JP7597783B2 - バイサルファイトを使用しない全ゲノムメチル化解析 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本開示は、全ゲノムにおいて、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－カルボキシルシトシン及び／または５－ホルミルシトシンの位置を特定する方法を提供する。
〔背景技術〕
５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）は、哺乳動物ゲノムに見られる２つの主要エピジェネティックマークである。５ｈｍＣは、１０－１１転座（ＴＥＴ）ファミリーのジオキシゲナーゼによって、５ｍＣから生成される。Ｔｅｔはさらに、５ｈｍＣを酸化して、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）にすることができ、哺乳動物ゲノムにおいて、５ｃａＣは、存在量が５ｍＣ及び５ｈｍＣよりもかなり少ない（５ｈｍＣの量の１０分の１～１００分の１）。５ｍＣ及び５ｈｍＣは連動して、遺伝子調節から正常な発生に至る広範な生物学的プロセスで重要な役割を果たす。ＤＮＡの異常なメチル化及びヒドロキシメチル化は、様々な疾患と関連付けられており、がんの特徴として広く認められている。したがって、ＤＮＡ配列における５ｍＣ及び５ｈｍＣの判定は、基礎研究に重要であるのみならず、診断及び治療を含む臨床用途にも有用である。

５ｆＣ及び５ｃａＣは、５ｍＣの最終酸化誘導体の２つであり、塩基除去修復経路におけるチミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）によって、無修飾シトシンに変換できる。すなわち、５ｆＣ及び５ｃａＣは、胚発生で重要な役割を果たす能動的脱メチル化プロセスにおいて、２つの重要な鍵となる中間体である。５ｆＣ及び５ｃａＣは、これらの状況において確認されており、５ｍＣの脱メチル化がほぼ完了したことの指標として機能し得る。５ｆＣ及び５ｃａＣは、特異的タンパク質との結合、ならびにＲＮＡポリメラーゼＩＩの速度及び特異性に対する作用といった追加の機能も果たし得る。

ＤＮＡのメチル化及びヒドロキシメチル化の解析方法のうち、現行のゴールドスタンダードであるとともに、最も広く使われている方法は、バイサルファイトシーケンシング（ＢＳ）、ならびに、Ｔｅｔアシストバイサルファイトシーケンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）及び酸化バイサルファイトファイトシーケンシング（ｏｘＢＳ）といったその派生方法である。同様に、バイサルファイトシーケンシングは、全ゲノムＤＮＡのメチル化のアッセイ方法のうち、最も確立された方法である。これらの方法のいずれも、バイサルファイト処理を用いて、非メチル化シトシンをウラシルに変換する一方で、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣは、インタクトなままにする。バイサルファイト処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅（ウラシルをチミンとして読み取る）を通じて、各シトシンの修飾情報を１塩基の分解能で得ることができる（ＣをＴに変換することで、非メチル化シトシンの位置が得られる）。しかしながら、バイサルファイトシーケンシングには、主な欠点が少なくとも２つある。第１に、バイサルファイト処理は、所要の酸性条件及び温熱条件下で、脱プリン化が原因で、ＤＮＡの９０％超が分解される過酷な化学反応である点である。この分解により、その用途は、循環セルフリーＤＮＡ及びシングルセルシーケンシングを含む臨床試料のように、インプットの少ない試料に厳しく制限される。第２に、バイサルファイトシーケンシングは、無修飾シトシンのチミンへの完全な変換に依存する点である。無修飾シトシンは、ヒトゲノムにおいて、全シトシンのおよそ９５％を占める。これらのすべての位置がチミンに変換されると、配列複雑度が大幅に低下し、シーケンシングクオリティが下がり、マッピング率が低くなり、ゲノムカバレッジが不均一となり、シーケンシングコストが上昇する。バイサルファイトシーケンシング法は、無修飾シトシンのチミンへの変換が不完全なことにより、５ｍＣ及び５ｈｍＣの偽検出も発生しやすい。

全ゲノム塩基の分解能のメチロームシーケンシングにより、ＤＮＡメチル化は最も網羅的に解析可能となるが、高額なシーケンシングコストにより、用途が制限される場合が多い。シーケンシングコストを削減するために、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）を用いてもよい。しかしながら、ＲＲＢＳは、所定の配列コンテクストにおけるごく一部のＣｐＧ部位しか対象としないので、メチル化の網羅的な状況は得られない。したがって、低コストで、ｍＣｐＧのカバレッジを向上させるアプローチに対するニーズが存在する。
〔発明の概要〕
本開示は、全ゲノム塩基の分解能のメチローム解析方法を提供する。実施形態では、その方法は、ＤＮＡ試料における５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－カルボキシルシトシン及び／または５－ホルミルシトシンのうちの１つ以上の位置を特定する。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、全ゲノムを含む。本明細書に記載されている方法は、ＤＮＡのメチル化及びヒドロキシメチル化の解析であって、無修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、塩基単位の分解能で、修飾シトシンを検出する穏和な反応を伴う解析を実現する。本発明で提供するのは、ＴＥＴによる酸化と、ボラン誘導体（例えば、ピリジンボラン及び２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ_３））による還元を組み合わせることによって、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを特定するための改良型の方法であり、この方法は、本明細書では、ＴＡＰＳ（ＴＥＴアシストピリジンボランシーケンシング）（表１）という。ＴＡＰＳは、無修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、高い感度及び特異性で、修飾を直接検出するとともに、本明細書に記載されているように、改変して、他のシトシン修飾を検出することができる。ＴＡＰＳは、非破壊的であり、ＤＮＡを最長で１０ｋｂに保つものである。ＴＡＰＳでは、バイサルファイトシーケンシングと比べて、マッピング率が高く、カバレッジが均一で、シーケンシングコストが低く、クオリティの上昇が可能となり、網羅性の向上した、より安価なメチローム解析が行われる。本明細書に記載されているように、５ｆＣ及び／または５ｃａＣを特定するには、酸化工程を用いない、この方法の変形形態を使用する。

全ゲノムＴＡＰＳ（ｗｇＴＡＰＳ）では、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）と比べて、シーケンシングコストが半減する。しかしながら、特に、５ｍＣ及び５ｈｍＣが、哺乳動物ゲノムにおける全シトシン残基の約４％を占めるに過ぎないため、ショートリード全ゲノムシーケンシングによって生成されるリードの６５％～８０％前後が、メチル化ＣｐＧ部位（ｍＣｐＧ）を全く含まないことを考慮すると、全ゲノムシーケンシングのコストは、多くのプロジェクトにとって、依然として法外である。シーケンシングコストを削減するために、バイサルファイト処理の前に、ＣｐＧに富む領域を制限酵素によって濃縮するＲｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）が、広く用いられている方法である。しかしながら、ＲＲＢＳは、所定の配列コンテクストにおけるごく一部のＣｐＧ部位しかカバーしないので、メチル化の網羅的な状況は得られない。したがって、低コストで、ｍＣｐＧのカバレッジを向上させるアプローチに対するニーズが存在する。一実施形態では、本開示は、費用効果が良いゲノムワイドなメチル化解析を１ＣｐＧの分解能で行うための新たな方策をもたらす、ＴＡＰＳ法の改変型（本明細書では、エンドヌクレアーゼ濃縮ＴＡＰＳ（ｅｅＴＡＰＳ）という）を提供する。別の実施形態では、本開示は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び／または５ｃａＣを検出するのに使用できる、ＴＡＰＳ法の変形形態の改変型（例えば、ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳ）を提供する。

すなわち、本開示は、全ゲノムにおいて、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－カルボキシルシトシン及び／または５－ホルミルシトシンのうちの１つ以上を特定するための、低コストな方法を提供する。本明細書に記載されている方法は、例えばＴＥＴアシストピリジンボラン処理によって、修飾シトシン（５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、５ｃａＣ）をジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換してから、そのＤＨＵ部位をエンドヌクレアーゼによって切断して、ＤＮＡ断片を作製した後、その断片をシーケンシングライブラリーにすることをベースとする。断片化されなかったゲノムＤＮＡは、直接シーケンシングすることはできず、ＤＨＵに変換される修飾シトシンが存在する場合のみ、ゲノムＤＮＡは切断されて、ＤＮＡ断片となった後、その断片の各末端（修飾シトシンの位置を示す）により、シーケンシングできる。その切断された断片をシーケンシングすることによって、元のＤＮＡ試料におけるメチル化シトシンを塩基単位の分解能で特定できる。さらに、高メチル化シトシンは、低メチル化部位よりも、切断される傾向が高いので、この方法を用いて、ＤＮＡメチル化の半定量を行うことができる。

一態様では、本開示は、ＤＮＡ試料における５ｍＣまたは５ｈｍＣの特定方法であって、
ａ．５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを有する標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５ｆＣに変換する工程
ｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置が得られる方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料における５－メチルシトシン（５ｍＣ）の特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡ試料を改変する工程（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に、ブロック基を付加する工程
ｉｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程
ｉｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣの位置が得られる方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料における５ｍＣまたは５ｈｍＣの特定方法であって、
ａ．５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを有する標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５ｆＣに変換する工程
ｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置が得られる方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料において、５ｍＣを同定するとともに、５ｈｍＣを同定する方法であって、
ａ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣを特定すること（以下の工程を含む）と、
ｉ．５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを有する標的ＤＮＡを含む第１のＤＮＡ試料を準備する工程
ｉｉ．その第１の試料中のＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）
１．その第１のＤＮＡ試料中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に、ブロック基を付加する工程
２．その第１のＤＮＡ試料中の５ｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程
３．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む第１の改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｉｉｉ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程
ｉｖ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程
ｖ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣの位置が得られる工程
ｂ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定すること（以下の工程を含む）と、
ｉ．５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを有する標的ＤＮＡを含む第２のＤＮＡ試料を準備する工程
ｉｉ．その第２の試料中のＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）
１．その第２のＤＮＡ試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程
２．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む第２の改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｉｉｉ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程
ｉｖ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程
ｖ．その第２の試料に由来する改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置が得られる工程
ｃ．工程（ａ）及び（ｂ）の結果を比較することであって、工程（ｂ）では存在するが、工程（ａ）では存在しない切断部位により、その標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣの位置が得られることと、
を含む方法を提供する。

実施形態では、そのＤＮＡ試料中の５ｈｍＣに付加するブロック基は、糖である。実施形態では、その糖は、天然の糖または修飾糖、例えば、グルコースまたは修飾グルコースである。実施形態では、ブロック基は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素、例えば、Ｔ４バクテリオファージβ－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）及びＴ４バクテリオファージα－グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにそれらの誘導体及び類似体の存在下で、ＤＮＡ試料を、糖に連結されたＵＤＰ、例えば、ＵＤＰ－グルコース、または修飾グルコースに連結されたＵＤＰと接触させることによって、５ｈｍＣに付加する。

実施形態では、ＤＮＡ試料中の５ｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程、ならびにＤＮＡ試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程はそれぞれ、そのＤＮＡ試料を１０－１１転座（ＴＥＴ）酵素と接触させることを含む。さらなる実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴｅｔ１、マウスＴｅｔ２、マウスＴｅｔ３、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（ＣｃＴＥＴ）、及びこれらの誘導体または類似体のうちの１つ以上である。実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ＮｇＴＥＴまたはその誘導体である。実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、マウスｍＴｅｔ１（ｍＴｅｔ１ＣＤ）またはその誘導体である。別の実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ２（ｈＴＥＴ２）またはその誘導体である。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｃａＣまたは５ｆＣの特定方法であって、
ａ．５ｃａＣ及び／または５ｆＣを有する標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．その５ｃａＣ及び５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程と、
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｃａＣまたは５ｆＣのいずれかの位置が得られる方法を提供する。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｃａＣの特定方法であって、
ａ．５ｃａＣを有する標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡ試料中の５ｆＣに、ブロック基を付加する工程と、
ｃ．その５ｃａＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程と、
ｄ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｅ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｆ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｃａＣの位置が得られる方法を提供する。

実施形態では、そのＤＮＡ試料中の５ｆＣに、ブロック基を付加する工程は、そのＤＮＡをアルデヒド反応性化合物（例えば、ヒドロキシルアミン誘導体（Ｏ－エチルヒドロキシルアミンなど）、ヒドラジン誘導体及びヒドラジド誘導体を含む）と接触させることを含む。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｆＣの特定方法であって、
ａ．５ｆＣを有する標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡ試料中の５ｃａＣに、ブロック基を付加する工程と、
ｃ．その５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程と、
ｄ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｅ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｆ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｆＣの位置が得られる方法を提供する。

実施形態では、そのＤＮＡ試料中の５ｃａＣに、ブロック基を付加する工程は、そのＤＮＡ試料をカルボン酸誘導体化試薬（例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を含む）、及び（ｉｉ）アミン（エチルアミンなど）、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミン化合物と接触させることを含む。

別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｈｍＣの特定方法であって、
ａ．５ｈｍＣを有する標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備することと、
ｂ．その試料中のＤＮＡを改変すること（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程
ｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断することと、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加することと、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出することと、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣの位置が得られる方法を提供する。

実施形態では、５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程は、そのＤＮＡ試料を酸化剤と接触させることを含む。さらなる実施形態では、その酸化剤は、過ルテニウム酸カリウム、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ、ルテニウム酸カリウムまたは酸化マンガンである。

実施形態では、そのＤＮＡ試料は、ゲノムＤＮＡを含む。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、ピコグラム量のＤＮＡを含む。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、ＤＮＡを約１ｐｇ～約９００ｐｇ、ＤＮＡを約１ｐｇ～約５００ｐｇ、ＤＮＡを約１ｐｇ～約１００ｐｇ、ＤＮＡを約１ｐｇ～約５０ｐｇ、ＤＮＡを約１～約１０ｐｇ、ＤＮＡを約２００ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満、ＤＮＡを約５０ｐｇ未満、ＤＮＡを約２０ｐｇ未満、及びＤＮＡを約５ｐｇ未満含む。別の実施形態では、そのＤＮＡ試料は、ナノグラム量のＤＮＡを含む。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、ＤＮＡを約１～約５００ｎｇ、ＤＮＡを約１～約２００ｎｇ、ＤＮＡを約１～約１００ｎｇ、ＤＮＡを約１～約５０ｎｇ、ＤＮＡを約１ｎｇ～約１０ｎｇ、ＤＮＡを約１ｎｇ～約５ｎｇ、ＤＮＡを約１００ｎｇ未満、ＤＮＡを約５０ｎｇ未満、ＤＮＡを約５ｎｇ、またはＤＮＡを約２ｎｇ未満含む。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、マイクログラム量のＤＮＡを含む。

実施形態では、５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程は、そのＤＮＡ試料を還元剤（例えば、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ_３）、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを含む）と接触させることを含む。好ましい実施形態では、その還元剤は、ｐｉｃ－ＢＨ_３及び／またはピリジンボランである。

実施形態では、その改変標的ＤＮＡを切断する工程は、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料と、ＤＨＵの存在により、改変標的ＤＮＡを特異的に切断する１つ以上のエンドヌクレアーゼとを接触させることによって、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを特異的に切断することを含む。実施形態では、そのエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ活性及びＡＰリアーゼ活性を有する２官能性ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、例えば、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）及び／またはｈＮＥＩＬ１が挙げられる。実施形態では、その改変標的ＤＮＡは、ウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ）を用いて切断する。そのＵＳＥＲ酵素は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを組み合わせたものを含む。改変標的ＤＮＡを切断するために、単独でまたは組み合わせて使用できる他の酵素は、アプリン酸／アピリミジン酸エンドヌクレアーゼ１（ＡＰＥ１）、ＵＤＧ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇ及び／またはｈＮＥＩＬ１である。

実施形態では、上記の方法は、その切断された改変標的ＤＮＡのサイズ選別を行う工程をさらに含む。実施形態では、上記の方法は、その改変標的ＤＮＡのコピー数を増幅する工程をさらに含む。実施形態では、この増幅工程は、その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程の前に行う。その改変標的ＤＮＡのコピー数を増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プライマー伸長法及び／またはクローニングを行うことによって行ってよい。

実施形態では、その改変標的ＤＮＡの配列を決定する工程は、チェーンターミネーションシーケンシング、マイクロアレイ、ハイスループットシーケンシング及び制限酵素解析を含む。実施形態では、その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程は、次世代シーケンシング法を含む。

一態様では、本開示は、改変標的ＤＮＡの切断方法であって、１つ以上のＤＨＵ（すなわちＤＨＵ残基）を含む改変標的ＤＮＡと、その１つ以上のＤＨＵの位置またはその１つ以上のＤＨＵと隣接する位置で、その改変標的ＤＮＡを切断する１つ以上のエンドヌクレアーゼとを接触させること含む方法を提供する。その１つ以上のエンドヌクレアーゼは、例えば、本明細書に記載されているいずれかのタイプのエンドヌクレアーゼまたはそれらを組み合わせたものであってよい。実施形態では、その改変標的ＤＮＡにおける１つ以上のＤＨＵは、例えば、本明細書に記載されている方法によって、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣから派生させたものである。実施形態では、その改変標的ＤＮＡにおける１つ以上のＤＨＵは、例えば、本明細書に記載されている方法によって、５ｃａＣ及び／または５ｆＣから派生させたものである。

実施形態では、その方法は、接触工程の前に、その改変標的ＤＮＡをもたらすために、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、その改変は、（ｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、（ｉｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程を含む。

実施形態では、その方法は、接触工程の前に、改変標的ＤＮＡをもたらすために、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、その改変は、（ｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣに、ブロック基を付加する工程と、（ｉｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、（ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程を含む。

実施形態では、その方法は、接触工程の前に、改変標的ＤＮＡをもたらすために、５ｃａＣ及び／または５ｆＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、その改変は、例えば、本明細書に記載されている方法によって、その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程を含む。

実施形態では、その方法は、接触工程の前に、改変標的ＤＮＡをもたらすために、５ｃａＣ及び／または５ｆＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、その改変は、（ｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その標的ＤＮＡにおける５ｆＣにブロック基を付加する工程と、（ｉｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その５ｃａＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程を含む。

実施形態では、その方法は、接触工程の前に、改変標的ＤＮＡをもたらすために、５ｃａＣ及び／または５ｆＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、その改変は、（ｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その標的ＤＮＡにおける５ｃａＣに、ブロック基を付加する工程と、（ｉｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程を含む。

実施形態では、その方法は、接触工程の前に、改変標的ＤＮＡをもたらすために、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、その改変は、（ｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、（ｉｉ）例えば、本明細書に記載されている方法によって、その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程を含む。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ボラン含有化合物のスクリーニングである。１１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）における５ｃａＣのＤＨＵへの変換について、ボラン含有化合物をスクリーニングし、変換率は、ＭＡＬＤＩによって推定した。２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ボラン）、ボランピリジン及びｔｅｒｔ－ブチルアミンボランは、５ｃａＣをＤＨＵに完全に変換できたが、エチレンジアミンボラン及びジメチルアミンボランでは、変換率は３０％前後であった。ジクロロヘキシルアミンボラン、モルホリンボラン、４－メチルモルホリンボラン及びトリメチルアミンボランでは、検出可能な生成物は、測定されなかった（不検出）。水素化ホウ素ナトリウム及びトリ（アセトキシ）水素化ホウ素ナトリウムのような他の還元剤は、酸性培地中で速やかに分解されて、変換が不完全となった。シアノ水素化ホウ素ナトリウムは、酸性条件下では、シアン化水素が形成される可能性があることから、使用しなかった。完全な変換、低い毒性及び高い安定性から、Ｐｉｃ－ボラン及びピリジンボランを選択した。
〔図２〕ＤＮＡオリゴにおけるＰｉｃ－ボラン反応である。（Ａ）５ｃａＣを含む１１ｍｅｒのモデルＤＮＡをｐｉｃ－ボランで処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けたものである。各グラフの上に、質量（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、質量の観察値が示されている。（Ｂ）ｄＣ及び各種シトシン誘導体の変換率をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって定量した。データは、３つのレプリケートの平均±標準偏差としてされている。
〔図３Ａ〕単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応である。^１Ｈ ＮＭＲの結果は、２’－デオキシ－５，６－ジヒドロウリジンに関する過去の報告に従ったものである（Ｉ．Ａｐａｒｉｃｉ－Ｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８１，４０３１－４０３８（２０１６））。単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応生成物の^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ－ｄ_４、４００ＭＨｚ）チャートである。δ ｐｐｍ： ６．２８ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）， ４．３０ （ｍ， １Ｈ）， ３．８１ （ｍ， １Ｈ）， ３．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６ Ｈｚ）， ２．２０ （ｍ， １Ｈ）， ２．０３ （ｍ， １Ｈ）．
〔図３Ｂ〕単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応である。^１３Ｃ ＮＭＲの結果は、２’－デオキシ－５，６－ジヒドロウリジンに関する過去の報告に従ったものである（Ｉ．Ａｐａｒｉｃｉ－Ｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８１，４０３１－４０３８（２０１６））。単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応生成物の^１３Ｃ ＮＭＲ （ＭｅＯＨ－ｄ_４， ４００ ＭＨｚ）チャートである。δ ｐｐｍ： １７１．５６ （ＣＯ）， １５３．５４ （ＣＯ）， ８５．９７ （ＣＨ）， ８３．８６ （ＣＨ）， ７０．９９ （ＣＨ）， ６１．９２ （ＣＨ_２）， ３６．０４ （ＣＨ_２）， ３５．４６ （ＣＨ_２）， ３０．４９ （ＣＨ_２）．
〔図４Ａ〕５ｃａＣのＤＨＵへの、ボランによる変換と、５ｃａＣのＤＨＵへのボラン反応の機序案を示す図である。
〔図４Ｂ〕５ｆＣのＤＨＵへの、ボランによる変換と、５ｆＣのＤＨＵへのボラン反応の機序案を示す図である。
〔図５〕（Ａ）ＴＡＰＳ法が、５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方をＤＨＵに変換し、そのＤＨＵが、複製時にはチミンとして機能することを示す図である。（Ｂ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳの方法の概説である。
〔図６－１〕５ｆＣ及び５ｃａＣを含むモデルＤＮＡオリゴをｐｉｃ－ボランによって、５ｆＣ及び５ｃａＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｆＣ及び５ｃａＣは、ｐｉｃ－ＢＨ_３によってジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される。５ｆＣは、Ｏ－エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ_２）のようなヒドロキシルアミン誘導体によってブロックしたが、その誘導体は、オキシムとなり、ｐｉｃ－ボランによる変換を阻止することになる。５ｃａＣは、ＥＤＣ結合を介して、エチルアミンによってブロックして、ｐｉｃ－ボランによる変換をブロックするアミドに変換した。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。
〔図６－２〕５ｆＣ及び５ｃａＣを含むモデルＤＮＡオリゴをｐｉｃ－ボランによって、５ｆＣ及び５ｃａＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｆＣ及び５ｃａＣは、ｐｉｃ－ＢＨ_３によってジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される。５ｆＣは、Ｏ－エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ_２）のようなヒドロキシルアミン誘導体によってブロックしたが、その誘導体は、オキシムとなり、ｐｉｃ－ボランによる変換を阻止することになる。５ｃａＣは、ＥＤＣ結合を介して、エチルアミンによってブロックして、ｐｉｃ－ボランによる変換をブロックするアミドに変換した。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。
〔図７－１〕５ｍＣ及び５ｈｍＣを含むモデルＤＮＡオリゴをＫＲｕＯ_４及びｐｉｃ－ボランによって、５ｈｍＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｈｍＣは、βＧＴによってグルコースでブロックして、５ｇｍＣに変換できた。５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｍＣは、ｐｉｃ－ボランによって変換できなかった。５ｈｍＣは、ＫＲｕＯ_４によって酸化させて、５ｆＣにしてから、ｐｉｃ－ボランによってＤＨＵに変換できた。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。
〔図７－２〕５ｍＣ及び５ｈｍＣを含むモデルＤＮＡオリゴをＫＲｕＯ_４及びｐｉｃ－ボランによって、５ｈｍＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｈｍＣは、βＧＴによってグルコースでブロックして、５ｇｍＣに変換できた。５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｍＣは、ｐｉｃ－ボランによって変換できなかった。５ｈｍＣは、ＫＲｕＯ_４によって酸化させて、５ｆＣにしてから、ｐｉｃ－ボランによってＤＨＵに変換できた。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。
〔図８〕制限酵素消化によって、ＴＡＰＳが、５ｍＣをＴに効果的に変換できることが示された。（Ａ）ＴＡＰＳによる配列変化を確認するための制限酵素消化アッセイの図である。（Ｂ）ＴＡＰＳによる、ＣからＴへの変換を確認するためのＴａｑαＩ消化試験である。ＴＡＰＳは、ＴａｑαＩ制限部位を有するとともに、完全にメチル化された５つのＣｐＧ部位（５ｍＣ）を含む２２２ｂｐのモデルＤＮＡと、その非メチル化コントロール（Ｃ）で行った。５ｍＣ、Ｃ及びＣ ＴＡＰＳに示されているように、ＰＣＲ増幅した２２２ｂｐのモデルＤＮＡは、ＴａｑαＩによって、約１６０ｂｐ及び約６０ｂｐの断片に切断できる。５ｍＣ－ＴＡＰＳのレーンに示されているように、メチル化ＤＮＡでＴＡＰＳを行った後、Ｔ（ｍＣ）ＧＡ配列は、ＴＴＧＡに変換され、ＴａｑαＩ消化によっては切断されなくなる。
〔図９〕２２２ｂｐのモデルＤＮＡ及びｍＥＳＣ ｇＤＮＡでのＴＡＰＳである。（Ａ）ＴＡＰＳの前（５ｍＣ、Ｃ）及びＴＡＰＳの後（５ｍＣ ＴＡＰＳ、Ｃ ＴＡＰＳ）における、完全にメチル化された５つのＣｐＧ部位を含む２２２ｂｐのモデルＤＮＡと、その非メチル化コントロールのサンガーシーケンシングの結果である。５ｍＣのみが、ＴＡＰＳ法によってＴに変換される。（Ｂ）ＮｇＴＥＴ１による酸化後及びｐｉｃ－ボランによる還元後のｍＥＳＣ ｇＤＮＡコントロールにおける相対的な改変レベルの、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量結果である。データは、３つのレプリケートの平均±標準偏差としてされている。
〔図１０Ａ〕ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。氷浴で冷却する前（の２２２ｂｐの非メチル化ＤＮＡ、２２２ｂｐのメチル化ＤＮＡ及びｍＥＳＣ ｇＤＮＡのアガロースゲル画像である。ＴＡＰＳ後、検出可能なＤＮＡ分解は、観察されず、ＤＮＡは、二本鎖を保ち、冷却せずに見ることができた。バイサルファイト変換では、分解が起こり、ＤＮＡは、一本鎖となり、氷上で冷やした後のみに見ることができた。
〔図１０Ｂ〕ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。氷浴で冷却した後（Ｂ）の２２２ｂｐの非メチル化ＤＮＡ、２２２ｂｐのメチル化ＤＮＡ及びｍＥＳＣ ｇＤＮＡのアガロースゲル画像である。ＴＡＰＳ後、検出可能なＤＮＡ分解は、観察されず、ＤＮＡは、二本鎖を保ち、冷却せずに見ることができた。バイサルファイト変換では、分解が起こり、ＤＮＡは、一本鎖となり、氷上で冷やした後のみに見ることができた。
〔図１０Ｃ〕ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。ＴＡＰＳ及びバイサルファイトで処理した、様々な断片長のｍＥＳＣ ｇＤＮＡであって、氷上で冷やす前（左パネル）及び氷上で冷やした後（右パネル）のｍＥＳＣ ｇＤＮＡのアガロースゲル画像である。ＴＡＰＳ後のＤＮＡは、二本鎖を保ち、ゲル上で、直接見ることができた。バイサルファイト処理の方が、試料の損傷及び断片化が大きく、ＤＮＡは、一本鎖となり、氷上で冷やした後のみに見ることができた。図１５に示されているように、ＴＡＰＳによる変換は、すべてのｇＤＮＡにおいて、断片の長さにかかわらず、完全なものであった。
〔図１０Ｄ〕ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。ＴＡＰＳの前及び後の２２２ｂｐのモデルＤＮＡのアガロースゲル画像であり（独立して３回反復）、その反応後、検出可能な分解は見られなかった。
〔図１１〕ＴＡＰＳの前及び後のモデルＤＮＡ間での増幅曲線及び融解曲線の比較である。ｑＰＣＲアッセイによって、ＴＡＰＳの前及び後のモデルＤＮＡで、増幅曲線において小さな違いが見られた。メチル化ＤＮＡ（５ｍＣ）の融解曲線は、ＴＡＰＳの後、低い温度の方にシフトしたことから、Ｔｍが低下する、ＣからＴへの変換の可能性が示されたが、非メチル化ＤＮＡ（Ｃ）では、シフトは見られなかった。
〔図１２〕サンガーシーケンシングによって示されたように、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳの後、ＣからＴへの完全な変換が誘導された。本明細書に記載されているようにして、１つのメチル化ＣｐＧ部位及び１つのヒドロキシメチル化ＣｐＧ部位を含むモデルＤＮＡを調製した。本明細書に記載されているように、ＮｇＴＥＴ１による酸化及びピリジンボランによる還元のプロトコールに従って、ＴＡＰＳによる変換を行った。５ｈｍＣのブロック、ＮｇＴＥＴ１による酸化及びピリジンボランによる還元のプロトコールに従って、ＴＡＰＳβによる変換を行った。５ｈｍＣの酸化及びピリジンボランによる還元のプロトコールに従って、ＣＡＰＳによる変換を行った。変換後、変換されたＤＮＡ試料１ｎｇをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ増幅し、サンガーシーケンシング用に処理した。ＴＡＰＳは、５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方をＴに変換した。ＴＡＰＳβは、５ｍＣを選択的に変換し、それに対し、ＣＡＰＳは、５ｈｍＣを選択的に変換した。これらの３つの方法のいずれでも、無修飾シトシン及びその他の塩基は変換されなかった。
〔図１３Ａ〕ＴＡＰＳは、様々なＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼと適合しており、サンガーシーケンシングによって示されているように、ＣからＴへの完全な変換を誘導する。ポリメラーゼ試験用の、メチル化ＣｐＧ部位を含むモデルＤＮＡとプライマー配列は、本明細書に記載されている。ＴＡＰＳ処理後、５ｍＣは、ＤＨＵに変換された。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ及びＶｅｎｔエキソポリメラーゼは、ＤＨＵをＴとして読み取るので、ＰＣＲ後、ＣからＴへの完全な変換を誘導する。あるいは、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含め、ビオチン標識プライマー及び等温ポリメラーゼで、プライマー伸長を行った。新たに合成したＤＮＡ鎖をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１によって分離してから、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増幅し、サンガーシーケンシング用に処理した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＨＵを効率的にバイパスして、ＤＨＵ部位の反対側にアデニンを挿入できたが、これは、ＲＴ－ＰＣＲ及びサンガーシーケンシングによって証明されている。
〔図１３Ｂ〕特定の他の市販されているポリメラーゼは、ＤＨＵを含むＤＮＡを効率的には増幅しなかった。ＴＡＰＳ処理後、５ｍＣは、ＤＨＵに変換された。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼは、ＤＨＵをＴとして読み取るので、ＣからＴへの完全な変換を誘導することになる。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ及びＮＥＢ Ｑ５ポリメラーゼを含め、特定の他の市販されているポリメラーゼでは、ＣからＴへの変換が低度であったか、または変換されなかったことが観察された（不図示）。
〔図１４〕ＤＨＵでは、Ｔ及びＣと比べて、ＰＣＲバイアスが見られない。本明細書に記載されているように、対応するＤＮＡオリゴを用いて、１つのＤＨＵ／Ｕ／Ｔ／Ｃ修飾を含むモデルＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲ反応に基づき、ＤＨＵ／Ｕ／Ｔ／Ｃ修飾を有する各モデルＤＮＡの標準曲線をプロットし、モデルＤＮＡインプットは、１：１０の段階希釈を行った（０．１ｐｇ～１ｎｇ。すべてのｑＰＣＲ実験をトリプリケートで行った）。ＥｘｃｅｌのＳＬＯＰＥ関数によって、対数濃度（ｎｇ）の値とＣｔ平均値との回帰の傾きを計算した。効率（％）＝（１０＾（－１／傾き）－１）×１００％という式を用いて、ＰＣＲ効率を計算した。増幅係数＝１０＾（－１／傾き）という式を用いて、増幅係数を計算した。ＤＨＵ、ＴまたはＣの修飾を有するモデルＤＮＡでのＰＣＲ効率は、ほぼ同じであったことから、ＤＨＵは、通常の塩基として読み取ることができ、ＰＣＲバイアスの原因とならないと見られることが示された。
〔図１５〕ＴＡＰＳは、ＤＮＡ断片の長さにかかわらず、５ｍＣをＴに完全に変換した。（Ａ）ＴａｑαＩ－消化アッセイのアガロースゲル画像により、すべての試料において、ＤＮＡ断片の長さにかかわらず、５ｍＣからＴへの完全な変換が確認された。ＴＡＰＳ後、λゲノムに由来する１９４ｂｐのモデル配列をＰＣＲ増幅し、ＴａｑαＩ酵素で消化した。変換されなかった試料から増幅されたＰＣＲ産物は、切断できたが、ＴＡＰＳ処理試料で増幅された産物は、インタクトなままであったことから、制限部位の喪失、すなわち、５ｍＣからＴへの完全な変換が示唆されている。（Ｂ）ゲルバンドの定量によって、ＣからＴへの変換パーセンテージを推定したところ、試験したすべてのＤＮＡ断片長で、１００％となった。
〔図１６〕異なるＴＡＰＳ条件での変換及び偽陽性である。ｍＴｅｔ１及びピリジンボランを組み合わせたところ、ＮｇＴＥＴ１またはｐｉｃ－ボランを用いた他の条件と比べて、メチル化Ｃの変換率が最も高くなり（９６．５％。完全にＣｐＧがメチル化されたλＤＮＡで計算した）と、無修飾のＣの変換率が最も低くなった（０．２３％、２ｋｂの無修飾スパイクインで計算した）。バーの上に示されているのは、試験したすべてのシトシン部位の変換率±標準誤差である。
〔図１７〕短いスパイクインにおける変換率である。５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む（Ａ）１２０ｍｅｒ－１及び（Ｂ）１２０ｍｅｒ－２である。両方の鎖の５ｍＣ及び５ｈｍＣの部位で、ほぼ完全な変換が行われた。実際の配列は、修飾の状態とともに、上下に示されている。
〔図１８Ａ〕全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。ＴＡＰＳで処理したＤＮＡにおける５ｍＣ及び５ｈｍＣの変換率である。左：既知の位置においてメチル化またはヒドロキシメチル化された合成スパイクイン（ＣｐＮ）である。
〔図１８Ｂ〕全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。無修飾の２ｋｂのスパイクインから得られた、ＴＡＰＳの偽陽性率である。
〔図１８Ｃ〕全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。１００万個のシミュレーションリードを１つのＩｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ ＣＰＵの１つのコアで処理した時の、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの総実行時間である。
〔図１８Ｄ〕全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。シーケーシングしたすべてのリードペア（トリミング後）のうち、ゲノムにマッピングされた割合である。
〔図１８Ｅ〕全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。シーケンシングしたすべてのリードペアにおける第１及び第２のリードにおける１塩基あたりのシーケンシングクオリティスコアをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅによって記録したものである。上は、ＴＡＰＳである。下は、ＷＧＢＳである。
〔図１９〕ＴＡＰＳでは、ＷＧＢＳよりも均一なカバレッジが得られ、カバーされなかった位置がＷＧＢＳよりも少なかった。ＷＧＢＳとＴＡＰＳの間で、（Ａ）すべての塩基及び（Ｂ）ＣｐＧ部位におけるカバレッジ深度を比較したものであり、両方の鎖で計算した。「ＴＡＰＳ（ダウンサンプリング済み）」では、マッピングされたすべてのＴＡＰＳリードから取ったランダムなリードを選択して、カバレッジ中央値が、ＷＧＢＳのカバレッジ中央値と一致するようにした。最後のビンには、カバレッジが５０×超の位置が示されている。
〔図２０〕すべての染色体にわたる修飾レベルの分布である。マウス染色体全体にわたる、１００ｋｂのウィンドウにおける改変レベルの平均を、ＣｐＧのカバレッジによって重み付けして、Ｇａｕｓｓｉａｎ加重移動平均フィルターを用いて、ウィンドウサイズ１０で平滑化したものである。
〔図２１Ａ〕ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。すべてのマウスＣｐＧアイランド（２０個のウィンドウにビニングした）及び４ｋｂｐのフランキング領域（サイズの等しい５０個のウィンドウにビニングした）におけるシーケンシングカバレッジ深度の平均である。シーケンシング深度の差を考慮するために、マッピングされたすべてのＴＡＰＳリードをダウンサンプリングして、ゲノム全体にわたる、マッピングされたＷＧＢＳリードの数の中央値と適合させた。
〔図２１Ｂ〕ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。ＴＡＰＳのみ、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの両方、またはＷＧＢＳのみによって、少なくとも３本のリードによってカバーされたＣｐＧ部位である。
〔図２１Ｃ〕ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。少なくとも３本のリードによってカバーされたとともに、ＴＡＰＳのみ、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳ、またはＷＧＢＳのみによって検出された修飾レベルが０．１超であるＣｐＧ部位の数である。
〔図２１Ｄ〕ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳにおける修飾レベル（％）の染色体分布の例である。マウス染色体４における、１００ｋｂのウィンドウ当たりの修飾ＣｐＧの割合の平均を、Ｇａｕｓｓｉａｎ加重移動平均フィルターを用いて、ウィンドウサイズ１０で平滑化したものである。
〔図２１Ｅ〕ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの両方において、少なくとも３本のリードによってカバーされたＣｐＧ部位の数を表すヒートマップであり、各方法によって測定した場合の修飾レベルによって分類したものである。コントラストを向上させるために、両方の方法で無修飾のＣｐＧを含む第１のビンは、カラースケールから除外し、星印で示されている。
〔図２２〕ＣｐＧアイランド周辺の修飾レベルである。ＣｐＧアイランド（２０個のウィンドウにビニングした）及び４ｋｂｐのフランキング領域（サイズの等しい５０個のウィンドウにビニングした）における修飾レベルの平均である。カバレッジが３リード未満のビンは無視した。
〔図２３〕ＴＡＰＳでは、ＷＧＢＳよりもカバレッジ－修飾バイアスが小さい。すべてのＣｐＧ部位を、そのカバレッジに従ってビニングし、各ビンにおいて、修飾値の平均（●）及び中央値（黒三角）が、ＷＧＢＳ（Ａ）及びＴＡＰＳ（Ｂ）に関して示されている。最後のビンには、１００個超のリードによってカバーされたＣｐＧ部位が示されている。線は、データポイントにわたる直線近似を表している。
〔図２４〕ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡライブラリー調製キットを用いて、インプットの少ないｇＤＮＡ及びセルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳを調製した。（Ａ）ｄｓＤＮＡライブラリーキットＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩまたはＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを用いて、わずか１ｎｇのマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）による、シーケンシングライブラリーの構築が成功した。ｓｓＤＮＡライブラリーキットＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑキットを用いて、インプットＤＮＡ量をさらに、（Ｂ）０．０１ｎｇのｍＥＳＣ ｇＤＮＡまたは（Ｃ）１ｎｇのセルフリーＤＮＡまで減少させた。
〔図２５〕ｄｓＤＮＡ ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐライブラリー調製キットを用いて、インプットの少ないｇＤＮＡ及びセルフリーＤＮＡのＴＡＰＳライブラリーを調製した。ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを用いて、１ｎｇほどの少ない（Ａ）ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ及び（Ｂ）セルフリーＤＮＡで、シーケンシングライブラリーの構築が成功した。セルフリーＤＮＡは、血漿ヌクレアーゼ消化により、１６０ｂｐ前後（ヌクレオソームサイズ）のシャープな長さ分布を有する。ライブラリーの構築後、そのＤＮＡは、約３００ｂｐとなり、それは、Ｂにおけるシャープなバンドである。
〔図２６〕高品質なセルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳである。（Ａ）ＴＡＰＳで処理したｃｆＤＮＡにおける５ｍＣの変換率である。（Ｂ）ＴＡＰＳで処理したｃｆＤＮＡにおける偽陽性率である。（Ｃ）シーケンシングされたすべてのリードペアのうち、ゲノムにユニークにマッピングされた割合である。（Ｄ）シーケンシングされたすべてのリードペアのうち、ゲノムにユニークにマッピングされ、ＰＣＲ重複リードを除去した後の割合である。ＣＨＧ及びＣＨＨは、非ＣｐＧコンテクストである。
〔図２７〕ＴＡＰＳは、遺伝的バリアントを検出できる。メチル化（ＭＯＤ、上の行）及びＣ→Ｔ ＳＮＰ（下の行）では、元の上鎖（ＯＴ）／元の下鎖（ＯＢ）（左のカラム）、ならびにＯＴと相補的な鎖（ＣＴＯＴ）及びＯＢと相補的な鎖（ＣＴＯＢ）（右のカラム）において、別々の塩基分布が見られた。
〔図２８〕ＴＡＰＳ変換生成物のエンドヌクレアーゼ切断である。（Ａ）ＴＡＰＳ変換の前及び後のｍＥＳＣ ｇＤＮＡの、異なるエンドヌクレアーゼによる消化の結果である。ＴＡＰＳ変換では、メチル化シトシンに代わって、ＤＨＵが導入される。Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏ ＩＶはエンドヌクレアーゼＩＶ、Ｔｍａ Ｅｎｄｏ ＩＩＩはエンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔｔｈ Ｅｎｄｏ ＩＶはエンドヌクレアーゼＩＶ、Ｎｔｈ Ｅｎｄｏ ＩＩＩはＮｔｈエンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｅｎｄｏ ＶはエンドヌクレアーゼＶである。（Ｂ）ＴＡＰＳで処理したｍＥＳＣ ｇＤＮＡであって、ＵＳＥＲ消化前、ＵＳＥＲ消化後、及びサイズ選別後のｍＥＳＣ ｇＤＮＡの代表的な画像である。（Ｃ）ＢＳ－ｓｅｑ及びｅｅＴＡＰＳの両方によって測定したすべてのＣｐＧにおけるメチル化レベルを示す散布図である。
〔図２９Ａ〕エンドヌクレアーゼ濃縮ＴＡＰＳ（ｅｅＴＡＰＳ）である。ｅｅＴＡＰＳの概略図（上図）と、ＣＧメチル化レベルの、コンピューターによる測定値（下図）である。まず、ＴＡＰＳで５－メチルシトシン（ｍＣ）をジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換してから、ＵＳＥＲ消化を通じて濃縮した。その後、サイズ選別を行ったＤＮＡ断片を調製して、シーケンシングライブラリーにし、ＰＣＲによって増幅した。リードのアラインメント後、各ＣｐＧ部位で切断されるリードの数を、各ＣｐＧ部位で切断されたリードの総数、または各ＣｐＧ部位をカバーするリードの総数で除したものとして、ＣＧメチル化レベルを計算した。
〔図２９Ｂ〕４ｋｂのモデルＤＮＡでのｅｅＴＡＰＳの検証である。トラックは、上から下の順で、バイサルファイトシーケンシング（ＢＳ－ｓｅｑ）、ｅｅＴＡＰＳ、及びｅｅＴＡＰＳコントロールで測定したメチル化レベルを示している。ｅｅＴＡＰＳコントロールでは、ＴＡＰＳで変換せずに、ＵＳＥＲ酵素を用いて、ＤＮＡを消化した。
〔図３０Ａ〕ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳのゲノムの断片化方法を示す図である。ｗｇＴＡＰＳでは、ゲノムＤＮＡは、ランダムに断片化されるのに対して、断片化は、ｅｅＴＡＰＳでは、メチル化ＣｐＧ（ｍＣＧ）部位で、ｒｒＴＡＰＳでは、ＣＣＧＧ部位で特異的に行われる。
〔図３０Ｂ〕ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳによってカバーされたＣｐＧ部位のパーセンテージを、クロマチンの異なる特徴と重ね合わせたものを示すバープロットである。これらのクロマチンの特徴は、以前の研究（２０）で定義されている。
〔図３０Ｃ〕ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳによって、１ＣｐＧの分解能で求めたメチル化レベルの相関性を示すヒートマップである。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳの両方において、メチル化レベルを１６群に分けた。カラーは、所定の間隔でのＣｐＧの数を示している。ｗｇＴＡＰＳでのカバレッジが５超の部位のみを考慮に入れた。プロットの上部には、ピアソンの相関係数が示されている。
〔図３０Ｄ〕ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ、ｒｒＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳにおける、検出されたｍＣｐＧ部位の重複を示すベンプロットである。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳの両方において、メチル化レベルが、メチル化レベルの第１四分位超のＣｐＧ部位を、メチル化ＣｐＧとして定義した。ｒｒＴＡＰＳでは、ｗｇＴＡＰＳと同じメチル化カットオフ値を用いた。（ｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳでは、メチル化レベルが０．５超のＣｐＧ部位を、ｍＣｐＧとして定義し、ｅｅＴＡＰＳでは、メチル化レベルが０．２８超のＣｐＧ部位をｍＣｐＧとして定義した。）
〔図３１〕（Ａ）シーケンシングした断片の末端におけるヌクレオチド頻度である。（Ｂ）切断部位と、その部位に最も近いＣｐＧとの距離の分布を示すバープロットである。（Ｃ）ｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳによって、１ＣｐＧの分解能で求めたメチル化レベルの相関性を示すヒートマップである。ｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの両方において、メチル化レベルを１６群に分けた。カラーは、所定の間隔でのＣｐＧの数を示している。ｗｇＴＡＰＳでのカバレッジが５超であり、ｒｒＴＡＰＳでのカバレッジが５超である部位のみを考慮に入れた。ピアソンの相関係数は、０．９２である。（Ｄ）ｅｅＴＡＰＳのレプリケートで検出されたｍＣｐＧ部位の重複であり、レプリケートは、同じ深度になるようにサブサンプリングして、ｍＣｐＧを検出した。
〔図３２〕異なるゲノム機構におけるメチル化をｅｅＴＡＰＳでプロファイリングしたものである。（Ａ）ｍＥＳＣの１番染色体において、ｅｅＴＡＰＳ（上の線）及びｗｇＴＡＰＳ（下の線）の両方によって測定したメチル化レベルである。１００ｋｂのウィンドウを使用し、移動平均値をＲにおいて、ｂｗ＝１０で、ｍｏｖＡｖｇ２関数によって計算した。（Ｂ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳ間での、染色体ビンにおけるメチル化レベルの相関性を示す密度プロットである。１００ｋｂのウィンドウを用いて、各ビンにおいて、メチル化レベルの平均を計算した。プロットの上部には、ピアソンの相関係数が示されている。（Ｃ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳにおける、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）及び４ｋｂのフランキング領域にわたるメチル化レベルの平均である。（Ｄ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳ間での、ＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルの相関性を示す密度プロットである。プロットの上部には、ピアソンの相関係数が示されている。（Ｅ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳでの、クロマチンの異なる特徴におけるメチル化レベルの相関性を示す密度プロットである。これらのクロマチンの特徴は、ヒストンマーカーによって以前に定義されたものであり（Ｂｏｇｕ，Ｇ．Ｋ．，Ｖｉｚａｎ，Ｐ．，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｗ．，Ｂｅａｔｏ，Ｍ．，Ｄｉ Ｃｒｏｃｅ，Ｌ．ａｎｄ Ｍａｒｔｉ－Ｒｅｎｏｍ，Ｍ．Ａ．（２０１５）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｎｄ ＲＮＡ Ｍａｐｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３６，８０９－８１９）、（Ｆ）にも示されている。プロットの上部には、ピアソンの相関係数を示した。（Ｆ）クロマチンのすべての特徴にわたるメチル化レベルの分布をｅｅＴＡＰＳ（下のバー）及びｗｇＴＡＰＳ（上のバー）によって測定したものを示すボックスプロットである。
〔図３３〕ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳにおける、転写開始部位（ＴＳＳ）周辺のメチル化分布の平均である。遺伝子は、ＧＳＥ７２８５５のデータセットに従い、それらの発現レベルによって分類した。
〔図３４〕インプットの少ない試料での、ｅｅＴＡＰＳによる解析である。（Ａ）ｅｅＴＡＰＳを用いて、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、２００ｎｇのｍＥＳＣ ｇＤＮＡインプットで検出されたｍＣｐＧの数（ｗｇＴＡＰＳによって特定されたｍＣｐＧのうちの数）である。２００ｎｇのｍＥＳＣでは、リードを２分の１にダウンサンプリングして、インプットの少ない試料に合わせて、シーケンス深度を適合させた。０．２８超のメチル化レベルという基準を用いて、ｍＣｐＧを割り当て、ｅｅＴＡＰＳでは、１超の切断数をｍＣｐＧとして割り当て、ｗｇＴＡＰＳでは、０．５超のメチル化レベルをｍＣｐＧとして割り当てた。バーの上に示されているパーセンテージは、検出されたｍＣｐＧのパーセンテージである（ｗｇＴＡＰＳで検出されたｍＣｐＧは、真として定義する）。（Ｂ）異なるインプットレベルを用いて、マウスゲノムにわたり、ｅｅＴＡＰＳで測定したメチル化分布を示すヒートマップである。各染色体を１００ｋｂのウィンドウに分け、それらのウィンドウは、ヒートマップの行によって表されている。メチル化レベルは、１００ｋｂの各ウィンドウにおいて、メチル化ＣｐＧ部位の数を、カバーされたＣｐＧ部位の総数で除したものとして定義した。（Ｃ）インプットの少ない試料間での、２００ｎｇのインプット試料に対するメチル化の相関性を示す密度プロットである。メチル化レベルは、（Ｂ）に示されているように、１００ｋｂのウィンドウにおいて、全マウスゲノムにわたり計算した。ピアソンの相関係数は、各プロットについて示されている。
〔図３５〕ｅｅＴＡＰＳシーケンシング深度の解析結果である。（Ａ）１～１０×のシーケンシング深度でリードをサンプリングしたときに検出されるメチル化ＣｐＧの数である。上に示されているパーセンテージは、ｅｅＴＡＰＳによって検出されたｍＣｐＧのパーセンテージである（ｗｇＴＡＰＳで検出されたｍＣｐＧを真と定義する）。（Ｂ）１～１０×のシーケンシング深度でリードをサンプリングしたときの、１００ｋｂのウィンドウにおける、全マウスゲノム（上の線）及びＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）（下の線）におけるメチル化の相関性である。
〔発明を実施するための形態〕
本開示は、バイサルファイトを使用せずに、塩基単位の分解能で、全ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡにおけるシトシン修飾を特定する方法を提供する。本明細書に記載されている方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１２６２７（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている方法に対する改良点を含み、そのＰＣＴ特許には、バイサルファイトを使用せずに、塩基単位の分解能で、配列における５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出する方法（ＴＡＰＳという）を含む方法が記載されている。ＴＡＰＳは、無修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、５ｍＣ及び５ｈｍＣを直接かつ定量的に、塩基単位の分解能で検出するための穏和な酵素反応及び化学反応からなる。本開示は、無修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、５ｆＣ及び５ｃａＣを塩基単位の分解能で検出するための改良型の方法も提供する。すなわち、本発明で提供する方法は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び５ｃａＣのマッピングを行うものであり、バイサルファイトシーケンシングのような以前の方法の問題点を解消する。

本明細書に記載されている方法は、例えばＴｅｔアシストピリジンボラン処理によって、修飾シトシン（５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、５ｃａＣ）をジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換してから、ＤＨＵ部位を、（例えばＵＳＥＲ（ウラシル特異的除去試薬）によって）切断して、ＤＮＡ断片を作製した後、その断片をシーケンシングライブラリーにすることをベースとする。断片化されなかったゲノムＤＮＡは、直接シーケンシングすることはできない。ＤＨＵに変換される修飾シトシンが存在する場合のみ、ＤＮＡは切断されて、ＤＮＡ断片となった後、その断片の各末端（修飾シトシンの位置を示す）により、シーケンシングできる。すなわち、例えば、ｅｅＴＡＰＳは、５ｍＣ／５ｈｍＣのＤＨＵへの変換により、切断された断片のみをシーケンシングすることによって、全ゲノムＴＡＰＳ（ＷＧＴＡＰＳ）のコストを削減する。切断された断片をシーケンシングすることによって、元のＤＮＡ試料におけるメチル化シトシンを塩基単位の分解能で特定できる。

５ｍＣまたは５ｈｍＣを（一緒に）特定する方法
別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料における５ｍＣまたは５ｈｍＣの特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５ｆＣに変換する工程
ｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置が得られる方法を提供する。

標的ＤＮＡにおける５ｍＣまたは５ｈｍＣの特定方法の実施形態では、その方法は、標的ＤＮＡにおいて、５ｍＣまたは５ｈｍＣの改変が認められた各位置における、５ｍＣまたは５ｈｍＣの改変頻度に関する半定量的な尺度を提供する。５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定するこの方法は、５ｍＣ及び５ｈｍＣの位置をもたらすが、これらの２つのシトシン修飾の区別は行わない。それどころか、５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方をＤＨＵに変換する。

５ｍＣの特定方法
一態様では、本開示は、ＤＮＡ試料における５－メチルシトシン（５ｍＣ）の特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に、ブロック基を付加する工程
ｉｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程
ｉｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｍＣの位置をもたらす工程と、
を含む方法を提供する。

標的ＤＮＡにおける５ｍＣの特定方法の実施形態では、その方法は、標的ＤＮＡにおいて、５ｍＣの改変が認められた各位置における、５ｍＣの改変頻度に関する半定量的な尺度をもたらす。

５ｈｍＣを含めずに、標的ＤＮＡにおける５ｍＣを特定するために、試料中の５ｈｍＣをブロックして、５ｈｍＣが、５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換されないようにする。本開示の方法では、試料ＤＮＡにおける５ｈｍＣは、ブロック基を５ｈｍＣに付加することによって、次の工程で反応しないようになる。一実施形態では、そのブロック基は、修飾糖を含む糖、例えば、グルコースまたは６－アジド－グルコース（６－アジド－６－デオキシ－Ｄ－グルコース）である。その糖ブロック基は、１つ以上のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下で、ＤＮＡ試料をウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－糖と接触させることによって、５ｈｍＣのヒドロキシメチル基に付加する。

実施形態では、そのグルコシルトランスフェラーゼは、Ｔ４バクテリオファージβ－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、Ｔ４バクテリオファージα－グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにこれらの誘導体及び類似体である。βＧＴは、ＤＮＡにおいて、β－Ｄ－グルコシル（グルコース）残基をＵＤＰ－グルコースから５－ヒドロキシメチルシトシン残基に移転する化学反応を触媒する酵素である。

ブロック基が、例えばグルコースであるとは、グルコース部分（例えば、β－Ｄ－グルコシル残基）が５ｈｍＣに付加されて、グルコシル５－ヒドロキシメチルシトシンが得られることを指す。その糖ブロック基は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の基質であるとともに、後で、５ｈｍＣが５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換されないようにブロックするいずれの糖または修飾糖であることもできる。続いて、ＴＥＴ酵素を用いた酸化によるような、本発明で提供する方法によって、ＤＮＡ試料中の５ｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程を行う。そして、ボランによる酸化のような、本発明で提供する方法によって、その５ｃａＣ及び／または５ｆＣのＤＨＵへの変換を行う。

５ｍＣを特定するとともに、５ｈｍＣを特定する方法
本開示は、（ｉ）本明細書に記載されている第１のＤＮＡ試料で、５ｍＣを特定する方法を行い、（ｉｉ）本明細書に記載されている第２のＤＮＡ試料で、５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する方法を行うことによって、標的ＤＮＡにおいて、５ｍＣを特定するとともに、５ｈｍＣを特定する方法を提供する。（ｉ）によって、５ｍＣの位置が得られる。（ｉ）及び（ｉｉ）の結果を比較することによって、（ｉ）では存在するが、（ｉｉ）では存在しない切断部位によって、標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣの位置が得られる。実施形態では、第１及び第２のＤＮＡ試料は、同じＤＮＡ試料に由来する。例えば、第１及び第２の試料は、解析対象のＤＮＡを含む試料から取った別々のアリコートであってよい。

５ｍＣ及び５ｈｍＣ（ブロックされていない）を５ｆＣ及び５ｃａＣに変換してから、ＤＨＵに変換するので、ＤＮＡ試料に存在するすべての５ｆＣ及び５ｃａＣが、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣとして検出されることになる。しかしながら、通常の条件下では、ゲノムＤＮＡにおける５ｆＣ及び５ｃａＣのレベルが極めて低いことを考慮すると、ＤＮＡ試料中のメチル化及びヒドロキシメチル化を解析するときには、上記の事象は、許容されることが多いであろう。その５ｆＣ及び５ｃａＣのシグナルは、例えば、５ｆＣにおいては、ヒドロキシルアミンの結合によって、５ｃａＣにおいてＥＤＣのカップリングによって、５ｆＣ及び５ｃａＣを保護して、ＤＨＵに変換されないようにすることによって除去できる。

上記の方法は、５ｍＣの位置と、５ｍＣまたは５ｈｍＣ（組み合わさったもの）の位置とを比較することを通じて、標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣの位置を特定する。あるいは、標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣの改変位置を直接測定できる。すなわち、一態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｈｍＣの特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡを改変する工程（以下の工程を含む）と、
ｉ．そのＤＮＡ試料中の５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程
ｉｉ．その５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程
ｃ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｄ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｅ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣの位置が得られる方法を提供する。

実施形態では、その５ｈｍＣを５ｆＣに変換する工程は、そのＤＮＡと、例えば、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４）（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２，３３，９３４－９３７及びＷＯ２０１３０１７８５３（参照により、本明細書に援用される）に記載されているようなもの）またはＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ（過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ））（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，５３，５７５６－５７５９及びＷＯ２０１７０３９００２（参照により、本明細書に援用される）に記載されているようなもの）と、を接触させることによって、５ｈｍＣを酸化して、５ｆＣにすることを含む。使用できる他の酸化剤は、ルテニウム酸カリウム及び／または酸化マンガンである。続いて、本明細書に開示されている方法によって、例えばボラン反応によって、ＤＮＡ試料中の５ｆＣをＤＨＵに変換する。

５ｃａＣまたは５ｆＣの特定方法
一態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｃａＣまたは５ｆＣの特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程と、
ｆ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｇ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｈ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｃａＣまたは５ｆＣのいずれかの位置が得られる方法を提供する。

５ｆＣまたは５ｃａＣを特定するこの方法は、５ｆＣまたは５ｃａＣの位置をもたらすが、これらの２つのシトシン修飾の区別は行わない。むしろ、５ｆＣ及び５ｃａＣの両方をＤＨＵに変換し、そのＤＨＵを、本明細書に記載されている方法によって検出する。

５ｃａＣの特定方法
別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｃａＣの特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡ試料中の５ｆＣに、ブロック基を付加する工程と、
ｃ．その５ｃａＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程と、
ｇ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｈ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｉ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｃａＣの位置が得られる方法を提供する。

標的ＤＮＡにおける５ｃａＣの特定方法の実施形態では、その方法は、標的ＤＮＡにおいて、５ｃａＣの改変が認められた各位置における、５ｃａＣの改変頻度に関する半定量的な尺度をもたらす。

この方法では、５ｆＣをブロックし（５ｍＣ及び５ｈｍＣは、ＤＨＵに変換されない）、標的ＤＮＡにおける５ｃａＣを特定可能にする。実施形態では、ＤＮＡ試料中の５ｆＣに、ブロック基を付加する工程は、そのＤＮＡと、アルデヒド反応性化合物（例えば、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体及びヒドラジド誘導体を含む）とを接触させることを含む。ヒドロキシルアミン誘導体としては、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミン塩酸塩、ヒドロキシルアンモニウム酸の硫酸塩、リン酸ヒドロキシルアミン、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、Ｏ－ヘキシルヒドロキシルアミン、Ｏ－ペンチルヒドロキシルアミン、Ｏ－ベンジルヒドロキシルアミン、及び特に、Ｏ－エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ２）、Ｏ－アルキル化ヒドロキシルアミンまたはＯ－アリール化ヒドロキシルアミン、これらの酸または塩が挙げられる。ヒドラジン誘導体としては、Ｎ－アルキルヒドラジン、Ｎ－アリールヒドラジン、Ｎ－ベンジルヒドラジン、Ν，Ν－ジアルキルヒドラジン、Ｎ，Ｎ－ジアリールヒドラジン、Ν，Ν－ジベンジルヒドラジン、Ｎ，Ｎ－アルキルベンジルヒドラジン、Ν，Ν－アリールベンジルヒドラジン及びＮ，Ｎ－アルキルアリールヒドラジンが挙げられる。ヒドラジド誘導体としては、－トルエンスルホニルヒドラジド、Ｎ－アシルヒドラジド、Ν，Ν－アルキルアシルヒドラジド、Ｎ，Ｎ－ベンジルアシルヒドラジド、Ν，Ν－アリールアシルヒドラジド、Ｎ－スルホニルヒドラジド、Ｎ，Ｎ－アルキルスルホニルヒドラジド、Ν，Ν－ベンジルスルホニルヒドラジド及びＮ，Ｎ－アリールスルホニルヒドラジドが挙げられる。

５ｆＣの特定方法
別の態様では、本開示は、ＤＮＡ試料中の５ｆＣの特定方法であって、
ａ．標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を準備する工程と、
ｂ．そのＤＮＡ試料中の５ｃａＣに、ブロック基を付加する工程と、
ｃ．その５ｆＣをＤＨＵに変換して、改変標的ＤＮＡを含む改変ＤＮＡ試料をもたらす工程と、
ｄ．その改変標的ＤＮＡを切断する工程と、
ｅ．その切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程と、
ｆ．その改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程と、
を含み、
切断部位の存在により、その標的ＤＮＡにおける５ｆＣの位置が得られる方法を提供する。

標的ＤＮＡにおける５ｆＣの特定方法の実施形態では、その方法は、標的ＤＮＡにおいて、５ｆＣの改変が認められた各位置における、５ｆＣの改変頻度に関する半定量的な尺度をもたらす。

そのＤＮＡ試料中の５ｃａＣに、ブロック基を付加する工程は、（ｉ）そのＤＮＡ試料と、カップリング剤、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはΝ，Ν’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミド誘導体のようなカルボン酸誘導体化試薬とを接触させ、（ｉｉ）そのＤＮＡ試料と、アミン、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミン化合物とを接触させることによって行うことができる。すなわち、例えば、ＤＮＡ試料をＥＤＣで処理してから、ベンジルアミン、エチルアミンまたはその他のアミンで処理して、例えば５ｃａＣをブロックして、ｐｉｃ－ＢＨ_３によってＤＨＵに変換されないようにするアミドを形成させることによって、５ｃａＣをブロックできる。ＥＤＣ触媒によって、５ｃａＣをカップリングする方法は、ＷＯ２０１４１６５７７０に記載されており、参照により、本明細書に援用される。

ＤＮＡ試料／標的ＤＮＡ
本開示の方法では、バイサルファイトシーケンシングのような方法に伴う大幅な分解を回避する穏和な酵素反応及び化学反応を利用する。すなわち、本発明の方法は、循環セルフリーＤＮＡのような、インプットの少ない試料の解析、及びシングルセル解析に有用である。

実施形態では、ＤＮＡ試料は、ピコグラム量のＤＮＡを含む。実施形態では、ＤＮＡ試料は、ＤＮＡを約１ｐｇ～約９００ｐｇ、ＤＮＡを約１ｐｇ～約５００ｐｇ、ＤＮＡを約１ｐｇ～約１００ｐｇ、ＤＮＡを約１ｐｇ～約５０ｐｇ、ＤＮＡを約１～約１０ｐｇ、約２００ｐｇ未満、ＤＮＡを約１００ｐｇ未満、ＤＮＡを約５０ｐｇ未満、ＤＮＡを約２０ｐｇ未満、及びＤＮＡを約５ｐｇ未満含む。別の実施形態では、ＤＮＡ試料は、ナノグラム量のＤＮＡを含む。本明細書に開示されている方法で用いる試料のＤＮＡは、単一の細胞に由来するＤＮＡまたはバルクＤＮＡ試料を含め、いずれの量であることもできる。実施形態では、本発明の方法は、ＤＮＡを約１～約５００ｎｇ、ＤＮＡを約１～約２００ｎｇ、ＤＮＡを約１～約１００ｎｇ、ＤＮＡを約１～約５０ｎｇ、ＤＮＡを約１～約１０ｎｇ、ＤＮＡを約２～約５ｎｇ、ＤＮＡを約１００ｎｇ未満、ＤＮＡを約５０ｎｇ未満、ＤＮＡを５ｎｇ未満、及びＤＮＡを２ｎｇ未満含むＤＮＡ試料で行うことができる。実施形態では、そのＤＮＡ試料は、マイクログラム量のＤＮＡを含む。

ＤＮＡ試料を準備するとは、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ試料をいずれかの供給源から、直接または間接的のいずれかで得ることを指す。本明細書に記載されている方法で用いるＤＮＡ試料は、例えば、体液、組織試料、器官、細胞小器官または単一の細胞を含むいずれかの供給源に由来するものであってよい。実施形態では、ＤＮＡ試料は、循環セルフリーＤＮＡ（セルフリーＤＮＡまたはｃｆＤＮＡ）であり、このＤＮＡは、血液中に見られるＤＮＡであり、細胞内には存在しない。ｃｆＤＮＡは、当該技術分野において知られている方法を用いて、血液または血漿から単離できる。ｃｆＤＮＡを単離するには、例えばＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を含む市販のキットが利用可能である。ＤＮＡ試料は、濃縮工程に起因してもよく、その工程としては、抗体免疫沈降、クロマチン免疫沈降、制限酵素消化ベースの濃縮、ハイブリダイゼーションベースの濃縮または化学標識ベースの濃縮が挙げられるが、これらに限らない。

標的ＤＮＡは、シトシン修飾（すなわち、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び／または５ｃａＣ）を有するいずれのＤＮＡであってもよく、そのＤＮＡとしては、組織、器官、細胞及び細胞小器官から精製したＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限らない。標的ＤＮＡは、試料中の単一のＤＮＡ分子であることができ、またはシトシン修飾を有する試料（またはそのサブセット）中のＤＮＡ分子集団全体であってもよい。標的ＤＮＡは、供給源に由来する天然型のＤＮＡであることができ、または例えば、断片化、修復及びシーケンシング用のアダプターとのライゲーションによって、ハイスループットシーケンシングを行える状態に事前に変換されていることもできる。すなわち、本明細書に記載されている方法を用いて、（例えば、個別の標的の配列を求めることによって）個別に解析したり、または（例えば、ハイスループットシーケンシング法または次世代シーケンシング法によって）集団で解析したりできる標的ＤＮＡ配列のライブラリーを作製できるように、標的ＤＮＡは、複数のＤＮＡ配列を含むことができる。

標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料は、モネラ界（細菌）、原生生物界、菌類界、植物界及び動物界の生物から得ることができる。ＤＮＡ試料は、患者もしくは対象、環境試料、または該当する生物から得てよい。実施形態では、ＤＮＡ試料は、細胞、細胞群、体液、組織試料、器官及び／または細胞小器官から抽出するか、精製するか、または取り出す。好ましい実施形態では、試料ＤＮＡは、全ゲノムＤＮＡである。

５ｍＣ及び５ｈｍＣの５ｃａＣ及び／または５ｆＣへの変換
本明細書に記載されているｅｅＴＡＰＳ法など、本発明で提供する方法の実施形態は、５ｍＣ及び５ｈｍＣ（または５ｈｍＣをブロックする場合には、５ｍＣのみ）を５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程を含む。実施形態では、この工程は、ＤＮＡ試料を１０－１１転座（ＴＥＴ）酵素と接触させることを含む。ＴＥＴ酵素は、５ｍＣのＮ５メチル基への酸素分子の移転を触媒する酵素のファミリーであり、この移転により、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）が形成される。ＴＥＴはさらに、５ｈｍＣを酸化して５ｆＣにし、５ｆＣを酸化して５ｃａＣを形成させるのを触媒する（図５Ａを参照されたい）。本明細書に記載されている方法で有用なＴＥＴ酵素としては、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴｅｔ１、マウスＴｅｔ２、マウスＴｅｔ３、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（ＣｃＴＥＴ）、及びこれらの誘導体または類似体のうちの１つ以上が挙げられる。実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ＮｇＴＥＴまたはその誘導体である。別の実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ１（ｈＴＥＴ１）またはその誘導体である。実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、マウスＴｅｔ１またはその誘導体（ｍＴｅｔ１ＣＤ）である。別の実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ２（ｈＴＥＴ２）またはその誘導体である。

５ｃａＣ及び／または５ｆＣのＤＨＵへの変換
本明細書に記載されている方法は、ＤＮＡ試料中の５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程を含む。実施形態では、この工程は、ＤＮＡ試料と、例えば、ボラン還元剤（ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ_３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムなど）を含む還元剤とを接触させることを含む。好ましい実施形態では、その還元剤は、ピリジンボラン及び／またはｐｉｃ－ＢＨ_３である。

改変標的ＤＮＡを切断する工程
本明細書に記載されている方法は、変換工程（複数可）の前（すなわち、修飾シトシンをＤＨＵに変換する１つまたは複数の工程の前）のＤＮＡ試料において修飾シトシン（５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び／または５ｃａＣ）があった位置に、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを切断する工程を含む。本明細書に記載されている切断工程は、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを特異的に切断する一方で、ＤＨＵを含まないＤＮＡは、未切断または実質的に未切断のままにする。

ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを切断する工程は、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡと、その改変標的ＤＮＡを特異的に切断する１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼとを接触させることによって行うことができる。実施形態では、そのＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちの１つ以上は、ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ活性及びＡＰリアーゼ活性を有する２官能性ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、そのＤＮＡエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）及び／またはｈＮＥＩＬ１が挙げられる。実施形態では、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡは、ウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ）によって切断する。ＵＳＥＲ酵素は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを組み合わせたものを含む。改変標的ＤＮＡを切断するのに使用できる他の酵素は、アプリン酸／アピリミジン酸エンドヌクレアーゼ１（ＡＰＥ１）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｄｏ ＩＩＩ）、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｆｐｇ及びｈＮＥＩＬ１のうちの１つ以上である。

実施形態では、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを切断する工程は、Ｈｏｕｓｅ ＣＨ，Ｍｉｌｌｅｒ ＳＬ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｈｙｄｒｏｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６；３５（１）：３１５－３２０に記載されているように、その改変標的ＤＮＡを酸性ｐＨ及び／または加熱条件に暴露することを含む。実施形態では、その切断工程は、その改変標的ＤＮＡを少なくとも７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃もしくは１１０℃の温度、及び／または７以上、７．５以上、８以上、８．５以上、９以上、９．５以上、１０以上、１０．５以上、１１以上、１１．５以上、１２以上、１２．５以上もしくは１３以上のｐＨに暴露することを含む。

切断された改変標的ＤＮＡへのアダプターＤＮＡ分子の付加
実施形態では、本明細書に記載されている方法は、例えばＵＳＥＲ酵素によって切断した改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程を含む。アダプターＤＮＡまたはＤＮＡリンカーは、化学合成した短い一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであって、他のＤＮＡ分子の一方の末端または両方の末端にライゲーションできるオリゴヌクレオチドである。二本鎖のアダプターは、そのアダプターの各末端が、平滑末端、または５’もしくは３’オーバーハング（すなわち粘着末端）を有するように合成できる。ＤＮＡアダプターを、切断された改変標的ＤＮＡにライゲーションして、相補的なプライマーによるＰＣＲ増幅用、及び／またはクローニング及び／またはライブラリー作製（例えば次世代シーケンシングライブラリー）用の配列をもたらす。

アダプターを、切断された標的ＤＮＡにライゲーションする前に、例えば、５’リン酸基を有する平滑末端を作製する末端修復によって、その切断されたＤＮＡの末端をライゲーション用に調製してよい。平滑末端をアダプターへのライゲーションに使用でき、またはライゲーションの前に、例えばテーリング反応によって、オーバーハングを作製できる。テーリングは、ノンテンプレートヌクレオチドを平滑な二本鎖ＤＮＡ分子の３’末端に付加する酵素的な方法である。３’末端のＡテーリング（すなわち、３’末端へのｄＡの付加）を用いて、アダプターと、相補的なｄＴオーバーハングとのライゲーションを促進できる。

実施形態では、切断された改変標的ＤＮＡに、ＤＮＡアダプター分子を付加する工程の前または後のいずれかに、その切断された標的ＤＮＡのサイズ選択を行う。実施形態では、そのサイズ選別は、切断された標的ＤＮＡにＤＮＡアダプターを付加した後に行う。サイズ選別は、当該技術分野において知られている方法によって行うことができ、その方法としては、固相逆固定化（ＳＰＲＩ）常磁性ビーズ（例えば、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用するもの）が挙げられるが、これらに限らない。

改変標的ＤＮＡのコピー数の増幅
本明細書に記載されている方法は、当該技術分野において知られている方法によって、改変標的ＤＮＡのコピー数を増幅する（増加させる）工程を任意に含んでよい。改変標的ＤＮＡがＤＮＡであるときには、そのコピー数は、例えば、ＰＣＲ、クローニング及びプライマー伸長法によって増加できる。特定の標的ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって、個々の標的ＤＮＡのコピー数を増幅できる。あるいは、標準的な技法によって、ＤＮＡベクターにクローニングすることによって、複数の異なる改変標的ＤＮＡ配列を増幅できる。実施形態では、複数の異なる改変標的ＤＮＡ配列のコピー数をＰＣＲによって増加させて、次世代シーケンシング用のライブラリーを作製し、その場合、例えば、二本鎖のアダプターＤＮＡを事前に、試料ＤＮＡ（または改変試料ＤＮＡ）にライゲーションし、そのアダプターＤＮＡと相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。

次世代シーケンシングライブラリーの作製
切断された改変標的ＤＮＡにアダプターＤＮＡ分子を付加したら、その改変標的ＤＮＡのコピー数を（例えばＰＣＲによって）増幅して、次世代シーケンシング用のライブラリーＤＮＡ配列を作製できる。ＰＣＲ用のプライマーは、切断された標的ＤＮＡに事前にライゲーションしたアダプターＤＮＡに対応する（アダプターＤＮＡと相補的な）配列を有する。本発明で提供する方法（試薬、工程及びその順序を含む）により、ハイスループットな次世代シーケンシング法を用いてシーケンシングできるＤＮＡ配列のライブラリーを作製可能になる。

改変標的ＤＮＡの切断部位の検出
本明細書に開示されている方法の実施形態では、その方法は、切断された改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程を含む。その改変標的ＤＮＡは、未改変の標的ＤＮＡにおいて、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ及び５ｃａＣの１つ以上が存在していた位置に、ＤＨＵを含む。ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡは、ＤＨＵ感受性のエンドヌクレアーゼによる消化を含む、本明細書に記載されている方法によって切断する。続いて、切断された断片をシーケンシングライブラリーに変換でき、その各断片の開始点及び終点は、修飾シトシン（５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣまたは５ｃａＣ）の部位に対応する。これにより、メチル化ＣｐＧ部位をゲノムワイドに濃縮可能となり、その一方で、メチル化されていないゲノムの大部分が除去される。したがって、切断部位を特定する方法であって、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって、シトシン修飾を検出できる。このような方法としては、サンガーシーケンシング法、マイクロアレイ法及び次世代シーケンシング法のようなシーケンシング法が挙げられる。

キット
加えて、本開示は、標的ＤＮＡにおける５ｍＣ及び５ｈｍＣを特定するためのキットを提供する。このようなキットは、本明細書に記載されている方法によって５ｍＣ及び５ｈｍＣを特定するための試薬を含む。そのキットは、本明細書に記載されている方法によって、５ｃａＣを特定するための試薬、及び５ｆＣを特定するための試薬も含んでよい。実施形態では、そのキットは、ＴＥＴ酵素、ボラン還元剤、及び本発明の方法を行うための説明を含む。さらなる実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ＴＥＴ１もしくはＴＥＴ２（またはこれらの誘導体）であり、そのボラン還元剤は、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ_３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムからなる群のうちの１つ以上から選択されている。さらなる実施形態では、そのＴＥＴ１酵素は、ＮｇＴｅｔ１、ヒトＴＥＴ１またはマウスＴｅｔ１であり、そのボラン還元剤は、ピリジンボラン及び／またはｐｉｃ－ＢＨ_３である。別の実施形態では、そのＴＥＴ酵素は、ｍＴＥＴ２またはその誘導体である。

実施形態では、そのキットはさらに、５ｈｍＣブロック基及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む。さらなる実施形態では、その５ｈｍＣブロック基は、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－糖であり、その糖は、グルコースまたはグルコース誘導体であり、そのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｔ４バクテリオファージβ－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、Ｔ４バクテリオファージα－グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにこれらの誘導体及び類似体である。

実施形態では、そのキットはさらに、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ（過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ））、ルテニウム酸カリウム、ならびに酸化マンガンのうちの１つ以上から選択した酸化剤を含む。

実施形態では、そのキットは、ＤＮＡ試料における５ｆＣをブロックするための試薬を含む。実施形態では、そのキットは、例えば、本明細書に記載されているようなヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体及びヒドラジド誘導体を含むアルデヒド反応性化合物を含む。実施形態では、そのキットは、本明細書に記載されているような、５ｃａＣをブロックするための試薬を含む。

実施形態では、そのキットは、ＤＮＡを単離するための試薬を含む。実施形態では、そのキットは、インプットの少ないＤＮＡを試料から単離するため、例えば、ｃｆＤＮＡを血液、血漿または血清から単離するための試薬を含む。実施形態では、そのキットは、ゲノムＤＮＡを単離するための試薬を含む。

実施形態では、そのキットは、本明細書に記載されているように、ＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを切断するための酵素を１つ以上含む。実施形態では、そのキットは、本明細書に記載されているようなアダプターＤＮＡ分子を含む。加えて、そのキットは、切断された改変標的ＤＮＡに、そのアダプターＤＮＡ分子をライゲーションするための酵素を含んでもよい。
〔実施例〕
実施例１：ＴＡＰＳ及びＷＧＴＡＰＳ
方法
モデルＤＮＡの調製
ＭＡＬＤＩ及びＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ試験用のＤＮＡオリゴ：Ｃ、５ｍＣ及び５ｈｍＣを有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。すべての配列及び修飾を図６－１及び図６－２並びに図７－１及び図７－２に見ることができた。５ｆＣを有するＤＮＡオリゴをＣテーリング法によって合成した。すなわち、ＤＮＡオリゴ５’－ＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴＣ－３’及び５’－ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴ－３’をアニーリングしてから、５－ホルミル－２’－ｄＣＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性欠損変異体）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２において２時間、３７℃でインキュベートした。その生成物をＢｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ－６ Ｇｅｌ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で精製した。

Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、標準的なホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ）及び５－カルボキシ－ｄＣ－ＣＥホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって、５ｃａＣを有するＤＮＡオリゴを合成した。その後の脱保護及び精製は、Ｇｌｅｎ－Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をメーカーの指示に従って用いて行った。Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎによって、精製オリゴヌクレオチドの特徴付けを行った。

変換試験用の２２２ｂｐのモデルＤＮＡ：ＣｐＧ部位を５個含む２２２ｂｐのモデルＤＮＡを作製するために、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、バクテリオファージλＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＰＣＲ増幅し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。プライマー配列は、フォワードプライマーが５’－ＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣ－３’、リバースプライマーが５’－ＣＡＵＴＡＣＴＣＡＣＵＴＣＣＣＣＡＣＵＴ－３’である。ＰＣＲ産物の逆鎖におけるウラシル塩基をＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって除去した。続いて、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２、０．６４ｍＭのＳ－アデノシルメチオニン及び２０ＵのＭ．ＳｓｓＩ ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む溶液２０μｌにおいて、精製ＰＣＲ産物１００ｎｇを２時間、３７℃でメチル化してから、２０分、熱不活化を６５℃で行った。メチル化された２２２ｂｐのモデルＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによって精製した。

サンガーシーケンシングによる、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳの検証用のモデルＤＮＡ：５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５０ｍＭのＮａＣｌを含むアニーリング緩衝液中で、５ｍＣ部位を１つ及び５ｈｍＣ部位を１つ含む３４ｂｐのＤＮＡオリゴを他のＤＮＡオリゴとアニーリングしてから、４００ＵのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を含む反応液中で、２５℃において１時間ライゲーションし、１．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによって精製した。

ライゲーション反応後、ＵＳＥＲ酵素によってウラシルリンカーを除去して、
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＣＧＡ^ｍＣＧＣＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＣ^ｈｍＣＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＧＣＣＡＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ
という配列（５’→３’）の最終生成物を得た。このモデルＤＮＡの増幅用のＰＣＲプライマーは、Ｐ５プライマーが５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ－３’、Ｐ７プライマーが５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ－３’であった。

ポリメラーゼ試験及びサンガーシーケンシング用のモデルＤＮＡ：ポリメラーゼ試験及びサンガーシーケンシング用のモデルＤＮＡは、異なるＤＮＡオリゴを使用した以外は、上記と同じライゲーション方法で調製した。

最終生成物の配列（５’→３’）は、
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＣＧＣＴＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＴ^ｍＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧ^ｍＣＴＡＣＴＧＴＡ^ｍＣＧＴＡＧＣＡＴＣＴＡＴＡＧＣＣＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＧＣＣＡＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ
であった。モデルＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、上に示したＰ５プライマー及びＰ７プライマーである。プライマー伸長用のビオチン標識プライマー配列は、このＰ７プライマーの５’末端に連結したビオチンである。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写した後のＲＴ－ＰＣＲ用のＰＣＲプライマーは、このＰ５プライマー、及び５’－ＴＧＣＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧ－３’というＲＴプライマーであった。

ＰＣＲバイアス試験用のモデルＤＮＡ：ＰＣＲバイアス試験用のモデルＤＮＡは、異なるＤＮＡオリゴを使用した以外は、上記と同じライゲーション方法で調製した。

最終生成物の配列（５’→３’）は、
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＣＧＣＴＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＴＸＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣＡＴＣＴＡＴＡＧＣＣＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＧＣＣＡＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ
であり、この配列中、Ｘは、ＤＨＵ、Ｕ、ＴまたはＣである。このモデルＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、上記のＰ５プライマー及びＰ７プライマーである。

メチル化されたバクテリオファージλゲノムＤＮＡの調製
Ｍｇ^２＋不含緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＥＤＴＡ）中の０．６４ｍＭのＳＡＭ及び０．８Ｕ／μｌのＭ．ＳｓｓＩ酵素を含む反応液５０μＬ中で、メチル化されていないバクテリオファージλＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｇを２時間、３７℃でメチル化した。続いて、Ｍ．ＳｓｓＩ酵素０．５μＬ及びＳＡＭ１μＬを加え、その反応物をさらに２時間、３７℃でインキュベートした。その後、メチル化されたＤＮＡを１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。完全なメチル化を確認するために、すべての手順をＮＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ２において繰り返した。続いて、ＤＮＡのメチル化をＨｐａＩＩ消化アッセイで検証した。ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）中の２ＵのＨｐａＩＩ酵素（ＮＥＢ）を含む反応液１０μＬ中で、５０ｎｇのメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを１時間、３７℃で消化した。消化生成物を１％アガロースゲルに、未消化のλＤＮＡコントロールとともに流した。そのアッセイ後、非メチル化λＤＮＡは消化されたが、メチル化λＤＮＡは、インタクトなままであったことから、ＣｐＧのメチル化が完全かつ成功したことが確認された。λＤＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ－ＥＭＢＬアクセッション番号Ｊ０２４５９で見ることができる。

２ｋｂの無修飾スパイクインコントロールの調製
ｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号２６１０３）から、１ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．５μＭのプライマー、１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む反応液中で、２ｋｂのスパイクインコントロール（２ｋｂ－１、２、３）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマー配列は、表２に列挙されている。

ＰＣＲ産物をＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムで精製した。２ｋｂの無修飾コントロール配列（５’→３’）は、以下のとおりであった。
ＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＧＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＧＣＣＡＴＧＴＴＡＡＧＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＧＡＡＡＣＡＣＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＴＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＴＡＡＧＧＣＡＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＴＧＡＣＧＡＡＧＧＣＴＴＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧＴＧＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＧＣＴＣＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＴＣＣＴＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧＧＣＧＧＧＡＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＡＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＡＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＡＴＣＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＡＴＧＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＣＧＴＴＧＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＴＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＣＴＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＣＴ
１２０ｍｅｒのスパイクインコントロールの調製
１２０ｍｅｒのスパイクインコントロールをプライマー伸長法によって生成した。オリゴ配列及びプライマーは、表３に列挙されている。

簡潔に述べると、１２０ｍｅｒ－１のスパイクインでは、５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５０ｍＭのＮａＣｌを含むアニーリング緩衝液中で、３μＭのオリゴを１０μＭのプライマーとアニーリングした。１２０ｍｅｒ－２のスパイクインでは、５μＭのオリゴを７．５μＭのプライマーとアニーリングした。０．４μＭのｄＮＴＰ（１２０ｍｅｒ－１：ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄｈｍＣＴＰ、１２０ｍｅｒ－２：ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ）及び５ＵのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含むＮＥＢ緩衝液２において、プライマー伸長を１時間、３７℃で行った。反応後、スパイクインコントロールをＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製した。続いて、ＮＥＢ緩衝液２中に０．６４ｍＭのＳＡＭ及び０．８Ｕ／μｌのＭ．ＳｓｓＩ酵素を含む反応液５０μＬ中で、１２０ｍｅｒのスパイクインコントロールを２時間、３７℃でメチル化し、Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムによって精製した。使用したすべてのスパイクイン配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｆｉｇｓｈａｒｅ．ｃｏｍ／ｓ／８０ｃ３ａｂ７１３ｃ２６１２６２４９４ｂからダウンロードできる。

Ｎ５ｍＣＮＮ及びＮ５ｈｍＣＮＮを有する合成スパイクインの生成
Ｎ５ｍＣＮＮ及びＮ５ｈｍＣＮＮの配列を有する合成オリゴをアニーリング及び伸長方法によって生成した。オリゴ配列は、下記の表４に列挙されている。

簡潔に述べると、５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５０ｍＭのＮａＣｌを含むアニーリング緩衝液中で、１０μＭのＮ５ｍＣＮＮ及びＮ５ｈｍＣＮＮのオリゴ（ＩＤＴ）を合わせてアニーリングした。０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ）及び５ＵのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含むＮＥＢ緩衝液２中で、伸長を１時間、３７℃で行った。反応後、スパイクインコントロールをＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製した。

Ｎ５ｍＣＮＮ及びＮ５ｈｍＣＮＮを有する合成スパイクイン（５’→３’）：
ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＴＮｍＣＮＮＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＡＴＧＧＴＣＮＮＧＮＡＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧ
相補鎖（５’→３’）：ＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＡＴＮｈｍＣＮＮＧＡＣＣＡＴＣＴＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＮＮＧＮＡＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣ
ＤＮＡの消化及びＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析
ＤＮＡ試料を２ＵのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０ｎＭのデアミナーゼ阻害剤エリスロ－９－アミノ－β－ヘキシル－α－メチル－９Ｈ－プリン－９－エタノール塩酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で消化した。一晩３７℃でインキュベート後、その試料をさらに、６Ｕのアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．５ＵのホスホジエステラーゼＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３時間、３７℃で処理した。消化されたＤＮＡ溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ １０Ｋ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過して、タンパク質を除去し、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を行った。

ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析は、６４９５Ｂ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）と接続した１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行った。ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．８マイクロメートル、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。そのカラム温度を４０℃に保ち、溶媒系は、１０ｍＭの酢酸アンモニウムを含む水（ｐＨ６．０、溶媒Ａ）及び水－アセトニトリル（６０／４０（ｖ／ｖ）、溶媒Ｂ）であり、流速は０．４ｍＬ／分であった。グラジエントは、溶媒Ｂ０％で０～５分、溶媒Ｂ０→５．６３％で５～８分、溶媒Ｂ５．６３％で８～９分、溶媒Ｂ５．６３→１３．６６％で９～１６分、溶媒Ｂ１３．６６→１００％で１６～１７分、溶媒Ｂ１００％で１７～２１分、溶媒Ｂ１００→０％で２１～２４．３分、溶媒Ｂ０％で２４．３～２５分であった。定量のために、ＭＳの動的多重反応モニタリングモード（ｄＭＲＭ）を使用した。供給源依存性パラメーターは、ガス温度２３０℃、ガス流束１４Ｌ／分、ネブライザー４０ｐｓｉ、シースガス温度４００℃、シースガス流束１１Ｌ／分、正イオンモードにおけるキャピラリー電圧１５００Ｖ、ノズル電圧０Ｖ、高圧ＲＦ１１０Ｖ及び低圧ＲＦ８０Ｖ（いずれも正イオンモード）であった。フラグメンター電圧は、すべての化合物において３８０Ｖであったとともに、他の化合物依存性パラメーターは、表５にまとめられているとおりであった。

ＮｇＴＥＴ１の発現及び精製
Ｈｉｓタグ付加ＮｇＴＥＴ１タンパク質（ＧＧ７３９５５２．１）をコードするｐＲＳＥＴ－Ａプラスミドを設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。以前に説明されたものに、いくつかの改変を加えて（Ｊ．Ｅ．Ｐａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ＴＥＴ－ｌｉｋｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，４３１６－４３２１（２０１５）。参照により、本明細書に援用される）、タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株で発現させて、精製した。簡潔に述べると、一晩、小規模培養して得た細菌を、タンパク質の発現のために、ＯＤ６００が０．７～０．８になるまで、ＬＢ培地において３７℃及び２００ｒｐｍで成長させた。続いて、培養液を室温まで冷却し、標的タンパク質の発現を０．２ｍＭのイソプロピル－β－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。細胞を、さらに１８時間、１８℃及び１８０ｒｐｍで維持した。その後、細胞を回収し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのイミダゾール、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液に再懸濁させた。細胞をＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ－Ｃ５高圧ホモジナイザーで破砕し、溶解液を遠心分離によって１時間、３０，０００×ｇ及び４℃で清澄化した。回収した上清をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に充填し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾール、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液で、ＮｇＴＥＴ１タンパク質を溶出させた。続いて、回収した画分をＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｄｘ ７５（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）で精製した。次に、ＮｇＴＥＴ１を含む画分を回収し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液に、緩衝液を交換し、ＨｉＴｒａｐ ＨＰ ＳＰカラムに入れた。純粋なタンパク質を塩濃度勾配で溶出させ、回収し、２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む最終緩衝液に、緩衝液を交換した。続いて、タンパク質を１３０μＭまで濃縮し、グリセロール（３０％（ｖ／ｖ））と混合し、アリコートを－８０℃で保存した。

ｍＴＥＴ１ＣＤの発現及び精製
Ｎ末端Ｆｌａｇタグを有するｍＴＥＴ１ＣＤ触媒ドメイン（ＮＭ＿００１２５３８５７．２、４３７１～６３９２）をｐｃＤＮＡ３－Ｆｌａｇに、ＫｐｎＩ制限部位とＢａｍＨ１制限部位の間にクローニングした。タンパク質の発現のために、１ｍｇのプラスミドを１ＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ）細胞培養液に、１×１０^６細胞／ｍＬの密度でトランスフェクションし、細胞を４８時間、３７℃、１７０ｒｐｍ及び５％ＣＯ_２で成長させた。その後、細胞を遠心分離によって回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む溶解緩衝液に再懸濁させ、氷で２０分インキュベートした。続いて、細胞溶解液を遠心分離によって３０分、３００００×ｇ及び４℃で清澄化した。回収した上清をＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）で精製し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬの３×Ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液で、純粋なタンパク質を溶出させた。回収した画分を濃縮し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む最終緩衝液に、緩衝液を交換した。濃縮したタンパク質をグリセロール（３０％（ｖ／ｖ））と混合し、液体窒素で凍結し、アリコートを－８０℃で保存した。組み換えｍＴＥＴ１ＣＤの活性及び品質をＭＡＬＤＩ質量分析解析によって調べた。このアッセイに基づくと、組み換えｍＴＥＴ１ＣＤは、十分な活性を有し、５ｍＣの５ｃａＣへの酸化を触媒できる。試験したモデルオリゴの、いくらかの有意な消化が、ＭＡＬＤＩによって検出されたことから、タンパク質がヌクレアーゼを含まないことが確認された。

ＴＥＴによる酸化
ＮｇＴＥＴ１による酸化：２２２ｂｐのモデルＤＮＡオリゴをＴｅｔによって酸化するために、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）、１００ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）、１ｍＭのａ－ケトグルタル酸塩、２ｍＭのアスコルビン酸、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５μＭのＮｇＴＥＴを含む溶液２０μｌ中で、２２２ｂｐのＤＮＡ１００ｎｇを１時間、３７℃でインキュベートした。その後、０．４ＵのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をその反応混合物に加え、３０分、３７℃でインキュベートした。その生成物をＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって、メーカーの指示に従って精製した。

ゲノムＤＮＡをＮｇＴＥＴ１によって酸化するために、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）、１００ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）、１ｍＭのａ－ケトグルタル酸塩、２ｍＭのアスコルビン酸、１ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５μＭのＮｇＴＥＴ１を含む溶液５０μｌ中で、ゲノムＤＮＡ５００ｎｇを１時間、３７℃でインキュベートした。その後、４ＵのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をその反応混合物に加え、３０分、３７℃でインキュベートした。その生成物を１．８×Ａｍｐｕｒｅビーズで、メーカーの指示に従って精製した。

ｍＴＥＴ１による酸化：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００μＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）、１ｍＭのａ－ケトグルタル酸塩、２ｍＭのアスコルビン酸、１ｍＭのジチオスレイトール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＡＴＰ及び４μＭのｍＴＥＴ１ＣＤを含む反応液５０μｌ中で、ゲノムＤＮＡ１００ｎｇを８０分、３７℃でインキュベートした。その後、０．８ＵのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をその反応混合物に加え、１時間、５０℃でインキュベートした。その生成物をＢｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ－３０ Ｇｅｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及び１．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで、メーカーの指示に従って精製した。

ボランによる還元
Ｐｉｃ－ＢＨ_３による還元：ＭｅＯＨ中の５Ｍのα－ピコリン－ボラン（ｐｉｃ－ＢＨ_３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２５μＬと、３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）５μＬをＤＮＡ試料２０μＬに加え、６０℃で１時間インキュベートした。その生成物を、２２２ｂｐの場合にはＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって、メーカーの指示に従って精製し、またはオリゴの場合にはＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、メーカーの指示に従って精製した。

あるいは、２－ピコリン－ボラン（ｐｉｃ－ボラン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１００ｍｇをＤＭＳＯ１８７μＬに溶解して、３．２６Ｍ前後の溶液を得た。各反応では、ｐｉｃ－ボラン溶液２５μＬと、３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）５μＬをＤＮＡ試料２０μＬに加え、３時間、７０℃でインキュベートした。その生成物を、ゲノムＤＮＡの場合にはＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムによって、ＤＮＡオリゴの場合にはＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、メーカーの指示に従って精製した。

ピリジンボランによる還元：６００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝４．３）及び１Ｍのピリジンボランを含む反応液５０μＬ中で、水３５μＬ中の酸化ＤＮＡ５０～１００ｎｇをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒにおいて１６時間、３７℃及び８５０ｒｐｍで還元した。その生成物をＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムによって精製した。

単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応：ＭｅＯＨ中の３．２６Ｍの２－ピコリン－ボラン（ｐｉｃ－ボラン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μＬと、３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）５００μＬを２’－デオキシシチジン－５－カルボン酸ナトリウム塩（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）１０ｍｇに加えた。その混合物を１時間、６０℃で攪拌した。その生成物をＨＰＬＣによって精製して、純粋な化合物を白色泡状物として得た。高分解能ＭＳ （Ｑ－ＴＯＦ） ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｎａ］＋ Ｃ_９Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_５Ｎａに対する計算値： ２５３．０８００；実測値： ２５３．０７８９．
５ｈｍＣのブロック
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ－Ｇｌｃ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ＵのβＧＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び１０μＭの５ｈｍＣ ＤＮＡオリゴを含む溶液２０μｌ中で、５ｈｍＣのブロックを１時間、３７℃で行った。その生成物をＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、メーカーの指示に従って精製した。

５ｆＣのブロック
１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍＭのＯ－エチルヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０μＭの５ｆＣ ＤＮＡオリゴにおいて、５ｆＣのブロックを２時間、３７℃で行った。その生成物をＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、メーカーの指示に従って精製した。

５ｃａＣのブロック
７５ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）、２０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｍＭの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ）及び１０μＭの５ｃａＣ ＤＮＡオリゴにおいて、５ｃａＣのブロックを３７℃で０．５時間行った。続いて、Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）をメーカーの指示に従って用いて、緩衝液を１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌに交換した。１０ｍＭのエチルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をそのオリゴに加え、１時間、３７℃でインキュベートした。その生成物をＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、メーカーの指示に従って精製した。

５ｈｍＣの酸化
５ｈｍＣ ＤＮＡオリゴ４６μＬを１ＭのＮａＯＨ２．５μＬで３０分、３７℃で、振とう培養器において変性させてから、５０ｍＭのＮａＯＨ及び１５ｍＭの過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶液１．５μＬで１時間、氷上で酸化させた。その生成物をＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６ Ｃｏｌｕｍｎｓによって、メーカーの指示に従って精製した。

ＴａｑαＩアッセイによるＴＡＰＳ変換の検証
ＴａｑαＩ制限部位（ＴＣＧＡ）を含む標的領域をＰＣＲ増幅し、その後、ＴａｑαＩ消化を行うことによって、ＴＡＰＳ後の５ｍＣの変換を試験した。例えば、我々のＴＡＰＳライブラリーにおける５ｍＣの変換は、ＣｐＧがメチル化されたλＤＮＡスパイクインコントロールから増幅される単一のＴａｑαＩ制限部位を含む１９４ｂｐのアンプリコンに基づき試験できる。１９４ｂｐのアンプリコンから増幅されたＰＣＲ産物をＴａｑαＩ制限酵素で消化し、消化産物を２％アガロースゲルで調べる。未変換のコントロールＤＮＡで増幅されたＰＣＲ産物は、ＴａｑαＩによって消化され、そのゲル上に、２本のバンドが示される。ＴＡＰＳで変換された試料では、ＣからＴへの変換により、制限部位は喪失するので、１９４ｂｐのアンプリコンは、インタクトのままとなる。全体的な変換レベルは、消化されたゲルバンド及び消化されなかったゲルバンドの定量に基づき評価でき、成功したＴＡＰＳ試料では、そのレベルは、９５％超となるはずである。

簡潔に述べると、対応するプライマーを用いて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって、変換させたＤＮＡ試料をＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ産物を４単位のＴａｑαＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）において、３０分、６５℃でインキュベートし、２％アガロースゲル電気泳動によって調べた。

定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
ＴＡＰＳ前及びＴＡＰＳ後のモデルＤＮＡ間で増幅曲線及び融解曲線を比較するために（図１１）、１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、２５０ｎＭのプライマー（フォワードプライマー：ＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣ及びリバースプライマー：ＣＡＴＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＴＴ）、ならびに３ｍＭのＭｇＳＯ_４を含むＰＣＲマスターミックス１９μＬに、ＤＮＡ試料１ｎｇを加えた。ＰＣＲ増幅のために、初期変性工程を１０分、９５℃で行ってから、９５℃での変性５分、カスタマイズしたアニーリング温度でのアニーリング５分、及び７２℃での伸長５分というサイクルを４０サイクル行った。最終工程には、９５℃で１分、７０℃で１分を含め、融解曲線（０．０２℃刻み、毎回取得前に５分置いた）は６５℃～９５℃とした。

他のアッセイでは、ｑＰＣＲは、１×Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２００ｎＭのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むＰＣＲマスターミックス１９μＬに、所要量のＤＮＡ試料を加えることによって行った。ＰＣＲ増幅のために、初期変性工程を２０秒、９５℃で行ってから、９５℃での変性３秒、アニーリング２０秒、及び６０℃での伸長というサイクルを４０サイクル行った。

ＨｐａＩＩ－ｑＰＣＲアッセイによる、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡにおけるＣ^ｍＣＧＧのメチル化レベルの検証
ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ１μｇを、反応液５０μＬ中の５０単位のＨｐａＩＩ（ＮＥＢ、５０単位／μＬ）及び１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液と１６時間、３７℃でインキュベートした。コントロールの反応では、ＨｐａＩＩを加えなかった。プロテイナーゼＫ１μＬを反応物に加え、４０℃で３０分インキュベートしてから、プロテイナーゼＫを１０分、９５℃で不活化した。特異的なＣＣＧＧの位置について、対応するプライマーセット（表９に列挙されている）を用いて、上記のようなｑＰＣＲアッセイによって、ＨｐａＩＩで消化した試料またはコントロール試料のＣｔ値を測定した。

サンガーシーケンシング
エキソヌクレアーゼＩ及びエビ由来アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＺｙｍｏ－ＳｐｉｎカラムによってＰＣＲ産物を精製し、サンガーシーケンシング用に処理した。

異なる長さの断片に対するＤＮＡ損傷試験
ｍＥＳＣゲノムＤＮＡに０．５％のＣｐＧメチル化λＤＮＡをスパイクインし、断片化しないままにするか、またはＣｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０という装置で超音波処理し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで、５００～１ｋｂまたは１ｋｂ～３ｋｂでサイズ選別を行った。ＤＮＡ２００ｎｇをｍＴＥＴ１ＣＤで１回酸化させ、上記のようなピリジンボラン複合体で還元するか、またはＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーのプロトコールに従って用いて変換した。ＴＡＰＳ及びバイサルファイトによる変換の前及び後のＤＮＡ１０ｎｇを１％アガロースゲルに流した。可視化するために、バイサルファイト変換を行ったゲルを１０分、氷浴で冷やした。ＴＡＰＳ試料における５ｍＣの変換を、上記のように、ＴａｑαＩ消化アッセイによって試験した。

ｍＥＳＣの培養及びゲノムＤＮＡの単離
ゼラチンコートプレートで、１５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトアビジン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０００単位／ｍＬのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、マウスＥＳＣ（ｍＥＳＣ）Ｅ１４を培養した。培養液を３７℃及び５％ＣＯ_２で維持し、２日おきに継代した。

ゲノムＤＮＡの単離のために、細胞を遠心分離によって５分、１０００×ｇ及び室温で回収した。Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ＤＮＡを抽出した。

ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳ用のｍＥＳＣ ｇＤＮＡの調製
全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）用に、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡに、０．５％の非メチル化λＤＮＡをスパイクインした。全ゲノムＴＡＰＳ用には、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡに、０．５％のメチル化λＤＮＡ及び０．０２５％の２ｋｂの無修飾スパイクインコントロールをスパイクインした。ＤＮＡ試料をＣｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０という装置によって断片化し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで、２００～４００ｂｐでサイズ選別を行った。加えて、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによるサイズ選別後、ＴＡＰＳ用のＤＮＡに、０．２５％のＮ５ｍＣＮＮ及びＮ５ｈｍＣＮＮコントロールオリゴをスパイクインした。

全ゲノムバイサルファイトシーケンシング
全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）には、０．５％の非メチル化バクテリオファージλＤＮＡをスパイクインした断片化ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ２００ｎｇを使用した。ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、末端修復反応及びＡ－テーリング反応、ならびにメチル化アダプター（ＮｅｘｔＦｌｅｘ）のライゲーションを行った。その後、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をＩｌｌｕｍｉｎａのプロトコールに従って用いて、ＤＮＡに対してバイサルファイト変換を行った。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、最終的なライブラリーを６サイクル増幅し、１×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製した。ＮｅｘｔＳｅｑ５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、ＮｅｘｔＳｅｑ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔを１５％のＰｈｉＸというコントロールライブラリースパイクインとともに用いて、ＷＧＢＳシーケンシングライブラリーに対して、８０ｂｐのペアエンドシーケンシングを行った。

全ゲノムＴＡＰＳ
全ゲノムＴＡＰＳ用に、０．５％のメチル化λＤＮＡ及び０．０２５％の２ｋｂの無修飾スパイクインコントロールをスパイクインした断片化ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ１００ｎｇを使用した。ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、末端修復反応及びＡ－テーリング反応、ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇアダプターのライゲーションを行った。ライゲーションしたＤＮＡを、上記のプロトコールに従って、ｍＴＥＴ１ＣＤで２回酸化させてから、ピリジンボランで還元した。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、最終的なシーケンシングライブラリーを５サイクル増幅し、１×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製した。ＮｅｘｔＳｅｑ５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、１つのＮｅｘｔＳｅｑ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔキットを用いて、１％のＰｈｉＸコントロールライブラリースパイクインとともに、全ゲノムＴＡＰＳシーケンシングライブラリーに対して、８０ｂｐのペアエンドシーケンシングを行った。

ｄｓＤＮＡライブラリー調製キットを用いたローインプット全ゲノムＴＡＰＳ
上記のようにして、全ゲノムＴＡＰＳ用に調製したｍＥＳＣ ｇＤＮＡをローインプット全ゲノムＴＡＰＳに使用した。簡潔に述べると、ＮｇＴＥＴ１を１回、上記のプロトコールに従って用いて、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡを１００ｎｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ含む試料を酸化させた。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、末端修復反応及びＡ－テーリング反応、ならびにライゲーションを行った。その後、上記のようにして、ＤＮＡに対してｐｉｃ－ボラン反応を行った。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、変換されたライブラリーを増幅し、１×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製した。

ｓｓＤＮＡライブラリー調製キットを用いたローインプット全ゲノムＴＡＰＳ
上記のようにして、全ゲノムＴＡＰＳ用に調製したｍＥＳＣ ｇＤＮＡをローインプット全ゲノムＴＡＰＳに使用した。簡潔に述べると、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡを１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ及び１０ｐｇ含む試料をＮｇＴＥＴ１で１回酸化させ、上記のようにして、ｐｉｃ－ボランで還元した。Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、シーケンシングライブラリーを調製した。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、最終的なライブラリーを６サイクル（１００ｎｇ）、９サイクル（１０ｎｇ）、１３サイクル（１ｎｇ）、１６サイクル（１００ｐｇ）及び２１サイクル（１０ｐｇ）増幅し、０．８５×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製した。

別の実験において、上記のようにして、全ゲノムＴＡＰＳ用に調製したｍＥＳＣ ｇＤＮＡをローインプット全ゲノムＴＡＰＳに使用した。簡潔に述べると、ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡを１００ｎｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ含む試料を末端修復反応及びＡ－テーリング反応に用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇアダプターにライゲーションした。続いて、ライゲーションした試料を、上記のプロトコールに従って、ｍＴＥＴ１ＣＤで１回酸化させてから、ピリジンボランで還元した。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、変換されたライブラリーを５サイクル（１００ｎｇ）、８サイクル（１０ｎｇ）及び１３サイクル（１ｎｇ）増幅し、１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。

セルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳ
１０ｎｇ及び１ｎｇのセルフリーＤＮＡ試料から、セルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳ試料を調製した。簡潔に述べると、上記のようにして、試料をＮｇＴＥＴ１で１回酸化させ、ｐｉｃ－ボランで還元した。Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、シーケンシングライブラリーを調製した。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、最終的なライブラリーを９サイクル（１０ｎｇ）及び１３サイクル（１ｎｇ）増幅し、０．８５×Ａｍｐｕｒｅビーズで精製した。

別の実験において、全ゲノムＴＡＰＳに関して上記されているようにして、セルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳ試料を１０ｎｇ及び１ｎｇのセルフリーＤＮＡ試料から調製した。簡潔に述べると、ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、セルフリーＤＮＡ試料を末端修復反応及びＡ－テーリング反応に使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇアダプターにライゲーションした。続いて、ライゲーションした試料を、上記のプロトコールに従って、ｍＴＥＴ１ＣＤで１回酸化させてから、ピリジンボランで還元した。ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、変換されたライブラリーを７サイクル（１０ｎｇ）及び１３サイクル（１ｎｇ）増幅し、１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。

ＷＧＢＳデータ処理
ペアエンドリードをＦＡＳＴＱとしてＩｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅからダウンロードし、その後、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ！ ｖ０．４．４（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）でクオリティトリミングを行った。トリミング後に、少なくとも１つのリードが３５ｂｐよりも短いリードペアを除去した。－－ｎｏ＿ｏｖｅｒｌａｐオプションを用いたＢｉｓｍａｒｋ ｖ０．１９（Ｆ．Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｂｉｓｍａｒｋ：Ｂｉｓｍａｒｋ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｉｇｎｅｒ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃａｌｌｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－Ｓｅｑ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７，１５７１－１５７２（２０１１）、参照により本明細書に援用される）を使用して、ｍｍ９バージョンのマウスゲノム、λファージ及びＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＧＥＮＯＭＥＳに由来する配列）を組み合わせたゲノムに、トリミングしたリードをマッピングした。「ｔｈｒｅｅ－Ｃ」フィルターを用いて、非変換率が極端なリードを除去した。Ｐｉｃａｒｄ ｖ１．１１９（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ／）のＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓを用いて、ＰＣＲデュプリケートをコールした。マッピングアーチファクトが発生しやすいことが知られている領域をダウンロードし（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ａｎｓｈｕｌｋｕｎｄａｊｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｌａｃｋｌｉｓｔｓ）、さらなる解析から除外した（Ｅ．Ｐ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４８９，５７－７４（２０１２）。参照により、本明細書に援用される）。

ＴＡＰＳデータの事前処理
ペアエンドリードをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅからダウンロードし、その後、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ！ ｖ０．４．４でクオリティトリミングを行った。トリミング後に、少なくとも１つのリードが３５ｂｐよりも短いリードペアを除去した。ＢＷＡ ｍｅｍ ｖ．０．７．１５（Ｈ．Ｌｉ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５，１７５４－１７６０（２００９）。参照により、本明細書に援用される）をデフォルトパラメーターで用いて、スパイクイン配列、λファージ及びｍｍ９バージョンのマウスゲノムを組み合わせたゲノムに、トリミングしたリードをマッピングした。マッピングアーチファクトが発生しやすいことが知られている領域をダウンロードし（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ａｎｓｈｕｌｋｕｎｄａｊｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｌａｃｋｌｉｓｔｓ）、さらなる解析から除外した（Ｅ．Ｐ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ４８９，５７－７４（２０１２））。

ＴＡＰＳにおいて変換された塩基の検出
カスタムのｐｙｔｈｏｎ３スクリプト（ＭＦ－ｆｉｌｔｅｒ．ｐｙ）を用いて、アラインメントしたリードを元の上鎖（ＯＴ）及び元の下鎖（ＯＢ）に分けた。続いて、ＯＴ及びＯＢで別々に、Ｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓを用いて、ＰＣＲデュプリケートを除去した。デュプリケートが除去されたマッピング済みのＯＴリード及びＯＢリードで別々に、ＢａｍＵｔｉｌ ｃｌｉｐＯｖｅｒｌａｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｇｅｎ／ｂａｍＵｔｉｌ）を用いて、リードペアにおける重複セグメントを除去した。続いて、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐ及びカスタムのｐｙｔｈｏｎ３スクリプト（ＭＦ－ｃａｌｌｅｒ＿ＭＯＤ．ｐｙ）を用いて、改変塩基を検出した。

ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳのシーケンシングクオリティ解析
ｐｙｔｈｏｎ３スクリプト（ＭＦ－ｐｈｒｅｄｄｅｒ．ｐｙ）によって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅからダウンロードしたような元のＦＡＳＴＱファイルから、ヌクレオチドの種類ごとのクオリティスコア統計を抽出した。

ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳのカバレッジ解析
Ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｖ２．２５ ｇｅｎｏｍｅｃｏｖ（Ａ．Ｒ．Ｑｕｉｎｌａｎ，Ｉ．Ｍ．Ｈａｌｌ，ＢＥＤＴｏｏｌｓ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６，８４１－８４２（２０１０）。参照により、本明細書に援用される）で、塩基ごとのゲノムカバレッジファイルを作成した。ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの間で、相対的なカバレッジ分布を比較するために、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗの－ｓオプションを用いて、ＷＧＢＳにおける対応するカバレッジ中央値に対して、ＴＡＰＳリードをサブサンプリングした。ＷＧＢＳ及びサブサンプリング済みのＴＡＰＳにおけるカバレッジを比較する解析では、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの両方のｂａｍファイルで、ｃｌｉｐＯｖｅｒｌａｐを使用した。

ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによって測定されたシトシン修飾の解析
塩基ごとの修飾リードの割合を、それぞれＢｉｓｍａｒｋのアウトプット及びＭＦ－ｃａｌｌｅｒ＿ＭＯＤ．ｐｙのアウトプットから計算した。Ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔを用いて、積集合を求め、統計解析結果及び図をＲ及びＭａｔｌａｂで作成した。ＩＧＶ ｖ２．４．６（Ｊ．Ｔ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，２４－２６（２０１１）。参照により、本明細書に援用される）を用いて、ゲノム領域を可視化した。ＣＧＩ周囲のカバレッジ及び修飾レベルをプロットするために、ｍｍ９におけるすべてのＣＧＩ座標をＵＣＳＣゲノムブラウザーからダウンロードし、２０個のウィンドウにビニングし、両側において、サイズが８０ｂｐのウィンドウ最大５０個分だけ広げた（ただし、次のＣＧＩまでの距離の半分に達しないことを条件とした）。Ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍａｐを用いて、各ビンにおいて、（ＣｐＧにおける）平均修飾レベル、及び（すべての塩基、両方の鎖における）カバレッジを計算した。各ビンの値を再び平均化し、その後、Ｍａｔｌａｂでプロットした。

データ処理時間のシミュレーション
（－ｐ －ｓｓ ＮＳ５０ －－ｅｒｒｆｒｅｅ －－ｍｉｎＱ １５ －ｋ ０ －ｎｆ ０ －ｌ ７５ －ｃ １００００００ －ｍ ２４０ －ｓ ０ －ｉｒ ０ －ｉｒ２ ０ －ｄｒ ０ －ｄｒ２ ０ －ｓａｍ －ｒｓ １０というパラメーターで、）λファージゲノムに基づき、ＡＲＴ４２を用いて、合成ペアエンドシーケンシングリードをシミュレートした。その後、すべてのＣｐＧの位置の５０％を、修飾されたものとしてマークし、カスタムのｐｙｔｈｏｎ３スクリプトを用いて、ＴＡＰＳ（修飾塩基を変換する）またはＷＧＢＳ（無修飾塩基を変換する）のいずれかとして、２つのライブラリーを作製した。その後、本書における各方法に使用するパイプラインに従って、それらのリードを処理した。Ｌｉｎｕｘのコマンド時間によって、処理時間を測定した。すべての解析工程は、１つのＩｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ ＣＰＵ及び２５０ＧＢメモリーを用いて、シングルスレッドモードで行った。

結果及び考察
ｐｉｃ－ＢＨ_３は、これまで知られていなかった還元的脱炭酸／脱アミノ反応によって、５ｆＣ及び５ｃａＣをＤＨＵに容易に変換できることが見出された（図４）。その反応は、ＭＡＬＤＩを用いて、単一のヌクレオシド及び複数のオリゴヌクレオチドの両方で、定量的であることが示された（図２～３及び６－１～７－２）。

１１ｍｅｒの５ｃａＣ含有ＤＮＡオリゴをモデルとして使用して、５ｃａＣと反応できる化学物質をスクリーニングした（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によってモニタリングした）。特定のボラン含有化合物が、５ｃａＣオリゴと効率的に反応して、分子量が４１Ｄａ減少したことがわかった（図１及び２）。さらなる試験用に、ピリジンボラン及びその誘導体２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ボラン）を選択した。それらは、市販されているとともに、環境に優しい還元剤であるからである。

単一の５ｃａＣヌクレオシドでの反応を繰り返し、ピリジンボラン及びｐｉｃ－ボランが、５ｃａＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換することを確認した（図３、４Ｂ）。興味深いことに、ピリジンボラン及びｐｉｃ－ボランは、どうやら還元的脱炭酸／脱アミノのような機序を通じて、５ｆＣをＤＨＵに変換することもわかった（図４Ｃ、６－１及び６－２）。両方の反応の詳細な機序は、まだ明らかになっていない。そのＤＮＡオリゴでのボラン反応に対する、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量解析から、ｐｉｃ－ボランが、９８％前後の効率性で、５ｃａＣ及び５ｆＣをＤＨＵに変換するとともに、非メチル化シトシン、５ｍＣまたは５ｈｍＣに対する活性を有さないことが確認される（図２Ｂ）。

ウラシル誘導体として、ＤＨＵは、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼの両方によって、チミンとして認識されることができる。したがって、ボランによる還元を用いて、５ｃａＣのＴへの変換及び５ｆＣのＴへの変換の両方を誘導できるとともに、ボランによる還元を、５ｆＣ及び５ｃａＣの、塩基単位の分解能でのシーケンシングに用いることができ、我々は、このシーケンシングをピリジンボランシーケンシング（「ＰＳ」）と称した（表６）。５ｆＣＴへのＴへの、ボランによる還元は、ヒドロキシルアミンの結合（Ｃ．Ｘ．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ５－ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｉｔｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｉｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５３，６７８－６９１（２０１３）。参照により、本明細書に援用される）を通じて、５ｃａＣのＴへの、ボランによる還元は、ＥＤＣのカップリング（Ｘ．Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＢ－Ｓｅｑ）ｆｏｒ ５－ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＤＮＡ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５，９３１５－９３１７（２０１３）。参照により、本明細書に援用される）を通じてブロックできる（図６－１及び図６－２）。このブロッキングにより、ＰＳを用いて、５ｆＣまたは５ｃａＣを特異的にシーケンシング可能になる（表６）。

さらに、Ｔｅｔアシストピリジンボランシーケンシング（「ＴＡＰＳ」）という本発明のプロセスでは、ＴＥＴ酵素を用いて、５ｍＣ及び５ｈｍＣを酸化させて５ｃａＣにし、その後、５ｃａＣをボランによって還元することができる（図５Ａ～Ｂ、表１）。ＴＡＰＳは、５ｍＣ及び５ｈｍＣのＣ→Ｔ変換を誘導できるので、５ｍＣ及び５ｈｍＣを塩基単位の分解能で検出するのに使用できる。

加えて、本明細書でＴＡＰＳβと称するプロセスでは、β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）は、５ｈｍＣをグルコースで標識することによって、５ｈｍＣがＴＥＴによって酸化されないように（Ｍ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｅ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ １４９，１３６８－１３８０（２０１２））、かつボランによって還元されないように保護でき（図７－１及び図７－２）、５ｍＣのみを選択的にシーケンシング可能になる（図５Ｂ、表１）。その後、ＴＡＰＳの測定結果からＴＡＰＳβの結果を差し引くことによって、５ｈｍＣ部位を推定できる。あるいは、ＴＥＴの代わりに、これまで酸化バイサルファイトファイトシーケンシング（ｏｘＢＳ）で用いてきた試薬である過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４）（Ｍ．Ｊ．Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ５－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｓｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３６，９３４－９３７（２０１２））を化学的酸化剤として用いて、５ｈｍＣを特異的に酸化させて、５ｆＣにすることができる（図７－１及び図７－２）。このアプローチは、本明細書では、化学アシストピリジンボランシーケンシング（「ＣＡＰＳ」）と称し、このアプローチを用いて、５ｈｍＣを特異的にシーケンシングできる（図５Ｂ、表１）。したがって、ＴＡＰＳ及び関連方法は原則的に、シトシンの４つのエピジェネティックな修飾をすべてシーケンシングするための網羅的なシステムを提供できる（図５Ｂ、表１、表６）。

ＴＡＰＳ単独では、ゲノムにおける既存の５ｆＣ及び５ｃａＣも検出されることになる。しかしながら、通常の条件下では、ゲノムＤＮＡにおける５ｆＣ及び５ｃａＣのレベルが極めて低いことを考慮すると、上記の事象は許容されるであろう。特定の条件下で、５ｆＣ及び５ｃａＣのシグナルを完全に除去したい場合には、ヒドロキシルアミンの結合によって５ｆＣを保護し、ＥＤＣのカップリングによって５ｃａＣを保護することによって、容易に除去して、ＤＨＵへの変換を防ぐこともできる。

５ｍＣ及び５ｈｍＣを塩基単位の分解能でマッピングするための現行の標準的かつ最も広く用いられている方法であるバイサルファイトシーケンシングと比較して、ＴＡＰＳの性能を評価した。Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ＴＥＴ様オキシゲナーゼ（ＮｇＴＥＴ１）及びマウスＴｅｔ１（ｍＴｅｔ１）は両方とも、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、５ｍＣを効率的に酸化させて、５ｃａＣにできるので、これらを使用した。５ｍＣのＴへの変換を確認するために、完全にメチル化されたＣｐＧ部位を含むモデルＤＮＡにＴＡＰＳを適用したところ、制限酵素消化（図８Ａ～Ｂ）及びサンガーシーケンシング（図９Ａ）によって実証されたように、ＴＡＰＳが、５ｍＣをＴに効果的に変換できることが示された。ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳも、サンガーシーケンシングによって検証した（図１２）。

ＴＡＰＳは、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に由来するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）にも適用した。ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量により、予想どおり、５ｍＣが、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡにおけるシトシン修飾の９８．５％を占め、残りが、５ｈｍＣ（１．５％）、ならびに微量の５ｆＣ及び５ｃａＣで構成され、ＤＨＵを有さないことが示された（図９Ｂ）。ＴＥＴによる酸化後、シトシン修飾の約９６％が酸化されて、５ｃａＣになり、３％が酸化されて、５ｆＣになった（図９Ｂ）。ボランによる還元後、シトシン修飾の９９％超が、ＤＨＵに変換された（図９Ｂ）。これらの結果から、ＴＥＴによる酸化及びボランによる還元の両方が、ゲノムＤＮＡに対して効率的に機能することが示されている。

ＴＥＴによる酸化及びボランによる還元の両方とも、穏和な反応であり、バイサルファイトと比べて、顕著なＤＮＡ分解は見られず（図１０Ａ～Ｄ）、これにより、ＤＮＡの回収率が高くなる。バイサルファイトシーケンシングを上回る別の顕著な利点は、ＴＡＰＳが、非破壊的であり、ＤＮＡを最長で１０ｋｂの長さに維持できる点である（図１０Ｃ）。さらに、ＤＮＡは、ＴＡＰＳ後、二本鎖を保ち（図１０Ａ～Ｃ）、その変換は、ＤＮＡの長さの影響を受けない（図１５Ａ～Ｂ）。

加えて、ＤＨＵは、天然の塩基に近いので、様々なＤＮＡポリメラーゼ、及び等温ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼと適合し（図１３Ａ～Ｂ）、ＰＣＲ中に、Ｔ／Ｃと比べて、バイアスが見られない（図１４）。

ｍＥＳＣ ｇＤＮＡの２つの試料に対して、全ゲノムシーケンシングを行ったが、比較のために、一方は、ＴＡＰＳを用いて変換し、もう一方は、標準的な全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）を用いて変換した。

ＴＡＰＳの正確性を評価するために、完全に無修飾であるか、（上記の方法を用いて）ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＳｓｓＩ）またはＧｐＣメチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＣｖｉＰＩ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル化したかのいずれかである異なる長さのスパイクインを付加した。５ｍＣ及び５ｈｍＣ含む短いスパイクイン（１２０ｍｅｒ－１及び１２０ｍｅｒ－２）では、ＣｐＧコンテクスト及び非ＣｐＧコンテクストの両方の状況において、両方の鎖に対する両方の修飾に関して、ほぼ完全な変換が観察された（図１７Ａ～Ｂ）。

ＷＧＢＳにおけるｇＤＮＡ２００ｎｇに対して、ＴＡＰＳには、ｇＤＮＡ１００ｎｇを使用した。ＴＡＰＳの正確性を評価するために、３つの異なる種類のスパイクインコントロールを付加した。すべてのＣｐＧが完全にメチル化されたλＤＮＡを使用して、偽陰性率（５ｍＣの非変換率）を推定し、２ｋｂの無修飾アンプリコンを使用して、偽陽性率（無修飾Ｃの変換率）を推定し、いずれかの他の塩基（メチル化ＣはＮ５ｍＣＮＮ、ヒドロキシメチル化ＣはＮ５ｈｍＣＮＮ）に囲まれたメチル化Ｃ及びヒドロキシメチル化Ｃの両方を含む合成オリゴスパイクインを使用して、異なる配列コンテクストにおける５ｍＣ及び５ｈｍＣでの変換率を比較した。ｍＴｅｔ１及びピリジンボランを組み合わせた場合に、５ｍＣ変換率が最も高くなり（λスパイクインでは９６．５％、合成スパイクインでは９７．３％）、無修飾Ｃの変換率が最も低くなった（０．２３％）（図１８Ａ～Ｂ及び図１６）。２．７％～３．５％の偽陰性率、及びわずか０．２３％の偽陽性率は、バイサルファイトシーケンシングに匹敵し、最近の研究では、９個の市販バイサルファイトキットの偽陰性率の平均は１．７％であり、偽陽性率は０．６％であった（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ＦＦＰＥ ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｓｐｉｒａｔｅｓ，ｌａｖａｇｅｓ，ｅｆｆｕｓｉｏｎｓ，ｐｌａｓｍａ，ｓｅｒｕｍ，ａｎｄ ｕｒｉｎｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，ｅ９３９３３（２０１４））。合成スパイクインにより、ＴＡＰＳが、５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方に対して十分に機能すること、ならびにＴＡＰＳが、非ＣｐＧコンテクストにおいては、多少劣るのみであることが示唆されている。５ｈｍＣにおける変換は、５ｍＣよりも８．２％低く、非ＣｐＧコンテクストにおける変換は、ＣｐＧコンテクストよりも１１．４％低い（図１８Ａ）。

ＷＧＢＳデータでは、アラインメント工程及び修飾コール工程の両方において、特別なソフトウェアが必要となる。これに対して、我々の処理パイプラインでは、標準的なゲノムアライナー（ｂｗａ）の後に、我々が「ａｓＴａｉｒ」と呼ぶカスタムの修飾コールツールを使用する。シミュレーションしたＷＧＢＳリード及びＴＡＰＳリード（同じ部分メチル化ソース配列に由来する）を処理したところ、ＴＡＰＳ／ａｓＴａｉｒは、ＷＧＢＳ／Ｂｉｓｍａｒｋよりも３倍速かった（図１８Ｃ）。

ほぼすべてのシトシンがチミンに変換されることにより、ＷＧＢＳライブラリーは、極めて歪んだヌクレオチド組成を特徴とし、この組成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに悪影響を及ぼし得る。その結果、ＷＧＢＳリードでは、ＴＡＰＳと比べて、シトシン／グアニン塩基対において、実質的に、より低いシーケンシングクオリティスコアが見られた（図１８Ｅ）。ヌクレオチド組成バイアスを相殺するために、少なくとも１０～２０％のＰｈｉＸ ＤＮＡ（塩基バランスの取れたコントロールライブラリー）を一般的に、ＷＧＢＳライブラリーに加える（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＷｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ＨｉＳｅｑ ３０００／ＨｉＳｅｑ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍｓを参照されたい）。したがって、我々は、ＷＧＢＳライブラリーに１５％ＰｈｉＸを添加した。この結果、ＢＳで変換されたリードの情報内容の低下、及びバイサルファイト処理による、ＤＮＡの分解と組み合わさって、ＷＧＢＳにおけるマッピング率は、ＴＡＰＳと比べて有意に低下した（図１８Ｄ及び表７）。

すなわち、同じシーケンシングコスト（ＮｅｘｔＳｅｑ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔで１回）において、ＴＡＰＳの平均深度は、ＷＧＢＳの平均深度を上回った（ＴＡＰＳでは２１倍、ＷＧＢＳでは１３．１倍。表８）。さらに、ＴＡＰＳでは、カバーされなかった領域はわずかで、全体では、ＷＧＢＳと同じシーケンシング深度にダウンサンプリングした後でも、より均一なカバレッジ分布が見られた（四分位範囲：ＴＡＰＳでは９、ＷＧＢＳでは１１。図１９Ａ及び表８）。

例えば、特に、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）は、ＷＧＢＳとＴＡＰＳの間でシーケンシング深度の差について調整した時でも、概ね、ＴＡＰＳの方が多くカバーされ（図２１Ａ）、その一方で、いずれにおいても、ＣＧＩ内の脱メチル化は同程度であった（図２２）。さらに、ＷＧＢＳでは、高度にカバーされたＣｐＧ部位において、修飾レベルが低下したわずかなバイアスが見られたが（図２３Ａ）、我々の結果により、ＴＡＰＳでは、修飾－カバレッジのバイアスがほんのわずかであることが示唆されている（図２３Ｂ）。これらの結果から、ＴＡＰＳでは、ＷＧＢＳと比べて、シーケンシングクオリティが劇的に向上すると同時に、シーケンシングコストが効果的に半減されることが示されている。

ＴＡＰＳのゲノムカバレッジの向上及び均一化により、少なくとも３本のリードによってカバーされたＣｐＧ部位の数が増加した。ＴＡＰＳでは、マウスゲノムにおける合計４３，２０５，３１６個のＣｐＧ部位の８８．３％が、このレベルでカバーされたのに対し、ＷＧＢＳでは、わずか７７．５％であった（図２１Ｂ及び１９Ｂ）。ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳにおいて、染色体領域全体にわたって、メチル化測定値の相関性が高くなった（図２１Ｄ及び図２０）。ヌクレオチドごとに基づくと、いずれの方法においても、少なくとも３本のリードによって、３２，７５５，２７１個のＣｐＧ位置がカバーされた（図２１Ｂ）。我々は、これらの部位内で、「修飾ＣｐＧ」を、修飾レベルが少なくとも１０％であるすべてのＣｐＧ位置として定義した（Ｌ．Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５，４９（２０１４））。この閾値を用いたところ、ＴＡＰＳとＷＧＢＳの間で、ＣｐＧの９５．８％において、修飾状態が一致した。少なくとも３本のリードによってカバーされたとともに、ＷＧＢＳにおいて、修飾されていることが見出されたすべてのＣｐＧの９８．５％が、ＴＡＰＳによって、修飾されたものとしてリコールされたことから、ＷＧＢＳとＴＡＰＳの間での一致が良好であることが示された（図２１Ｃ）。ＷＧＢＳ及びＴＡＰＳの両方で、少なくとも３本のリードによってカバーされたＣｐＧごとに修飾レベルを比較したところ、ＴＡＰＳとＷＧＢＳの間で良好な相関性が観察された（ピアソンのｒ＝０．６３、ｐ＜２ｅ－１６、図２１Ｅ）。注目すべきことに、ＴＡＰＳでは、高度に修飾されたＣｐＧ位置であって、ＷＧＢＳによっては見落とされたＣｐＧ位置のサブセットが特定された（図２１Ｅ、右下隅）。我々はさらに、直交性制限消化処理及びリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、これらのＣｐＧのうちの７個を検証し、それらのすべてが、完全にメチル化及び／またはヒドロキシメチル化されていることを確認した（表９）。

勘案すると、これらの結果によって、ＴＡＰＳは、ＷＧＢＳに直接置き換わることができ、実際に、ＷＧＢＳよりも網羅的にメチロームが調べられることが示されている。

最後に、インプットの少ないＤＮＡで、ＴＡＰＳを試験したところ、ＴＡＰＳが、１ｎｇほどの少ないｇＤＮＡでも機能し、場合によっては、１細胞レベルに近い１０ｐｇのｇＤＮＡまで減少しても機能することが示された。ＴＡＰＳは、１ｎｇの循環セルフリーＤＮＡでも有効に機能する。これらの結果から、インプットの少ないＤＮＡ及び臨床用途でのＴＡＰＳの潜在能力が示されている（図２４Ａ～Ｃ、図２５Ａ～Ｂ）。

１～２ｍｌの血漿から採取した１つの健全な試料、１つのバレット食道（バレット）試料及び１つの膵臓癌試料に由来する３つの循環セルフリーＤＮＡ試料（ｃｆＤＮＡ）で、ＴＡＰＳを試験した。標準的なＴＡＰＳプロトコールは、下記のとおりであり、各試料を約１０倍のカバレッジでシーケンシングした。ｃｆＤＮＡ ＴＡＰＳの結果を解析したところ、ＴＡＰＳにより、高い５ｍＣ変換率（図２６Ａ）、低い偽陽性率（無修飾シトシンの変換、図２６Ｂ）、高いマッピング率（図２６Ｃ）及び低いＰＣＲ重複率（図２６Ｄ）を含め、インプットの少ないｃｆＤＮＡから、バルクなゲノムＤＮＡの場合と同じ高品質なメチロームシーケンシングが行われることが示された。これらの結果から、ｃｆＤＮＡからの疾患診断に関して、ＴＡＰＳに検出力があることが示されている。

ＴＡＰＳは、メチル化を、Ｃ→Ｔの遺伝的バリアントまたは一塩基多型（ＳＮＰ）から識別することもできるので、遺伝的バリアントを検出することができる。ＴＡＰＳでは、メチル化及びＣ→ＴのＳＮＰでは、異なるパターンが得られる。すなわち、メチル化では、元の上鎖（ＯＴ）／元の下鎖（ＯＢ）においてはＴ／Ｇリード、ＯＴと相補的な鎖（ＣＴＯＴ）及びＯＢと相補的な鎖（ＣＴＯＢ）においてはＡ／Ｃリードが得られるのに対して、Ｃ→ＴのＳＮＰでは、ＯＴ／ＯＢ及び（ＣＴＯＢ／ＣＴＯＴ）においてＴ／Ａリードが得られる（図２７）。これにより、１回の実験及びシーケンシングランで、メチル化情報及び遺伝的バリアント、すなわち変異の両方を得る際のＴＡＰＳの有用性がさらに向上する。本明細書に開示されているＴＡＰＳ法のこの能力により、ゲノム解析とエピジェニック解析が統合され、標準的な全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を行う必要がなくなることによって、シーケンシングコストが実質的に削減される。

要約すると、我々は、バイサルファイトを使用せずに、シトシンのエピジェニックな修飾を塩基単位の分解能でシーケンシングするＰＳ由来の一連の方法を開発し、全メチロームシーケンシングにおけるＴＡＰＳの有用性を実証した。ＴＡＰＳは、穏和な酵素反応及び化学反応を用いて、塩基単位の分解能で、高い感度及び特異性で、無修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、５ｍＣ及び５ｈｍＣを直接検出することによって、半分のシーケンシングコストで、高品質かつより完全なメチロームをもたらすという点で、バイサルファイトシーケンシングよりも優れる。したがって、ＴＡＰＳは、ＤＮＡのメチルシトシン及びヒドロキシメチルシトシンの解析における新たなスタンダードとして、バイサルファイトシーケンシングに置き換わる可能性がある。最近報告された、バイサルファイトを使用しない５ｆＣシーケンシング方法（Ｂ．Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｆｒｅｅ，ｂａｓｅ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５－ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｃａｌｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，１０４７－１０５０（２０１５）、Ｃ．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ５－Ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ＥＳＣｓ ａｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｓｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，７２０－７３１（２０１７））において、シトシンに大規模な改変を導入するのとは異なり、ＴＡＰＳでは、修飾シトシンを、天然塩基に近いＤＨＵに変換し、そのＤＨＵを一般的なポリメラーゼによって、Ｔとして「読み取る」ことができ、ＴＡＰＳは、ＰＣＲを使用しないＤＮＡシーケンシングと適合する可能性がある。ＴＡＰＳは、様々な下流解析（パイロシーケンシング、メチル化感受性ＰＣＲ、制限消化処理、ＭＡＬＤＩ質量分析、マイクロアレイ及び全ゲノムシーケンシングが挙げられるが、これらに限らない）と適合する。ＴＡＰＳでは、長いＤＮＡを保持できるので、マッピングしにくい特定の領域を調べるために、ＳＭＲＴシーケンシング及びナノポアシーケンシングのようなロングリードシーケンシング技術と組み合わせると、極めて有用であり得る。プルダウン法をＴＡＰＳと組み合わせて、シーケンシングコストをさらに削減し、塩基単位の分解能の情報を低分解能のアフィニティーベースマップに加えることも可能である。本実施例では、ＴＡＰＳが、コスト、複雑さ、及び解析に必要な時間を低減しながら、常法の用途で、ＷＧＢＳに直接置き換わる可能性があることが示された。これにより、学術的な研究及び臨床診断において、エピジェネティックな解析がさらに広く採用可能になるであろう。

実施例２：エンドヌクレアーゼ濃縮ＴＡＰＳ（ｅｅＴＡＰＳ）
方法
スパイクインコントロールの調製
１ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．５μＭのプライマー及び１×Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む反応液中で、ｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号２６１０３）をＰＣＲ増幅することによって、４ｋｂのスパイクインコントロールを調製した。プライマー配列は、表１０に列挙されている。そのＰＣＲ産物をＺｙｍｏ－ＩＣカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製し、反応液５０μＬ中で、ＨｐａＩＩ Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって２時間、３７℃でメチル化した。１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、メチル化された生成物を精製した。以前に説明されたようにして（Ｗｕ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｘ．Ｊ．ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．（２０１６）Ｂａｓｅ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＭＡＢ－ｓｅｑ ａｎｄ ｃａＭＡＢ－ｓｅｑ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，１１：１０８１－１１００）、非メチル化λ－ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＭ．ＳｓｓＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）でメチル化することによって、ＣｐＧが完全にメチル化されたλ－ＤＮＡを調製した。

担体ＤＮＡの調製
１ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．５μＭのプライマー及び１×Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む反応液中で、ｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号２６１０３）をＰＣＲ増幅することによって、担体ＤＮＡを調製した。プライマー配列は、表１０に列挙されている。そのＰＣＲ産物をＺｙｍｏ－ＩＣカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０によって断片化し、０．９×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製して、２００～５００ｂｐの断片について選択した。

ｍＥＳＣの培養及びゲノムＤＮＡの単離
ゼラチンコートプレートで、１５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトアビジン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１，０００単位ｍｌ－１の白血病阻止因子（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、Ｅ１４ ｍＥＳＣを培養した。培養液を３７℃及び５％ＣＯ２で維持し、２日おきに継代した。ゲノムＤＮＡの単離のために、細胞を遠心分離によって５分、１０００ｇ及び室温で回収した。Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をメーカーのプロトコールに従って用いて、ＤＮＡを抽出した。

ｍＴｅｔ１ＣＤの発現及び精製
ｍＴｅｔ１触媒ドメイン（ｍＴｅｔ１ＣＤ）の発現及び精製は、上記のようにして行った。

ｍＴｅｔ１ＣＤによる酸化
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００μＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）、１ｍＭのα－ケトグルタル酸塩、２ｍＭのアスコルビン酸、１ｍＭのジチオスレイトール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＡＴＰ及び４μＭのｍＴｅｔ１ＣＤを含む反応液５０μｌ中で、０．５％のメチル化λ－ＤＮＡ及び０．０２５％の２ｋｂの無修飾ＤＮＡコントロールをスパイクインしたｍＥＳＣ ｇＤＮＡ２００ｎｇを８０分、３７℃で酸化させた。その後、０．８ＵのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をその反応混合物に加え、１時間、５０℃でインキュベートした。その生成物をＢｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ－３０ Ｇｅｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及び１．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで、メーカーの指示に従って精製した。

ＤＨＵを消化するエンドヌクレアーゼのスクリーニング
ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ１μｇを、上記のようにして、ｍＴｅｔ１ＣＤによって酵素的に酸化させた。その後、６００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．３）及び１Ｍのピリジンボランを含む反応液５０μｌ中で、水３５μｌ中の酸化ＤＮＡをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒにおいて、１６時間、３７℃及び８５０ｒ．ｐ．ｍ．で還元した。Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムを用いて、その生成物を精製した。続いて、ＴＡＰＳで変換したＤＮＡ、または未変換のＤＮＡ４０ｎｇを、ＵＳＥＲ（カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）、エンドヌクレアーゼＩＶ（カタログ番号Ｍ０３０４Ｓ）、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ（カタログ番号Ｍ０２９１Ｓ）、エンドヌクレアーゼＶ（カタログ番号Ｍ０３０５Ｓ）、ＵＤＧ（カタログ番号Ｍ０２８０Ｓ）、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ（カタログ番号Ｍ０２９４Ｓ）、Ｆｐｇ（カタログ番号Ｍ０２４０Ｓ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）（カタログ番号Ｍ０２６８Ｓ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（カタログ番号Ｍ０２９９Ｓ）、ＡＰＥ１（カタログ番号Ｍ０２８２Ｓ）という酵素（すべてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）によって、メーカーのプロトコールに従って消化した。消化産物を１．８×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで、メーカーの指示に従って精製し、各生成物１０ｎｇを２％アガロースゲルに流した。

ｅｅＴＡＰＳ
ｍＥＳＣゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇまたは１ｎｇ）に、ＣＣＧＧの配列コンテクストにおいてメチル化した４ｋｂの０．０５％コントロールをスパイクインし、上記のようにして、ｍＴｅｔ１ＣＤによって酸化させた。その後、６００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．３）及び１Ｍのピリジンボランを含む反応液５０μｌ中で、水３５μｌ中の酸化ＤＮＡ試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒにおいて、１６時間、３７℃及び８５０ｒ．ｐ．ｍ．で還元した。Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムを用いて、その生成物を精製した。ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液中の２ＵのＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む反応液２０μＬ中で、変換した試料を１時間、３７℃で消化し、０．３５×～１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズでサイズ選別を行った。ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、末端修復反応及びＡ－テーリング反応、ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇアダプターのライゲーションを行った。コントロールライブラリーを調製するために、スパイクインコントロールを含む未変換のｍＥＳＣ ｇＤＮＡ２００ｎｇを、上記のようにして、ＵＳＥＲ酵素によって消化し、サイズ選別を行い、ライブラリーの構築に使用した。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて、最終的なシーケンシングライブラリーを６サイクル（２００ｎｇのインプットの場合）、８サイクル（５０ｎｇのインプットの場合）、１０サイクル（１０ｎｇのインプットの場合）または１４サイクル（１ｎｇのインプットの場合）増幅し、０．３５×～１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズでサイズ選別を行った。ＮｅｘｔＳｅｑ５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、他のシーケンシングライブラリーと併せて、最終的なライブラリーに対して、８０ｂｐのペアエンドシーケンシングを行った。

ｒｒＴＡＰＳ
ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ１μｇに、ＣｐＧがメチル化された１％のλをスパイクし、Ｆａｓｔ ｄｉｇｅｓｔ Ｍｓｐ１酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、反応液５０μＬ中で３０分、３７℃で消化した。消化されたＤＮＡをフェノール／クロロホルム沈殿法によって精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔをメーカーのプロトコールに従って用いて、末端修復反応及びＡ－テーリング反応、ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇアダプターのライゲーションを行った。続いて、ライゲーションしたライブラリーを１．６×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、１％アガロースゲルに流した。１００～４００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって、メーカーのプロトコールに従って精製した。アダプターにライゲーションした試料を担体ＤＮＡ１００ｎｇにスパイクし、上記のようにして、ｍＴｅｔ１ＣＤによって二重酸化させた。６００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．３）及び１Ｍのピリジンボランを含む反応液５０μｌ中で、水３５μｌ中の酸化ＤＮＡをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒにおいて、１６時間、３７℃及び８５０ｒ．ｐ．ｍ．で還元した。Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎカラムを用いて、その生成物を精製した。最終的なシーケンシングライブラリーをＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ウラシル（＋）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで６サイクル増幅し、１×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。ＮｅｘｔＳｅｑ ５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、他のシーケンシングライブラリーと併せて、最終的なライブラリーに対して、８０ｂｐのペアエンドシーケンシングを行った。

ｅｅＴＡＰＳのデータ解析
生のシーケンシングリードをＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）で処理して、－－ｐａｉｒｅｄ－－ｌｅｎｇｔｈ３５というパラメーターで、アダプター及び品質のトリミングを行った。ｂｗａ ｍｅｍ ０．７．１７－ｒ１１８８（Ｌｉ，Ｈ．ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．（２００９）Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５，１７５４－１７６０）をデフォルトパラメーターで用いて、クリーンしたリードをアラインメントした。４ｋｂのモデルＤＮＡでは、２，６２７～６，９１１のｐＮＩＣ２８－Ｂｓａ４配列を参照として使用した。ｍＥＳＣ ｇＤＮＡでは、ｍｍ９ゲノムを参照として用いた。適正にマッピングされたリードペアのみ（８３または９９として割り当てられたフラッグを有するリード１）を抽出して、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｖ２．２７．１（Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｉ．Ｍ．（２０１０） ＢＥＤＴｏｏｌｓ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６，８４１－８４２）を用いて、その断片全体のエンドポイント及びリードスルーの両方でカバレッジを計算し、切断の割合を計算するときには、非切断部位も考慮に入れた。ｅｅＴＡＰＳを解析するための詳しい計算パイプラインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｌａｂ．ｃｏｍ／ｊｆｅｉｃｈｅｎｇ／ｕｓｅｒｅｎｒｉｃｈに見ることができる。ｅｅＴＡＰＳにおいて、２つのテクニカルレプリケートをシーケンシングした。シーケンス深度がｅｅＴＡＰＳに及ぼす作用を解析するときに、２つのレプリケートに由来するアラインメントファイルをマージしてから、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ（Ｌｉ，Ｈ．，Ｈａｎｄｓａｋｅｒ，Ｂ．，Ｗｙｓｏｋｅｒ，Ａ．，Ｆｅｎｎｅｌｌ，Ｔ．，Ｒｕａｎ，Ｊ．，Ｈｏｍｅｒ，Ｎ．，Ｍａｒｔｈ，Ｇ．，Ａｂｅｃａｓｉｓ，Ｇ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓ．（２００９）Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５，２０７８－２０７９）を用いて、０．１～１の割合によってサブサンプリングした。

ｒｒＴＡＰＳのデータ解析
生のシーケンシングリードをｓｅｑｔｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｓｅｑｔｋ）のｔｒｉｍｆｑ －ｂ ２で処理して、各リードの左から２ｂｐをトリミングした。Ａｓｔａｉｒ３．２．７を使用して、ｒｒＴＡＰＳを処理した（８）。ｍｍ９ゲノムを参照として使用して、ａｓｔａｉｒ ａｌｉｇｎを用いて、クリーンしたリードをアラインメントした。メチル化ＣｐＧをａｓｔａｉｒコールによって抽出した。

ｍＥＳＣにおけるｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較
ｗｇＴＡＰＳデータをＧＳＥ１１２５２０（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｂ．，Ｓｉｅｊｋａ－Ｚｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｐ．，Ｖｅｌｉｋｏｖａ，Ｇ．，Ｂｉ，Ｙ．，Ｙｕａｎ，Ｆ．，Ｔｏｍｋｏｖａ，Ｍ．，Ｂａｉ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ－Ｂｏｃｋｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｃ．Ｘ．（２０１９）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｆｒｅｅ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３７，４２４－４２９）からダウンロードした。少なくとも４本のリードでカバーされたＣｐＧ部位のみを、カバーされたＣｐＧ部位とみなした。ＣｐＧメチル化レベルが、すべてのＣｐＧメチル化レベルの第１四分位（ｗｇＴＡＰＳでは０．５、ｅｅＴＡＰＳでは０．２８）よりも高いという基準に従って、メチル化ＣｐＧ部位の数を定義した。ｂｅｄｔｏｏｌｓを用いて、ゲノムを、重複しない１００ｋｂのウィンドウに分割した。ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ ｔｒａｃｋをｈｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｍｍ９／ｄａｔａｂａｓｅ／ｃｐｇＩｓｌａｎｄＥｘｔ．ｔｘｔ．ｇｚからダウンロードした。Ｇｅｎｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｅをｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｍｍ９／ｄａｔａｂａｓｅ／ｒｅｆＧｅｎｅ．ｔｘｔ．ｇｚからダウンロードした。ｗｇＴＡＰＳでは、メチル化の平均値を用いて、各ウィンドウにおいて、メチル化を割り当てた。ｅｅＴＡＰＳでは、切断割合が０．２８超のＣｐＧ部位を、メチル化された部位とし、このカットオフ未満の部位は、非メチル化部位とし、そして、各ビンのメチル化レベルをメチル化ＣｐＧ数／（メチル化ＣｐＧ数＋非メチル化ＣｐＧ数）として測定した。ｅ１４ ｍＥＳＣ細胞株の発現データをＧＥＯエントリーＧＳＥ７２８５５（Ｎｅｒｉ，Ｆ．，Ｒａｐｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｋｒｅｐｅｌｏｖａ，Ａ．，Ｉｎｃａｒｎａｔｏ，Ｄ．，Ｐａｒｌａｔｏ，Ｃ．，Ｂａｓｉｌｅ，Ｇ．，Ｍａｌｄｏｔｔｉ，Ｍ．，Ａｎｓｅｌｍｉ，Ｆ．ａｎｄ Ｏｌｉｖｉｅｒｏ，Ｓ．（２０１７）Ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，５４３，７２－７７）から得て、そのデータを用いて、遺伝子を、その発現レベルに従って４つの群に分けた。

結果
ｅｅＴＡＰＳの開発
ＴＡＰＳ反応後のシーケンシングのために、メチル化ＣｐＧ部位を濃縮するために、ＤＨＵを含むＴＡＰＳ産物を特異的に切断するエンドヌクレアーゼを特定した。ＤＨＵまたは構造の似ているヌクレオチド（ウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、ジヒドロチミン）を消化する能力が知られている１０個の市販のエンドヌクレアーゼを試験した。ＵＳＥＲ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、及びＦｐｇを含むヌクレアーゼは、ＴＡＰＳで変換されたＤＮＡを切断したが、ＡＰＥ１及びＵＤＧのような他のヌクレアーゼは、ＴＡＰＳで変換されたＤＮＡを実質的に切断しなかった（図２８Ａ）。ＵＳＥＲは、ＴＡＰＳで変換されたＤＮＡの切断効率が最も高かったとともに、変換されなかったＤＮＡに対する影響が最も小さかったので（図２８Ａ）、ＵＳＥＲを選択した。

続いて、ＴＡＰＳによる変換をＵＳＥＲ消化と組み合わせて、メチル化された配列を濃縮した。まず、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に由来する、断片化されていないゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＴＡＰＳで変換し、ＵＳＥＲで消化した。切断によって、１００ｂｐ～１０ｋｂの範囲のＤＮＡ断片が得られた（図２８Ｂ）。どうやら、短い断片ほど、密集してメチル化された領域に対応し、長い断片は、ゲノムのうち、まばらにメチル化された部分に対応するようである。断片化したＤＮＡのサイズ選別を行って、メチル化状態が中程度となるように、２００ｂｐ～１ｋｂの断片を保持し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーを調製した（図２９Ａ、図２８Ｂ）。メチル化ＣｐＧ部位を特定及び定量するために、計算パイプラインを作成した。各ＣｐＧ部位で切断されるリードの数を、各ＣｐＧ部位で切断されるかまたは各ＣｐＧ部位をカバーするリードの総数で除した数として、メチル化レベルを計算した（図２９Ａ）。

ｅｅＴＡＰＳの性能を評価するために、ＨｐａＩＩメチルトランスフェラーゼによってメチル化したＣＣＧＧ部位におけるすべてのＣｐＧで、４ｋｂのスパイクインモデルＤＮＡを調製し、このメチルトランスフェラーゼによっては、オフターゲットの非ＣＣＧＧ部位においても、いくらか低いレベルでのＣｐＧのメチル化が行われた。モデルＤＮＡにおいては、ｅｅＴＡＰＳによるメチル化とバイサルファイトによるメチル化の間での一致性が優れていたことから（ピアソンの相関係数（ｒ）＝０．９８）（図２８Ｃ）、ＤＮＡメチル化レベルの定量における、ｅｅＴＡＰＳの検出力が裏付けられた（図２９Ｂ）。一方で、ＵＳＥＲ酵素を用いて、ＴＡＰＳで変換されなかった４ｋｂのモデルＤＮＡを消化したコントロール試料では、有意なメチル化を有するＣｐＧは検出されなかったことから（図２９Ｂ）、メチル化の検出における、ｅｅＴＡＰＳの高い特異性が示された。勘案すると、これらの結果から、ｅｅＴＡＰＳが、４ｋｂのモデルＤＮＡにおいて、ＤＮＡのメチル化状態を正確に導き出せることが示された。

ｍＥＳＣでのｅｅＴＡＰＳ
モデルＤＮＡに対するｅｅＴＡＰＳの能力を示したので、ｅｅＴＡＰＳを用いて、ｍＥＳＣ ｇＤＮＡにおけるＣｐＧのメチル化をプロファイリングした（表１１）。ｅｅＴＡＰＳは、メチル化ＣｐＧを濃縮することになるので、コスト効率の良い方法であることが提議されている。実際、ｅｅＴＡＰＳにおける断片の８４．６％がＣ／Ｇとなったことを我々は見出した（図３１Ａ）。切断部位と、最も近いＣｐＧとの距離に対するさらなる解析により、切断イベントの７２．７％が、ＣｐＧで生じたことが特定された（図３１Ｂ）。

この点をさらに示すために、ｅｅＴＡＰＳをｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳと比較した（図３０Ａ、表１１）。まず、３つのすべての方法でカバーされるＣｐＧ部位の数を比較した（カバレッジが３超のＣｐＧを、カバーされるＣｐＧとみなした）。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳでは、ＣｐＧ部位の大半がカバーされた（ｗｇＴＡＰＳでは、１９．３Ｍ個の部位、全ＣｐＧの９２．１％、ｅｅＴＡＰＳでは１５．２Ｍ個の部位、全ＣｐＧの７４．２％）のに対して、ｒｒＴＡＰＳでカバーされたのは、約１．５Ｍ個の部位（全ＣｐＧの７．２％）に過ぎなかった（図３０Ｂ）。これらのアッセイによってカバーされるゲノム領域をさらに比較するために、カバーされた部位を、様々なゲノム領域（Ｂｏｇｕ，Ｇ．Ｋ．，Ｖｉｚａｎ，Ｐ．，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｗ．，Ｂｅａｔｏ，Ｍ．，Ｄｉ Ｃｒｏｃｅ，Ｌ．ａｎｄ Ｍａｒｔｉ－Ｒｅｎｏｍ，Ｍ．Ａ．（２０１５）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｎｄ ＲＮＡ Ｍａｐｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３６，８０９－８１９）にマッピングした。遠位の調節エレメントにおけるメチル化のような、遺伝子間のメチル化も、遺伝子調節に重要であると知られている。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳは、類似の広範な特徴分布を共有し、カバーされたＣｐＧ部位の大半が、ヘテロクロマチンに位置する（ｗｇＴＡＰＳでは６５．６％、ｅｅＴＡＰＳでは７１％）のに対して、ｒｒＴＡＰＳは、プロモーター領域に偏る（カバーされたＣｐＧの４６％）ことを我々は見出した（図３０Ｂ）。１ＣｐＧの分解能では、ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳにおいて、良好な相関性が見られ（ｒ＝０．５６、図３０Ｃ）、それに対して、ｒｒＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳにおいては、非常に高い相関性が見られた（ｒ＝０．９２、図３１Ｃ）。ｅｅＴＡＰＳでは、メチル化が過剰推定され、これは、非メチル化ＣｐＧを有するＤＮＡ断片の方が長くなり、あまりうまく増幅されないことによる可能性が高い。

次に、異なるアッセイでカバーされるメチル化ＣｐＧ部位を比較した。ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳでは、メチル化ＣｐＧ（ｍＣｐＧ）部位として定義される部位に関して、高い一致性が見られる（ｗｇＴＡＰＳによって検出された８２．４％のｍＣｐＧ部位が、ｅｅＴＡＰＳによっても検出される。図３０Ｄ）が、ｒｒＴＡＰＳは、約２０．０％のｍＣｐＧを検出するのみである（図３０Ｄ）。さらに、ｅｅＴＡＰＳでは、高い再現性が見られ、レプリケートにおいて、８１％のｍＣｐＧが観察された（図３１Ｄ）。勘案すると、これらの解析により、ｅｅＴＡＰＳが、全ゲノム規模で、ｍＣｐＧ部位を正確かつ確実に検出でき、１ＣｐＧの分解能で、メチル化を測定するための強力な半定量的ツールであり得ることが裏付けられている。

ゲノム機構でのｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳの比較
ｅｅＴＡＰＳとｗｇＴＡＰＳの間で、異なるゲノム機構にわたるメチル化パターンを比較した。領域内のメチル化レベルを定量するために、ｗｇＴＡＰＳでは、メチル化の平均値を使用し、ｅｅＴＡＰＳでは、検出されたＣｐＧ部位の総数に対する、メチル化ＣｐＧの割合を使用した。ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳにおいて、相関性の高い、染色体ワイドなメチル化パターンが見られたが、ｅｅＴＡＰＳでは、メチル化レベルが過剰に推定された（図３２Ａ、Ｂ）。ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）は、ＤＮＡのメチル化が非常に少ないことが知られており、これらは、ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳの両方に反映されている（図３２Ｃ）。ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳを用いて、ＣＧＩでのメチル化レベルを測定したものの相関性は０．８１だったことから、ｅｅＴＡＰＳは、様々な機構において、ＣｐＧのメチル化状態を正確に捉えることができることがさらに示されている（図３２Ｄ）。

以前の研究により、プロモーター領域におけるＤＮＡのメチル化は概ね、遺伝子の発現と逆相関することが明らかにされている。我々は、遺伝子を、その発現レベルに従って４つの群に分け、転写開始部位（ＴＳＳ）の４ｋｂ上流から４ｋｂ下流までのメチル化の平均をプロットした。我々は、ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳの両方を用いて、高度に発現する遺伝子が、メチル化レベルの低い傾向があり、発現レベルの低い遺伝子が、メチル化レベルの高いことを見出した（図３３）。我々は、以前に定義されたようにして（Ｂｏｇｕ，Ｇ．Ｋ．，Ｖｉｚａｎ，Ｐ．，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｗ．，Ｂｅａｔｏ，Ｍ．，Ｄｉ Ｃｒｏｃｅ，Ｌ．ａｎｄ Ｍａｒｔｉ－Ｒｅｎｏｍ，Ｍ．Ａ．（２０１５）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｎｄ ＲＮＡ Ｍａｐｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３６，８０９－８１９）、クロマチンの異なる特徴においても、メチル化分布を比較した（図３２Ｅ、Ｆ）。以前の研究と一致して、ヘテロクロマチン領域は、高度にメチル化される一方で、ユークロマチンにおけるプロモーター領域は大抵の場合、ＣＧのメチル化が少ない（図３２Ｆ）。

インプットの少ない試料に対するｅｅＴＡＰＳの適用
インプットの少ない試料でのｅｅＴＡＰＳの性能を評価するために、我々は、ｅｅＴＡＰＳに、１ｎｇ、１０ｎｇ及び５０ｎｇのｍＥＳＣ ｇＤＮＡをそれぞれ適用した。２００ｎｇのｍＥＳＣ ＤＮＡ試料では、シーケンシングリードを２分の１にダウンサンプリングして、インプットの少ない試料のシーケンシング深度と適合させた。ｅｅＴＡＰＳにおいて、１ｎｇのＤＮＡを用いても、ｗｇＴＡＰＳによって特定されたｍＣｐＧ部位の２７％が再現されることを我々は見出した。５０ｎｇのｍＥＳＣ ＤＮＡを使用したところ、そのパーセンテージは、４７％まで上昇した（図３４Ａ）。これらのインプットの少ない試料によって、全ゲノムのメチル化プロファイルをさらに比較するために、我々は、ゲノムを１００ｋｂのウィンドウにビニングし、各ビンにおいて、メチル化レベルの平均を計算した（図３４Ｂ）。これらのインプットの少ない試料の間で、一貫性の高いメチル化プロファイルが観察されたことから（２分の１の２００ｎｇでのｅｅＴＡＰＳと比較した１ｎｇでのｒ＝０．８８、２０ｎｇでのｒ＝０．９２、５０ｎｇでのｒ＝０．９５。図３４Ｃ）、インプットの少ないＤＮＡ試料に対するｅｅＴＡＰＳの適用が実行可能であることがさらに示された。

シーケンシング深度がｅｅＴＡＰＳに及ぼす作用
シーケンシング深度が、検出できるｍＣｐＧ部位の総数に及ぼす作用を評価するために、我々は、ｅｅＴＡＰＳをダウンサンプリングし、その性能を評価した。検出されるｍＣｐＧ部位の総数は、シーケンシング深度が深いほど増加した（図３５Ａ）。とはいえ、４×（７０Ｍ個のリード）のシーケンシング深度では、７４％のｍＣｐＧ部位を検出するのに成功できた（４×ｅｅＴＡＰＳでも、ｗｇＴＡＰＳで検出された１４．９Ｍ個のｍＣｐＧ部位のうち、１０．９Ｍ個の部位がｍＣｐＧとして定義された）。染色体及びＣＧＩの全体にわたるメチル化の相関性の点でも、同様の傾向が観察され（図３５Ｂ）、ＣＧＩにおけるピアソンの相関係数は、４×カバレッジでは、０．８３に達した（図３５Ｂ）。したがって、ｅｅＴＡＰＳが、ＷＧＢＳと比べて、低いシーケンシングコストで、グローバルなメチル化プロファイルを正確にもたらすことができることを我々は実証した。

考察
ｗｇＴＡＰＳは、網羅性が最も高い定量的かつ塩基単位の分解能の全ゲノムメチル化解析を行うことができた。しかしながら、全ゲノムシーケンシングの高いコストと、大量の処理データにより、多くのプロジェクトにおける、メチル化解析の広範な用途は依然として制限を受ける。メチル化ＣｐＧ部位は、哺乳動物のゲノムにおけるほんの一部であるので、メチル化の状態を調べるには、全ゲノムシーケンシングは、データ効率が最も高いアプローチというわけではない。コスト効率の良いアプローチは、シーケンシングによってさらに解析する際に、メチル化ＣｐＧを含む領域のみを特異的に選択するものであろう。ＣｐＧリッチな領域の制限酵素消化濃縮に基づくＲｅｄｕｃｅｄ－Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行い、その後にバイサルファイトシーケンシングを行うことは、費用効果の高いメチローム解析アプローチであるが、この方法では、ゲノムにおけるＣｐＧ部位のごく一部がカバーされたに過ぎなかった（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｇｎｉｒｋｅ，Ａ．，Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｗ．，Ｒａｍｓａｈｏｙｅ，Ｂ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．ａｎｄ Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２００５）Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３，５８６８－５８７７）。ＴＡＰＳは、Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎのアプローチと適合しており、ｒｒＴＡＰＳが、ゲノムのサブセットにおいて、特にＣＧＩにおいて、メチル化を正確に定量できることを我々は実証した。遺伝子プロモーターにおけるＣｐＧのメチル化の、十分に確立された生物学的意義に加えて、遺伝子間のＤＮＡメチル化は、細胞運命決定及び腫瘍形成に関与する可能性から、広範な研究で注目されている。濃縮アプローチをゲノムワイドなＣｐＧ部位まで広げるために、我々はＴＡＰＳの利点をさらに用いて、５ｍＣをＤＨＵに直接変換し、それにより、ＤＨＵ感受性のエンドヌクレアーゼによる誘導によって、これらの特異的な改変塩基での切断を可能にした。これらの断片の選択的な濃縮をシーケンシングと組みわせることを通じて、ｅｅＴＡＰＳにより、ＣｐＧのメチル化をゲノムワイドな規模で検出可能になることを我々は実証した。ＴＡＰＳによってメチル化シトシンが直接検出されるため、このような方策が可能である。従来の抗体ベースの濃縮方法とは異なり、ｅｅＴＡＰＳは、１ＣｐＧの分解能での直接的なメチル化検出の可能性をもたらす。

ｅｅＴＡＰＳを用いて、費用効果の良い形式で、１ＣｐＧの分解能で、ゲノムワイドなメチル化の特徴を捉えることができ、それにより、ｒｒＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳ間のギャップが埋まることを我々は実証した。複数の異なるゲノム機構にわたる、ｅｅＴＡＰＳによるメチル化プロファイルは、ｗｇＴＡＰＳを用いて得られるプロファイルとの相関性が高かった。さらに、ｅｅＴＡＰＳは、わずか７０Ｍ個のリードで、ｗｇＴＡＰＳによって検出されたメチル化ＣｐＧの７４％を検出できる。ｅｅＴＡＰＳの考え得る制約（メチル化ＣｐＧ部位の間隔のばらつきに起因する）は、単一のＣｐＧ部位でのメチル化レベルの半定量的な測定である可能性がある。この研究では、我々は、概念実証として、２００ｂｐ～１ｋｂの断片を選択した。しかしながら、それでも、ｗｇＴＡＰＳとｅｅＴＡＰＳとの相関係数は０．５６ほどの良好さである。さらに、ＴＡＰＳ反応の穏和な性質を足場として、インプットの少ないＤＮＡ試料でのメチル化の検出において、ｅｅＴＡＰＳが、費用効果が高い有望なプロトコールであることも我々は示した。

ボラン含有化合物のスクリーニングである。１１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）における５ｃａＣのＤＨＵへの変換について、ボラン含有化合物をスクリーニングし、変換率は、ＭＡＬＤＩによって推定した。２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ボラン）、ボランピリジン及びｔｅｒｔ－ブチルアミンボランは、５ｃａＣをＤＨＵに完全に変換できたが、エチレンジアミンボラン及びジメチルアミンボランでは、変換率は３０％前後であった。ジクロロヘキシルアミンボラン、モルホリンボラン、４－メチルモルホリンボラン及びトリメチルアミンボランでは、検出可能な生成物は、測定されなかった（不検出）。水素化ホウ素ナトリウム及びトリ（アセトキシ）水素化ホウ素ナトリウムのような他の還元剤は、酸性培地中で速やかに分解されて、変換が不完全となった。シアノ水素化ホウ素ナトリウムは、酸性条件下では、シアン化水素が形成される可能性があることから、使用しなかった。完全な変換、低い毒性及び高い安定性から、Ｐｉｃ－ボラン及びピリジンボランを選択した。 ＤＮＡオリゴにおけるＰｉｃ－ボラン反応である。（Ａ）５ｃａＣを含む１１ｍｅｒのモデルＤＮＡをｐｉｃ－ボランで処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けたものである。各グラフの上に、質量（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、質量の観察値が示されている。（Ｂ）ｄＣ及び各種シトシン誘導体の変換率をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって定量した。データは、３つのレプリケートの平均±標準偏差としてされている。 単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応である。^１Ｈ ＮＭＲの結果は、２’－デオキシ－５，６－ジヒドロウリジンに関する過去の報告に従ったものである（Ｉ．Ａｐａｒｉｃｉ－Ｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８１，４０３１－４０３８（２０１６））。単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応生成物の^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ－ｄ_４、４００ＭＨｚ）チャートである。δ ｐｐｍ： ６．２８ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）， ４．３０ （ｍ， １Ｈ）， ３．８１ （ｍ， １Ｈ）， ３．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６ Ｈｚ）， ２．２０ （ｍ， １Ｈ）， ２．０３ （ｍ， １Ｈ）． 単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応である。^１３Ｃ ＮＭＲの結果は、２’－デオキシ－５，６－ジヒドロウリジンに関する過去の報告に従ったものである（Ｉ．Ａｐａｒｉｃｉ－Ｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８１，４０３１－４０３８（２０１６））。単一ヌクレオシドのｐｉｃ－ボラン反応生成物の^１３Ｃ ＮＭＲ （ＭｅＯＨ－ｄ_４， ４００ ＭＨｚ）チャートである。δ ｐｐｍ： １７１．５６ （ＣＯ）， １５３．５４ （ＣＯ）， ８５．９７ （ＣＨ）， ８３．８６ （ＣＨ）， ７０．９９ （ＣＨ）， ６１．９２ （ＣＨ_２）， ３６．０４ （ＣＨ_２）， ３５．４６ （ＣＨ_２）， ３０．４９ （ＣＨ_２）． ５ｃａＣのＤＨＵへの、ボランによる変換と、５ｃａＣのＤＨＵへのボラン反応の機序案を示す図である。 ５ｆＣのＤＨＵへの、ボランによる変換と、５ｆＣのＤＨＵへのボラン反応の機序案を示す図である。 （Ａ）ＴＡＰＳ法が、５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方をＤＨＵに変換し、そのＤＨＵが、複製時にはチミンとして機能することを示す図である。（Ｂ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳの方法の概説である。 ５ｆＣ及び５ｃａＣを含むモデルＤＮＡオリゴをｐｉｃ－ボランによって、５ｆＣ及び５ｃａＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｆＣ及び５ｃａＣは、ｐｉｃ－ＢＨ_３によってジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される。５ｆＣは、Ｏ－エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ_２）のようなヒドロキシルアミン誘導体によってブロックしたが、その誘導体は、オキシムとなり、ｐｉｃ－ボランによる変換を阻止することになる。５ｃａＣは、ＥＤＣ結合を介して、エチルアミンによってブロックして、ｐｉｃ－ボランによる変換をブロックするアミドに変換した。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。 ５ｆＣ及び５ｃａＣを含むモデルＤＮＡオリゴをｐｉｃ－ボランによって、５ｆＣ及び５ｃａＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｆＣ及び５ｃａＣは、ｐｉｃ－ＢＨ_３によってジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される。５ｆＣは、Ｏ－エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ_２）のようなヒドロキシルアミン誘導体によってブロックしたが、その誘導体は、オキシムとなり、ｐｉｃ－ボランによる変換を阻止することになる。５ｃａＣは、ＥＤＣ結合を介して、エチルアミンによってブロックして、ｐｉｃ－ボランによる変換をブロックするアミドに変換した。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。 ５ｍＣ及び５ｈｍＣを含むモデルＤＮＡオリゴをＫＲｕＯ_４及びｐｉｃ－ボランによって、５ｈｍＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｈｍＣは、βＧＴによってグルコースでブロックして、５ｇｍＣに変換できた。５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｍＣは、ｐｉｃ－ボランによって変換できなかった。５ｈｍＣは、ＫＲｕＯ_４によって酸化させて、５ｆＣにしてから、ｐｉｃ－ボランによってＤＨＵに変換できた。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。 ５ｍＣ及び５ｈｍＣを含むモデルＤＮＡオリゴをＫＲｕＯ_４及びｐｉｃ－ボランによって、５ｈｍＣをブロックした状態またはブロックしなかった状態で処理したものをＭＡＬＤＩによって特徴付けた結果である。５ｈｍＣは、βＧＴによってグルコースでブロックして、５ｇｍＣに変換できた。５ｍＣ、５ｈｍＣ及び５ｇｍＣは、ｐｉｃ－ボランによって変換できなかった。５ｈｍＣは、ＫＲｕＯ_４によって酸化させて、５ｆＣにしてから、ｐｉｃ－ボランによってＤＨＵに変換できた。各グラフの上に、ＭＳ（ｍ／ｚ）の計算値が示されており、ピークの左に、ＭＳの観察値が示されている。 制限酵素消化によって、ＴＡＰＳが、５ｍＣをＴに効果的に変換できることが示された。（Ａ）ＴＡＰＳによる配列変化を確認するための制限酵素消化アッセイの図である。（Ｂ）ＴＡＰＳによる、ＣからＴへの変換を確認するためのＴａｑαＩ消化試験である。ＴＡＰＳは、ＴａｑαＩ制限部位を有するとともに、完全にメチル化された５つのＣｐＧ部位（５ｍＣ）を含む２２２ｂｐのモデルＤＮＡと、その非メチル化コントロール（Ｃ）で行った。５ｍＣ、Ｃ及びＣ ＴＡＰＳに示されているように、ＰＣＲ増幅した２２２ｂｐのモデルＤＮＡは、ＴａｑαＩによって、約１６０ｂｐ及び約６０ｂｐの断片に切断できる。５ｍＣ－ＴＡＰＳのレーンに示されているように、メチル化ＤＮＡでＴＡＰＳを行った後、Ｔ（ｍＣ）ＧＡ配列は、ＴＴＧＡに変換され、ＴａｑαＩ消化によっては切断されなくなる。 ２２２ｂｐのモデルＤＮＡ及びｍＥＳＣ ｇＤＮＡでのＴＡＰＳである。（Ａ）ＴＡＰＳの前（５ｍＣ、Ｃ）及びＴＡＰＳの後（５ｍＣ ＴＡＰＳ、Ｃ ＴＡＰＳ）における、完全にメチル化された５つのＣｐＧ部位を含む２２２ｂｐのモデルＤＮＡと、その非メチル化コントロールのサンガーシーケンシングの結果である。５ｍＣのみが、ＴＡＰＳ法によってＴに変換される。（Ｂ）ＮｇＴＥＴ１による酸化後及びｐｉｃ－ボランによる還元後のｍＥＳＣ ｇＤＮＡコントロールにおける相対的な改変レベルの、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量結果である。データは、３つのレプリケートの平均±標準偏差としてされている。 ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。氷浴で冷却する前（の２２２ｂｐの非メチル化ＤＮＡ、２２２ｂｐのメチル化ＤＮＡ及びｍＥＳＣ ｇＤＮＡのアガロースゲル画像である。ＴＡＰＳ後、検出可能なＤＮＡ分解は、観察されず、ＤＮＡは、二本鎖を保ち、冷却せずに見ることができた。バイサルファイト変換では、分解が起こり、ＤＮＡは、一本鎖となり、氷上で冷やした後のみに見ることができた。 ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。氷浴で冷却した後（Ｂ）の２２２ｂｐの非メチル化ＤＮＡ、２２２ｂｐのメチル化ＤＮＡ及びｍＥＳＣ ｇＤＮＡのアガロースゲル画像である。ＴＡＰＳ後、検出可能なＤＮＡ分解は、観察されず、ＤＮＡは、二本鎖を保ち、冷却せずに見ることができた。バイサルファイト変換では、分解が起こり、ＤＮＡは、一本鎖となり、氷上で冷やした後のみに見ることができた。 ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。ＴＡＰＳ及びバイサルファイトで処理した、様々な断片長のｍＥＳＣ ｇＤＮＡであって、氷上で冷やす前（左パネル）及び氷上で冷やした後（右パネル）のｍＥＳＣ ｇＤＮＡのアガロースゲル画像である。ＴＡＰＳ後のＤＮＡは、二本鎖を保ち、ゲル上で、直接見ることができた。バイサルファイト処理の方が、試料の損傷及び断片化が大きく、ＤＮＡは、一本鎖となり、氷上で冷やした後のみに見ることができた。図１５に示されているように、ＴＡＰＳによる変換は、すべてのｇＤＮＡにおいて、断片の長さにかかわらず、完全なものであった。 ＴＡＰＳでは、バイサルファイトと比べて、有意なＤＮＡ分解が起こらない。ＴＡＰＳの前及び後の２２２ｂｐのモデルＤＮＡのアガロースゲル画像であり（独立して３回反復）、その反応後、検出可能な分解は見られなかった。 ＴＡＰＳの前及び後のモデルＤＮＡ間での増幅曲線及び融解曲線の比較である。ｑＰＣＲアッセイによって、ＴＡＰＳの前及び後のモデルＤＮＡで、増幅曲線において小さな違いが見られた。メチル化ＤＮＡ（５ｍＣ）の融解曲線は、ＴＡＰＳの後、低い温度の方にシフトしたことから、Ｔｍが低下する、ＣからＴへの変換の可能性が示されたが、非メチル化ＤＮＡ（Ｃ）では、シフトは見られなかった。 サンガーシーケンシングによって示されたように、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ及びＣＡＰＳの後、ＣからＴへの完全な変換が誘導された。本明細書に記載されているようにして、１つのメチル化ＣｐＧ部位及び１つのヒドロキシメチル化ＣｐＧ部位を含むモデルＤＮＡを調製した。本明細書に記載されているように、ＮｇＴＥＴ１による酸化及びピリジンボランによる還元のプロトコールに従って、ＴＡＰＳによる変換を行った。５ｈｍＣのブロック、ＮｇＴＥＴ１による酸化及びピリジンボランによる還元のプロトコールに従って、ＴＡＰＳβによる変換を行った。５ｈｍＣの酸化及びピリジンボランによる還元のプロトコールに従って、ＣＡＰＳによる変換を行った。変換後、変換されたＤＮＡ試料１ｎｇをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ増幅し、サンガーシーケンシング用に処理した。ＴＡＰＳは、５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方をＴに変換した。ＴＡＰＳβは、５ｍＣを選択的に変換し、それに対し、ＣＡＰＳは、５ｈｍＣを選択的に変換した。これらの３つの方法のいずれでも、無修飾シトシン及びその他の塩基は変換されなかった。 ＴＡＰＳは、様々なＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼと適合しており、サンガーシーケンシングによって示されているように、ＣからＴへの完全な変換を誘導する。ポリメラーゼ試験用の、メチル化ＣｐＧ部位を含むモデルＤＮＡとプライマー配列は、本明細書に記載されている。ＴＡＰＳ処理後、５ｍＣは、ＤＨＵに変換された。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ及びＶｅｎｔエキソポリメラーゼは、ＤＨＵをＴとして読み取るので、ＰＣＲ後、ＣからＴへの完全な変換を誘導する。あるいは、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含め、ビオチン標識プライマー及び等温ポリメラーゼで、プライマー伸長を行った。新たに合成したＤＮＡ鎖をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１によって分離してから、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲによって増幅し、サンガーシーケンシング用に処理した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＨＵを効率的にバイパスして、ＤＨＵ部位の反対側にアデニンを挿入できたが、これは、ＲＴ－ＰＣＲ及びサンガーシーケンシングによって証明されている。 特定の他の市販されているポリメラーゼは、ＤＨＵを含むＤＮＡを効率的には増幅しなかった。ＴＡＰＳ処理後、５ｍＣは、ＤＨＵに変換された。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ Ｐｌｕｓポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼは、ＤＨＵをＴとして読み取るので、ＣからＴへの完全な変換を誘導することになる。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ及びＮＥＢ Ｑ５ポリメラーゼを含め、特定の他の市販されているポリメラーゼでは、ＣからＴへの変換が低度であったか、または変換されなかったことが観察された（不図示）。 ＤＨＵでは、Ｔ及びＣと比べて、ＰＣＲバイアスが見られない。本明細書に記載されているように、対応するＤＮＡオリゴを用いて、１つのＤＨＵ／Ｕ／Ｔ／Ｃ修飾を含むモデルＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲ反応に基づき、ＤＨＵ／Ｕ／Ｔ／Ｃ修飾を有する各モデルＤＮＡの標準曲線をプロットし、モデルＤＮＡインプットは、１：１０の段階希釈を行った（０．１ｐｇ～１ｎｇ。すべてのｑＰＣＲ実験をトリプリケートで行った）。ＥｘｃｅｌのＳＬＯＰＥ関数によって、対数濃度（ｎｇ）の値とＣｔ平均値との回帰の傾きを計算した。効率（％）＝（１０＾（－１／傾き）－１）×１００％という式を用いて、ＰＣＲ効率を計算した。増幅係数＝１０＾（－１／傾き）という式を用いて、増幅係数を計算した。ＤＨＵ、ＴまたはＣの修飾を有するモデルＤＮＡでのＰＣＲ効率は、ほぼ同じであったことから、ＤＨＵは、通常の塩基として読み取ることができ、ＰＣＲバイアスの原因とならないと見られることが示された。 ＴＡＰＳは、ＤＮＡ断片の長さにかかわらず、５ｍＣをＴに完全に変換した。（Ａ）ＴａｑαＩ－消化アッセイのアガロースゲル画像により、すべての試料において、ＤＮＡ断片の長さにかかわらず、５ｍＣからＴへの完全な変換が確認された。ＴＡＰＳ後、λゲノムに由来する１９４ｂｐのモデル配列をＰＣＲ増幅し、ＴａｑαＩ酵素で消化した。変換されなかった試料から増幅されたＰＣＲ産物は、切断できたが、ＴＡＰＳ処理試料で増幅された産物は、インタクトなままであったことから、制限部位の喪失、すなわち、５ｍＣからＴへの完全な変換が示唆されている。（Ｂ）ゲルバンドの定量によって、ＣからＴへの変換パーセンテージを推定したところ、試験したすべてのＤＮＡ断片長で、１００％となった。 異なるＴＡＰＳ条件での変換及び偽陽性である。ｍＴｅｔ１及びピリジンボランを組み合わせたところ、ＮｇＴＥＴ１またはｐｉｃ－ボランを用いた他の条件と比べて、メチル化Ｃの変換率が最も高くなり（９６．５％。完全にＣｐＧがメチル化されたλＤＮＡで計算した）と、無修飾のＣの変換率が最も低くなった（０．２３％、２ｋｂの無修飾スパイクインで計算した）。バーの上に示されているのは、試験したすべてのシトシン部位の変換率±標準誤差である。 短いスパイクインにおける変換率である。５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む（Ａ）１２０ｍｅｒ－１及び（Ｂ）１２０ｍｅｒ－２である。両方の鎖の５ｍＣ及び５ｈｍＣの部位で、ほぼ完全な変換が行われた。実際の配列は、修飾の状態とともに、上下に示されている。 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。ＴＡＰＳで処理したＤＮＡにおける５ｍＣ及び５ｈｍＣの変換率である。左：既知の位置においてメチル化またはヒドロキシメチル化された合成スパイクイン（ＣｐＮ）である。 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。無修飾の２ｋｂのスパイクインから得られた、ＴＡＰＳの偽陽性率である。 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。１００万個のシミュレーションリードを１つのＩｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ ＣＰＵの１つのコアで処理した時の、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの総実行時間である。 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。シーケーシングしたすべてのリードペア（トリミング後）のうち、ゲノムにマッピングされた割合である。 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）よりも改善されたＴＡＰＳのシーケンシングクオリティ。シーケンシングしたすべてのリードペアにおける第１及び第２のリードにおける１塩基あたりのシーケンシングクオリティスコアをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅによって記録したものである。上は、ＴＡＰＳである。下は、ＷＧＢＳである。 ＴＡＰＳでは、ＷＧＢＳよりも均一なカバレッジが得られ、カバーされなかった位置がＷＧＢＳよりも少なかった。ＷＧＢＳとＴＡＰＳの間で、（Ａ）すべての塩基及び（Ｂ）ＣｐＧ部位におけるカバレッジ深度を比較したものであり、両方の鎖で計算した。「ＴＡＰＳ（ダウンサンプリング済み）」では、マッピングされたすべてのＴＡＰＳリードから取ったランダムなリードを選択して、カバレッジ中央値が、ＷＧＢＳのカバレッジ中央値と一致するようにした。最後のビンには、カバレッジが５０×超の位置が示されている。 すべての染色体にわたる修飾レベルの分布である。マウス染色体全体にわたる、１００ｋｂのウィンドウにおける改変レベルの平均を、ＣｐＧのカバレッジによって重み付けして、Ｇａｕｓｓｉａｎ加重移動平均フィルターを用いて、ウィンドウサイズ１０で平滑化したものである。 ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。すべてのマウスＣｐＧアイランド（２０個のウィンドウにビニングした）及び４ｋｂｐのフランキング領域（サイズの等しい５０個のウィンドウにビニングした）におけるシーケンシングカバレッジ深度の平均である。シーケンシング深度の差を考慮するために、マッピングされたすべてのＴＡＰＳリードをダウンサンプリングして、ゲノム全体にわたる、マッピングされたＷＧＢＳリードの数の中央値と適合させた。 ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。ＴＡＰＳのみ、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの両方、またはＷＧＢＳのみによって、少なくとも３本のリードによってカバーされたＣｐＧ部位である。 ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。少なくとも３本のリードによってカバーされたとともに、ＴＡＰＳのみ、ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳ、またはＷＧＢＳのみによって検出された修飾レベルが０．１超であるＣｐＧ部位の数である。 ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳにおける修飾レベル（％）の染色体分布の例である。マウス染色体４における、１００ｋｂのウィンドウ当たりの修飾ＣｐＧの割合の平均を、Ｇａｕｓｓｉａｎ加重移動平均フィルターを用いて、ウィンドウサイズ１０で平滑化したものである。 ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによるゲノムワイドなメチローム測定値の比較である。ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳの両方において、少なくとも３本のリードによってカバーされたＣｐＧ部位の数を表すヒートマップであり、各方法によって測定した場合の修飾レベルによって分類したものである。コントラストを向上させるために、両方の方法で無修飾のＣｐＧを含む第１のビンは、カラースケールから除外し、星印で示されている。 ＣｐＧアイランド周辺の修飾レベルである。ＣｐＧアイランド（２０個のウィンドウにビニングした）及び４ｋｂｐのフランキング領域（サイズの等しい５０個のウィンドウにビニングした）における修飾レベルの平均である。カバレッジが３リード未満のビンは無視した。 ＴＡＰＳでは、ＷＧＢＳよりもカバレッジ－修飾バイアスが小さい。すべてのＣｐＧ部位を、そのカバレッジに従ってビニングし、各ビンにおいて、修飾値の平均（●）及び中央値（黒三角）が、ＷＧＢＳ（Ａ）及びＴＡＰＳ（Ｂ）に関して示されている。最後のビンには、１００個超のリードによってカバーされたＣｐＧ部位が示されている。線は、データポイントにわたる直線近似を表している。 ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡライブラリー調製キットを用いて、インプットの少ないｇＤＮＡ及びセルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳを調製した。（Ａ）ｄｓＤＮＡライブラリーキットＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩまたはＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを用いて、わずか１ｎｇのマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）による、シーケンシングライブラリーの構築が成功した。ｓｓＤＮＡライブラリーキットＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑキットを用いて、インプットＤＮＡ量をさらに、（Ｂ）０．０１ｎｇのｍＥＳＣ ｇＤＮＡまたは（Ｃ）１ｎｇのセルフリーＤＮＡまで減少させた。 ｄｓＤＮＡ ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐライブラリー調製キットを用いて、インプットの少ないｇＤＮＡ及びセルフリーＤＮＡのＴＡＰＳライブラリーを調製した。ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを用いて、１ｎｇほどの少ない（Ａ）ｍＥＳＣ ｇＤＮＡ及び（Ｂ）セルフリーＤＮＡで、シーケンシングライブラリーの構築が成功した。セルフリーＤＮＡは、血漿ヌクレアーゼ消化により、１６０ｂｐ前後（ヌクレオソームサイズ）のシャープな長さ分布を有する。ライブラリーの構築後、そのＤＮＡは、約３００ｂｐとなり、それは、Ｂにおけるシャープなバンドである。 高品質なセルフリーＤＮＡ ＴＡＰＳである。（Ａ）ＴＡＰＳで処理したｃｆＤＮＡにおける５ｍＣの変換率である。（Ｂ）ＴＡＰＳで処理したｃｆＤＮＡにおける偽陽性率である。（Ｃ）シーケンシングされたすべてのリードペアのうち、ゲノムにユニークにマッピングされた割合である。（Ｄ）シーケンシングされたすべてのリードペアのうち、ゲノムにユニークにマッピングされ、ＰＣＲ重複リードを除去した後の割合である。ＣＨＧ及びＣＨＨは、非ＣｐＧコンテクストである。 ＴＡＰＳは、遺伝的バリアントを検出できる。メチル化（ＭＯＤ、上の行）及びＣ→Ｔ ＳＮＰ（下の行）では、元の上鎖（ＯＴ）／元の下鎖（ＯＢ）（左のカラム）、ならびにＯＴと相補的な鎖（ＣＴＯＴ）及びＯＢと相補的な鎖（ＣＴＯＢ）（右のカラム）において、別々の塩基分布が見られた。 ＴＡＰＳ変換生成物のエンドヌクレアーゼ切断である。（Ａ）ＴＡＰＳ変換の前及び後のｍＥＳＣ ｇＤＮＡの、異なるエンドヌクレアーゼによる消化の結果である。ＴＡＰＳ変換では、メチル化シトシンに代わって、ＤＨＵが導入される。Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏ ＩＶはエンドヌクレアーゼＩＶ、Ｔｍａ Ｅｎｄｏ ＩＩＩはエンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔｔｈ Ｅｎｄｏ ＩＶはエンドヌクレアーゼＩＶ、Ｎｔｈ Ｅｎｄｏ ＩＩＩはＮｔｈエンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｅｎｄｏ ＶはエンドヌクレアーゼＶである。（Ｂ）ＴＡＰＳで処理したｍＥＳＣ ｇＤＮＡであって、ＵＳＥＲ消化前、ＵＳＥＲ消化後、及びサイズ選別後のｍＥＳＣ ｇＤＮＡの代表的な画像である。（Ｃ）ＢＳ－ｓｅｑ及びｅｅＴＡＰＳの両方によって測定したすべてのＣｐＧにおけるメチル化レベルを示す散布図である。 エンドヌクレアーゼ濃縮ＴＡＰＳ（ｅｅＴＡＰＳ）である。ｅｅＴＡＰＳの概略図（上図）と、ＣＧメチル化レベルの、コンピューターによる測定値（下図）である。まず、ＴＡＰＳで５－メチルシトシン（ｍＣ）をジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換してから、ＵＳＥＲ消化を通じて濃縮した。その後、サイズ選別を行ったＤＮＡ断片を調製して、シーケンシングライブラリーにし、ＰＣＲによって増幅した。リードのアラインメント後、各ＣｐＧ部位で切断されるリードの数を、各ＣｐＧ部位で切断されたリードの総数、または各ＣｐＧ部位をカバーするリードの総数で除したものとして、ＣＧメチル化レベルを計算した。 ４ｋｂのモデルＤＮＡでのｅｅＴＡＰＳの検証である。トラックは、上から下の順で、バイサルファイトシーケンシング（ＢＳ－ｓｅｑ）、ｅｅＴＡＰＳ、及びｅｅＴＡＰＳコントロールで測定したメチル化レベルを示している。ｅｅＴＡＰＳコントロールでは、ＴＡＰＳで変換せずに、ＵＳＥＲ酵素を用いて、ＤＮＡを消化した。 ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳのゲノムの断片化方法を示す図である。ｗｇＴＡＰＳでは、ゲノムＤＮＡは、ランダムに断片化されるのに対して、断片化は、ｅｅＴＡＰＳでは、メチル化ＣｐＧ（ｍＣＧ）部位で、ｒｒＴＡＰＳでは、ＣＣＧＧ部位で特異的に行われる。 ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳによってカバーされたＣｐＧ部位のパーセンテージを、クロマチンの異なる特徴と重ね合わせたものを示すバープロットである。これらのクロマチンの特徴は、以前の研究（２０）で定義されている。 ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳによって、１ＣｐＧの分解能で求めたメチル化レベルの相関性を示すヒートマップである。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳの両方において、メチル化レベルを１６群に分けた。カラーは、所定の間隔でのＣｐＧの数を示している。ｗｇＴＡＰＳでのカバレッジが５超の部位のみを考慮に入れた。プロットの上部には、ピアソンの相関係数が示されている。 ｍＥＳＣ ＤＮＡでのｗｇＴＡＰＳ、ｅｅＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの比較である。ｗｇＴＡＰＳ、ｒｒＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳにおける、検出されたｍＣｐＧ部位の重複を示すベンプロットである。ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳの両方において、メチル化レベルが、メチル化レベルの第１四分位超のＣｐＧ部位を、メチル化ＣｐＧとして定義した。ｒｒＴＡＰＳでは、ｗｇＴＡＰＳと同じメチル化カットオフ値を用いた。（ｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳでは、メチル化レベルが０．５超のＣｐＧ部位を、ｍＣｐＧとして定義し、ｅｅＴＡＰＳでは、メチル化レベルが０．２８超のＣｐＧ部位をｍＣｐＧとして定義した。） （Ａ）シーケンシングした断片の末端におけるヌクレオチド頻度である。（Ｂ）切断部位と、その部位に最も近いＣｐＧとの距離の分布を示すバープロットである。（Ｃ）ｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳによって、１ＣｐＧの分解能で求めたメチル化レベルの相関性を示すヒートマップである。ｗｇＴＡＰＳ及びｒｒＴＡＰＳの両方において、メチル化レベルを１６群に分けた。カラーは、所定の間隔でのＣｐＧの数を示している。ｗｇＴＡＰＳでのカバレッジが５超であり、ｒｒＴＡＰＳでのカバレッジが５超である部位のみを考慮に入れた。ピアソンの相関係数は、０．９２である。（Ｄ）ｅｅＴＡＰＳのレプリケートで検出されたｍＣｐＧ部位の重複であり、レプリケートは、同じ深度になるようにサブサンプリングして、ｍＣｐＧを検出した。 異なるゲノム機構におけるメチル化をｅｅＴＡＰＳでプロファイリングしたものである。（Ａ）ｍＥＳＣの１番染色体において、ｅｅＴＡＰＳ（上の線）及びｗｇＴＡＰＳ（下の線）の両方によって測定したメチル化レベルである。１００ｋｂのウィンドウを使用し、移動平均値をＲにおいて、ｂｗ＝１０で、ｍｏｖＡｖｇ２関数によって計算した。（Ｂ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳ間での、染色体ビンにおけるメチル化レベルの相関性を示す密度プロットである。１００ｋｂのウィンドウを用いて、各ビンにおいて、メチル化レベルの平均を計算した。プロットの上部には、ピアソンの相関係数が示されている。（Ｃ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳにおける、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）及び４ｋｂのフランキング領域にわたるメチル化レベルの平均である。（Ｄ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳ間での、ＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルの相関性を示す密度プロットである。プロットの上部には、ピアソンの相関係数が示されている。（Ｅ）ｅｅＴＡＰＳ及びｗｇＴＡＰＳでの、クロマチンの異なる特徴におけるメチル化レベルの相関性を示す密度プロットである。これらのクロマチンの特徴は、ヒストンマーカーによって以前に定義されたものであり（Ｂｏｇｕ，Ｇ．Ｋ．，Ｖｉｚａｎ，Ｐ．，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｗ．，Ｂｅａｔｏ，Ｍ．，Ｄｉ Ｃｒｏｃｅ，Ｌ．ａｎｄ Ｍａｒｔｉ－Ｒｅｎｏｍ，Ｍ．Ａ．（２０１５）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｎｄ ＲＮＡ Ｍａｐｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３６，８０９－８１９）、（Ｆ）にも示されている。プロットの上部には、ピアソンの相関係数を示した。（Ｆ）クロマチンのすべての特徴にわたるメチル化レベルの分布をｅｅＴＡＰＳ（下のバー）及びｗｇＴＡＰＳ（上のバー）によって測定したものを示すボックスプロットである。 ｗｇＴＡＰＳ及びｅｅＴＡＰＳにおける、転写開始部位（ＴＳＳ）周辺のメチル化分布の平均である。遺伝子は、ＧＳＥ７２８５５のデータセットに従い、それらの発現レベルによって分類した。 インプットの少ない試料での、ｅｅＴＡＰＳによる解析である。（Ａ）ｅｅＴＡＰＳを用いて、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、２００ｎｇのｍＥＳＣ ｇＤＮＡインプットで検出されたｍＣｐＧの数（ｗｇＴＡＰＳによって特定されたｍＣｐＧのうちの数）である。２００ｎｇのｍＥＳＣでは、リードを２分の１にダウンサンプリングして、インプットの少ない試料に合わせて、シーケンス深度を適合させた。０．２８超のメチル化レベルという基準を用いて、ｍＣｐＧを割り当て、ｅｅＴＡＰＳでは、１超の切断数をｍＣｐＧとして割り当て、ｗｇＴＡＰＳでは、０．５超のメチル化レベルをｍＣｐＧとして割り当てた。バーの上に示されているパーセンテージは、検出されたｍＣｐＧのパーセンテージである（ｗｇＴＡＰＳで検出されたｍＣｐＧは、真として定義する）。（Ｂ）異なるインプットレベルを用いて、マウスゲノムにわたり、ｅｅＴＡＰＳで測定したメチル化分布を示すヒートマップである。各染色体を１００ｋｂのウィンドウに分け、それらのウィンドウは、ヒートマップの行によって表されている。メチル化レベルは、１００ｋｂの各ウィンドウにおいて、メチル化ＣｐＧ部位の数を、カバーされたＣｐＧ部位の総数で除したものとして定義した。（Ｃ）インプットの少ない試料間での、２００ｎｇのインプット試料に対するメチル化の相関性を示す密度プロットである。メチル化レベルは、（Ｂ）に示されているように、１００ｋｂのウィンドウにおいて、全マウスゲノムにわたり計算した。ピアソンの相関係数は、各プロットについて示されている。 ｅｅＴＡＰＳシーケンシング深度の解析結果である。（Ａ）１～１０×のシーケンシング深度でリードをサンプリングしたときに検出されるメチル化ＣｐＧの数である。上に示されているパーセンテージは、ｅｅＴＡＰＳによって検出されたｍＣｐＧのパーセンテージである（ｗｇＴＡＰＳで検出されたｍＣｐＧを真と定義する）。（Ｂ）１～１０×のシーケンシング深度でリードをサンプリングしたときの、１００ｋｂのウィンドウにおける、全マウスゲノム（上の線）及びＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）（下の線）におけるメチル化の相関性である。

Claims (16)

1. 改変標的ＤＮＡの切断方法であって、
   標的ＤＮＡ中の５ｃａＣ及び／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換し、１つ以上のＤＨＵを含む改変標的ＤＮＡを提供する変換工程と、
   １つ以上のＤＨＵを含む前記改変標的ＤＮＡと、前記１つ以上のＤＨＵの位置または前記１つ以上のＤＨＵと隣接する位置で、前記改変標的ＤＮＡを切断する１つ以上のエンドヌクレアーゼとを接触させることとを含む、方法。
2. 前記方法が、前記変換工程の前に、５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを含む標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、前記改変することが、前記標的ＤＮＡにおける５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び／または５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、前記５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを変換する工程の前に、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む前記標的ＤＮＡを改変することをさらに含み、前記改変することが、前記標的ＤＮＡにおける５ｈｍＣに、ブロック基を付加する工程を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記５ｈｍＣに付加する前記ブロック基が、糖である、請求項３に記載の方法。
5. 前記標的ＤＮＡにおける５ｍＣ及び／または５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程が、前記標的ＤＮＡと、１０－１１転座（ＴＥＴ）酵素とを接触させることを含む、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ＴＥＴ酵素が、ヒトＴＥＴ１、ヒトＴＥＴ２、ヒトＴＥＴ３、マウスＴＥＴ１、マウスＴＥＴ２、マウスＴＥＴ３、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、およびＣｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ＴＥＴ（ＣｃＴＥＴ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＴＥＴ酵素が、ＮｇＴＥＴ、マウスＴＥＴ２、またはヒトＴＥＴ１である、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程が、前記標的ＤＮＡを酸化剤と接触させることを含む、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記酸化剤が、過ルテニウム酸カリウム、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ、ルテニウム酸カリウムまたは酸化マンガンである、請求項８に記載の方法。
10. 前記５ｃａＣ及び／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程が、前記標的ＤＮＡを還元剤と接触させることを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記還元剤が、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ_３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記１つ以上のエンドヌクレアーゼが、アプリン酸／アピリミジン酸エンドヌクレアーゼ１（ＡＰＥ１）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＴｍａエンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＴｔｈエンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）及びｈＮＥＩＬ１からなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記１つ以上のエンドヌクレアーゼが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及びＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを組み合わせたものを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記切断された改変標的ＤＮＡに、アダプターＤＮＡ分子を付加する工程をさらに含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記切断された改変標的ＤＮＡの配列を検出する工程をさらに含み、切断された部位の存在は、前記標的ＤＮＡにおける５ｃａＣまたは５ｆＣの何れかの位置を提供する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記方法が、前記接触させる工程の前に、前記改変標的ＤＮＡのコピー数を増幅する工程をさらに含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
    

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