JP7512969B2 - アミノ酸の分析方法 - Google Patents
アミノ酸の分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7512969B2 JP7512969B2 JP2021127548A JP2021127548A JP7512969B2 JP 7512969 B2 JP7512969 B2 JP 7512969B2 JP 2021127548 A JP2021127548 A JP 2021127548A JP 2021127548 A JP2021127548 A JP 2021127548A JP 7512969 B2 JP7512969 B2 JP 7512969B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mobile phase
- amino acids
- derivatized
- derivatization
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N35/1009—Characterised by arrangements for controlling the aspiration or dispense of liquids
- G01N35/1016—Control of the volume dispensed or introduced
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8804—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 automated systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8818—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
特許法第３０条第２項適用 １．第３１回クロマトグラフィー科学会議（ＳＣＳ３１） クロマトグラフィー科学会主催。開催期間：２０２０年１１月１８～２０日 予稿配布及びポスター発表日：２０２０年１１月１９日 ２．新アミノ酸分析研究会第１０回学術講演会 発表日：２０２０年１１月３０日 ３．島津Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｅｗｓ Ｎｏ．Ｌ５９２ 初版掲載日：２０２１年１月２２日 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｎ．ｓｈｉｍａｄｚｕ．ｃｏ．ｊｐ／ａｐｌｎｏｔｅｓ／ｌｃ／ａｎ＿１５９２．ｐｄｆ
本発明は、アミノ酸の分析方法に関する。詳細には、本発明は、タンパク質を構成するＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸の一斉分析方法に関する。
アミノ酸の多くはα位に不斉炭素原子を有しており、Ｌ体とＤ体の鏡像異性体が存在する。タンパク質の構成単位をはじめ自然界に存在するアミノ酸の殆どがＬ－アミノ酸であるが、近年、発酵食品や生体試料に、多くのＬ－アミノ酸以外に数種のＤ－アミノ酸が含まれることが知られるようになった。生体内や、食品・食材の呈味性、保存性、香気性等におけるＤ－アミノ酸の役割の研究を進展させ、医薬品や機能性食品の開発へ役立てる上で、アミノ酸のＤ／Ｌ分離の需要が高まっている。Ｄ－アミノ酸の量はＬ－アミノ酸の量に比べ食品中や生体内において微量であるため、高濃度に存在するＬ－アミノ酸と分離し定量することが求められる。
Ｄ体を含み得るアミノ酸（以下、「Ｄ／Ｌ－アミノ酸」と記す場合がある。）の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析方法として、光学活性なプレカラム誘導体化試薬を用いて誘導体化し、アミノ酸のＬ体とＤ体を逆相カラムで分離し検出する方法（特許文献１及び非特許文献１参照）が知られている。
また、一般に、Ｄ／Ｌ－アミノ酸をＨＰＬＣで分析する際、単一の分析条件では全ての成分の分離が困難であるため、複数のアミノ酸の一斉分析を行う方法として、二次元ＨＰＬＣによる方法が提案されている。例えば、逆相カラム及びキラルカラムを使用し、誘導体化後に蛍光検出又はＭＳ検出する方法（特許文献２、非特許文献２及び非特許文献３参照）、プレカラム誘導体化液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法：非特許文献４及び非特許文献５参照）、２種のキラルカラムを交互に使用し、試料中のアミノ酸を誘導体化することなくＬＣ／ＭＳで検出する、非誘導体化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法（非特許文献６参照）が報告されている。
また、一般に、Ｄ／Ｌ－アミノ酸をＨＰＬＣで分析する際、単一の分析条件では全ての成分の分離が困難であるため、複数のアミノ酸の一斉分析を行う方法として、二次元ＨＰＬＣによる方法が提案されている。例えば、逆相カラム及びキラルカラムを使用し、誘導体化後に蛍光検出又はＭＳ検出する方法（特許文献２、非特許文献２及び非特許文献３参照）、プレカラム誘導体化液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法：非特許文献４及び非特許文献５参照）、２種のキラルカラムを交互に使用し、試料中のアミノ酸を誘導体化することなくＬＣ／ＭＳで検出する、非誘導体化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法（非特許文献６参照）が報告されている。
Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ Ｈ．， Ｗｉｔｔｎｅｒ Ｒ．， Ｇｏｄｅｌ Ｈ．， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ １９８９；４７６：７３－８２．
新エネルギー・産業技術総合開発機構ニュースリリース、産技助成Ｖｏｌ．１４、２００８年７月３１日、 ＵＲＬ：https://www.nedo.go.jp/news/press/AA5_0386A.html
Ｈａｍａｓｅ Ｋ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ Ａ．，Ｏｈｇｕｓｕ Ｔ．，Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｗ．，Ｚａｉｔｓｕ Ｋ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ２００７；１１４３：１０５－１１１．
Ｖｉｓｓｅｒ Ｗ．Ｆ．，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ－Ｄｕｉｆ Ｎ．Ｍ．，Ｏｐｈｏｆｆ Ｒ．，Ｂａｋｋｅｒ Ｓ．，Ｋｌｏｍｐ Ｌ．Ｗ．，Ｂｅｒｇｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ ２０１１；１２１８：７１３０－６．
Ｍｉｎ Ｊ．Ｚ．，Ｈａｔａｎａｋａ Ｓ．，Ｙｕ Ｈ．Ｆ．，Ｈｉｇａｓｈｉ Ｔ．，Ｉｎａｇａｋｉ Ｓ．，Ｔｏｙｏ’ｏｋａ Ｔ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ Ａｎａｌｙｔ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． ＬｉｆｅＳｃｉ． ２０１１；８７９：３２２０－８．
Ｎａｋａｎｏ Ｙ．，Ｋｏｎｙａ Ｙ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｍ．，Ｆｕｋｕｓａｋｉ Ｅ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７；１２３：１３４－１３８．
特殊な誘導体化試薬を用いる分析方法は、コストや汎用性の観点で、多種のＤ／Ｌ－アミノ酸の一斉分析への適用に課題がある。
二次元ＨＰＬＣによる方法は、分析に長時間を要し、かつ複雑なシステムを要するという課題がある。すなわち、複数の分析条件（移動相、カラム等）を用いて試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸を一斉分析する際、分析条件の切換時に移動相の置換が必要であり、全く異なる分析条件の場合は装置内の移動相の切換のみならず、使用するカラムの平衡化に時間を要する。また、複数の分析条件に各々対応する移動相の調製にも手間を要する。
さらに、分析対象とするＤ－アミノ酸の種類によっては、１試料に対し２種またはそれ以上の異なる誘導体化反応を行う必要があり、１試料あたり２個以上、すなわち試料数の２倍量以上のバイアルの準備や、人による誘導体化反応の作業に手間を要する。
一方、ＬＣ／ＭＳ分析は高価なシステムを要するほか、目的成分のイオン化の際にそのシグナル強度に対して、試料中に含まれる夾雑物がイオンサプレッションやエンハンスを引き起こす、マトリックス効果の影響を受けやすく、他のＨＰＬＣの検出器に比べ定量性に乏しい。そのため定量を行う場合は、内部標準による補正が必要となる。また、ＬＣ／ＭＳの汚染原因となるイオンペア試薬（トリフルオロ酢酸等）を用いるため、装置を専用化する必要がある。
二次元ＨＰＬＣによる方法は、分析に長時間を要し、かつ複雑なシステムを要するという課題がある。すなわち、複数の分析条件（移動相、カラム等）を用いて試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸を一斉分析する際、分析条件の切換時に移動相の置換が必要であり、全く異なる分析条件の場合は装置内の移動相の切換のみならず、使用するカラムの平衡化に時間を要する。また、複数の分析条件に各々対応する移動相の調製にも手間を要する。
さらに、分析対象とするＤ－アミノ酸の種類によっては、１試料に対し２種またはそれ以上の異なる誘導体化反応を行う必要があり、１試料あたり２個以上、すなわち試料数の２倍量以上のバイアルの準備や、人による誘導体化反応の作業に手間を要する。
一方、ＬＣ／ＭＳ分析は高価なシステムを要するほか、目的成分のイオン化の際にそのシグナル強度に対して、試料中に含まれる夾雑物がイオンサプレッションやエンハンスを引き起こす、マトリックス効果の影響を受けやすく、他のＨＰＬＣの検出器に比べ定量性に乏しい。そのため定量を行う場合は、内部標準による補正が必要となる。また、ＬＣ／ＭＳの汚染原因となるイオンペア試薬（トリフルオロ酢酸等）を用いるため、装置を専用化する必要がある。
本発明の目的は、試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸を高い再現性で簡便に分析可能なアミノ酸の分析方法を提供すること、特にタンパク質を構成するＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸の一斉分析方法を提供することである。
本発明は、下記の態様を有する。
［１］ 複数種のアミノ酸を含有する試料を誘導体化試薬で誘導体化処理し、得られた誘導体化試料を移動相と共にカラムに流通させる、液体クロマトグラフィーによるアミノ酸の分析方法であって、
