JP7577791B2 - Tumor marker STAMP-EP8 based on methylation modification and its application - Google Patents
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Description
本発明は、疾患診断用マーカー分野に関わり、より具体的に、本発明は、メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ）及びその応用に関わる。 The present invention relates to the field of disease diagnostic markers, and more specifically, the present invention relates to a tumor marker based on methylation modification, STAMP (Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer), and its applications.
腫瘍が遺伝病であるという考えは、何十年もの間当分野で根強く残っている。人々の数回の体系的な大規模シーケンスにより、癌組織における体細胞変異の数が、予想よりも大幅に少ないことが確認され、これらの結果は、癌が単純な遺伝病ではないことを示唆している。 The idea that tumors are genetic diseases has persisted in the field for decades. Several systematic large-scale sequencing studies of people have confirmed that the number of somatic mutations in cancer tissues is significantly lower than expected, suggesting that cancer is not simply a genetic disease.
腫瘍診断を達成するために、近年、多くの新しい腫瘍マーカーが発見され、臨床診断に使用されている。１９８０年以前は、腫瘍マーカーは主にホルモン、酵素、タンパク質などの細胞分泌物であり、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン抗原（ＡＦＰ）などは、胃がんや肝臓がんなどの多くの腫瘍のマーカーであり、炭水化物抗原１２５（ＣＡ１２５）は子宮頸癌のマーカーとして使用でき、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は前立腺癌マーカーとして使用でき；このような腫瘍マーカーはまだ臨床で使用されているが、その感度と精度は臨床ニーズを満たすのが困難である。 In order to achieve tumor diagnosis, many new tumor markers have been discovered and used in clinical diagnosis in recent years. Before 1980, tumor markers were mainly cell secretions such as hormones, enzymes, proteins, etc., such as carcinoembryonic antigen (CEA), alpha-fetoprotein antigen (AFP), etc., which are markers for many tumors such as gastric cancer and liver cancer, carbohydrate antigen 125 (CA125) can be used as a marker for cervical cancer, and prostate-specific antigen (PSA) can be used as a marker for prostate cancer; such tumor markers are still used in clinical practice, but their sensitivity and accuracy are difficult to meet clinical needs.
ますます多くの証拠が、エピジェネティック調節の小さな変化が、腫瘍において重要な役割を果たすことを示している。エピジェネティクスとは、遺伝子のＤＮＡ配列を変更せずに、遺伝子機能における遺伝可能な変化、及び最終的にもたらされた表現型の変化を研究する学科である。エピジェネティクスには、主にＤＮＡメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））、ヒストン修飾（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、マイクロＲＮＡレベルの変化などの生化学的プロセスが含まれる。エピジェネティクス機構の一つであるＤＮＡメチル化とは、生体内で、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＤＭＴ）の触媒作用下で、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をメチルドナーとし、メチル基を特定の塩基に転移させるプロセスを指す。哺乳類では、ＤＮＡメチル化は主に５’－ＣｐＧ－３’のＣで発生し、５－メチルシトシン（５ｍＣ）を生成する。 More and more evidence shows that small changes in epigenetic regulation play an important role in tumors. Epigenetics is the study of heritable changes in gene function and the resulting phenotypic changes without altering the DNA sequence of the gene. Epigenetics mainly includes biochemical processes such as DNA methylation, histone modification, and changes in microRNA levels. DNA methylation, one of the epigenetic mechanisms, refers to the process in vivo in which a methyl group is transferred to a specific base using S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl donor under the catalysis of DNA methyltransferase (DMT). In mammals, DNA methylation mainly occurs at the C of 5'-CpG-3' to generate 5-methylcytosine (5mC).
リキッドバイオプシー技術は、血液中の循環腫瘍細胞または循環腫瘍ＤＮＡを検出標的として使用する腫瘍を診断および予測する技術である。当該技術は、多くの欠点がある：まず、感度と特異性は十分に高くない；腫瘍自体は非常に不均一で、複数のサブタイプの細胞集団が含まれている；臨床サンプル、特に血液サンプルでは、腫瘍ＤＮＡの割合は非常に小さく、既存の腫瘍マーカーが臨床ニーズの感度を満たすことが難しく、臨床で誤診を引き起こしやすい；次、一つのマーカーは一つまたは少数の腫瘍にしか効かなく、血液中のＤＮＡの由来は非常に複雑であるため、既存の腫瘍マーカーは複雑な腫瘍の発生源と転移に対処できない。これらの複雑な状況があるため、多くのＤＮＡメチル化腫瘍マーカーが臨床応用で使用される際に統一の基準を有し難くなり、マーカーの感度と精度にひどく影響を及す。 Liquid biopsy technology is a technology for diagnosing and predicting tumors that uses circulating tumor cells or circulating tumor DNA in the blood as a detection target. This technology has many shortcomings: first, the sensitivity and specificity are not high enough; the tumor itself is very heterogeneous and contains multiple subtype cell populations; in clinical samples, especially blood samples, the proportion of tumor DNA is very small, making it difficult for existing tumor markers to meet the sensitivity of clinical needs and prone to misdiagnosis in clinical practice; second, one marker can only work on one or a few tumors, and the origin of DNA in blood is very complex, so existing tumor markers cannot deal with the origin and metastasis of complex tumors. Due to these complex circumstances, many DNA methylation tumor markers are difficult to have a unified standard when used in clinical applications, which severely affects the sensitivity and accuracy of the markers.
本発明者らの以前の研究では、メチル化修飾に基づくいくつかの腫瘍マーカーが発見されたが、腫瘍診断のためのより多くの手段を提供するために、より多くの新しい腫瘍マーカーを見つける必要がある。 In our previous studies, several tumor markers based on methylation modifications were discovered, but more new tumor markers need to be found to provide more tools for tumor diagnosis.
本発明の目的としては、ＤＮＡメチル化修飾を腫瘍マーカーとして使用し、腫瘍の特異性サイトで異常な高メチル化を利用して腫瘍を検出する方法を提供することである。 The object of the present invention is to provide a method for detecting tumors by using DNA methylation modifications as a tumor marker and utilizing abnormal hypermethylation at specific tumor sites.
本発明の第一の様態では、（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；（ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイト（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）が存在するもの；及び／又は（ｃ） 上記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド）を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。 In a first aspect of the present invention, there is provided an isolated polynucleotide comprising: (a) a polynucleotide having a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a fragment of the polynucleotide of (a) in which at least one modified CpG site (e.g., 2-191, more specifically, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 90, 110, 130, 150, 170, 180, 190) is present; and/or (c) a nucleic acid complementary to the polynucleotide or fragment of (a) or (b) (e.g., a polynucleotide having a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 3).
一つの好ましい例では、上記の修飾が、５－メチル化修飾、５－ヒドロキシメチル化修飾、５－ホルミル化修飾又は５－カルボキシル化修飾を含む。 In one preferred example, the above modification includes a 5-methylation modification, a 5-hydroxymethylation modification, a 5-formylation modification, or a 5-carboxylation modification.
別の好ましい例では、（ｂ）には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントに中、以下のものが存在する：２０４～２２３位（０２１～０２４号メチル化サイトを含む）塩基；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１～４７８位塩基（００１～０４０号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の５１３～１０４０位塩基（０４１～０７７号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１０８２～１６０２位塩基（０７８～１１４号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１６２１～２１１７位塩基（１１５～１５３号メチル化サイトを含む）；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の２１６０～２７００位塩基（１５４～１９１号メチル化サイトを含む）。 In another preferred embodiment, (b) is present in the above-mentioned polynucleotide fragment: bases 204 to 223 (including methylation sites 021 to 024); bases 1 to 478 (including methylation sites 001 to 040) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases 513 to 1040 (including methylation sites 041 to 077) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases 1082 to 1602 (including methylation sites 078 to 114) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases 1621 to 2117 (including methylation sites 115 to 153) of SEQ ID NO: 1 or 2; or bases 2160 to 2700 (including methylation sites 154 to 191) of SEQ ID NO: 1 or 2.
本発明の第二の様態では、上記のポリヌクレオチドから転換される、前記の第一の様態の配列と対応する単離されたポリヌクレオチドを提供し、ただし、修飾されたＣｐＧサイトのシトシンＣが変化しなく、未修飾のシトシンがＴ又はＵに転換する。 In a second aspect of the invention, there is provided an isolated polynucleotide corresponding to the sequence of the first aspect, which is converted from the polynucleotide described above, except that the cytosine C at the modified CpG site is unchanged and the unmodified cytosine is converted to T or U.
