JP7563757B2

JP7563757B2 - 組成物中のプロテオグリカンの定量方法

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Publication number: JP7563757B2
Application number: JP2021211956A
Authority: JP
Inventors: 達治高橋; 祐太朗辻; 里沙ワイズ
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 2021-05-18
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2024-10-08
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: JP2022177785A

Description

本発明は、プロテイン飲料等に用いられるタンパク質を含む組成物に含有されるプロテオグリカンを定量する方法などに関する。

プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸と共に細胞外マトリックス中の基質を形成する主要な生体高分子である。ヒトや牛などの哺乳動物、鮭や鮫など魚類の軟骨に含まれており、プロテオグリカンを含むサプリメントなどの食品、プロテオグリカンの製造方法等が数多く報告されている。また、プロテオグリカン自体の様々な有用性も数多く知られており、例えば、プロテオグリカンは軟骨分化促進作用やひざ関節改善作用、皮膚色素沈着抑制作用などを有することが報告されている（特許文献１参照）。

上述のように、プロテオグリカンは複合体であり、サプリメントなどの飲食品等の組成物に含有されているプロテオグリカンの含有量を正確に測定することは難しい。そのため、組成物に含まれているプロテオグリカンの含有量について、未だその測定技術が確立されていないのが現実である。例えば、遊離のコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸を除くために、分子量分画膜を有する中空状の容器で前処理を行い、グリコサミノグリカンを比色定量する試薬と組み合わせたプロテオグリカンの定量方法が報告されている（特許文献２参照）。

特開２０１６－１３８０６０号公報特開２０１８－１５１２０６号公報

本発明により解決しようとする課題は、タンパク質（乳タンパク質など）を含む機能性食品等の組成物に含有されているプロテオグリカンを定量する新たな方法を見出すことなど、である。

上記課題を解決するために本発明者は鋭意検討を行った結果、例えば、プロテオグリカンとタンパク質とを含有する組成物を抽出する溶媒を最適化し、当該抽出液をメチレンブルー又はその誘導体を含む呈色試薬を用いてプロテオグリカン濃度を測定することで組成物中のプロテオグリカン含有量を定量しうること、などを見出した。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

（１）プロテオグリカンとタンパク質（乳タンパク質など）とを含有する組成物を、水又はＰＩＰＥＳ緩衝液で抽出する工程と、抽出後の水溶性画分を回収する工程と、メチレンブルー又はその誘導体を含む呈色試薬を用いて、水溶性画分のプロテオグリカン濃度を測定する工程と、水溶性画分のプロテオグリカン濃度から、組成物中のプロテオグリカン含有量を算出する工程と、を含む、組成物中のプロテオグリカンの定量方法。
（２）プロテオグリカンとタンパク質とを含有する組成物を、水又はＰＩＰＥＳ緩衝液で抽出する工程と、抽出後の水溶性画分を回収する工程と、回収された水溶性画分をイオン交換樹脂に吸着させる工程と、吸着したプロテオグリカンを、ＰＩＰＥＳ緩衝液を含む溶出液でイオン交換樹脂から溶出する工程と、溶出されたプロテオグリカンの分子量をＨＰＬＣにより測定する工程と、を含む、組成物中のプロテオグリカンの分析方法。
（３）プロテオグリカンの分子量が１０万～２００万である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）抽出工程を複数回行い、複数の水溶性画分の混合液中のプロテオグリカン濃度を測定する、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）水溶性画分の一部を用いて（２）に記載の方法でプロテオグリカンを分析し、当該プロテオグリカンの分子量と関連付けて、組成物中のプロテオグリカン含有量を算出する、（１）～（４）のいずれかに記載の定量方法。

本発明の方法によれば、プロテオグリカンとタンパク質（乳タンパク質など）とを含有する組成物中のプロテオグリカンの含有量を簡便且つ精密に定量することができる。

図１は、本発明の一実施形態におけるプロテオグリカンの定量方法及び定性分析方法の流れを示す工程図である。図２は、水溶性画分に回収されたプロテオグリカンの定性分析方法の流れを示す工程図である。図３は、本発明の一実施形態において、プロテオグリカン標準品を用いて作成した検量線の例を示す。図４は、プロテオグリカンの定性分析によって得られたＨＰＬＣ分析チャートの一例である。図５（Ａ）は、実施例３での、試料３－１（プロテオグリカンＦが含有）における定性分析の結果（矢印はピーク）を示す。図５（Ｂ）は、実施例３での、試料３－２（プロテオグリカンＦが未含有）における定量分析の結果を示す。図６（Ａ）は、実施例４での、試料溶液４－１－１（プロテオグリカンが含有）における定量分析の結果（矢印はピーク）を示す。図６（Ｂ）は、実施例４での、試料溶液４－１－２（プロテオグリカンが未含有）における定量分析の結果を示す。図６（Ｃ）は、実施例４での、試料溶液４－２－１（プロテオグリカンが含有）における定量分析の結果（ピーク）を示す。図６（Ｄ）は、実施例４での、試料溶液４－２－２（プロテオグリカンが未含有）における定量分析の結果を示す。

