JP7526489B2 - 組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、組換えタンパク質の製造方法に関する。本発明はまた、組換えタンパク質の細胞あたりの生産量を増加させる方法にも関する。

組換え細胞を用いた組換えタンパク質の生産において、細胞増殖の旺盛さが組換えタンパク質の生産能に必ずしも結びつかないことが知られている。例えば、特許文献１には、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子を有するエシェリヒア・コリを培地で培養すること、フィブロイン様タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導すること、およびフィブロイン様タンパク質を採取することを含む、フィブロイン様タンパク質の製造法であって、前記発現誘導後の菌体増殖が低減されていることを特徴とする、方法が開示されている。

国際公開第２０１５／１７８４６６号

本発明は、組換え細胞の細胞増殖を低減しつつ、組換えタンパク質の生産能を高める、組換えタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、組換えタンパク質の製造において、改変された形態形成制御因子を有する細胞を宿主として用いることで、組換え細胞の細胞増殖が低減されると共に、細胞あたりの組換えタンパク質の生産量が向上することを見出した。本発明は、この新規な知見に基づくものである。

本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
組換えタンパク質を発現する組換え細胞の細胞増殖を低減させる増殖低減工程と、
上記組換え細胞を、細胞増殖が低減された状態で、タンパク質生産培地中で培養して上記組換えタンパク質を生産する生産工程と、を備え、
上記増殖低減工程において、上記組換え細胞として、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞を用いることで、上記組換え細胞の細胞増殖を低減させる、組換えタンパク質の製造方法。
［２］
上記改変された形態形成制御因子が、変異型細胞骨格タンパク質である、［１］に記載の製造方法。
［３］
上記変異型細胞骨格タンパク質が、変異型ＭｒｅＢである、［２］に記載の製造方法。
［４］
上記変異型形態形成制御因子が、ＭｒｅＢと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、［３］に記載の製造方法。
［５］
上記変異型形態形成制御因子が、ＭｒｅＢの第５３番目のアミノ酸残基アラニンに変異を有するものである、［３］又は［４］に記載の製造方法。
［６］
上記変異型形態形成制御因子が、ＭｒｅＢの第５３番目のアミノ酸残基アラニンがスレオニンに置換された変異を有するものである、［３］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
上記組換え細胞は、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質の発現カセットが導入されたものである、［１］に記載の製造方法。
［８］
上記細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質が、ｓｕｌＡである、［７］に記載の製造方法。
［９］
上記タンパク質生産培地が、天然由来成分を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
上記組換えタンパク質の疎水度が－１．０以上である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１１］
上記組換えタンパク質が構造タンパク質である、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
上記組換えタンパク質がフィブロインである、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
上記組換えタンパク質がクモ糸フィブロインである、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］
上記組換え細胞が、桿菌である、［１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］
上記組換え細胞が、エシェリヒア属に属する微生物である、［１］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］
組換えタンパク質の細胞あたりの生産量を増加させる方法であって、
組換えタンパク質を発現する組換え細胞の細胞増殖を低減させる増殖低減工程と、
上記組換え細胞を、細胞増殖が低減された状態で、タンパク質生産培地中で培養して上記組換えタンパク質を生産する生産工程と、を含み、
上記増殖低減工程において、上記組換え細胞として、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞を用いることで、上記組換え細胞の細胞増殖を低減させる、方法。
［１７］
上記改変された形態形成制御因子が、変異型細胞骨格タンパク質である、［１６］に記載の方法。
［１８］
上記組換え細胞は、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質の発現カセットが導入されたものである、［１６］に記載の方法。

本発明によれば、組換え細胞の細胞増殖を低減しつつ、組換えタンパク質の生産能を高める、組換えタンパク質の製造方法を提供することが可能となる。

ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の平均粒子径を培養時間に対してプロットしたグラフである。 生産培養開始後１６時間におけるＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の細胞自体の重量（乾燥菌体重量から生産された組換えタンパク質の重量を除いたもの）を示すグラフである。 ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の生産培養開始後１６時間における細胞の増殖を示すグラフである。 ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の改変フィブロイン生産量（細胞あたりの生産量）を示すグラフである。 ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の改変フィブロイン生産量（培地あたりの生産量）を示すグラフである。 ｓｕｌＡ誘導発現株及びＣｏｎｔｒｏｌ株の平均粒子径を培養時間に対してプロットしたグラフである。 ｓｕｌＡ誘導発現株及びＣｏｎｔｒｏｌ株の細胞増殖（細胞濃度）を培養時間に対してプロットしたグラフである。 ｓｕｌＡ誘導発現株及びＣｏｎｔｒｏｌ株の生産培養開始後２４時間における細胞数を示すグラフである。 ｓｕｌＡ誘導発現株及びＣｏｎｔｒｏｌ株の改変フィブロイン生産量（細胞あたりの生産量）を示すグラフである。 ｓｕｌＡ誘導発現株及びＣｏｎｔｒｏｌ株の改変フィブロイン生産量（培地あたりの生産量）を示すグラフである。 ＨＫ０２２ファージが溶原化する機構を利用して、改変フィブロイン発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込む方法の概要を示す概略図である。 φ８０ファージが溶原化する機構を利用して、改変フィブロイン発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込む方法の概要を示す概略図である。 λファージが有する相同組換えシステムを利用して、改変フィブロイン発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込む方法の概要を示す概略図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

〔組換えタンパク質の製造方法〕
本実施形態に係る組換えタンパク質の製造方法は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞の細胞増殖を低減させる増殖低減工程と、組換え細胞を、細胞増殖が低減された状態で、タンパク質生産培地中で培養して組換えタンパク質を生産する生産工程と、を少なくとも備える。また、本実施形態に係る組換えタンパク質の製造方法は、増殖低減工程において、組換え細胞として、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞を用いることで、組換え細胞の細胞増殖を低減させるものである。

（形態形成制御因子）
本明細書において、「形態形成制御因子」とは、細胞の形態形成又は形態制御に関連するタンパク質を意味する。細胞の形態には、例えば、細胞の剛性、形状、サイズが含まれる。形態形成制御因子としては、例えば、細胞伸長、細胞幅及び細胞極性の形成又は制御に関連するタンパク質が挙げられる。形態形成制御因子の具体例としては、細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質及びペプチドグリカン合成酵素等が挙げられる。

原核細胞において、例えば、大腸菌など多くの細菌は、細胞がペプチドグリカン（短いペプチドによって架橋された糖鎖）により覆われている。これらの細菌では、細胞の伸長及び分裂にあたって、すでに存在するペプチドグリカンの分解、及び新たに合成されたペプチドグリカンの挿入が厳密に制御されることによって、細胞が破裂することなく、その形態を維持することが可能となっている。細胞骨格タンパク質の機能の一つは、ペプチドグリカン合成酵素の細胞内局在を制御することであると考えられる。すなわち、細胞の形態を最終的に決めるのはペリプラズム領域にあるペプチドグリカンであるが、それを合成する酵素を制御するのは細胞質内にある細胞骨格タンパク質である。

