JP7577149B2

JP7577149B2 - Ｔ細胞受容体

Info

Publication number: JP7577149B2
Application number: JP2023032695A
Authority: JP
Inventors: トリブル，ニコラス; ローレンス，ウィリアム; バッグ，エリノア
Original assignee: アダプティミューン・リミテッド
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2024-11-01
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: BR112018070625A2; US20250084146A1; DK3440106T3; US20230028573A1; RU2018138838A; AU2017248122B2; US11286289B2; ZA202006432B; AU2022256177A1; JP2019513383A; AU2022256177B2; KR102523449B1; CY1124664T1; KR20230044016A; ZA201806866B; LT3440106T; IL262128B1; IL262128A; HRP20211493T1; EP3988565A1

Description

本発明は、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）Ａ４タンパク質（アミノ酸２３０～２３９）由
来のＨＬＡ－Ａ^＊０２０１拘束デカペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを結合するＴ細胞受容
体（ＴＣＲ）に関する。本発明のＴＣＲは、このＭＡＧＥエピトープに対する優れた特異
性プロファイルを示す。

がん・精巣抗原（ＣＴＡ）は、約１４０遺伝子によってコードされる腫瘍関連抗原（Ｔ
ＡＡ）のサブクラスである。これらの抗原の発現は、精巣、胎盤および胎児卵巣などの免
疫特権部位に限定される；それらは、他の組織内では通常は発現されない。これらの遺伝
子の発現は、悪性腫瘍において認められている。ＣＴＡの免疫原性は、多くの固形腫瘍に
おいてこれらの抗原を標的にするがんワクチンの広範な開発を導いてきた。このＴＡＡの
大きなクラスの中で、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）は、がん免疫療法のための有望な候補
として浮かび上がってきている。

３０を超えるがん・精巣（ＣＴ）遺伝子が、染色体Ｘ上の遺伝子クラスター内に編成さ
れている多遺伝子ファミリーのメンバーとして報告されている（ＣＴ－Ｘ抗原）。ＣＴ遺
伝子クラスターは、Ｘｑ２４およびＸｑ２８の間に位置し、ＭＡＧＥおよびＮＹ－ＥＳＯ
－１などの遺伝子ファミリーを含む。Ｉ型ＭＡＧＥ遺伝子クラスターは、最も広範囲に特
徴づけられており、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ－ＢおよびＭＡＧＥ－Ｃファミリーを含む。
ＭＡＧＥ－Ａタンパク質は、異なる１２のＭＡＧＥ－Ａ遺伝子ファミリーメンバー（ＭＡ
ＧＥ－Ａ１からＭＡＧＥ－Ａ１２）によってコードされ、ＭＡＧＥ相同ドメイン（ＭＨＤ
）と呼ばれる、保存された１６５～１７１アミノ酸塩基によって定義される。ＭＨＤは、
すべてのＭＡＧＥ－Ａファミリーメンバーによって共有されたアミノ酸の領域のみに相当
する。

Ｔ細胞は、ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）、または主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）
と呼ばれる、細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識してそれらと相互作用する。ペプ
チドは、より大きな分子に由来し、これは、細胞によってプロセシングされ、ＨＬＡ／Ｍ
ＨＣ分子も示す。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は限定され、ＨＬＡ分子
およびペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を必要とする。特異的なＴ細胞が存在し
ない場合には、そのパートナー複合体が存在するとしてもＴ細胞応答はない。同様に、特
定の複合体がない場合には、応答はないが、Ｔ細胞は存在する。このメカニズムは、感染
に対する免疫系の応答に、自己免疫疾患に、かつ腫瘍などの異常に対する応答に関与して
いる。

いくつかのＭＡＧＥ遺伝子ファミリータンパク質は、生殖細胞およびがんにおいてのみ
発現される（ＭＡＧＥ－ＡからＭＡＧＥ－Ｃファミリー）。他は、正常組織において広範
に発現される（ＭＡＧＥ－ＤからＭＡＧＥ－Ｈ）。これらすべてのＭＡＧＥタンパク質フ
ァミリーは、他のＭＡＧＥタンパク質の配列と近似した相同領域を有し、かつ免疫認識に
おいてＨＬＡ／ペプチド複合体として提示されるペプチドを含む。したがって、所望のＭ
ＡＧＥペプチド／ＨＬＡ－Ａ２抗原に特異性が高いＴＣＲ臨床候補を選択することは重要
である。

ＭＡＧＥＡ４は、ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのＣＴＡメンバーである。それは胚
発生において役割を果たしうると考えられているが、その機能はまだ知られていない。腫
瘍病因論では、それは、腫瘍形質転換または腫瘍進行の局面に関与するようである。ＭＡ
ＧＥＡ４は、精上皮腫、先天性角化不全症、黒色腫、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓がん、
肺がん、大腸がんおよび乳がんを含む、多数の腫瘍に関与するとされている。ペプチドＧ
ＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）は、既知のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質のアミノ酸残基
番号２３０～２３９に相当する。

ＭＡＧＥＢ２は、ＭＡＧＥＢ遺伝子ファミリーのＣＴＡである。ＭＡＧＥＢ２は
、精巣および胎盤、ならびに多様な組織学的な型の腫瘍の顕著な画分において発現される
。ペプチドＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号２）は、ＭＡＧＥＡ４と交差反応性を示し
、それによって、ある種のＴＣＲが、両方のペプチドを提示しているＨＬＡ分子に結合す
ることができるようになる。

本発明者らは、ＭＡＧＥＢ２に優先して、ＭＡＧＥＡ４ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨ
ＴＶを提示しているＨＬＡ分子に結合するＴＣＲを開発した。第１の態様では、本発明は
、可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面
プラズモン共鳴で測定されるときに約０．０５μＭから約２０．０μＭまでの解離定数で
、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合す
る特性を有するＴＣＲであって、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲ
ベータ鎖可変ドメインを含み、ＴＣＲ可変ドメインは、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号
１）の少なくとも残基Ｖ２、Ｙ３およびＤ４との接触を形成する、ＴＣＲを提供する。

実施形態では、本発明によるＴＣＲは、可溶型のＴＣＲを使用して２５℃、ｐＨ７．１
から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約２０μＭから約５０μＭまで
の解離定数で、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号
２）に結合する特性を有し、ここで、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴ
ＣＲベータ鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、解離定数は、５０マイクロＭを
超え、例えば、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭまたはそれ以上などである。

したがって、本発明によるＴＣＲは、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを提示しているＨＬＡに効
率良く結合する能力があるが、ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶを提示しているＨＬＡに効率良く結
合する能力はない。

一部の実施形態では、ＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号３（アルファ鎖）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／またはベータ鎖可変ドメインは、配列番号４（ベータ鎖）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

さらなる態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する特性を有し、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
アルファ鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを提供する。

ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶＨＬＡ－Ａ２複合体は、本発明のＴＣＲが標的としうるがんマ
ーカーを提供する。本発明は、がん細胞に細胞傷害剤または免疫エフェクター剤を送達す
る目的に有用な、かつ／または養子療法における使用に有用な、こうしたＴＣＲを提供す
る。

ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法、およびＴＣＲ配列のＩＭＧＴ公
的データベースへのリンクを使用して記載されている。天然のアルファ－ベータヘテロ二
量体ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖を有する。概して、それぞれの鎖は、可変領域
、連結領域および定常領域を含み、ベータ鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い
多様性領域も含むが、この多様性領域は、連結領域の部分とみなされることが多い。それ
ぞれの可変領域は、フレームワーク配列内に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域
）を含み、１つは、ＣＤＲ３と命名された超可変領域である。それらのフレームワーク、
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によっ
て、区別されるいくつかの型のアルファ鎖可変（Ｖα）領域およびいくつかの型のベータ
鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖα型は、ＩＭＧＴ命名法において固有のＴＲＡＶ番号によ
って称される。したがって、「ＴＲＡＶ２１」は、ＴＣＲからＴＣＲまでで保存されてい
るがＴＣＲからＴＣＲまでで異なるアミノ酸配列も含むアミノ酸配列によって部分的に定
義される固有のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列、ならびにＣＤＲ３配
列を有するＴＣＲＶα領域を定義する。同様の方法で、「ＴＲＢＶ５－１」は、固有の
フレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を有するＴＣＲＶβ領域を定義する
が、部分的にのみ定義されたＣＤＲ３配列を有する。

ＴＣＲの連結領域は、固有のＩＭＧＴＴＲＡＪおよびＴＲＢＪ命名法によって、定常
領域は、ＩＭＧＴＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ命名法によって、同様に定義される。

ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法において略語ＴＲＢＤによって称され、上記の
ように、連鎖状のＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域は、連結領域と一緒とみなされることが多い。

αβＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般に、それぞれ２つの「ドメイン」、すなわち、可
変ドメインおよび定常ドメインを有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域および
連結領域の連鎖からなる。本明細書および特許請求の範囲において、「ＴＣＲアルファ可
変ドメイン」という用語は、したがって、ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪ領域の連鎖を指し、Ｔ
ＣＲアルファ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＡＣ領域、またはＣ末端トランケー
ト型ＴＲＡＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲベータ可変ドメイン」という用語は、ＴＲＢ
ＶおよびＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域の連鎖を指し、ＴＣＲベータ定常ドメインという用語は
、細胞外ＴＲＢＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＢＣ配列を指す。

ＩＭＧＴ命名法によって定義される固有の配列は、ＴＣＲ分野における当業者に広く知
られており、利用可能である。例えば、それらは、ＩＭＧＴ公的データベースにおいて見
出されうる。“ＴｃｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒＦａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）
ＬｅＦｒａｎｃａｎｄＬｅＦｒａｎｃ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ
０－１２－４４１３５２－８も、ＩＭＧＴ命名法によって定義される配列を開示している
が、その公開日および結果として生じる時間のずれのため、その中の情報は、時に、ＩＭ
ＧＴデータベースの参照による確認を必要とする。

本発明による１つのＴＣＲは、配列番号２（ＴＲＡＶ１０＋ＴＲＡＣ）に示されている
ようなアルファ鎖細胞外ドメインおよび配列番号３（ＴＲＢＶ２４－１＋ＴＲＢＣ－２）
に示されているようなベータ鎖細胞外ドメインを含む。「親ＴＣＲ」、「親ＭＡＧＥ－Ａ
４ＴＣＲ」という用語は、本明細書において同義的に使用され、配列番号２および３そ
れぞれの細胞外アルファ鎖およびベータ鎖を含むこのＴＣＲを指す。ペプチド－ＨＬＡ複
合体に対して親ＴＣＲよりも高い親和性および／または遅い解離速度を有する、親ＴＣＲ
に対して相対的に変異または修飾されたＴＣＲを提供することは望ましい。

こうした変異または修飾されたＴＣＲの結合プロファイルが比較されうるものに対する
参照ＴＣＲを提供する目的で、配列番号３に示されている親ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲアル
ファ鎖の細胞外配列および配列番号４に示されている親ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲベータ鎖
の細胞外配列を有する本発明による可溶性ＴＣＲを使用することは都合がいい。そのＴＣ
Ｒは、本明細書において、「参照ＴＣＲ」または「参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲ」と称さ
れる。配列番号５は、配列番号３の親アルファ鎖細胞外配列を含み、またＴ１６２（すな
わち、ＴＲＡＣのＴ４８）からＣ１６２に置換されていることに留意されたい。同様に、
配列番号６は、配列番号４の親ベータ鎖細胞外配列であり、またＳ１６９（すなわち、Ｔ
ＲＢＣ２のＳ５７）からＣ１６９に置換され、Ｃ１８７からＡ１８７に置換され、Ｎ２０
１からＤ２０１に置換されている。親アルファ鎖および親ベータ鎖細胞外配列に対して相
対的なこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性ＴＣＲ、すなわち、
細胞外アルファ鎖およびベータ鎖をリフォールディングすることによって形成されたＴＣ
Ｒを安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。安定なジスルフィドで連結さ
れた可溶性ＴＣＲを参照ＴＣＲとして使用することにより、結合親和性および結合半減期
のさらに好都合な評価が可能となる。本発明のＴＣＲは、上記の変異を含んでいてもよい
。

本発明のＴＣＲは、天然に存在しないものであってもよく、かつ／または精製および／もしくは改変されていてもよい。本発明のＴＣＲは、親ＴＣＲに対して相対的なアルファ鎖可変ドメインおよび／またはベータ鎖可変ドメインに存在する２つ以上の変異を有していてもよい。「改変ＴＣＲ」および「変異体ＴＣＲ」は、本明細書において同義的に使用され、親ＴＣＲに対して相対的に、特に、そのアルファ鎖可変ドメインおよび／またはベータ鎖可変ドメイン内に、導入された１つまたは複数の変異を有するＴＣＲを一般に意味する。これらの変異は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に対する結合親和性を改良しうる。ある特定の実施形態では、アルファ鎖可変ドメイン内に１、２、３、４、５、６、７つまたは８つの変異、例えば、４つまたは８つの変異があり、かつ／またはベータ鎖可変ドメイン内に１、２、３、４つまたは５つの変異、例えば、５つの変異がある。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。

本発明のＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号３に示されている番号付けを参
照して
の変異を有していてもよく、かつ／または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号４に示されている番号付けを参照して
の変異のうちの少なくとも１つを有していてもよい。

本発明のＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号３もしくは５もしくは７～８の
アミノ酸残基１～１０５のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１～２７、３４～４７および５４～９０がそれぞれ配列番号３
もしくは５もしくは７～８のアミノ酸残基１～２７、３４～４７および５４～９０の配列
に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８～３３、４
８～５３および９１～１０５がそれぞれ配列番号３もしくは５もしくは７～８のアミノ酸
残基２８～３３、４８～５３および９１～１０５の配列に対して少なくとも９０％もしく
は９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。

アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２６の配列は、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基１～２６
の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配
列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し
ていてもよく、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８～３３の配列は、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３～４９の配列は、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基３
４～４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（
ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残
基を有していてもよく、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８～５３の配列は、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＲＭＴＦまたはＬ
ＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであってもよく、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５～８９の配列は、配列番号３のアミノ酸残基５４～９０の
配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、またはそれに対して相対的
に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよく、
（ｖｉ）アミノ酸９０～９３の配列は、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦであってもよ
い。

本発明のＴＣＲのベータ鎖可変ドメインは、配列番号４もしくは６もしくは９のアミノ
酸配列
またはそのアミノ酸残基１～４５、５１～６７、７４～１０９がそれぞれ配列番号４も
しくは９のアミノ酸残基１～４５、５１～６７、７４～１０９の配列に対して少なくとも
９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基４６～５０、６８～７３および１０
９～１２３がそれぞれ配列番号４もしくは９のアミノ酸残基４６～５０、６８～７３およ
び１０９～１２３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列
を含んでいてもよい。

ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５の配列は、（ａ）配列番号４の残基１～４５のアミノ
酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配
列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し
ていてもよく、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列は、ＫＧＨＤＲであってもよく、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７の配列は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５
１～６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（
ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残
基を有していてもよく、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３の配列は、ＳＶＦＤＫであってもよく、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４～９０の配列は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５４～
９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）
の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を
有していてもよく、
（ｖｉ）アミノ酸１０９～１２３の配列は、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＮＥＱＦＦまたはＣＡ
ＴＳＧＱＧＡＹＲＥＱＦＦである。

本発明のＴＣＲは、以下のアルファ鎖およびベータ鎖可変ドメインの組合せのうちの１
つを有していてもよい：

本明細書中に開示されている本発明のいずれのＴＣＲの表現型的にサイレントなバリア
ントも本発明の範囲内である。本明細書中で使用される場合、「表現型的にサイレントな
バリアント」という用語は、上記のものに加えて１つまたは複数のさらなるアミノ酸変更
を組み込むＴＣＲであって前記変更を含まない対応するＴＣＲと類似した表現型を有する
ＴＣＲを指すことが理解される。本出願の目的で、ＴＣＲ表現型には、抗原結合特異性（
Ｋ_Ｄおよび／または結合半減期）および抗原特異性が含まれる。表現型的にサイレントな
バリアントは、同一条件下で（例えば、２５℃、同じＳＰＲチップ上で）測定されたとき
に、前記変更を含まない対応するＴＣＲの測定されたＫ_Ｄおよび／または結合半減期の１
０％以内の、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１複合体に対す
るＫ_Ｄおよび／または結合半減期を有していてもよい。好適な条件は、実施例３において
さらに定義されている。抗原特異性は、以下でさらに定義されている。当業者に知られて
いるように、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１複合体との相
互作用のための親和性を変えることなく、上記に詳述されているものと比較して、その定
常ドメインおよび／または可変ドメイン内に変更を組み込むＴＣＲを作製することが可能
でありうる。特に、こうしたサイレントな変異は、抗原結合に直接に関与しないことが知
られている配列の部分内（例えば、ＣＤＲの外側）に組み込まれうる。こうした些細なバ
リアントは、本発明の範囲内に含まれる。１つまたは複数の保存的置換がなされているＴ
ＣＲも、本発明の部分を構成する。

変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいたもの、制限酵素に基づいたクロー
ニング、またはライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）手順を含むが、これらに
限定されない、任意の適切な方法を使用して行われうる。これらの方法は、多くの標準的
な分子生物学教科書の中で詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および制限
酵素に基づいたクローニングに関するさらなる詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕ
ｓｓｅｌｌ，（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ－ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄ．）ＣＳＨＬＰｒｅｓｓを参照されたい。ライ
ゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）手順についてのさらなる情報は、Ｒａｓｈｔ
ｃｈｉａｎ，（１９９５）ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ６（１）：３０
－６において見出されうる。

本発明のＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）
ＨＬＡ－Ａ２複合体を結合する特性を有する。本発明のＴＣＲは、他の、関連性のないエ
ピトープに対して相対的に、そのＭＡＧＥエピトープに対する特異性が高いことが見出さ
れており、したがって、そのエピトープを提示している細胞および組織に治療剤または検
出可能な標識を送達するためのターゲティングベクターとして特に好適である。本発明の
ＴＣＲの文脈における特異性は、ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶについて陰性であるＨＬ
Ａ－Ａ^＊０２０１標的細胞、またはＭＡＧＥＢ２ペプチドＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶを提示
するＨＬＡ細胞を認識するきわめて低い能力を有するのに対して、該ペプチドＧＶＹＤＧ
ＲＥＨＴＶについて陽性であるＨＬＡ－Ａ^＊０２０１標的細胞を認識する本発明のＴＣＲ
の能力に関する。特異性を試験するために、ＴＣＲは、可溶型であってもよく、かつ／ま
たはＴ細胞の表面上で発現されてもよい。認識は、ＴＣＲおよび標的細胞の存在下におけ
るＴ細胞活性化のレベルを測定することによって決定されうる。この場合には、ペプチド
陰性またはＭＡＧＥＢ２標的細胞の最低限の認識は、同じ条件下で測定されたときに、
ペプチド陽性標的細胞の存在下で産生されるレベルの１０％未満、好ましくは、５％未満
、より好ましくは、１％未満のＴ細胞活性化のレベルとして定義される。本発明の可溶性
ＴＣＲについて、特異性は、治療的に関連するＴＣＲ濃度で決定されうる。治療的に関連
する濃度は、１０^－９Ｍ以下のＴＣＲ濃度として、かつ／または対応するＥＣ_５０値より
も最高１００倍、好ましくは、最高１０００倍高い濃度として定義されうる。ペプチド陽
性細胞は、ペプチドをパルスすることによって得られてもよく、または、より好ましくは
、それらは天然に存在する前記ペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチド陽性細胞
およびペプチド陰性細胞の両方がヒト細胞である。

本発明のある特定のＴＣＲは、養子療法における使用にきわめて好適であることが見出
されている。こうしたＴＣＲは、２００μＭ未満、例えば、約０．０５μＭから約２０μ
Ｍまたは約１００μＭまでの、複合体に対するＫ_Ｄを有していてもよく、かつ／または約
０．５秒から約１２分までの範囲内の、複合体に対する結合半減期（Ｔ_１／２）を有して
いてもよい。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲは、約０．０５μＭから約２０μＭ、
約０．１μＭから約５μＭまたは約０．１μＭから約２μＭまでの、複合体に対するＫ_Ｄ
を有しうる。理論に拘束されることを望むものではないが、養子細胞療法における治療的
使用を伴うＴＣＲに対する親和性の最適枠があるようである。腫瘍抗原からエピトープを
認識する天然に存在するＴＣＲは、一般に、親和性が低すぎ（２０マイクロＭから５０マ
イクロＭ）、（ナノモル範囲内またはそれより高い）きわめて高い親和性のＴＣＲは、交
差反応性の問題を持つ（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１８０６１１６－６１３１；Ｚｈａｏｅｔａｌ（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１７９５８４５－５８５４；Ｓｃｍｉｄｅｔａｌ（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
１８４４９３６－４９４６）。

本発明のＴＣＲは、αβヘテロ二量体であってもよくまたは単鎖形式であってもよい。
単鎖形式には、Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－ＶβまたはＶα－Ｌ
－Ｖβ－Ｃβ型のαβＴＣＲポリペプチドが含まれ、ＶαおよびＶβはそれぞれＴＣＲα
可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβはそれぞれＴＣＲα定常領域お
よびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。治療剤を抗原提示細胞に送達す
るためのターゲティング剤としての使用のために、ＴＣＲは、可溶型（すなわち、膜貫通
ドメインまたは細胞質ドメインを有していない）であってもよい。安定性のために、可溶
性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、ＷＯ０３／０２０７６３に、記載されているよう
に、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有することが好ま
しい。本発明のαβヘテロ二量体内に存在する定常ドメインのうちの１つまたは両方は、
例えば、多くとも１５個、または多くとも１０個もしくは多くとも８個の、またはそれよ
り少ないアミノ酸だけ、Ｃ末端でトランケートされていてもよい。養子療法における使用
のために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの
両方を有する完全長の鎖としてトランスフェクトされてもよい。養子療法における使用の
ためのＴＣＲは、自然界においてそれぞれのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメイン
との間に見出されるものと一致しているジスルフィド結合を含んでいてもよく、付加的に
または代替的に、天然でないジスルフィド結合が存在していてもよい。

当業者には明らかであろうように、ＴＣＲの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく
、所与の配列をそのＣ末端および／またはＮ末端で、１、２、３、４、５つまたはそれ以
上の残基だけ、トランケートすることも可能でありうる。すべてのこうした些細なバリア
ントは、本発明によって包含される。

本発明のアルファ－ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、通常、アルファ鎖ＴＲＡＣ定常ドメ
イン配列およびベータ鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含む。アルファ
鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１ま
たはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然のジスルフィド結合を欠失させるた
めのトランケーションまたは置換によって修飾されていてもよい。アルファ鎖およびベー
タ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳ
ｅｒ５７についてのシステイン残基の置換によっても修飾されていてもよく、前記システ
インは、ＴＣＲのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間でジスルフィド結合
を形成する。

本発明のいくつかのＴＣＲは、参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲのものよりも実質的に高い
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対する結合親和性、および／または結合半
減期を有する。天然のＴＣＲの結合親和性を高めると、そのペプチド－ＭＨＣリガンドに
対するＴＣＲの特異性が低下されることが多く、これは、ＺｈａｏＹａｎｇｂｉｎｇ
ｅｔａｌ．，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＡｍｅ
ｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，ＵＳ，ｖｏ
ｌ．１７９，Ｎｏ９，１Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００７，５８４５－５８５４において
実証されている。しかし、親ＴＣＲに由来する本発明のＴＣＲは、親ＴＣＲよりも実質的
に高い結合親和性を有しているにもかかわらず、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ－ＨＬＡ－Ａ２複
合体に対する特異的を維持している。さらに、それらは、ＭＡＧＥ－Ｂ２を超えＭＡＧＥ
－Ａ４について親ＴＣＲよりも顕著に（例えば、少なくとも１０倍）選択的である。

結合親和性（平衡定数Ｋ_Ｄに反比例する）および結合半減期（Ｔ_１／２と表される）は
、本明細書中の実施例３の表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）法を使用して決定され
うる。測定は、可溶型のＴＣＲを使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で行われう
る。ＴＣＲの親和性が２倍になると、結果としてＫ_Ｄは半分になることは理解されよう。
Ｔ_１／２は、解離速度（ｋ_ｏｆｆ）によって除算されたｌｎ２として算出される。したが
って、Ｔ_１／２が２倍になると、結果としてｋ_ｏｆｆは半分になる。ＴＣＲについてのＫ
_Ｄおよびｋ_ｏｆｆ値は、通常、可溶型、すなわち、トランケートされて疎水性膜貫通ドメ
イン残基が除去された形態のＴＣＲについて測定される。したがって、所与のＴＣＲは、
そのＴＣＲの可溶型がその必要条件を満たす場合には、それが、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ－
ＨＬＡ－Ａ２複合体に対する結合親和性、および／または結合半減期を有するという必要
条件を満たすことが理解されるべきである。好ましくは、所与のＴＣＲの結合親和性また
は結合半減期は、同じアッセイプロトコールを使用して、数回、例えば、３回以上測定さ
れ、結果の平均がとられる。参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲは、その方法によって測定され
た場合に約６５μＭのＫ_Ｄを有し、そのｋ_ｏｆｆは約０．７３／秒である（すなわち、Ｔ
_１／２は約０．９５秒である）。

さらなる態様では、本発明は、本発明のＴＣＲをコードする核酸を提供する。一部の実
施形態では、核酸は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＴＣＲ
のα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発
明は、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸
は、天然に存在しないものであってもよく、かつ／または精製および／もしくは改変され
ていてもよい。

別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベク
ターは、ＴＣＲ発現ベクターである。

本発明は、本発明のベクター、好ましくは、ＴＣＲ発現ベクターを宿している細胞も提
供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム、または２つの異なるオープ
ンリーディングフレームにおいて、アルファ鎖およびベータ鎖をそれぞれコードする本発
明の核酸を含んでいてもよい。別の態様は、本発明のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核
酸を含む第１の発現ベクター、および本発明のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む
第２の発現ベクターを宿している細胞を提供する。こうした細胞は、養子療法において特
に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよく、かつ／または組換え体および／
または天然に存在しないものであってもよく、かつ／または改変されていてもよい。

本発明のＴＣＲは、養子療法における有用性を有するので、本発明には、本発明のＴＣ
Ｒを提示している、天然に存在しないかつ／または精製および／もしくは改変された細胞
、特に、Ｔ細胞が含まれる。本発明は、本発明のＴＣＲを提示しているＴ細胞の増殖した
集団も提供する。本発明のＴＣＲをコードする核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡなど
）でのＴ細胞のトランスフェクションに好適ないくつかの方法がある（例えば、Ｒｏｂｂ
ｉｎｓｅｔａｌ．，（２００８）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６－６１３１
を参照されたい）。本発明のＴＣＲを発現しているＴ細胞は、養子療法に基づいたがんの
治療における使用に好適となる。当業者には知られているであろうように、養子療法が行
われうるいくつかの好適な方法がある（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，（
２００８）ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ８（４）：２９９－３０８を参照されたい）
。

本発明の可溶性ＴＣＲは、抗原提示細胞および抗原提示細胞を含む組織に対する検出可
能な標識または治療剤を送達するのに有用である。したがって、（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ
－ＨＬＡ－Ａ２複合体を提示している細胞の存在を検出するためにＴＣＲが使用される、
診断目的のための）検出可能な標識；治療剤；または（例えば、ペグ化による）ＰＫ修飾
部分と（共有結合または他の方法で）結合されていてもよい。

診断目的のための検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射標識、酵素、核酸
プローブおよびコントラスト試薬が含まれる。

本発明のＴＣＲと結合されうる治療剤としては、免疫調節物質、放射性化合物、酵素（
例えばパーフォリン）または化学療法剤（例えばシスプラチン）が含まれる。毒性作用が
望ましい部位において果たされることを確実にするために、毒素は、化合物がゆっくりと
放出されるように、ＴＣＲに連結されたリポソームの中にあってもよい。これは、体内で
の輸送中の損傷作用を防止することになり、関連する抗原提示細胞に対するＴＣＲの結合
後に毒素が最も高い効果を有することを確実にする。

他の好適な治療剤としては、
・小分子細胞傷害剤、すなわち、７００ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞
を死滅させる能力を有する化合物。こうした化合物としては、細胞傷害作用を有する能力
のある毒性金属も含まれうる。さらに、これらの小分子細胞傷害剤としては、プロドラッ
グ、すなわち、生理学的な条件下で壊変してまたは変換されて細胞傷害剤を放出する化合
物も含まれることが理解されるべきである。こうした作用剤の例には、シスプラチン、メ
イタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、
ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソル
フィマーソディウムフォトフリンＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒ
ｉｎＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレートグルクロネート（ｔｒｉｍｅ
ｔｒｅａｔｅｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、オーリスタチンＥビンクリスチンおよびド
キソルビシンが含まれる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有するタンパク質
またはその断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮ
アーゼおよびＲＮアーゼ；
・放射性核種、すなわち、α粒子もしくはβ粒子、またはγ線のうちの１つまたは複
数の同時発生的な放出を伴って壊変する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素１３１、レ
ニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、ア
クチニウム２２５ならびにアスタチン２１３；高親和性ＴＣＲ、またはその多量体に対す
るこれらの放射性核種の結合を促進するためにキレート化剤が使用されてもよい；
・免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ
－２およびＩＦＮ－γなどのサイトカイン、
・スーパー抗原およびその変異体；
・ＴＣＲ－ＨＬＡ融合体；
・ケモカイン、例えば、ＩＬ－８、血小板第４因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など
；
・抗Ｔ細胞または抗ＮＫ細胞決定因子抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗
ＣＤ１６）を含む、抗体またはその断片；
・抗体様結合特性を有する代替のタンパク質足場
・補体活性化因子；
・異種のタンパク質ドメイン、同種異系のタンパク質ドメイン、ウイルス／細菌のタ
ンパク質ドメイン、ウイルス／細菌のペプチド
が含まれる。

好ましい一実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能的な断片もしく
はバリアントと（通常、アルファ鎖またはベータ鎖のＮ末端またはＣ末端への融合によっ
て）結合された本発明のＴＣＲによって提供される。本明細書に記載の組成物および方法
における使用に好適である抗体断片およびバリアント／アナログとしては、ミニボディ、
Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ
（商標）（Ａｂｌｙｎｘ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって市販されている、これらのコンスト
ラクトは、ラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）抗体に由来する合成単一免疫グロ
ブリン可変重鎖ドメインを含む）ならびにドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ（Ｂｅｌｇｉ
ｕｍ）、親和性が成熟した単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン
可変軽鎖ドメインを含む）または抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、ほんの少
し例を挙げれば、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（Ｓｗｅｄｅｎ）、改変され
たプロテインＡ足場を含む）またはＡｎｔｉｃａｌｉｎｓ（Ｐｉｅｒｉｓ（Ｇｅｒｍａｎ
）、改変されたアンチカリンを含む）などが含まれる。

いくつかの目的のために、本発明のＴＣＲは、数種類のＴＣＲを含む複合体に凝集され
て多価ＴＣＲ複合体を形成していてもよい。多価ＴＣＲ複合体の生成において使用されう
る、多量体化ドメインを含むいくつかのヒトタンパク質がある。例えば、ｐ５３の四量体
化ドメイン、これは、単量体ｓｃＦｖ断片と比較して、血清残留性の上昇および解離速度
の顕著な低下を示す、ｓｃＦｖ抗体断片の四量体を生成するために利用されてきた（Ｗｉ
ｌｌｕｄａｅｔａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１７）１４３
８５－１４３９２）。ヘモグロビンも、この種類の適用に潜在的に使用されうる四量体化
ドメインを有する。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、多量体でない野生型または本発明のＴ
細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶＨＬＡ－Ａ２複合体に対す
る増強された結合能力を有しうる。したがって、本発明のＴＣＲの多価複合体も本発明の
範囲内に含まれる。本発明によるこうした多価ＴＣＲ複合体は、ｉｎｖｉｔｒｏまたは
ｉｎｖｉｖｏで特定の抗原を提示している細胞をトラッキングまたはターゲティングす
るのに特に有用であり、こうした使用を有するさらなる多価ＴＣＲ複合体の生成のための
中間体としても有用である。

当技術分野においてよく知られているように、ＴＣＲには、翻訳後修飾が行われうる。
グリコシル化は、１つのこうした修飾であり、これは、ＴＣＲ鎖における定められたアミ
ノ酸に対するオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基、または
セリン／スレオニン残基は、よく知られているオリゴ糖付加のための部位である。特定の
タンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質高次構造および特定の酵
素の有用性を含む、いくつかの要因に依存する。さらに、グリコシル化状態（すなわち、
オリゴ糖型、共有結合および付加の総数）は、タンパク質機能に影響しうる。したがって
、組換えタンパク質を製造するとき、グリコシル化を制御するのが望ましいことが多い。
制御されたグリコシル化は、抗体に基づいた療法を改良するために使用されてきた。（Ｊ
ｅｆｆｅｒｉｓＲ．，ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．２００９Ｍａｒ；
８（３）：２２６－３４．）。本発明の可溶性ＴＣＲに対して、グリコシル化は、ｉｎ
ｖｉｖｏで、例えば、特定の細胞株を使用することによって、またはｉｎｖｉｔｒｏで
、化学修飾によって、制御されてもよい。グリコシル化は、薬物動態を改良すること、免
疫原性を低下させること、および天然のヒトタンパク質をより密接に模倣することができ
るので、こうした修飾は望ましい（ＳｉｎｃｌａｉｒＡＭａｎｄＥｌｌｉｏｔｔ
Ｓ．，ＰｈａｒｍＳｃｉ．２００５Ａｕｇ；９４（８）：１６２６－３５）。

患者への投与のために、（通常、検出可能な標識または治療剤と結合された）本発明の
ＴＣＲ、核酸および／または細胞は、薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に医薬
組成物中で提供されてもよい。本発明による治療用またはイメージング用ＴＣＲは、通常
、薬学的に許容される担体を通常は含むであろう無菌の医薬組成物の部分として供給され
ることになる。この医薬組成物は、（患者にそれを投与する望ましい方法に依存して）い
かなる好適な形態であってもよい。それは、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封
された容器内で提供されることになり、キットの部分として提供されてもよい。こうした
キットには、通常は（必ずではないが）、使用のための説明書が含まれるはずである。そ
れは、複数の前記単位剤形を含んでいてもよい。

医薬組成物は、任意の適切な経路、好ましくは、非経口（皮下、筋肉内、または好まし
くは静脈内を含む）経路による投与用に構成されていてもよい。こうした組成物は、製薬
の分野において知られている任意の方法によって、例えば、無菌条件下で活性成分を担体
または添加剤と混合することによって調製されうる。

本発明の物質の用量は、治療される疾患または障害、治療される個体の年齢および状態
などによって広い範囲の間で変化しえ、医師が、使用される適切な用量を最終的に決定す
ることになる。

本発明のＴＣＲ、医薬組成物、ベクター、核酸および細胞は、実質的に純粋な形態で、
例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、
少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくと
も９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％純粋
で、提供されてもよい。

本発明によってさらに提供されるのは、以下である：
・医学における使用のための、好ましくは、がん、例えば、固形腫瘍（例えば、肺、
肝臓および胃の転移巣）および／または扁平上皮癌などを治療する方法における使用のた
めの、本発明のＴＣＲ、核酸または細胞。
・がんを治療するための医薬品の製造における本発明のＴＣＲ、核酸または細胞の使
用。
・患者に本発明のＴＣＲ、核酸または細胞を投与することを含む、患者においてがん
を治療する方法。

本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれに
ついてのものと同様である。本明細書において言及されている従来技術文献は、法律によ
って許可される最大限の範囲まで組み込まれている。

本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。

添付の配列が参照され、そこでは、
配列番号１は、ＭＡＧＥＡ４ペプチドであり
配列番号２は、ＭＡＧＥＢ２ペプチドである

配列番号３は、親ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲのアルファ鎖の細胞外部分のアミノ酸配
列であり、かつ配列番号４は、親ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＴＣＲベータ鎖アミノ酸配列のベ
ータ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。

配列番号５は、（本明細書において「参照ＴＣＲ」と称される）天然のＬｅｎｔｉＴ
ＣＲのアルファ鎖のアミノ酸配列を示す。配列は、Ｔ１６２（すなわち、ＴＲＡＣ定常領
域のＴ４８）にシステインが置換されることを除いて親ＴＣＲのものと同じである。配列
番号６は、（本明細書において「参照ＴＣＲ」と称される）天然のＬｅｎｔｉＴＣＲの
ベータ鎖である。配列は、システインがＳ１６９（すなわち、ＴＲＢＣ２定常領域のＳ５
７）に置換され、Ａ１８７がＣ１８７に置換され、Ｄ２０１がＮ２０１に置換されること
を除いて親ＴＣＲのものと同じである。

配列番号７および８は、本発明のＴＣＲ内に存在しうるアルファ鎖の配列を示す。ＣＤ
Ｒ領域を形成している部分配列、またはＣＤＲ領域の実質的な部分は、下線付きである。

配列番号９は、本発明のＴＣＲ内に存在しうるベータ鎖の配列を示す。ＣＤＲ領域を形
成している部分配列、またはＣＤＲ領域の実質的な部分は下線付きである。

配列番号１０から１５は、ＴＣＲＡ、ＢおよびＣの可溶性のアルファ鎖およびベータ
鎖の配列を示す。これらのＴＣＲのいずれも、本発明による機能的ＴＣＲに発展させるこ
とはできなかった。

［実施例１］
ｐＧＭＴ７に基づく発現プラスミド内への参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲアルファ鎖および
ベータ鎖可変領域配列のクローニング
それぞれ配列番号３および４の親ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲ可変アルファドメインおよび
ＴＣＲ可変ベータドメインは、ＣαまたはＣβのいずれかを含むｐＧＭＴ７に基づく発現
プラスミド内に、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣｌｏｎｉｎｇａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＴｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏ
ｎ）に記載されている標準的な方法によってクローニングされた。プラスミドは、Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３０ｘｌＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒを使用して
シークエンスされた。それぞれ配列番号４および５の参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲ可変ア
ルファドメインおよびＴＣＲ可変ベータドメインは、同様の方法でクローニングされた。

ＴＣＲアルファ鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、制限酵素で切断された、ｐＥＸ
９５６内にライゲーションされた。ＴＣＲベータ鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、
同じく制限酵素で切断された、ｐＥＸｂ２１内にライゲーションされた。

ライゲーションされたプラスミドは、コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１
－ｂｌｕｅ細胞内に形質転換され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ／寒天プ
レート上に播種された。３７℃で一晩インキュベーション後、単一コロニーが採取され、
１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ中で３７℃で振盪しながら一晩培養
された。クローニングされたプラスミドは、Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を
使用して精製され、プラスミドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３０ｘ
ｌＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒを使用してシークエンスされた。

［実施例２］
可溶性参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲの発現、リフォールディングおよび精製
実施例１において調製されるような、参照ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プ
ラスミドが大腸菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐
性コロニーがＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）培地中で３７℃で約０．６～０．
８のＯＤ_６００まで培養された後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現が誘発され
た。細胞は、導入３時間後に、ＢｅｃｋｍａｎＪ－６Ｂ内で４０００ｒｐｍで３０分間
の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、ＭｇＣｌ_２およびＤＮアーゼＩの存在
下で２５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ＮｏｖａＧｅｎ）で溶解された。封入体ペレット
は、ＢｅｃｋｍａｎＪ２－２１遠心分離機内で１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離
によって回収された。次いで、３回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜
成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Ｔｒｉｔｏｎバッファー（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ－ＨＣＩｐＨ８．０、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、２００ｍＭＮａＣｌ
、１０ｍＭＮａＥＤＴＡ）中でホモジナイズされた後に、ＢｅｃｋｍａｎＪ２－２１
内で１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下の
バッファー：５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＮａＥＤＴＡ中での同
様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、３０ｍｇの一
定分量に小分けされて－７０℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、６Ｍのグアニ
ジン－ＨＣｌで可溶化することによって定量化され、ＯＤ測定は、日立Ｕ－２００１分光
光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。

約１５ｍｇのＴＣＲα鎖および１５ｍｇのＴＣＲβ鎖の可溶化封入体が凍結ストックか
ら解凍され、確実に完全に鎖変性するように、１０ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ塩酸グ
アニジン、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．１、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ）中に希釈された。完全に還元および変性されたＴＣＲ鎖
を含むグアニジン溶液は、次いで、０．５リットルの以下のリフォールディングバッファ
ー：１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１、４００ｍＭＬ－アルギニン、２ｍＭＥＤＴ
Ａ、５Ｍ尿素中に注入された。酸化還元対（塩酸システアミンおよび二塩酸シスタミン
）がそれぞれ６．６ｍＭおよび３．７ｍＭの最終濃度まで添加され、約５分後に、変性さ
れたＴＣＲ鎖が添加された。溶液は、約３０分間放置された。リフォールディングされた
ＴＣＲは、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ１メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；製品番号１３２６７
０）において１０ＬのＨ_２Ｏに対して１８～２０時間透析された。この時間の後に、透析
バッファーは、新しい１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１（１０Ｌ）に２回交換され、透析
は、５℃±３℃でさらに約８時間継続された。

可溶性ＴＣＲは、透析されたリフォールディング物をＰＯＲＯＳ５０ＨＱ陰イオン交
換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をＡｋｔａ精製装置（Ｇ
ＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５０カラム容量を超える１０ｍＭのＴｒｉｓｐ
Ｈ８．１中の０～５００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出することによって分解産物および夾
雑物から分離された。ピーク画分がプールされ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された。プールされた画分は、次いで、４℃で保存され、クマシ
ーで染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終
的に、可溶性ＴＣＲは、ＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で予め平衡化されたＧＥＨ
ｅａｌｔｈｃａｒｅＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲゲル濾過カラムを使用して精製および
特性評価された。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、ＢＩＡ
ｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。

［実施例３］
結合特性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ解析
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標））は、可溶性
ＴＣＲの、そのペプチド－ＭＨＣリガンドに対する結合を解析するために使用されうる。
これは、ストレプトアビジンでコーティングされた結合表面（センサーチップ）に固定さ
れうる可溶性ビオチン化ペプチド－ＨＬＡ（「ｐＨＬＡ」）複合体を作製することによっ
て容易になる。センサーチップは、異なる４種のｐＨＬＡ複合体に対するＴ細胞受容体の
結合を同時に測定することを可能にする４つの個別のフローセルを含む。ｐＨＬＡ複合体
の手動注入により、固定されたクラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することが可能
となる。

ビオチン化されたクラスＩのＨＬＡ－Ａ^＊０２０１分子は、構成サブユニットタンパク
質および合成ペプチドを含む、細菌で発現された封入体からｉｎｖｉｔｒｏでリフォー
ルディングされ、その後、精製されて、ｉｎｖｉｔｒｏで酵素によりビオチン化された
（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎｅｔａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６
６：９－１５）。ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１重鎖は、適切なコンストラクトにおいてタンパク
質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを置き換えるＣ末端ビオチン化タグ付きで発現
された。１リットルの細菌培養液あたり約７５ｍｇの封入体発現レベルが得られた。ＭＨ
Ｃ軽鎖またはβ２－ミクログロブリンも、適切なコンストラクトから大腸菌における封入
体として、１リットルの細菌培養液あたり約５００ｍｇのレベルで発現された。

大腸菌細胞は溶解され、封入体は約８０％の純度まで精製された。封入体からのタンパ
ク質は、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１、１００ｍＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＥＤＴＡ中で変性され、０．４ＭＬ－アルギニ
ン、１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１、３．７ｍＭ二塩酸シスタミン、６．６ｍＭ
塩酸システアミン、ＨＬＡ－Ａ^＊０２分子によるロードが必要とされる４ｍｇ／ＬのＭＡ
ＧＥ－Ａ４ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶまたはＭＡＧＥ－Ｂ２ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶペプチ
ド中に３０ｍｇ／リットル重鎖、３０ｍｇ／リットル β２ｍの濃度で、変性タンパク
質の単一パルスを＜５℃のリフォールディングバッファー中に添加することによってリフ
ォールディングされた。リフォールディングは、４℃で少なくとも１時間で完了に到達す
ることが可能にされた。

バッファーは、１０容量の１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．１中での透析によって交換さ
れた。バッファーの２回の交換は、溶液のイオン強度を十分に低下させるために必要とさ
れた。次いで、タンパク質溶液は、１．５μｍのセルロースアセテートフィルターを通し
て濾過され、ＰＯＲＯＳ５０ＨＱ陰イオン交換カラム（８ｍｌのベッド容量）上にロー
ドされた。タンパク質は、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して
１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．１中の直線的な０～５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出され
た。ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１－ペプチド複合体は、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出され、ピ
ーク画分が収集されて、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加
され、それらの画分が氷上で冷却された。

ビオチンタグ付きｐＨＬＡ分子は、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１、５ｍＭＮａＣ
ｌ中で平衡化されたＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅの高速脱塩カラムを使用して、同バッフ
ァー中にバッファー交換された。溶出されるとすぐに、タンパク質含有分画は氷上で冷却
され、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された。次いで、ビ
オチン化試薬：１ｍＭビオチン、５ｍＭＡＴＰ（ｐＨ８に緩衝された）、７．５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、および５μｇ／ｍｌＢｉｒＡ酵素（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎｅｔａ
ｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：９－１５に従って精製された）が
添加された。次いで、この混合物は、室温で一晩インキュベート可能にされた。

ビオチン化されたｐＨＬＡ－Ａ^＊０２０１分子は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用
して精製された。ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３
０カラムは、濾過されたＰＢＳで予め平衡化されて１ｍｌのビオチン化反応混合物がロー
ドされ、そのカラムは、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰ
ＢＳを用いて０．５ｍｌ／分で展開された。ビオチン化されたｐＨＬＡ－Ａ^＊０２０１分
子は、約１５ｍｌで単一のピークとして溶出された。タンパク質を含む画分は、プールさ
れて、氷上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加された。タンパク質濃度は、
クマシー結合アッセイ（ＰｅｒＢｉｏ）を使用して決定され、ビオチン化されたｐＨＬＡ
－Ａ^＊０１分子の一定分量は、－２０℃で凍結保存された。

こうした固定された複合体は、Ｔ細胞受容体および補助受容体ＣＤ８ααの両方を結合
することができ、その両方が可溶相に注入されうる。可溶性ＴＣＲのｐＨＬＡ結合特性は
、ＴＣＲが可溶相または固定相のいずれかにおいて使用される場合、質的にも量的にも類
似していることが認められる。これは、可溶種の部分活性についての重要な対照であり、
ビオチン化ｐＨＬＡ複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同じくらい活性であること
も示唆する。

ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーは、
小さなフローセル内のセンサー表面付近のレスポンスユニット（ＲＵ）で表される屈折率
における変化を測定し、受容体リガンド相互作用を検出するためおよびそれらの親和性お
よび動態パラメーターを解析するために使用されうる原理である。ＢＩＡｃｏｒｅ実験は
、２５℃の温度で、ランニングバッファーとしてＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ、ｐＨ７
．１～７．５）を使用し、タンパク質試料の希釈物を調製して行われた。ストレプトアビ
ジンは、標準的なアミンカップリング法によってフローセルに固定された。ｐＨＬＡ複合
体は、ビオチンタグを介して固定された。次いで、異なるフローセルの表面上を一定流速
で通過する可溶性ＴＣＲによってアッセイが行われ、その際のＳＰＲレスポンスが測定さ
れた。

平衡結合定数
平衡結合定数を決定するために、上記のＢＩＡｃｏｒｅ解析法が使用された。ジスルフ
ィドで連結された可溶性ヘテロ二量体形態の参照ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲの段階希釈物が
調製され、１つめは約１０００ＲＵの特異的なＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶＨＬＡ－Ａ^＊０２
０１複合体でコーティングされ、２つめは約１０００ＲＵの非特異的な複合体でコーティ
ングされた、２つの異なるフローセル上に毎分５μｌの一定流速で注入された。レスポン
スは、対照細胞からの測定値を使用して各濃度について標準化された。標準化されたデー
タレスポンスは、ＴＣＲ試料の濃度に対してプロットされ、平衡結合定数Ｋ_Ｄを算出する
ために非線形曲線適合モデルに適合された。（Ｐｒｉｃｅ＆Ｄｗｅｋ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓａｎｄＰｒｏｂｌｅｍｓｉｎＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｆｏ
ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ（２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ）１９７９，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。ジスルフィドで連結された可溶型の参照ＭＡＧＥ－Ａ４
ＴＣＲ（実施例２）は、約２．００μＭのＫ_Ｄを示した。同じＢＩＡｃｏｒｅデータよ
り、Ｔ_１／２は約０．９５秒であった。

動態パラメーター
上記のＢＩＡｃｏｒｅ解析法は、平衡結合定数および解離速度を決定するためにも使用
された。

高親和性ＴＣＲ（下記の実施例４を参照されたい）のために、Ｋ_Ｄは、解離速度定数、
ｋ_ｏｆｆ、および結合速度定数、ｋ_ｏｎを実験的に測定することによって決定された。平
衡定数Ｋ_Ｄは、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出された。

１つめは約１０００ＲＵの特異的なＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶＨＬＡ－Ａ^＊０２０１複合
体でコーティングされ、２つめは約１０００ＲＵの非特異的な複合体でコーティングされ
た２つの異なるセルにＴＣＲが注入された。流速は、５０μｌ／分に設定された。典型的
には、約１μＭの濃度の２５０μｌのＴＣＲが注入された。次いで、レスポンスがベース
ラインに戻るまでまたは＞２時間が経過するまでバッファーが流された。動態パラメータ
ーは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して算出された。解離相は、半減
期の算出を可能にする単一指数関数的減衰方程式に適合された。

［実施例４］
本発明の高親和性ＴＣＲの調製
ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドは、実施例１におけるように調製
された：

プラスミドが大腸菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ内に別々に形質転換され、単一のアンピシリ
ン耐性コロニーがＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）培地中で３７℃で約０．６～
０．８のＯＤ_６００まで培養された後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現が誘発
された。細胞は、導入３時間後に、ＢｅｃｋｍａｎＪ－６Ｂ内で４０００ｒｐｍで３０
分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、ＭｇＣｌ_２およびＤＮアーゼＩの
存在下で２５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解された。封入体ペレ
ットは、ＢｅｃｋｍａｎＪ２－２１遠心分離機内で１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心
分離によって回収された。次いで、３回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよ
び膜成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Ｔｒｉｔｏｎバッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ－ＨＣＩｐＨ８．０、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、２００ｍＭＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭＮａＥＤＴＡ）中でホモジナイズされた後に、ＢｅｃｋｍａｎＪ２－
２１内で１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以
下のバッファー：５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＮａＥＤＴＡ中で
の同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、３０ｍｇ
の一定分量に小分けされて－７０℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、６Ｍのグ
アニジン－ＨＣｌで可溶化することによって定量化され、ＯＤ測定は、日立Ｕ－２００１
分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。

確実に完全に鎖変性するように、本発明の各ＴＣＲのための約１０ｍｇのＴＣＲα鎖お
よび１０ｍｇのＴＣＲβ鎖の可溶化封入体は、１０ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ塩酸グ
アニジン、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．１、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ）中に希釈された。完全に還元および変性されたＴＣＲ鎖
を含むグアニジン溶液は、次いで、０．５リットルの以下のリフォールディングバッファ
ー：１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１、４００ｍＭＬ－アルギニン、２ｍＭＥＤＴ
Ａ、５Ｍ尿素中に注入された。酸化還元対（塩酸システアミンおよび二塩酸シスタミン
）がそれぞれ６．６ｍＭおよび３．７ｍＭの最終濃度まで添加され、約５分後に、変性さ
れたＴＣＲ鎖が添加された。溶液は、約３０分間放置された。リフォールディングされた
ＴＣＲは、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ１メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；製品番号１３２６７
０）において１０ＬのＨ_２Ｏに対して１８～２０時間透析された。この時間の後に、透析
バッファーは、新しい１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．１（１０Ｌ）に２回交換され、透析
は、５℃±３℃でさらに約８時間継続された。

可溶性ＴＣＲは、透析されたリフォールディング物をＰＯＲＯＳ５０ＨＱ陰イオン交
換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をＡｋｔａ精製装置（Ｇ
ＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１５カラム容量を超える１０ｍＭのＴｒｉｓｐ
Ｈ８．１中の０～５００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出することによって分解産物および夾
雑物から分離された。プールされた画分は、次いで、４℃で保存され、クマシーで染色さ
れたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可溶
性ＴＣＲは、ＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で予め平衡化されたＧＥＨｅａｌｔｈ
ｃａｒｅＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価さ
れた。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、ＢＩＡｃｏｒｅ表
面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。

ＭＡＧＥ－Ａ４エピトープまたはＭＡＧＥ－Ｂ２に対するこうして調製されたＴＣＲの
親和性プロファイルは、実施例３の方法を使用して評価され、参照ＴＣＲと比較された。
結果は、以下の表に記載されている：

配列番号１０／１１、１２／１３、１４／１５の組合せに基づいた高親和性ＴＣＲを調
製するために試行も行われた。

配列番号１０のアルファ鎖と配列番号１１のベータ鎖とを合わせ持つ、ＴＣＲＡの場
合には、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０およびＰＲＡＭＥの間で交差反応性が認めら
れた。変異および選択によってこの交差反応性をなくすことは不可能であった。

ＴＣＲＢは、配列番号１２のアルファ鎖と配列番号１３のベータ鎖とを合わせ持つ。
ＴＣＲＢは、可溶性ＴＣＲを形成するようにフォールディングさせることができなかっ
たため、結合特性評価は不可能であった。

ＴＣＲＣは、配列番号１４のアルファ鎖と配列番号１５のベータ鎖とを合わせ持つ。
このＴＣＲは、発現されたときに可溶性であってかつ抗原に結合することができた。しか
し、Ｔ細胞において発現されたときには、ＴＣＲＣは、活性を示さなかった。

［実施例５］
親ＭＡＧＥ－Ａ４ＴＣＲおよびバリアントＭＡＧＥ－Ａ１０ＴＣＲでのＴ細胞のトラ
ンスフェクション
（ａ）Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｎを介した２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションによる
レンチウイルスベクター調製
望ましいＴＣＲをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターをパッケージングす
るために、第３世代レンチウイルスパッケージングシステムが使用された。Ｅｘｐｒｅｓ
ｓ－Ｉｎを介したトランスフェクション（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して
、２９３Ｔ細胞は、４種のプラスミド（実施例５ｃ（以下）に記載のＴＣＲアルファ鎖－
Ｐ２Ａ－ＴＣＲベータ鎖単一ＯＲＦ遺伝子を含む１種のレンチウイルスベクター、および
感染性であるが複製不可能なレンチウイルス粒子を構築するために必要な他の構成要素を
含む３種のプラスミド）でトランスフェクトされた。

トランスフェクションのために、指数関数的な増殖期にある２９３Ｔ細胞の１つのＴ１
５０フラスコが回収され、細胞は、プレート上に均一に分散され、わずかに５０％を超え
るコンフルエントであった。Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｎの一定分量は、室温にされた。３ｍＬ
の無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０ｍＭＨＥＰＥＳ）が無菌の１５ｍｌのコニカル
チューブ内に入れられた。１７４μｌのＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｎ試薬が無血清培地中に直接
に添加された（これは、３．６：１の試薬対ＤＮＡの重量比を実現する）。これは、３～
４回チューブを逆さにすることによって完全に混合されて、室温で５～２０分間インキュ
ベートされた。

別の１．５ｍｌのマイクロチューブ内で、予め混合されたパッケージング混合物一定分
量（１８μｇのｐＲＳＶ．ＲＥＶ（Ｒｅｖ発現プラスミド）、１８μｇのｐＭＤＬｇ／ｐ
．ＲＲＥ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド）、７μｇのｐＶＳＶ－Ｇ（ＶＳＶ糖タンパク
質発現プラスミド）を含む、通常約２２μｌ）に１５μｇのプラスミドＤＮＡが添加され
、ＤＮＡ混合物を確実に均一にさせるために上および下にピペッティングされた。このＤ
ＮＡ混合物に約１ｍＬのＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｎ／無血清培地が滴下で添加され、次いで、
上および下に穏やかにピペッティングされた後に、残りのＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｎ／無血清
培地に移し戻された。チューブは、３～４回逆さにされて、室温で１５～３０分間インキ
ュベートされた。細胞のフラスコから古い培地が除去された。２９３Ｔ細胞の直立型フラ
スコの底にＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｎ／培地／ＤＮＡ（３ｍＬ）複合体が直接に添加された。
ゆっくりと、フラスコは、細胞を覆うように平らに置かれ、確実に分散するようにきわめ
て穏やかに揺動された。１分後、２２ｍｌの新しい培地（Ｒ１０＋ＨＥＰＥＳ：ＲＰＭＩ
１６４０、熱失活された１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グル
タミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ）が添加され、フラスコは、インキュベーターに注意深く
戻された。これは、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートされた。２４時間後、パッ
ケージングされたレンチウイルスベクターを含む培地が回収された。

パッケージングされたレンチウイルスベクターを回収するために、細胞培養液上清は、
０．４５ミクロンのナイロンシリンジフィルターを通して濾過され、培養液は、１０，０
００ｇで１８時間（または１１２，０００ｇで２時間）遠心分離され、（ペレットを乱さ
ないように注意しながら）上清の大部分が除去され、残りの数ｍＬ（チューブあたり３１
ｍｌの開始容量から、通常、約２ｍｌ）の上清中にペレットが再懸濁された。これは、１
ｍｌずつの一定分量でドライアイス上でスナップ凍結され、－８０℃で保存された。

（ｂ）目的の遺伝子を含むパッケージングされたレンチウイルスベクターでのＴ細胞の形
質導入
パッケージングされたレンチウイルスベクターでの形質導入前に、健常な志願者の血液
からヒトＴ細胞（ＣＤ８もしくはＣＤ４または必要条件によっては両方）が単離された。
これらの細胞は、計数され、４８ウェルプレート内で、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＲ
１０中、１ｍｌあたり１×１０^６細胞（０．５ｍＬ／ウェル）で、１細胞あたり３個のビ
ーズの比率で、予め洗浄された抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティング付きマイクロビーズ
（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔｃｅｌｌｅｘｐａｎｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）と共に一晩インキュベートされた。

一晩の刺激後、０．５ｍｌの無希釈のパッケージングされたレンチウイルスベクターが
、望ましい細胞に添加された。これは、３７℃／５％ＣＯ_２で３日間インキュベートされ
た。形質導入３日後、細胞は、計数され、０．５×１０^６細胞／ｍｌまで希釈された。Ｉ
Ｌ－２を含む新しい培地が必要に応じて添加された。ビーズは、形質導入５～７日後に除
去された。２日間隔で、細胞が計数され、ＩＬ－２を含む新しい培地が交換または添加さ
れた。細胞は、０．５×１０^６細胞／ｍＬおよび１×１０^６細胞／ｍＬの間で維持された
。細胞は、３日目からフローサイトメトリーによって解析され、５日目から機能アッセイ
（例えば、ＩＦＮγ放出についてのＥＬＩＳｐｏｔ、実施例６を参照されたい）に使用さ
れた。１０日目から、または細胞が分裂を遅延させ、大きさが減少したときに、細胞は、
保存のために（９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ中に１×１０^７細胞／ｍｌで）少なくとも
４×１０^６細胞／バイアルの一定分量で凍結される。

［実施例６］
ＭＡＧＥＡ４ＴＣＲ改変Ｔ細胞の活性化
腫瘍細胞株に応答した、ＴＣＲ形質導入した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化
を実証するために、以下のアッセイを行った。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定さ
れるような、ＩＦＮ－γ産生を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化についての読み
出しとして使用した。

ＥＬＩＳＰＯＴ
試薬
アッセイ培地：１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２０１１－０９）、８８％Ｒ
ＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１）、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏ
カタログ番号２５０３０）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏカタ
ログ番号１５０７０－０６３）。
洗浄バッファー：０．０１ＭＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０）
関連したＡＥＣ基質セット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５１９５１）
と共に、捕捉抗体および検出抗体ならびにヒトＩＦＮ－γ ＰＶＤＦＥＬＩＳＰＯＴ
９６ウェルプレートを含むヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ；カタログ番号５５１８４９）

方法
標的細胞の調製
この方法において使用される標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞：両方ＨＬＡ－Ａ
２^＋ＭＡＧＥＡ１０^＋であるＡ３７５ヒト黒色腫細胞であった。ＨＬＡ－Ａ２^＋Ｍ
ＡＧＥＡ１０^－である、ＨＣＴ１１６ヒト結腸がんは、陰性対照として使用された。十
分な標的細胞（５０，０００細胞／ウェル）は、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（
Ｈｅｒａｅｕｓ）内で１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離３回によって洗浄された。細胞
は、次いで、アッセイ培地中に１０^６細胞／ｍｌで再懸濁された。

エフェクター細胞調製
この方法において使用されるエフェクター細胞（Ｔ細胞）は、ＣＤ１４およびＣＤ２５
マイクロビーズキット（それぞれＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０
－０５０－２０１および１３０－０９２－９８３）を使用して、健常な志願者の静脈血か
ら新たに単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から負の選択によって得られた、末梢血
リンパ球（ＰＢＬ）であった。細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティング付きビーズ（Ｄ
ｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔｃｅｌｌｅｘｐａｎｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）で刺激され、（実施例５に記載のコンストラクトに基づいた）目的の全αβＴＣＲをコ
ードする遺伝子を運ぶレンチウイルスで形質導入され、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むア
ッセイ培地中で形質導入１０日後および１３日後の間まで増殖した。これらの細胞は、次
いで、アッセイ培地中に入れられた後に、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（Ｈｅｒ
ａｅｕｓ）内で１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離によって洗浄された。細胞は、次いで
、４×最終的に必要とされる濃度でアッセイ培地中に再懸濁された。

プレートは、以下のように調製された：１００μＬの抗ＩＦＮ－γ捕捉抗体は、１プレ
ートあたり１０ｍｌの無菌ＰＢＳ中に希釈された。次いで、各ウェル内に１００μＬの希
釈された捕捉抗体が分注された。プレートは、次いで、４℃で一晩インキュベートされた
。インキュベーション後、プレートは、洗浄（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａ
ｗａｓｈＰｌｕｓ９６ウェルプレート洗浄機；Ｄｙｎｅｘ）されて捕捉抗体が除去さ
れた。プレートは、次いで、各ウェルに２００μＬのアッセイ培地を添加することによっ
てブロッキングされ、室温で２時間インキュベートされた。アッセイ培地は、次いで、プ
レートから洗浄され（プログラム１、プレート型２、ＵｌｔｒａｗａｓｈＰｌｕｓ９
６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、残りのすべての培地は、ＥＬＩＳＰＯＴプレー
トをペーパータオル上で軽く振り払うことおよび軽く叩くことによって除去された。

次いで、以下の順序でアッセイの成分がＥＬＩＳＰＯＴプレートに添加された：
５０μＬの標的細胞１０^６細胞／ｍｌ（合計５０，０００個の標的細胞／ウェルにする
）
５０μＬ培地（アッセイ培地）
５０μＬエフェクター細胞（２０，０００個のＴＣＲ形質導入ＰＢＬ細胞／ウェル）

プレートは、次いで、一晩インキュベートされた（３７℃／５％ＣＯ_２）。翌日、プレ
ートは、洗浄バッファーで３回洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａ
ｓｈＰｌｕｓ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、ペーパータオル上で軽く叩
かれて乾燥されて余分な洗浄バッファーが除去された。１００μｌの一次検出抗体は、次
いで、各ウェルに添加された。一次検出抗体は、製造業者の説明書に明記された希釈を使
用して、１０ｍＬの希釈バッファー（単一のプレートに必要とされる容量）中に希釈され
た。プレートは、次いで、室温で少なくとも２時間インキュベートされた後に洗浄バッフ
ァーで３回洗浄された（プログラム１、プレート型２、ＵｌｔｒａｗａｓｈＰｌｕｓ
９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）；余分な洗浄バッファーは、プレートをペーパ
ータオル上で軽く叩くことによって除去された。

二次検出は、各ウェルに１００μＬの希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰを添加し
てプレートを室温で１時間インキュベートすることによって行われた。ストレプトアビジ
ン－ＨＲＰは、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、１０ｍＬの希釈バッファ
ー（単一のプレートに必要とされる容量）中に希釈された。プレートは、次いで、洗浄バ
ッファーで３回洗浄され（プログラム１、プレート型２、ＵｌｔｒａｗａｓｈＰｌｕｓ
９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分な洗
浄バッファーが除去された。プレートは、次いで、ＰＢＳで各ウェルに２００μＬを添加
することによって２回洗浄され、バッファーが軽く振り出され、ペーパータオル上で軽く
叩かれて余分なバッファーが除去された。使用前１５分以内に、１滴（２０ｕＬ）のＡＥ
Ｃ色素原が各１ｍｌのＡＥＣ基質に添加されて混合された。各プレートについて１０ｍｌ
のこの溶液が調製された；１ウェルあたり１００μＬが添加された。プレートは、次いで
、ホイルを使用して光から保護され、通常、５～２０分以内に生じる、スポット発色が定
期的にモニターされる。プレートは、発色反応を終了させるために水道水中で洗浄され、
それらが３つの成分に分解される前に振盪乾燥された。プレートは、次いで、室温で少な
くとも２時間乾燥可能にされた後に、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（登録商標）プレートリーダ
ー（ＣＴＬ；ＣｅｌｌｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ）を使用してス
ポットが計数された。

［実施例７］
すべての代替アミノ酸での置換による結合モチーフの同定
それぞれの位置のアミノ酸残基が１９種すべての代替の天然に存在するアミノ酸で順次
置き換えられた天然のＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドのバリアントが得られ、それによって、全
部で１７１種のペプチドが調製された。天然のペプチドおよびアミノ酸置換されたペプチ
ドが、抗原提示細胞上にパルスされ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して測定されるよう
な、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生が、ＴＣＲ４で形質導入されたＴ細胞の活性化
についての読み出しとして使用された。不可欠な位置は、天然のペプチドに対して相対的
に５０％を超えるＴ細胞活性における低下によって定義された。

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、実施例６に記載のように行われた。

ペプチドの各位置における許容される残基は、以下に示される。下線付きのアミノ酸は
、ペプチド内の該当位置における天然の残基を表す。

したがって、抗原提示細胞の表面上でＨＬＡ－Ａ^＊０２０１と複合体形成しているときに、ＭＡＧＥＡ４ＴＣＲ４が、ペプチド（配列番号１）の少なくともＶ２Ｙ３およびＤ４と接触することは明らかである。
出願時の特許請求の範囲は以下の通り。

［請求項１］
可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約０．０５μＭから約２０．０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する特性を有し、かつＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＡＹＶＳＶ（配列番号２）に対する結合を超えＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体形成した配列番号１に対する結合について少なくとも１０倍の選択性を有するＴＣＲであって、前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ可変ドメインが、ＧＶＤＧＫＳＤＳＶ（配列番号１）の少なくとも残基Ｖ２、Ｙ３およびＤ４との接触を形成する、前記ＴＣＲ。
［請求項２］
アルファ鎖ＴＲＡＶ１０＋ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＶ２４－１＋ＴＲＢＣ－２定常ドメイン配列を有する、アルファ－ベータヘテロ二量体である、請求項１に記載のＴＣＲ。
［請求項３］
ＶαおよびＶβがそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβがそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌがリンカー配列である、型Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、またはＶα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβの単鎖形式である、請求項１に記載のＴＣＲ。
［請求項４］
検出可能な標識、治療剤またはＰＫ改変部分と結合された、請求項１から３のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項５］
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基１～１０５の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３に示されている番号付けを参照して
の変異を有し、かつ／または前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基１～１０５の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に示されている番号付けを参照して
の変異のうちの少なくとも１つを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項６］
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７～８のアミノ酸残基１～１０５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１～２７、３４～４７および５４～９０がそれぞれ配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７～８のアミノ酸残基１～２７、３４～４７および５４～９０の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８～３４、４８～５３および９１～１０５がそれぞれ配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７～８のアミノ酸残基２８～３３、４８～５３および９１～１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項７］
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基１～１０５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１～２７、３４～４７および５５～８９がそれぞれ配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基１～２７、３４～４７および５５～８９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８～３３、４８～５３および９１～１０５がそれぞれ配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基２８～３３、４８～５３および９１～１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項８］
前記アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２７の配列が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基１～２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８～３３の配列が、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３４～４７の配列が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基３３～４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８～５３の配列が、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＲＭＴＦまたはＬＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４～９０の配列が、配列番号３のアミノ酸残基５５～８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有し、
（ｖｉ）アミノ酸９１～１０５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦである、
請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項９］
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１～４５、５１～６７および７４～１０９がそれぞれ配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸残基１～４５、５１～６７および７４～１０９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基４６～５０、６８～７３および１０９～１２３がそれぞれ配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸残基４６～５０、６８～７３および１０９～１２３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項１０］
前記ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５の配列が、（ａ）配列番号４の残基１～２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列が、ＫＧＨＤＲであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３の配列が、ＳＦＤＶＫであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４～９０の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５４～９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｖｉ）アミノ酸１０９～１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＮＥＱＦＦまたはＣＡＴＳＧＱＧＡＹＲＥＱＦＦである、
請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
［請求項１１］
請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸。
［請求項１２］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲを提示している、単離されたまたは天然に存在しない細胞、特に、Ｔ細胞。
［請求項１３］
（ａ）単一のオープンリーディングフレーム内に、もしくは前記アルファ鎖および前記ベータ鎖をそれぞれコードする２つの異なるオープンリーディングフレーム内に、請求項１３に記載の核酸を含むＴＣＲ発現ベクター、または
（ｂ）請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を宿している細胞。
［請求項１４］
１種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１の核酸、または請求項１２もしくは請求項１３に記載の細胞を含む医薬組成物。
［請求項１５］
薬における使用のための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１３の核酸、または請求項１４もしくは請求項１５の細胞。
［請求項１６］
がんを治療する方法における使用のための、請求項１５に記載の使用のためのＴＣＲ、核酸または細胞。

配列番号１ＭＡＧＥＡ４エピトープ
配列番号２ＭＡＧＥＢ２エピトープ
配列番号３アルファ可変鎖
配列番号４ベータ可変鎖
配列番号５アルファ鎖可溶型
配列番号６ベータ鎖可溶型
配列番号７変異型アルファ可変鎖
配列番号８変異型アルファ可変鎖
配列番号９変異型ベータ可変鎖
配列番号１０アルファ鎖可溶型
配列番号１１ベータ鎖可溶型
配列番号１２アルファ鎖可溶型
配列番号１３ベータ鎖可溶型
配列番号１４アルファ鎖可溶型
配列番号１５ベータ鎖可溶型

Claims

ＨＬＡ－Ａ ^＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、当該ＴＣＲがＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、
アルファＣＤＲ１が、ＶＳＰＦＳＮであり、
アルファＣＤＲ２が、ＬＴＩＭＴＦ、または、ＬＴＩＶＴＦ、または、ＬＴＩＬＴＦであり、かつ、
アルファＣＤＲ３が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦであり、並びに、
ベータＣＤＲ１が、ＫＧＨＤＲであり、
ベータＣＤＲ２が、ＳＦＤＶＫであり、かつ、
ベータＣＤＲ３が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦである、ＴＣＲ。
アルファ鎖ＴＲＡＶ１０＋ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＶ２４－１＋ＴＲＢＣ－２定常ドメイン配列を有する、アルファ－ベータヘテロ二量体である、請求項１に記載のＴＣＲ。
型Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、またはＶα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβの単鎖形式である、請求項１に記載のＴＣＲであって、ＶαおよびＶβがそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβがそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、かつ、Ｌがリンカー配列である、ＴＣＲ。
検出可能な標識、治療剤またはＰＫ改変部分と結合された、請求項１から３のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインが、配列番号３のＴＣＲアルファ鎖可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または、
前記ＴＣＲベータ鎖可変ドメインが、配列番号４のＴＣＲベータ鎖可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲが、
（ｉ）そのアミノ酸残基１～２７の配列が、配列番号３のアミノ酸残基１～２７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８～３３の配列が、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３４～４７の配列が、配列番号３のアミノ酸残基３４～４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８～５３の配列が、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４～９０の配列が、配列番号３のアミノ酸残基５４～９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ、
（ｖｉ）アミノ酸９１～１０５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦである、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲが、配列番号３、７、または８のアミノ酸配列である前記ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲが、
（ｉ）そのアミノ酸残基１～４５の配列が、配列番号４の残基１～４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列が、ＫＧＨＤＲであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７の配列が、配列番号４のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７２の配列が、ＳＦＤＶＫであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基７３～１０９の配列が、配列番号４のアミノ酸残基７３～１０９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列であり、かつ、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦである、
前記ＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲが、配列番号９のアミノ酸配列である前記ＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲが、配列番号３、７、および８からなる群から選択されるアミノ酸配列である前記ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列である前記ＴＣＲベータ鎖可変ドメインとを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
前記ＴＣＲが、配列番号８のアミノ酸配列である前記ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列である前記ＴＣＲベータ鎖可変ドメインとを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
核酸によりコードされるＴＣＲを提示している細胞であって、前記核酸が、
（Ａ）（ｉ）そのアミノ酸残基１～２７の配列が、配列番号３のアミノ酸残基１～２７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８～３３の配列が、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３４～４７の配列が、配列番号３のアミノ酸残基３３～４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８～５３の配列が、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４～９０の配列が、配列番号３のアミノ酸残基５４～９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する、かつ
（ｖｉ）アミノ酸９１～１０５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ
である、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインと、
（Ｂ）（ｉ）アミノ酸残基１～４５の配列が、配列番号４の残基１～４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列が、ＫＧＨＤＲであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１～６７の配列が、配列番号４のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７２の配列が、ＳＦＤＶＫであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基７３～１０９の配列が、配列番号４のアミノ酸残基７３～１０９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ
である、ＴＣＲベータ鎖可変ドメインと
を含むＴＣＲをコードする、細胞であり、
前記ＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ ^＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する、細胞。
前記ＴＣＲをコードする核酸が、配列番号３、７、および８のアミノ酸配列からなる群から選択されるＴＣＲアルファ鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列であるＴＣＲベータ鎖可変ドメインとを含むＴＣＲをコードする、請求項１２に記載の細胞。
前記ＴＣＲをコードする核酸が、配列番号８のアミノ酸配列であるＴＣＲアルファ鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列であるＴＣＲベータ鎖可変ドメインとを含むＴＣＲをコードする、請求項１２または１３に記載の細胞。
１種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。
薬における使用のための、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項１２から１４のいずれか１項に記載の細胞。
がんを治療する方法における使用のための、請求項１６に記載のＴＣＲ、または細胞。