JP7554465B2 - Method for preparing thin sections for imaging mass spectrometry and method for analyzing localization of target substance on biological surface - Google Patents
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Description
本発明は、イメージング質量分析用薄切片の作製方法、及び生体表面における対象物質の局在解析方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing thin sections for imaging mass spectrometry and a method for analyzing the localization of a target substance on a biological surface.
イメージング質量分析法は、質量分析（ＭＳ）を用いて、物質の局在を可視化する分析方法として注目されている。分析対象物質を含む試料をイメージング質量分析法に供するためには、試料を薄切片化しなくてはならない。従来は、クライオスタット等を用いて、試料を薄切片に加工していたが、その加工は熟練を要するものであった。 Imaging mass spectrometry is attracting attention as an analytical method that uses mass spectrometry (MS) to visualize the localization of substances. In order to subject a sample containing the substance to be analyzed to imaging mass spectrometry, the sample must be cut into thin slices. Conventionally, samples have been cut into thin slices using a cryostat or other equipment, but this process requires skill.
生体表面から試料を作製する方法としては、粘着テープ、接着剤等を使用して、生体表面から試料を作製する方法が知られている。例えば、特許文献１には、皮膚から採取した試料を熱分解マススペクトル法、または熱脱着マススペクトル法を用いて皮膚表面、または皮膚内部に存在する物質の定量を行う方法において、試料の採取方法として、シアノアクリレート系接着剤やセロファンテープを、採取皮膚部位に塗布又は圧着し、乾いた後に剥がすことにより、皮膚に存在する物質を分析する方法が開示されている。また、特許文献２には、シアノアクリレート系接着剤を、植物の葉の表面に塗布し、固化させた後、当該葉表面から接着剤を剥離して、葉の付着物を分析するために用いられることが開示されている。 Methods for preparing samples from the surface of a living body include those using adhesive tape, glue, etc. For example, Patent Document 1 discloses a method for quantifying substances present on or inside a skin sample collected from the skin using pyrolysis mass spectrometry or thermal desorption mass spectrometry, in which a cyanoacrylate adhesive or cellophane tape is applied or pressed to the collected skin site and then peeled off after drying to analyze substances present on the skin. Patent Document 2 discloses that a cyanoacrylate adhesive is applied to the surface of a plant leaf, allowed to solidify, and then the adhesive is peeled off from the leaf surface to be used to analyze attachments on the leaf.
しかしながら、特許文献１の方法は、採取された皮膚表面中に存在する物質を熱分解して分析する方法であり、生体表面における対象物質の局在を解析する方法ではない。また、試料の採取方法として具体的に開示されているのは、セロファンテープを圧着して試料を採取する方法のみである。特許文献２の方法は、試料表面に付着している物質を採取する方法であって、生体表面に元々存在する対象物質の局在を解析するための試料の作製方法ではない。 However, the method in Patent Document 1 is a method for pyrolyzing and analyzing substances present on the collected skin surface, and is not a method for analyzing the localization of target substances on the surface of a living body. Furthermore, the only sample collection method specifically disclosed is a method for collecting samples by pressing cellophane tape. The method in Patent Document 2 is a method for collecting substances attached to the surface of a sample, and is not a method for preparing a sample for analyzing the localization of target substances originally present on the surface of a living body.
イメージング質量分析法に供するためには、試料を薄切片化しなくてはならないが、従来は、クライオスタット等を用いて、試料を薄切片に加工しなければならず、その加工は熟練を要する。イメージング質量分析法のための薄切片試料を作製するために、粘着テープや接着剤を用いた場合は、粘着テープや接着剤に、レーザーイオン化法でイオン化する物質が含まれていると、質量分析の際にノイズとなり、試料中の対象物質の正確な解析ができない。 To perform imaging mass spectrometry, samples must be cut into thin slices, but conventionally, samples must be processed into thin slices using a cryostat or similar device, which requires skill. When using adhesive tape or glue to prepare thin-section samples for imaging mass spectrometry, if the adhesive tape or glue contains substances that are ionized by laser ionization, this will cause noise during mass spectrometry, making it impossible to accurately analyze the target substances in the sample.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、イメージング質量分析用の薄切片を、熟練を要さずに簡便に作製する方法及び、該作製方法を用いて作製した薄切片を用いて、イメージング質量分析法により、簡便に、生体表面における対象物質の局在を解析する方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in consideration of the above circumstances, and aims to provide a method for easily preparing thin sections for imaging mass spectrometry without requiring skill, and a method for easily analyzing the localization of a target substance on the surface of a living body by imaging mass spectrometry using thin sections prepared using the preparation method.
