JP7588466B2 - Methods for producing parvovirus - Google Patents
Methods for producing parvovirus Download PDFInfo
- Publication number
- JP7588466B2 JP7588466B2 JP2020008613A JP2020008613A JP7588466B2 JP 7588466 B2 JP7588466 B2 JP 7588466B2 JP 2020008613 A JP2020008613 A JP 2020008613A JP 2020008613 A JP2020008613 A JP 2020008613A JP 7588466 B2 JP7588466 B2 JP 7588466B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- density gradient
- parvovirus
- virus
- solution
- sucrose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、単分散化されたパルボウイルスの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a monodispersed parvovirus.
ウイルスはヒトを含め多くの動植物や微生物に感染して増幅する。ウイルスにはゲノムとしてＤＮＡを有するものとＲＮＡを有するものが存在し、それぞれに異なる増幅機構を有する。ウイルスはそれ単独で増えることはできず、動物、植物又は微生物の細胞に感染して、その細胞の機能を利用して自らを複製することができる。 Viruses infect and multiply in many animals, plants, and microorganisms, including humans. Some viruses have DNA as their genome, while others have RNA, and each has a different amplification mechanism. Viruses cannot multiply on their own, but can infect the cells of animals, plants, or microorganisms and use the functions of those cells to replicate themselves.
主なウイルスの一つにパルボウイルスがある。パルボウイルス科のウイルスは、いずれも４～６ｋｂ一本鎖ＤＮＡを持つウイルスであり、ウイルス粒子の直径は１８～２２ｎｍで、生二十面体をしており、エンベロープを持たず、エーテル、クロロホルム、熱等に耐性を有する（非特許文献１）。 One of the main viruses is the parvovirus. All viruses in the Parvoviridae family have single-stranded DNA of 4 to 6 kb, and the virus particles have a diameter of 18 to 22 nm, are icosahedral, non-enveloped, and are resistant to ether, chloroform, heat, etc. (Non-Patent Document 1).
パルボウイルス科のウイルスは、パルボウイルス亜科とデンソウイルス亜科に分けられる。パルボウイルス亜科のウイルスは、複数の属に分類される。遺伝子治療に利用されるアデノ随伴ウイルスなどからなるディペンドウイルス属、ヒトに感染しリンゴ病を引き起こすＢ１９などからなるエリスロウイルス属、そしてイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）などからなるパルボウイルス属などがある。 Viruses in the Parvoviridae family are divided into the Parvovirinae and Densovirinae subfamily. Viruses in the Parvovirinae subfamily are classified into several genera. These include the Dependovirus genus, which is made up of the adeno-associated virus used in gene therapy, the Erythrovirus genus, which is made up of B19, which infects humans and causes fifth disease, and the Parvovirus genus, which is made up of canine parvovirus (CPV), feline parvovirus (FPV), goose parvovirus (GPV), and minute virus of mice (MVM).
パルボウイルスは製薬業界において重要視されるウイルスである。遺伝子組換え製剤（バイオ医薬品）や抗体医薬などの生物由来の医薬品は、製剤がウイルスに汚染されていないこと（ウイルス安全性）を保証するために、製造工程のウイルスクリアランス（除去性能）を評価しバリデーションする必要がある。バイオ医薬品等のウイルス安全性に関する研究文献においても、細胞・組織加工製品に混入する可能性のあるウイルスとして、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）が挙げられている（非特許文献２）。 Parvovirus is a virus that is considered important in the pharmaceutical industry. To ensure that biologically derived pharmaceuticals such as genetically modified preparations (biopharmaceuticals) and antibody drugs are not contaminated by viruses (viral safety), it is necessary to evaluate and validate the virus clearance (removal performance) of the manufacturing process. Research literature on the viral safety of biopharmaceuticals also lists minute virus of mice (MVM) as a virus that may be contaminating cell and tissue processed products (Non-Patent Document 2).
そのため、医薬品製造の各工程前の段階の中間製造品にＭＶＭを添加して、工程前後のウイルス量を定量することにより、個々の工程のウイルスクリアランスの測定が行われる。その際、１０7単位又は１０8単位以上のウイルスを準備することが必要な場合がある。さらに、実際には一つの試験について同一条件を複数回繰り返す必要があるため、１０7単位又は１０8単位の何倍ものウイルスの準備が必要となる。このように、バイオ医薬品のウイルスクリアランス試験を行うためには、大量のウイルス溶液が必要とされる。 Therefore, MVM is added to the intermediate product before each process of pharmaceutical manufacturing, and the amount of virus before and after the process is quantified to measure the virus clearance of each process. In this case, it may be necessary to prepare 107 units or 108 units or more of virus. Furthermore, since it is actually necessary to repeat the same conditions multiple times for one test, it is necessary to prepare many times more than 107 units or 108 units of virus. Thus, a large amount of virus solution is required to perform a virus clearance test for a biopharmaceutical.
パルボウイルスを生産する方法としては、宿主細胞を培養し、ウイルスを感染させて培養し、回収したウイルスを精製する方法が知られている。マウス微小ウイルスの宿主細胞としては、Ａ９細胞や３２４Ｋ細胞（シミアンウイルス４０で形質転換されたヒト線維芽細胞、ＮＢ３２４Ｋと表記される場合もある）が知られている（特許文献１～３、非特許文献３）。培養上清に１０8 ＴＣＩＤ50／ｍＬ以上の高感染価のマウス微小ウイルスを生産させる方法も知られている（特許文献２、４）。 Known methods for producing parvovirus include culturing host cells, infecting and culturing the virus, and purifying the collected virus. Known host cells for minute virus of mice include A9 cells and 324K cells (human fibroblasts transformed with simian virus 40, sometimes written as NB324K) (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Document 3). Methods for producing minute virus of mice with a high infectivity titer of 10 8 TCID 50 /mL or more in a culture supernatant are also known (Patent Documents 2 and 4).
回収したウイルスは、力価が十分高ければ、濃縮などの精製を必要とせずに、低速遠心や除菌膜濾過（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のみでウイルスクリアランス試験に使用することができる（特許文献２、特許文献４）。また、濃縮・精製を行ってウイルスの感染価を高めたり不純物濃度を下げたりする方法も知られている（特許文献１）。 If the titer of the recovered virus is sufficiently high, it can be used in a virus clearance test by only low-speed centrifugation or membrane filtration for separation of microorganisms without the need for purification such as concentration (Patent Document 2, Patent Document 4). In addition, a method is also known in which the virus is concentrated and purified to increase the infectivity titer or reduce the impurity concentration (Patent Document 1).
本発明が解決しようとする課題は、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を正確に評価することのできるパルボウイルスを製造する方法を提供すること等にある。また、別の課題は、会合状態にあるパルボウイルスを単分散化する方法を提供することにある。 The problem that the present invention aims to solve is to provide a method for producing parvovirus that allows accurate evaluation of the virus clearance performance of a virus removal membrane. Another problem is to provide a method for monodispersing parvovirus in an aggregated state.
生物製剤の製造におけるウイルス除去工程として、粒子サイズのふるい効果に基づいた分離機構（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を有する膜分離工程を導入する場合、ウイルス除去膜のパルボウイルスのクリアンス能力を評価することになる。本発明者らは、使用するウイルスによっては会合状態で存在し、そのような会合状態にあるウイルスをウイルスクリアランス試験において使用すると、本来ウイルス除去膜を通るはずのウイルスがウイルス除去膜に捕捉されてしまい、ウイルス除去性能を過剰評価（過大評価）してしまうリスクがあるという問題点を見出した。これは、ウイルスが会合状態で存在するとウイルスの実質的なサイズが一分子のサイズよりも大きくなるためである。 When a membrane separation process having a separation mechanism based on the sieving effect of particle size (size exclusion) is introduced as a virus removal process in the manufacture of biological products, the parvovirus clearance ability of the virus removal membrane is evaluated. The inventors have found that some viruses exist in an associated state, and when such associated viruses are used in a virus clearance test, viruses that would normally pass through the virus removal membrane are captured by the virus removal membrane, posing a risk of overestimating (overestimating) the virus removal performance. This is because when viruses exist in an associated state, the actual size of the virus becomes larger than the size of a single molecule.
本発明者らは上記問題点を初めて見出し、当該問題点への気づきをきっかけに鋭意検討を行った結果、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心にウイルスを適用することにより単分散化されたウイルスを取得することを可能とした。そしてウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能評価試験において当該単分散化されたウイルスを使用することにより、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能の評価を従来よりも正確にすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventors first discovered the above problem, and after becoming aware of it, they conducted extensive research, which led them to discover that it is possible to obtain monodispersed viruses by subjecting the viruses to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient liquid. They then discovered that by using the monodispersed viruses in a virus removal membrane virus clearance performance evaluation test, it is possible to evaluate the virus removal membrane virus clearance performance more accurately than before, and thus completed the present invention.
従来公知のパルボウイルスの生産方法や精製方法は、パルボウイルスの感染価を高くすることや不純物濃度を低くすることに目的が置かれており、ウイルス粒子の分散状態に関して全く着目しておらず、単分散状態にあるウイルスの取得方法は全く知られていない。また、実際にウイルス分散性に関し、パルボウイルス懸濁液を０．１μｍ膜で濾過して、通過するかどうかを確認することで検証されているケースもある（特許文献１）。しかし、パルボウイルスの一分子（ｏｎｅ ｖｉｒｉｏｎ）の大きさは１８～２２ｎｍであり（非特許文献１）、二分子が会合した３６～４４ｎｍサイズの会合体や、三分子又は四分子が会合した凝集体でも０．１μｍ膜を通過する。そのため、０．１μｍ膜による濾過を用いた検証はパルボウイルスの凝集状態の確認には不十分であり、凝集状態が確認できているとは言えない。０．１μｍ膜で濾過したウイルス懸濁液をウイルスクリアランス試験に使用した場合、これらの会合体を含んでいる可能性が否定できず、サイズ分離膜の評価で過大評価をしてしまうリスクがある。 Conventionally known methods for producing and purifying parvovirus aim to increase the infectivity of parvovirus and to reduce the concentration of impurities, and do not pay any attention to the dispersion state of virus particles, and no method for obtaining a virus in a monodispersed state is known. In addition, in some cases, the virus dispersibility has actually been verified by filtering a parvovirus suspension through a 0.1 μm membrane to confirm whether it passes through (Patent Document 1). However, the size of one parvovirus molecule is 18 to 22 nm (Non-Patent Document 1), and even an aggregate of 36 to 44 nm in size in which two molecules are associated, or an aggregate in which three or four molecules are associated, can pass through a 0.1 μm membrane. Therefore, verification using filtration through a 0.1 μm membrane is insufficient to confirm the aggregated state of parvovirus, and it cannot be said that the aggregated state has been confirmed. When a virus suspension filtered through a 0.1 μm membrane is used in a virus clearance test, the possibility that it contains these aggregates cannot be denied, and there is a risk of overestimating the size separation membrane.
