JP7540730B2 - How to Test for Rheumatoid Arthritis - Google Patents
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Description
本発明は、関節リウマチを検査する方法等に関する。 The present invention relates to a method for testing rheumatoid arthritis, etc.
関節リウマチ（Rheumatoid Arthritis ：（RA [ MIM 180300 ]）は、自己免疫性の全身炎症性疾患であり、罹患者は全世界の人口の約1％である。関節リウマチは、滑膜の炎症とそれに伴う軟骨・骨破壊による関節破壊を特徴とする。原因不明の自己免疫疾患であり、患者のQOL低下と社会経済的損失を生じている。Rheumatoid arthritis (RA [MIM 180300]) is an autoimmune systemic inflammatory disease that affects approximately 1% of the world's population. Rheumatoid arthritis is characterized by joint destruction due to synovial inflammation and associated cartilage and bone destruction. It is an autoimmune disease of unknown cause, and causes a decrease in patients' quality of life and socioeconomic losses.
腸内細菌叢はヒトの免疫や代謝に大きく影響しており、炎症性腸疾患や大腸癌、糖尿病、自閉症など、様々な疾患の病因である可能性が報告され、発症予測のバイオマーカーとして有望視されている。近年、関節リウマチの診断に寄与する腸内細菌叢に関する発明が報告されている（特許文献１）。The intestinal flora has a significant impact on human immunity and metabolism, and has been reported to be a possible cause of various diseases, such as inflammatory bowel disease, colon cancer, diabetes, and autism, and is considered a promising biomarker for predicting the onset of these diseases. In recent years, an invention related to the intestinal flora that contributes to the diagnosis of rheumatoid arthritis has been reported (Patent Document 1).
これまで腸内細菌叢を用いたスクリーニングは、16S rRNA等から推定可能な属レベルやOTU単位での菌種によって測定されており、精密さに欠ける手法であった。近年は糞便中の微生物の全DNAを対象に包括的な評価・解析が可能であるショットガンシークエンスという次世代シークエンスを用いた手法が実施されている。しかし、この手法は、細菌叢の膨大なゲノムデータに対して複雑な解析を施行した後に得られるゲノムデータが必要であり、一般のスクリーニングに応用するには困難であった。こうした背景から、より簡便で正確に細菌叢をスクリーニングする技術の開発と適応が必要とされていた。 Until now, screening using the intestinal microbiota has been performed by measuring bacterial species at the genus level or OTU level, which can be estimated from 16S rRNA, etc., and this method lacked precision. In recent years, a next-generation sequencing method called shotgun sequencing has been implemented, which enables comprehensive evaluation and analysis of all the DNA of microorganisms in feces. However, this method requires genome data that can be obtained after performing complex analysis on the vast amount of genome data of the bacterial flora, making it difficult to apply to general screening. Against this background, there was a need to develop and adapt a technology that can screen the bacterial flora more easily and accurately.
本発明は、関節リウマチの新規バイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。 The objective of the present invention is to provide a new biomarker for rheumatoid arthritis and a method for using the same.
本発明者は、鋭意研究を進めた結果、関節リウマチを検査する方法であって、（1）被検体から採取された腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法、であれば、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。As a result of intensive research, the present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by a method for testing for rheumatoid arthritis, the method including (1) a step of detecting at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from a subject. Based on this finding, further research has led to the completion of the present invention. That is, the present invention encompasses the following aspects.
項１． 関節リウマチを検査する方法であって、
（1）被検体から採取された腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、
を含む、検査方法．
項２． 検出したバイオマーカーがPrevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）を含む場合、さらに、
（2a）前記工程（1）で検出された前記BM1の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含む、項１に記載の検査方法．
項３． 検出したバイオマーカーがBN744_01293遺伝子（BM2）を含む場合、さらに、（2b）前記工程（1）で検出された前記BM2の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含む、項１に記載の検査方法．
項４． 検出したバイオマーカーがPrevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）、並びにBN744_01293遺伝子（BM2）を含む場合、さらに、（2c）前記工程（1）で検出された前記BM1の量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ前記工程（1）で検出された前記BM2の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含む、項１に記載の検査方法．
項５． 前記腸内細菌含有試料が糞便である、項１～４のいずれかに記載の検査方法．
項６． 前記被検体がヒトである、項１～５のいずれかに記載の検査方法．
項７． Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、関節リウマチの検査薬．
項８． Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、関節リウマチの検査キット．
項９． 被検物質で処理された動物から採取された腸内細菌含有試料腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法．
項１０． 被検物質で処理された動物から採取された腸内細菌含有試料腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、関節リウマチの誘発性又は増悪性の評価方法．
(1) detecting at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from a subject;
An inspection method comprising:
(2a) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of the BM1 detected in the step (1) is equal to or higher than a cutoff value;
The inspection method according to
Item 3. When the detected biomarker contains the BN744_01293 gene (BM2), (2b) a step of determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of the BM2 detected in the step (1) is equal to or lower than a cutoff value;
The inspection method according to
Item 4. When the detected biomarkers include at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene (BM2), (2c) a step of determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of the BM1 detected in the step (1) is equal to or higher than a cutoff value and the amount or concentration of the BM2 detected in the step (1) is equal to or lower than a cutoff value;
The inspection method according to
Item 5. The testing method according to any one of
Item 7. A diagnostic agent for rheumatoid arthritis, comprising a detection agent for at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene.
Item 8. A test kit for rheumatoid arthritis, comprising a detection agent for at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene.
Item 9. A method for screening an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, using as an index the amount or concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal treated with a test substance.
Item 10. A method for evaluating the inducibility or aggravation of rheumatoid arthritis using as an index the amount or concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal treated with a test substance.
