JP7475598B2

JP7475598B2 - １，３－ブタンジオールの製造方法

Info

Publication number: JP7475598B2
Application number: JP2020036634A
Authority: JP
Inventors: 明日香盤若; 潤坪田; 順小川; 重信岸野
Original assignee: Osaka Gas Co Ltd; Kyoto University NUC
Current assignee: Osaka Gas Co Ltd; Kyoto University NUC
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: JP2021136900A

Description

本発明は、ブタンジオール生産菌を用いて１，３－ブタンジオールを製造する方法に関する。

１，３－ブタンジオール（以下、「１，３－ＢＤＯ」とも称する）は、様々な用途に用いられる化合物であり、保湿剤、界面活性剤、吸湿剤、溶剤などの化学品や食品、樹脂などの原料として高い利用価値を有する。また、１，３－ＢＤＯの光学活性体である（Ｒ）－１，３－ブタンジオール及び（Ｓ）１，３－ブタンジオールは、医薬、農薬等の合成原料として高い利用価値を有している。

従来から、１，３－ＢＤＯは、化石資源である石油を原料とする化学合成によりアセトアルデヒドを製造し、このアセトアルデヒドのアルドール縮合によりアセトアルドールとした後、これを水素化することで製造されている。

一方、生物化学的な手法を用いて光学活性な１，３－ＢＤＯを製造する方法として、１，３－ＢＤＯのラセミ体に一方のエナンチオマーを優先的に不斉資化する微生物を作用させて、残存した他方のエナンチオマーを回収する方法（特許文献１）、微生物の不斉還元活性を利用することで、４－ヒドロキシ－２－ブタノンからＲ体又はＳ体の１，３－ＢＤＯを製造する方法（特許文献２）が提案されている。

また、特許文献３には、発酵性基質として糖類やグリセロールを用い、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＡｄｈＥ遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え大腸菌の培養物や菌体、その処理物などの活性物質を発酵性基質に接触させて、生成した１，３－ブタンジオールを回収する手法が提案されている。

特開平２－１９５８９７号公報特開平２－３１６８４号公報特許第５７８７３６０号

特許文献１や特許文献２には、１，３－ＢＤＯを製造する際に、１，３－ＢＤＯのラセミ体や４－ヒドロキシ－２－ブタノンを原料として使用することが提案されているが、１，３－ＢＤＯを製造する際に使用し得る他の原料については明らかになっていない。

また、特許文献３記載の方法では、外来遺伝子を導入した微生物を用いているが、化粧品や食品の原料については、外来遺伝子の導入を伴わない手法により製造されたものであることを望む消費者が多い。外来遺伝子を導入した微生物に組み込まれたＡｄｈＥ遺伝子の産物である酵素を用いる場合にも、酵素が遺伝子組換え微生物由来のものである以上、外来遺伝子の導入を伴わない手法により製造されたものであることを望む消費者の要望に十分に応えられているとは言えず、また、一般的に酵素が高価であるため、生産コストも嵩むという問題もある。

生物化学的な手法を用いて１，３－ＢＤＯを製造する方法を実用化する上では、原料となるより適切な化合物を選定したり、１，３－ＢＤＯ生産性を有する外来遺伝子を導入していない微生物を探索したりすることが極めて重要である。

本発明は以上の実情に鑑みなされたものであり、３－ヒドロキシ酪酸（以下、「３ＨＢ」とも称する）を原料とし、遺伝子組換えでない微生物を用いて１，３－ブタンジオールを製造することができる方法の提供を、その目的とする。

本願発明者は、遺伝子組換えでない手法によって１，３－ＢＤＯを製造する方法について鋭意研究を重ねた結果、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）及びクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）が３ＨＢを基質として還元的に変換することにより１，３－ＢＤＯを生産するという新たな知見を得て、本発明を完成させるに至った。

上記目的を達成するための本発明に係る１，３－ブタンジオールの製造方法の特徴構成
は、ブタンジオール生産菌を、３－ヒドロキシ酪酸を添加した培地において培養する培養
工程を行い、
前記ブタンジオール生産菌として、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株、クロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株のうち少なくともいずれか一方を用いる点にある。

