JP7516336B2 - チロシンキナーゼ阻害剤と併用してｅｇｆ／ｅｇｆｒ経路を抑制する方法および組成物 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、特にチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）療法に反応しない、あるいは耐性ができたヒトにおけるがんなどの病状を治療し、予防する方法に関する。

非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、全世界のがん関連死亡の主要因であり、最近の治療や診断の発展にもかかわらず、５年間の生存率は～１６％にとどまっている。かかる不良転帰は、大半が診断時には後期の疾病段階、疾病の強力な特性や転移の程度に起因する。著しい発展により、悪性のがん細胞を引き起こすゲノム異常を明らかにしたが、現在、利用可能な化学療法は依然として満足できるものではなく、大多数のがん診断患者に対する予後が問題として残されている。

大半の化学療法製剤は、悪性表現型の発達と関連があると思われる特定の分子標的に作用する。しかし、シグナル経路の複雑なネットワークが細胞の増殖を調節し、大半の悪性がんがこのような経路の多様な遺伝的奇形によって促進される。標準細胞毒性化学療法による肺がんの治療は、効能では最適化されているが、ＮＳＣＬＣ治療法の最近のアプローチは、ＮＳＣＬＣをこれら特有の腫瘍ドライバー遺伝子に基づく分子サブセットに分類することに基づく。ＮＳＣＬＣのかかる分子ドライバーは、治療学的に特定腫瘍遺伝子に対して標的薬剤によって攻撃され得る。

従来の大半の化学療法薬は、これらの活動においては非選択的だった。その的確な作用のメカニズムは多様で複雑であったが、一般に、大半の正常組織からよりも悪性腫瘍で通常多く見られる有糸分裂を行う細胞を損傷させることで効力が生じた。標的化された製剤は、がんの発生やがんの維持に必要且つ必須であるたんぱく質、特に悪性腫瘍の不節制な成長や血管新生、侵襲性および転移の特性を誘導する酵素の活性化を調節することにより、その効力を選択するように設計されている。通常、改善された差次的活性は、がん患者に対して問題となる副作用を減らし、特に、悪心、嘔吐や骨髄と胃腸管の細胞死を減少させて、腫瘍細胞に対しては効果を増大させる。

がん治療における治療的介入のための有望な標的セットは、ＨＥＲ－キナーゼ軸の要素を含む。これらは例えば、前立腺、肺および乳房の堅固な上皮腫瘍で上位に規制される場合が多く、膠芽腫腫瘍でも上位に規制される。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）はＨＥＲ－キナーゼ軸の要素であり、他の様々ながん治療法の開発のための選択の標的となっている。チロシン残基の可逆的リン酸化がＥＧＦＲ経路の活性化に求められるため、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ－ＴＫＩｓ）がこれらの治療法の１つである。即ち、ＥＧＦＲ－ＴＫＩは、腫瘍細胞の成長や分裂を誘導する細胞シグナル経路を誘発および／または維持させる役割をする細胞表面受容体を遮断する。具体的には、前記阻害剤は、ＨＥＲ－１と言われるＥＧＦＲキナーゼドメインを干渉するものとみられる。さらに有望なＥＧＦＲ－ＴＫＩには、キナゾリン、ピリドピリミジンおよびピロロピリミジンの３種の化合物がある。

ＥＧＦＲ特異性チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩｓ）についての臨床研究では、最善の応答を有するサブセットとして、機能獲得ＥＧＦＲ変種（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する腫瘍の患者を識別したにもかかわらず、多くのＮＳＣＬＣ患者に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）が高度に発現または増幅するということが確認された。これらの患者は、初期にはＥＧＦＲ標的治療法に反応するが、残念
なことに最終的には、標的治療法での解決が困難である長期間有効性の限界から、再発することになるであろう。全般的に、ＥＧＦＲ標的治療法の進展までの平均時間は、約８～１４ヵ月である。患者において、ＥＧＦＲ標的阻害剤に対する獲得耐性の多数のメカニズムが発見され検証されている。

ＮＳＣＬＣに対し、臨床的に用いられる最も普遍的なＦＤＡ承認を受けたＴＫＩのうち２つは、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｎｉｂ：ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＵＫ Ｌｔｄ．製作；商品名ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））；以下「ＩＲＥＳＳＡ」または「ゲフィチニブ」）およびエルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．製作；商品名ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）；以下「ＴＡＲＣＥＶＡ」またはエルロチニブ）であり、２つとも一部の患者から励みとなる臨床結果を得て、現在ＥＧＦＲ－ｍｕｔの進行性ＮＳＣＬＣ患者の第１選択治療の基準として用いられている。

これらの化合物を用いるに当たって重要な限界は、治療を受けるヒトが初めての療法に反応した後、治療効果に耐性を発現したり、または任意の測定可能な程度であってもＥＧＦＲ－ＴＫＩに反応しないことがあり得るというものである。従って、前記化合物は、最初は強い抗腫瘍特性を発揮できるが、がんの治療においてすぐに効果が減少したり、全く効能がないこともあり得る。また、これまで、医学的研究が前記耐性を生じさせる生体分子、または病理学的メカニズムを完全に証明できていないため、現在、こうした耐性を示す一部の患者に、彼らの疾病を治療するための治療的代案が略残されていない。

ＥＧＦＲ－ＡＴＰ結合親和性を増加させる二次ゲートキーパーのＴ７９０Ｍ突然変異は、腫瘍がＥＧＦＲ特異性ＴＫＩで進行する患者の５０％に発生する。また、ＮＧＣＬＣ患者の約５～１５％において、ＥＧＦＲ阻害剤による治療後にＭＥＴ増幅が報告されている。ＥＧＦＲ－Ｔ７９０ＭおよびＭＥＴ増幅した腫瘍細胞は、ＥＧＦＲ標的治療前に腫瘍から検出されることがあり、治療の際に、これらの細胞が選択的に強化されていることを示唆する。さらに、ＥＧＦＲ ＴＫＩの治療前にＴ７９０Ｍまたは増幅したＭＥＴをＨＧＦ
発現で検出することは、ＥＧＦＲ標的治療に対する反応持続期間の減少と関連する。

特定の理論に制限されることなく、突然変異もせず、増幅もしない代案的な受容体チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ標的治療に対する獲得耐性に貢献できると考えられる。「バイパス経路（ｂｙｐａｓｓ ｐａｔｈｗａｙｓ）」とも呼ばれる、また別の受容体チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ ＴＫＩを含む標的治療剤に対する本質的耐性および獲得耐性いず
れものメカニズムとして確認されている。ゲートキーパー突然変異の獲得を通じた耐性と比較して、遺伝子変形のない明確なシグナル経路の誘導を含む獲得耐性メカニズムは、文献に略記録されていない。

受容体－チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩｓ）による治療は、進行性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者において、無進行生存期間および生存期間が改善される。しかし、初期反応と有意な緩和にもかかわらず、二次耐性の発生は必然的に治療の失敗につながる。ゲフィチニブまたはエルロチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤の単一作用法は、一時的な成功のみを提供できるとみられる。この耐性の問題を解決するのに必要なことは、近い将来に二次的なＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性を克服できるよう、小分子または抗体などのさらなる治療剤とＴＫＩとの併用であると考えられる。

本発明の目的は、ＥＧＦ－ＥＧＦＲによって活性化した経路の抑制のために、活性ＥＧＦ経路免疫（ＥＧＦ ＰＴＩ）とチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を併用するための柔軟な活性療法を、治療を必要とする患者に投与することを含む脱調節されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導されたがん患者を治療する方法であり
、前記方法において、前記ＴＫＩは、１０～５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づいた連続したレジメンに従って投与され、前記ＥＧＦ ＰＴＩは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回、または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って混合投与される。

本発明の他の目的は、脱調節されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ １／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者を治療する方法であり、ここで、前記患者はＥＧＦＲの突然変異型を発現する腫瘍を有し、前記方法は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）とＥＧＦを標的とする能動免疫とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与することを含み、前記ＴＫＩは、約１０～１５０ｍｇの範囲の１日平均投与量および活性免疫化に基づく連続したレジメンに従って投与され、ＥＧＦ ＰＴＩは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って混合投与され、前記治療方法は、ＴＫＩ治療に対する耐性が生じることを防止する。

本発明の他の目的は、有効量の抗ＥＧＦ標的抗体を含む第１の区画と有効量のＴＫＩを含む第２の区画とを含む薬剤キットである。

本発明のもう１つの目的は、ＥＧＦに対する免疫反応を起こす有効量のワクチンを含む第１の区画と有効量のＴＫＩを含む第２の区画とを含む薬剤キットである。

本発明のもう１つの目的は、ＥＧＦＲに対する免疫反応を起こす有効量のワクチンを含む第１の区画と有効量のＴＫＩを含む第２の区画とを含む薬剤キットである。

本発明のもう１つの目的は、ＥＧＦに対する免疫反応を起こすワクチンとの混合投与によって、脱調節されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／Ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ）によって誘導されたがん患者の治療方法に用いられるＴＫＩであり、このような治療が必要な患者に前記ＴＫＩは、約１０～１５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づいた連続したレジメンに従って投与され、ＥＧＦに対する免疫反応を起こしたワクチンは１週間に３回、２回または１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って混合投与される。

本発明のもう１つの目的は、ＥＧＦに対する免疫反応を起こす有効量のワクチンを含む第１の区画および有効量のＴＫＩを含む第２の区画を含む、脱調節されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導されたがん患者の治療のための薬剤キットの製造のためのＴＫＩの用途であり、このような治療が必要な患者に前記ＴＫＩは、約１０～１５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づいた連続したレジメンに従って投与され、前記ワクチンは、ＴＫＩ療法を開始する前に１週間に３回、２回または１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を、週平均の投与量の範囲とする投薬計画に従って投与される。

以下、本発明の実施形態の非制限的例により示された複数の図面を参照とする詳細な説明によって、本発明はより詳細に記載されており、図面の同一参照番号は、同一部分を示している。