前記移動相が複数の移動相から構成され、かつ少なくとも１つの移動相が混合溶媒系であり、
２種以上の誘導体化試薬を用いて、２種以上の誘導体化試料を調製し、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記複数の移動相の混合比を時間の経過に伴い変化させる、異なる分析条件を設定し、
かつ、前記誘導体化試薬の種類毎に、混合溶媒系である移動相における溶媒混合比を設定し、
前記２種以上の誘導体化試料を、前記異なる分析条件及び溶媒混合比を自動で切り替えて分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を分離し定量する、アミノ酸の分析方法。
［２］ 前記アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、トレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、バリン、メチオニン、シスチン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、グリシンを分析する、［１］に記載の方法。
［１］ 複数種のアミノ酸を含有する試料を誘導体化試薬で誘導体化処理し、得られた誘導体化試料を移動相と共にカラムに流通させる、液体クロマトグラフィーによるアミノ酸の分析方法であって、
前記移動相が複数の移動相から構成され、かつ少なくとも１つの移動相が混合溶媒系であり、
２種以上の誘導体化試薬を用いて、２種以上の誘導体化試料を調製し、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記複数の移動相の混合比を時間の経過に伴い変化させる、異なる分析条件を設定し、
かつ、前記誘導体化試薬の種類毎に、混合溶媒系である移動相における溶媒混合比を設定し、
前記２種以上の誘導体化試料を、前記異なる分析条件及び溶媒混合比を自動で切り替えて分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を分離し定量する、アミノ酸の分析方法。
［２］ 前記アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、トレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、バリン、メチオニン、シスチン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、グリシンを分析する、［１］に記載の方法。
［３］ 前記複数の移動相が、移動相Ａ及び移動相Ｂの２種からなり、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を時間の経過に伴い変化させる分析条件を設定し、前記異なる分析条件を自動で切り替えて前記２種以上の誘導体化試料を分析する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記移動相Ａが緩衝液であり、移動相Ｂが混合溶媒系である、［３］に記載の方法。
［５］ 前記移動相Ｂが水、アセトニトリル及びメタノールの混合溶媒系であり、かつ前記誘導体化試薬の種類毎に、その溶媒混合比を設定し、前記２種以上の誘導体化試料の分析毎に前記溶媒混合比を自動で切り替える、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］ 前記誘導体化試薬として、ｏ－フタルアルデヒド及びＮ－アセチル－Ｌ－システインの混合物、並びにｏ－フタルアルデヒド及びＮ－イソブチリル－Ｌ－システインの混合物、の２種を用いる、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記誘導体化処理を、前処理機能を有する自動試料導入装置により行う、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
８］ カラムに流通する移動相のｐＨが７～１２である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法。
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を時間の経過に伴い変化させる分析条件を設定し、前記異なる分析条件を自動で切り替えて前記２種以上の誘導体化試料を分析する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記移動相Ａが緩衝液であり、移動相Ｂが混合溶媒系である、［３］に記載の方法。
［５］ 前記移動相Ｂが水、アセトニトリル及びメタノールの混合溶媒系であり、かつ前記誘導体化試薬の種類毎に、その溶媒混合比を設定し、前記２種以上の誘導体化試料の分析毎に前記溶媒混合比を自動で切り替える、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］ 前記誘導体化試薬として、ｏ－フタルアルデヒド及びＮ－アセチル－Ｌ－システインの混合物、並びにｏ－フタルアルデヒド及びＮ－イソブチリル－Ｌ－システインの混合物、の２種を用いる、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記誘導体化処理を、前処理機能を有する自動試料導入装置により行う、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
８］ カラムに流通する移動相のｐＨが７～１２である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法。
本発明によれば、試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸を高い再現性で簡便に分析可能なアミノ酸の分析方法、特にタンパク質を構成するＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸の一斉分析方法を提供できる。
本発明は、複数種のアミノ酸を含有する試料を誘導体化試薬で誘導体化処理し、得られた誘導体化試料を移動相と共にカラムに流通させる、液体クロマトグラフィーによるアミノ酸の分析方法であって、
前記移動相が複数の移動相から構成され、かつ少なくとも１つの移動相が混合溶媒系であり、
２種以上の誘導体化試薬を用いて、２種以上の誘導体化試料を調製し、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記複数の移動相の混合比を時間の経過に伴い変化させる、異なる分析条件を設定し、
かつ、前記誘導体化試薬の種類毎に、混合溶媒系である移動相における溶媒混合比を設定し、
前記２種以上の誘導体化試料を、前記異なる分析条件及び溶媒混合比を自動で切り替えて分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を分離し定量する、アミノ酸の分析方法（以降、単に「本方法」と記す場合がある。）である。
前記移動相が複数の移動相から構成され、かつ少なくとも１つの移動相が混合溶媒系であり、
２種以上の誘導体化試薬を用いて、２種以上の誘導体化試料を調製し、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記複数の移動相の混合比を時間の経過に伴い変化させる、異なる分析条件を設定し、
かつ、前記誘導体化試薬の種類毎に、混合溶媒系である移動相における溶媒混合比を設定し、
前記２種以上の誘導体化試料を、前記異なる分析条件及び溶媒混合比を自動で切り替えて分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を分離し定量する、アミノ酸の分析方法（以降、単に「本方法」と記す場合がある。）である。
本方法で分析対象となるアミノ酸は、好適にはタンパク質を構成する、プロリン以外のアミノ酸である。具体的には、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、シスチン（（Ｃｙｓ）２）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）が挙げられる。このうち、不斉炭素原子を分子内に有しないグリシンを除くアミノ酸にＬ体とＤ体が存在する。すなわち本方法では、好適には３７成分のアミノ酸を一斉に分析することができる。
本方法では、２種以上の誘導体化試薬を用いる。アミノ酸の誘導体化試薬としては、遊離のアミノ基と反応してアミノ酸分析を促進する置換基を有する化合物が従来より用いられており、例えばニンヒドリン、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）、ｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、２，４－ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）、Ｎα－（２，４－ジニトロ－５－フルオロフェニル）－Ｌ－アラニンアミド（ＦＤＡＡ）、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｆ）等が挙げられる。
本方法において、誘導体化試薬は、Ｄ／Ｌ－アミノ酸をジアステレオマーとして誘導体化し、かかる誘導体化Ｄ－アミノ酸及び誘導体化Ｌ－アミノ酸を蛍光検出により分析可能とする。このような誘導体化試薬として、ＯＰＡ及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）の混合物（以下、「ＯＰＡ／ＮＡＣ」と称する場合がある。）、並びにＯＰＡ及びＮ－イソブチリル－Ｌ－システイン（ＮＩＢＣ）の混合物（以下、「ＯＰＡ／ＮＩＢＣ」と称する場合がある。）の２種類を用いるのが極めて好ましい。
ＮＡＣ又はＮＩＢＣはいずれも光学活性部位を有するキラルチオールであり、これらキラルチオールの存在下でＯＰＡを反応させることによりＤ／Ｌ－アミノ酸をジアステレオマー蛍光誘導体化し、蛍光検出により分析可能とできる。
本方法において、誘導体化試薬は、Ｄ／Ｌ－アミノ酸をジアステレオマーとして誘導体化し、かかる誘導体化Ｄ－アミノ酸及び誘導体化Ｌ－アミノ酸を蛍光検出により分析可能とする。このような誘導体化試薬として、ＯＰＡ及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）の混合物（以下、「ＯＰＡ／ＮＡＣ」と称する場合がある。）、並びにＯＰＡ及びＮ－イソブチリル－Ｌ－システイン（ＮＩＢＣ）の混合物（以下、「ＯＰＡ／ＮＩＢＣ」と称する場合がある。）の２種類を用いるのが極めて好ましい。
ＮＡＣ又はＮＩＢＣはいずれも光学活性部位を有するキラルチオールであり、これらキラルチオールの存在下でＯＰＡを反応させることによりＤ／Ｌ－アミノ酸をジアステレオマー蛍光誘導体化し、蛍光検出により分析可能とできる。
本方法では、分析に供する試料の誘導体化処理を予め手作業で行い、複数の誘導体化試料を準備して分析を行ってもよいが、本方法を一層効率的に行う観点からは、誘導体化処理を、前処理機能を有する自動試料導入装置（以下、オートサンプラーとも記す。）により行うことが好ましい。