上記特徴構成によれば、培地に添加した３ＨＢを基質として、ブタンジオール生産菌が１，３－ブタンジオールを生成する。したがって、培養工程で得られる培養液から１，３－ブタンジオールを適宜回収することで、遺伝子組換えでない微生物を用いて１，３－ブタンジオールを製造することができる。尚、本願における「ブタンジオール生産菌」には、遺伝子組換えを伴うものを含まず、外来遺伝子の導入を伴わない遺伝子破壊やゲノム編集、突然変異を伴うものが含まれる。
本願発明者は、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株をブタンジオール生産菌として用いた場合に、１，３－ブタンジオールの有意な生成がみられることを実験により確認している。
また、本願発明者は、クロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株をブタンジオール生産菌として用いた場合に、１，３－ブタンジオールの有意な生成が見られることを実験により確認している。

１，３－ブタンジオール生産菌の生産性を確認するための試験の結果をまとめたグラフである。

以下、本発明に係る１，３－ブタンジオールの製造方法に用いるブタンジオール生産菌及び１，３－ブタンジオールの製造方法について説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。以下の説明において、特に言及している場合を除き、「％」とは質量体積％を意味する。

〔ブタンジオール生産菌〕
本発明に係る１，３－ブタンジオールの製造方法で用いるブタンジオール生産菌は、３ＨＢの存在下で生育可能であり、３ＨＢを基質として１，３－ブタンジオールを生成する菌である。具体的に、ブタンジオール生産菌は、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ベイジェリンキから選択される菌である。

本願発明者は、３ＨＢを基質として１，３－ＢＤＯを生産可能な微生物の探索を行ったところ、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株及びクロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株が特に有意な１，３－ＢＤＯ生産性を有することを見出した。したがって、ブタンジオール生産菌は、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株及びクロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株であることが好ましい。尚、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株及びクロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株は、いずれも理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料研究室（ＪＣＭ）から入手可能である。

〔１，３－ブタンジオールの製造方法〕
以下にブタンジオール生産菌を用いた１，３－ブタンジオールの製造方法を説明する。具体的には、３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を添加した培地においてブタンジオール生産菌を培養する培養工程を行う。尚、培養工程を経て生産された１，３－ＢＤＯを回収する操作としては、遠心操作やろ過等の公知の分離操作を採用すればよく、例えば、培養工程で得られた培養液を遠心分離し、得られた上清から抽出することで回収することができる。

＜Ａ：培養工程＞
具体的に、培養工程では、３ＨＢを添加した培地に１，３－ブタンジオール生産菌を植菌し、２０～４０℃程度の温度下において所定時間（例えば１～７日程度）嫌気培養を行う。

＜Ｂ：１，３－ブタンジオール生産菌＞
１，３－ブタンジオール生産菌としては、クロストリジウム・スポロゲネス（好ましくはクロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株）及びクロストリジウム・ベイジェリンキ（好ましくはクロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株）である。尚、ブタンジオール生産菌は、一種のみを使用してもよいし、二種以上を同時に使用してもよい。

＜Ｃ：培地＞
培養工程で用いる培地は、３ＨＢと栄養源を含有する。培地のｐＨは１，３ブタンジオール生産菌の生育条件を満たすｐＨであればよく、例えばｐＨ６～７程度である。

培地に添加する３ＨＢは塩形態であってもよい。また、３ＨＢの添加量は、１，３－ブタンジオール生産菌が生育可能であれば、特に限定されるものではないが、例えば０．１～１．０％である。

培地に配合するエネルギー源としての有機炭素源は、特に限定されないが、例えば、トリプトン、酵母エキス、可溶性デンプン、エタノール、ｎ－プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。また、電子受容体としての炭素源としては、酪酸などの有機酸が挙げられ、これを培地に添加すると、還元反応全体が促進される傾向がある。

また、培地には、必要に応じて種々の無機塩や窒素源を配合してもよい。尚、無機塩や窒素源の配合量は、１，３－ブタンジオール生産菌の生育に影響を及ぼすことなく、１，３－ＢＤＯの生産という目的が達成される範囲において適宜設定すればよい。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。尚、本発明が実施例に限定されないことは言うまでもない。