ＥＧＦ／ＥＧＦＲ経路の抑制時の抗ＥＧＦを表すＳＤＳ－ＰＡＧＥ－ＷＢ（ウェスタンブロット）を示す。 併用治療がＥＧＦＲ突然変異ＮＳＣＬＣ患者に有益であることを示唆し、本発明による併用治療が、ゲフィチニブによるＳＴＡＴ３の活性化を逆転したことを図示するＳＤＳ－ＰＡＧＥ ＷＢを示す。 １：２希釈のみで実験された抗ＥＧＦ抗体の結果を図示したＳＤＳ－ＰＡＧＥ ＷＢを示す。エルロチニブの濃度は０．５マイクロモルであった。 ゲフィチニブ、抗ＥＧＦ抗体、およびゲフィチニブと抗ＥＧＦ抗体の併用による治療後のＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２のレベルの比較を示す。 エルロチニブ、抗ＥＧＦ抗体、およびエルロチニブと抗ＥＧＦ抗体との併用で治療した後のＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２のレベルの比較を示し、これは表１に要約されている。 エルロチニブ、抗ＥＧＦ抗体、およびエルロチニブと抗ＥＧＦ抗体の併用で治療した後のＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２のレベルの比較を示し、これは表１に要約されている。 ゲフィチニブ＋抗ＥＧＦＲとの併用の結果を示し、４つのタンパク質のリン酸化は抑制された。 ゲフィチニブ＋抗ＥＧＦＲとの併用の結果を示し、４つのタンパク質のリン酸化は抑制された。 ゲフィチニブ＋抗ＥＧＦＲとの併用の結果を示し、４つのタンパク質のリン酸化は抑制された。 ゲフィチニブと増加した抗ＥＧＦ抗体の濃度の併用の結果を示す。 ゲフィチニブと増加した抗ＥＧＦ抗体の濃度の併用の結果を示す。 Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３およびＥＧＦＲの大半が、完全に不活性化したことを表す抗ＥＧＦおよびゲフィチニブを併用した生データ（ｒａｗ ｄａｔａ）を示す。 Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３およびＥＧＦＲの大半が、完全に不活性化したことを表す抗ＥＧＦおよびゲフィチニブを併用した生データ（ｒａｗ ｄａｔａ）を示す。 「血清飢餓状態」とＥＧＦＲ誘導のもとに行われた、また別の実験についての生データを示す。培養時間は２時間であり、ゲフィチニブの濃度は０．５μＭであった。 「血清飢餓状態」とＥＧＦＲ誘導のもとに行われた、また別の実験についての生データを示す。培養時間は２時間であり、ゲフィチニブの濃度は０．５μＭであった。 薬物、０．１および０．２５μＭを投与された患者から観察された生理学的条件で、より相応するゲフィチニブの濃度を用いて行われた、また別の一連の実験についての生データを示す。 薬物、０．１および０．２５μＭを投与された患者から観察された生理学的条件で、より相応するゲフィチニブの濃度を用いて行われた、また別の一連の実験についての生データを示す。 薬物、０．１および０．２５μＭを投与された患者から観察された生理学的条件で、より相応するゲフィチニブの濃度を用いて行われた、また別の一連の実験についての生データを示す。 薬物、０．１および０．２５μＭを投与された患者から観察された生理学的条件で、より相応するゲフィチニブの濃度を用いて行われた、また別の一連の実験についての生データを示す。 ２４時間の血清飢餓および薬物治療によるゲフィチニブ＋抗ＥＧＦの併用実験の生データを示す。 ハウスキーピングタンパク質（アクチン）を含む総タンパク質を正規化する追加実験の生データを示し、前記実験データはＥＲＫのリン酸化を示し、ＥＧＦＲは抗ＥＧＦ＋ゲフィチニブの併用で完了した。 ハウスキーピングタンパク質（アクチン）を含む総タンパク質を正規化する追加実験の生データを示し、前記実験データはＥＲＫのリン酸化を示し、ＥＧＦＲは抗ＥＧＦ＋ゲフィチニブの併用で完了した。 ハウスキーピングタンパク質（アクチン）を含む総タンパク質を正規化する追加実験の生データを示し、前記実験データはＥＲＫのリン酸化を示し、ＥＧＦＲは抗ＥＧＦ＋ゲフィチニブの併用で完了した。 「非標準条件」下のエルロチニブおよび抗ＥＧＦの追加実験の生データを示す。薬物を含む培養時間は２時間であり、エルロチニブの濃度は１μＭであった。 「非標準条件」下のエルロチニブと抗ＥＧＦの追加実験についての生データを示す。薬物を含む培養時間は２時間であり、エルロチニブの濃度は１μＭであった。 「血清飢餓」下のエルロチニブおよび抗ＥＧＦの追加実験の生データを示す。薬物を含む培養時間は２時間であり、エルロチニブの濃度は1μＭであった。 「血清飢餓」下のエルロチニブおよび抗ＥＧＦの追加実験の生データを示す。薬物を含む培養時間は２時間であり、エルロチニブの濃度は1μＭであった。 「血清飢餓」の条件下で試験された抗ＥＧＦ抗体を有する前記ＴＫＩ ＡＺＤ９２９１を用いた追加実験の生データを示す。 「血清飢餓」の条件下で試験された抗ＥＧＦ抗体を有する前記ＴＫＩ ＡＺＤ９２９１を用いた追加実験の生データを示す。 ＰＣ９細胞におけるＡＺＤ９２９１と抗ＥＧＦ（Ａｂ１）とを用いた別の実験についての生データを示す。 ＰＣ９細胞におけるＡＺＤ９２９１と抗ＥＧＦ（Ａｂ１）とを用いた別の実験についての生データを示す。 広範囲なパラメーターＷＢの終点を有する、単一治療および併用治療をテストした演算結果を示す。 薬物によるＥＧＦＲとＥｒｋの完全な非活性化を防止するために、濃度が０．１μＭに減少した薬物ＡＺＤ９２９１を含んでＰＣ９細胞が２４時間培養されたさらなる実験での生データを示す。 ２時間の培養期間の間のＰＣ９－ＧＲ４（Ｔ７９０Ｍポジティブ）におけるＡＺＤ９２９１（０．２μＭのＡＺＤ９２９１）および抗ＥＧＦ（Ａｂ１）のまた別の実験での生データを示す。 ２時間の培養期間の間のＰＣ９－ＧＲ４（Ｔ７９０Ｍポジティブ）におけるＡＺＤ９２９１（０．２μＭのＡＺＤ９２９１）および抗ＥＧＦ（Ａｂ１）のまた別の実験での生データを示す。 ２４時間の培養期間中に、ＰＣ９－ＧＲ４（Ｔ７９０Ｍポジティブ）におけるＡＺＤ９２９１（０．２μＭのＡＺＤ９２９１）と抗ＥＧＦ（Ａｂ１）のまた別の実験での生データを示す。 ２４時間の培養期間中に、ＰＣ９－ＧＲ４（Ｔ７９０Ｍポジティブ）におけるＡＺＤ９２９１（０．２μＭのＡＺＤ９２９１）と抗ＥＧＦ（Ａｂ１）のまた別の実験での生データを示す。 抗ＥＧＦ抗体を生成する本発明による融合タンパク質の配列を示す。 抗ＥＧＦ抗体を生成する本発明による融合タンパク質の配列を示す。 ＰＣ９細胞におけるゲフィチニブと抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）の、さらなる実験における生データと追加のメイカーズ（ｍａｋｅｒｓ）に対する効果を示す。 ＰＣ９細胞におけるゲフィチニブと抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）の、さらなる実験における生データと追加のメイカーズに対する効果を示す。 ＰＣ９細胞におけるゲフィチニブと抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）の、さらなる実験における生データと追加のメイカーズに対する効果を示す。 ＰＣ９細胞におけるゲフィチニブと抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）の、さらなる実験における生データと追加のメイカーズに対する効果を示す。 追加のメイカーズを含むＰＣ９細胞における抗ＥＧＦ Ａｂ１とＡｂ２との比較を示す追加実験における生データを示す。 追加のメイカーズを含むＰＣ９細胞における抗ＥＧＦ Ａｂ１とＡｂ２との比較を示す追加実験における生データを示す。 追加のメイカーズを含むＰＣ９細胞における抗ＥＧＦ Ａｂ１とＡｂ２との比較を示す追加実験における生データを示す。 追加のメイカーズを含むＰＣ９細胞における抗ＥＧＦ Ａｂ１とＡｂ２との比較を示す追加実験における生データを示す。 野生型タンパク質より低分子量の高リン酸化Ｎｏｔｃｈ３、ＡｋｔおよびＳＴＡＴ－３バンドの出現を示すＥＧＦでこれらを誘導する代わりにヒト血清で成長した細胞の生データを示す。 ２４時間で観察されたものより著しく強い、Ａｂ２によるＰＡＲＰ切断の強い誘導を示す。 ＮＳＣＬＣ Ｈ２２２８細胞における抗ＥＧＦが、ＥＧＦＲ／ＥＧＦ経路の活性化と、ＡＬＫ転移とを抑制することを示す。 水平経路の抑制、ＥＭＴに関する本発明による併用療法の影響を示す。 経路の抑制に関するＴＫＩの効果を示す概略図である。 経路の抑制に関する抗ＥＧＦの効果を示す概略図である。 経路の抑制に関するＥＧＦ－ＰＴＩとＴＫＩとの併用の効果を示す概略図である。

本明細書に記載されている技術の実施形態は、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化に対する抑制効果を有する生理学的濃度の抗ＥＧＦ抗体が、少なくともこれらのシグナル分子に対するＴＫＩの効果ほど重要であるという発見に基づいている。抗ＥＧＦ抗体とＴＫＩとの併用治療が、ｐＥＧＦＲ、ｐＡｋｔ、ｐＥＲＫ１／２およびｐＳＴＡＴ－３の抑制に対する追加効果を表すということがさらに明らかになった。一部の実施形態において、このような抗体あるいはそれらの抗原結合断片は、ＮＳＬＣを治療する方法に用いられる。本発明の範囲内で、ＥＧＦに対する免疫反応を起こすワクチンの投与により、抗ＥＧＦ抗体が生体内で旺盛に生成され得るということが考慮される。また、本発明の範囲内で、受動モノクローナル抗ＥＦＧ抗体が投与できるということが考慮される。

便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項で用いられる特定の用語は、以下にまとめる。他に明記したり文脈に内在していない限り、以下の用語と語句は、後述の意味を含む。明らかに他に明記したり、文脈で明らかでない限り、下記の用語と語句は、当該用語または語句に関連する技術分野で得た意味を排除しない。本発明の範囲は、請求範囲によってのみ限定されるため、その定義は、特定の実施形態の説明を助けるために提供され、請求された発明を限定するものではない。他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

通常、本明細書において、用語「減少する」、「低減する」、「低減した」、「低減」、「減少」および「抑制される」は、いずれも基準に比べて統計的に有意な量の減少を意味するものに用いられる。しかし、疑念を回避するために、通常、「減少する」、「減少」、「低減する」または「抑制される」は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％程度の減少を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、例えば、基準レベルと比較して提供された個体または媒介変数が全くなかったり、または提供された治療がない場合に比べて１０～９９％減少した場合までを含む。

通常、本明細書で用いられる用語「増加した」、「増加する」、「強化する」または「
活性化する」は、全て静的に有意な量による増加を意味するために用いられる；疑念を回避するために、「増加した」、「増加される」、「強化する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％増加、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または１００％の増加、または１０～１００％の間の任意の増加を含んだり、または基準レベルと比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍または２倍～１０倍以上の任意の増加を意味する。

本明細書で用いられる用語「単離した」または「部分的に精製された」は、核酸またはポリペプチドの場合において、その天然源（ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｕｒｃｅ）で発見されるものと同じ核酸またはポリペプチドと共に存在したりおよび／または分泌されたポリペプチドの場合において、分泌されたり細胞によって発現される場合、核酸またはポリペプチドと存在する少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを意味する。化学的に合成された核酸またはポリペプチド、あるいは試験管内転写／翻訳を用いて合成された核酸またはポリペプチドは、「単離した」ものとみなされる。「精製された」または「実質的に精製された」という用語は、対象の核酸またはポリペプチドを少なくとも９５重量％、例えば、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％以上単離した核酸またはポリペプチドをいう。

本明細書で用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣接した残基のαアミノおよびカルボキシル基の間のペプチド結合によって、他のアミノ酸残基に連結した一連のアミノ酸残基を表すために本明細書で同一の意味で用いられる。本明細書にて同一の意味で用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、サイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むタンパク質アミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して用いられる場合が多く、用語「ペプチド」は、小さなポリペプチドに関して用いられる場合が多いが、技術分野でこれら用語の使用は重複する。本明細書において、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、エンコードされた遺伝子生成物およびその断片を言及する場合に、同一の意味で用いられる。従って、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子生成物、天然発生のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片およびこれらの他の等価物、変異体、断片、並びに類似体を含む。

本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じてタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質などの標的を認識し、特異的に結合する任意の免疫グロブリン分子を含む。本明細書で用いられる用語は、最も広い意味で用いられ、抗体が所望の生物学的活性を表す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦｖ断片など）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異、少
なくとも２つの無傷の抗体で生成された非特異的抗体などの多重特異的抗体、抗体部分を含む融合タンパク質および抗原認識部位を含むその他の修飾された免疫グロブリン分子を含む。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれるこれらの重鎖定常ドメインの識別に基づく免疫グロブリン:ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＧおよびＩｇＭの任意の５つの主要部類、またはこれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であり得る。様々な部類の免疫グロブリンは多様であり、公知のサブユニット構造および３次元の構成を有する。抗体は例えば、細胞毒性、毒素、放射性同位元素などといった他の分子
と結合されたり（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、または、ありのままであり得る。抗体は、生体内でこれらを能動的に生成することで付与でき、またはモノクローナル抗体の手動投与によって付与できる。