最初に、本明細書で用いる用語について簡単に説明する。
（組成物）
本発明の方法により測定対象となる組成物は、例えば、プロテイン飲料等に用いられる乳タンパク質とプロテオグリカンとを含む組成物等が挙げられ、液体、固体又は半固体の形態を含むが固体状態が好ましく、より好ましくは粉体組成物である。また、この組成物に含まれるプロテオグリカン含有量の下限は、０μｇ／ｍｇ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｇ、より好ましくは１μｇ／ｍｇである。組成物中のプロテオグリカン含有量は検出限界値以上であれば測定することができ、また、検出できなかった場合はプロテオグリカンの含有量が検出限界値以下であることが分かるからである。この組成物に含まれるプロテオグリカン含有量の上限は特に制限はないが、好ましくは、組成物を製造するためのコスト的な観点から通常１００μｇ／ｍｇ以下である。

（タンパク質）
組成物に含まれるタンパク質は、例えば、乳タンパク質、植物由来のプロテイン（例えば、ソイプロテイン、エンドウ豆由来のプロテイン）、魚介類由来のプロテイン、がある。乳タンパク質は、例えば脱脂粉乳、全脂粉乳、トータルミルクプロテイン、ホエイプロテイン、カゼインプロテイン、カゼインナトリウム、乳清蛋白質、バターミルクパウダー、牛乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、ナチュラルチーズ、である。例えば、Ｗｈｅｙｃｏ社の販売するＷ８０Ｉｎｓｔａｎｔは、チーズホエイ由来のホエイタンパク質であり、主成分のβ－ラクトグロブリン（分子量３６６００の２量体）、α－ラクトアルブミン（分子量１４２００）に加え、ＢＳＡやラクトフェリンなどから構成されている。

（プロテオグリカン）
プロテオグリカンはコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックスの主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、プロテオグリカンは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。プロテオグリカンに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を保持することで、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。

本発明の方法で測定しうるプロテオグリカンの種類としては、特に制限されるものではなく、サケ鼻軟骨、イカ頭部軟骨及び豚軟骨などから抽出されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はケラタン硫酸プロテオグリカンのいずれに分類されるものであってもよい。具体的には、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、デコリン、ビグリカン、セルグリシン、パールカン、シンデカン、グリピカン、ルミカン、ケラトカン等が例示される。これらの中でも、本発明の方法には、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、更に好ましくはアグリカン含量の測定に適している。本発明において用いられるプロテオグリカンの分子量は特に制限されないが、好ましくは、１０万～２００万である。

（抽出液）
本発明の方法で用いる抽出液は、水又はＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）緩衝液である。ＰＩＰＥＳ緩衝液は、約１ｍＭ以上の濃度で用いることができ、約５ｍＭ以上が好ましく、約１０ｍＭ以上がさらに好ましい。またＰＩＰＥＳ緩衝液濃度の上限は約１００ｍＭであり、約５０ｍＭ以下が好ましく、約２０ｍＭ以下がさらに好ましい。当該抽出液のｐＨは、約６．０～約８．０（例えば、約７．０）である。後述する実施例において用いた具体的な抽出液は、精製水、又は１０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液を含み、約７．０のｐＨを有する。本発明の方法に使用される緩衝液は、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＮａＯＡｃ）を同時に含んでもよい。

（イオン交換樹脂）
用語、イオン交換樹脂とは、負に荷電した固相（すなわち、陽イオン交換樹脂）、又は正に荷電した固相（すなわち、陰イオン交換樹脂）をいう。この荷電は、１つ以上の荷電したイオン基を（例えば、共有結合によって）固相に結合させることによって提供される。あるいは、この電荷は、全体として正電荷を有するキチンやキトサンのように固相の内在的性質であり得る。