前処理機能を有するオートサンプラーを用いると、誘導体化試薬及び試料を自動で混合して誘導体化処理する操作をプログラム設定した該オートサンプラーに誘導体化試薬及び分析対象とする試料を入れたバイアル瓶をセットし、前記設定を実行することで誘導体化処理を自動で行い、誘導体化された試料をそのまま分析に供することができる。
なお、オートサンプラーでの誘導体化処理はバイアル瓶で行われてもよいし、ニードル内で混合する機能を有する場合は、誘導体化処理がニードル内で行われてもよい。
前処理機能を有するオートサンプラーを用いると、誘導体化試薬及び試料を自動で混合して誘導体化処理する操作をプログラム設定した該オートサンプラーに誘導体化試薬及び分析対象とする試料を入れたバイアル瓶をセットし、前記設定を実行することで誘導体化処理を自動で行い、誘導体化された試料をそのまま分析に供することができる。
なお、オートサンプラーでの誘導体化処理はバイアル瓶で行われてもよいし、ニードル内で混合する機能を有する場合は、誘導体化処理がニードル内で行われてもよい。
複数種のアミノ酸を含有する試料を誘導体化試薬で誘導体化処理し、得られた誘導体化試料を移動相と共にカラムに流通させて、ＨＰＬＣによる分析を行う。
カラムの充填剤の平均粒子径は好ましくは１～６μｍであり、微細孔を有していてもよく、比表面積が５０～６００ｍ２／ｇの粒子、例えばシリカ粒子であってよい。かかる粒子は、アミノ酸の分離を容易にするために誘導体化アミノ酸と相互作用する結合表面を有してもよい。好適な結合表面として、例えばＣ４、Ｃ８又はＣ１８アルキル結合基を含んでいてもよいアルキル結合表面等の疎水性結合表面が挙げられる。より具体的には、例えばオクタデシルシリル（ＯＤＳ）基で表面が修飾されたシリカ粒子を充填剤（固定相）とするカラムが挙げられる。
カラムの長さは１５～３００ｍｍの範囲が好ましく、直径は０．５～５ｍｍの範囲が好ましい。カラムは市販品を用いることができ、好適なカラムの例として、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標）が挙げられる。
カラムの充填剤の平均粒子径は好ましくは１～６μｍであり、微細孔を有していてもよく、比表面積が５０～６００ｍ２／ｇの粒子、例えばシリカ粒子であってよい。かかる粒子は、アミノ酸の分離を容易にするために誘導体化アミノ酸と相互作用する結合表面を有してもよい。好適な結合表面として、例えばＣ４、Ｃ８又はＣ１８アルキル結合基を含んでいてもよいアルキル結合表面等の疎水性結合表面が挙げられる。より具体的には、例えばオクタデシルシリル（ＯＤＳ）基で表面が修飾されたシリカ粒子を充填剤（固定相）とするカラムが挙げられる。
カラムの長さは１５～３００ｍｍの範囲が好ましく、直径は０．５～５ｍｍの範囲が好ましい。カラムは市販品を用いることができ、好適なカラムの例として、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標）が挙げられる。
本方法では、前記移動相が複数の移動相から構成され、かつ少なくとも１つの移動相が混合溶媒系であり、複数の移動相の組成を変化させながら（以下、グラジエント条件とも称する）ＨＰＬＣ分析を行う。詳細には、カラムに流通させる移動相の親水性が高い状態で分析を開始し、時間の経過に伴い、移動相の親水性を徐々に低くして（移動相中の疎水性溶媒の量を増加させて）いくようにグラジエント条件を設定する。このように移動相の親水性を変化させることで、親水性アミノ酸は疎水性アミノ酸より先にカラムを通過して溶出され、移動相の組成を変化させないアイソクラティック条件に比べ、分析に要する時間を短縮でき、高い再現性で多種のアミノ酸を一斉に分析できる。
従来のＤ－アミノ酸分析方法で、複数種の誘導体化試薬を対象試料に添加して誘導体化した試料を分析する際、まずいずれかの誘導体化試薬を用いて誘導体化した試料をＨＰＬＣ分析し、続いて別の誘導体化試薬を用いて誘導体化した試料をＨＰＬＣ分析する。このときに、移動相やカラム種、グラジエント条件の初期条件等の種々の分析条件に大幅な変更が伴うことが多く、手間と時間を要していた。また、複数の分析条件に各々対応する移動相の調製や試料数の２倍量以上のバイアルの準備等、分析に使用する様々な消費財のコストも無視できなかった。
本方法の好適な実施態様では、複数の移動相が、移動相Ａ及び移動相Ｂの２種からなり、誘導体化試薬の種類毎に、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を時間の経過に伴い変化させる分析条件を設定する。好適には移動相Ａが緩衝液であり、移動相Ｂが混合溶媒系であり、誘導体化試薬の種類毎に、移動相Ｂにおける溶媒混合比を設定する。
さらに、２種以上の誘導体化試薬として、前記したＯＰＡ／ＮＡＣとＯＰＡ／ＮＩＢＣの２種類を用いると、２種の誘導体化試料の分析における移動相Ａ、及び移動相Ｂを構成する混合溶媒系の溶媒種を同一にできる。そして、移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件、及び移動相Ｂの混合溶媒系の混合溶媒比以外の諸条件、すなわちカラム種、カラム温度、移動相の流速、検出器等の分析条件を同一にできる。
したがって、かかる異なる分析条件のみを自動で切り替えれば、前記２種以上の誘導体化試料を簡便に分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を高い再現性で分離し定量することができる。
さらに、２種以上の誘導体化試薬として、前記したＯＰＡ／ＮＡＣとＯＰＡ／ＮＩＢＣの２種類を用いると、２種の誘導体化試料の分析における移動相Ａ、及び移動相Ｂを構成する混合溶媒系の溶媒種を同一にできる。そして、移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件、及び移動相Ｂの混合溶媒系の混合溶媒比以外の諸条件、すなわちカラム種、カラム温度、移動相の流速、検出器等の分析条件を同一にできる。
したがって、かかる異なる分析条件のみを自動で切り替えれば、前記２種以上の誘導体化試料を簡便に分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を高い再現性で分離し定量することができる。
移動相Ａに使用できる緩衝液としては、酢酸系緩衝液、リン酸系緩衝液、ホウ酸系緩衝液等が挙げられる。中でも、移動相ＡのｐＨが５以上、好ましくはｐＨ７～１２、特にｐＨ７～１１であるのが好ましい。また、移動相Ａ及び移動相Ｂが混合された後のｐＨが７～１２、好ましくは７～１１の範囲に維持可能な緩衝液であるのが好ましく、リン酸系緩衝液がより好ましい。
緩衝液には、本方法におけるアミノ酸分析の精度を阻害しない範囲で、無機塩、制菌剤、界面活性剤等が含まれていてもよい。
緩衝液には、本方法におけるアミノ酸分析の精度を阻害しない範囲で、無機塩、制菌剤、界面活性剤等が含まれていてもよい。
移動相Ｂに使用できる混合溶媒系を構成する溶媒としては、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン等が挙げられる。これらは２種を混合しても、３種以上を混合して使用してもよい。
中でも、移動相Ｂが水、アセトニトリル及びメタノールの混合溶媒系であるのが好ましい。かつ、前記誘導体化試薬の種類毎に、その溶媒混合比を設定するのが好ましい。かかる態様であれば、前記２種以上の誘導体化試料の分析毎に、前記溶媒混合比を自動で切り替えればよいので好ましい。
本方法における特に好適な実施形態は、移動相を以下のように設定する。
すなわち、ＯＰＡ／ＮＡＣで誘導体化した試料の分析に際しては、移動相Ｂにおける混合溶媒系の溶媒種の選択及び配合量比を水／アセトニトリル／メタノール＝１５／１０／７５（容量比）とする。ＯＰＡ／ＮＩＢＣで誘導体化した試料の分析に際しては、移動相Ｂにおける混合溶媒系を水／アセトニトリル／メタノール＝１０／２０／７０（容量比）とする。
ＯＰＡ／ＮＡＣの分析に対し、ＯＰＡ／ＮＩＢＣの分析における移動相Ｂは水の含有量が少なくアセトニトリル含有量が多く、相対的に疎水性とした条件である。また、ＮＡＣはアセチル基を有するのに対し、ＮＩＢＣはイソブチリル基を有するため相対的に疎水性が高く、かかる疎水性の差も利用することで、複数のアミノ酸、具体的にはタンパク質構成Ｄ／Ｌアミノ酸を、グリシンを含め一斉分析することが可能である。
すなわち、ＯＰＡ／ＮＡＣで誘導体化した試料の分析に際しては、移動相Ｂにおける混合溶媒系の溶媒種の選択及び配合量比を水／アセトニトリル／メタノール＝１５／１０／７５（容量比）とする。ＯＰＡ／ＮＩＢＣで誘導体化した試料の分析に際しては、移動相Ｂにおける混合溶媒系を水／アセトニトリル／メタノール＝１０／２０／７０（容量比）とする。
ＯＰＡ／ＮＡＣの分析に対し、ＯＰＡ／ＮＩＢＣの分析における移動相Ｂは水の含有量が少なくアセトニトリル含有量が多く、相対的に疎水性とした条件である。また、ＮＡＣはアセチル基を有するのに対し、ＮＩＢＣはイソブチリル基を有するため相対的に疎水性が高く、かかる疎水性の差も利用することで、複数のアミノ酸、具体的にはタンパク質構成Ｄ／Ｌアミノ酸を、グリシンを含め一斉分析することが可能である。
以下、本方法について図面を参照しながら詳細に説明する。
１．液体クロマトグラフ分析システムの構成
図１は、本方法を実施するための液体クロマトグラフ分析システムの一例の概略構成図である。この液体クロマトグラフ分析システム１００は、移動相ブレンディングユニット１０と、送液ユニット２０と、オートサンプラー３０と、カラムオーブン４０及びカラム４１と、検出器５０と、操作部６０と、表示部７０とを含む。なお、液体クロマトグラフ分析システム１００はこれらの構成に限定されず、他の任意の構成を追加してもよいし、同様の機能を発揮する任意の構成と置換されていてもよい。
１．液体クロマトグラフ分析システムの構成
図１は、本方法を実施するための液体クロマトグラフ分析システムの一例の概略構成図である。この液体クロマトグラフ分析システム１００は、移動相ブレンディングユニット１０と、送液ユニット２０と、オートサンプラー３０と、カラムオーブン４０及びカラム４１と、検出器５０と、操作部６０と、表示部７０とを含む。なお、液体クロマトグラフ分析システム１００はこれらの構成に限定されず、他の任意の構成を追加してもよいし、同様の機能を発揮する任意の構成と置換されていてもよい。
送液ユニット２０は、複数の移動相を吸引して送液する送液ポンプと、かかる複数の移動相を所定の混合比率で混合する混合器を有する。図１では、２種の移動相（移動相Ａ及び移動相Ｂ）を送液する送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを備える例を示しており、送液ポンプ２１Ａには移動相Ａが貯留された移動相容器１１が接続され、送液ポンプ２１Ｂには移動相ブレンディングユニット１０が接続されている。また、送液ポンプ２１Ａ及び２１Ｂからそれぞれ送液される、移動相Ａ及び移動相Ｂを所定の混合比率で混合する混合器２２を備える。
移動相ブレンディングユニット１０は、それぞれ異なる複数の移動相が貯留された移動相容器を有し、図１では４つの移動相（以下溶媒ａ、溶媒ｂ、溶媒ｃ、溶媒ｄという）が貯留された移動相容器１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄを備える例を示す。
