JP7545166B2 - 組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法、システム及び組換えバクミド - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子治療分野に属し、より具体的には、組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法、システム及び組換えバクミドに関する。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、宿主の範囲が広く、免疫原性が低く、安全性が高く、動物体内での外来遺伝子の長期安定発現を媒介できるなどの特徴により、現在、遺伝子治療分野において最も有望なベクターの一つである。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に媒介される最初の遺伝子治療薬が承認されて以来、ＡＡＶベクターの大規模作製技術に対する需要が増えてきた（Ｙｌａ－Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０，１８３１－１８３２，２０１２）。しかし、ｒＡＡＶの大規模生産は、依然としてこのような治療法の開発を制限する要因である。そこで、この課題及び生物安全性の問題を克服するために、昆虫細胞に感染するバキュロウイルスの能力による生産システムが開発された。即ち、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及びＩＴＲコア発現エレメントを提供し、それぞれＴｎ７により組換えして３種類の異なるバキュロウイルスゲノムに導入し、この３種の換えバキュロウイルスを昆虫細胞に共感染させてｒＡＡＶを作製する必要がある（Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ． ２００２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５－１９４３；ＵＳ２００３０１４８５０６；ＵＳ２００４０１９７８９５）。これをもとに、２種類のバキュロウイルスの生産システムに簡素化され、Ｒｅｐ及びＣａｐ発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を１つのバキュロウイルスに統合する（Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ．２００９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１８８８－１８９６）。しかし、２つのバキュロウイルスを細胞に共感染させる効率は低く、それぞれの細胞のエネルギを十分に利用することができない。感染はランダムな過程であるため、核酸を含まないｒＡＡＶ中空粒子が産生されやすく、作製プロセス条件の最適化は複雑で、異なるバッチで作製されたｒＡＡＶの品質は不安定である。

そこで、それをもとに主に細胞系に依存するワンバックシステム、１つのシャトルプラスミドに基づくワンバックシステム及びＤＨ１０Ｂａｃに基づくワンバックシステムを含むワンバックシステム（Ｏｎｅ Ｂａｃ ｓｙｓｔｅｍ）がさらに開発された。パッケージング細胞系に依存するワンバックシステムは、まず、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子の発現を誘導するパッケージング細胞系を構築し、さらに、外来目的遺伝子（ＧＯＩ）を持つＩＴＲコア発現エレメントを統合した組換えバキュロウイルスＢＥＶ－（ＩＴＲ－ＧＯＩ）に感染させた後、細胞系におけるＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子の発現を誘導することでｒＡＡＶを産生する（Ａｓｌａｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０６：５０５９－５０６４）。１つのシャトルプラスミドに基づくワンバックシステムは、ＡＡＶのＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及びＩＴＲコア発現エレメントを一緒に１つのシャトルプラスミド上に構築し、Ｔｎ７トランスポゾンに媒介される組換えによりシャトルプラスミドが持つｒＡＡＶパッケージングエレメントを１つのバキュロウイルスゲノムに統合し、さらに、この組換えバキュロウイルスを宿主細胞に感染させることでｒＡＡＶを産生する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８Ｊｕｌ４；１０：３８－４７．）。ＤＨ１０Ｂａｃに基づくワンバックシステムは、ＡＡＶのＣａｐ遺伝子及びＲｅｐ遺伝子をＤＨ１０Ｂａｃにおけるバキュロウイルスゲノム（Ｂａｃｍｉｄ）に統合し、Ｔｎ７トランスポゾンに媒介される組換えによりＩＴＲコアエレメント、Ｃａｐ遺伝子及びＲｅｐ遺伝子を含む組換えＢａｃｍｉｄが得られ、この組換えバキュロウイルス（ＢＥＶ）を宿主細胞に感染させることでｒＡＡＶを産生する（呉陽ら、ＣＮ２０１８１１６１８５４２）。

しかしながら、上述したバキュロウイルスシステムは、全てＴｎ７組換えによりＩＴＲコアエレメントを非必須遺伝子であるＰｏｌｈ遺伝子の遺伝子座に挿入し、Ｒｅｐ及びＣａｐ発現カセットは、Ｔｎ７組換え又はＲｅｄ組換えによりｐｏｌｈ遺伝子の遺伝子座又はいくつかの他の非必須遺伝子の遺伝子座に導入される。バキュロウイルスの継代過程において、Ｔｎ７配列又は非必須遺伝子が欠失しやすい問題により、産生したＢＥＶの継代安定性が悪いため、安定性に対する要求が高い大規模なバッチ生産及び応用に適していない。そのため、遺伝子治療ベクター薬物の生産には、まだ改善の余地がある。

従来技術の欠陥及び改善需要に対して、本発明によれば、組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法、システム及び組換えバクミドが提供される。組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメント（Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩ）のうちの少なくとも１種を組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子のＮ末端又はＣ末端に挿入することにより、従来技術ではこの必須機能エレメントを組換えバキュロウイルスゲノムの非必須遺伝子座に挿入した結果、バキュロウイルスの継代過程において外来遺伝子が欠失しやすいことからＢＥＶの継代安定性が悪いという問題が解決される。

上記の目的を達成するために、本発明によれば、以下のステップ（１）、（２）を含む組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法が提供される。
ステップ（１）：組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを構築し、前記組換えバキュロウイルスゲノムは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含み、前記必須機能エレメントは、Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含み、
ステップ（２）：ステップ（１）で得られた組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを宿主細胞系にトランスフェクションして培養し、
前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。

好ましくは、前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つが前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入されることは、前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つが前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子発現カセットの３ｋｂ範囲内に位置する。

好ましくは、前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、必須遺伝子発現カセットの１．５ｋｂ範囲内に位置する。

好ましくは、ステップ（１）において、具体的には、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む相同組換えベクターを構築し、或いは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む相同組換えベクター及びシャトルプラスミドを構築し、相同組換えの方法により、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する３つの必須機能エレメントを組換えバキュロウイルスゲノムを含む同一の組換えバクミドに統合することで、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られ、
前記相同組換えベクターは、バキュロウイルスを標的とする必須遺伝子を含み、かつこのベクターは、Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩのうちの少なくとも１種を含む。

好ましくは、残りの必須機能エレメントは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの非必須遺伝子の遺伝子座に挿入される。

好ましくは、前記バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座は、Ａｃ６、Ａｃ９、Ａｃ１０、Ａｃ１７、Ａｃ６６、Ａｃ１０９、Ａｃ１３９、Ａｃ１３５、Ａｃ９８、Ａｃ１４７及びＡｃ１２８から選択される。

好ましくは、前記バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子的遺伝子座は、Ａｃ１３５、Ａｃ９８（３８Ｋ）、Ａｃ１４７（ＩＥ１）及びＡｃ１２８（ＧＰ６４）から選択される。

好ましくは、前記Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つの必須遺伝子の遺伝子座のＣ末端に挿入され、前記外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つの非必須遺伝子の遺伝子座に挿入される。

好ましくは、前記Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入され、前記外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩは、前記組換えバキュロウイルスゲノムのもう１つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。

好ましくは、前記Ｃａｐ遺伝子の遺伝子配列は、リボソームリークスキャンによりコドン最適化した配列である。

好ましくは、前記Ｃａｐ遺伝子の遺伝子配列は、配列番号１に示される配列である。

好ましくは、前記Ｒｅｐ遺伝子の遺伝子配列は、リボソームリークスキャンによりコドン最適化した配列である。

好ましくは、前記Ｒｅｐ遺伝子の遺伝子配列は、配列番号２に示される配列である。

好ましくは、前記コア発現エレメントＩＴＲ遺伝子配列は、配列番号３に示される配列である。

好ましくは、ステップ（１）は、具体的に以下のサブステップを含み、
ステップ（１－１）：Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び、外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含む１つ又は複数の相同組換えベクターを構築し、
ステップ（１－２）：ステップ（１－１）で得られた１つ又は複数の相同組換えベクターによりＣａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを統合して組換えバキュロウイルスゲノムの１つ又は複数の必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入することで、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する全ての必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られる。

好ましくは、ステップ（１）は、具体的に以下のステップを含み、
ステップ（１－１）：前記必須機能エレメントのうちの１つ又は２つを含む相同組換えベクターを構築し、次にＲｅｄ相同組換えによりこの相同組換えベクターにおけるＡＡＶ必須機能エレメントをバキュロウイルスゲノムの１つ又は２つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入し、
ステップ（１－２）：残りの必須機能エレメントを含むシャトルプラスミドを構築し、
ステップ（１－３）：シャトルプラスミドに媒介されるＴｎ７組換えによりＣａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを１つのバキュロウイルスゲノムに統合することで、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する全ての必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られる。

本発明の別の態様によれば、組換えアデノ随伴ウイルスを作製するための組換えバクミドであって、前記組換えバクミドは、組換えバキュロウイルスゲノムを含み、前記組換えバキュロウイルスゲノムは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含み、前記必須機能エレメントは、Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含み、前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される組換えアデノ随伴ウイルスを作製するための組換えバクミドが提供される。

本発明の別の態様によれば、前記組換えバクミド組換えアデノ随伴ウイルス的作製システムが提供される。

本発明は、上記の技術的手段によれば、従来技術に比べて以下の有益な効果を有する。
（１）本発明で提供されるｒＡＡＶの作製方法では、組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメント（Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩ）のうちの少なくとも１種を組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子のＮ末端又はＣ末端に挿入することにより、この必須遺伝子の発現に影響を与えることがなく、従来技術ではｒＡＡＶ必須機能エレメントを組換えバキュロウイルスゲノムの非必須遺伝子座に挿入した結果、バキュロウイルスの継代過程において外来遺伝子が欠失しやすいことから産生したＢＥＶの継代安定性が悪いという技術的問題が解決される。安定性は、バキュロウイルス作製ＡＡＶシステムの大規模生産（例えば、２０００Ｌの規模）を制限する要因であり、ＢＥＶの継代安定の問題を解決して、ＡＡＶの大規模作製を可能にする。

（２）本発明で提供されるｒＡＡＶを生産する必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドでは、ＩＴＲ－ＧＯＩ、Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子のうちの１つ又は複数が組換えバキュロウイルスゲノムの１つ又は複数の必須遺伝子のＮ末端又はＣ末端に位置することにより、前記ｒＡＡＶを生産する全ての機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスの継代安定性及びｒＡＡＶ収量が向上し、従来のｒＡＡＶのバキュロウイルス作製システムに対して適合性が良好で、作製される組換えバキュロウイルスＢＥＶ全体の安定性が顕著に向上する。

（３）本発明の好ましい実施例において、組換えアデノ随伴ウイルスを生産する３つの必須遺伝子エレメントを全て組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子座の一端に挿入することにより、組換えバキュロウイルスの継代安定性及び組換えアデノ随伴ウイルスの収率が大幅に向上する。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルスの作製のフローチャートである。 本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルスの必須機能エレメント発現カセットの模式図である。 実施例１で構築された ＡＣ２０－３１３ ＢＥＶの各世代の安定性を示す。 実施例１の９ＫＣ－１４２Ａ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。 実施例１で構築されたＡＣ２０－３１３の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。 実施例１の９ＫＣ－１４２Ａの異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。 実施例１で構築されたＡＣ２０－３１３のＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。 実施例２のＡｃ－１４１－１７５ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。 実施例２の９ＫＣ－３１３ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。 実施例２のＡｃ－１４１－１７５の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。 実施例２の９ＫＣ－３１３異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。 実施例２のＡｃ－１４１－１７５のＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。 実施例３のＡｃ－１４１－１６３ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。 実施例３のＡｃ－１４１－１６３の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。 実施例３のＡｃ－１４１－１６３のＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。 実施例４のＡｃ－１４１－１６２ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。 実施例４のＡｃ－１４１－１６２の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。 実施例４のＡｃ－１４１－１６２ｖｓ９ｋｃ－３１３パッケージング率を示す。 Ａｃ－１４１－１６０及びＡｃ－１４１－１６２ ＢＥＶが産生したｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。

本発明の目的、技術的手段及び利点をより明確にするために、以下、図面及び実施例により本発明をさらに詳しく説明する。以下の具体的な実施例は本発明を解釈するためのものであり、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。

バキュロウイルスオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ゲノムは、全長が約１３４ｋｂであり、約１５６個のオープンリーディングフレームを有する。これらの遺伝子の中で、６２個の遺伝子は（可能な）非必須遺伝子に分類される。既知のバキュロウイルスシステムでは、全てＡＡＶのＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及びＩＴＲコア発現エレメントをそれぞれ又は一緒にＰｏｌｈ、Ｃｈｉａ、Ｃａｔｈ、ｅｇｔ、ｐ１０、ｃｔｘなどの非必須遺伝子座に挿入するため、バキュロウイルスの継代過程において外来遺伝子が欠失しやすいことで、産生したＢＥＶの継代安定性が悪い。残りの９４個は、細胞培養増殖の必須遺伝子であると考えられており、そのうちのいくつかは、バキュロウイルスヌクレオカプシドに関連するタンパク質、例えば、Ａｃ１００（Ｐ６．９）、Ａｃ８９（ＶＰ３９ ｃａｐｓｉｄ）、Ａｃ８０（ＧＰ４１ ｔｅｇｕｍｅｎｔ）、Ａｃ９８（３８Ｋ）、Ａｃ１４２、Ａｃ１４４、Ａｃ９２（Ｐ３３）、Ａｃ５４（ＶＰ１０５４）、Ａｃ７７（ＶＬＦ－１）、Ａｃ１０４（ＶＰ８０）、Ａｃ９（ＰＰ７８／８３）であり、これらの遺伝子が欠失又は変異すると、バキュロウイルスは安定して存在できなくなる。いくつかは、バキュロウイルスのエンベロープタンパク質、例えば、Ａｃ９４（ＯＤＶ－Ｅ２５）、Ａｃ１０９（ＯＤＶ－ＥＣ４３）、Ａｃ１４３（ＯＤＶ－Ｅ１８）であり、これらの遺伝子が欠失すると、バキュロウイルスは安定して存在できなくなる。いくつかは、ＢＶの収量に関連するタンパク質、例えば、Ａｃ１７、Ａｃ３４、Ａｃ３６、Ａｃ３８、Ａｃ１３９、Ａｃ１５３であり、これらの遺伝子が欠失すると、バキュロウイルスのＢＶ力価は１／１００～１／１０００まで低下してしまう。これらの必須遺伝子は、バキュロウイルスの継代過程において比較的安定し、欠失しにくい。

本発明で提供される組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法は、図１に示すように、以下のステップを含む。
ステップ（１）：組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを構築する。前記組換えバキュロウイルスゲノムは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを産生する必須機能エレメントを含み、前記必須機能エレメントは、Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含む。
（２）ステップ（１）で得られた、組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを宿主細胞系にトランスフェクションして培養する。

前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。本発明に記載の必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端とは、前記必須機能エレメントが組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子発現カセットの３ｋｂ範囲内、好ましくは、必須遺伝子発現カセットの１．５ｋｂ範囲内に位置することを指す。

いくつかの実施例において、ステップ（１）では、具体的に、前記組換えアデノ随伴ウイルスを産生する必須機能エレメントを含む相同組換えベクターを構築し、又は前記組換えアデノ随伴ウイルスを産生する必須機能エレメントを含む相同組換えベクター及びシャトルプラスミドを構築し、相同組換え方法により前記組換えアデノ随伴ウイルスを産生する３つの必須機能エレメントを組換えバキュロウイルスゲノムを含む同一の組換えバクミドに統合し、前記組換えアデノ随伴ウイルスを産生する必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得る。前記相同組換えベクターは、バキュロウイルスを標的とする必須遺伝子を含み、このベクターは、Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩのうちの少なくとも１種を持っている。

いくつかの実施例において、前記相同組換えはＲｅｄ組換え及び／又はＴｎ７相同組換えである。

Ｔｎ７トランスポゾンに媒介される組換えは、外来遺伝子を組換えバキュロウイルスゲノム上に高速かつ効率的で構築する方法である。組換えバキュロウイルスゲノムにＴｎ７トランスポゾン認識配列を導入する必要がある。また、複数の異なる位置で同時に又は複数回で組換えすることに適していない。現在、組換えバキュロウイルスゲノムに対する効率的な改造は、依然として比較的複雑で煩雑な作業である。

Ｒｅｄ組換えは、細菌レベルの効率的な組換え方法であり、大腸菌（ＤＨ１０Ｂａｃ）での組換えバキュロウイルスゲノムに対する高速改造に適用できる。Ｒｅｄ組換えは、λファージＲｅｄ組換え酵素（Ｅｘｏ、Ｂｅｔａ及びＧａｍの３種類のタンパク質からなる）により将導入細胞におけるホモロジーアームを持つ線形ＤＮＡ断片及びゲノムの特定の標的配列に対して相同組換えを行い、目的遺伝子の置換を実現する方法である（Ｄｏｕｂｌｅｔｅｔ ａｌ．２００８，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．，７５（２）：３５９－６１）。組換え体のスクリーニングを容易にするために、両側にＦＲＴ配列を有するクロラムフェニコール（Ｃｈｏｌ）耐性遺伝子発現カセット（配列番号１）又は両側にＦＲＴ配列を有するゲンタマイシン（Ｇｅｎ）耐性遺伝子発現カセット（配列番号２）を導入し、これによって、後でｐＣＰ２０プラスミド（温度感受性プラスミド；Ｆｌｐ組換え酵素を発現する）によりこの耐性遺伝子を容易に除去することができ、バクミドゲノムにおいてこの耐性遺伝子により一連の遺伝子欠失又は挿入を数回続けて行うことに適用できる。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法において、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントのうちの１つ、２つ又は３つを前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入し、必須遺伝子の遺伝子座がバキュロウイルスの継代中で欠失しにくいという特性により、バキュロウイルスの継代安定性を向上させ、これによって、組換えアデノ随伴ウイルスの全体作製安定性及び作製収量を向上させることができる。必須機能エレメントが全部で前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座に挿入されない場合、残りの必須機能エレメントを前記組換えバキュロウイルスゲノムの非必須遺伝子の遺伝子座に挿入してもよい。好ましくは、３つの必須機能エレメントを全て組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入する。

本発明に記載のバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子は、バキュロウイルスゲノムから不活性化又は除去されると、昆虫細胞培養物でのバキュロウイルスの増殖能力及び（又は）安定存在に大きく影響する遺伝子として定義される。いくつかの実施例において、前記バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座は、Ａｃ６（３０８９．．３７２１）、Ａｃ１７（１３７３８．．１４２３２）、Ａｃ９（５２８７．．６９１８）、Ａｃ６６（５５２９２．．５７７１８）、Ａｃ１０９（９４７２１．．９５８９３）、Ａｃ９８（８５０２１．．８５９８３）、Ａｃ１３９（１２１２０５．．１２２５５４）、Ａｃ１３５（１１６４９２．．１１７３９１）、Ａｃ１０（６９１７．．７７３５）、ＩＥ１（１２７１９８．．１２８９４６）及びＧＰ６４（１０８１７９．．１０９７１７）から選択される。ＩＥ１は、Ａｃ１４７であり、ＧＰ６４は、Ａｃ１２８である。

本発明の実施例において、ＡＡＶパッケージングエレメントをＡｃ１３５、Ａｃ９８（３８Ｋ）、Ａｃ１４７（ＩＥ１）及びＡｃ１２８（ＧＰ６４）の４つの必須遺伝子のＣ末端に挿入する。従来のＴｎ７組換えにより組換えバクミドを作製して得られた組換えバキュロウイルスと比較して、Ｃａｐ、Ｒｅｐ及びＩＴＲコアエレメントをバキュロウイルスの必須遺伝子のＣ末端に挿入して得られた組換えバキュロウイルスは、細胞中で連続継代した後のｒＡＡＶの生産レベルはより安定し、ｒＡＡＶ収率はより高い。しかし、ＡＡＶパッケージングエレメントをバキュロウイルスの必須遺伝子Ａｃ８０（ＧＰ４１）及びＡｃ１５３のＣ末端に挿入して得られた組換えバキュロウイルスは、細胞中で連続継代した後のｒＡＡＶの生産レベルは急激に低下する。ＡＡＶパッケージングエレメントをバキュロウイルスの必須遺伝子Ａｃ８０（ＧＰ４１）及びＡｃ１５３のＣ末端に挿入することで、下流の必須遺伝子Ａｃ７９及びＡｃ１５４遺伝子のプロモーター領域が破壊され、Ａｃ７９及びＡｃ１５４遺伝子の発現に影響を与え、得られた組換えバキュロウイルスが細胞中で連続継代した後のｒＡＡＶの生産レベルは急激に低下するためであると推測されている。そのため、ＡＡＶパッケージングエレメントをバキュロウイルスの必須遺伝子のＮ末端又はＣ末端に挿入しても上下流の必須遺伝子の発現に影響を与えなければよいと推測されている。バキュロウイルスの必須遺伝子は、Ａｃ６、Ａｃ９、Ａｃ１０、Ａｃ１７、Ａｃ６６、Ａｃ１０９及びＡｃ１３９遺伝子座から選択されてもよい。

本発明に記載の組換えバキュロウイルスゲノムの非必須遺伝子の遺伝子座は、Ｃｈｉａ、Ｃａｔｈ、Ａｃ１２４、ｐ１０、ｐ２６、ｐ７４、ｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｇｐ３７、ｉａｐ２及びｏｄｖ－ｅ５６から選択される１つ又は複数である。好ましくは、非必須遺伝子の遺伝子座はＣｈｉａ及び／又はＣａｔｈである。

いくつかの実施例において、前記Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。前記外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つの非必須遺伝子の遺伝子座、又はこの非必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端若しくはＣ末端に挿入される。