本明細書にて同一の意味で用いられる「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡとＲＮＡを含む。前記ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはこれらの類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応によってポリマーに組み合わせることができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオシドおよびこれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。

「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特性を有する糖タンパク質である。抗体は、特定抗原に対する結合特異性を表す反面、免疫グロブリンは、一般に、抗原特異性が欠如した他の抗体類似分子および抗体を全て含む。例えば、後者の種類のポリペプチドは、リンパ系によって低いレベルで、また骨髄腫によって増加したレベルで生成される。

用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、広い意味で同一に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、１価、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す二重特異性抗体）を含み、また、任意の抗体断片（以下に詳しく記載する）を含んでもよい。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化および／または親和性成熟し得る。

重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって、抗体（免疫グロブリン）が、様々な部類に割り当てられる。５つの主要免疫グロブリンであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの部類があり、これらのうち幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＡ－１、ＩｇＡ－２などにさらに区分されてもよい。様々な部類の免疫グロブリンに相応する前記重鎖定常ドメインはα、δ、ε、γおよびμとそれぞれ呼ばれる。様々な部類の免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造は公知となっており、例えば、一般に、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４ｔｈ ｅｄ．（２０００）に記載されている。抗体は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドと、前記抗体の共有結合または非共有結合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。

本明細書において、用語「全長抗体」、「無傷抗体」および「全抗体」は同一の意味で用いられ、実質的に無傷型の抗体を意味するものであって、以下に記載の抗体断片を意味するものではない。特に、前記用語は、前記Ｆｃ領域を含む重鎖を有した抗体を意味する。

「抗体断片」は、無傷抗体の一部のみを含み、前記部分は、無傷抗体に存在する場合、その部分と通常関連する機能のうち少なくとも１つ、好ましくは大半または全てを維持することが望ましい。１つの実施形態において、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、よって、抗原を結合する能力を維持する。別の実施形態において、例えばＦｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調整、ＡＤＣＣ機能および補体結合などの無傷抗体に存在する場合のＦｃ領域と一般に関連する生物学的機能のうち、少なくとも１つを維持する。１つの実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同一の生体内半減期を有する１価抗体である。例えば、このような抗体断片は、前記断片に対する生体内の安定性を付与できるＦｃ配列と連結された抗原結合アーム上に含んでもよい。

本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の個体群か
ら得られた抗体を意味し、即ち、個体群を含むそれぞれの抗体は、少量で存在し得る自然発生する突然変異を除いては、本質的に同一のアミノ酸配列を含む。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対して誘導される。また、通常、異なる決定基（エピトープ）に対して誘導された他の抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは異なり、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して誘導される。

本明細書において、具体的に、モノクローナル抗体は、所望の生物学的な活性（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７；ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４））を示す限り、前記のような抗体の断片だけでなく、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体中の相応する配列と同一もしくは相同である、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、鎖の残部は他の種に由来する抗体に由来する抗体中の相応する配列と同一もしくは相同である、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体を含む。

「ヒト抗体」は、ヒトにより生成された抗体のアミノ酸配列に相応し、および/または
、本明細書に開示されるようなヒト抗体を製造するための任意の技術を用いて製造されたアミノ酸配列を有するものである。具体的に、前記ヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。

本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性または良性の、全ての前がん性およびがん性細胞と前がん性およびがん性組織とを含む全ての腫瘍細胞の成長と増殖とを意味する。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及されているように互いに排他的ではない。

用語「がん」および「がん性」は、一般に非調節の細胞の成長/増殖を特徴とする哺乳
動物における生理学的条件を意味または説明する。がんの例としては、上皮がん、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫や白血病を含むが、これらに制限されるのではない。このようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、すい臓がん、膠芽腫、子宮頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、へパトーマ（肝細胞がん）、乳がん、大腸がん、結腸・直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん腫や各種の頭頸部がんが含まれる。

本明細書に用いられる「治療」は、治療される個人または細胞の自然経過を変更しようとする臨床的介入を意味し、予防または臨床病理学の過程の中で行うことができる。治療の望ましい効果は、疾病の発生または再発防止、症状の軽減、疾病の任意の直接または間接的な病理学的結果の減少、炎症および／もしくは組織／器官損傷の予防または減少、疾病進行率の緩和、病状の改善または緩和、並びに緩和または改善された予後を含む。一部の実施形態において、本発明の抗体は、疾病または障害の発現を遅延させるために用いられる。

「薬剤賦形剤」は、薬学業界で一般に用いられるものを意味し、特に「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．Ｒｏｗｅ, Ｐａｕｌ Ｊ．
Ｓｈｅｓｋｅｙ, Ｐａｕｌ Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ－４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００３）
の全体の内容を含む。

本発明の物質／分子の「治療学的有効量」は、患者に所望の反応性を導き出すために、患者の病状、年齢、性別および体重、並びに物質／分子の能力などの因子によって変わり得る。また、治療学的に有益な効果が物質／分子の任意の毒性または有害な効果より上回
るものが、治療学的有効量である。「予防学的有効量」は、所望の予防的結果を得るために必要な投与量および必要な期間の効果的な量を意味する。疾病の初期段階または初期段階以前に被験体に予防量が使用されるため、前記予防学的有効量は治療学的有効量より少なくて済むのが一般的であるが、必須ではない。

「化学療法剤」は、がん治療に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパやＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブルスファン、インプロスルファンやピポスルファンなどのアルキルスルホネート（スルホン酸アルキル）；ベンゾドーパ、カルボクオン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などシクロホスファミドのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンアミン並びにメチロールメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；δ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β－ラパコン；ラパコール；コルチカイン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチンおよび９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（これらのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン８）；ド
ラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エルウテロビン；パンクラティスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、チョロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン・オキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンやラニムスチンなどのニトロスレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩ１およびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ, Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ、Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．,３３：１８３－１８６（１９９４）参照）などの抗生物質；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；また、ネオカルジノスタチン発色団および関連のクロモタンパク質エンジイン抗生発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アゼセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィルリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＬＩＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソームインジェクション（ＤＯＸＩＬ（登録商標））およびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソラビシン（ｅｓｏｒａｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロンや５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝物；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロ
スタンなどの抗-副腎；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグルラトン；アルドホスファ
ミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；エルプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンやアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラリン・；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロゾキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類（ポリサッカライド）錯体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ, Ｅｕｇｅｎｅ, Ｏｒｅｇ．）；レゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２’,２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（‘Ａｒａ－Ｃ’）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン加工ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＳＡＮＥ^TM）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンやカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；レウコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；これらの薬剤学的に許容される塩、酸または誘導体；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンと、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、並びにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ^TM）と５－ＦＵおよびロイコボビンが併用される治療計画の略語であるＦＯＬＦＯＸなどの前記の２つ以上の組み合わせが含まれる。

「患者の反応」は、限定されるものではないが、以下を含む患者に利点を示す任意のエンドポイントを用いて評価できる。（１）減速および完全な阻止を含む疾病進行の、ある程度までの抑制；（２）疾病発症および／または症状の数の減少；（３）病変サイズの減少；（４）隣接する抹消器官および／または組織への疾病細胞浸潤の抑制（即ち、減少、減速または完全な停止）；（５）疾病拡散の抑制（即ち、減少、減速または完全な停止）；（６）病変の退行または切除をもたらし得る細胞の増殖、浸潤または転移の減少；（７）障害と関連する１つ以上の症状の、ある程度の軽減；（８）治療後の無病期間の増加；および／または（９）治療後の特定の時点での死亡率の減少。

「組織または細胞のサンプル」は、被験者または患者の組織から得られた同様の細胞の集まりを意味する。組織または細胞サンプルの供給源は、新鮮な、凍結および／もしくは保存された臓器または組織サンプルまたは生検または吸引物から得られる固体組織；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液などの体液；被験者の妊娠期または発達期における任意の時期の細胞であってもよい。また、前記組織サンプルは、１次細胞または培養細胞または細胞株であってもよい。場合によっては、前記組織または細胞サンプルは、疾病組織／器官から得られる。前記組織サンプルは、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、抗生剤などの本来は組織と自然に混合しない化合物を含有してもよい。

ＥＧＦＲ－ＴＫＩ製剤
本発明の方法は、被験者にＥＧＦＲ－ＴＫＩ製剤を投与することを含む。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の系列は、上皮成長因子（ＥＧＦ）系列の構成要素に反応して機能を
結合するおよび引き出す４つの構造的に関連する細胞表面受容体チロシンキナーゼを含む。ヒトにおいて、これはＨｅｒ－１およびＥｒｂＢ１としても知られているＥＧＦＲ、ＮｅｕおよびＥｒｂＢ２とも呼ばれるＨｅｒ－２、Ｈｅｒ－３（ＥｒｂＢ３）およびＨｅｒ－４（ＥｒｂＢ４）を含む。ＥｒｂＢシグナルの過多活性化は、様々な固形腫瘍の発生と関連がある。従って、様々なさらなる実施形態において、本発明は、抗ＥＧＦ抗体とエルロチニブだけでなく、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブおよびセツキシマブなどの他のＥＧＦＲ阻害剤、並びにラパチニブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブなどのＨＥＲ２阻害剤の併用を含む。任意の実施形態において、前記ＥＧＦＲ－ＴＫＩは、現在、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）という商品名で販売されている薬の有効成分であるエルロチニブである。

エルロチニブは、チロシンキナーゼ阻害剤であり、Ｎ－（３－エチニルフェニル）－６,７－ビス（２－メトキシエトキシ）－４－キナゾリンアミンという化学名のキナゾリン
アミンである。特定の実施形態において、前記エルロチニブは、エルロチニブ塩酸塩である。経口投与のためのＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）錠は、２５ｍｇ、１００ｍｇおよび１５０ｍｇのエルロチニブに相当するエルロチニブ塩酸塩（２７．３ｍｇ、１０９．３ｍｇおよび１６３.９ｍｇ）並びに、以下の非活性成分であるラクトース一水和物、ハイプロ
メロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよび二酸化チタンを含有する３種の投与量で入手可能である。また、錠剤は、製品を識別するために、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃６（２５ｍｇのみ該当）を含んだ微量の着色添加物が含有される。詳細な情報は承認された薬物のラベルから得られる。ＮＳＣＬＣ用のＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）の承認された推奨用量は、１５０ｍｇ／１日であり；すい臓がんに対する承認された用量は、１００ｍｇ／１日である。必要に応じて、５０ｍｇの減量で服用量を減らすことができる。

別の実施形態において、前記ＥＧＦＲ－ＴＫＩ製剤は、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）という商品名として販売されている薬の有効成分のゲフィチニブである。ゲフィチニブは、Ｎ－（３－クロロ－４－フルオロフェニル）－７－メトキシ－６－[３－４－モルホリノプ
ロポキシ]の化学名４－キナゾリンアミンを有するチロシンキナーゼ阻害剤である。臨床
処方は、有効成分であるラクトース一水和物、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムを含有する２５０ｍｇ錠剤として提供される。単一の療法として推奨される用量は、１日２５０ｍｇ１錠である。さらに詳細な情報は承認された薬物のラベルで確認できる。

アファチニブ、パニツムマブおよびセツキシマブなどの他のＥＧＦＲ阻害剤だけでなく、ラパチニブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブなどのＨＥＲ２阻害剤は、当該技術分野で公知となっており、よって、当業者は本発明と共に使用する際に求められる、それらの構造、剤形、用量および用法（例えば、承認された薬物のラベルなどの公開された医学的情報に基づいて）が容易に分かる。