固相とは、１つ以上の荷電したイオン基が接着し得る非水性マトリックスを意味する。この固相は、精製カラム、個々の粒子の非連続的な相、膜、またはフィルターなどであり得る。固相を形成するための材料の例としては、多糖類（例えば、アガロースおよびセルロース）、及び他の機械的に安定なマトリックス（例えば、シリカ（例えば、制御された孔を有するガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、および上記のいずれかの誘導体）が挙げられる。

陰イオン交換樹脂は、正に荷電した（例えば、固相に結合された４級アミノ基のような、１つ以上の正に荷電したイオン基を有する）固相を指す。市販の陰イオン交換樹脂としては、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥＳＥＰＨＡＤＥＸ^ＴＭ、及びＦＡＳＴＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。陰イオン交換樹脂は、そのイオン基の解離性により強塩基性又は弱塩基性に分けられる。

弱塩基性陰イオン交換樹脂とは、例えば、１～３級アミノ基を官能基として持つ樹脂のように、弱塩基性を示す陰イオン交換樹脂を意味する。弱塩基の官能基はアルカリ溶液中では解離せずイオン交換能を示さないため中性領域で使用することが好ましい。また、プロテオグリカン中のスルホ基のような比較的強い酸性基とは交換するが、夾雑タンパク質中のカルボキシ基のような弱酸性基とは交換しにくいと考えられる。

（呈色試薬）
本実施形態で用いる呈色試薬は、メチレンブルー又はその誘導体を含む。メチレンブルー（ＭＢ）はチアジン系の塩基性色素で陽性に荷電し、核酸やムコ多糖類等の酸性物質と結合し青色の色調を示すため染色試薬として用いられる。ＭＢは水溶液中において単量体と二量体として存在することが知られており、分光光度計による吸光度測定で確認することができる（極大吸収波長、単量体：６６４ｎｍ、二量体：６１６ｎｍ）。メチレンブルー誘導体の例としては、１－メチルメチレンブルー、１，９－ジメチルメチレンブルー、メチレンバイオレット、ブロモメチレンバイオレット、４－ヨードメチレンバイオレット、１，９－ジメチル－３－ジメチル－アミノ－７－ジエチル－アミノ－フェノチアジン、および１，９－ジメチル－３－ジメチルアミノ－７－ジブチル－アミノ－フェノチアジンが挙げられるがこれらに限定されない。

これらの試薬の中でも、グリコサミノグリカンを選択的に比色定量できる試薬が好ましく、ＢＬＹＳＣＡＮＧＬＹＣＯＳＡＭＩＮＯＧＬＹＣＡＮＡＳＳＡＹＫＩＴ（ＡＣＣＵＲＡＴＣＨＥＭＩＣＡＬ＆ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社製）、Ｒｈｅｕｍｅｒａｋｉｔ（ＡｓｔａｒｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）、ＢｌｙｓｃａｎＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）などが市販されている。

以下に本発明の定量方法及び定性分析方法について、図面を参照して説明する。図１は、一実施形態におけるプロテオグリカンの定量方法及び定性分析方法の流れを示す工程図である。図１に示すように、本実施形態の方法は、測定対象となるプロテオグリカン含有組成物から測定試料を採取する工程（Ｓ１）と、この試料を水又はＰＩＰＥＳ緩衝液に溶解してプロテオグリカンを抽出する抽出工程（Ｓ２）と、抽出後の水溶性画分を回収する回収工程（Ｓ３）と、メチレンブルー又はその誘導体を含む呈色試薬を用いて、水溶性画分のプロテオグリカン濃度を測定する比色定量工程（Ｓ４）と、を含む。なお、回収工程（Ｓ３）で得られた水溶性画分の一部を用いてプロテオグリカンの分子量を測定する定性分析工程（Ｓ５）を備えてもよい。これにより、組成物中のプロテオグリカンの定量分析と定性分析とを同時に行うことができる。

ここで、測定試料の抽出工程Ｓ２は、本発明の方法における最も重要な工程である。上述したように、プロテオグリカンは極めて高分子量の糖タンパク質であるため溶液中での凝集を防ぐ必要がある。このため、測定対象の組成物を、水又はプロテオグリカンの官能基の解離に適した緩衝液に溶解する。このような緩衝液としては、例えば、ＰＩＰＥＳナトリウム緩衝液及び／又はＰＩＰＥＳカリウム緩衝液が挙げられる。好ましくは、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンを含み、及びカルシウムイオンを含まないＰＩＰＥＳ緩衝液である。ナトリウムイオン及びカリウムイオンの濃度は特に限定されないが、５ｍＭ以上の濃度であることが好ましく、さらに好ましくは１０ｍＭ以上である。

上記抽出液を用いて測定試料からプロテオグリカンを抽出する方法は特に限定されないが、ボルテックスミキサー等を用いた攪拌、又は超音波処理などを単独で又は組み合わせて行うことができる。抽出後に、例えば、２５℃にて、回転数３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することなどにより水溶性画分を回収する（Ｓ３）。この抽出工程（Ｓ２）は、複数回行い、複数の水溶性画分を混合して混合溶液中のプロテオグリカン濃度を測定することが好ましい。

続いての比色定量工程（Ｓ４）は、上記メチレンブルー又はその誘導体を含む呈色試薬を用いて、水溶性画分のプロテオグリカン濃度を測定する工程と、得られたプロテオグリカン濃度から、組成物中のプロテオグリカン含有量を算出する工程と、を含む。この呈色反応は、硫酸化プロテオグリカンを分析するための定量的な色素結合法である。典型的な色素標識である１，９－ジメチルメチレンブルーを使用した場合は、プロテオグリカンの硫酸化多糖成分に特異的に結合して青色の色調を示す。このとき、プロテオグリカン標準品を用いて測定した吸光度を既知の濃度に対してプロットすれば直線のグラフが得られる。図３に、このようにして作成した検量線の例を示す。被験物質の濃度は、グラフから読み取るか、または傾きの度合いから算出することができる。１，９－ジメチルメチレンブルーの吸収スペクトルは、６５６ｎｍにピークの最大値があるが、吸光度のピークは広いので、６２５～６７５ｎｍの間の吸光度を測定すればよい。

図２は、上記定性分析工程（Ｓ５）をさらに詳細に説明したものである。定性分析工程（Ｓ５）は、最初に、平衡化緩衝液で平衡化されたイオン交換樹脂に上記で回収された水溶性画分を吸着させる工程（Ｓ５１）と、プロテオグリカンが吸着したイオン交換樹脂を、上記緩衝液を含む洗浄緩衝液で洗浄した後、当該イオン交換樹脂から溶出緩衝液でプロテオグリカンを溶出する及び／又は脱着する工程（Ｓ５２）と、溶出されたプロテオグリカンの分子量をＨＰＬＣにより測定するＨＰＬＣ分析工程（Ｓ５３）と、を含む。

吸着工程（Ｓ５１）において負荷される試料中のプロテオグリカンは、官能基の解離に適した緩衝液に溶解されているため効率よくイオン交換樹脂に吸着される。プロテオグリカンの吸着を促進するために、室温ないし低温（４℃～１０℃）で、低流速で測定試料をチャージすることが好ましい。イオン交換樹脂の洗浄には、測定試料の調製に用いた緩衝液及び／又は平衡化緩衝液と同じ緩衝液が好ましい。洗浄緩衝液には、夾雑物をカラムから除去するために溶液のイオン強度を上げるための塩を含んでもよい。例えば、ＮａＣｌを添加する場合の濃度は０～０．４Ｍ未満であり、好ましくはＮａＣｌを含まない緩衝液と約０．２ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を逐次的に用いてもよい。

溶出工程（Ｓ５２）で用いられる溶出緩衝液は、測定試料の調製に用いた緩衝液を含んでも含まなくてもよいが、溶出されるプロテオグリカンの凝集を抑止するために、平衡化緩衝液と同じ緩衝液を用いることが好ましい。溶出液のイオン強度は、イオン交換樹脂に対するプロテオグリカンの吸着力を減弱させる程度のイオン強度が好ましく、例えば、ＮａＣｌを添加する場合の濃度は０．４Ｍ以上であり、好ましくは約０．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いることができる。

ＨＰＬＣ分析工程（Ｓ５３）では、最初に溶出液を脱塩することが好ましい。ＨＰＬＣによる検出を容易にする上で、溶出液に含まれる塩濃度を低下させるためである。ＨＰＬＣ分析工程（Ｓ５３）におけるサイズ排除ゲルクロマトグラフィー用のカラムとしては、分析可能な分子量が１０万～２００万に対応しているカラムを用いればよいが、分離能がよくなることから粒子径１０μｍ以上の充填剤を含むカラムやタンパク分析用のカラムを使用することが好ましく、特に基材がメタクリレートポリマーのカラムを用いることが好ましい。

ＨＰＬＣ法における検出は、溶媒と比較した被分析物の屈折率を利用する示唆屈折率検出器や、ＵＶ検出器を使用して２００～２８０ｎｍの吸光度を検出する方法等が使用でき、特に２００～２２０ｎｍのＵＶ波長におけるＵＶ検出器が好ましい。また、プロテオグリカンのピークは標準品であるプロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬工業製）を用意し、分析対象の試料とクロマトグラムを重ねほぼ同じ溶出範囲にピークがあれば、そのピークがプロテオグリカンを検出したピークであることが分かる。また、予めプロテオグリカンの標準品で検量線を作成することで、試料中のプロテオグリカンの定量を行ってもよい。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。

（実施例１）
プロテオグリカン０．４４質量％含有、所定の乳タンパク質を所定量含有された試料粉末約４５４．５ｍｇに、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）又は酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を、それぞれ１５ｍＬ加えた。次に、これらの水溶液を超音波処理にて抽出し、遠心分離により上清を回収した。当該上清液を濾紙でろ過し、５０ｍＬの溶液を調製した。以下表１中の「ＰＧ含有量（ｍｇ／５０ｍＬ）」にて、この調製を示している。これを精製水で２倍希釈したものを測定試料とした。

なお、上記各緩衝液の調製方法は以下のとおりである。
１０ｍＭのＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液：３．０５ｇのＰＩＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ）に、精製水約８００ｍＬを加えて、室温で攪拌し、５ＮのＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整した。これに精製水を加えて全容を１０００ｍＬとし、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ溶液を調製した。
リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）：「食品添加物公定書、一般試験法、試薬・試液」に基づいて調製した。
酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）：酢酸ナトリウム三水和物０．３ｇに水８０ｍＬを加え溶解し、酢酸にてｐＨ６．０に調製し、水を加えて１００ｍＬにした。

別に、プロテオグリカンの標準品約２ｍｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に１０ｍＬとした。この液を４／１０、２／１０、１／１０、１／２０、１／４０希釈としたものを標準液とし、さらにリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を０濃度として、ＤＭＭＢ比色定量法により、得られた検量線から試料中のプロテオグリカン量を求めた。ＤＭＭＢ法（ＤｉｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅＢｌｕｅＡｓｓａｙ）は、Ｂｌｙｓｃａｎ^ＴＭＧＬＹＣＯＳＡＭＩＮＯＧＬＹＣＡＮＡＳＳＡＹｋｉｔ（ＢｉｏｃｏｌｏｒＬｔｄ．）を用いて以下の手順で行った。

測定試料１００μｌにＢｌｙｓｃａｎ^ＴＭｄｙｅｒｅａｇｅｎｔ（１．０ｍｌ）を加えた。ボルテックスミキサーで混合し、振盪機にて室温で１０００ｒｐｍ、３０分間攪拌した。遠心分離後上清を除去し、そこに解離試薬（０．５ｍｌ）を加えた。ボルテックスミキサーでよく混合し沈殿を溶解させたものを測定サンプルとした。各サンプル２００μｌを９６マイクロウェルプレートの各ウェルに移し、マイクロプレートリーダーにて、波長６５６ｎｍの吸光度を測定した。標準品、テストサンプルの吸光度を測定し、標準曲線から各試料のプロテオグリカン濃度を求めた。その結果を以下の表１に示す。表１中の「ＰＧ」とは、プロテオグリカンをいう。

表１に示したように、ＰＩＰＥＳ緩衝液を用いた場合に、最も定量的にプロテオグリカンを回収することができた。

（実施例２）組成物中のプロテオグリカンの測定
１．粉末の調製
２種類の粉末を作製した。
図４（Ａ）で示す測定での試料を作製するために、プロテオグリカンを０．４４質量％含有、所定の乳タンパク質を所定量含有された試料粉末約４５４．５ｍｇを準備した。
図４（Ｂ）で示す測定での試料（ブランクの試料）を作製するために、プロテオグリカンを含有せず、所定の乳タンパク質を所定量含有された試料粉末約４５４．５ｍｇを準備した。

ここで、当該粉末に含有された乳タンパク質は、具体的な素材としては脱脂粉乳、全脂粉乳、トータルミルクプロテイン、カゼインナトリウム、乳清タンパク質、バターミルクパウダー、牛乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、ナチュラルチーズ等である。

２．溶液の作製
当該粉末を精密に量り、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１５ｍＬを加え、溶液を作製した。次にこの溶液を所定条件で超音波処理を行い、超音波処理後、遠心分離により上清液を回収した。当該上清液を濾紙でろ過し、５０ｍＬの溶液を調製した。

３．イオン交換処理
弱塩基性陰イオン交換用ゲルであるＴＯＹＯＰＡＫＤＥＡＥＭ（ゲル量２．０ｍＬ、東ソー株式会社製）のカラムに、精製水１０ｍＬを流した後、上記で調製した１０ｍＭのＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬを流してイオン交換樹脂を平衡化した。このカラムに同緩衝液に溶解した上記測定試料１０ｍＬを負荷した。続いて、５ｍＬの同緩衝液でカラムを洗浄後、０．３５ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液１０ｍＬを流してさらに洗浄した。洗浄後のカラムに、０．５ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液１０ｍＬを流してプロテオグリカンをカラムから脱着させた。

４．脱塩処理
上記イオン交換処理で回収した脱着画分１０ｍＬを、アミコンウルトラ遠心式フィルターユニット（分画分子量１００Ｋ、メルク株式会社）を用いて最初に脱着液で１回洗浄後、精製水で洗浄して脱塩した。遠心後のフィルターカップから濃縮液を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて５ｍＬの溶液（測定試料）とした。

別に、プロテオグリカンの標準品（富士フイルム和光純薬工業製）約１ｍｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ｍＬ（標準液）とした。

５．ＨＰＬＣ分析
上述で作製した測定試料及び標準液を用いて、以下の操作条件でＨＰＬＣ分析を行い、測定試料中のプロテオグリカンの含有の有無を測定した。
検出器：ＵＶ－ＶＩＳ検出器ＳＰＤ－２０Ａ（株式会社島津製作所製）
測定波長：２１５ｎｍ
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ５０００－ＰＷＸＬ φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ（東ソー株式会社製）
カラム温度：４０℃
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流速：０．５ｍＬ／分
注入量：１００μＬ

この測定の結果を図４に示す。図４（Ａ）の矢印は、プロテオグリカンの溶出位置（１２．７３３ｍｉｎ）を示す。なお、図示しないが当該標準液を用いてのＨＰＬＣ分析では、プロテオグリカンＦの溶出位置が１２．７ｍｉｎ付近であった。
一方、図４（Ｂ）は、プロテオグリカンを含まないブランクの試料を分析した結果である。プロテオグリカンの溶出位置が確認できなかった。

（実施例３）組成物中のプロテオグリカンの定量分析
１．粉末の調製（試料３－１及び試料３－２）
図５で示す測定で用いる試料の作製用に、以下に示す２種類の粉末（試料３－１及び試料３－２）を作製した。

・試料３－１：プロテオグリカンＦ（一丸ファルコス）を６．４質量％含有、所定のペクチンを所定量含有された試料粉末約２３１．７ｍｇを準備した。
・試料３－２：プロテオグリカンＦ（一丸ファルコス）を未含有、所定のペクチンを所定量含有された試料粉末約２３１．７ｍｇを準備した。

２．標準溶液の作製
以下３．と並行して、標準溶液を作製した。プロテオグリカンの標準品（富士フイルム和光純薬工業）約２ｍｇを精密に量り、約２ｍｇの粉末を準備した。リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて当該粉末を溶解して、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて標準溶液を作製した。

なお、本実施例３において用いられたリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）は、「食品添加物公定書一般試験法試薬・試液」である。

３．試料溶液の作製（試料３－１及び試料３－２）
当該粉末（試料３－１、試料３－２）をそれぞれ精密に量り、それぞれ約２３１．７ｍｇ準備した。当該約２３１．７ｍｇの粉末を、精製水１５ｍＬを加え、超音波処理を１５分間行い、溶解させて溶液を作製した。この溶液に、ペクチナーゼ（ＰｅｃｔｉｎａｓｅｆｒｏｍＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔｕｓ、ＳＩＧＭＡ、Ｐ２６１１）２０μＬを加え、５０℃にて６０分間酵素処理を行った。当該ペクチナーゼ（酵素）を失活させるために、当該処理後の溶液を、８０℃にて３０分間の処理を行った。

当該３０分間の処理後の溶液について、約１８００Ｇで１０分間遠心分離を行い、当該遠心分離後の上清液を回収した。アミコンウルトラ遠心式フィルターユニット（分画分子量１００Ｋ、メルク株式会社）を用いて、当該上清液を約２４００Ｇで３０分間遠心分離した。当該膜を透過しない側のプロテオグリカン分画（プロテオグリカンを濃縮して含有されている分画）を精製した。プロテオグリカン分画は、５回水洗を行った。得られたプロテオグリカン分画にリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に２０ｍＬとした（２０ｍＬの溶液を作製した）。当該作製した溶液を０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過した。当該ろ過したろ液を試料溶液とする。なお、試料溶液の調製方法は、同等の回収率が得られる方法であれば、他の方法を代用可能である。

３．液体クロマトグラフィーによる測定
標準溶液及び試料溶液を次の操作条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行い、検量線から試験溶液中のプロテオグリカン濃度を算出し、次式により、標準溶液並びに試料溶液（試料３－１及び試料３－２）の中のプロテオグリカン含量を求めた。

計算方法：
プロテオグリカン含量（％）＝（Ａ×Ｖ×Ｎ×１／Ｗ）×１００
Ａ：試験溶液中のプロテオグリカン濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｖ：定容量（ｍＬ）
Ｎ：希釈倍数
Ｗ：試験品採取量（ｍｇ）

操作条件：
検出器：示差屈折計（ＲＩＤ－１０Ａ、島津製作所）
カラム：ゲルろ過カラム（東ソー株式会社製、ＴＳＫｇｅｌＧ５０００ＰＷＸＬ）
カラム管：内径約７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍのステンレス管
カラム温度：４０℃
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．５ｍＬ／分
注入量：５０μＬ

この測定の結果を図５に示す。図５（Ａ）の矢印は、試料溶液（プロテオグリカン含有の試料３－１の溶液）のプロテオグリカンの溶出位置（１３ｍｉｎ～１５ｍｉｎ）を示す。なお、図示しないが当該標準液を用いてのＨＰＬＣ分析では、プロテオグリカンの溶出位置が１３ｍｉｎ～１５ｍｉｎ付近であり、図５（Ａ）の矢印で示す位置とほぼ同じであった。
一方、図５（Ｂ）では、試料溶液（プロテオグリカン未含有の試料３－２の溶液）では、当該プロテオグリカンの溶出位置がペクチンなどの他の成分の存在により明確に確認できず、当該試料溶液（３－２）中の当該プロテオグリカンの量を定量できなかった。

（実施例４）組成物中のプロテオグリカンの定量分析
１．ソフトカプセルの作製（試料４－１及び試料４－２）
図６で示す測定で用いる試料の作製用に、２種類のソフトカプセル（試料４－１及び試料４－２、ゼラチン含有のソフトカプセル）を作製した。

・試料４－１：植物油を約１９０ｍｇ、プロテオグリカンを５．５ｍｇ含有したソフトカプセル４７０．００ｍｇを準備した。
・試料４－２：植物油を約１９０ｍｇ、プロテオグリカンを未含有のソフトカプセル４７０．００ｍｇを準備した。

なお、本実施例４において用いられたリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）は、「食品添加物公定書一般試験法試薬・試液」である。

３．試料溶液の作製
当該ソフトカプセルから、以下の試料溶液（溶液４－１－１、溶液４－１―２、溶液４－２－１、溶液４－２－２）を作製した。
・溶液４－１－１：クロロホルム溶液（キシダ化学、２８２－１６０１３）を加え、試料４－１を溶解した溶液
・溶液４－１－２：クロロホルム溶液（キシダ化学、２８２－１６０１３）を加え、試料４－２を溶解した溶液
・溶液４－２－１：アセトン溶液（キシダ化学、１７０－００３０５）を加え、試料４－１を溶解した溶液
・溶液４－２－２：アセトン溶液（キシダ化学、１７０－００３０５）を加え、試料４－２を溶解した溶液

当該試料溶液の作製において、次のように、ソフトカプセルを溶媒に溶解させた。はさみなどを用いてソフトカプセルを２分割した。当該２分割したものを遠沈管（５０ｍＬ容量）に投入し、各溶媒（クロロホルム溶液、アセトン溶液など）１０ｍＬを加えた。次に、超音波洗浄機にて１５分間処理を行った。
なお、溶媒としてヘキサン溶液（キシダ化学、１４０－３６７６３）を用いた場合、上述のカプセル（試料４－１及び試料４－２）は溶解しなかった。

遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）により、当該遠心分離後の上清（当該溶媒）を除去した。当該遠心分離後のペレットに、１００％エタノール溶液を２０ｍＬ加え、溶解液をそれぞれ新たに作製した。当該溶解液を、再度、遠心分離機において同様の処理をおこなった。この工程を５回繰り返し、使用した溶媒をエタノールへと置換した。

得られた析出物に４Ｍ－グアニジン塩酸溶液１５ｍＬを加えて溶解し、アミコンウルトラ遠心式フィルターユニット（分画分子量１００Ｋ、メルク株式会社）にてプロテオグリカン画分を濃縮精製した。この際、原液を洗浄透過後、精製水１５ｍＬにて遠沈管をリンスし、このリンス水を用いて分画膜の水洗を１回行った。精製したプロテオグリカン濃縮液にリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に５０ｍＬとし、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したろ液を試料溶液として、当該測定サンプル中のプロテオグリンの定量分析を行った。

３．液体クロマトグラフィーによる測定
標準溶液及び試料溶液を次の操作条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行い、検量線から試験溶液中のプロテオグリカン濃度を算出し、次式により、標準溶液並びに試料溶液（試料溶液４－１－１、試料溶液４－１―２、試料溶液４－２－１及び試料溶液４－２－２）の中のプロテオグリカン含量を求めた。

この測定の結果を図６に示す。
図６（Ａ）の矢印は、当該試料溶液４－１―１（プロテオグリカンが含有、ソフトカプセルをクロロホルム溶液で溶解）のプロテオグリカンの溶出位置（１３ｍｉｎ～１５ｍｉｎ）を示す。以下、図６（Ｃ）で示す測定の結果と比べて、図６（Ａ）の点線矢印で示す溶出位置（１６ｍｉｎ）付近で、夾雑物の検出が確認された。
図６（Ｂ）では、当該試料溶液４－１－２（プロテオグリカンが未含有、ソフトカプセルをクロロホルム溶液で溶解）の測定結果を示すが、矢印の位置位置（１３ｍｉｎ～１５ｍｉｎ）でプロテオグリカンのピークが確認されなかった。
図６（Ｃ）の矢印は、当該試料溶液４－２―１（プロテオグリカンが含有、ソフトカプセルをアセトン溶液で溶解）のプロテオグリカンの溶出位置（１３ｍｉｎ～１５ｍｉｎ）を示す。以下、図６（Ａ）で示す測定の結果と比べて、溶出位置（１６ｍｉｎ）付近で、夾雑物の検出が確認されなかった。
図６（Ｄ）では、当該試料溶液４－２－２（プロテオグリカンが未含有、ソフトカプセルをアセトン溶液で溶解）の測定結果を示すが、矢印の位置位置（１３ｍｉｎ～１５ｍｉｎ）でプロテオグリカンのピークが確認されなかった。

プロテオグリカンとタンパク質（乳タンパク質など）とを含む組成物は、例えば、カルシウムを骨に定着させるとともに、軟骨分化促進作用やひざ関節改善作用を有する機能性食品として期待される。本発明の方法によれば、プロテオグリカンとタンパク質とを含有する組成物中のプロテオグリカンの含有量を簡便且つ精密に定量することができることから、このような機能性食品の品質管理等に利用することができる。

Claims

プロテオグリカンとタンパク質とを含有する組成物を、ＰＩＰＥＳナトリウム緩衝液及び／又はＰＩＰＥＳカリウム緩衝液で抽出する工程と、
前記抽出後の水溶性画分を回収する工程と、
メチレンブルー又はその誘導体を含む呈色試薬を用いて、前記水溶性画分のプロテオグリカン濃度を測定する工程と、
前記水溶性画分のプロテオグリカン濃度から、前記組成物中のプロテオグリカン含有量を算出する工程と、
を含む、組成物中のプロテオグリカンの定量方法。
プロテオグリカンとタンパク質とを含有する組成物を、ＰＩＰＥＳナトリウム緩衝液及び／又はＰＩＰＥＳカリウム緩衝液で抽出する工程と、
前記抽出後の水溶性画分を回収する工程と、
回収された水溶性画分をイオン交換樹脂に吸着させる工程と、
前記吸着したプロテオグリカンを、ＰＩＰＥＳ緩衝液を含む溶出液で前記イオン交換樹脂から溶出する工程と、
前記溶出されたプロテオグリカンの分子量をＨＰＬＣにより測定する工程と、
を含む、組成物中のプロテオグリカンの分析方法。
前記ＰＩＰＥＳナトリウム緩衝液及び／又はＰＩＰＥＳカリウム緩衝液のナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンの濃度が５ｍＭ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
前記タンパク質が、乳タンパク質、植物由来のプロテイン及び／又は魚介類由来のプロテイン、である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。