一つの好ましい例では、それが、バイサルファイトで処理される前記第一の様態と対応するポリヌクレオチドから転換されてなる。もう一つの好ましい例では、上記のポリヌクレオチドが、（ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；（ｅ） 上記（ｄ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイト（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）が存在するものを含む。 In one preferred embodiment, it is converted from a polynucleotide corresponding to the first embodiment, which is treated with bisulfite. In another preferred embodiment, the polynucleotide includes (d) a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; (e) a fragment of the polynucleotide of (d) above, in which at least one modified CpG site (e.g., 2 to 191, more specifically, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 90, 110, 130, 150, 170, 180, 190) is present.
別の好ましい例では、（ｅ）には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントに、以下のものが存在する：２０４～２２３位（０２１～０２４号メチル化サイトを含む）塩基；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１～４７８位塩基（００１～０４０号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の５１３～１０４０位塩基（０４１～０７７号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１０８２～１６０２位塩基（０７８～１１４号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１６２１～２１１７位塩基（１１５～１５３号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の２１６０～２７００位塩基（１５４～１９１号メチル化サイトを含む）；２４７８～２４９７位（０２１～０２４号メチル化サイトと対応する）塩基；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の２２２３～２７００位塩基（００１～０４０号メチル化サイトと対応する）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の１６６１～２１８８位塩基（０４１～０７７号メチル化サイトと対応する）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の１０９９～１６１９位塩基（０７８～１１４号メチル化サイトと対応する）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の５８４～１０８０位塩基（１１５～１５３号メチル化サイトと対応する）；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の１～５４１位塩基（１５４～１９１号メチル化サイトと対応する）。 In another preferred embodiment, in (e), the following are present in the above-mentioned polynucleotide fragment: bases 204 to 223 (including methylation sites 021 to 024); bases 1 to 478 (including methylation sites 001 to 040) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases 513 to 1040 (including methylation sites 041 to 077) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases 1082 to 1602 (including methylation sites 078 to 114) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases 1621 to 2117 (including methylation sites 115 to 153) of SEQ ID NO: 1 or 2; bases at positions 2160 to 2700 (including methylation sites 154 to 191) of SEQ ID NO:1 or 2; bases at positions 2478 to 2497 (corresponding to methylation sites 021 to 024); bases at positions 2223 to 2700 (corresponding to methylation sites 001 to 040) of SEQ ID NO:4 or 3; bases at positions 1661 to 2188 (corresponding to methylation sites 041 to 077) of SEQ ID NO:4 or 3; bases at positions 1099 to 1619 (corresponding to methylation sites 078 to 114) of SEQ ID NO:4 or 3; bases at positions 584 to 1080 (corresponding to methylation sites 115 to 153) of SEQ ID NO:4 or 3; Bases 1 to 541 of 4 or 3 (corresponding to methylation sites 154 to 191).
本発明の第三の様態では、腫瘍検出用の試薬又はキットを調製するための、前記の第一の様態又は第二の様態に記載されたポリヌクレオチドの用途を提供する。 In a third aspect of the present invention, there is provided a use of the polynucleotide described in the first or second aspect for preparing a reagent or kit for tumor detection.
一つの好ましい例では、上記の腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むが、これらに限定されない。 In one preferred embodiment, the tumor includes, but is not limited to, blood system tumors such as leukemia, lymphoma, and multiple myeloma; gynecological and reproductive system tumors such as breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, vulvar cancer, testicular cancer, prostate cancer, and penile cancer; digestive system tumors such as esophageal cancer, gastric cancer, colorectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, and gallbladder cancer; respiratory system tumors such as lung cancer and pleurioma; nervous system tumors such as glioma, neuroblastoma, and meningioma; head and neck cancers such as oral cancer, tongue cancer, laryngeal cancer, and nasopharyngeal cancer; urinary system tumors such as kidney cancer and bladder cancer; and skin and other system tumors such as skin cancer, melanoma, osteosarcoma, liposarcoma, and thyroid cancer.
もう一つの好ましい例では、上記の腫瘍のサンプルが、組織サンプル、パラフィン包埋サンプル、血液サンプル、胸水サンプル、肺胞洗浄液サンプル、腹水および洗浄液サンプル、胆汁サンプル、便サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、喀痰サンプル、脳脊髄液サンプル、細胞塗抹サンプル、子宮頸部塗抹サンプルまたはブラシサンプル、組織および細胞生検サンプルを含むが、これらに限定されない。 In another preferred embodiment, the tumor sample includes, but is not limited to, tissue samples, paraffin-embedded samples, blood samples, pleural fluid samples, bronchoalveolar lavage fluid samples, ascites and lavage fluid samples, bile samples, stool samples, urine samples, saliva samples, sputum samples, cerebrospinal fluid samples, cell smear samples, cervical smear or brush samples, tissue and cell biopsy samples.
本発明の第四の様態では、腫瘍検出試薬を調製する方法を提供し、上記の方法が、以下を含む：前記第一の様態又は第二の様態に記載されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出する検出試薬をデザインする；ただし、上記の標的配列には、少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在する；好ましくに、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含むが、これらに限定されない。 In a fourth aspect of the present invention, a method for preparing a tumor detection reagent is provided, the method comprising the steps of: providing a polynucleotide as described in the first or second aspect; designing a detection reagent for specifically detecting the modification status of a CpG site in a target sequence that is the full length or a fragment of the polynucleotide; and providing that the target sequence has at least one modified CpG site (e.g., 2 to 191, more specifically, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 90, 110, 130, 150, 170, 180, 190). Preferably, the detection reagent includes, but is not limited to, a primer and a probe.
本発明の第五の様態では、標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出する試薬又は組み合わせた試薬を提供し、ただし、上記の標的配列とは、前記第一の様態又は第二の様態のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドの全長又はフラグメントであり、少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在する。 In a fifth aspect of the present invention, a reagent or combination of reagents is provided for specifically detecting the modification status of a CpG site in a target sequence, where the target sequence is a full length or fragment of a polynucleotide described in any one of the first or second aspects, and contains at least one (e.g., 2 to 191, more specifically, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 90, 110, 130, 150, 170, 180, 190) modified CpG site.
一つの好ましい例では、上記の試薬又は組み合わせた試薬が、上記の標的配列を含む遺伝子配列を標的とし（上記の遺伝子配列に基づきデザインされ）、上記の遺伝子配列が、遺伝子パネル又は遺伝子グループを含む。 In one preferred example, the reagent or combination of reagents targets (is designed based on) a gene sequence that includes the target sequence, and the gene sequence includes a gene panel or group of genes.
もう一つの好ましい例では、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含む。 In another preferred embodiment, the detection reagent includes a primer and a probe.
もう一つの好ましい例では、上記のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と４に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と８に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と１０に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と１２に示されたプライマー；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と１４に示されたプライマー；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と１６に示されたプライマーである。 In another preferred embodiment, the primers are the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 4; the primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8; the primers shown in SEQ ID NOs: 9 and 10; the primers shown in SEQ ID NOs: 11 and 12; or the primers shown in SEQ ID NOs: 13 and 14; or the primers shown in SEQ ID NOs: 15 and 16.
本発明の第六の様態では、腫瘍検出用のキットを調製するための、前記の第五の様態に記載された試薬又は組み合わせた試薬の用途を提供する；好ましくに、上記の腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むが、これらに限定されない。 In a sixth aspect of the present invention, there is provided a use of the reagent or combination of reagents described in the fifth aspect for preparing a kit for tumor detection; preferably, the tumor is selected from the group consisting of hematological tumors such as leukemia, lymphoma, multiple myeloma, gynecological and reproductive tumors such as breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, vulvar cancer, testicular cancer, prostate cancer, penile cancer, digestive tumors such as esophageal cancer, gastric cancer, colorectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, gallbladder cancer, respiratory tumors such as lung cancer, pleurioma, nervous tumors such as glioma, neuroblastoma, meningioma, head and neck tumors such as oral cancer, tongue cancer, laryngeal cancer, nasopharyngeal cancer, urinary tumors such as kidney cancer, bladder cancer, skin and other tumors such as skin cancer, melanoma, osteosarcoma, liposarcoma, thyroid cancer, etc.
本発明の第七の様態では、容器、及び容器に位置する前記の試薬又は試薬の組み合わせを含む検出キットを提供する；好ましくに、各試薬は別々の容器に位置する。 In a seventh aspect of the present invention, there is provided a detection kit comprising a container and a reagent or combination of reagents as described above located in the container; preferably, each reagent is located in a separate container.
一つの好ましい例では、上記のキットは、さらに、バイサルファイト、ＤＮＡ精製試薬、ＤＮＡ抽出試薬、ＰＣＲ増幅試薬及び／又はユーザーマニュアル（検出操作ステップと結果判定標準を表示するもの）を含む。 In one preferred embodiment, the kit further comprises bisulfite, DNA purification reagents, DNA extraction reagents, PCR amplification reagents and/or a user manual indicating the detection procedure steps and result criteria.
本発明の第八の様態では、（ｉ）試料を提供し、核酸を抽出すること；（ｉｉ）（ｉ）の核酸における標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を検出し、上記の標的配列は、前記の第一の様態に記載されたポリヌクレオチド又はこれから転換されてなる前記の第二の様態に記載されたポリヌクレオチドであることを含む、生体外で試料のメチル化プロファイルを検出する方法を提供する。 In an eighth aspect of the present invention, there is provided a method for detecting a methylation profile of a sample in vitro, comprising: (i) providing a sample and extracting a nucleic acid; and (ii) detecting the modification status of a CpG site of a target sequence in the nucleic acid of (i), the target sequence being a polynucleotide as described in the first aspect or a polynucleotide as described in the second aspect converted therefrom.
一つの好ましい例では、ステップ（３）には、分析する方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化チップ法、ｑＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンス法、３世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、又はそれらの組み合わせ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示された配列における一部又は全部のメチル化サイトの組み合わせた遺伝子グループの生体外での検出方法及び生体内トレーサー検出方法を含む。また、他のメチル化検出方法及び将来の新たに開発されるメチル化検出方法も本発明に適用できる。 In one preferred embodiment, in step (3), the analysis method includes pyrosequencing, bisulfite sequencing, methylation chip, qPCR, digital PCR, next generation sequencing, third generation sequencing, whole genome methylation sequencing, DNA enrichment detection, Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) technology, HPLC, MassArray, methylation specific PCR (MSP), or a combination thereof, and an in vitro detection method and an in vivo tracer detection method of a gene group combining some or all of the methylation sites in the sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, other methylation detection methods and newly developed methylation detection methods in the future can also be applied to the present invention.
もう一つの好ましい例では、ステップ（ｉｉ）が、（１）その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように（ｉ）の産物を処理する；好ましくに、上記の修飾が、５－メチル化修飾、５－ヒドロキシメチル化修飾、５－ホルミル化修飾又は５－カルボキシル化修飾を含む；好ましくに、バイサルファイトでステップ（ｉ）に記載された核酸を処理すること；（２）（１）で処理された核酸における上記の標的配列の修飾状況を分析すること；を含む。 In another preferred embodiment, step (ii) comprises: (1) treating the product of (i) so that unmodified cytosines therein are converted to uracil; preferably, said modifications comprise a 5-methylation modification, a 5-hydroxymethylation modification, a 5-formylation modification or a 5-carboxylation modification; preferably treating the nucleic acid described in step (i) with bisulfite; (2) analyzing the modification status of the target sequence in the nucleic acid treated in (1).
もう一つの好ましい例では、上記のメチル化プロファイル異常とは、当該ポリヌクレオチドＣｐＧにおけるＣが、高度にメチル化されることを意味する。 In another preferred embodiment, the abnormal methylation profile means that the C in the polynucleotide CpG is highly methylated.
もう一つの好ましい例では、上記のメチル化プロファイルの方法は、疾患の診断結果を直接取得することを目的としたものではなく、診断的な方法ではない。 In another preferred embodiment, the above methylation profiling method is not intended to directly obtain a diagnosis of a disease and is not a diagnostic method.
本発明の第九の様態では、本発明の第一の様態又は第二の様態に示された配列に基づきデザインされたプライマーペアと、当該配列を含む遺伝子パネル又は遺伝子グループとを含み、ＤＮＡメチル化状態の検出によって、正常細胞と腫瘍細胞の特徴を得る腫瘍診断キットを提供する。 In a ninth aspect of the present invention, a tumor diagnostic kit is provided that includes a primer pair designed based on the sequence shown in the first or second aspect of the present invention and a gene panel or gene group including the sequence, and that obtains characteristics of normal cells and tumor cells by detecting the DNA methylation state.
本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。 Based on the disclosure herein, other aspects of the present invention will be apparent to one of ordinary skill in the art.
本発明者らが、腫瘍マーカーの研究に取り組んだ結果として、広範な研究とスクリーニングによって、汎用なＤＮＡメチル化腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ）を提供し、ＳＴＡＭＰは、正常組織では低メチル化状態にあり、腫瘍組織では高メチル化状態にあり、臨床腫瘍の検出や腫瘍診断試薬のデザインの基礎として使用できる。 As a result of the inventors' research into tumor markers, through extensive research and screening, they have provided a versatile DNA methylation tumor marker, STAMP (Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer), which is hypomethylated in normal tissues and hypermethylated in tumor tissues and can be used as a basis for the detection of clinical tumors and the design of tumor diagnostic reagents.
用語
本明細書で使用される場合、「単離」とは、物質をその元の環境から単離することを指す（天然物質である場合、元の環境は自然環境である）。例えば、生細胞において、自然状態にあるポリヌクレオチドとポリペプチドは、単離・精製されないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然状態で共存する他の物質から単離される場合、それは単離・精製されるものである。
As used herein, the term "isolated" refers to isolating a substance from its original environment (if it is a naturally occurring substance, the original environment is the natural environment). For example, polynucleotides and polypeptides that are naturally occurring in living cells are not isolated and purified, but the same polynucleotide or polypeptide is isolated and purified when it is separated from other substances with which it coexists in the natural state.
本明細書で使用される場合、「サンプル」または「試料」は、任意の個体または単離された組織、細胞、または体液（血漿など）から得られる、ＤＮＡメチル化状態の検出に適した物質を含む。例えば、示されたサンプルが、組織サンプル、パラフィン包埋サンプル、血液サンプル、胸水サンプル、肺胞洗浄液サンプル、腹水および洗浄液サンプル、胆汁サンプル、便サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、脳脊髄液サンプル、細胞塗抹サンプル、子宮頸部塗抹サンプルまたはブラシサンプル、組織および細胞生検サンプルを含むが、これらに限定されない。 As used herein, a "sample" or "specimen" includes any material obtained from an individual or isolated tissue, cell, or body fluid (such as plasma) suitable for detection of DNA methylation status. For example, the samples referred to include, but are not limited to, tissue samples, paraffin-embedded samples, blood samples, pleural fluid samples, bronchoalveolar lavage fluid samples, peritoneal fluid and lavage fluid samples, bile samples, stool samples, urine samples, saliva samples, cerebrospinal fluid samples, cell smear samples, cervical smear or brush samples, tissue and cell biopsy samples.
本明細書で使用される場合、「高（度）メチル化」は、遺伝子配列におけるＣｐＧの高度的なメチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化またはカルボキシル化修飾の存在を指す。たとえば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）分析法の観点から、メチル化特異的プライマーを使用したＰＣＲ反応では、陽性のＰＣＲ結果が得られると、テスト対象のＤＮＡ（遺伝子）領域が高メチル化状態にあることを意味する。例えば、リアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲの場合、高メチル化状態の判定は、コントロール試料のメチル化状態の相対値に基づく統計的差異について分析することができる。 As used herein, "hypermethylation" refers to the presence of high levels of methylation, hydroxymethylation, formylation or carboxylation modifications of CpGs in a gene sequence. For example, in terms of methylation-specific PCR (MSP) analysis, a positive PCR result in a PCR reaction using methylation-specific primers means that the DNA (gene) region being tested is in a hypermethylated state. For example, in the case of real-time quantitative methylation-specific PCR, the determination of the hypermethylation state can be analyzed for statistical differences based on the relative value of the methylation state of a control sample.
遺伝子マーカー
腫瘍を診断するために有用な標的を見つけるために、本発明者らは、広範囲で詳細な研究を行い、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８という標的を確定した。ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８遺伝子配列領域のメチル化状態が、腫瘍組織と非腫瘍組織では有意差があるので、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８遺伝子配列領域には異常な高メチル化状態の存在を検出すると、当該受検者が、がんのハイリスクグループであることを判定できる。さらに、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８によって提示される腫瘍組織と非腫瘍組織の間の有意差が、固形腫瘍と非固形腫瘍を含むさまざまな種類の腫瘍に広範に存在する。
Genetic Marker In order to find a target useful for diagnosing tumors, the present inventors have conducted extensive and detailed research and identified a target called STAMP-EP8. Since there is a significant difference in the methylation state of the STAMP-EP8 gene sequence region between tumor tissues and non-tumor tissues, when the presence of an abnormal high methylation state in the STAMP-EP8 gene sequence region is detected, the subject can be determined to be in a high-risk group for cancer. Furthermore, the significant difference between tumor tissues and non-tumor tissues presented by STAMP-EP8 is widely present in various types of tumors, including solid tumors and non-solid tumors.
そして、本発明が、単離されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と逆相補する配列）に示されたヌクレオチド配列を有し、腫瘍細胞において、当該ポリヌクレオチド配列の複数箇所の５’－ＣｐＧ－３’の塩基Ｃポジションに、５－メチルシトシン（５ｍＣ）が生成される。本発明が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつ少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）のメチル化ＣｐＧサイトが存在するものも含む。上記のポリヌクレオチド又はフラグメントは、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。 The present invention also provides an isolated polynucleotide, which has a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (a sequence reverse-complementary to SEQ ID NO: 1), and in tumor cells, 5-methylcytosine (5mC) is generated at the C position of multiple 5'-CpG-3' bases in the polynucleotide sequence. The present invention also includes a fragment of a polynucleotide having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, which has at least one methylated CpG site (e.g., 2 to 191, more specifically, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 90, 110, 130, 150, 170, 180, 190). The above polynucleotide or fragment may be used to design a detection reagent or detection kit.
本発明のいくつかの具体的な実施例には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントは、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１～３０９位塩基を含むフラグメント（０１７～０２０号ＣｐＧサイトを含有するもの）である。上記のフラグメントのアンチセンス鎖も使用することができる。これらのフラグメントは、本発明の好ましい実施形態の例である；本発明によって提供される情報によれば、他のフラグメントも選択することができる。 In some specific examples of the present invention, the above polynucleotide fragment is, for example, a fragment containing bases 281-309 of SEQ ID NO: 1 (containing CpG sites 017-020). Antisense strands of the above fragments can also be used. These fragments are examples of preferred embodiments of the present invention; other fragments can also be selected according to the information provided by the present invention.
なお、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されたヌクレオチド配列又は配列フラグメントを含む遺伝子パネル又は遺伝子グループも本発明に含まれる。上記の遺伝子パネル又は遺伝子グループに対して、ＤＮＡメチル化状態の検出によって、正常細胞と腫瘍細胞の特徴も得る。 The present invention also includes a gene panel or a gene group that includes the nucleotide sequence or sequence fragment shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. For the above gene panel or gene group, detection of the DNA methylation status can also provide characteristics of normal cells and tumor cells.
上記のポリヌクレオチドは、メチル化状態を分析するためのゲノムの重要な領域として使用することができ、それらのメチル化状態は、当技術分野で既知された様々な技術によって分析することができる。メチル化状態を分析するために使用することができる任意の技術を本発明に適用することができる。 The above polynucleotides can be used as important regions of the genome for analyzing the methylation status, which can be analyzed by various techniques known in the art. Any technique that can be used to analyze the methylation status can be applied to the present invention.
上記のポリヌクレオチドをバイサルファイトで処理した後に、メチル化されないシトシンは、ウラシルに転化され、メチル化されたシトシンは、変化しない。 After treating the above polynucleotide with bisulfite, unmethylated cytosines are converted to uracils and methylated cytosines remain unchanged.
そして、本発明が、上記ポリヌクレオチド（それと相補する鎖（アンチセンス鎖）を含む）をバイサルファイトで処理して得るポリヌクレオチドも提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。 The present invention also provides polynucleotides obtained by treating the above polynucleotides (including the complementary strand (antisense strand)) with bisulfite, including polynucleotides having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. These polynucleotides may be used in the design of detection reagents or detection kits.
本発明が、上記ポリヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖をバイサルファイトで処理して得るポリヌクレオチドのフラグメントも含み、ただし、少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）のメチル化ＣｐＧサイトが存在する。センス鎖に対応するアンチセンス鎖の各ＣｐＧサイトの番号は、本発明によって提供される内容に従って容易に得られる。 The present invention also includes a polynucleotide fragment obtained by treating the above polynucleotide or its antisense strand with bisulfite, provided that there is at least one (e.g., 2 to 191, more specifically, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 90, 110, 130, 150, 170, 180, 190) methylated CpG site. The number of each CpG site in the antisense strand corresponding to the sense strand can be easily obtained according to the contents provided by the present invention.
検出試薬とキット
本発明の新たな発見に基づき、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するための、ポリヌクレオチド配列に基づいてデザインされた検出試薬も提供する。本分野に既知された確定なゲノムの配列、その変異とメチル化状態の検出方法と試薬は、いずれも本発明に適用できる。
Detection Reagents and Kits Based on the new findings of the present invention, detection reagents designed based on polynucleotide sequences for detecting the methylation profile of polynucleotides in samples in vitro are also provided. Any of the methods and reagents for detecting defined genomic sequences, their mutations and methylation statuses known in the art can be applied to the present invention.
そして、本発明が、腫瘍検出試薬を調製する方法を提供し、以下を含む：上記のポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列を特異的に検出する検出試薬をデザインする；ただし、上記の標的配列には、少なくとも１個のメチル化ＣｐＧサイトが存在する。 The present invention also provides a method for preparing a tumor detection reagent, which includes: providing the above-mentioned polynucleotide, designing the full length or a fragment of the above-mentioned polynucleotide as a target sequence, and designing a detection reagent that specifically detects the target sequence; provided that the above-mentioned target sequence contains at least one methylated CpG site.
本発明に記載された検出試薬が、プライマー、プローブなどを含むが、これらに限定されない。 The detection reagents described in this invention include, but are not limited to, primers, probes, etc.
上記の試薬は、例えばプライマーペアであり、ポリヌクレオチドの配列を知っている場合、プライマーのデザインは当業者に既知されたものであり、２つのプライマーが、増幅される標的遺伝子の特定の配列の両側に隣接している（ＣｐＧ配列を含み、その中のＣｐＧと相補するのは、元のメチル化された遺伝子領域を標的とするものであり、その中のＴｐＧと相補するのは、元の脱メチル化された遺伝子領域を標的とするものである）。本発明の新たな発見によれば、上記の標的配列の異なる位置にあるＣｐＧサイトまたはそれらの組み合わせについて、当業者は、様々なプライマーまたはプローブまたは他のタイプの検出試薬をデザインすることができ、これらは、本発明の技術案に含まれることを理解すべきである。本発明の好ましい実施例では、上記のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の００１～０４０号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５と６に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の０４１～０７７号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７と８に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の０７８～１１４号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９と１０に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の１１５～１５３号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１と１２に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の１５４～１９１号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３と１４に示されたプライマー；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の０２１－０２４号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５と１６に示されたプライマー。 The above reagent is, for example, a primer pair, and when the sequence of the polynucleotide is known, the design of the primer is known to those skilled in the art, and the two primers flank a specific sequence of the target gene to be amplified (including a CpG sequence, in which the complementary CpG targets the original methylated gene region, and the complementary TpG targets the original demethylated gene region). According to the new discovery of the present invention, for CpG sites at different positions of the above target sequence or their combinations, those skilled in the art can design various primers or probes or other types of detection reagents, which should be understood to be included in the technical proposal of the present invention. In a preferred embodiment of the present invention, the above primers are selected from the group consisting of primers shown in SEQ ID NO:5 and 6 for obtaining an amplification product containing CpG sites 001-040 of SEQ ID NO:1; primers shown in SEQ ID NO:7 and 8 for obtaining an amplification product containing CpG sites 041-077 of SEQ ID NO:1; primers shown in SEQ ID NO:9 and 10 for obtaining an amplification product containing CpG sites 078-114 of SEQ ID NO:1; primers shown in SEQ ID NO:11 and 12 for obtaining an amplification product containing CpG sites 115-153 of SEQ ID NO:1; primers shown in SEQ ID NO:13 and 14 for obtaining an amplification product containing CpG sites 154-191 of SEQ ID NO:1; Primers shown in SEQ ID NO: 15 and 16 that produce an amplification product containing the CpG sites 021-024 of 1.
上記の試薬は、試薬の組み合わせ（プライマー組み合わせ）であっても良く、複数グループのプライマーを含み、複数の上記ポリヌクレオチドを別々に増幅することができる。 The above reagents may be a combination of reagents (primer combinations) that contain multiple groups of primers and can amplify multiple of the above polynucleotides separately.
本発明が、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するキットも提供し、当該キットが、容器、及び容器に位置する上記のプライマーペアを含む。 The present invention also provides a kit for detecting a methylation profile of a polynucleotide in a sample in vitro, the kit comprising a container and the above-described primer pair located in the container.
また、上記のキットには、さらに、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの精製、ＰＣＲ増幅などに必要な様々な試薬も含んでも良い。 The above kit may also contain various reagents necessary for DNA extraction, DNA purification, PCR amplification, etc.
さらに、上記のキットは、当業者の使用を便利にするための、検出操作ステップおよび結果判断基準を示すユーザーマニュアルを含むことができる。 Furthermore, the above kit may include a user manual showing the detection operation steps and result judgment criteria for convenient use by those skilled in the art.
検出方法
ポリヌクレオチドのメチル化プロファイルは、既存の技術（例えばメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）またはリアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲ、Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ）、または開発中と開発予定の他の技術によって測定することができる。
Detection Methods The methylation profile of a polynucleotide can be measured by existing techniques (eg, Methylation Specific PCR (MSP) or Real-time Quantitative Methylation Specific PCR, Methyllight) or other techniques under development and to be developed.
定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を使用して、メチル化レベルを検出することもできる。この方法は、ＭＳＰ法よりも感度の高い、蛍光ＰＣＲの連続光学モニタリングに基づくものである。それが高いスループットを有し、かつその結果を分析するための電気泳動の使用を避ける。 Quantitative methylation-specific PCR (QMSP) can also be used to detect methylation levels. This method is based on continuous optical monitoring of fluorescent PCR, which is more sensitive than the MSP method. It has high throughput and avoids the use of electrophoresis to analyze the results.
他の使用できる技術は、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、ｑＰＣＲ法、次世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、及び組み合わせた遺伝子グループ検出法などの、当技術分野の通常方法がある。本発明の新たな開示に基づいて、当技術分野で公知されたこれらの技術ならびに開発しようとする技術は、いずれも本発明に適用できることを理解すべきである。 Other techniques that can be used include conventional techniques in the art, such as pyrosequencing, bisulfite sequencing, qPCR, next generation sequencing, whole genome methylation sequencing, DNA enrichment detection, Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) technology, HPLC, and combined gene group detection. Based on the new disclosure of the present invention, it should be understood that all of these techniques known in the art, as well as techniques to be developed, can be applied to the present invention.
本発明の好ましい様態として、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出する方法も提供する。上記の方法は、以下の原理に基づくものである：バイサルファイトは、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換でき、その後のＰＣＲ増幅プロセスでチミンに変換されるが、メチル化されたシトシンは変化しない；したがって、ポリヌクレオチドをバイサルファイトで処理した後、メチル化されたサイトには、Ｃ／Ｔのようなポリヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が生成される。上記の原理に基づいて試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出すると、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを効果的に区別できる。 As a preferred embodiment of the present invention, a method for detecting the methylation profile of a polynucleotide in a sample in vitro is also provided. The above method is based on the following principle: bisulfite can convert unmethylated cytosine to uracil, which is then converted to thymine in the subsequent PCR amplification process, while methylated cytosine remains unchanged; therefore, after treating a polynucleotide with bisulfite, a polynucleotide polymorphism (SNP), such as C/T, is generated at the methylated site. Detecting the methylation profile of a polynucleotide in a sample based on the above principle can effectively distinguish between methylated and unmethylated cytosine.
本発明に記載された方法が、以下を含む：（ａ）試料を提供し、ゲノムＤＮＡを抽出する；（ｂ）バイサルファイトでステップ（ａ）のゲノムＤＮＡを処理し、ゲノムＤＮＡにおけるメチル化されていないシトシンをウラシルに転化する；（ｃ）ステップ（ｂ）で処理されたゲノムＤＮＡにメチル化プロファイル異常の存在の有無を分析する。 The method described in the present invention includes: (a) providing a sample and extracting genomic DNA; (b) treating the genomic DNA of step (a) with bisulfite to convert unmethylated cytosines in the genomic DNA to uracil; and (c) analyzing the genomic DNA treated in step (b) for the presence or absence of methylation profile abnormalities.
本発明の方法は、（ｉ）受験者の試料に検出を行い、受験者が腫瘍を罹患しているかどうかを分析すること；（ｉｉ）腫瘍のハイリスクグループを区別することに用いられても良い。上記の方法は、直接的な疾患診断結果を得ることを目的としない状況でもあり得る。 The method of the present invention may be used to (i) perform detection on a test subject's sample and analyze whether the test subject has a tumor; or (ii) distinguish high-risk groups for tumors. The above method may also be used in situations where the aim is not to obtain a direct disease diagnosis.
本発明の好ましい実施例において、ＤＮＡメチル化は、ＰＣＲ増幅およびパイロシーケンシングによって検出されるが、当業者は、実際の応用には、当該方法に限定されず、他のＤＮＡメチル化検出方法も可能であることを理解すべきである。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、実施例で提供されるものに限定されない。 In a preferred embodiment of the present invention, DNA methylation is detected by PCR amplification and pyrosequencing, but those skilled in the art should understand that the actual application is not limited to this method and other DNA methylation detection methods are also possible. The primers used for PCR amplification are not limited to those provided in the examples.
ゲノムＤＮＡはバイサルファイトで処理された後に、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、その後のＰＣＲプロセスでチミンに変換されることが、ゲノムの配列の複雑さを軽減するので、ＰＣＲによる特定の標的フラグメントの増幅がより困難になる。したがって、好ましくに、ネステッドＰＣＲ増幅を採用し、外周と内周に２ペアのプライマーをデザインし、２回のＰＣＲ増幅反応を行ってもよく、１回目の増幅産物を２回目の増幅のテンプレートとして使用し、増幅の効率と特異性を効果的に改善することができる。しかしながら、本発明で利用可能な検出方法はこれに限定されないことを理解すべきである。 After genomic DNA is treated with bisulfite, unmethylated cytosine is converted to uracil, which is then converted to thymine in the subsequent PCR process, reducing the complexity of the genome sequence, making it more difficult to amplify a specific target fragment by PCR. Therefore, nested PCR amplification is preferably adopted, and two pairs of primers are designed on the outer and inner circumferences to perform two PCR amplification reactions, and the first amplification product can be used as a template for the second amplification, which can effectively improve the efficiency and specificity of the amplification. However, it should be understood that the detection method available in the present invention is not limited to this.
臨床サンプルに関する研究および検証によって、本発明の方法は、臨床腫瘍の診断に使用される場合、非常に高い精度を有する。本発明は、腫瘍補助診断、治療効果判断、予後モニタリングなどの分野に適用することができ、高い臨床応用価値を有する。 Through research and validation on clinical samples, the method of the present invention has extremely high accuracy when used in clinical tumor diagnosis. The present invention can be applied to fields such as tumor auxiliary diagnosis, treatment effect assessment, and prognosis monitoring, and has high clinical application value.
以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。 The present invention will be further described below with reference to specific examples. It should be understood that these examples are merely illustrative of the present invention and do not limit the scope of the present invention. Experimental methods in the following examples that do not specify specific conditions are usually performed according to the general conditions described in J. Sambrook et al., Guide to Molecular Cloning, Third Edition, Science Press, 2002, or according to the conditions recommended by the manufacturer.
実施例１：ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８の検出に関わる核酸配列
本発明者らは、研究とスクリーニングを繰り返した後に、腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ－ＥＰ８を得、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １（ｃｈｒ８：２３５６２４７６－２３５６５１７５，Ｈｕｍａｎ／ｈｇ１９）に示された；ただし、下線が引かれた塩基はメチル化されたＣｐＧサイトであり、下線が引かれた数字はそのサイトの番号を示す。
Example 1: Nucleic acid sequence involved in the detection of STAMP-EP8 After repeated research and screening, the present inventors obtained a tumor marker STAMP-EP8, the sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1 (chr8:23562476-23565175, Human/hg19); where the underlined bases are methylated CpG sites, and the underlined numbers indicate the site numbers.
バイサルファイトで処理された上記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の通りである（ただし、ＹはＣまたはＵを表す）： The above SEQ ID NO:1 sequence treated with bisulfite is shown below as SEQ ID NO:2 (where Y represents C or U):
上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の通りである： The reverse complement of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1 is SEQ ID NO:3:
バイサルファイトで処理された上記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の通りである（ただし、ＹはＣまたはＵを表す）： The above SEQ ID NO:3 sequence treated with bisulfite is shown below as SEQ ID NO:4 (where Y represents C or U):
実施例２：腫瘍細胞株と非腫瘍細胞株の間のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８ ＣｐＧサイトのメチル化の違いーＢＳＰ－バイサルファイトシーケンシングＰＣＲ（ＢＳＰ－Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＰＣＲ）
当該バイサルファイトシーケンシングＰＣＲのステップは、以下に示された：
１． 肺がん細胞株Ａ５４９および正常な肺細胞株ＭＲＣ５からゲノムＤＮＡを抽出した；
２． 肺がん細胞株Ａ５４９及び正常な肺細胞株ＭＲＣ５から抽出されたゲノムＤＮＡをそれぞれバイサルファイトで処理し、その後のＰＣＲ増幅のテンプレートとした；
３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の配列に従って増幅プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～１４）を表１に示されるようにデザインし、増幅を行った。
４． ＰＣＲ増幅後、２％アガロースゲル電気泳動でＰＣＲフラグメントの特異性を検出し、ゲルを切断して標的フラグメントを回収し、Ｔベクターをライゲートして挿入し、コンピテント大腸菌を形質転換し、プレートに塗り広げ、２日目に、シーケンスのためにクローンを選択し、サンガーシーケンスのために各フラグメントから１０個を超えるクローンを選択した。
Example 2: Differences in methylation of STAMP-EP8 CpG sites between tumor and non-tumor cell lines - BSP-Bisulfite Sequencing PCR
The steps of the bisulfite sequencing PCR are shown below:
1. Genomic DNA was extracted from lung cancer cell line A549 and normal lung cell line MRC5;
2. Genomic DNA extracted from lung cancer cell line A549 and normal lung cell line MRC5 were treated with bisulfite and used as templates for subsequent PCR amplification;
3. Amplification primers (SEQ ID NO: 5-14) were designed according to the sequence of SEQ ID NO: 1 as shown in Table 1, and amplification was carried out.
4. After PCR amplification, the specificity of the PCR fragments was detected by 2% agarose gel electrophoresis, the target fragments were recovered by cutting the gel, ligated and inserted into T vector, transformed into competent E. coli, and plated, and on the second day, clones were selected for sequencing, and more than 10 clones were selected from each fragment for Sanger sequencing.
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における００１－０４０メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図１に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。 The results of BSP verification of the methylation levels of the 001-040 methylation site in the region of SEQ ID NO:1 in lung cancer cells and normal lung cells are shown in Figure 1, which showed that the STAMP-EP8 methylation level in lung cancer cells was significantly higher than that in normal liver cells.
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における０４１－０７７メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図２に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。 The results of BSP verification of the methylation levels of the 041-077 methylation site in the region of SEQ ID NO:1 in lung cancer cells and normal lung cells are shown in Figure 2, which shows that the STAMP-EP8 methylation level in lung cancer cells is significantly higher than that in normal liver cells.
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における０７８－１１４メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図３に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。 The results of BSP verification of the methylation levels of the 078-114 methylation site in the region of SEQ ID NO:1 in lung cancer cells and normal lung cells are shown in Figure 3, which shows that the STAMP-EP8 methylation level in lung cancer cells is significantly higher than that in normal liver cells.
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における１１５－１５３メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図４に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。 The results of BSP verification of the methylation levels of the 115-153 methylation site in the region of SEQ ID NO:1 in lung cancer cells and normal lung cells are shown in Figure 4, which shows that the STAMP-EP8 methylation level in lung cancer cells is significantly higher than that in normal liver cells.
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における１５４－１９１メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図５に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。 The results of BSP verification of the methylation levels of the 154-191 methylation site in the region of SEQ ID NO:1 in lung cancer cells and normal lung cells are shown in Figure 5, which showed that the STAMP-EP8 methylation level in lung cancer cells was significantly higher than that in normal liver cells.
実施例３：腫瘍細胞株と非腫瘍細胞株の間のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８ ＣｐＧサイトのメチル化の違い－パイロシーケンス法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
当該パイロシーケンス法のステップは、以下に示された：
１． 臨床サンプルの入手：臨床からパラガングリオーマ／非癌性－癌組織サンプルを得、パラガングリオーマ／非癌性サンプルをコントロールグループとし、癌組織サンプルを腫瘍検出実験グループとした；
２． ＤＮＡの抽出：それぞれに実験グループとコントロールグループのＤＮＡを抽出した；この実験では、フェノール－クロロホルム抽出法を使用したが、この方法に限定されない；
３． バイサルファイトの処理：抽出されたＤＮＡサンプルをバイサルファイトで処理し、手順に厳密に従った；この実験では、ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＥＺＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ、アイテム番号Ｄ５００６を使用したが、このキットに限定されない；
４． プライマーのデザイン：ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８配列とするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の特徴に基づき、ＰＣＲ増幅プライマーとパイロシーケンスプライマーをデザインした；０２１－０２４号ＣｐＧサイトのメチル化値を検出し、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化値の代表として、ＰＣＲプライマー増幅配列、パイロシーケンスプライマー配列、パイロシーケンスマシン検出配列及び検出サイトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５～１８に示された（表２）；
５． ＰＣＲ増幅とアガロースゲル電気泳動：バイサルファイトで処理されたサンプルをＰＣＲのテンプレートとして使用し、ＰＣＲ増幅を行い、増幅産物は、ＰＣＲ増幅の特異性を特定するためにアガロースゲル電気泳動によって特定された；
６． パイロシーケンシング：ＱＩＡＧＥＮ会社のＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＩＤパイロシーケンサーで検出し、ユーザーマニュアルのステップに従って厳密に操作した；
７． ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値の計算：パイロシーケンシングは、標的領域の各ＣｐＧサイトのメチル化値を独立に検出することができる；サンプル中のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値として、すべてのＣｐＧサイトの平均メチル化値を計算した；
８． 結果の分析：パラガングリオーマ／非癌性コントロールグループと、腫瘍実験グループとのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化値を比較した。
Example 3: Differences in methylation of STAMP-EP8 CpG sites between tumor and non-tumor cell lines - pyrosequencing
The steps of the pyrosequencing method are shown below:
1. Obtaining clinical samples: Obtaining paraganglioma/non-cancerous-cancer tissue samples from clinics, paraganglioma/non-cancerous samples were the control group, and cancer tissue samples were the tumor detection experimental group;
2. DNA extraction: DNA was extracted from the experimental and control groups respectively; in this experiment, the phenol-chloroform extraction method was used, but not limited to this method;
3. Bisulfite treatment: The extracted DNA samples were treated with bisulfite, and the procedure was strictly followed; in this experiment, ZYMO Research's EZDNA Methylation-Gold Kit, item number D5006 was used, but not limited to this kit;
4. Primer design: Based on the characteristics of SEQ ID NO: 1, which is the STAMP-EP8 sequence, PCR amplification primers and pyrosequencing primers were designed; the methylation value of the CpG site of 021-024 was detected, and the PCR primer amplification sequence, pyrosequencing primer sequence, pyrosequencing machine detection sequence and detection site were shown in SEQ ID NO 15-18 as representatives of the STAMP-EP8 methylation value (Table 2);
5. PCR amplification and agarose gel electrophoresis: The bisulfite-treated samples were used as templates for PCR amplification, and the amplified products were identified by agarose gel electrophoresis to identify the specificity of PCR amplification;
6. Pyrosequencing: detected by QIAGEN PyroMark Q96 ID pyrosequencer, strictly following the steps in the user manual;
7. Calculation of the methylation value of STAMP-EP8: Pyrosequencing can detect the methylation value of each CpG site in the target region independently; the average methylation value of all CpG sites was calculated as the methylation value of STAMP-EP8 in the sample;
8. Analysis of results: STAMP-EP8 methylation levels were compared between the paraganglioma/non-cancerous control group and the tumor experimental group.
実施例４：白血病－臨床サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた８例の非白血病骨髄スミアサンプルをコントロールグループとし、８例の白血病骨髄スミアサンプルを実験グループとし、上記実施例３のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルを比較した。
Example 4: Leukemia - validation of clinical samples - pyrosequencing method Eight non-leukemic bone marrow smear samples obtained from clinical trials were used as the control group, and eight leukemic bone marrow smear samples were used as the experimental group. The STAMP-EP8 methylation levels of the control group and the experimental group were compared using the pyrosequencing step described in Example 3 above.
結果は、図６に示されたように、白血病臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しく非癌性組織より高い。 As shown in Figure 6, the methylation level of STAMP-EP8 in the experimental group in leukemia clinical samples was significantly higher than that in non-cancerous tissues.
実施例５：乳がん－臨床サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた５例の乳がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、５例の乳がん組織サンプルを実験グループとし、上記実施例３のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルを比較した。
Example 5: Breast cancer - validation of clinical samples - pyrosequencing method Five breast cancer paraganglioma samples obtained from clinical trials were used as the control group, and five breast cancer tissue samples were used as the experimental group. The STAMP-EP8 methylation levels of the control group and the experimental group were compared using the pyrosequencing step described in Example 3 above.
結果は図７に示されたように、乳がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。 As shown in Figure 7, the methylation level of STAMP-EP8 in the experimental group in breast cancer clinical samples was significantly higher than that in paraganglioma tissues.
実施例６：結腸直腸がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた８例の結腸直腸がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、８例の結腸直腸がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
Example 6: Colorectal cancer - validation of clinical case samples - pyrosequencing method Eight clinically obtained colorectal cancer paraganglioma samples were used as the control group, and eight clinically obtained colorectal cancer samples were used as the experimental group. The methylation levels of STAMP-EP8 were analyzed by the pyrosequencing step of Example 3.
結果は図８に示されたように、結腸直腸がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。 As shown in Figure 8, the methylation level of STAMP-EP8 in the experimental group in colorectal cancer clinical samples was significantly higher than that in paraganglioma tissues.
実施例７：食道がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた１０例の食道がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、１０例の食道がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
Example 7: Esophageal cancer - verification of clinical case samples - pyrosequencing method Ten esophageal cancer paraganglioma samples obtained from clinical trials were used as the control group, and ten esophageal cancer samples were used as the experimental group, and the methylation levels of STAMP-EP8 were analyzed by the pyrosequencing step of Example 3.
結果は図９に示されたように、食道がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。 As shown in Figure 9, the methylation level of STAMP-EP8 in the experimental group in esophageal cancer clinical samples was significantly higher than that in paraganglioma tissues.
実施例８：肝臓がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた８例の肝臓がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、８例の肝臓がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
Example 8: Liver cancer - verification of clinical case samples - pyrosequencing method Eight liver cancer paraganglioma samples obtained from clinical trials were used as the control group, and eight liver cancer samples were used as the experimental group. The methylation levels of STAMP-EP8 were analyzed by the pyrosequencing step of Example 3.
結果は図１０に示されたように、肝臓がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。 As shown in Figure 10, the methylation level of STAMP-EP8 in the experimental group in liver cancer clinical samples was significantly higher than that in paraganglioma tissues.
実施例９：肺がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた４例の肺がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、４例の肺がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
Example 9: Lung cancer - verification of clinical case samples - pyrosequencing method Four lung cancer paraganglioma samples obtained from clinical trials were used as the control group, and four lung cancer samples were used as the experimental group. The methylation levels of STAMP-EP8 were analyzed by the pyrosequencing step of Example 3.
結果は図１１に示されたように、肺がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。 As shown in Figure 11, the methylation level of STAMP-EP8 in the experimental group in lung cancer clinical samples was significantly higher than that in paraganglioma tissues.
実施例１０：膵臓がん－臨床サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた４例の膵臓がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、４例の膵臓がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
Example 10: Pancreatic cancer - validation of clinical samples - pyrosequencing method Four pancreatic cancer paraganglioma samples obtained from clinical trials were used as the control group, and four pancreatic cancer samples were used as the experimental group. The methylation levels of STAMP-EP8 were analyzed by the pyrosequencing step of Example 3.
結果は図１２に示されたように、膵臓がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。 As shown in Figure 12, the methylation level of STAMP-EP8 in the pancreatic cancer clinical samples in the experimental group was significantly higher than that in the paraganglioma tissues.
本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきことは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。 All references mentioned in this application are incorporated herein by reference as if each reference were incorporated solely by reference. It should be understood that based on the above disclosure of the present invention, one skilled in the art may make various changes or modifications to the present invention, and these equivalents are also included within the scope of the claims appended hereto.
Claims (18)
単離されたポリヌクレオチドを提供するステップ（ｉ）であって、
前記単離されたポリヌクレオチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 前記（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメント；及び／又は
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸；
を含む、ステップ（ｉ）と、
前記ポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出する検出試薬をデザインし、前記標的配列には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメントが存在するステップ（ｉｉ）と、
を含み、
前記修飾は、５－メチル化修飾であり、
前記腫瘍検出用の試薬は、複数の腫瘍を検出できる、
方法。 1. A method for preparing a reagent for tumor detection, comprising:
2. Step (i) of providing an isolated polynucleotide, comprising:
The isolated polynucleotide comprises:
(a) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1;
(b) a fragment of the polynucleotide of (a), which comprises the sequence set forth in positions 204 to 223 or 1 to 478 of SEQ ID NO: 1; and/or (c) a nucleic acid complementary to the polynucleotide or fragment of (a) or (b);
Step (i) comprising:
(ii) designing a detection reagent for specifically detecting the modification status of a CpG site in a target sequence, the entire length or a fragment of the polynucleotide being used as a target sequence, the target sequence being a fragment of the sequence shown in positions 204 to 223 or 1 to 478 of SEQ ID NO: 1;
Including,
the modification is a 5-methylation modification,
The tumor detection reagent is capable of detecting multiple tumors.
method.
食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんを含む消化器系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんを含む婦人科および生殖器系の腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む血液系腫瘍;肺がん、胸膜腫を含む呼吸器系腫瘍;神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫を含む神経系腫瘍;口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんを含む頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんを含む泌尿器系腫瘍;皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんを含む皮膚および他の系の腫瘍からなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。 The plurality of tumors include
tumors of the digestive system, including esophageal cancer, gastric cancer, colorectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, and gallbladder cancer; tumors of the gynecological and reproductive system, including breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, vulvar cancer, testicular cancer, prostate cancer, and penile cancer; tumors of the blood system, including leukemia, lymphoma, and multiple myeloma; tumors of the respiratory system, including lung cancer and pleurioma; tumors of the nervous system, including glioma, neuroblastoma, and meningioma; tumors of the head and neck, including oral cancer, tongue cancer, laryngeal cancer, and nasopharyngeal cancer; tumors of the urinary system, including kidney cancer and bladder cancer; tumors of the skin and other systems, including skin cancer, melanoma, osteosarcoma, liposarcoma, and thyroid cancer,
The method of claim 1.
前記プライマーは、
SEQ ID NO:５に示されたプライマーとSEQ ID NO:６に示されたプライマー；
SEQ ID NO:７に示されたプライマーとSEQ ID NO:８に示されたプライマー；
SEQ ID NO:９に示されたプライマーとSEQ ID NO:１０に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１１に示されたプライマーとSEQ ID NO:１２に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１３に示されたプライマーとSEQ ID NO:１４に示されたプライマー；又は
SEQ ID NO:１５に示されたプライマーとSEQ ID NO:１６に示されたプライマーである、
請求項１または２に記載の方法。 the detection reagent comprises a primer,
The primer is
A primer shown in SEQ ID NO:5 and a primer shown in SEQ ID NO:6;
A primer set forth in SEQ ID NO:7 and a primer set forth in SEQ ID NO:8;
A primer set forth in SEQ ID NO:9 and a primer set forth in SEQ ID NO:10;
A primer set forth in SEQ ID NO:11 and a primer set forth in SEQ ID NO:12;
A primer set forth in SEQ ID NO:13 and a primer set forth in SEQ ID NO:14; or
A primer set forth in SEQ ID NO: 15 and a primer set forth in SEQ ID NO: 16.
The method according to claim 1 or 2.
（ｅ） 前記（ｄ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４若しくは３の２４７８～２４９７位、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４若しくは３の２２２３～２７００位に示される配列からなるフラグメント；
を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。 (d) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4;
(e) a fragment of the polynucleotide of (d), comprising the sequence shown in positions 2478 to 2497 of SEQ ID NO: 4 or 3, or positions 2223 to 2700 of SEQ ID NO: 4 or 3;
5. The method of claim 4 , comprising:
前記単離されたポリヌクレオチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 前記（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメント；及び／又は
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸；
を含み、
前記単離されたポリヌクレオチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメントが存在し、
前記腫瘍検出用の試薬は、複数の腫瘍を検出でき、前記複数の腫瘍は、
食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんを含む消化器系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんを含む婦人科および生殖器系の腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む血液系腫瘍;肺がん、胸膜腫を含む呼吸器系腫瘍;神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫を含む神経系腫瘍;口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんを含む頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんを含む泌尿器系腫瘍;皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんを含む皮膚および他の系の腫瘍からなる群から選択される、
使用。 Use of a reagent for detecting a methylation profile of a CpG site of an isolated polynucleotide in the preparation of a reagent or kit for detecting a tumor, comprising:
The isolated polynucleotide comprises:
(a) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1;
(b) a fragment of the polynucleotide of (a), which comprises the sequence set forth in positions 204 to 223 or 1 to 478 of SEQ ID NO: 1; and/or (c) a nucleic acid complementary to the polynucleotide or fragment of (a) or (b);
Including,
The isolated polynucleotide comprises a fragment of the sequence shown in positions 204-223 or 1-478 of SEQ ID NO:1;
The tumor detection reagent is capable of detecting a plurality of tumors, the plurality of tumors being:
tumors of the digestive system, including esophageal cancer, gastric cancer, colorectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, and gallbladder cancer; tumors of the gynecological and reproductive system, including breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, vulvar cancer, testicular cancer, prostate cancer, and penile cancer; tumors of the blood system, including leukemia, lymphoma, and multiple myeloma; tumors of the respiratory system, including lung cancer and pleurioma; tumors of the nervous system, including glioma, neuroblastoma, and meningioma; tumors of the head and neck, including oral cancer, tongue cancer, laryngeal cancer, and nasopharyngeal cancer; tumors of the urinary system, including kidney cancer and bladder cancer; tumors of the skin and other systems, including skin cancer, melanoma, osteosarcoma, liposarcoma, and thyroid cancer,
use.
前記プライマーは、
SEQ ID NO:５に示されたプライマーとSEQ ID NO:６に示されたプライマー；
SEQ ID NO:７に示されたプライマーとSEQ ID NO:８に示されたプライマー；
SEQ ID NO:９に示されたプライマーとSEQ ID NO:１０に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１１に示されたプライマーとSEQ ID NO:１２に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１３に示されたプライマーとSEQ ID NO:１４に示されたプライマー；又は
SEQ ID NO:１５に示されたプライマーとSEQ ID NO:１６に示されたプライマーである、ことを特徴とする請求項６に記載の使用。 The detection reagent comprises a primer,
The primer is
A primer shown in SEQ ID NO:5 and a primer shown in SEQ ID NO:6;
A primer set forth in SEQ ID NO:7 and a primer set forth in SEQ ID NO:8;
A primer set forth in SEQ ID NO:9 and a primer set forth in SEQ ID NO:10;
A primer set forth in SEQ ID NO:11 and a primer set forth in SEQ ID NO:12;
A primer set forth in SEQ ID NO:13 and a primer set forth in SEQ ID NO:14; or
The use according to claim 6 , characterized in that the primers are those shown in SEQ ID NO:15 and SEQ ID NO:16.
前記ポリヌクレオチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 前記（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメント；及び／又は
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸；
を含み、
単離された前記ポリヌクレオチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメントが存在し、
前記検出用の試薬が、プライマーを含み、
前記プライマーは、
SEQ ID NO:5に示されたプライマーとSEQ ID NO:6に示されたプライマー;
SEQ ID NO:7に示されたプライマーとSEQ ID NO:8に示されたプライマー;
SEQ ID NO:9に示されたプライマーとSEQ ID NO:10に示されたプライマー;
SEQ ID NO:11に示されたプライマーとSEQ ID NO:12に示されたプライマー;
SEQ ID NO:13に示されたプライマーとSEQ ID NO:14に示されたプライマー;又は
SEQ ID NO:15に示されたプライマーとSEQ ID NO:16に示されたプライマーであり、
前記修飾は、５－メチル化修飾である、
ＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬。 A tumor detection reagent or combination of reagents for specifically detecting the modification status of a CpG site in a target sequence, the target sequence comprising a full-length or fragment of a polynucleotide,
The polynucleotide is
(a) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1;
(b) a fragment of the polynucleotide of (a), which comprises the sequence set forth in positions 204 to 223 or 1 to 478 of SEQ ID NO: 1; and/or (c) a nucleic acid complementary to the polynucleotide or fragment of (a) or (b);
Including,
The isolated polynucleotide comprises a fragment of the sequence shown in positions 204-223 or 1-478 of SEQ ID NO: 1;
The detection reagent comprises a primer,
The primer is
A primer shown in SEQ ID NO:5 and a primer shown in SEQ ID NO:6;
A primer shown in SEQ ID NO:7 and a primer shown in SEQ ID NO:8;
A primer shown in SEQ ID NO:9 and a primer shown in SEQ ID NO:10;
A primer shown in SEQ ID NO:11 and a primer shown in SEQ ID NO:12;
A primer set forth in SEQ ID NO:13 and a primer set forth in SEQ ID NO:14; or
A primer set forth in SEQ ID NO: 15 and a primer set forth in SEQ ID NO: 16,
the modification is a 5-methylation modification;
A reagent or combination of reagents for tumor detection to specifically detect the modification status of CpG sites.
を含むことを特徴とする検出キット。 A detection kit comprising a container and a tumor detection reagent or a combination of reagents for specifically detecting the modification status of a CpG site according to any one of claims 10 to 12 contained in the container.
をさらに含む、請求項１～５のいずれか一つに記載の方法。 (iii) analyzing the modification status of the CpG site;
The method of any one of claims 1 to 5 , further comprising:
前記分析する方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化チップ法、ｑＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンス法、３世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、メチル化特異的ＰＣＲ、又はそれらの組み合わせ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示された配列における一部又は全部のメチル化サイトの組み合わせた遺伝子グループの生体外での検出方法及び生体内トレーサー検出方法を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。 In the step (iii), the modification status of the CpG site is methylation, and analyzing the methylation status;
The method of claim 16, wherein the analyzing method comprises pyrosequencing, bisulfite sequencing, methylation chip, qPCR, digital PCR, next generation sequencing, third generation sequencing, whole genome methylation sequencing, DNA enrichment detection, Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) technology, HPLC, MassArray, methylation specific PCR, or a combination thereof, and an in vitro detection method and an in vivo tracer detection method of a combination of gene groups of some or all of the methylation sites in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 .
（１）ステップ（ｉ）の産物における未修飾のシトシンがウラシルに変換するようにバイサルファイトで前記ステップ（ｉ）の産物を処理すること；
（２）（１）で処理された核酸における前記標的配列の修飾状況を分析すること；
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 The step (ii)
(1) treating the product of step (i) with bisulfite to convert unmodified cytosines in the product of step (i) to uracils;
(2) analyzing the modification status of the target sequence in the nucleic acid treated in (1);
3. The method according to claim 1 or 2, comprising:
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