JP7573287B2 - アフィニティー精製用免疫グロブリン結合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、１つ又は複数のドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質に関する。さらに本発明は、本発明のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンのアフィニティー精製ための、これらのＩｇ結合タンパク質又はアフィニティーマトリックスの使用及び本発明のＩｇ結合タンパク質を用いるアフィニティー精製の方法に関する。

多くのバイオテクノロジー及び医薬用途では、抗体を含有する試料から汚染物質を除去することが求められる。抗体を捕捉及び精製するための確立された手順は、スタフィロコッカス・アウレウス由来の細菌細胞表面プロテインＡを免疫グロブリンの選択的リガンドとして用いるアフィニティークロマトグラフィーである（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．による総説、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１，２００２：２１７－２３１を参照されたい）。野生型プロテインＡは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に高い親和性と選択性で結合する。アルカリ安定性などの特性が向上したプロテインＡのバリアントが、抗体を精製するために利用可能であり、プロテインＡのリガンドを含むさまざまなクロマトグラフィーマトリックスが市販されている。しかし、現在入手可能なプロテインＡをベースとするクロマトグラフィーマトリックスは、アルカリ性条件に曝されると免疫グロブリンに対する結合能の低下を示す。

発明の背景にある技術的課題
抗体又はＦｃ含有融合タンパク質の大規模生産プロセスでは大抵、アフィニティー精製にプロテインＡが使用される。しかし、アフィニティークロマトグラフィーでのプロテインＡの利用には限界があるので、当技術分野では、免疫グロブリンのアフィニティー精製を容易にするために、免疫グロブリンに特異的に結合する特性が改良された新規Ｉｇ結合タンパク質を提供する必要性がある。Ｉｇ結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックスの価値を最大限に活用するためには、アフィニティーリガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい。クロマトグラフィーサイクルの間には、徹底した洗浄手順が、マトリックス上の残留汚染物質の浄化及び除去ために必要である。この手順では、高濃度のＮａＯＨを含むアルカリ性溶液をアフィニティーリガンドマトリックスに加えることが、一般的に行われている。野生型プロテインＡドメインは、このような過酷なアルカリ性条件に長時間耐えることができず、すぐに免疫グロブリンに対する結合能を失ってしまう。さらに、アフィニティーリガンドマトリックスを繰り返し使用するためには、過酷な酸性条件下での洗浄ステップが求められる。

したがって、この分野では、Ｆｃ配列を含むタンパク質を結合でき、かつアフィニティークロマトグラフィーの過酷な洗浄条件に耐えられる新規タンパク質を得ることが、長い間必要とされている。

本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製に特によく適したＩｇ結合タンパク質を提供する。特に、本発明のＩｇ結合タンパク質にはいくつかの利点がある。本発明のＩｇ結合タンパク質の重要な利点の１つは、高い動的結合容量と相まって、Ｉｇ結合能の低下を伴わない高ｐＨにおける長時間の向上した安定性である。

上記の概要は、本発明によって解決されるすべての問題を必ずしも記載しているわけではない。

本発明の一態様は、アフィニティー精製に適したＩｇ結合タンパク質を提供することである。
［１］これは、１つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質であって、少なくとも１つのドメインが、配列番号１（ｃｓ５０）、配列番号２（ｃｓ５２）、配列番号３（ｃｓ５８）、配列番号４（ｃｓ５９）、配列番号５（ｃｓ６０）、配列番号６（ｃｓ５１）、配列番号７（ｃｓ５６）、配列番号８（ｃｓ５４）、若しくは配列番号１０（ｃｓ５５）のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、若しくは配列番号１０のいずれかと少なくとも９５％の同一性をもつアミノ酸配列を含む、又はそれからなるＩｇ結合タンパク質で達成される。
［２］前記ドメインが、配列番号１に記載のアミノ酸配列（ｃｓ５０）又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、［１］に記載のＩｇ結合タンパク質。
［３］前記ドメインが、配列番号７に記載のアミノ酸配列（ｃｓ５６）若しくはそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、又は前記ドメインが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（ｃｓ５５）若しくはそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、［１］に記載のＩｇ結合タンパク質。
［４］前記ドメインが、配列番号８に記載のアミノ酸配列（ｃｓ５４）又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（ｃｓ５７）を含む、［３］に記載のＩｇ結合タンパク質。
［５］互いに連結している２、３、４、５、６、７、又は８つのドメインを含む、［１］～［４］に記載のＩｇ結合タンパク質。
［６］ホモ多量体又はヘテロ多量体である、［５］に記載のＩｇ結合タンパク質。
［７］１つ又は複数のドメインが、直接又は１つ若しくは複数のリンカーで、互いに連結している、［６］に記載のＩｇ結合タンパク質。
［８］前記タンパク質が、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、又はＦａｂ断片に結合する、［１］～［７］のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質。
［９］固体支持体に固定化された、［１］～［８］のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質。
［１０］アフィニティー分離マトリックスに結合する［１］～［９］のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質を含む、アフィニティー分離マトリックス。
［１１］Ｉｇ結合タンパク質に親和性をもつ任意のタンパク質をアフィニティー精製するための、［１］～［９］のいずれか１つに記載のＩｇ結合タンパク質又は［１０］に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
［１２］Ｉｇ配列を含むタンパク質のアフィニティー精製の方法であって、前記方法が、
（ａ）Ｉｇ配列を含む該タンパク質を含有する液体を用意すること、
（ｂ）［１０］に記載のアフィニティー分離マトリックスを用意すること、
（ｃ）Ｉｇ配列を含むタンパク質への、［１］～［９］のいずれか１つに記載の前記少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質の結合を可能にする条件下で、前記アフィニティー分離マトリックスを液体と接触させること、及び
（ｄ）Ｉｇ配列を含む前記タンパク質を、前記アフィニティー精製マトリックスから溶出すること
を含む方法。
［１３］ステップ（ｄ）において、Ｉｇ配列を含むタンパク質の９０％超が、［１］～［９］のいずれかのＩｇ結合タンパク質から溶出される、［１２］に記載の方法。
［１４］（ｅ）アフィニティー精製マトリックスをアルカリ洗浄液で洗浄する追加ステップを含む、［１２］～［１３］に記載の方法。
［１５］Ｉｇ結合タンパク質のＩｇ結合能が、アルカリ性条件下でのインキュベーション前のＩｇ結合能の少なくとも７０％である、［１４］に記載の方法。

この発明の概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明するものではない。他の実施形態は、あとに続く詳細な説明を検討することで明らかになるであろう。

新規Ｉｇ結合タンパク質のアミノ酸配列。上段の数字は、Ｉｇ結合タンパク質の対応するアミノ酸の位置を指す。図１Ａは、配列番号１７のコンセンサスアミノ酸配列及び配列番号１～６のアミノ酸配列。位置３、９、４０、４３、及び４６の可変アミノ酸を灰色で示す。図１Ｂは、配列番号１８のコンセンサスアミノ酸配列及び配列番号７～１０のアミノ酸配列。位置２、４、７、４０、４６、及び５３の可変アミノ酸を灰色で示す。 Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ８５への固定化。エポキシマトリックスであるＰｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ８５へのＩｇ結合タンパク質のカップリング効率。Ｙ軸：エポキシマトリックスへのタンパク質の結合量、単位ｍｇ／ｍｌ。 本発明のＩｇ結合タンパク質の動的結合容量。図３Ａは、市販のタンパク質樹脂ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅと比較したＩｇ結合タンパク質の動的結合容量（ＤＢＣ；ｍｇ／ｍｌ）を示す。図３Ｂは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅと比較したＩｇ結合タンパク質の動的結合容量（ＤＢＣ；ｍｇ／ｍｌ）の向上を示す。 本発明のＩｇ結合タンパク質の苛性安定性。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅと比較したＩｇ結合タンパク質のアルカリ安定性の分析。Ｙ軸：２４時間、０．５Ｍ ＮａＯＨインキュベートした後の残存ＩｇＧ結合活性、単位％。

本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、及び試薬はさまざまでありうるので、以下で本発明を詳細に説明する前に、本発明はそれらに限定されるものではないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のものであり、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

好ましくは、本明細書で使用される用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集（Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ）（ｌＵＰＡＣ勧告）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ バーゼル、スイスに示されている定義と一致する。

本明細書及びあとに続く特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載されたメンバー、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）、若しくはステップ、又はメンバー、完全体、若しくはステップのグループを含むが、他のメンバー、完全体、若しくはステップ、又はメンバー、完全体、若しくはステップのグループを除外しないことを意味すると理解されたい。本発明の明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、複数形も含めて交換可能に使用され、それぞれの意味に該当する。また、本明細書で使用される場合、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、１つ又は複数の掲げられた項目のあらゆる可能な組み合わせ、及び代替（「ｏｒ」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。

本明細書で使用される「約」という用語は、明示的に記載されている量及びそこから±１０％はずれることも含む。より好ましくは、５％はずれることが「約」という用語に含まれる。

いくつかの文献（例えば特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書など）が、本明細書の本文全体を通して引用されている。本明細書のどの部分も、本発明が、先の発明に基づいてそのような開示に先行する権利を与えられていないことを認めるものと解釈されるべきではない。本明細書で引用されているいくつかの文書は、「参照により組み込まれる」ことを特徴とする。このように組み込まれた文献の定義や教示と、本明細書に記載された定義や教示との間に矛盾がある場合は、本明細書の文が優先される。

本明細書で言及されている配列はすべて、添付の配列表に開示されており、その配列表の内容と開示全体は本明細書の一部である。

本発明の文脈では、「Ｉｇ結合タンパク質」又は「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンに特異的に結合することができるタンパク質を記述するのに使用される。本明細書で理解される「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」としては、例えばヒトＩｇＧ_１、ヒトＩｇＧ_２、ヒトＩｇＧ_４、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウシＩｇＧ、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧなどの哺乳類ＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、及びＦｃ領域を含む免疫グロブリン断片（「Ｆｃ断片」若しくは「Ｆｃ」とも呼ばれる）及び／又はＦａｂ領域を含む免疫グロブリン断片（「Ｆａｂ断片」若しくは「Ｆａｂ」とも呼ばれる）を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されない。Ｉｇ結合タンパク質は、完全な免疫グロブリン、並びにＦｃ領域を含むＩｇ断片及び／又はＦａｂ領域を含むＩｇ断片に結合することができる。本明細書で理解される「免疫グロブリン」の定義には、免疫グロブリンを含む融合タンパク質、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの断片（Ｆｃ断片）、Ｆａｂ領域を含む免疫グロブリンの断片（Ｆａｂ断片）、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの断片を含む融合タンパク質、Ｆａｂ領域を含む免疫グロブリンの断片を含む融合タンパク質、Ｉｇ又はＦｃ領域を含むＩｇ断片（Ｆｃ断片）を含む複合体、及びＦａｂ領域を含むＩｇ断片（Ｆａｂ断片）を含む複合体が含まれる。

本発明による「結合」という用語は、好ましくは、特異的な結合に関する。「特異的な結合」とは、Ｉｇ結合タンパク質又はＩｇ結合ドメインが、それに対して特異的である免疫グロブリンに、別の非免疫グロブリン標的への結合と比較してより強く結合することを意味する。

「結合活性」という用語は、本発明のＩｇ結合タンパク質が免疫グロブリンに結合する能力を指す。例えば、結合活性は、アルカリ処理の前及び／又は後に測定することができる。結合活性は、Ｉｇ結合タンパク質、又はマトリックスに結合しているＩｇ結合タンパク質、すなわち固定化された結合タンパク質について測定することができる。「人工的な」という用語は、天然に存在しないもの、すなわちこの用語は、人によって作製又は改変されたものを指す。例えば、人の手によって（例えば、研究室で遺伝子工学によって、シャフリング法によって、若しくは化学反応によってなど）作り出された、又は意図的に改変されたポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列は人工的である。

「解離定数」語又は「Ｋ_Ｄ」という用語は、特異的な結合親和性を画定する。本明細書で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語（通常は「ｍｏｌ／Ｌ」の単位で測定され、「Ｍ」と略記されることがある）は、第１のタンパク質と第２のタンパク質の間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すことを意図している。本発明の文脈では、Ｋ_Ｄという用語は、Ｉｇ結合タンパク質と免疫グロブリンの間の結合親和性を記述するために特に使用される。本発明のＩｇ結合タンパク質は、免疫グロブリンに対する解離定数Ｋ_Ｄが、少なくとも１ｍＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらに好ましくは１０ｎＭ以下であれば、免疫グロブリンに結合するとみなされる。

「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合によって連結された直鎖状分子鎖を意味し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すのに使用される他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に包含され、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はこれらの用語のいずれかと言い換え可能に使用することができる。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾の生成物を指すことも意図しており、その翻訳後修飾には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解による切断、天然に存在しないアミノ酸による修飾、及び当技術分野で周知の同様の修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、２つ以上のタンパク質ドメインからなるＩｇ結合タンパク質も、「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語の定義に当てはまる。

「アルカリ安定な（ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｔａｂｌｅ）」又は「アルカリ安定性（ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」又は「苛性安定な（ｃａｕｓｔｉｃ ｓｔａｂｌｅ）」又は「苛性安定性（ｃａｕｓｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」（本明細書では「ｃｓ」とも略す）という用語は、免疫グロブリンに結合する能力を著しく失うことなくアルカリ性条件に耐える本発明のＩｇ結合タンパク質の能力を指す。当業者は、例えば実施例に記載されているように、Ｉｇ結合タンパク質を例えば水酸化ナトリウム溶液とインキュベートし、それに続いて、当業者に公知の慣習的な実験によって、例えばクロマトグラフィーアプローチで、免疫グロブリンへの結合活性を試験することによって、アルカリ安定性を容易に試験することができる。

本発明のＩｇ結合タンパク質及び本発明のＩｇ結合タンパク質を含むマトリックスは、アルカリ安定性が「増加」又は「向上」しており、前記Ｉｇ結合タンパク質を組み込んでいる分子及びマトリックスがアルカリ性条件下で参照に比べて長期間安定であることを意味する。

本明細書で使用される「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失又は挿入によって他のアミノ酸配列と異なるＩｇ結合タンパク質又はドメインのアミノ酸配列を含む。これらの修飾は、遺伝子工学によって作り出されてもよく、又は人によって実施される化学合成若しくは化学反応によって生成されてもよい。

本明細書で使用される「複合体」という用語は、第２のタンパク質又は非タンパク質性の部分などの他の物質に化学的に結合している少なくとも第１のタンパク質を含む、又は本質的にそれからなる分子に関する。

「改変」又は「アミノ酸改変」という用語は、ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸によって交換、削除、又は挿入すること指す。既知の遺伝子コード並びに組換え及び合成ＤＮＡ技術を考慮して、熟練した科学者はアミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを容易に構築することができる。

「置換」又は「アミノ酸置換」という用語は、ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を指す。「欠失」又は「アミノ酸欠失」という用語は、ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸の除去を指す。

「挿入」又は「アミノ酸挿入」という用語は、ポリペプチド配列へのアミノ酸の追加を指す。

本明細書全体を通して、アミノ酸残基の位置番号は、例えば配列番号１～１０のものに対応するように指定されている。

「アミノ酸配列の同一性」という用語は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（又は差異）の定量的な比較を指す。参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「パーセント同一の」又は「パーセント同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセント割合と定義される。

配列同一性を決定するためには、問い合わせタンパク質配列を参照タンパク質配列に対してアライメントする。アライメントの方法は当該技術分野では周知である。シーケンスアライメントの方法は当該技術分野で周知である。例えば、参照アミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の程度を決定するためには、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ類似性プログラムが好ましくは用いられる。マルチプルアラインメント解析には、当業者に公知のＣｌｕｓｔａｌＷが好ましくは用いられる。

配列の同一性の程度は、一般的に、修飾されていない配列の全長に関して計算される。本明細書で使用される場合、「パーセント同一の」又は「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「パーセント同一性」という言い回しは、２つのポリペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は目視によって測定して、最大の対応関係について比較及びアラインメントしたとき、いくつかの実施形態では少なくとも８９．５％、いくつかの実施形態では少なくとも９１％、いくつかの実施形態では少なくとも９２％、いくつかの実施形態では少なくとも９３％、いくつかの実施形態では少なくとも９４％、いくつかの実施形態では少なくとも９５％、いくつかの実施形態では少なくとも９６％、いくつかの実施形態では少なくとも９７％、いくつかの実施形態では少なくとも９８％、いくつかの実施形態では１００％のアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。明確にするために、例えば少なくとも８９．５％の同一性をもつ配列は、８９．５％よりも高い同一性をもつすべての配列、例えば、少なくとも８９．６％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸の同一性をもつ実施形態を含む。パーセント同一性は、いくつかの実施形態では少なくとも５２残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５３残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５４残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５５残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５６残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５７残基の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５８残基の領域にわたって存在している。

「融合された」という用語は、構成要素が直接又はペプチドリンカーを介して、ペプチド結合で連結されていることを意味する。

「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第２のタンパク質に遺伝工学的に結合された少なくとも第１のタンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子の結合を通して作り出される。したがって、融合タンパク質は、単一の直線的なポリペプチドとして発現される同一又は異なるタンパク質の多量体を含みうる。

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、広い意味で、少なくとも２つの他の分子を共有結合する分子を指す。本発明の典型的な実施形態では、「リンカー」とは、Ｉｇ結合ドメインを少なくとも１つのさらなるＩｇ結合ドメインと連結する部分、すなわち、２つのタンパク質ドメインを互いに連結して多量体を作り出す部分と理解される。好ましい実施形態では、「リンカー」はペプチドリンカーであり、すなわち、２つのタンパク質ドメインを連結する部分は、１つの単一アミノ酸又は２つ以上のアミノ酸を含むペプチドである。

「クロマトグラフィー」という用語は、移動相と固定相を用いて、試料中の１つの種類の分子（例えば免疫グロブリン）を他の分子（例えば汚染物質）から分離する分離技術を指す。液体移動相は分子の混合物を含有し、これらを、固定相（固体マトリックスなど）を横切って又は固定相を通して送り出す。移動相中のさまざまな分子が固定相と特異的に相互作用するので、移動相に含まれる分子を分離することができる。

「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、固定相に結合したリガンドが移動相（試料）中の分子（免疫グロブリンなど）と相互作用する、すなわち、リガンドが精製すべき分子に対して特異的な結合親和性を有するクロマトグラフィーの特定の様式を指す。本発明の文脈で理解されるように、アフィニティークロマトグラフィーは、免疫グロブリンを含有する試料を、本発明のＩｇ結合タンパク質などのクロマトグラフィーリガンドを含む固定相に加えるものである。

「固体支持体」又は「固形マトリックス」という用語は、固定相と交換可能で使用される。

本明細書に言い換え可能で使用される「アフィニティーマトリックス」又は「アフィニティー分離マトリックス」又は「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は、アフィニティーリガンド、例えば本発明のＩｇ結合タンパク質が結合しているマトリックス、例えばクロマトグラフィーマトリックスを指す。リガンド（例えばＩｇ結合タンパク質）は、混合物から精製又は除去される目的の分子（例えば上記で定義された免疫グロブリン）に特異的に結合することができる。

本明細書で使用される「アフィニティー精製」という用語は、マトリックスに固定化されたＩｇ結合タンパク質に、上記で定義された免疫グロブリンを結合させることで、液体から上記で定義された免疫グロブリンを精製する方法を指す。それにより、免疫グロブリンを除く他の混合物成分がすべて除去される。さらなるステップでは、免疫グロブリンが精製された形で溶出される。

発明の実施形態
以下、本発明についてさらに説明する。以下の文章では本発明の異なる実施形態がより詳細に画定される。以下で画定される各実施形態は、明確に反対の指示がない限り、他の実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示されたいずれの特徴も、好ましい又は有利であると示された他の特徴又は特徴と組み合わせることができる。

１つの実施形態では、Ｉｇタンパク質は１つ又は複数のドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号１～１０のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性をもつアミノ酸を含む、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｉｇタンパク質は１つ又は複数のドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは／又は１０のいずれかと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性をもつアミノ酸を含む、又は本質的にそれからなる、又はそれからなる。本発明のＩｇ結合ドメインは、５８個のアミノ酸からなる３つのヘリックスの束であり、アミノ酸残基７～１９のヘリックス１、アミノ酸残基２３～３７のヘリックス２、及びアミノ酸残基４０～５６のヘリックス３を含む。

本発明のＩｇ結合タンパク質の驚くべき利点は、低いｐＨや高いｐＨ（ｐＨ１３以上）のなどの極端な条件下でも、Ｉｇ結合性を失わずに安定していることである。本明細書に記載のＩｇ結合タンパク質は、Ｉｇ結合特性を損なうことなく、長期間にわたってアルカリ安定性を示す。さらに、Ｉｇの結合性を大きく失うことなく、低いｐＨにおいて安定している。本発明のＩｇ結合タンパク質は、０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも２４時間インキュベートした後の結合能の減少が３０％未満である。この特徴は、ＮａＯＨ濃度が高いアルカリ溶液を用いてマトリックス状の汚染物質を除去する洗浄手順を含むクロマトグラフィーのアプローチにとって重要であり、例えばその結果マトリックスは何回も使用することができる。高い苛性安定性に加えて、Ｉｇ結合タンパク質は高いカップリング効率を示す。さらに、アフィニティークロマトグラフィーの重要なステップは、本発明のＩｇ結合タンパク質に結合しているタンパク質の溶出である。このステップは通常、低いｐＨで行われる。本発明のＩｇ結合タンパク質は、この処理後もＩｇへの結合性を失わない。

好ましいＩｇ結合タンパク質。いくつかの実施形態では、配列番号１（ｃｓ５０）、配列番号２（ｃｓ５２）、配列番号３（ｃｓ５８）、配列番号４（ｃｓ５９）、配列番号５（ｃｓ６０）、配列番号６（ｃｓ５１）、配列番号７（ｃｓ５６）、配列番号８（ｃｓ５４）、配列番号９（ｃｓ５７）、又は配列番号１０（ｃｓ５５）のいずれか１つのアミノ酸配列は、１又は２個のさらなる置換を有する。いくつかの実施形態は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれかに対するアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性をもつアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれかに対するアミノ酸配列と少なくとも９８％配列同一性をもつアミノ酸配列に関する。

いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は１つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、配列番号１～７のアミノ酸配列、又は配列番号１～７のいずれかと少なくとも９５％の同一性をもつアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。Ｉｇ結合タンパク質は、例えば０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも２４時間インキュベートした後の残存Ｉｇ結合能によって決定して、アルカリ性条件下でインキュベートする前のＩｇ結合能の少なくとも７０％のＩｇ結合能を有する。

配列番号１７。１つの実施形態は、配列番号１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、又は本質的にそれからなる、それからなる１つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質を包含する。配列番号１７のアミノ酸配列を図１Ａ及びここに示す。

ＩＤＸ_３ＫＦＤＥＡＸ_９ＱＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＸ_４０ＳＬＸ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＰ
ここで、３位のアミノ酸（Ｘ_３）はＡ又はＳから選択され、９位のアミノ酸（Ｘ_９）はＱ又はＡから選択され、４０位のアミノ酸（Ｘ_４０）はＴ又はＶから選択され、４３位のアミノ酸（Ｘ_４３）はＳ又はＡから選択され、４６位のアミノ酸（Ｘ_４６）はＧ又はＡから選択される。

配列番号１７のアミノ酸配列の選ばれた例は、図１Ａに示すように、配列番号１～６である。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又は少なくとも８９．５％の同一性をもつ配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。例えば、配列番号１と少なくとも８９．５％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性をもつアミノ酸配列は、配列番号２（ｃｓ５２；配列番号１と９８．３％の同一性）、配列番号３（ｃｓ５８；配列番号１と９８．３％の同一性）、配列番号４（ｃｓ５９；配列番号１と９８．３％の同一性）、配列番号５（ｃｓ６０；配列番号１と９６．６％の同一性）、及び配列番号６（ｃｓ５１；配列番号１の９６．６％の同一性）が挙げられるが、これらに限定されない。配列番号１７の例示的なアミノ酸配列に関するアミノ酸同一性については表１を参照されたい。

配列番号１８。１つの実施形態は、配列番号１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８９．５％同一のアミノ酸配列を含む、又は本質的にそれからなる、それからなる１つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含むＩｇ結合タンパク質を包含する。配列番号１８のアミノ酸配列は図１Ｂ及びここに示されている。
ＩＸ_２ＡＸ_４ＨＤＸ_７ＤＱＱＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＸ_４０ＳＬＥＩＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＮＸ_５３ＳＱＡＰＫ
ここで、２位のアミノ酸（Ｘ_２）はＡ又はＤから選択され、４位のアミノ酸（Ｘ_４）はＫ又はＱから選択され、７位のアミノ酸（Ｘ_７）はＫ又はＥから選択され、４０位のアミノ酸（Ｘ_４０）はＱ又はＶから選択され、４６位のアミノ酸（Ｘ_４６）はＧ又はＡから選択され、５３位のアミノ酸（Ｘ_５３）はＤ又はＥから選択される。

配列番号１８のアミノ酸配列の選ばれた例は、図１Ｂに示すように、配列番号７～１０である。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列、又は少なくとも９２％の同一性をもつアミノ酸配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。例えば、配列番号７と少なくとも８９．５％の同一性をもつアミノ酸配列としては、配列番号８（ｃｓ５４；配列番号７と９６．６％の同一性）、配列番号１０（ｃｓ５５；配列番号７と９４．８％の同一性）、及び配列番号９（ｃｓ５７；配列番号７と９３．１％の同一性）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば配列番号１８のアミノ酸配列に関するアミノ酸同一性については表２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１～８に記載のアミノ酸配列又は配列番号１～８のいずれかと少なくとも９２％同一の配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。

いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号８（ｃｓ５４）に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９２％同一のアミノ酸配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。他の実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１０（ｃｓ５５）に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９４％同一、好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号１～１０、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、若しくは配列番号１０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１～１０のいずれか、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは１０のいずれかと少なくとも９５％同一の配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。他の実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号９（ｃｓ５７）に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９８％同一のアミノ酸配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。

他の実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、配列番号８、９、１０に記載のアミノ酸配列又は配列番号８、９、１０のいずれかと少なくとも８９．５％同一の配列の１つ又は複数のドメインを含んでいる。ただし５４位にあたるアミノ酸はセリンである。

免疫グロブリンに対する親和性。本発明のＩｇ結合タンパク質は、解離定数Ｋ_Ｄが好ましくは５００ｎＭ未満、又は１００ｎＭ未満、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下で、免疫グロブリンに結合する。Ｉｇ結合タンパク質又はドメインの結合親和性を決定するための方法、すなわち解離定数Ｋ_Ｄを決定するための方法は、当業者に公知であり、例えば当業者に公知の以下の方法から選択することができる。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術、結合平衡除外分析（ＫｉｎＥｘＡアッセイ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）、分析的超遠心分離法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）及び増強化学発光（ＥＣＬ）。いくつかの方法は、実施例でさらに説明される。典型的には、解離定数Ｋ_Ｄは、２０℃、２５℃、又は３０℃で決定される。具体的に記載されていない場合、本明細書に記載のＫ_Ｄ値は、表面プラズモン共鳴により２２℃±３℃で決定される。１つの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭ～５０ｎＭの範囲のヒトＩｇＧ_１に対する解離定数Ｋ_Ｄを有する（実施例６、表３を参照）。

Ｉｇ結合タンパク質の高いアルカリ安定性。本発明のＩｇ結合タンパク質は、実施例及び図に示すように、驚くべきことに、Ｉｇ結合タンパク質のとりわけ良好なアルカリ安定性を示す。Ｉｇ結合タンパク質のアルカリ安定性は、Ｉｇ結合活性の低下を比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、アルカリ性の液体は、０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくは０．２５～０．５Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。本発明のＩｇ結合タンパク質はアルカリ安定性が高いので、１３より高いｐＨをもつアルカリ性の液体を、固定化された本発明のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスを洗浄するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質のアルカリ安定性は、０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも２４時間インキュベートした後のＩｇ結合活性の低下を比較することによって決定される（図４及び実施例を参照）。

多量体。１つの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、又は８個、好ましくは互いに連結された２、３、４、５、又は６個のＩｇ結合ドメインを含み、すなわち、Ｉｇ結合タンパク質は、例えば、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、又は六量体でありうる。多量体は、２つ、３つ、４つ、又はさらにそれより多くの結合ドメインを含みうる。本発明の多量体は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術によって人工的に作り出された融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、多量体はホモ多量体であり、例えば、Ｉｇ結合タンパク質のすべてのＩｇ結合ドメインのアミノ酸配列は同一である。

多量体は、２つ以上のＩｇ結合ドメインを含むことができ、前記Ｉｇ結合ドメインは、好ましくは、上記配列を含む、又はそれから本質的に構成される。二量体の例は、配列番号１１（ｃｓ５８二量体）、配列番号１２（ｃｓ５９二量体）、配列番号１３（ｃｓ６０二量体）、及び配列番号１４（ｃｓ５０二量体）に示されている。五量体の例は、配列番号１５（ｃｓ５０五量体）及び配列番号１６（ｃｓ５９五量体）に示されている。

いくつかの実施形態では、多量体はヘテロ多量体であり、例えば、少なくとも１つのＩｇ結合ドメインは、Ｉｇ結合タンパク質内の他のＩｇ結合ドメインと異なるアミノ酸配列を有する。

リンカー。１つの実施形態のいくつかの実施形態では、１つ又は複数のＩｇ結合ドメインは、互いに直接連結されている。他の実施形態では、１つ又は複数のＩｇ結合ドメインは、１つ又は複数のリンカーで互いに連結されている。これらの典型的な実施形態で好ましいのはペプチドリンカーである。これは、ペプチドリンカーが第１のＩｇ結合ドメインと第２のＩｇ結合ドメインを連結するアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、第１のＩｇ結合ドメイン及び第２のＩｇ結合ドメインに、ドメインのＣ末端とＮ末端の間のペプチド結合によって連結され、それにより単一の直線的なポリペプチド鎖が作り出される。リンカーの長さと組成は、少なくとも１つから最大で約３０個のアミノ酸の間でさまざまでありうる。より具体的には、ペプチドリンカーは、１～３０個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のアミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、苛性条件やプロテアーゼに対して安定であることが好ましい。リンカーは、Ｉｇ結合タンパク質のドメインのコンフォメーションを不安定すべきではない。よく知られているのは、グリシンやセリンなどの小さいアミノ酸を含む又はそれからなるリンカーである。リンカーは、グリシンを豊富に含んでいることができる（例えば、リンカーの５０％を超える残基がグリシン残基であることができる）。また、さらなるアミノ酸を含むリンカーも好ましい。本発明の他の実施形態は、アラニン、プロリン、及びセリンからなるリンカーを含む。タンパク質の融合のための他のリンカーは当該技術分野で公知であり、それを使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質の多量体は、Ｉｇ結合ドメインを連結する同一の又は異なる１つ又は複数のリンカーを含む。

アフィニティー分離マトリックス。別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスを対象とする。

好ましい実施形態では、アフィニティー分離マトリックスは固体支持体である。アフィニティー分離マトリックスは、上記の少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質を含む。

アフィニティーマトリックスは、免疫グロブリンの分離に有用であり、洗浄過程の間に適用されるようなアルカリ性が高い条件の後でさえも、Ｉｇ結合特性を保持すべきである。マトリックスのそのような洗浄は、マトリックスを長期間繰り返し使用するためには不可欠である。

アフィニティークロマトグラフィーの固体支持体マトリックスは、当該技術分野で公知であり、例えば、アガロース及びアガロースの安定化誘導体（例えばＰｒａｅｓｔｏ（登録商標）Ｐｕｒｅ、Ｐｒａｅｓｔｏ（登録商標）Ｊｅｔｔｅｄ Ａ５０、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（登録商標）、ＰｒｉｓｍＡ（登録商標）、セファロース６Ｂ、ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）、ｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ セファロース Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、その他）、セルロース又はセルロースの誘導体、多孔質ガラス（例えばＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ樹脂）、モノリス（例えばＣＩＭ（登録商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（例えばＣＭジルコニア又はＣＰＧ（登録商標））、酸化チタン、又は合成ポリマー（例えばＰｏｒｏｓ ５０Ａ若しくはＰｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）Ａ樹脂などのポリスチレン、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、単分散ポリアクリレート樹脂（例えばＵｎｉＭａｂ（商標）、ＵｎｉＭａｂ（商標）Ｐｒｏ）、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドなど）及びさまざまな組成物のハイドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、支持体は、多糖類などのポリヒドロキシポリマーを含む。支持体に適した多糖類の例としては、寒天、アガロース、デキストラン、デンプン、セルロース、プルランなどや、及びこれらの安定化したバリアントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

固体支持体マトリックスのフォーマットは、よく知られている好適なもののいずれでもよい。本明細書に記載のＩｇ結合タンパク質をカップリングするためのそのような固体支持体マトリックスは、例えば以下のうちの１つを含む可能性がある。カラム、キャピラリー、粒子、膜、フィルター、モノリス、繊維、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセット、又はクロマトグラフィーで一般的に使用され、当業者に公知の他のフォーマット。

１つの実施形態では、マトリックスは、ビーズとしても知られる実質的に球状の粒子、例えばセファロース若しくはアガロースビーズ又は単分散ポリアクリレートビーズで構成される。好適な粒子径は、４０～７０ｐｍなど、２０～８０ｐｍなど、１０～１００ｐｍなど５～５００ｐｍの直径範囲でありうる。粒子形態のマトリックスは、充填層として、又は拡張床を含む吊り下げられた形態で使用することができる。

代替的な実施形態では、固体支持体マトリックスは膜であり、例えばヒドロゲル膜である。いくつかの実施形態では、アフィニティー精製は、１つの実施形態のＩｇ結合タンパク質が共有結合しているマトリックスとしての膜を含むものである。また、固体支持体は、カートリッジ内の膜の形態であることもできる。

いくつかの実施形態では、アフィニティー精製は、１つの実施形態のＩｇ結合タンパク質が共有結合している固体支持体マトリックスを含有するクロマトグラフィーカラムを含むものである。

固体支持体への固定化。本発明の実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は固体支持体に結合している。本発明のいくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に追加のアミノ酸残基を含むことができる。本発明のＩｇ結合タンパク質は、従来のカップリング技術によって好適な固体支持体マトリックスに結合させることができる。タンパク質リガンドを固体支持体に固定化するための方法は、この分野で周知であり、標準的な技術や機器設備を用いて当業者によって容易に行われる。いくつかの実施形態では、カップリングは、例えば、複数のリジンを介した多点カップリングであっても、例えばシステインを介した単一点カップリングであってもよい。

いくつかの実施形態では、アルカリ安定Ｉｇ結合タンパク質は、固相（マトリックス）に共有結合するための結合部位を含む。サイト特異的な結合部位は、システイン又はリジンなどの天然アミノ酸を含み、これにより、固相又は固相とタンパク質の間のリンカーの反応性基との特異的な化学反応が可能になる。

いくつかの実施形態では、結合部位はＩｇ結合タンパク質のＣ－末端又はＮ－末端に直接存在してもよい。いくつかの実施形態では、単一のシステインが、Ｉｇ結合タンパク質の部位特異的な固定化のためにＣ－末端に配置されている。Ｃ－末端システインを有することの利点は、システインのチオールと支持体上の求電子基とが反応し、結果としてチオエーテル架橋結合がもたらされることを通して、Ｉｇ結合タンパク質の結合が達成できることである。これにより、結合タンパク質の優れた移動性がもたらされ、結合能が増加する。

他の実施形態では、Ｎ－末端又はＣ－末端と結合部位の間にリンカーが存在してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、末端システインをもつ、３～２０個のアミノ酸、好ましくは４～１０個のアミノ酸のＮ－又はＣ－末端アミノ酸配列を含みうる。末端の結合部位のアミノ酸は、プロリン、グリシン、アラニン、及びセリンの群から選択することができ、単一のシステインがカップリングのためにＣ－末端にある。

本発明のいくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質は、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端の追加のアミノ酸残基、例えば、Ｎ－末端のリーダー配列、及び／又はＮ－末端若しくはＣ－末端にタグを含む若しくは含まないカップリング配列を含んでいてもよい。

Ｉｇ結合タンパク質の使用。１つの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン又はそのバリアントのアフィニティー精製のための１つの実施形態のＩｇ結合タンパク質又は１つの実施形態のアフィニティーマトリックスの使用を対象とし、すなわち、本発明のＩｇ結合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーに使用される。いくつかの実施形態では、本発明のＩｇ結合タンパク質は、本発明の１つの実施形態に記載の固体支持体に固定化されている。

免疫グロブリンのアフィニティー精製方法。１つの実施形態では、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製方法を対象とし、この方法は以下のステップを含む。
（ａ）ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、又はＦａｂ断片などのＩｇを含むタンパク質（上記で定義された融合タンパク質及び複合体を含む）を含有する液体を用意すること、
（ｂ）前記アフィニティー分離マトリックスに固定化された上記の固定化Ｉｇ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスを用意すること、
（ｃ）上記の少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質のＩｇへの結合を可能にする条件下で、前記液体を前記アフィニティー分離マトリックスと接触させること、並びに
（ｄ）前記マトリックスから前記Ｉｇを溶出させ、それにより前記Ｉｇを含有する溶出液を得ること。

いくつかの実施形態では、アフィニティー精製方法は、アフィニティー分離マトリックスに非特異的に結合している一部又はすべての分子をアフィニティー分離マトリックスから除去するのに十分な条件下でステップ（ｃ）と（ｄ）の間に実施される１つ又は複数の洗浄ステップをさらに含んでいてもよい。非特異的に結合とは、少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質とＩｇの間の相互作用を伴わない任意の結合を意味する。

開示の使用や方法に適したアフィニティー分離マトリックスは、上記の実施形態による当業者に公知のマトリックスである。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）におけるＩｇ結合タンパク質からの免疫グロブリンの溶出は、ｐＨの変化及び／又は塩濃度の変化を通して達成される。一般には、アフィニティー精製の方法を実行するための好適な条件は当業者に周知である。いくつかの実施形態では、開示のＩｇ結合タンパク質を含むアフィニティー精製の開示の使用又は方法は、３．５以上（例えば約３．８、約４．０、又は約４．５）のｐＨで、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のＩｇ含有タンパク質の溶出を可能にすることができる。本発明のＩｇ結合タンパク質は安定性が高いので、ｐＨ３．５以上の溶液をＩｇタンパク質の溶出に用いることができる（実施例６を参照）。

いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスを効率的に洗浄するための、好ましくは、例えばｐＨが１３～１４のアルカリ性の液体を使用するさらなるステップ（ｆ）が追加される。ある特定の実施形態では、洗浄液体は、０．１～１．０ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨ、好ましくは０．２５～０．５ＭのＮａＯＨ又はＫＯＨを含む。本発明のＩｇ結合タンパク質はアルカ性安定性が高いので、このような強アルカリ性溶液を洗浄目的に使用することができる。

いくつかの実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質のＩｇ結合能は、例えば０．５Ｍ ＮａＯＨで少なくとも２４時間インキュベートした後の残存Ｉｇ結合能によって決定して、アルカリ性条件下でインキュベーションする前のＩｇ結合能の少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は１００％である（図４及び実施例を参照）。

いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスは、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、又は少なくとも１００回再使用することができ、ステップ（ａ）～（ｅ）の繰り返しにより、任意選択で（ａ）～（ｆ）は、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、又は少なくとも１００回繰り返すことができる。

核酸分子。１つの実施形態では、本発明は、上記に開示のＩｇ結合タンパク質をコードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子を対象とする。１つの実施形態では、本発明は、核酸分子を含むベクターを対象とする。ベクターは、タンパク質のコーディング情報を宿主細胞に導入ために使用できる任意の分子又は実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。１つの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。

１つの実施形態では、本発明は、上記に開示の核酸やベクター、例えば原核生物の宿主細胞、例えば大腸菌、又は真核生物の宿主、例えば酵母サッカロマイセス・セレビシエ若しくはピキア・パストリス、又はＣＨＯ細胞などの哺乳類の細胞を含む発現系を対象とする。

Ｉｇ結合タンパク質の製造方法。１つの実施形態では、本発明は、次のステップを含む本発明のＩｇ結合タンパク質の製造方法を対象とする。（ａ）前記Ｉｇ結合タンパク質を得るために、結合タンパク質の発現に好適な条件下で１つの実施形態の宿主細胞を培養するステップ、及び（ｂ）任意選択で前記Ｉｇ結合タンパク質を分離するステップ。原核生物や真核生物の宿主を培養するのに好適な条件は当業者に周知である。

本発明のＩｇ結合分子は、平易な有機合成法、固相支援合成法、又は市販の自動合成機など、多くの従来からあり、よく知られている技術のいずれかによって調製することができる。一方で、それらのＩｇ結合分子は、従来の組換え技術単独で、又は従来の合成技術と組み合わせて調製することもできる。

本発明の１つの実施形態は、上記に詳述した本発明によるＩｇ結合タンパク質の調製のための方法を対象とし、前記方法は以下のステップを含む。（ａ）上記で画定されたＩｇ結合タンパク質をコードする核酸を調製するステップ、（ｂ）前記核酸を発現ベクターに導入するステップ、（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ、（ｄ）宿主細胞を培養するステップ、（ｅ）Ｉｇ結合タンパク質が発現する培養条件に宿主細胞を供し、それにより、上記のＩｇ結合タンパク質を産生させるステップ、任意選択で、（ｆ）ステップ（ｅ）で産生させたタンパク質を分離すること、及び（ｇ）任意選択でタンパク質を上記の固体マトリックスに結合させるステップ。

本発明のさらなる実施形態では、Ｉｇ結合タンパク質の生成は、無細胞のインビトロ転写／翻訳で行われる。

以下の実施例は、本発明のさらなる説明のために提供される。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、以下の実施例は、上記説明に基づいた本発明の実施可能性を示すものに過ぎない。

実施例１．本発明のＩｇ結合タンパク質の生成
人工Ｉｇ結合リガンドは、最初、天然に存在するプロテインＡドメイン及びプロテインＡドメインバリアント（例えばＺドメイン）のシャッフリング法で生成した。より詳細には、本明細書で理解されるシャッフリング法は、一組の同一でない既知のアミノ酸配列から出発する人工アミノ酸配列をもたらす組み立て方法である。シャッフリング法は以下のステップを含んでいた。ａ）５つの天然に存在するプロテインＡのドメインＥ、Ｂ、Ｄ、Ａ、及びＣ、並びにプロテインＡバリアントのドメインＺの配列を用意するステップ、ｂ）前記配列のアラインメントするステップ、ｃ）インシリコ統計的断片化を行って、再結合した（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ）部分配列を特定するためのステップ、ｄ）モザイク産物を生成するためのさまざまな断片の新しい人工配列、すなわち新しいアミノ酸配列を組み立てるステップ。ステップｃ）で生成された断片はあらゆる長さであり、例えば、断片化された親配列の長さがｎであった場合、断片の長さは１～ｎ－１であった。

モザイク産物中のアミノ酸の相対的な位置は出発アミノ酸配列に対して維持された。人工的にシャッフルされたＩｇ結合タンパク質の全体的なアミノ酸配列は、天然に存在するプロテインＡドメイン又はドメインＺのいずれかの全体アミノ酸配列に８５％以下の同一性であるという点で人工的である。最初の人工Ｉｇ結合タンパク質を生成した後、タンパク質をアミノ酸配列の部位特異的ランダム化によってさらに変えて、機能特性をさらに変えた。さらなる改変を、個々のアミノ酸残基の部位飽和変異誘発によって導入した。例えば、アルカリ性で安定なＩｇ結合タンパク質ｃｓ２６（配列番号１９）のアミノ酸配列は、このアプローチによって生成した。

バリアントｃｓ５０、ｃｓ５２、ｃｓ５８、ｃｓ５９、ｃｓ６０、ｃｓ５１、ｃｓ５６、ｃｓ５４、ｃｓ５５、及びｃｓ５７を、合成遺伝子断片（ツイストバイオサイエンス／サーモフィッシャーサイエンティフィック）で生成した。遺伝子断片は精製ＰＣＲ産物に相当し、ｐＥＴ２８ａベクターの派生物にクローニングした。ライゲーション産物をエレクトロポレーションによって大腸菌ＸＬ２－ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン）に形質転換した。単一コロニーをＰＣＲによってスクリーニングして、適切なサイズのインサートが入ったコンストラクトを特定した。ＤＮＡシーケンシングを用いて正しい配列を確認した。本発明のバリアントはすべて、例えば天然に存在するプロテインＡドメインＣ、プロテインＡドメインＢ、又はドメインＺと８０％未満の同一性を有する。

実施例２．Ｉｇ結合タンパク質の発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を、Ｉｇ結合タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。細胞を選択寒天プレート（カナマイシン）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。前培養は、５００ｍＬ容の三角フラスコ中で、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した５０ｍｌの２×ＹＴ培地に単一コロニーから播き、一般的なオービタルシェーカーで３７℃、２００ｒｐｍにて１７時間培養した。ＯＤ_６００読み出しは４～６の範囲にあるべきである。主要培養物は、１Ｌ容の厚壁三角フラスコ中で、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び微量元素（Ｓｔｕｄｉｅｒ ２００５を参照）を補充した３００ｍｌのスーパーリッチ培地（２％グルコース、５％酵母抽出物、０．８９％グリセロール、０、７６％ラクトース、２５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２０２ｍＭ ＴＲＩＳ、１０ｍＭ ＭｇＳ０４、ｐＨ７．４、消泡剤ＳＥ１５からなる改変Ｈ１５培地）に、出発ＯＤ_６００を０．３に調整した前述の一晩培養物から播いた。培養物を共振音響ミキサー（ＲＡＭ_ｂｉｏ）に移し、３７℃にて２０×ｇでインキュベートした。Ｏｘｙ‐Ｐｕｍｐストッパーで通気を促した。組換えタンパク質発現は、グルコースを代謝し、続いてラクトースを細胞に入れることにより誘導した。細胞を一晩、約１８時間培養して、最終ＯＤ_６００が約３０～４５に達した。細胞収集前にＯＤ_６００を測定し、０．６／ＯＤ_６００に調整した試料を取り出し、沈殿させ、－２０℃で凍結した。バイオマス細胞を集めるために、１２０００×ｇで１５分間、２０℃で遠心分離した。ペレットの重量を測定した（湿重量）。プロセス前に細胞を－２０℃で保存した。

実施例３：Ｉｇ結合タンパク質の発現及び溶解度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
試料を９０μｌ抽出バッファー（０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、６ｍＭ ＭｇＳ０４、６ｍＭ ＭｇＣＬ、１５Ｕ／ｍｌベンゾナーゼを補充したＰＢＳ）に再懸濁し、８５０ｒｐｍで室温にて１５分間、サーモミキサーで撹拌することにより可溶化し、続いて－８０℃で１５分間インキュベートした。解凍後、遠心分離（１６０００×ｇ、２分、室温）によって可溶性タンパク質を不溶性タンパク質から分離した。上清を取り出し（可溶性画分）、ペレット（不溶性画分）を同量の尿素バッファー（８Ｍ尿素、０．２Ｍトリス、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に再懸濁した。可溶性及び不溶性画分の両方から３５μｌを採取し、１０μｌの５×サンプルバッファー及び５μｌの０．５Ｍ ＤＴＴを加えた。試料を９５℃で５分間煮沸した。最後に、それらの試料のうちの５μｌをＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳゲルに載せ、製造者の推奨に従って泳動し、クーマシーで染色した。すべてのＩｇ結合タンパク質の高いレベルの発現が、選択された期間内の最適化された条件下で見られた（データは示さず）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによれば、すべての発現Ｉｇ結合タンパク質は、９５％を超えて溶けた。

実施例４：Ｉｇ結合タンパク質の精製
Ｉｇ結合タンパク質を、大腸菌の可溶性画分に発現した。細胞を、細胞破砕バッファーに再懸濁し、超音波細胞破砕システム（Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ＨＤ ２２００、Ｂａｎｄｅｌｉｎ）で溶解した。精製ステップは、製造者の指示に従って、ＡＫＴＡｖａｎｔシステム（ＧＥヘルスケア）を使用してＩＥＣセファロースＳＰ－ＨＰ（ＧＥヘルスケア）で、ｐＨ３．０のクエン酸バッファー（２０ｍＭクエン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ３．０）を用いて行った。純粋なタンパク質画分は、直線勾配で塩化ナトリウム濃度を１Ｍに上げることによって１０カラム量で溶出した。

実施例５．Ｉｇ結合タンパク質は高い親和性でＩｇＧに結合する（表面プラズモン共鳴実験で測定）。
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）をＳＰＲランニングバッファーで平衡化した。表面に露出したカルボキシル基を、ＥＤＣとＮＨＳの混合物を通すことによって活性化して、反応性のエステル基を得た。７００～１５００ＲＵのオンリガンドをフローセルに、オフリガンドを別のフローセルに固定化した。リガンドを固定化した後にエタノールアミンを注入することにより、共有結合していないＩｇ結合タンパク質が除去される。リガンドが結合すると、タンパク質分析物が表面に蓄積され、屈折率が上がる。屈折率のこの変化はリアルタイムで測定し、時間に対する応答ユニット又はレゾナンスユニット（ＲＵ）としてプロットする。分析物を連続希釈して好適な流量（μｌ／分）でチップに載せた。各実行の後、チップ表面を再生バッファーで再生し、ランニングバッファーで平衡化した。対照試料をマトリックスに加えた。再生と再平衡化は前述の通りに行った。結合試験をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥヘルスケア）を用いて２５℃で実施した。データの評価は、製造者から提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを用いて、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデル（Ｒｌ＝０）によって行った。評価した解離定数（Ｋ_Ｄ）をオフターゲットに対して標準化し、さまざまな人工Ｉｇ結合タンパク質のＫ_Ｄ値を、セツキシマブ（ＩｇＧ_１）については表３Ａに、セツキシマブ（ＩｇＧ_１）、ナタリズマブ（ＩｇＧ_４）、及びパニツマブ（ＩｇＧ_２）については表３Ｂに示す。

実施例６．アガロースをベースとするクロマトグラフィービーズＰｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ８５に結合させたＩｇ結合タンパク質－カップリング効率、ＤＢＣ１０％、溶出
精製したＩｇ結合タンパク質を、製造者の指示に従って、アガロースをベースとするクロマトグラフィービーズ（Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ８５、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ；カタログ番号ＰＲ０１２６５－１６４）に結合させた（カップリング条件：ｐＨ９．５、３時間、３５℃、４．１Ｍ ＮａＳ０_４、エタノールアミンで一晩ブロッキング）。カップリング効率については図２を参照されたい。結合させた樹脂と市販のＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（カタログ番号２９０４９１０４、ＧＥヘルスケア）をスーパーコンパクト（ｓｕｐｅｒ ｃｏｍｐａｃｔ）５／５０カラム（Ｇｏｅｔｅｃ ＧｍｂＨ）に充填した。ポリクローナルヒトＩｇＧ Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（登録商標）（Ｏｃａｔｐｈａｒｍ）をＩｇＧ試料として使用した（濃度２．２ｍｇ／ｍｌ）。ポリクローナルｈＩｇＧ試料は、固定化されたＩｇ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で加えた。動的結合容量（ＤＢＣ、ｍｇ／ｍｌ）については図３を参照されたい。同等の結果が、Ｐｒａｅｓｔｏ８５エポキシ樹脂に結合させた２０ｍｇ／ｍｌのｃｓ５９（二量体）又はｃｓ６０（二量体）で得られた（カップリング条件：ｐＨ９．５、３時間、３５℃、３５０ｍｇ／ｍｌ樹脂Ｎａ_２Ｓ０_４）。

マトリックスを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３．５）で洗浄し、そのあと０．１Ｍリン酸で洗浄して、固定化されたＩｇ結合タンパク質に結合したｈＩｇＧを溶出させた。試験したすべてのＩｇ結合タンパク質において、９７％を超える抗体が溶出した（１００％、ｃｓ５５、ｃｓ５６、ｃｓ５７；９９．５％、ｃｓ５４；９８．３％、ｃｓ５２；９７．４％、ｃｓ５１；９７．３％、ｃｓ５０）。あるいは、マトリックスを１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３．７）で洗浄し、そのあと０．１Ｍリン酸で洗浄して、固定化Ｉｇ結合タンパク質に結合したｈＩｇＧを溶出させた。９８％を超える抗体が、ｃｓ６０（二量体）を固定化したマトリックスから溶出した。

実施例７．エポキシ活性化マトリックスに結合させたＩｇ結合タンパク質のアルカリ安定性
カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨと室温（２２℃＋／－３℃）で、０時間及び２４時間インキュベートした。０．５Ｍ ＮａＯＨとのインキュベーションの前後で、固定化されたタンパク質のＩｇ結合活性を分析した。結果を図４に示す。さらに、いくつかのＩｇ結合タンパク質について、苛性安定性を０．５Ｍ ＮａＯＨで４８時間後に分析した。強アルカリ性溶液中で２日間インキュベートした後さえも、残存する結合能はｃｓ５０で７９％、ｃｓ５２で７５．２％、ｃｓ５６で６１．４％であった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅと比較して、結合能は少なくとも３８．９％（ｃｓ５６）、７０．１％（ｃｓ５２）、７８．７％（ｃｓ５０）向上した。

２０ｍｇ／ｍｌのｃｓ５９（二量体）又はｃｓ６０（二量体）を固定化したＰｒａｅｓｔｏ ８５エポキシ樹脂を、０．５Ｍ ＮａＯＨで室温（２２℃±３℃）にて２４時間及び５０時間インキュベートした。強アルカリ溶液中で２日を超えた後でさえも、ｃｓ５９（二量体）及びｃｓ６０（二量体）は、Ｉｇに対する結合能がそれぞれ９５．３％及び９８．６％残っていること示した。５０時間のアルカリ処理後のｃｓ５９及びｃｓ６０の残存ＩｇＧ結合能は、配列番号１９の苛性安定タンパク質に比べて向上している（Ｉｇに対する結合能が８８％残っている）。

Claims (12)

1. １つ又は複数のＩｇ結合ドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質であって、少なくとも１つの前記Ｉｇ結合ドメインが、配列番号１、２、３、４、若しくは５のアミノ酸配列、又は配列番号１、２、３、４、若しくは５と少なくとも９７％の同一性をもつアミノ酸配列を含む、又はそれからなり、前記Ｉｇ結合タンパク質が、０．５Ｍ ＮａＯＨのアルカリ性条件下で少なくとも２４時間安定であることを特徴とする、Ｉｇ結合タンパク質。
2. 互いに連結している２、３、４、５、６、７、又は８つの前記Ｉｇ結合ドメインを含む、請求項１に記載のＩｇ結合タンパク質。
3. ホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項２に記載のＩｇ結合タンパク質。
4. 前記Ｉｇ結合ドメインが、直接又は１つ若しくは複数のリンカーで、互いに連結している、請求項３に記載のＩｇ結合タンパク質。
5. ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ断片、Ｆｃ断片、又はＦａｂ断片に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
6. 固体支持体に固定化された、請求項１～５のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質。
7. アフィニティー分離マトリックスに結合する請求項１～６のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質を含む、アフィニティー分離マトリックス。
8. 前記Ｉｇ結合タンパク質に親和性をもつ任意のタンパク質のアフィニティー精製のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質又は請求項７に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
9. Ｉｇ配列を含むタンパク質のアフィニティー精製の方法であって、前記方法が、
   （ａ）Ｉｇ配列を含むタンパク質を含有する液体を用意すること、
   （ｂ）請求項７に記載のアフィニティー分離マトリックスを用意すること、
   （ｃ）前記Ｉｇ配列を含むタンパク質への、請求項１～６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＩｇ結合タンパク質の結合を可能にする条件下で、前記アフィニティー分離マトリックスを前記液体と接触させること、及び
   （ｄ）前記Ｉｇ配列を含むタンパク質を、前記アフィニティー分離マトリックスから溶出すること
   を含む方法。
10. ステップ（ｄ）において、前記Ｉｇ配列を含むタンパク質の９０％超が、請求項１～６のいずれか一項に記載のＩｇ結合タンパク質から溶出される、請求項９に記載の方法。
11. （ｅ）前記アフィニティー分離マトリックスをアルカリ洗浄液で洗浄する追加ステップを含む、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記Ｉｇ結合タンパク質のＩｇ結合能が、アルカリ性条件下でのインキュベーション前のＩｇ結合能の少なくとも７０％である、請求項１１に記載の方法。

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