ＥＧＦＲの小分子阻害剤は、一部のＮＳＣＬＣ患者の臨床反応を誘導し、この反応はＥＧＦＲのキナーゼドメインにおいて突然変異を活性化させることと関連がある。これらの突然変異タンパク質は、ヒト上皮細胞を変形させるのに十分であり、ＮＳＣＬＣ細胞株の生存において必須である。腫瘍形成に対する突然変異ＥＧＦＲとその寄与により誘導された生物学的変化を理解するために、これを活性化させる下流シグナル伝達経路の徹底した理解が求められる。シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、多数のヒトがんで活発であり、細胞周期の進行、抗アポトーシス、細胞生存および血管新生に関与する多数の遺伝子の転写を調節する発がん性転写因子である。

ＳＴＡＴ３は、ＥＧＦ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および他のサイトカインによって活性が媒介し得るＥＧＦＲ、ＪＡＫ２および他のチロシンキナーゼによって活性化し得る。従って、ＳＴＡＴ３は、多くのシグナル経路の収束点であり、腫瘍形成および腫瘍転移において主要な役割をする。ＳＴＡＴ３は、様々な形態の突然変異ＥＧＦＲによって活性化し、線維芽細胞およびヒト肺がん細胞において、これらの突然変異の発がん効果に寄与すると考えられる。

リガンド結合または突然変異による活性化後、ＥＧＦＲは、転写および翻訳後のメカニズムを介して細胞の生物学的特性を変化させるシグナル伝達経路のカスケードを開示している。これらの変更を媒介するシグナル経路は、Ｒａｓ－Ｒａｆ－ミトゲン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホイノシチド３－キナーゼ－ＡＫＴ、並びにシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３およびＳＴＡＴ５シグナル伝達経路が含まれる。ＳＴＡＴ系転写因子は、保存したチロシン残基のリン酸化によって活性化して、二量体化、核転座およびＤＮＡ結合を誘導する。また、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５は、ＣＯＯＨ末端のセリン残基上でリン酸化する；前記リン酸化は、二量体化、核転座およびＤＮＡ結合に必要でないが、一部遺伝子の最大の転写活性に求められると考えられる。

構造的に、幾つかの非小細胞肺がん細胞株は、活性ＳＴＡＴ３を含んでいる。最近、遺伝的に定義されているシステムにおいて、ＳＴＡＴ３が複数のＥＧＦＲ突然変異によって活性化することが確認された。しかし、突然変異ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達経路のどれが発がん性を媒介するのに必要か知られていないが、広範囲なヒト悪性腫瘍におけるＳＴＡＴ３の役割と、様々な細胞類型におけるＥＧＦによって活性化するという事実を考慮すると、ＳＴＡＴ３は、体細胞突然変異ＥＧＦＲの発がん効果において必須であると考えられる。ＳＴＡＴ３は、突然変異ＥＧＦＲを発現する線維芽細胞だけでなく、自然発生のＥＧＦＲ突然変異を有する２つのＮＳＣＬＳ細胞株でも活性化し、かかる活性化は、これらの細胞の形質転換および生存に必要であることが報告されている。

ＳＴＡＴ３の活性化は、リガンド－受容体の相互作用を含む場合が多い。ＳＴＡＴ３は、インターフェロン、ＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦおよびインターロイキン（ＩＬ－６）ファミリーのサイトカインを含む多数の各種サイトカインによって活性化し得る。それらの同族受容体に対するサイトカインの結合は、ＪＡＫｓのリン酸化、ＳＴＡＴ３の二量体化、核転座、ＤＮＡ結合および遺伝子活性化を誘導する（１２，１３）。また、ＳＴＡＴ３のリン酸化は、Ｓｒｃファミリーキナーゼなどの細胞質チロシンキナーゼによって誘導されることもある（１４）。ＮＳＣＬＣ、乳がんおよび頭頚部がんを含む多くの原発性腫瘍標本および腫瘍由来の細胞株において、上昇したＥＧＦＲの活性およびＳＴＡＴ３の活性は、正の相関関係があると報告されている。

増加したＳＴＡＴ３の活性は、突然変異ＥＧＦＲを発現する細胞株および肺腺がんで確認される。特定の理論に限定されず、ＳＴＡＴ３は、突然変異ＥＧＦＲによって要求され、その下流の表現効果において必須であると考えられる。線維芽細胞におけるＳＴＡＴ３の機能の抑制は、突然変異ＥＧＦＲによる形質転換を抑える。残念ながら、ＴＫＩなどの標的療法は、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＳＴＡＴ３の活性を完全に抑制することができない。

以前の研究は、突然変異ＥＧＦＲがＩＬ－６の上向き調節を通じて、ｇｐ１３０／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路の活性化を誘導することを提示していた。ＮＳＣＬＣ試料において、ＩＬ－６およびＩＬ－６受容体成分ｇｐ８０およびｇｐ１３０の腫瘍発現が見つかった（２０）。また、ＩＬ－６およびＩＬ－８などの炎症性サイトカインの増加したレベルがＮＳＣＬＣの腫瘍形成および予後と関連することも観察された。これは、ＩＬ－６およびそ
の下流経路がＥＧＦＲ突然変異を有するＮＳＣＬＣ患者の標的となる可能性があることを示す。しかし、ＮＳＣＬＣにおいて、発がん性ＥＧＦＲ突然変異によるＩＬ－６誘導についてのメカニズムはまだ明確でないが、肺がんにおいて、ＮＦ－ｋＢおよびＳＴＡＴ３シグナルがＩＬ－６自己分泌を調節すると考えられる。

本発明の一様態によると、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ結合（ｍＡｂ）によって活性化した経路の抑制のために、本発明によるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と抗ＥＧＦ抗体とを併用する柔軟かつ積極的なレジメンを、治療を必要とする患者に投与することで、脱調節されたヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導されたがん患者を治療するために、抗ＥＧＦ抗体が用いられ、ここで、前記ＴＫＩは、約１０～２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づいた連続したレジメンに従って投与され、本発明によるＥＧＦ ＴＰＩは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回、また
は少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って混合投与される。

本発明の別の様態によると、ＥＧＦに対する免疫反応を起こすワクチンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を併用する柔軟かつ積極的なレジメンを、治療を必要とする患者に投与することで、脱調節されたヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導されたがん患者のワクチン化により抗ＥＧＦ抗体が生成され、ここで、前記ＴＫＩは、約１０～２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づいた連続したレジメンに従って投与され、本発明によるワクチンは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回、または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って混合投与される。

本発明の別の様態によると、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化に対する生理学的濃度における抗ＥＧＦ抗体の効果は、少なくともこれらのシグナル分子に対するゲフィチニブなどのＴＫＩの効果ほど顕著であることが確認された。ゲフィチニブなどのＴＫＩと抗ＥＧＦ抗体との併用治療が、ｐＥＧＦＲ、ｐＡｋｔ、ｐＥＲＫ１／２抑制に対して予想できない顕著な相乗効果を示すことは、本発明の範囲内である。特定の理論に限定されることなく、治療に対する耐性を得る第１のステップとしてみなされるゲフィチニブをＥＧＦＲ突然変異細胞に投与すると、ＳＴＡＴ３の活性化が誘導され、本発明による抗ＥＧＦ抗体の併用はかかる活性化を抑制すると考えられる。

上述した通り、ゲフィチニブおよびエルロチニブなどの既存のＴＫＩ療法は、ＥＧＦＲの活性化を遮断するための投与量で、がんを治療するために、毎日の療法において患者に投与することを必要とする。しかし、上述した通り、前記治療に対する耐性が患者に発現する場合も多い。本発明は、抗ＥＧＦ抗体の能動的または受動的使用と併用されるＴＫＩの投薬計画が耐性患者にそれらの耐性を克服するために投与されたり、ＴＫＩ療法に反応しない患者にそれらの非反応性を克服するために投与される（以下では、がんを有するヒトに対して用いられる場合、いずれの症状も「耐性」という用語に含まれる）という、本出願人による驚くべき発見に基づく。この併用投薬スケジュールは、驚くほど耐性に効果がある。本発明の別の実施形態は、前記耐性または非反応性に対する原因と判断されている本発明者のＳＴＡＴ３の代謝経路の同定に基づく。

本発明の方法は、ＮＳＬＣの治療に限定されない。代わりに、本発明の方法によって、除去されたＴＫＩ耐性および明らかになった生体分子経路は、ＴＫＩを用いた治療が治療中の患者にとって有益な結果をもたらす任意の病状が、他の病状の治療に適用できることが容易に理解されるであろう。「有益な結果」とは、病状の重症度の軽減、病状悪化の防止、病状の治療および患者の寿命や期待寿命の延びなどが含まれ得るが、これらに限定されない。これらの病状は、本発明の方法を用いて臨床的に影響を受け得る任意の他のキナ
ーゼまたはＥＧＦＲによって調節される、またはこれに関連し得る。

より具体的には、下記の実施例に記載の発明者の実験研究は、ＥＧＦＲシグナルカスケードの効果的な抑制を立証するこれらの腫瘍に対する分子研究において、毎日の投薬計画でのＴＫＩの臨床活性を立証した。前記実施例は、前記分子研究が他のモデルシステムにおいて観察されたこれらのＴＫＩの挙動を適切に反映したことを確認した。また、驚くことに、本発明は、受動的に投与されるか、またはかかる抗体を生産するワクチンの投与によって能動的に生産される抗ＥＧＦ抗体と併用したＴＫＩが分子モデル－従来のＴＫＩ療法に対する耐性を証明する腫瘍においても、効果的に腫瘍の成長を抑制できるということを立証する。

１つの例示的な実施形態において、前臨床研究に用いられた抗ＥＧＦ抗体は、モンタナイドアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に製剤化されたＭａｎ
ｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ａｎ Ｅｐｉｄ
ｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚなど（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８、その全体の内容が参考文献として含まれる）によって記述されているように、ＣＩＭＡｖａｘ－ＥＧＦワクチンのｒＥＧＦ－ｒＰ６４ｋコンジュゲートの免疫化によって能動的に生成される。ＥＧＦまたはＥＧＦＲに対する免疫反応を生成する他のワクチン製剤が使用できることは、本発明の範囲内で考慮されている。また、他の成長因子またはそれらの受容体に対する免疫反応を起こすワクチンも使用できることが本発明の範囲内にある。特に、それぞれのその全体の内容が参考文献として含まれるＷＯ２０１３/０７６５８０およびＷＯ２０１４/１４０８９４に開示されている免疫原性タンパク質は、本発明による抗ＥＧＦ抗体を生産するのに用いられ得る。

任意の理論に限定されることを望まないが、ＳＴＡＴ３の代謝経路の抑制が細胞増殖に関与する細胞シグナル経路の刺激に求められると思われ、さらに、本発明の併用投薬計画によって前記ＳＴＡＴ３のさらなる抑制が、前記細胞シグナルを抑制または下向き調節するのに効果的であると思われる。また、従来のＴＫＩ治療に耐性がある患者にもＳＴＡＴ３がまた抑制されるため、本発明の併用投薬計画によって有益な抗腫瘍効果が得られる。本発明の併用療法は、従来のＴＫＩ療法が失敗した病状の妨害と関連し得る。従って、本発明の方法は、細胞および分子レベルにおいて従来の方法と異なって作用することで、ＴＫＩ療法に対する耐性または非反応性を克服し得る。

特定の実施形態において、抗ＥＧＦ抗体とＴＫＩの併用投薬は、従来のＴＫＩ療法に耐性があるヒトにおいて、がん、特に肺がん、乳がんおよび前立腺がんを治療するのに効果的であり得る。本発明の方法を用いて治療され得る他の形態のがんとしては、胃がん、大腸がんおよび卵巣がんだけでなく、膠芽腫腫瘍を含むが、これらに限定されない。これらのがん形態それぞれは、有意なＥＧＦＲ発現を示すので、本発明の方法による治療のための好適な標的となる。