本発明は、前記目的を達成すべく鋭意検討した結果、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を用いて、対象物質を含有する生体表面と、導電性基材と、を接着させ、前記導電性基材を生体表面から剥離することにより、対象物質の局在を保持したまま、導電性基材上に生体表面の薄切片を作製することができ、作製した薄切片を、そのままイメージング質量分析法に供することにより、簡便に、生体表面における対象物質の局在を分析することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of extensive research to achieve the above-mentioned object, the present invention has been completed based on the discovery that by adhering a biological surface containing a target substance to a conductive substrate using an adhesive that is not ionized by laser ionization, and then peeling the conductive substrate from the biological surface, it is possible to prepare thin sections of the biological surface on the conductive substrate while maintaining the localization of the target substance, and by subjecting the prepared thin sections directly to imaging mass spectrometry, it is possible to easily analyze the localization of the target substance on the biological surface.
本発明は以下の態様を含む。
［１］ 対象物質を含有する生体表面と、導電性基材とを、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を用いて接着させる接着工程と、
前記生体表面から、前記導電性基材を剥離して、前記対象物質の前記生体表面での局在を保持したまま、前記導電性基材上に前記生体表面の薄切片を作製する薄切片作製工程と、
を含む、対象物質を含有する生体表面のイメージング質量分析用薄切片の作製方法。
［２］ 前記レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤が、シアノアクリレートである、［１］に記載のイメージング質量分析用薄切片の作製方法。
［３］ ［１］又は［２］に記載のイメージング質量分析用薄切片の作製方法で作製した、導電性基材上のイメージング質量分析用薄切片を、イメージング質量分析法により分析し、前記生体表面における前記対象物質の局在を解析する局在解析工程を含む、生体表面における対象物質の局在解析方法。
［４］ 前記レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤が、シアノアクリレートである、［３］に記載の対象物質の局在解析方法。
The present invention includes the following aspects.
[1] An adhesion step of adhering a biological surface containing a target substance to a conductive substrate using an adhesive that is not ionized by a laser ionization method;
a thin section preparation step of peeling the conductive substrate from the biological surface and preparing a thin section of the biological surface on the conductive substrate while maintaining the localization of the target substance on the biological surface;
A method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry of a biological surface containing a target substance, comprising:
[2] The method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry described in [1], wherein the adhesive that is not ionized by the laser ionization method is cyanoacrylate.
[3] A method for analyzing the localization of a target substance on the surface of a living organism, comprising a localization analysis step of analyzing, by imaging mass spectrometry, a thin section for imaging mass spectrometry on a conductive substrate, prepared by the method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry described in [1] or [2], to analyze the localization of the target substance on the surface of the living organism.
[4] The method for localization analysis of a target substance according to [3], wherein the adhesive that is not ionized by the laser ionization method is cyanoacrylate.
本発明によれば、熟練を要さずに、対象物質の局在を保持したまま、生体表面の薄切片を簡便に作製することができる、イメージング質量分析用薄切片の作製方法、及び前記作製方法により作製した薄切片を、そのままイメージング質量分析法に供することにより、イメージング質量分析法により、簡便に、生体表面における対象物質の局在を分析することができる、対象物質の局在解析方法を提供することができる。 The present invention provides a method for preparing thin sections for imaging mass spectrometry that can easily prepare thin sections of a living body surface while maintaining the localization of a target substance without requiring skill, and a method for analyzing the localization of a target substance that can easily analyze the localization of a target substance on a living body surface by imaging mass spectrometry by subjecting the thin sections prepared by the preparation method to imaging mass spectrometry as is.