細菌の細胞骨格タンパク質としては、例えば、ＦｔｓＺチューブリン及びＭｒｅＢアクチンを挙げることができる。ペプチドグリカン合成酵素としては、例えば、ＰＢＰ３（ＦｔｓＩ）及びＰＢＰ２を挙げることができる。ＦｔｓＺチューブリンは、分裂関連タンパク質の中で一番始めに分裂面に局在し、分裂環（Ｚリング）を形成する。さらに十数種類の関連タンパク質を次々とＺリングへと集合させ、ＰＢＰ３とｄｉｖｉｓｏｍｅと呼ばれる超分子複合体を形成する。ＭｒｅＢは、細胞伸長に必須のＰＢＰ２などとｅｌｏｎｇａｓｏｍｅと呼ばれる複合体を形成している。他に、ｅｌｏｎｇａｓｏｍｅの構成因子としては、ＲｏｄＺ、ＲｏｄＡ、ＭｒｅＣ、及びＭｒｅＤ等が挙げられる。

真核細胞の細胞骨格タンパク質としては、例えば、クレセンチン、細胞骨格のＰａｒＭとＳｏｐＡ等が挙げられる。

（改変された形態形成制御因子）
本明細書において、「改変された形態形成制御因子」とは、置換、欠失、挿入、付加または突然変異若しくは人為的発現調節によって改変された形態形成制御因子を意味する。人為的発現調節とは、核酸もしくは遺伝子の発現を誘導、低下または抑制して、蛋白質またはポリペプチドの生成を、それぞれ誘導、低下または抑制することを意味する。形態形成制御因子の発現量は、形態形成制御因子が発現カセット中に組み込まれて細胞内に導入することにより改変することができる。さらに、形態形成制御因子の発現量は、形態形成制御因子の配列にエンハンサーまたはその他の調節配列等の追加により改変することができる。別の改変を含んでも良い。または前記の組合せでも良い。

（変異型形態形成制御因子）
本明細書において、「変異型形態形成制御因子」とは、野生型の形態形成制御因子のアミノ酸配列と比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列を有する形態形成制御因子を意味する。なお、変異型形態形成制御因子には、野生型の形態形成制御因子が完全に欠失している（例えば、当該形態形成制御因子をコードする遺伝子が染色体ＤＮＡから脱落している、当該形態形成制御因子をコードする遺伝子が発現しなくなっている等によりタンパク質として発現していない）ことも含む。変異型形態形成制御因子は、野生型の形態形成制御因子のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましく、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることがより好ましく、９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが更に好ましい。変異型形態形成制御因子は、野生型の形態形成制御因子が有する生物活性の一部又は全部が失われているものであってよい。

変異型形態形成制御因子を有する細胞は、例えば、自然界に存在する細胞のスクリーニングによる方法、Ａ２２（Ｓ－（３，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）－ｉｓｏｔｈｉｏｕｒｅａ）等の薬剤処理及び／又は紫外線照射等の突然変異を誘発したうえでスクリーニングする手法、遺伝子工学的手法により変異型形態形成制御因子を有する細胞を取得する方法により得ることができる。

遺伝子工学的手法を利用した方法としては、例えば、ランダムに変異を導入する方法、部位特異的に変異を導入する方法がある。前者のランダムに変異を導入する方法には、例えば、ランダム変異導入用キット（ＢＤ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いてもよい。また、後者の部位特異的に変異を導入する方法には、例えば、部位特異的変異導入用キット（Ｍｕｔａｎ－Ｋ（タカラバイオ社製））を用いてもよい。

これらの中でも、遺伝子工学的手法を利用した方法で変異型形態形成制御因子を有する細胞を取得するのが好ましいが、この方法に限定されるわけではない。

変異型形態形成制御因子としては、変異型細胞骨格タンパク質であることが好ましく、変異型ＭｒｅＢであることがより好ましい。変異型ＭｒｅＢは、野生型のＭｒｅＢのアミノ酸配列（配列番号１）と比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列を有する。

変異型ＭｒｅＢとしては、例えば、野生型のＭｒｅＢ（配列番号１）の第１４番目アミノ酸残基Ｓ、第２０番目アミノ酸残基Ａ、第２３番目アミノ酸残基Ｌ、第５３番目アミノ酸残基Ａ、第７４番目アミノ酸残基Ｒ、第８４番目アミノ酸残基Ｆ、第１４３番目アミノ酸残基Ｅ、第１５８番目位アミノ酸残基Ｔ、第１８５番目アミノ酸残基Ｓ、第２０７番目アミノ酸残基Ｇ、第２０９番目アミノ酸残基Ｌ、第２７６番目アミノ酸残基Ｅ及び第３２２番目アミノ酸残基Ｌ等の１又は複数のアミノ酸残基に変異を有するものが挙げられる。変異型ＭｒｅＢとして好ましくは、野生型のＭｒｅＢ（配列番号１）の第５３番目アミノ酸残基Ａ、第７４番目アミノ酸残基Ｒ、第８４番目アミノ酸残基Ｆ及び第１８５番目アミノ酸残基Ｓから選ばれる１又は複数のアミノ酸残基に変異を有するものが挙げられる。

変異型ＭｒｅＢのより具体的な例としては、例えば、野生型のＭｒｅＢ（配列番号１）に対して、Ｓ１４Ａ、Ａ２０Ｖ、Ｌ２３Ｒ、Ａ５３Ｔ、Ｒ７４Ｃ、Ｒ７４Ｌ、Ｆ８４Ｖ、Ｅ１４３Ａ、Ａ１５８Ｔ、Ｓ１８５Ｆ、Ｇ２０７Ｃ、Ｌ２０９Ｒ、Ｅ２７６Ｄ及びＬ３２２Ｑ等の１又は複数のアミノ酸残基が置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものが挙げられる。変異型ＭｒｅＢとしては、野生型のＭｒｅＢ（配列番号１）に対して、Ｅ１４３Ａ、Ｒ７４Ｌ、Ａ５３Ｔ、Ｓ１８５Ｆ、Ｆ８４Ｖ、より好ましくは、Ｒ７４Ｌ、Ａ５３Ｔ、Ｓ１８５Ｆ、Ｆ８４Ｖ、Ｇ２０７Ｃ及びＬ２０８Ｒから選択される１又は複数のアミノ酸残基が置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものが好ましく、Ａ５３Ｔ、Ｓ１８５Ｆ及びＦ８４Ｖから選択される１又は複数のアミノ酸残基が置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものがより好ましい。