本発明の方法による使用に適したＴＫＩは、がん、特に乳がん、肺がんおよび前立腺がんの治療に用いるために、一般に公知のＴＫＩが含まれ得るが、これに限定されない。例えば、前記ＴＫＩは、上述した通り、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）およびＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）を含むことができるが、ＣＩ１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．から入手可能
）、ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧから入手可能）、ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ
ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）、ＥＫＢ５６９（Ｗｙｅｔｈから入手可能）、ＩＭＣ－Ｃ２２５（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．およびＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．から入手可能）およびそれらの薬学的に許容される塩または等価物をさらに含むことができ、後者のグループは、現在、臨床試験ステップにおけるステ
ップＩまたはステップＩＩにあり、これらはいずれも「キナーゼ阻害剤」または「ＴＫＩ」という用語に含まれている。

特に、幾つかのＴＫＩは、効果的な抗腫瘍活性を有することが確認され、また承認されたり、臨床試験中にある。これらの例としては、Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４），ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）およびＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ），イマチニブメシル酸塩（ＳＴＩ５７１；Ｇｌｅｅｖｅｃ）、エルロチニブ（ＯＳＩ－１７７４；ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ １０３３），セマキ
シニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４），ソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６），ステント（ＳＵ１ １２４８）およびレフルノミド（ＳＵ
１０１）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

がんに対する所定の治療効能は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかし、本発明において、例えば、腫瘍の兆候や症状のいずれか、または全てが有益な方法で変更されたり、他の臨床的に承認された症状が本明細書に記載のような薬剤で治療した後、少なくとも１０％程改善または向上すると、治療は「効果的な治療」とみなされる。また、効能は、入院や医療介入の必要性により判定された個人の疾病が悪化しないこと（即ち、疾病の進行が止まること）によって評価され得る。かかる徴候を測定する方法は、当業者に公知となっており、および／または本明細書に記載されている。

疾病の治療をするための有効量は、これを必要とする哺乳動物に投与される場合、本明細書で定義されている通り、その疾病に対する効果的な治療をもたらすのに十分な量を意味する。薬剤の効能は、例えば、腫瘍サイズ、腫瘍質量、腫瘍密度、血管新生、腫瘍成長速度などのがんの物理的指標を評価することで決定され得る。また、本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合部分、または本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合部分をコードする核酸を含む薬剤で治療される被験体において、ＭＩＣペプチドまたはその断片を循環することにおける減少により薬剤の効能が測定され得る。

本発明の実施形態に関する説明は、開示されている特定の形態によって本発明を拘束したり限定することを意図していない。本発明の特定の実施形態および実施例は、説明を目的として本明細書に記載されているが、関連技術分野の当業者が分かるように、様々な同等な修正が本発明の範囲内で可能である。本明細書で提供されている開示の教示は、他の手続きまたは方法に適切に適用され得る。本明細書で記載されている様々な実施形態を組み合わせて、また他の実施形態を提供することができる。必要に応じて、本明細書の様態は、前記文献および出願の組成、機能および概念を用いるために修正され、また他の実施形態を提供することができる。本発明の詳細な説明を考慮して、本開示についてこのような変更およびその他の変更が行なわれ得る。

上述した実施形態の任意の特定要素は、他の実施形態の要素と結合または代替され得る。また、本発明の特定の実施形態に関する利点がこれらの実施形態に関して説明されているが、他の実施形態もこのような利点を示すことができ、全ての実施形態が必ず本発明の範囲内に含まれるような利点を示す必要はない。

本発明は、下記実施例によりさらに説明されるが、これらに限定されるものではない。

実施例I：エンドポイントにＷＢを用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ経路の抑制に対する抗ＥＧ
Ｆの評価
目的：ＮＳＣＬＣ患者のＰＣ９細胞株でＥＧＦ－ＥＧＦＲ結合によって活性化した経路の抑制に対して、ゲフィチニブに対する抗ＥＧＦ抗体の効果を比較するためである。同一
の細胞株において、抗ＥＧＦとゲフィチニブとの併用が相乗効果を示すか評価するためである。

ウェスタンブロッティング（ＷＢ）法で活性化を実験するための材料および方法
ＰＣ９細胞株は、ＴＫＩに対して感受性がある前記細胞株を生成するエクソン１９における欠失を有している。これは、第１選択のＴＫＩ治療を受けるＮＳＣＬＣ患者群のＥＧＦＲ突然変異セグメントに対するモデルを示す。

この実験のための全ての組織培養材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ（Ｋｉｂｂｕｔｚ Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）から入手した。ＰＣ９細胞株は、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供された。細胞は１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ－グルタミンで補充されたＲＰＭＩ培地で維持した。細胞は３７℃で５％のＣ０２の加湿雰囲気下で成長させる。

本プロジェクトで用いられた抗ＥＧＦ抗体は、上述の通り、モンタナイドアジュバント（Ａｂ１）と共に製剤化されたｒＥＧＦ－ｒＰ６４ｋコンジュゲートＣＩＭＡｖａｘ－ＥＧＦワクチンの４回の免疫が付与されたサルにおける免疫研究から得られた。血清は、メロン（Ｍｅｌｌｏｎ）ゲルを用いて処理され、補体などの汚染物を除去した。この精製は、Ｓｃｏｔｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ， ＵＫで行われた。ＥＬＩＳＡの力価は略１／６０
０００である。

実験１：典型的な標準実験において、研究下の５つのＴ－７５フラスコの細胞株を約７０％コンフルエンスまで培養し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清培地でｏ／ｎ培養した。血清飢餓細胞を再度洗浄し、以下のように処理した：

第１の実験において、抗ＥＧＦ希釈は、単独またはゲフィチニブと併用したとき、１：２０、１：１０、および１：５で実験された。ゲフィチニブは、約４０ナノモル培地の濃度で使用され、ＥＧＦと抗体もしくはゲフィチニブ、または抗ＥＧＦとゲフィチニブは混合され、細胞に添加される前に約３７℃で約１０分間予備培養された。治療は、約１５分間であった。

実験２：第２の実験において、抗ＥＧＦは１：２の希釈のみで実験された。ゲフィチニブは０．５マイクロモルの濃度であった。前記実験において、治療は約２時間まで持続された。

治療の後、実験１および２において、培養液をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する溶解緩衝剤に溶解した。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに載せ、膜に移して、ＥＧＦＲ、ｐ－ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｐ－ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ－３に対する抗体でブロッティングした。バンドの強度は、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて測定し、次いで２段階の正規化に提供された。まず、リン酸化バンドの強度を同じサンプルの総タンパク質に相当するバンドの強度で除した。次いで、前記値は、同じタンパク質に対してＥＧＦ処理された細胞で得られた値で除した。前記プロジェクトに用いられたＥＧＦおよび抗ＥＧＦ抗体は、モンタナイドアジュバントと共に製剤化されたｒＥＧＦ－ｒＰ６４ｋコンジュゲートＣＩＭＡｖａｘ－ＥＧＦワクチンの４回の免疫が付与されたサルにおける免疫研究から得られた。前記ワクチンおよび得られた抗ＥＧＦ抗体は、Ｂｉｏｖｅｎ（Ｅｕｒｏｐｅ）Ｌｔｄ，Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｎｏｒｔｈ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｕ．Ｋ．Ｓｃｏｔｌａｎ
ｄによって提供された。ウェスタンブロッティングのための抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕ
ｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で購入した。前記実験プロジェクトにおける生データが図１に反映されている。

実験１および２の結果（２時間培養）
第２の実験の結果を以下に提示されている観察と共に、図２に示している：図１に示されている実験１の結果は、長期の培養がＳＴＡＴ３のリン酸化に重要な影響を及ぼすということを確認した。また、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化に対する抗ＥＧＦの影響は、少なくともこれらのシグナル分子に対するゲフィチニブの影響ほど顕著であるということが観察された。また、抗ＥＧＦとゲフィチニブとの併用治療は、ｐＥＧＦＲ、ｐＡｋｔ、ｐＥＲＫ１／２の抑制に対するさらなる効果を示すことが結論付けられた。特定の理論に限定されず、療法に対する耐性を得る第１のステップとしてみなされるＥＧＦＲ突然変異細胞に対するゲフィチニブの投与は、ＳＴＡＴ３の活性化を誘導すると考えられる。

抗ＥＧＦにＰＣ９細胞の実験的露出に基づいて、抗ＥＧＦはＳＴＡＴ３を活性化させないが、多少制限された抑制効果を有することを示す。さらに、予想外に、図２を証拠として、併用治療がＥＧＦＲ突然変異ＮＳＣＬＣ患者に有益であり得るということを暗示する前記併用治療は、ゲフィチニブによるＳＴＡＴ３の活性化を完全に逆転させたことが結論付けられた。

実験３：第３の実験において、抗ＥＧＦは１：２の希釈のみで実験した。エルロチニブの濃度は０．５マイクロモルであった。前記実験において、治療は約２時間まで持続された。治療の後、培養液をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する溶解緩衝剤に溶解させた。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに載せ、膜に移して、ＥＧＦＲ、ｐ－ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｐ－ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ－３に対する抗体でブロッティングした。バンドの強度は、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて測定し、次いで２段階の正規化に提供された。まず、リン酸化バンドの強度を同じサンプルの総タンパク質に相当するバンドの強度で除した。次いで、前記値は、同じタンパク質に対してＥＧＦ処理された細胞で得られた値で除した。ＥＧＦと抗ＥＧＦは、全てＢｉｏｖｅｎによって提供された。ウェスタンブロッティングのための抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）で購入した。実験プロジェクトにおける生データが図３に反映されて
おり、以下の表１に要約されている。

実施例２：エンドポイントにＷＢを用いてＥＧＦ／ＥＧＦＲ経路の抑制に対する抗ＥＧＦ（単剤とゲフィチニブとの併用）の評価
ＰＣ９のＮＳＣＬＣ細胞株において、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ結合によって活性化した経路の抑制に対する抗ＥＧＦ抗体とゲフィチニブとエルロチニブの効果を比較するために、さらなる実験を行って、同じ細胞株において、抗ＥＧＦおよびゲフィチニブまたはエルロチニブの併用が単剤治療よりも優れているか否かを評価した。本実験は、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有するゲフィチニブに対する耐性のあるＰＣ９細胞株（ＰＣ９－ＧＲ４）において、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ結合によって活性化した経路の抑制に対するＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変
異陽性転移性非小細胞肺がん患者に対して、ＵＳ ＦＤＡによって承認されたＴＡＧＲＩ
ＳＳＯ^TM ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（ＡＺＤ９２９１）および抗ＥＧＦ抗体の効果を比較
し、同じ細胞株において、抗ＥＧＦとＡＺＤ９２９１との併用が単剤治療よりも優れているか否かを評価するために考案された。

ウェスタンブロッティング（ＷＢ）法で活性化を実験するための材料および方法
細胞株
本研究の遂行において、ＴＫＩに耐性のあるＰＣ９由来の細胞株が用いられている。親ＰＣ９はＮＳＣＬＣ由来細胞であり、これはエクソン１９で１５ｂｐの欠失を有し、ゲフィチニブとフォレチニブに対して非常に感受性がある（ｎＭ範囲でＩＣ５０）。これらは、第１選択のＴＫＩ治療を受けたＮＳＣＬＣ患者集団のＥＧＦＲ突然変異セグメントに対するモデルを示す。本発明者は、２か月にわたってエルロチニブとゲフィチニブの濃度を増加させながらＰＣ９細胞を治療し、ゲフィチニブとエルロチニブ（ＩＣ ５０ 約５～１０μＭ）に耐性のある６つの異なる細胞株（ＰＣ９－ＥＲおよびＧＲ１～ＧＲ５）を得た。患者と同様に、６つの細胞株のいずれも感受性突然変異（１５ｂｐ欠失）を損失しなかったが、そのうち２つに耐性突然変異Ｔ７９０Ｍが存在した。この２つの細胞株（ＰＣ９－ＧＲ１およびＧＲ４）は、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ突然変異タンパク質にも結合できるＡｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ（ＡＺＤ９２９１）によって開発された新世代ＥＧＦＲ ＴＫＩ
に対して感受性がある。

材料
全ての組織培養材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｋｉｂｂｕｔ
ｚ Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）から得た。前記ＰＣ９細胞株は、その細胞株を樹立した研究者であるＤｒ．Ｍａｙｕｍｉ Ｏｎｏの承認を得て、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から提供された。細胞が１０％の
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ－グルタミンで補充したＲＰＭＩ培地で培養され、３７℃で５％のＣ０２の加湿雰囲気下で維持された。Ｂｉｏｖｅｎは抗ＥＧＦ抗体を提供した。本プロジェクトで用いられた抗ＥＧＦ抗体は、モンタナイドアジュバントと共に製剤化されたｒＥＧＦ－ｒＰ６４ｋコンジュゲートの４回の免疫が付与されたサルにおける免疫研究から得られた。補体のような汚染物を除去するために、メロンゲル上で血清が処理された。この精製ステップは、Ｓｃｏｔｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫで行われた。ＥＬＩＳＡの力価は１／６００００であった。ゲフィチニブは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，
ＴＸ）から購入した。ウェスタンブロッティングのためのＥＧＦおよび抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入し
た。

治療
実験１および２において、前記ＰＣ９細胞株の９つのＴ－７５フラスコを７０％コンフルエンスまで培養し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清培地でｏ／ｎ培養した。次いで、血清飢餓細胞を再度洗浄（×２）した後、１０ｎｇのＥＧＦ／ｍＬが含有された無血清培地において、３７℃で１０分間予備培養された抗ＥＧＦ（単剤とゲフィチニブとの併用）で処理した。薬物による細胞培養時間は約１０分であった；全ての場合において、ゲフィチニ
ブの濃度は４０ｎＭであり、抗体希釈は１／２０～１／２の範囲であった。次いで、３種類の実験が行われた：

Ａ．血清飢餓：「２４時間血清飢餓」の実験において、ＰＣ９細胞株の５つのＴ－７５フラスコを血清枯渇（ｏ／ｎ）に提供し、洗浄し（×２）、１０ｎｇのＥＧＦ／ｍＬを含有した無血清培地において、３７℃で１０分間予備培養された抗ＥＧＦ（単剤とゲフィチニブとの併用）で処理された。薬物による細胞の培養時間は、１５分または２時間であった；ゲフィチニブを各種濃度で試験し、ＡＺＤ９２９１濃度は常に０．５μＭであり、エルロチニブは１μＭであり、抗ＥＧＦは１／２に希釈して添加された。

Ｂ．血清飢餓／薬物治療：「２４時間血清飢餓と薬物治療」の実験において、ＰＣ９細胞株の５つのＴ－７５フラスコを同時に血清枯渇に提供し、２４時間抗体または全てをゲフィチニブで処理した。次の日、細胞は、１０ｎｇ ＥＧＦ／ｍＬを含有する無血清培地
において、３７℃で１０分間予備培養された抗ＥＧＦ（単剤とゲフィチニブとの併用）で処理された。薬物を有する細胞のさらなる培養時間は２時間であり；ゲフィチニブは０．５μＭで実験された；また、

Ｃ．非標準条件：「非標準条件下」の実験において、ＰＣ９（４つのフラスコ）細胞は、血清飢餓に提供されず、ヒトＥＧＦの代わりにウシ胎児血清による活性化が用いられた。それらはＰＢＳ（×２）で洗浄され、薬物は１０％のＦＢＳが含有された培地に添加され、２時間培養された。また、ゲフィチニブとＡＺＤ９２９１の濃度は０．５μＭであり、エルロチニブは１μＭであり、抗ＥＧＦは１／２に希釈して添加された。

ウェスタンブロッティング
処理後、培養液をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液に溶解させた。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に載せ、膜に移して、ＥＧＦＲ、ｐ－ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２、ｐ－ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ－３に対する抗体でブロティングした。バンドの強度は、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて測定した後、２段階の正規化に提供された。まず、リン酸化バンドの強度を、同じサンプルの総タンパク質に相当するバンドの強度で除した。次いで、前記値を、同じタンパク質に対してＥＧＦ処理された細胞から得られた値で除した。

結果
ＰＣ９細胞におけるゲフィチニブおよび抗ＥＧＦ（１５分、４０ｎＭのゲフィチニブ）
第１の実験（リン酸化タンパク質の定量化およびウェスタンブロッティング）の結果を図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示す。前記第１の実験において、ゲフィチニブはＥＧＦＲ、ＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化を抑制したが、ＳＴＡＴ３は活性化したことが確認された。前記Ｂｉｏｖｅｎの抗ＥＧＦ抗体は、ＥＧＦＲ（生理学的に１/２０および１/１０程に希釈した場合にのみ活性化した。１/５では活性化しなかった）およびＡｋｔを活性化させ
るが、ＥｒｋおよびＳＴＡＴ３を抑制することが示された。ゲフィチニブ＋抗ＥＧＦＲの併用において、４つのタンパク質のリン酸化が抑制された。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示されているデータを考慮すると、併用治療は、単剤治療よりも優れていた。

第２の実験（１５分、０．５μＭのゲフィチニブ）
前記第２の実験は、抗ＥＧＦ抗体の濃度を高める第１の実験の結果の確認として行われた。ＡｋｔおよびＳＴＡＴ－３の場合、ゲフィチニブの単剤レーンに対する実験的問題のために結果が分からないので、定量化が示されなかった。第２の実験は、第１の実験でＥＧＦＲおよびＥｒｋに対して得られた結果と、図７Ａおよび７Ｂに示されるデータを考慮した抗ＥＧＦ＋ゲフィチニブの併用の優秀性を確認した。

第３の実験セット（２時間）
第３の実験セットは、２時間の培養時間を使って行われた。第１の分析は、ＥＧＦによって誘導されず、血清飢餓のない細胞を有する「非標準条件」下で実施された。薬物による培養時間は、以前の実験よりもはるかに長く（２時間）、ゲフィチニブの濃度は０．５μＭまで上昇した。ゲフィチニブ単剤がＥＧＦＲおよびＥｒｋを不活性化させたが、ＳＴＡＴ-３は活性化させたことが確認された。これらの条件下で、前記Ｂｉｏｖｅｎの抗Ｅ
ＧＦ抗体は、Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ-３およびＥＧＦＲを比較的少なく不活性化させたが、Ａ
ｋｔは活性化させた。Ｂｉｏｖｅｎの抗ＥＧＦ抗体とゲフィチニブとを併用する場合、図８Ａおよび８Ｂに示されるデータを考慮すると、Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３およびＥＧＦＲは、ほぼ完全に不活性化した。

第３の実験セット（血清飢餓条件）
また別の実験を「血清飢餓条件」およびＥＧＦＲによる誘導下で行った。培養時間は２時間であり、ゲフィチニブの濃度は０．５μＭであった（第３の実験と同一）。これもまた、ゲフィチニブ単剤がＥＧＦＲおよびＥｒｋを不活性化させたが、「非標準」条件下ではさらに強くＳＴＡＴ３が活性化したことが明らかになった。抗ＥＧＦ単剤は、Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３およびＥＧＦＲを著しく不活性化させたが、Ａｋｔは活性化させた。抗ＥＧＦとゲフィチニブとを併用した場合、図９Ａおよび９Ｂに示されるデータを考慮すると、Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３およびＥＧＦＲは、ほぼ完全に不活性化し、Ａｋｔもまた著しく抑制された。

前記薬物が０．１μＭおよび０．２５μＭ投与された患者に観察された生理学的条件にさらに相応するゲフィチニブの濃度を用いて、２回の追加実験を行った。実験において、抗ＥＧＦは、ゲフィチニブによるＳＴＡＴ３の活性化を抑制し、ｐＥＧＦＲに対する併用の相乗効果が確認された。Ａｋｔの結果（ＥＲＫに対する結果ではない）は、０．２５μＭの場合におけるこれまでの経験と一致し、０．１μＭについては、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄに示されているように、その逆であった（ＥＲＫについては一貫性があるが、Ａｋｔについては一貫性がない）。これらの不一致は、実験誤差に起因する可能性もある。

第４の実験セット（２４時間）
ゲフィチニブ＋抗ＥＧＦに対する２つの最終併用実験を２４時間の血清飢餓および薬物治療で行った（方法参照）。第１の実験（下記参照）は部分的に失敗し、幾つかのタンパク質が測定できなかった。しかし、図１１に示すように、ゲフィチニブ、抗ＥＧＦおよびその併用によるＥＲＫの完全な（またはほぼ完全な）阻害が観察され、抗ＥＧＦによる総ＳＴＡＴ３の中程度の下向き調節が存在するように見えた。この結果を確認するために、総タンパク質を正規化するためのハウスキーピングタンパク質（アクチン）を含む第２の実験を行った。前記実験において、ＥＲＫおよびＥＧＦＲのリン酸化は、抗ＥＧＦ＋ゲフィチニブの併用により完了した。また、この併用において、抗ＥＧＦは、ＳＴＡＴ３のゲフィチニブ誘導活性化を完全に逆転させ、ゲフィチニブはＡｋｔの抗ＥＧＦ誘導活性化を遮断した。最終的に、図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃに示すような抗体またはその併用の存在下で、総ＳＴＡＴ３のレベルにおいて中程度の下向き調節が確認され、以下の表２に要約している。

ＰＣ９細胞におけるエルロチニブおよび抗ＥＧＦ
ゲフィチニブにより得られた結果に基づいて、本発明者は「非標準条件」および「血清飢餓条件」下で、エルロチニブおよび抗ＥＧＦに対する２つの追加実験を行った。薬物による培養時間は２時間であり、エルロチニブの濃度は１μＭであった。２つの実験の結果は、図１３Ａおよび図１３Ｂで非標準条件について、並びに、図１４Ａおよび１４Ｂで「血清飢餓」について示されている。

その結果は、ゲフィチニブで得た結果と一致する。エルロチニブ単剤はＥＧＦＲおよびＥｒｋを不活性化させたが、ＳＴＡＴ３は活性化させた。抗ＥＧＦ単剤は、（特に、図１４Ａおよび１４Ｂに示すような血清飢餓条件下で）Ｅｒｋ、ＥＧＦＲおよびＳＴＡＴ３を著しく不活性化させたが、Ａｋを活性化させた。抗ＥＧＦとエルロチニブとを併用する場合、Ｅｒｋ、ＡｋｔおよびＥＧＦＲはほぼ完全に不活性化し、ＳＴＡＴ３もまたエルロチニブにより処理された細胞に比べて著しく抑制された。このようなエルロチニブ＋抗体の併用の相乗効果は、血清飢餓および標準条件の両方で観察された。

ＰＣ９細胞におけるＡＺＤ９２９１および抗ＥＧＦ
また別の実験において、本発明者は、感受性および耐性（Ｔ７９０Ｍ）の変異でＥＧＦＲタンパク質に結合できる次世代ＴＫＩであるＡＺＤ９２９１を使用した。米国および欧州で販売承認を取得し、エルロチニブ／ゲフィチニブで進行されるＮＳＣＬＣ患者を対象として商用化している。抗ＥＧＦ抗体とＡＺＤ９２９１との相互作用を「血清飢餓」条件下で試験し、その結果を図１５Ａおよび図1５Ｂに示す。抗ＥＧＦ抗体は、ＥＲＫを完全
に遮断し、ＥＧＦＲリン酸化もまた抑制し、前記効果は第２世代ＴＫＩ ＡＺＤ９２９１
ほど強力であった。また、抗ＥＧＦ抗体はＡｋｔを誘導した。