移動相ブレンディングユニット１０は、移動相容器１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄから溶媒ａ、溶媒ｂ、溶媒ｃ、溶媒ｄを吸引して所定の混合比率で混合して移動相Ｂを調製する、複数の開度調整可能な電磁バルブを含む混合器１２を備えており、調製された移動相Ｂは送液ポンプ２１Ｂにより送液される。
移動相ブレンディングユニット１０は、移動相容器１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄから溶媒ａ、溶媒ｂ、溶媒ｃ、溶媒ｄを吸引して所定の混合比率で混合して移動相Ｂを調製する、複数の開度調整可能な電磁バルブを含む混合器１２を備えており、調製された移動相Ｂは送液ポンプ２１Ｂにより送液される。
オートサンプラー３０は、一定量の試料を注入するオートインジェクター３３を備える。オートサンプラー３０は好適には分析試料の前処理機能を有しており、複数の誘導体化試薬３１ａ、３１ｂ及び分析試料３２を設置できる。
オートサンプラー３０には、混合器２２を介して移動相Ａ及び移動相Ｂが所定の混合比率で混合された移動相が送られてくる。オートサンプラー３０の前処理機能を用いて、誘導体化試薬及び分析試料を予め混合して誘導体化処理し、調製した誘導体化試料をオートインジェクター３３で所定量吸引して移動相に注入する。オートインジェクター３３により注入された誘導体化試料は、前記混合された移動相と共に、誘導体化アミノ酸成分を時間方向に分離するカラム４１を通過し、該試料に含まれる分離された誘導体化アミノ酸成分を検出器５０により検出する。カラムオーブン４０は分析中にカラム４１を一定温度に保つ。カラム４１は、例えば逆相カラム（ＯＤＳ（オクタデシルシリル）基で表面が修飾されたシリカゲルを固定相とするＣ１８カラムなど）である。
検出器５０は蛍光検出器であり、特定の励起波長の励起光で試料中の誘導体化アミノ酸成分を励起させることにより蛍光させ、特定の蛍光波長の蛍光を検出する。
制御部６０は、移動相ブレンディングユニット１０、送液ユニット２０、オートサンプラー３０、カラムオーブン４０および検出器５０と電気的に接続されており、設定された分析条件に基づいてこれらの動作を制御する機能や、検出信号に基づき所定の演算処理（クロマトグラムの作成等）を行う機能を有する。本方法の実施形態では、混合器２２において、複数の移動相の混合率を時間経過とともに変化させながら分析が行われる。
制御部６０は、移動相ブレンディングユニット１０、送液ユニット２０、オートサンプラー３０、カラムオーブン４０および検出器５０と電気的に接続されており、設定された分析条件に基づいてこれらの動作を制御する機能や、検出信号に基づき所定の演算処理（クロマトグラムの作成等）を行う機能を有する。本方法の実施形態では、混合器２２において、複数の移動相の混合率を時間経過とともに変化させながら分析が行われる。
制御部６０では、本方法で用いる複数の誘導体化試薬の種類毎に、分析条件を複数設定することができる。分析条件には、例えば、試料の種類、移動相の種類、カラムの種類等が含まれる。これにより、液体クロマトグラフ分析システム１００は、試料の分析を複数の分析条件で行うことができる。
制御部６０には記憶部が内蔵され、例えば、論理演算を実行するＣＰＵ、移動相ブレンディングユニット１０、送液ユニット２０等の制御に必要な動作プログラムが格納されたＲＯＭ、制御時にデータ等が一時的にストアされるＲＡＭ等から構成される。
制御部６０には記憶部が内蔵され、例えば、論理演算を実行するＣＰＵ、移動相ブレンディングユニット１０、送液ユニット２０等の制御に必要な動作プログラムが格納されたＲＯＭ、制御時にデータ等が一時的にストアされるＲＡＭ等から構成される。
制御部６０に含まれるＣＰＵ等がこの動作プログラムに従って移動相ブレンディングユニット１０の各部や、送液ユニット２０、オートサンプラー３０の前処理を適宜制御することで、後述する分析動作が行われる。検出器５０で検出されたデータを制御部６０で処理して、試料中のアミノ酸成分を同定し定量する。また、表示部７０は例えば液晶表示器であり、分析結果などを表示する。
なお、制御部６０は、パーソナルコンピュータやより高度なワークステーションをハードウエア資源として、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを該コンピュータ上で実行することによりそれぞれの機能を実現する構成とすることができ、液体クロマトグラフ分析システム１００全体を制御できる。
なお、制御部６０は、パーソナルコンピュータやより高度なワークステーションをハードウエア資源として、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを該コンピュータ上で実行することによりそれぞれの機能を実現する構成とすることができ、液体クロマトグラフ分析システム１００全体を制御できる。
２．分析動作
次に、図２のフローチャートに沿って、図１の液体クロマトグラフ分析システムを用いた分析動作を説明する。
次に、図２のフローチャートに沿って、図１の液体クロマトグラフ分析システムを用いた分析動作を説明する。
分析試料と複数の誘導体化試薬（誘導体化試薬１としてＯＰＡ／ＮＡＣ、及び誘導体化試薬２としてＯＰＡ／ＮＩＢＣ）を、前処理機能を有する自動試料導入装置（オートサンプラー３０）に設置する。
制御部６０は、移動相Ｂを溶媒混合比条件１に制御し、そして移動相Ａと移動相Ｂとがグラジエント条件１における所定の初期混合比率となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを制御し、混合された移動相が所定流速となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを動作させる。
制御部６０は、移動相Ｂを溶媒混合比条件１に制御し、そして移動相Ａと移動相Ｂとがグラジエント条件１における所定の初期混合比率となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを制御し、混合された移動相が所定流速となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを動作させる。
ここで、後述する実施例では、移動相Ａとしてリン酸系緩衝液が貯留されている移動相容器１１と、水、アセトニトリル、メタノールがそれぞれ貯留されている３つの移動相容器１１ａ、１１ｂ及び１１ｃが設けられている（移動相容器１１ｄは未使用である）。制御部６０は、移動相ブレンディングユニット１０の混合器１２で、水、アセトニトリル及びメタノールを、予め設定した溶媒混合比条件１で混合して移動相Ｂを調製するように制御する。そして、送液ポンプ２１Ａにより移動相Ａが、及び送液ポンプ２１Ｂにより移動相Ｂがそれぞれ送液され、混合器２２においてグラジエント条件１における所定の初期混合比率で混合された移動相がオートサンプラー３０を介してカラム４１に一定流速で流される。
移動相Ｂにおける水、アセトニトリル及びメタノールの溶媒混合比条件１、並びに移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件１はいずれも、誘導体化試薬１で誘導体化した誘導体化試料１の分析に対応して設定された条件である。
移動相Ｂにおける水、アセトニトリル及びメタノールの溶媒混合比条件１、並びに移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件１はいずれも、誘導体化試薬１で誘導体化した誘導体化試料１の分析に対応して設定された条件である。
次いで、制御部６０に予め格納されている動作プログラムに従ってオートサンプラー３０を制御して、誘導体化試薬１により分析試料の誘導体化を行い、誘導体化試料１を調製する。
誘導体化処理は、オートサンプラー３０中に設置する他のバイアル（図示せず）に誘導体化試薬及び分析試料を所定量秤量して混合することで行える。あるいは、オートインジェクター３３のニードルに誘導体化試薬及び分析試料を続けて所定量吸引し、ニードル内で混合可能な前処理機能をオートサンプラー３０が有する場合には、かかる機能を用いて誘導体化試薬及び分析試料を混合することで誘導体処理を行うこともできる。
なお、分析試料の誘導体化処理を予め手作業により行った後、誘導体化処理した試料をオートサンプラー３０に設置してもよいが、オートサンプラー３０の前処理機能を用いて、誘導体化試薬及び分析試料を予め設置して自動で誘導体化処理するように制御することで、前処理に要する労力及び時間を削減できる。また、誘導体化の反応時間の一定化により、安定性と再現性が向上する。
誘導体化処理は、オートサンプラー３０中に設置する他のバイアル（図示せず）に誘導体化試薬及び分析試料を所定量秤量して混合することで行える。あるいは、オートインジェクター３３のニードルに誘導体化試薬及び分析試料を続けて所定量吸引し、ニードル内で混合可能な前処理機能をオートサンプラー３０が有する場合には、かかる機能を用いて誘導体化試薬及び分析試料を混合することで誘導体処理を行うこともできる。
なお、分析試料の誘導体化処理を予め手作業により行った後、誘導体化処理した試料をオートサンプラー３０に設置してもよいが、オートサンプラー３０の前処理機能を用いて、誘導体化試薬及び分析試料を予め設置して自動で誘導体化処理するように制御することで、前処理に要する労力及び時間を削減できる。また、誘導体化の反応時間の一定化により、安定性と再現性が向上する。
制御部６０から誘導体化試料１の分析開始が指示されると、その指示に応じて、オートサンプラー３０に備えられているオートインジェクター３３は、移動相中に所定のタイミングで上記誘導体化試料１を所定量注入する。注入された誘導体化試料１は移動相の流れに乗ってカラム４１に導入され、カラム４１を通過する間に、該試料中の誘導体化アミノ酸成分が時間方向に分離されてカラム４１出口から溶出する。
制御部６０はまた、誘導体化試料１の注入時点から、グラジエント条件１に従って、混合器２２における移動相Ａと移動相Ｂの混合比を時間経過に伴い変化させる。すなわち、分析中、制御部６０は、有機溶媒を含有する移動相Ｂの混合比率を時間経過とともに上昇させながら移動相としてカラム４１に供給する。なお、制御部６０は、移動相Ａ及び移動相Ｂのグラジエント条件１を実行させるように構成されたグラジエントタイムプログラム作成部を有することができる。
予め設定された分析用制御プログラムに基づいて制御部６０が各部の動作を制御することにより、検出器５０からの検出信号が取得される。
アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件１によって初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保して誘導体化試料１の分析を終了する。
なお、複数の分析試料をオートサンプラー３０に設置することにより、分析すべき誘導体化試料１が複数存在する場合、先の誘導体化試料１の分析終了後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比が初期比に戻り上記の平衡化時間が経過後に、制御部６０は、続いての誘導体化試料１の分析開始を指示する。そして、移動相Ａと移動相Ｂとがグラジエント条件１における所定の初期混合比率となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを制御し、混合された移動相が所定流速となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを動作させ、アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件１によって初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保することを繰り返す。
アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件１によって初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保して誘導体化試料１の分析を終了する。
なお、複数の分析試料をオートサンプラー３０に設置することにより、分析すべき誘導体化試料１が複数存在する場合、先の誘導体化試料１の分析終了後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比が初期比に戻り上記の平衡化時間が経過後に、制御部６０は、続いての誘導体化試料１の分析開始を指示する。そして、移動相Ａと移動相Ｂとがグラジエント条件１における所定の初期混合比率となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを制御し、混合された移動相が所定流速となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを動作させ、アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件１によって初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保することを繰り返す。
誘導体化試料１の分析が終了後、溶媒混合比の条件を変化させる。すなわち、制御部６０は、移動相ブレンディングユニット１０の混合器１２で、水、アセトニトリル及びメタノールの混合量比を、各々の移動相容器からの電磁バルブを調整することによって溶媒混合比条件１から溶媒混合比条件２に変更して移動相Ｂを調製するように制御する。そして、送液ポンプ２１Ａにより移動相Ａが、送液ポンプ２１Ｂにより移動相Ｂがそれぞれ送液され、混合器２２においてグラジエント条件２における所定の初期混合比率で混合された移動相がオートサンプラー３０を介してカラム４１に一定流速で流される。
ここで、移動相Ｂにおける水、アセトニトリル及びメタノールの溶媒混合比条件２、並びに移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件２はいずれも、誘導体化試薬２で誘導体化した誘導体化試料２の分析に対応して設定された条件である。
そして、図２のフローチャートにおける「非注入分析」を行うのが好ましい。具体的には、制御部６０は、誘導体化試料２の分析に先立ち、グラジエント条件２に従って、混合器２２における移動相Ａと移動相Ｂの混合比を時間経過に伴い変化させ、以降はグラジエント条件２を実行しながら移動相をカラム４１に供給する操作を行う。
ここで、移動相Ｂにおける水、アセトニトリル及びメタノールの溶媒混合比条件２、並びに移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件２はいずれも、誘導体化試薬２で誘導体化した誘導体化試料２の分析に対応して設定された条件である。
そして、図２のフローチャートにおける「非注入分析」を行うのが好ましい。具体的には、制御部６０は、誘導体化試料２の分析に先立ち、グラジエント条件２に従って、混合器２２における移動相Ａと移動相Ｂの混合比を時間経過に伴い変化させ、以降はグラジエント条件２を実行しながら移動相をカラム４１に供給する操作を行う。
「非注入分析」が終了後、制御部６０に予め格納されている動作プログラムに従ってオートサンプラー３０を制御して、誘導体化試薬２による分析試料の誘導体化を行い、誘導体化試料２を調製する。誘導体化処理は上記と同様にして行える。続いて誘導体化試料２の分析開始が指示される。
制御部６０からの指示に応じ、オートサンプラー３０に備えられているオートインジェクター３３は、移動相中に所定のタイミングで上記誘導体化試料２を所定量注入する。注入された誘導体化試料２は移動相の流れに乗ってカラム４１に導入され、カラム４１を通過する間に、該試料中の誘導体化アミノ酸成分が時間方向に分離されてカラム４１出口から溶出する。
制御部６０からの指示に応じ、オートサンプラー３０に備えられているオートインジェクター３３は、移動相中に所定のタイミングで上記誘導体化試料２を所定量注入する。注入された誘導体化試料２は移動相の流れに乗ってカラム４１に導入され、カラム４１を通過する間に、該試料中の誘導体化アミノ酸成分が時間方向に分離されてカラム４１出口から溶出する。
制御部６０は誘導体化試料２の注入時点から、グラジエント条件２に従って、混合器２２における移動相Ａと移動相Ｂの混合比を時間経過に伴い変化させ、以降はグラジエント条件２を実行しながら移動相をカラム４１に供給する。分析中は、予め設定された分析用制御プログラムに基づいて制御部６０が各部の動作を制御することにより、検出器５０からの検出信号が取得される。
アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件２により初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保して、誘導体化試料２の分析を終了する。
なお、複数の分析試料をオートサンプラー３０に設置することにより、分析すべき誘導体化試料２が複数存在する場合、先の誘導体化試料２の分析終了後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比が初期比に戻り上記の平衡化時間が経過後に、制御部６０は、続いての誘導体化試料２の分析開始を指示する。そして、移動相Ａと移動相Ｂとがグラジエント条件２における所定の初期混合比率となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを制御し、混合された移動相が所定流速となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを動作させ、アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件２によって初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保することを繰り返す。
なお、複数の分析試料をオートサンプラー３０に設置することにより、分析すべき誘導体化試料２が複数存在する場合、先の誘導体化試料２の分析終了後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比が初期比に戻り上記の平衡化時間が経過後に、制御部６０は、続いての誘導体化試料２の分析開始を指示する。そして、移動相Ａと移動相Ｂとがグラジエント条件２における所定の初期混合比率となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを制御し、混合された移動相が所定流速となるように送液ポンプ２１Ａ、２１Ｂを動作させ、アミノ酸３７成分のうちの最後の成分が溶出し終えた後、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比をグラジエント条件２によって初期比に戻し、平衡化時間を十分に確保することを繰り返す。
制御部６０は、得られたデータを用いてクロマトグラムを作成し、試料中に存在が確認されたアミノ酸について、クロマトグラム上のピークの面積値を計算し、予め作成した検量線を参照してピーク面積値からアミノ酸毎に濃度値を求め、分析結果レポートを作成する。制御部６０は、前記分析結果レポートの作成を行うデータ処理部を有することができる。
なお、全ての分析が終了後に、移動相ブレンディングユニット１０から送液ポンプ２１Ｂを介して水と有機溶媒の混合溶液を送液し、後処理としてシステム、カラム等を洗浄することができる。かかる後処理により、試料を注入するプローブへの試料の残存や、システム、カラム中における塩の析出を防止できる。
本方法では、２種類の誘導体化試薬を用いて分析対象である試料をそれぞれ誘導体化処理し、一方の誘導体化試料の分析と他方の誘導体化試料の分析において、移動相の選択及びグラジエント条件を検討して、第１分析条件と第２分析条件の大部分の共通化を達成することができた。したがって、両者の分析条件における移動相Ｂの混合溶媒系の混合比と、移動相Ａ及び移動相Ｂのグラジエント条件の２つを変更して制御するのみで、従来分離検出が困難であったＤ－アミノ酸の分離性能を高めると共に、迅速に、多種のアミノ酸の同時分析が可能となる。
上記した制御が可能なシステムの例としては、Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）Ｘ３システム（株式会社島津製作所製）が挙げられる。このシステムは低圧グラジエントキットを備え、かかるキット内の低圧グラジエントユニットが上記で説明した移動相ブレンディングユニットに相当し、複数の移動相の混合比を制御可能な移動相ブレンディング機能を有している。移動相ブレンディング機能とオートサンプラーの自動前処理機能を用いることで、移動相やグラジエント条件を変更した分析スケジュールを自動で作成し、切替可能なので、移動相の調製、移動相置換に要する時間、及び誘導体化の手間等を削減することができる。
上記実施形態は本発明の一例であり、本発明の趣旨に沿った範囲で適宜変形や修正、追加を行えることは明らかである。
上記実施形態は本発明の一例であり、本発明の趣旨に沿った範囲で適宜変形や修正、追加を行えることは明らかである。
本方法は、酒類及び各種の食品分析をはじめ、生化学・医療分野等の様々な分野におけるアミノ酸含有量分析にも適用できる。酒類としてはビール、日本酒、赤ワイン、白ワイン等の醸造酒等が挙げられる。食品としては発酵食品等が挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら限定されない。
［誘導体化試薬の調製例］
・０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液：
ホウ酸０．６２ｇ及び水酸化ナトリウム０．２０ｇを純水１００ｍｌに加えて完全に溶解させて調製した。
・ｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）試剤：
ＯＰＡ１０ｍｇにエタノール０．３ｍｌを加えて完全に溶解させ、次いで０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液０．７ｍｌ及び純水４ｍｌを加えて調製した。
・Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）溶液：
ＮＡＣ２０ｍｇに０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液１０ｍｌを加えて調製した。
・Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（ＮＩＢＣ）溶液：
