直接プロットされ得て、又はＰ_ａｐｐ（見かけの浸透係数）値を所定の式［Ｑｒ／ｄｔ＝時間に対する受け手区画内の累積量；Ａ＝細胞単層の面積；Ｃ０＝投与溶液の初期濃度］を用いて判定され、プロットされ得る。Ｐ_ａｐｐ値が一般に使用されて、ＢＢＢを通過する分子の能力が判定される。Ｐ_ａｐｐ値は、脳内皮単層を越える化合物の比透過性の尺度である。

ＦＣ５コンストラクトの検出及び定量に使用される特定のペプチドを以下の表１に示す。

サンプルはまた、実施例２に記載されるように、Ｆｃ特異的抗体を使用してウエスタンブロット分析によっても分析した（図４Ｄ、三連で実施）。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰがＦＣ５－ｍＦｃと同程度に効果的に血液脳関門を通過したのに対して、ＢＢＢ担体部分ＦＣ５のないＦｃ－ＡＢＰは、脳内皮細胞単層を横断しなかった。予測されたように、対照の単一ドメイン抗体ＥＧ２及びＡ２０．１、又は対照の完全ＩｇＧ（抗ＨＥＬ）は、血液脳関門を通過しなかった。ヒト化ＦＣ５－Ｈ３－ｈＦｃ－ＡＢＰ融合タンパク質でも、同様の結果が得られた（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＩＧＦ１Ｒ５－ｍＦｃ－ＡＢＰＡＢＰでも、同様の結果が得られた（図１７Ａ及びＢ）。

実施例５：生体内におけるＦＣ５－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰ融合分子のＢＢＢ移動及び薬物動態学
実施例２のコンストラクトが、血液脳関門から脳、特に脳脊髄液（ＣＳＦ）に移動する能力を生体内で評価し、並びＣＳＦ及び血清中のコンストラクトの存在を定量化した。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰを示された用量（２．５、６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇ）で尾静脈を通じてラットに静脈内投与した。血清及びＣＳＦを連続的に採取した。ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰレベルをｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法を用いて定量化した。

大槽ＣＳＦの複数の試料採取に使用される技術は、以前記載された方法の修正によってＮＲＣで開発された（Huang et al.,1995; Kornhuber et al., 1986）。全ての動物は、Charles River Laboratories International, Inc. （Wilmington, MA, USA）から購入した。動物は、温度２４°Ｃ、相対湿度５０±５％で１２時間の明暗サイクルで３匹ずつのグループに収容し、食物と水を自由摂取させた。全て動物の処置は、ＮＲＣの動物管理委員会によって承認され、カナダ動物管理ガイドラインに準拠した。８～１０週齢のオスウィスターラット（体重範囲、２３０～２５０ｇ）を全ての研究で使用した。

全ての実験で、試験抗体（ＦＣ５ Ｆｃ融合物）を等モル投与量（７ｍｇ／ｋｇ）で尾静脈に静脈内投与した。ＣＳＦのサンプル採取は、９６時間にわたる５回までの穿刺によって大槽から行った。サンプル採取のために、ラットを３％イソフルランで短時間軽く麻酔し、定位固定枠に入れ、頭部を４５°の角度で下向きに回転させた。後頭稜から開始して、耳の間に２ｃｍの正中切開を行い、筋肉を分離して大槽を覆う硬膜を露出させた。１ｍｌシリンジに管材料を取り付けた、２７Ｇバタフライニードル（QiuckMedical、カタログ番号ＳＶ２７ＥＬ）を使用して硬膜を穿刺し、約２０μｌのＣＳＦを吸引した。次に、ＣＳＦをサンプルガラスバイアル（Waters、カタログ番号１８６０００３８４ｃ）に移し、さらなる分析まで－８０°Ｃの冷凍庫に入れた。

血液サンプルは、市販のチューブで尾静脈から採取した（BD microtainer、カタログ番号３６５９５６）。室温で１５～３０分間凝固させた後、１１００ｒｃｆ（３４２２ｒｐｍ）で１０分間遠心分離して凝血塊を除去し；次に、血清を清浄なガラスバイアル（Waters、カタログ番号１８６０００３８４ｃ）に移し、ドライアイスで凍結させ、さらなる分析まで－８０°Ｃで保存した。採取の終了時に、ラットを心臓穿刺によって殺処分した。血液及びＣＳＦ ＰＫ分析は、WinLin 6.0プログラムを使用して実施した。

血清及びＣＳＦサンプルは、表１に示されるペプチドシグネチャーを使用して、実施例４に記載される質量分析及びｎａｎｏＬＣ－ＳＲＭベースの定量によって分析した。

ＣＳＦ採取は、ＣＳＦが血液で容易に汚染され得る繊細な手順である。Ｖ_ＨＨの量は、ＣＳＦ中では血中よりもはるかに少ない（＜０．１％）と予想されるために、わずかな血液の混入でも個々のＣＳＦサンプルの価値を著しく損ない得る。したがって、血液で汚染されたＣＳＦサンプルについて厳密な除外基準を開発する必要があった。血液とＣＳＦのアルブミン比を評価するために、血漿及びＣＳＦ中のアルブミンレベルを定量化するためのｎａｎｏＬＣ－ＳＲＭ法が開発された。多重アッセイにおいて、その他のペプチドピークとの干渉を最小限に抑えるために、アルブミンペプチドＡＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＡＡＲをその独自の保持時間及びｍ／ｚ値（Mol Pharm）に基づいて選択した。ペプチドの強度は、上述したようなＳＲＭを使用して、ＣＳＦ及び血漿サンプルの双方で定量化した。アルブミン比は、各ラットについて次のように計算した：
アルブミン比＝分析された血漿のｎＬあたりの強度／分析されたＣＳＦのｎＬあたりの強度
１５００以下の比率は、血液汚染と見なされた。

図５に示されように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは時間及び用量依存様式でＣＳＦ中に出現し、Ｃｍａｘは１２～２４時間であり、生体内におけるＦＣ５による脳及びＣＳＦ区画内へのＡＢＰの輸送が示唆された（Ａ）。血清ＰＫパラメーター（図５及び以下の表２）は、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのα及びβ半減期が、完全ＩｇＧ（ラットＦｃを含むベンチマーク抗体）の半減期と同様であり、Ｆｃを含まないＡＢＰ又はＦＣ５又はＦＣ５－ＡＢＰよりもかなり高いことを示す。

実施例６：非ＢＰ歯類の大型動物の脳へのＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトの送達
ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰの血清及びＣＳＦ ＰＫプロファイルをビーグル犬において評価した。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰＰを１０～１２歳齢のビーグル犬に静脈内注射によって投与し、血清及びＣＳＦを連続的に採取して、上記の実施例５に記載されるように、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭＭ（左パネル）によって、及びＦｃ特異的抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した（図６Ｂ）。星印は、血液に汚染されたサンプルを示す（ＭＲＭ分析には示されない）。見て分かるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰはＣＳＦ中に時間依存様式で出現し、生体内でイヌ血液脳関門を越えるＦＣ５によるＡＢＰの輸送を示唆し、ＢＢＢ担体の翻訳特性を裏付けた。ＰＫパラメータ及びＣＳＦ暴露をWinNonlinソフトウエアによって分析し、以下の表３に示す。