＜薄切片作製方法＞
本発明のイメージング質量分析用薄切片の作製方法は、対象物質を含有する生体表面と、導電性基材とを、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を用いて接着させる接着工程と、前記生体表面から、前記導電性基材を剥離して、前記対象物質の前記生体表面での局在を保持したまま、前記導電性基材上に前記生体表面の薄切片を作製する薄切片作製工程と、を含む。本発明のイメージング質量分析用薄切片の作製方法により、熟練を要さずに、対象物質の局在を保持したまま、生体表面の薄切片を簡便に作製することができる。以下、各工程について詳細に説明する。
<Method of preparing thin slices>
The method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry of the present invention includes an adhesion step of adhering a biological surface containing a target substance to a conductive substrate using an adhesive that is not ionized by laser ionization, and a thin section preparation step of peeling the conductive substrate from the biological surface and preparing a thin section of the biological surface on the conductive substrate while maintaining the localization of the target substance on the biological surface. The method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry of the present invention allows a thin section of a biological surface to be easily prepared without requiring skill while maintaining the localization of the target substance. Each step will be described in detail below.
＜＜接着工程＞＞
本発明において、接着工程は、対象物質を含有する生体表面と、導電性基材とを、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を用いて接着させる工程である。
対象物質としては、生体表面に存在し、イメージング質量分析法で測定可能な物質であれば特に制限はなく、例えば、ヒトを含む動物の脳、胃、小腸、大腸等の消化器、心臓、肺、腎臓、肝臓、皮膚等の表面に含まれる物質、がん組織等の病理組織や細胞の表面に含まれる物質、植物の葉、茎、果実等の表面に含まれる物質等が挙げられる。
<<Bonding process>>
In the present invention, the adhesion step is a step of adhering a biological surface containing a target substance to a conductive substrate using an adhesive that is not ionized by the laser ionization method.
There are no particular limitations on the target substance as long as it is present on the surface of a living body and can be measured by imaging mass spectrometry, and examples of the target substance include substances found on the surfaces of the digestive organs, such as the brain, stomach, small intestine, and large intestine, the heart, lungs, kidneys, liver, and skin, of animals including humans, substances found on the surfaces of pathological tissues and cells, such as cancer tissue, and substances found on the surfaces of plant leaves, stems, fruits, etc.
生体表面としては、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤で剥離可能な生体表面であれば、特に制限はなく、例えば、ヒトを含む動物の脳、胃、小腸、大腸等の消化器、心臓、肺、腎臓、肝臓、皮膚等の表面、がん組織等の病理組織や細胞の表面、植物の葉、茎、果実等の表面等が挙げられる。 There are no particular limitations on the biological surface, so long as it can be peeled off with an adhesive that is not ionized by the laser ionization method. Examples include the surfaces of the digestive organs, such as the brain, stomach, small intestine, and large intestine, the heart, lungs, kidneys, liver, and skin of animals, including humans; the surfaces of pathological tissues and cells, such as cancer tissue; and the surfaces of plant leaves, stems, fruits, etc.
導電性基材としては、イメージング質量分析法に使用される導電性基材であれば、特に制限はなく、例えば、金属基材、金属や酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）などで導電性を付与したガラス基材、導電性両面テープ等が挙げられる。 There are no particular limitations on the conductive substrate, so long as it is a conductive substrate used in imaging mass spectrometry. Examples include metal substrates, glass substrates made conductive with metal or indium tin oxide (ITO), conductive double-sided tape, etc.
レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤としては、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤であれば特に制限はなく、例えば、シアノアクリレートの他、アクリル樹脂（ラジカル重合開始剤を使用）またはエポキシ樹脂（カチオン重合開始剤を使用）等の光硬化型樹脂、エポキシ樹脂等の熱硬化型樹脂等が挙げられる。対象物質を含有する生体表面と、導電性基材とを、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を用いて接着させることにより、接着後に得られる、導電性基材上のイメージング質量分析用薄切片を、そのままイメージング質量分析法に供しても、接着剤が、イオン化することがないため、接着剤がイメージング質量分析の際のノイズになることがない。
レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤の中でも、シアノアクリレートが、極めて短時間に固化し、生体に毒性がなく、すなわち生体試料に与える影響がなく、また、固化後も透明性が極めて高いため顕微鏡観察時に標的となる生体表面構造の観察が行いやすいため、好ましく用いられる。
The adhesive that is not ionized by the laser ionization method is not particularly limited as long as it is an adhesive that is not ionized by the laser ionization method, and examples thereof include cyanoacrylate, photocurable resins such as acrylic resins (using a radical polymerization initiator) or epoxy resins (using a cationic polymerization initiator), and thermosetting resins such as epoxy resins. By adhering a biological surface containing a target substance to a conductive substrate using an adhesive that is not ionized by the laser ionization method, even if the thin section for imaging mass spectrometry on the conductive substrate obtained after adhesion is directly subjected to imaging mass spectrometry, the adhesive is not ionized, and therefore the adhesive does not become noise during imaging mass spectrometry.
Among adhesives that do not ionize by laser ionization, cyanoacrylate is preferably used because it solidifies in an extremely short time, is non-toxic to living organisms, i.e., has no effect on biological samples, and remains extremely transparent even after solidification, making it easy to observe the target biological surface structure during microscopic observation.
生体表面と導電性基材との接着は、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を、生体表面及び導電性基材のいずれか一方又は両方に塗布し、固化させることにより行うことができる。例えば、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤がシアノアクリレートの場合は、生体表面に１滴～数滴滴下し、導電性基材を押し当てて、３０秒～２分間密着固化させることにより、生体表面と導電性基材とを接着させることができる。レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤が、光硬化型接着剤の場合は、光を照射することにより固化することができる。例えば、光硬化型接着剤が、アクリル樹脂（ラジカル重合開始剤を使用）またはエポキシ樹脂（カチオン重合開始剤を使用）である場合は、重合開始剤を配合した光硬化型接着剤を、生体表面及び導電性基材のいずれか一方又は両方に塗布し、３００～５００ｎｍの光を、０．５～２分間照射することにより固化することができる。レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤が、熱硬化型接着剤の場合は、加熱することにより固化することができる。例えば、熱硬化型接着剤が、エポキシ樹脂である場合は、エポキシ樹脂を、生体表面及び導電性基材のいずれか一方又は両方に塗布し、２５～２００℃で、３０～１２０分間加熱することにより固化することができる。 The adhesion between the biological surface and the conductive substrate can be achieved by applying an adhesive that is not ionized by the laser ionization method to either or both of the biological surface and the conductive substrate, and allowing it to solidify. For example, if the adhesive that is not ionized by the laser ionization method is cyanoacrylate, one to several drops can be dropped onto the biological surface, and the conductive substrate can be pressed against it and allowed to solidify for 30 seconds to 2 minutes, thereby adhering the biological surface and the conductive substrate. If the adhesive that is not ionized by the laser ionization method is a photocurable adhesive, it can be solidified by irradiating it with light. For example, if the photocurable adhesive is an acrylic resin (using a radical polymerization initiator) or an epoxy resin (using a cationic polymerization initiator), it can be solidified by applying a photocurable adhesive containing a polymerization initiator to either or both of the biological surface and the conductive substrate, and irradiating it with light of 300 to 500 nm for 0.5 to 2 minutes. If the adhesive that is not ionized by the laser ionization method is a heat-curable adhesive, it can be solidified by heating. For example, if the thermosetting adhesive is an epoxy resin, the epoxy resin can be applied to either or both of the biological surface and the conductive substrate, and then hardened by heating at 25 to 200°C for 30 to 120 minutes.