ＮＩＢＣ２０ｍｇに０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液１０ｍｌを加えて調製した。
＜誘導体化試薬１：ＯＰＡ／ＮＡＣ＞
ＯＰＡ試剤及びＮＡＣ溶液を等容量で混合して調製し、分析に用いた。
＜誘導体化試薬２：ＯＰＡ／ＮＩＢＣ＞
ＯＰＡ試剤及びＮＩＢＣ溶液を等容量で混合して調製し、分析に用いた。
・０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液：
ホウ酸０．６２ｇ及び水酸化ナトリウム０．２０ｇを純水１００ｍｌに加えて完全に溶解させて調製した。
・ｏ－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）試剤：
ＯＰＡ１０ｍｇにエタノール０．３ｍｌを加えて完全に溶解させ、次いで０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液０．７ｍｌ及び純水４ｍｌを加えて調製した。
・Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）溶液：
ＮＡＣ２０ｍｇに０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液１０ｍｌを加えて調製した。
・Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（ＮＩＢＣ）溶液：
ＮＩＢＣ２０ｍｇに０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液１０ｍｌを加えて調製した。
＜誘導体化試薬１：ＯＰＡ／ＮＡＣ＞
ＯＰＡ試剤及びＮＡＣ溶液を等容量で混合して調製し、分析に用いた。
＜誘導体化試薬２：ＯＰＡ／ＮＩＢＣ＞
ＯＰＡ試剤及びＮＩＢＣ溶液を等容量で混合して調製し、分析に用いた。
［オートサンプラーによる、誘導体化試料の調製及び注入例］
誘導体化試薬１又は誘導体化試薬２をオートサンプラーのニードルに４μＬ吸引し、次いで試料１μＬを吸引して、ニードル内で混合した後、移動相に注入した。
なお、誘導体化プログラムにより、分析サンプル、バイアル番号、注入量、ミキシング回数、ミキシング容量、待ち時間、エアギャップ量を設定することができる。
誘導体化試薬１又は誘導体化試薬２をオートサンプラーのニードルに４μＬ吸引し、次いで試料１μＬを吸引して、ニードル内で混合した後、移動相に注入した。
なお、誘導体化プログラムにより、分析サンプル、バイアル番号、注入量、ミキシング回数、ミキシング容量、待ち時間、エアギャップ量を設定することができる。
［分析装置］
ＨＰＬＣシステム：Ｎｅｘｅｒａ Ｘ３（島津製作所製）
・デガッサー：ＤＧＵ－４０３、ＤＧＵ－４０５
・ポンプ：ＬＣ－４０Ｄ Ｘ３（２台）、低圧グラジエントキット（１台）
・オートサンプラー：ＳＩＬ－４０Ｃ Ｘ３
・カラム恒温槽：ＣＴＯ－４０Ｃ
・コミュニケーションバスモジュール：ＳＣＬ－４０
・分光蛍光検出器：ＲＦ－２０ＡＸＳ
ＨＰＬＣシステム：Ｎｅｘｅｒａ Ｘ３（島津製作所製）
・デガッサー：ＤＧＵ－４０３、ＤＧＵ－４０５
・ポンプ：ＬＣ－４０Ｄ Ｘ３（２台）、低圧グラジエントキット（１台）
・オートサンプラー：ＳＩＬ－４０Ｃ Ｘ３
・カラム恒温槽：ＣＴＯ－４０Ｃ
・コミュニケーションバスモジュール：ＳＣＬ－４０
・分光蛍光検出器：ＲＦ－２０ＡＸＳ
［ＨＰＬＣ分析条件］
《誘導体化試薬１を用いた誘導体化試料１》
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標；株式会社島津製作所製）
固定相Ｃ８、長さ１５０ｍｍ×内径３．０ｍｍ、充填物粒子径１．９μｍ
移動相：
［移動相Ａ］リン酸二水素カリウム０．６８ｇ及びリン酸水素二カリウム２．６１ｇを純水２０００ｍＬに加えて完全に溶解させて調製した、リン酸系緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）
［移動相Ｂ］水／アセトニトリル／メタノール＝１５／１０／７５
＜移動相のグラジエント条件（タイムプログラム）＞
４％Ｂ（０－３分）→１１％Ｂ（１３分）→１４％Ｂ（２２分）→２５％Ｂ（３０分）→３０％Ｂ（３５分）→４１％Ｂ（６１分）→８０％Ｂ（６１．０１－６３分）→４％Ｂ（６３．０１－６７分）
＜流速＞０．６ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
サンプル注入量：１μＬ
バイアル：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬａｂＴｏｔａｌ（登録商標）ｆｏｒ ＬＣ １．５ｍＬ，Ｇｌａｓｓ
検出器（ＦＬ）：ＲＦ－２０ＡＸＳ，Ｅｘ：３５０ｎｍ，Ｅｍ：４５０ｎｍ
《誘導体化試薬１を用いた誘導体化試料１》
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標；株式会社島津製作所製）
固定相Ｃ８、長さ１５０ｍｍ×内径３．０ｍｍ、充填物粒子径１．９μｍ
移動相：
［移動相Ａ］リン酸二水素カリウム０．６８ｇ及びリン酸水素二カリウム２．６１ｇを純水２０００ｍＬに加えて完全に溶解させて調製した、リン酸系緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）
［移動相Ｂ］水／アセトニトリル／メタノール＝１５／１０／７５
＜移動相のグラジエント条件（タイムプログラム）＞
４％Ｂ（０－３分）→１１％Ｂ（１３分）→１４％Ｂ（２２分）→２５％Ｂ（３０分）→３０％Ｂ（３５分）→４１％Ｂ（６１分）→８０％Ｂ（６１．０１－６３分）→４％Ｂ（６３．０１－６７分）
＜流速＞０．６ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
サンプル注入量：１μＬ
バイアル：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬａｂＴｏｔａｌ（登録商標）ｆｏｒ ＬＣ １．５ｍＬ，Ｇｌａｓｓ
検出器（ＦＬ）：ＲＦ－２０ＡＸＳ，Ｅｘ：３５０ｎｍ，Ｅｍ：４５０ｎｍ
《誘導体化試薬２を用いた誘導体化試料２》
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標；株式会社島津製作所製）
固定相Ｃ８、長さ１５０ｍｍ×内径３．０ｍｍ、充填物粒子径１．９μｍ
移動相：
［移動相Ａ］リン酸二水素カリウム０．６８ｇ及びリン酸水素二カリウム２．６１ｇを純水２０００ｍＬに加えて完全に溶解させて調製した、リン酸系緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）
［移動相Ｂ］水／アセトニトリル／メタノール＝１０／２０／７０
＜移動相のグラジエント条件（タイムプログラム）＞
１０％Ｂ（０分）→１５％Ｂ（３－１５分）→２０％Ｂ（２５分）→５２％Ｂ（５７分）→８０％Ｂ（５７．０１－５９分）→１０％Ｂ（５９．０１－６３分）
＜流速＞０．６ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
サンプル注入量：１μＬ
バイアル：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬａｂＴｏｔａｌ（登録商標）ｆｏｒ ＬＣ １．５ｍＬ，Ｇｌａｓｓ
検出器（ＦＬ）：ＲＦ－２０ＡＸＳ，Ｅｘ：３５０ｎｍ，Ｅｍ：４５０ｎｍ
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標；株式会社島津製作所製）
固定相Ｃ８、長さ１５０ｍｍ×内径３．０ｍｍ、充填物粒子径１．９μｍ
移動相：
［移動相Ａ］リン酸二水素カリウム０．６８ｇ及びリン酸水素二カリウム２．６１ｇを純水２０００ｍＬに加えて完全に溶解させて調製した、リン酸系緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）
［移動相Ｂ］水／アセトニトリル／メタノール＝１０／２０／７０
＜移動相のグラジエント条件（タイムプログラム）＞
１０％Ｂ（０分）→１５％Ｂ（３－１５分）→２０％Ｂ（２５分）→５２％Ｂ（５７分）→８０％Ｂ（５７．０１－５９分）→１０％Ｂ（５９．０１－６３分）
＜流速＞０．６ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
サンプル注入量：１μＬ
バイアル：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬａｂＴｏｔａｌ（登録商標）ｆｏｒ ＬＣ １．５ｍＬ，Ｇｌａｓｓ
検出器（ＦＬ）：ＲＦ－２０ＡＸＳ，Ｅｘ：３５０ｎｍ，Ｅｍ：４５０ｎｍ
実施例１
分析対象とする試料に、誘導体化試薬１（ＯＰＡ／ＮＡＣ）又は誘導体化試薬２（ＯＰＡ／ＮＩＢＣ）を反応させることにより、試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸をジアステレオマー蛍光誘導体化し、誘導体化試料を上記分析条件でＨＰＬＣ分析して、蛍光検出した。誘導体化はオートサンプラーにより自動で行い、移動相Ｂは送液ポンプの移動相ブレンディング機能を用いて調製した。誘導体化試料１の分析終了後、誘導体化試料２への分析条件の切替を自動で行った。
分析対象とする試料に、誘導体化試薬１（ＯＰＡ／ＮＡＣ）又は誘導体化試薬２（ＯＰＡ／ＮＩＢＣ）を反応させることにより、試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸をジアステレオマー蛍光誘導体化し、誘導体化試料を上記分析条件でＨＰＬＣ分析して、蛍光検出した。誘導体化はオートサンプラーにより自動で行い、移動相Ｂは送液ポンプの移動相ブレンディング機能を用いて調製した。誘導体化試料１の分析終了後、誘導体化試料２への分析条件の切替を自動で行った。
２．分析方法の安定性及び精度の評価
２－１．検量線の直線性
２種類の誘導体化試薬、すなわち異なるキラルチオールを用いることにより、３７成分のアミノ酸を分離した。検量線の直線性はいずれも寄与率（ｒ２）が０．９９９以上であった。３７成分のアミノ酸についての、検量線の直線性の評価結果を表１に示す。また、得られた検量線の例を図３に示す。
２－１．検量線の直線性
２種類の誘導体化試薬、すなわち異なるキラルチオールを用いることにより、３７成分のアミノ酸を分離した。検量線の直線性はいずれも寄与率（ｒ２）が０．９９９以上であった。３７成分のアミノ酸についての、検量線の直線性の評価結果を表１に示す。また、得られた検量線の例を図３に示す。
２－２．各アミノ酸の保持時間と面積の再現性
Ｄ／Ｌ－アミノ酸標準溶液（３７成分、各２μｍｏｌ／Ｌ）について、６回の繰り返し分析における、保持時間と面積の再現性（％ＲＳＤ）を確認したところ、それぞれ０．１％以下、１．５％以下であった。かかるＤ／Ｌ－アミノ酸標準溶液のクロマトグラムを図４に示す。図４において、横軸は時間を示し、縦軸は検出器の信号強度を示す。
また、保持時間と面積の再現性の評価結果を表２に示す。
図４のクロマトグラムのピークに付した番号は、表１及び表２のアミノ酸種に付した番号と対応している。
表１及び表２において、斜体文字で記した成分がＯＰＡ／ＮＡＣ誘導体化により検出され、常体文字（通常字体）で記した成分がＯＰＡ／ＮＩＢＣ誘導体化により検出されることを意味する。