実施例７：ＢＢＢ透過性
生体内（ラットモデル）においてヒトＦｃ（ｈＦｃ）と融合しＡＢＰ（ＦＣ５－ｈＦｃ－ＡＢＰ）に化学的に連結されたＦＣ５のＢＢＢ透過性とＣＳＦの外観。ＦＣ５－ｈＦｃは、製造会社の使用説明書（ThermoFisher Scientific）に従ってヘテロ二機能性架橋剤スルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート）を使用して、ＡＢＰ－シスタミドと連結させた。化学的にコンジュゲートされた分子をラットに６．２５ｍｇ／ｋｇで尾静脈を介して静脈内投与し、血清及びＣＳＦサンプルを４及び２４時間目に採取して、図５に記載されるように分析した。図７に示されるように、ＦＣ５－ｈＦｃ－ＡＢＰはＣＳＦ中に時間依存様式で出現するが、ＢＢＢ担体のないＦｃ－ＡＢＰは出現せず、血液脳関門を越えるＡＢＰのＦＣ５媒介輸送を裏付けた。

実施例８：ＢＢＢ－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰコンストラクトの脳への送達
実施例２のＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトが、生体内で血液脳関門を移動し脳実質に浸透する能力をマウスで評価した。

ＦＣ５－ｍＦｃ－Ｌ－ＡＢＰは、野生型（ＷＴ）及びＡＤ遺伝子組換え（ＡＤ－Ｔｇ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、Jackson Lab）マウスに１５ｍｇ／ｋｇで尾静脈を介して静脈内注射によって投与し（図８Ａ及び８Ｂ）、又はＡＤ－Ｔｇマウスに７．５、１５、及び３０ｍｇ／ｋｇで投与し、４及び２４時間循環させた。次に、マウスの左総頸動脈を介して、１ｍｌ／分の速度で１０ｍｌのヘパリン化（１００Ｕ／ｍｌ）生理食塩水で脳を完全に灌流し、脳の特定の灌流を促進した。次に、脳を摘出して海馬及び皮質の組織を解剖し、即座に凍結して、使用するまで－８０℃で保存した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich, Oakville, ON）を含む氷冷均質化緩衝液中で、ダウンスホモジナイザー（４℃で１０～１２回のストローク）を使用して、凍結組織を均質化した。次に、サンプルを４℃でそれぞれ１０秒間３回超音波分解し、不溶性物質を除去した（１０，０００×ｇ、４℃で１０分間）。上清をタンパク質含量について分析し、実施例４に記載の方法及び表１に示すペプチドシグネチャーを使用して、約０．５μｇのタンパク質をＳＲＭ分析に使用した（図８Ａ）。サンプルはまた、ｍＦｃ特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した（図８Ｂ及び８Ｃ）。融合分子の３つの成分全て（ＦＣ５、Ｆｃ、及びＡＢＰ）に属する特定の「シグネチャ」ペプチドが、皮質及び海馬の双方でＭＲＭによって検出され、ＦＣ５担体がＡＢＰを脳の標的領域に成功裏に送達したことが示唆された（ＦＣ５ペプチドのデータのみが図８Ａに示される）。Ｆｃ又はＦｃ断片のみに融合した対照単一ドメイン抗体Ａ２０．１で典型的に測定される約５０ｎｇ／ｇ組織と比較して、測定されたレベルは、異なる時点で７５０～１４００ｎｇ／ｇ脳組織に及んだ。これは、組織抽出物中のＦｃ及びＡＢＰを探索するウエスタンブロット分析によって、さらに確認された（８Ｂ及び８Ｃ）。生理食塩水のみが投与された動物では、ウエスタンブロットによって融合分子のタンパク質シグナルは検出されなかった。脳の標的領域でウエスタンブロットによって検出されたＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰレベルの用量依存的な増加があった（図８Ｃ）。これらの結果は、野生型（ＷＴ）及びＡＤ－Ｔｇマウスにおいて、ＦＣ５がＡＢＰを脳の標的領域（すなわち、海馬及び皮質）に成功裏に送達することを明確に示す。

実施例９：マウス脳からのＡβクリアランス
Ｔｇマウスのアミロイド負荷に対するＡＢＰの有効性を評価するために、ＡＢＰ単独又はＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトによる処置の結果を比較した。

ＡＢＰ単独（図９Ａ）又はＢＢＢ担体ＦＣ５と融合したＡＢＰ（図９Ｂ及び９Ｃ）による処置の比較。２つの異なるＡＤ Ｔｇマウスモデル、三重遺伝子組換え（ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ、ＡＰＰ_Ｓｗｅ、及びｔａｕＰ３０１Ｌ導入遺伝子を保有する、３ＸＴｇ－ＡＤ、ｓｖ１２９／Ｃ５７ＢＬ６マウス、Dr. F.M. LaFerla, University of California）及び二重遺伝子組換え（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９及びＡＰＰ_Ｓｗｅ導入遺伝子を保有する、Jackson Lab）を使用し；マウスに、それぞれ３ヶ月間又は２ヶ月間期間にわたり、隔日で３００ｎｍｏｌ／ｋｇの遊離ＡＢＰを皮下（ｓｃ）投与した。処置期間の終了時に、市販のアッセイキット（InVitrogen、ＫＨＢ３５４４）を使用して、製造業者のアッセイ手順に従って脳内ＡβレベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＡＢＰ単独による処置は、２～３ヶ月の複数回の（隔日）処置後に、脳Ａβの２５～５０％の減少をもたらした（９Ａ）。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰコンストラクトを二重遺伝子組換えＡＤマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２２０ｎｍｏｌ／ｋｇに相当）に静脈内注射し、上記の実施例８に記載されるように、ＥＬＩＳＡとｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭの双方で注射後２４時間の脳Ａβレベルを測定した。意外なことに、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰによる処置の２４時間以内に約５０％のアミロイドの減少が観察され（図９Ｂ）、ＦＣ５によるＡＢＰの効率的な脳送達が、Ａβレベルの減少におけるＡＢＰの有効性を劇的に高めたことが示唆された。ＣＳＦ分析はまた、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ処置後２４時間以内にＡβ_１～４２レベルの有意な減少を示した（図９Ｃ）。ＭＲＭによって検出されたＡβペプチド配列（配列：ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ、表１／ＥＬＩＳＡ分析は、ＡＢＰによって認識されるＡβエピトープと離れている／異なる（したがって、ＥＬＩＳＡ又はＭＲＭによる定量化に干渉しない）。