本発明によれば、関節リウマチのバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、関節リウマチの検査、関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング、関節リウマチの誘発性又は増悪性の評価等が可能になり得る。According to the present invention, a biomarker for rheumatoid arthritis can be provided. Use of the biomarker may enable testing for rheumatoid arthritis, screening of active ingredients for preventive or therapeutic agents for rheumatoid arthritis, evaluation of the inducibility or exacerbation of rheumatoid arthritis, and the like.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。In this specification, the expressions "contain" and "comprise" include the concepts of "contain," "include," "consist essentially of," and "consist only of."
1．関節リウマチの検査方法
本発明は、その一態様において、関節リウマチを検査する方法であって、（1）被検体から採取された腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の関節リウマチ検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 1. Rheumatoid arthritis testing method In one aspect, the present invention relates to a method for testing for rheumatoid arthritis, comprising the step of (1) detecting at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from a subject (also referred to as the "rheumatoid arthritis testing method of the present invention" in this specification). This will be described below.
1-1．工程（1）
検査対象である関節リウマチの種類は、特に制限されない。関節リウマチの各種分類基準における全てのクラス、グレード、ステージの関節リウマチが検査対象となる。関節リウマチには、抗CCP抗体陰性の関節リウマチも包含される。 1-1． Step (1)
The type of rheumatoid arthritis to be tested is not particularly limited. Rheumatoid arthritis of all classes, grades, and stages in various classification criteria for rheumatoid arthritis can be tested. Rheumatoid arthritis also includes anti-CCP antibody-negative rheumatoid arthritis.
被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。The subject is a target organism of the testing method of the present invention, and the species of the organism is not particularly limited. Examples of the species of the subject include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, and preferably humans.
被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば関節リウマチに罹患しているかどうか不明な検体、関節リウマチに罹患していると既に別の方法により判定されている検体、関節リウマチに罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、関節リウマチの治療中の検体等が挙げられる。The condition of the subject is not particularly limited. Examples of the subject include a specimen in which it is unknown whether or not it has rheumatoid arthritis, a specimen that has already been determined by another method to have rheumatoid arthritis, a specimen that has already been determined by another method to not have rheumatoid arthritis, a specimen being treated for rheumatoid arthritis, etc.
腸内細菌含有試料は、腸内細菌を含有するものである限り、特に制限されない。腸内細菌含有試料としては、例えば腸液、糞便等の消化管内容物が挙げられる。これらの中でも、被検体に対する負担の観点から、糞便が好ましい。腸内細菌含有試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。腸内細菌含有試料は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。The enterobacteria-containing sample is not particularly limited as long as it contains enterobacteria. Examples of the enterobacteria-containing sample include digestive tract contents such as intestinal fluid and feces. Among these, feces is preferred from the viewpoint of the burden on the subject. The enterobacteria-containing sample may be used alone or in combination of two or more types. The enterobacteria-containing sample may be collected from the subject by a method known to those skilled in the art.
工程（1）の検出対象は、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（本明細書において、これらをまとめて「対象バイオマーカー」と示すこともある。）である。The detection target in step (1) is at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene (these may be collectively referred to as the "target biomarkers" in this specification).
対象バイオマーカーは、関節リウマチにおいてその量が変化しているバイオマーカーであり、これを指標とすることにより関節リウマチを鑑別可能である。The target biomarker is a biomarker whose amount changes in rheumatoid arthritis, and can be used as an indicator to differentiate rheumatoid arthritis.
対象バイオマーカー中、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）は、関節リウマチ検体における量が健常検体における量よりも高い対象バイオマーカーである。Among the target biomarkers, at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii is a target biomarker whose amount in rheumatoid arthritis samples is higher than that in healthy samples.
対象バイオマーカー中、BN744_01293遺伝子（BM2）は、関節リウマチ検体における量が健常検体における量よりも低い対象バイオマーカーである。Among the target biomarkers, the BN744_01293 gene (BM2) is a target biomarker whose amount in rheumatoid arthritis samples is lower than that in healthy samples.
工程（1）における対象バイオマーカーの数は、1種のみでもよいが、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、又は9種の組み合わせであってもよい。より多くの対象バイオマーカーを組み合わせることにより、関節リウマチの検査等を、より正確に行うことが可能になる。The number of target biomarkers in step (1) may be only one type, or may be a combination of two or more, three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, or nine types. By combining more target biomarkers, it becomes possible to perform tests for rheumatoid arthritis, etc. more accurately.
検出は、通常は、対象バイオマーカーの量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積あたりの重量や、試料中の総菌体量又は総核酸量あたりの量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。Detection is usually performed by measuring the amount or concentration of the target biomarker. "Concentration" is not limited to absolute concentration, but may also be relative concentration, weight per unit volume, amount per total amount of bacterial cells or total amount of nucleic acid in a sample, raw data measured to know the absolute concentration, etc.
対象バイオマーカーを検出する方法としては、対象バイオマーカーの一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、あらかじめ予測した選択培地において腸内細菌を培養し、対象とする腸内細菌のコロニーの有無を確認する培養法、ある腸内細菌特有の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出するサザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、DNAマイクロアレイ法等が挙げられる。また、資料中のDNAのショットガンシークエンスを利用した方法（例えば後述の試験例1の方法）も利用することができる。さらに、細菌代謝物の代謝検出、細菌タンパク質のプロテオミクス検出の抗体に基づく方法等も利用することができる。The method for detecting the target biomarker is not particularly limited as long as it can specifically detect a part or all of the target biomarker. Specific examples of the detection method include a culture method in which enterobacteria are cultured in a previously predicted selective medium and the presence or absence of colonies of the target enterobacteria is confirmed, a Southern hybridization method for detecting genes specific to a certain enterobacteria or mRNA derived from the gene, a Northern hybridization method, a DNA microarray method, and the like. In addition, a method using shotgun sequencing of DNA in a sample (for example, the method of Test Example 1 described later) can also be used. Furthermore, an antibody-based method for metabolic detection of bacterial metabolites and proteomic detection of bacterial proteins can also be used.