〔生産性確認試験〕
３種の菌株（サンプル１～３）について、１，３－ＢＤＯ生産性を調べるための確認試験を行った。

＜サンプルについて＞
サンプル１は、ＪＣＭより入手したクロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株である。
サンプル２は、同じくＪＣＭより入手したクロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株である。
サンプル３は、土壌から単離した菌株であって、１６ＳｒＲＮＡ解析によってクロストリジウム属に属することが判明した菌株（ＯＧＳ－Ｃ）である。

＜菌株の培養＞
３ＨＢ含有ＧＡＭ培地（ｐＨ６．５、３ＨＢ含有量が０．５％、グルコース含有量が４．０％）に各サンプル（各菌株）を接種し、３７℃、嫌気条件下において２４時間培養した後（前培養）、同培地で３７℃、嫌気条件下において２４時間培養した（本培養）。本培養後の培養液を３ＨＢ含有ＧＡＭ寒天培地（ｐＨ６．５、３ＨＢ含有量が０．５％、グルコース含有量が４．０％）に塗布し、３７℃、嫌気条件下において２４時間培養した。続いて、３ＨＢ含有ＧＡＭ寒天培地上に得られたコロニーを３ＨＢ含有ＧＡＭ培地に植菌し、３７℃、嫌気条件下において３日間培養した。

＜ＧＣ用サンプルの調製＞
１，３－ＢＤＯを含むジオール類はフェニルホウ酸と架橋を形成して容易に誘導体化される。そこで、まず、培養液を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清の一部について、コスモナイスフィルターＷ（日本ミリポア社製）でろ過した。その後、試験管（１６．６×１００ｍｍ）にろ過後の培養上清を０．８０ｍＬ添加した。続いて、０．１０％の１，２－ブタンジオールを１００μＬ、１．０％のフェニルホウ酸メタノール溶液を１５０μＬ、３０％のＮａＣｌ水溶液を０．２０ｍＬの順で添加した。その後、１０秒間撹拌機で撹拌して懸濁させ、クロロホルムを２．０ｍＬ添加した後、更に１０秒間撹拌して懸濁させた。しかる後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、有機層を試験管に回収し、エバポレーターで約２０倍に濃縮して、これをＧＣ（ガスクロマトグラフィー）用サンプルとした。

＜ＧＣ分析＞
ＧＣ分析には、島津製作所製のＳｈｉｍａｄｚｕＧｃ－１７００ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを用いた。カラムには、ＧＬサイエンス社製のＴＣ－７０（６０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を用いた。検出器にはＦＩＤを用いた。測定条件は以下の通りである。
移動相：ヘリウム
線速：２４ｃｍ／ｓｅｃ
インジェクター温度：２３０℃
検出器温度：２３０℃
カラム温度：１５０℃で５分間保持後、５℃／分で昇温し、１９０℃で１０分間保持
サンプル注入量：１μＬ
スプリット比：１／５０

〔生産性確認試験の結果〕
１，３－ＢＤＯ濃度（ｗ／ｖ％）を表１、１，３－ＢＤＯ濃度（ｍＭ）を表２にまとめた。また、図１は、１，３－ＢＤＯ濃度（ｍＭ）をまとめたグラフである。

表１、表２及び図１から分かるように、各菌株は、いずれも１，３－ＢＤＯ生産性を有している。特に、サンプル１（クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株）は、有意な１，３－ＢＤＯ生産性を示すことがわかる。

したがって、１，３－ブタンジオール生産菌としてクロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ベイジェリンキを用いることで、３ＨＢを基質として１，３－ＢＤＯを生産することが可能であり、特に、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株を用いることで、１，３－ＢＤＯの生産量を高められる。

本発明に係る１，３－ブタンジオールの製造方法は、ブタンジオール生産菌を用いて１，３－ブタンジオールを製造するために利用することができる。

Claims

ブタンジオール生産菌を、３－ヒドロキシ酪酸を添加した培地において培養する培養工程を行い、
前記ブタンジオール生産菌として、クロストリジウム・スポロゲネスＪＣＭ７８５０株、クロストリジウム・ベイジェリンキＪＣＭ１３９０株のうち少なくともいずれか一方を用いる、１，３－ブタンジオールの製造方法。