実施例１０：ＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトへのＦｃ構成要素の導入はその血清半減期を延長する
ＦＣ５－ＡＢＰ（ＦＣ５配列番号１７；及びＡＢＰ配列番号３６）及びＦＣ５－ｈＦｃ－ＡＢＰ（ＦＣ５配列番号１７；ｈＦｃ１ｘ７配列番号４０及びＡＢＰ配列番号３６］コンストラクトを実施例２に記載されるようにＣＨＯ細胞で生成した。血清ＰＫは、実施例５に記載されるように判定した。ＦＣ５－ＡＢＰ及びＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトを１５ｍｇ／ｋｇでラットの尾静脈に静脈内投与した。血清を連続的に採取し、ＦＣ５－ＡＢＰ及びＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰレベルをＦＣ５－及びＡＢＰ－特異的抗体を使用した直接ＥＬＩＳＡによって定量化した。血清サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈（１：５，０００）し、Maxisorbプレートに適用して、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを３Ｘ×１００μｌのＰＢＳで洗浄し、室温で（ＲＴ）３０分間、ＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡでブロックした。ブロッキング溶液を除去し、プレートをＨＲＰ結合ＦＣ５モノクローナル抗体と共にインキュベートした（９０分間）。インキュベーションと洗浄に続いて、１００μｌのSureBlue試薬を添加し、室温で１０～１５分間暗所でインキュベートした。反応の終了時に、１００μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加し、プレートリーダーで４５０ｎｍにおける発色を読み取った。図１０に示されるように、Ｆｃを含まないＦＣ５－ＡＢＰは、Ｆｃ成分を含むＦＣ５－ＡＢＰコンストラクト（ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ）と比較して、血清中で非常に急速に（１時間以内）除去された。このアッセイはまた、ＡＢＰ特異的抗体でも同様の結果で繰り返された。サンプル適用後、ＥＬＩＳＡプレートを最初にＡＢＰウサギポリクローナル抗体と共にでインキュベートし（９０分間）、ＨＲＰコンジュゲートウサギ二次抗体がそれに続き（３０分間）、結合抗体を上記のように検出した（データ未掲載）。

実施例１１：ラット脳からのＡβクリアランス
ＡＤ－Ｔｇラットに、生理食塩水又はＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのどちらかを４週間にわたり毎週尾静脈から投与した（３０ｍｇ／ｋｇの初回負荷量及び引き続く１５ｍｇ／ｋｇの４回の週用量）。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ及びＡβのＣＳＦレベルをｎａｎｏＬＣ ＭＲＭによって分析した。４週間の処置の前後に、特定のＡβ結合剤［１８Ｆ］ＮＡＶ４６９４を使用して、ＰＥＴスキャンによって脳Ａβレベルを判定した。ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは、２４時間以内にラットにおけるＣＳＦのＡβレベルを減少させた。Ｔｇマウスにおけるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰのＣＳＦレベルとＡβとの逆相関が観察され、ＦＣ５によって脳及びＣＳＦに送達されたＡＢＰによる、Ａβの標的結合と急速なクリアランスが示唆された（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。これは、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰによる４週間の処置に続くラット脳Ａβレベルの有意な減少（３０～５０％）を明確に示したＰＥＴスキャンによって、さらに裏付けられた（図１１Ｃ）。

実施例１２：海馬の体積の増加及び神経細胞結合性の改善
実施例１１に記載される実験では、生理食塩水処置及びＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰ処置Ｔｇマウスを、処置前に体積測定及び機能的磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）に供した。体積測定ＭＲＩ（図１２Ａ）は、生理食塩水処置対象と比較して、ＡＢＰ処置Ｔｇマウスにおける海馬の体積の増加を示し、ＡＢＰで処置すると海馬の萎縮が停止したことが示唆された。機能的ＭＲＩ（図１２Ｂ）は、生理食塩水処置対象と比較して、ＡＢＰ処置Ｔｇマウスの前帯状回（cingulated）皮質における改善された結合性を示し、神経細胞の結合性の回復が示唆された。このデータは、現在提供されている意義、有効性、及び優れた治療上の利点を裏付ける。

実施例１３：ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰ処置はイヌのＣＳＦＡβレベルの低下を示す
実施例６に記載されるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰの血清及びＣＳＦのＰＫプロファイルを２つの用量（１５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇで、ビーグル犬において評価した。ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによるＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰの血清及びＣＳＦレベルの測定に加えて、ＡβのＣＳＦレベルもまた、実施例９に記載されるようにｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによって測定した。見て分かるように、ＦＣ５－ｍＦｃ－ＡＢＰは、用量及び時間依存様式でＣＳＦ中に出現した（図１３Ｂ）。最も重要なことは、Ｔｇマウス及びＴｇラットで見られるように、ＣＳＦ ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰレベルに反比例する、ＣＳＦ Ａβレベルの有意な減少があった。

実施例１４：異なるＢＢＢ担体を用いたＡＢＰ融合分子の生成
ＡＢＰ融合分子の汎用性を評価するために、ＡＢＰを別のヒト化ＢＢＢ担体ＩＧＦ１Ｒ５（Ｈ２）と成功裏に融合させた。図１２に示されるように、分子の二機能性が維持され、ＡＢＰがＡβオリゴマーに結合する能力（ＥＬＩＳＡ及びオーバーレイアッセイ）、及びＩＧＦ１Ｒ５が生体外でＢＢＢモデルを越えてＡＢＰを送達する能力（データ未掲載）もまた維持された。これは、ＡＢＰが、異なるＢＢＢ通過単一ドメイン抗体と融合され、脳に送達され得ることを明確に示唆する。

実施例１５：異なるＢＢＢ通過単一ドメイン抗体－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトによるＡβオリゴマーの結合
修飾されたＡＢＰ（表１及び図１５に示される配列番号によって示されるような分子の部位特異的変異又はＣ末端部分の除去）を有する、様々なＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトが提供される。図１５に示されるように、全てのコンストラクトは、ＥＬＩＳＡ法によって、Ａβオリゴマーの結合における同様の効力を維持した。

実施例１６：安定性及び生物製造可能性を改善するための特定の変異を含むＦＣ５－ｈＦｃ１Ｘ７－Ｌ－ＡＢＰの生成。
特定の変異を有するＦＣ５－ｈＦｃ１Ｘ７－Ｌ－ＡＢＰ（配列番号３５のＡＢＰ；配列番号３６のＡＢＰ）をＣＨＯ細胞で生成し、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下においてＳＤＳ－ＰＧＥ上で分離して、図２に記載されるようにクマシーブルーで染色した。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ＦＣ５特異的、ｈＦｃ特異的、及びＡＢＰ特異的の抗体を用いて免疫ブロット法を実施した。別のセットでは、融合分子中のＡＢＰのＡβ結合もまたオーバーレイアッセイにより試験した。結合したＡβをＡβ特異的抗体６Ｅ１０によって検出した。見て分かるように、特定の変異（例えば、ここに示されているように、ＡＢＰ配列番号３５及びＡＢＰ配列番号３６）によるＡＢＰの系統的修飾は、例えば、還元及び非還元条件下での単一タンパク質バンドによって本明細書で明確に示されているように、生成される分子の安定性を実質的に高めた（二重タンパク質バンドが見られる、図２Ａのその他のＡＢＰコンストラクトと比較して）。融合分子の安定性におけるこの実質的な強化は、有利には、均質分子の生物製造可能性を促進する。

実施例１７：様々なＦＣ５－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰコンストラクト及びＩＧＦ１Ｒ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏＢＢＢ透過性。
図４に記載されているように、ＢＢＢ通過を生体外ラットＢＢＢモデルで評価し、血液脳関門を通過する分子をｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法で検出した。ヒト化ＦＣ５及びＩＧＦ１Ｒ担体に融合された全てのＡＢＰ変異型は、ＢＢＢを効果的に通過した。予測されたように、非ＢＢＢ透過性ｓｄＡｂであるＡ２０．１はＢＢＢを通過せず、同様に、Ａ２０．１に融合されたＡＢＰはＢＢＢを透過しなかった（図１７Ａ）。図１７Ｂでは、融合分子の３つの構成要素、ＦＣ５、Ｆｃ、及びＡＢＰ全ての「フィンガープリント」ペプチドが、ｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによって検出されたことが示される。