また、試料中の細菌を測定する手段としては、例えばあらかじめ予測した選択培地において腸内細菌を培養し菌数を計測する方法、選択液体培地中で腸内細菌を培養し濁度や吸光度を測定する方法、FISH法、リアルタイムPCR法、RT－PCR法等が挙げられる。In addition, methods for measuring bacteria in a sample include, for example, culturing enterobacteria in a predetermined selective medium and measuring the number of bacteria, culturing enterobacteria in a selective liquid medium and measuring turbidity or absorbance, FISH, real-time PCR, RT-PCR, etc.
ここで、RT－PCR法について説明する。RT－PCR法を用いる分析方法は、例えば、（1）試料中の目的とする腸内細菌のRNAを抽出する工程、（2）抽出したRNAにハイブリダイズする核酸断片（プライマー）を用いてRT－PCRを行う工程、及び（3）工程（2）により増幅されたDNA断片を検出する工程により行うことができる。検体由来の鋳型cDNAに上記核酸断片を組み合わせ、増幅反応を行うことにより、目的とする腸内細菌に特異的なDNA断片（PCR産物）を得ることができる。PCR産物を経時的に観察し、一定のDNA量に達した時のPCRサイクル数を特定することにより、試料中の目的とする腸内細菌数を定量することが可能となる。Here, the RT-PCR method will be explained. An analytical method using the RT-PCR method can be carried out, for example, by the steps of (1) extracting the RNA of the target enterobacteria from a sample, (2) performing RT-PCR using a nucleic acid fragment (primer) that hybridizes to the extracted RNA, and (3) detecting the DNA fragment amplified in step (2). By combining the above-mentioned nucleic acid fragment with a template cDNA derived from a sample and carrying out an amplification reaction, a DNA fragment (PCR product) specific to the target enterobacteria can be obtained. By observing the PCR product over time and determining the number of PCR cycles at which a certain amount of DNA is reached, it is possible to quantify the number of the target enterobacteria in a sample.
増幅されるPCR産物の経時的な観察は、PCR産物をSYBR（R）GreenI等のインターカレーター性蛍光色素により標識し、各PCR段階での蛍光強度を測定することにより行うことができる。インターカレーター性色素は二本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度が増加する性質を有することから、標的細菌のcDNAからPCR反応により生成するPCR産物を正確に測定することができ、特にSYBR（R）GreenIが好適に用いられる。 The amplified PCR products can be observed over time by labeling the PCR products with an intercalating fluorescent dye such as SYBR(R) GreenI and measuring the fluorescence intensity at each PCR stage. Intercalating dyes have the property that their fluorescence intensity increases when they intercalate into double-stranded nucleic acid, making it possible to accurately measure the PCR products generated by the PCR reaction from the cDNA of the target bacteria; SYBR(R) GreenI is particularly suitable.
任意に設定された一定の蛍光強度（DNA量）に達した時のPCRサイクル数（以下CT値とする）を特定することにより、試料中の目的とする腸内細菌の定量が可能となる。また、蛍光色素により標識したTaqManプローブやMoleculerBeacon等を使用することもできる。TaqManプローブやMoleculerBeaconは、PCRにより増幅される領域の内部配列と相同性を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素とクエンチャーを結合させたプローブであり、PCR反応に共存させて用いる。プローブに結合した蛍光色素とクエンチャーの相互作用でPCR増幅反応に応じた蛍光を発するため、各PCR段階での蛍光強度を測定することにより増幅されるPCR産物の経時的な観察を行うことができる。By determining the number of PCR cycles (hereafter referred to as CT value) when a certain arbitrarily set fluorescence intensity (amount of DNA) is reached, it is possible to quantify the target enterobacteria in the sample. In addition, TaqMan probes labeled with fluorescent dyes and Molecular Beacons can also be used. TaqMan probes and Molecular Beacons are probes in which a fluorescent dye and a quencher are bound to an oligonucleotide that has homology to the internal sequence of the region amplified by PCR, and are used in combination with the PCR reaction. The interaction between the fluorescent dye bound to the probe and the quencher emits fluorescence according to the PCR amplification reaction, so the amplified PCR product can be observed over time by measuring the fluorescence intensity at each PCR stage.
試料中の目的とする腸内細菌の定量は、DAPIカウント法や培養法等により計測した細菌数の対数値とCT値の検量線により求めることができる。すなわち、標的とする細菌数の対数値を横軸に、CT値を縦軸にプロットした検量線を予め作成し、PCR反応の結果得られたCT値を該検量線に適用して、試料中の目的とする腸内細菌の定量を行う。 The quantity of the target enterobacteria in a sample can be determined from a calibration curve of the logarithm of the number of bacteria measured by the DAPI counting method, culture method, etc. and the CT value. That is, a calibration curve is created in advance, with the logarithm of the number of target bacteria plotted on the horizontal axis and the CT value on the vertical axis, and the CT value obtained as a result of the PCR reaction is applied to the calibration curve to quantify the target enterobacteria in the sample.
工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、関節リウマチの検出指標である対象バイオマーカーの量及び／又は濃度を提供することができ、これにより関節リウマチの検出などを補助することができる。According to the testing method of the present invention including step (1), it is possible to provide the amount and/or concentration of a target biomarker that is an indicator for detecting rheumatoid arthritis, thereby assisting in the detection of rheumatoid arthritis, etc.
工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、治療効果判定、関節リウマチの病態解明、関節リウマチの予後予測、患者層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）等に利用し得る。The test results obtained by the testing method of the present invention, including step (1), can be used to assess the effectiveness of treatment, clarify the pathology of rheumatoid arthritis, predict the prognosis of rheumatoid arthritis, stratify patients, and select treatment methods (personalized medicine, treatment responsiveness), etc.
