JP7590751B2 - 浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法 - Google Patents
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Description
本発明は、浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法に関する。
培養細胞へ被験物質を曝露する場合、被験物質を培地へ直接添加するか、あるいは被験物質を水や生理食塩水等の水溶性溶媒に溶解させて培地へ添加する方法がある。また、被験物質が難水溶性の場合、被験物質をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やエタノール等の有機溶媒に溶解させ、培地へ添加する方法がある。しかしながら、これらの有機溶媒は、培地中の濃度が高くなると細胞毒性を呈するため、予め最終濃度の１００倍から１０００倍になるように被験物質を有機溶媒に溶解し、培地の総量に対して０．１重量％から１．０重量％になるように添加する必要がある。そのため、被験物質の有機溶媒への溶解性が低い場合、最終濃度を高く設定できない場合がある。
また、被験物質が水にも有機溶媒にも溶解しない場合は、被験物質を培地に分散させる方法がある。しかしながら、被験物質が培地の上部に浮遊したり、培地の下部に沈んだりする場合、被験物質が細胞と接触しているのかどうかはっきりしない場合がある。特に、浮遊系培養細胞を用いた場合は、被験物質と細胞が共に培地中で一定の位置を保つことができないため、被験物質と細胞が接触しているのかどうか猶更はっきりしない。そのため、浮遊系培養細胞を用いて難水溶性被験物質の安全性評価を行う際、本来は陽性であるものが陰性と判定される場合があり（非特許文献１）、改良が望まれていた。
難水溶性被験物質を培養細胞へ曝露する方法としては、これまでに、１分子内に正電荷と負電荷の両方を有する双性イオンを含む培地用添加剤を用いる方法（特許文献１）、可逆的にゲル化可能な生体適合性ゲルに細胞を包埋し、細胞を含むゲルと難水溶性の被験物質を接触させる方法（特許文献２）、温度感受性ハイドロゲル培地に難水溶性被験物質を浸潤させることにより、該被験物質と培地中のヒト単核球細胞を曝露させる方法（特許文献３）、液体パラフィンに難水溶性被験物質を溶解させ、細胞と短時間接触させる方法（非特許文献２）等が提案されてきた。しかしながら、特許文献１の手法は、双性イオンが細胞へ影響することによって評価結果に影響を及ぼす場合があり、特許文献２及び３の手法は、難水溶性被験物質が、培地のゲル化に影響を及ぼし、評価結果に影響を及ぼす場合があった。また、非特許文献２の手法では、液体パラフィンに溶解できない被験物質を適切に評価することができない。
化学物質の試験に関するＯＥＣＤガイドライン Ｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚感作性：ヒト細胞株活性化試験（ｈ－ＣＬＡＴ）、ＴＧ４４２Ｅ、２０１６年
Ｎａｒｉｔａ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｔｏｃｉｃｏｌ． Ｓｃｉ．、４３（３）、２２９－２４０、２０１８
本発明は、浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を提供することを課題とする。
即ち、本発明は、浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法であって、（Ａ）難水溶性被験物質、（Ｂ）２５℃で液状の炭化水素及び（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素を７０℃以上に加熱溶解させた後に冷却して固型物を得た後、該固型物の上から浮遊系培養細胞の懸濁液を適用し、一定時間放置することを特徴とする、浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を提供するものである。
また、本発明は、（Ａ）難水溶性被験物質のオクタノール／水分配係数が３．５以上である浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を提供するものである。
また、本発明は、（Ｂ）２５℃で液状の炭化水素がスクワランである浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を提供するものである。
また、本発明は、（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素が４８～６９℃に融点を有するパラフィンワックスである浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を提供するものである。
また、本発明は、（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素の含有量が、（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）の総量に対して５０重量％以上である浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を提供するものである。
また、本発明は、上記曝露方法を用いた難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価法であり、浮遊系培養細胞の一種であるヒト単球性白血病由来（ＴＨＰ－１）細胞上に発現される細胞表面マーカーＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量を指標にした、難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価法を提供するものである。
本発明により、これまで困難であった浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露が可能となり、難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価を適切に実施することが可能となる。
本発明における浮遊系培養細胞とは、血液、髄液、リンパ球等の体液中に浮遊して存在している細胞を指し、例えば白血球、骨髄細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、間葉系細胞等を指す。具体的には、ヒト単球性白血病由来（ＴＨＰ－１）細胞、ヒトＴ細胞性白血病由来（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、ヒトリンパ芽球由来（ＴＫ６）細胞、ヒト前骨髄性白血病由来（ＨＬ－６０）細胞等が挙げられる。
本発明における（Ａ）難水溶性被験物質とは、水にもＤＭＳＯやエタノール等の有機溶媒にも溶解しない被験物質を指す。本発明は、難水溶性被験物質のオクタノール／水分配係数が３．５以上の場合、特に有用であり、例えば、サリチル酸ヘキシル、Ｎ，Ｎ－ジブチルアニリン、１－クロロメチルピレン、クロトリマゾール、安息香酸ベンジル等が挙げられる。尚、オクタノール／水分配係数とは、ある化学物質のｎ－オクタノールおよび水への分配度の比（ｎ－オクタノール相及び水相中における濃度の比）であり、例えばＯＥＣＤガイドライン１０７に規定されるフラスコ振とう法、ＯＥＣＤガイドライン１１７に規定されるＨＰＬＣ法、あるいは量子化学計算や分子動力学シミュレーション等により算出することができる。
本発明における（Ｂ）２５℃で液状の炭化水素とは、例えばスクワラン、ミネラルオイル、水添ポリイソブテン等が挙げられる。特に、非鉱物油であるスクワランが好ましく用いられる。
本発明における（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素とは、例えばパラフィンワックス、マイクロクリスタリンワックス等が挙げられる。特に、ハンドリングの点から４８～６９℃に融点を有するパラフィンワックスが好ましく用いられ、例えば、１１５°（融点約４８℃）、１３０°（融点約５６℃）、１５５°（融点約６９℃）等を使用することができる。
本発明における固型物とは、（Ａ）難水溶性被験物質、（Ｂ）２５℃で液状の炭化水素及び（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素を７０℃以上で加熱することにより均一に溶解させた後に冷却することにより得られるものであり、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合させる順番は特に限定されない。例えば、予め（Ａ）難水溶性被験物質と（Ｂ）２５℃で液状の炭化水素を均一に溶解させた後、（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素と混合し、７０℃以上で加熱することにより均一に溶解させた後に冷却することにより固型物を得ることができる。固型物を調製するための容器は特に限定されず、例えば、細胞培養用ディッシュ、マイクロプレート、マイクロチューブ等を使用することができる。
本発明における浮遊系培養細胞の懸濁液を調製する際に使用する溶液は、細胞を懸濁することができれば特に限定されない。例えば、培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を使用することができる。浮遊系培養細胞へ難水溶性被験物質を長時間曝露する場合は、細胞の生育への影響を最小限にするため、培地を使用するのが好ましい。
本発明における浮遊系培養細胞の懸濁液を適用する方法は、特に限定されない。例えば、パスツールピペット、マイクロピペット等を用いて、固型物の上から浮遊系培養細胞の懸濁液を適用する。その後、ＣＯ２インキュベーター等に入れ、一定時間放置することにより、自重により浮遊系培養細胞が懸濁液の下部に沈み、固型物の上面と接触する。これにより、固型物中に含まれる難水溶性被験物質と浮遊系培養細胞を効率よく接触させることが可能となる。
本発明における一定時間とは、難水溶性被験物質と浮遊系培養細胞を効率よく接触させるために十分な時間のことを指し、特に限定されないが、例えば６時間、２４時間、４８時間等が挙げられる。
本発明における（Ｃ）２５℃で固型状且つ７０℃で液状の炭化水素の含有量は特に限定されないが、冷却後の操作上の点から（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）の総量に対して５０重量％以上であることが好ましい。
本発明における浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法を用いることにより、被験物質の細胞毒性、遺伝子発現あるいはタンパク発現を指標にした各種有効性あるいは安全性の評価に応用することができる。
本発明における難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価法とは、浮遊系培養細胞の一種であるヒト単球性白血病由来（ＴＨＰ－１）細胞上に発現される細胞表面マーカーＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量の変化を指標にして評価するものである。ＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量の測定方法は特に限定されないが、例えば抗ヒトＣＤ８６及びＣＤ５４抗体を用いて細胞を染色し、フローサイトメーターを用いて測定する方法等が挙げられる。評価方法としては、例えば難水溶性被験物質処理群におけるＣＤ８６及びＣＤ５４の平均蛍光強度を、難水溶性被験物質未処理群の平均蛍光強度で除して相対蛍光強度を算出し、評価する方法等が挙げられる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
１．固型物の調製
難水溶性被験物質であるサリチル酸ヘキシル（Ｆｌｕｋａ社、オクタノール／水分配係数５．０６）及びＮ，Ｎ－ジブチルアニリン（富士フィルム和光純薬社、オクタノール／水分配係数５．１２）をそれぞれスクワラン（シュガースクワラン、日光ケミカルズ社）に溶解し、難水溶性被験物質のスクワラン溶液を調製した。３００ｍｇのスクワラン溶液及び３００ｍｇのパラフィンワックス（１５５°パラフィン、日本精蝋社）を１．５ｍＬのマイクロチューブへ入れ、７２℃にて６０分間加熱溶解した。その後、室温まで冷却することにより固型物を得た。
難水溶性被験物質であるサリチル酸ヘキシル（Ｆｌｕｋａ社、オクタノール／水分配係数５．０６）及びＮ，Ｎ－ジブチルアニリン（富士フィルム和光純薬社、オクタノール／水分配係数５．１２）をそれぞれスクワラン（シュガースクワラン、日光ケミカルズ社）に溶解し、難水溶性被験物質のスクワラン溶液を調製した。３００ｍｇのスクワラン溶液及び３００ｍｇのパラフィンワックス（１５５°パラフィン、日本精蝋社）を１．５ｍＬのマイクロチューブへ入れ、７２℃にて６０分間加熱溶解した。その後、室温まで冷却することにより固型物を得た。
２．浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露
ＴＨＰ－１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて培養し、細胞を回収した後、２．０×１０６個／ｍＬになるように新しい培地で再懸濁し、細胞懸濁液を得た。５００μＬの細胞懸濁液を、マイクロピペットを用いて固型物の上に適用した後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した。
ＴＨＰ－１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて培養し、細胞を回収した後、２．０×１０６個／ｍＬになるように新しい培地で再懸濁し、細胞懸濁液を得た。５００μＬの細胞懸濁液を、マイクロピペットを用いて固型物の上に適用した後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した。
３．難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
上記手法にて難水溶性被験物質を曝露した後のＴＨＰ－１細胞を回収し、染色用緩衝液で細胞を洗浄した。その後、ブロッキング溶液を加えて４℃にて１５分間インキュベートした後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ５４抗体及びマウスＩｇＧ抗体で細胞を４℃にて３０分間染色した。ＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量は、フローサイトメーターを用いて測定した。即ち、抗ＣＤ８６抗体及び抗ＣＤ５４抗体で処理された細胞の平均蛍光強度と、マウスＩｇＧ抗体で処理された細胞の平均蛍光強度の差を算出し、被験物質無しの場合の平均蛍光強度を１００とした場合の相対蛍光強度を算出した。
上記手法にて難水溶性被験物質を曝露した後のＴＨＰ－１細胞を回収し、染色用緩衝液で細胞を洗浄した。その後、ブロッキング溶液を加えて４℃にて１５分間インキュベートした後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ５４抗体及びマウスＩｇＧ抗体で細胞を４℃にて３０分間染色した。ＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量は、フローサイトメーターを用いて測定した。即ち、抗ＣＤ８６抗体及び抗ＣＤ５４抗体で処理された細胞の平均蛍光強度と、マウスＩｇＧ抗体で処理された細胞の平均蛍光強度の差を算出し、被験物質無しの場合の平均蛍光強度を１００とした場合の相対蛍光強度を算出した。
＜判定基準＞
ＣＤ８４の相対蛍光強度が１５０％以上又はＣＤ５４の相対蛍光強度が２００％以上の場合を陽性、その他の場合を陰性と判定した。
ＣＤ８４の相対蛍光強度が１５０％以上又はＣＤ５４の相対蛍光強度が２００％以上の場合を陽性、その他の場合を陰性と判定した。
被験物質の濃度（重量％）は、（Ａ）の含有量を（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）の含有量で除して算出した。
表１に示したように、サリチル酸ヘキシルの２０重量％、２４重量％及びＮ，Ｎ－ジブチルアニリンの１２．５重量％及び１５重量％において、ＣＤ５４の相対蛍光強度が２００％以上となった。また、Ｎ，Ｎ－ジブチルアニリンの１０重量％において、ＣＤ８６の相対蛍光強度が１５０％以上となった。このことから、サリチル酸ヘキシル及びＮ，Ｎ－ジブチルアニリンは、共に陽性と判定された。
１）Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ Ｏ ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｓｃｉ．、３８（４）、５９９－６０９、２０１３
表２に、従来の手法と本発明の手法との判定結果を示した。ｉｎ ｖｉｖｏ評価法の一種である局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）では、サリチル酸ヘキシル及びＮ，Ｎ－ジブチルアニリン共に陽性と判定された。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価法の一種であるｈ－ＣＬＡＴでは、サリチル酸ヘキシルは陽性と判定されたのに対し、Ｎ，Ｎ－ジブチルアニリンは陰性と判定され、偽陰性となった。このことから、本発明の手法を用いることにより、難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価を適切に実施できることが明らかとなった。
本発明によれば、難水溶性被験物質の細胞毒性、遺伝子発現あるいはタンパク発現を指標にした各種有効性あるいは安全性の評価、特に難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価を適切に実施することができ、動物実験代替試験法への貢献も高いことから、化粧品だけでなく、医薬品等にも応用可能である。
Claims (3)
- 浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法であって、（Ａ）オクタノール／水分配係数が３．５以上である難水溶性被験物質、（Ｂ）スクワラン、（Ｃ）４８～６９℃に融点を有するパラフィンワックスを７０℃以上に加熱溶解させた後に冷却して固型物を得た後、該固型物の上から浮遊系培養細胞の懸濁液を適用し、一定時間放置することを特徴とする、浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法。
- 前記（Ｃ）４８～６９℃に融点を有するパラフィンワックスの含有量が、（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）の総量に対して５０重量％以上である請求項１記載の浮遊系培養細胞への難水溶性被験物質の曝露方法。
- 請求項１又は２記載の曝露方法を用いた難水溶性被験物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価法であり、浮遊系培養細胞の一種であるヒト単球性白血病由来（ＴＨＰ－１）細胞上に発現される細胞表面マーカーＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量を指標にした、難水溶性皮膚感作性物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価法。
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