本明細書に記載される実施形態及び実施例は例示的であり、特許請求される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。代替物、修正、及び均等物をはじめとする前述の実施形態のバリエーションは、発明者らによって特許請求の範囲に含まれることが意図される。さらに、論じられる特徴の組み合わせは、本発明の解決策には必要ではないかもしれない。

実施例１８：ヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクト［ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰ（ＡＢＰ配列番号３５及びＡＢＰ配列番号３６）］は生体外ラット血液脳関門を無傷で通過する。
ヒト化ＦＣ５－ＡＢＰ融合分子の血液脳関門通過を実施例４に記載されるように評価した。血液脳関門を通過する融合分子をウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ法によって分析した。免疫ブロットは、ｈＦｃ特異的及びＡＢＰ特異的抗体で探索した。どちらの抗体もＢＢＢ（下部チャンバー）を通過する分子を認識し、分子サイズは生体外ＢＢＢ（上部チャンバー）に適用されたＦＣ５－ＡＢＰ融合コンストラクトの分子サイズと同一であり、ＢＢＢを通過した分子が無傷のままであることを示した。これは、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって立証され、ＢＢＢ通過分子がＦＣ５特異的抗体で捕捉され、捕捉された分子がＡＢＰ抗体を用いて検出された。

実施例１９：ヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクト［ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－Ｌ－ＡＢＰ（ＡＢＰ配列番号３５及びＡＢＰ配列番号３６）］はＦＣ５によって生体内でＢＢＢを越えて輸送され脳に無傷で送達される。
マウスにおけるヒト化ＦＣ５－ＡＢＰ融合分子の血液脳関門通過及び脳送達を、実施例８に記載されるように評価した。分子の静脈内投与及び心臓内灌流に続いて４時間後、脳を摘出し、皮質をＲＩＰＡ緩衝液で抽出し、注入されたＦＣ５－ＡＢＰ融合分子の存在を、ＡＢＰ特異的抗体でプローブするウエスタンブロットによって、及び分子をＦＣ５特異的抗体で捕捉してＡＢＰ特異的抗体で検出するサンドイッチＥＬＩＳＡによって、検出した。ウエスタンブロットは、皮質に完全長のＦＣ５－ＡＢＰコンストラクトが存在することを明らかにした。これはサンドイッチＥＬＩＳＡによって立証され、ＦＣ５特異的抗体によって分子が捕捉され、ＡＢＰ特異的抗体によって捕捉された分子が検出される能力によって示唆されるように、それは分子の無傷の特性を明らかにした。

実施例２０：ヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクト［ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰ（ＡＢＰ配列番号３６］の生体外（Ａ）及び生体内（Ｂ）結合（標的結合）
免疫組織化学検査を実施例３に記載されるように実施した。ＡＤ遺伝子組換えマウス由来の脳切片をＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰ（ＡＢＰ、配列番号３６）と共にインキュベートし、結合した融合分子はＨＲＰコンジュゲートＦＣ５特異的抗体を用いて視覚化した。陰性対照として、切片をコンストラクトなしで、又は融合ＡＢＰなしのＦＣ５－ｈＦｃコンストラクトと共に、インキュベートした。簡潔に述べると、ＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子組換えマウスの皮質及び海馬を含むホルマリン固定４０μｍの浮遊切片を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中で８０°Ｃで３０分間抗原賦活化に供し、次に室温まで冷却した。切片をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の３％Ｈ_２Ｏ_２で３０分間処理して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、再度すすいだ。０．３％トリトンＸ－１００を含むDako無血清タンパク質ブロック中での１時間のインキュベートに続いて、切片を０．３％トリトンＸ－１００を含むDako希釈液中のＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１ｘ７－ＡＢと、又はＦＣ５－ｈＦｃ１ｘ７のモル当量と共に、室温で９０分間インキュベートした。ＰＢＳで完全にすすいだ後、切片をDako希釈液中の抗ＦＣ５－ＨＲＰと共に室温で６０分間インキュベートし、再度すすぎ、次にキットの指示に従ってVector Immpact DABを使用して展開した。切片をSuperfrostプラスストスライドに載せて一晩風乾させ、次に再水和させてメチルグリーンで対比染色し、アセトン／０．０５％酢酸（ｖ／ｖ）に浸浸して脱水し、透明化してPermountで覆った。ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７－ＡＢＰコンストラクトでは選択的結合（黒点）が見られたが、ＡＢＰのないＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１Ｘ７では見られず、脳内のＡβ沈着のＡＢＰ依存性結合（標的結合）が示唆された。アミロイド沈着を生じない野生型マウス由来の脳切片には、結合は見られなかった（データ未掲載）。

Ａβ沈着物の同様の結合が、ＡＤ遺伝子組換えマウスへのＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰコンストラクトの海馬内注射後に検出された（Ｂ）。海馬内注射の４時間後、Ｔｇマウスを灌流して脳を摘出し、切片化した。ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰのＡβ沈着物（光沢のある白い点）への結合を、ＡＢＰ特異的ポリクローナル抗体で可視化した。脳切片を最初にＡＢＰ特異的モノクローナル抗体と共にインキュベートし、Ａｌｅｘａ－６４７コンジュゲート抗ウサギＦｃ二次抗体がそれに続いた。

実施例２１：生体内におけるヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクト（ＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ－ＡＢＰ（配列番号４６）による標的結合
フルオロフォア標識（図１８Ａ）又は未感作ＦＣ５－ＡＢＰ（図１８Ｂ）融合分子を、野生型（Ｗｔ）及びＡＤ－Ｔｇ（Ｔｇ）マウスの海馬領域に微量注入した。フルオロフォア標識ＦＣ５－ＡＢＰ融合分子のマイクロインジェクションの３０分後、脳を摘出し、切片化して蛍光顕微鏡下で観察した。２１Ａに示されるように、注入された分子は、Ａβ特異的抗体との共局在によって確認されるように、Ａβ沈着物に結合した。並行研究では、未感作ＦＣ５－ＡＢＰ融合分子の海馬内注射の４時間後に、注入領域（ｉｐｓ）及び非注入領域（ｃｏｎ）からの海馬体を採取して、トリス緩衝化生理食塩水で均質化した。捕捉抗体としてＦＣ５抗体を用い、検出抗体としてＡＢＰ又はＡβ特異的抗体のどちらかを用いる、サンドイッチＥＬＩＳＡに海馬抽出物を供した。２１Ｂに示されるように、微量注入されたＦＣ５－ＡＢＰ分子は無傷のままであり、Ａβ特異的抗体によって検出されたプルダウン複合体中のＡβの存在によって示されるように、ＡＢＰは生体内で標的Ａβと会合し結合できた。

実施例２２：非ヒト化及びヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－Ｌ－ＡＢＰコンストラクト間のＰＫ／ＰＤ比較
ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰ又はＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１ｘ７－ＡＢＰを、図５に記載されるように１５ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射を通じてラットに静脈内投与した。血清及びＣＳＦを連続的に採取した。ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰレベルをｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭ法を用いて定量化した。図２２Ａに示されるように、血清及びＣＳＦのＰＫプロファイルは、非ヒト化及びヒト化コンストラクトで非常に良く似ていた。ＦＣ５－ｍＦｃ２ａ－ＡＢＰ又はＦＣ５（Ｈ３）－ｈＦｃ１ｘ７－ＡＢＰを図９Ｂに記載されるように１５ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射を通じてＴｇマウスに静脈内投与した。ＣＳＦ中のＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰ及びＡβレベルを図９Ｂに記載されるようにｎａｎｏＬＣ－ＭＲＭによって測定した。図２２Ｂに示されるように、ＣＳＦ中の非ヒト化及びヒト化ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰのレベルは類似しており、最も重要なことには、ＣＳＦのＡβレベルの変化（減少）も非常に良く似ており、ＦＣ５－Ｆｃ－ＡＢＰコンストラクトのヒト化は、融合コンストラクのＰＫ及びＰＤプロファイルに影響を及ぼさなかった。

配列

参考文献
本明細書及び本出願全体を通して参照される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照により本明細書に援用される。
Ａｂｂｏｔｔ ＮＪ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ＣＮＳ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．３６（３）：４３７－４９．
Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ Ｍ，Ｄｅｓｍｙｔｅｒ Ａ，Ｗｙｎｓ Ｌ，Ｈａｍｅｒｓ Ｒ，ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ（１９９７）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｃａｍｅｌＨｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４１４，５２１－５２６
Ｂａｒａｇｅｂ ＳＨ，Ｓｏｎａｗａｎｅ ＫＤ（２０１５）Ａｍｙｌｏｉｄ ｃａｓｃａｄｅＨｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｏｉ：０．１０ １６／ｊ ．ｎｐｅｐ．２０ １５ ．０６．００８
Ｂａｒｄ Ｆ ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｔｅｒ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ Ｎａｔ Ｍｅｄ．６，９１６－９１９．
Ｂｅｌｌ Ａ，Ｗａｎｇ ＺＪ，Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ Ｍ，Ｃｈａｎｇ ＴＡ，Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ，Ｔｒｏｊａｈｎ Ｕ，Ｂａａｒｄｓｎｅｓ Ｊ，Ｊａｒａｍｉｌｌｏ ＭＬ，Ｌｉ Ｓ，Ｂａｒａｌ ＴＮ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ－ＭｃＣｏｕｒｔ Ｍ，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｒ，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｊ．（２０１０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２８９，８１－９０．
Ｃａｒａｍ－Ｓａｌａｓ Ｎ，Ｂｏｉｌｅａｕ Ｅ，Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＧＫ，Ｇａｒｂｅｒ Ｅ，Ｂｒｕｎｅｔｔｅ Ｅ，Ａｂｕｌｒｏｂ Ａ，Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ Ｄ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ＦｃＲｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７６３：３８３－４０１．
Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ Ｂ，Ｍｉｃｈｅｌ Ｍｅｎａｒｄ，Ｌｅｓｌｉｅ Ｂｒｏｗｎ，ＭｅｌｉｓｓａＨｅｗｉｔｔ，Ｔｒｅｖｏｒ Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ．（２０１３）Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｉｏｌａｒ ｍａｔｅｒｉａｌ １（ＰＣＭ－１）ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｓ １３－ａｍｙｌｏｉｄ（Ａ／３１－４２）ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２６，４１５－４２４．
Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ Ｂ，Ｓｈｉｎｇｏ Ｉｔｏ，Ｔｒｅｖｏｒ Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｃｈａｎｔａｌ Ｇａｕｄｅｔ，Ｍｉｃｈｅｌ Ｍｅｎａｒｄ，Ｌｅｓｌｉｅ Ｂｒｏｗｎ，Ｊａｍｅｓ Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ．（２０１４）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｍｙｌｏｉｄ－１３ ｏｌｉｇｏｍｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＢＰ）ｔａｒｇｅｔｓ ａｍｙｌｏｉｄ－１３ ｄｅｐｏｓｉｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｒａｉｎ ａｎｄＨｕｍａｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４４５：６５６－６６０．
Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．，ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．（１９８７）Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅＨｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７．
Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．，ａｎｄ Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ．（１９９６），Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＶＨ ｄｏｍａｉｎｓ：ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｒｅｅＨｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２，１６９－１７９
ＤｅＬａＧａｒｚａ，Ｖ．Ｗ．（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ．Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．６８，１３６５－７２．
Ｄｕｍｏｕｌｉｎ，Ｍ．，Ｃｏｎｒａｔｈ，Ｋ．，Ｖａｎ Ｍｅｉｒｈａｉｇｈｅ，Ａ．，Ｍｅｅｒｓｍａｎ，Ｆ．，Ｈｅｒｅｍａｎｓ，Ｋ．，Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｗｙｎｓ，Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｔａｇｎｅ，Ａ．（２００２）Ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈＨｉｇｈ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １１，５００－５１５．
Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ，Ｐｅｒｒｅｔ Ｓ，Ｋａｍｅｎ Ａ．（２００２）Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ａｎｄＨｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－ｇｒｏｗｉｎｇＨｕｍａｎ ２９３－ＥＢＮＡ１ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２）：Ｅ９．
Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｅ．，Ｋｏｍａｒｏｍｙ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｌｌ，Ｒ．（１９８４）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｍｅｎｔ ｐｌｏｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９，１２５－１４２
Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＧＫ，Ｃａｒａｍ－Ｓａｌａｓ Ｎ，Ｈａｑｑａｎｉ ＡＳ，Ｂｒｕｎｅｔｔｅ Ｅ，Ｅｌｄｒｅｄｇｅ Ｊ，Ｐｅｐｉｎｓｋｙ Ｂ，Ａｎｔｏｇｎｅｔｔｉ Ｇ，Ｂａｕｍａｎｎ Ｅ，Ｄｉｎｇ Ｗ，Ｇａｒｂｅｒ Ｅ，Ｊｉａｎｇ Ｓ，Ｄｅｌａｎｅｙ Ｃ，Ｂｏｉｌｅａｕ Ｅ，Ｓｉｓｋ ＷＰ，Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ ＤＢ．（２０１４）Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ－ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２８，４７６４－４７７８．
Ｇａｒｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｂａｌｌ，Ｍ．，Ｂｏｒｇ，Ｎ．，Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉ，Ｒ．，Ｆｅｎａｒｔ，Ｌ．，Ｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｄ．，Ｌｉｎｄｍａｒｋ，Ｔ．，Ｍａｂｏｎｄｚｏ，Ａ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｒａｕｂ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ，Ｄ．，Ｔｅｒａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｏｂｅｒｇ，Ｊ．－Ｏ．，ａｎｄ Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｔ．
（２００５）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １９，２９９－３３４
Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＮＲ，ＤｅＰａｓｃａｌｉｓ Ｒ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ，Ｋａｓｈｍｉｒｉ ＳＶＳ（２００５）Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ ２６，３１－４３
Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＭＭ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ Ｉ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，３８５－４２７
Ｇｏｕｒｅ ＷＦ，Ｋｒａｆｆｔ ＧＡ，Ｊｅｒｅｃｉｃ Ｊ，Ｈｅｆｔｉ Ｆ．（２０１４）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒ ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｏｘｉｎｓ：ａ ｐａｔｈ ｆｏｒｗａｒｄ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，６，４２－５６．
Ｇｅｒｇｏｖ Ｍ，Ｏｊａｎｐｅｒａ Ｉ，Ｖｕｏｒｉ Ｅ．（２００３）Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ２３８ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｉｏｎｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７９５，４１－５３
Ｈａｒｄｙ Ｊ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃ Ｎ，Ｗｉｎｂｌａｄ Ｂ，Ｐｏｒｔｅｌｉｕｓ Ｅ，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ Ｎ，Ｃｅｄａｚｏ－Ｍｉｎｇｕｅｚ Ａ，ＺｅｔｔｅｒｂｅｒｇＨ．（２０１４）Ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２７５，２９６－３０３．
Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ，Ｔ．，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｍｅｒｓ，Ｃ．，Ｓｏｎｇａ，Ｅ．Ｂ．，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ，Ｎ．，ａｎｄＨａｍｅｒｓ，Ｒ．（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３６３，４４６－４４８．
Ｈａｑｑａｎｉ，Ａ．Ｓ．，Ｃａｒａｍ－Ｓａｌａｓ，Ｎ．，Ｄｉｎｇ，Ｗ．，Ｂｒｕｎｅｔｔｅ，Ｅ．，Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｃ．Ｅ．，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｅ．，Ｂｏｉｌｅａｕ，Ｅ．，ａｎｄ Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ，Ｄ．（２０１３）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ＣＳＦ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＮａｎｏＬＣ－ＳＲＭ－ＩＬＩＳ ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１０，１５４２－１５５６
Ｈｕａｎｇ ＹＬ，Ｓａ¨ｌｊｏ¨ Ａ，Ｓｕｎｅｓｏｎ Ａ，ＨａｎｓｓｏｎＨＡ．（１９９５）Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｏｆ ｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｔｒａｕｍａ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ；６３：１３－２２．
Ｈｕｓｓａｃｋ Ｇ．，Ｈｉｒａｍａ Ｔ．，Ｄｉｎｇ Ｗ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｒ．，ａｎｄ Ｔａｎｈａ Ｊ．（２０１１）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈＨｉｇｈ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６，ｅ２８２１８．