（細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質）
形態形成制御因子である細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質としては、例えば、原核生物においては、ｓｕｌＡ、ｙｅｅＶ、ｓｌｍＡ及びＭｉｎファミリータンパク質（ＭｉｎＣ、Ｄ、及びＥ）が挙げられる。これらに加え、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等の一部の微生物では、ｅｚｒＡ及びＮｏｃが挙げられる。

ｓｕｌＡは、ＳＯＳシステムの構成因子であり、ＦｔｓＺと相互作用することでＦｔｓＺの重合を阻害する。ｓｕｌＡが細胞内に蓄積すると、その細胞は隔壁がなく長い糸状細胞になる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９３年，１７５：１１１８－１１２５．）。野生型のｓｕｌＡは、配列番号６に示すアミノ酸配列を有し、これをコードするｓｕｌＡ遺伝子は、例えば配列番号７に示す核酸配列を有する。本実施形態における形態形成制御因子ｓｕｌＡをコードする核酸配列は、配列番号７に記載の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。

ｙｅｅＶ（ＣｂｔＡ）は、タイプＩＶのｔｏｘｉｎ－ａｎｔｉｔｏｘｉｎ（ＴＡ）システムのＴｏｘｉｎである。ｙｅｅＶは、ＦｔｓＺ及びＭｒｅＢのそれぞれと相互作用し、阻害的に働く。ＦｔｓＺにおいては、そのＧＴＰ依存的な重合を阻害し、ＭｒｅＢにおいては、そのＡＴＰ依存的な重合を阻害する。ＦｔｓＺ及びＭｒｅＢは、細胞の大きさ及び形態を制御するため、それらを阻害するｙｅｅＶを過剰に発現すると、細胞が大きくなることが知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１年，７９：１０９－１１８、及び、ＰＬｏＳ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１７年，１３：ｅ１００７００７．）。

（改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞）
改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞には、野生型の形態形成制御因子を遺伝子工学的手法等の人為的な操作を用いて改変された形態制御因子を細胞内に有するもの、自然界における突然変異を経て野生型とは異なる形態形成制御因子を細胞内に有するもの、形態形成制御因子が発現カセット中に組み込まれて細胞内に導入されて形態形成制御因子の発現量が改変されたもの等が含まれる。

（組換え細胞）
本実施形態に係る組換え細胞は、組換えタンパク質を発現するものである。本実施形態に係る組換え細胞は、例えば、組換えタンパク質（以下、「目的タンパク質」ともいう。）をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む（以下、「目的タンパク質発現カセット」ということもある。）ものであってよい。本実施形態に係る組換え細胞は、発現カセットを１つ含むものであってもよく、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ）含むものであってもよい。

調節配列は、宿主における組換えタンパク質（目的タンパク質）の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。調節配列は、外来性のものであってもよく、内在性のもの（宿主由来の調節配列）であってもよい。

目的タンパク質発現カセットを含む組換え細胞は、例えば、少なくとも目的タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法により得ることができる。当該発現ベクターは、目的タンパク質発現カセットを含むものであってもよい。本実施形態に係る組換え細胞は、目的タンパク質発現カセットをゲノムＤＮＡ外に有するものであってもよく、目的タンパク質発現カセットがゲノムＤＮＡ中に組み込まれたものであってもよいが、目的タンパク質発現カセットがゲノムＤＮＡ中に組み込まれたものであるのが好ましい。

宿主細胞を形質転換する方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、プラスミドベクターを用いて宿主細胞を形質転換することが挙げられる。

目的タンパク質発現カセットをゲノムＤＮＡ中へ組み込む方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、λファージの２重鎖切断修復における組換え機構を応用したλｒｅｄ法、Ｒｅｄ／ＥＴ相同組換え法、ｐＵＴ－ｍｉｎｉ Ｔｎ５を用いたトランスポゾン活性を利用した転移法が挙げられる。例えば、バイオメダル社の「トランスポゾンによる遺伝子導入キット：ｐＵＴｍｉｎｉ－Ｔｎ５ Ｋｉｔ」等を用い、キットに記載の方法に準じて、目的タンパク質発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができる。このとき、少なくとも目的タンパク質をコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞のゲノムＤＮＡ中の１又は複数の調節配列と作動可能に連結するように組み換えることで、目的タンパク質発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込んでもよい。

宿主細胞を形質転換する方法としては、λファージのインテグラーゼにより宿主細胞のゲノムＤＮＡ中のアタッチメント・サイト（ａｔｔＢ部位）とベクター上のアタッチメント・サイト（ａｔｔＰ部位）を介して目的タンパク質発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込む方法、及び相同組換えに不可欠な３つの遺伝子エキソ（ｅｘｏ）、ベータ（ｂｅｔ）、ガンマ（ｇａｍ）遺伝子を有するヘルパープラスミドｐＫＤ４６を用いたレッド－リコンビナーゼ・システムを使用して目的タンパク質発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込む方法が好ましい。

宿主細胞として、細菌等の原核生物の細胞、並びに酵母細胞、糸状真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞等の真核生物の細胞のいずれも用いることができる。ただし、増殖が速くかつ培養コストを削減する観点から、宿主細胞は細菌等の原核細胞の細胞であることが好ましい。宿主細胞は、球菌、らせん菌、桿菌のいずれであってもよいが、桿菌であることが好ましい。

細菌等の原核生物の宿主細胞としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。原核生物の好ましい例としては、例えば、大腸菌、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、及びラクトコッカス等を挙げることができる。宿主細胞は、エシェリヒア属に属する微生物、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることが好ましい。

エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｋ５（ＡＴＣＣ ２３５０６）、エシェリヒア・コリ ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）、エシェリヒア・コリ Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ ＴＢ１、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることが好ましい。

上記宿主細胞を形質転換する方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。

ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９－３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２－２０３）により実施することができる。

形質転換に使用するベクター（以下、単に「ベクター」という。）の種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（米国特許４６８６１９１号、米国特許４９３９０９４号、米国特許５１６０７３５号）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。

宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。

ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９－１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９－６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５－８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８－４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５－５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５－７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８－３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。

プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、目的タンパク質をコードする遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

真核生物の宿主細胞としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。

酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。

酵母を宿主細胞として用いる場合のベクターは通常、複製起点（宿主細胞における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のための誘導性プロモーター及びターミネータ、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。

ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内におけるベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：２９９－３１０）。

酵母を宿主細胞として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ－Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ Ｂ等を挙げることができる。

酵母を宿主細胞とした場合のプロモーターの具体例として、ガラクトース誘導性のｇａｌ １プロモーター及びｇａｌ １０プロモーター；銅誘導性のＣＵＰ １プロモーター；チアミン誘導性のｎｍｔ１プロモーター；並びにメタノール誘導性のＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＤＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤＨプロモーター、ＭＯＸプロモーター、ＺＺＡ１、ＰＥＸ５－、ＰＥＸ８－及びＰＥＸ１４－プロモーター等を挙げることができる。

