JP7566466B2

JP7566466B2 - アルコール飲料

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Publication number: JP7566466B2
Application number: JP2019553111A
Authority: JP
Inventors: チュエンリウ，シャオ; ジー，アルシンチャン，メイ
Original assignee: ナショナルユニヴァーシティーオブシンガポール
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2024-10-15
Anticipated expiration: 2038-03-27
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Description

本発明は、アルコール飲料に関する。特に、アルコール飲料は、プロバイオティック細菌を含んでもよい。

プロバイオティクスから得ることができる健康上の利益から、プロバイオティクスの消費に対する関心が高まっている。現在、多くの食品及び飲料がプロバイオティクスを含んでいる。しかし、食品及び飲料のほとんどは、乳製品ベースの製品であり、したがって、これらは、乳糖不耐症の人には理想的ではない可能性がある。したがって、乳製品分野以外の新しい食品環境におけるプロバイオティクスの新規送達方法に関する研究が進行中である。

麦芽ベースの飲料は、いくつかのラクトバチルス属(Lactobacillus)プロバイオティック株の生存力に対して保護効果を示すことが示されている。アルコール飲料、特に特製ビールは、消費者の間で人気が高まっている。ビールは、麦芽ベースの飲料である。しかし、ビールはプロバイオティック細菌の増殖を妨げ、生存を損なう多くの固有の抗微生物障害を有するため、ビール中でプロバイオティック生存力を維持することは、依然として主要な技術的難題である。ビール中の主な抗微生物化合物はイソ-α-酸であり、これは、イオノフォアとして作用し、細胞内酸性化、及びエネルギー生成及びレドックス恒常性の阻害などの様々なメカニズムを通してグラム陽性細菌の増殖を制限する。プロバイオティック細菌は、ビールから単離されておらず、ビール中で増殖し、生き残るために酸の阻害作用を克服するメカニズムを持っていない。

本発明は、これらの課題に対処し、及び/又はプロバイオティック細菌を含む改善された飲料を提供しようとするものである。

大まかに言えば、本発明は、プロバイオティック細菌を含むアルコール飲料に関する。本発明のアルコール飲料は、プロバイオティック細菌を含む飲料という点で、他のアルコール飲料と比較して健康上の利益を提供し得る。特に、プロバイオティック細菌は、腸の健康及び免疫系機能の増強などの健康上の利益を提供することが示されている。

第1の態様によれば、本発明は、プロバイオティック細菌を含むアルコール飲料を提供する。

アルコール飲料は、適切なアルコール含有量を有してよい。特定の態様によれば、アルコール飲料のアルコール含有量は、≧0.5体積％であってもよい。特に、アルコール含有量は、0.5～10％、1.0～9.0％、1.5～8.0％、2.0～7.5％、2.5～7.0％、3.0～6.5％、3.5～6.0％、4.0～5.5％、4.5～5.0％であってもよい。さらにより具体的には、アルコール含有量は、2.0～5.0％であってもよい。

アルコール飲料は、任意の適切なアルコール飲料であってよい。特に、アルコール飲料は、ビールである。特定の態様によれば、アルコール飲料は、ホップをさらに含んでもよい。本発明の目的のために、ホップへの言及は、ホップ及び/又はその誘導物を指す。ホップは、任意の適切なホップであってよい。例えば、ホップは、異性化ホップ抽出物であってもよい。ホップは、適切な苦味を有してよい。特に、ホップは、≦30 IBUの苦味を有してもよい。さらにより具体的には、苦味は、0～30 IBU、3～27 IBU、5～25 IBU、7.5～20 IBU、9～18 IBU、10～16 IBU、12～15 IBU、13～14 IBUであってもよい。

アルコール飲料に含まれるプロバイオティック細菌は、任意の適切なプロバイオティック細菌であってよい。例えば、プロバイオティック細菌は、乳酸桿菌(lactobacilli)、ビフィドバクテリア(bifidobacteria)、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。特に、乳酸桿菌は、以下に限定されないが、ラクトバチルス(L.)パラカゼイ(Lactobacillus (L.) paracasei)、L.ラムノサス(L. rhamnosus)、L.アシドフィルス(L. acidophilus)、L.カゼイ(L. casei)、L.ファーメンタム(L. fermentum)、L.プランタルム(L. plantarum)又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

適切な量のプロバイオティック細菌が、アルコール飲料に含まれてよい。例えば、プロバイオティック細菌は、≧5.0 log CFU/mLの細胞数を有してもよい。特に、アルコール飲料に含まれるプロバイオティック細菌は、5.0～12.0 log CFU/mL、5.5～11.5 log CFU/mL、6.0～11.0 log CFU/mL、6.5～10.5 log CFU/mL、7.0～10.0 log CFU/mL、7.5～9.5 log CFU/mL、8.0～9.0 log CFU/mLの細胞数を有してもよい。さらにより具体的には、アルコール飲料に含まれるプロバイオティック細菌は、約7.0 log CFU/mLの細胞数を有してもよい。

アルコール飲料は、適切なpHを有してよい。例えば、アルコール飲料のpHは、2～6であってもよい。特に、pHは、2.5～5.5、3～5、3.5～4.5、3.75～4.0であってもよい。さらにより具体的には、pHは、約3～5であってもよい。

アルコール飲料は、適切なブリックス(Brix)を有してよい。例えば、アルコール飲料のブリックスは、4～20°Bxであってもよい。特に、ブリックスは、5～18°Bx、6～15°Bx、7～12°Bx、8～10°Bx、9～9.5°Bxであってもよい。さらにより具体的には、ブリックスは、約5～15°Bxであってもよい。

本発明の第2の態様によれば、上記のアルコール飲料を形成する方法であって、
- ワート(wort)又はマスト(must)を提供するステップ;
- プロバイオティック細菌をワート又はマストに添加するステップ;
- 酵母をワート又はマストに添加するステップ; 及び
- 所定の期間及び所定の温度でワート又はマストを発酵させて、アルコール飲料を形成するステップ
を含む、方法が提供される。

ワート又はマストは、本発明の目的に適した任意のワート又はマストであってよい。

ワート又はマストに添加されるプロバイオティック細菌は、任意の適切なプロバイオティック細菌であってよい。例えば、プロバイオティック細菌は、上記のとおりであってもよい。

ワート又はマストに添加される酵母は、本発明の目的に適した任意の酵母であってよい。例えば、酵母は、サッカロミセス属(Saccharomyces)酵母、非サッカロミセス属(non-Saccharomyces)酵母、又はそれらの組み合わせであってもよい。特定の態様によれば、酵母は、以下に限定されないが、サッカロミセス(S.)セレビシエ(Saccharomyces (S.) cerevisiae)、S.パスツリアヌス(S. pasteurianus)、トルラスポラ(T.)デルブレッキイ(Torulaspora (T.) delbrueckii)、ラカンセア(L.)サーモトレランス(Lachancea (L.) thermotolerans)、ピキア(P.)クルイベリ(Pichia (P.) kluyveri)、メチニコビア(M.)プルケリマ(Metschnikowia (M.) pulcherrima)、又はそれらの組み合わせであってもよい。

この方法は、ホップをワート又はマストに添加することをさらに含んでもよい。ワート又はマストに添加されるホップは、上記の任意の適切なホップであってよい。

プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加は、同時に又は連続して行ってよい。

特定の態様によれば、プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加は、同時に行ってよい。次いで、発酵は、適切な条件下で行ってよい。例えば、発酵は、ワート又はマストを第1の温度で第1の期間発酵させ、その後、ワート又はマストを第2の温度で第2の期間発酵させることを含んでもよい。この方法は、第2の期間の終わりにホップを添加することをさらに含んでもよい。

特定の態様によれば、プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加は、連続して行ってよい。特に、酵母の添加は、プロバイオティック細菌の添加後の第3の期間後に行ってもよい。次いで、発酵は、適切な条件下で行ってよい。例えば、発酵は、ワート又はマストを第3の温度で酵母添加後の第4の期間発酵させ、その後、ワート又はマストを第4の温度で第5の期間発酵させることを含む。この方法は、第5の期間の終わりにホップを添加することをさらに含んでもよい。

第1の期間、第2の期間、第3の期間、第4の期間及び第5の期間は、任意の適切な時間量であってよい。期間は、ワート又はマストに添加されるプロバイオティック細菌及び酵母に応じて選択してよい。

第1の温度、第2の温度、第3の温度及び第4の温度は、本発明の目的に適した任意の温度であってよい。例えば、第1の温度及び第3の温度は、同じであってもよい。例えば、第2の温度及び第4の温度は、同じであってもよい。

特に、第1の温度及び第3の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、20～42℃であってもよい。さらにより具体的には、第1の温度及び第3の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、約30℃であってもよい。

特に、第2の温度及び第4の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、18～30℃であってもよい。さらにより具体的には、第2の温度及び第4の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、約20℃であってもよい。

特定の態様によれば、形成されたアルコール飲料は、発酵後に適切な温度で保存してもよい。例えば、本発明の方法から形成されたアルコール飲料は、≦20℃の温度で保存してもよい。特に、アルコール飲料は、約≦10℃の温度で保存してもよい。さらにより具体的には、アルコール飲料は、約1～5℃の温度で保存してもよい。

本発明を十分に理解し、容易に実行に移し得るために、添付の実例となる図面を参照して、非限定的な例としてのみ、例示的な実施形態をここに説明する。

図1は、ホップ添加ワート中での10日間の発酵中の3つのプロバイオティック細菌株の生存のグラフを示す: (●)L.パラカゼイL26; (X)L.パラカゼイLpc-37及び; (◆)L.ラムノサスHN001。^#エラーバーは標準偏差を示す(n=3)。*発酵温度は、全体を通して37℃で行われた。図2は、共発酵期間、及び5℃及び25℃での保存期間中のL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す: (○)L.パラカゼイL26、5℃; (●)L.パラカゼイL26、25℃; (□)L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04の共接種、5℃及び; (■)L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04の共接種、25℃。^*発酵温度は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から10日目まで20℃で行った。^*27 IBUの異性化ホップ抽出物を10日目に添加した。図3は、連続発酵期間、及び5℃及び25℃での保存期間中のL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す: (○)L.パラカゼイL26、5℃; (●)L.パラカゼイL26、25℃; (□)L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04の連続接種、5℃及び; (■)L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04の連続接種、25℃。^*発酵温度は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から10日目まで20℃で行った。^S.セレビシエS-04を2日目に添加した。^#27 IBUの異性化ホップ抽出物を10日目に添加した。図4は、5℃でのビールの保存中の共接種されたL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す: (□)0 IBU、5℃; (X)7.5 IBU、5℃; (○)15 IBU、5℃; (△)22.5 IBU、5℃。^*発酵温度は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から10日目まで20℃で行った。^#異性化ホップ抽出物を10日目に添加した。図5は、25℃でのビールの保存中の共接種されたL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す: (■)0 IBU、25℃; (＋)7.5 IBU、25℃; (●)15 IBU、25℃; (▲)22.5 IBU、25℃。^*発酵温度は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から10日目まで20℃で行った。^#異性化ホップ抽出物を10日目に添加した。図6(a)は、発酵及び5℃でのビールの保存中のpHの変化を示し: (□)0 IBU、5℃; (X)7.5 IBU、5℃; (○)15 IBU、5℃; (△)22.5 IBU、5℃、図6(b)は、発酵及び25℃でのビールの保存中のpHの変化を示す: (■)0 IBU、25℃; (＋)7.5 IBU、25℃; (●)15 IBU、25℃; (▲)22.5 IBU、25℃。図7(a)は、発酵及び5℃でのビールの保存中の゜ブリックスの変化を示し: (□)0 IBU、5℃; (X)7.5 IBU、5℃; (○)15 IBU、5℃; (△)22.5 IBU、5℃、図7(b)は、発酵及び25℃でのビールの保存中のブリックスの変化を示す: (■)0 IBU、25℃; (＋)7.5 IBU、25℃; (●)15 IBU、25℃; (▲)22.5 IBU、25℃。図8は、5℃及び25℃でのビールの保存中の連続接種されたL.パラカゼイL26(先の酵母発酵後)の生存を示す: (○)5℃; (△)25℃。^#ホップ添加ワート(27 IBUと同等)を、L.パラカゼイL26の添加前の10日間、S.セレビシエS-04を用いて発酵させた。図9は、発酵、及び5℃及び25℃での連続接種されたプロバイオティックビールの保存中のpHの変化を示す: (○)5℃; (△)25℃。図10は、発酵、及び5℃及び25℃での連続接種されたプロバイオティックビールの保存中の゜ブリックスの変化を示す: (○)5℃; (△)25℃。図11は、発酵及び5℃でのビールの保存中の共接種されたプロバイオティクスの増殖及び生存を示す: (◆)L.パラカゼイL26; (■)L.ラムノサスHN001; (▲)L.アシドフィルスNCFM。^*発酵温度は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から10日目まで20℃で行った。^#7.5 IBUの異性化ホップ抽出物を10日目に添加した。図12は、発酵及び25℃でのビールの保存中の共接種されたプロバイオティクスの増殖及び生存を示す: (◇)L.パラカゼイL26; (□)L.ラムノサスHN001; (△)L.アシドフィルスNCFM。^*発酵温度は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から10日目まで20℃で行った。^#27 IBUの異性化ホップ抽出物を10日目に添加した。図13(a)は、発酵及び5℃でのビールの保存中のpHの変化を示し: (◆)L.パラカゼイL26; (■)L.ラムノサスHN001; (▲)L.アシドフィルスNCFM、図13(b)は、発酵及び25℃でのビールの保存中のpHの変化を示す: (◇)L.パラカゼイL26; (□)L.ラムノサスHN001; (△)L.アシドフィルスNCFM。図14(a)は、発酵及び5℃でのビールの保存中の゜ブリックスの変化を示し: (◆)L.パラカゼイL26; (■)L.ラムノサスHN001; (▲)L.アシドフィルスNCFM、図14(b)は、発酵及び25℃でのビールの保存中の゜ブリックスの変化を示す: (◇)L.パラカゼイL26; (□)L.ラムノサスHN001; (△)L.アシドフィルスNCFM。図15は、非サッカロミセス属酵母との共発酵及びその後の5℃での保存中のL.パラカゼイL26の増殖を示す: (■)L.パラカゼイL26とT.デルブレッキイ Prelude; (●)L.パラカゼイL26とM.プルケリマ Flavia。発酵は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から12日目まで20℃で行った。^#7.5 IBUの異性化ホップ抽出物を12日目に添加した。図16は、非サッカロミセス属酵母との共発酵及びその後の25℃での保存中のL.パラカゼイL26の増殖を示す: (□)L.パラカゼイL26とT.デルブレッキイ Prelude; (〇)L.パラカゼイL26とM.プルケリマ Flavia。発酵は、0日目から2日目まで30℃で、2日目から12日目まで20℃で行った。^#7.5 IBUの異性化ホップ抽出物を12日目に添加した。図17(a)は、発酵及び5℃での保存中のホップ無添加ワートのpH変化を示し、図17(b)は、発酵及び25℃での保存中のホップ無添加ワートのpH変化を示す: (■)L.パラカゼイL26とT.デルブレッキイ Prelude; (●)L.パラカゼイL26とM.プルケリマ Flavia。(□); T.デルブレッキイ Preludeのみ; (○)M.プルケリマ Flaviaのみ。図18(a)は、発酵及び5℃での保存中のホップ無添加ワートの゜ブリックス変化を示し、図18(b)は、発酵及び25℃での保存中のホップ無添加ワートの゜ブリックス変化を示す: (■)L.パラカゼイL26とT.デルブレッキイ Prelude; (●)L.パラカゼイL26とM.プルケリマ Flavia。(□); T.デルブレッキイ Preludeのみ; (○)M.プルケリマ Flaviaのみ。図19は、発酵及び5℃でのビールの保存中のS.セレビシエW-34/70との共接種及び連続接種中のL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す: (●)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の共接種、5℃; (■)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の連続接種、5℃。^*発酵温度は、0日目から1日目まで30℃で、1日目から22日目まで20℃で行った。^#7.5 IBUの異性化ホップ抽出物を22日目に添加した。^S.セレビシエW-34/70を、連続接種のために発酵の1日目に添加した。図20は、発酵及び25℃でのビールの保存中のS.セレビシエW-34/70との共接種及び連続接種中のL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す: (〇)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の共接種、25℃; (□)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の連続接種、25℃。^*発酵温度は、0日目から1日目まで30℃で、1日目から22日目まで20℃で行った。^#7.5 IBUの異性化ホップ抽出物を22日目に添加した。^S.セレビシエW-34/70を、連続接種のために発酵の1日目に添加した。図21(a)は、発酵及び5℃でのビールの保存中のpHの変化を示し: (●)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の共接種、5℃; (■)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の連続接種、5℃; (▲)S.セレビシエW-34/70単培養物、5℃、図21(b)は、発酵及び25℃でのビールの保存中のpHの変化を示す: (〇)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の共接種、25℃; (□)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の連続接種、25℃; (△)S.セレビシエW-34/70単培養物、25℃。図22(a)は、発酵及び5℃でのビールの保存中の゜ブリックスの変化を示し: (●)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の共接種、5℃; (■)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の連続接種、5℃; (▲)S.セレビシエW-34/70単培養物、5℃、図22(b)は、発酵及び25℃でのビールの保存中の゜ブリックスの変化を示す: (〇)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の共接種、25℃; (□)L.パラカゼイL26とS.セレビシエW-34/70の連続接種、25℃; (△)S.セレビシエW-34/70単培養物、25℃。

詳細な説明
上で説明したように、プロバイオティック細菌を送達するための手段として非乳飲料に対する需要がある。

本発明は、プロバイオティック細菌を含むアルコール飲料に関する。一般に、プロバイオティック細菌の増殖を妨げ、生存を損なう抗微生物化合物の存在により、ビールなどのアルコール飲料にプロバイオティック細菌を組み込むことを予想することは困難である。したがって、本発明は、アルコール飲料中に抗微生物化合物が存在するにもかかわらず、プロバイオティック細菌が増殖し、生き残ることができる、驚くべき且つ予想外のアルコール飲料を提供する。

プロバイオティック細菌は、健康上の利益を提供することが知られている。例えば、プロバイオティック細菌の特定の株は、腸の健康及び消化の改善をもたらすことができることが示されている。したがって、本発明によるアルコール飲料は、腸の健康の改善及び免疫の増強などの健康上の利益をもたらし得る。

本発明の目的のために、アルコール飲料は、エタノール又はエチルアルコールなどのアルコールを含む飲料と定義される。特に、アルコール飲料は、≧0.5体積％のアルコール含有量を有してもよい。

アルコール飲料は、適切なアルコール含有量を有してよい。特定の態様によれば、アルコール飲料のアルコール含有量は、≧0.5体積％であってもよい。例えば、アルコール含有量は、0.5～10％、1.0～9.0％、1.5～8.0％、2.0～7.5％、2.5～7.0％、3.0～6.5％、3.5～6.0％、4.0～5.5％、4.5～5.0％であってもよい。特に、アルコール含有量は、2.0～5.0％であってもよい。さらにより具体的には、アルコール含有量は、約3～4％であってもよい。

アルコール飲料は、任意の適切なアルコール飲料であってよい。アルコール飲料の例としては、以下に限定されないが、ビール、ワイン、シードル、スピリッツなどが挙げられる。特定の態様によれば、アルコール飲料は、ビールであってもよい。

アルコール飲料に含まれるプロバイオティック細菌は、任意の適切なプロバイオティック細菌であってよい。プロバイオティック細菌は、適切な量で提供されると、受容者に健康上の利益を付与する任意の適切な生きた微生物であってもよい。例えば、プロバイオティック細菌は、乳酸桿菌、ビフィドバクテリア、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。特に、乳酸桿菌は、以下に限定されないが、L.パラカゼイ、L.ラムノサス、L.アシドフィルス、L.カゼイ、L.ファーメンタム、L.プランタルム又はそれらの組み合わせを含んでもよい。さらにより具体的には、乳酸桿菌は、ラクトバチルス・パラカゼイLAFTI L26、ラクトバチルス・パラカゼイLpc-37、ラクトバチルス・ラムノサスHN001、ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

特定の態様によれば、アルコール飲料は、ホップをさらに含んでもよい。本発明の目的のために、ホップは、ホップ及び/又はその誘導物を含む。ホップは、異性化アルファ酸を含む任意の適切なホップであってよい。ホップは、以下に限定されないが、ホップ球果、ホップペレット、ホップ樹脂、ホップ粉末、異性化ホップ抽出物などの、任意の適切な形態であってよい。

ホップは、任意の適切なホップであってよい。例えば、ホップは、異性化ホップ抽出物であってもよい。ホップは、適切な苦味を有してよい。特に、ホップは、≦30 IBUの苦味を有してもよい。さらにより具体的には、苦味は、0～30 IBU、3～27 IBU、5～25 IBU、7.5～20 IBU、9～18 IBU、10～16 IBU、12～15 IBU、13～14 IBUであってもよい。IBUは、国際苦味単位を指し、アルコール飲料中のホップ化合物の濃度の尺度である。特に、IBUは、アルコール飲料中のイソフムロンの百万分率(ppm)を測定する。

アルコール飲料は、適切なpHを有してよい。例えば、アルコール飲料のpHは、2～6であってもよい。特に、pHは、2.5～5.5、3～5、3.5～4.5、3.7～4.0であってもよい。さらにより具体的には、pHは、約3～5であってもよい。

アルコール飲料は、適切なブリックス又はその比重相当値を有してよい。ブリックスは、アルコール飲料中の糖の量の尺度である。例えば、1°Bxは、100gのアルコール飲料中の1gのスクロースを指す。したがって、ブリックスが高いほど、アルコール飲料中のアルコール含有量が高くなり得る。アルコール飲料のブリックスは、4～20°Bxであってもよい。本発明の目的のために、アルコール飲料のブリックスへの言及は、アルコール飲料に含まれるワート又はマストのブリックスの尺度を指す。特に、アルコール飲料のブリックスは、5～18°Bx、6～15°Bx、7～12°Bx、8～10°Bx、9～9.5°Bxであってもよい。さらにより具体的には、ブリックスは、約5～15°Bxであってもよい。

アルコール飲料は、プロバイオティック細菌を適切なレベルに維持するために、適切な温度で保存してよい。例えば、アルコール飲料は、約≦20℃の温度で保存してもよい。好ましくは、アルコール飲料は、≦10℃の温度で保存してもよい。特に、アルコール飲料は、約1～10℃、5～8℃、6～7℃の温度で保存してもよい。さらにより具体的には、アルコール飲料は、約1～5℃の温度で保存してもよい。

本発明の第2の態様によれば、第1の態様のアルコール飲料を形成する方法であって、
- ワート又はマストを提供するステップ;
- プロバイオティック細菌をワート又はマストに添加するステップ;
- 酵母をワート又はマストに添加するステップ; 及び
- 所定の期間及び所定の温度でワート又はマストを発酵させて、アルコール飲料を形成するステップ
を含む、方法が提供される。

ワート又はマストは、本発明の目的に適した任意のワート又はマストであってよい。本発明の目的のために、ワートは、以下に限定されないが、大麦麦芽及び/又はその付加物、例えば、小麦、トウモロコシ、ライ麦、イネ及び水(加熱、煮沸及び冷却を受けているもの)を含んでもよい。ワートはまた、添加された糖を含んでもよい。本発明の目的のために、マストは、以下に限定されないが、果汁、例えば、ブドウ果汁(加熱、煮沸及び冷却を受けているもの)を含んでもよい。マストはまた、添加された糖を含んでもよい。

ワート又はマストに添加されるプロバイオティック細菌は、任意の適切なプロバイオティック細菌であってよい。例えば、プロバイオティック細菌は、上記のとおりであってもよい。プロバイオティック細菌の添加は、適切な量のプロバイオティック細菌をワート又はマストに添加することを含んでもよい。例えば、添加されるプロバイオティック細菌の量は、1～9 log CFU/mlであってもよい。特に、添加されるプロバイオティック細菌の量は、約2～8 log CFU/ml、3～7 log CFU/ml、4～6 log CFU/ml、4.5～5 log CFU/mlであってもよい。さらにより具体的には、添加されるプロバイオティック細菌の量は、5～7 log CFU/mlであってもよい。

ワート又はマストに添加される酵母は、本発明の目的に適した任意の酵母であってよい。酵母は、サッカロミセス属酵母、非サッカロミセス属酵母、又はそれらの組み合わせであってもよい。特定の態様によれば、酵母は、サッカロミセス属酵母であってもよい。サッカロミセス属酵母の例としては、以下に限定されないが、S.セレビシエ、S.パラドクサス(S. paradoxus)、S.パスツリアヌス(S. pasteurianus)、S.バヤヌス(S. bayanus)及びS.セレビシエ変種ブラウディ(S. cerevisiae var. boulardii)が挙げられる。別の特定の態様によれば、酵母は、非サッカロミセス属酵母であってもよい。非サッカロミセス属酵母の例としては、以下に限定されないが、T.デルブレッキイ、L.サーモトレランス、P.クルイベリ及びM.プルケリマが挙げられる。特に、酵母をワート又はマストに添加することは、S.セレビシエを添加することを含む。

酵母の添加は、適切な量の酵母をワート又はマストに添加することを含んでもよい。例えば、添加される酵母の量は、1～9 log CFU/mlであってもよい。特に、量は、約5～7 log CFU/mLであってもよい。

この方法は、ホップをワート又はマストに添加することをさらに含んでもよい。ワート又はマストに添加されるホップは、上記の任意の適切なホップであってよい。ホップの添加は、適切な量のホップをワート又はマストに添加することを含んでもよい。例えば、添加されるホップの量は、≦30 IBUであってよい。特に、添加されるホップの量は、0～30 IBU、3～27 IBU、5～25 IBU、7.5～20 IBU、9～18 IBU、10～16 IBU、12～15 IBU、13～14 IBUであってもよい。さらにより具体的には、添加されるホップの量は、約7.5 IBUであってもよい。

特定の態様によれば、プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加は、同時に行ってよい。次いで、発酵は、適切な条件下で行ってよい。例えば、発酵は、ワート又はマストを適切な温度で適切な期間発酵させることを含んでもよい。温度は、発酵中の任意の点で変更してもよい。特に、発酵は、ワート又はマストを第1の温度で第1の期間発酵させ、その後、ワート又はマストを第2の温度で第2の期間発酵させることを含んでもよい。この方法は、第2の期間の終わりにホップを添加することをさらに含んでもよい。

特定の態様によれば、プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加は、連続して行ってよい。特に、酵母の添加は、プロバイオティック細菌の添加後の第3の期間後に行ってもよい。次いで、発酵は、適切な条件下で行ってよい。例えば、発酵は、ワート又はマストを適切な温度で適切な期間発酵させることを含んでもよい。温度は、発酵中の任意の点で変更してもよい。特に、発酵は、ワート又はマストを第3の温度で第4の期間発酵させ、その後、ワート又はマストを第4の温度で第5の期間発酵させることを含んでもよい。この方法は、第5の期間の終わりにホップを添加することをさらに含んでもよい。

第1の期間、第2の期間、第3の期間、第4の期間及び第5の期間は、任意の適切な時間量であってよい。期間は、ワート又はマストに添加されるプロバイオティック細菌及び酵母に応じて選択してよい。例えば、第1の期間、第3の期間、及び第4の期間は、1～5日間、好ましくは1～2日間であってもよい。第2の期間及び第5の期間は、8～30日間であってもよい。

特に、第1の温度及び第3の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、プロバイオティック細菌の増殖に好ましい条件をもたらし、最大のプロバイオティック細菌細胞数に到達することを可能にする任意の適切な温度であってもよい。例えば、第1の温度及び第3の温度は、25～35℃であってもよい。さらにより具体的には、第1の温度及び第3の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、約30℃であってもよい。

特に、第2の温度及び第4の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、酵母の増殖をもたらすための任意の適切な温度であってもよい。例えば、第2の温度及び第4の温度は、13～25℃であってもよい。さらにより具体的には、第2の温度及び第4の温度は、同じであっても又は異なっていてもよく、約20℃であってもよい。

一実施形態では、この方法は、ワートに同時にプロバイオティック細菌を添加すること、及び酵母を添加することを含む。ワートは、ホップ無添加であってもよい。プロバイオティック細菌及び酵母は、第1の温度で第1の期間、ワートに共接種される。例えば、第1の温度は、約25～35℃であってもよい。特に、第1の温度は、約30℃であってもよい。第1の期間は、約1～5日間であってもよい。特に、第1の期間は、2日間であってもよい。次いで、発酵を、第2の温度で第2の期間進行させる。第2の温度は、約13～25℃であってもよい。特に、第2の温度は、約20℃であってもよい。第2の期間は、約8～30日間であってもよい。特に、第2の期間は、8、12又は21日間であってもよい。次いで、適切な濃度の異性化ホップ抽出物が、第2の期間の終わりに発酵したワートに添加される。例えば、ホップ抽出物は、7.5 IBUのホップ抽出物であってもよい。次いで、形成されたアルコール飲料は、約1～5℃などの適切な温度で保存される。

別の実施形態では、この方法は、最初に、プロバイオティック細菌をワートに添加し、第3の期間の後になって初めて酵母を添加することを含む。ワートは、ホップ無添加であってもよい。第3の期間は、1～5日間であってもよい。特に、酵母は、ワートへのプロバイオティック細菌の添加の1又は2日後に添加してもよい。プロバイオティック細菌は、第3の温度で第4の期間、ワートに接種してもよい。第3の温度は、約25～35℃であってもよい。特に、第3の温度は、約30℃であってもよい。第4の期間は、約1～5日間であってもよい。特に、第4の期間は、2日間であってもよい。次いで、発酵を、第4の温度で第5の期間進行させる。第4の温度は、約13～25℃であってもよい。特に、第4の温度は、約20℃であってもよい。第5の期間は、約8～30日間であってもよい。特に、第5の期間は、8又は21日間であってもよい。次いで、適切な濃度の異性化ホップ抽出物が、第5の期間の終わりに発酵したワートに添加される。例えば、ホップ抽出物は、7.5IBUのホップ抽出物であってもよい。次いで、形成されたアルコール飲料は、約1～5℃などの適切な温度で保存される。

別の態様によれば、医学で使用するための上記のアルコール飲料が提供される。特に、本発明のアルコール飲料は、アルコール飲料の消費者の腸の健康及び/又は消化の改善に使用するためのものであってよい。

前述の説明は例示的な実施形態を説明してきたが、本発明から逸脱することなく、多くの変形を行うことができることは当業者に理解される。

本発明を一般的に記載してきたが、これは、実例として提供され、限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解される。

提供される実施例で使用される全ての材料は、次のとおりである:

12.2％(w/v)ドライライトモルト抽出物(Thomas Coopers Breweries、南オーストラリア、オーストラリア)を脱イオン水中に再構成し、続いて20分間煮沸して、ホットブレイク(hot break)を達成することにより、スイートワート(sweet wort)を調製した。その後、2.0％(w/v)デキストロース(Thomas Coopers Breweries、南オーストラリア、オーストラリア)及び0.2％(w/v)カスケードホップペレット(Yakima Chief-Hopunion、ヤキマ、USA)をワートに混合し、さらに60分間煮沸した。次いで、冷たいIce Mountain蒸留水(Fraser and Neave, Limited、マレーシア)を元のバッチ重量まで添加し、約60分間氷浴を使用してワートを冷却し、コールドブレーク(cold break)を達成した。その後、冷却したワートを、二重層のチーズクロスを通して250mL又は500mLの蓋付きガラス瓶にろ過し、95℃で15分間殺菌して、ワートの無菌性を確実にし、これは、ポテトデキストロース寒天(PDA; Oxoid Ltd.、ハンプシャー、UK)を使用して確認された。ホップは、前培養としての使用、並びに同時及び連続発酵段階のために、ホップ無添加ワートの調製では省略した。

［実施例１－プロバイオティック細菌に対するイソ-α-酸の抗微生物作用］
プロバイオティック細菌に対するホップ酸の抗細菌作用、及びホップ添加ビールにプロバイオティック細菌を組み込むことの難しさを明らかにするために、ホップ添加ワートを3つの異なるプロバイオティック株、L.パラカゼイL26、L.パラカゼイLpc-37及びL.ラムノサスHN001を用いて発酵させ、それらの増殖及び安定性を記録した。スクリーニング段階では、L.パラカゼイL26、L.パラカゼイLpc-37、及びL.ラムノサスHN001の三重の発酵を、200mLのホップ添加ワートを含有する500mL蓋付きガラス瓶中で行った。各ガラス瓶に、1％(v/v)のそれぞれのプロバイオティック前培養物を接種し、37℃で10日間静的にインキュベートした。

図1は、10日間の発酵期間を通したホップ添加ワート中のL.パラカゼイL26、L.パラカゼイLpc-37及びL.ラムノサスHN001の生存動態を示す。3つ全てのプロバイオティック株の細胞数は、徐々に減少し、7日目までに検出できなくなった。プロバイオティック細菌は、ホップ無添加ワート中で増殖した前培養物中での増殖中に、ホップ無添加ワート中で少なくとも約8.50 Log CFU/mLの高い生細胞数に達することができた(データは示さない)ため、細胞死は、ホップイソ-α-酸の存在が原因である可能性がある。したがって、細胞数の減少は、3つ全てのプロバイオティック株が、ホップ添加ワート中で生き残ることができず、したがって、ホップ耐性ではないことを示した。これらの細菌は、ビール中で増殖し、生き残るためにうまく適応することを可能にする複雑なメカニズムを持たないため、ホップ添加ワート中のプロバイオティック細胞死は、驚くべきことではない。

L.パラカゼイL26は、最も高い生存性を示し、L.パラカゼイLpc-37及びL.ラムノサスHN001が続いた。L.パラカゼイL26は、4日目に5.13 Log CFU/mLの検出可能な細胞数を依然として有し、一方、L.パラカゼイLpc-37及びL.ラムノサスHN001は、2日目にそれぞれ6.12及び4.13 Log CFU/mLの細胞数を有した。したがって、L.パラカゼイL26は、完全に死滅する前に、ホップイソ-α-酸に対するより良い程度の耐性を示した。L.パラカゼイL26は、ホップ添加ワート中で最大の生存性を示したため、以下の実施例に示すように、L.パラカゼイL26を、酵母を用いたさらなる発酵に使用した。

［実施例２－異なる接種戦略を使用したプロバイオティックビール発酵］
2.1 S.セレビシエS-04及びL.パラカゼイL26の共接種
共発酵中、三重の発酵を、400mLのホップ無添加ワートを含有する500mL蓋付きガラス瓶中で行った。L.パラカゼイL26及びS.セレビシエS-04酵母を、L.パラカゼイL26の増殖に有利になるように、それぞれ約6.72 Log CFU/mL及び5.00 Log CFU/mLで共培養した。対照は、ホップ無添加ワート中にそれぞれL.パラカゼイL26及びS.セレビシエS-04前培養物の同じ接種物を含んだ。発酵は、プロバイオティック増殖に好ましい条件をもたらし、最大のプロバイオティック細胞数に到達することを可能にするために、最初に、0日目から2日目まで30℃で静的に行った。次いで、発酵は、酵母増殖を満たすために、2日目から10日目まで20℃で進行させた。

10日間の発酵後、同じサンプルについて貯蔵寿命試験を行った(貯蔵寿命段階)。10日目に、27国際苦味単位(IBU)の異性化ホップ抽出物(Brouwland、ベーフェルロ、ベルギー)を、実施例1と同じホップ濃度でホップ無添加ビールに添加した。プロバイオティック生存性に対する冷蔵及び周囲保存温度の影響を評価するために、サンプルを5℃及び25℃で保存した。L.パラカゼイL26のプレートカウントが7.0 Log CFU/mLを下回ったときに、各発酵セットの貯蔵寿命の終わりを決定した。

得られた結果を図2に示す。図2に基づくと、ホップ抽出物なしの発酵期間中、L.パラカゼイL26単培養物(酵母の非存在下)は、ホップの非存在下で10日目に9.06 Log CFU/mLの高い静止期細胞数を達成することができた。したがって、結果は、L.パラカゼイL26に対するイソ-α-酸の抗細菌作用を補強する。酵母の存在下では、L.パラカゼイL26は、依然として高い静止期細胞数を達成し、これを10日間の発酵期間を通して維持することができ、10日目に8.77 log CFU/mLを記録した。結果は、増殖期及び静止期間中に、L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04との間の成功した共存発酵を示す。

図2から分かるように、10日目にホップ抽出物を添加した後、25℃で、L.パラカゼイL26単培養物細胞数は、保存1日以内に検出できなくなり、一方、L.パラカゼイL26共培養物細胞数は、13日目までに7.0 log CFU/mL未満に下がった。したがって、S.セレビシエS-04の生存力向上効果は、25℃の保存温度では強くは認められなかった。しかし、生存力向上効果は、5℃ではより顕著であった。5℃では、L.パラカゼイL26単培養物細胞数は、16日目までに7.0 log CFU/mLを下回り、一方、L.パラカゼイL26共培養物は、保存中ずっと首尾よく高い生細胞数を維持し、32日目までに(健康上の利益を提供するために必要な)基準となる7.0 log CFU/mLを下回ったのみであった。したがって、生存力向上効果は、冷蔵保存温度及び酵母の存在の両方によるものである。

様々な保存温度でのホップ添加ビールの不揮発性物質の特徴を表1に示す。表1によれば、L.パラカゼイL26によって産生された乳酸は、L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04の両方を接種されたビールにおいて記録された低pH値(3.52～3.64)をもたらした。したがって、乳酸(5.08～5.15g/L)による寄与に起因して、得られたビールは酸味を有するであろう。

2.2 酵母及びプロバイオティック細菌の連続接種
連続発酵段階の間、L.パラカゼイL26の生存力に対する、発酵の2日目にS.セレビシエS-04酵母を添加することの影響を調べた。これは、プロバイオティック生存力を、酵母の遅れた添加で改善することができるかどうかを決定するためであった。

共接種(実施例2.1)と同様の手順を、連続接種発酵について行った。三重の発酵を、400mLのホップ無添加ワートを含有する500mL蓋付きガラス瓶中で行った。L.パラカゼイL26(1％(v/v)接種物)を、各ガラス瓶に添加した。発酵の2日目に、1％(v/v)のS.セレビシエS-04を、同じサンプルに添加した。同じ接種物におけるL.パラカゼイL26及びS.セレビシエS-04の単培養物は、対照として機能した。発酵は、プロバイオティック細菌増殖に好ましい条件をもたらし、最大のプロバイオティック細菌細胞数に到達することを可能にするために、最初に、0日目から2日目まで30℃で静的に行った。次いで、発酵は、酵母増殖を満たすために、2日目から10日目まで20℃で進行させた。

10日間の発酵後、同じサンプルについて貯蔵寿命試験を行った。手順は、実施例2.1に概説した共接種実験についての手順と同様であった。同じ添加量の異性化ホップ抽出物、保存温度、及び貯蔵寿命の終了条件を利用した。

10日間の連続発酵期間中のホップ無添加ワート中のL.パラカゼイL26の増殖動態、それに続く異性化ホップ抽出物の添加後の連続発酵保存期間中のその生存動態を、図3に示す。

図3によれば、共発酵と同様の増殖動態が観察された。酵母の非存在下では、L.パラカゼイL26単培養物は、ホップの非存在下で10日目に8.95 log CFU/mLの高い静止期細胞数を達成することができ、このことは、添加されたホップのないホップ無添加ワートが、L.パラカゼイL26に適した増殖培地であることを補強する。酵母の存在下では、L.パラカゼイL26は、10日目に8.99 log CFU/mLの高い生細胞数を同様に達成することができ、このことは、酵母が、L.パラカゼイL26の増殖を妨げないことを示す。

図3から、L.パラカゼイL26の単培養物細胞数及び連続培養物細胞数の両方が、25℃での保存1日以内に7.0 log CFU/mLを下回ったことが分かる。共接種発酵と同様に、S.セレビシエS-04の生存力向上効果は、5℃でより有望であった。5℃では、L.パラカゼイL26単培養物細胞数は、16日目までに7.0 log CFU/mLを下回り、一方、L.パラカゼイL26共培養物細胞数は、19日目までに下回ったのみであった。生存力向上効果は、冷蔵保存温度及び酵母の存在の両方に起因し得ることが分かる。

10日目に異性化抽出物を添加せずに5℃で保存したL.パラカゼイL26単培養物は、22日目に8.88 log CFU/mLの高い生細胞数を依然として有した(データは示さない)ため、保存中のL.パラカゼイL26の死滅は、ホップ抽出物の添加に起因し得る。

様々な保存温度でのホップ添加ビールの不揮発性物質の特徴を表2に示す。表2から、L.パラカゼイL26によって産生されたかなりの量の乳酸(8.25～8.39g/L)が、L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04の両方を接種されたビールにおいて記録された低pH値(3.30～3.31)をもたらしたことが分かる。乳酸の蓄積は、最終的なプロバイオティックビール製品に酸味をもたらすであろう。

プロバイオティック細菌の生存力に対する冷蔵保存及び酵母添加の相乗効果は、実施例2.1の共接種戦略の使用と比較して、弱まったことが分かる。

［実施例３－プロバイオティック細菌の生存力の向上及び貯蔵寿命の延長］
より長い貯蔵寿命は、長いコールドチェーン流通ネットワークが原因となる損失を低減し、加えて、高いアルコール関税を受ける売れ残りのビールから生じる損失を軽減するであろう。したがって、プロバイオティック細菌に対するホップレベルの影響を調べた。

実施例1に見られるように、ホップイソ-α-酸は、プロバイオティック細菌の生存力に悪影響を及ぼした。L.パラカゼイL26は、連続接種と比較して、S.セレビシエS-04との共接種中により高い生存性を示した(実施例2)ため、プロバイオティック細菌と酵母との共発酵を、この実施例で使用した。

行った方法は、実施例2.1と同様であったが、ホップ抽出物のレベルが異なっていた。S.セレビシエS-04酵母及びL.パラカゼイL26プロバイオティックの三重の発酵を、600mLのホップ無添加ワートを含有する1L蓋付きガラス瓶中で行った。各ガラス瓶に、0.5％(v/v)の酵母前培養物及び1％(v/v)のプロバイオティック細菌前培養物を接種し、30℃で2日間、続いて20℃で8日間、静的にインキュベートした。

10日目に、7.5、15及び22.5国際苦味単位(IBU)の異性化ホップ抽出物(Brouwland、ベーフェルロ、ベルギー)を、それぞれホップ無添加ビールに添加した。1つの三重セットのビールは、ホップ無添加のままとした。サンプルを貯蔵寿命段階のために5℃及び25℃で保存した。L.パラカゼイL26のプレートカウントが7.0 Log CFU/mLを下回ったときに、各発酵セットの貯蔵寿命の終わりを決定した。

図4は、5℃における、異なるIBUレベルのホップ添加ワート中でS.セレビシエS-04と共接種した場合のL.パラカゼイL26の増殖動態及び生存動態を示す。ホップ抽出物を添加した保存中、ホップ濃度が低下すると、プロバイオティック細菌の生存が改善した。細菌増殖の阻害剤であるホップイソ-α-酸の低減により、プロバイオティック細菌の生存のためにより不利でない環境が作り出されたため、このことは予想される。22.5及び15IBUでは、ビールは、それぞれ6日間及び10日間の貯蔵寿命を有した。7.5IBUでは、プロバイオティック細菌は、7.0 log CFU/mLを超える細胞数を1ヶ月間維持した。これは、図2の22日間の貯蔵寿命からの改善である。ホップ無添加ビール(0 IBU)では、プロバイオティック細菌は、8 log CFU/mLを超える細胞数を少なくとも4ヶ月間維持した。

図5は、25℃における、異なるIBUレベルのホップ添加ワート中でS.セレビシエS-04と共接種した場合のL.パラカゼイL26の増殖動態及び生存動態を示す。予想通り、25℃で保存されたプロバイオティック細菌サンプルは、冷蔵下で保存されたサンプルと比較して、より乏しい生存率を有した。全てのホップ添加サンプルは、3日間の保存後に7.0 log CFU/mL未満のプロバイオティック細菌細胞数を示し、一方、ホップ無添加サンプルは、冷蔵下での少なくとも4ヶ月と比較して、わずか約38日間の保存の間、7.0 log CFU/mLを超えるプロバイオティック細胞数を維持した(図4)。結果は、プロバイオティック細菌の生存力を維持するための、プロバイオティックビールのコールドチェーン流通及び保存の重要性を示す。

図6(a)及び図6(b)は、ぞれぞれ、5℃及び25℃での発酵及び保存中のpHの変化を示す。pH測定値は、異なるサンプルにわたって類似していた。サンプルにわたって達成された低pH(約3.5)はまた、乳酸がプロバイオティック細菌によって産生され、酸味をもたらしたことを示唆する。

図7(a)及び図7(b)は、ぞれぞれ、5℃及び25℃での発酵及び保存中の゜ブリックス測定値の変化を示す。゜ブリックス測定値は、異なるサンプルにわたって類似しており、このことは、ホップ濃度の違いが、酵母の発酵能力、及び栄養素利用に大きく影響しなかったことを示す。

したがって、ホップレベルの低下と共にプロバイオティック細菌の生存力が上昇し、ホップの抗微生物作用が、5℃と比較して25℃でより顕著であったことが分かる。

［実施例４－酵母発酵後のプロバイオティック細菌の添加による発酵手順の改変］
三重の発酵を、220mLのホップ添加ワートを含有する250mL蓋付きガラス瓶中で行った。ホップ濃度は、27 IBUの異性化ホップ抽出物の添加と同等であった。S.セレビシエS-04(0.5％(v/v)接種物)を、最初に各ガラス瓶に添加した。20℃で10日間の発酵後、1％(v/v)のL.パラカゼイL26を、同じサンプルに添加した。その後、貯蔵寿命試験を行った。手順は、実施例2.1に概説した共接種実験の手順と同様であった。同じ保存温度、及び貯蔵寿命の終了条件を利用した。

図8は、5℃及び25℃での保存中の添加されたL.パラカゼイL26の生存を示す。10日目にプロバイオティック細菌を接種し、その後すぐに5℃及び25℃で保存した後、L.パラカゼイL26は、25℃と比較して、5℃でより良い生存性を示し、それぞれ5℃及び25℃で42日目に6.67及び5.27 log CFU/mLの細胞数であった。これは、用いられる接種戦略にかかわらず、プロバイオティック細菌の生存力を維持するための、プロバイオティックビールに対する低温保存及びコールドチェーン流通に対する必要性をさらに強調する。

図9及び10は、発酵及び保存期間中のpH及び゜ブリックス測定値を示す。゜ブリックス値は、実施例2.1(表1)における共発酵サンプルの゜ブリックス値と類似していた。

図8から、L.パラカゼイL26は増殖を示さなかったが、その細菌数は、冷蔵保存中に少なくとも1ヶ月間変化しないままであることが観察された。これはおそらく、プロバイオティック細菌の生存にとってより好ましい環境を作り出す、酵母によるホップ酸の隔離によるものである。さらに、図9に示すように、実施例2.1(表1)の共発酵サンプルと比較して、4.6～4.7対3.5で、より高いpHが得られた。より高いpH値は、ホップ酸の効力を低減し、プロバイオティック細菌の生存に対して全体的な良い効果を有する。

したがって、図8で得られた結果に基づいて、5℃での保存の間ずっとプロバイオティック細胞数は比較的変わらないため、初期酵母発酵期間後にプロバイオティクスのより高い添加量(例えば、最小7 log CFU/mLを超える、例えば、8 log CFU/mL)を添加する、プロバイオティックビールのバージョンを作製することができた。これは、酵母を用いた発酵プロセスにプロバイオティクスが参加することを可能にするのとは対照的に、結果として得られるビールの酸性度が低下するため、より好ましく且つ許容可能なフレーバープロファイルも作り出すであろう。

［実施例５－異なるプロバイオティック細菌及び酵母の対を使用したプロバイオティックビール発酵］
実施例2～4は、プロバイオティックと酵母の対として、L.パラカゼイL26とS.セレビシエS-04を使用することに焦点を合わせている。他のプロバイオティック細菌及び酵母株を使用して、プロバイオティックビールの代替バージョンを形成できるかどうかを決定するために、他のプロバイオティック細菌と酵母の対も調べた。これらのプロバイオティック細菌と酵母の対は、S.セレビシエS-04と他のラクトバチルス属プロバイオティック細菌(実施例5.1)、L.パラカゼイL26と他の非サッカロミセス属酵母(実施例5.2)、及びL.パラカゼイL26とS.セレビシエW34/70ラガー酵母(実施例5.3)を含む。

5.1 S.セレビシエS-04及び他のラクトバチルス属プロバイオティック細菌を使用した発酵
L.ラムノサスHN001を使用して、ホップの抗細菌作用を明らかにした(実施例1)。単独では、それはホップの抗細菌作用を受けやすい。しかし、L.パラカゼイL26(実施例2)と同様に、その生存性を酵母の存在下で改善することができるかどうかは不明である。したがって、ホップ無添加ワートを、S.セレビシエS-04及びL.ラムノサスHN001を用いて発酵させ、7.5IBUのホップ抽出物を発酵の終わりに添加し、続いて、5℃及び25℃で保存した。別のプロバイオティック細菌株であるL.アシドフィルスNCFMも利用して、その生存性が酵母の存在下で改善されるかどうかを調べた。

三重の発酵を、550mLのホップ無添加ワートを含有する1L蓋付きガラス瓶中で行った。L.パラカゼイL26、L.ラムノサスHN001、及びL.アシドフィルスNCFMを、S.セレビシエS-04との共発酵に使用した。1％(v/v)のプロバイオティック細菌接種物及び0.5％(v/v)の酵母接種物を各ガラス瓶に添加した。発酵は30℃で2日間、続いて20℃で8日間、静的に行った。

10日間の発酵後、7.5IBUの異性化ホップ抽出物を、各サンプルに添加した。貯蔵寿命試験を、実施例2.1に概説した共接種実験の手順と同様の手順で行った。同じ保存温度、及び貯蔵寿命の終了条件を利用した。

図11は、ホップ無添加ワート中にS.セレビシエS-04と共接種し、続いて7.5IBUのホップ抽出物を添加し、5℃で保存した場合の、L.パラカゼイL26、L.ラムノサスHN001、及びL.アシドフィルスNCFMの増殖及び生存を示す。10日間の発酵後に達成された高い細胞数(それぞれ8.06log CFU/mL及び8.49log CFU/mL)によって示されるように、L.ラムノサスHN001及びL.アシドフィルスNCFMは両方とも、共発酵中にS.セレビシエS-04と共存することができた。

図11から、L.ラムノサスHN001は、低温保存中に最も乏しい生存性を示し、4日間の冷蔵後に細胞数は7.0 log CFU/mL未満であり、一方、L.パラカゼイL26の細胞数は、保存1ヶ月以内に7.0 log CFU/mLを下回り、以前に実施例3で得られた結果(図4)を補強する。L.アシドフィルスNCFMは、低温保存の2ヶ月間、7.0 Log CFU/mLを超える有望な細胞数を示し、保存57日目までに7 Log CFU/mLを下回った。これは、L.パラカゼイL26についての冷蔵下での1ヶ月の貯蔵寿命からの大幅な改善である(L.アシドフィルスNCFM及びL.パラカゼイL26の両方について7.5 IBUの同じレベルで)。したがって、L.アシドフィルスNCFMも、プロバイオティックビールの形成に使用し得る。L.アシドフィルスNCFMは、健康なヒト集団及び罹患したヒト集団の両方において胃腸通過を生き残ることが示されており、安全なヒト消費の長い歴史を有する。L.アシドフィルスNCFMは、小児下痢の発生率の低下、抗生物質療法中の腸内微生物叢の安定化、及び小腸細菌異常増殖症状の改善を含むがこれらに限定されない、ヒトの試験におけるいくつかの健康上の利益を誘導することが示されている。したがって、プロバイオティックビールにL.アシドフィルスNCFMを組み込むことにより、より健康的なビールの代替選択肢が消費者に提供されるであろう。

図12は、ホップ無添加ワート中にS.セレビシエS-04と共接種し、続いて7.5 IBUのホップ抽出物を添加し、25℃で保存した場合の、L.パラカゼイL26、L.ラムノサスHN001、及びL.アシドフィルスNCFMの増殖及び生存を示す。L.ラムノサスHN001は、最も乏しい生存性を示し、L.パラカゼイL26及びL.アシドフィルスNCFMが続き、5℃で観察された傾向(図11)とよく似ていることがわかる。ホップの抗細菌作用はまた、より高い温度でより顕著であり、L.ラムノサスHN001、L.パラカゼイL26、及びL.アシドフィルスNCFMの細胞数は、それぞれ保存1、4、及び9日目に基準となる7.0 log CFU/mLを下回った。

図13(a)及び図13(b)は、S.セレビシエS-04と、L.ラムノサスHN001、L.アシドフィルスNCFM、及びL.パラカゼイL26とを用いた発酵、及びそれぞれ5℃及び25℃での保存中に得られたpH測定値を示し、図14(a)及び図14(b)は、5℃及び25℃の保存温度における対応する゜ブリックス測定値を示す。pH測定値は、サンプル間で類似していたが、゜ブリックス値は、L.ラムノサスHN001ではより高く、このことは、L.アシドフィルスNCFM及びL.パラカゼイL26と比較して、このプロバイオティック細菌及び酵母によってより少ない糖が発酵期間中に利用されたことを示す。

5.2 L.パラカゼイL26及び他の非サッカロミセス属酵母を使用した発酵
前の実施例の結果は、ホップ添加ビール中のラクトバチルス・パラカゼイL26の生存を高める、サッカロミセス・セレビシエS-04の能力を実証している。目新しいビールに対する需要の高まりに伴い、この実施例では、L.パラカゼイL26を非サッカロミセス属酵母と共培養することによってプロバイオティックビールを生産する可能性、及びプロバイオティック細菌に対するこれらの酵母の生存力向上効果を調べる。

共発酵は、S.セレビシエS-04の代わりに、トルラスポラ・デルブレッキイ Prelude又はメチニコビア・プルケリマ Flaviaを使用して、実施例2.1に記載されているように行った。発酵は、500mLガラス瓶中の300mLのホップ無添加ワートを用いて行った。共培養の場合、ホップ無添加ワートに、6.69 log CFU/mLのL.パラカゼイL26と、5.63 log CFU/mLのT.デルブレッキイ Prelude又は5.08 log CFU/mLのM.プルケリマ Flaviaとを接種した。ホップ無添加ワートに同じ酵母接種物を接種することによって、酵母単培養物も調製した。接種したワートを、L.パラカゼイL26の増殖に有利になるように、0日目から2日目まで静的条件下で30℃でインキュベートした。その後、酵母の増殖に応じるため、2日目から12日目まで発酵温度を20℃に下げた。

12日間の発酵後、ビールに異性化ホップ抽出物(Brouwland、ベーフェルロ、ベルギー)を7.5 IBUの苦味度まで添加した。ホップ添加ビールの貯蔵寿命試験を、5℃及び25℃で実施例3に記載されているように行った。

図15は、ホップ無添加ワート中でT.デルブレッキイ Prelude又はM.プルケリマ Flaviaのいずれかと共培養した場合の12日間の発酵期間中、及び5℃での保存中のL.パラカゼイL26の増殖動態及び生存動態を示す。2種の非サッカロミセス属酵母の存在下でのL.パラカゼイL26の増殖は、このプロバイオティック細菌をS.セレビシエS-04と共に培養した場合と同様であった(実施例2.1; 図2)。発酵後、ビール中の8.83～8.97 log CFU/mLのプロバイオティック生細胞数が達成された。これは、T.デルブレッキイ Prelude及びM.プルケリマ Flaviaが、発酵中にL.パラカゼイL26に対して阻害効果を発揮しなかったことを示した。

5℃での保存時に、共培養ビールのL.パラカゼイL26数は、5℃での保存中に少なくとも8日間7.0 log CFU/mLを超えたままであり、その後、27日目に6.69～6.76 log CFU/mLに減少した。実施例1に報告されているように、ホップ添加ビール中のL.パラカゼイL26単培養物のプロバイオティック細菌細胞数は、保存5日目までに、最低治療レベル(7.0 log CFU/mL)未満になった。したがって、非サッカロミセス属酵母の存在も、ビール中のプロバイオティック細菌の生存を改善することができた。それにもかかわらず、T.デルブレッキイ Prelude及びM.プルケリマ Flaviaのプロバイオティック生存力向上効果は、S.セレビシエS-04ほど顕著ではなかった。これは、L.パラカゼイL26細胞数が、後者の酵母と共培養した場合に1ヶ月間7.0 log CFU/mLを超えたままであったためである(実施例3、図4; 実施例5.1、図11)。

T.デルブレッキイ Prelude又はM.プルケリマ Flaviaのいずれかと共培養し、その後25℃で保存した場合のホップ添加ビール中のL.パラカゼイL26の生細胞数の変化を、図16に示す。ビールを25℃で保存した場合、プロバイオティック生細胞数は、4日以内に8.83～8.97 log CFU/mLから3 log CFU/mL未満に減少した。これは、ホップ添加ビール中のL.パラカゼイL26に対する酵母の生存向上効果が室温で最低であった(図2、3、5、8、及び12)、これまでに収集された結果と一致していた。

図17(a)及び図17(b)は、12日間の発酵期間、及びそれぞれ5℃及び25℃での保存期間中に得られたpH測定値を示し、一方、図18(a)及び図18(b)は、5℃及び25℃の保存温度における対応する゜ブリックス測定値を示す。pH測定値は、サンプル間で類似していたが、゜ブリックス値は、L.ラムノサスHN001ではより高く、このことは、L.アシドフィルスNCFM及びL.パラカゼイL26と比較して、より少ない糖が、発酵期間中にこのプロバイオティック細菌及び酵母によって利用されたことを示す。

5.3 L.パラカゼイL26及び他のS.セレビシエW34/70ラガー酵母を使用した発酵
以前に、S.セレビシエS-04エール酵母を、ホップ無添加ワート中の共発酵及び連続発酵中にL.パラカゼイL26と共に使用した(実施例2)。異性化ホップ抽出物を添加した冷蔵保存中、共培養物中のL.パラカゼイL26は、連続培養物(9日)と比較して、7.0 log CFU/mLを超える高い生細胞数を22日間維持した。

主流の市販ビールはラガービールであるため、本実施例では、L.パラカゼイL26との共接種及び連続接種中の、ラガー酵母株サッカロミセス・セレビシエW-34/70の使用を検討する。

方法は実施例2.1と同様であった。三重の発酵を、350mLのホップ無添加ワートを含有する、500mL蓋付きガラス瓶中で行った。共発酵サンプルでは、ホップ無添加ワートに、L.パラカゼイL26(1％(v/v))及びS.セレビシエW-34/70酵母(1％(v/v))を接種した。連続発酵サンプルでは、L.パラカゼイL26及びS.セレビシエW-34/70酵母の同じ接種物を、ホップ無添加ワートに添加したが、S.セレビシエW-34/70は、発酵の1日目になって初めて添加した。S.セレビシエW-34/70の単培養物は、対照として機能した。発酵は、プロバイオティック細菌の増殖に好ましい条件をもたらすために、0日目から1日目まで30℃で静的に進行した。次いで、酵母の増殖を可能にするため、1日目から22日目まで温度を20℃に下げた。

22日間の発酵後、7.5 IBUの添加量の異性化ホップ抽出物(Brouwland、ベーフェルロ、ベルギー)を、ホップ無添加ビールに添加した。次いで、ホップ添加ビールを5℃及び25℃で保存し、L.パラカゼイL26の生存性を評価した。

図19及び20は、それぞれ5℃及び25℃における、S.セレビシエW-34/70を用いた発酵及び保存中のL.パラカゼイL26の増殖及び生存を示す。L.パラカゼイL26は、22日間の発酵期間中にラガー酵母S.セレビシエW-34/70と共存することができ、共接種サンプル及び連続接種サンプルの両方について8.60 log CFU/mLを超える高い細胞数を維持したことが分かる。

7.5 IBUの異性化ホップ抽出物の添加とその後の保存の後、共接種サンプル及び連続接種サンプル中のL.パラカゼイL26は、5℃で保存した場合、保存4日以内に8.60 log CFU/mLを超える細胞数を依然として維持した。対照的に、L.パラカゼイL26細胞数は、25℃で保存された全てのサンプルについて同じ期間内に7.0 log CFU/mLを下回り、このことは、プロバイオティック生存力を維持するための、プロバイオティックビールのコールドチェーン流通及び保存の重要性を補強する。

図20のデータはまた、共接種法が、連続接種よりも、プロバイオティック生存力の延長におけるより良い技術であり得ることを示唆し、25℃における保存4日目に、連続接種サンプルではプロバイオティック細菌細胞数が検出されなかったが、共接種サンプル中にL.パラカゼイL26について6.63 log CFU/mLが依然として検出された。これらの知見は、S.セレビシエS-04と共培養したL.パラカゼイL26が、連続培養物(9日)と比較して、7.0 log CFU/mLを超える高い生細胞数を22日間維持した、実施例2で得られた知見を繰り返す。このような効果は、5℃で保存されたサンプルではそれほど顕著ではなく、保存31日目の共接種サンプルと連続接種サンプルとの間でプロバイオティック細胞数に有意差はない(連続接種によるプロバイオティック細胞数は、共接種法によるプロバイオティック細胞数よりもわずかに少なかったが(図19))。

冷蔵下では、プロバイオティック細菌細胞数は、保存31日目までに基準となる7.0 log CFU/mLを下回った。これは、S.セレビシエW34/70が、1ヶ月の貯蔵寿命を有した(実施例3、図4; 実施例5.1、図11)S.セレビシエS-04と同様の程度のプロバイオティック細菌生存力向上効果を提供したことを示す。したがって、これは、ラガータイプのプロバイオティックビールを生産し得ることを示す。

図21(a)及び図21(b)は、22日間の発酵期間、及びそれぞれ5℃及び25℃での保存期間中に得られたpH測定値を示し、一方、図22(a)及び図22(b)は、5℃及び25℃の保存温度における対応する゜ブリックス測定値を示す。L.パラカゼイL26を含有するサンプルのpH測定値は、3.55～3.56であり、L.パラカゼイL26及びS.セレビシエS-04を使用したプロバイオティックビール発酵で得られた測定値(実施例2、表1及び2)と類似している。

図22(a)及び22(b)から、゜ブリックス測定値が、全てのサンプルでゆっくりと低下し、22日間の発酵期間の終わりにプラトーに達したことが示される。全てのサンプルで゜ブリックス値がさらに減少しないことは、酵母による完全な糖利用を示しており、22日後の保存期間の開始の正当性を示す。

本発明は、以下を提供する。
１．プロバイオティック細菌を含む、アルコール飲料。
２．飲料のアルコール含有量が、≧0.5体積％である、上記１に記載の飲料。
３．ホップをさらに含む、上記１又は２に記載の飲料。
４．ホップ又はその誘導物が、≦30 IBUの苦味を有する、上記３に記載の飲料。
５．プロバイオティック細菌が、乳酸桿菌、ビフィドバクテリア、又はそれらの組み合わせを含む、上記１～４のいずれかに記載の飲料。
６．飲料に含まれるプロバイオティック細菌が、L.パラカゼイ(L. paracasei)、L.ラムノサス(L. rhamnosus)、L.アシドフィルス(L. acidophilus)、L.カゼイ(L. casei)、L.ファーメンタム(L. fermentum)、L.プランタルム(L. plantarum)又はそれらの組み合わせから選択される乳酸桿菌である、上記１～５のいずれかに記載の飲料。
７．プロバイオティック細菌が、≧5.0 log CFU/mLの細胞数を有する、上記１～６のいずれかに記載の飲料。
８． 2～6のpHを有する、上記１～７のいずれかに記載の飲料。
９． 4～20°Bxのブリックスを有する、上記１～８のいずれかに記載の飲料。
１０．ビールである、上記１～９のいずれかに記載の飲料。
１１．上記１～１０のいずれかに記載のアルコール飲料を形成する方法であって、
- ワート又はマストを提供するステップ;
- プロバイオティック細菌をワート又はマストに添加するステップ;
- 酵母をワート又はマストに添加するステップ; 及び
- 所定の期間及び所定の温度でワート又はマストを発酵させて、アルコール飲料を形成するステップ
を含む、方法。
１２．ホップ又はその誘導物をワート又はマストに添加することをさらに含む、上記１１に記載の方法。
１３．ホップが、≦30 IBUの苦味を有する、上記１１又は１２に記載の方法。
１４．プロバイオティック細菌が、乳酸桿菌、ビフィドバクテリア、又はそれらの組み合わせを含む、上記１１～１３のいずれかに記載の方法。
１５．飲料に含まれるプロバイオティック細菌が、L.パラカゼイ、L.ラムノサス、L.アシドフィルス、L.カゼイ、L.ファーメンタム、L.プランタルム又はそれらの組み合わせから選択される乳酸桿菌である、上記１１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．酵母が、サッカロミセス属(Saccharomyces)酵母、非サッカロミセス属(non-Saccharomyces)酵母、又はそれらの組み合わせである、上記１１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．酵母が、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、S.パスツリアヌス(S. pasteurianus)、T.デルブレッキイ(T. delbrueckii)、M.プルケリマ(M. pulcherrima)、P.クルイベリ(P. kluveri)、L.サーモトレランス(L. thermotolerans)、又はその組み合わせである、上記１１～１６のいずれかに記載の方法。
１８．プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加が、同時に行われる、上記１１～１７のいずれかに記載の方法。
１９．発酵が、ワート又はマストを第1の温度で第1の期間発酵させ、その後、ワート又はマストを第2の温度で第2の期間発酵させることを含む、上記１８に記載の方法。
２０．第2の期間の終わりにホップ又はその誘導物を添加することをさらに含む、上記１９に記載の方法。
２１．プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加が、連続して行われる、上記１１～１７のいずれかに記載の方法。
２２．酵母の添加が、プロバイオティック細菌の添加後の第3の期間後に行われる、上記２１に記載の方法。
２３．発酵が、ワート又はマストを第3の温度で酵母添加後の第4の期間発酵させ、その後、ワート又はマストを第4の温度で第5の期間発酵させることを含む、上記２２に記載の方法。
２４．第5の期間の終わりにホップを添加することをさらに含む、上記２３に記載の方法。
２５．形成されたアルコール飲料が、≦20℃の温度で保存される、上記１１～２４のいずれかに記載の方法。

Claims

≧5.0 log CFU/mLの細胞数を有するプロバイオティック細菌を含むアルコール飲料であって、≦30 IBUの苦味を有する異性化ホップ抽出物であるホップ又はその誘導物をさらに含み、2～6のpHを有し、5℃で貯蔵した場合に≧5.0 log CFU/mLのプロバイオティック細菌細胞数が4日間以上維持される、上記アルコール飲料。
飲料のアルコール含有量が、≧0.5体積％である、請求項１に記載の飲料。
異性化ホップ抽出物が、≦7.5 IBUの苦味を有する、請求項１又は２に記載の飲料。
プロバイオティック細菌が、乳酸桿菌、ビフィドバクテリア、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の飲料。
飲料に含まれるプロバイオティック細菌が、L.パラカゼイ(L. paracasei)、L.ラムノサス(L. rhamnosus)、L.アシドフィルス(L. acidophilus)、L.カゼイ(L. casei)、L.ファーメンタム(L. fermentum)、L.プランタルム(L. plantarum)又はそれらの組み合わせから選択される乳酸桿菌である、請求項１～４のいずれか一項に記載の飲料。
4～20°Bxのブリックスを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の飲料。
ビールである、請求項１～６のいずれか一項に記載の飲料。
請求項１～７のいずれか一項に記載のアルコール飲料を形成する方法であって、
- ワート又はマストを提供するステップ;
- プロバイオティック細菌をワート又はマストに添加するステップであって、添加するプロバイオティック細菌の量が5～7 log CFU/mLであるステップ;
- 酵母をワート又はマストに添加するステップであって、添加する酵母の量が5～7 log CFU/mLであるステップ;
- 所定の期間及び所定の温度でワート又はマストを発酵させて、アルコール飲料を形成するステップであって、発酵が、具体的に、
プロバイオティック細菌の添加及び酵母の添加を同時にすること、
ワート又はマストを25～35℃で1～5日間発酵させ、その後、ワート又はマストを13～25℃で8～30日間発酵させること、
発酵の終わりに異性化ホップ抽出物を発酵したワート又はマストに添加すること、そして
形成されたアルコール飲料を1～5℃で貯蔵すること
を含むステップ
を含み、異性化ホップ抽出物が≦30 IBUの苦味を有する、方法。
異性化ホップ抽出物が、≦7.5 IBUの苦味を有する、請求項８に記載の方法。
プロバイオティック細菌が、乳酸桿菌、ビフィドバクテリア、又はそれらの組み合わせを含む、請求項８又は９に記載の方法。
飲料に含まれるプロバイオティック細菌が、L.パラカゼイ、L.ラムノサス、L.アシドフィルス、L.カゼイ、L.ファーメンタム、L.プランタルム又はそれらの組み合わせから選択される乳酸桿菌である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
酵母が、サッカロミセス属(Saccharomyces)酵母、非サッカロミセス属(non-Saccharomyces)酵母、又はそれらの組み合わせである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
酵母が、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、S.パスツリアヌス(S. pasteurianus)、T.デルブレッキイ(T. delbrueckii)、M.プルケリマ(M. pulcherrima)、P.クルイベリ(P. kluveri)、L.サーモトレランス(L. thermotolerans)、又はその組み合わせである、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。