別の実施例において、前記Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。前記外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの別の必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。

好ましい実施例において、前記ｒＡＡＶの作製方法では、前記Ｃａｐ遺伝子発現カセットにおけるＣａｐ遺伝子の配列は、リボソームリークスキャンに基づいてコドン最適化を行った配列であり、好ましくは、配列番号３に示される配列である。前記Ｒｅｐ遺伝子発現カセットにおけるＲｅｐ遺伝子の配列は、リボソームリークスキャンに基づいてコドン最適化を行った配列であり、好ましくは、配列番号４に示される配列である。前記コア発現エレメントＩＴＲ遺伝子の配列は、好ましくは配列番号５に示される配列である。

本発明に記載の組換えバクミドは、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶのゲノムに由来し、ｒＡＡＶの生産に必須なＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子及びＲｅｐ遺伝子の発現カセットを含む。アデノ随伴ウイルスの生産に必須な機能タンパク質成分の発現カセットは、Ｐ１０又はＰＨプロモーターによって制御されるようにその下流に位置する（図２）。

いくつかの実施例において、ステップ（１）は、具体的に以下のサブステップを含む。
（１－１）Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含む１つ又は複数の相同組換えベクターを構築する。
（１－２）ステップ（１－１）で得られた１つ又は複数の相同組換えベクターにより、Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを統合し、組換えバキュロウイルスゲノムの１つ又は複数の必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入し、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する全ての必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得る。

いくつかの実施例において、ステップ（１－２）では、ステップ（１－１）で得られた１つ又は複数の相同組換えベクターにより、Ｒｅｄ相同組換えによりＣａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを前記組換えバキュロウイルスゲノムの１つ又は複数の必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入して統合する。

各構造において、ベクターは、ウイルス、例えば、バキュロウイルスに由来の配列を含み、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）が挙げられるが、これに限定されない。

いくつかの実施例において、まず、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）及びＲｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を含む相同組換えベクター、並びに外来目的遺伝子（ＧＯＩ）を持つＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含む相同組換えベクターをそれぞれ構築する。そして、１回目の相同組換えによりＣａｐ、Ｒｅｐ発現カセットをバキュロウイルスゲノムの１つの必須遺伝子の遺伝子座発現カセットのＮ末端又はＣ末端に統合する。次に、２回目の相同組換えによりＩＴＲ－ＧＯＩを前記バキュロウイルスゲノムの別の必須遺伝子座発現カセットのＮ末端又はＣ末端に統合し、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得る。

いくつかの実施例において、Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットを含む相同組換えベクターをＤＨ１０Ｂａｃ／ｐＫＤ４６エレクトロコンピテントセルにエレクトロポレーションすることにより、Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットを含むＤＨ１０Ｂａｃ菌株が得られる。前記Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットをバキュロウイルスゲノムの１つの必須遺伝子発現カセットのＮ末端又はＣ末端に挿入する。そして外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含む相同組換えベクターを前記Ｃａｐ遺伝子発現カセット及びＲｅｐ遺伝子発現カセットを含むＤＨ１０Ｂａｃ菌株にエレクトロポレーションすることにより、外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩをバキュロウイルスゲノムの別の必須遺伝子発現カセットのＮ末端又はＣ末端に挿入し、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られる。

別の実施例において、ステップ（１）は、具体的に以下のステップを含む。
（１－１）前記必須機能エレメントのうちの１つ又は２つを含む相同組換えベクターを構築し、そして、Ｒｅｄ相同組換えにより大腸菌中でこの相同組換えベクターにおける必須機能エレメントをバキュロウイルスゲノムの１つ又は２つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入する。
（１－２）残りの必須機能エレメントを含むシャトルプラスミドを構築する。
（１－３）シャトルプラスミドに媒介されるＴｎ７組換えによりＣａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを１つのバキュロウイルスゲノムに統合し、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する全ての必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得る。

いくつかの実施例において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）及びＲｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を含む相同組換えベクター、並びに外来目的遺伝子（ＧＯＩ）を持つＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含むシャトルベクターを構築し、そしてＲｅｄ相同組換えによりＣａｐ、Ｒｅｐ発現カセットをバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入し、次にＴｎ７組換えによりシャトルベクター中的ＩＴＲ－ＧＯＩを前記バキュロウイルスゲノムにおけるａｔｔＴｎ７部位に挿入し、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得る。

いくつかの実施例において、まず、外来目的遺伝子（ＧＯＩ）を持つＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含む相同組換えベクター、並びにｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）及びＲｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を含むシャトルベクターを構築し、そして、Ｒｅｄ相同組換えによりＩＴＲ－ＧＯＩをバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入し、次にＴｎ７組換えによりシャトルベクターにおけるＣａｐ、Ｒｅｐ発現カセットを前記バキュロウイルスゲノムにおけるａｔｔＴｎ７部位に挿入し、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得る。

いくつかの実施例において、前記シャトルプラスミドは、ｐｆａｓｔ．Ｂａｃ．Ｄｕａｌプラスミドに基づき、アデノ随伴ウイルスのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子の発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩコア発現エレメントの１つ又は２つの遺伝子を含む。

いくつかの実施例において、前記組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドは、ＡｃＭＮＰＶ Ｅ２（ゲノム配列：Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＫＭ６６７９４０．１）、ＡｃＭＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ（ｂＭＯＮ１４２７２）の構造参考文献（Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９３．６７（８）：４５６６－７９．）に由来する。

ｒＡＡＶのパッケージングには、主にｒＡＡＶのゲノム、即ち、ＩＴＲコア発現エレメント、ＡＡＶのＲｅｐ機能遺伝子、及びＡＡＶのＣａｐ機能遺伝子の３種類の必須機能エレメントが必要である。また、ＡＡＰなどの他の機能タンパク質成分をさらに含んでもよい。ＡＡＰ遺伝子は、パッケージング効率の向上を促進する作用を有する。したがって、組換えアデノ随伴ウイルスのパッケージング効率をさらに向上させるために、必須機能エレメント以外の他の機能タンパク質成分、例えば、ＡＰＰなどを組換えバクミドに統合し、具体的に組換えバクミドゲノムの非必須遺伝子の遺伝子座又は必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端若しくはＣ末端に挿入することができる。

既存のほとんどのｒＡＡＶ作製バキュロウイルスシステムにおいて、外来遺伝子（ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子又はＩＴＲコア発現エレメント）を持つ組換えバキュロウイルスは、いずれもバキュロウイルスの非必須遺伝子の多角体遺伝子（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ，ｐｏｌｈ）部位に挿入されたものを採用する。組換えバキュロウイルスの構築を容易にするために、通常、市販されているＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃシステムを使用している。Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃシステムの原理は以下のとおりである。まず、外来遺伝子をシャトルプラスミド中に構築し、次に、組換えシャトルプラスミドを組換えバクミドを含む大腸菌に形質転換し、Ｔｎ７トランスポゾンに媒介される細菌レベルの組換えにより組換えシャトルプラスミドが持つ外来遺伝子を組換えバクミドに統合する。そして、前記大腸菌から抽出した組換えバクミドＤＮＡを昆虫細胞にトランスフェクションした後、外来遺伝子を持つ組換えバキュロウイルスＢＥＶをレスキューする。このシステムのように大腸菌中で複製増殖できるとともに昆虫細胞中で複製し、パッケージングにより組換えバキュロウイルスを産生できる高分子環状ＤＮＡは、バクミド（Ｂａｃｍｉｄ）と呼ばれる。バクミドは、細菌の複製起点、抗生物質耐性遺伝子、組換えバキュロウイルスゲノム及びＴｎ７組換えクローニング部位を持っている。このシステムの最初の開発者Ｌｕｃｋｏｗらは、多角体遺伝子（ｐｏｌｈ）部位をＴｎ７組換えクローニング部位として選択した（Ｌｕｃｋｏｗｅｔ ａｌ．１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）：４５６６－４５７９）。

ｒＡＡＶに必須な機能タンパク質成分の発現カセットであるＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子の遺伝子発現カセットをｃｔｘ、ｅｇｔ、３９ｋ、ｏｒｆ５１、ｐｇ３７、ｉａｐ２、ｏｄｖ－ｅ５６（Ｎｏａｄ等，２００９ ，ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１０：８７）などの非必須遺伝子座に挿入することも提案されている（ＣＮ２０１８１１６１８５４２；ＣＮ２０１２８００４６２５９）。バキュロウイルスゲノムには、複数の複製起点が存在する。バキュロウイルスの増殖過程において、そのゲノムは複数の起点で複製する形式により複製し、ＢＥＶは、複数回継代した後に一部の非必須遺伝子が欠失する。そのため、外来遺伝子を非必須遺伝子座に挿入して得られたＢＥＶの継代安定性が悪く、目的遺伝子が欠失しやすい。また、現在、全てのバキュロウイルスシステムはいずれもＴｎ７組換えによりＩＴＲコア発現エレメントを挿入する。そうすると、組換えバキュロウイルスゲノムに一対のＴｎ７トランスポゾン認識配列を導入する必要がある。しかし、バキュロウイルスの継代過程において、Ｔｎ７は不安定で失われやすいことから、得られたＢＥＶの継代安定性が悪いため、安定性に対する要求が高い大規模なバッチ生産及び応用に適していない。そのため、遺伝子治療ベクター薬物の生産には、まだ改善の余地がある。

本発明で提供される前記ｒＡＡＶを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドは、ＩＴＲ－ＧＯＩ、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子のうちの少なくとも１つが必須遺伝子のＮ末端又はＣ末端に付加されるため、作製される組換えバキュロウイルスＢＥＶの全体の安定性が顕著に向上する。

本発明では、得られたｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを宿主細胞系にトランスフェクションして培養することにより組換えバキュロウイルスを得る。具体的には、得られた組換えバクミドを対応の宿主細胞系にトランスフェクションした後、前記ｒＡＡＶを作製する。以下の方式を含むが、これらに限定されない。
抽出とトランスフェクション：キッチにより大腸菌から前記組換えバクミドＤＮＡを抽出して精製し、さらに宿主細胞系にトランスフェクションする。
直接感染：前記組換えバクミドを宿主細胞系にトランスフェクションして組換えバキュロウイルスＢＥＶを取得し、さらにＢＥＶを対応の宿主細胞系に直接感染させる。

本発明に記載のバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドは、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分の発現カセット及びＩＴＲコアエレメント発現カセットを含む。いくつかの実施例において、前記バキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドは、Ｃｈｉａ遺伝子及びＣａｔｈ遺伝子（ＣＣと略称）が欠失したバキュロウイルスである。前記ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分の発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットは、前記組換えバクミドの必須遺伝子Ａｃ１３５、Ａｃ９８（３８Ｋ）、Ａｃ１４７（ＩＥ１）、Ａｃ１２８（ＧＰ６４）、Ａｃ６、Ａｃ９、Ａｃ１０、Ａｃ１７、Ａｃ６６、Ａｃ１０９及びＡｃ１３９から選択される１つ又は複数の遺伝子座に挿入される。

本発明によれば、組換えアデノ随伴ウイルスを作製するための組換えバクミドがさらに提供される。この組換えバクミドは、組換えバキュロウイルスゲノムを含む。この組換えバキュロウイルスゲノムは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む。前記必須機能エレメントは、Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含む。前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入される。

本発明によれば、前記組換えバクミドを含む組換えアデノ随伴ウイルスの作製システムがさらに提供される。

以下、実施例を挙げる。
実施例１
ＤＨ１０Ｂａｃ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（Ａｃ１３５）－Ｔｎ７（ＩＴＲ－ＧＯＩ）によりｒＡＡＶを作製した。

本実施例は、１つの相同組換えベクター及びシャトルベクターを含む。相同組換えベクターは、必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子を標的とし、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分の発現カセット、Ｃｈｏｌ発現カセット及びＥＴＬ－ＥＧＦＰ発現カセットを含む。Ｃｈｏｌ発現カセットは、Ｒｅｄ相同組換え陽性クローンのスクリーニング標識であり、ＥＴＬ－ＥＧＦＰ発現カセットは、ＢＥＶのＴＣＩＤ_５０力価測定に使用され、シャトルベクターは、ｒＡＡＶのコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットを含む。

本実施例で提供されるｒＡＡＶ作製システムによりｒＡＡＶを作製する方法は、以下ステップを含む。
１．１ ＡＡＶ前記必須機能エレメントＣａｐ及びＲｅｐ遺伝子発現カセットを含む相同組換えベクターを構築し、そして、Ｒｅｄ相同組換えにより大腸菌中でこの相同組換えベクターにおける必須機能エレメントをバキュロウイルスゲノムの１つ又は２つの必須遺伝子の遺伝子座のＣ末端に挿入する。具体的なステップは以下のとおりである。

１．１．１ ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を含み、必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。まず、野生型ＡｃＭＮＰＶバクミドＤＮＡをテンプレートとしてプライマー（ＨＡＬ（１３５）－Ｆ：ａｇｔｔａｔｔｇｔｇｃｃｇｔｔｔｇｃｔｃａ及びＨＡＬ（１３５）－Ｒ：ｔｔａｔｔｔａａｔｔｇｔｇｔｔｔａａｔａｔｔａｃａ）を用いて上流ホモロジーアーム断片ＨＡＬ（Ａｃ１３５）（配列番号６）を増幅し、プライマー（ＨＡＲ（１３５）－Ｆ：ｔｃａｔｔｔｇｔｔｔｔｔａａａａｔｔｇａ及びＨＡＲ（１３５）－Ｒ：ｔｔｇａａａａａｃａａａｔｇａｃａｔｃａｔｃｔ）を用いて下流ホモロジーアーム断片ＨＡＲ（Ａｃ１３５）（配列番号７）を増幅した。

１．１．２ そして、上流ホモロジーアーム、下流ホモロジーアーム、クロラムフェニコール耐性遺伝子発現カセット（Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｌｏ－Ｐ２）、Ｃａｐ９遺伝子発現カセット（Ｐ１０－Ｃａｐ９－ＰＡ）、Ｒｅｐ２遺伝子発現カセット（ＰＨ－Ｃａｐ９－ＰＡ）これらのＤＮＡ断片を一緒にｐＵＣ５７ベクター上にクローンし、Ａｃ１３５遺伝子を標的とする相同組換えベクターｐＵＣ５７－ＨＡＬ（Ａｃ１３５）－Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｏｌ－Ｐ２－ＥＴＬ－ＥＧＦＰ－ＰＡ－Ｃａｐ９ＫＣ－Ｒｅｐ２－ＨＡＲ（Ａｃ１３５）を得た。

１．１．３ ステップ１．１．２で得られた相同組換えベクターを制限酵素ＰｍｅＩ及びＡｖｒＩＩにより二重消化し、線形ＤＮＡ断片ＨＡＬ（Ａｃ１３５）－Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｏｌ－Ｐ２－ＥＴＬ－ＥＧＦＰ－ＰＡ－Ｃａｐ９ＫＣ－Ｒｅｐ２－ＨＡＲ（Ａｃ１３５）を回収した。そして、このＤＮＡ断片をＤＨ１０Ｂａｃ／ｐＫＤ４６コンピテントセルにエレクトロポレーションし、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールに耐性があるＬＢプレートに塗布した。逆さまにして３７℃で４８時間培養した後、青色コロニーを選択してシェイクした。バクミドＤＮＡを少量抽出してＰＣＲ同定し、陽性クローンをスクリーニングし、シーケンシングして検証した。スクリーニングした陽性菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｏｌ－Ｐ２－ＥＴＬ－ＥＧＦＰ－ＰＡ－Ｃａｐ９ＫＣ－Ｒｅｐ２（Ａｃ１３５）と命名した。この菌株のうち、Ｒｅｐ、Ｃａｐ発現カセットは、バキュロウイルスの必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子のＣ末端の２６２５ｂｐに位置する。

１．２ ＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含むシャトルベクターを構築した。本実施例において、ＩＴＲコア発現エレメントは、赤色蛍光タンパク質（ｍｃｈｅｒｒｙ）発現カセットを用いた。即ち、ｍｉｎｉＥｆ１ａプロモーターによりｍｃｈｅｒｒｙの発現を制御し、ｒＡＡＶの活性の検出を容易にし、ＩＴＲ及び赤色蛍光タンパク質発現カセット（ＧＯＩ）をシャトルベクターｐＦａｓｔＤｕａｌ上に構築した。

１．３ 前記１．２ステップで構築されたシャトルベクターをＤＨ１０Ｂａｃ－Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｏｌ－Ｐ２－ＥＴＬ－ＥＧＦＰ－ＰＡ－Ｃａｐ９ＫＣ－Ｒｅｐ２（Ａｃ１３５）コンピテントに転換し、Ｔｎ７組換えによりＩＴＲ－ＧＯＩを前記ステップ２で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドにおけるＴｎ７部位に挿入し、最終的に、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得た（番号ＡＣ２０－３１３）。

１．４ ステップ１．３で得られたｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドＡＣ２０－３１３を宿主細胞系にトランスフェクションして培養することで、組換えバキュロウイルスを得た。

この組換えバクミドＤＮＡを抽出して、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスＢＥＶ及びｒＡＡＶを作製した。トランスフェクションした後のＳｆ９昆虫細胞はＢＥＶを成功に生産し、大量で複製して増殖したＢＥＶはさらに感染することでＳｆ９細胞に顕著な病変現象（ＣＰＥ）が発生した。蛍光顕微鏡により顕著な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質の発現が観察された。ＣＰＥが発生したＳｆ９細胞の培養上清液及び大量のｒＡＡＶを含むＳｆ９細胞を収集した。この培養上清液には大量のＢＥＶ、即ち第０世代のＢＥＶ（Ｐ０）が含まれる。作製されたＢＥＶ－Ｐ０を感染多重度（ＭＯＩ＝３）で懸濁培養されているＳｆ９細胞に感染させ、７２時間感染させた後、細胞活性は５０％以下まで低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清及び細胞沈殿をそれぞれ収集し、上清液を第１世代ＢＥＶ－Ｐ１として標識し、細胞をＢＥＶ－Ｐ０でパッケージングされたｒＡＡＶとして標識した。

このシステムで産生された組換えバキュロウイルスの安定性及びＡＡＶ収率安定性測定

まず、特許ＣＮ１０６５４４３２５Ｂに記載の方法に従って対応の組換えバキュロウイルスを対照（番号９ＫＣ－１４２Ａ（ＰＦＤ－ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＰＡ））として得た。９ＫＣ－１４２Ａは、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ９）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及びＩＴＲ－ＧＯＩを一緒にシャトルベクター上に構築し、そしてＴｎ７組換えにより非必須遺伝子のＰｏｌｈ遺伝子座に挿入して組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得た。最後に、Ｓｆ９細胞にトランスフェクションして組換えバキュロウイルスを得た。

本実施例のシステムの安定性をさらに評価するために、本実施例及び後の実施例において、いずれもＱ－ＰＣＲ方法によりＢＥＶ及びＡＡＶの力価を測定した。この方法は特許ＣＮ１０８６９９５６７Ａに記載の方法である。本実施例で作製されたＢＥＶ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（Ａｃ１３５）－Ｔｎ７（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を同じＭＯＩで連続継代した後、Ｓｆ９細胞に感染させ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５......Ｐ１０世代のＢＥＶを取得し、組換えバキュロウイルスの継代安定性を測定した。蛍光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法により全ての世代ＢＥＶの力価を測定した。力価の単位はＶＧ／ｍｌ（ＶＧ，ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）である。ｇｐ６４遺伝子に対応する一対のプライマー（Ｑ－ＧＰ６４－Ｆ：ＡＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣＣＣＣＧＣＣ及びＱ－ＧＰ６４－Ｒ：ＣＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＡＴＡＣＧＣＣＴＧ）により総バキュロウイルスの力価を測定し、Ｒｅｐ配列に対応する一対のｑＰＣＲプライマー（Ｑ－Ｒｅｐ－Ｆ：ＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＴ及びＱ－Ｒｅｐ－Ｒ：ＡＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴ）によりＲｅｐ発現カセット及びＣａｐ発現カセットを含むバキュロウイルスの力価を測定し、Ｔｎ７配列に対応する一対のｑＰＣＲプライマー（Ｑ－Ｔｎ７－Ｆ：ｔｃｇｔａｔｔａｇｃｔｔａｃｇａｃｇｃｔａｃａ及びＱ－Ｔｎ７－Ｒ：ｔａｇｔｔｇｇｇａａｃｔｇｇｇａｇｇｇｇ）によりＩＴＲ－ＧＯＩを含むバキュロウイルスの力価を測定した。Ｔｎ７／ＧＰ６４及びＲＥＰ／ＧＰ６４の比によりＢＥＶにおける外来遺伝子断片：Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットの継代安定性を評価した。比が安定して変化しない場合、Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットの継代安定性が比較的高いことを示し、継世回数の増加に伴って比の値が顕著に低下する場合、挿入された外来断片の安定性が悪いことを示す。継代過程全体では、総ＢＥＶ力価、即ちＧＰ６４のＱ－ＰＣＲ力価で感染多重度（ＭＯＩ）を計算して継代した。

組換えバキュロウイルスの継代安定性を評価する別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージング率及び上清力価である。ｑＰＣＲ法により全ての世代のｒＡＡＶの力価を測定し、力価の単位はＶＧ／ｍｌ（ＶＧ，ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）である。ｒＡＡＶ力価の測定は、ＩＴＲ配列を標的とする一対のプライマー（Ｑ－ＩＴＲ－Ｆ：ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ及びＱ－ＩＴＲ－Ｒ：ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ）又はＷＰＲＥ配列を標的とする一対のプライマー（Ｑ－ＷＰＲＥ－Ｆ：ＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧ及びＱ－ＷＰＲＥ－Ｒ：ＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴ）を使用した。測定結果を下図に示す。