1-2．工程（2）
本発明の検査方法は、一態様として、検出したバイオマーカーがPrevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）を含む場合、さらに、
（2a）前記工程（1）で検出された前記BM1の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2aを含む本発明の検査方法によれば、関節リウマチを判定することが可能となる。 1-2． Step (2)
In one embodiment, the testing method of the present invention further comprises the steps of: when the detected biomarker includes at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii,
(2a) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of the BM1 detected in the step (1) is equal to or higher than a cutoff value;
According to the testing method of the present invention including step 2a, it is possible to diagnose rheumatoid arthritis.
本発明の検査方法は、一態様として、検出したバイオマーカーがBN744_01293遺伝子（BM2）を含む場合、さらに、
（2b）前記工程（1）で検出された前記BM2の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2bを含む本発明の検査方法によれば、関節リウマチを判定することが可能となる。
In one embodiment, when the detected biomarker includes the BN744_01293 gene (BM2), the testing method of the present invention further comprises:
(2b) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of the BM2 detected in the step (1) is equal to or lower than a cutoff value;
According to the testing method of the present invention including step 2b, it is possible to diagnose rheumatoid arthritis.
本発明の検査方法は、一態様として、検出したバイオマーカーがPrevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）、並びにBN744_01293遺伝子（BM2）を含む場合、さらに、
（2c）前記工程（1）で検出された前記BM1の量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ前記工程（1）で検出された前記BM2の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2cを含む本発明の検査方法によれば、関節リウマチを判定することが可能となる。
In one embodiment, the testing method of the present invention further comprises the steps of: when the detected biomarkers include at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene (BM2),
(2c) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of BM1 detected in the step (1) is equal to or higher than a cutoff value and the amount or concentration of BM2 detected in the step (1) is equal to or lower than a cutoff value;
According to the testing method of the present invention including step 2c, it is possible to diagnose rheumatoid arthritis.
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、関節リウマチに罹患していない被検体から採取された腸内細菌含有試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、関節リウマチに罹患していない被検体から採取された腸内細菌含有試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば0.5～1.4倍、0.6～1.3倍、0.7～1.2倍、0.8～1.1倍、0.9～1倍の値とすることができる。The cutoff value can be appropriately set by a person skilled in the art from the viewpoints of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc., and can be a value determined on a case-by-case basis or a predetermined value based on the amount and/or concentration of the target biomarker in an enterobacteria-containing sample collected from a subject not suffering from rheumatoid arthritis. The cutoff value can be, for example, 0.5 to 1.4 times, 0.6 to 1.3 times, 0.7 to 1.2 times, 0.8 to 1.1 times, or 0.9 to 1 times the amount and/or concentration of the target biomarker in an enterobacteria-containing sample collected from a subject not suffering from rheumatoid arthritis (the average value, median value, etc., when there are multiple subjects).
工程（2）の好ましい一態様においては、被検体が関節リウマチの治療中の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。In a preferred embodiment of step (2), when the subject is a subject undergoing treatment for rheumatoid arthritis, the effectiveness of treatment can be assessed by setting the cutoff value, for example, based on the amount and/or concentration of the target biomarker in a previous sample from the same subject.
2．関節リウマチのより高い精度での診断
工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が関節リウマチに罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに関節リウマチの医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で関節リウマチを診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に関節リウマチを検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「関節リウマチに罹患している」と診断できる。 2. Diagnosing rheumatoid arthritis with higher accuracyWhen a subject is determined to have rheumatoid arthritis by the test method of the present invention including step (2), rheumatoid arthritis can be diagnosed with higher accuracy by combining the test method of the present invention with a step of applying a doctor's diagnosis of rheumatoid arthritis.In addition, since the test method of the present invention can detect rheumatoid arthritis more accurately, by combining the above steps with the test method of the present invention, it is possible to more efficiently and more accurately diagnose "having rheumatoid arthritis."
3．関節リウマチの治療
工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が関節リウマチに罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．関節リウマチのより高い精度での診断」に記載の様に関節リウマチに罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）関節リウマチに罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に関節リウマチを検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、関節リウマチに罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。 3. Treatment of rheumatoid arthritis When a subject is judged to have rheumatoid arthritis by the test method of the present invention including step (2), or when a subject is diagnosed to have rheumatoid arthritis as described above in "2. Highly accurate diagnosis of rheumatoid arthritis", a step (3) of treating the subject judged or diagnosed to have rheumatoid arthritis can be performed. In addition, since the test method of the present invention can detect rheumatoid arthritis more accurately, a subject suffering from rheumatoid arthritis can be treated more efficiently and more reliably by combining step 3 with the test method of the present invention or the combination of the test method of the present invention and the step of applying a doctor's diagnosis.
関節リウマチの治療方法は、特に制限されないが、代表的には投薬治療が挙げられる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えば抗リウマチ薬、生物学的製剤（バイオ医薬品）、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド（副腎皮質ステロイド）等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。 The method of treating rheumatoid arthritis is not particularly limited, but a representative example is drug therapy. The medicines used in drug therapy are not particularly limited, but examples include antirheumatic drugs, biological preparations (biopharmaceuticals), nonsteroidal anti-inflammatory drugs, steroids (corticosteroids), etc. One, two, or three or more types of medicines can be used in combination.
4．関節リウマチの検査薬
本発明は、その一態様において、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）を含む、関節リウマチの検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 4. Test Agent for Rheumatoid Arthritis In one aspect, the present invention relates to a test agent for rheumatoid arthritis (sometimes referred to as the "test agent of the present invention" in the present specification) comprising a detection agent for at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene. This will be described below.
Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、BN744_01293遺伝子、関節リウマチ等については、上記「1．関節リウマチの検査方法」における定義と同様である。 Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, the BN744_01293 gene, rheumatoid arthritis, etc. are defined as above in "1. Testing methods for rheumatoid arthritis."
本発明の検出剤は、対象バイオマーカーを特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象バイオマーカーである遺伝子、対象バイオマーカーである細菌の遺伝子、又はそれらの発現産物に対するプライマー、プローブ、抗体等が挙げられる。The detection agent of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically detect a target biomarker. Examples of the detection agent include a gene that is a target biomarker, a bacterial gene that is a target biomarker, or a primer, probe, antibody, or the like for an expression product thereof.
本発明の検出剤は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の付加が挙げられる。The detection agent of the present invention may be modified as long as its function is not significantly impaired. Modifications include, for example, the addition of labels such as fluorescent dyes, enzymes, proteins, radioisotopes, chemiluminescent substances, biotin, etc.
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。 The fluorescent dyes used in the present invention are preferably those generally used to label nucleotides for detection and quantification of nucleic acids, such as HEX (4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxylfluorescein, green fluorescent dye), fluorescein, NED (trade name, manufactured by Applied Biosystems, yellow fluorescent dye), 6-FAM (trade name, manufactured by Applied Biosystems, yellow-green fluorescent dye), rhodamin or its derivatives (e.g., tetramethylrhodamine (TMR)), but are not limited thereto. As a method for labeling nucleotides with fluorescent dyes, any suitable known labeling method can be used (see Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)). In addition, commercially available fluorescent labeling kits can also be used (e.g., Oligonucleotide ECL 3'-Oligo Labeling System, manufactured by Amersham Pharmacia, etc.).
本発明の検出剤は、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、検出剤を固定化した基板（例えばプローブを固定化したマイクロアレイチップ等。）の形態として提供することができる。The detection agent of the present invention can also be used by immobilizing it on any solid phase. Therefore, the test agent of the present invention can be provided in the form of a substrate on which the detection agent is immobilized (e.g., a microarray chip on which a probe is immobilized, etc.).
固定化に使用される固相は、ポリヌクレオチド等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。固定方法は、例えばマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。The solid phase used for immobilization is not particularly limited as long as it can immobilize polynucleotides, etc., and examples of such solid phases include glass plates, nylon membranes, microbeads, silicon chips, capillaries, or other substrates. There are no particular limitations on the immobilization of the detection agent to the solid phase. The immobilization method is well known in the art depending on the type of immobilized probe, such as using a commercially available spotter (such as Amersham) for microarrays (e.g., in situ synthesis of oligonucleotides using photolithographic technology (Affymetrix) or inkjet technology (Rosetta Inpharmatics)).
プライマーやプローブ等は、対象バイオマーカーやそれに由来する核酸等を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、対象バイオマーカーが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては対象バイオマーカー若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）が特異的に増幅されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または増幅物が対象バイオマーカーに由来するものであると判断できるものであればよい。There are no particular limitations on the primers, probes, etc., so long as they selectively (specifically) recognize the target biomarker or a nucleic acid derived therefrom. Here, "selectively (specifically) recognize" means, for example, in the Northern blot method, that the target biomarker can be specifically detected, and in the RT-PCR method, that the target biomarker or a nucleic acid derived therefrom (cDNA, etc.) is specifically amplified, but is not limited thereto, and may be anything that enables a person skilled in the art to determine that the detected or amplified product is derived from the target biomarker.
プライマーやプローブの具体例としては、下記（a）に記載するポリヌクレオチド並びに下記（b）に記載するポリヌクレオチド：
（a）対象バイオマーカーが有する塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、並びに
（b）対象バイオマーカーが有する塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
Specific examples of primers and probes include the polynucleotides described in (a) below and the polynucleotides described in (b) below:
The hybridization target may include at least one selected from the group consisting of: (a) a polynucleotide having at least 15 consecutive bases in a base sequence of a target biomarker and/or a polynucleotide complementary to the polynucleotide; and (b) a polynucleotide having at least 15 bases that hybridizes under stringent conditions to a base sequence of a target biomarker or a base sequence complementary thereto.
相補的なポリヌクレオチド又は相補的な塩基配列（相補鎖、逆鎖）とは、対象バイオマーカーの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチド又は塩基配列を意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。A complementary polynucleotide or complementary base sequence (complementary strand, reverse strand) refers to a polynucleotide or base sequence that is complementary to the full-length sequence of a polynucleotide consisting of the base sequence of a target biomarker, or a partial sequence thereof having a base sequence of at least 15 consecutive bases in length (for convenience, these are also referred to as the "positive strand" herein). However, such a complementary strand is not limited to a completely complementary sequence to the base sequence of the positive strand of interest, but may have a complementary relationship to the extent that it can hybridize with the positive strand of interest under stringent conditions. The stringent conditions here can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to which the complex or probe is bound, as taught in Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). For example, washing conditions after hybridization can usually be about "1xSSC, 0.1% SDS, 37°C". It is preferable that the complementary strand maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although not particularly limited, a more stringent hybridization condition can be about "0.5xSSC, 0.1% SDS, 42°C", and an even more stringent hybridization condition can be about "0.1xSSC, 0.1% SDS, 65°C". Specifically, examples of such complementary strands include a strand consisting of a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target positive strand, and a strand consisting of a base sequence that has at least 90%, preferably 95%, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more identity with the strand.
プライマーやプローブ等は、例えば対象バイオマーカーが有する塩基配列をもとに、例えば各種設計プログラムを利用して設計することができる。具体的には前記対象バイオマーカーの塩基配列を設計プログラムにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列を、プライマーまたはプローブとして使用することができる。Primers, probes, etc. can be designed, for example, using various design programs based on the base sequence of the target biomarker. Specifically, a candidate sequence for a primer or probe obtained by applying the base sequence of the target biomarker to a design program, or a sequence that at least partially contains the sequence, can be used as the primer or probe.
プライマーやプローブ等の塩基長は、上述のように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであれば特に制限されず、用途に応じて適宜設定することができる。塩基長としては、例えばプライマーとして用いる場合であれば、例えば15塩基～35塩基が例示でき、例えばプローブとして用いる場合であれば、例えば15塩基～35塩基が例示できる。The base length of primers, probes, etc. is not particularly limited as long as it has a length of at least 15 consecutive bases as described above, and can be set appropriately depending on the application. For example, when used as a primer, the base length can be, for example, 15 to 35 bases, and when used as a probe, the base length can be, for example, 15 to 35 bases.
本発明の検査薬には、本発明の検出剤以外の、他の検出剤（例えば、他の核酸を検出するためのプローブや、抗体等）が含まれていてもよい。この場合の本発明の検査薬は、関節リウマチの他に、他の疾患や状態も検査することができる検査薬であってもよい。この場合、本発明の検出剤は、関節リウマチ検査用の検出剤として含まれている。この観点から、本発明の検査薬は、その一態様において、本発明の検出剤からなる関節リウマチ検査用検出剤を含む、関節リウマチの検査薬である。The test agent of the present invention may contain a detection agent other than the detection agent of the present invention (e.g., a probe for detecting other nucleic acids, an antibody, etc.). In this case, the test agent of the present invention may be a test agent that can test for other diseases or conditions in addition to rheumatoid arthritis. In this case, the detection agent of the present invention is included as a detection agent for testing for rheumatoid arthritis. From this perspective, in one aspect, the test agent of the present invention is a test agent for rheumatoid arthritis that contains a detection agent for testing for rheumatoid arthritis consisting of the detection agent of the present invention.
本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。The test agent of the present invention may be in the form of a composition. The composition may contain other components as necessary. Examples of other components include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, chelating agents, etc.
本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の腸内細菌含有試料における対象バイオマーカーの検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば核酸抽出試薬、緩衝液等）、器具（例えば腸内細菌含有試料の精製、分離用器具）等が挙げられる。The test agent of the present invention may be in the form of a kit. In addition to the detection agent or the composition containing the detection agent, the kit may contain something that can be used to detect the target biomarker in an enterobacteria-containing sample from a subject. Specific examples of such things include various reagents (e.g., nucleic acid extraction reagents, buffer solutions, etc.), tools (e.g., tools for purifying and isolating enterobacteria-containing samples), etc.
5．関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 5. Screening method for an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis In one aspect, the present invention relates to a screening method for an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis (also referred to as the "screening method for the active ingredient of the present invention" in this specification) using as an index the amount or concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal treated with a test substance. This will be described below.
腸内細菌含有試料、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、BN744_01293遺伝子、関節リウマチ、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定等については、上記「1．関節リウマチの検査方法」における定義と同様である。 The definitions for enterobacteria-containing samples, Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, the BN744_01293 gene, rheumatoid arthritis, and measurement of the amount or concentration of target biomarkers are the same as those in "1. Testing method for rheumatoid arthritis" above.
動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられる。The animal species is not particularly limited. Examples of animal species include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits.
被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。 A wide variety of test substances can be used, whether naturally occurring or artificially produced. In addition to purified compounds, compositions containing a mixture of various compounds and animal and plant extracts can also be used. Compounds include not only low molecular weight compounds, but also high molecular weight compounds such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides.
本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分（或いは、関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。More specifically, the method for screening an active ingredient of the present invention includes a step of selecting a test substance as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis (or a candidate substance for an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis) when the biomarker used as an indicator is at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, and the value of the indicator is lower than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal that has not been treated with the test substance.
本発明の有効成分スクリーニング方法は、別の具体例として、指標とするバイオマーカーが、BN744_01293遺伝子（BM2）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分（或いは、関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。As another specific example, when the biomarker used as an indicator is the BN744_01293 gene (BM2), the method for screening an active ingredient of the present invention includes a step of selecting the test substance as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis (or a candidate substance for an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis) if the value of the indicator is higher than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal that has not been treated with the test substance.
対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じ細菌又は遺伝子を意味する。 A corresponding biomarker refers to the same bacterium or gene as the target biomarker that is being used as an indicator.
「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。 "High" means, for example, that the index value is 2, 5, 10, 20, 50, or 100 times the control value.
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。 "Low" means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, or 1/100 of the control value.
6．関節リウマチの誘発性又は増悪性の評価方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、関節リウマチの誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 6. Method for Evaluating Inducibility or Aggravation of Rheumatoid Arthritis In one aspect, the present invention relates to a method for evaluating inducibility or aggravation of rheumatoid arthritis (also referred to as the "toxicity evaluation method of the present invention" in this specification) using as an index the amount or concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal treated with a test substance. This will be described below.
腸内細菌含有試料、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、BN744_01293遺伝子、関節リウマチ、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．関節リウマチの検査方法」及び「6．関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。 The definitions of the enterobacteria-containing sample, Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, BN744_01293 gene, rheumatoid arthritis, measurement of the amount or concentration of the target biomarker, animal species, test substance, etc. are the same as those in "1. Testing method for rheumatoid arthritis" and "6. Screening method for active ingredients of a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis" above.
本発明の毒性評価方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を関節リウマチの誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。More specifically, the toxicity evaluation method of the present invention includes a step of determining that a test substance has an inducing or exacerbating effect on rheumatoid arthritis when the biomarker used as an indicator is at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, and the value of the indicator is higher than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal that has not been treated with the test substance.
本発明の毒性評価方法は、別の具体例として、指標とするバイオマーカーが、BN744_01293遺伝子（BM2）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を関節リウマチの誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。As another specific example, when the biomarker used as an indicator is the BN744_01293 gene (BM2), the toxicity evaluation method of the present invention includes a step of determining that the test substance has the ability to induce or exacerbate rheumatoid arthritis if the value of the indicator is lower than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal that has not been treated with the test substance.
対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じ細菌又は遺伝子を意味する。 A corresponding biomarker refers to the same bacterium or gene as the target biomarker that is being used as an indicator.
「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。 "High" means, for example, that the index value is 2, 5, 10, 20, 50, or 100 times the control value.
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。 "Low" means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, or 1/100 of the control value.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
試験例1．関節リウマチバイオマーカーのスクリーニング
発明者はショットガンシークエンスによって得られる膨大な細菌叢のゲノム情報(メタゲノム)に対して、系統解析、遺伝子解析、及びパスウェイ解析の3つを軸に網羅的な解析を行う独自のパイプラインを構築した。メタゲノム解析パイプラインにおいては、まず、関節リウマチ患者85名（内、抗CCP抗体陰性患者28名）及び健常者42名の糞便サンプルをRNAlaterを溶媒として回収、ビーズ法によって溶菌し、DNAを抽出した。Hiseq3000を用いた150bpのペアエンドシークエンスにより、1サンプルあたり平均13Gbのシークエンスリードを得た。ヒトゲノムや低質なリードを除去し、逸脱値を示した関節リウマチ患者3名を解析から除外した。系統解析として、約8000の細菌・真菌・ウイルスのゲノム配列情報に照合し、各サンプルの持つ微生物の網羅的な組成割合を得た。一方、遺伝子およびパスウェイ解析では、各リードに対してde novo アセンブリを行い、可及的に長鎖の塩基配列（コンティグ）を作成した。コンティグ中の遺伝子をコードしている領域を同定し、サンプル間で類似している領域のクラスタリングを施行した。公共のデータベースに登録された遺伝子や蛋白単位でのアミノ酸配列情報やパスウェイ情報に照合することで、各サンプルに含まれる遺伝子配列の相対量を網羅的に算出した。上記より得た微生物の組成割合、遺伝子の相対量に対してケースコントロール解析を施行し、バイオマーカーとして8個の菌種と1個の遺伝子を同定した（Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、BN744_01293遺伝子（R6FCZ7；UniRefデータベースID）。 Test Example 1. Screening of rheumatoid arthritis biomarkers The inventors constructed a unique pipeline for comprehensive analysis of the vast amount of genomic information (metagenomics) of bacterial flora obtained by shotgun sequencing, focusing on three axes: phylogenetic analysis, genetic analysis, and pathway analysis. In the metagenomic analysis pipeline, fecal samples from 85 rheumatoid arthritis patients (including 28 patients negative for anti-CCP antibodies) and 42 healthy individuals were first collected using RNAlater as a solvent, lysed by the bead method, and DNA was extracted. An average of 13 Gb of sequence reads were obtained per sample by 150 bp paired-end sequencing using Hiseq3000. Human genomes and low-quality reads were removed, and three rheumatoid arthritis patients who showed deviant values were excluded from the analysis. As a phylogenetic analysis, the genome sequence information of approximately 8,000 bacteria, fungi, and viruses was collated to obtain a comprehensive composition ratio of the microorganisms contained in each sample. On the other hand, in the gene and pathway analysis, de novo assembly was performed for each read to create a long base sequence (contig) as much as possible. The gene-coding regions in the contigs were identified, and similar regions between samples were clustered. The relative amount of gene sequences contained in each sample was calculated comprehensively by comparing the amino acid sequence information and pathway information of genes and proteins registered in public databases. A case-control analysis was performed on the microbial composition ratio and relative gene amount obtained above, and eight bacterial species and one gene were identified as biomarkers (Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, BN744_01293 gene (R6FCZ7; UniRef database ID).
図１に菌種量を比較したボルケーノプロットを示す。また、図２に遺伝子量を比較したボルケーノプロットを示す。Figure 1 shows a volcano plot comparing the amount of bacterial species. Figure 2 shows a volcano plot comparing the amount of genes.
バイオマーカーとして同定された8個の菌種について、関節リウマチ群における各菌種の組成比を健常者群における各菌種の組成比で除した値を表１に示す。For the eight bacterial species identified as biomarkers, the composition ratio of each bacterial species in the rheumatoid arthritis group divided by the composition ratio of each bacterial species in the healthy control group is shown in Table 1.
バイオマーカーとして同定された1個の遺伝子について、関節リウマチ群における各菌種の組成比を健常者群における各菌種の組成比で除した値を表２に示す。For one gene identified as a biomarker, the composition ratio of each bacterial species in the rheumatoid arthritis group divided by the composition ratio of each bacterial species in the healthy control group is shown in Table 2.
8個の菌種においては、関節リウマチ患者群で組成割合が有意に高く（各組成比：2.28、18.8、1.81、2.51、1.87、1.44、2.54、1.69）、１個の遺伝子においては患者群で保有量が有意に高かった（保有比：0.40）。これら9個の腸内細菌叢情報を組み合わせることで、100倍以上の高い比率をもって患者群と対照群を区別することが可能となり、関節リウマチの診断に寄与すると考えられる。The composition ratio of eight bacterial species was significantly higher in the rheumatoid arthritis patient group (respective composition ratio: 2.28, 18.8, 1.81, 2.51, 1.87, 1.44, 2.54, 1.69), and the possession amount of one gene was significantly higher in the patient group (possession ratio: 0.40). By combining these nine pieces of gut microbiota information, it is possible to distinguish the patient group from the control group with a ratio more than 100 times higher, which is thought to contribute to the diagnosis of rheumatoid arthritis.
さらに、上記解析結果に基づいて、同定したバイオマーカー全てを組合わせて診断する場合の、全関節リウマチ患者（82名）に対する受信者動作特性（ROC）曲線、及び抗CCP抗体陰性患者（28名）に対するROC曲線を作成した。結果を図３及び４に示す。Furthermore, based on the results of the above analysis, we created a receiver operating characteristic (ROC) curve for all rheumatoid arthritis patients (82 patients) and an ROC curve for anti-CCP antibody-negative patients (28 patients) when diagnosing by combining all the identified biomarkers. The results are shown in Figures 3 and 4.
バイオマーカーを用いた関節リウマチの診断は、感度78%、特異度71%と高精度であることが確認された（図３）。また、これまで診断が困難だった抗CCP抗体陰性患者の診断においても、感度82%、特異度69%と良好な結果を示した（図４）。The diagnosis of rheumatoid arthritis using biomarkers was confirmed to be highly accurate, with a sensitivity of 78% and a specificity of 71% (Figure 3). In addition, good results were obtained in diagnosing anti-CCP antibody-negative patients, who had previously been difficult to diagnose, with a sensitivity of 82% and a specificity of 69% (Figure 4).
Claims (7)
（1）被検体から採取された腸内細菌含有試料における、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、Prevotella amnii、及びBN744_01293遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、
を含み、
検出したバイオマーカーがPrevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）を含む場合、さらに、（2a）前記工程（1）で検出された前記BM1の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含み、
検出したバイオマーカーがBN744_01293遺伝子（BM2）を含む場合、さらに、（2b）前記工程（1）で検出された前記BM2の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含み、又は
検出したバイオマーカーがPrevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）、並びにBN744_01293遺伝子（BM2）を含む場合、さらに、（2c）前記工程（1）で検出された前記BM1の量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ前記工程（1）で検出された前記BM2の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が関節リウマチに罹患していると判定する工程、
を含む、方法。 A method for assisting in testing for rheumatoid arthritis, comprising:
(1) detecting at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from a subject;
Including ,
(2a) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the detected biomarker includes at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, and when the amount or concentration of BM1 detected in the step (1) is equal to or higher than a cutoff value;
Including,
If the detected biomarker contains the BN744_01293 gene (BM2), (2b) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis if the amount or concentration of the BM2 detected in the step (1) is equal to or lower than a cutoff value;
or
When the detected biomarkers include at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene (BM2), (2c) determining that the subject is suffering from rheumatoid arthritis when the amount or concentration of BM1 detected in the step (1) is equal to or higher than a cutoff value and the amount or concentration of BM2 detected in the step (1) is equal to or lower than a cutoff value;
A method comprising :
前記バイオマーカー検出剤が、バイオマーカーである遺伝子に対するプライマー及び／又はプローブ、バイオマーカーである細菌の遺伝子に対するプライマー及び／又はプローブ、バイオマーカーである遺伝子の発現産物に対する抗体、並びにバイオマーカーである細菌の遺伝子の発現産物に対する抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、
関節リウマチの検査薬。 The present invention includes a detection agent for at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene;
the biomarker detection agent is at least one selected from the group consisting of primers and/or probes for genes that are biomarkers, primers and/or probes for bacterial genes that are biomarkers, antibodies for expression products of genes that are biomarkers, and antibodies for expression products of bacterial genes that are biomarkers;
Rheumatoid arthritis test.
前記バイオマーカー検出剤が、バイオマーカーである遺伝子に対するプライマー及び／又はプローブ、バイオマーカーである細菌の遺伝子に対するプライマー及び／又はプローブ、バイオマーカーである遺伝子の発現産物に対する抗体、並びにバイオマーカーである細菌の遺伝子の発現産物に対する抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、
関節リウマチの検査キット。 The present invention includes a detection agent for at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and the BN744_01293 gene;
the biomarker detection agent is at least one selected from the group consisting of primers and/or probes for genes that are biomarkers, primers and/or probes for bacterial genes that are biomarkers, antibodies for expression products of genes that are biomarkers, and antibodies for expression products of bacterial genes that are biomarkers;
Rheumatoid arthritis test kit.
指標とするバイオマーカーが、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分或いはその候補物質として選択する工程を含み、
指標とするバイオマーカーが、BN744_01293遺伝子（BM2）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を関節リウマチの予防又は治療剤の有効成分或いはその候補物質として選択する工程を含む、
スクリーニング方法。 A method for screening an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis, using as an index the amount or concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal treated with a test substance , comprising:
When the biomarker used as an indicator is at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, if the value of the indicator is lower than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an enterobacteria-containing sample collected from an animal not treated with the test substance, the test substance is selected as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or a candidate substance thereof,
and when the biomarker used as an indicator is the BN744_01293 gene (BM2), if the value of the indicator is higher than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an enterobacteria-containing sample collected from an animal not treated with the test substance, the test substance is selected as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or a candidate substance thereof.
Screening methods .
指標とするバイオマーカーが、Prevotella denticola、Gardnerella vaginalis、Porphyromonas somerae、Prevotella marshii、Prevotella disiens、Bacteroides sartorii、Prevotella corporis、及びPrevotella amniiからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を関節リウマチの誘発性又は増悪性があると判定する工程を含み、
指標とするバイオマーカーが、BN744_01293遺伝子（BM2）である場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された腸内細菌含有試料における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を関節リウマチの誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む、
評価方法。 A method for evaluating inducibility or aggravation of rheumatoid arthritis, using as an index the amount or concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, Prevotella amnii, and BN744_01293 gene in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal treated with a test substance, comprising:
When the biomarker used as an indicator is at least one biomarker (BM1) selected from the group consisting of Prevotella denticola, Gardnerella vaginalis, Porphyromonas somerae, Prevotella marshii, Prevotella disiens, Bacteroides sartorii, Prevotella corporis, and Prevotella amnii, the method includes a step of determining that the test substance has an inducing or exacerbating effect on rheumatoid arthritis when the value of the indicator is higher than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an intestinal bacteria-containing sample collected from an animal not treated with the test substance,
When the biomarker used as an indicator is the BN744_01293 gene (BM2), the method includes a step of determining that the test substance has an inducing or exacerbating effect on rheumatoid arthritis when the value of the indicator is lower than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in an enterobacteria-containing sample collected from an animal not treated with the test substance.
Evaluation method .
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