Ｈｕｓｓａｃｋ Ｇ，Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ Ｍ，ｖａｎ ＦａａｓｓｅｎＨ，Ｓｏｎｇｅｒ ＪＧ，Ｎｇ ＫＫ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｒ，Ｔａｎｈａ Ｊ（２０１１ｂ）Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ａ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８６（１１）：８９６１－７６．
Ｉｑｂａｌ Ｕ．，Ｔｒｏｊａｈｎ Ｕ．，ＡｌｂａｇｈｄａｄｉＨ．，Ｚｈａｎｇ Ｊ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｍ．，Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ Ｄ．，Ｔｏｍａｎｅｋ Ｂ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｇ．，ａｎｄ Ａｂｕｌｒｏｂ Ａ．（２０１０）Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏ－ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＶＨＨ－ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６０，１０１６－１０２８．
Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．，Ｓｃｈｏｎ，Ｏ．，Ｆａｍｍ，Ｋ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（２００４）Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ ｂｙＨｅａｔ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１１６１－１１６５．
Ｊｉ Ｗ ａｎｄＨａ Ｉ（２０１０）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９，１２０－１３１．
Ｊｏｎｅｓ ＰＴ，Ｄｅａｒ ＰＨ，Ｆｏｏｔｅ Ｊ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ（１９８６）Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５．
Ｋａｂａｔ ＥＡ，Ｗｕ ＴＴ．Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ Ｖ ｒｅｇｉｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｇｅｎｅｓ，ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１；１４７：１７０９－１９．
Ｋｉｍ，Ｄ．Ｙ．，Ｋａｎｄａｌａｆｔ，Ｈ．，Ｄｉｎｇ，Ｗ．，Ｒｙａｎ，Ｓ．，ｖａｎ Ｆａｓｓｅｎ，Ｈ．，Ｈｉｒａｍａ，Ｔ．，Ｆｏｏｔｅ，Ｓ．Ｊ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｒ．，ａｎｄ Ｔａｎｈａ，Ｊ．（２０１２）Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆＨｕｍａｎ ＶＨ ｄｏｍａｉｎｓ ＰＥＤＳ ａｄｖａｎｃｅ ａｃｃｅｓｓ Ａｕｇｕｓｔ ３０，２０１２，１－９．
Ｋｏｒｎｈｕｂｅｒ ＭＥ，Ｋｏｒｎｈｕｂｅｒ Ｊ，Ｃｉｍｎｉａｋ Ｕ．（１９８６）Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ＣＳＦ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅｌｙ ｍｏｖｉｎｇ ｒａｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ １９８６；１７：６３－６８．
Ｌａｎｎｆｅｌｔ Ｌ，Ｒｅｌｋｉｎ，ＮＲ，Ｓｉｅｍｅｒｓ ＥＲ（２０１４）Ａｍｙｌｏｉｄ－ｆ３－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２７５，２８４－２９５．
Ｌｉ Ｓ，Ｚｈｅｎｇ Ｗ，Ｋｕｏｌｅｅ Ｒ，Ｈｉｒａｍａ Ｔ，Ｈｅｎｒｙ Ｍ，Ｍａｋｖａｎｄｉ－Ｎｅｊａｄ Ｓ，Ｆｊａｌｌｍａｎ Ｔ，Ｃｈｅｎ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｊ．Ｐｅｎｔａｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９；４６：１７１８－２６．
Ｍａｎｇｉａｌａｓｃｈｅ Ｆ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ａ，Ｗｉｎｂｌａｄ Ｂ，Ｍｅｃｏｃｃｉ Ｐ，Ｋｉｖｉｐｅｌｔｏ Ｍ（２０ １０）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ９，７０２－ ７１６
Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ Ａ，ａｎｄ ＷｅｉｎｅｒＨＬ（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０２，８３４－８３８．
Ｍｏｒｒｏｎｅ ＣＤ，Ｍｉｎｇｚｈｅ Ｌｉｕ Ｍ，Ｂｌａｃｋ ＳＥ，ＭｃＬａｕｒｉｎ ＪＡ（２０１５）Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｆ３ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．７，Ａｒｔｉｃｌｅ ６４，１－１６．
Ｍｕｓｉｅｋ ＥＳ，Ｈｏｌｔｚｍａｎ ＤＭ（２０１５）Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄＨｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：ｔｉｍｅ，ｓｐａｃｅ ａｎｄ “ｗｉｎｇｍｅｎ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，８００－８０６．
Ｎｉｃａｉｓｅ Ｍ，Ｖａｌｅｉｏ－Ｌｅｐｉｎｉｅｃ Ｍ，Ｍｉｎａｒｄ Ｐ，Ｄｅｓｍａｄｒｉｌ Ｍ．（２００４）Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｎ ａ ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１３（７）：１８８２－１８９１．
Ｎｕｔｔａｌｌ，Ｓ．Ｄ．，Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｕ．Ｖ．，Ｄｏｕｇｈｔｙ，Ｌ．，Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｈｏｏｇｅｎｒａａｄ，Ｎ．Ｊ．，Ｈａｔｔａｒｋｉ，Ｍ．，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．Ａ．，Ｉｒｖｉｎｇ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄＨｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．（２００３）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＩｇＮＡＲ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅＨｕｍａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｏｍ７０．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３－３５５４．
Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８．
Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１５，５－３６（１９９５）
Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．Ｄｒｕｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ：ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅ，Ｎｅｕｒｏｎ．２００２，３６，５５５－５５８．
Ｑｕｅｅｎ Ｃ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＷＰ，ＳｅｌｉｃｋＨＥ，Ｐａｙｎｅ ＰＷ，Ｌａｎｄｏｌｆｉ ＮＦ，Ｄｕｎｃａｎ ＪＦ，Ａｖｄａｌｏｖｉｃ ＮＭ，Ｌｅｖｉｔｔ Ｍ，Ｊｕｎｇｈａｎｓ ＲＰ，Ｗａｌｄｍａｎｎ ＴＡ（１９８９）ＡＨｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３．
Ｒａｆｉｉ ＭＳ，Ａｉｓｅｎ ＰＳ．（２０１５）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ＢＭＣ Ｍｅｄ．１３：６２．
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ，Ｃｌａｒｋ Ｍ，ＷａｌｄｍａｎｎＨ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ（１９８８）ＲｅｓｈａｐｉｎｇＨｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２７．
Ｓａｍｕｅｌｓ Ｂ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９３）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｒ．５４，４２１－４２９
Ｓａｖｏｎｅｎｋｏ ＡＶ，Ｍｅｌｎｉｋｏｖａ Ｔ，Ｈｉａｔｔ Ａ，ＬｉＴ，Ｗｏｒｌｅｙ ＰＦ，Ｔｒｏｎｃｏｓｏ ＪＣ，Ｗｏｎｇ ＰＣ，Ｐｒｉｃｅ ＤＬ．（２０１２）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｎｎａｃｏｌｏｇｙ．３７，２６１－２７７
Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ，ａｎｄＨａｒｄｙ Ｊ（２０１６）Ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄＨｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｔ ２５ ｙｅａｒｓ ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．８，５９５－６０８
Ｓｅｎｇｕｐｔａ Ｕ，Ｎｉｌｓｏｎ ＡＮ，Ｋａｙｅｄ Ｒ（２０１６）Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｍｙｌｏｉｄ－β Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．６：４２－４９
Ｓｅｖｉｇｎｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｄｕｃａｎｕｍａｂ ｒｅｄｕｃｅｓ Ａβ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．５３７，５０－５６
Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，Ｍｅｎｇ ＹＧ，Ｒａｅ Ｊ，Ｂｒｉｇｇｓ Ｊ，Ｘｉｅ Ｄ，Ｌａｉ Ｊ，Ｓｔａｄｌｅｎ Ａ，Ｌｉ Ｂ，Ｆｏｘ ＪＡ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ（２００１）Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎＨｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩ，Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩ，Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ，ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６，６５９１－６６０４．
Ｔｅｍｐｅｓｔ ＰＲ，Ｂｒｅｍｍｅｒ Ｐ，Ｌａｍｂｅｒｔ Ｍ，Ｔａｙｌｏｒ Ｇ，Ｆｕｒｚｅ ＪＭ，Ｃａｒｒ ＦＪ，Ｈａｒｒｉｓ ＷＪ（１９９１）Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ａＨｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔＨｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，２６６－２７１．
Ｔｏ Ｒ，Ｈｉｒａｍａ Ｔ，Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ Ｍ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｒ，Ｗａｎｇ Ｐ，Ｘｕ Ｐ，Ｎｉ Ｆ，ａｎｄ Ｔａｎｈａ Ｊ．（２００５）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＨｕｍａｎ ＶＨＳ ｂｙ ａ Ｐｈａｇｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，４１３９５－４１４０３．
Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ Ｎ，Ｈｉｎｔｏｎ，ＲＰ，Ｋｕｍａｒ Ｓ（２００５）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆＨｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ ａｎｔｉ－Ｔａｃ ｔｏ Ｚｅｎａｐａｘ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６９－８３．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．（１９９５）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｒｅｖｅｒｓａｌ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＳＤＺ ＰＳＣ ８３３，Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ ａ ａｎｄ Ｖｅｒａｐａｍｉｌ ｏｎ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．，３４，２３５－２４１
ＷＯ ９５／０４０６９
ＷＯ／２００４／０７６６７０
ＷＯ２００３／０４６５６０
ＷＯ ２００２／０５７４４５
ＷＯ ２０１１／１２７５８０
ＷＯ ２００７／０３６０２１
ＷＯ ２００６／１３３５６６