酵母へのベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。

糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。

糸状真菌を宿主細胞とした場合のプロモーターの具体例として、サリチル酸誘導性ＰＲ１ａプロモーター；シクロヘキシミド誘導性Ｐｌａｃｃプロモーター；及びキナ酸誘導性Ｐｑａ－２プロモーター等を挙げることができる。

糸状真菌へのベクターの導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

本実施形態に係る組換え細胞の作製にあたり、目的タンパク質発現カセットの組み込み、及び形態形成制御因子への変異導入の順序は問わない。すなわち、改変された形態形成制御因子を有する宿主細胞に目的タンパク質発現カセットを組み込んでもよく、目的タンパク質発現カセットを有する宿主細胞に対して改変された形態形成制御因子を導入してもよい。

（目的タンパク質）
本実施形態に係る組換えタンパク質の製造方法により生産する目的タンパク質は、特に制限されず、任意のタンパク質を使用することができる。ここで、目的タンパク質とは、本実施形態に係る製造方法により生産した後、回収等して利用することを目的とするタンパク質のことを意味する。目的タンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体等を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン（例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等）、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。

本明細書においてフィブロインは、天然由来のフィブロインと改変フィブロインとを含む。本明細書において「天然由来のフィブロイン」とは、天然由来のフィブロインと同一のアミノ酸配列を有するフィブロインを意味し、「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。

フィブロインは、クモ糸フィブロインであってよい。「クモ糸フィブロイン」には、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。

フィブロインは、例えば、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係るフィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。

本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）_ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）_ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。

天然由来のフィブロインとしては、例えば、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。天然由来のフィブロインの具体例としては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。

昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。

昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。

クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。

ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。

コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］_ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。

エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。

レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式４：［ＲＥＰ３］_ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｑは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意アミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。

目的タンパク質は、親水性タンパク質であってもよく、疎水性タンパク質であってもよい。目的タンパク質としては、目的タンパク質を構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ、以下「疎水度」とも表す。）が－１．０以上であるものが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標は、下記表１に示すとおりである。

本発明の一実施形態において、目的タンパク質の疎水度は、－０．９以上、－０．８以上、－０．７以上、－０．６以上、－０．５以上、－０．４以上、－０．３以上、－０．２以上、－０．１以上、０以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、又は０．４以上であってよく、また、目的タンパク質の疎水度は、１．０以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、又は０．５以下であってよい。

目的タンパク質の分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。目的タンパク質の分子量は、例えば、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、例えば、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。一般にタンパク質の分子量が大きくなる程凝集しやすくなる傾向にある。

（増殖低減工程）
増殖低減工程は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞の細胞増殖を低減させる工程である。本実施形態に係る組換えタンパク質の製造方法では、組換え細胞として、上述した組換え細胞（少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞）を用いることで、組換え細胞の細胞増殖を低減させる。

増殖低減工程では、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞を、後述するタンパク質生産培地で培養することにより、当該組換え細胞の細胞増殖を低減させることができる。

（生産工程）
生産工程は、組換え細胞を、細胞増殖が低減された状態で、タンパク質生産培地中で培養して組換えタンパク質を生産する工程である。増殖低減工程と生産工程は、同時に実施することもできる。

組換え細胞を培養するためのタンパク質生産培地は特に限定されず、組換え細胞の種類に応じて、公知の天然培地又は合成培地から選択することができる。タンパク質生産培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ビタミン類、ミネラル、栄養要求性により要求される栄養素、及びその他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する液体培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。

タンパク質生産培地は、天然由来成分を含むことが好ましい。天然由来成分は、天然物（例えば、酵母）そのもの、天然物からの抽出物（例えば、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）等の成分を意味する。天然由来成分は、通常、含まれる成分の種類及びそれぞれの含有量は完全に特定されていないものである。天然由来成分は、例えば、ビタミン類、低分子のペプチド（例えば、アミノ酸残基数２～２０のペプチド）及びアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む。

炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、ソルビトール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。

炭素源としては、１種類であってもよく、２種類以上の炭素源を任意の比率で混合してもよい。タンパク質生産培地における炭素源の濃度は、０.１ｗ/ｖ％～５０ｗ/ｖ％程度、好ましくは０.５ｗ/ｖ％～４０ｗ/ｖ％程度、より好ましくは１ｗ/ｖ％～３０ｗ/ｖ％程度、特に好ましくは５ｗ/ｖ％～２０ｗ/ｖ％程度であってよい。本実施形態において、炭素源としてグリセロール又はグルコースを用いることが好ましく、グリセロール又はグルコースと他の炭素源とを任意の比率で混合してもよい。炭素源中のグリセロール又はグルコースの比率は、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、特に好ましくは７０重量％以上であることが望ましい。培養開始時の炭素源の好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中の炭素源の消費に応じて、炭素源を適宜に添加してもよい。

窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素塩、アミノ酸、ペプトン、エキス類、コーンスターチ製造工業における副産物であるコーンスティープリカー（ＣＳＬ）等の有機窒素源が挙げられる。ペプトン類としては、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトン、又は大豆ペプトン等が挙げられる。エキス類としては、肉エキス、酵母エキス、心臓浸出液（ハートインフュージョン）等が挙げられる。アミノ酸又はペプチドを含む窒素源としては、より低分子のペプチド及びアミノ酸の含有量が高いほうが好ましい。

リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。

硫黄源としては、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。

ビタミン類としては、ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、４－アミノ安息香酸、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアンミン、チムジン等が挙げられる。ビタミン類の源としては、麦芽エキス、ポテトエキス、トマトジュース等の各種エキスが挙げられる。

ミネラルとしては、リン（Ｐ）の他に、イオウ（Ｓ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、鉄（Ｆｅ）、ナトリウム（Ｎａ）等が挙げられる。

生産工程における培養は、例えば、通気培養又は振盪培養により、好気的に行うことができる。培養は、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、又はそれらの組み合わせにより実施することができる。タンパク質生産培地のｐＨは、例えば、３．０～９．０であってよい。培養温度は、例えば、１５～４０℃であってよい。培養時間は、例えば、１～６０時間であってよい。

培養条件は、上記組換え細胞が増殖でき、かつ目的タンパク質を発現している組換え細胞において目的タンパク質を蓄積させることができる限り、特に制限されない。なお、目的タンパク質が発現している期間においては、組換え細胞は増殖してもよく、しなくてもよい。培養条件は、目的タンパク質が発現する前の期間と発現を開始した後の期間において同一であってもよく、同一でなくてもよい。

