JP7587866B2

JP7587866B2 - 間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞及びそれを含む骨疾患治療用組成物

Info

Publication number: JP7587866B2
Application number: JP2022561156A
Authority: JP
Inventors: スクパク、ヒョン; ギョンイ、ヨン; ジンコ、ウン; ジンキム、ハ; レイ、スン; ルムクォン、ア
Original assignee: セフォカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2024-11-21
Anticipated expiration: 2041-10-08
Also published as: JP7786762B2; US20230248776A1; KR102783479B1; JP2023521097A; JP2024170544A; CA3202264A1; KR102783479B9; WO2022075809A1; CN115516081A; KR20220047199A; CN115516081B; EP4227404A4; EP4227404A1

Description

本出願は、２０２０年１０月０８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１３０１３８号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。
この特許出願は、韓国政府（科学技術情報通信部、保健福祉部）が資金提供する韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）助成金の支援を受けて提出されました。
［プロジェクトＩＤ番号］２２Ｄ０８０１Ｌ１
［プロジェクト番号］２２Ｄ０８０１Ｌ１
［部局名］韓国政府（科学技術情報通信部、保健福祉部）
［プロジェクト管理（専門）機関名］韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）
［研究計画名］韓国政府再生医療技術開発プロジェクト
［研究プロジェクト名］大腿骨頭骨壊死患者におけるヒト臍帯由来骨芽細胞細胞療法ＣＦ－Ｍ８０１の安全性と探索的有効性を評価する第１相臨床試験
［貢献度］５０／１００
［プロジェクト実施団体名］セフォカンパニーリミテッド
［研究期間］２０２２．０４．０１～２０２４．１２．３１
この特許出願は、韓国政府（科学技術情報通信部、保健福祉部）が資金提供する韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）助成金の支援を受けて提出されました。
［プロジェクトＩＤ番号］２２Ｃ０６０４Ｌ１
［プロジェクト番号］２２Ｃ０６０４Ｌ１
［部局名］韓国政府（科学技術情報通信部、保健福祉部）
［プロジェクト管理（専門）機関名］韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）
［研究計画名］韓国政府再生医療技術開発プロジェクト
［研究プロジェクト名］臍帯由来骨芽細胞を用いた骨粗鬆症性骨折治療のための先端バイオコンバージェンスメディカルプロダクトの開発
［貢献度］５０／１００
［プロジェクト実施団体名］セフォカンパニーリミテッド
［研究期間］２０２２．０４．０１～２０２５．１２．３１

本発明は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法、前記方法で分化した骨芽細胞を含む骨疾患治療用細胞治療剤ないしその製造方法に関する。

また、本発明は、前記方法で得られた骨芽細胞を骨疾患患者に投与する段階を含む骨疾患治療方法に関する。

幹細胞(Ｓｔｅｍｃｅｌｌ)は、各種細胞に分化(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ)できる多能性(ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ)を有する未分化細胞を総称し、幹細胞は、特定の分化因子及び／又は環境によって特定の細胞に分化できる。幹細胞の種類としては、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、がん幹細胞（ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌ）などがある。近年、多様な細胞に分化可能な幹細胞を用いて損傷した組織の再生、軟骨損傷疾患、糖尿病、白血病、神経疾患、心臓病、脊髄外傷または線維性障害などを始めとした様々な疾患を治療しようとする研究が活発に行われており、これによって幹細胞を特定の細胞に分化させようとする研究が試みられている。また、分化が終わった細胞を逆分化を通じて幹細胞として作製した人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ，ｉＰＳ）なども細胞分化に使用されている。特に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ、ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌ）は、骨、軟骨、脂肪、筋肉細胞を含む様々な中胚葉性細胞に分化する能力を持つ多分化能幹細胞である。このような能力により間葉系幹細胞は、骨疾患、組織損傷の再生医療の分野で治療的製剤として価値があると考えられている。再生医学は、従来では、回復が不可能であった組織や臓器の固有回復メカニズムを活性化させるか、または損傷した組織を交替することにより、損傷した部位を再生させることを目的としているため、身体が自ら治癒できない組織または臓器を実験室で培養し、これを身体内に安全に移植するか、または注入する試みを含む。再生医療に基づく治療法として、難治性疾患に対する治療方法で幹細胞の自己複製能力及び分化能力を用いた幹細胞治療剤が次世代治療剤として脚光を浴びている。

ただし、使用される幹細胞の起源、由来部位、培養程度、分化程度など多様な要因に起因した危険要素により、安全性及び有効性に対する基準が厳しく、許認可に困難性がある。また、多様な細胞に分化できる多能性を有する幹細胞を特定の細胞に分化させ、商業的に使用するためには、大量生産が必要であるが、幹細胞から骨細胞に迅速かつ安全に分化させることは、困難である。

幹細胞を特定細胞に分化させる方法について、大韓民国特許１０－２０１６－００３４５４１号では、ゾルゲル相転移を用いてヒドロゲルをコーティングした多孔質膜において幹細胞から骨細胞に分化させる方法が公開されており、大韓民国特許１０－２０１８－０１１４３０７号では、間葉系幹細胞の分化を促進するために培地にヘキサノイルグリコールキトサンを含有する方法を公開している。ＵＳ８，５８０，７５７Ｂ２では、間葉系幹細胞の分化を調整する方法として、ｍｉＲＮＡまたは、ｓｉＲＮＡを用いる方法について開示している。このように間葉系幹細胞を骨細胞に分化させるための様々な試みがなされているが、外部の物質を幹細胞に投与することなく、分化培地に高価な組成の追加なしに幹細胞から骨細胞を迅速に大量に分化させることができる方法は、依然として開発されていない状況である。

しかし、骨関連疾患に対する細胞治療薬として活用できるように、骨芽細胞を幹細胞から安定的かつ迅速に分化及び培養する方法に対するさらなる研究は、依然として要求されているのが実情である。

そこで、本発明者らは、骨疾患を治療するための再生医療方法の一つとして、間葉系幹細胞から分化した骨細胞治療剤を製造する最適な方法を考えながら本発明を創出した。本発明者らは、骨疾患治療用細胞治療剤を製造するための骨芽細胞を製造する方法を提供しようとする。本発明の分化方法を用いる場合、従来の細胞治療剤用幹細胞を分化させる方法に比べて骨芽細胞に安定的かつ迅速に分化でき、前記骨芽細胞の骨再建の効能が非常に優れていることを確認し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法、前記方法で分化した骨芽細胞を含む骨疾患治療用細胞治療剤ないしその製造方法を提供することである。

本発明は、ｉ）空気透過性ポリマー膜を界面活性剤バブルでコーティングする段階、
ｉｉ）前記段階ｉ）のバブルに間葉系幹細胞を１×１０^３～１×１０^５個／ｃｍ^２の密度で接種する段階、
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）の間葉系幹細胞を分化培地から骨芽細胞に分化させる段階、
ｉｖ）前記段階ｉｉｉ）で分化させた骨芽細胞を分離及び得る段階、
を含む間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階ｉ）の界面活性剤は、ポロキサマー(ｐｏｌｏｘａｍｅｒ)であってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階ｉ）のバブルは、前記空気透過性ポリマー膜の上で界面活性剤を入れて動かしてバブルを発生させる段階を含んで製造されるものであってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階ｉｉ）の間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、胎盤、羊膜、骨髄、脂肪、毛包、歯、歯髄及び皮膚真皮からなる群から選ばれるいずれか一つ以上に由来するものであってもよい。

本発明は、さらに前記方法で得られた骨芽細胞を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記骨芽細胞は、コネキシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、ＣＸ４３）、ランス２（Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２、ＲＵＮＸ２）及びコラーゲンタイプ１Ａ（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１）の発現レベルが未分化幹細胞及び成熟した骨細胞に比べて高く、アンギオポイエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１、ＡＮＧＰＴ１）及びアルカリホスファターゼ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）の発現レベルが未分化幹細胞に比べて高く、オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＯＳＸ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣＮ）及びオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯＰＮ）の発現レベルが成熟した骨細胞に比べて低いものであってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記骨芽細胞は、Ｋｉ‐６７の発現レベルが未分化幹細胞に比べて低いものであってもよい。

本発明は、さらに前記方法で得られた骨芽細胞を含む骨疾患治療用細胞治療剤を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記骨疾患は、骨折、大腿骨頭骨壊死、脊椎癒合、遅延癒合または不癒合、骨粗鬆症、骨壊死症、仮関節症、パジェット病及び骨形成不全症からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。

本発明は、さらに前記方法で得られた骨芽細胞を骨疾患患者に投与する段階を含む骨疾患治療方法を提供する。

本発明の間葉系幹細胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ)とは、多能性(ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ)未分化細胞と同じ意味で使用されるが、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、心臓細胞または筋肉細胞を含む様々な中胚葉性細胞または神経細胞のような外胚葉性細胞にも分化する能力を持つ成体幹細胞を意味する。また、胚幹細胞で一般的に問題となるがん（ｃａｎｃｅｒ）化や倫理的な問題から自由であるだけでなく、移植後も免疫拒絶反応を起こさない場合がある。

本発明の「骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）」とは、脊椎動物の骨細胞(ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ)を作る細胞であって、造骨細胞ともいう。骨基質を合成及び分泌して骨を作ることもあり、自分が作った骨組織の中に埋もれて自ら一般骨細胞になりもする。その他に骨に必要なＣａ、Ｍｇイオンなどの物質を骨に沈着させて骨組織を石灰化させることができる。内部物質の違いと活性によって休止期と形成期に分かれ、分裂能力は大きいが、古い骨ではその数が減少する。

本発明の「骨疾患(ｂｏｎｅｄｉｓｅａｓｅ)」とは、骨（ｂｏｎｅ）に損傷が生じ、骨の構成及び密度が変化し、骨折が起こりやすい状態を意味する。骨は、骨格系の安定性を維持する身体内で最も硬い組織であって、筋肉のテコとして使用され、内部の臓器を保護するだけでなく、カルシウム、マグネシウムなどのミネラルを貯蔵する役割を果たす。このような骨疾患は、殆ど骨折などの外傷、または無血性壊死、骨粗鬆症などの代謝性疾患によって発生し、原因に関係なく身体の機械的支持に問題が生じ、運動能が低下するだけでなく、気管節の形成などで持続的な痛みを誘発する。本明細書において骨疾患は、骨粗鬆症、骨壊死症、仮関節症、パジェット病または骨形成不全症を含む。

前記「骨粗鬆症(ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ)」とは、骨の量が減少し、質的な変化により骨の強度が弱くなり、骨折が起こる可能性が高い状態を意味し、主に遺伝、早期閉経、過度な食事療法またはステロイド薬剤などが主な原因になる。

前記「骨壊死症」とは、骨に血液供給ができず、骨組織が死んでいく疾患である。身体のどこでも発生することがあるが、主に大腿部（太ももの骨）の上側、腕の上側、肩、膝や脊椎などで発生する。

前記「仮関節症」とは、「仮関節」とも呼ばれ、骨が折れた後にその部位がくっつかず（不癒合）、まるで関節のように動くことをいう。骨折後の治療過程で、間違いがあって、或いは骨折部位の細菌感染が原因となって発生することがある。

前記「パジェット病」とは、骨が新たに生じて成長し、吸収される過程である骨再形成(ｂｏｎｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ)が過度に現れ、様々な部位の骨格系が侵される局所性骨疾患である。主に骨盤、大腿部または頭蓋骨で発生する。

前記「骨形成不全症」とは、先天的に骨が弱く、特別な原因なしに骨が折れやすい症状を総称し、骨異形成症ともいう。

本発明の「分化(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ)」とは、細胞が分裂増殖して成長している間に互いに構造や機能が特殊化する現象、すなわち、生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられた役割を行うために形態や機能が変わっていくことをいう。例えば、個体発生で最初に同質であったある生物系の部分の間に質的な違いが生じること、またはその結果として、質的に区別できる部分系に分かれている状態を分化という。

本発明の「細胞療法剤(ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｇｅｎｔ)」とは、個体から分離、培養及び特殊な操作で製造された細胞及び組織を治療、診断又は予防の目的で使用する医薬品であって、細胞又は、組織の機能を復元させるため、生きている者が同種または異種細胞を体外で増殖選別するか、または他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて使用されてもよい。

前述したように、従来の幹細胞を用いた細胞治療剤は、高い単価などの問題により大衆的に商用化されにくく、特に幹細胞を骨芽細胞に分化するのに時間と費用がかかりすぎるという短所が存在した。

一方、本発明による分化方法は、継代培養初期の幹細胞を骨芽細胞に短期間で安定的かつ迅速に分化させることができる。従来の幹細胞分化方法は、８回以上継代培養された幹細胞を約２０日以上分化させなければ骨芽細胞を得ることができなかったのに対し、本発明では、５回継代培養された幹細胞を約３日だけ分化させると、分化した骨芽細胞を得ることができる（図１）。特に、本発明の分化方法を用いる場合、幹細胞の出所（ｄｏｎｏｒ）による反応偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）なしにすべて骨芽細胞に分化できるため、同種細胞治療剤として活用しうる。

したがって、本発明は、ｉ）空気透過性ポリマー膜を界面活性剤バブルでコーティングする段階、
ｉｉ）前記段階ｉ）のバブルに間葉系幹細胞を１×１０^３～１×１０^５個／ｃｍ^２の密度で接種する段階、
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）の間葉系幹細胞を分化培地から骨芽細胞に分化させる段階、
ｉｖ）前記段階ｉｉｉ）で分化させた骨芽細胞を分離及び得る段階、
を含む間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法ないし前記方法で分化した骨芽細胞を提供しうる。

前記段階ｉ）のポリマー膜は、ハイパーフラスコの多孔質膜であってもよい。

前記段階ｉｉ）の密度は、好ましくは、１×１０^３～１×１０^５個／ｃｍ^２であってもよく、より好ましくは、１×１０^４個／ｃｍ^２であってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階ｉ）の界面活性剤は、ポロキサマー(ｐｏｌｏｘａｍｅｒ)であってもよい。ポロキサマー以外の他の界面活性剤は、細胞毒性を細胞毒性を帯びており（実施例４）、本発明に適していない。前記ポロキサマーは、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１２４、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３８及びポロキサマー４０７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上であってもよい。

前記段階ｉ）の界面活性剤は、最大１０％界面活性剤であってもよい。

前記段階ｉ）のバブルは、前記空気透過性ポリマー膜上に界面活性剤を入れて動かして発生されるものであってもよい。例えば、前記段階ｉ）のバブルは、前記空気透過性ポリマー膜の上で界面活性剤を振って発生するか、またはピペッティングを通じて発生されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階ｉｉ）の間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、胎盤、羊膜、骨髄、脂肪、毛包、歯、歯髄及び皮膚真皮からなる群から選ばれるいずれか一つ以上に由来するものであってもよい。より好ましくは、段階ｉｉ）の間葉系幹細胞は、臍帯由来間葉系幹細胞であってもよい。

前記臍帯由来間葉系幹細胞の場合、出産後に廃棄される臍帯組織を用いることにより、採取が容易で多量の幹細胞を容易に確保できるという長所がある。脂肪や骨髄由来幹細胞は、分離、抽出される供与者の年齢や健康状態などに影響を受けて増殖力や分化能などに制限があり、変動性が多いが、臍帯由来幹細胞の場合、成体幹細胞の中で最も早い時期に得ることができる幹細胞として、供与者の年齢などの変数によって幹細胞能に影響をほとんど受けず、優れた増殖力及び分化能を持つ。また、臍帯由来間葉系幹細胞は、神経系疾患、肝疾患、筋骨格系疾患など様々な疾患に活用可能な幹細胞群を分離できるという長所がある。

前記段階ｉｉ）で間葉系幹細胞をバブルに接種することは、空気透過性ポリマー膜を界面活性剤バブルでコーティングした後、少なくとも２時間以上経過してバブルが消滅し始めたときに接種するものであってもよい。

前記段階ｉｉ)の間葉系幹細胞は、５～８継代培養した幹細胞であってもよい。より好ましくは、５～６継代培養した幹細胞であってもよい。

前記段階ｉｉ)で接種された間葉系幹細胞は、分化培地から骨芽細胞に分化する前にα－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ及びＦＢＳからなる群から選ばれるいずれか１つ以上を含んでもよい培養液で１２時間～４８時間培養するものであってもよい。より好ましくは、前記培養液中で２０時間～３０時間培養するものであってもよい。

前記段階ｉｉｉ）の分化は、２４時間～１２０時間分化させるものであってもよい。より好ましくは、６０時間～８０時間分化させるものであってもよい。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記骨芽細胞は、コネキシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、ＣＸ４３）、ランス２（Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２、ＲＵＮＸ２）及びコラーゲンタイプ１Ａ（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１）の発現レベルが未分化幹細胞及び成熟した骨細胞に比べて高く、アンギオポイエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１、ＡＮＧＰＴ１）及びアルカリホスファターゼ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）の発現レベルが未分化幹細胞に比べて高く、オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＯＳＸ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣＮ）及びオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯＰＮ）の発現レベルが、成熟した骨細胞に比べて低いものであってもよい。

本発明の骨芽細胞は、初期骨芽細胞から発現するコネキシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、ＣＸ４３）、ランス２（Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２、ＲＵＮＸ２)、コラーゲンタイプ１Ａ（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１)及びアルカリホスファターゼ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）の発現が未分化幹細胞に比べて著しく高く、細胞増殖マーカーであるＫｉ－６７の発現が未分化より減少はするが、発現されており、コロニーを形成することで細胞増殖が起こる初期骨芽細胞であることが分かる。これに比べて十分に成熟した骨細胞になるほど発現が増加するオステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＯＳＸ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣＮ）及びオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯＰＮ）の発現レベルは、成熟した骨細胞（ＮＨＯｓｔ）に比べて低かった。また、初期骨芽細胞において明確に発現するアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１、ＡＮＧＰＴ１）の発現も遺伝子及びタンパク質の発現が数百倍以上増加して初期の骨芽細胞の特性を明らかに示していた（表１）。

前記ＣＸ４３は、ＧＪＡ１遺伝子によって暗号化され、軟骨細胞、造骨細胞、骨細胞破骨細胞などの骨細胞の類型で発現される最も一般的な間隙接合タンパク質である。ＣＸ４３は、様々な骨細胞の類型間の信号伝達を調節するのに重要な役割を果たし、骨の発達、分化、モデリング及びリモデリングだけでなく、病理を調節する。特に、ＣＸ４３は、造骨細胞の生存、増殖及び分化に必要であり、様々な骨形成マーカーの発現を向上させることができる。

前記ＲＵＮＸ２は、骨細胞分化の主な調節子であり、骨芽細胞分化の初期表現形質であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）と後期表現形質であるオステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣＮ）の発現を調節する重要な転写因子である。初期段階の骨芽細胞（ｏｓｔｅｏ－ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ、ｉｍｍａｔｕｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）は、ＲＵＮＸ２＋であり、増殖能を有し、成熟した骨細胞に分化し、無機質化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）過程がさらに行われる。骨芽細胞は、一定期間は、細胞分裂が止まらない状態であり、分化が行われることにより分裂能を次第に失って骨細胞に分化するようになる（図１７ａ及び図１７ｂ）。

前記コラーゲンタイプ１Ａ（ＣＯＬ１Ａ１）は、骨芽細胞への分化時に特徴的に発現される骨形成マーカーである。

前記オステリックス（ＯＳＸ）は、骨細胞形成に関連した分化因子に該当する。ＯＳＸは、ＣＯＬ１Ａ１プロモーター活性を高めることにより、骨マットレスの発現を増加させて造骨芽細胞が成熟した造骨細胞に分化するのに重要な役割を果たす。

前記オステオカルシン（ＯＣＮ）は、骨細胞形成に関連した分化因子に該当する。ＯＣＮは、骨芽細胞で形成された後に骨基質中に沈着し、その後、新たに形成されるものの一部は、血液内に放出されるので、血中濃度を測定すると、骨形成の程度が分かる。

前記オステオポンチン（ＯＰＮ）は、骨細胞形成に関連した分化因子であり、骨形成マーカータンパク質に該当する。

本発明は、さらに前記方法で得られた骨芽細胞を含む骨疾患治療用細胞治療剤を提供しうる。

本発明は、さらに前記方法で得られた骨芽細胞を骨疾患患者に投与する段階を含む骨疾患治療方法を提供しうる。

前記投与は、非経口投与であってもよく、前記骨芽細胞は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して投与されてもよい。

本発明による分化方法は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に安定的かつ迅速に分化させることができる。前記分化した骨芽細胞は、血管形成能に優れており、骨形成能に優れている。したがって、本発明による幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法ないし前記方法で得られた骨芽細胞は、骨疾患に関連した細胞治療剤の用途としても効果的に使用できる。

図１は、本発明の臍帯由来骨芽細胞を分化及び得る工程を示す。図２は、ポロキサマーバブルコーティング後、ポロキサマー溶液は除去し、多孔質膜上に残っているポロキサマーバブルが保持されているかどうかを７時間（０Ｈ～７Ｈ）観察した結果を示す。ポロキサマー溶液の除去後、２時間後（２Ｈ）にバブルが消えることが確認できた。図３は、ポロキサマーバブルコーティング後、ＱＤ処理した細胞をロードしたものを蛍光顕微鏡３Ｄイメージで撮影した結果を示す。図４は、界面活性剤の種類別の細胞毒性実験の結果を示す。ＣＣＫ－８（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８)１日目の結果であるＰ４０７（ポロキサマー４０７）を除いた残りの界面活性剤（ＤＩＡＰＯＮＫ－ＳＦ及びＴｗｅｅｎ－２０）は、細胞に毒性を示すことが確認できた。図５は、界面活性剤の種類別の細胞毒性実験の結果を示す。ＣＣＫ－８（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８)１日から３日までの細胞増殖を確認した結果、Ｐ４０７（ポロキサマー４０７）を除いた残りの界面活性剤（ＤＩＡＰＯＮＫ－ＳＦ及びＴｗｅｅｎ－２０）は、細胞毒性で細胞が増殖しないことが確認できた。図６は、界面活性剤の種類別の細胞毒性実験の結果を示す。ＣＣＫ－８（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８)１日目の結果であるＰ４０７（ポロキサマー４０７）を除いた残りの界面活性剤（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ及びＴｗｅｅｎ－２０）は、細胞に毒性を示すことが確認できた。図７は、界面活性剤の種類別の細胞毒性実験の結果を示す。ＣＣＫ－８（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８)１日から３日までの細胞増殖を確認した結果、Ｐ４０７（ポロキサマー４０７）を除いた残りの界面活性剤（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ及びＴｗｅｅｎ－２０）は、細胞毒性で細胞が増殖しないことが確認できた。図８は、未分化細胞またはゲル（Ｇｅｌ）状の界面活性剤から分化させた細胞に比べてバブル状（Ｂｕｂｂｌｅｆｏａｍ）の界面活性剤から分化させた細胞の遺伝子（ＣＯＬ１Ａ）発現レベルが有意的に高いことを示す。図９は、未分化細胞またはゲル（Ｇｅｌ）状の界面活性剤から分化させた細胞に比べてバブル状（Ｂｕｂｂｌｅｆｏａｍ）の界面活性剤から分化させた細胞のタンパク質（ＶＥＧＦ）発現レベルが有意的に高いことを示す。図１０は、未分化細胞（ＲＣＢ００１、ＲＣＢ００２、ＲＣＢ００５）に対して本発明の分化した細胞治療剤（ＲＣＢ００１‐ＤＰ１～ＲＣＢ００５‐ＤＰ５）の骨誘導遺伝子の発現レベルを比較した結果を示す。未分化細胞に対して本発明の細胞治療剤から分泌されるコネキシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、ＣＸ４３）及びランス２（Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２、ＲＵＮＸ２）の発現レベルが有意的に増加したことが確認できた。図１１は、未分化細胞（ＲＣＢ００５）に対して本発明の分化した細胞治療剤（ＲＣＢ００５‐ＤＰ１）の骨誘導遺伝子の発現レベルを骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）及び成熟した(ｍａｔｕｒｅ)骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ）と比較した結果を示す。前記骨芽細胞は、初期の骨芽細胞マーカーであるコネキシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、ＣＸ４３）、ランス２（Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２、ＲＵＮＸ２）及びコラーゲンタイプ１Ａ（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１）の発現レベルが未分化細胞及び成熟した骨芽細胞に比べて高く、オーステリック（Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＯＳＸ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣＮ）及びオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯＰＮ）の発現レベルは、成熟した(ｍａｔｕｒｅ)骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ）に比べて低いことが確認できた。図１２は、骨形成マーカータンパク質と血管誘導マーカータンパク質が未分化細胞に対して本発明の分化した骨細胞治療剤において増加したことが確認できた。（Ａ）は、ＣＯＬ１Ａ１、（Ｂ）は、オステオポンチン（ＯＰＮ）及び（Ｃ）は、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）を意味する。図１３は、本発明の分化した細胞治療剤が解凍後、３日目ないし７日目後でも骨形成マーカータンパク質と血管誘導マーカータンパク質が維持されることを示す。（Ａ）は、ＣＯＬ１Ａ１、（Ｂ）は、オステオポンチン（ＯＰＮ）及び（Ｃ）は、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）を意味する。図１４は、本発明の臍帯由来骨芽細胞の血管内皮血管形成能を示す。血管新生誘導因子として知られているＶＥＧＦ陽性対照群(ＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ)程度に臍帯由来の原料細胞（ＵｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＵＣＭＳＣ）及び骨分化細胞治療剤（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）による血管生成が誘導されることが確認でき、特に細胞治療剤により分泌されたタンパク質によって形成された血管は、より厚くて丈夫に形成されることが確認できた。図１５ａ及び図１５ｂは、本発明の細胞治療剤の大動物（ヤギ）に対する有効性の結果を示す。図１６は、本発明の細胞治療剤の小動物（ラット）に対する有効性の結果を示す。図１７ａ及び図１７ｂは、間葉系幹細胞から骨細胞への分化段階を示す。点線で示す領域が本発明の細胞治療剤の段階を意味する。図１８は、未分化ＵＣＭＳＣ（原料）と分化した骨芽細胞（ＤＰ）の２バッチで細胞分裂能をＫｉ‐６７（細胞分裂の指標）で確認した結果を示す。一貫してＫｉ－６７発現がＤＰから１％以下に急激に減少することが確認でき、これはＣＦ－Ｍ８０１が骨芽細胞モデルの初期段階の骨芽細胞であることを意味する。図１９ａ及び図１９ｂは、未分化幹細胞ＢＭＭＳＣ、ＵＣＭＳＣ（原料）と分化した骨芽細胞（ＤＰ）の２バッチを用いてＣＦＵ‐Ｆを測定した結果を示す。分化した骨芽細胞（ＤＰ、ＣＦ－Ｍ８０１）は、Ｋｉ－６７（細胞分裂の指標）発現と類似したパターンでＣＦＵ－Ｆが減少することが確認できた。図２０は、未分化幹細胞ＵＣＭＳＣ（原料）と分化した骨芽細胞（ＤＰ）の２バッチを用いてコロニー形成後、アルカリ性リン酸分解酵素（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で染色して吸光度を測定した結果を示す。分化した骨芽細胞（ＤＰ）が作ったコロニーは、未分化細胞に比べてアルカリ性リン酸分解酵素が染色され、その吸光度値が増加したことから、この細胞治療剤が増殖して作ったコロニーは、骨芽細胞であることが確認できた。図２１ａ及び図２１ｂは、本発明の分化させた骨芽細胞（ＤＰ１～ＤＰ３）は、ＣＤ１０を８０％以上発現することに対し、未分化間葉系幹細胞は、ＣＤ１０を１５％以下で発現する。これは、本発明の骨芽細胞は、従来の幹細胞標識因子ではない骨芽細胞特異的な標識因子を確認し、純度を確認して管理していることを意味した。

［実施例１］
臍帯由来幹細胞の分離及び収得
分離した臍帯からまず動脈と静脈血管を除去し、残った組織を細かく刻んで、ＡｄｉＣｏｌ^ＴＭ（ＣＥＦＯ）と３７℃で３０分以上反応させた後、細胞を抽出した。抽出された細胞は、ＣＥＦＯｇｒｏ^ＴＭ培地で３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養し、間葉系幹細胞を確保した。

［実施例２］
空気透過性ポリマー膜を界面活性剤バブルでコーティング
ハイパーフラスコの多孔質膜上でＰＢＳに完全に溶かした８％ポロキサマー４０７（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７）を振ってバブルを発生させた後、残ったポロキサマー溶液を注ぎ込んだ。２時間の間、３７℃で空気透過性ポリマー膜をポロキサマーバブルでコーティングした。顕微鏡３Ｄイメージングを通じてポロキサマー４０７バブル発生後、溶液を除去してバブルが維持されているかどうかを観察した結果、２時間後（２Ｈ)にバブルが消え始め、５時間後（５Ｈ)には、バブルが完全に消えることが確認できた（図２）。

また、臍帯由来間葉系幹細胞を追跡できるように幹細胞にｑｕａｎｔｕｍｄｏｔ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｓｉｌｉｃａｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ(ＱＤ)を２４時間ｕｐｔａｋｅした。ポロキサマー４０７バブル発生後に溶液を除去し、細胞をｌｏａｄｉｎｇした後、顕微鏡Ｚ－ｓｔａｃｋを用いて３Ｄでイメージ化した（図３)。

［実施例３］
骨芽細胞への分化及び培養
前記［実施例２］においてポロキサマーバブルでコーティングしてから２時間後、前記［実施例１］で得られた臍帯由来幹細胞を１×１０^４個／ｃｍ^２密度で接種し、ＤＭＥＭ及びＦＢＳを含む培養液で２４時間培養した。培養した幹細胞を骨分化培地で７２時間骨芽細胞に分化させた。

［実施例４］
空気透過性ポリマー膜コーティングに適した界面活性剤の選別
代表的な生体適合性界面活性剤として知られているポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ４０７、Ｐ４０７）、ココイルメチルタウリン（ＳｏｄｉｕｍＭｅｔｈｙｌＣｏｃｏｙｌＴａｕｒａｔｅ，ＤＩＡＰＯＮＫ－ＳＦ)，ツイン２０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、Ｔｗｅｅｎ２０）またはメチルプレドニゾロン（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）の毒性を確認した。

具体的には、３次元多孔質膜を含むトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）に上のチャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）には界面活性剤Ｐ４０７、ＤＩＡＰＯＮＫ－ＳＦまたはＴｗｅｅｎ２０をそれぞれ０、０.５１、５または１５％（ｖ／ｖ）でそれぞれ処理して前記［実施例２］と同様の方法で２時間コーティングした後、前記［実施例１］で得られた臍帯由来間葉系幹細胞を２０，０００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２でｓｅｅｄｉｎｇした。下のチャンバーには細胞増殖培地を入れて３日間培養した。１、２、３日目にＣＣＫ－８（Ｃａｔ．ＣＫ０４、ＤＯＪＩＮＤＯ）溶液を入れ、３７℃ＣＯ_２ｉｎｃｕｂａｔｏｒで３時間反応後、４５０ｎｍで吸光度を測定して細胞毒性（図４）及び細胞増殖程度（図５）を分析した。

また、３次元多孔質膜を含むトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）に上のチャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）には界面活性剤Ｐ４０７、ＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅまたはＴｗｅｅｎ２０を４ｍＭ濃度で処理して前記［実施例２］と同様の方法で２時間コーティングした後、前記［実施例１］で得られた臍帯由来間葉系幹細胞を２０，０００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２でｓｅｅｄｉｎｇした。下のチャンバーには細胞増殖培地を入れて３日間培養した。１、２、３日目にＣＣＫ‐８溶液を入れ、３７℃ＣＯ_２ｉｎｃｕｂａｔｏｒで３時間反応後、４５０ｎｍで吸光度を測定して細胞毒性（図６）及び細胞増殖程度（図７）を分析する。

その結果、［図４］～［図７］に示すように、Ｐ４０７を除いた残りのＤＩＡＰＯＮＫ－ＳＦ、ツイン２０及びメチルプレドニゾロンは、すべて細胞に毒性を示すことが確認できた。

［実施例５］
界面活性剤コーティング方法の選別
ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）をハイパーフラスコ多孔質膜上にバブルまたはゲル状でコーティングした後、［実施例３］の方法で分化させた臍帯由来幹細胞の骨分化の程度を比較した。

具体的には、分化誘導された骨芽細胞と未分化細胞をそれぞれ捕集してＴｒｉｚｏｌ^ＴＭとクロロホルム（Ｓｉｇｍａ）を処理し、遠心分離で層分離してｍＲＮＡのみを得た。ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＵｎｉｖｅｒｓａｌｃＤＮＡＭａｓｔｅｒＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡで合成した。その後、ＣＯＬ１Ａ１を対象としてＲＴ－ＰＣＲを通じてＤＮＡを増幅し、遺伝子レベルでのＤＮＡｃｏｐｙー数の差を確認した。ポリメラーゼ連鎖反応条件は、９５℃１０秒、５４℃１０秒、７２℃３０秒で５０ｃｙｃｌｅｓであった（図８）。

また、前記［実施例３］の方法で製造及び分化誘導された骨芽細胞及び未分化細胞の培養液を捕集し、血管内皮細胞成長因子Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）の分泌程度を酵素免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を行った（図９）。

その結果、［図８］及び［図９］に示すように、未分化又はゲル状のポロキサマーから分化した細胞に比べて、本発明の方法で分化した細胞の骨誘導遺伝子及び血管形成誘導タンパク質の発現の程度が非常に優れていることが確認できた。

［実施例６］
得られた骨芽細胞の骨形成能の評価
＜６－１＞骨芽細胞の骨形成能（遺伝子レベル)
骨芽細胞の分化過程で採取した骨芽細胞からＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲｅａｌＴｉｍｅ－ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ－ＰＣＲ)を用いて骨形成遺伝子マーカーであるランス２（Ｒｕｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２、ＲＵＮＸ２）及びコネキシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、ＣＸ４３）の遺伝子発現レベルを未分化細胞と比較した。

具体的には、前記［実施例３］の方法で製造及び分化誘導された骨芽細胞と未分化細胞をそれぞれ捕集し、Ｔｒｉｚｏｌ^ＴＭとクロロホルム（Ｓｉｇｍａ）を処理し、遠心分離を通じて層分離してｍＲＮＡのみを得た。ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＵｎｉｖｅｒｓａｌｃＤＮＡＭａｓｔｅｒＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡで合成した。その後、ＲＵＮＸ２、ＣＸ４３を対象としてＲＴ－ＰＣＲを通じてＤＮＡを増幅し、遺伝子レベルでの発現量差を確認した。ポリメラーゼ連鎖反応条件は、９５℃１０秒、５４℃１０秒、７２℃３０秒で５０サイクルであった。

また、前記［実施例３］の方法で製造及び分化誘導された骨芽細胞、未分化細胞、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）及び成熟した骨細胞（ＮＨＯｓｔ）をそれぞれ捕集してｍＲＮＡを得て、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＵｎｉｖｅｒｓａｌｃＤＮＡＭａｓｔｅｒＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡで合成した。その後、ＲＵＮＸ２、ＣＸ４３、ＣＯＬ１Ａを対象としてＲＴ－ＰＣＲを通じてＤＮＡを増幅し、遺伝子レベルでの発現量差を確認した。ポリメラーゼ連鎖反応条件は、９５℃１０秒、５４℃１０秒、７２℃３０秒で５０ｃｙｃｌｅｓであった。

その結果、［図１０］及び［図１１］に示すように、本発明の骨芽細胞において、ＲＵＮＸ２、ＣＸ４３又はＣＯＬ１Ａが未分化幹細胞及び成熟した骨細胞（ＮＨＯｓｔ）に対して高く発現されることが確認できた。［図１０］において、ＲＣＢ００１、ＲＣＢ００２及びＲＣＢ００５は、未分化細胞を意味し、ＲＣＢ００１‐ＤＰ１～ＲＣＢ００５‐ＤＰ５は、分化した本願発明の細胞治療剤を意味する。

一方、ＯＳＸ、ＯＣＮまたはＯＰＮの場合、成熟した骨細胞（ＮＨＯｓｔ）において本発明の骨芽細胞よりも高く発現されたが、これは本発明の骨芽細胞がＮＨＯｓｔに比べて未成熟骨分化段階にあることを示す（図１１）。図１１において、ＲＣＢ００１、ＲＣＢ００２及びＲＣＢ００５は、未分化細胞を意味し、ＲＣＢ００１‐ＤＰ１～ＲＣＢ００５‐ＤＰ５は、分化した本願発明の細胞治療剤を意味する。

＜６－２＞骨芽細胞の骨形成能（タンパク質レベル)
前記［実施例３］の骨芽細胞分化過程で採取した培養液及び骨芽細胞において骨形成または血管形成タンパク質マーカーとして知られているコラーゲンタイプ１Ａ（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１Ａ、ＣＯＬ１Ａ）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）またはアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｒｔｉｎ、ＡＮＧＰＴ－１）のタンパク質濃度の変化を確認した。さらに、凍結した本発明の細胞治療剤が解凍後にも骨形成タンパク質ないし血管誘導タンパク質を維持できるかどうかを確認した。

具体的には、前記［実施例３］の方法で調製及び分化誘導された骨芽細胞、未分化細胞及び分化培養液をそれぞれ捕集し、酵素免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄｉｎｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を行った。ＣＯＬ１Ａは、分化誘導された細胞と未分化細胞を採取して細胞を溶解させた細胞内のタンパク質発現変化の程度を確認し、オステオポンチン、アンジオポエチンは、分化７２時間目までの培養液でタンパク質分泌の程度を確認した。

その結果、［図１２］に示すように、前記本発明の骨芽細胞においてＣＯＬ１Ａタンパク質の発現が増加し、オステオポンチン及びアンジオポエチンの分泌がすべて高く発現されることが確認できた。また、［図１３］に示すように、解凍後３日～７日まで経過しても本発明の細胞治療剤の骨形成タンパク質ないし血管誘導タンパク質が維持されることが確認できた。［図１２］及び［図１３］において、（Ａ）はＣＯＬ１Ａ１、（Ｂ）はオステオポンチン（ＯＰＮ）及び（Ｃ）はアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）を意味する。

［実施例７］
得られた骨芽細胞の血管形成能の評価
得られた骨芽細胞によって分泌される血管形成タンパク質によるヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ＨＵＶＥＣ）の血管形成能を確認した。

具体的には、８．０μｍｐｏｒｅｓｉｚｅの多孔質膜が含まれた１２ｗｅｌｌトランスウェルプレート上には、未分化幹細胞または骨芽細胞を４×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで接種し、培養中のＨＵＶＥＣ細胞を用いてｑｕａｎｔｕｍ－ｄｏｔを２４時間ｕｐｔａｋｅさせた後、細胞を採取してトランスウェルの下に２５，０００／ｃｍ^２密度で接種した。接種した後、１日間共培養してＨＵＶＥＣの血管チューブ形成分析実験を行った。各細胞は、１２ｗｅｌｌｐｌａｔｅにｓｅｅｄｉｎｇ後、ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いて培地及び物質交換を発生させた後、１２時間培養してＨＵＶＥＣ細胞の血管誘導を確認した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上には骨分化細胞と未分化細胞を入れて比較した。陰性対照群は、コーティングされたＭａｔｒｉｇｅｌの上にＨＵＶＥＣ細胞のみを接種してＶＥＧＦのないＨＵＶＥＣ培地を用いて１２時間培養したものであり、陽性対照群は、陰性対照群と同じ条件でＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍｌを添加して培養したものである。

その結果、[図１４]に示すように、血管新生誘導因子として知られているＶＥＧＦ陽性対照群(ＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ)と似たレベルで臍帯由来の原料細胞（ＵｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＵＣ‐ＭＳＣ）と骨細胞治療剤の共培養時にチューブ（ｔｕｂｅ）の形成が起こることを確認できた。また、骨分化細胞治療剤（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）と共培養したとき、厚くて丈夫な血管が形成されることが確認でき、特に細胞治療剤によって分泌されたタンパク質によって形成された血管は、より厚くて丈夫に形成されることが確認できた。

［実施例８］
得られた骨芽細胞の骨再生能の確認－ｉｎｖｉｖｏ
大動物（ヤギ）または小動物（ラット）モデルにおいて骨欠損を誘導した後、本発明の細胞治療剤の骨再生能を確認した。

具体的には、免疫抑制させたヤギモデルにおいて大腿骨欠損を誘導した後、ヤギ１匹あたり１×１０^７骨芽細胞を処理して２６週間骨再生効果を確認した（表２）。また、ヤギモデルに対する有効性試験として骨組織を２ヶ月半脱灰し、Ｈ＆Ｅ及びＭａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色で本細胞治療剤の有効性に対する組織学的評価を行った。

免疫抑制させたラットモデルの場合、橈骨欠損を誘導した後、ラット１匹あたり１×１０^６骨芽細胞を処理して１２週間の骨再生効果を確認した（表３）。Ｓｈａｍ対照群は、アルジネートから構成されたスキャフォールドのみを処理した。骨再生の程度はμＣＴイメージによって確認し、骨組織固定、脱灰及びセクションしてスライドを作製し、染色後に新生骨再生を確認した。

ヤギモデルに対する有効性試験の結果、[図１５ａ]及び[図１５ｂ]に示したように、２６週において雄と雌ともに、対照群のｐｒｏｘｉｍａｌとｄｉｓｔａｌ部分の新生骨の形成が非常に不十分であり、部分的にのみ確認され、傷の治癒過程にあることが確認できた。一方、細胞投与群のｐｒｏｘｉｍａｌとｄｉｓｔａｌでは、欠損部位に細胞が詰まって増殖及び骨細胞に分化して新生骨柱が途切れることなく有機的によく連結されており、厚さもかなり厚くなったことが確認できた（図１５ａの左下の白矢印）。血管も規則的によく形成されていることが分かった。１３週目、２６週目のいずれも新生骨の形成は、細胞投与群でのみ有意的に観察されることが確認できた。

ラットモデルに対する有効性試験の結果、[図１６]に示すように、Ｇ３グループは、ｐａｓｓａｇｅ７で２日分化させた細胞治療剤、Ｇ５グループは、ｐａｓｓａｇｅ５で３日分化させた治療剤グループで、両グループとも対照群に比べて骨のボリューム、骨のボリューム密度、ＢＭＤなどが増加する傾向を示したが、特にｐａｓｓａｇｅ５で３日分化させた治療剤グループの骨のボリュームがより有意的に増加したことが確認できた。

［実施例９］
細胞治療剤の段階（Ｓｔａｇｅ）確認
本発明の細胞治療剤の段階を確認した。

＜９－１＞Ｋｉ－６７の発現確認
ヒトＫｉ－６７は、細胞周期中に停止期（Ｇ０)には発現せず、増殖期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ期)に発現することが知られており、細胞治療剤は、骨細胞への分化後には細胞が増殖しないため発現しない。そこで、未分化ＵＣＳＭＣ（原料)と本発明の分化した骨芽細胞（ＤＰ）の２バッチで細胞分裂能を細胞分裂の指標であるＫｉ－６７に対する発現程度を細胞免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＣＣ)で確認し、核染色物質であるＤＡＰＩを染色して細胞数に対してＫｉ‐６７の発現程度に補正した。

具体的には、ｓｌｉｄｅｐｌａｔｅを準備して各ｗｅｌｌに３×１０^５分量で未分化、分化細胞を接種した後、２４時間ＣＯ_２ｉｎｃｕｂａｔｏｒで培養した。４％ホルムアルデヒドで１０分間常温で細胞を固定し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００で常温で１０分間細胞をｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎした。ＢＳＡで常温で３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、Ｋｉ－６７１次抗体を常温で１時間、蛍光連結した２次抗体を光を遮光した後、常温で１時間反応させた。ＤＡＰＩが含まれているＰｒｏＬｏｎｇ^ＴＭＧｏｌｄＡｎｔｉｆａｄｅＭｏｕｎｔａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍｏｕｎｔｉｎｇし、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。

その結果、［図１８］に示すように、一貫してＫｉ－６７発現が骨芽細胞（ＤＰ）において１％以下に急激に減少することが確認できた。

＜９－２＞ＣＦＵ－Ｆ発現の確認
未分化幹細胞ＢＭＭＳＣ、ＵＣＭＳＣ（原料）と本発明の分化した骨芽細胞（ＤＰ）の２バッチを用いてＣＦＵ－Ｆを測定した。また、間葉系幹細胞は、体外培養を始めると、増殖を始めて特徴的な細胞集落を形成することが知られているが、集落内の細胞は、線維芽細胞のような形状を示し、それぞれの細胞集落をＣｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔといい、これは幹細胞の重要な特徴として知られている。そこで、形成されたコロニーを２％ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ染色実施後、目視及びカメラ写真で観察し、染色されたコロニーを３ｍｍ以上、ｄｅｎｓｉｔｙ８０％以上であることを計数することにより定量した。

その結果、[図１９ａ]及び[図１９ｂ]に示すように、分化した骨芽細胞（ＤＰ、ＣＦ－Ｍ８０１）は、Ｋｉ－６７（細胞分裂の指標）発現と類似したパターンでＣＦＵ－Ｆが減少することを確認できた。また、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞である原料細胞では、コロニーが多量に形成されたが、細胞治療剤では、コロニー形成がほとんどできないことを確認した。これにより、臍帯由来幹細胞原料細胞は、骨分化細胞に分化することにより、コロニー形成能を喪失したものと判断した。この結果から細胞治療剤は、原料細胞からほとんどが分化したことを確認した。

＜９－３＞ＡＬＰ発現の確認
細胞治療剤ＣＦ‐Ｍ８０１を用いたＣＦＵ‐Ｆにおいて平均１％未満で現れるコロニーを形成する細胞が未分化間葉系幹細胞であるか、骨分化誘導された細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）であるかを確認した。

具体的には、前記実施例＜９－２＞においてＣＦＵ－Ｆと同様の方法で培養して現れるコロニーをＡＬＰ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色法で染色して骨分化の有無を確認した。１０，０００個の細胞を接種して１週間維持した後、ＡＬＰ染色を行った。ＡＬＰ染色後、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅを反応させて染色を十分に溶かして上清液のみを採取した後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒで吸光度を測定した。

その結果、[図２０]に示すように、同種臍帯由来間葉系幹細胞である未分化ＵＣＭＳＣは、ＡＬＰ染色が殆ど行われなかったが、骨分化誘導されたＣＦ－Ｍ８０１は、互いに異なる３つのｌｏｔでコロニーがすべてＡＬＰ陽性であることが確認できた。また、骨分化誘導されたＣＦ－Ｍ８０１が未分化細胞に比べて高い吸光度を示した。これを相対値に変換して分析した結果、未分化ＵＣＭＳＣに対してすべての場合において１.５倍以上高い値を示した。結果として、分化した骨芽細胞（ＤＰ）は、一定期間は、細胞分裂が止まらない状態であり、分化が進むにつれて分裂能を次第に失い、骨細胞に分化することを確認した。

総合的に、本発明の細胞治療剤は、骨細胞分化のｍａｓｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒであるＲＵＮＸ２が間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができる。初期段階の骨芽細胞（ｏｓｔｅｏ－ｐｒｏｇｅｎｉｏｔｒｓ、ｉｍｍａｔｕｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）は、ＲＵＮＸ２＋であり、増殖能を有し、成熟した骨細胞に分化し、ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎがさらに行われることが分かった（図１７ａ及び図１７ｂ）。

＜９－４＞ＣＤ－１０発現の確認
細胞治療剤分化の確認のためにＣＤ１０に対する発現程度をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ）及び細胞免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＣＣ）により確認した。

具体的には、前記［実施例３］の方法により製造及び分化誘導された骨芽細胞、未分化細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を２％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ溶液で細胞を浮遊させた。ＣＤ１０１次抗体を常温で１時間反応させ、ウォッシングした後にＦＩＴＣ蛍光が連結した２次抗体を常温で３０分間反応させた。細胞をウォッシングした後、上清液を除去し、３．７％ホルムアルデヒドを入れて常温で２０分間固定した後、フローサイトメトリー（ＢＤＡｃｃｕｒｉＣ６Ｐｌｕｓ）を用いてＣＤ１０の発現程度を確認した。

ＩＣＣは、ｓｌｉｄｅｐｌａｔｅを準備し、各ｗｅｌｌに３×１０^５分量で未分化、分化細胞を接種した後、２４時間ＣＯ_２ｉｎｃｕｂａｔｏｒで培養した。４％ホルムアルデヒドで１０分間常温で細胞を固定し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で常温で１０分間細胞をｐｅｒｍｅａｂｉｌｉzａｔｉｏｎした。ＢＳＡで常温で３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、ＣＤ１０１次抗体を常温で１時間、ＦＩＴＣ蛍光連結した２次抗体を光を遮光した後、常温で１時間反応させた。ＤＡＰＩが含まれているＰｒｏＬｏｎｇ^ＴＭＧｏｌｄＡｎｔｉｆａｄｅＭｏｕｎｔａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍｏｕｎｔｉｎｇし、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。

その結果、［図２１ａ］及び［図２１ｂ］に示したように、本発明の分化させた骨芽細胞（ＤＰ１～ＤＰ３）は、ＣＤ１０を８０％以上発現することに対し、未分化間葉系幹細胞は、ＣＤ１０を１５％以下で発現することを確認できた。これは、本発明の骨芽細胞は、従来の幹細胞標識因子ではない骨芽細胞特異的な標識因子を確認し、純度を確認管理していることを意味した。

本発明による分化方法は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に安定的かつ迅速に分化させることができる。前記分化した骨芽細胞は、血管形成能に優れており、骨形成能に優れている。したがって、本発明による幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法ないし前記方法で得られた骨芽細胞は、骨疾患に関連した細胞治療剤ないし治療方法用途としても効果的に使用でき、産業上の利用可能性がある。

Claims

ｉ）空気透過性ポリマー膜をポロキサマー(ｐｏｌｏｘａｍｅｒ)バブルでコーティングする段階と、
ｉｉ）前記段階ｉ）のバブルに間葉系幹細胞を１×１０^３～１×１０^５個／ｃｍ^２の密度で接種する段階と、
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）の間葉系幹細胞を分化培地中で骨芽細胞に分化させる段階と、
ｉｖ）前記段階ｉｉｉ）で分化させた骨芽細胞を分離及び得る段階と、
を含み、
前記段階ｉ）のバブルは、前記空気透過性ポリマー膜の上でポロキサマーを入れて動かしてバブルを発生させる段階を含んで製造される、
間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法。
前記段階ｉｉ）の間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、胎盤、羊膜、骨髄、脂肪、毛包、歯、歯髄及び皮膚真皮からなる群から選ばれるいずれか一つ以上に由来することを特徴とする、請求項１に記載の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法。