Ｄ／Ｌ－アミノ酸標準溶液（３７成分、各２μｍｏｌ／Ｌ）について、６回の繰り返し分析における、保持時間と面積の再現性（％ＲＳＤ）を確認したところ、それぞれ０．１％以下、１．５％以下であった。かかるＤ／Ｌ－アミノ酸標準溶液のクロマトグラムを図４に示す。図４において、横軸は時間を示し、縦軸は検出器の信号強度を示す。
また、保持時間と面積の再現性の評価結果を表２に示す。
図４のクロマトグラムのピークに付した番号は、表１及び表２のアミノ酸種に付した番号と対応している。
表１及び表２において、斜体文字で記した成分がＯＰＡ／ＮＡＣ誘導体化により検出され、常体文字（通常字体）で記した成分がＯＰＡ／ＮＩＢＣ誘導体化により検出されることを意味する。
すなわち、ＯＰＡ／ＮＡＣによって誘導体化されたＤ－Ａｓｐ、Ｄ－Ａｒｇ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ａｓｐ、Ｌ－Ａｒｇ、Ｌ－Ａｌａ、Ｌ－Ｔｒｐ、Ｌ－Ｉｌｅ、Ｌ－Ｐｈｅを検出し、一方、ＯＰＡ／ＮＩＢＣによって誘導体化された、Ｄ－Ｇｌｕ、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ｍｅｔ、Ｄ－（Ｃｙｓ）２、Ｄ－Ｉｌｅ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｌ－Ｇｌｕ、Ｌ－Ａｓｎ、Ｌ－Ｓｅｒ、Ｌ－Ｇｌｎ、Ｌ－Ｈｉｓ、Ｌ－Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－Ｖａｌ、Ｌ－Ｍｅｔ、Ｌ－（Ｃｙｓ）２、Ｌ－Ｌｅｕ、Ｌ－Ｌｙｓを検出する。
このように、本方法の極めて好適な実施態様では、誘導体化試薬としてＯＰＡ／ＮＡＣ及びＯＰＡ／ＮＩＢＣの２種類を用い、かかる誘導体化試薬毎の移動相の条件を、上述のとおり移動相Ａとしていずれもリン酸系緩衝液を用い、また移動相Ｂは水、アセトニトリル及びメタノールの混合溶媒系であって、誘導体化試薬毎に溶媒混合比が異なるのみとし、移動相Ａと移動相Ｂのグラジエント条件以外のＨＰＬＣ分析条件を同一にする（共通化する）ことができた。
したがって、ＯＰＡ／ＮＡＣによる誘導体化試料１の分析を終えて誘導体化試料２の分析を行う際において、移動相ブレンディングユニットで、水、アセトニトリル及びメタノールの混合比を自動で変更して移動相Ｂを調製し、かつ、誘導体化試料１の分析におけるグラジエント条件１、及び誘導体化試料２の分析におけるグラジエント条件２を自動で制御する分析メソッドを切り替えることで、手間がかからず簡易に分析条件を変更できる。試料中の、タンパク質を構成するＤ／Ｌ－アミノ酸計３７成分が良好に分離され、精度よく正確に同定、定量することができる。
また、３７成分のアミノ酸の分析を、合計１３０分の分析時間で行うことができる。
したがって、ＯＰＡ／ＮＡＣによる誘導体化試料１の分析を終えて誘導体化試料２の分析を行う際において、移動相ブレンディングユニットで、水、アセトニトリル及びメタノールの混合比を自動で変更して移動相Ｂを調製し、かつ、誘導体化試料１の分析におけるグラジエント条件１、及び誘導体化試料２の分析におけるグラジエント条件２を自動で制御する分析メソッドを切り替えることで、手間がかからず簡易に分析条件を変更できる。試料中の、タンパク質を構成するＤ／Ｌ－アミノ酸計３７成分が良好に分離され、精度よく正確に同定、定量することができる。
また、３７成分のアミノ酸の分析を、合計１３０分の分析時間で行うことができる。
本発明の分析方法は、試料中のＤ／Ｌ－アミノ酸を、高い再現性で簡便に分析可能であり、特にタンパク質を構成するＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸を一斉に分析することができる。そのため、ビール、日本酒、ワイン等の醸造酒をはじめとする各種の食品分析分野におけるアミノ酸分析に有用である。
符号の説明
１００…液体クロマトグラフ分析システム
１０…移動相ブレンディングユニット
１１、１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ…移動相容器
１２…混合器
２０…送液ユニット
２１Ａ、２１Ｂ…送液ポンプ
２２…混合器
３０…オートサンプラー
３１ａ、３１ｂ…誘導体化試薬
３２…分析試料
３３…オートインジェクター
４０…カラムオーブン
４１…カラム
５０…検出器
６０…制御部
７０…表示部
１００…液体クロマトグラフ分析システム
１０…移動相ブレンディングユニット
１１、１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ…移動相容器
１２…混合器
２０…送液ユニット
２１Ａ、２１Ｂ…送液ポンプ
２２…混合器
３０…オートサンプラー
３１ａ、３１ｂ…誘導体化試薬
３２…分析試料
３３…オートインジェクター
４０…カラムオーブン
４１…カラム
５０…検出器
６０…制御部
７０…表示部
Claims (8)
- 複数種のアミノ酸を含有する試料を誘導体化試薬で誘導体化処理し、得られた誘導体化試料を移動相と共にカラムに流通させる、液体クロマトグラフィーによるアミノ酸の分析方法であって、
前記移動相が複数の移動相から構成され、かつ少なくとも１つの移動相が混合溶媒系であり、
２種以上の誘導体化試薬を用いて、２種以上の誘導体化試料を調製し、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記複数の移動相の混合比を時間の経過に伴い変化させる、異なる分析条件を設定し、
かつ、前記誘導体化試薬の種類毎に、混合溶媒系である移動相における溶媒混合比を設定し、
前記２種以上の誘導体化試料を、前記異なる分析条件及び溶媒混合比を自動で切り替えて分析し、誘導体化Ｌ－アミノ酸及び誘導体化Ｄ－アミノ酸を分離し定量する、アミノ酸の分析方法。 - 前記アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、トレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、バリン、メチオニン、シスチン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルアラニン、ロイシン、リジン、グリシンを分析する、請求項１に記載の方法。
- 前記複数の移動相が、移動相Ａ及び移動相Ｂの２種からなり、
前記誘導体化試薬の種類毎に、前記移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を時間の経過に伴い変化させる分析条件を設定し、前記異なる分析条件を自動で切り替えて前記２種以上の誘導体化試料を分析する、請求項１又は２に記載の方法。 - 前記移動相Ａが緩衝液であり、移動相Ｂが混合溶媒系である、請求項３に記載の方法。
- 前記移動相Ｂが水、アセトニトリル及びメタノールの混合溶媒系であり、かつ前記誘導体化試薬の種類毎に、その溶媒混合比を設定し、前記２種以上の誘導体化試料の分析毎に前記溶媒混合比を自動で切り替える、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記誘導体化試薬として、ｏ－フタルアルデヒド及びＮ－アセチル－Ｌ－システインの混合物、並びにｏ－フタルアルデヒド及びＮ－イソブチリル－Ｌ－システインの混合物、の２種を用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記誘導体化処理を、前処理機能を有する自動試料導入装置により行う、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- カラムに流通する移動相のｐＨが７～１２である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021127548A JP7512969B2 (ja) | 2021-08-03 | 2021-08-03 | アミノ酸の分析方法 |
| US17/875,765 US12498357B2 (en) | 2021-08-03 | 2022-07-28 | Amino acid analysis method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021127548A JP7512969B2 (ja) | 2021-08-03 | 2021-08-03 | アミノ酸の分析方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023022595A JP2023022595A (ja) | 2023-02-15 |
| JP2023022595A5 JP2023022595A5 (ja) | 2023-12-18 |
| JP7512969B2 true JP7512969B2 (ja) | 2024-07-09 |
Family
ID=85201695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021127548A Active JP7512969B2 (ja) | 2021-08-03 | 2021-08-03 | アミノ酸の分析方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US12498357B2 (ja) |
| JP (1) | JP7512969B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116500161A (zh) * | 2023-04-25 | 2023-07-28 | 深圳深检集团医学检验实验室 | 一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法 |
| JPWO2025009305A1 (ja) * | 2023-07-05 | 2025-01-09 | ||
| CN121410173B (zh) * | 2025-12-25 | 2026-04-07 | 中国科学院地理科学与资源研究所 | 在线柱前衍生耦合液质联用的氨基酸检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005003558A (ja) | 2003-06-12 | 2005-01-06 | Shiseido Co Ltd | 液体クロマトグラフ装置及び試料に含まれる光学異性体の分析方法 |
| WO2018092818A1 (ja) | 2016-11-15 | 2018-05-24 | 株式会社資生堂 | 多次元クロマトグラフィー分析方法及び分析システム |
| JP2018100906A (ja) | 2016-12-20 | 2018-06-28 | 花王株式会社 | キラルアミノ酸の分離方法 |
| JP2018163155A (ja) | 2017-03-24 | 2018-10-18 | 味の素株式会社 | アミノ酸の分析方法 |
-
2021
- 2021-08-03 JP JP2021127548A patent/JP7512969B2/ja active Active
-
2022
- 2022-07-28 US US17/875,765 patent/US12498357B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005003558A (ja) | 2003-06-12 | 2005-01-06 | Shiseido Co Ltd | 液体クロマトグラフ装置及び試料に含まれる光学異性体の分析方法 |