結論
ＥＧＦＲ突然変異を有するＴＫＩ感受性ＰＣ９細胞へのゲフィチニブまたはエルロチニブの投与は、療法に対する耐性獲得の第１のステップと考えられるＳＴＡＴ３の活性化につながった。２時間および２４時間の培養期間は、血清飢餓の条件下で、前記効果を劇的に増加させた。

抗ＥＧＦへのＰＣ９細胞の露出は、ＳＴＡＴ３を活性化させない。一方、２時間および２４時間の培養により、再現可能でさらに著しい阻害効果を有する場合もある。

抗ＥＧＦ単剤はＡｋｔを活性化させるが、ゲフィチニブまたはエルロチニブも存在する場合、前記効果は逆転する。「血清飢餓」実験の条件下で、ＥＧＦＲおよびＥＲＫ１/２
リン酸化に対する抗ＥＧＦの効果は、少なくともこれらのシグナル分子に対するゲフィチニブまたはエルロチニブの効果ほど顕著である。ゲフィチニブと抗ＥＧＦとの併用治療は、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２阻害に対するさらなる効果（明らかに、相乗効果）を示し、研究中の４つのタンパク質、即ち、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、ＡｋｔおよびＳＴＡＴ３の活性化を遮断する。

予想に反して、前記併用治療は、「血清飢餓」条件および「非標準」条件のいずれにおいても、ゲフィチニブまたはエルロチニブによるＳＴＡＴ－３の活性化を再現可能に逆転させる。ゲフィチニブの場合、培養時間が２時間または２４時間まで延長されると逆転が完了し、ＳＴＡＴ３のリン酸化は誘導されない血清飢餓細胞のレベルまで低下する。２４時間の培養の場合、抗ＥＧＦによる総ＳＴＡＴ３タンパク質の中程度の下向き調節も観察された。

前記の全ての結果は、ＴＫＩに対する耐性の出現を遅らせる可能性があるので、ＥＧＦＲ突然変異を有するＮＳＣＬＣ患者において、第１選択併用治療が有益であり得ることを示唆している。抗ＥＧＦ抗体は、実質的にＥｒｋを遮断し、ＴＫＩに耐性のあるＰＣ９由来Ｔ７９０Ｍ細胞株において、ＥＧＦＲリン酸化を部分的に抑制する。単剤療法として、抗ＥＧＦ抗体は、第２世代の薬剤ＡＺＤ９２９１と同様に有効である。

実施例３：エンドポイントにＷＢを用いたＥＧＦ／ＥＧＦＲ経路の阻害に対する抗ＥＧＦ（単剤とＴＫＩとの併用）の評価
さらなる実験が、ＰＣ９ ＮＳＣＬＣ細胞株において、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ結合によって
活性化した経路の阻害に対するＡＺＤ９２９１（第３世代ＴＫＩ）との抗ＥＧＦ抗体の効果を比較するために行われた。前記実験は、同じ細胞株において、抗ＥＧＦとＴＫＩとの併用が単剤治療よりも優れているかどうかを評価するために考案された。また、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有するゲフィチニブに耐性のあるＰＣ９細胞株（ＰＣ９－ＧＲ４）において、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ結合によって活性化した経路の阻害に対する抗ＥＧＦ抗体およびＡＺＤ９２９１の効果を比較し、同じ細胞株において、抗ＥＧＦとＡＺＤ９２９１との併用は、単剤治療よりも優れているかどうかを評価するために考案された。最終的に、前記実験は、ＰＣ９ ＮＳＣＬＣ細胞株において、ＴＫＩに対する耐性に係る分子メカニズムに対
する抗ＥＧＦの効果を測定するための試みであった。

ウェスタンブロッティング（ＷＢ）法で活性化を実験するための材料および方法
細胞株
上述のように、ＰＣ９細胞株は、ＥＧＦＲのエクソン１９で１５ｂｐの欠失を有し、前記細胞株がＴＫＩに対して感受性を示すようにする。これは、ＴＫＩ治療を受けているＮＳＣＬＣ患者集団のＥＧＦＲ突然変異セグメントのモデルを示す。かかる努力の一環として、ＴＫＩに耐性のあるＰＣ９由来細胞株が開発された。親ＰＣ９は、１５ｂｐの欠失を有し、ゲフィチニブおよびＡＺＤ９２９１（ｎＭ範囲でＩＣ５０）などの第１世代、第２世代および第３世代ＴＫＩに極めて感受性のあるＮＳＣＬＣ由来細胞である。ＰＣ９細胞は、２ヶ月間にわたってエルロチニブおよびゲフィチニブの濃度を増加させながら処理され、ゲフィチニブおよびエルロチニブ（ＩＣ５０ 約５～１０μＭ）に耐性のある６つの
異なる細胞株（ＰＣ９－ＥＲおよびＧＲ１～ＧＲ５）を得た。患者と同様に、６つの細胞株のいずれも感受性突然変異（１５ｂｐの欠失）を損失しなかったが、そのうちの２つに耐性突然変異Ｔ７９０Ｍが存在する。この２つの細胞株（ＰＣ９－ＧＲ１およびＧＲ４）は、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ突然変異タンパク質にも結合できるＡｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ（ＡＺＤ９２９１）により開発された新世代ＥＧＦＲ ＴＫＩに対して感受性がある。

材料
全ての組織培養材料は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｋｉｂｂｕｔ
ｚ Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ, Ｉｓｒａｅｌ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ, Ｓｃｏｔｌａｎｄ, ＵＫ）から得た。前記ＰＣ９細胞株は、その細胞株を樹立した研究者であるＤｒ. Ｍａｙｕｍｉ Ｏｎｏの承認を得て、Ｆ. Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から提供された。細胞が１０％の
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンおよび２ｍ
ＭのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ培地で培養され、３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で維持された。Ｂｉｏｖｅｎは抗ＥＧＦ抗体を提供した。

前記研究に２種の抗体が用いられた。

－Ａｂｌ：上述のように、抗ＥＧＦ抗体は、モンタナイドアジュバントと共に製剤化されたｒＥＧＦ－ｒＰ６４ｋ ＣＩＭＡＶａｘ－ＥＧＦコンジュゲートの４回の免疫が付与
されたサルにおける免疫研究から得られた。これらは、いわゆる「Ａｂｌ」または「Ｂｉｏｖｅｎの抗ＥＧＦ抗体」と呼ばれる。補体のような汚染物質を除去するために、メロンゲル上で血清が処理された。この精製ステップは、Ｓｃｏｔｉａ, Ａｂｅｒｄｅｅｎ, ＵＫで行われた。前処理のＥｌｉｓａ力価は１／６００００であった。ゲフィチニブは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ, ＴＸ）から購入した。ウェスタン
ブロッティングのためのＥＧＦおよび抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ）から購入した。

－Ａｂ２：抗ＥＧＦ抗体は、修飾されたＣＴＢおよびＥＧＦ配列を含有する組換え融合分子によるウサギの免疫化から得られた。これらは、いわゆる「Ａｂ２」または「Ｂｉｏｖｅｎの抗ＥＧＦ２抗体」と呼ばれる。修飾されたＣＴＢおよびＥＧＦ配列を含有する免疫原性組換え融合分子を配列１に示し、また、以下の配列を有する図２０Ａ（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０７６５８０にも記載されている）にさらに表している：

配列１：

前記実験では使用されていないが、追加の抗ＥＧＦ抗体は、配列２に示し、また、以下の配列を有する図２０Ｂ（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０７６５８０にも記載されている）に示しているように、修飾されたＣＴＢおよびＥＧＦ配列を含有する組換え融合分子によるウサギの免疫化から得ることができる。

配列２：

下記ハイブリドーマは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ, Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ, Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ
Ｅｎｇｌａｎｄ, Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ, Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ, Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されている。

細胞株 ＥＣＡＣＣ受託番号 寄託日
配列２ ２０１６年３月１５日
配列１ ２０１６年３月１７日

前記寄託は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａ
ｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に基づき作成された。
これにより、寄託日から３０年間、寄託を維持することができる。これらの細胞株は、ブタペスト条約の条項下で、ＡＴＣＣにより利用でき、ＢｉｏｖｅｎとＡＴＣＣとの合意に従わなければならず、これは先に到来する関連米国特許の発行時、または任意の米国もしくは外国特許出願公報の公開時に、細胞株の永久的かつ制限のない利用可能性を保証し、３５ ＵＳＣ§１２２およびそれによる庁長官の規則に従って、米国特許商標庁長官が付
与した細胞株の利用可能性を保証する（特に、８８６ ＯＧ ６３８に関して３７ ＣＦＲ
§１．１４を含む）。

血液は、予備免疫および数回の免疫化後に収集された。血清は、補体を含む非免疫グロブリンを除去するために、メロンゲル上で精製された。前記精製ステップはＳｃｏｔｉａ, Ａｂｅｒｄｅｅｎ, ＵＫで行われた。

治療
標準実験において、ＰＣ９またはＰＣ９－ＧＲ４細胞株のＴ－２５フラスコを血清枯渇（ｏ／ｎ）に提供し、洗浄し（×２）、１０ｎｇのＥＧＦ／ｍＬを含む無血清培地において３７℃で１０分間予備培養された抗ＥＧＦ（単剤とゲフィチニブまたはＡＺＤ９２９１との併用）で処理された。薬物による細胞の培養時間は、２時間または２４時間であった。ゲフィチニブまたはＡＺＤ９２９１の濃度は、細胞株の濃度依存性で試験された。５日間の実験において、ＰＣ９細胞は、血清飢餓に提供されなかったが、ヒト血清と共に培養された。これらをＰＢＳ（×２）で洗浄し、薬物（抗ＥＧＦ、ゲフィチニブまたはその併用）が１０％のヒト血清を含む培地に添加され、５日間培養された。

ウェスタンブロッティング
処理後、培養液をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液に溶解させた。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥＢゲル上に載せ、膜に移して、ＥＧＦＲ、ｐ－ＥＧＦＲ、ＥＲ１/２、ｐ－ＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ
、ＳＴＡＴ－３、ｐＳＴＡＴ、Ｂｍｉ１、ＨＥＳ１、ＰＡＲＰ、切断されたＰＡＲＰ、Ｎｏｔｃｈ３、切断されたＮｏｔｃｈ３、ＡＸＬ、ｐＹＡＰおよびチューブリンに対する抗体でブロッティングした。バンドの強度は、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて測定した後、２段階の正規化に提供された。まず、リン酸化バンドの強度を、同じサンプルの総タンパク質に相当するバンドの強度で除した。次いで、前記値を、同じタンパク質のＥＧＦ処理された細胞から得られた値で除した。

結果
ＰＣ９細胞におけるＡＺＤ９２９１および抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）
第１の実験（２時間、０．２μＭのゲフィチニブ）
第１の実験（リン酸化タンパク質のウェスタンブロッティングおよび定量化）の結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。図面から分かるように、０．２μＭでＡＺＤ９２９１によるＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３、ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化の阻害があった。通常、抗体単剤は、ｐＳＴＡＴ３およびｐＥｒｋを抑制させたが、Ａｋｔを活性化させた。前記併用は、ｐＥＧＦＲおよびｐＥｒｋの場合、２つの薬物を単独使用する場合に比べて明らかに優れていた。また、下記表３に要約している通り、ｐＡｋｔは完全に抑制され、ｐＳＴＡＴ３はベースレベル以下に下がった。

第２の実験（２４時間、０．１μＭのＡＺＤ９２９１）
さらなる実験において、ＰＣ９細胞を薬物と共に２４時間培養した。このより長い培養時間によって、薬物によるＥＧＦＲおよびＥｒｋの完全な不活性化を防止するために、ＡＺＤ９２９１の濃度は０．１μＭに減少した。結果を図１７に示す。抗ＥＧＦ抗体単剤の唯一の効果は、使用された抗体のアリコートの不活性化の可能性に対する恐れがあるＡｋｔ活性化であった（注：その疑念のため、前記ウェスタンブロットは定量化されなかった）。

ＰＣ９－ＧＲ４（Ｔ７９０Ｍ陽性）におけるＡＺＤ９２９１および抗ＥＧＦ（Ａｂ１）
この細胞株において、ＥＧＦはＥｒｋ、ＳＴＡＴ－３またはＡｋｔのリン酸化にあまり影響を及ぼさず、ｐＥＧＦＲに対する阻害効果も有しているように見えた。２時間後、ＡＺＤ９２９１（０．２μＭで）はｐＥＧＦＲを完全に遮断し、部分的にｐＡｋｔおよびｐＥｒｋを遮断した。ｐＳＴＡＴ３に対する明確な刺激効果はなかった。抗ＥＧＦ抗体は、Ａｋｔのリン酸化を刺激した（親ＰＣ９の場合と同一）。２つの薬剤の併用は、ｐＳＴＡＴ－３およびｐＡｋｔの場合において、ＡＺＤ９２９１単剤の範囲内であり、ｐＥＧＦＲおよび特にｐＥｒｋの場合でより優れていた。図１８Ａおよび１８Ｂに示し、表４に要約している。

第２の実験（２４時間、０．２μＭのＡＺＤ９２９１）
さらなる実験を２４時間およびＡＺＤ９２９１の同じ濃度（即ち、患者において達成された生理学的濃度の範囲内）で行った。第３世代ＴＫＩは、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化を抑制したが、（ゲフィチニブおよび感受性のあるＰＣ９細胞の場合における本発明者の観察と同様に）ＳＴＡＴ３を明らかに活性化させた。抗ＥＧＦ単剤は、ｐＡｋｔを刺激し、他のマーカーにはあまり影響を与えていないように見える。しかしながら、完全なｐＥＧＦＲおよびｐＥｒｋ阻害、Ａｋｔの抗体誘導性リン酸化のＡＺＤ９２９１による逆転、並びに、ＡＺＤ９２９１による前記ＳＴＡＴ３の抗体による遮断によって、この併用は、２つの薬剤より明らかに優れていた。図１９Ａおよび１９Ｂに示し、表５に要約している。

ＰＣ９細胞におけるゲフィチニブおよび抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）、並びに追加マーカー
ＳＴＡＴ３に加えて、他のマーカーおよび経路は、ＥＧＦＲ突然変異腫瘍細胞におけるゲフィチニブに対する耐性の発現と関係がある。切断されたＮｏｔｃｈ３（Ｎｏｔｃｈ３の活性型）、ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＹＡＰ、ＢｍｉｌおよびＨｅｓ１（幹細胞に関する）並びにＡＸＬ（ＥＭＴ転移に関する）の幾つかを試験するために予備分析を行った。また、抗体がアポトーシスを誘導するかどうかを測定するために、ＰＡＲＰを調べた。これまでの実験で得られたＰＣ９細胞株の抽出物を使用した。第１の実験において、２４時間でのＡｂｌ、ゲフィチニブ０．５μＭ、および上記で言及したマーカーの併用に対する効果を評価した。前記抗ＥＧＦ抗体は、Ｈｅｓ１およびＡＸＬを著しく下向き調節し、Ｎｏｔｃｈ切断およびＹＡＰリン酸化を抑制した。あまり著しくないＢｍｉｌの下向き調節も観察された。ゲフィチニブにはこのような効果がなかった。ＰＡＲＰ切断に関しては、図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄに示し、表６および７に要約しているように、２つの薬物はいずれも２４時間後にそれを誘導することができた。

ＰＣ９細胞における抗ＥＧＦ Ａｂ１とＡｂ２との比較（追加マーカー含む）
最初に２４時間の実験では、Ａｂ１およびＡｂ２単剤の効果を比較した。２つの抗体はいずれも同様の方法でｐＡｋｔを刺激した。前記実験において、それらはｐＥｒｋに影響を及ぼさなかった（しかし、ＥＧＦもまたそれを誘導することに失敗した）。ＳＴＡＴ－３に対して、Ａｂ２は１／２でＳＴＡＴ－３のＥＧＦ刺激によるリン酸化のより強い阻害
を誘導した。ｐＥＧＦＲの結果は繰り返す必要がある。また、２４時間の実験が保留中である。残りのマーカーに関しては、Ａｂ２は、Ｈｅｓ１を下向き調節し、Ｎｏｔｃｈ３切断を遮断し、ＰＡＲＰ切断を誘導するのに、明らかにより大きな影響力がある。また、図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃおよび２２Ｄに示し、表８および９に要約しているように、Bmilの場合において、原因不明の優れたバンドの出現を引き起こした。

結果
前記実験で得られた陽性結果を考慮して、５日間の培養後、２つの抗体の単剤およびゲフィチニブとの併用の効果について評価した。細胞は、ＥＧＦを用いてそれを誘導する代わりに、ヒト血清中で成長させた（方法参照）。最も顕著な結果の１つは、図２３に示すように、野生型タンパク質よりも低い分子量の高リン酸化Ｎｏｔｃｈ３、ＡｋｔおよびＳＴＡＴ－３バンドの出現であった。これらのバンドは、幾つかの理由により起こり得るが、タンパク質分解切断が最も有力である。２４時間後に観察されたＢｍｉｌおよびＨｅｓｌへの影響はまだ確認されなかった。一方、図２４に示すように、２４時間で観察されたものよりも著しく強い、Ａｂ２によるＰＡＲＰ切断の強い誘導があった（注：これらのウェスタンブロットは、エキストラバンドの出現により定量化されなかった）。

結論
ＥＧＦＲ突然変異を有するＴＫＩ感受性ＰＣ９細胞、および、Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ突然変異を有するＡＺＤ９２９１感受性ＰＣ９－ＧＲ４への２４時間の投与は、療法に対する耐性獲得における第１のステップと考えられるＳＴＡＴ３の活性化につながった。

抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）単剤はＡｋｔを活性化させるが、ＡＺＤ９２９１も存在する場合にはこの効果は逆転する。

ＡＺＤ９２９１と抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）との併用治療は、試験した２つの細胞株（ＰＣ９、ＰＣ９－ＧＲ４）において、研究中の４つのタンパク質（ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３）の活性化を遮断し、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２阻害に対する相乗効果を示す。注目すべきことに、併用治療は、ゲフィチニブまたはＡＺＤ９２９１によるＳＴＡＴ３の活性化を再現可能に逆転させる。

併用において、抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）の添加は、免疫療法として、ゲフィチニブの効果に次のような影響を与える：ＴＫＩの影響を受けないＹＡＰ３を抑制する;ＴＫＩの影響を
受けないＡＸＬ、ＥＭＴマーカーを抑制する;ＴＫＩの影響を受けないＮｏｔｃｈ３の切
断を抑制する;ＴＫＩの影響を受けないがん幹細胞マーカーであるＨＥＳ１を減少させる;およびＰＡＲＰ切断を増加させる。

さらに、ＴＫＩへの抗ＥＧＦの添加は、ＴＫＩの特徴の１つであるＳＴＡＴ３の活性化を逆転させるが、耐性の出現に直接関連する。

また、抗ＥＧＦ（Ａｂｌ）単剤は、ＴＫＩに対する耐性に関する多様な経路に影響を及ぼす。２４時間で、それはＹＡＰのリン酸化、Ｎｏｔｃｈの切断を遮断し、ＡＸＬおよびＨｅｓ１を下向き調節する。ゲフィチニブと抗体はいずれもＰＡＲＰの切断（アポトーシスのマーカー）を誘導する。

前記実験データの証拠は、ＴＫＩに対する耐性の出現を遅らせる可能性があるため、第１選択併用治療がＥＧＦＲ突然変異を有するＮＳＣＬＣ患者に有益であり得るという先行研究結果にさらなる強みを加える。

ウサギに由来する抗体（Ａｂ２）は、ｐＳＴＡＴ３の遮断、幹細胞マーカーの下向き調節、およびアポトーシスの誘導の側面で、霊長類に由来する抗体（Ａｂ１）よりも優れているか、少なくとも同等である。

抗体Ａｂ２は、さらに解決する必要がある現象であるＮｏｔｃｈ３、ＳＴＡＴ３またはＡｋｔ等の主要タンパク質の切断を誘導する。文献から、カスパーゼ３がＡｋｔを切断できることが理解される。

公知の通り、ＮＳＣＬＣ ＥＧＦＲ突然変異を有する患者において、ＴＫＩによる第１
選択治療は、治療に対する耐性および転移性疾患の突然の再発をもたらす。現在の第１選択のＴＫＩに対する耐性の出現に関するパラメーターは、腫瘍細胞株、動物および治療された患者から収集したサンプルにおける研究で観察されるように、ＳＴＡＴ３およびＹＡＰの活性化、ＡＸＬおよびＭＥＴの増加した発現を含む。

任意の特定の理論に拘束されることなく、前記実施例が示唆しているように、ＴＫＩ＋ＥＧＦ ＰＴＩの併用は、ｐＳＴＡＴ３を破壊し、Ｎｏｔｃｈ３のタンパク質分解切断お
よびその標的遺伝子ＨＥＳ１は、図２９に示すように、前記併用に対して感受性があることが示される。一方、図２７に示すように、ＴＫＩ単独療法によるｐＳＴＡＴ３、Ｎｏｔｃｈ３のタンパク質分解切断、およびその標的遺伝子ＨＥＳ１には効果がないことが示されている。さらに、ＴＫＩ単独療法で上向き調節されたＡＸＬ、ＭＥＴ等の分子は、ＴＫＩ＋ＥＧＦ ＰＴＩの併用によって抑制されることに留意する。また、ＴＫＩ＋ＥＧＦ ＰＴＩでは、ＴＫＩ単独よりＰＡＲＰの切断がさらに観察される。本発明による併用療法は、初期のＥＧＦＲ ＴＫＩ反応を向上させ、耐性の発現を予防するための論理的な設計手
法の満たされない要求への１つの接近法を提案し、ＥＧＦＲ ＴＫＩとＥＧＦ ＰＴＩとの併用はこのような治療の接近法の１つである。

これらの教示をさらに説明するために、例示的な実施形態が提示されているが、これらの教示は、例示的な実施形態のみに限定されないことが理解されるべきである。

本発明は、様々な実施形態に関して記載されているが、これらの教示は、添付の請求の範囲の趣旨および範疇内で、広範囲な追加および他の実施形態も可能であることを理解すべきである。

本発明は、ＴＫＩと抗ＥＧＦ抗体との相乗的な併用を示す様々な実施形態に関して記載されているが、併用治療が、がん治療における化学療法の治療効果を増加させるために、様々な化学療法レジメンとさらに組み合わせてもよいことは、当業者に自明であろう。

本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示の観点で最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を制限するように限定されるべきではない。当業者は、他の多くの実施形態が本発明に含まれることが容易に分かる。当業者は、本明細書に記述されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を理解したり、通常の実験のみを用いて確認することができる。このような等価物は、下記に添付する請求の範囲によって含まれることが意図される。

Claims (1)

1. 非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者を治療するための薬剤の製造における、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはその一部を含む免疫原性タンパク質とチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の使用であって、
   前記ＴＫＩは、１０ｍｇ～１５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づいた連続したレジメンに従って投与され、前記ＴＫＩはエルロチニブまたはゲフィチニブであって、
   前記免疫原性タンパク質は、ＳＴＡＴ３の活性化を低下させるための治療有効量に従って、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回、繰り返し共投与される、
   使用。