Claims (54)

1. ａ）血液脳関門（ＢＢＢ）を移動する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はその断片であって、前記ｓｄＡｂ又はその抗体断片が：
   ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号３）のＣＤＲ３配列を含む、血液脳関門（ＢＢＢ）を移動する抗体又はその抗体断片；
   ｂ）βアミロイドに結合するポリペプチドであって、前記βアミロイドに結合するポリペプチドが、
   ｉ）Ｘ_１ＴＦＸ_２ＴＸ_３Ｘ_４ＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＸ_５Ｘ_６ＳＴＱＬＸ_７ＳＸ_８ＶＸ_９ＮＩ
   式中、Ｘ_１＝Ｇ又はＡ，Ｘ_２＝Ｇ又はＶ，Ｘ_３＝Ｇ又はＡ，Ｘ_４＝Ｇ又はＡ，Ｘ_５＝Ｇ又はＶ，Ｘ_６＝Ｇ又はＶ，Ｘ_７＝Ｇ又はＶ，Ｘ_８＝Ｇ又はＡ，Ｘ_９＝Ｇ又はＡ（配列番号３１）；又は
   ｉｉ)配列番号３２～３８のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むβアミロイド結合ポリペプチド（ＡＢＰ）変異型である、βアミロイドに結合するポリペプチド；及び
   ｃ）Ｆｃ断片
   を含む融合タンパク質を含む、化合物。
2. 前記βアミロイドに結合するポリペプチドが、配列番号３２～３８のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の化合物。
3. 前記βアミロイドに結合するポリペプチドが、配列番号３２～３８からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の化合物。
4. 前記βアミロイドに結合するポリペプチドが、配列番号３６を含む、請求項３に記載の化合物。
5. 前記ｓｄＡｂ又はその断片がヒト化されている、請求項１に記載の化合物。
6. 前記ｓｄＡｂ又はその断片が、
   

   

   式中、Ｘ１＝Ｄ又はＥ，Ｘ２＝Ａ又はＥ，Ｘ３＝Ｆ又はＶ，Ｘ４＝Ｅ又はＧ，Ｘ５＝Ｒ又はＬ，Ｘ６＝Ｆ又はＷ，Ｘ７＝Ｌ又はＶ；
   配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
7. 前記ｓｄＡｂ又はその断片が、
   

   