＜＜薄切片作製工程＞＞
本発明において、薄切片作製工程は、前記生体表面から、前記導電性基材を剥離して、前記対象物質の前記生体表面での局在を保持したまま、前記導電性基材上に前記生体表面の薄切片を作製する工程である。前記接着工程において、レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤を固化した後に、生体表面から、導電性基材を剥離することにより、導電性基材上に、対象物質の生体表面の局在を保持したまま、生体表面の薄切片を作製することができる。
<<Thin section preparation process>>
In the present invention, the thin section preparation step is a step of peeling off the conductive substrate from the biological surface and preparing a thin section of the biological surface on the conductive substrate while maintaining the localization of the target substance on the biological surface. In the adhesion step, the adhesive that is not ionized by the laser ionization method is solidified, and then the conductive substrate is peeled off from the biological surface, whereby a thin section of the biological surface can be prepared on the conductive substrate while maintaining the localization of the target substance on the biological surface.
本発明における薄切片作製工程において作製される生体表面の薄切片は、対象物質の生体表面での局在が保持されているため、対象物質が、生体表面のどの部分に局在しているかをイメージング質量分析法により解析することができる。 The thin sections of the biological surface produced in the thin section production process of the present invention retain the localization of the target substance on the biological surface, so that the part of the biological surface where the target substance is localized can be analyzed by imaging mass spectrometry.
薄切片作製工程により作製される生体表面の薄切片は、レーザーイオン化法でイオン化する接着剤を含まないため、後述するイメージング質量分析法による対象物質の局在解析方法において、接着剤によるノイズが発生することなく、生体表面における対象物質の局在を解析することができる。 The thin sections of the biological surface produced by the thin section production process do not contain adhesive that is ionized by the laser ionization method, so that in the method of analyzing the localization of a target substance using imaging mass spectrometry described below, the localization of the target substance on the biological surface can be analyzed without noise caused by adhesive.
＜対象物質の局在解析方法＞
本発明の対象物質の局在解析方法は、前記イメージング質量分析用薄切片の作製方法で作製したイメージング質量分析用薄切片を、イメージング質量分析法により分析し、前記生体表面における前記対象物質の局在を解析する局在解析工程と、を含む。本発明の対象物質の局在解析方法により、生体表面における対象物質の局在を簡便に解析することができる。
<Method for localization analysis of target substance>
The method for analyzing the localization of a target substance of the present invention includes a localization analysis step of analyzing the thin section for imaging mass spectrometry prepared by the method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry by imaging mass spectrometry to analyze the localization of the target substance on the surface of the living body. By using the method for analyzing the localization of a target substance of the present invention, the localization of the target substance on the surface of the living body can be easily analyzed.
＜＜局在解析工程＞＞
本発明の対象物質の局在解析方法において、局在解析工程は、前記イメージング質量分析用薄切片作製方法において作製した生体表面の薄切片を、イメージング質量分析法により分析し、前記生体表面における前記対象物質の局在を解析する工程である。前記イメージング質量分析用薄切片の作製方法において作製した生体表面の薄切片は、イメージング質量分析法を用いて解析する際に、接着剤がイオン化することがないため、接着剤がイメージング質量分析の際のノイズになることがない。
<<Localization analysis process>>
In the method for localization analysis of a target substance of the present invention, the localization analysis step includes analyzing the thin section of the living body surface prepared by the method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry by imaging mass spectrometry, The thin section of the living body surface prepared by the method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry is analyzed by imaging mass spectrometry, and the adhesive is ionized. Therefore, the adhesive does not become noise during imaging mass spectrometry.
局在解析工程において、生体表面の薄切片は、イメージング質量分析法により分析する前に、前処理してもよい。例えば、対象物質が、揮発性物質の場合は、対象成分が、イメージング質量分析法に供する前に揮発しないように、不揮発性又は難揮発性の誘導体に変換してもよい。 In the localization analysis step, the thin slices of the biological surface may be pretreated before being analyzed by imaging mass spectrometry. For example, if the target substance is a volatile substance, the target component may be converted into a non-volatile or difficult-to-volatile derivative so that it does not volatilize before being subjected to imaging mass spectrometry.
本発明において、イメージング質量分析法とは、組織切片上の１点で質量分析（ＭＳ）測定する一次元ＭＳを行った後、一定間隔（１０～２００μｍ）をおいて再度同条件でＭＳ測定を行い、それをイメージングしたい切片領域内で行う二次元的ＭＳを行い、多数のＭＳスペクトルから測定対象物質のみを抽出し、二次元画像とする方法である。測定対象物質と同質量が検出された位置と、検出されない位置ではコントラストが異なるため，測定対象物質の局在解析が可能になる。 In the present invention, imaging mass spectrometry is a method in which one-dimensional MS is performed at one point on a tissue section, followed by another MS measurement under the same conditions at a fixed interval (10-200 μm), followed by two-dimensional MS within the section area to be imaged, extracting only the substance to be measured from the multiple MS spectra and forming a two-dimensional image. The contrast differs between the position where the same mass as the substance to be measured is detected and the position where it is not detected, making it possible to analyze the localization of the substance to be measured.
イメージング質量分析法は、マトリクス支援型レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析装置を用いて行うことができる。イメージング質量分析法は、薄切片に、イメージング用イオン化支援剤を噴霧し、レーザーを２次元的に操作し、薄切片を２次元的に質量分析することにより行うことができる。イメージング用イオン化支援剤としては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、９－アミノアクリジン等が挙げられる。
イメージング質量分析法は、切片上を二次元的に質量分析することで、測定後に画像を構築するため、画像解像度は、レーザー照射径、照射ステップ間隔、及び、対象物質に塗布するマトリックス結晶の大きさに依存することになる。これらの値が小さい程、画像解像度は高くなるため、好ましい。例えば、レーザー照射径は、５～５０μｍが好ましく、５～２０μｍがより好ましい。照射ステップ間隔は、５～２００μｍが好ましく、５～２０μｍがより好ましい。対象物質に塗布するマトリックス結晶の大きさは、５～５０μｍが好ましく、５～２０μｍがより好ましい。
イメージング質量分析の測定時間は、薄切片の大きさ、画像解像度に応じて適宜決定することができるが、例えば、５分間から５時間である。また、本発明のイメージング質量分析法としては、試料全面に均一な強度でレーザーを照射・イオン化し、静電イオンレンズによって拡大・検出し蛍光板に投影する、投影型イメージング質量分析法を用いることもできる。
Imaging mass spectrometry can be performed using a matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometer. Imaging mass spectrometry can be performed by spraying an ionization-assisting agent for imaging onto a thin section, operating a laser two-dimensionally, and performing two-dimensional mass analysis of the thin section. Examples of the ionization-assisting agent for imaging include α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, sinapic acid, and 9-aminoacridine.
In imaging mass spectrometry, an image is constructed after measurement by performing two-dimensional mass analysis on a slice, so that the image resolution depends on the laser irradiation diameter, the irradiation step interval, and the size of the matrix crystal applied to the target substance. The smaller these values are, the higher the image resolution is, and therefore, preferable. For example, the laser irradiation diameter is preferably 5 to 50 μm, more preferably 5 to 20 μm. The irradiation step interval is preferably 5 to 200 μm, more preferably 5 to 20 μm. The size of the matrix crystal applied to the target substance is preferably 5 to 50 μm, more preferably 5 to 20 μm.
The measurement time for imaging mass spectrometry can be appropriately determined depending on the size of the thin section and the image resolution, and is, for example, 5 minutes to 5 hours. As the imaging mass spectrometry method of the present invention, a projection type imaging mass spectrometry method can also be used, in which a laser is irradiated with a uniform intensity over the entire surface of the sample to ionize it, and the ionized light is magnified and detected by an electrostatic ion lens and projected onto a fluorescent screen.
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will now be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
対象物質を、ペリルアルデヒド（ＰＡ）、βカリオフィレン（βＣ）、ロスマリン酸（ＲＡ）として、シソ葉裏面における対象物質の局在を以下のようにしてイメージング質量分析法により解析した。
シソ葉裏面にシアノアクリレートを滴下し、すぐに導電性ガラスを押し付け、約１分間保持することにより、接着剤を固化させた。その後、導電性ガラスを裏返し、葉を上にして、葉をゆっくりと剥離することで腺鱗及び、葉表層を導電性ガラスに転写した。
導電性ガラスに転写したシソ葉剥離面を顕微鏡観察したところ、図１に示すように、表皮組織、葉脈、腺鱗を視認することができた。
[Example 1]
The target substances were perillaldehyde (PA), β-caryophyllene (βC), and rosmarinic acid (RA), and the localization of the target substances on the abaxial surface of perilla leaves was analyzed by imaging mass spectrometry as follows.
Cyanoacrylate was dropped onto the underside of a perilla leaf, and immediately pressed against a conductive glass and held for about one minute to allow the adhesive to solidify. The conductive glass was then turned over, the leaf facing up, and the leaf was slowly peeled off to transfer the glandular scales and the leaf surface to the conductive glass.
When the peeled surface of a perilla leaf transferred to conductive glass was observed under a microscope, the epidermal tissue, veins, and glandular scales were visible, as shown in Figure 1.
次に、剥離面を上にし、ポリプロピレンやポリエチレンなど疎水性シートを押し付けることで腺鱗をつぶした。こうすることで腺鱗内の物質を腺鱗外へ露出させた。その後、直ちにグリシン（１ｍＭ、６００μＬ）を剥離面へスプレーした。これにより、図２に示すように、ペリルアルデヒドが持つアルデヒド基をグリシンの持つアミノ基がシッフ塩基を形成することで、ペリルアルデヒドが揮発しなくなる。
次に、イメージング用イオン化支援剤である、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を剥離面へスプレーした後、ｒａｐｉｆｌｅＸ（ＢＲＵＫＥＲ社製）を用いて、レーザーを２次元的に走査し剥離面を２次元的に質量分析測定した。この時、レーザーの照射間隔は２０μｍとした。測定後、グリシン－ペリルアルデヒドの質量であるｍ／ｚ ２０９．１を画像化した。その結果を図３に示す。また、図１の顕微鏡観察像と図３のイメージング質量分析像とを重ね合わせた像を図４に示す。
図４に示したように、腺鱗がつぶれた箇所で、ペリルアルデヒドが検出された。このことから、ペリルアルデヒドは腺鱗に局在していることが判明した。
Next, the glandular scales were crushed by pressing a hydrophobic sheet such as polypropylene or polyethylene against the peeled surface. This caused the substances inside the glandular scales to be exposed to the outside of the glandular scales. Glycine (1 mM, 600 μL) was then immediately sprayed onto the peeled surface. As a result, as shown in Figure 2, the aldehyde group of perillaldehyde and the amino group of glycine form a Schiff base, preventing perillaldehyde from volatilizing.
Next, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, an ionization assisting agent for imaging, was sprayed onto the peeled surface, and then a laser was two-dimensionally scanned using a rapifleX (manufactured by BRUKER) to perform two-dimensional mass spectrometry measurement of the peeled surface. At this time, the laser irradiation interval was set to 20 μm. After the measurement, the mass of glycine-perillaldehyde, m/z 209.1, was imaged. The results are shown in FIG. 3. Also, an image obtained by superimposing the microscopic observation image in FIG. 1 and the imaging mass spectrometry image in FIG. 3 is shown in FIG. 4.
As shown in Figure 4, perillaldehyde was detected at the site where the glandular scales were crushed, indicating that perillaldehyde is localized in the glandular scales.
上記と同様にして、βカリオフィレン及びロスマリン酸のシソ葉裏面での局在を、βカリオフィレンの質量であるｍ／ｚ ２０５．３、ロスマリン酸の質量であるｍ／ｚ ３６１．１をイメージング質量分析法で画像化することにより解析した。レーザー照射間隔は２０μｍとした。図５に、βカリオフィレンのイメージング質量分析像、図６に、図１の顕微鏡画像と、図５のイメージング質量分析像とを重ね合わせた像をそれぞれ示す。図７に、ロスマリン酸のイメージング質量分析像、図８に、図１の顕微鏡画像と、図７のイメージング質量分析像とを重ね合わせた像をそれぞれ示す。
図６に示すように、βカリオフィレンについても、ペリルアルデヒドと同様に、腺鱗がつぶれた箇所で、ペリルアルデヒドが検出された。このことから、βカリオフィレンも腺鱗に局在していることが判明した。
それに対し、ロスマリン酸は、図８に示すように、腺鱗と腺鱗以外の表皮細胞とから検出された。このことから、ロスマリン酸は腺鱗以外の表皮細胞にも局在していることが判明した。
In the same manner as above, the localization of β-caryophyllene and rosmarinic acid on the abaxial surface of perilla leaves was analyzed by imaging the masses m/z 205.3 and 361.1 of β-caryophyllene and rosmarinic acid, respectively. The laser irradiation interval was 20 μm. FIG. 5 shows an imaging mass spectrometry image of β-caryophyllene, and FIG. 6 shows an image obtained by superimposing the microscopic image of FIG. 1 and the imaging mass spectrometry image of FIG. 5. FIG. 7 shows an imaging mass spectrometry image of rosmarinic acid, and FIG. 8 shows an image obtained by superimposing the microscopic image of FIG. 1 and the imaging mass spectrometry image of FIG. 7.
As shown in Figure 6, β-caryophyllene was also detected at the site where the glandular scales were crushed, similar to perillaldehyde. This indicates that β-caryophyllene is also localized in the glandular scales.
In contrast, rosmarinic acid was detected in the glandular scales and epidermal cells other than the glandular scales, as shown in Figure 8. This demonstrated that rosmarinic acid is localized in epidermal cells other than the glandular scales.
本発明によれば、熟練を要さずに、対象物質の局在を保持したまま、導電性基材上に生体表面の薄切片を簡便に作製することができる、イメージング質量分析用薄切片の作製方法、及び前記作製方法により作製した薄切片を用いて、イメージング質量分析法により、簡便に、生体表面における対象物質の局在を分析することができる、生体表面における対象物質の局在解析方法を提供することができる。 The present invention provides a method for preparing thin sections for imaging mass spectrometry that can easily prepare thin sections of a biological surface on a conductive substrate while maintaining the localization of a target substance without requiring skill, and a method for analyzing the localization of a target substance on a biological surface that can easily analyze the localization of a target substance on a biological surface by imaging mass spectrometry using a thin section prepared by the preparation method.
Claims (4)
前記生体表面から、前記導電性基材を剥離して、前記対象物質の前記生体表面での局在を保持したまま、前記導電性基材上に前記生体表面の薄切片を作製する薄切片作製工程と、
を含み、
前記レーザーイオン化法でイオン化しない接着剤が、シアノアクリレートまたはエポキシ樹脂である、対象物質を含有する生体表面のイメージング質量分析用薄切片の作製方法。 an adhesion step of adhering a biological surface (excluding the surface of tissue inside the human body) containing a target substance to a conductive substrate using an adhesive that is not ionized by a laser ionization method;
a thin section preparation step of peeling the conductive substrate from the biological surface and preparing a thin section of the biological surface on the conductive substrate while maintaining the localization of the target substance on the biological surface;
Including,
A method for preparing a thin section for imaging mass spectrometry of a biological surface containing a target substance , wherein the adhesive that is not ionized by laser ionization is a cyanoacrylate or an epoxy resin .
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