培養温度は、通常、細胞の増殖に対して大きな影響を与える。一般的にいえば、増殖の下限の温度は細胞中の水分の凍結温度である０℃又はそれよりやや低い温度であり、上限の温度はタンパク質、核酸などの高分子化合物の変性温度で定まる。ある菌株について増殖可能な温度範囲は比較的せまく、例えば、大腸菌では増殖の下限温度は０～１５℃、上限は４６℃、増殖至適温度は３６～４２℃付近にある。増殖至適温度によって微生物を分類すると、２０℃以下に至適温度のある好低温菌、２０～４５℃に至適温度のある好中温菌、４５℃以上に至適温度のある好熱菌にわけられる。ここで増殖至適温度とは、培養する微生物が最大の比増殖速度を得られる温度をいい、また、比増殖速度とは、単位微生物量あたりの増殖速度をいい、微生物に固有の値で、培養条件により変化する。

本発明の一実施形態において、「増殖至適温度」とは、ｐＨ、溶存酸素濃度などの培養温度以外の条件が、培養開始時に一定の場合に、微生物が最大の比増殖速度を得ることができる温度をいう。本発明の一実施形態において、組換え細胞が目的タンパク質を発現している際（目的タンパク質の発現が誘導性の場合には発現誘導後）に、培養温度の調整等により、組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度に上記組換え細胞を冷却又は維持することで、組換え細胞において目的タンパク質の発現量を増加させることができる。組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度とは、例えば、組換え細胞の増殖至適温度の下限値よりも３～２５℃低い温度であってよく、８～２０℃低い温度であってよく、１０～１８℃低い温度であってよく、１２℃～１８℃低い温度であってよく、１４℃～１７℃低い温度であってよく、３～１０℃低い温度であってよく、５～８℃低い温度であってよい。

（組換えタンパク質の発現誘導）
本実施形態に係る組換え細胞は、目的タンパク質の発現が誘導できるものであってもよい。組換えタンパク質の発現の誘導は、誘導性プロモーターによる転写（目的とするタンパク質をコードする核酸の転写）を活性化することにより行われる。誘導性プロモーターの活性化は、誘導性プロモーターの種類に応じて、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。

例えば、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質（発現誘導剤）の存在により活性化される誘導性プロモーターを使用した場合、当該誘導物質を培養液に添加することにより、組換えタンパク質の発現を誘導することができる。誘導物質は、１度に、又は複数回に分けて培養液に添加してもよく、また、連続フィードにより培養液に添加してもよい。流加基質溶液に誘導物質を含有させてフィードしてもよい。添加する誘導物質の量は、誘導物質及び誘導性プロモーターの種類に応じて設定することができるが、例えば、組換え細胞の乾燥重量１ｇ当たり０．１～３０μｇの範囲とすることができ、好ましくは、０．５～２０μｇの範囲である。

また例えば、温度の上昇又は低下により活性化される誘導性プロモーターを使用した場合、培養液の温度を上昇又は低下させることにより、組換えタンパク質の発現を誘導することができる。例えば、温度上昇により活性化されるλファージのＰＲプロモーター又はＰＬプロモーターを使用した場合、増殖時の培養液の温度を２０～３７℃の範囲とすることで増殖時の組換えタンパク質の発現は抑えられ、次いで培養液の温度を３８～４４℃に上昇させることにより、組換えタンパク質の発現を誘導させることができる。このときに熱ショックタンパク質による影響を緩和させるために、特開平６－２９２５６３号公報に記載のように増殖時の培養液のｐＨを６．５～７．５とし、組換えタンパク質の発現誘導を開始する時点で培養液のｐＨを４．５～６．５と変動させることにより、より安定した発現誘導を行うことができる。

組換え細胞の増殖を行う段階から、組換えタンパク質の発現を誘導する段階へ移行する時期には、特に制限はなく、培養システムの構成、生産プロセスの設計に応じて適宜設定することができる。組換えタンパク質の生産を効率よく行う観点からは、組換え細胞の増殖が対数増殖期の中期～後期に達した時に、組換えタンパク質の発現の誘導を開始するのが好ましい。

組換え細胞の増殖は、遅延期又は誘導期（培養初期の細胞数の増加が遅い時期）から始まり、対数増殖期（単位時間ごとに細胞数が２倍と対数的に増加する時期）を経て、定常期（細胞の正味の数に変動の見られない時期）に至る。対数増殖期の中期とは、遅延期における細胞数と定常期における細胞数の中間程度の細胞数になる時期をいい、対数増殖期の後期とは、中期から定常期までの時期をいう。組換えタンパク質の発現の誘導を開始する時期の具体例として、例えば、定常期におけるＯＤ_６００の値が約１５０になる組換え細胞の場合、ＯＤ_６００の値が３０～１１０に達した時期であるのが好ましく、４０～９０に達した時期であるのがより好ましく、５０～８０に達した時期であるのが更に好ましい。

組換えタンパク質の発現を誘導する時間は、使用する宿主、目的タンパク質の種類に応じて、設定した生産量に達するまで行えばよい。培養液の温度等の培養条件により生産速度は変化するため、組換えタンパク質の発現を誘導する時間を一義的に決める必要はない。次工程の組換えタンパク質の分離及び精製の進行に合わせて組換えタンパク質の発現を誘導する時間を設定してもよい。また、並行して行っている組換え細胞の増殖、及び当該増殖した組換え細胞の移送に影響がないように組換えタンパク質の発現を誘導する時間を設定することが、工業的生産においては好ましい。

（前培養工程）
本実施形態に係る組換えタンパク質の製造方法は、前培養工程を更に備えていてもよい。前培養工程は、増殖抑制工程の前に、組換え細胞を前培養培地で培養する工程である。前培養培地の具体的な態様は、上述したタンパク質生産培地で説明した態様と同様である。

本実施形態に係る組換えタンパク質の製造方法では、前培養培地として、タンパク質生産培地よりも栄養成分が豊富な培地を用いることが好ましい。これにより、増殖抑制工程及び生産工程に供する組換え細胞の数を増やすことができる。

〔組換えタンパク質の細胞あたりの生産量を増加させる方法〕
上述した本発明は、組換えタンパク質の細胞あたりの生産量を増加させる方法として捉えることもできる。すなわち、一実施形態に係る組換えタンパク質の細胞あたりの生産量を増加させる方法は、組換えタンパク質を発現する組換え細胞の細胞増殖を低減させる増殖低減工程と、組換え細胞を、細胞増殖が低減された状態で、タンパク質生産培地中で培養して組換えタンパク質を生産する生産工程と、を含み、増殖低減工程において、組換え細胞として、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含む組換え細胞を用いることで、組換え細胞の細胞増殖を低減させる、方法である。当該方法の具体的な態様及び好ましい態様は、上述したとおりである。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
（１）組換え細胞（改変フィブロインを発現する大腸菌株）の作製
（目的タンパク質）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ９６６」ともいう。）を設計した。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号３で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。

次に、ＰＲＴ９６６をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）ベクターに組み換えて、ｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターを得た。

（改変フィブロイン発現カセットの大腸菌ゲノムＤＮＡ中への組込み）
宿主として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、以下（ａ）～（ｃ）の手法を用いて改変フィブロイン発現カセットをゲノムＤＮＡ中の３箇所に組み込み、改変フィブロイン発現カセットを３つ有する組換え細胞を取得した。

（ａ）ａｔｔＨＫ０２２
１つ目の改変フィブロイン発現カセットは、ＨＫ０２２ファージが溶原化する機構を利用してゲノムＤＮＡ中に組み込んだ。当該機構は、宿主ゲノムＤＮＡ中の特定部位（ａｔｔＢサイト）とファージゲノムの特定部位（ａｔｔＰ（ＨＫ０２２）サイト）との間での配列特異的な組み換えである。

図１１は、ＨＫ０２２ファージが溶原化する機構を利用して、改変フィブロイン発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込む方法の概要を示す概略図である。まず、ｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターからＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して、ＰＲＴ９６６をコードする核酸を切り出した後、ａｔｔＰ（ＨＫ０２２）サイトを有するプラスミドベクターａｔｔＨＫ０２２－Ｃｍ２に組み換えて、ａｔｔＨＫ０２２－Ｔ７ｐ－ＰＲＴ９６６－Ｔ７ｔ－ＦＲＴ－Ｃｍ２－ｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ－ＦＲＴベクターを得た。次に、ａｔｔＨＫ０２２－Ｔ７ｐ－ＰＲＴ９６６－Ｔ７ｔ－ＦＲＴ－Ｃｍ２－ｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ－ＦＲＴベクターを宿主に導入して、宿主ゲノムＤＮＡ中のａｔｔＢサイトと同ベクターのａｔｔＰ（ＨＫ０２２）サイトとの間での配列特異的な組み換えにより改変フィブロイン（ＰＲＴ９６６）発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込んだ。なお、宿主には、あらかじめｉｎｔ遺伝子を有するヘルパープラスミドｐＡＨ６９（Ｊ．Ｂａｃｔ １８３：６３８４－６３９３）を導入してインテグラーゼを発現させた。その後、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７： ６６４０－６６４５）を導入してＦＬＰを発現させることにより、ＦＲＴ配列で挟まれたクロラムフェニコール耐性遺伝子とｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ領域を除去した。

（ｂ）ａｔｔφ８０
２つ目の改変フィブロイン発現カセットは、φ８０ファージが溶原化する機構を利用して宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込んだ。当該機構は、宿主ゲノムＤＮＡ中の特定部位（ａｔｔＢサイト）とファージゲノムの特定部位（ａｔｔＰ（φ８０）サイト）との間での配列特異的な組み換えである。

図１２は、φ８０ファージが溶原化する機構を利用して、改変フィブロイン発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込む方法の概要を示す概略図である。まず、ｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターからＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して、ＰＲＴ９６６をコードする核酸を切り出した後、ａｔｔＰ（φ８０）サイトを有するプラスミドベクターａｔｔφ８０－Ｋｍ１＿１に組み換えて、ａｔｔφ８０－ｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ－ＦＲＴ－Ｋｍ１－ＦＲＴ－ＳＰＴ３ｐ－ＰＲＴ９６６－Ｔ７ｔ－ＦＲＴベクターを得た。次に、上記（ａ）の方法で１つ目の改変フィブロイン発現カセットを組み込んだ宿主にａｔｔφ８０－ｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ－ＦＲＴ－Ｋｍ１－ＦＲＴ－ＳＰＴ３ｐ－ＰＲＴ９６６－Ｔ７ｔ－ＦＲＴベクターを導入して、宿主ゲノムＤＮＡ中のａｔｔＢサイトと同ベクターのａｔｔＰ（φ８０）サイトとの間での配列特異的な組み換えにより２つ目の改変フィブロイン（ＰＲＴ９６６）発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込んだ。その後、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０を導入してＦＬＰを発現させることにより、ＦＲＴ配列で挟まれたカナマイシン耐性遺伝子を除去した。

（ｃ）λＲｅｄ＿ｍａｎＸ
３つ目の改変フィブロイン発現カセットは、λファージが有する相同組換えシステムを利用して宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込んだ。当該相同組換えシステムは、ファージゲノムのＲｅｄ領域にあるｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍ遺伝子産物により相同組換えを生じるものである。

図１３は、λファージが有する相同組換えシステムを利用して、改変フィブロイン発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込む方法の概要を示す概略図である。まず、ｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターを鋳型としてＴ７プロモーターに改変を導入するプライマーを用いたＰＣＲ法により改変フィブロイン発現カセット（ｍａｎＸ５’相同配列－ＳＰＴ３プロモーター－ＰＲＴ９６６－Ｔ７ターミネータ－をこの順に含む。）を増幅した。同様に、ｐＫＤ１３－Ｃｍベクターを鋳型としてＰＣＲ法によりクロラムフェニコール耐性遺伝子発現カセット（Ｔ７ターミネーター相同配列－ＦＲＴ－クロラムフェニコール耐性遺伝子－ＦＲＴ－ｍａｎＸ３’相同配列をこの順に含む。）を増幅した。両ＰＣＲ産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングシステム（タカラバイオ株式会社製）を使用して連結した。次に、上記（ａ）及び（ｂ）の方法で１つ目の改変フィブロイン発現カセット及び２つ目の改変フィブロイン発現カセットを組み込んだ宿主に連結したＤＮＡ断片を導入して、宿主ゲノムＤＮＡ中のｍａｎＸ５’相同配列とＤＮＡ断片上のｍａｎＸ５’相同配列との間の相同組み換え、及び宿主ゲノムＤＮＡ中のｍａｎＸ３’相同配列とＤＮＡ断片上のｍａｎＸ３’相同配列との間の相同組み換えにより、３つ目の改変フィブロイン（ＰＲＴ９６６）発現カセットを宿主ゲノムＤＮＡ中に組み込んだ。なお、宿主には、あらかじめｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子をもつヘルパープラスミドｐＫＤ４６（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：６６４０－６６４５）を導入して、それぞれの遺伝子を発現させた。その後、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０を導入してＦＬＰを発現させることにより、ＦＲＴ配列で挟まれたクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去した。

（２）ＭｒｅＢ変異の導入
ＭｒｅＢ遺伝子のタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）をＰＣＲ法によって取得し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いてｐＫＯＶプラスミド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７９：６２２８－６２３７）にクローニングした。第５３番目のアミノ酸をスレオニンに変換するため、Ａ２Ｔ－Ｆプライマー（５’－ＡＧＣＧＴＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡＧＧＴＣＡＴＧ－３’）及びＡ２Ｔ－Ｒプライマー（５’－ＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＧＣＴＴＴＴＣＧＧＴ－３’）を使用したＰＣＲ法により変異を導入したＭｒｅＢをコードする核酸を増幅した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｍｉｘで反応させた後に上記（１）で取得した組換え細胞を形質転換した。得られた株を用い、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７９：６２２８－６２３７に記載の方法で、当該株のゲノム中にＭｒｅＢ－Ａ５３Ｔ変異を導入し、ＭｒｅＢ（Ａ５３Ｔ）変異株を得た。

（３）改変フィブロインの発現及び評価
上記（１）及び（２）の方法で取得した組換え細胞（改変フィブロイン発現カセットを３つゲノムＤＮＡ中に有し、かつＭｒｅＢ（Ａ５３Ｔ）変異を有する組換え細胞。以下、「ＭｒｅＢ変異株」ともいう。）を以下の方法で培養し、改変フィブロインの発現量解析を行った。比較として、上記（１）の方法で取得した組換え細胞（改変フィブロイン発現カセットを３つゲノムＤＮＡ中に有し、ＭｒｅＢに変異を有しない組換え細胞。以下、「野生型ＭｒｅＢ株」ともいう。）も同様に評価した。

ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株は、それぞれ２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、１００ｍＬの前培養培地（表２のシード培養用培地）にＯＤ_６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ_６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。

当該シード培養液を５００ｍＬのタンパク質生産培地（表３の生産培地）を添加したジャーファーメンターにＯＤ_６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。

タンパク質生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（表４の流加基質溶液）を６ｇ／時間の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、１６時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度０．１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。

回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、改変フィブロイン（ＰＲＴ９６６）を得た。

得られた凍結乾燥粉末に対して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Ｔｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｌｔｄ．）を用いて画像解析を行い、改変フィブロインの生産量を評価した。凍結乾燥粉末の重量から計算した各改変フィブロインの生産量（細胞あたりの生産量）を、野生型ＭｒｅＢ株における誘導時間３２時間の値を１００％としたときの相対値として、算出した。

培養期間中、定期的に培養液の一部を取り出し、粒子計数分析装置（ＣＤＡ―１０００、シスメックス）により、組換え細胞の平均粒子径を測定した。

（４）結果
図１は、ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の平均粒子径を培養時間に対してプロットしたグラフである。横軸のＣ０はシード培養から生産培養に切り替わった時点であり、Ｔ０は発現誘導剤により組換えタンパク質の生産が始まった時点である。ＭｒｅＢ変異株は、シード培養時の栄養豊富な培地において、盛んに細胞分裂して増殖するとともに細胞の幅が野生型ＭｒｅＢ株よりも増大した。その後に生産培地に移したところ、図１のＣ０（生産培地への移植時点）からＴ０（発現誘導時点）までの間に示されるように、生産培地の栄養成分が資化されても野生型ＭｒｅＢ株が細胞分裂を続けたのに対してＭｒｅＢ変異株は増殖が緩やかであった結果として、野生型ＭｒｅＢ株の平均粒子径が急速に減少したのに対してＭｒｅＢ変異株はほとんど平均粒子径の変化がなく、改変フィブロインの発現誘導以降、ＭｒｅＢ変異株の平均粒子径は野生型ＭｒｅＢ株よりも３０％程度増大したままであった。

図２は、生産培養開始後１６時間におけるＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の細胞自体の重量（乾燥菌体重量から生産された組換えタンパク質の重量を除いたもの）を示すグラフである。

図３は、ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の生産培養開始後１６時間における細胞の増殖を示すグラフである。図２および図３に示すように、ＭｒｅＢ変異株の増殖は野生型ＭｒｅＢ株よりも低減していることが理解できる。

図４は、ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の改変フィブロイン生産量（細胞あたりの生産量）を示すグラフである。図４に示すように、ＭｒｅＢ変異株による改変フィブロイン生産量は、野生型ＭｒｅＢ株と比べて、発現誘導後１６時間で３３％、発現誘導後３２時間で３５％程度上昇した。

図５は、ＭｒｅＢ変異株及び野生型ＭｒｅＢ株の改変フィブロイン生産量（培地あたりの生産量）を示すグラフである。図５に示すように、ＭｒｅＢ変異株による改変フィブロイン生産量は、野生型ＭｒｅＢ株と比べて、発現誘導後１６時間で３３％程度上昇した。

結果として、ＭｒｅＢ変異株を用いることによって、改変フィブロインの生産培養時に細胞増殖が低減されたことにより、細胞あたりの改変フィブロインの収率が顕著に高まった。加えて、目的タンパク質に比べて菌体数が少ないことから、破砕する操作も軽減できる点でも、野生型ＭｒｅＢ株を用いるよりもＭｒｅＢ変異株を用いたほうが改変フィブロインタンパク質の製造において有利であることが確認できた。

［実施例２］
（１）改変フィブロインを誘導発現する大腸菌株の作製
実施例１と同様に、改変フィブロインＰＲＴ９６６を有するｐＥＴ－２２（＋）／ＰＲＴ９６６ベクターを得た。また、実施例１と同様に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を宿主として、改変フィブロイン発現カセットを３つ有する組換え細胞を取得した。

（２）形態形成制御因子ｓｕｌＡを誘導発現する大腸菌株の作製
（形態形成制御因子の発現カセットベクターの作製）
下記のｓｕｌＡ＿Ｆ及びｓｕｌＡ＿Ｒのプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ｓｕｌＡ遺伝子のタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）を増幅した。また、下記のＲＢＳ－４及びｐＥＴ－ＭＣＳ＿Ｆのプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ａｔｔＰ（Ｐ２１）サイトを有するプラスミドベクターａｔｔＰ２１－ＫｍＲ２を直鎖化、増幅した。増幅したこれら２断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を用いて、添付マニュアルに従い、連結し、ａｔｔＰ２１－Ｔ７ｐ－ｓｕｌＡ－Ｔ７ｔ－ＦＲＴ－ＫｍＲ２－ｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ－ＦＲＴベクターを得た。
sulA_F：5’-TTTAAGAAGGAGATATACATATGTACACTTCAGGCTATGCAC-3’（配列番号８）
sulA_R：5’-TGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAATGATACAAATTAGAGTGAATTTTTAGCCCGG-3’（配列番号９）
RBS-4：5’-ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAA-3’（配列番号１０）
pET-MCS_F：5’-GAATTCGAGCTCCGTCGAC-3’（配列番号１１）

ｓｕｌＡを増幅するＰＣＲは、終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー、及びＯＤ～０．０１のＢＬ２１（ＤＥ３）細胞懸濁液を添付のマニュアルに従って、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ（タカラバイオ株式会社製）と混合し、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒の条件を３０サイクル行った。ａｔｔＰ２１－ＫｍＲ２を直鎖化、増幅するＰＣＲも、同様に終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、１ｎｇのａｔｔＰ２１－ＫｍＲ２ベクターを鋳型として、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒の条件を３０サイクル行った。得られた発現ベクターの塩基配列は、サンガー法によって確認した。

（形態形成制御因子の発現カセットの宿主染色体上への組込み）
次に、（１）の方法で取得した改変フィブロイン発現カセットを３つ染色体上に有する組換え細胞を宿主細胞として、ａｔｔＰ２１－Ｔ７ｐ－ｓｕｌＡ－Ｔ７ｔ－ＦＲＴ－ＫｍＲ２－ｏｒｉ＿Ｒ６Ｋ－ＦＲＴベクターを宿主に導入して、宿主染色体上のａｔｔＢサイトと同ベクターのａｔｔＰ（Ｐ２１）サイトとの間での配列特異的な組み換えによりｓｕｌＡ発現カセットを宿主染色体上に組み込んだ。なお、宿主には、あらかじめｉｎｔ遺伝子を有するヘルパープラスミドｐＡＨ１２１（Ｊ．Ｂａｃｔ １８３：６３８４－６３９３）を導入してインテグラーゼを発現させた。

（３）改変フィブロインの発現及び評価
上記（１）及び（２）の方法で取得した組換え細胞（改変フィブロイン発現カセットを３つ染色体上に有し、かつｓｕｌＡの発現カセットを有する組換え細胞。以下、「ｓｕｌＡ誘導発現株」ともいう。）を、実施例１と同様な方法にて培養し、改変フィブロインの発現量解析を行った。比較として、上記（１）の方法で取得した組換え細胞（改変フィブロイン発現カセットを３つ染色体上に有し、ｓｕｌＡの発現カセットを有しない組換え細胞。以下、「Ｃｏｎｔｒｏｌ株」ともいう。）も同様に評価した。

培養期間中、定期的に培養液の一部を取り出し、粒子計数分析装置（ＣＤＡ―１０００、シスメックス）により、組換え細胞の粒子濃度（細胞濃度）を測定した。

（４）結果
図６は、ｓｕｌＡ誘導発現株及びＣｏｎｔｒｏｌ株の平均粒子径を培養時間に対してプロットしたグラフである。横軸のＴ０は発現誘導剤により組換えタンパク質（改変フィブロイン）の生産が始まった時点であり、Ｔの後の数字は発現誘導後の経過時間を表す。改変フィブロインの発現誘導以降、ｓｕｌＡ誘導発現株の平均粒子径が増大した一方で、Ｃｏｎｔｒｏｌ株にはほとんど変化が見られなかった。

図７は、改変フィブロインの発現誘導時（Ｔ０）のＣｏｎｔｒｏｌ株を基準（１００％）としたときのＣｏｎｔｒｏｌ株及びｓｕｌＡ誘導発現株の細胞濃度（細胞数）の相対値の変化を示すグラフである。図７に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ株が改変フィブロインの発現誘導後２４時間で細胞濃度（細胞数）が１２７％に増加したのに対して、ｓｕｌＡ誘導発現株の細胞濃度（細胞数）はむしろ低減されていた。

図８は、改変フィブロインの発現誘導後２４時間におけるＣｏｎｔｒｏｌ株（１００％）に対するｓｕｌＡ誘導発現株の細胞濃度（細胞数）の相対値を示すグラフである。

図９は、Ｃｏｎｔｒｏｌ株を基準（１００％）としたときのｓｕｌＡ誘導発現株の改変フィブロインの細胞あたりの生産量の相対値を示すグラフである。図９に示すように、ｓｕｌＡ誘導発現株による改変フィブロインの細胞あたりの生産量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ株と比べて、発現誘導後２４及び２８時間で約２００％以上に増加した。

図１０は、Ｃｏｎｔｒｏｌ株を基準（１００％）としたときのｓｕｌＡ誘導発現株の改変フィブロインの培地あたりの生産量の相対値を示すグラフである。図１０に示すように、ｓｕｌＡ誘導発現株による改変フィブロインの培地あたりの生産量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ株と比べて、発現誘導後２４時間で約１２６％に増加した。

結果として、ｓｕｌＡ誘導発現株を用いることによって、改変フィブロインの生産培養時に細胞増殖が低減されたことにより、細胞あたりの改変フィブロインの収率が顕著に高まった。加えて、目的タンパク質に比べて菌体数が少ないことから、破砕する操作も軽減できる点でも、通常の改変フィブロイン発現組換え細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ株）を用いるよりもｓｕｌＡ誘導発現株を用いたほうが改変フィブロインタンパク質の製造において有利であることが確認できた。

Claims (15)

1. 組換えタンパク質を発現する組換え細胞をタンパク質生産培地中で培養して前記組換えタンパク質を生産することを含み、
   前記組換え細胞は、宿主細胞として原核生物の細胞を用いたものであり、
   前記組換え細胞は、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含むことで、その細胞増殖が低減されており、
   前記形態形成制御因子が、細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質、又はペプチドグリカン合成酵素である、組換えタンパク質の製造方法。
2. 前記改変された形態形成制御因子が、変異型細胞骨格タンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記変異型細胞骨格タンパク質が、変異型ＭｒｅＢである、請求項２に記載の製造方法。
4. 前記変異型ＭｒｅＢが、野生型のＭｒｅＢと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の製造方法。
5. 前記変異型ＭｒｅＢが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＭｒｅＢの第５３番目のアミノ酸残基アラニンに変異を有するものである、請求項３又は４に記載の製造方法。
6. 前記変異型ＭｒｅＢが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＭｒｅＢの第５３番目のアミノ酸残基アラニンがスレオニンに置換された変異を有するものである、請求項３～５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記組換え細胞は、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質の発現カセットが導入されたものである、請求項１に記載の製造方法。
8. 前記細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質が、ｓｕｌＡである、請求項７に記載の製造方法。
9. 前記タンパク質生産培地が、天然由来成分を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
10. 前記組換えタンパク質の疎水度が－１．０以上である、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. 前記組換え細胞が、桿菌である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
12. 前記組換え細胞が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
13. 組換えタンパク質の細胞あたりの生産量を増加させる方法であって、
    組換えタンパク質を発現する組換え細胞をタンパク質生産培地中で培養して前記組換えタンパク質を生産することを含み、
    前記組換え細胞は、宿主細胞として原核生物の細胞を用いたものであり、
    前記組換え細胞は、少なくとも一つの改変された形態形成制御因子を含むことで、その細胞増殖が低減されており、
    前記形態形成制御因子が、細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質、又はペプチドグリカン合成酵素である、方法。
14. 前記改変された形態形成制御因子が、変異型細胞骨格タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記組換え細胞は、細胞骨格タンパク質の機能を制御するタンパク質の発現カセットが導入されたものである、請求項１３に記載の方法。

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