JP7499267B2 - Ａｔｘｎ２発現を調節するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、アタキシン２をコードする核酸（ＡＴＸＮ２）に相補的であり、それを標的とし、ＡＴＸＮ２の発現の低下をもたらすオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＡＴＸＮ２発現の低下は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態を含む、神経変性疾患などの広範囲の医学的障害に有益である。

ＡＴＸＮ２遺伝子内の３１個以上のＣＡＧ反復により生じる、アタキシン２（ＡＴＸＮ２）の拡張したグルタミン反復は、希少な神経変性障害である脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）を引き起こす。さらに、拡張したＣＡＧ反復は、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）との、ＲＮＡに依存した相互作用による、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の遺伝性危険因子である。ＴＤＰ－４３タンパク質症に関係する他の神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびパーキンソン症候群である。近年、ＡＬＳ関係マウスモデルである、ＴＤＰ－４３導入遺伝子マウス（ＴＤＰ－４３^Ｔ／Ｔｇ）は、Ａｔｘｎ２陰性マウスと交配され、寿命が有意に延び、ＴＤＰ－４３^Ｔ／Ｔｇ Ａｔｘｎ２^－／マウスの運動機能が改善された（Ｂｅｃｋｅｒら ２０１７ Ｎａｔｕｒｅ ５４４：３６７－３７１）。同じ記事において、ＡＴＸＮ２を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置をしたＴＤＰ－４３^Ｔ／Ｔｇマウスは、寿命が延び、運動性能が改善したことが示された。
ＡＴＸＮ２を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第２０１７／１７５１１３号、国際公開第２０１５／１４３２４６号、および同第２０１７／１１７４９６号でも記載されており、特に国際公開第２０１７／１１７４９６号は、ＡＬＳの処置に関する。Ｓｃｏｌｅｓら ２０１７ Ｎａｔｕｒｅ ５４４：３６２は、小脳にてＡＴＸＮ２を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力について評価しており、ＳＣＡ２に対する潜在的な治療法を示す、プルキンエ細胞への局在化を示した。

発明の目的
本発明は、インビボおよびインビトロの両方にてＡＴＸＮ２を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的にされ、効果的なＡＴＸＮ２阻害をもたらし得る、ヒトＡＴＸＮ２ プレｍＲＮＡのイントロン９に存在する、特異的な標的配列を識別した。特に、配列番号１の位置８３１１８～８３１４６を標的にするのが、ＡＴＸＮ２の低下という観点から有利である。

本発明はまた、ＡＴＸＮ２を阻害可能な、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および化合物、ならびに、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態を含む、神経変性疾患などの疾患または障害の処置における、これらの使用も提供する。

本発明は、ヒトアタキシン２（ＡＴＸＮ２）転写物を標的とし、ＡＴＸＮ２の発現を阻害し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

本発明は、式
ＴＣＡｃＡｔｔｔｔａｃｔｔｔａａｃＣＴＣ（配列番号１５＿４）
（式中、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃが５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）
で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、式

のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩を提供する。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容され得る塩の形態である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容され得るナトリウム塩の形態である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容され得るカリウム塩の形態である。

本発明は、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲートを提供する。代替的に記述をすると、いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コンジュゲート化オリゴヌクレオチドの形態である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはコンジュゲート化していない。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、例えば滅菌リン酸緩衝生理食塩水を含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で製剤化される。希釈剤はリン酸緩衝生理食塩水であり得る。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば２～３０または２～５０ｍｇ／ｍＬ、または例えば４～３０ｍｇ／ｍＬの濃度にて、薬学的に許容され得る希釈剤の中で製剤化される。希釈剤はリン酸緩衝生理食塩水であり得る。

本発明は、ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞内でＡＴＸＮ２発現を調節するための方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を、有効量で上記細胞に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、方法はインビボ法である。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞、例えば小脳細胞、例えばプルキンエ細胞、または皮質細胞である。

本発明は、医薬品に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物を提供する。

本発明は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患からなる群から選択される疾患の処置に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物を提供する。

本発明は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３を伴う状態からなる群から選択される疾患などの、神経変性疾患の処置または予防のための医薬を調製するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物の使用を提供する。

本発明は、治療的、または予防的有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物を、疾患を患う、または疾患に罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を処置または予防するための方法であって、上記疾患が、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患からなる群から選択される、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、疾患は脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）である。

いくつかの実施形態では、疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。

さらなる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントと、を含む、医薬組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞にてＡＴＸＮ２発現を調節するための、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を有効量で上記細胞に投与することによる、インビボまたはインビトロ法のための方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ＡＴＸＮ２のインビボ活性と関連する疾患、障害、または機能障害を処置または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを、上記疾患、障害、または機能障害を患う、またはこれに罹患しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。

さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、神経変性疾患、例えば、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患の処置または予防のために使用される。

さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置または予防のために使用される。

図１は、化合物１５＿４（核酸塩基の配列を配列番号１５に示す）を示す。図１に示す化合物は、プロトン化形態で示され、ホスホロチオエート結合上のＳ原子がプロトン化されている。プロトンの存在は分子の環境の酸性度、および、代替のカチオンの存在（例えば、オリゴヌクレオチドが塩形態である場合）によって変化することが理解されよう。プロトン化ホスホロチオエートは互変異性形態で存在する。 図２は、ヒト細胞株における、ヒトＡｔａｘｉｎ２ プレｍＲＮＡ配列の全体にわたる、１５００種類を超える化合物の標的化のスクリーニングを示す。化合物７＿１を中空の菱形として示す。 図３は、図６に従った、化合物のみを標的にするホットスポット領域の配列番号６を示す。化合物７＿１を中空の菱形として示す。 図４は、化合物３７＿１（ＡＳＯ７）と比較した、化合物７＿１および１５＿４のインビトロでの有効性の評価を示す 図５は、インビボマウス研究－１１個の選択した化合物のノックダウン（ｍＲＮＡ）の比較、３つの実験からのコンパイルデータを示す。研究１＝黒丸、研究２＝白丸、研究３＝白黒が半分ずつの丸。 図６は、インビボマウス研究－タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、皮質領域、小脳領域における化合物７＿１への曝露を示す。皮質に対するタンパク質データを示す。 図７は、インビボマウス研究－タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、皮質領域、小脳領域における化合物１５＿４への曝露を示す。皮質に対するタンパク質データを示す。 図８は、マウスのインビボ研究、１５０μｇの化合物７＿１および化合物１５＿４を脳室内（ＩＣＶ）投与した後の時間経過を示す（７日目のみに測定）。 図９は、ＮＨＰインビボＰＫ／ＰＤ研究－、４、８、または２４ｍｇ（化合物７＿１）、および８ｍｇの化合物１５＿４を投与した後、処置の１４日後に測定した主要組織におけるｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを示す。 図１０は、ＮＨＰインビボＰＫ／ＰＤ研究－４、８、または２４ｍｇ（化合物７＿１）、および８ｍｇの化合物１５＿４を投与した後、処置の１４日後に測定した、主要組織におけるｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを示す。データは、２つの化合物の相対的な特異的活性を示すために提示されている。

定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に一般的に理解されているように、共有結合した２つ以上のヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾に対して言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシド等の１種以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。

連続するヌクレオチド配列
用語「連続するヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中で用語「連続する核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域を含み、任意に、さらなるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のためには、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つまたは複数のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称され得る。

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価のＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つまたは複数の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、本明細書で用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾された「単位」または修飾された「モノマー」と互換的に使用され得る。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。

有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、またはオリゴヌクレオチドの全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

ホスホロチオエート結合は、例えば以下に示すように、種々の互変異性形態で存在し得る。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、非天然のバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１に記載されている。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾されたプリンまたはピリミジン、例えば、置換されたプリンまたは置換されたピリミジン、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示し得、各文字は、等価の機能の修飾核酸塩基を任意に含み得る。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献で使用されている用語である。

相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば、５－メチルシトシンは多くの場合シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４５巻、第２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 付録３７ １．４．１を参照されたい）。

用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列または配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

以下は、標的配列に完全に相補性であるオリゴヌクレオチドの例である。

以下は、標的配列（配列番号６）に完全に相補性であるオリゴヌクレオチド（配列番号１５）の例である。
５’ ｔｔａａｇｇａｇｇｔｔａａａｇｔａａａａｔｇｔｇａａｔｔｔ ３’（配列番号：６）
３’ ｃｔｃｃａａｔｔｔｃａｔｔｔｔａｃａｃｔ ５’（配列番号１５）

同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対との間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解されるべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔ_ｍ）によって表される。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連付けられる（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応のΔＧ°が非常に低ければ、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが強いことを示している。ΔＧ°は、水中濃度が１Ｍ、ｐＨが７、および温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６-３８、およびＨｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定し得る。ΔＧ°測定のために、市販の装置が入手可能であることは当業者には公知であると思われる。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０-１４６５に記載の最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いて（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１１２１１-１１２１６、およびＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：５３８８-５４０５に記載された適切に誘導された熱力学的パラメータを使用し）、数値的に推定し得る。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ゜値で標的核酸にハイブリダイズする。

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＡＴＸＮ２をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＡＴＸＮ２標的核酸と称され得る。

好適には、標的核酸はＡＴＸＮ２タンパク質、特に哺乳動物ＡＴＸＮ２、例えば、ヒト、サル、ラット、およびブタＡＴＸＮ２に対するｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡ配列を付与する、ヒトＡＴＸＮ２（例えば表２および表３を参照）をコードする。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、および５、またはそれらの自然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物Ａｔａｘｉｎ２タンパク質をコードする配列）からなる群から選択される。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

インビボまたはインビトロでの適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＡＴＸＮ２標的核酸を発現している細胞内のＡＴＸＮ２標的核酸の発現を阻害し得る。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合により１つまたは２つのミスマッチを除いて、また場合により、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、または他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’またはＤ’’）を除いて、ＡＴＸＮ２標的核酸に相補的である。標的核酸は、いくつかの実施形態では、成熟ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡなどのメッセンジャＲＮＡといったＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、ヒトＡＴＸＮ２などの哺乳動物Ａｔａｘｉｎ２タンパク質、例えば、配列番号１に開示されているものなどの、ヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ配列をコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。例示的な標的核酸に関するさらなる情報は、表２および表３に提供される。

Ｆｗｄ＝フォワード鎖 ゲノム座標は、プレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）を提供する。ＮＣＢＩ参照は、ｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）を提供する。
＊アメリカ国立生物工学情報センター参照配列データベースは、ゲノム、転写物およびタンパク質を含む、包括的で統合された、冗長性のない、十分に注釈が付けられた参照配列のセットである。これはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ．で主催されている。

標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列または標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡイントロン９から選択される配列である（上記表１を参照のこと）。

本発明の一実施形態では、標的配列は配列番号６である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的またはハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。

オリゴヌクレオチドが相補的またはハイブリダイズする標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～５０ヌクレオチド、例えば１２～３０、例えば１４～２０、例えば１５～１８連続ヌクレオチドである。

標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えば、サル細胞もしくはヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、プルキンエ細胞などのプルキンエニューロンであり得る。他の関係する標的細胞は、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンなどの、運動ニューロンである。

インビトロ評価のために、標的細胞は、Ａ４３１またはＵ２－ＯＳ細胞などの、確立された細胞株であり得る。あるいは、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＣＳ）に由来する運動ニューロン（例えば、Ｓａｎｃｅｓら ２０１６ Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９（４）：５４２－５５３を参照のこと）、または、ｉＰＣＳ由来のプルキンエ細胞（Ｗａｎｇら ２０１５ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：９２３２）を、インビトロスクリーニングのために使用し得る。

好ましい実施形態では、標的細胞は、ＡＴＸＮ２ プレｍＲＮＡまたはＡＴＸＮ２成熟ｍＲＮＡなどのＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡを発現する。ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では考慮されない。
天然に存在するバリアント

用語「天然に存在するバリアント」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、または多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＡＴＸＮ２遺伝子または転写産物のバリアント、および対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸およびその天然に存在するバリアントを標的とし得る。

いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物ＡＴＸＮ２標的核酸、例えば配列番号１、２、３、４、および５からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＡＴＸＮ２標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。

発現の調節
本明細書で使用される用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＡＴＸＮ２の量と比較したときに、ＡＴＸＮ２の量を変更するオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処置された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処置された個体もしくは標的細胞であると一般的に理解されている。

調節の１つのタイプは、例えばｍＲＮＡの分解または転写の遮断により、ＡＴＸＮ２の発現を阻害、減少、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低下、回避、または終了するオリゴヌクレオチドの能力である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは有利に、ヒトＡＴＸＮ２などの哺乳動物ＡＴＸＮ２の発現を阻害し得る。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば融解温度（Ｔ^ｍ）によって測定して、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２^℃、より好ましくは＋１．５～＋１０^℃、最も好ましくは＋３～＋８^℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合に糖部分の修飾を有する、１つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。

リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。

そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。その他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはモルホリノ核酸の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられたヌクレオシドも含まれる。

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシド内に天然に見られる２’－ＯＨ基に変化させることを介して行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位で導入され得る。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨもしくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、またはリボース環の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）ヌクレオシドである。

実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、結合親和性の向上および／またはヌクレアーゼ耐性の増大をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡおよび２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下に、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドを例示する。

本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）

「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに取り込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは通常、オリゴヌクレオチド／相補的二重鎖の融解温度を測定することにより決定され得る。

非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈら．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、Ｍｉｔｓｕｏｋａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、ならびにＷａｎおよびＳｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。

さらなる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。

スキーム１：

特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。

特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。

本明細書に記載の化合物は、数個の不斉中心を含み得、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在し得る。

用語「不斉炭素原子」は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」または「Ｓ」立体配置のものであり得る。

薬学的に許容され得る塩
用語「薬学的に許容され得る塩」は、生物学的にも別様にも望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持している塩を指す。

保護基
用語「保護基」は、単独または組合せで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われることができるように、多官能化合物の反応性部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基を、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。

ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能し得、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅ Ｈなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を動員し得る。ヌクレアーゼ媒介機構を介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、通常少なくとも５または６の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテイルマーが片側または両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。

ＲＮａｓｅ Ｈ活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成する場合にＲＮａｓｅ Ｈを動員する、その能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力の決定に使用することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１が、Ｌｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計とも称され得る。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップおよび３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’→３’方向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）、および１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）と隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続するヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。

例として、本発明のギャップマー型オリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_６－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_８－１６－Ｆ’_２－８
但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなり、またはこれを含み、領域ＦおよびＦ’は独立して、１～８個、例えば２～６個、例えば３～４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、またはこれからなり、（領域ＧのＤＮＡヌクレオシドに隣接した）領域Ｆの３’末端に位置する、少なくとも１つの２’糖修飾ヌクレオシドが存在し、（領域ＧのＤＮＡヌクレオシドに隣接して位置する）領域Ｆ’の５’末端に位置する、少なくとも１つの２’糖修飾ヌクレオシドが存在し、Ｇは、６～１６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば１０～１５個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば、１０～１４個の連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば１１～１５個の連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば１３～１５個の連続ＤＮＡヌクレオチドの領域などの、ＲＮａｓｅ Ｈを動員可能な、６～１６個のヌクレオシドの領域である。

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方が、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］_１－５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に規定したとおりである。

交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、それらがＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。「交互フランクギャップマー」はそれ故、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（ＦまたはＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである。

交互フランク領域は、１～２つ、または１つ、または２つ、または３つの連続するＤＮＡヌクレオシドなどの最大３つの連続するＤＮＡヌクレオシドを含み得る。

オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’またはＤ”
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ－Ｇ－Ｆ’、ならびにさらに５’および／または３’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ”と称され得る。

領域Ｄ’またはＤ”の付加は、連続するヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連続するヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と連結するために使用する場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。

領域Ｄ’およびＤ”は、それぞれ、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合して、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”またはＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

領域Ｄ’またはＤ”は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’またはＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’またはＤ”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号パンフレットに開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断性リンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号パンフレットに開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続するヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ”を含む。

オリゴヌクレオチドギャップマーを下記式で表し得る：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ_１－８－Ｇ_６－１６－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_６－１６－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＦ_１－８－Ｇ_６－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ”_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_６－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ”_１－３。

いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ”との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。

１つまたは複数の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬効薬理を改善し得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織、または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官におけるオフターゲット活性または活性）。

一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組合せからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１４３３７９号に開示されているような、トランスフェリン受容体に対して特異的親和性を有する抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体または抗体断片、例えば脳血液関門を通過する送達を促進する抗体または抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片である。

リンカー
結合またはリンカーは、１つまたは複数の共有結合を介して、ある目的の化学基またはセグメントを別の目的の化学基またはセグメントに結合する、２個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、または結合部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第３の領域（領域Ｃ）を、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列などの第１の領域（領域Ａ）に共有結合させるよう機能する。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）を含み得る。

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常見られる条件下、または見られるものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、哺乳動物細胞で見られる、または見られるものに類似した、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または酸化もしくは還元剤、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどに由来する、哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１～１０個のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオシドを含み、より好ましくは２～６個のヌクレオシドを含み、最も好ましくは２～４個の結合したヌクレオシドを含み、これは少なくとも３または４または５つの連続するホスホジエステル結合などの少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている－本明細書の領域Ｄ’またはＤ”も参照されたい。

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、鎖構造、またはエチレングリコール、アミノ酸単位もしくはアミノアルキル基などの繰返し単位のオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－ＣまたはＡ－Ｙ－Ｃから構築し得る。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

処置
本明細書で使用される用語「処置」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の処置、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。

いくつかの実施形態では、治療は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態を含む神経変性疾患からなる群から選択される神経障害といった、神経障害を患うと診断されている患者にて実施される。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置で使用するためのものである。

本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、式
ＴＣＡｃＡｔｔｔｔａｃｔｔｔａａｃＣＴＣ（配列番号１５＿４）
（式中、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃが５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）
で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、トランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片など、血液脳関門を通過する送達を促進するコンジュゲートである。

製造方法
さらなる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻、第２８７～３１３頁を参照されたい）。さらなる実施形態において、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様において、本発明の組成物を製造する方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、方法が提供される。

薬学的塩
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。

医薬組成物
さらなる態様において、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中５０～３００μＭ溶液の濃度で使用される。

本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体およびアジュバントの適切で好ましいさらなる例を提供している（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容され得る活性または不活性物質と混合することができる。医薬組成物の調製のための組成物および方法は、限定するものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、または滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９、または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であると思われる。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。

いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。

用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用し得る。

研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）および実験動物におけるＡｔａｘｉｎ２タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進し得る。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、またはタンパク質を生成する遺伝子もしくはｍＲＮＡのモジュレーターを分解もしくは阻害することによって達成される。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

本発明は、ＡＴＸＮ２を発現している標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法を提供し、この方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを前記細胞に有効量で投与することを含む。

いくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、インビトロ細胞培養物または哺乳動物の組織の一部を形成するインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、脳幹および脊髄を含む、脳または中枢神経系に存在する。特に、小脳内の細胞は、特に、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の影響を受けた個体において、関係する標的細胞、例えばプルキンエニューロンまたはプルキンエ細胞である。

他の関係する標的細胞は、脳の皮質、および脊髄中に位置する運動ニューロンである。運動皮質内の上位運動ニューロン、ならびに、脳幹および脊髄内の下位運動ニューロンは、本発明の標的細胞である。特に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の影響を受ける個体の運動ニューロンは、関係する標的細胞である。

診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術により、細胞および組織におけるＡＴＸＮ２発現を検出および定量することができる。

治療のために、オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ２の発現を調節することによって処置し得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトに投与し得る。

本発明は、疾患を処置または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物を、疾患を患う、またはそれに罹りやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。

本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、組成物またはコンジュゲートに関する。

本発明に従ったオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。

本発明はまた、本明細書で言及される障害の処置のための医薬の製造のため、または本明細書で言及される障害の処置方法のための、上記本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。

本明細書で言及される疾患または障害は、ＡＴＸＮ２の発現に関連している。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、伸長ＣＡＧ反復領域などの、ＡＴＸＮ２遺伝子内での変異と関連している場合がある。疾患または障害は、タンパク質生成物がＡＴＸＮ２と関連している、または相互作用する遺伝子と、関連している場合がある。特に、ＴＤＰ－４３タンパク質症と関連する疾患において、ＡＴＸＮ２の低減は、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびパーキンソン症候群において、有益な効果を有し得る。

本発明の方法は、好ましくは、ＡＴＸＮ２の異常なレベルおよび／または活性によって引き起こされる疾患の処置または予防のために使用される。

本発明はさらに、ＡＴＸＮ２の異常なレベルおよび／または活性の処置のための医薬を製造するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。

一実施形態において、本発明は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態を含む、神経変性疾患から選択される疾患または障害の治療で使用するための、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物に関する。特に、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療における、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド抱合体、または医薬組成物の使用が有利である。

投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、眼内、または髄腔内投与など）を介して投与することができる。

いくつかの実施形態では、投与は、髄腔内投与を介する。

有利には、例えば神経学的障害の治療のために、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、髄腔内または頭蓋内に、例えば脳内または脳室内投与を介して投与される。

本発明はまた、皮下投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩または組成物などのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用を提供する。

本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩または組成物などの、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用を提供する。

本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である医薬の製造のために記載されるような本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
併用療法

いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、別の治療剤との併用処置で使用される。治療剤は、例えば、上記の疾患または障害の標準的な治療であり得る。

実施例
材料および方法
オリゴヌクレオチドモチーフ配列およびオリゴヌクレオチド化合物

モチーフ配列は、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列を表す。

設計とは、ギャップマー設計の「Ｆ－Ｇ－Ｆ’」を意味し、各数字は、連続した修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数を表し（最初の数＝５’隣接）、それにＤＮＡヌクレオシドの数が続き（２つ目の数＝ギャップ領域）、それに修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数が続き（３つ目の数＝３’隣接）、任意に、ＤＮＡおよびＬＮＡのさらなる繰返し領域が先行する、または後に続き、これらは必ずしも、標的核酸に相補的な連続ヌクレオチド配列の一部ではない。

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字は、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡのＣは全て５－メチルシトシンであり、５－メチルＤＮＡのシトシンは全て「ｅ」で表され、ヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用する装置、支持体および濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されている場合がある。

オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８のホスホロアミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで用いて、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の終わりに、水性アンモニアを使用して６０℃で５～１６時間、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切断する。オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）または固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特徴付けられ、分子量はさらにＥＳＩ－ＭＳによって確認される。

オリゴヌクレオチドの伸長：
β－シアノエチル－ホスホロアミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、またはＬＮＡ－Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイトおよびアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）の溶液を活性剤として用いて行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカー、またはそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を使用することにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を使用して導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。

固相合成後のコンジュゲーションでは、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーホルフォラミダイトを使用でき、脱保護および固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが分離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。

ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラムでの取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速でバッファーとして使用する。収集された画分は凍結乾燥されて、精製された化合物が典型的には白色固体として得られる。

略語：
ＤＣＩ ４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｔ_ｍアッセイ

オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖は、５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈され、５００ｍｌの２ｘＴ_ｍバッファー（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）と混合される。この溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで、室温で３０分間アニールする。二重鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）は、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ペルチェ温度プログラマＰＴＰ６を備えたＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定する。温度を２０oＣから９５oＣに上昇させ、次いで２５oＣに低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解およびアニーリングの両方の極大値を使用して、二重鎖Ｔ_ｍを評価する。

細胞株

実施例１ ２５および５μＭにおける、Ａ４３１、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＡＲＰＥ１９細胞株での、ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
配列番号１の位置８３１２１～８３１４４の領域を標的にする、表４のＬＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、３つのヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを行った。ヒト細胞株のＡ３４１、ＮＣＩ－Ｈ２３、およびＡＲＰＥ１９を、表５に列挙する販売者から購入し、５％ＣＯ２で３７℃にて、加湿したインキュベーター内で、供給元により推奨される方法で維持した。スクリーニングアッセイのために、細胞を、供給元により推奨される培地内で９６マルチウェルプレートに播種した（材料および方法セクションの、表５を参照のこと）。１ウェル当たりの細胞数は、各細胞株に対して最適化されている（材料および方法セクションの、表５を参照のこと）。

オリゴヌクレオチドの添加前に、（ＰＢＳに溶解させた）５または２５μｍの濃度にて、細胞を０～２４時間の間でインキュベートした。オリゴヌクレオチドを添加した３～４日後に、細胞を回収した（各細胞株に対するインキュベーション時間は、材料および方法セクションにおける表５に示されている）。

ＲＮＡを、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６キット（７４１８２）を使用して抽出した。ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲを、ｑＳｃｒｉｐｔ ＸＬＴワンステップＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ Ｌｏｗ ＲＯＸ、９５１３４－１００（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。標的転写産物のレベルを、ＶＩＣ標識したＧＵＳＢ対照と共に、複数の反応において、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎアッセイを使用して定量化した。対象のＡＴＸＮ２（Ｈｓ０１００２８３３＿ｍ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ））、およびハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢ（４３２６３２０Ｅ ＶＩＣ－ＭＧＢプローブ）の標的転写物に対する、ＴａｑＭａｎプライマーアッセイ。技術的なデュプレックスセットアップを使用した（ｎ＝１、生物学的複製）。

相対的なＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの発現レベルを表６に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として示す。すなわち、値が小さいほど、阻害は大きい。

実施例２：Ａ４３１、ＮＣＩ－Ｈ２３、Ｕ２５１、およびＵ２－ＯＳ細胞株における、実施例１から選択した化合物のインビトロＥＣ５０および有効性の試験。
以下のオリゴヌクレオチド濃度：５０、１５．８１、５．００、１．５８、０．５０、０．１６、０．０５、および０．０１６μＭ（半対数希釈、５０μＭから８箇所）、およびｎ＝１～２の生物学的複製にて、実施例１に記載するアッセイを使用して、５μＭにおいて、ＮＣＩ－Ｈ２３細胞で２０％未満の残留ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡを示す実施例１のオリゴヌクレオチドの、ＥＣ５０および有効性（ＫＤ）を測定した。

材料および方法のセクションの表５に、２つのさらなる細胞株に関する条件を示し、細胞株Ｕ２－ＯＳに使用したＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、ＡＴＸＮ２、Ｈｓ００２６８０７７＿ｍ１（ＦＡＭ－ＭＧＢ）、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ、４３２６１３７Ｅ（ＶＩＣ－ＭＧＢ）である。実施例１で使用した細胞株に帯するＴａｑＭａｎプライマーは、この実施例でも同一であった。

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を使用してＥＣ５０値を計算し、５０μＭにおけるＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの最大低減（Ｍａｘ ＫＤ）を表に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の％として示す。表７～表１０に、各細胞株に対する結果を示す。

実施例３：「領域１２」を標的にする化合物と、ヒトＡＸＴＮ２にまたがり標的にする化合物の比較
ＡＴＸＮ２ プレｍＲＮＡ配列（配列番号１）にまたがり、１５００個を超えるＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを設計し、０．５μＭの低用量におけるそれらのインビトロ潜在性を、Ａ４３１およびＵ２ＯＳ細胞で評価した。結果を図２にまとめている。実線円として表されるホットスポット領域（配列番号６）が、潜在性の高い化合物を提供することが、データから確認される。図３は、選択したホットスポット領域化合物のみを示す。

実施例４ ０．５μＭにおける、Ｕ２ＯＳおよびＡ４３１細胞株での、ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
配列番号１の位置８３１２１～８３１４４の領域もまた標的にする、表１１のＬＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、３つのヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを行った。上記実施例に記載のとおりである。相対的なＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ発現レベルを表１１に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として示す。すなわち、値が小さいほど、阻害は大きい。

化合物に関して、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

実施例５：選択した化合物のインビトロＥＣ５０および有効性の試験
実施例２に記載の方法論を使用し、開始濃度として１０ｍＭを使用して、実施例３で試験した化合物のＥＣ５０を測定した。ＥＣ５０値を以下のとおりに計算した：

実施例６：マウス一次皮質ニューロン細胞における、先行技術の化合物ＡＳＯ７（化合物３７＿１）と比較した、選択した化合物７＿１および１５＿４の評価。
化合物３７＿１＝ｇｔｇｇｇａｔａｃａａａｔｔｃｔａｇｇｃ（式中、下線付き太文字は２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを表し、太字でない文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ヌクレオシド間結合は全てホスホロチオエートである（Ｓｃｈｏｌｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ、第５４４巻、第３６２～３６６頁（２０１７年４月２０日）に開示しているとおり）。

マウス一次皮質ニューロン細胞培養の調製
標準的な手順に従い、１５日齢のマウスの胚脳から、一次皮質ニューロン培養物を調製した。手短に言うと、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で２～３時間、培養皿をポリ－Ｌ－リジン（５０μｇ／ｍｌポリ－Ｌ－リジン、１０ｍＭ Ｎａテトラボレート、ｐＨ８の緩衝液）でコーティングした。皿を、使用前に１×ＰＢＳで洗浄した。回収したマウス胚脳をかみそりの刃で切開して均質化し、３８ｍｌの切開培地（ＨＢＳＳ、０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ペニシリン／ストレプトマイシン）に浸した。トリプシン２ｍｌを添加し、細胞を３７^℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、４ｍｌのトリプシンストッパーを添加し、細胞を遠心分離した。

細胞を２０ｍｌ ＤＭＥＭ（＋１０％ ＦＢＳ）に分散させて、さらなる均質化のために、１３ｇの針を備えた注射器に通した。この後、５００ｒｐｍで１５分間遠心分離をした。上清を取り除き、細胞をＤＭＥＭ（＋１０％ ＦＢＳ）に分散させて９６ウェルプレート（１００μｌ中に、０．１×１０＾６細胞／ウェル）に播種した。神経細胞細胞培養物は、播種後直接使用する準備ができていた。

マウス一次皮質ニューロン細胞培養物におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング
翌日、培地を、９６ウェルプレート中の増殖培地（Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｂ２７上清、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン－ストレプトマイシン）および５μＭ ＦｄＵに変更し、所望濃度にて６日間、オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。ＲＮＡを全て細胞から分離し、ノックダウン有効性をｑＰＣＲ分析により測定した。ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、ＲＰＬ４、Ｍｍ．ＰＴ．５８．１７６０９２１８、またはＲＰＳ２９、Ｍｍ．ＰＴ．５８．２１５７７５７７のいずれかのデュプレックスで実施する、１つのＡＴＸＮ２プローブセット（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（ＡＴＸＮ２＿ａｓｓａｙ１、Ｍｍ．ＰＴ．５８．７１７８３４１）と共に、各サンプルを二連で実行した。各反応物に、以前に希釈した４μＬのＲＮＡ、０．５μＬの水、および５．５μＬのＴａｑＭａｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。

相対検量線法を使用してデータを分析し、各サンプルをまず、２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ４およびＲＰＳ２９）の幾何平均に正規化した後、未処理の対照動物の割合として表現した。
使用した化合物：７＿１、１５＿４、および３７＿１（ＡＳＯ７）
結果を図４に示す。

実施例７：インビボＩＣＶマウス研究
動物の管理
カゴ１つ当たり５～６匹を収容したＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃメスマウス（１６－２３ｇ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｊｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にて、化合物のインビボ活性および忍容性を試験した。動物を一定の温度（２２±２℃）および湿度（５５±１０％）に維持したコロニー室で保持し、１２時間／日照射した（０６００時間点灯）。全ての動物は試験期間中、自由に食物および水を摂取し得た。全てのマウスプロトコルは、デンマーク動物実験国内倫理委員会（Ｄａｎｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｅｔｈｉｃｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって承認された。

投与経路－脳室内注射。
化合物を脳室内（ＩＣＶ）注射によりマウスに投与した。ＩＣＶ投与前にマウスの体重を測定し、イソフルランまたはプロポフォールで麻酔した（３０ｍｇ／ｋｇ）。脳室内注射は、皮膚および頭蓋骨を通り右側脳室中へ正確な距離（３．９ｍｍ）を貫通するように調節されたスタンドに固定された２３ゲージ針を装着したＦＥＰカテーテルを有する、ハミルトン・マイクロ・シリンジを用いて行った。注射されるマウスは、片手の親指と人差し指とで首のひだを保持した。優しくではあるがしっかりとした圧力をかけ、針が頭蓋骨の正中線の右１～２ｍｍ（内側外側）と目の後ろ１～２ｍｍとを貫通するように頭を上に押した。試験化合物またはビヒクルのボーラスを、以前に測定した注入速度にて、３０秒間注射した。還流を避けるために、マウスをさらに５秒間この位置で保持した後、針から離れるように注意深く下方に引き抜いた。この手順は手術または切開を必要としない。この手順から回復するまで動物を加熱ランプ下に置いた。脳組織（皮質および小脳）、ならびに肝臓および腎臓皮質を、投与の２または４週間後に、薬剤濃度分析、ならびにＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質分析のために、ドライアイス上で収集した。

３つの独立実験を、下表（表１３）に示すとおりに、種々の化合物の群で実施した。

化合物３６＿１＝ＴＣＣａｔｔａａｃｔａｃｔＣＴＴＴ（大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。）

忍容性の結果：
国際公開第２０１６／１２６９９５号に記載されているとおりに動物の挙動を監視することで、急性の毒性を測定した（実施例９を参照のこと）。慢性毒性を、実験の時間経過中の、各動物の体重を監視することで測定し、５％を超える体重減少は、慢性毒性を示す。毒性の兆候を示した顕著な動物を安楽死させ、場合によっては実験を早く終えた（高い割合で動物が毒性の兆候を示す場合、全ての動物を安楽死させた）。

実験１
化合物７＿１：いずれの動物も、急性の毒性の兆候は示さなかった。１匹のマウスが、実験中（２７日間）に体重減少を示した。

化合物１４＿１：１０匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの８匹の動物のうち５匹が、実験中（８日目に終了）に体重減少を示した。

化合物１５＿１：１０匹の動物のうち１匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの８匹の動物の全てのうち、５匹が実験中（８日目に終了）に体重減少を示した。

実験２
化合物３７＿１（ＡＳＯ７）は１０匹の動物全てにおいて急性の毒性を示し、投与後３０分以内に深刻な痙攣を伴い、投与の１時間後に安楽死させる必要があった。

化合物３６＿１：１０匹の動物のうち３匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの７匹の動物のうち４匹が、実験中（１２日目に終了）に体重減少を示した。

化合物１７＿１：いずれの動物も、急性の毒性の兆候は示さなかった。１０匹の動物のうち２匹が、実験中（２９日間）に体重減少を示した。

化合物１８＿１：１０匹の動物のうち１匹が急性の毒性を示し、安楽死させた。残りの９匹の動物のうち３匹が、実験中（２９日間）に体重減少を示した。

実験３
化合物１５＿３：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹のうち、２匹が、実験中（１５日目に終了）に体重減少した。

化合物１５＿４：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹の動物はいずれも、実験中（１４日で終了）に体重減少を示さなかった。

化合物１４＿３：６匹の動物のうち１匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの５匹のうち、３匹が、実験中（９日目に終了）に体重減少した。

化合物１４＿２：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹のうち、３匹が、実験中（１５日目に終了）に体重減少した。

化合物１５＿２：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹のうち、３匹が、実験中（１０日目に終了）に体重減少した。

化合物１５＿５：６匹の動物は全て急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。

オリゴ含有量およびＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ分析のための、組織の均質化
Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを使用して、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）にて、マウスの脳、肝臓、および腎臓サンプルを均質化した。ホモジネートを完全に溶解させるため室温で３０分間インキュベートした。溶解後、ホモジネートを３分間１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を分析に使用した。半分を生物学的分析のために取っておき、もう半分に関して、ＲＮＡ抽出を直接継続した。

オリゴ含有量分析
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法を用いて、１０～５０倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ、およびジゴキシゲニン抱合体化ＬＮＡ検出プローブ（５ｘＳＳＣＴにて両方３５ｎＭ、それぞれ、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に相補性である）を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、３０分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた（Ｎｕｎｃカタログ番号４３６０１４）。

プレートを室温で１時間インキュベートし、２ｘＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、および０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．０）で洗浄した。アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１１０９３２７４９１０）およびアルカリホスファターゼ基質系（Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ基質、ＫＰＬ製品コード：５０－８８－００）とコンジュゲートした抗ＤＩＧ抗体を使用して、捕捉したＬＮＡ二重鎖を検出した。オリゴ複合体の量を、Ｂｉｏｔｅｋリーダーにて６１５ｎｍにおける吸光度として、測定した。

データを組織重量に対して正規化し、オリゴのｎＭとして表現した。

ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの減少
ＲＮＡを、キットＣｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔを用いるＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、３５０μＬの上清から精製した。ＲＮＡサンプルを、ＲＮａｓｅフリー水中で２ｎｇ／μＬに標準化し、およびさらなる使用まで－２０℃で保存した。

ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、デュプレックス（ＲＰＬ４、Ｍｍ．ＰＴ．５８．１７６０９２１８とデュプレックスのＡＴＸＮ２＿ａｓｓａｙ１、Ｍｍ．ＰＴ．５８．７１７８３４１、および、ＲＰＳ２９、Ｍｍ．ＰＴ．５８．２１５７７５７７とデュプレックスのＡＴＸＮ２＿ａｓｓａｙ２、Ｍｍ．ＰＴ．５８．１１６７３１２３）にて実施する、４種類のプローブセット（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、各サンプルを二連で実行した。各反応物に、以前に希釈した４μＬのＲＮＡ、０．５μＬの水、および５．５μＬのＴａｑＭａｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。

相対検量線法を使用してデータを分析し、各サンプル（２つのＡＴＸＮ２アッセイの幾何平均）をまず、２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ４およびＲＰＳ２９）の幾何平均に正規化した後、未処理の対照動物の割合として表現した。
ＡＴＸＮ２タンパク質分析のための、組織の均質化

Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを使用して、１％ Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＲＩＰＡ緩衝液中にてマウスの脳サンプルを均質化した。ホモジェネートを完全に細胞溶解させるために、３０分間４℃でインキュベートした。細胞溶解後、ホモジェネートを１０分間、１４０００ｒｃｆにて遠心分離にかけ、上清を小さな体積にアリコートして、さらに使用するまで－２０℃にて保存した。

ＡＴＸＮ２タンパク質の減少
ＢＣＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した全てのタンパク質に基づき、サンプルを０．０５ｍｇ／ｍｌに正規化した。ＡＴＸＮ２タンパク質の減少をデュプレックス（一次抗体：Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ａｔａｘｉｎ－２、１：５０、＃６１１３７８、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＡｎｔｉ－ＨＰＲＴ、１：１００、＃ａｂ１０９０２１、Ａｂｃａｍ：二次抗体：抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で測定し、メーカーの標準的な手順に従い、キャピラリーウェスタン免疫アッセイＷＥＳ機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）で分析した。

相対量でデータを分析した。各サンプルに対するＡＴＸＮ２の発現をまず、ハウスキーピングタンパク質（ＨＰＲＴ）に対して正規化した後で、未処理の対照動物の割合として表現した。

図５～図７に結果を示す。

図５：１１個の選択した化合物のノックダウン（ｍＲＮＡ）の比較、３つの実験からのコンパイルデータ、研究１＝黒丸、研究２＝白丸、研究３＝白黒が半分ずつの丸。

図６：タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、皮質領域、小脳領域における化合物７＿１への曝露。皮質に対するタンパク質データを示す。

図７：タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、皮質領域、小脳領域における化合物１５＿４への曝露。皮質に対するタンパク質データを示す。

実施例８：インビボでのＩＣＶマウス研究－作用期間
化合物７＿１の作用期間を調査するために、新しい研究を立ち上げた。１５＿４を、１箇所の時点のみ（７日間）に含めた。手順は、以下のプロトコルを使用する、実施例７に記載されているとおりである。

ｍＲＮＡノックダウンの結果を図８に示す。これは、皮質、および特に小脳組織の両方において、少なくとも５６日間の、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのロバストで潜在的なノックダウンを示している（有効性の最大レベルは７～５６日間維持され、このことは、作用の有効期間は５６日間よりも相当長いことを示している）。処置がさほど効果的でない数匹のマウスが存在するようであり、これは、同じ個体と関連しているため、時間経過にわたり、マウスには、手順が関係している可能性がある。

実施例９：インビボでのカニクイザル研究
対象
対象は、投与開始時に体重が２～４ｋｇの、オスおよびメスカニクイザルであった。それぞれの、腰の髄腔内空間に、ポリウレタンカテーテルを埋め込んだ。カテーテルの近位端を、皮下アクセスポートに接続して、髄腔内空間への注射、およびＣＳＦサンプルの引き出しを可能にした。

カニクイザルに、生理食塩水、化合物番号７＿１、または化合物番号１５＿４（１．０ｍｌの体積で、続いて１．５ｍｌのａＣＳＦで、０．３３ｍｌ／分にて生理食塩水に溶解したもの）のいずれかを投与した。注入の総時間は４．５分であった。用量、期間、グループサイズ、および組織についての情報は、表１５を参照のこと。

サンプル当たり、自然流下から、最大０．８ｍｌのＣＳＦにより、ＣＳＦを腰のアクセスポートから収集した。ＣＳＦを遠心分離にかけて、上清を、分析するまで－８０℃にて保持した。利用可能な静脈から入手した血漿を、分析するまで－８０℃にて保持した。

適切な体積の、市販されている安楽死溶液をカニクイザルに投与しながら、ケタミンおよびイソフルランで安楽死させた。剖検組織をその直後に入手し、切開のために、脳を冷却した表面に移した。薬剤濃度分析およびＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ分析のために、きれいな除去技術を使用してサンプルを全て収集し、重量を量ってドライアイス上で冷凍した。

忍容性
生活相の間に、臨床的副作用は報告されなかった。組織病理学的には、試験量において、いずれの化合物に対しても懸念は示されなかった。
オリゴ含有量およびＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ分析のための、組織の均質化

実施例７を参照のこと－同じ手順を用いた。

オリゴ含有量分析
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法を用いて、５０～１００倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ、およびジゴキシゲニン抱合体化ＬＮＡ検出プローブ（５ｘＳＳＣＴにて両方３５ｎＭ、それぞれ、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に相補性である）を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、３０分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた（Ｎｕｎｃカタログ番号４３６０１４）。

プレートを室温で１時間インキュベートし、２ｘＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、および０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．０）で洗浄した。アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１１０９３２７４９１０）およびアルカリホスファターゼ基質系（Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ基質、ＫＰＬ製品コード：５０－８８－００）とコンジュゲートした抗ＤＩＧ抗体を使用して、捕捉したＬＮＡ二重鎖を検出した。オリゴ複合体の量を、Ｂｉｏｔｅｋリーダーにて６１５ｎｍにおける吸光度として、測定した。

データを組織重量に対して正規化し、オリゴのｎＭとして表現した。
ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの減少
ＲＮＡを、キットＣｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔを用いるＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、３５０μＬの上清から精製した。ＲＮＡサンプルを、ＲＮａｓｅフリー水中で２ｎｇ／μＬに標準化し、およびさらなる使用まで－２０℃で保存した。

ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、各サンプルを、シングルプレックスで実施する、ＡＴＸＮ２（表１６を参照）に対する４つのプローブセット（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ならびに、異なるハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｍｆ０４３９２５４６＿ｇ１、ＰＯＬＲ３Ｆ、Ｍｆ０２８６０９３９＿ｍ１、ＹＷＨＡＺ、Ｍｆ０２９２０４１０＿ｍ１およびＵＢＣ、Ｍｆ０２７９８３６８＿ｍ１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対する４つのプローブセットを用い、二連で実施した。

各反応物に、以前に希釈した４μＬのＲＮＡ、０．５μＬの水、および５．５μＬのＴａｑＭａｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。

相対検量線法を使用してデータを分析した。各サンプル（４つのＡＴＸＮ２アッセイの平均）をまず、Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００２，３（７）：ｒｅｓｅａｒｃｈ ００３４．１-００３４．１１に記載されているｇｅＮＯＲＭ分析により測定した、３つの最良なパフォーマンスを示す各組織のハウスキーピング遺伝子の平均に正規化し、その後、未処理の対照動物の割合として表現する（図９を参照）。

ＡＴＸＮ２タンパク質分析のための、組織の均質化
マウス研究と同じ
ＡＴＸＮ２タンパク質の減少
ＢＣＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した全タンパク質に基づき、小脳および皮質サンプルを０．２ｍｇ／ｍｌに正規化した。ＡＴＸＮ２タンパク質の減少をデュプレックス（一次抗体：Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ａｔａｘｉｎ－２、１：５０、＃６１１３７８、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＡｎｔｉ－ＨＰＲＴ、１：５０、＃ａｂ１０９０２１、Ａｂｃａｍ：二次抗体：抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で測定し、メーカーの標準的な手順に従い、キャピラリーウェスタン免疫アッセイＷＥＳ機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）で分析した。

相対量でデータを分析した。各サンプルに対するＡＴＸＮ２の発現をまず、ハウスキーピングタンパク質（ＨＰＲＴ）に対して正規化した後で、未処理の対照動物の割合として表現した。

結果を図９および図１０に示す。

Claims (23)

1. 式
   ＴＣＡｃＡｔｔｔｔａｃｔｔｔａａｃＣＴＣ（ＣＭＰ番号１５＿４）
   （式中、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ Ｃが５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）
   で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、式
   

   

   
   のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 薬学的に許容され得る塩の形態である、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 薬学的に許容され得るナトリウム塩の形態である、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 薬学的に許容され得るカリウム塩の形態である、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
7. 請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
8. 薬学的に許容され得る希釈剤が、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１～１００ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液で、前記薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される、請求項７または８に記載の医薬組成物。
10. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２～３０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液で、前記薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される、請求項７または８に記載の医薬組成物。
11. ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するためのインビトロ法であって、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
12. ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するための医薬組成物であって、有効量の、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項６に記載のコンジュゲート、を含む、医薬組成物。
13. ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するための医薬の調製のための、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項６に記載のコンジュゲートの使用。
14. 医薬品に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患の処置に使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のコンジュゲート。
16. 脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患の処置または予防のための医薬の調製のための、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のコンジュゲート、または請求項７に記載の医薬組成物の使用。
17. 治療的、または予防的有効量の、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のコンジュゲートを含む、神経変性疾患を処置または予防するための医薬組成物であって、前記神経変性疾患が、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン症候群、およびＴＤＰ－４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される、医薬組成物。
18. 前記神経変性疾患が脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）である、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート。
19. 前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート。
20. 前記神経変性疾患が脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）である、請求項１６記載の使用。
21. 前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１６記載の使用。
22. 前記神経変性疾患が脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）である、請求項１７記載の医薬組成物。
23. 前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１７記載の医薬組成物。