図３は、ＡＣ２０－３１３ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。ｒＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子Ａｃ１３５のＣ端に置いた。バクミド番号はＡＣ２０－３１３である。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶ安定性を測定した。Ｔｎ／ＧＰ６４の百分率はＢＥＶ上でのＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットの安定性を示し、ＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率はＢＥＶ上でのｒｅｐ及びｃａｐ発現カセットの安定性を示す。柱状グラフに示される異なる世代のＢＥＶの安定性結果を分析したら、安定性が良好であった。

図４は、対照群９ＫＣ－１４２Ａ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。対照群９ＫＣ－１４２Ａ ＢＥＶは、特許ＣＮ１０６５４４３２５Ａに記載の方法により構築された組換えバクミドであり（番号９ＫＣ－１４２Ａ）、対照ウイルスとして用いた。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶの安定性を測定した。Ｔｎ／ＧＰ６４の百分率はＢＥＶ上でのＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットの安定性を示し、ＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率はＢＥＶ上でのｒｅｐ及びｃａｐ発現カセットの安定性を示す。柱状グラフに示される異なる世代のＢＥＶの安定性結果を分析したら、対照ウイルスの安定性が悪かった。

図５は、ＡＣ２０－３１３の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のｒＡＡＶの細胞パッケージング率及び上清力価を測定した。同図から分かるように、Ｐ２－Ｐ４世代のＢＥＶが産生したｒＡＡＶのパッケージング率及び上清力価が比較的高く、Ｐ５からパッケージング率が低下し始めたが、Ｐ９世代のパッケージング率は６．０６Ｅ＋４ｖｇ／細胞、上清力価は１．２０Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌであった。

図６は、９ＫＣ－１４２Ａの異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のｒＡＡＶの細胞パッケージング率及び上清力価を測定した。同図から分かるように、Ｐ２－Ｐ５世代からパッケージング率の低下が顕著であり、Ｐ５世代のパッケージング率は僅か７．０２Ｅ＋４ｖｇ／細胞であり、上清力価は僅か１．２６Ｅ＋９ｖｇ／ｍｌであった。

図７は、ＡＣ２０－３１３のＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。同図における３本のベルトはそれぞれＡＡＶウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３であり、サイズはそれぞれ８７ＫＤａ、７２ＫＤａ、６２ＫＤａであった。Ｐ２世代のＢＥＶ種ウイルスが生産したｒＡＡＶをＰ３として標識し、等々である。

実験結果から分かるように、対照群９ＫＣ－１４２Ａに比べ、本実施例では、ｒＡＡＶのＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットを必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子のＣ末端２６２５ｂｐに置いて得られたＢＥＶは、継代安定性が顕著に向上した（図３）。具体的には、Ｔｎ７／ＧＰ６４の百分率は一定に維持して低下せず、ＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率はゆっくりと低下し、Ｐ１０（２６．７２％）はＰ２（６４．９７％）よりも約２．４倍低下した。対照群９ＫＣ－１４２Ａ Ｔｎ７／ＧＰ６４及びＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率は顕著に低下し、ＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率についてはＰ１０（０．６４％）はＰ２（３７．７８％）よりも５９倍低下した。Ｐ４のＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率は６．８８％まで（５．５倍）低下した。また、異なる世代のＢＥＶを宿主細胞ｓｆ９に感染させて生産したｒＡＡＶの上清力価及び細胞パッケージング率については、ＡＣ２０－３１３は対照群９ＫＣ－１４２Ａよりも顕著に優れた。ＡＣ２０－３１３ Ｐ２／Ｐ３／Ｐ４のパッケージング率は基本的に１Ｅ＋６ＶＧ／細胞であり、Ｐ５からゆっくりと低下し始めた（２．５倍低下、パッケージング率：３．７２Ｅ＋５ＶＧ／細胞）。Ｐ９のパッケージング率は依然として６．０６Ｅ＋４ＶＧ／細胞であり、ｒＡＡＶの生産安定性は大幅に改善された。対照群９ＫＣ－１４２Ａは、Ｐ２－Ｐ５世代からパッケージング率が顕著に低下し、Ｐ５世代のパッケージング率が僅か７．０２Ｅ＋４ｖｇ／細胞、上清力価が僅か１．２６Ｅ＋９ｖｇ／ｍｌであった（図６）。

本実施例で作製されたＰ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５......Ｐ１０世代のＢＥＶを同じＭＯＩでそれぞれ２００ｍｌのｓｆ９細胞に感染させ、感染の３日後に細胞活性を監視した。活性が５０％未満になった場合、それぞれ遠心分離して細胞沈殿及び上清を収集し、収集した細胞沈殿及び上清をそれぞれ精製し、細胞を３回繰り返して凍結融解して溶解し、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、上清にヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を加え、３７℃の水浴で６０ｍｉｎ処理し、処理後に、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。収集した細胞溶解液及び収集した上清液をＰＥＧで沈殿させ、再懸濁させた後、イオジキサノールで密度勾配遠心分離して精製した（Ａｓｌａｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０６：５０５９－５０６４）。最終的に精製した製品ウイルスを全て１８５ｕｌのＰＢＳで再懸濁させ、各世代の精製製品ウイルスを１０ｕｌ取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを通し、銀染色した。結果を図７に示す。

同図に示されるＰ３、Ｐ４・・・Ｐ１１は、前の世代の種ウイルスＢＥＶで産生したｒＡＡＶを増幅することを示す。図７から分かるように、異なる世代のＢＥＶ（Ｐ２－Ｐ１０）でｒＡＡＶウイルスをパッケージングするときに、Ｐ２－Ｐ７のＢＥＶ種ウイルスの安定性が比較的高く、産生したｒＡＡＶの総量の低下は少なかった。図３の結果と一致する。Ｐ３及びＰ４レーンでのｒＡＡＶウイルスの濃度が非常に高いため、レーンは比較的黒かった。Ｐ２及びＰ３の種ウイルスＢＥＶでｒＡＡＶを増幅する場合、ウイルスのパッケージング率は非常に高いことを示している。

したがって、ｒｅｐ及びｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子ＡＣ１３５の横に置き、ＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットをＴｎ７組換えにより非必須遺伝子のＰｏｌｈ座に置くことにより、ＢＥＶの継代安定性及びｒＡＡＶを安定して生産する能力が向上した。

実施例２
実施例１を鑑み、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を、必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子を標的とするようにすることにより、ＢＥＶ安定性及びｒＡＡＶパッケージング率がＲｅｐ／Ｃａｐを非必須遺伝子のＰＨ遺伝子座に置いた場合よりも優れた組換えバキュロウイルスバクミドが得られた。そのため、次の実施例において、Ｒｅｐ／Ｃａｐを必須遺伝子ＧＰ６４の横に置き、ｒＡＡＶのコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットをバキュロウイルスの異なる必須遺伝子のＣ末端に置き、ＢＥＶの安定性及びｒＡＡＶのパッケージング率を評価した。

ＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（Ａｃ１３５）によりｒＡＡＶを作製した。

本実施例は、２つの相同組換えベクターを含む。一つは、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分であるＣａｐ及びＲｅｐ発現カセット、Ｃｈｏｌ発現カセット並びにＥＴＬ－ＥＧＦＰ発現カセットを含み、必須遺伝子ＧＰ６４を標的とする相同組換えベクターである。Ｃｈｏｌ発現カセットは、Ｒｅｄ相同組換え陽性クローンスクリーニング標識であり、ＥＴＬ－ＥＧＦＰ発現カセットは、ＢＥＶのＴＣＩＤ_５０力価の測定に使用される。もう一つは、ｒＡＡＶのコア発現エレメントであるＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセット及びＧｅｎ発現カセットを含み、必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子を標的とする相同組換えベクターである。Ｇｅｎ発現カセットは、Ｒｅｄ相同組換え陽性クローンスクリーニング標識である。

本実施例で提供されるｒＡＡＶ作製システムによりｒＡＡＶを作製する方法は、以下のステップを含む。
２．１ それぞれｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を含み、必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子を標的とする相同組換えベクター、及びＩＴＲ－ＧＯＩを含み、必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。
２．１．１ ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を含み、ＧＰ６４遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。野生型ＡｃＭＮＰＶゲノムにおけるＣｈｉａ、Ｃａｔｈ及びＧＰ６４のこの３つの遺伝子は隣り合う。本実施例において、ＧＰ６４のＣ端にｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）が挿入されたとともに、Ｃｈｉａ及びＣａｔｈ遺伝子が欠失した好ましいスキームを採用した。まず、野生型ＡｃＭＮＰＶバクミドＤＮＡをテンプレートとしてプライマー（ＨＡＬ（ＧＰ６４）－Ｆ：ｇｇｔａａｃｇｇｃｃａａｔｔｃａａｃｇｔ及びＨＡＬ（ＧＰ６４）－Ｒ：ａａｇｃａａｔａｔａｔｔｇａｇｔａｔｃａ）により上流ホモロジーアーム断片であるＨＡＬ（ＧＰ６４）（配列番号８）を増幅し、プライマー（ＨＡＲ（ＧＰ６４）－Ｆ：ｔｃｔｃａａｃａｃａｃｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｇａ及びＨＡＲ（ＧＰ６４）－Ｒ：ｔｇｇａｇａａｃａｃｃａａｇｔｔｔｇｇｃｇｇｃｇｔ）により下流ホモロジーアーム断片であるＨＡＲ（ＧＰ６４）（配列番号９）を増幅した。

そして、上流ホモロジーアーム、下流ホモロジーアーム、クロラムフェニコール耐性遺伝子発現カセット（Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｌｏ－Ｐ２）、Ｃａｐ９遺伝子発現カセット（Ｐ１０－Ｃａｐ９－ＰＡ）、Ｒｅｐ２遺伝子発現カセット（ＰＨ－Ｃａｐ９－ＰＡ）これらのＤＮＡ断片を一緒にｐＵＣ５７ベクター上にクローンし、ＧＰ６４遺伝子を標的とする相同組換えベクターｐＵＣ５７－ＨＡＬ（ＧＰ６４）－Ｐ１－ＦＲＴ－Ｃｈｏｌ－Ｐ２－ＥＴＬ－ＥＧＦＰ－ＰＡ－Ｃａｐ９ＫＣ－Ｒｅｐ２－ＨＡＲ（ＧＰ６４）を得た。

２．１．２ ＩＴＲコア発現エレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含み、Ａｃ１３５遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。本実施例において、ＩＴＲのコア発現エレメントは、赤色蛍光タンパク質（ｍｃｈｅｒｒｙ）の発現カセットを採用し、ｍｉｎｉＥｆ１ａプロモーターによってｍｃｈｅｒｒｙの発現を制御することにより、ｒＡＡＶの活性の検出が容易になる。まず、野生型ＡｃＭＮＰＶバクミドＤＮＡをテンプレートとしてプライマー設計し、上流ホモロジーアーム断片であるＨＡＬ（Ａｃ１３５）（配列番号６）及び下流ホモロジーアーム断片であるＨＡＲ（Ａｃ１３５）（配列番号７）を増幅した。

そして、上流ホモロジーアーム、下流ホモロジーアーム、ゲンタマイシン耐性遺伝子発現カセット（Ｐ１－ＦＲＴ－Ｇｅｎ－Ｐ２）及びＩＴＲコアエレメント遺伝子発現カセット（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を一緒にｐＵＣ５７ベクター上にクローンし、Ａｃ１３５遺伝子を標的とするとともにＩＴＲ－ＧＯＩを持つ相同組換えベクターｐＵＣ５７－ＨＡＬ（Ａｃ１３５）－Ｐ１－ＦＲＴ－Ｇｅｎ－Ｐ２－Ｔｎ７Ｌ－ＩＴＲ－ｍｉｎｉＥＦ１ａ－ｍｃｈｅｒｒｙ－ＷＰＲＥ－ＰＡ－ＩＴＲ－ＨＡＲ（Ａｃ１３５）を得た。

２．２ Ｒｅｄ相同組換えによりｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及び外来目的遺伝子（ＧＯＩ）を持つＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）をそれぞれバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端及び必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子のＣ末端に挿入し、ｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分、ＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを得た。
２．２．１ 実施例１のステップ１．１．４に従ってｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）をバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端に挿入し、スクリーニングした陽性菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ９－Ｒｅｐ２（ＧＰ６４）と命名した。

２．２．２ そして、実施例１のステップ１．１．４に従って外来目的遺伝子（ＧＯＩ）を持つＩＴＲコアエレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を２．２．１で得られた組換えバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子のＣ末端に挿入し、スクリーニングした陽性モノクローナル菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（Ａｃ１３５）と命名した。バクミドを抽出し、ｒＡＡＶを生産するカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミド（番号Ａｃ－１４１－１７５）を得た。このバクミドにおいて、Ｒｅｐ、Ｃａｐ発現カセットは、バキュロウイルスの必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子Ｃの末端の２３５ｂｐに位置し、ＩＴＲコアエレメントは、バキュロウイルスの必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子のＣ末端の１５０３ｂｐに位置する。

２．３ ステップ２．２で得られたｒＡＡＶの生産に必須な機能タンパク質成分及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドＡｃ－１４１－１７５を宿主細胞系にトランスフェクションして培養し、組換えバキュロウイルスを得た。

この組換えバクミドＤＮＡを抽出してＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスＢＥＶ及びｒＡＡＶを作製した。トランスフェクションした後のＳｆ９昆虫細胞はＢＥＶを成功に生産した。増殖したＢＥＶが大量に複製し、さらに感染することでＳｆ９細胞に顕著な病変現象（ＣＰＥ）が発生した。蛍光顕微鏡により顕著な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質の発現が観察された。ＣＰＥが発生したＳｆ９細胞培養上清液（大量のＢＥＶ、即ち第０世代のＢＥＶ（Ｐ０）を含む）を収集した。また、大量のｒＡＡＶを含むＳｆ９細胞を収集した。作製されたＢＥＶ－Ｐ０を感染多重度（ＭＯＩ＝３）で懸濁培養しているＳｆ９細胞に感染させ、感染した７２時間後、細胞活性は５０％以下に低下した。細胞培養液を１０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清及び細胞沈殿をそれぞれ収集し、上清液を第１世代ＢＥＶ－Ｐ１として標識し、細胞をＢＥＶ－Ｐ０でパッケージングされたｒＡＡＶとして標識した。

このシステムで産生した組換えバキュロウイルスの安定性及びＡＡＶ収率の安定性検出

対照バキュロウイルスは、特許ＣＮ１０９６０９５５２Ｂに記載の方法により得られた組換えバキュロウイルス（番号９ＫＣ－３１３（ＩＴＲ－ｍｉｎｉＥｆ１ａ－ｍｃｈｅｒｒｙ－ＷＰＲＥ－ＰＡ－ＩＴＲ））である。９ＫＣ－３１３は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ９）及びＲｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）を非必須遺伝子（Ｃａｔｈ及びＣｈｉａ）の遺伝子座に挿入した後、Ｔｎ７組換えによりＩＴＲ－ＧＯＩを非必須遺伝子であるＰｏｌｈ座に挿入して組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを取得し、最後にＳｆ９細胞にトランスフェクションして得られた組換えバキュロウイルスである。

本実施例のシステムの安定性をさらに分析するために、本実施例で作製されたＢＥＶ－ Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（Ａｃ１３５）を同じＭＯＩで連続継代した後、Ｓｆ９細胞に感染させ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５......Ｐ１０世代のＢＥＶを取得し、組換えバキュロウイルスの継代安定性を測定した。

蛍光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法により全ての世代のＢＥＶの力価を測定した。力価の単位はＶＧ／ｍｌ（ＶＧ，ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）である。ｇｐ６４遺伝子に対応する一対のプライマー（Ｑ－ＧＰ６４－Ｆ：ＡＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣＣＣＣＧＣＣ及びＱ－ＧＰ６４－Ｒ：ＣＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＡＴＡＣＧＣＣＴＧ）により総バキュロウイルスの力価を測定し、Ｒｅｐ配列に対応する一対のｑＰＣＲプライマー（Ｑ－Ｒｅｐ－Ｆ：ＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＴ及びＱ－Ｒｅｐ－Ｒ：ＡＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴ）によりＲｅｐ発現カセット及びＣａｐ発現カセットを含むバキュロウイルスの力価を測定し、Ｔｎ７配列に対応する一対のｑＰＣＲプライマー（Ｑ－Ｔｎ７－Ｆ：ｔｃｇｔａｔｔａｇｃｔｔａｃｇａｃｇｃｔａｃａ及びＱ－Ｔｎ７－Ｒ：ｔａｇｔｔｇｇｇａａｃｔｇｇｇａｇｇｇｇ）によりＩＴＲ－ＧＯＩを含むバキュロウイルスの力価を測定した。Ｔｎ７／ＧＰ６４及びＲＥＰ／ＧＰ６４の比の値により、ＢＥＶにおける外来遺伝子断片：Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットの継代安定性を評価した。比の値が安定して変化しない場合、Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットの継代安定性が高いことを示し、継世回数の増加に伴って比の値が顕著に低下する場合、挿入された外来断片の安定性が悪いことを示す。継代過程全体は、総ＢＥＶの力価、つまりＧＰ６４のＱ－ＰＣＲの力価により感染多重度（ＭＯＩ）を計算して継代した。

組換えバキュロウイルスの継代安定性を評価する別の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージング率及び上清力価である。ｑＰＣＲ法により全ての世代のｒＡＡＶの力価を測定し、力価の単位はＶＧ／ｍｌ（ＶＧ，ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）である。ｒＡＡＶの力価の測定は、ＷＰＲＥ配列を標的とする一対のプライマー（Ｑ－ＷＰＲＥ－Ｆ：ＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧ及びＱ－ＷＰＲＥ－Ｒ：ＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴ）を使用した。測定結果を図８から図１２に示す。

図８は、Ａｃ－１４１－１７５ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す図である。ｒＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子ＧＰ６４のＣ端に置いた。ｒＡＡＶのＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子Ａｃ１３５のＣ端に置いた。バクミド番号はＡｃ－１４１－１７５である。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶ安定性を測定した。柱状グラフに示される異なる世代のＢＥＶの安定性結果を分析したら、安定性が良好であった。

図９は、対照群９ＫＣ－３１３ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。対照群９ＫＣ－３１３ ＢＥＶは、特許ＣＮ１０９６０９５５２Ａに記載の方法に従って対照ウイルスとして得られた組換えバクミド（番号９ＫＣ－３１３）である。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶ安定性を測定した。柱状グラフに示される異なる世代のＢＥＶの安定性結果を分析したら、Ｔｎ７／ＧＰ６４の比の値が比較的低く、Ｐ４世代では２７．６６％に低下した。

図１０は、Ａｃ－１４１－１７５の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のｒＡＡＶの細胞パッケージング率及び上清力価を測定した。同図から分かるように、パッケージング率及び上清力価はいずれも比較的安定し、Ｐ９世代では、パッケージング率は２．１４Ｅ＋５ｖｇ／細胞に維持され、上清力価は９．１２Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌに達した。

図１１は、対照群９ＫＣ－３１３の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のｒＡＡＶの細胞パッケージング率及び上清力価を測定した。同図から分かるように、対照ウイルスの異なる世代のＢＥＶがｒＡＡＶを産生する安定性が悪く、パッケージング率の低下が非常に顕著であり、Ｐ５世代は僅か２．６２Ｅ＋４ｖｇ／細胞であった。

図１２は、Ａｃ－１４１－１７５のＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥの銀染色図である。同図における３本のベルトはそれぞれＡＡＶウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３であり、サイズはそれぞれ８７ＫＤａ、７２ＫＤａ、６２ＫＤａであった。Ｐ２世代のＢＥＶ種ウイルスが生産したｒＡＡＶをＰ３として標識し、等々である。

実験結果から分かるように、対照群９ＫＣ－３１３に比べ、本実施例では、ｒＡＡＶのＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットを必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端の２３５ｂｐに置き、ＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子であるＡｃ１３５遺伝子のＣ末端の２６２５ｂｐに置いて得られたＢＥＶは、継代安定性が顕著に向上した（図８）。具体的には、Ｔｎ７／ＧＰ６４及びＲＥＰ／ＧＰ６４の百分率はＰ２－Ｐ７では一定に維持して低下しなかった。Ｔｎ７／ＧＰ６４の百分率について、Ｐ１０（３３．００％）はＰ２（６２．０８％）よりも約１．９倍低下した。対照群９ＫＣ－３１３ Ｔｎ７／ＧＰ６４の百分率は、Ｐ４ではＰ２の６６．９２％から２７．６６％に低下し、２．４倍低下した。Ｔｎ７／ＧＰ６４の比の値はＩＴＲ－ＧＯＩの安定性を示す。ｒＡＡＶのパッケージング率結果（図９、図１０）は、Ａｃ－１４１－１７５のＰ２－Ｐ９世代のＢＥＶがいずれも１Ｅ＋５ｖｇ／細胞のパッケージング率を有することをさらに証明している。対照９ＫＣ－３１３の異なる世代のＢＥＶの細胞パッケージング率は迅速に低下し、Ｐ３の４．９４Ｅ＋５ｖｇ／細胞からＰ４の１．７３Ｅ＋５ｖｇ／細胞、Ｐ５の２．６２Ｅ＋４ｖｇ／細胞に低下した。

本実施例で作製されたＰ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５......Ｐ１０世代のＢＥＶを同じＭＯＩでそれぞれ２００ｍｌのｓｆ９細胞に感染させ、感染の３日後に細胞活性を監視した。活性が５０％未満になった場合、それぞれ遠心分離して細胞沈殿及び上清を収集し、収集した細胞沈殿及び上清をそれぞれ精製し、細胞を３回繰り返して凍結融解して溶解し、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、上清にヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を加え、３７℃の水浴で６０ｍｉｎ処理し、処理後に、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。収集した細胞溶解液及び収集した上清液をＰＥＧで沈殿させ、再懸濁させた後、イオジキサノール密度勾配遠心分離により精製した（Ａｓｌａｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０６：５０５９－５０６４）。最終的に精製した製品ウイルスを全て１８５ｕｌのＰＢＳで再懸濁させ、各世代の精製製品ウイルスを１０ｕｌ取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを通し、銀染色した。結果を図１２に示す。

図１２から分かるように、異なる世代のＢＥＶ（Ｐ２－Ｐ１０）でｒＡＡＶウイルスをパッケージングする際に、Ｐ２－Ｐ９のＢＥＶ種ウイルスは安定性が高く、産生したｒＡＡＶ総量の低下が小さかった。図１０の結果と一致した。

したがって、ＩＴＲ－ＧＯＩをバキュロウイルスの必須遺伝子ＡＣ１３５の横に置くことにより、ＢＥＶの継代安定性及びｒＡＡＶを安定して生産する能力が向上し、ｒＡＡＶの大規模生産に重要な意義を有する。

実施例３
ｒＡＡＶのＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端２３５ｂｐに固定し、引き続き他のバキュロウイルス必須遺伝子座を測定し、ＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（３８Ｋ）によりｒＡＡＶを作製した。

実施例２のステップ２．１に従って、プライマー（ＨＡＬ（３８Ｋ）－Ｆ：ｔｃｇｇｃｇａａｃｇｔｇｔｔｔｔｇｔｃｃｃａａ及びＨＡＬ（３８Ｋ）－Ｒ：ｃｔａｔｔｃａｔｔｇｔｃｇｃｔｇｔｃｔｔｃｔ）により上流ホモロジーアームＨＡＬ（３８Ｋ）（配列番号１０）を増幅し、プライマー（ＨＡＲ（３８Ｋ）－Ｆ：ａｇｔｔｔａｔａｔｔｔｔｔａｔｔｔａａｔａ及びＨＡＲ（３８Ｋ）－Ｒ：ｇａｔｃａｔｇｔａｇｃａｃａｃｔｃｇａｔｇｃｇａ）により下流ホモロジーアームＨＡＲ（３８Ｋ）（配列番号１１）を増幅し、ＩＴＲコア発現エレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含み、バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子３８Ｋである遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。そして、実施例１のステップ１．１．４に従ってＩＴＲ－ＧＯＩを２．２．１で得られた組換えバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子である３８Ｋ遺伝子のＣ末端の１２６ｂｐに挿入した。スクリーニングした陽性モノクローナル菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（３８Ｋ）と命名した。バクミドを抽出し、ｒＡＡＶを生産するカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミド（番号Ａｃ－１４１－１６３）を得た。

実施例２の方法によりＢＥＶ継代安定性を測定した。測定データを図１３、図１４及び図１５に示す。

図１３は、Ａｃ－１４１－１６３ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。ｒＡＡＶのＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子３８ＫのＣ端の１２６ｂｐに置いた（バクミド番号Ａｃ－１４１－１６３）。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶ安定性を測定した。柱状グラフに示される異なる世代のＢＥＶの安定性結果を分析したら、安定性が良好であった。

図１４は、Ａｃ－１４１－１６３異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のｒＡＡＶの細胞パッケージング率及び上清力価を測定した。同図から分かるように、Ｐ５世代ではパッケージング率は低下し始めたが、Ｐ１０世代のパッケージング率は高いレベル１．２１Ｅ＋５ｖｇ／細胞に維持され、上清力価は１．８４Ｅ＋１１ｖｇ／ｍｌに達した。

図１５は、Ａｃ－１４１－１６３ Ｐ２－Ｐ１０世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。同図における３本のベルトはそれぞれＡＡＶウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３であり、サイズはそれぞれ８７ＫＤａ、７２ＫＤａ、６２ＫＤａである。Ｐ２世代のＢＥＶ種ウイルスが生産したｒＡＡＶをＰ３として標識し、等々である。

以上の結果から分かるように、実施例２の対照ウイルス９ＫＣ－３１３に比べ、Ａｃ－１４１－１６３の異なる世代のＢＥＶのＴｎ７／ＧＰ６４及びＲｅｐ／ＧＰ６４の百分率はいずれも非常に安定した。そのｒＡＡＶのパッケージング率及び上清力価はいずれも比較的高いレベルに維持された。Ｐ２－Ｐ４のパッケージング率保持は、１．００Ｅ＋６ｖｇ／細胞に維持された。Ｐ５ではパッケージング率がＰ４の９．０６Ｅ＋５ｖｇ／細胞から１．７７Ｅ＋５ｖｇ／細胞に低下したが、その後、パッケージング率はＰ１０まで１．２１Ｅ＋５ｖｇ／細胞に維持された。これに対し、対照群９ＫＣ－３１３では、Ｐ５のパッケージング率は２．６２Ｅ＋４ｖｇ／細胞に低下した。ｒＡＡＶの上清力価も比較的高いレベルに維持され、最大５．８６Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬにも達し（Ｐ６）、総ｒＡＡＶの量が大幅に増加した。

本実施例で作製されたＰ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５......Ｐ１０世代のＢＥＶを同じＭＯＩでそれぞれ２００ｍｌのｓｆ９細胞に感染させ、感染の３日後に細胞活性を監視した。活性が５０％未満になった場合、それぞれ遠心分離して細胞沈殿及び上清を収集し、収集した細胞沈殿及び上清をそれぞれ精製し、細胞を３回繰り返して凍結融解して溶解し、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、上清にヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を加え、３７℃の水浴で６０ｍｉｎ処理し、処理後に、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。収集した細胞溶解液及び収集した上清液をＰＥＧで沈殿させ、再懸濁させた後、イオジキサノールで密度勾配遠心分離して精製した（Ａｓｌａｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０６：５０５９－５０６４）。最終的に精製した製品ウイルスを全て１８５ｕｌのＰＢＳで再懸濁させた。Ｐ１０の体積は１８５ｕｌ＊１．５＝２７７．５ｕｌであった。Ｐ９は、精製過程においてサンプルにトラブルがあった。最終的な総ウイルス量は減少した。各世代の精製製品ウイルスを１０ｕｌ取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを通し、銀染色した。結果を図１５に示す。

図１５から分かるように、精製過程でトラブルがあるＰ９及び実際体積が他のウイルスの１．５倍のＰ１０を除き、異なる世代のＢＥＶ（Ｐ２－Ｐ１０）でｒＡＡＶウイルスをパッケージングする際に、ＢＥＶの各世代の種ウイルスは安定性が高く、産生したｒＡＡＶの総量の低下は少なかった。これによって、Ｒｅｐ及びｃａｐ発現カセットをＢＥＶの必須遺伝子ＧＰ６４のＣ端に置き、ＩＴＲ－ＧＯＩをＢＥＶの必須遺伝子３８ＫのＣ端に置くことにより、ｒＡＡＶの生産を大幅に安定化できることがさらに実証された。

実施例４
ｒＡＡＶのＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端の２３５ｂｐに固定し、引き続き他のバキュロウイルスの必須遺伝子座を測定し、ＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（ＩＥ１）によりｒＡＡＶを作製した。

実施例２のステップ２．１に従って、プライマー（ＨＡＬ（ＩＥ１）－Ｆ：ａｔｃａｔｇａｃａａｔａｔｔｇｃｇａｇｔ及びＨＡＬ（ＩＥ１）－Ｒ：ｔｔａａｔｔａａａｔｔｃｇａａｔｔ）により上流ホモロジーアームＨＡＬ（ＩＥ１）（配列番号１２）を増幅し、プライマー（ＨＡＲ（ＩＥ１）－Ｆ：ｔｔａｔａｃａｔａｔａｔｔｔｔｇａａｔ及びＨＡＲ（ＩＥ１）－Ｒ：ｃｃｇａｃｃｃａｇａｔｔｃｇｃｃｔｃａａｔ）により下流ホモロジーアームＨＡＲ（ＩＥ１）（配列番号１３）を増幅し、ＩＴＲコア発現エレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含み、バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子であるＩＥ１遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。そして、実施例１のステップ１．１．４に従ってＩＴＲ－ＧＯＩを２．２．１で得られた組換えバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子であるＩＥ１遺伝子のＣ末端の１２３７ｂｐに挿入し、スクリーニングした陽性モノクローナル菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（ＩＥ１）と命名した。バクミドを抽出し、ｒＡＡＶを生産するカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミド（番号Ａｃ－１４１－１６２）を得た。

実施例２の方法によりＢＥＶ継代安定性を測定した。測定データを図１６、図１７及び図１８に示す。

図１６は、Ａｃ－１４１－１６２ ＢＥＶの異なる世代の安定性を示す。ｒＡＡＶのＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットはバキュロウイルスの必須遺伝子ＩＥ１のＣ末端の１２３７ｂｐに置かれ、バクミド番号はＡｃ－１４１－１６２であった。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のＢＥＶ安定性を測定した。柱状グラフに示される異なる世代のＢＥＶの安定性結果を分析したら、安定性は対照ウイルス９ＫＣ－３１３と同じであった。図１７は、Ａｃ－１４１－１６２の異なる世代のＢＥＶパッケージングｒＡＡＶの収率を示す。Ｑ－ＰＣＲによりＰ２－Ｐ１０世代のｒＡＡＶの細胞パッケージング率及び上清力価を測定した。同図から分かるように、パッケージング率は継代に伴って低下し、安定性が悪かった。

以上の結果から分かるように、実施例１の対照ウイルス９ＫＣ－１４２Ａに比べ、Ａｃ－１４１－１６２の異なる世代のＢＥＶのＲｅｐ／ＧＰ６４の百分率はより安定した。対照ウイルス９ＫＣ－３１３と同様に、Ａｃ－１４１－１６２の異なる世代のＢＥＶのＴｎ７／ＧＰ６４百分率の低下が比較的速く、安定性は実施例１、２、３のＡＣ２０－３１３、Ａｃ－１４１－１７５、Ａｃ－１４１－１６３のほど高くなかった。Ｔｎ／ＧＰ６４は、Ｐ２の１６５．５２％からＰ５の２５．１８％に低下し、そのｒＡＡＶのパッケージング率及び上清力価も徐々に低下する傾向にあった。その細胞パッケージング率及び上清力価のレベルは、対照ウイルス９ＫＣ－３１３とほぼ一致し、やや高かった（図１８）。図１８は、Ａｃ－１４１－１６２ｖｓ９ｋｃ－３１３パッケージング率を示す。同図から分かるように、Ａｃ－１４１－１６２各世代のパッケージング率は、対照ウイルス９ｋｃ－３１３よりもやや高かった。

比較例１
ｒＡＡＶのＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端の２３５ｂｐに置き、引き続き他のバキュロウイルスの必須遺伝子座を測定した。ＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（ＧＰ４１）によりｒＡＡＶを作製した。

実施例２のステップ２．１に従って、プライマー（ＨＡＬ（ＧＰ４１）－Ｆ：ｔｔｔｔｇｔｇａａｃｇｇｇｃｔｃｇｃｔａ及びＨＡＬ（ＧＰ４１）－Ｒ：ｔｃａｔｇｇｃｇａｃｇａｃｔｃｔｇｔａｃａ）により上流ホモロジーアームＨＡＬ（ＧＰ４１）（配列番号１４）を増幅し、プライマー（ＨＡＲ（ＧＰ４１）－Ｆ：ｔｔａｔｇｃａｇｔｇｃｇｃｃｃｔｔｔｃｇｔ及びＨＡＲ（ＧＰ４１）－Ｒ：ｔｇｃｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇａｔｔａｃｔａ）により下流ホモロジーアームＨＡＲ（ＧＰ４１）（配列番号１５）を増幅し、ＩＴＲコア発現エレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含み、バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子であるＧＰ４１遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。そして、実施例１のステップ１．１．４に従ってＩＴＲ－ＧＯＩを２．２．１で得られた組換えバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子であるＧＰ４１遺伝子のＣ末端１１５ｂｐに挿入した。スクリーニングした陽性モノクローナル菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（ＧＰ４１）と命名した。バクミドを抽出し、ｒＡＡＶを生産するカプシドタンパク質の遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミド（番号Ａｃ－１４１－１６０）を得た。

本実施例において、実施例２の方法を参照しながらＢＥＶのレスキュー及び継代を行った。一緒にレスキュー及び継代したのは番号Ａｃ－１４１－１６０及びＡｃ－１４１－１６２である。この２つのウイルスを同時にＰ２世代に拡大培養した後、Ｐ２のＢＥＶ種ウイルスを２５０ｍＬのｓｆ９細胞に接種し、感染した３日後、細胞活性を測定した。活性が５０％未満である場合、上清及び細胞をそれぞれ収集した。細胞を繰り返して凍結融解して溶解し、イオジキサノール密度勾配遠心分離法により精製品ＡＡＶとなるように精製した。収集した上清及び細胞におけるｒＡＡＶウイルスの力価、並びに最終的に精製したｒＡＡＶの力価及び純度を測定した。純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色の方法により測定された。

図１９は、Ａｃ－１４１－１６０（ｒＡＡＶのＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットがバキュロウイルスの必須遺伝子ＧＰ４１のＣ端に位置する）及びＡｃ－１４１－１６２ ＢＥＶが生産したｒＡＡＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ銀染色図である。Ｑ－ＰＣＲにより２種類のウイルスの力価が一致すると検出された場合、Ａｃ－１４１－１６０のＶＰ３は比較的太く、中空率が比較的高いことを示している。表１及び図１９の結果から分かるように、Ａｃ－１４１－１６２ Ｐ３が生産した製品ウイルスの力価は３．１５Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬであり、Ａｃ－１４１－１６０ Ｐ３が産生した製品ウイルスの力価は２．２１Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬであった。しかし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、Ａｃ－１４１－１６０のＶＰ３のベルトは明らかにより太く、Ａｃ－１４１－１６０が生産したｒＡＡＶの中空率はＡｃ－１４１－１６２よりも高いことを示している。原因を分析したら、ＩＴＲ－ＧＯＩを必須遺伝子であるＧＰ４１遺伝子のＣ末端（Ａｃ７９遺伝子のＮ端の開始コドンの前に相当）に置くと、Ａｃ７９遺伝子の発現に影響を与えることで、バキュロウイルスの増力に影響を与えると考えられている。そのため、ＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットを必須遺伝子ＧＰ４１のＣ端に置くのは最適な選択ではない可能性がある。

比較例２
ｒＡＡＶのＲｅｐ／Ｃａｐ発現カセットをバキュロウイルスの必須遺伝子であるＧＰ６４遺伝子のＣ末端の２３５ｂｐに固定し、引き続き他のバキュロウイルスの必須遺伝子座を測定した。ＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（Ａｃ１５３）によりｒＡＡＶを作製した。

実施例２のステップ２．１に従って、プライマー（ＨＡＬ（Ａｃ１５３）－Ｆ：ｔｇａｃａｔａａａｔａｔｇｇａｇａａｔｃａｇｇｃａ及びＨＡＬ（Ａｃ１５３）－Ｒ：ｔｔａａｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａａａａｔｔａａｃａｇｔ）により上流ホモロジーアームＨＡＬ（Ａｃ１５３）（配列番号１６）を増幅し、プライマー（ＨＡＲ（Ａｃ１５３）－Ｆ：ｔｇｔｇａｔａｔｇａａａｔｇｔａｔａｔａ及びＨＡＲ（Ａｃ１５３）－Ｒ：ａｔｇｃａａｇａａｔｔｇｔａｔｇｔｔｇｃｔ）により下流ホモロジーアームＨＡＲ（Ａｃ１５３）（配列番号１７）を増幅し、ＩＴＲコア発現エレメント（ＩＴＲ－ＧＯＩ）を含み、バキュロウイルスゲノムの必須遺伝子であるＡｃ１５３遺伝子を標的とする相同組換えベクターを構築した。そして、実施例１のステップ１．１．４によりＩＴＲ－ＧＯＩを２．２．１で得られた組換えバキュロウイルスゲノムにおける必須遺伝子であるＡｃ１５３遺伝子のＣ末端の１３６８ｂｐに挿入した。スクリーニングした陽性モノクローナル菌株をＤＨ１０Ｂａｃ－△ＣＣ－Ｃａｐ－Ｒｅｐ（ＧＰ６４）－ＩＴＲ－ＧＯＩ（Ａｃ１５３）と命名した。バクミドを抽出し、ｒＡＡＶを生産するカプシドタンパクの質遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）及びＩＴＲコアエレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミド（番号Ａｃ－１４１－１７４）を得た。

実施例２の方法に従ってＢＥＶの継代安定性を測定した。Ｐ１－Ｐ３のみについて測定した。測定データは以下の通りである。

実施例６と同様に、Ａｃ－１４１－１７４ウイルスの細胞パッケージング率は比較的低く、Ｔｎ７／ＧＰ６４の百分率は非常に低く、ＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットを必須遺伝子Ａｃ１５３の横に置くのが好適ではないことを示している。原因を分析したら、ＩＴＲ－ＧＯＩを必須遺伝子であるＡｃ１５３遺伝子のＣ末端（Ａｃ１５４遺伝子のＮ端の開始コドンの前に相当）に置くと、Ａｃ１５４遺伝子の発現に影響与えることで、バキュロウイルスの増殖に影響を与えると考えられている。そのため、ＩＴＲ－ＧＯＩ発現カセットを必須遺伝子であるＡｃ１５４遺伝子のＣ端に置くのは最適な選択ではない可能性がある。

当業者に理解され得るように、以上の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を制限するものではない。本発明の思想及び原則内になされるすべての修正、同等置換及び変更などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (7)

1. 以下のステップ（１）、（２）を含む組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法であって、
   ステップ（１）：組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを構築し、前記組換えバキュロウイルスゲノムは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含み、前記必須機能エレメントは、Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含み、
   ステップ（２）：ステップ（１）で得られた組換えアデノ随伴ウイルスを生産する組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドを宿主細胞系にトランスフェクションして培養し、
   前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子であるＡｃ１３５のＣ末端の下流２６２５ｂｐ位置、Ａｃ９８（３８Ｋ）のＣ末端の下流１２６ｂｐ位置、Ａｃ１４７（ＩＥ１）のＣ末端の下流１２３７ｂｐ位置、又は、Ａｃ１２８（ＧＰ６４）のＣ末端の下流２３５ｂｐ位置に挿入される、ことを特徴とする、作製方法。
2. ステップ（１）において、具体的には、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む相同組換えベクターを構築し、或いは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む相同組換えベクター及びシャトルプラスミドを構築し、相同組換えの方法により、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する３つの必須機能エレメントを組換えバキュロウイルスゲノムを含む同一の組換えバクミドに統合することで、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られ、
   前記相同組換えベクターは、バキュロウイルスを標的とする必須遺伝子を含み、かつこのベクターは、Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及びＩＴＲ－ＧＯＩのうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
3. 残りの必須機能エレメントは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの非必須遺伝子の遺伝子座に挿入されることを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
4. ステップ（１）は、具体的に以下のサブステップを含み、
   ステップ（１－１）：Ｃａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット及び、外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含む１つ又は複数の相同組換えベクターを構築し、
   ステップ（１－２）：ステップ（１－１）で得られた１つ又は複数の相同組換えベクターによりＣａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを統合して組換えバキュロウイルスゲノムの１つ又は複数の必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入することで、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する全ての必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られることを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
5. ステップ（１）は、具体的に以下のステップを含み、
   ステップ（１－１）：前記必須機能エレメントのうちの１つ又は２つを含む相同組換えベクターを構築し、次にＲｅｄ相同組換えによりこの相同組換えベクターにおけるＡＡＶ必須機能エレメントをバキュロウイルスゲノムの１つ又は２つの必須遺伝子の遺伝子座のＮ末端又はＣ末端に挿入し、
   ステップ（１－２）：残りの必須機能エレメントを含むシャトルプラスミドを構築し、
   ステップ（１－３）：シャトルプラスミドに媒介されるＴｎ７組換えによりＣａｐ遺伝子発現カセット、Ｒｅｐ遺伝子発現カセット、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを１つのバキュロウイルスゲノムに統合することで、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する全ての必須機能エレメントを含む組換えバキュロウイルスゲノムを含む組換えバクミドが得られることを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
6. 組換えアデノ随伴ウイルスを作製するための組換えバクミドであって、
   前記組換えバクミドは、組換えバキュロウイルスゲノムを含み、前記組換えバキュロウイルスゲノムは、前記組換えアデノ随伴ウイルスを生産する必須機能エレメントを含み、前記必須機能エレメントは、Ｃａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、及び外来目的遺伝子を持つコア発現エレメントＩＴＲ－ＧＯＩを含み、
   前記必須機能エレメントのうちの少なくとも１つは、前記組換えバキュロウイルスゲノムの必須遺伝子であるＡｃ１３５のＣ末端の下流２６２５ｂｐ位置、Ａｃ９８（３８Ｋ）のＣ末端の下流１２６ｂｐ位置、Ａｃ１４７（ＩＥ１）のＣ末端の下流１２３７ｂｐ位置、又は、Ａｃ１２８（ＧＰ６４）のＣ末端の下流２３５ｂｐ位置に挿入されることを特徴とする、組換えアデノ随伴ウイルスを作製するための組換えバクミド。
7. 請求項６に記載の組換えバクミドを含むことを特徴とする、組換えアデノ随伴ウイルスの作製システム。