   式中、Ｘ１＝Ｄ又はＥ，Ｘ２＝Ａ又はＥ，Ｘ３＝Ｆ又はＶ，Ｘ４＝Ｅ又はＧ，Ｘ５＝Ｒ又はＬ，Ｘ６＝Ｆ又はＷ，Ｘ７＝Ｌ又はＶ；
   配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１７からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
8. 前記ｓｄＡｂ又はその断片が、配列番号１７を含む、請求項７に記載の化合物。
9. 前記Ｆｃ断片がマウスＦｃ２ａ又はヒトＦｃ１である、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
10. 前記Ｆｃ断片が、配列番号３９、配列番号４０、又は配列番号４１を含む、請求項９に記載の化合物。
11. 前記Ｆｃ断片が、配列番号４０を含む、請求項１０に記載の化合物。
12. 前記融合タンパク質が前記Ｆｃ断片のＮ末端に連結されるｓｄＡｂ又はその断片、及び前記Ｆｃ断片のＣ末端に連結される前記βアミロイドに結合するポリペプチドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
13. 前記ｓｄＡｂ又はその断片が前記Ｆｃ断片のＣ末端に連結され、前記βアミロイドに結合するポリペプチドが前記Ｆｃ断片のＮ末端に連結される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。
14. 前記融合タンパク質がリンカーをさらに含む、請求項１２又は１３に記載の化合物。
15. 前記リンカーが、前記ｓｄＡｂ又はその断片を又は前記βアミロイドに結合するポリペプチドを、前記Ｆｃ断片に連結する、独立して選択されたリンカー配列である、請求項１４に記載の化合物。
16. 前記リンカー配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、又はＧＸ_１ＧＸ_２Ｘ_３ＧＸ_４Ｘ_５ＧＸ_６，
    式中、Ｘ_１＝Ａ又はＧ，Ｘ_２＝Ａ又はＧ，Ｘ_３＝Ｓ又はＴ，Ｘ_４＝Ｇ又はＶ，Ｘ_５＝Ｇ、Ａ又はＶ，及びＸ_６＝Ｓ又はＴである、請求項１５に記載の化合物。
17. 前記融合タンパク質が：配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１７からなる群から選択される配列を含む、ｓｄＡｂ又はその断片；配列番号３２、配列番号３３、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択される配列を含む、βアミロイドに結合するポリペプチド；並びに配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１からなる群から選択される配列を含む、Ｆｃ断片を含む、請求項１２に記載の化合物。
18. 前記融合タンパク質が：配列番号１７の配列を含む、前記ｓｄＡｂ又はその断片；配列番号３６の配列を含む、前記βアミロイドに結合するポリペプチド；及び配列番号４０の配列を含む、前記Ｆｃ断片を含む、請求項１７に記載の化合物。
19. 前記融合タンパク質が、配列番号４５～４７、４９及び５３のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１７に記載の化合物。
20. 前記融合タンパク質が、配列番号４７の配列を含む、請求項１９に記載の化合物。
21. 前記融合タンパク質が、配列番号５３の配列を含む、請求項１９に記載の化合物。
22. 前記化合物が前記融合タンパク質の二量体を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の化合物。
23. 配列番号４７の配列を含む、２つの融合タンパク質の二量体を含む、請求項２２に記載の化合物。
24. 配列番号５３の配列を含む、２つの融合タンパク質の二量体を含む、請求項２２に記載の化合物。
25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
26. 請求項２５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
27. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物と、薬理的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
28. 請求項２０に記載の化合物と、薬理的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
29. 請求項２３に記載の化合物と、薬理的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
30. 患者においてアルツハイマー病を治療するための請求項２７～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
31. アルツハイマー病を治療するに使用するための医薬組成物であって、前記使用が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項２７～３０のいずれか一項に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、医薬組成物。
32. 前記使用が、請求項２９に記載の組成物を対象に投与することを含む、請求項３１に記載の使用するための医薬組成物。
33. 脳アミロイドβレベルが増加している対象の脳内の毒性βアミロイドレベルを減少させるに使用するための医薬組成物であって、前記使用が、十分な量の請求項２７～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に反復非経口投与するステップを含む、医薬組成物。
34. 非経口投与が皮下又は静脈内投与である、請求項３３に記載の使用するための医薬組成物。
35. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の反復非経口投与後に、脳アミロイドβレベルが増加している対象の脳内の毒性βアミロイドレベルが減少する、請求項３３又は３４に記載の使用するための医薬組成物。
36. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の反復非経口投与の４週間以内に毒性βアミロイドが減少する、請求項３５に記載の医薬組成物。
37. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の非経口投与後に、ＣＳＦが増加している対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の毒性βアミロイドレベルが減少する、請求項３３に記載の医薬組成物。
38. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の単回非経口投与の２４時間以内に、ＣＳＦが増加している対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の毒性βアミロイドレベルが減少する、請求項３７に記載の医薬組成物。
39. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の化合物を対象に投与することを含む、脳アミロイドβのレベルが増加している対象の脳内の毒性βアミロイドレベルを減少させるための医薬組成物。
40. ｉ）Ｘ_１ＴＦＸ_２ＴＸ_３Ｘ_４ＡＳＡＱＡＳＬＡＳＫＤＫＴＰＫＳＫＳＫＫＸ_５Ｘ_６ＳＴＱＬＸ_７ＳＸ_８ＶＸ_９ＮＩ
    式中、Ｘ_１＝Ｇ又はＡ，Ｘ_２＝Ｇ又はＶ，Ｘ_３＝Ｇ又はＡ，Ｘ_４＝Ｇ又はＡ，Ｘ_５＝Ｇ又はＶ，Ｘ_６＝Ｇ又はＶ，Ｘ_７＝Ｇ又はＶ，Ｘ_８＝Ｇ又はＡ，Ｘ_９＝Ｇ又はＡ（配列番号３１）；又は
    ｉｉ）配列番号３２～３８のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
41. 前記ポリペプチドが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項４０に記載の単離ポリペプチド。
42. 配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の単離ポリペプチド。
43. 血液脳関門を移動できる抗体又はその断片に融合された、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
44. 血液脳関門を移動できる抗体又はその断片をさらに含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
45. Ｆｃ断片をさらに含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
46. （ａ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６からなる群から選択される、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はその断片であって、前記ｓｄＡｂ又はその断片が：
    ＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧ（配列番号１）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１配列、ＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ２配列、及びＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹ（配列番号３）のＣＤＲ３配列；
    ＥＹＰＳＮＦＹＡ（配列番号４）のＣＤＲ１配列、ＶＳＲＤＧＬＴＴ（配列番号５）のＣＤＲ２配列、及びＡＩＶＩＴＧＶＷＮＫＶＤＶＮＳＲＳＹＨＹ（配列番号６）のＣＤＲ３配列；
    ＧＧＴＶＳＰＴＡ（配列番号７）のＣＤＲ１配列、ＩＴＷＳＲＧＴＴ（配列番号８）のＣＤＲ２配列、及びＡＡＳＴＦＬＲＩＬＰＥＥＳＡＹＴＹ（配列番号９）のＣＤＲ３配列；
    又は
    ＧＲＴＩＤＮＹＡ（配列番号１０）のＣＤＲ１配列、ＩＤＷＧＤＧＧＸ（式中、ＸはＡ又はＴ）（配列番号１１）のＣＤＲ２配列、及びＡＭＡＲＱＳＲＶＮＬＤＶＡＲＹＤＹ（配列番号１２）のＣＤＲ３配列
    を含む、抗体又はその断片；
    （ｂ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８からなる群から選択される、βアミロイドに結合するポリペプチド；及び
    （ｃ）配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１からなる群から選択されるＦｃ断片
    を含む、融合タンパク質。
47. 前記融合タンパク質がリンカーペプチドをさらに含み；
    前記融合タンパク質が一本鎖ポリペプチドである、請求項４６に記載の融合タンパク質。
48. 前記融合タンパク質が二量体ポリペプチドを形成する、請求項４７に記載の融合タンパク質。
49. 請求項４６～４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬理学的に許容可能な担体とを含む組成物。
50. エフェクター機能が減弱されたＦｃを含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
51. 請求項４６～４８及び５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸又は核酸を含むベクター。
52. アルツハイマー病の症状を改善するための、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクル又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
53. 脳アミロイドβのレベルが増加している対象の脳内の毒性βアミロイドレベルを減少させるのに使用するための請求項５２に記載の医薬組成物。
54. 請求項５３に記載の医薬組成物を対象の体内に導入するステップを含む、脳アミロイドβのレベルが増加している対象の脳内の毒性βアミロイドレベルを減少させるための医薬組成物。

Images