すなわち、本発明としては以下が挙げられる。
［１］１）パルボウイルス含有液を、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心に適用する工程と、２）パルボウイルスを含む画分を回収する工程を含む、単分散化されたパルボウイルスを製造する方法。
［２－１］パルボウイルス含有液が、パルボウイルスの培養液である、前記［１］に記載の方法。
［２－２］パルボウイルスの培養液が、パルボウイルスの感染細胞を培養した培養上清及び／又は感染細胞破砕物である、前記［２－１］に記載の方法。
［３］単分散化されたパルボウイルスを３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した場合の対数除去率ＬＲＶが１．０未満である、前記［１］～［２－２］のいずれかに記載の方法。
なお、上記［１］～［２－２］のように引用するが範囲で示され、その範囲内に〔２－１〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔２－１〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
［４］前記密度勾配超遠心における密度勾配が、段階的（ステップグラジエント）密度勾配である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記密度勾配液がスクロースを含む、前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記有機物媒体含有液が、４０％以下のスクロース溶液層及び４０％を超えるスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液である前記［５］に記載の方法。
［７］前記有機物媒体含有液が、４０％スクロース溶液層及び６０％スクロース溶液層を含む段階的密度勾配液である、前記［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記有機物媒体含有液が、１５％スクロース溶液層、３０％スクロース溶液層、４５％スクロース溶液層、及び６０％スクロース溶液層を含む段階的密度勾配液である、前記［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［９］前記密度勾配が、連続的密度勾配である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［１０－１］前記密度勾配液が、段階的（ステップグラジエント）に重層した溶液を１２～２４時間静置することによって準備される連続的密度勾配液である、前記［９］に記載の方法。
［１０－２］前記密度勾配液が、段階的（ステップグラジエント）に重層した溶液を１４～１８時間静置することによって準備される連続的密度勾配液である、前記［９］に記載の方法。
［１１］前記段階的に重層した溶液が、４０％以下のスクロース溶液層及び４０％を超えるスクロース溶液層を少なくとも含む溶液である、前記［９］～［１０－２］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記段階的に重層した溶液が、１５％スクロース溶液層、３０％スクロース溶液層、４５％スクロース溶液層、及び６０％スクロース溶液層を含む、前記［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３－１］前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が２０，０００～３００，０００（ｈ×ｇ）である、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１３－２］前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が１９７４１００（ｈ×ｇ）である、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３－３］前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）が１０３９００（ｇ）× １９（ｈ）である、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記パルボウイルスを含む画分の溶媒を交換する工程をさらに含む、前記［１］～［１３－３］のいずれかに記載の方法。
［１５］パルボウイルスの回収率が５０％以上である、前記［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］パルボウイルスがマウス微小ウイルスである、前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７－１］単分散化されたパルボウイルスをタンパク質含有溶液に添加する工程を含む、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。
［１７－２］前記［１］～［１６］のいずれかに記載の方法により単分散化されたパルボウイルスをタンパク質含有溶液に添加する工程を含む、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。
［１８］パルボウイルス含有液を有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心に適用し、単分散化されたパルボウイルスを取得する工程、及び
前記単分散化されたパルボウイルス含有液をタンパク質含有溶液に添加する工程
を含む、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。
［１９］前記単分散化されたパルボウイルス含有液が添加されたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に供する工程をさらに含む、前記［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］ウイルスの除去又は不活化を評価する工程をさらに含む、前記［１７－１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記［１］から［１５］に記載の特徴を有する、前記［１７－１］～［２０］のいずれかに記載の方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] A method for producing a monodispersed parvovirus, comprising: 1) the steps of subjecting a parvovirus-containing solution to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient solution; and 2) the steps of recovering a fraction containing the parvovirus.
[2-1] The method according to [1] above, wherein the parvovirus-containing liquid is a culture solution of a parvovirus.
[2-2] The method according to the above [2-1], wherein the culture solution of the parvovirus is a culture supernatant of cells infected with the parvovirus and/or an infected cell lysate.
[3] The method according to any of the above [1] to [2-2], wherein the logarithmic removal rate (LRV) when the monodispersed parvovirus is filtered through a membrane having a pore size of 35 nm is less than 1.0.
In addition, when a citation is indicated as a range such as [1] to [2-2] above and an item with a sub-number such as [2-1] is located within that range, it means that the item with the sub-number such as [2-1] is also cited. The same applies below.
[4] The method according to any one of [1] to [3] above, wherein the density gradient in the density gradient ultracentrifugation is a step gradient density gradient.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the density gradient solution contains sucrose.
[6] The method according to [5], wherein the organic medium-containing liquid is a stepwise density gradient liquid containing at least a sucrose solution layer of 40% or less and a sucrose solution layer of more than 40%.
[7] The method according to any one of [4] to [6], wherein the organic medium-containing liquid is a stepwise density gradient liquid containing a 40% sucrose solution layer and a 60% sucrose solution layer.
[8] The method according to any one of [4] to [6], wherein the organic medium-containing liquid is a stepwise density gradient liquid including a 15% sucrose solution layer, a 30% sucrose solution layer, a 45% sucrose solution layer, and a 60% sucrose solution layer.
[9] The method according to any one of [1] to [3], wherein the density gradient is a continuous density gradient.
[10-1] The method according to [9], wherein the density gradient solution is a continuous density gradient solution prepared by allowing a solution layered in a stepwise manner (step gradient) to stand for 12 to 24 hours.
[10-2] The method according to [9], wherein the density gradient solution is a continuous density gradient solution prepared by allowing a solution layered in a stepwise manner (step gradient) to stand for 14 to 18 hours.
[11] The method according to any one of [9] to [10-2], wherein the stepwise layered solution is a solution containing at least a sucrose solution layer of 40% or less and a sucrose solution layer of more than 40%.
[12] The method according to any one of [9] to [11], wherein the stepwise layered solutions include a 15% sucrose solution layer, a 30% sucrose solution layer, a 45% sucrose solution layer, and a 60% sucrose solution layer.
[13-1] The method according to any one of [1] to [12] above, wherein the product (h×g) of the relative centrifugal force (g)×centrifugation time (h) of the density gradient ultracentrifugation is 20,000 to 300,000 (h×g).
[13-2] The method according to any one of [1] to [11], wherein the product (h×g) of the relative centrifugal force (g)×centrifugation time (h) of the density gradient ultracentrifugation is 1,974,100 (h×g).
[13-3] The method according to any one of [1] to [11] above, wherein the relative centrifugal force (g) × centrifugation time (h) of the density gradient ultracentrifugation is 103,900 (g) × 19 (h).
[14] The method according to any of [1] to [13-3], further comprising a step of exchanging a solvent for a fraction containing the parvovirus.
[15] The method according to any of [1] to [14], wherein the recovery rate of the parvovirus is 50% or more.
[16] The method according to any one of [1] to [15] above, wherein the parvovirus is minute virus of mice.
[17-1] A method for evaluating the virus clearance performance of a virus removal membrane, comprising a step of adding a monodispersed parvovirus to a protein-containing solution.
[17-2] A method for evaluating the virus clearance performance of a virus removal membrane, comprising a step of adding a parvovirus monodispersed by the method according to any one of [1] to [16] above to a protein-containing solution.
[18] A method for evaluating the virus clearance performance of a virus removal membrane, comprising the steps of: applying a parvovirus-containing liquid to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient liquid to obtain monodispersed parvovirus; and adding the monodispersed parvovirus-containing liquid to a protein-containing solution.
[19] The method according to [17] or [18], further comprising a step of subjecting a protein-containing solution to which the monodispersed parvovirus-containing solution has been added, to a virus removal membrane.
[20] The method according to any one of [17-1] to [19], further comprising a step of evaluating removal or inactivation of the virus.
[21] The method according to any one of [17-1] to [20], having the characteristics described in [1] to [15].
本発明により、単分散化されたパルボウイルスを製造することが可能となる。これにより、パルボウイルスを用いたウイルス除去膜のウイルスクリアランス試験において、ウイルス除去膜のウイルス分離性能を過大評価することなく、従来よりも正確に評価することが可能となる。ウイルス除去膜のウイルスクリアランスを正確に評価できることは、生物製剤の安全性担保をより正しく行うことができる点で有利である。 The present invention makes it possible to produce monodispersed parvovirus. As a result, in a virus clearance test of a virus removal membrane using parvovirus, it becomes possible to evaluate the virus separation performance of the virus removal membrane more accurately than before without overestimating it. The ability to accurately evaluate the virus clearance of a virus removal membrane is advantageous in that it allows for more accurate assurance of the safety of biological products.
以下、本発明を実施するための形態（以下、「実施形態」と言うことがある）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。また、以下に示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、これらの例示に限定されるものではない。 The following describes the form for carrying out the present invention (hereinafter sometimes referred to as "embodiment"). The present invention is not limited to the following embodiment, and can be practiced in various modifications within the scope of the gist. Furthermore, the embodiment shown below is an example of a method for embodying the technical idea of this invention, and is not limited to these examples.
一つの実施形態において、パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、又はマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）が例示される。好ましいパルボウイルスの例として、マウス微小ウイルスが例示される。マウス微小ウイルスは、パルボウイルス科、その中のパルボウイルス亜科におけるパルボウイルス属に属するウイルスである。マウス微小ウイルスはＭＶＭ（Ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）又はＭＭＶ（Ｍｉｃｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ）と呼ばれることもある。 In one embodiment, the parvovirus is exemplified by adeno-associated virus, human parvovirus B19, canine parvovirus (CPV), feline parvovirus (FPV), goose parvovirus (GPV), or minute virus of mice (MVM). A preferred example of the parvovirus is minute virus of mice. Minute virus of mice is a virus belonging to the Parvovirus genus in the Parvoviridae family, the Parvovirinae subfamily. Minute virus of mice is also called MVM (Minute virus of mice) or MMV (Mice minute virus).
一つの実施形態において、単分散化の対象とされるパルボウイルスは、会合状態にあればよい。パルボウイルスを感染させた宿主細胞を培地で培養した結果得られる、パルボウイルスの培養液も、パルボウイルス含有液の一つとして例示される。パルボウイルスは、宿主細胞に感染した状態で存在していてもよいし、パルボウイルス含有液（例えばパルボウイルスの培養液）中に遊離した状態で存在していてもよい。パルボウイルス含有液は、宿主細胞にパルボウイルスを感染させて培養することにより得られた培養物の培養上清及び／又は感染した細胞の破砕物（以下、単に「感染細胞破砕物」ともいう）であってもよい。「培養上清」としては、感染培養後の培地が例示される。「感染細胞破砕物」としては、感染培養後の細胞を凍結融解やホモジェナイズによって破砕した、いわゆるライゼートが例示される。 In one embodiment, the parvovirus to be monodispersed may be in an associated state. A parvovirus culture solution obtained by culturing host cells infected with the parvovirus in a medium is also an example of a parvovirus-containing solution. The parvovirus may be present in a state of infecting the host cells, or may be present in a free state in the parvovirus-containing solution (e.g., a parvovirus culture solution). The parvovirus-containing solution may be a culture supernatant of a culture obtained by infecting host cells with the parvovirus and culturing the cells, and/or a homogenate of the infected cells (hereinafter, also simply referred to as "infected cell homogenate"). An example of the "culture supernatant" is a medium after infection culture. An example of the "infected cell homogenate" is a so-called lysate obtained by homogenizing cells after infection culture by freezing and thawing.
凍結融解やホモジェナイズは、細胞と培養上清を一緒にして行うこともできるし、培養上清を分離した後に、適切な液体（新鮮培地、ＰＢＳなどの緩衝液など）を細胞に加えて行うこともできる。
凍結融解による細胞破壊は周知の方法である（非特許文献４、非特許文献６）。凍結と融解を交互に３～６回繰り返せばよい。通常は５回の凍結融解で十分に細胞は破壊され、内部のウイルスを回収することができる。また、細胞のホモジェナイズもすでに汎用的な方法であり、既知の方法（非特許文献４等）で細胞を破壊すれば、内部のウイルスを回収できる。あるいは、純水を加えて行う浸透圧により細胞破壊することによっても、細胞内部のウイルスを抽出することができる（非特許文献６）。
Freezing and thawing or homogenization can be performed on the cells and the culture supernatant together, or after separating the culture supernatant, an appropriate liquid (fresh medium, a buffer such as PBS, etc.) can be added to the cells.