| WO2018092818A1 (ja) | 2016-11-15 | 2018-05-24 | 株式会社資生堂 | 多次元クロマトグラフィー分析方法及び分析システム |
| JP2018100906A (ja) | 2016-12-20 | 2018-06-28 | 花王株式会社 | キラルアミノ酸の分離方法 |
| JP2018163155A (ja) | 2017-03-24 | 2018-10-18 | 味の素株式会社 | アミノ酸の分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023022595A (ja) | 2023-02-15 |
| US12498357B2 (en) | 2025-12-16 |
| US20230058304A1 (en) | 2023-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7512969B2 (ja) | アミノ酸の分析方法 | |
| Pereira et al. | Simultaneous analysis of free amino acids and biogenic amines in honey and wine samples using in loop orthophthalaldeyde derivatization procedure | |
| Buck et al. | Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent | |
| Van Wandelen et al. | Using quaternary high-performance liquid chromatography eluent systems for separating 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate-derivatized amino acid mixtures | |
| Jajić et al. | Validation of an HPLC method for the determination of amino acids in feed | |
| Haynes et al. | Applications of automated amino acid analysis using 9-fluorenylmethyl chloroformate | |
| Lee et al. | Chiral separation of intact amino acids by capillary electrophoresis-mass spectrometry employing a partial filling technique with a crown ether carboxylic acid | |
| Jin et al. | Determination ofd-Amino Acids Labeled with Fluorescent Chiral Reagents, R (−)-andS (+)-4-(3-Isothiocyanatopyrrolidin-1-yl)-7-(N, N-dimethylaminosulfonyl)-2, 1, 3-benzoxadiazoles, in Biological and Food Samples by Liquid Chromatography | |
| Harada et al. | Biaryl axially chiral derivatizing agent for simultaneous separation and sensitive detection of proteinogenic amino acid enantiomers using liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| CN103713078B (zh) | 一种蜂蜜中氨基酸的测定方法 | |
| Reischl et al. | Chemoselective and enantioselective analysis of proteinogenic amino acids utilizing N-derivatization and 1-D enantioselective anion-exchange chromatography in combination with tandem mass spectrometric detection | |
| Rigobello-Masini et al. | Implementing stepwise solvent elution in sequential injection chromatography for fluorimetric determination of intracellular free amino acids in the microalgae Tetraselmis gracilis | |
| Cai et al. | A quantitative strategy of ultrasound-assisted digestion combined UPLC-MS/MS for rapid identifying species-specific peptide markers in the application of food gelatin authentication | |
| Jegorov et al. | Separation of α-amino acid enantiomers by reversed phase high-performance liquid chromatography after derivatization with o-phthaldialdehyde and a sodium salt of 1-thio-β-d-glucose | |
| Sánchez-López et al. | Design of strategies to study the metabolic profile of highly polar compounds in plasma by reversed-phase liquid chromatography–high resolution mass spectrometry | |
| Liu et al. | Simultaneous measurement of amino acid enantiomers in the serum of late-life depression patients using convenient LC–MS/MS method with Nα-(5-fluoro-2, 4-dinitrophenyl)-l-leucinamide Derivatization | |
| Li et al. | Automated sample preparation with 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate and iodoacetamide derivatization reagents for enantioselective liquid chromatography tandem mass spectrometry amino acid analysis | |
| Furusho et al. | Development of a highly-sensitive two-dimensional HPLC system with narrowbore reversed-phase and microbore enantioselective columns and application to the chiral amino acid analysis of the mammalian brain | |
| Han et al. | Response boosting-based approach for absolute quantification of gelatin peptides using LC-MS/MS | |
| EP3296734A1 (en) | Chiral analysis method and chiral analysis system for bound-type amino acid | |
| Ozaki et al. | Simultaneous analysis of DL-Amino acids in foods and beverages using a highly sensitive chiral resolution labeling reagent | |
| Fleischer et al. | Fast mass spectrometry-based enantiomeric excess determination of proteinogenic amino acids | |
| Buha et al. | HPLC-FLD for the simultaneous determination of primary and secondary amino acids from complex biological sample by pre-column derivatization | |
| Öztepe et al. | Separation of the enantiomers of underivatized amino acids by using serially connected dual column high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| Ogunkunle et al. | Small molecules released from islets of Langerhans determined by liquid chromatography–mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20210824 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231208 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231208 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240522 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240528 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240610 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7512969 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |