JP7579564B2

JP7579564B2 - Ｒｂ１陽性癌の治療用医薬組成物及びキット

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Publication number: JP7579564B2
Application number: JP2020180429A
Authority: JP
Inventors: 智聡高橋; 晋河野; 金丹盛
Original assignee: Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2024-11-08
Anticipated expiration: 2040-10-28
Also published as: JP2022071454A

Description

本発明は、ＲＢ１陽性癌の治療用医薬組成物及びキットに関する。より詳細には、本発明は、ＲＢ１陽性癌の治療用医薬組成物、ＲＢ１陽性癌の治療用キット、癌患者への医薬の投与の有効性を試験する方法、癌患者への医薬の投与の有効性を試験するためのキットに関する。

現在、肝細胞癌を含む多種類の癌に対する、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４及び６阻害剤の単剤投与の有効性が、第ＩＩ相臨床試験で検討されている（非特許文献１）。

Schettini F., et al., CDK 4/6 Inhibitors as Single Agent in Advanced Solid Tumors, Front Oncol., 8, 608, 2018.

しかしながら、発明者らは、インビトロ及びインビボでの検討において、ＣＤＫ４及び６阻害剤の癌細胞株への単剤投与は、効果を示すものの最適ではないことを明らかにした。本発明は、ＲＢ１陽性癌を効果的に治療する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせ、を有効成分として含有する、ＲＢＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＣｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ１（ＲＢ１）陽性癌の治療用医薬組成物。
［２］前記ＣＤＫ４及び６阻害剤が、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号：５７１１９０－３０－２）、リボシクリブ（ＣＡＳ番号：１２１１４４１－９８－３）、アベマシクリブ（ＣＡＳ番号：１２３１９２９－９７－７）、トリラシクリブ（ＣＡＳ番号：１３７４７４３－００－６）又はレロシクリブ（ＣＡＳ番号：１６２８２５６－２３－４）である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤の組み合わせを有効成分として含有し、前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＫＫβ阻害剤又はＮＦ－κＢ阻害剤である、［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤がＩＫＫβ阻害剤であり、前記ＩＫＫβ阻害剤が、Ｂａｙ１１－７０８２（ＣＡＳ番号：１９５４２－６７－７）、ＩＭＤ－０３５４（ＣＡＳ番号：９７８－６２－１）、ＩＭＤ－１０４１（ＣＡＳ番号：１０７３６６６－７３－５）、ＩＭＤ－２５６０、ＴＰＣＡ１（ＣＡＳ番号：５０７４７５－１７－４）、ＢＯＴ－６４（ＣＡＳ番号：１１３７６０－２９－５）、ＢＭＳ３４５５４１（ＣＡＳ番号：４４５４３０－５８－０）、ＳＣ－５１４（ＣＡＳ番号：３５４８１２－１７－２）、ＩＫＫ－１６（ＣＡＳ番号：１１８６１９５－６２－９）、エルチプロタフィブ（ＣＡＳ番号：２５１３０３－０４－５）及びＢａｙ６５－１９４２（ＨＣｌｓａｌｔ）（ＣＡＳ番号：６００７３４－０６－３）からなる群より選択される、［３］に記載の医薬組成物。
［５］前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤がＮＦ－κＢ阻害剤であり、前記ＮＦ－κＢ阻害剤が、ＱＮＺ（ＣＡＳ番号：５４５３８０－３４－５）、ＪＳＨ－２３（ＣＡＳ番号：７４９８８６－８７－１）、ＧＹＹ４１３７（ＣＡＳ番号：１０６７４０－０９－４）、ｐ－ＸＳＣ（ＣＡＳ番号：８５５３９－８３－９）、ＣＶ３９８８（ＣＡＳ番号：８５７０３－７３－７）、プロスタグランジンＥ２（ＣＡＳ番号：３６３－２４－６）、ＬＹ２９４００２（ＣＡＳ番号：１５４４４７－３６－６）、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ＣＡＳ番号：１９５４５－２６－７）、メサラミン（ＣＡＳ番号：８９－５７－６）、ロリプラム（ＣＡＳ番号：８５４１６－７５－７）、没食子酸（ＣＡＳ番号：１４９－９１－７）、アナカルジン酸（ＣＡＳ番号：１６６１１－８４－０）、ＭＧ－１１５（ＣＡＳ番号：１３３４０７－８６－０）、ＭＧ－１３２（ＣＡＳ番号：１３３４０７－８２－６）、ラクタシスチン（ＣＡＳ番号：１３３３４３－３４－７）、エポキソミシン（ＣＡＳ番号：１３４３８１－２１－８）、パルテノリド（ＣＡＳ番号：２０５５４－８４－１）、カルフィルゾミブ（ＣＡＳ番号：８６８５４０－１７－４）、ボルテゾミブ（ＣＡＳ番号：１７９３２４－６９－７）、ＭＬＮ－４９２４（ＣＡＳ番号：９０５５７９－５１－３）、デランゾミブ（ＣＡＳ番号：８４７４９９－２７－８）、イキサゾミブ（ＣＡＳ番号：１２３９９０８－２０－３）、マリゾミブ（ＣＡＳ番号：４３７７４２－３４－２）及びオプロゾミブ（ＣＡＳ番号：９３５８８８－６９－０）からなる群より選択される、［３］に記載の医薬組成物。
［６］ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の組み合わせを有効成分として含有し、前記ＡＫＴ阻害剤が、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸ（ＣＡＳ番号：９２５６８１－４１－０）、イパタセルチブ（ＣＡＳ番号：１００１２６４－８９－６）、カピバセルチブ（ＣＡＳ番号：１１４３５３２－３９－１）、ミラセルチブ（ＣＡＳ番号：１３１３８８１－７０－７）、アフレセルチブ（ＣＡＳ番号：１０４７６４４－６２－１）、ユプロセルチブ（ＣＡＳ番号：１０４７６３４－６５－０）、リン酸トリシリビン（ＣＡＳ番号：６１９６６－０８－３）及びＭＫ２２０６（ＣＡＳ番号：１０３２３５０－１３－２）からなる群より選択される、［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［７］前記ＲＢ１陽性癌が、肝細胞癌、乳癌、肺癌又は大腸癌である、［１］～［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤、を含む、ＲＢ１陽性癌の治療用キット。
［９］癌患者由来の癌細胞が、ＲＢ１陽性であるか否かを検査する工程を含み、前記癌細胞がＲＢ１陽性であることが、前記癌患者の治療に、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であることを示す、癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験する方法。
［１０］ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は、ＲＢ１タンパク質に対する特異的結合物質、を含み、癌患者由来の癌細胞が、ＲＢ１陽性であるか否かの検査に用いられ、前記癌細胞が、ＲＢ１陽性であることが、前記癌患者の治療に、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であることを示す、前記癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験するためのキット。

本発明によれば、ＲＢ１陽性癌を効果的に治療する技術を提供することができる。

ＲＢ１へのＣＤＫ４及び６阻害剤の作用を説明する模式図である。（ａ）は、ＱＫＯマウスの作製手順を説明する模式図である。（ｂ）は、ＱＫＯマウスの肝臓に形成された腫瘍の代表的な写真である。（ａ）は実験例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の結果に基づいて作成したグラフである。実験例３におけるスクリーニングの結果を示すグラフである。実験例４におけるＢａｙ１１－７０８２を用いた検討において、細胞の生存率を示すグラフである。実験例４におけるＢａｙ１１－７０８２を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例４におけるＩＭＤ－０３５４を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例４におけるＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡを用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例４における初代肝細胞癌細胞（ＱＫＯＰＨＣＣ）を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＨｕｈ７細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＬｉ－７細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＨ１９７５細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＨＣＣ１１４３細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＴ４７Ｄ細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＨＣＴ－１１６細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５におけるＤＬＤ－１細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５のリボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２を併用した検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例５のアベマシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２を併用した検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例６において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例７におけるＨｅｐＧ２細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例７におけるＳＷ４８０細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例７におけるＨＣＴ－１１６細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例７におけるＤＬＤ－１細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例７におけるＡ５４９細胞を用いた検討において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例８において、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。実験例９のＨｅｐＧ２細胞を移植した担癌マウスモデルによる検討における、腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。実験例９のＬｉ－７細胞を移植した担癌マウスモデルによる検討における、腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。実験例９の、テトラサイクリン誘導性にマウスＲｂ１を発現するＱＫＯＰＨＣＣ細胞を移植した担癌マウスモデルによる検討における、腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。

［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、マウス遺伝子は、先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。また、マウスタンパク質は大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、マウス遺伝子を厳密に区別せずに表す場合がある。また、ヒトタンパク質、マウスタンパク質を厳密に区別せずに表す場合がある。

［医薬組成物又はキット］
１実施形態において、本発明は、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせ、を有効成分として含有する、ＲＢ１陽性癌の治療用医薬組成物を提供する。

医薬組成物は、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤が混合された医薬組成物であってもよい。あるいは、医薬組成物は、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤が混合された医薬組成物であってもよい。

また、１実施形態において、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤は、混合されておらず、それぞれ別々の容器に収容されており、治療用キットを構成していてもよい。治療用キットの場合、これらの薬物は混合されていないが、組み合わせて投与される。

治療用キットは、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤の組み合わせを含んでいてもよい。あるいは、治療用キットは、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の組み合わせを含んでいてもよい。

実施例において後述するように、発明者らは、インビトロ及びインビボにおいて、ＣＤＫ４及び６阻害剤と、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤又はＡＫＴ阻害剤とを併用することにより、ＲＢ１陽性の癌細胞を効果的に殺傷することができることを明らかにした。

図１は、ＲＢ１へのＣＤＫ４及び６阻害剤の作用を説明する模式図である。ＲＢ１は、有糸分裂の直後には脱リン酸化されている。活性化したＣＤＫ４及び６は、ＲＢ１をモノリン酸化する。ＲＢ１がモノリン酸化されると、ＣＤＫ２複合体がＲＢ１の完全なリン酸化を達成する。ＣＤＫ４及び６の活性の阻害は、ＲＢ１のモノリン酸化を阻害する。その結果、ＲＢ１はリン酸化されていない状態で長期間維持されることになる。その結果、細胞周期停止だけでなく、老化、アポトーシス、免疫原性の増強等が誘導される。

ＲＢ１陽性癌とは、腫瘍を構成する癌細胞がＲＢ１を発現している癌を意味する。ＲＢ１陽性癌が発現するＲＢ１は、変異を有していてもよいが、上述した野生型のＲＢ１の機能を維持していることが好ましく、野生型のＲＢ１であることが好ましい。具体的なＲＢ１陽性癌としては、肝細胞癌、乳癌、肺癌、大腸癌等が挙げられる。

ヒトＲＢ１のｃＤＮＡのアクセッション番号はＮＭ＿０００３２１．３である。また、ヒトＲＢ１タンパク質のアクセッション番号はＮＰ＿０００３１２．２である。また、マウスＲｂ１のｃＤＮＡのアクセッション番号はＮＭ＿００９０２９．２である。また、マウスＲＢ１タンパク質のアクセッション番号はＮＰ＿０３３０５５．２である。

本実施形態の医薬組成物において、ＣＤＫ４及び６阻害剤としては、ＣＤＫ４及び６とサイクリンＤからなる複合体の活性を阻害する薬物を用いることができる。ＣＤＫ４及び６阻害剤は、低分子化合物であってもよいし、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６又はサイクリンＤに対する阻害性核酸であってもよい。阻害性核酸としては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。

より具体的なＣＤＫ４及び６阻害剤としては、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号：５７１１９０－３０－２）、リボシクリブ（ＣＡＳ番号：１２１１４４１－９８－３）、アベマシクリブ（ＣＡＳ番号：１２３１９２９－９７－７）、トリラシクリブ（ＣＡＳ番号：１３７４７４３－００－６）、レロシクリブ（ＣＡＳ番号：１６２８２５６－２３－４）等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

また、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤としては、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を遮断する薬物を用いることができる。

ＮＦ－κＢシグナル伝達経路とは、ＩＫＫα、ＩＫＫβ及びＩＫＫγ（ＮＥＭＯ）からなるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）が、ＩκＢに結合して不活性化しているＮＦ－κＢの、ＩκＢをリン酸化してユビキチン化及び分解を導き、その結果、ＮＦ－κＢが細胞質から核に移行して遺伝子転写を活性化する経路である。

ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤は、例えば、ＩＫＫβ阻害剤であってもよいし、ＮＦ－κＢ阻害剤であってもよい。これらは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤は、低分子化合物であってもよいし、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫγ（ＮＥＭＯ）、ＩκＢ、ＮＦ－κＢ等に対する阻害性核酸であってもよい。阻害性核酸としては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。

具体的なＩＫＫβ阻害剤としては、Ｂａｙ１１－７０８２（ＣＡＳ番号：１９５４２－６７－７）、ＩＭＤ－０３５４（ＣＡＳ番号：９７８－６２－１）、ＩＭＤ－１０４１（ＣＡＳ番号：１０７３６６６－７３－５）、ＩＭＤ－２５６０、ＴＰＣＡ１（ＣＡＳ番号：５０７４７５－１７－４）、ＢＯＴ－６４（ＣＡＳ番号：１１３７６０－２９－５）、ＢＭＳ３４５５４１（ＣＡＳ番号：４４５４３０－５８－０）、ＳＣ－５１４（ＣＡＳ番号：３５４８１２－１７－２）、ＩＫＫ－１６（ＣＡＳ番号：１１８６１９５－６２－９）、エルチプロタフィブ（ＣＡＳ番号：２５１３０３－０４－５）、Ｂａｙ６５－１９４２（ＨＣｌｓａｌｔ）（ＣＡＳ番号：６００７３４－０６－３）等が挙げられる。

また、具体的なＮＦ－κＢ阻害剤としては、ＱＮＺ（ＣＡＳ番号：５４５３８０－３４－５）、ＪＳＨ－２３（ＣＡＳ番号：７４９８８６－８７－１）、ＧＹＹ４１３７（ＣＡＳ番号：１０６７４０－０９－４）、ｐ－ＸＳＣ（ＣＡＳ番号：８５５３９－８３－９）、ＣＶ３９８８（ＣＡＳ番号：８５７０３－７３－７）、プロスタグランジンＥ２（ＣＡＳ番号：３６３－２４－６）、ＬＹ２９４００２（ＣＡＳ番号：１５４４４７－３６－６）、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ＣＡＳ番号：１９５４５－２６－７）、メサラミン（ＣＡＳ番号：８９－５７－６）、ロリプラム（ＣＡＳ番号：８５４１６－７５－７）、没食子酸（ＣＡＳ番号：１４９－９１－７）、アナカルジン酸（ＣＡＳ番号：１６６１１－８４－０）、ＭＧ－１１５（ＣＡＳ番号：１３３４０７－８６－０）、ＭＧ－１３２（ＣＡＳ番号：１３３４０７－８２－６）、ラクタシスチン（ＣＡＳ番号：１３３３４３－３４－７）、エポキソミシン（ＣＡＳ番号：１３４３８１－２１－８）、パルテノリド（ＣＡＳ番号：２０５５４－８４－１）、カルフィルゾミブ（ＣＡＳ番号：８６８５４０－１７－４）、ボルテゾミブ（ＣＡＳ番号：１７９３２４－６９－７）、ＭＬＮ－４９２４（ＣＡＳ番号：９０５５７９－５１－３）、デランゾミブ（ＣＡＳ番号：８４７４９９－２７－８）、イキサゾミブ（ＣＡＳ番号：１２３９９０８－２０－３）、マリゾミブ（ＣＡＳ番号：４３７７４２－３４－２）及びオプロゾミブ（ＣＡＳ番号：９３５８８８－６９－０）等が挙げられる。

本実施形態の医薬組成物は、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の組み合わせ、を有効成分として含有するものであってもよい。ＣＤＫ４及び６阻害剤については上述したものと同様である。ＡＫＴ阻害剤は、低分子化合物であってもよいし、ＡＫＴに対する阻害性核酸であってもよい。阻害性核酸としては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。

ＡＫＴ阻害剤としては、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸ（ＣＡＳ番号：９２５６８１－４１－０）、イパタセルチブ（ＣＡＳ番号：１００１２６４－８９－６）、カピバセルチブ（ＣＡＳ番号：１１４３５３２－３９－１）、ミラセルチブ（ＣＡＳ番号：１３１３８８１－７０－７）、アフレセルチブ（ＣＡＳ番号：１０４７６４４－６２－１）、ユプロセルチブ（ＣＡＳ番号：１０４７６３４－６５－０）、リン酸トリシリビン（ＣＡＳ番号：６１９６６－０８－３）、ＭＫ２２０６（ＣＡＳ番号：１０３２３５０－１３－２）等が挙げられる。

ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤は、薬学的に許容される担体と混合されて、医薬組成物として製剤化されていてもよい。

あるいは、ＣＤＫ４及び６阻害剤、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤、ＡＫＴ阻害剤は、薬学的に許容される担体と混合されて、それぞれ別々に医薬組成物として製剤化されて治療用キットを構成していてもよい。

医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていることが好ましい。医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。

薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。

医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。

医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

ＣＤＫ４及び６阻害剤の投与量は、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約７５～４００ｍｇ、例えば約７５～１２５ｍｇ、例えば約１００～４００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。非経口的に投与する場合、その投与量は、患者の症状、対象臓器、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約３０～２００ｍｇ、例えば約３０～６０ｍｇ、例えば約５０～２００ｍｇ程度を、１～１０日に１回程度投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約７．５～４０ｍｇ、例えば約７．５～１２．５ｍｇ、例えば約１０～４０ｍｇ程度を、１～１０日に１回程度投与することが適切であると考えられる。

ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤の投与量は、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約５０～９００ｍｇ、例えば約３００～９００ｍｇ、例えば約２～５ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。非経口的に投与する場合、その投与量は、患者の症状、対象臓器、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約２～２００ｍｇ、例えば約２～５ｍｇ、例えば約５０～２００ｍｇ程度を、１～１０日に１回程度投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約２～１００ｍｇ、例えば約２～５０ｍｇ、例えば約１０～１００ｍｇ程度を、１～１０日に１回程度投与することが適切であると考えられる。

ＡＫＴ阻害剤の投与量は、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約２００～６００ｍｇ、例えば約２００～４００ｍｇ、例えば約３００～６００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。非経口的に投与する場合、その投与量は、患者の症状、対象臓器、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１００～８００ｍｇ、例えば約１００～５００ｍｇ、例えば約４００～８００ｍｇ程度を、１～１０日に１回程度投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１０～１００ｍｇ、例えば約１０～２５ｍｇ、例えば約３０～１００ｍｇ程度を、１～１０日に１回程度投与することが適切であると考えられる。

［癌患者への投与の有効性を試験する方法］
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の癌細胞が、ＲＢ１陽性であるか否かを検査する工程を含み、前記癌細胞がＲＢ１陽性であることが、前記癌患者の治療に、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であることを示す、癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験する方法を提供する。

実施例において後述するように、癌細胞がＲＢ１陽性であると、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与により、癌細胞を効果的に殺傷することができることを明らかにした。

癌細胞がＲＢ１陽性であるとは、癌細胞がＲＢ１を発現していることを意味する。癌細胞が発現するＲＢ１は、変異を有していてもよいが、上述した野生型のＲＢ１の機能を維持していることが好ましく、野生型のＲＢ１であることが好ましい。

癌細胞がＲＢ１陽性であるか否かは、例えば、癌細胞のゲノムＤＮＡ上のＲＢ１遺伝子座のＰＣＲ増幅、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡのマイクロアレイによる検出、ＲＢ１タンパク質のＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫化学染色等により行うことができる。上記のＰＣＲ増幅産物をシーケンスして、ＲＢ１遺伝子に変異が存在するか否かを解析してもよい。

［癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験するためのキット］
１実施形態において、本発明は、ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は、ＲＢ１タンパク質に対する特異的結合物質、を含み、癌患者由来の癌細胞が、ＲＢ１陽性であるか否かの検査に用いられ、前記癌細胞が、ＲＢ１陽性であることが、前記癌患者の治療に、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であることを示す、前記癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験するためのキットを提供する。

本実施形態のキットは、上述した、癌患者への、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与の有効性を試験する方法の実施に好適に利用することができる。

（ゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット）
本実施形態のキットは、ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセットを含んでいてもよい。プライマーセットの塩基配列は、ゲノム上のＲＢ１遺伝子を増幅することができれば特に限定されない。

癌患者由来の癌細胞のゲノムＤＮＡを、ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセットで増幅すると、癌細胞がゲノムＤＮＡ上にＲＢ１遺伝子を保持していた場合には、ＲＢ１遺伝子の増幅が認められる。

癌患者由来の癌細胞がＲＢ１遺伝子を保持していた場合には、癌患者への、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であると判断することができる。

（ゲノムＤＮＡに対するプローブ）
本実施形態のキットは、ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブを含んでいてもよい。プローブの塩基配列は、ゲノム上のＲＢ１遺伝子を検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。

癌患者由来の癌細胞のゲノムＤＮＡにＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブをハイブリダイズさせると、癌細胞がゲノムＤＮＡ上にＲＢ１遺伝子を保持していた場合には、プローブがハイブリダイズし、ＲＢ１遺伝子の存在を検出することができる。

（ｃＤＮＡ増幅用プライマーセット）
本実施形態のキットは、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセットを含んでいてもよい。プライマーセットの塩基配列は、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができれば特に限定されない。

癌患者由来の癌細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲにより増幅すると、癌細胞がＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡを発現していた場合には、ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡの増幅が認められる。

癌患者由来の癌細胞がＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡを発現していた場合には、癌患者への、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であると判断することができる。

（ｍＲＮＡに対するプローブ）
本実施形態のキットは、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブを含んでいてもよい。プローブの塩基配列は、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。

癌患者由来の癌細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブをハイブリダイズさせると、癌細胞がＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡを発現していた場合には、プローブがハイブリダイズし、ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出することができる。

（特異的結合物質）
本実施形態のキットは、ＲＢ１タンパク質に対する特異的結合物質を含んでいてもよい。特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。特異的結合物質は、ＲＢ１タンパク質を検出することができれば特に限定されない。特異的結合物質は、固相に結合されて、例えば、フローストリップ、アレイ等を構成していてもよい。

癌患者由来の癌細胞からタンパク質を抽出し、ＲＢ１タンパク質に対する特異的結合物質を用いたＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングにより、ＲＢ１タンパク質の存在を検出することができる。あるいは、癌患者由来の癌組織の切片を、ＲＢ１タンパク質に対する特異的結合物質を用いた免疫化学染色に供することにより、ＲＢ１タンパク質の存在を検出することができる。

癌患者由来の癌細胞がＲＢ１タンパク質を発現していた場合には、癌患者への、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であると判断することができる。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、患者由来の癌細胞がＲＢ１陽性であるか否かを検査する工程と、前記癌細胞がＲＢ１陽性であった場合に、前記患者にＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせを投与する工程とを含む、癌の治療方法を提供する。

１実施形態において、本発明は、ＲＢ１陽性癌の治療のための、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの使用を提供する。

１実施形態において、本発明は、ＲＢ１陽性癌の治療用医薬組成物又は治療用キットの製造のための、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの使用を提供する。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、マウスを用いた実験は、金沢大学の動物実験委員会が承認したプロトコル（ＡＰ－１５３４２６）にしたがって行った。

［実験例１］
（ＲＢ経路の不活性化は肝細胞癌の発症を誘導した）
ＲＢファミリーには、ＲＢ１、ＲＢＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＣｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒＬｉｋｅ１（ＲＢＬ１）、ＲＢＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＣｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒＬｉｋｅ２（ＲＢＬ２）が存在する。

本実験例では、ＲＢＬ１遺伝子を欠失し、Ｒｂ１遺伝子及びＲｂｌ２遺伝子をコンディショナルにノックアウト可能なマウス（以下、「ＴＫＯマウス」という場合がある。）において、更にＴｕｍｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰ５３（Ｔｒｐ５３）遺伝子を欠失したマウス（以下、「ＱＫＯマウス」という場合がある。）を使用した。

図２（ａ）に示すように、Ｒｂ１^{ｌｏｘ／ｌｏｘ}；Ｒｂｌ１^－／－；Ｒｂｌ２^{ｌｏｘ／ｌｏｘ}；Ｔｒｐ５３^－／－（ＱＫＯ）マウスに、Ｃｒｅリコンビナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ピューロマイシン耐性タンパク質（Ｐｕｒｏ）をコードする遺伝子をタンデムに有するＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターコンストラクト（ｐＣＭＶ－Ｐｕｒｏ－Ｃｒｅ－ＩＲＥＳ２－ＧＦＰ）、及び、トランスポゼーゼをコードする発現ベクター（ｐＣＭＶ－ｈｙＰＢａｓｅ）を、流体力学的注入法により尾静脈注射した。

その結果、注射から３日後に、肝臓においてＧＦＰの蛍光が観察された。そして、図２（ｂ）に示すように、典型的には、注射から２．５か月後に、肝臓に腫瘍の形成が認められた。図２（ｂ）において、矢印は腫瘍を示す。

腫瘍から採取した初代肝細胞癌細胞（以下、「ＱＫＯＰＨＣＣ」という場合がある。）は、Ｋｉ６７及びα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の高発現を示した。これは、肝細胞癌の特徴である。以上の結果から、ＲＢ経路の不活性化は肝細胞癌の発症を誘導することが明らかとなった。

［実験例２］
（ＣＤＫ４／６阻害剤の投与は最適ではない）
ＲＢ７ＬＰは、ＲＢ１の変異体であり、リン酸化を受けない。ＲＢ７ＬＰは、ＲＢ１のＮ末端ドメインを欠失しているが、ポケットＡ、Ｂ、Ｃの全てを保持しているためＥ２Ｆ及びＬｘＣｘＥモチーフを有するタンパク質と結合することができる。しかしながら、リン酸化されることが知られている７つのセリン残基がリン酸化されないアミノ酸に置換されている。配列番号１にＲＢ７ＬＰのアミノ酸配列を示す。

したがって、ＲＢ７ＬＰは、ＣＤＫ４／６阻害剤のＲＢ１依存的な作用を模倣することができる。そこで、肝細胞癌細胞でＲＢ７ＬＰを発現させて、アポトーシスの誘導を検討した。

具体的には、ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２に、テトラサイクリン誘導性のＲＢ７ＬＰの発現ベクター（ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ）を導入した。この細胞（以下、「ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞」という場合がある。）は培地へのドキシサイクリンの添加によりＲＢ７ＬＰを発現する。

続いて、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞の培地に１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加して３日間インキュベートした。また、比較のためにドキシサイクリンを添加せずに同様にインキュベートした細胞を使用した。

続いて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、各細胞のアネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。

続いて、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて各細胞を解析した。アネキシンＶの蛍光値が高く、ＰＩの蛍光値が低い細胞は、アポトーシス初期の細胞であり、アネキシンＶの蛍光値及びＰＩの蛍光値の双方が高い細胞は、アポトーシス後期の細胞である。

図３（ａ）はフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図３（ａ）中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、横軸はアネキシンＶの蛍光強度を示し、縦軸はＰＩの蛍光強度を示す。

図３（ｂ）は、図３（ａ）の結果に基づいて作成したグラフである。図３（ｂ）では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。図３（ｂ）中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、「＊＊＊」は、対応のない両側スチューデントのt検定の結果、Ｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ＲＢ７ＬＰの発現誘導によるアポトーシスの誘導は不十分であることが明らかとなった。この結果は、癌細胞へのＣＤＫ４／６阻害剤の投与によるアポトーシスの誘導が不十分であることを示す。

［実験例３］
（ＲＢ７ＬＰの効果を増強する化合物のスクリーニング）
ドキシサイクリン存在下のＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞を特異的に殺傷する化合物を、化合物ライブラリからスクリーニングした。

化合物ライブラリとして、８０種類のキナーゼ阻害剤を含む市販のライブラリ（製品名「ＳＣＲＥＥＮ－ＷＥＬＬＫｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＬｉｂｒａｒｙ」、型番「ＢＭＬ－２８３２」、エンゾライフサイエンス社）を使用した。

１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞を３日間培養した。続いて、各細胞を９６ウェルプレートに２０，０００個／ウェルで播種し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で終濃度１μＭの各化合物に暴露し、２４時間インキュベートした。続いて、市販のキット（製品名「ＣｅｌｌｃｏｕｎｔｒｅａｇｅｎｔＳＦ」、ナカライテスク社）を用いて各細胞の生存率を測定した。

図４は、スクリーニングの結果を示すグラフである。グラフの縦軸は下記式（Ｆ１）で示される割合を示す。下記式（Ｆ１）中、「ＤＯＸ（＋）細胞」はドキシサイクリンの存在下で化合物に暴露した細胞を示し、「ＤＯＸ（－）細胞」はドキシサイクリンの非存在下で化合物に暴露した細胞を示す。
割合＝ＤＯＸ（－）細胞の生存率／ＤＯＸ（＋）細胞の生存率 …（Ｆ１）

また、横軸は化合物番号を示す。縦軸の値が高いほど、ＤＯＸ（＋）細胞特異的な細胞傷害性を有することを示す。その結果、ＩＫＫβ阻害剤であるＢａｙ１１－７０８２（ＣＡＳ番号：１９５４２－６７－７）が、ＤＯＸ（＋）細胞特異的な細胞傷害性を有することが明らかとなった。すなわち、Ｂａｙ１１－７０８２が、ＲＢ７ＬＰを発現誘導したＨｅｐＧ２細胞の細胞傷害性を増強することが明らかとなった。

［実験例４］
（ＲＢ７ＬＰの発現及びＩＫＫβ阻害剤の効果の検討）
ＨｅｐＧ２細胞及び初代肝細胞癌細胞（ＱＫＯＰＨＣＣ）において、ＲＢ７ＬＰの発現誘導及びＩＫＫβ阻害剤の添加による細胞傷害性を検討した。ＩＫＫβ阻害剤として、Ｂａｙ１１－７０８２、ＩＭＤ－０３５４（ＣＡＳ番号：９７８－６２－１）及びＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡを使用した。

《Ｂａｙ１１－７０８２を用いた検討》
１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞を３日間培養した。続いて、各細胞を６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、終濃度０，５，１０，１５，２０，２５μＭのＢａｙ１１－７０８２に暴露し、２４時間インキュベートした。続いて、市販のキット（製品名「ＣｅｌｌｃｏｕｎｔｒｅａｇｅｎｔＳＦ」、ナカライテスク社）を用いて各細胞の生存率を測定した。

図５は、各細胞の生存率を示すグラフである。その結果、１０～２０μＭのＢａｙ１１－７０８２が、ＲＢ７ＬＰの発現誘導に対して最も相乗的な効果を示すことが明らかとなった。

続いて、１５μＭのＢａｙ１１－７０８２に２４時間暴露したＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞について、実験例２と同様にして、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、アネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。

続いて、フローサイトメトリー解析を行い、アポトーシスを生じた細胞の割合を測定した。図６は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図６では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図６中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２の非存在下における結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」は終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下における結果であることを示す。また、「Ｚ－ＶＡＤ－」は、カスパーゼ阻害剤であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（カタログ番号「３１８８－ｖ」、株式会社ペプチド研究所）の非存在下における結果であることを示し、「Ｚ－ＶＡＤ＋」は、終濃度２０μＭのＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫの存在下における結果であることを示す。また、「＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ドキシサイクリンの存在下で１５μＭのＢａｙ１１－７０８２に暴露したＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞の８０％超がアポトーシスを生じたことが明らかとなった。また、このアポトーシスはＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫの添加により有意に抑制された。

この結果は、Ｂａｙ１１－７０８２が、ＲＢ７ＬＰを発現誘導したＨｅｐＧ２細胞のアポトーシスの誘導を有意に増強することを更に支持するものである。

《ＩＭＤ－０３５４を用いた検討》
続いて、Ｂａｙ１１－７０８２の代わりに、ＩＫＫβ阻害剤であるＩＭＤ－０３５４（ＣＡＳ番号：９７８－６２－１）を用いて同様の検討を行った。

１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞を３日間培養した。続いて、各細胞を６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、終濃度１５μＭのＩＭＤ－０３５４に暴露し、２４時間インキュベートした。

続いて、実験例２と同様にして、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、アネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。続いて、フローサイトメトリー解析を行い、アポトーシスを生じた細胞の割合を測定した。

図７は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図７では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図７中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、「ＩＭＤ－」はＩＭＤ－０３５４の非存在下における結果であることを示し、「ＩＭＤ＋」は終濃度１５μＭのＩＭＤ－０３５４の存在下における結果であることを示す。また、「＊＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ＩＭＤ－０３５４が、ドキシサイクリンの存在下でＲＢ７ＬＰの発現を誘導したＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞のアポトーシスの誘導を有意に増強したことが明らかとなった。すなわち、ＩＭＤ－０３５４もＢａｙ１１－７０８２と同様の効果を示すことが明らかとなった。

《ＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡを用いた検討》
続いて、ＩＫＫβ阻害剤の添加の代わりにＩＫＫβのノックダウンを行い、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞のアポトーシスの誘導が増強されるか否かを検討した。

ＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡとして、市販のｓｈＲＮＡ発現ベクター（カタログ番号「＃ＳＨＣＬＮＧ－ＮＭ＿００１５５６」、「ＴＲＣＮ０００００１８９１７」、「ＴＲＣＮ０００００１８９１５」、「ＴＲＣＮ０００００１８９１６」、「ＴＲＣＮ０００００１８９１８」）のピューロマイシン耐性遺伝子をブラスチジン耐性遺伝子に置き換えたものを使用した。

４種類のｓｈＲＮＡをＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞に導入し、ウエスタンブロッティングによりＩＫＫβの発現を確認した結果、いずれのｓｈＲＮＡを用いてもＩＫＫβのノックダウンができることが確認された。そこで、これらのｓｈＲＮＡのうちの１種を次の実験に用いた。

ＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡの発現ベクターを導入した又は導入していない、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞を、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で３日間培養した。続いて、各細胞を６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で更に２４時間インキュベートした。

図８は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図８では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図８中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、「ｓｈＲＮＡ－」はＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡを導入していない細胞の結果であることを示し、「ｓｈＲＮＡ＋」はＩＫＫβに対するｓｈＲＮＡを導入した細胞の結果であることを示す。また、「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、Ｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ＩＫＫβのノックダウンが、ドキシサイクリンの存在下でＲＢ７ＬＰの発現を誘導したＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞のアポトーシスの誘導を有意に増強したことが明らかとなった。この結果は、ＩＫＫβの機能阻害が、ＲＢ７ＬＰを発現誘導したＨｅｐＧ２細胞のアポトーシスの誘導を有意に増強することを更に支持するものである。

《初代肝細胞癌細胞（ＱＫＯＰＨＣＣ）を用いた検討》
ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞の代わりに、実験例１で採取したＱＫＯＰＨＣＣを用いた検討を行った。

ＱＫＯＰＨＣＣに、ＲＢ７ＬＰの発現ベクター（ｐｌｅｎｔｉ６．３－ＲＢ７ＬＰ）を導入した細胞（以下、「ＲＢ７ＬＰ（＋）ＱＫＯＰＨＣＣ細胞」という場合がある。）及びＬａｃＺの発現ベクター（ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＬａｃＺ）を導入した細胞（以下、「ＲＢ７ＬＰ（－）ＱＫＯＰＨＣＣ細胞」という場合がある。）をそれぞれ作製した。

続いて、ＲＢ７ＬＰ（＋）ＱＫＯＰＨＣＣ細胞及びＲＢ７ＬＰ（－）ＱＫＯＰＨＣＣ細胞を、終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２に暴露し、２４時間インキュベートした。

図９は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図９では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図９中、「ＲＢ７ＬＰ－」はＲＢ７ＬＰ（－）ＱＫＯＰＨＣＣ細胞の結果であることを示し、「ＲＢ７ＬＰ＋」はＲＢ７ＬＰ（＋）ＱＫＯＰＨＣＣ細胞の結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２の非存在下における結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」は終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下における結果であることを示す。また、「＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、Ｂａｙ１１－７０８２が、ＲＢ７ＬＰを発現させたＱＫＯＰＨＣＣ細胞のアポトーシスの誘導を有意に増強したことが明らかとなった。すなわち、ＱＫＯＰＨＣＣ細胞においてもＨｅｐＧ２細胞と同様の結果が示された。

［実験例５］
（ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用効果の検討）
様々な癌細胞株を、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の存在下でインキュベートした後、実験例２と同様にして、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、アネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。続いて、フローサイトメトリー解析を行い、アポトーシスを生じた細胞の割合を測定した。

癌細胞株としては、ヒト肝癌細胞株である、Ｈｕｈ７、Ｌｉ－７及びＨｅｐＧ２、ヒト肺癌細胞株であるＨ１９７５、ヒト乳癌細胞株である、ＨＣＣ１１４３及びＴ４７Ｄ、ヒト結腸癌細胞株である、ＨＣＴ－１１６及びＤＬＤ－１を使用した。これらの細胞は、全てＲＢ１陽性であることが知られている。

ＣＤＫ４及び６阻害剤としては、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号：５７１１９０－３０－２）、リボシクリブ（ＣＡＳ番号：１２１１４４１－９８－３）又はアベマシクリブ（ＣＡＳ番号：１２３１９２９－９７－７）を使用した。また、ＩＫＫβ阻害剤としては、Ｂａｙ１１－７０８２を使用した。

《パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用》
Ｈｕｈ７細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度１０μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。Ｌｉ－７細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。Ｈ１９７５細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度１０μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。ＨＣＣ１１４３細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度１０μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で４時間インキュベートした。Ｔ４７Ｄ細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度１０μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。ＨＣＴ－１１６細胞は、終濃度８μＭのパルボシクリブ及び終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。ＤＬＤ－１細胞は、終濃度８μＭのパルボシクリブ及び終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。

図１０～１６は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図１０～１６では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図１０はＨｕｈ７細胞の結果であり、図１１はＬｉ－７細胞の結果であり、図１２はＨ１９７５細胞の結果であり、図１３はＨＣＣ１１４３細胞の結果であり、図１４はＴ４７Ｄ細胞の結果であり、図１５はＨＣＴ－１１６細胞の結果であり、図１６はＤＬＤ－１細胞の結果である。

図１０～１６中、「Ｐａｌｂｏ．－」はパルボシクリブの非存在下における結果であることを示し、「Ｐａｌｂｏ．＋」はパルボシクリブの存在下における結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２の非存在下における結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２の存在下における結果であることを示す。また、「ｎ．ｓ．」、「＊」、「＊＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、有意差がないこと、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、いずれの癌細胞株においても、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用により、アポトーシスの誘導が有意に増強されることが明らかとなった。この結果は、肝細胞癌だけでなく、肺癌、乳癌、結腸癌においても、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用が有効であることを示す。

《リボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用》
ＣＤＫ４及び６阻害剤として、リボシクリブを用いた検討を行った。ＨｅｐＧ２細胞に、終濃度８μＭのリボシクリブ及び終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。

図１７は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図１７では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図１７中、「Ｒｉｂｏ．－」はリボシクリブの非存在下における結果であることを示し、「Ｒｉｂｏ．＋」はリボシクリブの存在下における結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２の非存在下における結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２の存在下における結果であることを示す。また、「ｎ．ｓ．」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、有意差がないこと、Ｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ＣＤＫ４及び６阻害剤としてリボシクリブを使用した場合においても、ＩＫＫβ阻害剤との併用により、アポトーシスの誘導が有意に増強されることが明らかとなった。

《アベマシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用》
ＣＤＫ４及び６阻害剤として、アベマシクリブを用いた検討を行った。ＨｅｐＧ２細胞に、終濃度６μＭのアベマシクリブ及び終濃度１０μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。

図１８は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図１８では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図１８中、「Ａｂｅｍａ．－」はアベマシクリブの非存在下における結果であることを示し、「Ａｂｅｍａ．＋」はアベマシクリブの存在下における結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２の非存在下における結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２の存在下における結果であることを示す。また、「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、Ｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ＣＤＫ４及び６阻害剤としてアベマシクリブを使用した場合においても、ＩＫＫβ阻害剤との併用により、アポトーシスの誘導が有意に増強されることが明らかとなった。

［実験例６］
（ＲＢ７ＬＰの発現及びＮＦ－κＢ阻害剤の効果の検討）
ＩＫＫβ阻害剤の代わりにＮＦ－κＢ阻害剤を使用して、ＲＢ７ＬＰの発現誘導及びＮＦ－κＢ阻害剤の添加によるアポトーシスの誘導を検討した。ＮＦ－κＢ阻害剤として、ＱＮＺ（ＣＡＳ番号：５４５３８０－３４－５）を使用した。

１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、ＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞を３日間培養した。続いて、各細胞を６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、終濃度５０ｎＭのＱＮＺに暴露し、２４時間インキュベートした。

図１９は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図１９では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図１９中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、「ＱＮＺ－」はＱＮＺの非存在下における結果であることを示し、「ＱＮＺ＋」はＱＮＺの存在下における結果であることを示す。また、「＊＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、ＱＮＺが、ドキシサイクリンの存在下でＲＢ７ＬＰの発現を誘導したＨｅｐＧ２－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｐｕｒｏ－ＲＢ７ＬＰ－ＧＦＰ細胞のアポトーシスの誘導を有意に増強したことが明らかとなった。すなわち、ＮＦ－κＢ阻害剤も、ＩＫＫβ阻害剤と同様の効果を示すことが明らかとなった。

［実験例７］
（ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の併用効果の検討）
ＩＫＫβ阻害剤の代わりにＡＫＴ阻害剤を使用した検討を行った。様々な癌細胞株を、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の存在下でインキュベートした後、実験例２と同様にして、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、アネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。続いて、フローサイトメトリー解析を行い、アポトーシスを生じた細胞の割合を測定した。

癌細胞株としては、ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２、ヒト結腸癌細胞株であるＳＷ４８０、ＨＣＴ－１１６及びＤＬＤ－１、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を使用した。

ＣＤＫ４及び６阻害剤としては、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号：５７１１９０－３０－２）を使用した。また、ＡＫＴ阻害剤としては、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸ（ＣＡＳ番号：９２５６８１－４１－０）を使用した。

ＨｅｐＧ２細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度２５μＭのＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。ＳＷ４８０細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度２０μＭのＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。ＨＣＴ－１１６細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度２０μＭのＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。ＤＬＤ－１細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度２０μＭのＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。Ａ５４９細胞は、終濃度１０μＭのパルボシクリブ及び終濃度２０μＭのＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。

図２０～２４は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図２０～２４では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図２０はＨｅｐＧ２細胞の結果であり、図２１はＳＷ４８０細胞の結果であり、図２２はＨＣＴ－１１６細胞の結果であり、図２３はＤＬＤ－１細胞の結果であり、図２４はＡ５４９細胞の結果である。

図２０～２４中、「Ｐａｌｂｏ．－」はパルボシクリブの非存在下における結果であることを示し、「Ｐａｌｂｏ．＋」はパルボシクリブの存在下における結果であることを示す。また、「ＣＡＳ－」はＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの非存在下における結果であることを示し、「ＣＡＳ＋」はＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸの存在下における結果であることを示す。また、「＊」、「＊＊＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、いずれの癌細胞株においても、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の併用により、アポトーシスの誘導が有意に増強されることが明らかとなった。この結果は、肝細胞癌だけでなく、結腸癌、肺癌、においても、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＡＫＴ阻害剤の併用が有効であることを示す。

［実験例８］
（ＲＢ１の発現が、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用効果に及ぼす影響の検討）
ＲＢ１の発現が、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用効果に及ぼす影響を検討した。

まず、ＱＫＯＰＨＣＣ細胞に、テトラサイクリン誘導性のＲｂ１の発現ベクターを導入した。この細胞（以下、「ＱＫＯ－ＰＨＣＣ－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｂｌａｓｔ－ｍｏｕｓｅＲｂ１－ｍｃｈｅｒｒｙ細胞」という場合がある。）は、培地へのドキシサイクリンの添加によりＲｂ１を発現する。

続いて、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下で、ＱＫＯ－ＰＨＣＣ－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｂｌａｓｔ－ｍｏｕｓｅＲｂ１－ｍｃｈｅｒｒｙ細胞を３日間培養した。続いて、各細胞を６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下又は非存在下、終濃度１０μＭのパルボシクリブの存在下又は非存在下、終濃度１５μＭのＢａｙ１１－７０８２の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。

図２５は、フローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。図２５では、アポトーシス初期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の細胞の割合及びアポトーシス後期（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陽性）の細胞の割合の合計をアポトーシスを生じた細胞の割合とした。

図２５中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンの非存在下における結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを添加した結果であることを示す。また、「Ｐａｌｂｏ．－」はパルボシクリブの非存在下における結果であることを示し、「Ｐａｌｂｏ．＋」はパルボシクリブの存在下における結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２の非存在下における結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２の存在下における結果であることを示す。また、「＊＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、Ｒｂ１の非存在下では、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用によるアポトーシス誘導効果はごくわずかしか認められなかった。これに対し、Ｒｂ１の存在下では、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用によるアポトーシスの誘導を有意に増強したことが明らかとなった。この結果は、癌細胞におけるＲＢ１の存在の有無が、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用の有効性を示すマーカーであることを示す。

［実験例９］
（インビボでのＣＤＫ４／６阻害剤及びＩＫＫβ阻害剤の併用効果の検討）
担癌マウスモデルにＣＤＫ４／６阻害剤及びＩＫＫβ阻害剤を投与し、腫瘍体積の経時変化を測定した。

担癌マウスモデルとしては、ＨｅｐＧ２細胞を移植した担癌マウスモデル、Ｌｉ－７細胞を移植した担癌マウスモデル、テトラサイクリン誘導性にマウスＲｂ１を発現するＱＫＯＰＨＣＣ細胞（ＱＫＯ－ＰＨＣＣ－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｂｌａｓｔ－ｍｏｕｓｅＲｂ１－ｍｃｈｅｒｒｙ細胞）を移植した担癌マウスモデルを使用した。

ＣＤＫ４及び６阻害剤としては、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号：５７１１９０－３０－２）を使用した。また、ＩＫＫβ阻害剤としては、Ｂａｙ１１－７０８２を使用した。

《ＨｅｐＧ２細胞を移植した担癌マウスモデルによる検討》
ＨｅｐＧ２細胞１×１０^６個をＫＳＮ／ｓｌｃマウス（６週齢、雄）の背部皮下にマトリゲル（カタログ番号「３５４２３４」、コーニング社）とともに移植し、担癌マウスモデルを作製した。約４週間後、腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３に到達した後、試験群のマウスへのパルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の投与を開始した。パルボシクリブは、強制経口投与により８０ｍｇ／Ｋｇの投与量で毎日投与した。Ｂａｙ１１－７０８２は、コーン油に溶解し、皮下注射により２０ｍｇ／Ｋｇの投与量で２日ごとに投与した。また、対照群にはビヒクル（コーン油又はＬ－乳酸ナトリウム）を投与した。各群のマウスについて、２日ごとに腫瘍体積及び体重を測定した（ｎ＝５）。

図２６は各群のマウスの腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図２６中、縦軸は腫瘍体積の増加率（％）を示し、横軸は薬物の投与開始後の日数を示す。

図２６中、「Ｐａｌｂｏ．－」はパルボシクリブを投与しなかったマウスの結果であることを示し、「Ｐａｌｂｏ．＋」はパルボシクリブを投与したマウスの結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２を投与しなかったマウスの結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２を投与したマウスの結果であることを示す。また、「＊」、「＊＊＊」及び「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、パルボシクリブ単独投与により、非投与群と比較して、わずかに腫瘍体積の増加が抑制された。また、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用投与がほぼ完全に腫瘍体積の増加を抑制したことが明らかとなった。また、各群のマウスの体重には有意な差は認められなかった。この結果は、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用がインビボでも有効であることを示す。

《Ｌｉ－７細胞を移植した担癌マウスモデルによる検討》
Ｌｉ－７細胞１×１０^６個をＫＳＮ／ｓｌｃマウス（６週齢、雄）の背部皮下にマトリゲル（カタログ番号「３５４２３４」、コーニング社）とともに移植し、担癌マウスモデルを作製した。約５週間後、腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３に到達した後、試験群のマウスへのパルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の投与を開始した。パルボシクリブは、強制経口投与により８０ｍｇ／Ｋｇの投与量で毎日投与した。Ｂａｙ１１－７０８２は、コーン油に溶解し、皮下注射により２０ｍｇ／Ｋｇの投与量で２日ごとに投与した。また、対照群にはビヒクル（コーン油又はＬ－乳酸ナトリウム）を投与した。各群のマウスについて、２日ごとに腫瘍体積及び体重を測定した（ｎ＝５）。

図２７は各群のマウスの腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図２７中、縦軸は腫瘍体積の増加率（％）を示し、横軸は薬物の投与開始後の日数を示す。

図２７中、「Ｐａｌｂｏ．－」はパルボシクリブを投与しなかったマウスの結果であることを示し、「Ｐａｌｂｏ．＋」はパルボシクリブを投与したマウスの結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２を投与しなかったマウスの結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２を投与したマウスの結果であることを示す。また、「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、Ｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、パルボシクリブ単独投与により、非投与群と比較して、有意に腫瘍体積の増加が抑制された。また、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用投与が腫瘍体積を有意に減少させたことが明らかとなった。また、各群のマウスの体重には有意な差は認められなかった。この結果は、Ｌｉ－７細胞由来の腫瘍においても、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用がインビボで有効であることを示す。

《テトラサイクリン誘導性にマウスＲｂ１を発現するＱＫＯＰＨＣＣ細胞を移植した担癌マウスモデルによる検討》
ＱＫＯ－ＰＨＣＣ－ｐＴＲＥ３Ｇ－ｂｌａｓｔ－ｍｏｕｓｅＲｂ１－ｍｃｈｅｒｒｙ細胞５×１０^５個をＫＳＮ／ｓｌｃマウス（６週齢、雄）の背部皮下にマトリゲル（カタログ番号「３５４２３４」、コーニング社）とともに移植し、担癌マウスモデルを作製した。腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３に到達した後、試験群のマウスへのドキシサイクリン、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の投与を行った。

ドキシサイクリン（５０ｍｇ／Ｋｇ）及びパルボシクリブ（８０ｍｇ／Ｋｇ）は、強制経口投与により毎日投与した。Ｂａｙ１１－７０８２は、コーン油に溶解し、皮下注射により２０ｍｇ／Ｋｇの投与量で２日ごとに投与した。また、対照群にはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ、コーン油又はＬ－乳酸ナトリウム）を投与した。各群のマウスについて、２日ごとに腫瘍体積及び体重を測定した（ｎ＝５）。

図２８は各群のマウスの腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。図２８中、縦軸は腫瘍体積の増加率（％）を示し、横軸は薬物の投与開始後の日数を示す。

図２８中、「ＤＯＸ－」はドキシサイクリンを投与しなかったマウスの結果であることを示し、「ＤＯＸ＋」はドキシサイクリンを投与したマウスの結果であることを示す。また、「Ｐａｌｂｏ．－」はパルボシクリブを投与しなかったマウスの結果であることを示し、「Ｐａｌｂｏ．＋」はパルボシクリブを投与したマウスの結果であることを示す。また、「ＢＡＹ－」はＢａｙ１１－７０８２を投与しなかったマウスの結果であることを示し、「ＢＡＹ＋」はＢａｙ１１－７０８２を投与したマウスの結果であることを示す。また、「＊＊＊＊」は、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定の結果、Ｐ＜０．０００１で有意差が存在することを示す。

その結果、Ｒｂ１の非存在下では、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用投与による腫瘍体積の増加の抑制効果はごくわずかしか認められなかった。これに対し、Ｒｂ１の存在下では、パルボシクリブ及びＢａｙ１１－７０８２の併用投与により腫瘍体積の有意な減少が認められた。この結果は、癌細胞におけるＲＢ１の存在の有無が、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＩＫＫβ阻害剤の併用の有効性を示すマーカーであることを更に支持するものである。

Claims

サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせ、を有効成分として含有する、ＲＢＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＣｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ１（ＲＢ１）陽性癌の治療用医薬組成物であって、
前記ＣＤＫ４及び６阻害剤が、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号：５７１１９０－３０－２）、リボシクリブ（ＣＡＳ番号：１２１１４４１－９８－３）又はアベマシクリブ（ＣＡＳ番号：１２３１９２９－９７－７）であり、
前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＫＫβ阻害剤又はＮＦ－κＢ阻害剤であり、
前記ＩＫＫβ阻害剤が、Ｂａｙ１１－７０８２（ＣＡＳ番号：１９５４２－６７－７）、ＩＭＤ－０３５４（ＣＡＳ番号：９７８－６２－１）又はＩＫＫβに対する阻害性核酸であり、
前記ＮＦ－κＢ阻害剤が、ＱＮＺ（ＣＡＳ番号：５４５３８０－３４－５）であり、
前記ＡＫＴ阻害剤が、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸ（ＣＡＳ番号：９２５６８１－４１－０）であり、
前記ＲＢ１陽性癌が、肝細胞癌又は肺癌である、医薬組成物。
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤、を含む、ＲＢ１陽性癌の治療用キットであって、
前記ＣＤＫ４及び６阻害剤が、パルボシクリブ、リボシクリブ又はアベマシクリブであり、
前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＫＫβ阻害剤又はＮＦ－κＢ阻害剤であり、
前記ＩＫＫβ阻害剤が、Ｂａｙ１１－７０８２、ＩＭＤ－０３５４又はＩＫＫβに対する阻害性核酸であり、
前記ＮＦ－κＢ阻害剤が、ＱＮＺであり、
前記ＡＫＴ阻害剤が、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸであり、
前記ＲＢ１陽性癌が、肝細胞癌又は肺癌である、治療用キット。
癌患者由来の癌細胞が、ＲＢ１陽性であるか否かを検査する工程を含み、
前記癌細胞がＲＢ１陽性であることが、前記癌患者の治療に、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であることを示す、癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験する方法であって、
前記ＣＤＫ４及び６阻害剤が、パルボシクリブ、リボシクリブ又はアベマシクリブであり、
前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＫＫβ阻害剤又はＮＦ－κＢ阻害剤であり、
前記ＩＫＫβ阻害剤が、Ｂａｙ１１－７０８２、ＩＭＤ－０３５４又はＩＫＫβに対する阻害性核酸であり、
前記ＮＦ－κＢ阻害剤が、ＱＮＺであり、
前記ＡＫＴ阻害剤が、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸであり、
前記ＲＢ１陽性癌が、肝細胞癌又は肺癌である、方法。
ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、
ＲＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、
ＲＢ１遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、
ＲＢ１遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は
ＲＢ１タンパク質に対する特異的結合物質、を含み、
癌患者由来の癌細胞が、ＲＢ１陽性であるか否かの検査に用いられ、
前記癌細胞が、ＲＢ１陽性であることが、前記癌患者の治療に、ＣＤＫ４及び６阻害剤、及び、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤若しくはＡＫＴ阻害剤の組み合わせの投与が有効であることを示す、前記癌患者への前記組み合わせの投与の有効性を試験するためのキットであって、
前記ＣＤＫ４及び６阻害剤が、パルボシクリブ、リボシクリブ又はアベマシクリブであり、
前記ＮＦ－κＢシグナル伝達経路阻害剤が、ＩＫＫβ阻害剤又はＮＦ－κＢ阻害剤であり、
前記ＩＫＫβ阻害剤が、Ｂａｙ１１－７０８２、ＩＭＤ－０３５４又はＩＫＫβに対する阻害性核酸であり、
前記ＮＦ－κＢ阻害剤が、ＱＮＺであり、
前記ＡＫＴ阻害剤が、ＡｋｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸであり、
前記ＲＢ１陽性癌が、肝細胞癌又は肺癌である、キット。