Cell destruction by freezing and thawing is a well-known method (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 6). Freezing and thawing can be repeated alternately 3 to 6 times. Usually, 5 freeze-thaw cycles are sufficient to destroy the cells and recover the viruses inside them. Cell homogenization is also a commonly used method, and if the cells are destroyed by a known method (Non-Patent Document 4, etc.), the viruses inside the cells can be recovered. Alternatively, the viruses inside the cells can be extracted by destroying the cells by osmotic pressure caused by adding pure water (Non-Patent Document 6).
パルボウイルス含有液に含まれる不純物量を減らし、精製効率を上げる観点から、不純物の少ない培養上清から精製することが好ましい。さらに、不純物量をより少なくするために、培地は血清を含まない無血清培地であることが好ましい。 From the viewpoint of reducing the amount of impurities contained in the parvovirus-containing liquid and increasing purification efficiency, it is preferable to purify from a culture supernatant containing few impurities. Furthermore, in order to further reduce the amount of impurities, it is preferable that the medium is a serum-free medium that does not contain serum.
一つの実施形態において、培養液は、パルボウイルスが感染した宿主細胞を培養可能なものであれば特に限定されないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ培地、又はＦ－１２培地を含む液が例示される。 In one embodiment, the culture medium is not particularly limited as long as it is capable of culturing host cells infected with a parvovirus, and examples thereof include a liquid containing Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Eagle's Minimal Essential Medium, or F-12 medium.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液は、パルボウイルスを含有する液であれば特に限定されないが、溶液、懸濁液、又はゲル状液が例示され、溶液が好ましい態様として例示される。溶液の例として、パルボウイルスの培養液が挙げられる。 In one embodiment, the parvovirus-containing liquid is not particularly limited as long as it contains parvovirus, but examples include a solution, a suspension, or a gel-like liquid, with a solution being a preferred embodiment. An example of the solution is a culture solution of parvovirus.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液のｐＨとしては、パルボウイルスを培養できるｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨの下限値として５以上、６以上、７以上が例示される。ｐＨの上限値としては、１０以下、９以下、８以下が例示される。 In one embodiment, the pH of the parvovirus-containing liquid is not particularly limited as long as the parvovirus can be cultured, but examples of the lower limit of the pH include 5 or more, 6 or more, and 7 or more. Examples of the upper limit of the pH include 10 or less, 9 or less, and 8 or less.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液の血清含有量としては、０％、３％、５％、１０％が例示される。 In one embodiment, the serum content of the parvovirus-containing liquid is, for example, 0%, 3%, 5%, or 10%.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液が含有する血清としては、ＦＢＳ（牛胎児血清）、ＦＣＳ（仔牛血清）が例示される。 In one embodiment, the serum contained in the parvovirus-containing liquid is exemplified by FBS (fetal bovine serum) and FCS (calf serum).
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液中のウイルス濃度としては、密度勾配超遠心により単分散化されたウイルスを取得できるウイルス濃度であれば特に限定されないが、上限として１０12単位／ｍＬ以下、１０11単位／ｍＬ以下、１０10単位／ｍＬ以下、又は１０9単位／ｍＬ以下が例示される。下限として、１０6単位／ｍＬ以上、１０7単位／ｍＬ以上、又は１０8単位／ｍＬ以上が例示される。 In one embodiment, the virus concentration in the parvovirus-containing solution is not particularly limited as long as it is a virus concentration at which a monodispersed virus can be obtained by density gradient ultracentrifugation, and examples of the upper limit include 10 units /mL or less, 10 units/mL or less, 10 units/mL or less, or 10 units/mL or less. Examples of the lower limit include 10 units/mL or more, 10 units/mL or more, or 10 units/mL or more.
一つの実施形態において、密度勾配超遠心に使用される有機性の密度勾配液の溶質としては、密度勾配超遠心により単分散化されたパルボウイルスを取得できる有機性の密度勾配液であれば特に限定されないが、スクロース（ショ糖）又はイオジキサノールが例示され、スクロース（ショ糖）が好ましい態様として例示される。 In one embodiment, the solute of the organic density gradient liquid used in density gradient ultracentrifugation is not particularly limited as long as it is an organic density gradient liquid that can obtain monodispersed parvovirus by density gradient ultracentrifugation, but examples thereof include sucrose (cane sugar) and iodixanol, and sucrose (cane sugar) is a preferred embodiment.
一つの実施形態において、有機性の密度勾配液の溶媒としては、前記有機性の密度勾配液の溶質を溶解できる液体であれば特に限定されないが、ＴＮＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ－ＥＤＴＡ緩衝液）、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液）、又はＰＢＳ緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）であることが例示され、ＴＮＥ緩衝液であることが好ましい。 In one embodiment, the solvent for the organic density gradient liquid is not particularly limited as long as it is a liquid capable of dissolving the solutes of the organic density gradient liquid, but examples include TNE buffer (Tris-NaCl-EDTA buffer), TE buffer (Tris-EDTA buffer), or PBS buffer (Phosphate buffered saline), and TNE buffer is preferred.
一つの実施形態において、有機性の密度勾配液のｐＨとしては、密度勾配超遠心により単分散化されたウイルスを限定できるｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨの下限値として５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上が例示される。ｐＨの上限値としては、９．０以下、８．５以下、８．０以下、７．５以下が例示される。 In one embodiment, the pH of the organic density gradient solution is not particularly limited as long as it is a pH that can limit the viruses monodispersed by density gradient ultracentrifugation, but examples of lower limit values of pH include 5.0 or more, 5.5 or more, 6.0 or more, 6.5 or more, and 7.0 or more. Examples of upper limit values of pH include 9.0 or less, 8.5 or less, 8.0 or less, and 7.5 or less.
一つの実施形態において、単分散化された状態（単に「単分散化」ともいう）とは、ウイルスが会合（凝集）していない状態をいう。具体的には、本実施形態における単分散化とは、ウイルスを３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した際に、対数除去率（Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ：ＬＲＶ）が１．０未満になることが例示される。会合状態とは、パルボウイルス同士が結合し、３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した際のＬＲＶが１．０以上になる状態が例示される。会合状態は凝集状態と呼ばれることもある。単分散化したウイルスのサイズは、そのウイルスとして通常認識されているウイルスサイズとなる。そのため、ウイルスの単分散化は、ウイルスが会合することによってウイルスサイズが大きくなった結果、ウイルス除去膜のウイルスクリアランスが過大評価されるのを防ぐことができる。 In one embodiment, the monodispersed state (also simply referred to as "monodispersion") refers to a state in which the viruses are not associated (aggregated). Specifically, in this embodiment, monodispersion is exemplified by a logarithmic reduction value (LRV) of less than 1.0 when the viruses are filtered through a membrane with a pore size of 35 nm. An association state is exemplified by a state in which parvoviruses are bound to each other and the LRV is 1.0 or more when the viruses are filtered through a membrane with a pore size of 35 nm. The association state is sometimes called an aggregation state. The size of a monodispersed virus is the virus size that is normally recognized as that virus. Therefore, monodispersion of the virus can prevent the virus clearance of the virus removal membrane from being overestimated as a result of the virus size increasing due to virus association.
ＬＲＶは以下の通り算出することができる。
ＬＲＶ＝｛濾過前のウイルス感染価（ｌｏｇ10［ＴＣＩＤ50／ｍＬ］）｝－｛濾過後のウイルス感染価（ｌｏｇ10［ＴＣＩＤ50／ｍＬ］）｝
The LRV can be calculated as follows:
LRV = {virus infectivity before filtration (log 10 [TCID 50 /mL])} - {virus infectivity after filtration (log 10 [TCID 50 /mL])}
感染価は、ウイルスの量（濃度）を表記する単位である。感染価の測定方法には、最小感染単位を決定する終末点（Ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）方式と、ウイルスによって形成される局所病巣算定方式がある。終末点方式としては、ウイルスを段階希釈して、一定数以上の培養細胞に接種し、一定期間培養して、感染の陽性／陰性を判定することで、５０％感染陽性となる希釈倍率を求める、５０％感染終末点（ＴＣＩＤ50： Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ５０）法が一般的である。局所病巣算定方式としては、宿主細胞の単層培養上にウイルスを接種し、ウイルス吸着を行わせたあと、寒天を含む培地を重層して固まらせ、接種したウイルスの数だけ形成されるプラークを測定する、プラーク法がある。プラーク法を行った場合は、前述のＬＲＶの算出式の感染価の単位は、ｌｏｇ10［ＴＣＩＤ50／ｍＬ］の代わりにｌｏｇ10［ｐｆｕ／ｍＬ］となる。ｐｆｕはｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（プラーク形成単位）の略である。 The infectivity is a unit that expresses the amount (concentration) of a virus. There are two methods for measuring the infectivity: an end point method that determines the minimum infectious unit, and a local lesion counting method that counts the local lesions formed by the virus. The end point method generally involves a 50% infectious end point (TCID 50: Tissue culture infectious dose 50) method in which the virus is serially diluted, inoculated into a certain number or more of cultured cells, cultured for a certain period of time, and the positive/negative infection is determined to determine the dilution ratio at which the infection is 50% positive. The local lesion counting method involves a plaque method in which the virus is inoculated onto a monolayer culture of host cells, the virus is allowed to adsorb, and then a medium containing agar is layered on top to solidify, and the number of plaques formed is measured in proportion to the number of viruses inoculated. When the plaque method is used, the unit of infectivity in the above-mentioned LRV calculation formula is log 10 [pfu/mL] instead of log 10 [TCID 50 /mL], where pfu is an abbreviation for plaque forming unit.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液としては、パルボウイルスが単分散状態で存在することができる液であれば特に限定されないが、溶液、懸濁液、又はゲル状液が例示され、溶液が好ましい態様として例示される。当該溶液としては、ＰＢＳ緩衝液、ＴＮＥ緩衝液、又はＴＥ緩衝液が例示される。 In one embodiment, the parvovirus-containing liquid is not particularly limited as long as it is a liquid in which the parvovirus can exist in a monodispersed state, but examples thereof include a solution, a suspension, and a gel-like liquid, and a solution is exemplified as a preferred embodiment. Examples of the solution include PBS buffer, TNE buffer, and TE buffer.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液のｐＨとしては、パルボウイルスが単分散状態で存在することができる液であれば特に限定されないが、ｐＨの下限値として５以上、６以上、７以上が例示される。ｐＨの上限値としては、１０以下、９以下、８以下が例示される。 In one embodiment, the pH of the parvovirus-containing liquid is not particularly limited as long as the parvovirus can exist in a monodispersed state, but examples of the lower limit of the pH are 5 or more, 6 or more, and 7 or more. Examples of the upper limit of the pH are 10 or less, 9 or less, and 8 or less.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液の組成は、有機性の密度勾配液を含有する、ｐＨ７～８の範囲のＰＢＳ緩衝液が例示される。 In one embodiment, the composition of the parvovirus-containing liquid is, for example, a PBS buffer solution having a pH in the range of 7 to 8, containing an organic density gradient liquid.
一つの実施形態において、パルボウイルスは例えば以下の通り製造することができる。
まず、パルボウイルスの（非感染の）宿主細胞を培養する。宿主細胞としては、パルボウイルスが感染して増幅する細胞であれば特に限定されないが、マウス線維芽細胞Ａ９、シミアンウイルス４０形質転換ヒト線維芽細胞（３２４Ｋ細胞、ＮＢ３２４Ｋ細胞等）、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などを使用することができる。
In one embodiment, the parvovirus can be produced, for example, as follows.
First, a (non-infected) host cell of the parvovirus is cultured. The host cell is not particularly limited as long as it is a cell that can be infected and amplified by the parvovirus, and mouse fibroblast A9, simian virus 40-transformed human fibroblast (324K cell, NB324K cell, etc.), Chinese hamster ovary cell (CHO), etc. can be used.
一つの実施形態において、宿主細胞の培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、マイクロキャリアに固定して攪拌培養する方法、ローラーボトルを用いる方法、又はバイオリアクターを用いる方法が例示される。 In one embodiment, examples of the method for culturing the host cells include a method using a culture flask, a method of immobilizing the cells on a microcarrier and culturing them with stirring, a method using a roller bottle, or a method using a bioreactor.
一つの実施形態において、培養フラスコは、市販の、例えばファルコン社製の組織培養用フラスコや、マルチウェルプレートが例示される。 In one embodiment, the culture flask may be a commercially available tissue culture flask, such as a Falcon tissue culture flask, or a multi-well plate.
一つの実施形態において、マイクロキャリアは、市販の、例えばＧＥヘルスケア社製のＣｙｔｏｄｅｘ、Ｃｙｔｏｐｏｒｅが例示される。 In one embodiment, the microcarrier is a commercially available product, such as Cytodex or Cytopore manufactured by GE Healthcare.
一つの実施形態において、ローラーボトルは、市販の、例えばＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製のＣＥＬＬＭＡＳＴＥＲ細胞培養ローラーボトルが例示される。 In one embodiment, the roller bottle is a commercially available example of such a roller bottle, such as the CELLMASTER cell culture roller bottle manufactured by Greiner Bio-One.
いずれの培養方法においても、培養温度は、哺乳類動物細胞培養に汎用的に適用される３３℃～３９℃が例示され、特に３７℃が好ましい。培地のｐＨは、哺乳類動物細胞培養に汎用的に適用される７～８が好ましい。培地の濃度は、宿主細胞と等張圧となる（浸透圧が等しくなる）濃度が好ましい。 In either culture method, the culture temperature is, for example, 33°C to 39°C, which is commonly used for mammalian cell culture, and 37°C is particularly preferred. The pH of the medium is preferably 7 to 8, which is commonly used for mammalian cell culture. The concentration of the medium is preferably a concentration that is isotonic (has the same osmotic pressure) as the host cells.
一つの実施形態において、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＣＤ培地、ＳＦＭ培地、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＭＦ培地、Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ 培地（ＳＦＭ４Ｍｅｇａ Ｖｉｒ培地、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｘｐｒｅｓｓ培地、ＣＤＭ４Ａｖｉａｎ培地）等が例示される。これらの培地は、ギブコ社、サーモフィッシャー社、ＧＥヘルスケア社等から入手することができる。 In one embodiment, examples of the medium include DMEM medium, MEM medium, CD medium, SFM medium, OptiPro SMF medium, and Viral Vaccine Platform medium (SFM4Mega Vir medium, Vaccine Xpress medium, and CDM4Avian medium). These media can be obtained from Gibco, Thermo Fisher, GE Healthcare, and the like.
パルボウイルス含有液中のパルボウイルス以外の不純物量をより少なくするために、培地は血清を含まない無血清培地であることが望ましい。ウイルスの効率的な増幅は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を含む培地で培養することにより達成することができる。また、特許文献２に記載の方法などにより、回収する２４時間以上前に、培養培地を、血清含有培地から無血清培地に交換しておくことで、血清由来の不純物を含まない培地中にウイルスを生産させて回収することができる。次工程の密度勾配超遠心の前に、パルボウイルス含有液中に存在する細胞の破片などの大きな粒子系の夾雑物を除去するために、低速遠心と除菌膜濾過を行うこともできる。低速遠心は、ウイルスが沈殿しないが細胞の破片が沈殿する重力加速度を選択して実施することができる。例えば３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離や、１２，０００ｇ×３０分の遠心分離（非特許文献５）が行われるが、これらの条件に限定されない。また、除菌膜濾過は、孔径０．４５μｍ、０．２２μｍ又は０．１μｍの膜を使用することができる。これらの孔径を有する膜として、サーモフィッシャー社製ボトルトップフィルター（０．４５μｍ）、サーモフィッシャー社製ボトルトップフィルター（０．２２μｍ）、Ｍｅｒｃｋ社製マイレクス（０．２２μｍ、０．４５μｍ）、Ｍｅｒｃｋ社製ステリベクス（０．２２μｍ、０．４５μｍ）、又はザルトリウス社製ミニザルト（０．２μｍ）等が挙げられる。 In order to reduce the amount of impurities other than parvovirus in the parvovirus-containing liquid, it is desirable that the medium is a serum-free medium that does not contain serum. Efficient amplification of the virus can be achieved by culturing in a medium containing serum such as fetal bovine serum (FBS). In addition, by exchanging the culture medium from a serum-containing medium to a serum-free medium at least 24 hours before recovery using the method described in Patent Document 2, the virus can be produced in a medium that does not contain impurities derived from serum and recovered. Before the density gradient ultracentrifugation in the next step, low-speed centrifugation and sterilization membrane filtration can be performed to remove large particulate impurities such as cell debris present in the parvovirus-containing liquid. The low-speed centrifugation can be performed by selecting a gravitational acceleration at which the virus does not precipitate but the cell debris precipitates. For example, centrifugation at 3,000 rpm x 20 minutes or centrifugation at 12,000 g x 30 minutes (Non-Patent Document 5) is performed, but is not limited to these conditions. In addition, the sterilization membrane filtration can use a membrane with a pore size of 0.45 μm, 0.22 μm, or 0.1 μm. Examples of membranes with these pore sizes include Thermo Fisher's Bottle Top Filter (0.45 μm), Thermo Fisher's Bottle Top Filter (0.22 μm), Merck's Millex (0.22 μm, 0.45 μm), Merck's Sterivex (0.22 μm, 0.45 μm), and Sartorius' Minisart (0.2 μm).
続いて、培養した非感染状態の宿主細胞にパルボウイルスのシードを感染させる。シードウイルスは、ＡＴＣＣなどから購入したウイルスを、本願明細書に記載する方法等で増やした後にクライオチューブ等に小分けし、－８０℃で凍結保存しておいたものを使用できる。購入するシードウイルスの例として、ウイルスがＰＰＶならばＶＲ－７４２（ＡＴＣＣ）、ＭＶＭならばＶＲ－１３４６（ＡＴＣＣ）が例示される。 Then, the cultured uninfected host cells are infected with a parvovirus seed. The seed virus can be a virus purchased from ATCC or the like, multiplied by the method described in the present specification, aliquoted into cryotubes, etc., and frozen and stored at -80°C. Examples of purchased seed viruses include VR-742 (ATCC) if the virus is PPV, and VR-1346 (ATCC) if the virus is MVM.
続いて、培養上清を回収する。培養上清を回収するまでの培養時間は、ウイルスが十分に増幅する時間をかける。培養上清中及び細胞内のウイルス量を毎日測定し、最も好ましい時間を設定すればよい。細胞内のウイルス量を測定するには、培養上清を除去したあとに、細胞を３～５回の凍結融解で破砕して感染価を測定すればよい。ウイルス感染から、回収までの培養時間としては５日～１４日が例示される。 Then, the culture supernatant is collected. The culture time until the culture supernatant is collected is set to allow enough time for the virus to amplify. The amount of virus in the culture supernatant and within the cells is measured every day, and the most preferable time can be set. To measure the amount of virus within the cells, after removing the culture supernatant, the cells are disrupted by freezing and thawing 3 to 5 times, and the infectivity titer is measured. The culture time from virus infection to collection is, for example, 5 to 14 days.
パルボウイルスが十分に増幅するのに十分な時間培養した培養上清中にはパルボウイルスが含まれている。しかしながら、パルボウイルスが培養上清中に放出されずに感染宿主細胞内にとどまっている場合、感染宿主細胞を培養容器ごと３～５回凍結融解することで細胞を破砕し、細胞外に出てきたウイルスを回収することができる。凍結融解は、培養器材に培地が入った状態のまま行うこともでき、また、培地をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）やＴＮＥ（トリス緩衝液＋ＮａＣｌ＋ＥＤＴＡ）などの緩衝液に交換して行うこともできる。以上の方法で、パルボウイルス含有液を得ることができる。 The parvovirus is contained in the culture supernatant after culture for a time sufficient for the parvovirus to amplify sufficiently. However, if the parvovirus is not released into the culture supernatant and remains inside the infected host cells, the infected host cells together with the culture vessel can be frozen and thawed 3 to 5 times to disrupt the cells and recover the virus that has come out of the cells. Freezing and thawing can be performed with the culture medium still in the culture vessel, or can be performed after replacing the medium with a buffer such as PBS (phosphate buffered saline) or TNE (Tris buffer + NaCl + EDTA). A parvovirus-containing solution can be obtained by the above method.
続いて、前記得られたパルボウイルス含有液を密度勾配超遠心に適用する。密度勾配超遠心は、汎用的に使用されている超遠心の一つの方法である。超遠心とは、通常の遠心機よりも大きな重力で遠心することにより、通常の遠心では沈殿しないウイルスのような微粒子をも沈殿させることができる。このとき、遠心チューブ内の液体密度がウイルスよりも高いと、ウイルスは底面まで沈殿せず、その液体の上で沈降が止まる。遠心チューブ内にウイルスより密度が高い液体と密度が低い液体とを重層しておくと、ウイルスは密度の低い液体は通過して沈降するが、ウイルスより密度の高い液体内へは沈降できない。このように、密度勾配がかかった状態で超遠心することで、含まれる物質が密度によって異なる位置にとどまるようになる。この方法を密度勾配超遠心という。 Then, the obtained parvovirus-containing liquid is applied to density gradient ultracentrifugation. Density gradient ultracentrifugation is one of the methods of ultracentrifugation that is widely used. Ultracentrifugation is a method of centrifuging with a gravity greater than that of a normal centrifuge, which can precipitate even fine particles such as viruses that do not precipitate with normal centrifugation. At this time, if the liquid density in the centrifuge tube is higher than that of the virus, the virus does not settle to the bottom, but stops settling above the liquid. If a liquid with a higher density than the virus and a liquid with a lower density are layered in a centrifuge tube, the virus will pass through the lower density liquid and settle, but will not be able to settle in the liquid with a higher density than the virus. In this way, by performing ultracentrifugation under a density gradient, the contained substances will remain in different positions depending on their density. This method is called density gradient ultracentrifugation.
超遠心でかける力は、地球の重力ｇに対して何倍の力かという指標であらわされる。その指標として、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｏｒｃｅの略でＲＣＦ（相対遠心力）を表記する。 The force applied in ultracentrifugation is expressed as a number of times the force of the Earth's gravity (g). This force is expressed as RCF (relative centrifugal force), which is an abbreviation for Relative Centrifugal force.
一つの実施形態において、密度勾配超遠心は、例えば以下の通り実施することができる。
最初に、濃度の異なる有機性の密度勾配液を準備する。それを、超遠心チューブに、密度の大きい溶液の上に軽い溶液が層をなすように重層する。このとき、軽い液を先に添加し、その下方にシリンジやピペットなどで重い液を注入してもよいし、重い液を先に添加し、その上部に軽い液を乗せてもよい。次に、重層された有機性の密度勾配液の上に、パルボウイルス含有液を重層する。その後、超遠心機にかける。超遠心により、最後に重層したパルボウイルス含有液中の成分が、密度に応じて、有機性の密度勾配液の中で層状に分離した状態になる。超遠心機からチューブを取り出して、チューブの上層から下層にかけて液を分画採取する。分画採取の方法は、上面から一定量ずつピペットで吸い出す方法と、チューブ側面に注射器の針をさして、所定の部分だけを吸い出す方法と、チューブ底面に針で穴をあけて、下層液から順番に一定量ずつ分画する方法がある。
In one embodiment, density gradient ultracentrifugation can be performed, for example, as follows.
First, organic density gradient solutions with different concentrations are prepared. They are layered in an ultracentrifuge tube so that the lighter solution is layered on the higher density solution. At this time, the lighter solution may be added first and the heavier solution may be injected below it with a syringe or pipette, or the heavier solution may be added first and the lighter solution may be placed on top. Next, the parvovirus-containing solution is layered on top of the layered organic density gradient solutions. Then, the solution is subjected to an ultracentrifuge. By ultracentrifugation, the components in the parvovirus-containing solution layered last are separated into layers in the organic density gradient solution according to their densities. The tube is removed from the ultracentrifuge, and the solution is fractionated from the upper layer to the lower layer of the tube. The fractionation can be performed by sucking up a fixed amount from the top with a pipette, by inserting a needle of a syringe into the side of the tube and sucking up only a specified portion, or by making a hole in the bottom of the tube with a needle and fractionating a fixed amount in sequence from the bottom layer.
一つの実施形態において、パルボウイルス含有液は、使用するローターのサイズに応じ適宜濃縮することができる。濃縮方法としては、ＣｓＣｌ2を用いた塩析沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、限外濾過膜による濾過、又は超遠心による沈殿等、公知の方法を使用することができる。濃縮率を自由に設定できる観点又は溶媒交換が容易である観点から、超遠心による沈殿が好ましい方法として例示される。 In one embodiment, the parvovirus-containing solution can be appropriately concentrated depending on the size of the rotor used. As a concentration method, a known method such as salting out precipitation using CsCl2 , polyethylene glycol (PEG) precipitation, filtration through an ultrafiltration membrane, or precipitation by ultracentrifugation can be used. Precipitation by ultracentrifugation is exemplified as a preferred method from the viewpoint of freely setting the concentration rate or facilitating solvent exchange.
例えばパルボウイルスを超遠心により濃縮する場合、相体遠心力（ｇ）と遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）としては、上限としては１，２００，０００（ｈ×ｇ）以下、７００，０００（ｈ×ｇ）以下、３００，０００（ｈ×ｇ）以下が例示される。下限としては２０，０００（ｈ×ｇ）以上、１０，００００（ｈ×ｇ）以上、２００，０００（ｈ×ｇ）以上が例示される。 For example, when concentrating parvovirus by ultracentrifugation, the upper limit of the product (h×g) of the relative centrifugal force (g) and the centrifugation time (h) is 1,200,000 (h×g) or less, 700,000 (h×g) or less, or 300,000 (h×g) or less. The lower limit is 20,000 (h×g) or more, 10,0000 (h×g) or more, or 200,000 (h×g) or more.
超遠心の条件の一例として、超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で、Ｔｙｐｅ４５ Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で２９，４００ｒｐｍ、２時間超遠心する方法が例示される。 One example of ultracentrifugation conditions is to use an ultracentrifuge (Optima L-90K manufactured by Beckman Coulter) with a Type 45 Ti rotor (manufactured by Beckman Coulter) at 29,400 rpm for 2 hours.
次に、沈殿させたパルボウイルスを、適切な溶媒に再懸濁することで、濃縮されたパルボウイルス含有液を得ることができる。 The precipitated parvovirus can then be resuspended in a suitable solvent to obtain a concentrated parvovirus-containing solution.
再懸濁する溶媒は、汎用的に使われるＴＮＥ緩衝液などのトリス緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＤＭＥＭ培地（無血清）などの細胞培養培地などが利用できる。好ましくは、ＴＮＥ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、細胞培養用培地、より好ましくはＴＮＥ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＤＭＥＭ培地（無血清）がよく、最も好ましくはＴＮＥ緩衝液である。再懸濁した際のパルボウイルスの状態は、分散状態にあっても、凝集状態にあってもよい。 The solvent for resuspension may be a commonly used Tris buffer such as TNE buffer, PBS buffer, or cell culture medium such as DMEM medium (serum-free). TNE buffer, PBS buffer, or cell culture medium is preferable, TNE buffer, PBS buffer, or DMEM medium (serum-free) is more preferable, and TNE buffer is most preferable. The state of the parvovirus when resuspended may be either a dispersed state or an aggregated state.
密度勾配超遠心における有機性の密度勾配液の溶質としては、スクロース（ショ糖）又はイオジキサノールが例示される。溶質の好ましい例として、スクロースが例示される。 Examples of organic density gradient solutes in density gradient ultracentrifugation include sucrose (cane sugar) and iodixanol. A preferred example of the solute is sucrose.
スクロースを溶質とした場合、密度勾配超遠心用の遠心チューブに、濃度の異なるスクロース溶液を重層する。スクロース溶液の溶媒は、ＴＥ緩衝液（トリス緩衝液－ＥＤＴＡ）などが使用できる。 When sucrose is used as the solute, sucrose solutions of different concentrations are layered on a centrifuge tube for density gradient ultracentrifugation. The solvent for the sucrose solution can be TE buffer (Tris buffer - EDTA), etc.
パルボウイルスは超遠心にかけた際に、４０％スクロース層は通過する。５０％スクロース溶液と４０％スクロース溶液を重層し、その上部にパルボウイルス懸濁液（濃縮液）を重層して超遠心すると、パルボウイルスは４０％スクロース層と５０％スクロース層の界面から回収できる。 When parvovirus is subjected to ultracentrifugation, it passes through the 40% sucrose layer. If a 50% sucrose solution and a 40% sucrose solution are layered, and then a parvovirus suspension (concentrated solution) is layered on top of that and ultracentrifuged, the parvovirus can be recovered from the interface between the 40% sucrose layer and the 50% sucrose layer.
６０％スクロース層と４０％スクロース層を重層したときも、パルボウイルスは超遠心後に、それら２層の界面から回収することができる。 When a 60% sucrose layer and a 40% sucrose layer are layered, parvovirus can be recovered from the interface between the two layers after ultracentrifugation.
重層の濃度はこれらに限られたものではなく、６０％、４５％、３０％、１５％のスクロース溶液を重層して、その上にパルボウイルス懸濁液（濃縮液）を重層して密度勾配超遠心を行うと、パルボウイルスは４５％層から回収できる。 The overlay concentration is not limited to these; if 60%, 45%, 30%, and 15% sucrose solutions are overlaid, and then a parvovirus suspension (concentrated solution) is overlaid on top of that and density gradient ultracentrifugation is performed, the parvovirus can be recovered from the 45% layer.
６０％、５０％、４０％、３０％のスクロース溶液を重層して、その上にパルボウイルス懸濁液（濃縮液）を重層して密度勾配超遠心を行うと、パルボウイルスは５０％層と４０％層の界面から回収できる。 When 60%, 50%, 40%, and 30% sucrose solutions are layered, and then a parvovirus suspension (concentrated solution) is layered on top of that and density gradient ultracentrifugation is performed, the parvovirus can be recovered from the interface between the 50% and 40% layers.
これらの密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）は、パルボウイルスが自身の比重と平衡する溶液の位置まで落ちてくるのに十分な程度行えばよく、相体遠心力（ｇ）と遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）としては、１，５００，０００（ｈ×ｇ）以上行えばよい。より好ましくは１，８００，０００（ｈ×ｇ）以上７，０００，０００（ｈ×ｇ）以下であり、最も好ましくは１，９７４，１００（ｈ×ｇ）である。一例として、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ＋のスイングローターＳＷ－２８を使用して２４，０００ｒｐｍで超遠心する場合、相対遠心力は１０３，９００ｇであるため、１９時間超遠心を行うことで、マウス微小ウイルスは目的の位置から回収できる。 The relative centrifugal force (g) x centrifugation time (h) of these density gradient ultracentrifugations should be sufficient for the parvovirus to fall to the position of the solution where it is in equilibrium with its own specific gravity, and the product (h×g) of the relative centrifugal force (g) and the centrifugation time (h) should be 1,500,000 (h×g) or more. More preferably, it is 1,800,000 (h×g) or more and 7,000,000 (h×g) or less, and most preferably 1,974,100 (h×g). As an example, when ultracentrifugation is performed at 24,000 rpm using a swing rotor SW-28 of Optima L-90K+ manufactured by Beckman Coulter, Inc., the relative centrifugal force is 103,900 g, so that minute virus of mice can be recovered from the target position by performing ultracentrifugation for 19 hours.
なお、密度勾配溶液の重層は、重い層を分注した上に軽い層を乗せていく方法でも、軽い層を先に分注して重い層を下に注入する方法でも実施できる。そして、これらの超遠心は、ウイルスの失活を防ぐために通常４℃で行うのが業界の標準である。 The density gradient solution can be layered either by dispensing the heavy layer and then placing the light layer on top, or by dispensing the light layer first and then injecting the heavy layer underneath. The industry standard for these ultracentrifugations is usually to perform them at 4°C to prevent inactivation of the virus.
また、スクロース溶液を重層した直後に、ウイルス懸濁液を上に重層して密度勾配超遠心に適用することができるが、スクロース溶液を重層したのちに８～２４時間静置しておくと、それぞれのスクロース層の界面が拡散によりなじんで、濃度を連続的な勾配にすることができる。この方法でも密度勾配超遠心後にウイルスが回収できる位置は同じになる。 In addition, immediately after layering the sucrose solution, the virus suspension can be layered on top and applied to density gradient ultracentrifugation, but if the sucrose solution is left to stand for 8 to 24 hours after layering, the interfaces of the sucrose layers will blend together through diffusion, creating a continuous concentration gradient. With this method, the position from which the virus can be recovered after density gradient ultracentrifugation will be the same.
重層後に静置しない場合は、密度勾配は段階的であり、「段階的（ステップグラジエント）密度勾配超遠心」となるが、静置させることで、「連続的密度勾配超遠心」となる。 If the mixture is not allowed to stand after layering, the density gradient will be stepwise, and this will be called "step gradient density ultracentrifugation." However, if the mixture is allowed to stand, this will be called "continuous density gradient ultracentrifugation."
連続的密度勾配超遠心は、段階的密度勾配超遠心よりも、回収したい物質（パルボウイルス）と、除去したい不純物との分離がより細かく厳密に行えるようになる。超遠心の種類は目的に応じて使いわけることができる。 Continuous density gradient ultracentrifugation allows for more precise and precise separation of the substance to be recovered (parvovirus) from the impurities to be removed than step density gradient ultracentrifugation. Different types of ultracentrifugation can be used depending on the purpose.
重層後の静置は１℃～３０℃で行うのが好ましく、より好ましくは２℃～１０℃、最も好ましくは４℃で行う。静置時間は、短すぎると連続的にならず、長すぎると互いの濃度が拡散によって混ざり合いすぎて勾配が保たれなくなる。静置時間としては１２～２４時間が好ましく、より好ましくは１４～１８時間であり、最も好ましくは１６時間である。 The incubation time after layering is preferably at 1°C to 30°C, more preferably 2°C to 10°C, and most preferably 4°C. If the incubation time is too short, the mixture will not be continuous, and if it is too long, the concentrations will mix too much due to diffusion and the gradient will not be maintained. The incubation time is preferably 12 to 24 hours, more preferably 14 to 18 hours, and most preferably 16 hours.
パルボウイルスが密度勾配超遠心後にどの位置から回収できるかは、密度勾配超遠心後の遠心チューブ内の溶液を上から順に適当な体積（例えば１ｍＬ）ずつ分画採取し、感染性をアッセイすればよい。 The position from which the parvovirus can be recovered after density gradient ultracentrifugation can be determined by collecting appropriate volumes (e.g., 1 mL) of the solution in the centrifuge tube from the top to the bottom after density gradient ultracentrifugation and assaying for infectivity.
上記の密度勾配超遠心は、２回以上繰り返してより精製度を高めてもよい。このとき１回目と２回目でパルボウイルスを回収できる溶媒濃度は等しい。また、１回目と２回目で、重層する濃度組成を変えてもよい。例えば、１回目はスクロース濃度６０％、５０％、４０％、３０％と重層して、５０％と４０％の界面画分を回収し、２回目は６０％と４０％の２層で密度勾配超遠心を行い、両層の界面を回収することができる。またその逆でもよい。 The above density gradient ultracentrifugation may be repeated two or more times to further increase the degree of purification. In this case, the solvent concentrations at which the parvovirus can be recovered are the same in the first and second runs. The layered concentration composition may also be different in the first and second runs. For example, in the first run, sucrose concentrations of 60%, 50%, 40%, and 30% may be layered to recover the 50% and 40% interface fraction, and in the second run, density gradient ultracentrifugation may be performed with two layers of 60% and 40%, and the interface between both layers may be recovered. The reverse may also be done.
スクロース密度勾配超遠心において、パルボウイルスが回収される位置（スクロース濃度）は常に一定（４０％と５０％の間）であるため、目的や作業性に応じて重層方法を変更すればよい。 In sucrose density gradient ultracentrifugation, the position (sucrose concentration) at which parvovirus is recovered is always constant (between 40% and 50%), so the layering method can be changed depending on the purpose and workability.
不純物濃度をより低下させたい場合は、４０％と５０％の界面にウイルスを回収するとよい。不純物濃度がすでに十分低いなどの理由で、気にしなくてよい場合は、４０％と６０％のように濃度差の開いた界面にウイルスを回収するとよい。 If you want to further reduce the impurity concentration, it is a good idea to collect the virus at the interface between 40% and 50%. If you do not need to worry about the impurity concentration because it is already sufficiently low, it is a good idea to collect the virus at an interface with a larger concentration difference, such as between 40% and 60%.
有機性の密度勾配液の溶質がイオジキサノールの場合も、同様に２層以上の濃度に重層し、パルボウイルスが平衡化する界面の位置からウイルスを回収すればよい。 When the solute of the organic density gradient solution is iodixanol, it can be similarly layered to a concentration of two or more layers, and the virus can be collected from the interface where the parvovirus is in equilibrium.
本実施形態の方法で有機性の密度勾配液を用いて密度勾配超遠心されたパルボウイルスは、密度勾配超遠心前に凝集状態であったとしても、単分散状態で回収することができる。 Parvoviruses subjected to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient liquid according to the method of this embodiment can be recovered in a monodispersed state even if they are in an aggregated state before density gradient ultracentrifugation.
有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心により得られたマパルボウイルス含有液は、さらに溶媒交換することもできる。溶媒交換の方法としては、半透膜を用いた透析や、限外濾過膜による溶媒交換、限外濾過膜と遠心分離を組み合わせた方法、脱塩カラムによる溶媒交換法などを行えばよい。 The maparvovirus-containing solution obtained by density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient solution can be further subjected to solvent exchange. Methods for solvent exchange include dialysis using a semipermeable membrane, solvent exchange using an ultrafiltration membrane, a method combining an ultrafiltration membrane and centrifugation, and solvent exchange using a desalting column.
有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心により得られたパルボウイルス含有液中で、パルボウイルスが凝集していないかどうかを確認するためには、孔径が８０ｎｍ～３０ｎｍのフィルターで濾過して、濾過前後のウイルス量を感染価などで測定すればよい。 To confirm whether the parvovirus has aggregated in the parvovirus-containing solution obtained by density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient solution, the solution can be filtered through a filter with a pore size of 80 nm to 30 nm, and the amount of virus before and after filtration can be measured using the infectivity titer, etc.
濾過膜の孔径は、好ましくは７５ｎｍ～３５ｎｍであり、より好ましくは４０ｎｍ～３０ｎｍ、最も好ましくは３５ｎｍの孔径の膜である。 The pore size of the filtration membrane is preferably 75 nm to 35 nm, more preferably 40 nm to 30 nm, and most preferably 35 nm.
パルボウイルス含有液から、密度勾配超遠心により得られたパルボウイルスの回収率は、感染価×体積の式で得られる絶対感染価の回収率で求めることができる。本明細書で使用する場合、「絶対感染価」とは感染価に体積をかけた値を意味する。 The recovery rate of parvovirus obtained from a parvovirus-containing solution by density gradient ultracentrifugation can be determined as the recovery rate of the absolute infectivity titer, which is calculated by the formula infectivity titer x volume. As used herein, "absolute infectivity titer" means the value obtained by multiplying the infectivity titer by the volume.
例えば、マウスレトロウイルス含有液の感染価が、１０9 ＴＣＩＤ50／ｍＬ×１０００ｍＬの場合、精製原料の絶対感染価は１０12 ＴＣＩＤ50となる。これに対して密度勾配超遠心により得られたマウス微小ウイルス含有液が１０11 ＴＣＩＤ50／ｍＬ×１０ｍＬであれば、精製品の絶対感染価も１０12 ＴＣＩＤ50であるため、回収率は１００％となる。 For example, when the infectivity of a mouse retrovirus-containing liquid is 10 9 TCID 50 /mL × 1000 mL, the absolute infectivity of the purified raw material is 10 12 TCID 50. In contrast, when the mouse minute virus-containing liquid obtained by density gradient ultracentrifugation has an infectivity of 10 11 TCID 50 /mL × 10 mL, the absolute infectivity of the purified product is also 10 12 TCID 50 , and the recovery rate is 100%.
本実施形態の方法で得られる単分散化されたパルボウイルス含有液は、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心の前後で３０％以上の回収率であり、より好ましくは５０％以上である。このように回収率が高い理由は、本実施形態が提供する、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程が、複雑ではなく、比較的短時間であるため、経時的なウイルスの失活を回避できるためである。 The monodispersed parvovirus-containing liquid obtained by the method of this embodiment has a recovery rate of 30% or more before and after density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient liquid, and more preferably 50% or more. The reason for such a high recovery rate is that the density gradient ultracentrifugation process using an organic density gradient liquid provided by this embodiment is not complicated and takes a relatively short time, thereby making it possible to avoid inactivation of the virus over time.
本実施形態において、単分散化されたパルボウイルス含有液を用いてウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価することにより、従来過大評価されていたウイルスクリアランス性能をより正確に評価することができる。単分散化されたパルボウイルスは、本願明細書に記載の方法により製造したものを使用することができるし、それ以外の方法で製造された単分散化されたパルボウイルスであっても、単分散化されたウイルスであれば特に限定されない。 In this embodiment, the virus clearance performance of the virus removal membrane is evaluated using a monodispersed parvovirus-containing liquid, thereby making it possible to more accurately evaluate the virus clearance performance, which has been overestimated in the past. The monodispersed parvovirus that can be used is one produced by the method described in the present specification, and is not particularly limited as long as it is a monodispersed virus, even if it is produced by a method other than the above.
本実施形態において、ウイルス除去膜は、ウイルスを除去可能な膜であれば特に限定されないが、パルボウイルス用のウイルス除去膜であることが好ましい。パルボウイルス用のウイルス除去膜としては、例えばＭＶＭに対するＬＲＶが４以上である濾過膜が例示される。ＭＶＭに対するＬＲＶが４以上である濾過膜とは、使用する濾過膜に対し、ＭＶＭを含む溶液を５０Ｌ／ｍ2負荷した場合におけるＬＲＶが４以上となる膜である。ＭＶＭを含む溶液としては、１ｍｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリン溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）にＭＶＭ濃度を１０6ＴＣＩＤ50／ｍＬとしたものが用いられる。また、パルボウイルス用のウイルス除去膜としては、その平均孔径がパルボウイルスの大きさ前後以下であれば特に限定されないが、５～２４ｎｍの範囲が例示され、１４～２２ｎｍの範囲が好ましく、１８～２０ｎｍの範囲がより好ましい例として挙げられる。パルボウイルス除去用ウイルス除去膜としては、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸ、Ｐｅｇａｓｕｓ ＳＶ４、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＣＰＶ又はＶｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏが例示され、特に、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸ、Ｕｌｔｉｐｏｒｅ ＶＦ－ＤＶ２０、Ｐｅｇａｓｕｓ Ｐｒｉｍｅ、Ｐｅｇａｓｕｓ ＳＶ４、又はＶｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏ、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＣＰＶ、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＨＦが例示される。 In the present embodiment, the virus removal membrane is not particularly limited as long as it is a membrane capable of removing viruses, but is preferably a virus removal membrane for parvovirus. An example of a virus removal membrane for parvovirus is a filtration membrane having an LRV of 4 or more for MVM. A filtration membrane having an LRV of 4 or more for MVM is a membrane having an LRV of 4 or more when a solution containing MVM is loaded at 50 L/m 2 on the filtration membrane used. As the solution containing MVM, a 1 mg/mL human immunoglobulin solution (0.1 M NaCl, pH 4.5) with an MVM concentration of 10 6 TCID 50 /mL is used. In addition, the virus removal membrane for parvovirus is not particularly limited as long as its average pore size is approximately equal to or smaller than the size of parvovirus, but examples thereof include a range of 5 to 24 nm, a range of 14 to 22 nm is preferable, and a range of 18 to 20 nm is more preferable. Examples of the virus removal membrane for removing parvovirus include Planova 20N, Planova BioEX, Pegasus SV4, Virosart CPV, and Viresolve Pro, and in particular, examples include Planova 20N, Planova 15N, Planova BioEX, Ultipore VF-DV20, Pegasus Prime, Pegasus SV4, or Viresolve Pro, Virosart CPV, and Virosart HF.
本実施形態において、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能の評価は、以下の通り行うことができる。生物製剤等の実生産工程をスケールダウンした条件で行うことが好ましい。 In this embodiment, the virus clearance performance of the virus removal membrane can be evaluated as follows. It is preferable to perform the evaluation under scaled-down conditions of the actual production process of biological products, etc.
まず生物製剤の中間製品等のタンパク質を含有する溶液に、単分散化されたパルボウイルス含有液を添加する。タンパク質としては、血漿分画製剤のグロブリン、アルブミン、血液凝固第７因子（Ｆ－ＶＩＩ）、血液凝固第８因子（Ｆ－ＶＩＩＩ）、遺伝子組み換えタンパク質、モノクローナル抗体、トロンモジュリン製剤、腫瘍壊死因子、タンパク質性のワクチン、培地、培地添加剤、又はタンパク質分解酵素が例示されるがこれらに限定されるものではない。 First, a monodispersed parvovirus-containing liquid is added to a solution containing a protein, such as an intermediate product of a biological product. Examples of proteins include, but are not limited to, globulins from plasma fraction preparations, albumin, blood coagulation factor VII (F-VII), blood coagulation factor VIII (F-VIII), recombinant proteins, monoclonal antibodies, thrombomodulin preparations, tumor necrosis factors, proteinaceous vaccines, culture media, culture media additives, and proteolytic enzymes.
パルボウイルスを含有する液体を添加後、タンパク質含有溶液中のパルボウイルスが単分散状態であることは、プレフィルターで濾過を行うことにより確認することができる。プレフィルターの孔径としては、７５ｎｍ～２５ｎｍが例示されるが、より好ましくは４０～３０ｎｍであり、最も好ましくは３５ｎｍである。プレフィルターによるパルボウイルスの対数除去率ＬＲＶを測定する。ＬＲＶが１．０未満であることを確認する。 After adding the liquid containing the parvovirus, it can be confirmed that the parvovirus in the protein-containing solution is in a monodispersed state by filtering through a prefilter. The pore size of the prefilter is, for example, 75 nm to 25 nm, more preferably 40 to 30 nm, and most preferably 35 nm. The logarithmic removal rate (LRV) of the parvovirus by the prefilter is measured. Confirm that the LRV is less than 1.0.
続いてウイルス除去膜に供する、プレフィルター後のタンパク質含有溶液の一部を２本サンプリングしておく。１本は速やかに冷凍保管し、もう１本は濾過完了まで濾過条件と同じ環境下に静置して対照品とする。 Next, take two samples of the protein-containing solution after prefiltration that will be fed to the virus removal membrane. One is promptly frozen and stored, and the other is left in the same environment as the filtration conditions until filtration is complete, to serve as a control sample.
次に、単分散化されたパルボウイルスをウイルス除去膜に供する。単分散化されたパルボウイルスをウイルス除去膜に供することとしては、パルボウイルスを除去することができれば特に限定されないが、単分散化されたパルボウイルスをウイルス除去膜で濾過を行うことが例示される。濾過時の送液方法は、加圧濾過、低速ポンプ濾過が例示される。濾過時の膜間差圧は、使用するフィルターの耐圧性以内で行うことがきる。例えば、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎの場合は７０～１００ｋＰａ、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸの場合は、１９６～３４３ｋＰａで行うことができる。所定の量の濾過が完了したあと、濾液の一部を採取する。 Next, the monodispersed parvovirus is subjected to a virus removal membrane. The method of subjecting the monodispersed parvovirus to the virus removal membrane is not particularly limited as long as the parvovirus can be removed, and an example of the method is filtering the monodispersed parvovirus through the virus removal membrane. Examples of the liquid delivery method during filtration include pressure filtration and low-speed pump filtration. The transmembrane pressure difference during filtration can be within the pressure resistance of the filter used. For example, in the case of Planova 20N, filtration can be performed at 70 to 100 kPa, and in the case of Planova BioEX, filtration can be performed at 196 to 343 kPa. After a predetermined amount of filtration has been completed, a portion of the filtrate is collected.
直ちにウイルス除去率の測定を行わない場合は、サンプリングした濾液と、濾過前にサンプリングした対照品を凍結保管しておき、後日、濾過前溶液のサンプリング品と共に解凍してウイルス力価測定を行うことができる。直ちにウイルス除去率の測定を行う場合は、最初に凍結した濾過前溶液のサンプリング品を解凍して、濾過後溶液、対照品とともにウイルス力価測定を行う。 If the virus removal rate is not to be measured immediately, the sampled filtrate and the control sample taken before filtration can be frozen and stored, and then thawed at a later date together with the sampled pre-filtration solution to measure the virus titer. If the virus removal rate is to be measured immediately, the sampled pre-filtration solution that was frozen first is thawed, and the virus titer is measured together with the post-filtration solution and the control.
ウイルス力価測定は、プラーク法又はＴＣＩＤ５０法等、既知の方法で行う。濾過前溶液と、対照品とのウイルス力価を比較し、濾過中の力価の低下がないことを確認する。合否判定については測定ばらつき等のリスクに応じて事前に定めておけばよい。
濾過前後の溶液のウイルス力価の対数値の差から、対数除去率を求める。例えば、濾過前溶液のウイルス力価が１０6.0 ＴＣＩＤ50／ｍＬで、濾過後溶液のウイルス力価が１０2.0 ＴＣＩＤ50／ｍＬの場合、対数除去率は４．０となる。
The virus titer is measured by a known method such as the plaque method or the TCID50 method. The virus titer of the pre-filtration solution is compared with that of the control product to confirm that the titer does not decrease during filtration. The pass/fail judgment can be determined in advance according to the risk of measurement variability, etc.
The logarithmic removal rate is calculated from the difference in the logarithmic virus titers of the solution before and after filtration. For example, if the virus titer of the solution before filtration is 10 6.0 TCID 50 /mL and the virus titer of the solution after filtration is 10 2.0 TCID 50 /mL, the logarithmic removal rate is 4.0.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。実施例において示される試験方法は以下の通りである。 The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples. The test methods shown in the examples are as follows.
〔実施例１〕
マウス微小ウイルスの宿主細胞として形質転換ヒト繊維芽細胞（以下「宿主細胞」と呼ぶ）を用い、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ（以下、「１０％血清培地」と呼ぶ）で、３７℃、５％ＣＯ2環境下にて、７５ｃｍ2底面積、容量１５ｍＬの組織培養用フラスコ（以下、「フラスコ」と呼ぶ）を用いて継代培養した。フラスコから宿主細胞をはがして、新しいフラスコに１．５×１０6 ｃｅｌｌｓ／１５ｍｌ／ｆｌａｓｋの密度で２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（以下、「２．５％血清培地」と呼ぶ）に植え付けて、マウス微小ウイルスをＭＯＩ＝０．０１で感染させた。４日後に培地を、血清を含まない培地（以下「無血清培地」と呼ぶ）に交換し、さらに３日間培養した。
Example 1
Transformed human fibroblasts (hereinafter referred to as "host cells") were used as host cells for the minute virus of mice, and were subcultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as "10% serum medium") at 37°C under 5% CO2 in a tissue culture flask (hereinafter referred to as "flask") with a bottom area of 75 cm2 and a volume of 15 mL. The host cells were peeled off from the flask and inoculated into a new flask in DMEM medium containing 2.5% FBS (hereinafter referred to as "2.5% serum medium") at a density of 1.5 x 106 cells/15 ml/flask, and infected with the minute virus of mice at an MOI of 0.01. After 4 days, the medium was replaced with a medium not containing serum (hereinafter referred to as "serum-free medium"), and the cells were further cultured for 3 days.
マウス微小ウイルスを含む培養上清を回収して、３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して沈殿した細胞の破片を除去し、上清を０．４５μｍフィルター（ナルゲン社製）による濾過で簡易精製して、培養上清を得た。 The culture supernatant containing minute virus of mice was collected and centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to remove precipitated cell debris, and the supernatant was simply purified by filtration through a 0.45 μm filter (manufactured by Nalgene) to obtain the culture supernatant.
この簡易精製した培養上清を超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で、Ｔｙｐｅ４５ Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で２９，４００ｒｐｍ、２時間超遠心して、マウス微小ウイルスを沈殿させた。上清を除去し、沈殿したマウス微小ウイルスペレットに６ｍＬのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して再懸濁し、濃縮されたマウス微小ウイルスを含むＴＮＥ緩衝液（以下「濃縮ＭＶＭ培養液」と呼ぶ）を得た。 The simply purified culture supernatant was centrifuged at 29,400 rpm for 2 hours in an ultracentrifuge (Optima L-90K, Beckman Coulter) using a Type 45 Ti rotor (Beckman Coulter) to precipitate minute virus of mice. The supernatant was removed, and the precipitated minute virus of mice pellet was resuspended in 6 mL of TNE buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4/100 mM NaCl/1 mM EDTA) to obtain a TNE buffer solution containing concentrated minute virus of mice (hereinafter referred to as "concentrated MVM culture solution").
この濃縮ＭＶＭ培養液のマウス微小ウイルス感染価を測定した。感染価の測定は、９６－ｗｅｌｌプレートを用いて、宿主細胞を２×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ分注後に、１０倍段階希釈した検体を４ｗｅｌｌずつ添加して、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法によりＴＣＩＤ50／ｍＬを算出した。 The infectivity titer of the concentrated MVM culture solution with minute virus of mice was measured by dispensing host cells at 2 x 10 4 cells/well in a 96-well plate, adding 10-fold serially diluted samples to each of 4 wells, and calculating the TCID 50 /mL by the Spearman-Karber method.
次に、表１の（１）又は（２）の重層条件のスクロース密度勾配溶液（スクロース／ＴＮＥ緩衝液）を作成し、それぞれの最上面に、上記の濃縮ＭＶＭ培養液を重層した。 Next, a sucrose density gradient solution (sucrose/TNE buffer) was prepared with the layering conditions (1) or (2) in Table 1, and the concentrated MVM culture solution was layered on top of each.
超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）でスイングローターＳＷ－２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用して２４，０００ｒｐｍ（１０３，９００ｇ）、１９時間、密度勾配超遠心を行った。超遠心後の溶液を、上から３ｍＬずつマイクロピペットで分画採取し（全部で１２画分）、ウイルスの感染価を前述の方法で測定した。 Density gradient ultracentrifugation was performed for 19 hours at 24,000 rpm (103,900 g) using a swing rotor SW-28 (Beckman Coulter) in an ultracentrifuge (Optima L-90K, Beckman Coulter). After ultracentrifugation, 3 mL fractions were collected from the top using a micropipette (12 fractions in total), and the virus infectivity was measured using the method described above.
マウス微小ウイルス感染価のピークとなった、連続する２画分（１画分３ｍＬ×２＝６ｍＬ）を、マウス微小ウイルス含有液としてプールした。このマウス微小ウイルス含有液を、１％ヒトグロブリン水溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ）に添加して、孔径３５ｎｍの分離膜であるＰｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルター（旭化成メディカル社製）で濾過した。濾過条件は、４９ｋＰａ、１０Ｌ／ｍ2とした。 Two consecutive fractions (3 mL per fraction x 2 = 6 mL) that reached the peak of the minute virus of mice infectivity were pooled as a minute virus of mice solution. This minute virus of mice solution was added to a 1% human globulin aqueous solution (0.1 M NaCl) and filtered with a Planova 35N filter (manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), which is a separation membrane with a pore size of 35 nm. The filtration conditions were 49 kPa and 10 L/ m2 .
スクロース密度勾配超遠心のマウス微小ウイルス回収率は、条件（１）、（２）ともに１００％以上であった（表２）。
濾過前後のマウス微小ウイルス感染価を測定し、下記式に基づいて対数除去率ＬＲＶを算出した（表３）。
ＬＲＶ＝｛濾過前のマウス微小ウイルス感染価（ｌｏｇ10［ＴＣＩＤ50／ｍＬ］）｝－｛濾過後のマウス微小ウイルス感染価（ｌｏｇ10［ＴＣＩＤ50／ｍＬ］）｝
スクロース密度勾配超遠心後のマウス微小ウイルスでは対数除去率が１未満であり、単分散状態であった（表３）。
The recovery rate of minute virus of mice by sucrose density gradient ultracentrifugation was 100% or more under both conditions (1) and (2) (Table 2).
The infectivity titer of minute virus of mice was measured before and after filtration, and the logarithmic removal rate (LRV) was calculated according to the following formula (Table 3).
LRV={minute virus of mice infectivity titer before filtration (log 10 [TCID 50 /mL])}−{minute virus of mice infectivity titer after filtration (log 10 [TCID 50 /mL])}
After sucrose density gradient ultracentrifugation, the log removal rate of minute virus of mice was less than 1 and the virus was in a monodisperse state (Table 3).
ＭＶＭ：Ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ（マウス微小ウイルス）
回収率＝１００×（密度勾配超遠心後のＭＶＭの感染価×体積）／（密度勾配超遠心前のＭＶＭ培養液の感染価×体積）
MVM: Minute virus of mice
Recovery rate=100×(infectivity titer of MVM after density gradient ultracentrifugation×volume)/(infectivity titer of MVM culture solution before density gradient ultracentrifugation×volume)
〔実施例２〕
上記実施例１と同様の方法で濃縮ＭＶＭ培養液を得た。
次に、表３の重層条件のスクロース密度勾配溶液（スクロース／ＴＮＥ緩衝液）を作成し、４℃で１６時間静置したのちに、それぞれの最上面に、上記の濃縮ＭＶＭ培養液を重層した。
Example 2
A concentrated MVM culture medium was obtained in the same manner as in Example 1 above.
Next, a sucrose density gradient solution (sucrose/TNE buffer) was prepared according to the overlay conditions in Table 3, and after leaving it to stand at 4° C. for 16 hours, the above concentrated MVM culture solution was overlaid on the top surface of each.
超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）でスイングローターＳＷ－２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用して２４，０００ｒｐｍ（１０３，９００ｇ）、１９時間、密度勾配超遠心を行った。超遠心後の溶液を、上から１ｍＬずつマイクロピペットで分画採取し（全部で１２画分）、ウイルスの感染価を前述の方法で測定した。
マウス微小ウイルス感染価のピークとなった、連続する３画分（１画分３ｍＬ×３＝９ｍＬ）を、マウス微小ウイルス含有液としてプールした。
Density gradient ultracentrifugation was performed for 19 hours at 24,000 rpm (103,900 g) using a swing rotor SW-28 (Beckman Coulter) in an ultracentrifuge (Optima L-90K, Beckman Coulter). The solution after ultracentrifugation was fractionated from the top by 1 mL using a micropipette (total of 12 fractions), and the virus infectivity was measured by the method described above.
Three consecutive fractions (3 mL per fraction x 3 = 9 mL) which reached the peak of the minute virus of mice infectivity titer were pooled as a minute virus of mice-containing solution.
スクロース密度勾配超遠心のマウス微小ウイルス回収率は、６０％であった（表５）。 The recovery rate of minute virus of mice by sucrose density gradient ultracentrifugation was 60% (Table 5).
このマウス微小ウイルス含有液を、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎ（旭化成メディカル社製）フィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した（表６）。 This liquid containing minute virus of mice was filtered through a Planova 35N (Asahi Kasei Medical) filter in the same manner as in Example 1, and the logarithmic removal rate (LRV) was calculated (Table 6).
スクロース密度勾配超遠心後のマウス微小ウイルスでは対数除去率が１未満であり、単分散状態であった（表６）。 After sucrose density gradient ultracentrifugation, the log removal rate of minute virus of mice was less than 1 and the virus was in a monodisperse state (Table 6).
〔比較例１〕
実施例１と同様の方法で、培養上清からマウス微小ウイルスを含む培養上清を３バッチ回収した。それぞれを、３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して沈殿した細胞の破片を除去し、上清を０．４５μｍフィルター（ナルゲン社製）で濾過した。
Comparative Example 1
Three batches of culture supernatant containing minute virus of mice were recovered from the culture supernatant in the same manner as in Example 1. Each batch was centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to remove precipitated cell debris, and the supernatant was filtered through a 0.45 μm filter (manufactured by Nalgene).
これらを、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程を経ずに、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した。 These were filtered through a Planova 35N filter in the same manner as in Example 1, without going through a density gradient ultracentrifugation process using an organic density gradient solution, and the logarithmic removal rate (LRV) was calculated.
〔比較例２〕
実施例１と同様の方法で、濃縮ＭＶＭ培養液を得た。これを、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程を経ずに、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した。
Comparative Example 2
A concentrated MVM culture solution was obtained in the same manner as in Example 1. This was filtered through a Planova 35N filter in the same manner as in Example 1 without going through a density gradient ultracentrifugation step using an organic density gradient solution, and the logarithmic removal rate (LRV) was calculated.
〔比較例３〕
実施例１と同様の方法で、濃縮ＭＶＭ培養液を得た。ただし、超遠心で得たウイルスペレットの再懸濁に、ＴＮＥ緩衝液ではなく、ＰＢＳ（－）緩衝液を使用した。これを、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程を経ずに、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した。
Comparative Example 3
A concentrated MVM culture solution was obtained in the same manner as in Example 1. However, PBS(-) buffer was used for resuspension of the virus pellet obtained by ultracentrifugation instead of TNE buffer. This was filtered through a Planova 35N filter in the same manner as in Example 1 without going through a density gradient ultracentrifugation step using an organic density gradient solution, and the logarithmic removal rate (LRV) was calculated.
結果を表７に示す。 The results are shown in Table 7.
有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心を行っていないマウス微小ウイルスは、比較例１、比較例３、比較例３いずれも３５ｎｍフィルターの対数除去率が１以上であり、凝集状態であった。これは、本来Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎを通過するはずのマウス微小ウイルスがＰｌａｎｏｖａ ３５Ｎで捕捉されてしまうことを意味しており、比較例１～３のウイルスを使用してウイルス除去膜の性能を評価した場合、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能が過大評価されることが示唆された。 For minute virus of mice that was not subjected to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient liquid, the logarithmic removal rate of the 35 nm filter was 1 or more in all of Comparative Examples 1, 3, and 3, and the virus was in an aggregated state. This means that minute virus of mice that would normally pass through Planova 35N was captured by Planova 35N, suggesting that the virus clearance performance of the virus removal membrane is overestimated when the performance of the virus removal membrane is evaluated using the viruses of Comparative Examples 1 to 3.
Claims (11)
２）パルボウイルスを含む画分を回収する工程を含み、
パルボウイルスがマウス微小ウイルスであり、 前記密度勾配超遠心における密度勾配が、段階的（ステップグラジエント）密度勾配であり、
前記密度勾配液が、４０％以下のスクロース溶液層及び５０％以上のスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液であり、
前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が１，５００，０００～７，０００，０００（ｈ×ｇ）である、単分散化されたパルボウイルスを製造する方法。 1) subjecting a parvovirus-containing solution to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient solution;
2) recovering a fraction containing the parvovirus,
the parvovirus is minute virus of mice, the density gradient in the density gradient ultracentrifugation is a step gradient density gradient,
The density gradient solution is a stepwise density gradient solution including at least a sucrose solution layer of 40% or less and a sucrose solution layer of 50% or more,
The method for producing a monodispersed parvovirus, wherein the product (h×g) of relative centrifugal force (g)×centrifugation time (h) in the density gradient ultracentrifugation is 1,500,000 to 7,000,000 (h×g) .
前記単分散化されたパルボウイルスをタンパク質含有溶液に添加する工程と、
前記タンパク質含有液をウイルス除去膜で濾過する工程と、
濾過前後の前記タンパク質含有液におけるウイルス量を定量する工程を含む、
を含み、
パルボウイルスがマウス微小ウイルスであり、
前記密度勾配超遠心における密度勾配が、段階的（ステップグラジエント）密度勾配であり、
前記密度勾配液が、４０％以下のスクロース溶液層及び５０％以上のスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液であり、
前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が１，５００，０００～７，０００，０００（ｈ×ｇ）である、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。 applying the parvovirus- containing solution to density gradient ultracentrifugation using an organic density gradient solution to obtain monodispersed parvovirus;
adding the monodispersed parvovirus to a protein-containing solution;
filtering the protein-containing liquid through a virus removal membrane;
Quantifying the amount of virus in the protein-containing liquid before and after filtration;
Including,
Parvovirus is a minute virus of mice,
the density gradient in the density gradient ultracentrifugation is a step gradient density gradient,
The density gradient solution is a stepwise density gradient solution including at least a sucrose solution layer of 40% or less and a sucrose solution layer of 50% or more,
The method for evaluating the virus clearance performance of a virus removal membrane, wherein the product (h×g) of the relative centrifugal force (g)×centrifugation time (h) of the density gradient ultracentrifugation is 1,500,000 to 7,000,000 (h×g) .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020008613A JP7588466B2 (en) | 2020-01-22 | 2020-01-22 | Methods for producing parvovirus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020008613A JP7588466B2 (en) | 2020-01-22 | 2020-01-22 | Methods for producing parvovirus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021114907A JP2021114907A (en) | 2021-08-10 |
| JP7588466B2 true JP7588466B2 (en) | 2024-11-22 |
Family
ID=77173149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020008613A Active JP7588466B2 (en) | 2020-01-22 | 2020-01-22 | Methods for producing parvovirus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7588466B2 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013523175A (en) | 2010-04-14 | 2013-06-17 | イーエムディー・ミリポア・コーポレーション | Method for producing high-titer and high-purity virus stock and method for using the same |
| WO2014080676A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | 旭化成メディカル株式会社 | Method for producing parvovirus having high infectivity titer |
| WO2018128688A1 (en) | 2016-11-04 | 2018-07-12 | Baxalta Incorporated | Adeno-associated virus purification methods |
| JP2018518164A (en) | 2015-02-09 | 2018-07-12 | インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシュ メディカル （インセルム） | Purification of recombinant adeno-associated virus particles by multi-step anion exchange chromatography |
| JP2018523992A (en) | 2015-06-23 | 2018-08-30 | ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルムＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ | Methods for large-scale production and purification of parvovirus |
| JP2019519221A (en) | 2016-05-20 | 2019-07-11 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | Gene therapy for age-related diseases and conditions |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5688676A (en) * | 1995-06-07 | 1997-11-18 | Research Foundation Of State University Of New York | In vitro packaging of adeno-associated virus DNA |
-
2020
- 2020-01-22 JP JP2020008613A patent/JP7588466B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013523175A (en) | 2010-04-14 | 2013-06-17 | イーエムディー・ミリポア・コーポレーション | Method for producing high-titer and high-purity virus stock and method for using the same |
| WO2014080676A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | 旭化成メディカル株式会社 | Method for producing parvovirus having high infectivity titer |
| JP2018518164A (en) | 2015-02-09 | 2018-07-12 | インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシュ メディカル （インセルム） | Purification of recombinant adeno-associated virus particles by multi-step anion exchange chromatography |
| JP2018523992A (en) | 2015-06-23 | 2018-08-30 | ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルムＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ | Methods for large-scale production and purification of parvovirus |
| JP2019519221A (en) | 2016-05-20 | 2019-07-11 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | Gene therapy for age-related diseases and conditions |
| WO2018128688A1 (en) | 2016-11-04 | 2018-07-12 | Baxalta Incorporated | Adeno-associated virus purification methods |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021114907A (en) | 2021-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9644187B2 (en) | Methods of producing high titer, high purity virus stocks and methods of use thereof | |
| JP5980947B2 (en) | Production method of parvovirus with high infectivity | |
| EP3121268B1 (en) | Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus | |
| JP7390466B2 (en) | Evaluation method for virus clearance performance | |
| JP7588466B2 (en) | Methods for producing parvovirus | |
| JP6592100B2 (en) | Production method of parvovirus with high infectivity and purity | |
| JP2025167597A (en) | Method for determining viral clearance performance | |
| HK1231118A1 (en) | Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus | |
| HK1231118B (en) | Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221018 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231115 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240307 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240612 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240806 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20241015 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20241112 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7588466 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |