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JP7597974B2 - 大腸菌組成物およびその方法 - Google Patents
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Description

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願され、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは２０２１年１月２８日に作成され、１５２ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ７２５９１＿ＰＲＯＶ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の表題の配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）組成物およびその方法に関する。
抗微生物薬耐性を増大させることによってもたらされる公衆衛生に対する脅威は、ＷＨＯおよびＣＤＣによって公開された最近の報告（Ｔｈｅｌｗａｌｌ ＳＮら、Ａｎｎｕａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｎｄａｔｏｒｙ ＭＲＳＡ，ＭＳＳＡ ａｎｄ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ ａｎｄ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄａｔａ ２０１５／１６ ２０１６；Ｒｕｓｓｏ ＴＡら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２００３；５：４４９～５６）に記載されている。両機関によって記載された優先病原体としては、基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）の産生によって付与される、第３世代のセファロスポリンに対する耐性、およびカルバペネマーゼ酵素の産生に起因する、カルバペネムに対する耐性を有する腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）が挙げられる。ＣＤＣによれば、ＥＳＢＬを発現する腸内細菌科は、重大な脅威であるが、最終ラインであるカルバペネム抗生物質に対して耐性の腸内細菌科は、緊急の脅威であると考えられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＳＢＬ株は、ますます広がりつつあり、ＥＳＢＬとカルバペネマーゼとの両方を産生するクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる治療不可能な感染は、特に、発展途上国においてますます一般的になりつつある。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、血流感染（米国では１００，０００人あたり７０人）（Ｍａｒｄｅｒ ＥＰら、Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１４；１１：５９３～５）、尿路感染（カテーテル関連（米国の症例では、毎年、２５０，００～５２５，０００人）（Ａｌ－Ｈａｓａｎ ＭＮら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００９；６４：１６９～７））；非カテーテル関連（米国の症例では、毎年、６～８００万人）（ｉｄ．））；手術部位感染（米国の症例では、毎年、１２７，５００人）、肺炎（米国の症例では、毎年、１４，１００～２３，４００人）（ｉｄ．）および重篤な食中毒関連下痢（米国の症例では、毎年、６３，０００人）（Ｚｏｗａｗｉ ＨＭら、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５；１２：５７０～８４）を含む、臨床所見を伴う最も一般的なヒト細菌病原体の１つである。それらは、リポ多糖関連Ｏ抗原（１８０を超える既知の血清型）、莢膜多糖Ｋ抗原（８０を超える血清型）、および鞭毛Ｈ抗原（５０を超える血清型）の構造の差異によって血清学的に分類される。
尿路感染（ＵＴＩ）は、一部の個体においては、消散後も繰り返し再発し得る膀胱炎として現れることが最も多い。未処置のまま放置すると、それらは腎盂腎炎および血流感染に進行し得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染は、高レベルの抗生物質耐性と関連し（Ｒｏｇｅｒｓ ＢＡら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１１；６６：１～１４）、多くの株は、カルバペネムおよびポリミキシンなどの最後の手段の抗生物質を含む複数の抗生物質に対して耐性である（Ｎｉｃｏｌａｓ－Ｃｈａｎｏｉｎｅ Ｍ－Ｈら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４；２７：５４３～７４）。特に、Ｏ２５ｂ血清型多座配列型（ＭＬＳＴ）１３１は、主に市中発生型感染を引き起こし、拡張スペクトルセファロスポリン（ＥＳＢＬ）およびフルオロキノロンに対する高率の耐性を示す、世界規模のパンデミッククローンとして出現した（Ｐｏｏｌｍａｎ ＪＴら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１６；２１３：６～１３；Ｐｏｄｓｃｈｕｎ Ｒら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９８；１１：５８９～６０３）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢＳＩおよびＵＴＩ感染株は、侵襲性腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）または尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）としても知られる。ＥｘＰＥＣ株の中で、１８０を超える同定された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原血清型のうち、１０～１２のＯ血清型のサブセットが、菌血症の症例の６０％超を占めると報告されている（Ｙｉｎｎｏｎ ＡＭら、ＱＪＭ：ｍｏｎｔｈｌｙ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９９６；８９：９３３～４１）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の次に、クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびクレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）を含む）は、ＵＴＩ、肺炎、腹部内感染、および血流感染（ＢＳＩ）を含む侵襲性感染と関連する次の最も一般的なグラム陰性病原体である（Ｐｏｄｓｃｈｕｎ Ｒら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９８；１１：５８９～６０３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＪら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９１７１３；Ｃｈｅｎ Ｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１４；２２：６８６～９６；Ｉｒｅｄｅｌｌ Ｊら、Ｂｍｊ ２０１６；３５２：ｈ６４２０）。クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）は、水平伝播性のＥＳＢＬおよびカルバペネム耐性付与遺伝子を介して抗生物質耐性を獲得する高い能力を維持する（Ｆｏｌｌａｄｏｒ Ｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１６；２：ｅ００００７３；Ｓｃｈｒａｇ ＳＪ、Ｆａｒｌｅｙ ＭＭ、Ｐｅｔｉｔ Ｓら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅａｒｌｙ－Ｏｎｓｅｔ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｓｅｐｓｉｓ、２００５～２０１４、２０１６；１３８：ｅ２０１６２０１３）。したがって、この１０年間に、基質特異性拡張型β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生するＥＳＢＬ耐性クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の有病率は、世界レベルで劇的に増大してきた。クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）は、最大で８つの異なるＯ型および８０を超えるＫ型を発現することができる。ビルレントなクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）株と関連する多数のＫ抗原が存在するが、試料採取部位（血液、尿、唾液）、感染状態（侵襲性対非侵襲性）または獲得の性質（市中対院内）に関係なく、わずか４つのＯ抗原血清型が、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）臨床単離物の８０％超を占める（Ｓｔｏｌｌ ＢＪら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２０１１；１２７：８１７～２６）。
脆弱な新生児集団および高齢者における侵襲性多剤耐性（ＭＤＥ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）感染の割合の増加は、あまり有効ではなくなっている標準治療である抗生物質の代替手段としてのワクチンに基づく手法の必要性を強調する。
これらの必要性およびその他の必要性を満たすために、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する免疫応答を惹起するための組成物およびその使用方法に関する。
一実施形態では、本発明は、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む糖を含む組成物を提供する。
一態様では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む。
別の態様では、組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされたクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖；および担体タンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖をさらに含む。
別の実施形態では、本発明は、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；ならびにＯ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む組成物を提供する。一態様では、組成物は、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む少なくとも１つの糖をさらに含む。
別の態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
さらなる実施形態では、本発明は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖；ならびに式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む少なくとも１つの糖を含む組成物を提供する。
一態様では、組成物は、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片をさらに含む。別の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖は、式Ｏ８を含む。別の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖は、式Ｏ９を含む。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法であって、哺乳動物に、上記実施形態およびその態様のいずれか１つによる有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物においてクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を惹起する方法であって、哺乳動物に、上記実施形態およびその態様のいずれか１つによる有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞に関する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）鞭毛Ｈ（ｆｉｍＨ）ポリペプチドまたはその断片に由来するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドのＮ末端にフェニルアラニン残基を含む。
一態様では、本発明は、組換え哺乳動物細胞中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を産生させるための方法に関する。方法は、好適な条件下で組換え哺乳動物細胞を培養することによって、ポリペプチドまたはその断片を発現させること；およびポリペプチドまたはその断片を収集することを含む。一部の実施形態では、方法は、ポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドの収率は、少なくとも０．０５ｇ/Ｌである。一部の実施形態では、ポリペプチドの収率は、少なくとも０．１０ｇ/Ｌである。
一態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９、またはその任意の組合せに対する少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む組成物に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸（ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）である）を有するポリペプチドを含む組成物に関する。一部の実施形態では、組成物は、表１中の式のいずれか１つ、好ましくは、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ２、式Ｏ６、および式Ｏ２５Ｂ（ここで、ｎは、１～１００の整数、好ましくは、３１～１００である）から選択される糖をさらに含む。
図１Ａ～Ｈは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する例示的なポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列；および例示的なｗｚｚＢ配列のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を描写する。 図２Ａ～Ｔは、例示的な発現ベクターのマップを描写する。 図３は、発現および精製の結果を描写する。 図４は、発現および精製の結果を描写する。 図５は、発現の結果を描写する。 図６Ａ～Ｃは、収量を含めて、ｐＳＢ０２０８３およびｐＳＢ０２１５８ ＳＥＣプールおよび親和性を描写する。 図７は、ｐＳＢ２１９８ ＦｉｍＨ ｄｓｃＧ Ｌｏｃｋ変異体構築物の発現の結果を描写する。 図８は、ｐＳＢ２３０７ ＦｉｍＨ ｄｓｃＧ野生型の発現の結果を描写する。 図９Ａ～Ｃは、バックボーン中に４個以下の残基を含む、ポリメラーゼ依存的経路により合成されるＯ抗原の構造を描写する。 図１０Ａは、バックボーン中に５個または６個の残基を含む、ポリメラーゼ依存的経路によって合成されるＯ抗原の構造を描写する；図１０Ｂは、ＡＢＣトランスポーター依存的経路によって合成されると考えられるＯ抗原を描写する。 図１１は、ＦｉｍＨタンパク質を安定化して、マンノース結合を順応させ得る脂肪族疎水性側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌでのＰｈｅ１のコンピュータによる突然変異誘発スキャニングを描写する。 図１２Ａ～１２Ｂは、プラスミド：ｐＵＣレプリコンプラスミド、細胞あたり５００～７００コピー、鎖長調節因子（図１２Ａ）；およびＰ１５ａレプリコンプラスミド、細胞あたり１０～１２コピー、Ｏ抗原オペロン（図１２Ｂ）を描写する。 図１３Ａ～１３Ｂは、異種ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ鎖長調節因子のプラスミドに基づく発現による、血清型Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ株におけるＯ抗原鎖長のモジュレーションを描写する。ｗｚｚＢノックアウト株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１（Ｏ２５ａ）およびＧＡＲ２４０１（Ｏ２５ｂ）のプラスミド形質転換体中でのＬＰＳ発現の遺伝的相補が示される。図１３Ａの左側に、Ｏ２５ａ Ｏ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルを示す；右側には、Ｏ２５ｂ ＧＡＲ ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の同様のプロファイルを示す。Ｏ２５特異的血清（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）を用いて探査した複製ゲルのイムノブロットを、図１３Ｂに示す。レーン１～７と関連するＯ２５ａΔｗｘｘＢ（ノックアウト）バックグラウンド；レーン８～１５と関連するＯ２５ｂ ２４０１ΔｗｚｚＢ（ノックアウト）バックグラウンド。 図１４は、宿主Ｏ２５Ｋ５Ｈ１ΔｗｚｚＢ中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドによりもたらされた長鎖Ｏ抗原発現を描写する。 図１５は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ発現は、様々な臨床単離物中で長鎖Ｏ抗原ＬＰＳを生成することを描写する。 図１６Ａ～１６Ｂは、Ｏ２５ｂ Ｏ抗原ノックアウト宿主株中でのＯ２５ｂ長鎖Ｏ抗原ＬＰＳのプラスミド媒介性アラビノース誘導性発現を描写する。ＳＰＳ ＰＡＧＥからの結果を図１６Ａに示し、Ｏ２５イムノブロットからの結果を図１６Ｂに示し、その際、図１６Ａと図１６Ｂの両方において、レーン１は、クローン１、アラビノースなしに由来する；レーン２は、クローン１、０．２％アラビノースに由来する；レーン３は、クローン９、アラビノースなしに由来する；レーン４は、クローン９、０．２％アラビノースに由来する；レーン５は、Ｏ５５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ標準に由来する；およびレーン６は、Ｏ１１１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ標準に由来する。 図１７は、共通の宿主株中での長鎖Ｏ抗原ＬＰＳのプラスミド媒介性アラビノース誘導性発現を示す。 図１８は、探索的生体プロセス株中でのＯ２５ Ｏ抗原ＬＰＳの発現を描写する。 図１９Ａ～１９Ｂは、ＧＡＲ２８３１および’２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ株から精製された短鎖（図１９Ａ、株１、Ｏ２５ｂ ｗｔ２８３１）および長鎖Ｏ２５ｂ Ｏ抗原（図１９Ｂ、株２、Ｏ２５ｂ ２４０１ΔｗｚｚＢ／ＬＴ２ ＦｅｐＥ）のＳＥＣプロファイルおよび特性を描写する。 図２０Ａ～２０Ｂは、ウサギにおけるワクチン接種スケジュールを描写する：（図２０Ａ）ウサギ試験１ ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３のワクチン接種スケジュールに関する情報；（図２０Ｂ）ウサギ試験２ ＶＡＣ－２０１８－ＰＲＬ－ＥＣ－０７７のワクチン接種スケジュール。 図２１Ａ～２１Ｃは、Ｏ２５ｂ糖コンジュゲートＩｇＧ応答を描写する。－●－は、出血前の結果を表す；－■－出血１（第６週）；－▲－出血２（第８週）；－◆－出血３（第１２週）。図２１Ａは、ウサギ１－３の結果を描写する（中活性化）；図２１Ｂは、ウサギ２－３の結果を描写する（低活性化）；図２１Ｃは、ウサギ３－１の結果を描写する（高活性化）。 図２２Ａ～２２Ｆは、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲート、すなわち、低活性化Ｏ２５ｂ－ＣＲＭ１９７コンジュゲート（図２２Ｄ～Ｆにおいて、－●－は、ウサギ２－１に由来する出血前の結果を表し、－■－は、ウサギ２－１に由来する第１２週の抗血清の結果を表す）と、非コンジュゲート化多糖、すなわち、遊離Ｏ２５ｂ多糖（図２２Ａ～Ｃにおいて、－●－は、ウサギＡ－１に由来する出血前の結果を表し、－■－は、ウサギＡ－１に由来する第６週の抗血清の結果を表し、－▲－は、ウサギＡ－１に由来する第８週の抗血清の結果を表す）とに対するＩｇＧ応答を描写する。ＭＦＩは対数尺度でプロットされ、１０００未満のＭＦＩ範囲で免疫前抗体と免疫抗体との差異を強調することに留意されたい。図２２Ａは、ウサギＡ－１の結果を描写する（非コンジュゲート化ポリ）；図２２Ｂは、ウサギＡ－３の結果を描写する（非コンジュゲート化ポリ）；図２２Ｃは、ウサギＡ－４の結果を描写する（非コンジュゲート化ポリ）；図２２Ｄは、ウサギ２－１の結果を描写する（低活性化）；図２２Ｅは、ウサギ２－２の結果を描写する（低活性化）；および図２２Ｆは、ウサギ２－３の結果を描写する（低活性化）。 図２３Ａ～２３Ｃは、Ｏ２５ｂ抗血清を用いて検出された、天然のＯ２５ｂ Ｏ抗原と長鎖Ｏ２５ｂ Ｏ抗原の表面発現を描写する。図２３Ａは、－●－がＯ２５ｂ ２８３１対ＰＤ３抗血清の結果を描写し、－■－がＯ２５ｂ ２８３１ ｗｔ対出血前の結果を表し、－▲－がＯ２５ｂ ２８３１／ｆｅｐＥ対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－▼－がＯ２５ｂ ２８３１／ｆｅｐＥ対出血前の結果を表す、結果を描写する。図２３Ｂは、－●－がＯ２５ｂ ２４０１対ＰＤ３抗血清の結果を描写し、－■－がＯ２５ｂ ２４０１対出血前の結果を表し、－▲－がＯ２５ｂ ２４０１／ｆｅｐＥ対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－▼－がＯ２５ｂ ２４０１／ｆｅｐＥ対出血前の結果を表す、結果を描写する。図２３Ｃは、－●－が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２対ＰＤ３抗血清の結果を表し、－■－が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２対出血前の結果を表す、結果を描写する。 図２４は、５つの公知のケモタイプの外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般化された構造を描写する。全てのグリコースは、別途指摘しない限り、α－アノマー配置にある。生成物がそれぞれの結合の形成を触媒する遺伝子を、破線の矢印で示す。星印は、Ｏ抗原の結合が生じるコアオリゴ糖の残基を示す。 図２５は、非コンジュゲート化遊離Ｏ２５ｂ多糖が免疫原性ではないことを描写し（ｄＬＩＡ）、－●－は４－１に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－■－は、４－２に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－▲－は、５－１に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－▼－は、５－２に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－＊－は、６－１に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す；－＾－は、６－２に由来する第１８週（１週＝ＰＤ４）の抗血清の結果を表す。 図２６Ａ～２６Ｃ－は、ＢＲＣウサギＯ２５ｂ ＲＡＣコンジュゲート免疫血清ＯＰＡ力価の特異性を示すグラフを描写する。図２６Ａは、免疫前血清－●－および免疫後血清第１３週－■－のウサギ２－３のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｂは、免疫前血清－●－および免疫後血清第１９週－■－のウサギ１－２のＯＰＡ力価を示す。図２６Ｃは、ウサギ１－２の第１９週のＯＰＡ力価特異性を示し、ここで、ウサギ１－２の免疫血清のＯＰＡ活性は、１００μｇ／ｍＬの精製非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖と共に予備インキュベートすることによって遮断される。－■－は、ウサギ１－２の免疫血清第１９週の結果を表し、－▼－は、ウサギ１－２の第１９週のｗ／Ｒ１長鎖ＯＡｇの結果を表す。 図２７Ａは、例示的な投与スケジュールのイラストを示す。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖（図２７Ｂ、Ｏ２５ｂ遊離ポリ（２μｇ））および誘導されたＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲート（図２７Ｃ、Ｏ２５ｂ－ＣＲＭ１９７ ＲＡＣ長鎖（２μｇ））により惹起されたＯ抗原Ｏ２５ｂ ＩｇＧレベルを描写するグラフを示し、この際、－．．．－（点線）は、ナイーブなＣＤ１ Ｏ２５ｂＩｇＧレベルを表す。 図２８Ａ～２８Ｂは、用量２後（図２８Ａ）および用量３後（図２８Ｂ）の、ＲＡＣ、ｅＴＥＣ Ｏ２５ｂ長鎖糖コンジュゲート、および単一末端糖コンジュゲートのＯＰＡ免疫原性を描写するグラフを描写し、その際、－○－は、単一末端の短い２μｇの結果を表し、－●－は単一末端の長い２μｇの結果を表し、－▲－は、ＲＡＣ／ＤＭＳＯの長い２μｇの結果を表し、－▼－は、ｅＴＥＣの長い２μｇの結果を表し、＊はバックグラウンド対照（ｎ＝２０）を表す。†応答率は、ワクチン接種していないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの％である。 図２９は、ｅＴＥＣ化学のＯＰＡ免疫原性および改変されたレベルの多糖活性化を示すグラフを描写する。†応答率は、ワクチン接種していないベースラインの２倍を超える力価を有するマウスの％である。 図３０Ａ～３０Ｂは、例示的な投与スケジュールのイラストを示し（図３０Ａ）；Ｏ２５ｂ単離物による致死性チャレンジに由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｅＴＥＣコンジュゲートの用量で免疫されたマウスの保護を描写するグラフを示し（図３０Ｂ）、この際、－◇－は、ｅＴＥＣ長鎖の１７％の活性化を表し、－△－は、ｅＴＥＣ長鎖の１０％の活性化を表し、－▽－は、ｅＴＥＣ長鎖の４％の活性化を表し、－□－は、Ｏ２５ｂ多糖を表し、－○－はワクチン接種していない対照を表す。 図３１は、単一末端コンジュゲートの例示的調製を示す略図を描写し、コンジュゲーションプロセスは、チオール官能基の脱マスキング時の、ジスルフィドアミンリンカーによる２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の選択的活性化を含む。次いで、ＫＤＯを、図３１に描写されるようにブロモ活性化ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートする（単一末端コンジュゲートの調製）。 図３２Ａ～３２Ｂは、ＣＲＭ１９７への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖コンジュゲートの調製において使用される活性化（図３２Ａ）およびコンジュゲーション（図３２Ｂ）プロセスに関する例示的なプロセスフローダイアグラムを描写する。 図３３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ポリマンナンＯ抗原の反復単位（ＲＵ）の構造を描写する。凡例：三量体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５は同一であり、四量体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９Ａ／クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ａおよび五量体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９／クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３も同様である。生合成酵素配列のレベルでのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３サブタイプの差異は、Ｇｕａｃｈａｌｌａ ＬＭら（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７；７：６６３５）に記載されている。 図３４Ａ～３４Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８免疫血清が侵襲性クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５株に対して殺菌性であることを描写する。凡例：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８ Ｏ抗原 ＣＲＭ１９７コンジュゲートにより惹起されたウサギ免疫血清を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８株（図３４Ａ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５株（図３４Ｂ）を用いる殺菌アッセイにおいて評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８株に対する強力なオプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）活性が、２回のワクチン用量（１５週）後に観察されたが、これは、非コンジュゲート化Ｏ８多糖（Ｏ８－ＯＡｇ）での、またはマッチさせた免疫前血清（週０）での予備吸着後には存在しなかった。同じウサギ免疫血清は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５株に対して抗原特異的血清殺菌活性（ＳＢＡ）を示した。ＢＲＣ－幼若ウサギ補体、ｈＣ － ＩｇＧ／ＩｇＭは、ヒト血清を補体源として枯渇させた。 図３５Ａ～３５Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９ Ｏ抗原免疫血清が侵襲性クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３単離物に対して殺菌性であることを描写する。凡例：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９ａ Ｏ抗原ＣＲＭ１９７コンジュゲートにより惹起されたウサギ免疫血清を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９ａ株（図３５Ａ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ｂ株（図３５Ｂ）を用いるオプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）において評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９株に対するＯＰＡ活性が、２回のワクチン用量（１５週）後に観察されたが、これは、非コンジュゲート化Ｏ９多糖（Ｏ９－ＯＡｇ）での、またはマッチさせた免疫前血清（週０）での予備吸着後には存在しなかった。同じウサギ免疫血清は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ｂ株に対して強力な抗原特異的血清殺菌活性（ＳＢＡ）も示した。ＢＲＣ－幼若ウサギ補体、ｈＣ － ＩｇＧ／ＩｇＭは、ヒト血清を補体源として枯渇させた。
配列識別子
配列番号１は、野生型１型フィムブリエＤ－マンノース特異的アドヘシン［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ Ｊ９６］のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２は、配列番号１のａａ残基２２～３００（成熟ＦｉｍＨタンパク質）に対応するＦｉｍＨの断片のアミノ酸配列を記載する。
配列番号３は、ＦｉｍＨレクチンドメインのアミノ酸配列を記載する。
配列番号４は、ＦｉｍＨピリンドメインのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドのアミノ酸配列（ｐＳＢ０２１９８ － ＦｉｍＨ ｍＩｇＫ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔ ／ Ｆ２２．．Ｑ３００ Ｊ９６ ＦｉｍＨ Ｎ２８Ｓ Ｖ４８Ｃ Ｌ５５Ｃ Ｎ９１Ｓ Ｎ２４９Ｑ ／ ７ ＡＡ ｌｉｎｋｅｒ ／ ＦｉｍＧ Ａ１．．Ｋ１４ ／ ＧＧＨｉｓ８ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１（＋））を記載する。
配列番号６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドのアミノ酸配列（ｐＳＢ０２３０７ － ＦｉｍＨ ｍＩｇＫ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔ ／ Ｆ２２．．Ｑ３００ Ｊ９６ ＦｉｍＨ Ｎ２８Ｓ Ｎ９１Ｓ Ｎ２４９Ｑ ／ Ｈｉｓ８ ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１（＋））を記載する。
配列番号７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドの断片（ｐＳＢ０２０８３ ＦｉｍＨレクチンドメイン野生型構築物）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドの断片（ｐＳＢ０２１５８ ＦｉｍＨレクチンドメインＬｏｃｋ変異体）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＧに由来するポリペプチドの断片（ＦｉｍＧ Ａ１．．Ｋ１４）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドの断片のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１１は、４ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１２は、５ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１３は、６ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１４は、７ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１５は、８ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１６は、９ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１７は、１０ａａリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号１８は、ＦｉｍＨ Ｊ９６シグナル配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号１９は、配列番号５のシグナルペプチドのアミノ酸配列（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のｐＳＢ０２１９８ － ＦｉｍＨ ｍＩｇＫ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔ ／ Ｆ２２．．Ｑ３００ Ｊ９６ ＦｉｍＨ Ｎ２８Ｓ Ｖ４８Ｃ Ｌ５５Ｃ Ｎ９１Ｓ Ｎ２４９Ｑ ／ ７ ＡＡ ｌｉｎｋｅｒ ／ ＦｉｍＧ Ａ１．．Ｋ１４ ／ ＧＧＨｉｓ８）を記載する。
配列番号２０は、配列番号５による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドのアミノ酸配列（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のｐＳＢ０２１９８の成熟タンパク質 － ＦｉｍＨ ｍＩｇＫ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔ ／ Ｆ２２．．Ｑ３００ Ｊ９６ ＦｉｍＨ Ｎ２８Ｓ Ｖ４８Ｃ Ｌ５５Ｃ Ｎ９１Ｓ Ｎ２４９Ｑ ／ ７ ＡＡ ｌｉｎｋｅｒ ／ ＦｉｍＧ Ａ１．．Ｋ１４ ／ ＧＧＨｉｓ８）を記載する。
配列番号２１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＧに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２２は、配列番号６のシグナルペプチドのアミノ酸配列（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のｐＳＢ０２３０７ － ＦｉｍＨ ｍＩｇＫ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔ ／ Ｆ２２．．Ｑ３００ Ｊ９６ ＦｉｍＨ Ｎ２８Ｓ Ｎ９１Ｓ Ｎ２４９Ｑ ／ Ｈｉｓ８）を記載する。
配列番号２３は、配列番号６による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドのアミノ酸配列（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＦｉｍＨ ｍＩｇＫ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔ ／ Ｆ２２．．Ｑ３００ Ｊ９６ ＦｉｍＨ Ｎ２８Ｓ Ｎ９１Ｓ Ｎ２４９Ｑ ／ Ｈｉｓ８の成熟タンパク質）を記載する。
配列番号２４は、配列番号７による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドのアミノ酸配列（ｐＳＢ０２０８３ ＦｉｍＨレクチンドメイン野生型構築物の成熟タンパク質）を記載する。
配列番号２５は、Ｈｉｓタグのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２６は、配列番号８による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドのアミノ酸配列（ｐＳＢ０２１５８ ＦｉｍＨレクチンドメインＬｏｃｋ変異体の成熟タンパク質）を記載する。
配列番号２７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ（ｐＳＢ０１８７８）に由来するポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ（Ｋ１２）に由来するポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨ（ＵＴＩ８９）に由来するポリペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３０は、Ｏ２５ｂ ２４０１ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号３１は、Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号３２は、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号３３は、Ｋ１２ Ｗ３１１０ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号３４は、サルモネラＬＴ２ ＷｚｚＢアミノ酸配列を記載する。
配列番号３５は、Ｏ２５ｂ ２４０１ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号３６は、Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号３７は、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号３８は、Ｏ１５７ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号３９は、サルモネラＬＴ２ ＦｅｐＥアミノ酸配列を記載する。
配列番号４０は、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号４１は、ＬＴ２ｗｚｚＢ＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号４２は、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号４３は、Ｏ２５ｂＦｅｐＥ＿Ａのプライマー配列を記載する。
配列番号４４は、ｗｚｚＢ Ｐ１＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号４５は、ｗｚｚＢ Ｐ２＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号４６は、ｗｚｚＢ Ｐ３＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号４７は、ｗｚｚＢ Ｐ４＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号４８は、Ｏ１５７ ＦｅｐＥ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号４９は、Ｏ１５７ ＦｅｐＥ＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号５０は、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿Ｓのプライマー配列を記載する。
配列番号５１は、ｐＢＡＤ３３＿ａｄａｐｔｏｒ＿ＡＳのプライマー配列を記載する。
配列番号５２は、ＪＵＭＰＳＴＡＲＴ＿ｒのプライマー配列を記載する。
配列番号５３は、ｇｎｄ＿ｆのプライマー配列を記載する。
配列番号５４は、マウスＩｇＫシグナル配列のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５５は、ヒトＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ 大サブユニットｐ５１シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５６は、ヒトＩＬ１０タンパク質シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５７は、ヒト呼吸系発疹ウイルスＡ（Ａ２株）融合糖タンパク質Ｆ０シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５８は、インフルエンザＡ血球凝集素シグナルペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号５９～１０１は、ナノ構造関連ポリペプチドまたはその断片のアミノ酸および核酸配列を記載する。
配列番号１０２～１０９は、シグナルペプチド予測のために使用される様々な種からのシグナルＰ ４．１（ＤＴＵ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）配列を記載する。
発明の詳細な説明
一実施形態では、本発明は、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む糖を含む組成物を提供する。
一態様では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む。別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１に由来する糖をさらに含む。別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２に由来する糖をさらに含む。別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ３に由来する糖をさらに含む。別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ５に由来する糖をさらに含む。別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１に由来する糖およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２に由来する糖をさらに含む。
別の態様では、組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされたクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖；および担体タンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖をさらに含む。
別の態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む。
別の実施形態では、本発明は、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；ならびにＯ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む組成物を提供する。一態様では、組成物は、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む少なくとも１つの糖をさらに含む。
別の態様では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
さらなる態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む。
さらなる実施形態では、本発明は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖；ならびに式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む少なくとも１つの糖を含む組成物を提供する。
一態様では、組成物は、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片をさらに含む。別の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖は、式Ｏ８を含む。別の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖は、式Ｏ９を含む。
さらなる態様では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む。
上記実施形態の一態様では、糖は、担体タンパク質に共有結合する。一態様では、糖は、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む。別の態様では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される。
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法であって、哺乳動物に、上記実施形態およびその態様のいずれか１つによる有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。一態様では、免疫応答は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む。別の態様では、免疫応答は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する。
さらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物においてクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を惹起する方法であって、哺乳動物に、上記実施形態およびその態様のいずれか１つによる有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。一態様では、免疫応答は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む。別の態様では、免疫応答は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染から哺乳動物を保護する。
本発明者らは、発現のための哺乳動物細胞を使用することによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）接着因子タンパク質に由来するポリペプチドの産生の課題を克服した。本開示および実施例のセクションで例示されるように、組換えポリペプチドの哺乳動物細胞発現が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのポリペプチドの発現と比較して高収率を一貫して達成することが発見された。さらに、本発明者らは驚くべきことに、組換えポリペプチドおよびその断片を所望のコンフォメーションで安定化するための突然変異および発現構築物を同定した。
感染の一次段階、すなわち、宿主細胞受容体への細菌の結合および粘膜表面の定着の遮断は、細菌感染の可能性を防止する、処置する、および／または低減するのに重要である。細菌の結合は、接着因子と呼ばれる細菌表面タンパク質と、宿主細胞受容体との相互作用を含んでもよい。ＦｉｍＨ接着因子（尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する）を用いた以前の前臨床試験は、接着因子に対する抗体が惹起されることを確認した。接着因子の同定、特性評価、および単離における進歩は、中耳炎および虫歯から、肺炎および敗血症までの、感染を防止するための努力において必要である。
商業規模でＦｉｍＨおよびその断片などの接着因子タンパク質を生産するためには、ポリペプチドおよびその断片を、長時間にわたって十分な量で、および好ましいコンフォメーションで発現することができるような、好適な構築物および好適な宿主を同定する必要がある。例えば、一部の実施形態では、組換えポリペプチドの好ましいコンフォメーションは、モノマンノースに対する低い親和性（例えば、約３００μＭのＫｄ）を示す。一部の実施形態では、好ましいコンフォメーションは、モノマンノースに対する高い親和性（例えば、１．２μＭ未満のＫｄ）を示す。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する接着因子タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で組換え的に発現されたものである。しかしながら、その収率は、１０ｍｇ／Ｌ未満であった。大量の線毛関連接着因子を精製することは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生される場合、困難であり得る。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される生成物は、哺乳動物において有効な免疫応答を惹起するのに最適なものではないコンフォメーションを示し得ることが示唆された。
一態様では、本発明は、細菌接着因子タンパク質に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞を含む。
別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞中でポリペプチドまたはその断片を産生させるためのプロセスであって、（ｉ）好適な条件下で哺乳動物細胞を培養することによって、前記ポリペプチドまたはその断片を発現させること；および（ｉｉ）培養物から前記ポリペプチドまたはその断片を収集することを含むプロセスを含む。このプロセスは、ポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含んでもよい。また、このプロセスによって産生されるポリペプチドまたはその断片も本明細書に開示される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与にとって好適であるポリペプチドまたはその断片を含んでもよい。例えば、そのような組成物中のポリペプチドまたはその断片は、質量で、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の純度を有してもよい。組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。
さらなる態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導するのに使用するための組成物を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導するための本明細書に記載の組成物の使用および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導するための薬剤の製造における本明細書に記載の組成物の使用も開示される。
Ｉ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドおよびその断片
一態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞を本明細書に開示する。用語「に由来する」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により変更されている、本明細書に記載のとおりのＦｉｍＨポリペプチドもしくはＦｉｍＣＨポリペプチド複合体またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドまたは断片の配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型ＦｉｍＨポリペプチドもしくはＦｉｍＣＨポリペプチド複合体またはその断片と、のアミノ酸の全長が同一である。
断片は、前記配列から少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含むべきであり、特定の配列に応じて、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれ以上）である。好ましくは、断片は、配列からのエピトープを含む。一部の実施形態では、断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドのアミノ酸配列のうちの少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドまたは断片と比較した場合に、１個または複数の非古典的アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片と同様か、または同一の機能を持つ。
好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド複合体またはその断片を単離するか、または精製する。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡに組み込むと、好適な状態で培養する場合に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する前記ポリペプチドまたはその断片が哺乳動物細胞によって発現される。
好ましい一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は可溶性である。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、哺乳動物宿主細胞から分泌される。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端またはＣ末端伸長部などの追加のアミノ酸残基を含んでよい。そのような伸長部は、１つまたは複数のタグを含んでよく、それらは、ポリペプチドまたはその断片の検出（例えば、モノクローナル抗体により検出するためのエピトープタグ）および／または精製（例えば、ニッケルキレート化樹脂での精製を可能にするポリヒスチジンタグ）を促進し得る。一部の実施形態では、タグは、配列番号２１および配列番号２５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。そのようなアフィニティー精製タグは、当業界で公知である。アフィニティー精製タグの例には、例えば、Ｈｉｓタグ（例えば、金属イオンに結合し得るヘキサヒスチジン）、例えば、アミロースに結合し得るマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、例えば、グルタチオンに結合し得るグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、例えば、抗ｆｌａｇ抗体に結合し得るＦＬＡＧタグ、例えば、ストレプトアビジンまたはその誘導体に結合し得るＳｔｒｅｐタグが含まれる。好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端またはＣ末端伸長部などの追加のアミノ酸残基を含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、外因性タグ配列を含まない。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の具体的な株が本明細書において言及されることがあるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、指定がない限り、具体的な株に限定されないことは理解されるべきである。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドのＮ末端にフェニルアラニン残基を含む。一部の実施形態では、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、Ｎ末端の最初の２０残基位置内にフェニルアラニン残基を含む。好ましくは、フェニルアラニン残基は、ポリペプチドの１位に位置する。例えば、一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片のＮ末端に、追加のグリシン残基を含まない。
一部の実施形態では、野生型成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの１位のフェニルアラニン残基は、例えば、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ残基のいずれか１個などの脂肪族疎水性アミノ酸により置き換えられる。
一部の実施形態では、シグナルペプチドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を発現するために使用することができる。タンパク質を生産するためのシグナル配列および発現カセットは当業界で公知である。一般に、リーダーペプチドは、５～３０アミノ酸長であり、典型的には、新たに合成されるポリペプチドのＮ末端に存在する。シグナルペプチドは一般に、単一のアルファ－ヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチ部を含む。加えて、多くのシグナルペプチドは、アミノ酸の短い正の電荷を持つストレッチ部で始まり、これは、転座中に、ポリペプチドの適正なトポロジーを強制するために役立ち得る。シグナルペプチドの末端には、典型的に、シグナルペプチダーゼによって認識され、切断される、アミノ酸のストレッチ部が存在する。シグナルペプチダーゼは、転座の間またはその完了後のいずれかに、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成するように切断することができる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％，または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、切断可能なリンカーを含み得る。そのようなリンカーは、例えば、リンカーを切断することができる作用物質の添加によって、タグを、精製された複合体から分離することを可能にする。切断可能なリンカーは、当業界で公知である。そのようなリンカーは、例えば、感光性結合の照射または酸により触媒される加水分解によって切断され得る。切断可能なリンカーの別の例には、プロテアーゼ認識部位を含み、かつ好適なプロテアーゼ酵素の添加によって切断され得るポリペプチドリンカーが含まれる。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドまたは断片と比較して改変を含む。改変は、ポリペプチドへの分子の共有結合を含み得る。例えば、そのような改変には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などが含まれ得る。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドまたは断片と比較して、限定されるものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、当業者に公知の技法を用いる化学的改変などによる改変を含み得る。別の実施形態では、改変は、ポリペプチドへの脂質分子の共有結合を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片と比較して、ポリペプチドへの分子の共有結合を含まない。
例えば、細胞培養で生産されるタンパク質およびポリペプチドは、オリゴ糖鎖を含む共有結合した炭水化物構造を含む糖タンパク質であってよい。これらのオリゴ糖鎖は、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかを介してタンパク質に結合している。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の質量のかなりの部分を占め得る。一般に、Ｎ結合オリゴ糖は、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの標的コンセンサス配列（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい）内のアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に付加されている。一部の実施形態では、グリコシル化部位は、次のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む：アスパラギン－グリシン－トレオニン（ＮＧＴ）、アスパラギン－イソロイシン－トレオニン（ＮＩＴ）、アスパラギン－グリシン－セリン（ＮＧＳ）、アスパラギン－セリン－トレオニン（ＮＳＴ）、およびアスパラギン－トレオニン－セリン（ＮＴＳ）。哺乳動物細胞において生産される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、グリコシル化されていてよい。グリコシル化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列中のＮ結合グリコシル化シグナルＡｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒで生じていてよい。「Ｎ結合グリコシル化」は、ポリペプチド鎖中のアスパラギン残基へのＧＩｃＮＡｃを介しての炭水化物部分の結合を指す。Ｎ結合炭水化物は、共通のＭａｎ １－６（Ｍａｎ１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ－Ｒコア構造を含む（ここで、Ｒは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する生産されたポリペプチドまたはその断片のアスパラギン残基を表す）。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片中のグリコシル化部位は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列内の突然変異によって除去されている。例えば、一部の実施形態では、グリコシル化モチーフ（Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）のＡｓｎ残基は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、グリコシル化モチーフのＳｅｒ残基は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、グリコシル化モチーフのＴｈｒ残基は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片中のグリコシル化部位（Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒなど）は、除去または改変されていない。一部の実施形態では、グリコシル化を減少させる、または阻害する化合物を細胞培養培地に添加してよい。このような実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとももう１つの非グリコシル化（すなわち、アグリコシル化）部位、すなわち、結合している炭水化物部分を含まない、まったく占有されていないグリカン部位を含むか、またはグリコシル化阻害化合物の非存在下である点以外は同一の条件下の細胞により産生される、それ以外は同一のポリペプチドまたはタンパク質よりも、同じ潜在的なグリコシル化部位において少なくとも１つ少ない炭水化物部分を含む。そのような化合物は当業界で公知であり、それには、限定されるものではないが、ツニカマイシン、ツニカマイシンホモログ、ストレプトビルジン（ｓｔｒｅｐｔｏｖｉｒｕｄｉｎ）、マイコスポシジン（ｍｙｃｏｓｐｏｃｉｄｉｎ）、アンホマイシン（ａｍｐｈｏｍｙｃｉｎ）、ツシマイシン（ｔｓｕｓｈｉｍｙｃｉｎ）、抗生物質２４０１０、抗生物質ＭＭ１９２９０、バシトラシン、コリネトキシン、ショウドマイシン、ジュイマイシン（ｄｕｉｍｙｃｉｎ）、１－デオキシマンノノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、デオキシノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、Ｎ－メチル－１－デオキシマンノジリマイシン（ｄｅｘｏｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、ブレフェルジンＡ、グルコースおよびマンノースアナログ、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、２－デオキシグルコース、Ｄ－（＋）－マンノース、Ｄ－（＋）ガラクトース、２－デオキシ－２－フルオロ－Ｄ－グルコース、１，４－ジデオキシ－１，４－イミノ－Ｄ－マンニトール（ＤＩＭ）、フルオログルコース、フルオロマンノース、ＵＤＰ－２－デオキシグルコース、ＧＤＰ－２－デオキシグルコース、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、２５－ヒドロキシコレステロール、ヒドロキシコレステロール、スワインソニン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、アクチノマイシンＤ、モネンシン、ｍ－クロロカルボニル－シアニドフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、コンパクチン、ドリシル－ホスホリル－デオキシグルコース（ｄｏｌｉｃｈｙｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ＾－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ヒゴキサンチン（ｈｙｇｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、チミジン、コレステロール、グルコサミン、マンノサミン、カスタノスペルミン、グルタミン、ブロモコンデュリトール（ｂｒｏｍｏｃｏｎｄｕｒｉｔｏｌ）、コンデュリトールエポキシド（ｃｏｎｄｕｒｉｔｏｌ
ｅｐｏｘｉｄｅ）およびコンデュリトール誘導体、グリコシルメチル－ｐ－ニトロフェニルトリアゼン、β－ヒドロキシノルバリン、スレオ－β－フルオロアスパラギン、Ｄ－（＋）－グルコン酸δ－ラクトン、リン酸ジ（２－エチルヘキシル）、リン酸トリブチル、リン酸ドデシル、（ジフェニルメチル）－リン酸の２－ジメチルアミノエチルエステル、［２－（ジフェニルホスフィニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムヨージド、ヨードアセテート、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、およびフルオロアセテートが含まれ得る。当業者は、過度の実験を伴わずに、本発明の方法および組成物に従って使用することができるグリコシル化阻害物質を容易に認識するか、または決定することができるであろう。そのような実施形態では、ポリペプチドまたはその断片のグリコシル化は、ポリペプチドまたはその断片にアミノ酸突然変異を導入せずに制御することができる。
一部の実施形態では、哺乳動物細胞によって産生されるポリペプチドまたはその断片のグリコシル化のレベル（例えば、ポリペプチドまたはその断片上で占有されているグリカン部位の数、その部位でのグリコ型のサイズおよび／または複雑性など）は、解糖作用阻害化合物および／または突然変異などを含まない点以外は同一の培地中で、それ以外は同一の条件下で、生産されるポリペプチドまたはその断片のグリコシル化のレベルよりも低い。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合タンパク質グリコシル化の部位を含まない。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合タンパク質グリコシル化の少なくとも１つの部位を含まない。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合タンパク質グリコシル化のいずれの部位も含まない。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合タンパク質グリコシル化のための部位を含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合タンパク質グリコシル化の多くても１つの部位を含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列は、Ｎ結合タンパク質グリコシル化の多くても２つの部位を含む。
異なる細胞系により、またはトランスジェニック動物において発現される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、相互に比較して、異なるグリカン部位占有率、グリコ型および／またはグリコシル化パターンを有し得る。一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞において産生される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片のグリコシル化、グリカン占有率またはグリコ型にかかわらず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を包含する。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドに由来してよく、その際、ポリペプチドの１位のアミノ酸残基は、メチオニンではなく、フェニルアラニンであり、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドのアミノ酸配列の１位にフェニルアラニンを含む。別の好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、好ましくは、その際、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドのアミノ酸配列の１位の残基はフェニルアラニンである。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドに由来し得る配列番号４のアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＧポリペプチドに由来し得る。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣポリペプチドに由来し得る。
Ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドおよびその断片
細菌線毛アドヘシンＦｉｍＨおよびＦｍｌＨは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が特異的な宿主細胞糖タンパク質の認識により別個の尿路微小環境を利用することを可能にする。ＦｉｍＨは、尿路上皮細胞におけるマンノシル化ウロプラキン受容体に結合する一方で、ＦｍｌＨは、腎臓および炎症性膀胱において上皮表面タンパク質上のガラクトースまたはＮ－アセチルガラクトサミンＯ－グリカンに結合する。ＦｉｍＨフィムブリエは、腸管上皮上の高度マンノシル化タンパク質への結合を介して、腸管での腸管毒素産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）および多剤耐性侵襲性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の定着においても役割を果たす。
全長ＦｉｍＨは、２つのドメイン：Ｎ末端レクチンドメインおよびＣ末端ピリンドメインから構成され、それらは、短いリンカーによって接続されている。ＦｉｍＨのレクチンドメインは、尿路上皮細胞表面上のマンノシル化ウロプラキン１ａへの結合を担う炭水化物認識ドメインを含む。ピリンドメインは、後続のＦｉｍＧサブユニットのドナーストランドを介して線毛のコアに固定され、これは、ドナー鎖相補性（ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）と称されるプロセスである。
ＦｉｍＨのレクチンドメインのコンフォメーションおよびリガンド結合特性は、ＦｉｍＨのピリンドメインのアロステリック制御下にある。静的条件下では、全長ＦｉｍＨの２つのドメインの相互作用はレクチンドメインを、浅い結合ポケットによって特徴づけられるモノマンノースへの低親和性（例えば、Ｋｄ≒３００μＭ）状態で安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、中程度の親和性状態をもたらすコンフォメーション変化を誘導し、その際、レクチンおよびピリンドメインは緊密に接触したままである。しかしながら、せん断応力で、レクチンおよびピリンドメインは分離し、それによって、高親和性状態（例えば、Ｋｄ＜１．２μＭ）を誘導する。
ピリンドメインがもたらす負のアロステリック制御の不在により、ＦｉｍＨの単離されたレクチンドメインは高親和性状態でロックされる。高親和性状態でロックされている単離された組換えレクチンドメインは、高い安定性を示す。しかしながら、アドヘシンを低結合コンフォメーションでロックすることで、アドヘシン阻害抗体の産生が誘導される。したがって、レクチンドメインを低親和性状態で安定化することに関心が持たれる。
産物開発に十分な高い収率でＦｉｍＨを発現する方法にも、さらなる関心が持たれる。ＦｉｍＨを含む組成物を開発するための障害は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）周辺質においてその天然状態で発現されるＦｉｍＨで達成される低い収率である。ｌａｂベンチスケールで報告される典型的な収率は、精製ＦｉｍＣＨ複合体で３～５ｍｇ／Ｌ、およびＦｉｍＨ（ＬＤ）で４～１０ｍｇ／Ｌであり、これらは、治験用材料を製造するためにスケーラブルと判断されるレベル未満である。ＦｉｍＨのｉｎ ｖｉｖｏコンフォメーションは、タンパク質の精製組換え型によって達成されるコンフォメーションとは異なる。一般に、ＦｉｍＨは、ＦｉｍＨと、そのＦｉｍＣと呼ばれるペリプラズムシャペロンタンパク質とのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用によって少なくとも部分的に決定される天然のコンフォメーションを有する。
ＦｉｍＨの組換え生産は、依然として困難である。タンパク質発現および精製はルーチン的なプロセスではない。
好ましい一実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、全長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨを含む。全長ＦｉｍＨは、２つのドメイン：Ｎ末端のレクチンドメインおよびＣ末端ピリンドメインを含み、これらは、短いリンカーによって接続されている。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの全長は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの成熟タンパク質の全長を含む２７９のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの全長は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの成熟タンパク質の全長と、２１のアミノ酸長を有するシグナルペプチド配列とを含む３００のアミノ酸を含む。３００のアミノ酸長の野生型ＦｉｍＨの一次構造は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株全体で高度保存されている。
全長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの例示的な配列は配列番号１である。全長ＦｉｍＨ配列は、レクチンドメインのための配列およびピリンドメインのための配列を含む。ＦｉｍＨのレクチンドメインは、尿路上皮細胞表面上のマンノシル化ウロプラキン１ａへの結合を担う炭水化物認識ドメインを含む。ピリンドメインは、後続のＦｉｍＧサブユニットのドナーストランドを介して線毛のコアに固定され、これは、ドナー鎖相補性と称されるプロセスである。
Ｎ末端から始めて、全長ＦｉｍＨのそれぞれのドメインの名称と、括弧内の例示的なアミノ酸配列とは次のとおりである：ＦｉｍＨレクチン（配列番号２）およびＦｉｍＨピリン（配列番号３）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性など、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して様々な程度の同一性を有するバリアントが含まれる。ある特定の実施形態では、ＦｉｍＨバリアントタンパク質は、（ｉ）ＦｉｍＨ－ＦｉｍＣの一部を形成する；（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９から少なくとも１つのエピトープを含む；および／または（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨと免疫学的に交差反応する抗体を惹起し得る。
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つから少なくともｎ個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドを含み、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）である。好ましくは、断片は、それらの配列からエピトープを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つのアミノ酸配列のうちの少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２０に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２６に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２８に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号３０に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に記載の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する好適なポリペプチドおよびその断片の別の例は、野生型Ｎ末端シグナル配列を欠き、かつ配列番号１のアミノ酸残基２２～３００に対応する配列番号２として示される。ＦｉｍＨ断片の別の例は、配列番号１に記載のものなど、Ｎ末端シグナル配列全体および成熟タンパク質を含む。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片中のグリコシル化部位は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の配列内の突然変異によって除去されている。例えば、一部の実施形態では、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドの７位のＡｓｎ残基（例えば、配列番号２のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７位のＡｓｎ残基（例えば、配列番号３のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチド（例えば、配列番号２のナンバリングによる）の１０位のＴｈｒ残基は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７位のＴｈｒ残基（例えば、配列番号３のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのＮ２３５位のＡｓｎ残基（例えば、配列番号２のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのＮ２２８位のＡｓｎ残基（例えば、配列番号２のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドの７０位のＡｓｎ残基（例えば、配列番号２のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７０位のＡｓｎ残基（例えば、配列番号３のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態では、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドの７２位のＳｅｒ残基（例えば、配列番号２のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨポリペプチドのレクチンドメインの７２位のＳｅｒ残基（例えば、配列番号３のナンバリングによる）は、好ましくは置換によって突然変異していてよい。一部の実施形態では、残基の置換は、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎのいずれか１つから選択される。
用語「断片」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指し、そのポリペプチドに固有であるか、または特徴的である所与のポリペプチドの任意の別個の部分と定義される。この用語は、本明細書で使用される場合、全長ポリペプチドの活性の少なくとも画分を保持している所与のポリペプチドの任意の別個の部分も指す。ある特定の実施形態では、保持される活性の画分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。ある特定の実施形態では、保持される活性の画分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。ある特定の実施形態では、保持される活性の画分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。ある特定の実施形態では、保持される活性の画分は、全長ポリペプチドの活性の１００％以上である。一部の実施形態では、断片は、全長ポリペプチドのうちの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上の連続したアミノ酸を含む。
Ｂ．ＦｉｍＨ、ＦｉｍＣ、およびその断片の複合体
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片との複合体として存在する。好ましい一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片は、複合体で、好ましくは、複合体において１：１の比で存在する。理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、全長ＦｉｍＨは、ペリプラズムシャペロンＦｉｍＣにより活性なコンフォメーションで安定化され得、それによって、全長ＦｉｍＨタンパク質を精製することが可能となる。したがって、一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、全長ＦｉｍＨおよび全長ＦｉｍＣを含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨの断片およびＦｉｍＣの断片を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、全長ＦｉｍＨおよびＦｉｍＣの断片を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣの例示的な配列は、配列番号１０に記載されている。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨの複合体形成断片を含む。
ＦｉｍＨの複合体形成断片は、ＦｉｍＣまたはその断片と共に複合体を形成する能力を保持しているＦｉｍＨタンパク質の任意の部分またはポーションであり得る。ＦｉｍＨの好適な複合体形成断片は、同時免疫沈降アッセイ、架橋、または蛍光染色による共局在などの当業界で公知の標準的なアッセイによって得る、または決定することもできる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを使用することもできる（例えば、ＦｉｍＨ断片およびＦｉｍＣまたはその断片が、ゲル電気泳動によって証明されるとおり複合体であることを示すことによって）。ある特定の実施形態では、ＦｉｍＨの複合体形成断片は、（ｉ）ＦｉｍＨ－ＦｉｍＣ複合体の一部を形成する；（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９から少なくとも１つのエピトープを含む；および／または（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨと免疫学的に交差反応する抗体を惹起し得る。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＣと複合体形成しない全長ＦｉｍＨを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＣと複合体形成しないＦｉｍＨの断片を含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片ＦｉｍＣは、配列番号１０を含む。一部の実施形態では、複合体は、同じプラスミドから、好ましくはそれぞれのポリペプチドまたはその断片について別々のプロモーターの制御下で発現され得る。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片の構造に操作により組み込まれていてよい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片に結合する。複合体においてＦｉｍＨに結合しているＦｉｍＣ分子の部分は、「ドナー鎖」と呼ばれ、ＦｉｍＣＨ複合体においてＦｉｍＨに結合しているＦｉｍＣからの鎖を使用する天然ＦｉｍＨ構造の形成の機構は、「ドナー鎖相補」として公知である。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨの適切なドナー鎖相補バージョンによって発現され得、その際、ＦｉｍＣＨ複合体においてＦｉｍＨと相互作用するＦｉｍＣのアミノ酸配列は、それ自体が、ＦｉｍＨのＣ末端において操作により作製されて、ＦｉｍＣ分子の残りの部分が存在することを必要としない天然コンフォメーションを提供する。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、レクチン結合ドメインおよびピリン（ｐｉｌｉｎｇ）ドメインなど、その単離ドメインを含む複合体の形態で発現されてもよく、そのようなドメインは、共有結合または非共有結合で互いに結合していてよい。例えば、一部の実施形態では、結合セグメントは、単一のポリマー構造を含めて、アミノ酸配列または他のオリゴマー構造を含み得る。
本発明の方法および組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する前記ポリペプチドまたはその断片が組み合わされた状態で同時発現または形成される本明細書に記載の複合体を含み得る。
Ｃ．レクチンドメイン、ピリンドメイン、およびそのバリアント
ＦｉｍＨのレクチンドメインのコンフォメーションおよびリガンド結合特性は、ＦｉｍＨのピリンドメインのアロステリック制御下にあり得る。静的条件下では、全長ＦｉｍＨの２つのドメインの相互作用は、レクチンドメインを、浅い結合ポケットによって特徴づけられるモノマンノースへの低親和性（例えば、Ｋｄ≒３００μＭ）状態で安定化させる。マンノシドリガンドへの結合は、中程度の親和性状態をもたらすコンフォメーション変化を誘導し得、その際、レクチンおよびピリンドメインは緊密に接触したままである。しかしながら、せん断応力で、レクチンおよびピリンドメインは分離し、それによって、高親和性状態（例えば、Ｋｄ＜１．２μＭ）を誘導し得る。
ピリンドメインがもたらす負のアロステリック制御の不在により、ＦｉｍＨの単離されたレクチンドメインは高親和性状態（例えば、Ｋｄ＜１．２μＭ）でロックされる。高親和性状態でロックされている単離された組換えレクチンドメイン。しかしながら、アドヘシンを低親和性コンフォメーション（例えば、Ｋｄ≒３００μＭ）でロックすることで、アドヘシン阻害抗体の産生が誘導される。したがって、レクチンドメインを低親和性状態で安定化することに関心が持たれる。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインを含む。レクチンドメインの例示的な配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインはシステイン置換を含む。好ましい一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインは、レクチンドメインの最初の５０個のアミノ酸残基内にシステイン置換を含む。一部の実施形態では、レクチンドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のシステイン置換を含み得る。好ましくは、レクチンドメインは２つのシステイン置換を含む。例えば、ｐＳＢ０２１５８およびｐＳＢ０２１９８を参照されたい。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号３において挙げられた配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性など、配列番号３に対して様々な程度の同一性を有するＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのピリンドメインを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号７に挙げられた配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性など、配列番号７に対して様々な程度の同一性を有するＦｉｍＨピリンドメインバリアントを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号８に挙げられた配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性など、配列番号８に対して様々な程度の同一性を有するＦｉｍＨピリンドメインバリアントを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号８に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのピリンドメインを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号２４に挙げられた配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性など、配列番号２４に対して様々な程度の同一性を有するＦｉｍＨピリンドメインバリアントを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２４に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する他の好適なポリペプチドおよびその断片は、配列番号２６に挙げられた配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性など、配列番号２６に対して様々な程度の同一性を有するＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号２６に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有するポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、組成物は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つから少なくともｎ個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドを含み、その際、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）である。好ましくは、断片は、配列からのエピトープを含む。一部の実施形態では、組成物は、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つのアミノ酸配列のうちの少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨまたはそのホモログもしくはバリアントのレクチンドメインの位置および長さは、その配列と配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号２４、および配列番号２６のいずれか１つとのペアワイズアラインメントに基づき、例えば、ＦｉｍＨのアミノ酸配列を配列番号１とアラインさせ、かつ配列番号１の残基２２～１７９とアラインする配列を同定することによって予測することができる。
Ｄ．野生型Ｎ末端シグナル配列
一部の実施形態では、全長ＦｉｍＨのＮ末端野生型シグナル配列は宿主細胞において切断されて、成熟ＦｉｍＨポリペプチドが生じる。したがって、宿主細胞により発現されるＦｉｍＨは、Ｎ末端シグナル配列を含有しなくてよい。好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、野生型Ｎ末端シグナル配列のためのコード配列を含有しないヌクレオチド配列によってコードされ得る。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、ＦｉｍＨのＦｉｍＨ－ＦｉｍＣ複合体形成断片、Ｎ末端シグナル配列（配列番号１の残基１～２１など）、またはその組合せを含む。ＦｉｍＨの複合体形成断片は、ＦｉｍＣと共に複合体を形成する能力を保持しているＦｉｍＨタンパク質の任意の一部または部分であってよい。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列、レクチンドメイン、およびピリンドメインを含み得る、全長ＦｉｍＨポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の１から２１個の間のアミノ酸残基を欠いていてよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個のアミノ酸残基、または１～２１個の残基、１～２０個の残基、１～１５個の残基、１～１０個の残基、２～２０個の残基、２～１５個の残基、２～１０個の残基、５～２０個の残基、５～１５個の残基、または５～１０個の残基を欠いてよい）。
ＩＩ．核酸
一態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を開示する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードする１つまたは複数の核酸構築物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片のゲノム組込みおよび後続の発現のために使用することができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードする単一の核酸構築物を宿主細胞に導入することができる。あるいは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片のためのコード配列は、２つ以上の核酸構築物によって担持されていてよく、それらが次いで、宿主細胞に同時に、または連続的に導入される。
例えば、例示的な一実施形態では、単一の核酸構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインおよびピリンドメインをコードする。別の例示的な実施形態では、１つの核酸構築物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのレクチンドメインをコードし、第２の核酸構築物がピリンドメインをコードする。一部の実施形態では、ゲノム組込みが達成されている。
核酸構築物は、１つまたは複数のイントロンを含むゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含んでよい。一部の遺伝子は、イントロンが存在する場合に、より効率的に発現される。一部の実施形態では、核酸配列は、前記哺乳動物細胞における外因性ポリペプチドの発現に好適である。
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸は、任意の特定の細胞において発現のレベルを上昇させるように最適化されているコドンである。
一部の実施形態では、核酸構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の分泌を指示するペプチドをコードするシグナル配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片が内因性シグナル配列を含む一部の実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は、宿主細胞においてタンパク質の発現のレベルを上昇させるように最適化されているコドンであり得る。
一部の実施形態では、シグナル配列は、次の長さ：１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０アミノ酸長のいずれか１つである。一部の実施形態では、シグナル配列は、２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、シグナル配列は２１アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片がシグナル配列を含む場合、培養細胞においてポリペプチドまたはその断片の発現のレベルを向上させるために、ポリペプチドと天然に会合している内因性シグナル配列を、野生型ポリペプチドと会合していないシグナル配列と置き換えることができる。したがって、一部の実施形態では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含まない。一部の実施形態では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドの天然シグナル配列を含まない。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくは、シグナル配列である異種ペプチド、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその断片に由来する成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のペプチドと共に発現され得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片は、好ましくはシグナル配列である異種ペプチド（例えば、ＩｇＫシグナル配列）、または成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨタンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する他のペプチドと共に発現され得る。好ましい実施形態では、成熟タンパク質大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨのＮ末端での特異的切断は、成熟大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨタンパク質の最初のフェニルアラニン残基の直前で生じる。選択される異種配列は好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルぺプチダーゼにより切断される）ものである。
好ましい実施形態では、シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列である。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１９のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする。好ましい実施形態では、シグナル配列は、マウスＩｇＫシグナル配列である。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を生産するための好適な哺乳動物発現ベクターは当業界で公知であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）製のｐＳｅｃＴａｇ２発現ベクターなど、市販されていることがある。例示的なマウスＩｇカッパシグナルペプチド配列は、配列ＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号５４）を含む。一部の実施形態では、ベクターは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のｐＢｕｄＣＥ４．１哺乳動物発現ベクターを含む。追加の例示的で好適なベクターには、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１哺乳動物発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が含まれる。
一部の実施形態では、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含まない。
一部の実施形態では、核酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の天然シグナル配列を含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列ではない。一部の実施形態では、シグナル配列は、血球凝集素シグナル配列を含む。
一態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片のコード配列を含むベクターを本明細書において開示する。例示的なベクターは、自律複製し得るか、または哺乳動物細胞において複製し得るプラスミドを含む。典型的な発現ベクターは、発現構築物においてコード配列の発現を調節するために有用である好適なプロモーター、エンハンサー、およびターミネーターを含む。ベクターは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質（アンピシリンまたはネオマイシンなどの抗生物質に対する耐性の付与など）を得るための選択マーカーを含んでもよい。
好適なプロモーターは当業界で公知である。例示的なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス、ＥＦ１ ａ、ＧＡＰＤＨメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターなどが含まれる。プロモーターは、構成的でも、または誘導性プロモーターでもよい。１つまたは複数のベクターを用いることができる（例えば、すべてのサブユニットもしくはドメインもしくはその断片をコードする１つのベクター、またはサブユニットもしくはドメインもしくはその断片を総合してコードする複数のベクター）。
配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および２Ａペプチド配列も用いることができる。ＩＲＥＳおよび２Ａペプチドは、複数の配列の共発現に関して代替のアプローチを提供する。ＩＲＥＳは、タンパク質合成のさらに大きなプロセスのうちの一部分として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の途中での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。通常は、真核生物では、翻訳はｍＲＮＡ分子の５’末端のみで開始することができる。ＩＲＥＳエレメントは、１つの転写物での複数の遺伝子の発現を可能にする。１つの転写物から複数のタンパク質を発現する、ＩＲＥＳに基づくポリシストロン性ベクターは、選択から非発現クローンが漏れることを減少させることができる。２Ａペプチドは、１個のオープンリーディングフレーム中の複数のタンパク質をポリタンパク質へと翻訳することを可能にし、このポリタンパク質は続いて、リボソームをスキップする機構を介して個別のタンパク質へと切断される。２Ａペプチドは、複数のタンパク質生成物のよりバランスの取れた発現を提供することができる。例示的なＩＲＥＳ配列には、例えば、ＥＶ７１ ＩＲＥＳ、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳが含まれる。ゲノム組込みに関して、組込みは、部位特異的であるかまたはランダムであり得る。部位特異的組換えは、本明細書に記載の核酸構築物へと相同性配列を導入することにより実現することができる。そのような相同性配列は、宿主ゲノム中の特異的標的部位での内在性配列と実質的にマッチする。あるいは、ランダムな組込みを用いることができる。ときには、タンパク質の発現レベルは組込み部位に応じて変化することがある。したがって、所望の発現レベルを達成するクローンを特定するために、組換えタンパク質の発現レベルに従って、多数のクローンを選択することが望ましいことがある。
例示的な核酸構築物は、図２Ａ～２Ｔのいずれか１つなど、図面にさらに記載されている。
一態様では、核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
ＩＩＩ．宿主細胞
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードする配列が哺乳動物宿主細胞で発現される細胞に関する。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞で一過性に発現される。別の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれて、好適な条件下で培養されるとき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を発現する。好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、高い効率およびゲノム安定性で発現される。
好適な哺乳動物宿主細胞は当業界で公知である。好ましくは、宿主細胞は、工業的製造スケールでタンパク質を生産するために好適である。例示的な哺乳動物宿主細胞には、次のものおよびその誘導体のいずれか１つが含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞（サル腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞系、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＮＳＯ細胞（マウス骨髄腫細胞系）、およびＣ１２７細胞（非腫瘍発生性マウス細胞系）。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、マウスセルトリ（ＴＭ４）、バッファローラット肝臓（ＢＲＬ ３Ａ）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ）、ラット肝細胞癌（ＨＴＣ）、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）、マウスハイブリドーマ（Ｓｐ２／０）、マウス胸腺腫（ＥＬ４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＣＨＯ細胞誘導体、マウス胚性（ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３ Ｌｉ）、ラット心筋（Ｈ９ｃ２）、マウス筋原細胞（Ｃ２Ｃ１２）、およびマウス腎臓（ｍｉＭＣＤ－３）が含まれる。哺乳動物細胞系のさらなる例には、ＮＳ０／１、Ｓｐ２／０、Ｈｅｐ Ｇ２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＯＳ－７、ＴＭ４、ＣＶ１、ＶＥＲＯ－７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、ＭＭＴ ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、およびＦＳ４が含まれる。
細胞培養が可能ないずれの細胞も、本発明に従って用いることができる。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞の非限定的例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、Ｃｒｕ細胞、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児由来腎臓系（２９３細胞または懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングさせた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３～２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４～６８、１９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれる。一部の好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞は、ＧＳ細胞である。
加えて、任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞系を本発明に従って用いることができる。用語「ハイブリドーマ」は、本明細書で使用される場合、不死化細胞および抗体産生細胞の融合から生じる細胞または後代の細胞を指す。そのように得られたハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作製するために使用される個々の細胞は、限定されるものではないが、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびヒトを含む、任意の哺乳動物源由来であってよい。一部の実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞系との間の融合の産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合の後代がその後、形質細胞と融合するときに生じるトリオーマ細胞系である。一部の実施形態では、ハイブリドーマは、例えば、クアドローマなど、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞系である（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３０５３、１９８３を参照されたい）。当業者は、ハイブリドーマ細胞系が異なる栄養要件を有し得、かつ／または最適な増殖のために異なる培養条件を要求し得ることが分かるであろうし、必要に応じて、条件を改変することができるであろう。
一部の実施形態では、細胞は、第１の目的遺伝子を含み、その際、第１の目的遺伝子は、染色体組込みされている。一部の実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、目的の遺伝子（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコード）、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、治療目的の遺伝子は、難発現（ＤｔＥ）タンパク質をコードする遺伝子を含む。
一部の実施形態では、第１の目的遺伝子は、部位特異的組込み（ＳＳＩ）哺乳動物細胞における２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）の間に位置し、その際、２つのＲＴＳは、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている。例えば、ＮＬ１遺伝子座、ＮＬ２遺伝子座、ＮＬ３遺伝子座、ＮＬ４遺伝子座、ＮＬ５遺伝子座、およびＮＬ６遺伝子座の記載については、米国特許出願第２０２００００２７２７号を参照されたい。一部の実施形態では、第１の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座内に位置する。一部の実施形態では、細胞は、第２の目的遺伝子を含み、その際、第２の目的遺伝子は染色体組込みされている。一部の実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、治療目的の遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。一部の実施形態では、第２の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内に位置する。一部の実施形態では、第１の目的遺伝子はＮＬ１遺伝子座内に位置し、第２の目的遺伝子はＮＬ２遺伝子座内に位置する。一部の実施形態では、細胞は、第３の目的遺伝子を含み、その際、第３の目的遺伝子は染色体組込みされている。一部の実施形態では、第３の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、治療目的の遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、第３の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。一部の実施形態では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内に位置する。一部の実施形態では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１遺伝子座およびＮＬ２遺伝子座とは別個の遺伝子座内に位置する。一部の実施形態では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子、および第３の目的遺伝子は、３つの別々の遺伝子座内にある。一部の実施形態では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子、および第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ１遺伝子座内にあり、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子、および第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ２遺伝子座内にある。一部の実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。一部の実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は染色体組込みされている。
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、その際、細胞は、（ａ）ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳ；（ｂ）レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に組み込まれている第１の目的遺伝子；（ｃ）およびレポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、（ａ）の遺伝子座とは別個の第２の染色体遺伝子座内に組み込まれた第２の目的遺伝子を含む。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、その際、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳ；（ｂ）ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳ；（ｃ）レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子座内で染色体組込みされている第１の目的遺伝子；および（ｄ）レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片など）をコードする遺伝子、従属遺伝子、またはそれらの組合せを含む、（ｂ）のＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている第２の目的の遺伝子を含む。
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも６つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、その際、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳおよび第１の目的遺伝子；（ｂ）ＮＬ１遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳおよび第２の目的遺伝子；および（ｃ）ＮＬ２遺伝子座内で染色体組込みされている少なくとも２つの別個のＲＴＳおよび第３の目的遺伝子を含む。
本明細書において言及される場合、用語「作動可能な組み合わせで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結された」は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示し得る核酸分子が産生されるような手法での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能性タンパク質が産生されるような手法でのアミノ酸配列の連結を指す。一部の実施形態では、目的遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されていて、その際、目的遺伝子は、宿主細胞に染色体組込みされている。一部の実施形態では、目的遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており；その際、目的遺伝子は、宿主細胞に染色体組込みされている。一部の実施形態では、従属遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、従属遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の実施形態では、従属遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており；その際、従属遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の実施形態では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の実施形態では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、その際、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞に染色体組込みされている。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされている。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされていない。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されており、その際、リコンビナーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされていない。
本明細書において言及される場合、用語「染色体組込みされている」または「染色体組込み」は、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞の染色体への核酸配列の安定な組込み、すなわち、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に染色体組込みされた核酸配列を指す。一部の実施形態では、染色体組込みされている核酸配列は安定している。一部の実施形態では、染色体組込みされている核酸配列は、プラスミドまたはベクター上に位置しない。一部の実施形態では、染色体組込みされている核酸配列は切除されない。一部の実施形態では、染色体組込みは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ；ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子編集システム（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ）により媒介される。
一部の実施形態では、宿主細胞は、懸濁培養での増殖に好適である。懸濁適合性（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）宿主細胞は、一般的に単分散であるか、または実質的な凝集をせずに緩やかな凝集体で増殖する。懸濁適合性宿主細胞には、適合化または操作なしで懸濁培養に好適である細胞（例えば、造血細胞、リンパ系細胞）および接着依存性細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）の改変または適合化により懸濁適合性となっている細胞が含まれる。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の発現レベルまたは活性は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞などの細菌細胞における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の発現と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍上昇する。
本明細書に記載の宿主細胞は、大規模培養に好適である。例えば、細胞培養は、１０Ｌ、３０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ、４０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ以上であってよい。一部の実施形態では、細胞培養サイズは、１０Ｌ～５０００Ｌ、１０Ｌ～１０，０００Ｌ、１０Ｌ～２０，０００Ｌ、１０Ｌ～５０，０００Ｌ、４０Ｌ～５０，０００Ｌ、１００Ｌ～５０，０００Ｌ、５００Ｌ～５０，０００Ｌ、１０００Ｌ～５０，０００Ｌ、２０００Ｌ～５０，０００Ｌ、３０００Ｌ～５０，０００Ｌ、４０００Ｌ～５０，０００Ｌ、４５００Ｌ～５０，０００Ｌ、１０００Ｌ～１０，０００Ｌ、１０００Ｌ～２０，０００Ｌ、１０００Ｌ～２５，０００Ｌ、１０００Ｌ～３０，０００Ｌ、１５Ｌ～２０００Ｌ、４０Ｌ～１０００Ｌ、１００Ｌ～５００Ｌ、２００Ｌ～４００Ｌ、またはこれらの間の任意の整数の範囲であってよい。細胞培養のための培地成分は当業界で公知であり、例えば、緩衝剤、アミノ酸含分、ビタミン含分、塩含分、無機塩含分、血清含分、炭素源含分、脂質含分、核酸含分、ホルモン含分、微量元素含分、アンモニア含分、補因子含分、指示薬含分、低分子含分、加水分解物含分および酵素調節剤含分を含んでよい。
用語「培地」、「細胞培養培地」および「培養培地」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物細胞の増殖を助成する栄養素を含有する溶液を指す。典型的には、そのような溶液は、最小限の増殖および／または生存のために細胞が必要とする必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を提供する。そのような溶液は、限定されるものではないが、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（ナトリウム、クロリド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物（例えば、鉄）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースまたは他のエネルギー源を含む、最小限の割合を超えて増殖および／または生存を増強する補充成分を含有してもよい。一部の実施形態では、培地を有利には、細胞生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に配合する。一部の実施形態では、培地は、細胞培養の開始後に添加される供給培地である。
一部の実施形態では、細胞を、培地の成分が分かっており、制御もされている様々な化学的に規定された培地の１つで増殖させることができる。一部の実施形態では、細胞を、培地の成分のすべてが分かっているわけではなく、および／または制御されてるわけではない複雑な培地で増殖させることができる。哺乳動物細胞を培養するための化学的に規定された増殖培地は、広く開発されており、直近数十年にわたって公開されている。規定された培地のすべての成分が十分に特徴づけられており、そのように規定された培地は、血清または加水分解物などの複雑な添加剤を含有しない。初期の培地配合物は、タンパク質生産に関する懸念をほとんど、またはまったく伴わずに細胞増殖および生存維持を可能にするように開発された。最近では、培地配合物は、高増殖性組換えタンパク質産生細胞の培養を支持することを明白な目的として開発されている。そのような培地が、本発明の方法において使用するために好ましい。そのような培地は一般に、高密度での細胞の増殖および／または維持を支持する多量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要な場合には、本発明の方法で使用するために、これらの培地を当業者は改変することができる。例えば、当業者は、本明細書に開示のとおりの方法で基礎培地または供給培地として使用するために、これらの培地中のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび／またはメチオニンの量を減少させることができる。
複雑な培地のすべての成分が十分に特徴付けられているわけではなく、そのような複雑な培地は、単純および／または複雑な炭素源、単純および／または複雑な窒素源、および血清などの添加剤を特に含有し得る。一部の実施形態では、本発明に好適な複雑な培地は、本明細書に記載のとおりの規定培地の他の成分に加えて、加水分解物などの添加剤を含有する。一部の実施形態では、既定の培地は典型的には、およそ５０種の化学的実体を水中に既知の濃度で含む。それらの多くが、インスリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリンまたはＢＳＡなどの１種または複数の十分に特徴づけられているタンパク質も含有するが、他のものは、タンパク質成分を必要とせず、したがって、タンパク質非含有規定培地と称される。培地の典型的な化学的成分は、５つの広いカテゴリーに該当する：アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、および簡潔に分類することができない種々雑多なカテゴリー。
細胞培養培地は任意選択で、補充成分を補充されていてよい。用語「補充成分」は、本明細書で使用される場合、限定されるものではないが、ホルモンおよび／または他の増殖因子、特定のイオン（ナトリウム、クロリド、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、微量元素（非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースまたは他のエネルギー源を含む、最小限の割合を超えて増殖および/または生存を増強する成分を指す。一部の実施形態では、補充成分を、当初の細胞培養物に添加することができる。一部の実施形態では、補充成分を、細胞培養を開始した後に添加することができる。典型的には、微量元素は、マイクロモルまたはそれより低いレベルで含まれる様々な無機塩を指す。例えば、一般的に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。一部の実施形態では、鉄（第一鉄または第二塩）が微量元素として、当初細胞培養培地中にマイクロモル濃度で含まれてよい。微量元素のうち、マンガンも多くの場合に、二価カチオン（ＭｎＣｌ２またはＭｎＳＯ４）としてナノモルからマイクロモル濃度の範囲で含まれる。多数の、あまり一般的ではない微量元素が通常、ナノモル濃度で添加される。
一部の実施形態では、本発明の方法で使用される培地は、細胞培養において、例えば、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬまたは５×１０８細胞／ｍＬなどの高い細胞密度を支持するために好適な培地である。一部の実施形態では、細胞培養は、哺乳動物細胞流加培養、好ましくは、ＣＨＯ細胞流加培養である。
一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間、または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、チロシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間、または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、トリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間、または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、メチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間、または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ロイシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間、または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、セリンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、トレオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、グリシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの２つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニンおよびチロシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニンおよびトリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、チロシンおよびトリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、チロシンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの３つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの４つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの５つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの６つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンのうちの７つを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、トレオニンおよびグリシンを、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１から２ｍＭの間、０．１から１ｍＭの間、０．５から１．５ｍＭの間または０．５から１ｍＭの間の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３種を、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭ超の濃度でさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうちの少なくとも５種を、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭ超の濃度でさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンを、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭ超の濃度でさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９種を、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭ超の濃度でさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンのうちの少なくとも５種を、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭ超の濃度でさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメートおよびアスパラギンを、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、好ましくは２ｍＭの濃度でさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、セリンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ超の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、バリンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ超の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、システインを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ超の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、イソロイシンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ超の濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ロイシンを、３ｍＭ、５ｍＭ、７ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭまたは２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ超の濃度で含む。一部の実施形態では、上の細胞培養培地は、本明細書に開示のとおりの方法において使用するためのものである。一部の実施形態では、上の細胞培養培地を、本明細書に開示のとおりの方法において、基礎培地として使用する。一部の実施形態では、上の細胞培養培地を、本明細書に開示のとおりの方法において、供給培地として使用する。
ＩＶ．生産方法
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を生産する方法を含む。前記方法は、好適な条件下で哺乳動物細胞を培養し、それによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を発現させることを含む。前記方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を培養物から収集することをさらに含み得る。そのプロセスは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含んでよい。
一部の実施形態では、前記方法は、ポリペプチドまたはその断片を０．１ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌとの収率で生産する。
一部の実施形態では、細胞を、バッチまたは加流培養で増殖させることができるが、その際、培養を、ポリペプチドの十分な発現の後に停止し、その後、発現したポリペプチドを収集し、かつ任意選択で精製する。一部の実施形態では、細胞を、潅流培養で増殖させることができ、その際、培養は停止させず、新たな栄養素および他の成分を定期的に、または連続的に、培養物に添加し、その間に、発現したポリペプチドを定期的または連続的に収集する。
一部の実施形態では、細胞を、体積が数ミリリットルから数リットルの範囲の小規模反応容器内で増殖させることができる。一部の実施形態では、細胞を、体積がおよそ少なくとも１リットルから１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上の範囲であるか、またはそれらの間の任意の体積の大規模商業用バイオリアクター内で増殖させることができる。
細胞培養の温度は主に、細胞培養が依然として実行可能であり、高レベルのポリペプチドが産生される温度の範囲、代謝廃棄産物の産生または蓄積が最小化される温度、および／または実行者によって重要と考えられるこれらまたは他の因子の任意の組合せに基づき選択されることとなる。１つの非限定的例として、ＣＨＯ細胞は、およそ３７℃で良好に増殖して、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生する。一般に、大部分の哺乳動物細胞は、約２５℃～４２℃の範囲内で良好に増殖し、および／または高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生し得るが、本開示が教示する方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃から４０℃の範囲内で良好に増殖し、および／または高レベルのタンパク質またはポリペプチドを産生し得る。ある特定の実施形態では、細胞培養物は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度で、細胞培養プロセス中に１倍または複数倍に増殖する。
用語「培養物」および「細胞培養物」は、本明細書で使用される場合、細胞集団の生存および／または増殖に好適な条件下で培地中に懸濁されている細胞集団を指す。当業界において通常の技能を有する者には明らかであろうとおり、一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で使用される場合、細胞集団と、その集団が懸濁される培地とを含む組合せを指す。一部の実施形態では、細胞培養の細胞は、哺乳動物細胞を含む。
本発明は、所望のプロセス（例えば、組換えタンパク質（例えば、抗体）の生産に適用可能である任意の細胞培養方法で使用することができる。非限定的例として、細胞を、バッチまたは加流培養で増殖させることができるが、その際、培養を、組換えタンパク質（例えば、抗体）の十分な発現の後に停止し、その後、発現したタンパク質（例えば、抗体）を収集する。あるいは、別の非限定的例として、細胞を、バッチ再供給（ｂａｔｃｈ－ｒｅｆｅｅｄ）で増殖させることができ、その際、培養を停止させず、新たな栄養素および他の成分を培養物に定期的または連続的に添加し、その間に、発現された組換えタンパク質（例えば、抗体）を、定期的または連続的に収集する。他の好適な方法（例えば、スピンチューブ培養）が、当業界で公知であり、本発明を実施するために使用することができる。
一部の実施形態では、本発明に好適な細胞培養は、加流培養である。用語「加流培養」は、本明細書で使用される場合、培養プロセスの開始後に、追加の成分が１回または複数回供給される、細胞を培養する方法を指す。そのような供給成分は典型的には、培養プロセス中に枯渇する細胞のための栄養成分を含む。加流培養は典型的には、複数の時点で停止させて、培地中の細胞および／または成分を収集して、任意選択で精製する。一部の実施形態では、加流培養は、供給培地を補充された基礎培地を含む。
細胞を、実行者によって選択される任意の便利な体積で増殖させることができる。例えば、細胞を、体積が数ミリリットルから数リットルの範囲の小規模反応容器内で増殖させることができる。あるいは、細胞を、体積がおよそ少なくとも１リットルから１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５０００、２００００または２５０００リットル以上の範囲であるか、またはそれらの間の任意の体積の大規模商業用バイオリアクター内で増殖させることができる。
細胞培養の温度は主に、細胞培養が依然として実行可能である温度範囲、および高レベルの所望の産物（例えば、組換えタンパク質）が産生される温度の範囲に基づき選択されることとなる。一般に、大部分の哺乳動物細胞は、約２５℃～４２℃の範囲内で良好に増殖し、および／または所望の産物（例えば、組換えタンパク質）を産生し得るが、本開示が教示する方法は、これらの温度に限定されない。ある特定の哺乳動物細胞は、約３５℃から４０℃の範囲内で良好に増殖し、および／または所望の産物（例えば、組換えタンパク質または抗体）を産生し得る。ある特定の実施形態では、細胞培養物は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度で、細胞培養プロセス中に１倍または複数倍に増殖する。当業界において通常の技能を有する者は、好適な温度、または細胞の特定の必要性および実行者の特定の生産要求に応じて、細胞を増殖させるために温度を選択することができるであろう。細胞は、実行者の必要性および細胞自体の要求に応じて、任意の時間量にわたって増殖させることができる。一部の実施形態では、細胞を、３７℃で増殖させる。一部の実施形態では、細胞を３６．５℃で増殖させる。
一部の実施形態では、細胞を、初期増殖相（または増殖相）中に、実行者の必要性および細胞自体の要求に応じて、より多い、または少ない時間量にわたって増殖させることができる。一部の実施形態では、細胞を、予め規定された細胞密度を達成するために十分な期間にわたって増殖させる。一部の実施形態では、妨害せずに増殖させたら細胞が最終的に達するであろう最大細胞密度に対する所与のパーセンテージである細胞密度を達成するために十分な期間にわたって、細胞を増殖させる。例えば、最大細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの所望の生細胞密度を達成するために十分な期間にわたって、細胞を増殖させることができる。一部の実施形態では、細胞密度が培養１日あたり１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％を超えて上昇しなくなるまで、細胞を増殖させる。一部の実施形態では、細胞密度が培養１日あたり５％を超えて上昇しなくなるまで、細胞を増殖させる。
一部の実施形態では、細胞を規定の期間にわたって増殖させる。例えば、細胞培養の出発濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、細胞を０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日以上、好ましくは４～１０日増殖させる。場合によっては、細胞を１カ月以上増殖させることができる。本発明の実行者は、タンパク質生産要求および細胞自体の要求に応じて、初期増殖相の期間を選択することができるであろう。
酸素化および細胞への栄養素の分散を増加させるために、細胞培養物を初期培養相の間に撹拌または振盪することができる。本発明では、当業者は、限定されるものではないが、ｐＨ、温度、酸素化などを含めて、初期増殖相中のバイオリアクターのある特定の内部条件を制御または調節することが有利であり得ることを理解するであろう。
初期増殖相の終了時に、第２セットの培養条件を適用して、その培養物で代謝シフトが生じるように、培養条件の少なくとも１つをシフトさせることができる。代謝シフトは、例えば、細胞培養物の温度、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度または化学的誘導レベルの変化によって達成することができる。１つの非限定的実施形態では、培養物の温度をシフトさせることによって、培養条件をシフトさせる。しかしながら、当業界で公知であるとおり、温度のシフトは、好適な代謝シフトが達成され得る唯一の機構ではない。例えば、そのような代謝シフトは、限定されるものではないが、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度、および酪酸ナトリウムレベルを含む他の培養条件をシフトさせることによっても達成することもできる。培養シフトのタイミングは、タンパク質生産要求および細胞自体の要求に基づき、本発明の実行者によって決定されるであろう。
培養物の温度をシフトさせる場合、温度シフトは、比較的段階的であってよい。例えば、温度変化を完了するには、数時間または数日かかってよい。あるいは、温度シフトは比較的突然であってよい。例えば、温度変化を、数時間未満で完了してよい。ポリペプチドまたはタンパク質の商業的大規模生産において標準であるような好適な生産および制御装置を考慮すると、温度変化は１時間未満内でも完了し得る。
一部の実施形態では、細胞培養の条件が上に論述したとおりにシフトしたら、細胞培養物をその後の増殖相にわたって、細胞培養物の存続および生存の助けとなり、商業的に適切なレベルでの所望のポリペプチドまたはタンパク質の発現に好適な第２セットの培養条件下で維持する。
上に論述したとおり、限定されるものではないが、温度、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度、および酪酸ナトリウムレベルを含むいくつかの培養条件のうちの１つまたは複数をシフトさせることによって、培養物をシフトさせることができる。一部の実施形態では、培養物の温度をシフトさせる。この実施形態では、後続の増殖相中に、培養物を初期増殖相の温度または温度範囲よりも低い温度または温度範囲で維持する。上に論述したとおり、細胞密度または生存度を上昇させるために、または組換えタンパク質の発現を増大させるために、複数の別個の温度シフトを使用することができる。
一部の実施形態では、所望の細胞密度または生産力価が達成されるまで、細胞を後続の産生相で維持することができる。別の本発明の実施形態では、細胞を後続の産生相中に、既定の期間にわたって増殖させる。例えば、後続の増殖相の出発時での細胞培養物の濃度、細胞を増殖させる温度、および細胞の固有の増殖速度に応じて、細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日以上増殖させることができる。場合によっては、細胞を１か月以上増殖させることができる。本発明の実行者は、後続の産生相の期間を、ポリペプチドまたはタンパク質生産要求および細胞自体の必要性に応じて選択することができるであろう。
酸素化および細胞への栄養素の分散を増加させるために、細胞培養物を後続の産生相の間に撹拌または振盪することができる。本発明では、当業者は、限定されるものではないが、ｐＨ、温度、酸素化などを含めて、後続の増殖相中のバイオリアクターのある特定の内部条件を制御または調節することが有利であり得ることを理解するであろう。
一部の実施形態では、細胞は、組換えタンパク質を発現し、本発明の細胞培養方法は、増殖相および産生相を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示の方法のいずれかのステップ（ｉｉ）を細胞培養方法全体で適用する。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法のいずれかのステップ（ｉｉ）を細胞培養方法の一部で適用する。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）を、所定の生細胞密度が得られるまで適用する。
一部の実施形態では、本発明の細胞培養方法は増殖相および産生相を含み、ステップ（ｉｉ）は増殖相の間に適用される。一部の実施形態では、本発明の細胞培養方法は増殖相および産生相を含み、ステップ（ｉｉ）は増殖相の部分の間に適用される。一部の実施形態では、本発明の細胞培養方法は増殖相および産生相を含み、ステップ（ｉｉ）は増殖相および産生相の間に適用される。
本明細書に開示の方法のいずれかのステップ（ｉｉ）では、用語「維持すること」は、全培養プロセス（収集まで）で、または例えば、増殖相、増殖相の一部などの培養プロセスの一部で、または所定の細胞密度が得られるまで、アミノ酸またはＣ１もしくはＣ２未満の代謝産物の濃度を維持することを指し得る。
上述の方法のいずれかの一部の実施形態では、細胞増殖および／または生産性が対照培養と比較して上昇しており、その際、前記対照培養は、ステップ（ｉｉ）を含まないことを除いて、同一である。
上述の方法のいずれかの一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞増殖を向上させるための方法である。一部の実施形態では、本発明の方法は、高密度細胞培養において高い細胞密度で、細胞増殖を向上させるための方法である。
高い細胞密度は、本明細書で使用される場合、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬまたは５×１０８細胞／ｍＬを超える、好ましくは、１×１０７細胞／ｍＬを超える、より好ましくは、５×１０７細胞／ｍＬを超える細胞密度を指す。
一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞培養において細胞増殖を向上させるための方法であり、その際、細胞密度は、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬまたは５×１０８細胞／ｍＬを超える。一部の実施形態では、本発明の方法は、細胞培養において細胞増殖を向上させるための方法であり、その際、最大細胞密度は、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬまたは５×１０８細胞／ｍＬを超える。
一部の実施形態では、細胞増殖を、生細胞密度（ＶＣＤ）、最大生細胞密度、または積算生細胞密度（ＩＶＣＣ）によって決定する。一部の実施形態では、細胞増殖を最大生細胞密度によって決定する。
用語「生細胞密度」は、本明細書で使用される場合、培地の所与の体積中に存在する細胞の数を指す。生細胞密度は、当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。好ましくは、生細胞密度を、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ（登録商標）などの自動細胞カウンターを使用して測定する。最大細胞密度という用語は、本明細書で使用される場合、細胞培養中に達成される最大細胞密度を指す。用語「細胞生存率」は、本明細書で使用される場合、培養中の細胞が培養条件または実験変動の所与のセットの下で生存する可能性を指す。当業界において通常の技能を有する者は、細胞生存率を決定するための多くの方法のいずれかが本発明に包含されることを認めるであろう。例えば、細胞生存率を決定するために、生細胞の膜は通過しないが、死細胞または死にかけの細胞の破壊された膜は通過し得る色素（例えば、トリパンブルー）を使用することができる。
用語「積算生細胞数（ＩＶＣＣ）」は、本明細書で使用される場合、生細胞密度（ＶＣＤ）曲線下の面積を指す。ＩＶＣＣは、次の式：ＩＶＣＣｔ＋１＝ＩＶＣＣｔ＋（ＶＣＤｔ＋ＶＣＤｔ＋１）×（Δｔ）／２を使用して計算することができ、式中、Δｔは、ｔとｔ＋１時点との間の時間差である。ＩＶＣＣｔ＝０は、無視可能と仮定することができる。ＶＣＤｔおよびＶＣＤｔ＋１は、ｔおよびｔ＋１時点での生細胞密度である。
用語「力価」は、本明細書で使用される場合、例えば、所与の量の培地体積において細胞培養によって産生される組換えで発現されたタンパク質の全量を指す。力価は典型的には、培地１リットルあたりのタンパク質のグラム単位で表される。
一部の実施形態では、細胞増殖は、対照培養と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％上昇する。一部の実施形態では、細胞増殖は、対照培養と比較して、少なくとも１０％上昇する。一部の実施形態では、細胞増殖は、対照培養と比較して、少なくとも２０％上昇する。
一部の実施形態では、生産率は、力価および／または体積生産率によって決定される。
用語「力価」は、本明細書で使用される場合、例えば、所与の量の培地体積で細胞培養によって生産される組換えで発現されたタンパク質の全量を指す。力価は典型的には、培地１リットルあたりのタンパク質のグラム単位で表される。
一部の実施形態では、生産率は力価によって決定される。一部の実施形態では、生産率は、対照培養と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％上昇する。一部の実施形態では、生産率は、対照培養と比較して、少なくとも１０％上昇する。一部の実施形態では、生産率は、対照培養と比較して、少なくとも２０％上昇する。
一部の実施形態では、細胞培養の最大細胞密度は、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬまたは５×１０８細胞／ｍＬよりも高い。一部の実施形態では、細胞培養の最大細胞密度は、５×１０６細胞／ｍＬよりも高い。一部の実施形態では、細胞培養の最大細胞密度は、１×１０８細胞／ｍＬよりも高い。
Ｖ．精製
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を精製するための方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を単離すること、および／または精製することを含む。一部の実施形態では、発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は培地に分泌され、したがって、細胞および他の固体を遠心分離および／または濾過によって除去することができる。
本明細書に記載の方法に従って生産される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を宿主細胞から収集し、任意の好適な方法を使用して精製することができる。ポリペプチドまたはその断片を精製するための好適な方法には、沈殿、ならびに疎水性相互作用、イオン交換、アフィニティー、キレート化、およびサイズ排除などの様々な種類のクロマトグラフィーが含まれ、それらはすべて、当業界で公知である。好適な精製スキームは、これらの、または他の好適な方法の２つ以上を含んでもよい。一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の１つまたは複数は、エピトープタグまたはＨＩＳタグ、Ｓｔｒｅｐタグなどの精製を容易にする「タグ」を含んでよい。そのようなタグ付きポリペプチドは好都合には、キレート化クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、馴化培地から精製することができる。任意選択で、タグ配列を精製後に切断することができる。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、アフィニティー精製のためのタグを含んでよい。アフィニティー精製タグは当業界で公知である。例には、例えば、Ｈｉｓタグ（金属イオンに結合）、抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（アミロースに結合）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（グルタチオンに結合）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ（ストレプトアビジンまたはその誘導体に結合）が含まれる。
好ましい一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片は、精製タグを含まない。
一部の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の収量は、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｍｇ／Ｌである。
一部の実施形態では、培養は、サイズが少なくとも約１０リットル、例えば、少なくとも約１０Ｌ、少なくとも約２０Ｌ、少なくとも約３０Ｌ、少なくとも約４０Ｌ、少なくとも約５０Ｌ、少なくとも約６０Ｌ、少なくとも約７０Ｌ、少なくとも約８０Ｌ、少なくとも約９０Ｌ、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約１５０Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約２５０Ｌ、少なくとも約３００Ｌ、少なくとも約４００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約６００Ｌ、少なくとも約７００Ｌ、少なくとも約８００Ｌ、少なくとも約９００Ｌ、少なくとも約１０００Ｌ、少なくとも約２０００Ｌ、少なくとも約３０００Ｌ、少なくとも約４０００Ｌ、少なくとも約５０００Ｌ、少なくとも約６０００Ｌ、少なくとも約１０，０００Ｌ、少なくとも約１５，０００Ｌ、少なくとも約２０，０００Ｌ、少なくとも約２５，０００Ｌ、少なくとも約３０，０００Ｌ、少なくとも約３５，０００Ｌ、少なくとも約４０，０００Ｌ、少なくとも約４５，０００Ｌ、少なくとも約５０，０００Ｌ、少なくとも約５５，０００Ｌ、少なくとも約６０，０００Ｌ、少なくとも約６５，０００Ｌ、少なくとも約７０，０００Ｌ、少なくとも約７５，０００Ｌ、少なくとも約８０，０００Ｌ、少なくとも約８５，０００Ｌ、少なくとも約９０，０００Ｌ、少なくとも約９５，０００Ｌ、少なくとも約１００，０００Ｌなどの体積である。
ＶＩ．組成物および製剤
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の病原種に対する免疫を付与し得る、抗体を含む免疫応答を惹起する。
一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を唯一の抗原として含む。一部の実施形態では、組成物はコンジュゲートを含まない。
一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片および追加の抗原を含む。一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片および追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原を含む。一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの糖コンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来する。
一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片を含む。
一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＣに由来するポリペプチドまたはその断片を含む。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および糖を含む組成物を含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中で、ｎは、１～１００の整数である）のいずれかから選択される構造を含む。
一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される１つまたは複数のクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれらに由来する１種または複数の糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５の１つまたは複数からの、またはそれらに由来する糖、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のそれぞれからの、またはそれらに由来する糖を含む。
一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型のいずれか１つに由来する糖の組合せを含む。例えば、一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖を含む。好ましい一実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされており；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に開示の糖のいずれか１つを含む。好ましい実施形態では、組成物は、本明細書に開示のコンジュゲートのいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、好ましくは血清型Ｏ２５ｂからの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１、好ましくは血清型Ｏ１ａからの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２からの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６からの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。
一実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも２つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される少なくとも３つの糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、次の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６、好ましくは、Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６のそれぞれからの糖コンジュゲートを含む。
好ましい一実施形態では、上の組成物のいずれかの糖コンジュゲートは個別に、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。
したがって、一部の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。好ましい一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１つよりも多いより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。例えば、前記組成物は、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型（または「ｖ」、価数）から１２の異なる血清型（１２ｖ）からのＯ抗原を含み得る。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および３つの異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１２の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１３の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１４の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１５の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１６の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１７の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１８の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および１９の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および２０の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。
好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖の数は、１種の血清型（または「ｖ」、価数）から２６種の異なる血清型（２６ｖ）までの範囲であってよい。一実施形態では、１種の血清型が存在する。一実施形態では、２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、６種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、７種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、８種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、９種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１０種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１１種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１６種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１７種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１８種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、１９種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２０種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２１種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２２種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２３種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２４種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２５種の異なる血清型が存在する。一実施形態では、２６種の異なる血清型が存在する。糖を担体タンパク質にコンジュゲートして、本明細書に記載の糖コンジュゲートを形成させる。
一態様では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清群からのＯ抗原を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１つよりも多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片からのＯ抗原；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１２の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１３の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１４の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１５の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１６の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１７の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１８の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１９の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ抗原が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２０の異なる血清型に由来するＯ抗原を含む。
別の態様では、組成物は、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい一実施形態では、組成物は、１つよりも多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、前記組成物は、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含み得る。一実施形態では、組成物は、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１２の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１３の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１４の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１５の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１６の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１７の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１８の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、１９の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、２０の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。
好ましい一実施形態では、組成物は、Ｏ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１つよりも多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、前記組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含んでよい。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１２の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１３の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１４の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１５の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１６の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１７の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１８の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、１９の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされた、２０の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。
最も好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含み、その際、Ｏ多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖は、Ｏ抗原およびコア糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１種より多い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。例えば、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型から１２の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のＯ多糖を含み得る。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、４種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、８種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、９種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１１種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１２種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１３種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１４種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１５種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１６種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１７種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１８種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、１９種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのＯ多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原とコア糖とを含む、２０種の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。好ましい一実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
別の好ましい実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ多糖が式Ｏ２５ａ（式中、ｎは、少なくとも４０である）およびコア糖を含む、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているＯ多糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ６（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。
別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１７（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１５（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１８Ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ７５（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ４（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１６（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１３（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ７（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。
別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ８（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ８（式中、ｎは、１～２０、好ましくは２～５、より好ましくは３である）を含む。式Ｏ８は、例えば、図１０Ｂにおいて示されている。別の実施形態では、組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ９（式中、ｎは少なくとも４０である）と、コア糖とを含むＯ多糖をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ９（式中、ｎは、１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）を含む。式Ｏ９は、例えば、図１０Ｂにおいて示されている。別の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ９ａ（式中、ｎは、１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）を含む。式Ｏ９ａは、例えば、図１０Ｂにおいて示されている。
一部の実施形態では、Ｏ多糖は、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～２０、好ましくは４～８、より好ましくは５である）のいずれか１つから選択される。例えば、図１０Ｂを参照されたい。
前記のとおり、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびコンジュゲートされているＯ多糖（抗原）の任意の組合せを含み得る。１つの例示的な実施形態では、組成物は、式Ｏ２５ｂを含む多糖、式Ｏ１Ａを含む多糖、式Ｏ２を含む多糖、および式Ｏ６を含む多糖を含む。より具体的には、そのような組成物は、（ｉ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖；（ｉｉ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ１ａ（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖；（ｉｉｉ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ２（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖；および（ｉｖ）ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＯ多糖であって、式Ｏ６（式中、ｎは少なくとも４０である）とコア糖とを含むＯ多糖を含む。
一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ２５ａではない、いずれかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する少なくとも１つのＯ多糖を含む。例えば、一実施形態では、組成物は、式Ｏ２５ａを含む糖を含まない。そのような組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂを含むＯ多糖、式Ｏ１Ａを含むＯ多糖、式Ｏ２を含むＯ多糖、および式Ｏ６を含むＯ多糖を含み得る。
一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、２つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、３つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、４つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、５つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、６つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、７つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、８つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、９つの異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１１の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１２の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１３の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１４の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１５の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１６の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１７の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１８の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、１９の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。一実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；およびそれぞれのＯ多糖がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、Ｏ多糖がＯ抗原およびコア糖を含む、２０の異なる血清型に由来するＯ多糖を含む。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが１５±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが１７±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが５５±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが５１±２である式Ｏ２５ｂを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ２５Ｂに対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂを殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂに対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが３９±２である式Ｏ１ａを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが１３±２である式Ｏ１ａを含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａ多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ１Ａに対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａを殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａに対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが４３±２である式Ｏ２を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが４７±２である式Ｏ２を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、糖が、ｎが１７±２である式Ｏ２を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、糖が、ｎが１８±２である式Ｏ２を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ２に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが４２±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および糖が、ｎが５０±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、糖が、ｎが１７±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、糖が、ｎが１８±２である式Ｏ６を含む、担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含む組成物に関する。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される場合、少なくとも０．２ｐｇ／ｍｌ、０．３ｐｇ／ｍｌ、０．３５ｐｇ／ｍｌ、０．４ｐｇ／ｍｌまたは０．５ｐｇ／ｍｌの濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６多糖に結合することができる。したがって、本発明の免疫原性組成物を用いた免疫前および免疫後の血清のＯＰＡ活性の比較を行い、血清型Ｏ６に対するそれらの応答について比較して、応答者の増加の可能性を評価することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいてＩｇＧ抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６を殺傷することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトにおいて機能的抗体を惹起し、前記抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用アッセイによって決定される場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６を殺傷することができる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を増大させる。一実施形態では、免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも５０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食作用性殺傷アッセイによって決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の対象において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する少なくとも１：８の力価を惹起する。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対する応答者（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＯＰＡによって決定された場合、少なくとも１：８の力価を有する血清を有する個体）の割合を有意に増大させる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫前の集団と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６に対するヒト対象のＯＰＡ力価を有意に増大させる。
一態様では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片；および担体タンパク質に共有結合されている糖を含むコンジュゲートを含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア糖部分をさらに含む。一実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア糖部分をさらに含む。別の実施形態では、糖は、ＫＤＯ部分をさらに含む。好ましくは、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、コンジュゲートは、単一末端結合コンジュゲーションによって調製される。一実施形態では、コンジュゲートは、好ましくはＤＭＳＯ緩衝剤中での還元的アミノ化化学反応によって調製される。一実施形態では、糖は、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされる。好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む。一実施形態では、組成物は、それぞれのコンジュゲートが担体タンパク質に共有結合した糖を含み、糖が前記式のいずれか１つから選択される構造を含む、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９のさらなるコンジュゲートから、最大でも３０のさらなるコンジュゲートをさらに含む。
Ａ．糖
一実施形態では、糖は、糖のサイズを制御するために、異なるＷｚｚタンパク質（例えば、ＷｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）によって産生される。
本明細書で使用される場合、用語「糖」は、単一の糖部分または単糖単位ならびに二糖、オリゴ糖、および多糖を形成するように共有結合した２つ以上の単一の糖部分または単糖単位の組合せを指す。糖は、線状または分枝状であってもよい。
一実施形態では、糖は、組換えグラム陰性細菌中で産生される。一実施形態では、糖は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で産生される。一実施形態では、糖は、組換えサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞中で産生される。例示的な細菌としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤ５５９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２８３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８９６、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ１９０２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａ ＥＴＣ ＮＲ－５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ－、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ＣＶＤ１９４３、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＣＶＤ１９２５、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型パラティフィ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）Ａ ＣＶＤ１９０２、およびシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＣＶＤ１２０８Ｓが挙げられる。一実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１ではない。糖産生に対するこの遺伝的手法は、ワクチン成分としてのＯ多糖およびＯ抗原分子の効率的な産生を可能にする。
本明細書で使用される用語「ｗｚｚタンパク質」とは、例えば、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２などの、鎖長決定因子ポリペプチドを指す。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｅ４９９１／７６についてはＡＦ０１１９１０、Ｆ１８６についてはＡＦ０１１９１１、Ｍ７０／１－１についてはＡＦ０１１９１２、７９／３１１についてはＡＦ０１１９１３、Ｂｉ７５０９－４１についてはＡＦ０１１９１４、Ｃ６６４－１９９２についてはＡＦ０１１９１５、Ｃ２５８－９４についてはＡＦ０１１９１６、Ｃ７２２－８９についてはＡＦ０１１９１７、およびＥＤＬ９３３についてはＡＦ０１１９１９である。Ｇ７およびＢｉ３１６－４１ ｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれ、Ｕ３９３０５およびＵ３９３０６である。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するさらなるＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４５９５８１；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ ＦｅｐＥについてはＡＩＧ６６８５９；サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４６１０２４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４１６５３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４１５１１９である。好ましい実施形態では、ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つ、最も好ましくは、ｗｚｚＢ、より好ましくは、ｆｅｐＥである。
例示的なｗｚｚＢ配列は、配列番号３０～３４に記載の配列を含む。例示的なＦｅｐＥ配列は、配列番号３５～３９に記載の配列を含む。
一部の実施形態では、改変された糖（対応する野生型糖と比較して改変されている）を、グラム陰性細菌中でグラム陰性細菌からｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｆｅｐＥ）を発現させる（必ずしも過剰発現させない）ことによって、および／または第２のｗｚｚ遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）のスイッチを切って（すなわち、抑制して、欠失させて、除去して）、中間の、もしくは長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成することによって産生させることができる。例えば、改変された糖を、ｗｚｚ２を発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚ１のスイッチを切ることによって産生させることができる。または、別の方法では、改変された糖を、ｗｚｚｆｅｐＥを発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚＢのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｗｚｚＢを発現させる（必ず祖も過剰発現させない）が、ｗｚｚｆｅｐＥのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｆｅｐＥを発現させることによって産生させることができる。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、宿主細胞にとって異種である株に由来する。
一部の実施形態では、糖は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つに対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって産生される。一実施形態においては、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つから選択される配列を含む。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、糖は、ｆｅｐＥタンパク質に対して少なくとも３０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることによって産生される。
一態様では、本発明は、グラム陰性細菌中で、ｗｚｚファミリータンパク質、好ましくは、ｆｅｐＥを発現させて、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させることによって産生される糖に関する。一態様では、本発明は、グラム陰性細菌から、対応する野生型Ｏ抗原と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、短い、または中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させるように、培養物中でｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現するものではない）グラム陰性細菌によって産生される糖に関する。対応する野生型糖と比較して、反復単位の数が増加したさらなる例示的な糖については、以下のＯ多糖およびＯ抗原の記載を参照されたい。望ましい鎖長は、所与のワクチン構築物との関連で改善された、または最大の免疫原性をもたらすものである。
別の実施形態では、糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２４を参照されたい。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、実施例１３に記載されるような、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明は、内因性ｗｚｚ Ｏ抗原長調節因子の遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）が欠失し、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にとって異種のグラム陰性細菌に由来する（第２の）ｗｚｚ遺伝子（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ）で置き換えられ、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成する、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で産生される糖に関する。一部の実施形態では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、好ましくは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するｗｚｚ遺伝子を含む。他の実施形態では、本発明は、ｗｚｚＢによって調節されるＯ抗原を発現するすべての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に適用可能である。一態様では、ホモポリマーのマンナンからなるＯ抗原を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８およびＯ９株は、この実施形態では生産されず、それというのも、それらは、ＬＰＳの鎖長調節および外膜への輸送について異なる機構を用いるためである（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００９；２８４：３０６６２～７２；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２；２８７：３５０７８～９１；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１４；１１１：６４０７～１２）。さらなる実施形態では、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）血清型Ｏ１およびＯ２のホモポリマーのガラクタン多糖が、この実施形態に記載の方法により生産される。
一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法は、当業界で公知である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。
一態様では、組換え宿主細胞は、炭素源を含む培地中で培養される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための炭素源は、当業界で公知である。例示的な炭素源としては、限定されるものではないが、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルベート、スクシネートおよびメチルアミンなどの、糖アルコール、ポリオール、アルドール糖またはケト糖が挙げられる。好ましい実施形態では、培地は、グルコースを含む。一部の実施形態では、培地は、炭素源として、ポリオールまたはアルドール糖、例えば、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースおよびアラビノースを含む。培養を開始する前に、全ての炭素源を培地に添加するか、または培養中に少しずつ、もしくは連続的に添加してもよい。
組換え宿主細胞のための例示的な培養培地は、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む。好ましくは、培地は、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏを含む。
本明細書で使用される培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）または天然であってよく、組換え宿主細胞の培養のための十分な栄養素を含んでもよい。好ましくは、培地は、液体培地である。
一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、微量栄養素をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、増殖因子をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、さらなる炭素源をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および追加炭素源をさらに含んでもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するのに好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補助炭素源は、当業界で公知である。
一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ－Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、さらなる成分を含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ－Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、そのようなさらなる成分を含まない。
好適な補助炭素源の実例としては、限定されるものではないが、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解物、セルロース加水分解物および糖蜜などの他の炭水化物；酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸などの有機酸；ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトールなどのアルコールが挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、窒素源をさらに含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための好適な窒素源は、当業界で公知である。好適な窒素源の実例としては、限定されるものではないが、アンモニアガスおよび水性アンモニアを含むアンモニア；塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムなどの無機または有機酸のアンモニウム塩；尿素；硝酸または亜硝酸塩、および純粋な、または未精製の調製物としてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解物、コーン浸出液、カゼイン加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、ドライイースト、エタノール－酵母蒸留物、大豆粉、綿実粉などを含む、他の窒素含有材料が挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、無機塩を含む。好適な無機塩の実例としては、限定されるものではないが、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素、ならびにリン酸の塩が挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、好適な増殖因子を含む。好適な微量栄養素、増殖因子などの実例としては、限定されるものではないが、純粋な、もしくは部分的に精製された化合物として、または天然材料中に存在するものとしての、コエンザイムＡ、パントテン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ－６，８－チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ１２、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、アデニン、ウラシル、グアニン、チミンおよびシトシンなどの塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ－またはｒ－アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロアセテートなどが挙げられる。当業者であれば、当業界で公知の方法および技術に従って、経験的にその量を決定することができる。
別の実施形態では、本明細書に記載の改変された糖（対応する野生型糖と比較した場合）は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成的に生産される。糖の合成的生産または合成は、費用および時間集約的な生産プロセスの回避を容易にし得る。一実施形態では、糖は、例えば、逐次的グリコシル化戦略または逐次的グリコシル化戦略と、好適に保護された単糖中間体からの［３＋２］ブロック合成戦略との組合せを使用するなどによって合成される。例えば、チオールグリコシドおよびグリコシルトリクロロアセトイミデート誘導体を、グリコシル化におけるグリコシルドナーとして使用することができる。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される糖は、上記のｗｚｚファミリータンパク質の操作などの組換え手段によって産生される糖と同一の構造を有する。
産生される糖（組換えまたは合成手段による）は、例えば、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型：Ｏ１（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、およびＯ１Ｃ）、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４（例えば、Ｏ４：Ｋ５２およびＯ４：Ｋ６）、Ｏ５（例えば、Ｏ５ａｂおよびＯ５ａｃ（１８０／Ｃ３株））、Ｏ６（例えば、Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５およびＯ６：Ｋ５４）、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８（例えば、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８ａｃ、Ｏ１８Ａ１、Ｏ１８Ｂ、およびＯ１８Ｂ１）、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３（例えば、Ｏ２３Ａ）、Ｏ２４、Ｏ２５（例えば、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ）、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５（例えば、Ｏ４５およびＯ４５ｒｅｌ）、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３（例えば、Ｏ７３（７３－１株））、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のうちのいずれか１つを含む、任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する構造を含む。
個々の多糖は、典型的には、例えば、透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、および／またはカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）などの当業界で公知の方法によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。好ましくは、多糖は、接線流濾過を含む方法によって精製される。
精製された多糖を活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応することができるようにし（例えば、担体タンパク質に直接的に、またはｅＴＥＣスペーサーなどのリンカーを介して）、次いで、本明細書にさらに記載されるように、本発明の糖コンジュゲートに組み入れることができる。
１つの好ましい実施形態では、本発明の糖は、血清型がＯ２５ａである、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２５ｂである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１８Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ４である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１３である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ８である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ９である。
本明細書で使用される場合、上記の血清型のいずれかに対する参照は、当業界で公知であり、対応する血清型にとって独特である、反復単位構造（以下に記載されるようなＯ単位）を包含する血清型を指す。例えば、用語「Ｏ２５ａ」血清型（当業界では血清型「Ｏ２５」としても公知である）は、表１に示される式Ｏ２５を包含する血清型を指す。別の例として、用語「Ｏ２５ｂ」血清型とは、表１に示される式Ｏ２５ｂを包含する血清型を指す。
本明細書で使用される場合、血清型は、別途特定されない限り、例えば、式「Ｏ１８」という用語が、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１を包含すると一般的に指すように、本明細書で一般的に称される。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ１」とは、それぞれ、表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つなどの、表１に記載の式名に総称「Ｏ１」を含む式の種を包含することを一般的に指す。したがって、「Ｏ１血清型」とは、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ６」とは、それぞれ、表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つなどの、表１に記載の式名に総称「Ｏ６」を含む式の種を一般的に指す。したがって、「Ｏ６血清型」とは、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。
表１に記載の式名中に総称を含む式の種を一般的に指す用語の他の例としては、「Ｏ４」、「Ｏ５」、「Ｏ１８」、および「Ｏ４５」を含む。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ２」とは、表１に示される式Ｏ２を指す。用語「Ｏ２ Ｏ抗原」とは、表１に示される式Ｏ２を包含する糖を指す。
本明細書で使用される場合、上記の血清型に由来するＯ抗原に対する参照は、対応する血清型名と共に標識された式を包含する糖を指す。例えば、用語「Ｏ２５Ｂ Ｏ抗原」とは、表１に示される式Ｏ２５Ｂを包含する糖を指す。
別の例として、用語「Ｏ１ Ｏ抗原」は、それぞれ表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃなどの、用語「Ｏ１」を含む式を包含する糖を一般的に指す。
別の例として、用語「Ｏ６ Ｏ抗原」は、それぞれ表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；式Ｏ６：Ｋ１３；式Ｏ６：Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４などの、用語「Ｏ６」を含む式を包含する糖を一般的に指す。
Ｂ．Ｏ多糖
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ多糖」とは、その構造が全細胞またはリピドＡを含まないという条件で、Ｏ抗原を含む任意の構造を指す。例えば、一実施形態では、Ｏ多糖は、リピドＡが結合していないリポ多糖を含む。リピドＡを除去するステップは当業界で公知であり、例として、酸を添加する熱処理を含む。例示的なプロセスは、１００℃で９０分間の１％酢酸による処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドＡを単離するプロセスと組み合わされる。リピドＡを単離するための例示的プロセスとしては、超遠心分離が挙げられる。
一実施形態では、Ｏ多糖とは、Ｏ抗原からなる構造を指し、その場合、Ｏ多糖は、Ｏ抗原という用語と同義である。１つの好ましい実施形態では、Ｏ多糖とは、コア糖を含まない、Ｏ抗原の反復単位を含む構造を指す。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。別の好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原と、コア糖とを含む構造を指す。別の実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原、コア糖、およびＫＤＯ部分を含む構造を指す。
ＬＰＳから、コアオリゴ糖を含むＯ多糖を精製する方法は、当業界で公知である。例えば、ＬＰＳの精製後、精製されたＬＰＳを、１００℃で９０分間にわたって１％（ｖ／ｖ）酢酸中で加熱することによって加水分解した後、４℃で５時間にわたって１４２，０００ｘｇで超遠心分離することができる。Ｏ多糖を含有する上清を凍結乾燥し、４℃で保存する。ある特定の実施形態では、Ｏ多糖の単純な精製を可能にするための莢膜合成遺伝子の欠失が記載される。
Ｏ多糖を、限定されるものではないが、ＬＰＳからリピドＡを除去するための弱酸加水分解を含む方法によって単離することができる。他の実施形態は、Ｏ多糖調製のための薬剤としてヒドラジンの使用を含んでもよい。ＬＰＳの調製を、当業界で公知の方法によって達成することができる。
ある特定の実施形態では、Ｗｚｚタンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現しない）野生型、改変された、または弱毒化されたグラム陰性細菌株から精製されたＯ多糖が、コンジュゲートワクチンにおける使用のために提供される。好ましい実施形態では、Ｏ多糖鎖は、コンジュゲートまたは複合体化ワクチンとしてのワクチン抗原としての使用のためにｗｚｚタンパク質を発現する（必ずしも過剰発現しない）グラム陰性細菌株から精製される。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、６０倍、６１倍、６２倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、１００倍以上増加した分子量を有する。好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１倍かつ最大でも５倍増加した分子量を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２倍かつ最大でも４倍増加した分子量を有する。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量の増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｋＤａ以上増加した分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも1ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加した分子量を有する。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２１ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも９０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも８５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも６０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも５０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４９ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４８ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４７ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４６ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４４ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４３ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４２ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４１ｋＤａ増加している。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量のそのような増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。例えば、表２１を参照されたい。
別の実施形態では、Ｏ多糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、Ｏ多糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２１を参照されたい。
Ｃ．Ｏ抗原
Ｏ抗原は、グラム陰性細菌の外膜中のリポ多糖（ＬＰＳ）の一部である。Ｏ抗原は、細胞表面上にあり、可変性細胞構成要素である。Ｏ抗原の可変性は、グラム陰性細菌の血清型決定のための基礎を提供する。現在の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型決定スキームは、Ｏ多糖１～１８１を含む。
Ｏ抗原は、オリゴ糖反復単位（Ｏ単位）を含み、その野生型構造は、通常、広範囲の糖に由来する２～８個の残基を含有する。例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のＯ単位は、表１に示され、図９Ａ～９Ｃおよび図１０Ａ～１０Ｂも参照されたい。
一実施形態では、本発明の糖は、１個のオリゴ糖単位であってもよい。一実施形態では、本発明の糖は、関連する血清型の１つの反復オリゴ糖単位である。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含んでもよい。
一実施形態では、本発明の糖は、オリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、少数の反復単位（典型的には、５～１５の反復単位）を有し、典型的には、合成的に、または多糖の加水分解によって誘導される。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含んでもよい。
好ましくは、本発明の、および本発明の免疫原性組成物中の全ての糖は、多糖である。高分子量の多糖は、抗原性表面上に存在するエピトープのため、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量の多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物および方法における使用のために企図される。
一部の実施形態では、それぞれ個々のＯ抗原ポリマー中の反復Ｏ単位の数（したがって、ポリマー鎖の長さおよび分子量）は、ｗｚｚ鎖長調節因子、内膜タンパク質に依存する。異なるｗｚｚタンパク質は、異なる範囲のモード長（４～１００超の反復単位）をもたらす。用語「モード長」とは、反復Ｏ単位の数を指す。グラム陰性細菌は、一方は長く、一方は短い、２つの異なるＯＡｇモード鎖長をもたらす２つの異なるＷｚｚタンパク質を有することが多い。グラム陰性細菌中でのｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）は、ある特定の長さ範囲のＯ抗原の細菌産生にシフトさせる、もしくは偏らせる、および高収率の高分子量リポ多糖の産生を増強させる、Ｏ抗原長の操作を可能にし得る。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「短い」モード長とは、少数、例えば、１～２０の反復Ｏ単位を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「長い」モード長とは、２０より大きく、最大で４０までの反復Ｏ単位の数を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「非常に長い」モード長とは、４０より大きい反復Ｏ単位を指す。
一実施形態では、産生される糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１０反復単位、１５反復単位、２０反復単位、２５反復単位、３０反復単位、３５反復単位、４０反復単位、４５反復単位、５０反復単位、５５反復単位、６０反復単位、６５反復単位、７０反復単位、７５反復単位、８０反復単位、８５反復単位、９０反復単位、９５反復単位、または１００反復単位の増加を有する。
別の実施形態では、本発明の糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。例えば、表２１を参照されたい。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、実施例１３に記載されるような、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
糖中の反復単位の数を決定する方法も、当業界で公知である。例えば、多糖の分子量（コア糖またはＫＤＯ残基の分子量を含まない）を、反復単位の分子量（すなわち、式内のそれぞれの単糖の分子量の和として理論的に算出することができる、例えば、表１に示される対応する式中の構造の分子量）で除算することによって、反復単位の数（または式中の「ｎ」）を算出することができる。式内のそれぞれの単糖の分子量は、当業界で公知である。例えば、式Ｏ２５ｂの反復単位の分子量は、約８６２Ｄａである。例えば、式Ｏ１ａの反復単位の分子量は、約８４５Ｄａである。例えば、式Ｏ２の反復単位の分子量は、約８２９Ｄａである。例えば、式Ｏ６の反復単位の分子量は、約８９３Ｄａである。コンジュゲート中の反復単位の数を決定する場合、担体タンパク質の分子量およびタンパク質：多糖比を考慮に入れる。本明細書で定義される場合、「ｎ」とは、多糖分子中の反復単位の数（表１中で括弧内に示される）を指す。当業界で公知のように、生体高分子中で、反復構造は、例えば、失われる分枝などの、不完全な反復の領域が組み入れられていてもよい。さらに、細菌などの天然供給源から単離および精製された多糖は、サイズおよび分枝において不均一であり得ることが当業界で公知である。そのような場合、ｎは、集団中の分子のｎに関する平均値または中央値を表してもよい。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、Ｏ抗原の少なくとも１の反復単位の増加を有する。Ｏ抗原の反復単位は、表１に示される。一実施形態では、Ｏ多糖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の合計反復単位を含む。好ましくは、糖は、合計で少なくとも３から、最大でも８０の反復単位を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。
一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式（例えば、表１に示される式など（図９Ａ～９Ｃおよび図１０Ａ～１０Ｂも参照されたい））のいずれかにおけるｎが、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である、Ｏ抗原を含む。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１～最大でも１０００；少なくとも１０～最大でも５００；および少なくとも２０～最大でも８０、好ましくは、最大でも９０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１～最大でも９０である。好ましい実施形態では、ｎは、４０～９０、より好ましくは、６０～８５である。
一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎが少なくとも１であり、最大でも２００である、Ｏ抗原を含む。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１００であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも４０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも９０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも８５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも６０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも５０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４９である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４８である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４７である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４６である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３６であり、最大でも４５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３７であり、最大でも４４である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３８であり、最大でも４３である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４２である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４１である。
例えば、一実施形態では、糖におけるｎは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０、最も好ましくは４０である。別の実施形態では、ｎは、少なくとも３５～最大でも６０である。例えば、一実施形態では、ｎは、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０のいずれか１つ、好ましくは５０である。別の好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも５５～最大でも７５である。例えば、一実施形態では、ｎは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９、最も好ましくは６０である。
糖構造を、例えば、１Ｄ、１Ｈ、および／もしくは１３Ｃを含むＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの、当業界で公知の方法および手段によって決定することができる。
一部の実施形態では、コンジュゲーション前の精製された多糖は、５ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、糖は、１０ｋＤａ～４００ｋＤａ；５ｋＤａ～４００ｋＤａ；５ｋＤａ～３００ｋＤａ；５ｋＤａ～２００ｋＤａ；５ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～７５ｋＤａ；１０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１０ｋＤａ～４０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～２００ｋＤａ；１５ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１２ｋＤａ～１２０ｋＤａ；１２ｋＤａ～７５ｋＤａ；１２ｋＤａ～５０ｋＤａ；１２～６０ｋＤａ；３５ｋＤａ～７５ｋＤａ；４０ｋＤａ～６０ｋＤａ；３５ｋＤａ～６０ｋＤａ；２０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１２ｋＤａ～２０ｋＤａ；または２０ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、多糖は、７ｋＤａ～１５ｋＤａ；８ｋＤａ～１６ｋＤａ；９ｋＤａ～２５ｋＤａ；１０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１０ｋＤａ～６０ｋＤａ；１０ｋＤａ～７０ｋＤａ；１０ｋＤａ～１６０ｋＤａ；１５ｋＤａ～６００ｋＤａ；２０ｋＤａ～１０００ｋＤａ；２０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２０ｋＤａ～４００ｋＤａ；３０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３０ｋＤａ～６０ｋＤａ；３０ｋＤａ～５０ｋＤａまたは５ｋＤａ～６０ｋＤａの分子量を有する。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
本明細書で使用される場合、多糖または担体タンパク質－多糖コンジュゲートの用語「分子量」とは、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出される分子量を指す。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけることができる。機械的または化学的サイジングを用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。機械的サイジングを、高圧ホモジェナイゼーション剪断を使用して行うことができる。上記の分子量範囲は、コンジュゲーション前（例えば、活性化前）の精製された多糖を指す。
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Figure 0007597974000002
Figure 0007597974000003
Figure 0007597974000004
Figure 0007597974000005
Figure 0007597974000006
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Ｄ．コアオリゴ糖
コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ中のリピドＡとＯ抗原外側領域との間に位置する。より具体的には、コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＯ抗原とリピドＡとの間に結合を含む多糖の部分である。この結合は、最深部の３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基のヘミケタール機能と、リピドＡのＧｌｃＮＡｃ残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株間で高い類似度を示す。それは通常、限られた数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域と、外側コア領域とを含む。
より具体的には、内側コアは、主にＬ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース（ヘプトース）およびＫＤＯ残基から構成される。内側コアは、高度に保存されている。ＫＤＯ残基は、以下の式ＫＤＯ：
Figure 0007597974000010
 を含む。
コアオリゴ糖の外側領域は、内側コア領域よりも大きな変化を示し、この領域の差異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における５つのケモタイプ：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＫ－１２を区別する。５つの既知のケモタイプの外側コアオリゴ糖の炭水化物骨格の一般構造を例示する図２４を参照されたい。ＨｅｐＩＩは、内側コアオリゴ糖の最後の残基である。外側コアオリゴ糖は全て、（ヘキソース）３炭水化物骨格および２つの側鎖残基と共に、構造テーマを共有するが、骨格中のヘキソースの順序ならびに側鎖残基の性質、位置、および結合は全て変化し得る。Ｒ１およびＲ４外側コアオリゴ糖の構造は、非常に類似しており、単一のβ結合残基においてのみ異なっている。
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコアオリゴ糖は、遠位オリゴ糖の構造に基づいて、当業界では５つの異なるケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に分類される。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも２つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも３つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも４つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、５つ全部のコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。
別の好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含まない糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、そのような組成物は、Ｏ多糖を有する糖コンジュゲートがコアオリゴ糖を含まないにも拘わらず、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型は、５つのケモタイプの１つに従って特徴付けることができる。表２は、ケモタイプに従って特徴付けられる例示的な血清型を列挙する。太字の血清型は、示されたコアケモタイプと最も一般的に関連する血清型を表す。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、それぞれの対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のいずれか１つに対する免疫応答を含む、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。
Figure 0007597974000011
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ８、式Ｏ１８、式Ｏ９、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１～１００である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図２４に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ１８、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、糖中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２１、式Ｏ４４、式Ｏ１１、式Ｏ８９、式Ｏ１６２、および式Ｏ９（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ２ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図２４に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１５、式Ｏ１５３、式Ｏ２１、式Ｏ１７、式Ｏ１１、式Ｏ１５９、式Ｏ２２、式Ｏ８６、および式Ｏ９３（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ３ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図２４に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ８６、式Ｏ７、式Ｏ１０２、式Ｏ１６０、および式Ｏ１６６（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される、Ｒ４ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図２４に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、Ｋ－１２ケモタイプ（例えば、式Ｏ２５ｂを有する糖および式Ｏ１６（式中、ｎは１～１００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５である）を有する糖から選択される）を有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、例えば、図２４に示される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、糖は、コア糖を含む。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、糖は、コア糖を含まない。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。
Ｅ．コンジュゲート化Ｏ抗原
Ｏ抗原、または好ましくはＯ多糖の、タンパク質担体への化学的結合は、Ｏ抗原またはＯ多糖の免疫原性を改善し得る。しかしながら、ポリマーサイズの可変性が、生産に関する現実的課題である。商業的使用では、糖のサイズは、様々なコンジュゲーション合成戦略、製品の均一性、およびコンジュゲートの免疫原性との適合性に影響し得る。Ｏ抗原合成経路の操作によるＷｚｚファミリータンパク質鎖長調節因子の発現の制御は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む種々のグラム陰性細菌株における所望の長さのＯ抗原鎖の産生を可能にする。
一実施形態では、精製された糖は、担体タンパク質と反応することができる活性化された糖を産生するように化学的に活性化される。活性化されたら、それぞれの糖は、担体タンパク質に別々にコンジュゲートされて、コンジュゲート、すなわち、糖コンジュゲートを形成する。本明細書で使用される場合、用語「糖コンジュゲート」とは、担体タンパク質に共有結合した糖を指す。一実施形態では、糖は、担体タンパク質に直接結合する。別の実施形態では、糖は、スペーサー／リンカーを介して担体タンパク質に結合する。
Ｏ抗原に沿った１つもしくは複数の部位で担体をＯ抗原に結合させるスキームによって、またはコアオリゴ糖の少なくとも１つの残基を活性化するスキームによって、コンジュゲートを調製することができる。
一実施形態では、それぞれの糖は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。
タンパク質担体が組成物中の２個以上の糖について同じである場合、糖を、担体タンパク質の同じ分子（例えば、２個以上の異なる糖がコンジュゲートされた担体分子）にコンジュゲートすることができる。
好ましい実施形態では、糖は、タンパク質担体の異なる分子にそれぞれ個別にコンジュゲートされる（タンパク質担体の各分子は、それにコンジュゲートされた１つの型の糖だけを有する）。前記実施形態では、糖は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされると言われる。
糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションを、本明細書に開示される活性化およびコンジュゲーション方法によって達成することができる。多糖の担体タンパク質へのコンジュゲーション後、糖コンジュゲートは、様々な技術によって精製される（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。これらの技術としては、濃縮／透析濾過操作、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が挙げられる。個々の糖コンジュゲートを精製した後、それらを混合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。
活性化。本発明はさらに、多糖がリンカーまたは担体タンパク質へのコンジュゲーションのための反応基を産生する化学試薬で活性化される、本明細書に記載の実施形態のいずれかから産生される活性化された多糖に関する。一部の実施形態では、本発明の糖は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に活性化される。一部の実施形態では、活性化度は、多糖の分子量を実質的に減少させない。例えば、一部の実施形態では、活性化度は、多糖骨格を切断しない。一部の実施形態では、活性化度は、ＣＲＭ１９７などの担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数（アミノ酸分析によって決定される）によって測定された場合、コンジュゲーション度に有意に影響しない。例えば、一部の実施形態では、活性化度は、同じ活性化度で参照多糖を有するコンジュゲートの担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数と比較して、担体タンパク質中で改変されたリシン残基の数（アミノ酸分析によって決定される）を３倍有意に増加させない。一部の実施形態では、活性化度は、非コンジュゲート化遊離糖のレベルを増加させない。一部の実施形態では、活性化度は、最適な糖／タンパク質比を低下させない。
一部の実施形態では、活性化された糖は、活性化された糖の糖反復単位あたりのチオールのモル数が、１～１００％、例えば、２～８０％、２～５０％、３～３０％、および４～２５％などである、活性化のパーセンテージを有する。活性化度は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。好ましくは、活性化度は、最大でも５０％、より好ましくは最大でも２５％である。一実施形態では、活性化度は、最大でも２０％である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。
一実施形態では、多糖を、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて活性化して、シアン酸エステルを形成させる。次いで、活性化された多糖を、担体タンパク質（好ましくは、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）上のアミノ基に直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせる。
例えば、スペーサーは、マレイミド活性化された担体タンパク質（例えば、Ｎ－［γ－マレイミドブチリロキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用する）またはハロアセチル化された担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、Ｎ－スクシンイミジルブロモ酢酸（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルホ－ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨード酢酸（ＳＩＡ）、もしくはスクシンイミジル３－［ブロモアセトアミド］プロピオン酸（ＳＢＡＰ）を使用する）との反応後に得られるチオエーテル結合によって担体にカップリングすることができるチオール化された多糖を得るためのシスタミンまたはシステアミンであってよい。一実施形態では、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応によって作製してもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を使用して担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートする。
コンジュゲーションのための他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基の、ＣＤＩとの反応、次いで、カルバメート結合を形成するタンパク質との反応によって形成することができるカルボニルリンカーを含んでもよい。これは、第一ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、第一ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する第一ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体と、タンパク質上のアミノ基とのカップリング（ＣＤＩ化学反応）を含んでもよい。
分子量。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖を含む。他の実施形態では、糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖は、２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、糖は、１００ｋＤａ～１０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８００ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、単一末端コンジュゲーションによって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、水性緩衝剤中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
一部の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、４００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａ；または３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖コンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態では、糖コンジュゲートは、２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは３，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。
さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または５，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、ＤＭＳＯ中で調製される還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によって生産される。別の実施形態では、そのような分子量を有する糖コンジュゲートは、本明細書に記載のｅＴＥＣコンジュゲーションによって生産される。
さらなる実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。
糖コンジュゲートの分子量を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによって測定することができる。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。本発明の糖コンジュゲートを、糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）によって特徴付けることもできる。一部の実施形態では、糖コンジュゲート中の多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～３（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。他の実施形態では、糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．８～１．２、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。さらなる実施形態では、糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．２である。好ましい実施形態では、コンジュゲート中の多糖の担体タンパク質に対する比は、０．９～１．１である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
また、糖コンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、コンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイリングするために重力送りのカラム中で使用される。媒体中の小孔から排除される大きい分子は、低分子よりも迅速に溶出する。画分収集装置を使用して、カラム溶出液を収集する。画分を、糖アッセイによる比色分析で試験する。Ｋｄの決定のために、分子が完全に排除される画分（Ｖ０）、（Ｋｄ＝０）、および最大保持を示す画分（Ｖｉ）、（Ｋｄ＝１）を確立するために、カラムを較正する。特定の試料特性に達する画分（Ｖｅ）を、式Ｋｄ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）によってＫｄと関連させる。
遊離糖。本発明の糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートしていないが、それにも拘わらず、糖コンジュゲート組成物中に存在する遊離糖を含んでもよい。遊離糖は、糖コンジュゲートと非共有的に結合していてもよい（すなわち、非共有的に結合する、吸着する、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉される）。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約２０％の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約１５％の遊離多糖を含む。別の好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、約８％未満の遊離多糖を含む。好ましい一実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約６％の遊離多糖を含む。好ましい実施形態では、糖コンジュゲートは、多糖の総量と比較して、最大でも約５％の遊離多糖を含む。例えば、表１９、表２０、表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。
共有結合。他の実施形態では、コンジュゲートは、５～１０糖反復単位毎に；２～７糖反復単位毎に；３～８糖反復単位毎に；４～９糖反復単位毎に；６～１１糖反復単位毎に；７～１２糖反復単位毎に；８～１３糖反復単位毎に；９～１４糖反復単位毎に；１０～１５糖反復単位毎に；２～６糖反復単位毎に；３～７糖反復単位毎に；４～８糖反復単位毎に；６～１０糖反復単位毎に；７～１１糖反復単位毎に；８～１２糖反復単位毎に；９～１３糖反復単位毎に；１０～１４糖反復単位毎に；１０～２０糖反復単位毎に；４～２５糖反復単位毎に、または２～２５糖反復単位毎に、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。よくある実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。別の実施形態では、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５糖反復単位毎に存在する。一実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
リシン残基。本発明の糖コンジュゲートを特徴付ける別の方法は、コンジュゲート化リシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる糖にコンジュゲートされるようになる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数による。多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変に関する証拠を、当業者には公知の日常的な方法を使用するアミノ酸分析によって取得することができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基数の減少をもたらす。好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートのコンジュゲーション度は、４～７である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
糖鎖の担体タンパク質上のリシンへの結合の頻度は、本発明の糖コンジュゲートを特徴付けるための別のパラメーターである。例えば、一部の実施形態では、担体タンパク質と、多糖との間の少なくとも１つの共有結合は、多糖の４糖反復単位毎に存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５糖反復単位毎に少なくとも１回存在する。Ｏアセチル化。一部の実施形態では、本発明の糖は、Ｏアセチル化されている。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０～１００％、２０～１００％、３０～１００％、４０～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、７５～１００％、８０～１００％、９０～１００％、５０～９０％、６０～９０％、７０～９０％または８０～９０％のＯアセチル化度を有する糖を含む。他の実施形態では、Ｏアセチル化度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。Ｏアセチル化の％とは、１００％に対する所与の糖のパーセンテージを意味する（それぞれの反復単位はそのアセチル化された構造と比較して完全にアセチル化されている）。
一部の実施形態では、糖コンジュゲートを、還元的アミノ化によって調製する。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、糖が担体タンパク質に直接的に共有結合された、単一末端結合コンジュゲート化糖である。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合されている。
還元的アミノ化。一実施形態では、糖は、還元的アミノ化（米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００７／０２３１３４０号、第２００７／０１８４０７１号および第２００７／０１８４０７２号、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、およびＷＯ２００８／１４３７０９などに記載されている）によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
還元的アミノ化は、（１）糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質の還元を含む。酸化の前に、糖を加水分解してもよい。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。
酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本明細書で使用される用語「過ヨウ素酸塩」とは、過ヨウ素酸塩と、過ヨウ素酸との両方を指す。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。一実施形態では、多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。別の実施形態では、多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化される。
一実施形態では、酸化剤は、第一ヒドロキシルを選択的に酸化するための酸化剤の存在下の、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物などの安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおける、Ｎ－オキソアンモニウム塩である。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物である。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を担持する。ある態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。ある態様では、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を担持する分子である。ある態様では、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンのいずれか１つから選択される。好ましくは、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミドである。
糖の酸化ステップの後、糖は活性化されると言われ、本明細書の以下で「活性化された」と称される。活性化された糖および担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。一実施形態では、活性化された糖および担体タンパク質は、同時凍結乾燥される。別の実施形態では、活性化された多糖および担体タンパク質は、独立に凍結乾燥される。
一実施形態では、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行い、あり得る非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。
コンジュゲーションプロセスの次のステップは、還元剤を使用した、コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質の還元（いわゆる還元的アミノ化）である。好適な還元剤としては、ＢｒｏｎｓｔｅｄまたはＬｅｗｉｓ酸の存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは水素化ホウ素亜鉛などのシアノ水素化ホウ素、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）、ボラン－ピリジン、またはホウ化水素交換樹脂などのアミンボランが挙げられる。一実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
ある実施形態では、還元反応は、水性溶媒（例えば、ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０または７．０～７．５の、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される）中で実行され、別の実施形態では、反応は非プロトン性溶媒中で実行される。ある実施形態では、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を使用して、凍結乾燥された活性化された糖および担体タンパク質を復元することができる。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基があってもよく、これらのものを、好適なキャッピング剤を使用してキャップすることができる。一実施形態では、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。コンジュゲーション（還元反応および必要に応じて、キャッピング）の後、糖コンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術によって精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。糖コンジュゲートを、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ある実施形態では、糖コンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。一実施形態では、糖コンジュゲートは、滅菌濾過される。
好ましい実施形態では、Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６のいずれか１つから選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する糖コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される。好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１、Ｏ２、およびＯ６に由来する糖コンジュゲートが、還元的アミノ化によって調製される。
一態様では、本発明は、担体タンパク質、例えば、
Figure 0007597974000012
 ［式中、ｎは、１以上の任意の整数である］
によって表される、式Ｏ２５Ｂの糖に連結されているＣＲＭ１９７を含むコンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１～最大でも１０００；少なくとも１０～最大でも５００；および少なくとも２０～最大でも８０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは少なくとも３１～最大でも９０、より好ましくは４０～９０、最も好ましくは６０～８５である。
別の態様では、本発明は、表１（図９Ａ～９Ｃおよび図１０Ａ～１０Ｂも参照されたい）に示される以下の構造のいずれか１つ（式中、ｎは１より大きい整数であるか、または１に等しい）を有する糖に結合した、担体タンパク質、例えば、ＣＲＭ１９７を含むコンジュゲートに関する。
理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、一部の実施形態では、安定なコンジュゲートは、抗原の重要な免疫原性エピトープの構造的完全性の保持とのバランスを保つレベルの抗原改変を必要とすると考えられる。
アルデヒドの活性化および形成。一部の実施形態では、本発明の糖は、活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖が活性化されるそのような実施形態では、活性化のパーセンテージ（％）（または酸化度（ＤＯ））（例えば、実施例３１を参照されたい）とは、活性化された多糖のアルデヒドのモルあたりの糖反復単位のモルを指す。例えば、一部の実施形態では、糖は、多糖の反復単位上の隣接ジオールの過ヨウ素酸塩酸化によって活性化され、アルデヒドの形成をもたらす。糖反復単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量（ｍｅｑ）および酸化中の温度を変化させることにより、酸化度（ＤＯ）のレベルの変化が得られる。
糖およびアルデヒド濃度は、典型的には、比色アッセイによって決定される。代替試薬は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン１－オキシルラジカル）－Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）混合物であり、第一アルコール基からのアルデヒドの形成をもたらす。
一部の実施形態では、活性化された糖は、活性化された糖のアルデヒドのモルあたりの糖反復単位のモルが、例えば、２～８０、２～５０、３～３０、および４～２５などの、１～１００である酸化度を有する。活性化度は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、もしくは９０以上、または約１００である。好ましくは、酸化度（ＤＯ）は、少なくとも５、かつ最大でも５０、より好ましくは、少なくとも１０、かつ最大でも２５である。一実施形態では、活性化度は、少なくとも１０、かつ最大でも２５である。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。酸化度の値は、活性化のパーセンテージ（％）として表すことができる。例えば、一実施形態では、１０のＤＯ値は、活性化された糖中の合計１０の糖反復単位のうち、１の活性化された糖反復単位を指し、その場合、１０のＤＯ値は、１０％の活性化と表すことができる。
一部の実施形態では、還元的アミノ化化学反応によって調製されたコンジュゲートは、担体タンパク質と糖とを含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。
単一末端結合コンジュゲート。一部の実施形態では、コンジュゲートは、糖が、糖の一方の末端で担体タンパク質に共有結合した、単一末端結合コンジュゲート化糖である。一部の実施形態では、単一末端結合コンジュゲート化多糖は、末端糖を有する。例えば、コンジュゲートは、多糖の一方の末端（末端糖残基）が担体タンパク質に共有結合する場合、単一末端結合している。一部の実施形態では、コンジュゲートは、多糖の末端糖残基がリンカーを介して担体タンパク質に共有結合する場合、単一末端結合している。そのようなリンカーは、例えば、シスタミンリンカー（Ａ１）、３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）、および２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセタミド）リンカー（Ａ６）を含んでもよい。
一部の実施形態では、糖は、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートして、単一末端結合コンジュゲートを形成している。例えば、実施例２６、実施例２７、実施例２８、および図１７を参照されたい。
一部の実施形態では、コンジュゲートは好ましくは、バイオコンジュゲートではない。用語「バイオコンジュゲート」とは、宿主細胞バックグラウンドで調製された、タンパク質（例えば、担体タンパク質）と、抗原、例えば、Ｏ抗原（例えば、Ｏ２５Ｂ）とのコンジュゲートを指し、ここで、宿主細胞機構が、抗原をタンパク質に結合する（例えば、Ｎ結合）。糖コンジュゲートは、宿主細胞中でのコンジュゲートの調製を必要としない手段、例えば、タンパク質と糖との化学的結合によるコンジュゲーションによって調製されたバイオコンジュゲート、ならびに糖抗原（例えば、オリゴ糖および多糖）－タンパク質コンジュゲートを含む。
チオール活性化された糖。一部の実施形態では、本発明の糖は、チオール活性化されている。糖がチオール活性化されているそのような実施形態では、活性化のパーセンテージ（％）は、活性化された多糖の糖反復単位あたりのチオールのモルを指す。糖およびチオール濃度は、典型的には、スルフヒドリルの定量化のためのエルマンアッセイによって決定される。例えば、一部の実施形態では、糖は、ジスルフィドアミンリンカーを用いた２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）の活性化を含む。例えば、実施例１０および図３１を参照されたい。一部の実施形態では、糖は、二価ヘテロ二官能性リンカー（本明細書では「スペーサー」とも称される）を介して担体タンパク質に共有結合している。リンカーは、好ましくは、糖と担体タンパク質との間のチオエーテル結合を提供し、本明細書では「チオエーテル糖コンジュゲート」と称される糖コンジュゲートをもたらす。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）などの、カルバメートおよびアミド結合をさらに提供する。例えば、実施例２１を参照されたい。
一部の実施形態では、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質および糖を含み、糖は、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む。一部の実施形態では、コンジュゲート内の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは、３１～１００、より好ましくは、３５～９０、最も好ましくは、３５～６５の整数である式を含む。
例えば、一実施形態では、単一末端結合コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～１０の整数である）から選択される構造を有する糖とを含む。
Ｆ．ｅＴＥＣコンジュゲート
一態様では、本発明は一般に、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサー（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９５１７２７４号および国際特許出願公開ＷＯ２０１４０２７３０２に記載されている）を介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた上記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む糖コンジュゲート、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物の調製および使用のための方法に関する。前記糖コンジュゲートは、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた糖であって、糖が、カルバメート結合によってｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされ、担体タンパク質が、アミド結合によってｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされている、糖を含む。ｅＴＥＣスペーサーは、７個の線状原子（すなわち、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）を含み、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。
本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、一般式（Ｉ）：
Figure 0007597974000013
 ［式中、ｅＴＥＣスペーサーを構成する原子は、中央のボックス内に含まれる］
によって表され得る。
本発明の前記糖コンジュゲートにおいて、糖は、多糖またはオリゴ糖であってもよい。
本発明の糖コンジュゲート中に組み入れられる担体タンパク質は、本明細書にさらに記載されるように、または当業者には公知のように、そのような目的にとって一般的に好適な担体タンパク質群から選択される。特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
別の態様では、本発明は、ｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）有機溶媒中で糖と炭酸誘導体とを反応させて、活性化された糖を生産するステップ；ｂ）活性化された糖と、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩とを反応させて、チオール化された糖を生産するステップ；ｃ）チオール化された糖と、還元剤とを反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む、活性化されたチオール化された糖を生産するステップ；ｄ）活性化されたチオール化された糖と、１つまたは複数のα－ハロアセタミド基を含む活性化された担体タンパク質とを反応させて、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートを生産するステップ；ならびにｅ）チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）活性化された担体タンパク質の非コンジュゲート化α－ハロアセタミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化されたチオール化された糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬とを反応させるステップを含み、それによって、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートが生産される、方法を提供する。
よくある実施形態では、炭酸誘導体は、１，１’－カルボニル－ジ－（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）である。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、チオール化された糖は、活性化された糖と、二官能性対称性チオアルキルアミン試薬、シスタミンまたはその塩との反応によって生産される。あるいは、チオール化された糖を、活性化された糖と、システアミンまたはその塩との反応によって形成させることもできる。本発明の方法によって生産されるｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを、一般式（Ｉ）によって表すことができる。
よくある実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質のリシン残基上の非コンジュゲート化α－ハロアセタミド基と反応して、チオエーテル結合によって活性化されたリシン残基に共有結合するＳ－カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）残基を形成する、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインである。
他の実施形態では、第２のキャッピング試薬は、活性化されたチオール化された糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル基と反応して、キャッピングされたチオアセタミドを提供するヨードアセタミド（ＩＡＡ）である。ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬と第２のキャッピング試薬との両方を用いてキャッピングすることを含むことが多い。ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてのＮ－アセチル－Ｌ－システインおよび第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡを用いてキャッピングすることを含む。
一部の実施形態では、キャッピングステップｅ）は、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。
本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含んでもよい。一部の例では、本明細書に提供される方法によって形成される活性化されたチオール化された糖は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含み、その一部は、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質への共有的コンジュゲーションを受けない場合がある。そのような残留する遊離スルフヒドリル残基は、アチオール反応キャッピング試薬、例えば、ヨードアセタミド（ＩＡＡ）との反応によってキャッピングされ、潜在的に反応性の官能基をキャッピングする。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えば、マレイミド含有試薬なども企図される。
さらに、本発明のｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、残留する非コンジュゲート化担体タンパク質を含んでもよく、キャッピングプロセスステップ中に改変を受けた活性化された担体タンパク質を含んでもよい。
一部の実施形態では、ステップｄ）は、活性化されたチオール化された糖と、活性化された担体タンパク質とを反応させる前に、１つまたは複数のα－ハロアセタミド基を含む活性化された担体タンパク質を提供することをさらに含む。よくある実施形態では、活性化された担体タンパク質は、１つまたは複数のα－ブロモアセタミド基を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかに従って生産されたｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に記載の糖を含むｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを提供する。
一部の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５糖反復単位あたり少なくとも１回存在する。
本発明の態様のそれぞれ、特に、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態について、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖などの、本明細書に記載の糖を含む。
別の態様では、本発明は、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含み、前記免疫原性組成物が、本明細書に記載の糖を含むｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。
一部の実施形態では、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートは、担体タンパク質と、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む糖とを含む。一部の実施形態では、コンジュゲート中の糖は、ｎが１～１０００、５～１０００、好ましくは３１～１００、より好ましくは３５～９０、最も好ましくは３５～６５の整数である式を含む。
糖にコンジュゲートされるようになる担体タンパク質中のリシン残基の数を、コンジュゲートされるリシンの範囲として特徴付けることができる。例えば、免疫原性組成物の一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、糖に共有結合した３９のうちの４～１６個のリシン残基を含んでもよい。このパラメーターを表現するための別の方法は、ＣＲＭ１９７リシンの約１０％～約４１％が糖に共有結合しているというものである。他の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、糖に共有結合した３９のうちの２～２０個のリシン残基を含んでもよい。このパラメーターを表現するための別の方法は、ＣＲＭ１９７リシンの約５％～約５０％が糖に共有結合しているというものである。
よくある実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５糖反復単位あたり少なくとも１回存在する。
他の実施形態では、コンジュゲートは、５～１０糖反復単位毎に；２～７糖反復単位毎に；３～８糖反復単位毎に；４～９糖反復単位毎に；６～１１糖反復単位毎に；７～１２糖反復単位毎に；８～１３糖反復単位毎に；９～１４糖反復単位毎に；１０～１５糖反復単位毎に；２～６糖反復単位毎に；３～７糖反復単位毎に；４～８糖反復単位毎に；６～１０糖反復単位毎に；７～１１糖反復単位毎に；８～１２糖反復単位毎に；９～１３糖反復単位毎に；１０～１４糖反復単位毎に；１０～２０糖反復単位毎に；または４～２５糖反復単位毎に、担体タンパク質と糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。
別の実施形態では、担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５糖反復単位毎に存在する。
Ｇ．担体タンパク質
本発明の糖コンジュゲートの成分は、糖がコンジュゲートされている担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。
コンジュゲートの１つの成分は、Ｏ多糖がコンジュゲートされている担体タンパク質である。一実施形態では、コンジュゲートは、Ｏ多糖のコアオリゴ糖にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む（図２４を参照されたい）。一実施形態では、コンジュゲートは、Ｏ多糖のＯ抗原にコンジュゲートされた担体タンパク質を含む。
用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。
好ましい実施形態では、コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡのいずれか１つから独立に選択される。ある実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。一部の実施形態では、担体タンパク質は、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）を含む。さらなる実施形態では、本発明のコンジュゲートの担体タンパク質は、ＳＣＰ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｃ５ａ ぺプチダーゼ）（Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｋ．ら、２００５、ＰＮＡＳ １０２（５１）：１８３９１～１８３９６）である。
好ましい実施形態では、糖は、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ１９７は、毒素産生コリネファージベータのニトロソグアニジン突然変異誘発によって作出された非毒素産生ファージβ１９７ｔｏｘ－によって感染したクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって産生される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。
したがって、一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、糖がＣＲＭ１９７に共有結合している、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む。
好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性的であるが、抗原的に同一のバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：３８３８～３８４４、１９７３）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３またはＣＲＭ１０７；ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．１９９２により記載された他の突然変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または突然変異ならびに米国特許第４，７０９，０１７号および第４，９５０，７４０号に開示された他の突然変異；Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つまたは複数の残基の突然変異ならびに米国特許第５，９１７，０１７号もしくは第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片）、一部の様式で解毒されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）またはｄＰＬＹ－ホルモル、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５もしくはＷＯ００／３９２９９に開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、ＰｈｔＡ－Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）を含む、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３：２７０６～１３）、ＯＭＰＣ（通常、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出される髄膜炎菌外膜タンパク質－ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）、またはその免疫学的機能等価物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６～３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：４８８４～７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を担持する外毒素Ａなど（Ｕｃｈｉｄａ Ｃａｍｅｒｏｎ ＤＭ、ＲＪ Ｃｏｌｌｉｅｒ．１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４９６７～４９７１））からなる群から選択される。オブアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。他の好適な担体タンパク質としては、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されている）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａなどの不活化細菌毒素が挙げられる。
一部の実施形態では、担体タンパク質は、例えば、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、フラゲリン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される。一実施形態では、担体タンパク質は、解毒されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＥＰＡ）である。別の実施形態では、担体タンパク質は、解毒されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＥＰＡ）ではない。一実施形態では、担体タンパク質は、フラゲリンである。別の実施形態では、担体タンパク質は、フラゲリンではない。
好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡからなる群から独立に選択される。ある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ－例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。
好ましい実施形態では、本発明の莢膜糖は、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ１９７は、毒素産生コリネファージベータ（Ｕｃｈｉｄａ、Ｔ.ら、１９７１、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８～１１）のニトロソグアニジン突然変異誘発によって創出された非毒素産生ファージβ１９７ｔｏｘ－により感染したコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。ＣＲＭ１９７およびその産生に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許第５，６１４，３８２号に見出すことができる。
したがって、よくある実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、莢膜多糖がＣＲＭ１９７に共有結合している、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含む。
Ｈ．組成物の投薬量
投薬レジメンを調節して、最適な所望の応答を得ることができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の単回用量を投与することもできるし、複数の分割された用量を経時的に投与することもできるし、または用量を、状況の危急によって指定されるとおりに相応して減少もしくは増加させてもよい。投薬量の値は、緩和される状態の種類および重症度で変化し得て、単回または複数回の用量を含み得ることに注意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、個体の必要性および組成物を投与するか、または投与を管理する人の専門的判断に従って、具体的な投与レジメンを経時的に調節すべきこと、ならびに本明細書に記載の投薬量範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実行を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。治療用タンパク質の好適な投薬および投与のためのレジメンの決定は、関連分野で周知であり、本明細書に開示の教示を提供されたら、当業者には含まれていることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、組成物中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の量は、それぞれのタンパク質抗原約１０μｇ～約３００μｇの範囲であってよい。一部の実施形態では、組成物中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の量は、それぞれのタンパク質抗原約２０μｇ～約２００μｇの範囲であってよい。
各用量中の糖コンジュゲートの量は、典型的なワクチンにおいて有意で有害な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の免疫原が用いられ、およびそれがどのように提供されるかに応じて変化するであろう。
免疫原性組成物中の特定の糖コンジュゲートの量を、そのコンジュゲート（コンジュゲート化および非コンジュゲート化）に関する全多糖に基づいて算出することができる。例えば、２０％遊離多糖を含む糖コンジュゲートは、１００ｇの多糖用量中に約８０ｇのコンジュゲート化多糖と、約２０ｇの非コンジュゲート化多糖を有するであろう。糖コンジュゲートの量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に応じて変化し得る。糖濃度は、ウロン酸アッセイによって決定することができる。
免疫原性組成物中の異なる多糖成分の「免疫原性量」は異なっていてもよく、それぞれ、約１．０ｇ、約２．０ｇ、約３．０ｇ、約４．０ｇ、約５．０ｇ、約６．０ｇ、約７．０ｇ、約８．０ｇ、約９．０ｇ、約１０．０ｇ、約１５．０ｇ、約２０．０ｇ、約３０．０ｇ、約４０．０ｐｇ、約５０．０ｐｇ、約６０．０ｐｇ、約７０．０ｐｇ、約８０．０ｐｇ、約９０．０ｐｇ、または約１００．０ｇの任意の特定の多糖抗原を含んでもよい。一般に、それぞれの用量は、所与の血清型について、０．１ｇ～１００ｇ、特に、０．５ｇ～２０ｇ、より特には、１ｇ～１０ｇ、さらにより特には、２ｇ～５ｇの多糖を含むであろう。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。一実施形態では、それぞれの用量は、所与の血清型について、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇまたは２０ｇの多糖を含むであろう。
担体タンパク質量。一般に、それぞれの用量は、５ｇ～１５０ｇの担体タンパク質、特に、１０ｇ～１００ｇの担体タンパク質、より特には、１５ｇ～１００ｇの担体タンパク質、より特には、２５～７５ｇの担体タンパク質、より特には、３０ｇ～７０ｇの担体タンパク質、より特には、３０～６０ｇの担体タンパク質、より特には、３０ｇ～５０ｇの担体タンパク質、さらにより特には、４０～６０ｇの担体タンパク質を含むであろう。一実施形態では、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。一実施形態では、それぞれの用量は、約２５ｇ、約２６ｇ、約２７ｇ、約２８ｇ、約２９ｇ、約３０ｇ、約３１ｇ、約３２ｇ、約３３ｇ、約３４ｇ、約３５ｇ、約３６ｇ、約３７ｇ、約３８ｇ、約３９ｇ、約４０ｇ、約４１ｇ、約４２ｇ、約４３ｇ、約４４ｇ、約４５ｇ、約４６ｇ、約４７ｇ、約４８ｇ、約４９ｇ、約５０ｇ、約５１ｇ、約５２ｇ、約５３ｇ、約５４ｇ、約５５ｇ、約５６ｇ、約５７ｇ、約５８ｇ、約５９ｇ、約６０ｇ、約６１ｇ、約６２ｇ、約６３ｇ、約６４ｇ、約６５ｇ、約６６ｇ、約６７ｇ、６８ｇ、約６９ｇ、約７０ｇ、約７１ｇ、約７２ｇ、約７３ｇ、約７４ｇまたは約７５ｇの担体タンパク質を含むであろう。一実施形態では、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
Ｉ．アジュバント
一部の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも１、２または３つのアジュバントをさらに含んでもよい。用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。抗原は、主に送達系として、主に免疫モジュレーターとして作用するか、または両方の強力な特徴を有してもよい。好適なアジュバントとしては、ヒトを含む哺乳動物中での使用にとって好適なものが挙げられる。
ヒトにおいて使用することができる公知の好適な送達系型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））などの水中油エマルジョン、モンタニドなどの油中水エマルジョン、およびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子が挙げられる。
ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）を含む。好ましい実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムを含む。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムの形態で、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬまたは０．２ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムの形態で約０．２５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む。ヒトにおいて使用することができる公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、アクイラ（Ａｑｕｉｌｌａ）樹皮からのサポニン抽出物（ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ－ＡＱなどのＴＬＲ４アゴニスト、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）またはＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカイン、ＡＳ０１などが挙げられる。
ヒトにおいて使用することができる送達特性と免疫調節特性との両方を示す公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ２００６／１３４４２３およびＷＯ２００７／０２６１９０を参照されたい）またはＴＬＲ４アゴニストと水中油エマルジョンとの組合せであるＧＬＡ－ＥＭが挙げられる。
限定されるものではないが、動物実験などの獣医学的適用のために、当業者であれば、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル－ＭＤＰと称される）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥと称される）、および２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に細菌から抽出される３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩを使用することができる。
本明細書に開示される免疫原性組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとしては、限定されるものではないが、（１）例えば、（ａ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック（登録商標）遮断ポリマーＬ１２１、およびマイクロメートル以下のエマルジョンにマイクロ流体化された、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされたｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｂ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）などの、水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照されたい）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤を含む、または含まない）；（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）、ＡＢＩＳＣＯ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、または使用することができるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）もしくはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの、それから生成される粒子（ＩＳＣＯＭはさらなる洗剤を含まなくてもよい（例えば、ＷＯ００／０７６２１））などのサポニンアジュバント；（３）完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（例えば、ＷＯ９９／４４６３６））、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２１１、ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）（例えば、ＷＯ００／５６３５８を参照されたい）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ（例えば、ＥＰ０８３５３１８、ＥＰ０７３５８９８、ＥＰ０７６１２３１を参照されたい）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）；（８）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（９）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、ＷＯ００／６２８００）；（１０）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照されたい）；（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１３）組成物の効能を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－２５アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ノル－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる。
本発明の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を指し、したがって、これらの用語は、別途指摘しない限り、互換的に使用される。免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、場合により、ある特定の好ましい塩基の文脈内で、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチドである、１つまたは複数の免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する。ＣｐＧ免疫刺激モチーフのメチル化状態は一般に、ジヌクレオチド中のシトシン残基を指す。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’グアニンにリン酸結合によって連結された５’非メチル化シトシンを含有し、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ－９）への結合によって免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を介して免疫系を活性化するが、あたかもＣｐＧモチーフが非メチル化されたかのように強力ではない、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有してもよい。ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のパリンドロームを含んでもよく、次いで、ＣｐＧジヌクレオチドを包含してもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を含む、いくつかの発行された特許、公開特許出願、および他の刊行物に記載されている。
本発明のある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目に記載されたＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。
様々なクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドが同定されている。これらのものは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＰクラスと呼ばれ、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目により詳細に記載されている。本発明の方法は、これらの様々なクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
ＶＩＩ．ナノ粒子
別の態様では、１）ナノ構造；および２）少なくとも１つの線毛ポリペプチド抗原またはその断片を含む免疫原性複合体を本明細書において開示する。好ましくは、線毛ポリペプチドまたはその断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線毛Ｈ（ｆｉｍＨ）に由来する。好ましい一実施形態では、線毛ポリペプチドは、前記の線毛ポリペプチドのいずれか１つから選択される。例えば、線毛ポリペプチドは、配列番号１～１０、１８、２０、２１、２３、２４、および２６～２９から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでよい。
一部の実施形態では、抗原は、提示エピトープに対する適応免疫応答の発生を刺激するために、ナノ構造外部に融合またはコンジュゲートされている。一部の実施形態では、それぞれの病原体で生成される免疫応答の種類を適合させるために役立つように、免疫原性複合体は、外部に付着している、および／またはケージ内部に封入されているアジュバントまたは他の免疫調節化合物をさらに含む。
一部の実施形態では、ナノ構造は、複数の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含む単一のアセンブリを含む。
代替の実施形態では、ナノ構造は、複数の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含む複数のアセンブリ、および複数の第２のアセンブリを含み、それぞれの第２のアセンブリは、複数の同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含む。
様々なナノ構造プラットフォームを、本明細書に記載の免疫原性組成物の生成において使用することができる。一部の実施形態では、使用されるナノ構造は、単一のサブユニットの複数のコピーによって形成される。一部の実施形態では、使用されるナノ構造は、複数の異なるサブユニットの複数のコピーによって形成される。
ナノ構造は典型的には、ボール様形状であり、および／または例えば、本明細書において例示される正二十面体構造を伴う、回転対称（例えば、３倍および５倍軸）を有する。
一部の実施形態では、抗原は、フェリチン（ＦＲ）、Ｅ２ｐ、Ｑβ、およびＩ３－０１に由来する自己集合性ナノ構造などの自己集合性ナノ粒子上で提示される。Ｅ２ｐは、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計バリアントである。Ｉ３－０１は、超安定ナノ粒子に自己集合し得る操作タンパク質である。これらのタンパク質のサブユニットの配列は、当業界で公知である。第１の態様では、配列番号５９～９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％同一であり、かつ少なくとも１つの同定されている界面位置において同一であるアミノ酸配列を含むナノ構造関連ポリペプチドを本明細書において開示する。ナノ構造関連ポリペプチドを、例えば、ナノ構造を調製するために使用することができる。ナノ構造関連ポリペプチドは、それらが対で自己集合して正二十面体ナノ構造などのナノ構造を形成し得るように設計された。
一部の実施形態では、ナノ構造は、（ａ）それぞれの第１のアセンブリが複数の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含み、第１のナノ構造関連ポリペプチドが配列番号５９～９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、複数の第１のアセンブリ；および（ｂ）それぞれの第２のアセンブリが複数の同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含み、第２のナノ構造関連ポリペプチドが配列番号５９～９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を含み、かつ第２のナノ構造関連ポリペプチドが第１のナノ構造関連ポリペプチドとは異なる、複数の第２のアセンブリを含み、その際、複数の第１のアセンブリは、複数の第２のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成する。
ナノ構造は、第１のアセンブリおよび第２のアセンブリを正二十面体対称を伴うものなどのナノ構造に配向する、対称的に繰り返される非天然の非共有結合性ポリペプチド－ポリペプチド界面を含む。
配列番号５９～９２は、例示的なナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。配列番号５９～９２の例示的なナノ構造関連ポリペプチドでの界面残基の数は、４～１３残基の範囲である。様々な実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９～９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の同定された界面位置で（所与のナノ構造関連ポリペプチドでの界面残基の数に応じて）同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９～９２からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ少なくとも２０％、２５％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または１００％の同定された界面位置で同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドは、配列番号５９～９８からなる群から選択されるナノ構造関連ポリペプチドのアミノ酸配列を有するナノ構造関連ポリペプチドを含む。
１つの非限定的実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドを改変して、目的の「カーゴ」との共有結合を促進することができる。１つの非限定的例では、ナノ構造関連ポリペプチドを、様々なシステイン残基を規定の位置に導入することなどによって改変して、１種または複数の目的の抗原との結合を促進することができ、そうして、ナノ構造関連ポリペプチドのナノ構造が、ワクチンとして送達するための多数の抗原を提供する骨格を提供して、改善された免疫応答が生じるようにする。
一部の実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチド中に存在するが、コンジュゲーションに使用されることは意図されていない一部またはすべての天然システイン残基を他のアミノ酸に突然変異させて、既定の位置でのコンジュゲーションを促進することができる。別の非限定的実施形態では、ナノ構造関連ポリペプチドを、「エンドソームエスケープ」の促進に役立つ部分との結合（共有結合または非共有結合）によって改変することができる。標的化送達など、目的の分子を標的細胞に送達することを伴う用途では、重要なステップは、細胞への送達ビヒクルの入り口であるエンドソーム（膜結合オルガネラ）からのエスケープであり得る。エンドソームはリソソームに成熟して、それらの内容物を分解する。したがって、エンドソームがリソソームになる前に、送達ビヒクルがエンドソームからどうにかして「エスケープ」しなければ、送達ビヒクルは分解されて、その機能を実行することはないであろう。エンドソームを破壊して、サイトゾルへのエスケープを可能にする様々な脂質または有機ポリマーが存在する。したがって、この実施形態では、例えば、そのような脂質または有機ポリマーのモノマーまたは生じたアセンブリ表面への化学的コンジュゲーションを可能にするシステイン残基を導入することにより、ナノ構造関連ポリペプチドを改変することができる。別の非限定的例では、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでナノ構造の可視化を可能にするフルオロフォアまたは他のイメージング剤の化学的コンジュゲーションを可能にするシステイン残基を導入することにより、ナノ構造関連ポリペプチドを改変することができる。
タンパク質サブユニットまたは集合したナノ構造の安定性または溶解性を改善するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を突然変異させることができる。当業者には分かるであろうとおり、ナノ構造関連ポリペプチドが、既存のタンパク質ファミリーに対して有意な配列相同性を有するならば、そのファミリーに由来する他のタンパク質の複数の配列アラインメントを使用して、コンセンサスタンパク質設計と称されるプロセス（９）である、タンパク質安定性および／または溶解性を増大させ得る非保存位置でのアミノ酸突然変異の選択をガイドすることができる。
タンパク質表面に全陽電荷または全負電荷を付与するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を、正の電荷を持つ（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）または負の電荷を持つ（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）アミノ酸に突然変異させることができる。１つの非限定的実施形態では、自己集合性ナノ構造の内部表面に高い実効電荷を付与するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を突然変異させることができる。次いで、そのようなナノ構造を使用して、ナノ構造内部表面とカーゴ分子との間の静電相互作用により、逆の実効電荷を有するカーゴ分子をパッケージングまたは封入することができる。１つの非限定的実施形態では、自己集合性ナノ構造の内部表面に実効正電荷を付与するために、ナノ構造関連ポリペプチド上の表面アミノ酸残基を主に、アルギニンまたはリシン残基に突然変異させることができる。次いで、核酸を自己集合性ナノ構造内部に封入するために、ナノ構造関連ポリペプチドを含有する溶液を、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ．、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、または他の核酸などの核酸カーゴ分子の存在下で混合することができる。そのようなナノ構造を使用して、例えば、核酸を保護する、送達する、または濃縮することができるであろう。
一実施形態では、ナノ構造は正二十面体対称を有する。この実施形態では、ナノ構造は、６０コピーの第１のナノ構造関連ポリペプチドおよび６０コピーの第２のナノ構造関連ポリペプチドを含み得る。そのような実施形態の１つでは、それぞれの第１のアセンブリ中の同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドの数は、それぞれの第２のアセンブリ中の同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドの数とは異なる。例えば、一実施形態では、ナノ構造は、１２の第１のアセンブリおよび２０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、それぞれの第１のアセンブリは、例えば、５コピーの同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよく、それぞれの第２のアセンブリは、例えば、３コピーの同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよい。別の実施形態では、ナノ構造は、１２の第１のアセンブリおよび３０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、それぞれの第１のアセンブリは、例えば、５コピーの同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよく、それぞれの第２のアセンブリは、例えば、２コピーの同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよい。さらなる実施形態では、ナノ構造は、２０の第１のアセンブリおよび３０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、それぞれの第１のアセンブリは、例えば、３コピーの同一の第１のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよく、それぞれの第２のアセンブリは、例えば、２コピーの同一の第２のナノ構造関連ポリペプチドを含んでよい。これらの実施形態はすべて、正二十面体対称を有する合成ナノ材料を形成し得る。
ＶＩＩＩ．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖および／またはポリペプチドまたはその断片との組合せ
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、尿路感染症、菌血症、および敗血症の原因となることが公知であるグラム陰性病原体である。一態様では、本明細書に開示の組成物のいずれかは、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、それに由来する少なくとも１つの糖をさらに含んでよい。好ましい一実施形態では、本明細書に開示の組成物のいずれかは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｉ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドまたはその免疫原性断片；およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＩＩ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドまたはその免疫原性断片から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含んでよい。
当業界で公知であるとおり、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２抗原は、ホモポリマーガラクトース単位（またはガラクタン）を含有する。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２抗原はそれぞれ、Ｄ－ガラクタンＩ単位（ときに、Ｏ２ａ反復単位と称される）を含有するが、Ｏ１抗原は、Ｏ１抗原がＤ－ガラクタンＩＩキャップ構造を有することにおいて異なる。Ｄ－ガラクタンＩＩＩ（ｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩ）は、Ｄ－ガラクタンＩのバリアントである。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位、および［→３）－α－Ｄ－ Ｇａｌｐ－（１→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→３）－［α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→４）］－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→］（Ｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩ反復単位と称される）の反復単位を含む。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、［→３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→］（これはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２ａ抗原の要素であり得る）の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、［→３）－β－Ｄ－ＧｌｃｐＮＡｃ－（１→５）－β－Ｄ－Ｇａｌｆ－（１→］（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２ｃ抗原の要素であり得る）の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、（１→４）－連結Ｇａｌｐ残基の側鎖付加によるＯ２ａ反復単位の改変を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａｆｇ抗原の要素であり得る）。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、（１→２）－結合Ｇａｌｐ残基の側鎖付加によるＯ２ａ反復単位の改変を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａｅｈ抗原の要素であり得る）。
メカニズムまたは理論によって束縛されるものではないが、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３およびＯ５のＯ抗原多糖構造は、それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９ａ（式Ｏ９ａ）およびＯ８（式Ｏ８）のものと同一であることが当業界で開示されている。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ４に由来する糖は、［→４）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→２）－β－Ｄ－Ｒｉｂｆ－（１→）］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ７に由来する糖は、［→２－ａ－Ｌ－Ｒｈａｐ－（１→２）－β－Ｄ－Ｒｉｂｆ－（１→３）－α－Ｌ－Ｒｈａｐ－（１→３）－α－Ｌ－Ｒｈａｐ－（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ８血清型に由来する糖は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａと同じ繰返し単位構造を含むが、非化学量論的にＯ－アセチル化されている。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１２血清型に由来する糖は、［α－Ｒｈａｐ－（１→３）－β－ＧｌｃｐＮＡｃ］二糖反復単位の反復単位を含む。
一態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のうちの１つまた複数、またはそれらの組合せからの、またはそれに由来する糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のそれぞれからの、またはそれに由来する糖を含む。
別の態様では、本発明は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のうちの１つまたは複数、またはそれらの組合せからの、またはそれに由来する糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５のそれぞれからの、またはそれに由来する糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ９を有する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ８を有する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。
別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含む組成物を含む組成物に関する。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ９を有する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ８を有する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。
一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖を含む。
一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖の組合せを含み、その際、第１の糖は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型のいずれか１つに由来し；第２の糖は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２からなる群から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型のいずれか１つから由来する糖に由来する。例えば、一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖と、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖を含む。好ましい一実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートしており；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。
別の態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；およびＯ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む組成物を含む。
別の態様では、本発明は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ９を有する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３に由来する糖を含まない。一部の実施形態では、組成物は、式Ｏ８を有する糖を含み、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５に由来する糖を含まない。
一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。別の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。別の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１型に由来する少なくとも１つの糖；およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２型に由来する少なくとも１つの糖；および式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。
一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；式Ｏ８および式Ｏ９からなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｏ１（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ－Ｇａｌ－ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型であるか、またはそれに由来する少なくとも１つの糖；式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ２、式Ｏ６、および式Ｏ２５Ｂからなる群から選択される構造を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する少なくとも１つの糖を含む。
一部の実施形態では、組成物は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｉ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドまたはその免疫原性断片；およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＩＩ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドまたはその免疫原性断片から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む。そのようなポリペプチドの配列は、当業界で公知である。
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示に過ぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。以下の実施例は、本発明の一部の実施形態を例示するものである。
（実施例１）
構築物の概要
Figure 0007597974000014
Figure 0007597974000015
Figure 0007597974000016
Figure 0007597974000017
Figure 0007597974000018
Figure 0007597974000019
研究されたＦｉｍＨ構築物はすべて、予測された分子量のモノマータンパク質であった。
Figure 0007597974000020
 ＦｉｍＣ－ＦｉｍＨ複合体の予測分子量は５３．１ｋＤａである；
ＦｉｍＣの予測分子量は２４ｋＤａである。
（実施例２）
ＦｉｍＨレクチン結合ドメインの哺乳動物発現
この非限定的実施例は、ＨＥＫ細胞系において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を生産することに関する。収量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞における、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片の発現と比較して、相対的に高かった。
哺乳動物細胞からのＦｉｍＨバリアントの生産を達成するために、シグナルＰ予測アルゴリズムを使用して、異なる非相同シグナル配列をタンパク質および断片の分泌について分析した。野生型ＦｉｍＨリーダー配列も分析した。予測は、野生型ＦｉｍＨリーダー配列は、哺乳動物細胞におけるＦｉｍＨバリアントの分泌について機能し得るが、しかしながら、分泌されるバリアントは、全長野生型ＦｉｍＨのＦ２２残基（配列番号１を参照されたい）ではなく、全長野生型ＦｉｍＨのＷ２０残基（配列番号１を参照されたい）で切断されると予測されることを示した。血球凝集素シグナル配列は、機能しないと予測された。マウスＩｇＫシグナル配列は、配列番号１のＦ２２のＮ末端、または成熟タンパク質のＦ１残基を生産すると予測された。
これらの分析に基づき、ＤＮＡを合成して、野生型ＦｉｍＨリーダーを含むＦｉｍＨレクチン結合ドメインを発現する構築物を組換え生産した。構築物を、ｍＩｇＫシグナル配列を含むＦｉｍＨレクチン結合ドメインを発現するようにも調製した。精製を促進するために、Ｈｉｓタグなどのアフィニティー精製タグを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片のＣ末端に導入した。
発現プラスミドをＨＥＫ宿主細胞、すなわち、ＥＸＰＩ２９３哺乳動物細胞にトランスフェクトした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片が成功裏に発現した。例えば、Ｆ２２でＦｉｍＨの成熟開始に融合しているｍＩｇＫシグナル配列を使用する好ましいＮ末端プロセシングが、ｐＳＢ０１８９２ ＦｉｍＨｄｓｃＧ構築物についてＭＳにより実証された。プロセシングは、レクチンドメイン構築物ｐＳＢ０１８７８について正確であると考えられ、このことを質量分析データが裏付ける。
好ましいＮ末端プロセシング（すなわち、配列番号１のＦ２２でのプロセシング）は、天然ＦｉｍＨリーダーペプチドでは示されなかった。
ｐＳＢ０１８７７およびｐＳＢ０１８７８構築物は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）哺乳動物発現ベクター内に存在する。細胞を希釈し、続いて、２０ｍｌトランスフェクションで使用した。それぞれの構築物について１ｕｇ／ｍｌのＤＮＡを使用し、１２５ｍｌフラスコ内でＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅプロトコルを使用して、細胞をトランスフェクトした。７２時間後に、細胞生存率はまだ良好であったので、発現を９６時間まで継続することが可能であった。試料を７２時間目に採取し、それぞれ１０ｕｌをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに流して、発現についてチェックした。
９６時間後に、馴化培地を採取し、Ｎｉｃｋｅｌ Ｅｘｃｅｌ樹脂０．２５ｍｌをバッチ結合で、一晩、４℃で、回転させながら添加した。ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ８．０、ＮａＣｌ、イミダゾール中で溶離した。図４を参照されたい。
ｐＳＢ０１８７８は、Ｎ末端Ｆ２２と一致する質量を予測している。グリコシル化が１または２つの部位に存在（Ｎ－Ｄのそれぞれの脱アミドから＋１質量）。
グリコシル化変異体を構築した。例えば、ｐＳＢ０２０８１、ｐＳＢ０２０８２、ｐＳＢ０２０８３、ｐＳＢ０２０８８、およびｐＳＢ０２０８９を参照されたい。グリコシル化変異体は、目的のポリペプチドを発現した。結果については図５を参照されたい。
ＦｉｍＨレクチンドメインｌｏｃｋ変異体も構築した。例えば、ｐＳＢ０２１５８を参照されたい。ｐＳＢ０２１５８構築物の発現の結果は、図６Ｂに示されている。
フルオレセイン－コンジュゲート化アミノフェニル－マンノピラノシド（ＡＰＭＰ）０．５ピコモルを使用する蛍光偏光アッセイ。アッセイを室温、３００ＲＰＭで、６４時間実行した。結果は図６Ｃに示されている。
（実施例３）
ＦｉｍＨ／Ｃ複合体、ｐＳＢ０１８７９およびｐＳＢ０１８８０の哺乳動物発現
ＦｉｍＨ／Ｃ複合体を生産するために、ＥＦ１アルファプロモーター下のＦｉｍＣと、野生型またはｍＩｇＫシグナルペプチドのいずれかを含むＦｉｍＨとの二重発現構築物を調製した。これらをｐＢｕｄＣＥ４．１哺乳動物発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローニングし、Ｃ末端ＨｉｓタグをＦｉｍＣに添加した。ＦｉｍＣバリアントを、分泌のためにｍＩｇＫシグナルペプチドを用いて設計したが、それというのも、これは、ＳｉｇｎａｌＰ分析に基づき、成熟タンパク質の第１の残基としてＧ３７ ＦｉｍＣを得るためにプラスの予測をもたらしたためであった。
より具体的には、これらの構築物を、ベクターｐＢｕｄＣＥ４．１内にＥＦ１アルファプロモーター下のＦｉｍＣ断片および同じベクター内にＣＭＶプロモーター下のＦｉｍＨ断片インサートを有するように設計した。ベクターｐＢｕｄＣＥ４．１は、哺乳動物細胞での発現のために２つのプロモーターを有するＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製の発現ベクターである。ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、かつ同じ部位でｐＢｕｄＣＥ４．１ベクターにサブクローニングすることにより、ＦｉｍＣ断片インサート（ｐＳＢ０１８８１インサート）をサブクローニングした。これらを、２ｘＹＴゼオシン５０ｕｇ／ｍｌプレート上に播種した。コロニーを２ｘＹＴに、ゼオシン５０ｕｇ／ｍｌと共に接種し、終夜、３７℃で増殖させ、プラスミドを準備した。これらをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化して、インサートについてチェックすると、すべてのコロニーが約７２２ｂｐのインサートサイズを有した。
ｐＳＢ０１８８１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＳＢ０１８７９インサートおよびｐＳＢ０１８８０インサートＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。これらの断片をゲル単離し、ｐＳＢ０１８８１ベクターにサブクローニングし、２ｘＹＴｚｅｏ５０ｕｇ／ｍｌプレート上に播種した。それぞれからのコロニーを２ｘＹＴ ｚｅｏ５０ｕｇ／ｍｌに接種し、終夜、３７℃で増殖させ、プラスミドを調製し、かつＦｉｍＣインサートについて試験するためにはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで、かつＦｉｍＨインサートについて試験するためにはＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。すべてのクローンが、両方のクローニング部位で、予測されたサイズのインサートを有した。続いて、ｐＳＢ０１８７９－１およびｐＳＢ０１８８０－１クローンを発現のために使用した。
ＦｉｍＨ／ＦｉｍＣ複合体は、ＥＸＰＩ２９３細胞においても発現することが実証されている。発現は、ＥＦ１α、ＣＡＧ、Ｕｂ、Ｔｕｂ、または他のプロモーターなどのプロモーターをスイッチングすることによって最適化され得る。
好ましいＮ末端プロセシング（すなわち、配列番号１のＦ２２でプロセシング）は、天然ＦｉｍＨリーダーペプチドでは示されなかった。
シグナルペプチド予測のために使用されるシグナルＰ４．１（ＤＴＵ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）からの例示的な結果を下に示す。追加のシグナルペプチドは、成熟ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の１位にＰｈｅの好ましいＮ末端を生産すると予測される。以下は、４つの共通のシグナル配列の代表的な試料セットに過ぎない。
次のシグナルペプチド配列は、成熟ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の１位にＰｈｅの好ましいＮ末端をもたらすと予測された：
Figure 0007597974000021
次のシグナルペプチド配列は、成熟ＦｉｍＨポリペプチドまたはその断片の１位にＰｈｅの好ましいＮ末端をもたらすとは予測されなかった：
Figure 0007597974000022
Figure 0007597974000023
Figure 0007597974000024
Figure 0007597974000025
（実施例４）
ＦｉｍＨとＦｉｍＧペプチドとのドナーストランド相補融合の哺乳動物発現
いくつかのリンカー長さを試験した。野生型ＦｉｍＨおよびＦｉｍＨのＦ２２に融合しているｍＩｇＫシグナルペプチドの両方において、ＦｉｍＨをＮ末端ＦｉｍＧペプチドに融合するこれらのリンカーを用いる組換え発現を準備した。
ＦｉｍＨドナーストランド相補ＦｉｍＧ構築物は、ＥＸＰＩ２９３細胞においてロバストな発現を有することも示されている。
好ましいＮ末端プロセシング（すなわち、配列番号１のＦ２２でのプロセシング）は、天然ＦｉｍＨリーダーペプチドでは示されなかった。
ドナーストランド相補構築物のために、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）において様々なリンカーおよびＦｉｍＧペプチドを含む基本構築物を生産するように、オリゴヌクレオチドを設計した。固有のＢｓｔＥＩＩ部位を、ＦｉｍＨの配列番号１のナンバリングによるＧ２９４ Ｖ２９５ Ｔ２９６残基に組み入れた。同じＢｓｔＥＩＩ部位をリンカーに組み込んで、基本構築物を生産した。
ｐＳＢ０１８８２－０１８９５のための基本構築物を構築した。プライマーを使用して、ＡＣＣＵＰＲＩＭＥ ＰＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でｐｃＤＮＡ３．１（＋）をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ（ＣＭＶプロモーターにおいて）およびＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化されるｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングし、ゲル単離して断片を除去した。
別の一過性トランスフェクションを、対照としてＥＸＰＩ２９３細胞を一緒に用いて、ｐＳＢ０１８７７、０１８７８、０１８７９、０１８８０、０１８８５、および０１８９２で実行した。
ｐＳＢ０１８８２からｐＳＢ０１８９５の構築物を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＥＸＰＩ２９３細胞における一過性トランスフェクション発現試験で製造者プロトコルに従って使用した。ＥＸＰＩ２９３細胞２０ｍＬにおける７２時間、１０ｕｌの馴化培地負荷での発現後の結果を示す図３を参照されたい；高レベルの発現が観察された；ｐＳＢ０１８７９およびｐＳＢ０１８８０構築物からの発現後にＦｉｍＨ／ＦｉｍＣ複合体が存在した；馴化培地２０ｍｌをＮｉｃｋｅｌ Ｅｘｃｅｌにバッチ結合させ、４０ＣＶで洗浄、イミダゾール中で溶離。
追加のＦｉｍＨドナーストランド相補構築物を調製した。例えば、ｐＳＢ０２１９８、ｐＳＢ０２１９９、ｐＳＢ０２２００、ｐＳＢ０２３０４、ｐＳＢ０２３０５、ｐＳＢ０２３０６、ｐＳＢ０２３０７、ｐＳＢ０２３０８構築物を参照されたい。ｐＳＢ２１９８ ＦｉｍＨ ｄｓｃＧ ｌｏｃｋ変異体構築物の発現は図７において示されている。ｐＳＢ２１９８ ＦｉｍＨ ｄｓｃＧ Ｌｏｃｋ変異体は、一過性発現から１２ｍｇ／Ｌをもたらした。
Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ ２．０４（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．）により、次が観察された（発現に使用された実際の細胞型はＨＥＫ細胞であった）：
Figure 0007597974000026
（実施例５）
プロセシングされるシグナルペプチドを含む分子量断片
Figure 0007597974000027
Figure 0007597974000028
Figure 0007597974000029
Figure 0007597974000030
Figure 0007597974000031
（実施例６）
ＦｉｍＨ成熟タンパク質中のＰｈｅ１（配列番号２のナンバリングによる）のＮ末端α－アミノ基は、Ｄ－マンノースのための重要な極性認識を提供する
理論またはメカニズムによって束縛されるものではないが、ＦｉｍＨ成熟タンパク質のＰｈｅ１（配列番号２のナンバリングによる）の直前での正確なシグナルペプチド切断が機能性ＦｉｍＨタンパク質を発現するために重要であることが示唆されている。ＦｉｍＨタンパク質のＰｈｅ１の前のＮ末端でアミノ酸を付加することなどによるＮ末端α－アミノ基の変化は、Ｄ－マンノースのＯ２－、Ｏ５－およびＯ６－原子との水素結合相互作用を破壊して、Ｄ－マンノースとの立体反発を導入し、それによって、マンノース結合をブロックし得る。このことは、配列番号２のＰｈｅ１の前に余分のＧｌｙ残基を付加することで、マンノース結合が検出されなくなるという本発明者らの実験観察で確認される。
Ｄ－マンノースに結合したＦｉｍＨの結晶構造の分析後に、次のことが観察された：配列番号２のナンバリングによるＦｉｍＨのＡｓｐ５４および配列番号２のナンバリングによるＦｉｍＨのＧｌｎ１３３の側鎖と共に、Ｐｈｅ１のＮ末端α－アミノ基は、Ｄ－マンノースのための重要な極性認識モチーフを提供し、突然変異およびこれらの極性相互作用の変化により、マンノース結合がなくなる。
（実施例７）
ＦｉｍＨ中のＰｈｅ１の側鎖は、Ｄ－マンノースと直接的に相互作用せず、むしろ、ＦｉｍＨの内部に埋没しており、Ｐｈｅ１が他の残基、例えば、脂肪族疎水性残基（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＶａｌ）によって置き換えられ得ることを示唆している。
Ｄ－マンノースおよびその類似体との複合体におけるＦｉｍＨの結晶構造の分析（例えば、ＰＤＢ ＩＤ：１ＱＵＮ）は、Ｐｈｅ１（配列番号２のナンバリングによる）の側鎖がＤ－マンノースと直接的に相互作用せず、むしろ、その芳香族環とＶａｌ５６、Ｔｙｒ９５、Ｇｌｎ１３３およびＰｈｅ１４４（配列番号２のナンバリングによる）の側鎖とのスタッキングによって結合ポケットを安定化することを示している。
Ｐｈｅの代わりの代替のＮ末端の残基は、ＦｉｍＨタンパク質を安定させ、マンノース結合を調節し、正確なシグナルペプチド切断を可能にし得る。そのような残基は、ＦｉｍＨの結晶構造の外観検査、またはＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（商標）［ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＬＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１７］、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（商標）［Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、２０１７］、ＭＯＥ（商標）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ、２０１７］、およびＲｏｓｅｔｔａ（商標）［Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、２０１７］などのコンピュータによるタンパク質設計ソフトウェアを使用する、より定量的選択などによる、当業界で公知の好適な方法によって同定することができる。実例が図９Ａ～９Ｃに示されている。置換えのアミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸であってよい（例えば、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ）。図１１は、ＦｉｍＨタンパク質を安定化し、かつマンノース結合を調節し得る脂肪族疎水性側鎖を有する他のアミノ酸、例えば、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌでの、Ｐｈｅ１のコンピュータによる突然変異誘発スキャニングを描写する。
（実施例８）
ＦｉｍＨタンパク質中の、配列番号２のナンバリングによるＡｓｎ７の突然変異は、マンノース、ｍＡｂ２１、またはｍＡｂ４７５結合に影響を及ぼすことなく、推定上のＮ－グリコシル化部位を除去して、脱アミドを防止し得る。
哺乳動物細胞系からの分泌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｉｍＨの過剰発現は、配列番号２のナンバリングによる残基Ａｓｎ７でのＮ結合グリコシル化をもたらし得る。加えて、残基Ａｓｎ７は、溶媒に暴露され、その後にＧｌｙ残基が続いているので、非常に脱アミドされやすい。
Ｄ－マンノースおよびその類似体（例えば、ＰＤＢ ＩＤ：１ＱＵＮ）との複合体におけるＦｉｍＨの結晶構造の分析は、Ａｓｎ７がマンノース結合部位から２０Å超離れていて、その部位での突然変異はマンノース結合に影響を及ぼさないはずであることを示している。したがって、他のアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＧｌｎ）へのＡｓｎ７の突然変異は効果的に、推定上のＮ－グリコシル化部位を除去し、かつ脱アミドを防止し得る。
（実施例９）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株
臨床株および派生株を、表１０に列挙する。さらなる参照株は、Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、臨床Ｏ２５ａ血清型株；およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２を含んでいた。
標的オープンリーディングフレームを除去するが、短いｓｃａｒ配列を残す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の遺伝子ノックアウトを構築した。
簡単にするために、加水分解されたＯ抗原鎖およびコア糖を、Ｏ多糖（ＯＰＳ）の次に示す。
Figure 0007597974000032
（実施例１０）
ｗｚｚＢ、ｆｅｐＥおよびＯ抗原遺伝子クラスタークローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマー
Figure 0007597974000033
（実施例１１）
プラスミド
プラスミドベクターおよびサブクローンを、表１２に列挙する。種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ遺伝子を担持するＰＣＲ断片を、精製ゲノムＤＮＡから増幅し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔに提供される高コピー数プラスミド中にサブクローニングした（図１２Ａ～１２Ｂ）。このプラスミドは、ｐＵＣレプリコンに基づく。プライマーＰ３およびＰ４を使用して、その天然プロモーターと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｗｚｚＢ遺伝子を増幅したが、それらは、それぞれ、ＵＤＰ－グルコース－６－デヒドロゲナーゼおよびホスホリボシルアデニンヌクレオチドヒドロラーゼをコードする近位および遠位遺伝子中の領域に結合するように設計される（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＧ１６５５ ＮＣ＿０００９１３．３に注釈されている）。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ遺伝子およびプロモーターを含有するＰＣＲ断片を、以前に記載されたプライマーを使用して増幅した。同様の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥプライマーを、利用可能なＧｅｎｂａｎｋゲノム配列または内部で生成された全ゲノムデータ（ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１の場合）に基づいて設計した。低コピー数プラスミドｐＢＡＤ３３を使用して、アラビノースプロモーターの制御下でＯ抗原生合成遺伝子を発現させた。プラスミドを最初に改変して、５’プロモーターおよび３’６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子と相同なユニバーサルプライマーを使用して増幅された長いＰＣＲ断片のクローニング（Ｇｉｂｓｏｎ法による）を容易にした（表１２）。Ｏ２５ｂ生合成オペロンを含有するｐＢＡＤ３３サブクローンが図１２Ａ～１２Ｂに図示されている。
Figure 0007597974000034
（実施例１２）
Ｏ抗原精製
発酵ブロスを、酢酸で処理して、１～２％の最終濃度（４．１の最終ｐＨ）にした。ＯＡｇの抽出および脱脂を、酸処理したブロスを１００℃に２時間加熱することによって達成した。酸加水分解の終わりに、バッチを周囲温度に冷却し、１４％ＮＨ４ＯＨを添加して、６．１の最終ｐＨにした。中和されたブロスを遠心分離し、遠心分離液を収集した。遠心分離液に、リン酸ナトリウム中のＣａＣｌ２を添加し、得られたスラリーを室温で３０ｍｉｎインキュベートした。遠心分離によって固体を除去し、１０ｋＤａ膜を使用して遠心分離液を１２倍に濃縮した後、水に対して２回透析濾過した。次いで、ＯＡｇを保持する保持液を、カーボンフィルターを使用して精製した。カーボン濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウムを用いて１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。最終硫酸アンモニウム濃度は２Ｍであった。硫酸アンモニウム処理したカーボン濾液を、泳動緩衝剤として２Ｍ硫酸アンモニウムを含む膜を使用してさらに精製した。ＯＡｇは流出液中に収集された。長いＯＡｇについては、ＨＩＣ濾液を濃縮した後、５ｋＤａ膜を使用して水（２０倍透析容量）に対して緩衝剤交換した。短い（天然）ＯＡｇ多糖については、ＭＷＣＯをさらに低減させて、収率を増強した。
（実施例１３）
Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原のＣＲＭ１９７へのコンジュゲーション
第１のセットの長鎖Ｏ２５ｂ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、過ヨウ素酸塩酸化、次いで、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）を使用するコンジュゲーションを使用して生産した（表１４）。コンジュゲートは、酸化レベルを変化させることによって３つの活性化レベル（低、中および高）で変化する。還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して、凍結乾燥された活性化された多糖と、ＤＭＳＯ媒体中で復元された凍結乾燥されたＣＲＭ１９７とを反応させることによって、コンジュゲートを生産した。コンジュゲーション反応を２３℃で２４ｈにわたって実行した後、水素化ホウ素ナトリウムを使用して３ｈにわたってキャッピングした。コンジュゲーションクエンチングステップの後、５ｍＭコハク酸塩／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を使用して、１００Ｋ ＭＷＣＯの再生セルロース膜を用いる限外濾過／透析濾過によって、コンジュゲートを精製した。コンジュゲートの最終濾過を、０．２２μｍ膜を使用して実施した。
別途明示的に指摘されない限り、以下の実施例を通して開示されるコンジュゲートは、コア糖部分を含む。
１．１．異種ポリメラーゼ鎖長調節因子によって提供される長鎖Ｏ抗原発現
初期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株構築は、Ｏ２５血清型に焦点を当てた。目標は、異種ｗｚｚＢまたはｆｅｐＥ遺伝子がＯ２５ ｗｚｚＢノックアウト株においてより長い鎖長を提供するかどうかを見るためにそれらを過剰発現させることであった。最初に、血液単離物をＰＣＲによってスクリーニングして、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂサブタイプの株を同定した。次に、株を、アンピシリンに対する感受性についてスクリーニングした。ｗｚｚＢ欠失が導入された１つのアンピシリン感受性Ｏ２５ｂ単離物ＧＡＲ２４０１が同定された。同様に、ｗｚｚＢ欠失を、Ｏ２５ａ株Ｏ２５Ｋ５Ｈ１中で行った。これらの突然変異の遺伝的相補性について、ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１に由来するｗｚｚＢ遺伝子を、高コピーＰＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩクローニングベクター中にサブクローニングし、エレクトロポレーションによって両株に導入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２に由来するさらなるｗｚｚＢ遺伝子；同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、ＧＡＲ２４０１、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ、ＮＲ－５、Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ－およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２に由来するｆｅｐＥ遺伝子をクローニングし、導入した。
細菌を、ＬＢ培地中で一晩増殖させ、ＬＰＳをフェノールで抽出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４～１２％アクリルアミド）により分解し、染色した。ゲルの各ウェルに、同数の細菌細胞（約２ＯＤ６００単位）から抽出されたＬＰＳを載せた。ＬＰＳのサイズを、内部天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ標準から、および広い鎖長分布を示す（１つの反復単位によって異なる）試料のサブセットから認識できるラダーを計測することによって見積もった。図１３Ａの左側に、Ｏ２５ａ Ｏ２５Ｋ５ＨΔｗｚｚＢのプラスミド形質転換体のＬＰＳプロファイルを示す；右側には、Ｏ２５ｂ ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体の同様のプロファイルを示す。Ｏ２５特異的血清を用いて精査した複製ゲルのイムノブロットを、図１３Ｂに示す。
この実験の結果は、相同なｗｚｚＢ遺伝子の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａΔｗｚｚＢ宿主への導入が、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｗｚｚＢと同様、短いＯ２５ ＬＰＳ（１０～２０ｘ）の発現を回復させることを示す。ＧＡＲ２４０１に由来するＯ２５ｂ ｗｚｚＢ遺伝子の導入は回復させないが、これは、この株に由来するＷｚｚＢ酵素が欠損していることを示唆している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷｚｚＢアミノ酸配列の比較は、Ａ２１０ＥおよびＰ２５３Ｓ置換が原因であり得ることを示唆する。重要なことには、Ｏ２５ａ Ｏ２５Ｋ５Ｈ１に由来するサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥは、非常に長い（ＶＬ）ＯＡｇ ＬＰＳを発現する能力をもたらし、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥによってもたらされるものをサイズにおいて超えるＯＡｇが生じる。
同様のパターンの発現が、ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ形質転換体について観察された：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａまたはＫ１２株ｗｚｚＢは、短いＬＰＳを産生する能力を回復させた。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥは最も長いＬＰＳを生成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥはそれよりわずかに短いＬＰＳを生成したが、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｗｚｚＢは中間サイズの長いＬＰＳ（Ｌ）をもたらした。非常に長いＬＰＳを産生する他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥ遺伝子の能力を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａΔｗｚｚＢの形質転換体を用いる別の実験において評価した。ＧＡＲ２４０１、Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ株およびＯ１５７シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素産生株に由来するｆｅｐＥ遺伝子も、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥについて生成されたＬＰＳの長さほどではないが、非常に長いＬＰＳを産生する能力をもたらした（図１４）。
サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥが、評価されたポリメラーゼ調節因子の最も長いＬＰＳを生成する血清型Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ株において確立されたら、本発明者らは次に、それが他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型においても非常に長いＬＰＳを産生するかどうかを決定しようとした。血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、Ｏ１５およびＯ７５の野生型菌血症単離物に、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドおよび抽出されたＬＰＳを形質転換した。図１５に示される結果は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥが血液感染と関連する他の一般的な血清型において非常に長いＬＰＳを作る能力をもたらすことができることを確認するものである。結果はまた、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥのプラスミドに基づく発現が、これらの株において内因性ｗｚｚＢによって通常示される鎖長の制御を無効化するようであることも示す。
１．２．一般的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株におけるＯ抗原のプラスミドに基づく発現
生体プロセス発達の観点から、複数の株の代わりに一般的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主において異なる血清型のＯ抗原を産生する能力は、個々の抗原の製造を大きく単純化するであろう。この目的のために、異なる血清型に由来するＯ抗原遺伝子クラスターをＰＣＲによって増幅し、アラビノース調節性プロモーターの制御下で低コピー数プラスミド（ｐＢＡＤ３３）中にクローニングした。このプラスミドは、異なる（ｐ１５ａ）レプリコンおよび異なる選択マーカー（クロラムフェニコール対カナマイシン）を担持するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥプラスミドと適合する（同時に存在し得る）。最初の実験において、ｐＢＡＤ３３ Ｏ２５ｂオペロンプラスミドサブクローンを、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥプラスミドと共に、ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ中に同時トランスフェクトし、形質転換体を、０．２％アラビノースの存在下または非存在下で増殖させた。図１６Ａ～１６Ｂに示される結果は、非常に長いＯ抗原ＬＰＳがアラビノース依存的様式で産生されることを示した。
他の血清型からクローニングされたＯ抗原遺伝子クラスターも同様に評価し、その結果を図１７に示した。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥとｐＢＡＤ３３－ＯＡｇプラスミドとの同時発現により、Ｏ１、Ｏ２（４つのクローンのうちの２つについて）、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５血清型に対応する検出可能な長鎖ＬＰＳが得られた。未知の理由から、ｐＢＡＤ３３－Ｏ６プラスミドは、試験した４つ全部の単離物において検出可能なＬＰＳをもたらすことができなかった。発現レベルは可変性であったが、結果は、一般的な宿主中での長鎖Ｏ抗原の発現が実現可能であることを示している。しかしながら、一部の場合、例えば、プラスミドプロモーター配列の改変による、発現を改善するためのさらなる最適化が必要であり得る。
サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ｆｅｐＥプラスミドを含む、または含まない異なる血清型Ｏ２５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に由来するＬＰＳのプロファイルを、図１８に示す。２つの株を、Ｏ抗原の発酵、抽出および精製について試験した：天然の短いＯ２５ｂ ＯＡｇの産生については、ＧＡＲ２８３１；および長いＯ２５ｂ ＯＡｇの産生については、ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ。図１８のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに示される対応する短い、および長い形態のＬＰＳは赤色で強調される。多糖を、酢酸を用いて発酵した細菌から直接抽出し、精製した。精製された短い、および長い、または非常に長いＯ２５ｂ多糖のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを、図１９Ａ～１９Ｂに示す。２つのロットの短い多糖（ＧＡＲ２８３１由来）の特性を、単一の非常に長い多糖調製物（ＧＡＲ２４０１ΔｗｚｚＢ／ｆｅｐＥ株由来）と比較する。長いＯ抗原の分子量は、短いＯ抗原のそれよりも３．３倍大きく、反復単位数は約６５（非常に長い）と約２０であると見積もられた。表１３を参照されたい。
Figure 0007597974000035
非常に長いＯ２５ｂ Ｏ抗原多糖を、従来の還元的アミノ化プロセスを使用して、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた。３つの異なるロットの糖コンジュゲートを、変化する過ヨウ素酸塩活性化度で調製した：中（５．５％）、低（４．４％）および高（８．３％）。得られる調製物および非コンジュゲート化多糖は、内毒素夾雑物を含まないことが示された（表１４）。
４匹のウサギの群（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅのメス）に、図２０Ａに示されるスケジュールに従って、１０ｍｃｇの糖コンジュゲートおよび２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバントをそれぞれワクチン接種し、血清を採取した（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３）。１０ｍｃｇ用量は、細菌糖コンジュゲートの評価においてウサギに慣用的に投与される範囲の下端であることは注目に値する（２０～５０ｍｃｇがより典型的である）。また、１群のウサギには、別の試験（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＧＢ－０６９８）において、同じ用量（１０ｍｃｇの多糖＋２０ｍｃｇのＱＳ２１アジュバント）および同一の投与スケジュールを使用して、非コンジュゲート化多糖をワクチン接種した。
カルボキシビーズを、非コンジュゲート化Ｏ２５ｂの長い多糖を予め結合させたメチル化ヒト血清アルブミンで被覆したＬＵＭＩＮＥＸアッセイにおいて、３つのＯ２５ｂ糖コンジュゲート調製物に対するウサギ抗体応答を評価した。血清試料中のＯ２５ｂ特異的ＩｇＧ抗体の存在を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。最良に応答するウサギ（４匹の各群に由来する１匹）において第０週（免疫前）、第６週（用量２後、ＰＤ２）、第８週（用量３後、ＰＤ３）および第１２週（用量４後、ＰＤ４）で採取した血清中で観察された免疫応答のプロファイルを、図２１Ａ～２１Ｃに示す。１２匹のウサギのいずれにおいても、有意な免疫前血清ＩｇＧ力価は検出されなかった。対照的に、Ｏ２５ｂ抗原特異的抗体応答が、３つ全部の群におけるウサギに由来するワクチン接種後血清において検出され、低活性化糖コンジュゲート群の応答は、中または高活性化糖コンジュゲート群よりもわずかに高い傾向があった。最大応答は、用量３後の時点までに観察された。低活性化群の１匹のウサギおよび高活性化群の１匹のウサギは、ワクチン接種に応答することができなった（非応答動物）。
長いＯ２５ｂ ＯＡｇ多糖の免疫原性に対するＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲーションの影響を評価するために、非コンジュゲート化多糖をワクチン接種したウサギに由来する血清中の抗体の存在を、低活性化ＣＲＭ１９７糖コンジュゲートをワクチン接種したウサギに由来する血清と比較した（図２２Ａ～２２Ｆ）。意外なことに、遊離多糖は免疫原性ではなく、免疫血清および免疫前血清においてＩｇＧ応答を実質的に惹起しなかった（図２２Ａ）。対照的に、ある血清希釈率範囲（１：１００～１：６４００）にわたって、Ｏ２５ｂ ＯＡｇ－ＣＲＭ１９７をワクチン接種した４匹のウサギのうちの３匹に由来するＰＤ４血清中で、免疫前血清レベルより約１０倍高いＯ２５ｂ ＯＡｇ特異的ＩｇＧ平均蛍光強度値（ＭＦＩ）が観察された。これらの結果は、１０ｍｃｇの用量レベルでＯ２５ｂ ＯＡｇ多糖に対するＩｇＧ抗体を生成するための担体タンパク質コンジュゲーションの必要性を示している。
ＴＳＡプレート上で増殖させた細菌を、ＰＢＳ中に懸濁し、２．０のＯＤ６００に調整し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で固定した。４％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１ｈブロックした後、細菌を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の免疫前およびＰＤ３免疫血清の連続希釈液と共にインキュベートし、結合したＩｇＧを、ＰＥ標識二次Ｆ（ａｂ）抗体を用いて検出した。
Ｏ２５ｂ ＯＡｇ－ＣＲＭ１９７によって惹起されたＯ２５ｂ抗体の特異性を、インタクトな細菌を用いるフローサイトメトリー実験において示した。ＩｇＧの全細胞への結合を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター中でＰＥコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。
図２３Ａ～２３Ｃに示されるように、免疫前のウサギ抗体は、野生型血清型Ｏ２５ｂ単離物ＧＡＲ２８３１およびＧＡＲ２４０１またはＫ－１２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に結合することができなかったが、マッチさせたＰＤ３抗体は濃度依存的様式でＯ２５ｂ細菌を染色した。ＯＡｇを発現する能力を欠く陰性対照Ｋ－１２株は、その表面上の露出した内側コアオリゴ糖エピトープの存在に十中八九起因して、ＰＤ３抗体の非常に弱い結合しか示さなかった。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥプラスミドの、野生型Ｏ２５ｂ単離物への導入により、より長いＯＡｇ多糖によって提供されるより高い密度の免疫原性エピトープと一致して、有意に増強された染色が得られた。
結論：記載された結果は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥがサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種における非常に長いＯ抗原多糖の決定因子であるだけでなく、異なるＯ抗原血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対して、非常に長いＯＡｇを作る能力をもたらすことができることを示している。精製および適切な担体タンパク質への化学的コンジュゲーションを容易にすることによって、ならびにより高い分子量の複合体の形成を介して免疫原性を潜在的に増強することによって、生体プロセス発達に関する特性が改善されたＯ抗原ワクチン多糖を生産するために、この特性を活用することができる。
（実施例１４）
初期ウサギ試験は第１のポリクローナル抗体試薬およびＲＡＣ Ｏ２５ｂ ＯＡｇ－ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ応答を生成した
長鎖Ｏ２５ｂ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、過ヨウ素酸塩酸化、次いで、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）を使用するコンジュゲーションを使用して生産した（表１４）。表２４も参照されたい。
Figure 0007597974000036
ウサギ試験１（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３）（実施例１３にも上記されている）では、１０μｇのＬ－、Ｍ－またはＨ－活性化ＲＡＣ（＋ＱＳ２１）を用いる５匹のウサギ／群が、図２０Ａに示されるスケジュールに従って組成物を受けた。非コンジュゲート化遊離Ｏ２５ｂ多糖は、追跡ウサギ試験（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＧＢ－０６９８）において免疫原性ではないことが観察された（図２５を参照されたい）。
ウサギ試験２（ＶＡＣ－２０１８－ＰＲＬ－ＥＣ－０７７）では、Ｌ－ＲＡＣ（ＡｌＯＨ３、ＱＳ２１、またはアジュバントなし）を用いる２匹のウサギ／群が、図２０Ｂに示されるスケジュールに従って組成物を受けた。
ウサギ４－１、４－２、５－１、５－２、６－１、および６－２は、実施例１３に記載された非常に長い非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ多糖を受け、第１８週の血清を試験した。
より具体的には、５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、１００μｇのＡｌＯＨ３アジュバントを含む組成物を、ウサギ４－１に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、１００μｇのＡｌＯＨ３アジュバントを含む組成物を、ウサギ４－２に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、５０μｇのＱＳ－２１アジュバントを含む組成物を、ウサギ５－１に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ、５０μｇのＱＳ－２１アジュバントを含む組成物を、ウサギ５－２に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂを含み、アジュバントを含まない組成物を、ウサギ６－１に投与した。５０μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂを含み、アジュバントを含まない組成物を、ウサギ６－２に投与した。
（実施例１５）
Ｏ２５ｂ ＲＡＣコンジュゲートを用いたウサギ試験：ｄＬＩＡ血清希釈力価
試験１（ＶＡＣ－２０１７－ＰＲＬ－ＥＣ－０７２３）に由来する最良に応答するウサギに対する、ウサギ試験２（ＶＡＣ－２０１８－ＰＲＬ－ＥＣ－０７７）のＯ２５ｂ ｄＬＩＡ血清希釈力価。これらの実験のために、Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原のポリリシンコンジュゲートを、以前に記載されたメチル化血清アルブミン長鎖Ｏ抗原混合物の代わりにＬｕｍｉｎｅｘカルボキシビーズ上に受動的に吸着させる、改変された直接結合Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを実行した。ポリリシン－Ｏ２５ｂコンジュゲートの使用は、アッセイの感度およびＩｇＧ濃度依存的応答の質を改善し、曲線適合の使用（４パラメーター非線形式）によって血清希釈率の決定を可能にした。第１の試験に由来する最も高い力価のウサギに由来する血清中のＯ２５ｂＩｇＧ力価を、表１５中の第２の試験のウサギに由来する血清と比較する。
Figure 0007597974000037
第２のウサギ試験におけるより高用量（５０／２０μｇ対１０μｇ）は、ＩｇＧ力価を改善しなかった。
２カ月の休止は、ＩｇＧ応答を促進する（より短い間隔については観察されなかった）。
ミョウバンは、ＱＳ２１またはアジュバントなしと比較して、ウサギにおけるＩｇＧ応答を増強するようである。
子ウサギ補体（ＢＲＣ）および好中球の供給源としてのＨＬ６０細胞を用いるオプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を確立して、Ｏ抗原糖コンジュゲートの機能的免疫原性を測定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２８３１の予め凍結された細菌ストックを、３７℃でＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）培地中で増殖させた。細胞をペレット化し、２０％グリセロールを添加したＰＢＳ中、１ｍｌあたり１ＯＤ６００単位の濃度で懸濁し、凍結した。予め滴定し解凍した細菌を、１％ゼラチンを含むＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）中で０．５ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、１０μＬ（１０３ＣＦＵ）を、Ｕ底組織培養マイクロプレート中、２０μＬの連続希釈した血清と混合し、混合物を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３０ｍｉｎ、７００ｒｐｍ（ＢＥＬＬＣＯ Ｓｈａｋｅｒ）で振とうした。１０μｌの２．５％補体（子ウサギ血清、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ ３１０６１－３、ＨＢＧ中で予め希釈）および２０μＬのＨＬ－６０細胞（０．７５ｘ１０７／ｍｌ）および４０μＬのＨＢＧをＵ底組織培養マイクロプレートに添加し、混合物を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４５ｍｉｎ、７００ｒｐｍ（ＢＥＬＬＣＯ Ｓｈａｋｅｒ）で振とうした。続いて、それぞれ１００μＬの反応液のうちの１０μＬを、１００μＬの水を加え、減圧濾過し、１５０μＬの５０％ＬＢを加えることによって調製された、予め湿らせたＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮＨＴＳ ＨＶフィルタープレートの対応するウェルに移した。フィルタープレートを減圧濾過し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）分析装置およびＩＭＭＵＮＯＣＡＰＴＵＲＥソフトウェアを使用して、ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ色素および脱染溶液を用いて固定、染色、および脱染した後、コロニーを数えた。ＯＰＡ活性の特異性を確立するために、免疫血清を、１００μｇ／ｍＬの精製された長鎖Ｏ２５ｂ Ｏ抗原と共に予備インキュベートした後、ＯＰＡ反応における他のアッセイ成分と混合した。ＯＰＡアッセイは、ＨＬ６０細胞または補体に対する観察される殺傷の依存性を証明するために、これらの成分を含まない対照反応を含む。
両方のウサギ試験に由来する代表的なウサギに由来するマッチさせた免疫前およびワクチン接種後の血清試料を、アッセイにおいて評価し、血清希釈力価を決定した（表１６、図２６Ａ～２６Ｂ）。非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖と共に予備インキュベートすることにより、ＯＰＡの特異性を示す殺菌活性が遮断された（図１９Ｃ）。表１６はＯＰＡ力価を示す。
ウサギ２－３に、以下のように投薬した：ウサギ２－３の投薬：１０／１０／１０／１０μｇのＲＡＣコンジュゲート＋ＱＳ２１、用量４後（ＰＤ）に出血させた。ウサギ１－２に、以下のように投薬した：５０／２０／２０／２０μｇのＲＡＣコンジュゲート＋Ａｌ（ＯＨ）３、ＰＤ４に出血させた。
Figure 0007597974000038
（実施例１６）
非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖および誘導されたＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲートにより惹起されるＯ抗原Ｏ２５ｂ ＩｇＧレベル
１０匹のＣＤ－１マウスの群に、皮下注射により、０．２または２．０μｇ／動物のＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原糖コンジュゲートを、第０、５および１３週で投与し、免疫原性試験のために第３週（用量１後、ＰＤ１）、第６週（用量２後、ＰＤ２）および第１３週（用量３後、ＰＤ３）の時点で採血した。抗原特異的ＩｇＧのレベルを、内部標準としてのＯ２５ｂ特異的マウスｍＡｂを用いる定量的Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（実施例１５の詳細を参照されたい）によって決定した。ベースラインＩｇＧレベル（点線）を、２０匹の無作為に選択されたワクチン非接種マウスからプールされた血清中で決定した。遊離非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖Ｏ抗原多糖免疫原は、任意の時点でベースラインレベルを超えるＩｇＧを誘導しなかった。対照的に、ＩｇＧ応答は、Ｏ２５ｂ－ＣＲＭ１９７ ＲＡＣ長鎖コンジュゲート糖コンジュゲートの２回投与後に観察された：ロバストで均一なＩｇＧ応答が、ＰＤ３までに観察され、ＰＤ２で中間レベルおよびより変動性のＩｇＧレベルが観察された。ＧＭＴ ＩｇＧ値（ｎｇ／ｍｌ）は９５％ＣＩエラーバーと共に示される。図２７Ａ～２７Ｃを参照されたい。
（実施例１７）
Ｏ２５ｂ子ウサギ補体（ＢＲＣ）ＯＰＡの特異性
Ａ～Ｂ）ウサギ２～３および１～２に由来するＯ２５ｂ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ長鎖Ｏ抗原免疫後血清（マッチさせた免疫前対照血清ではなく）は、殺菌性ＯＰＡ活性を示す。Ｃ）ウサギ１～２に由来する免疫血清のＯＰＡ活性を、１００μｇ／ｍＬの長鎖Ｏ抗原Ｏ２５ｂ多糖と共に予備インキュベートすることによって遮断した。ＧＡＲ２８３１細菌株を、３７℃で１ｈ、ＨＬ６０、２．５％ＢＲＣおよび血清の連続希釈液と共にインキュベートし、フィルタープレート上のマイクロコロニーを計測することにより（ＣＦＵ）、生存する細菌を数えた。図２６Ａ～２６Ｃを参照されたい。
（実施例１８）
ＲＡＣおよびｅＴＥＣ Ｏ２５ｂ長鎖糖コンジュゲートは、単一末端糖コンジュゲートよりも免疫原性が高い
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性ＭＤＲ株Ａｔｌａｓ１８７９１３を用いたＢＲＣ ＯＰＡアッセイ。２０匹のＣＤ－１マウスの群に、図２８Ａ～２８Ｂに示されるのと同じスケジュールに従って２μｇの糖コンジュゲートをワクチン接種し、用量２後（ＰＤ２）（図２８Ａ）および用量３後（ＰＤ３）（図２８Ｂ）の時点でＯＰＡ応答を決定した。バーは、９５％ＣＩを含むＧＭＴを示す。ワクチン非接種ベースラインを超える応答動物率が示される。異なる群に由来する対数変換データを評価して、Ｗｅｌｃｈの補正を行った対応のないｔ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、差異が統計的に有意であるかどうかを評価した。結果を、表１７にまとめる。図２８Ａ～２８Ｂを参照されたい。２μｇのｅＴＥＣ Ｏ１ａ長鎖糖コンジュゲートをワクチン接種したマウスにおいては、ＰＤ２およびＰＤ３でのＯ１ａに対するＯＰＡ力価（データは示さない）は、表１７に示される、それぞれ、ＰＤ２およびＰＤ３でのＯ２５ｂに対するＯＰＡ力価よりも高いことが観察された。
Figure 0007597974000039
（実施例１９）
多糖活性化のレベルを改変することによってｅＴＥＣ化学のＯＰＡ免疫原性を改善することができる
カルバペネム耐性フルオロキノロン耐性ＭＤＲ株Ａｔｌａｓ１８７９１３を用いたＢＲＣ ＯＰＡアッセイ。２０匹のＣＤ－１マウスの群に、０．２μｇまたは２μｇの示された長鎖Ｏ２５ｂ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートをワクチン接種し、ＯＰＡ応答をＰＤ２の時点で決定した。４％活性化と１７％活性化の群に由来する集約された対数変換データを評価して、Ｗｅｌｃｈの補正を行った対応のないｔ検定（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、ＯＰＡ応答の差異が統計的に有意であることを確認した。個々の群に関するＧＭＴおよび応答動物率を、表１８にまとめる。図２９を参照されたい。
Figure 0007597974000040
（実施例２０）
負荷試験は、長鎖大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ｂ ｅＴＥＣコンジュゲートが３つの用量後に保護を惹起することを示す
示されたスケジュールに従って２μｇの用量で免疫された２０匹のＣＤ－１マウスの群に、１ｘ１０９個のＧＡＲ２８３１株の細菌をＩＰによりチャレンジした。その後の生存を、６日間にわたってモニタリングした。４％、１０％または１７％のレベルで活性化されたｅＴＥＣ糖コンジュゲートをワクチン接種したマウスの群は、致死的感染から保護されたが、ワクチン非接種対照マウスまたは２μｇの非コンジュゲート化Ｏ２５ｂ長鎖多糖をワクチン接種したマウスは保護されなかった。図３０Ａ～３０Ｂを参照されたい。
（実施例２１）
ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの調製のためのプロセス
糖の活性化およびシスタミン二塩酸塩を用いたチオール化。糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の水分含量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）分析によって決定し、０．１～１．０％、典型的には０．５％の水分含量に達するように調整する。
活性化を開始させるために、１，１’－カルボニル－ジ－１，２，４－トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液を、ＤＭＳＯ中、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新鮮に調製する。様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１～１０モル当量）を用いて糖を活性化し、ｒｔまたは３５℃で１～５時間、反応を進行させる。活性化反応溶液中の残留ＣＤＩ／ＣＤＴをクエンチするために、水を添加した。添加される水の量を決定し、最終水分含量が総水分量の２～３％となるように計算を実施する。反応をｒｔで０．５時間進行させた。５０ｍｇ／ｍＬの濃度の無水ＤＭＳＯ中でシスタミン二塩酸塩を新鮮に調製する。活性化された糖を、１～２モル当量のシスタミン二塩酸塩と反応させる。あるいは、活性化された糖を、１～２モル当量のシスタミン塩酸塩と反応させる。チオール化反応をｒｔで５～２０時間進行させて、チオール化された糖を生産する。チオール化レベルは、添加されるＣＤＴ／ＣＤＩの量によって決定される。
活性化されたチオール化された糖の還元および精製。チオール化された糖の反応混合物に、３～６モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液を添加し、ｒｔで３～５時間進行させる。次いで、反応混合物を、予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに添加することによって５～１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化された糖の透析濾過を、３０～４０倍透析容量の予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに対して実施する。活性化されたチオール化された糖の保持液のアリコートを取り出し、糖濃度およびチオール含量を決定する（Ｅｌｌｍａｎアッセイ）。
ブロモアセチル化された担体タンパク質の活性化および精製。担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の好適な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する。
担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、最初に活性化の前にｐＨ約７で、８±３℃で保持する。タンパク質溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）としてブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、３０～６０分間にわたって５±３℃で穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用して、１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイによって見積もる。
活性化の程度を、伝導率検出が抑制されたイオン交換液体クロマトグラフィー（イオンクロマトグラフィー）によるトータルブロミドアッセイによって決定する。活性化されたブロモアセチル化されたタンパク質上の結合した臭化物を、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切断し、存在し得る遊離臭化物と共に定量する。タンパク質上の残存する共有結合した臭化物を、試料をアルカリ性２－メルカプトエタノール中で加熱することによってイオン性臭化物に変換することによって遊離させる。
ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７の活性化および精製。１０ｍＭリン酸緩衝化０．９％ＮａＣｌ ｐＨ７（ＰＢＳ）を用いてＣＲＭ１９７を５ｍｇ／ｍＬに希釈した後、１Ｍストック溶液を使用して０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ７．０にした。２０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡＡＮＳを、ＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比１：０．３５（ｗ：ｗ）で添加した。反応混合物を３℃～１１℃で３０ｍｉｎ～１時間にわたってインキュベートした後、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を使用する限外濾過／透析濾過によって精製した。精製された活性化されたＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイによってアッセイして、タンパク質濃度を決定した後、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。凍結保護剤としてスクロースを５％ｗｔ／ｖｏｌとなるように添加し、活性化されたタンパク質を凍結し、コンジュゲーションに必要となるまで－２５℃で保存した。
ＣＲＭ１９７のリシン残基のブロモアセチル化は非常に一貫しており、利用可能な３９個のリシンから１５～２５個のリシンの活性化が得られた。この反応は、高収率の活性化されたタンパク質を生産した。
活性化されたチオール化された糖の、ブロモアセチル化された担体タンパク質へのコンジュゲーション。続いて、ブロモアセチル化された担体タンパク質および活性化されたチオール化された糖を添加する。糖／タンパク質インプット比は０．８±０．２である。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて９．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±４時間にわたって進行させる。
残存する反応性官能基のキャッピング。担体タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３～５時間、キャッピング試薬としての２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を、５℃で２０～２４時間、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。
ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの精製。コンジュゲーション反応（ＩＡＡキャッピング後）混合物を、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して実施する。次いで、糖コンジュゲート保持液を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートのアリコートを、アッセイのために取り出す。残りの糖コンジュゲートを、５℃で保存する。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。
（実施例２２）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５Ｂ ＥＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂリポ多糖の活性化。凍結乾燥された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥されたＯ２５ｂ／ＤＭＳＯ溶液の水分含量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）分析によって決定した。Ｏ２５ｂ／ＤＭＳＯ溶液にＷＦＩを添加することによって水分含量を調整して、０．５％の水分含量を達成した。
活性化を開始させるために、１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を、ＤＭＳＯ溶液中、１００ｍｇ／ｍＬとして新鮮に調製した。チオール化ステップの前に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖を、様々な量のＣＤＩで活性化した。ＣＤＩ活性化を、ｒｔまたは３５℃で１～３時間にわたって実行した。活性化反応溶液中の残留ＣＤＩをクエンチするために、水を添加した。添加される水の量を決定し、最終水分含量が総水分量の２～３％となるように計算を実施する。反応をｒｔで０．５時間進行させた。
活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖のチオール化。シスタミン二塩酸塩を、無水ＤＭＳＯ中で新鮮に調製し、１～２モル当量のシスタミン二塩酸塩を、活性化された多糖の反応溶液に添加した。反応をｒｔで２０±４時間進行させた。
活性化されたチオール化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖の還元および精製。チオール化された糖の反応混合物に、３～６モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液を添加し、ｒｔで３～５時間進行させた。次いで、反応混合物を、予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに添加することによって５～１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化された糖の透析濾過を、５Ｋ ＭＷＣＯの限外濾過膜カセットを用いて４０倍透析容量の予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに対して実施した。チオール化されたＯ２５ｂ多糖保持液を、糖濃度アッセイとチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイとの両方のために取り出した。活性化プロセスのフローダイアグラムを、図３２Ａに提供する。
コンジュゲーションプロセス－チオール化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖の、ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７へのコンジュゲーション。実施例２１に記載されたように、ブロモアセチル化によってＣＲＭ１９７担体タンパク質を別々に活性化した後、コンジュゲーション反応のために活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖と反応させた。ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７と、チオール化されたＯ２５ｂ多糖とを、反応容器中で一緒に混合した。糖／タンパク質インプット比は０．８±０．２であった。反応ｐＨを、８．０～１０．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±４時間にわたって進行させた。
ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７およびチオール化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ多糖上の反応基のキャッピング。ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってキャッピングした後、５℃で２０～２４時間、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて、チオール化されたＯ２５ｂ－多糖の残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。
ｅＴＥＣ結合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ糖コンジュゲートの精製。コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍのフィルターを通して濾過した。Ｏ２５ｂ糖コンジュゲートの透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯの限外濾過膜カセットを用いて実行した。５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して透析濾過を実施した。次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ糖コンジュゲート１００Ｋ保持液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５℃で保存した。
コンジュゲーションプロセスのフローダイアグラムを、図３２Ｂに提供する。
結果
いくつかのバッチの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｏ２５ｂ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートに関する反応パラメーターおよび特性評価データを、表１９に示す。シスタミン二塩酸塩を用いるＣＤＩ活性化－チオール化は、４１～９２％の糖収率および５％未満から１４％の遊離糖を有する糖コンジュゲートを生成した。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５も参照されたい。
Figure 0007597974000041
（実施例２３）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖－ＣＲＭ１９７ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製のための手順（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ｂ、Ｏ１ａ、Ｏ２、およびＯ６に由来するＯ抗原に適用される）
多糖の活性化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。活性化を開始させるために、様々な量の１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１～１０モル当量）を多糖溶液に添加し、ｒｔまたは３５℃で１～５時間、反応を進行させる。次いで、水（２～３％、ｖ／ｖ）を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＩをクエンチした。反応をｒｔで０．５時間進行させた後、１～２モル当量のシスタミン二塩酸塩を添加する。反応をｒｔで５～２０時間進行させた後、３～６モル当量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理して、チオール化された糖を生産する。チオール化レベルは、添加されるＣＤＩの量によって決定される。
次いで、反応混合物を、予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに添加することによって５～１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化された糖の透析濾過を、３０～４０倍透析容量の予め冷やした１０ｍＭリン酸二水素ナトリウムに対して実施する。活性化されたチオール化された糖の保持液のアリコートを取り出し、糖濃度およびチオール含量を決定する（Ｅｌｌｍａｎアッセイ）。
担体タンパク質（ＣＲＭ１９７）の活性化
ＣＲＭ１９７（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を、最初に活性化の前にｐＨ約8で、８±３℃で保持する。タンパク質溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）としてブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、３０～６０分間にわたって５±３℃で穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用して、１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイによって見積もる。
コンジュゲーション
続いて、活性化されたＣＲＭ１９７および活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を、リアクターに添加し、混合する。糖／タンパク質インプット比は１±０．２である。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて９．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±４時間にわたって進行させる。担体タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３～５時間、キャッピング試薬としての２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を、５℃で２０～２４時間、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。次いで、反応混合物を、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して実施される限外濾過／透析濾過を使用して精製する。次いで、精製されたコンジュゲートを、０．２μｍフィルターを通して濾過する。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。
（実施例２４）
一般的手順－還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）によるＯ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６、２５ｂ由来）多糖のコンジュゲーション
ジメチルスルホキシド中でのコンジュゲーション（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）
多糖の活性化
計算された量の５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）の連続添加によって１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０±０．２）中で多糖酸化を実行して、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要に応じて、反応ｐＨを、近似的に、ｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を４℃に冷却した。酸化を、約０．０９～０．１３モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加によって開始させた。酸化反応を、近似的に、２０±４ｈにわたって５±３℃で実施した。
活性化された多糖の濃度および透析濾過を、５Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過カセットを使用して実行した。透析濾過を、２０倍透析容量のＷＦＩに対して実施した。次いで、精製された活性化された多糖を５±３℃で保存した。精製された活性化された糖を、特に、（ｉ）比色アッセイによる糖濃度；（ｉｉ）比色アッセイによるアルデヒド濃度；（ｉｉｉ）酸化度；および（ｉｖ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性評価する。
活性化された多糖と、スクロース賦形剤との混合、および凍結乾燥
活性化された多糖を、スクロースと、活性化された多糖１グラムあたり２５グラムのスクロースの比で混合した。次いで、混ぜ合わせた混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥の後、凍結乾燥された活性化された多糖を含有するボトルを、－２０±５℃で保存した。計算された量のＣＲＭ１９７タンパク質をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した。凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を、－２０±５℃で保存した。
凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質の復元
凍結乾燥された活性化された多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。多糖の完全な溶解時に、復元のために等量の無水ＤＭＳＯを、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７に添加した。
コンジュゲーションおよびキャッピング
復元された活性化された多糖を、反応容器中で復元されたＣＲＭ１９７と混ぜ合わせた後、完全に混合して、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとのコンジュゲーションを開始する前に透明な溶液を得た。反応溶液中の最終多糖濃度は、約１ｇ／Ｌであった。反応混合物に０．５～２．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３±２℃で２０～４８ｈインキュベートすることによって、コンジュゲーションを開始させた。２モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加することによってコンジュゲーション反応を終結させて、未反応のアルデヒドをキャッピングした。このキャッピング反応は、２３±２℃で３±１ｈにわたって継続した。
コンジュゲートの精製
１００～３００ＫのＭＷＣＯの膜を使用する接線流濾過による精製に備えて、コンジュゲート溶液を、冷やした５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水（ｐＨ６．０）で１：１０に希釈した。
希釈されたコンジュゲート溶液を、５μｍフィルターに通過させ、媒体として５ｍＭコハク酸塩／０．９％塩水（ｐＨ６．０）を使用して透析濾過を実施した。透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を、０．２２μｍフィルターを通して移した。コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩／０．９％塩水（ｐＨ６）を用いて、約０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖濃度までさらに希釈した。あるいは、１００～３００ＫのＭＷＣＯの膜を使用する接線流濾過によって２０ｍＭヒスチジン－０．９％塩水（ｐＨ６．５）を使用して、コンジュゲートを精製する。最後の０．２２μｍ濾過ステップを完了させて、免疫原性コンジュゲートを取得した。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。
（実施例２５）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、およびＯ６から適用される、水性緩衝剤（ＲＡＣ／水性）中でのコンジュゲーション
多糖の活性化および透析濾過を、ＤＭＳＯに基づくコンジュゲーションについてのものと同じ様式で実施した。
濾過した活性化された糖を、血清型に応じて、０．４～２ｗ／ｗの範囲の多糖のタンパク質に対する質量比でＣＲＭ１９７と混合した。このインプット比を選択して、得られるコンジュゲート中の多糖のＣＲＭ１９７に対する比を制御した。
次いで、混ぜ合わせた混合物を凍結乾燥した。コンジュゲーション時に、多糖とタンパク質との混合物を、血清型に応じて５～２５ｇ／Ｌの範囲の多糖濃度で０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤中に溶解し、血清型に応じてｐＨを６．０～８．０に調整した。０．５～２．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加し、２３±２℃で２０～４８ｈにわたってインキュベートすることにより、コンジュゲーションを開始させた。１～２モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加することによってコンジュゲーション反応を終結させて、未反応のアルデヒドをキャッピングした。
あるいは、濾過した活性化された糖および計算された量のＣＲＭ１９７タンパク質をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤中への溶解時に混合した後、上記のようにコンジュゲーションを進行させることができる。
Figure 0007597974000042
（実施例２６）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖－ＣＲＭ１９７単一末端コンジュゲートの調製のための手順
グラム陰性細菌の外膜の一般的な成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、リピドＡ、コア領域、およびＯ抗原（Ｏ特異的多糖またはＯ多糖とも呼ばれる）を含む。異なる血清型のＯ抗原反復単位は、その組成、構造および血清学的特徴において異なる。本発明で使用されるＯ抗原は、その鎖末端に２－ケト－３－デオキシオクタン酸（ＫＤＯ）と呼ばれる糖単位を含有するコアドメインに結合される。多糖鎖の無作為活性化（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、またはカルボジイミドを用いる活性化）に基づく一部のコンジュゲーション法とは異なる。本発明は、チオール官能基のアンマスク時に、ジスルフィドアミンリンカーを用いたＫＤＯの選択的活性化を含むコンジュゲーションプロセスを開示し、次いで、それは図３１（単一末端コンジュゲートの調製）に描写されるようにブロモ活性化されたＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。
シスタミンリンカー（Ａ１）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖およびシスタミン（５０～２５０モル当量のＫＤＯ）を、リン酸緩衝剤中で混合し、ｐＨを６．０～７．０に調整した。混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（５～３０モル当量のＫＤＯ）を添加し、混合物を３７℃で４８～７２ｈにわたって撹拌した。室温に冷却し、等量のリン酸緩衝剤で希釈する際に、混合物をトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した（１．２モル当量のシスタミンを添加した）。次いで、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液に対して５ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過によって混合物を精製して、Ｏ抗原多糖を含有するチオールを提供した。チオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定することができる。
次いで、上記のチオール活性化されたＯ抗原多糖と、ブロモ活性化されたＣＲＭ１９７タンパク質とを、０．５～２．０の比で混合することによって、コンジュゲーションを進行させた。反応混合物のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて８．０～１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２４±４時間にわたって進行させた。担体タンパク質上の未反応のブロモ残基を、５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチした。次いで、３モル当量のヨードアセトアミドを添加した後（Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの添加と関連する）、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３～５時間進行させ、両方のキャッピングステップのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加によって８．０～１０．０に維持した。得られるコンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して３０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過後に取得した。表２１、表２２、表２３、表２４、および表２５を参照されたい。
（実施例２７）
３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカー（Ａ４）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖と、３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）（５～５０モル当量のＫＤＯ）とを、酢酸緩衝剤中で混合し、ｐＨを４．５～５．５に調整した。混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（５～３０モル当量のＫＤＯ）を添加し、混合物を２３～３７℃で２４～７２ｈ撹拌した。次いで、混合物を、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した（１．２モル当量の３，３’－ジチオビス（プロパン酸ジヒドラジド）リンカーを添加した）。次いで、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液に対して５ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過によって混合物を精製して、Ｏ抗原多糖を含有するチオールを提供した。チオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定することができる。
次いで、上記のチオール活性化されたＯ抗原多糖と、ブロモ活性化されたＣＲＭ１９７タンパク質とを、０．５～２．０の比で混合することによって、コンジュゲーションを進行させた。反応混合物のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて８．０～１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２４±４時間にわたって進行させた。担体タンパク質上の未反応のブロモ残基を、５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによってクエンチした。次いで、３モル当量のヨードアセトアミドを添加した後（Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの添加と関連する）、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３～５時間進行させ、両方のキャッピングステップのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加によって８．０～１０．０に維持した。得られるコンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して３０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過後に取得した。
（実施例２８）
２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセトアミド）リンカー（Ａ６）に基づくコンジュゲーション
Ｏ抗原多糖と、２，２’－ジチオ－Ｎ，Ｎ’－ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（アミノオキシ）アセトアミド）（５～５０モル当量のＫＤＯ）とを酢酸緩衝剤中で混合し、ｐＨを４．５～５．５に調整した。次いで、混合物を２３～３７℃で２４～７２ｈ撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（５～３０モル当量のＫＤＯ）を添加し、混合物をさらに３～２４ｈ撹拌した。次いで、混合物を、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（１．２モル当量のリンカーを添加した）で処理した。次いで、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液に対して５ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過によって混合物を精製して、Ｏ抗原多糖を含有するチオールを提供した。チオール含量を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによって決定することができる。
次いで、上記のチオール活性化されたＯ抗原多糖と、ブロモ活性化されたＣＲＭ１９７タンパク質とを、０．５～２．０の比で混合することによって、コンジュゲーションを進行させた。反応混合物のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて８．０～１０．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２４±４時間にわたって進行させた。５℃で３～５時間、２モル当量のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによって、担体タンパク質上の未反応のブロモ残基をクエンチした。次いで、３モル当量のヨードアセトアミドを添加した後（Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの添加と関連する）、残存する遊離スルフヒドリル基をキャッピングした。このキャッピング反応を５℃でさらに３～５時間進行させ、両方のキャッピングステップのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨの添加によって８．０～１０．０に維持した。得られるコンジュゲートを、５ｍＭコハク酸塩－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して３０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜を使用する限外濾過／透析濾過後に取得した。
（実施例２９）
ブロモ活性化されたＣＲＭ１９７の調製
ＣＲＭ１９７を、０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ８．０±０．２中で調製し、５±３℃に冷却した。タンパク質溶液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）としてブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、３０～６０分間にわたって５±３℃で穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用して、１０ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイによって見積もる。
Figure 0007597974000043
Figure 0007597974000044
Figure 0007597974000045
Figure 0007597974000046
Figure 0007597974000047
（実施例２９）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ－Ａｇ－ＴＴコンジュゲートの調製
凍結乾燥した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ｂ長鎖多糖、ロット番号７０９７６６－３０（約６．９２ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約３９ｋＤａ）、５０ｍｇを、破傷風トキソイド（ＴＴ）コンジュゲーションのために使用した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１ａ長鎖多糖７１０９５８－１４２－３（約６．３ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約４４．３ｋＤａ）（５０ｍｇ、７．９４ｍＬ）を凍結乾燥した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６長鎖多糖７１０７５８－１２１－１（約１６．８ｍｇ／ｍＬ、ＭＷ：約４４ｋＤａ）（５０ｍｇ、２．９８ｍＬ）を凍結乾燥した。
上記の凍結乾燥した多糖のそれぞれをＷＦＩ中に溶解して、約５～１０ｍｇ／ｍＬにし、０．５ｍＬ（１ｍＬアセトニトリル中の１００ｍｇの１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）溶液）を添加し、ＲＴで撹拌した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）０．２Ｍ（２ｍＬ）を添加し、ＲＴで撹拌した。
破傷風トキソイド（ＴＴ）の調製：ＴＴ（１００ｍｇ、４７ｍｌ）を約２０ｍＬに濃縮し、濾過チューブを使用して塩水で２回洗浄した（２ｘ５０ｍＬ）。その後、それをＨＥＰＥＳおよび塩水で希釈して、最終ＨＥＰＥＳ濃度を約０．２５Ｍにした。
ＴＴを上記のように調製し、反応液のｐＨを約９．１～９．２に調整した。反応混合物をＲＴで撹拌した。
２０～２４ｈ後、反応をグリシン（０．５ｍＬ）でクエンチした。その後、それを、ＭＷＣＯ再生セルロース膜を使用して濃縮し、塩水に対して透析濾過を実施した。濾過し、分析した。表２６を参照されたい。
Figure 0007597974000048
（実施例３０）
Ｏ抗原の発酵、精製、およびコンジュゲーションのさらなる結果
以下に記載される例示的なプロセスは一般に、全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に適用可能である。それぞれの多糖の生産は、バッチ式生産発酵、次いで、下流の精製前の化学的不活化を含んでいた。
株および保存。短鎖Ｏ抗原の生合成のために用いられた株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の臨床野生型株であった。長鎖Ｏ抗原を、天然ｗｚｚｂ遺伝子の欠失を有するようにＷａｎｎｅｒ－Ｄａｔｓｅｎｋｏ法によって操作された短鎖生産株の派生株を用いて生産し、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に由来する「長鎖」伸長機能ｆｅｐＥによって補完した。Ｔ７プロモーター領域が欠失された、高コピーｃｏｌＥ１ベース「トポ」ベクターまたはｃｏｌＥ１ベースベクターｐＥＴ３０ａの低コピー派生株上のその天然プロモーターから、ｆｅｐＥ機能を発現させた。
無動物ＬＢまたは最少培地中で細胞を少なくとも３．０のＯＤ６００まで増殖させることによって、細胞バンクを調製した。次いで、ブロスを新鮮な媒体中に希釈し、８０％グリセロールと混合して、２．０ＯＤ６００／ｍＬを有する２０％グリセロール最終濃度を得た。
種培養および発酵のために使用される培地。用いられる種および発酵培地は、以下の製剤を共有する：ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏ。
種および発酵条件。種を、単一の種バイアルから０．１％で接種した。種フラスコを３７℃で１６～１８時間インキュベートし、典型的には１０～２０ＯＤ６００／ｍＬを達成した。
発酵を、１０Ｌステンレススチール製定置蒸気滅菌発酵器中で実施した。
発酵培地の接種は、典型的には、１０ＯＤ６００の種から１：１０００であった。１０ｇ／Ｌのバッチ式グルコース上で増殖が進行する期間であるバッチ期は、典型的には８時間続く。グルコース消耗時に、溶解酸素の突然の上昇があり、その時点でグルコースを発酵液に供給した。次いで、発酵は典型的には１６～１８時間進行し、１２０を超えるＯＤ６００／ｍＬの収穫を得る。
血清型Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂに関する短鎖／長鎖Ｏ抗原生産の初期評価。Ｏ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂのための野生型株を、バッチ様式で補給最小培地中でＯＤ６００＝１５～２０まで発酵させた。酸素消費の突然の減少をもたらすグルコース消耗時に、増殖制限グルコース供給を、グルコース溶液から１６～１８時間にわたって適用した。１２４～１４５ＯＤ６００単位／ｍＬの細胞密度に達した。続いて、収穫ブロスのｐＨを約３．８に調整し、２時間にわたって９５℃に加熱した。次いで、加水分解されたブロスを２５℃に冷却し、ｐＨ６．０にし、遠心分離して固体を除去した。次いで、得られた上清を、Ｏ抗原の定量化のためにＳＥＣ－ＨＰＬＣカラムに印加した。２２４０～４１８０ｍｇ／Ｌの範囲の生産性が得られた。これらのバッチに由来する精製された短鎖Ｏ抗原の分子量は、１０～１５ｋＤａの範囲であることがわかった。また、Ｏ２およびＯ６加水分解物のＳＥＣクロマトグラフィーが、Ｏ１ａおよびＯ２５ｂ加水分解物中では明らかでない異なる別々の夾雑多糖を示すこともわかった。
長鎖型のＯ１ａ、Ｏ２、Ｏ６およびＯ２５ｂ Ｏ抗原に、高コピーのカナマイシン選択性トポプラスミド上に異種性の相補的ｆｅｐＥ遺伝子を担持する、ｗｚｚｂ欠失型のそれぞれの株の発酵によってアクセスした。発酵を、カナマイシン選択ではあるが、短鎖に関して実施した。１２４～１７７のＯＤ６００／ｍＬで観察された最終細胞密度は、３５００～９８５０ｍｇ／ＬのＯ抗原生産性と関連していた。長鎖Ｏ抗原の相補性に基づく合成は、親短鎖株におけるものと少なくとも同程度の生産性があり、場合によっては、より高い生産性があった。精製されたＯ抗原多糖の分子量は、３３～４９ｋＤａであったか、または対応する短鎖のサイズの約３倍であった。
Ｏ２およびＯ６に関する長鎖加水分解物は、長鎖抗原の場合、主要なＯ抗原ピーク上で肩として観察される、夾雑多糖ピークの証拠を示す；Ｏ１およびＯ２５ｂは、短鎖親に関してより容易に認められるように、夾雑多糖の生産の証拠を示さないことがわかった。
増殖速度抑制は、ｆｅｐＥがないトポレプリコンの存在と関連することがわかった。さらに、Δｗｚｚｂ突然変異自体は増殖速度に対して有害な効果を有しなかったが、これは、増殖速度の乱れがプラスミドベクターによって伝達されたことを示している。
Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５ Ｏ抗原の生産のための株の評価。血清型Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５の複数の野生型株を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって、発酵において望ましくない多糖を産生するそれらの傾向について評価した。Ｏ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５に関する株を、存在しない夾雑多糖として、ならびに１０００ｍｇ／Ｌを超えるＯ抗原を産生するその能力について、およびΔｗｚｚｂ形質の導入のためのＷａｎｎｅｒ－Ｄａｔｓｅｎｋｏ組換えを可能にする抗生物質感受性プロファイルのディスプレイについて選択した。
一般に、カナマイシン耐性であることがわかっているＯ１１、Ｏ１３、Ｏ１６、Ｏ２１およびＯ７５ ｗｚｚｂ株へのｆｅｐＥの導入を可能にする、クロラムフェニコール選択型のトポ－ｆｅｐＥおよびｐＥＴ－ｆｅｐＥを構築した。得られるトポ－ｆｅｐＥおよびｐＥＴ－ｆｅｐＥ担持株を、クロラムフェニコール選択を用いて発酵させ、酸加水分解されたブロスに由来する上清をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって評価した。高コピー（トポ）と低コピー（ｐＥＴ）の両方のｆｅｐＥ構築物は、それぞれに関して、親野生型と同等である生産性でＯ抗原の合成を指示した。潜在的に干渉する多糖の発現は観察されなかった。
ｗｚｚｂプラスミド担持株に関する増殖速度の評価により、Ｏ１１、Ｏ１３およびＯ２１が、ｐＥＴ－ｆｅｐＥによってではなく、トポ－ｆｅｐＥの存在によって遅延されることを示された；Ｏ１６およびＯ７５株は、レプリコンの選択とは無関係に許容し得る増殖速度を示した。
多糖のための精製プロセスは、Ｏ抗原を遊離させるための酸加水分解を含んでいた。発酵リアクター中の血清型特異的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の粗懸濁液を酢酸で直接処理して、３．５±０．５の最終ｐＨにし、酸性化されたブロスを少なくとも１時間にわたって９５±５℃の温度に加熱した。この処理は、オリゴ糖およびリピドＡの近位末端で、ＫＤＯ間の不安定な結合を切断し、かくして、Ｏ－Ａｇ鎖を遊離させる。遊離したＯ－Ａｇを含有する酸性化されたブロスを２０±１０℃に冷却した後、ＮＨ４ＯＨを使用してｐＨ７±１．０に中和した。このプロセスは、いくつかの遠心分離、濾過、および濃縮／透析濾過操作ステップをさらに含んでいた。
Figure 0007597974000050
Figure 0007597974000051
（実施例３１）
研究されたＯ抗原（Ｏ４、Ｏ１１、Ｏ２１、Ｏ７５）へのコンジュゲーション（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）
Figure 0007597974000052
Figure 0007597974000053
Figure 0007597974000054
Figure 0007597974000055
（実施例３２）
調製されたＰＬＬコンジュゲート
Figure 0007597974000056
（実施例３３）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリペプチドの安定な哺乳動物細胞発現
ＳＳＩ（部位特異的組込み）安定な発現系を使用して、ＦｉｍＨ ＧＳＤまたはＦｉｍＨ ＬＤを発現する安定なＣＨＯクローンを生成した。
宿主ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯバックグラウンドから操作された細胞系である（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ宿主細胞系の説明については、米国特許出願２０２００００２７２７号を参照されたい）。簡単に述べると、２つのＦＲＴ部位に囲まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むランディングパッドを、宿主細胞のゲノム内の転写ホットスポットに標的化した。ＧＦＰ遺伝子は、フリッパーゼリコンビナーゼ（ＦＬＰｅ）と共に同時発現されるＬＶＥＣベクターからのＦＲＴ部位に同じく囲まれているＧＳ遺伝子および目的遺伝子と交換することができる。この系は、有利には無作為の組込みと匹敵する増殖および生産性プロファイルを有するだけではなく、少なくとも１００世代までの遺伝子型および表現型安定性も示す。
本明細書において言及される場合、単語「ＦＲＴ部位」は、酵母２μｍプラスミドのフリッパーゼ（ＦＬＰ）遺伝子の産物、ＦＬＰリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒し得るヌクレオチド配列を指す。様々な非同一ＦＲＴ部位が当業界において公知である。様々なＦＲＴ部位の配列は、それらがすべて、組換えが生じる８塩基対非対称コア領域に隣接して同一の１３塩基対逆方向反復を含有することにおいて類似している。これは、部位の方向性および種々のＦＲＴ部位の中での変化を担う非対称コア領域である。これらの例示的な（非限定的）例には、天然に存在するＦＲＴ（Ｆ）、ならびにＦＲＴ Ｆ１およびＦＲＴ Ｆ２などのいくつかの変異体またはバリアントＦＲＴ部位が含まれる。
本明細書において言及される場合、用語「ランディングパッド」は、宿主細胞に染色体組込みされた第１の組換え標的部位を含む核酸配列を指す。一部の実施形態では、ランディング部位は、宿主細胞に染色体組込みされた２つ以上の組換え標的部位を含む。一部の実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、または８つのランディングパッドを含む。一部の実施形態では、細胞は、１、２、または３つのランディングパッドを含む。一部の実施形態では、細胞は、４つのランディングパッドを含む。一部の実施形態では、ランディングパッドは、１、２、３、４、５、６、７、または８つまでの別個の染色体座に組み込まれる。一部の実施形態では、ランディングパッドは、１、２、または３つまでの別個の染色体座に組み込まれる。一部の実施形態では、ランディングパッドは、４つまでの別個の染色体座に組み込まれる。
ＦｉｍＨ ＧＳＤまたはＦｉｍＨ ＬＤのためのＬＶＥＣ発現ベクターおよびＦＬＰｅ発現ベクターを、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌまたはＡｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのいずれかを用いる電気穿孔法によってＳＳＩ宿主細胞に同時トランスフェクトした。次いで、細胞をグルタミンを含まない培地中で培養して、ランディングパッド部位に組み込まれたＧＳ遺伝子を有する細胞を選択した。通常、細胞は２～３週間で回復する。次いで、単一細胞クローニングを９６ウェルプレート内で、ＦＡＣＳまたは限界希釈のいずれかによって実施した。細胞を含むウェルからの力価をランキングして、トップ４８のクローンに絞った。２４深型ウェルプレート内でフェッドバッチスクリーニングの第２ラウンドを行って、クローンをトップ１２に絞った。Ａｍｂｒ１５内でフェッドバッチスクリーニングの第３のラウンドを実行して、クローンをトップ３に絞った。Ａｍｂｒ２５０実験を使用して、ベストクローンを同定した。トップクローンのために、その同定後に、マスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクを生成した。
（実施例３４）
ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨＬＤ ＷＴタンパク質の細胞系発生および生産リアクター発現
ここに記載される実施例は、それぞれのタンパク質のためのコード配列は、ＣＨＯゲノムに安定的に組み込まれている安定なＣＨＯ細胞系からのＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴおよびＦｉｍＨＬＤ ＷＴタンパク質の両方の例示的な生産を記載する。
生産バイオリアクター環境において、選択された安定なＣＨＯ細胞系は、標的タンパク質を、ＦｉｍＨ－ＤＳＧ ＷＴでは培養物１リットルあたりおよそ１グラム、およびＦｉｍＨＬＤ ＷＴでは培養物１リットルあたり２５０ミリグラムで生産することができた。生産リアクターでのシードトレインをワーキング細胞バンクのバイアル解凍から連続的にスケールアップし、振盪フラスコ内で０．３×１０＾６細胞／ｍｌの接種生細胞密度を使用して振盪フラスコ内での３継代サイクルによって拡張して、生産リアクターのための十分な細胞を得た。細胞を３６．５℃、５％ＣＯ２で、３～４日間増殖させた。
１×１０＾６細胞／ｍｌの接種細胞密度を標的として、生産リアクターを最終振盪フラスコから播種した。７．０５（＋／－０．１５）のｐＨを使用し、５～１０％のＣＯ２飽和を標的として、生産リアクターを３６．５℃で７日間増殖させた。塩基制御のためには炭酸水素ナトリウム／カリウム、および酸制御のためにはＣＯ２散布によって、ｐＨを制御する。純酸素を使用し、散布を介して、溶解酸素を４０％の設定値で制御する。温度を７日目に３１℃に調節した。リアクターに１日目に、生細胞密度に相関して供給物を添加する供給戦略を使用して供給したが、これは、供給成分が操作中に流出しないことを保証するために、０．７５の供給係数を使用することによって達成される。次いで、供給物を１日かけて連続的に添加して、所望の体積の供給物を得る。
生産リアクターを１３日目に収集し、下流のプロセシングの前に、収集培養物を遠心し、０．２２μｍ濾過した。
（実施例３５）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８およびＯ９Ｏ抗原のＣＲＭ１９７コンジュゲートによって惹起された抗体は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ５およびＯ３侵襲性単離物に対して交差防御殺菌活性を示す。
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８およびＯ９ Ｏ抗原の短鎖単一末端天然ＣＲＭ１９７ポリマンナンコンジュゲートによって惹起された抗体が、同等または関連Ｏ抗原を発現するクレブシエラＯ５およびＯ３株に対して殺菌性および交差防御性であることを実証する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、高度に相同性の生合成遺伝子クラスターによってコードされる酵素によって合成される共通のポリマンナンＯ抗原を共有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびＯ９ Ｏ抗原多糖は、それらの反復単位が単糖結合および残基の数において異なる直鎖状マンノースホモポリマーである。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）におけるそれらのカウンターパートは、血清型Ｏ５およびＯ３ Ｏ抗原である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ポリマンナンＯ抗原の生合成は、他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原とは異なる機構のＯ単位転座および鎖合成を含む。この場合、鎖伸長は、鎖長がＷｚｚＢまたはＦｅｐＥ酵素によって制御されるＷｚｘ／Ｗｚｙ依存性経路とは別の生合成ＷｂｄＡ－ＷｂｄＤ複合体（Ｋｉｎｇ ＪＤ、Ｂｅｒｒｙ Ｓら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１４；１１１：６４０７～１２）によって調節される。結果として、天然ポリマンナンＯ抗原は、それらの短鎖形態で産生され得るに過ぎず、これは、精製および担体タンパク質コンジュゲーションのために、操作された長鎖大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原とは異なるバイオプロセス法を必要とする。同じ機構および限界が、ガラクトース残基から構成されるポリガラクタンである優勢なクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ１およびＯ２ Ｏ抗原に当てはまる。
これらのＯ抗原とそれらのサブタイプとの間の構造関連性が図３３に示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５ Ｏ抗原は、同一である（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２；２７７：２５０７０～８１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ Ｏ抗原は、共通の四量体Ｏ９ａ／Ｏ３ａおよび五量体Ｏ９／Ｏ３反復単位サブタイプを共有しているが、三量体Ｏ３ｂサブタイプは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）においてのみ見出される。これらのサブタイプは、血清学的に、かつ遺伝子型で同定され得る（Ｇｕａｃｈａｌｌａ ＬＭ、ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７；７：６６３５）。血清型Ｏ３ａ遺伝子座は、ｗｂｄＡ（Ｃ８０Ｒ）における単一の点突然変異によって識別される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９ ｗｂｄＡ酵素（Ｃ５５Ｒ）における類似の点突然変異は、Ｏ９多糖をＯ９ａに変換する（Ｋｉｄｏ Ｎ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２０００；１８２：２５６７～７３）。Ｏ３ｂサブタイプは、ＷｂｄＤ酵素の配列において、別の参照配列を必要とするような十分なヌクレオチド変異を有する。ＰｆｉｚｅｒのＢｉｇＳｄｂ全ゲノム配列決定（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）パイプラインに実装されたＫａｐｔｉｖｅウェブアルゴリズム（Ｗｉｃｋ ＲＲら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１８；５６）は、Ｏ３遺伝子座を、Ｏ３／Ｏ３ａ（同じ参照配列によってカバーされる）またはＯ３ｂのいずれかと指定する。
材料および方法
ａ．ウサギでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８およびＯ９ ＣＲＭ１９７免疫血清の生産
Ｃｏｖａｎｃｅでの研究の実行のために、それぞれ４匹の雌のニュージーランド白ウサギからなる２つの群を使用した。動物に、１用量あたり１０μｇ／動物の血清型Ｏ８またはＯ９ ＣＲＭ１９７コンジュゲートをアジュバントとしてのＣＦＡ／ＩＦＡと共に投与した。天然Ｏ８およびＯ９ Ｏ抗原を、シングルエンド化学作用を使用してコンジュゲートした。それぞれ１ｍＬ用量の１０μｇの抗原を２つの皮下ワクチン接種部位で分けた。ワクチン接種を０、６および１４週目に与え、７および１５週目に採血したが、これは、用量２後（ＰＤ２）および用量３後（ＰＤ３）時点に対応する。
ｂ．菌株
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）臨床単離物を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＩＨＭＡ）ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂによって維持されているＰｆｉｚｅｒ後援のＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｌｅａｄｅｒｓｈｉｐ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ（ＡＴＬＡＳ）コレクションから得た。Ｍｉｓｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、株を全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）によって遺伝子型で特徴付けた。ＷＧＳデータを使用して、多座配列タイプ（ＭＬＳＴ）情報を生成し、その際、ＢｉｇＤｄｂプラットフォームに組み込まれた樹立された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）スキーム（Ｗｉｒｔｈ Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００６；６０：１１３６～５１；Ｊｏｌｌｅｙ ＫＡら、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓ ２０１８；３：１２４；Ｄｉａｎｃｏｕｒｔ Ｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５；４３：４１７８～８２）を使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のための埋め込みインシリコセロタイプアルゴリズム（ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、Ｏ抗原血清型を予測した（Ｗｉｃｋ ＲＲら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１８；５６；Ｊｏｅｎｓｅｎ ＫＧら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１５；５３：２４１０～２６）。
Figure 0007597974000057
ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびＯ９ ＣＲＭ１９７コンジュゲート
それぞれＥＣ０１３０およびＥＣ０４２３株から、血清型Ｏ８およびＯ９ａＯ抗原多糖を抽出し、精製した（表３４）。コンジュゲーションプロセスは、ジスルフィドアミンリンカーでの、短鎖天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびＯ９ Ｏ抗原の還元末端上に存在するＫｄｏ単糖の選択的活性化を含む。チオール官能基を暴露したら、次いで、本明細書において記載の実施例２６において記載されているとおり、ブロモ活性化ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートする。
ｄ．殺菌アッセイ
事前凍結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ストックを、ＤＭＥＭまたはＬＢ培地中で、０．５から１．０の間のＯＤ６００まで株を増殖させることによって調製し、グリセロールを、凍結する前に２０％の最終濃度まで添加した。具体的なアッセイ条件は、それぞれの菌株について最適化された条件に従って変化した。予め滴定された解凍細菌をＯＰＡ緩衝剤（ハンクス平衡塩溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％ゼラチン）中で１×１０５ＣＦＵ／ｍｌまで希釈し、２０μＬ（１０３ＣＦＵ）の細菌懸濁液を２０μＬの連続希釈血清で３０分間、室温で、組織培養マイクロプレート内でオプソニン化した。続いて、１０μｌの補体（Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ ＳｅｒｕｍまたはＩｇＧ／ＩｇＭ枯渇ヒト血清、Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ）および２０μＬのＨＬ－６０細胞（１００～２００：１の比で）をそれぞれのウェルに、ＯＰＡ緩衝剤と共に、１００μＬの最終体積まで添加した。反応混合物を６０分間、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内で振盪した。場合によっては、細菌を、事前オプソニン化ステップなしで補体およびＨＬ６０とそのまま合わせ、６０分間、３７℃で、５％ＣＯ２下で振盪した。インキュベーション後に、１０μＬのそれぞれの反応物を、水１００μＬを含有する予め湿らせておいたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＨＶフィルタープレートの対応するウェルに移した。液体を真空濾過した後に、１００μＬの５０％細菌増殖培地を施与し、濾過し、プレートを終夜、３７℃で、密閉されたジップロック（登録商標）バッグ内でインキュベートした。翌日、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ色素で染色した後に、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）分析器およびＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅソフトウェアを使用してマイクロコロニーを数えた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９アッセイの場合には、ＯＰＡを、５０μＬ反応反応体積のために３８４ウェル形式で小型化した。ＯＰＡ活性の特異性を立証するために、オプソニン化ステップの前に、免疫血清を精製Ｏ抗原多糖と共にプレインキュベートした。いずれの観察される殺傷も、これらの成分に依存していることを実証するために、ＯＰＡアッセイは、ＨＬ６０細胞または補体を含まない対照反応を含んだ。ＨＬ６０の存在が影響を有さないクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）血清型Ｏ５アッセイでは、血清殺菌反応をエフェクター細胞の非存在下で実行した。
結果
ａ．殺菌アッセイのための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株の選択
ＬＰＳプロファイリングにより（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより）Ｏ抗原発現を、かつＯ抗原特異的ウサギ抗血清を用いるフローサイトメトリーによりＯ抗原表面アクセシビリティを確認した後に、細菌臨床株を初めに選択した。次に、血清補体の経験的スクリーニングを行って、免疫血清の存在下での高度な感染性と組み合わされた低レベルの非特異的殺傷の好適なバランスをもたらす濃度範囲全体で、個々の適合性ロットを同定した。追加のアッセイ最適化パラメーターには、細菌に対するＨＬ６０エフェクター細胞の比の調節、振盪機速度、プレートシーラーの有無およびオプソニン化プレインキュベーションステップの包含が含まれた。
ｂ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５ Ｏ抗原免疫血清交差防御および特異性
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８株ＥＣ０３０５およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５株ＫＰ０１２１をアッセイ開発のために選択した。両方とも、血液単離物である。ＥＣ０３０５は、セファロスポリンおよびテトラサイクリンに対して耐性があり、ＫＰ０１２１はアンピシリンに対して耐性がある。ＯＰＡアッセイを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８株ＥＣ０３０５のために、３．０％ＢＲＣ、１：１００の細菌のＨＬ６０に対する比、および単一ステップ６０分ＯＰＡインキュベーション反応を含む条件で開発した。免疫血清の存在下でのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５株ＫＰ０１２１の殺菌活性は、ＨＬ６０エフェクター細胞とは独立していることが見出されたので、ＳＢＡを開発した。この場合には、ＳＢＡ反応は、補体の源として１０％枯渇ヒト血清の使用を必要とした。これらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５株を用いる殺菌アッセイの結果は、図３４Ａ～３４Ｂにおいて示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８ ＯＰＡでは、２用量のＯ８－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの投与後に生成されるウサギ免疫血清は、遊離Ｏ８ Ｏ抗原多糖での免疫血清の予備吸着によってブロックされる有効なＯ抗原特異的殺傷を示した。１：１０００未満の血清希釈で、完全殺傷が観察された。同じウサギからのマッチした免疫前血清は不活性であった。同じウサギ血清をクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ５ ＳＢＡにおいて評価したところ、１：２０００血清希釈で同様の殺菌性であることが見い出された。殺傷は、遊離Ｏ８ Ｏ抗原によってブロックされ、免疫前の血清では存在しなかった。この場合、血清マトリックスプロゾーンは、１：１０００未満の血清希釈で、ＳＢＡ活性を遮断した。
ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ ＯＰＡ Ｏ抗原免疫血清交差防御および特異性
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９ａ株ＥＣ０６１１およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ｂ株ＫＰ０００９をアッセイ開発のために選択した。ＥＣ０６１１は、アンピシリンに対して耐性がある一方で、ＫＰ０００９は、セファロスポリン、フルオロキノロン、およびテトラサイクリンに対して耐性がある。両方とも、それぞれ腎臓および膀胱感染からのＵＴＩ単離物である。ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよび得られた免疫血清を生成するために使用されたＯ９ａ Ｏ抗原は、四量体ポリマンナン反復単位構造を有し、かつＯ９ａ ＥＣ０６１１アッセイ株Ｏ抗原と同一であるが；しかしながら、これは、そのｗｂｄＤ遺伝子の配列に基づき、より短い三量体反復単位を発現すると予測されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ｂ Ｏ抗原ＫＰ０００９アッセイ株とは構造的に非相同である（図３３を参照されたい）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９ａおよびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ３ｂ株でのＯＰＡの結果は、抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９ａ免疫血清が両方に対して有効であることを示している（図３５Ａ～３５Ｂ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ９ａ株では１：８，０００未満の血清希釈で、かつクレブシエラＯ３ｂ株では１：１，６００未満で、ＯＰＡにおける完全な殺傷が観察された。遊離Ｏ９ａ Ｏ抗原での、およびマッチした免疫前血清での血清の予備吸着での活性の欠如により、特異性が実証された。
結論
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８およびＯ９ポリマンナンＣＲＭ１９７コンジュゲートは、殺菌アッセイにおいて相同な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床株だけではなく、クレブシエラ血清型Ｏ５およびＯ３株も殺傷することができる機能性抗体を惹起する。結果により、これらのコンジュゲートが、構造的に関連するポリマンナンＯ抗原を発現する両方の種の単離物に対して交差防御性である抗体を惹起することが確認される。
以下の項目は、本発明のさらなる実施形態を説明する。
Ｃ１．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂおよび式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは、１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む糖を含む組成物。
Ｃ２．糖が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ２２、式Ｏ３５、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ８３、式Ｏ９１、式Ｏ１０５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１３９、式Ｏ１５３、式Ｏ１６７、および式Ｏ１７２（式中、ｎは２０～１００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ３．糖が、式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４（例えば、式Ｏ４：Ｋ５２および式Ｏ４：Ｋ６）、式Ｏ５（例えば、式Ｏ５ａｂおよび式Ｏ５ａｃ（株１８０／Ｃ３））、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ７、式Ｏ１０、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８（例えば、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１）、式Ｏ２１、式Ｏ２３（例えば、式Ｏ２３Ａ）、式Ｏ２４、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、式Ｏ２６、式Ｏ２８、式Ｏ４４、式Ｏ４５（例えば、式Ｏ４５および式Ｏ４５ｒｅｌ）、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５８、式Ｏ６４、式Ｏ６９、式Ｏ７３（例えば、式Ｏ７３（株７３－１））、式Ｏ７５、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ８６、式Ｏ８８、式Ｏ９０、式Ｏ９８、式Ｏ１０４、式Ｏ１１１、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１９、式Ｏ１２１、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１３６、式Ｏ１３８、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４７、式Ｏ１４９、式Ｏ１５２、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６４、式Ｏ１７３、および式６２Ｄ１（式中、ｎは２０～１００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ２に記載の組成物。
Ｃ４．式Ｏ１（例えば、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ）、式Ｏ２、式Ｏ６（例えば、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４）、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ２１、式Ｏ２５（例えば、式Ｏ２５ａおよび式Ｏ２５ｂ）、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、項目Ｃ２に記載の組成物。
Ｃ５．式Ｏ４、式Ｏ１１、式Ｏ２１、および式Ｏ７５から選択される構造を含む、項目Ｃ２に記載の組成物。
Ｃ６．式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１から選択される構造を含まない、項目Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ７．式Ｏ１２から選択される構造を含まない、項目Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ８．前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を発現させることによって生産される、項目Ｃ４に記載の組成物。
Ｃ９．ｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２からなる群から選択される、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１０．ｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢである、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１１．ｗｚｚファミリータンパク質がｆｅｐＥである、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１２．ｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１３．ｗｚｚファミリータンパク質がサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来する、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１４．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１５．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１６．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ８に記載の組成物。
Ｃ１７．糖が合成的に合成される、項目Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ１８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ１９．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２０．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２３．３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、項目Ｃ１からＣ２２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ１７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２９．３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含まない、項目Ｃ１からＣ２２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３０．リピドＡを含まない、項目Ｃ１からＣ２３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３１．多糖が１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ、または５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する、項目Ｃ１からＣ３０のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３２．２０～４０ｋＤａの平均分子量を有する、項目Ｃ１からＣ３１のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３３．糖が、４０，０００～６０，０００ｋＤａの平均分子量を有する、項目Ｃ１からＣ３２のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３４．ｎが３１～９０の整数である、項目Ｃ１からＣ３３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３５．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物であって、糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、組成物。
Ｃ３６．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および担体タンパク質に共有結合した、項目Ｃ１から項目Ｃ３４のいずれか一項に記載の糖を含むコンジュゲートを含む組成物。
Ｃ３７．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および項目Ｃ３５から項目Ｃ３６のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
Ｃ３８．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、項目Ｃ３５から項目Ｃ３７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ３９．担体タンパク質が破傷風トキソイド（ＴＴ）である、項目Ｃ３５から項目Ｃ３７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４０．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）である、項目Ｃ３５から項目Ｃ３７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４１．コンジュゲートが還元的アミノ化によって調製される、項目Ｃ３５から項目Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４２．ＣＤＡＰ化学反応によって調製されている、項目Ｃ３５から項目Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４３．単一末端結合コンジュゲート化糖である、項目Ｃ３５から項目Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４４．（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ３５から項目Ｃ３９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４５．糖が（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされ、糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、項目Ｃ４４に記載の組成物。
Ｃ４６．ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合した２～２０個、または４～１６個のリシン残基を含む、項目Ｃ４４から項目Ｃ４５のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４７．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、項目Ｃ３５から項目Ｃ４６のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４８．糖のタンパク質に対する比が少なくとも０．５であり、最大でも２である、項目Ｃ３５から項目Ｃ４６のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ４９．糖のタンパク質に対する比が０．４～１．７である、項目Ｃ３５から項目Ｃ４６のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ５０．糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ４３から項目Ｃ４９のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ５１．糖が、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１（式中、ｎは１～１０の整数である）から選択される構造を含む、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および担体タンパク質に共有結合した糖を含むコンジュゲートを含む組成物。
Ｃ５２．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片;ならびに項目Ｃ１から項目Ｃ３４のいずれか一項に記載の糖、および薬学的に許容できる希釈剤を含む組成物。
Ｃ５３．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片;ならびに項目Ｃ３５から項目Ｃ５１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、および薬学的に許容できる希釈剤を含む組成物。
Ｃ５４．組成物中の糖の総量と比較して最大でも約２５％の遊離糖を含む、項目Ｃ５３に記載の組成物。
Ｃ５５．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ５２から項目Ｃ５３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ５６．アルミニウムをさらに含む、項目Ｃ５２からＣ５３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ５７．ＱＳ－２１をさらに含む、項目Ｃ５２から項目Ｃ５３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ５８．ＣｐＧオリゴヌクレオチドをさらに含む、項目Ｃ５２から項目Ｃ５３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ５９．アジュバントを含まない、項目Ｃ５２から項目Ｃ５３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ６０．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片;および多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む組成物。
Ｃ６１．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６２．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６３．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６４．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、項目Ｃ１から項目Ｃ１７のいずれか一項に記載の糖を含む組成物。
Ｃ６５．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および（ｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有的にカップリングしたＯ６抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは３０より大きい整数である）の構造を含む、組成物。
Ｃ６６．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、項目Ｃ６５に記載の組成物。
Ｃ６７．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および（ｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１１抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有的にカップリングしたＯ２１抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が式Ｏ７５（式中、ｎは３０より大きい整数である）の構造を含む、組成物。
Ｃ６８．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される、項目Ｃ６７に記載の組成物。
Ｃ６９．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むコンジュゲートを含む組成物を作製する方法であって、ａ）有機溶媒中で、糖と、１，１’－カルボニル－ジ－（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とを反応させて、活性化された糖を生産するステップ；ｂ）活性化された糖と、シスタミンもしくはシステアミンまたはその塩とを反応させて、チオール化された糖を生産するステップ；ｃ）チオール化された糖と、還元剤とを反応させて、１つまたは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化されたチオール化された糖を生産するステップ；ｄ）活性化されたチオール化された糖と、１つまたは複数のα－ハロアセトアミド基を含む活性化された担体タンパク質とを反応させて、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートを生産するステップ；ならびにｅ）チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）活性化された担体タンパク質の非コンジュゲート化α－ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬とを反応させるステップであって、それによって、ｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートが生産され、糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、ステップを含み；組換え哺乳動物細胞中で、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを発現させるステップ、および前記ポリペプチドまたはその断片を単離するステップをさらに含む方法。
Ｃ７０．項目Ｃ１から項目Ｃ３４のいずれか一項に記載の組成物を作製することを含む、項目Ｃ６９に記載の方法。
Ｃ７１．キャッピングステップｅ）が、チオール化された糖－担体タンパク質コンジュゲートと、（ｉ）第１のキャッピング試薬としてのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、および／または（ｉｉ）第２のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドとを反応させることを含む、項目Ｃ６９から項目Ｃ７０のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ７２．トリアゾールまたはイミダゾールとの反応によって糖を混合して、混合された糖を提供するステップをさらに含み、ステップａ）の前に、混合された糖がシェル凍結され、凍結乾燥され、有機溶媒中で復元される、項目Ｃ６９から項目Ｃ７１のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ７３．ステップｃ）で生産されたチオール化された多糖の精製をさらに含み、精製ステップが透析濾過を含む、項目Ｃ６９から項目Ｃ７２のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ７４．透析濾過によるｅＴＥＣ結合糖コンジュゲートの精製をさらに含む、項目Ｃ６９から項目Ｃ７３のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ７５．ステップａ）における有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）およびヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）のいずれか１つ、またはその混合物から選択される極性非プロトン性溶媒である、項目Ｃ６９から項目Ｃ７４のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ７６．ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏを含む培地。
Ｃ７７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するために使用される、項目Ｃ７６に記載の培地。
Ｃ７８．培地中で組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養すること；前記培地中で前記細胞を培養することによって前記糖を生産することを含み、それによって、前記細胞が前記糖を産生する、項目Ｃ１からＣ３４のいずれか一項に記載の糖を生産するための方法。
Ｃ７９．培地が、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２－２Ｈ２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８０．培地が大豆加水分解物を含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８１．培地が酵母抽出物を含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８２．培地が大豆加水分解物および酵母抽出物をさらに含まない、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択される異種ｗｚｚファミリータンパク質を含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つから選択されるサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｗｚｚファミリータンパク質を含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８５．ｗｚｚファミリータンパク質が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９のいずれか１つから選択される配列を含む、項目Ｃ８４に記載の方法。
Ｃ８６．培養が、１２０ＯＤ６００／ｍＬを超える収率をもたらす、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８７．糖を精製することをさらに含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８８．精製ステップが、以下のいずれか１つ：透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、およびカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）を含む、項目Ｃ７８に記載の方法。
Ｃ８９．対象に項目Ｃ１から項目Ｃ６８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導するための方法。
Ｃ９０．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９１．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＩｇＧ抗体の誘導を含む、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９２．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性の誘導を含む、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９３．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体の誘導を含む、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９４．免疫応答が、初回投与後に少なくとも１，０００～２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９５．組成物が、式Ｏ２５（式中、ｎは４０～１００の整数である）を含む糖を含み、免疫応答が、初回投与後に少なくとも１，０００～２００，０００の幾何平均力価（ＧＭＴ）レベルを含む、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９６．哺乳動物が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、合併肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／幼児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染；肺炎、菌血症、および敗血症から選択される状態のいずれか１つのリスクがある、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９７．哺乳動物が、尿路感染、胆嚢炎、胆管炎、下痢、溶血性尿毒症症候群、新生児髄膜炎、尿性敗血症、腹腔内感染、髄膜炎、合併肺炎、創傷感染、前立腺生検後関連感染、新生児／幼児敗血症、好中球減少性発熱、および他の血流感染；肺炎、菌血症、および敗血症から選択される状態のいずれか１つを有する、項目Ｃ８９に記載の方法。
Ｃ９８．（ｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、または（ｉｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的である、対象におけるオプソニン貪食作用抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の項目Ｃ１から項目Ｃ６８のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
Ｃ９９．対象が尿路感染を発症するリスクがある、項目Ｃ９８に記載の方法。
Ｃ１００．対象が菌血症を発症するリスクがある、項目Ｃ９８に記載の方法。
Ｃ１０１．対象が敗血症を発症するリスクがある、項目Ｃ９８に記載の方法。
Ｃ１０２．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；ならびに（ｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原のコンジュゲート、（ｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原のコンジュゲート、（ｉｉｉ）担体タンパク質に共有的にカップリングした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原のコンジュゲート、および（ｉｖ）担体タンパク質に共有的にカップリングしたＯ６抗原のコンジュゲートを含む組成物であって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原が式Ｏ２５Ｂ（式中、ｎは３０より大きい整数である）の構造を含む、組成物。
Ｃ１０３．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒されたバリアント、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質からなる群から選択される、項目Ｃ１０２に記載の組成物。
Ｃ１０４．（ｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、（ｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する、対象における免疫応答を誘導するため、または（ｉｉｉ）腸外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的である、対象におけるオプソニン貪食作用抗体の産生を誘導するための方法であって、対象に、有効量の項目Ｃ５１に記載の組成物を投与することを含む方法。
Ｃ１０５．対象が尿路感染を発症するリスクがある、項目Ｃ１０４に記載の方法。
Ｃ１０６．対象が菌血症を発症するリスクがある、項目Ｃ１０４に記載の方法。
Ｃ１０７．対象が敗血症を発症するリスクがある、項目Ｃ１０４に記載の方法。
Ｃ１０８．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも５個の反復単位の増加を含む糖を含む組成物。
Ｃ１０９．糖が式Ｏ２５ａを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ａである、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１０．糖が式Ｏ２５ｂを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５ｂである、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１１．糖が式Ｏ２を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２である、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１２．糖が式Ｏ６を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６である、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１３．糖が式Ｏ１を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１である、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１４．糖が式Ｏ１７を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１７である、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１５．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２５ｂ、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、０１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７からなる群から選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型である、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１７．糖が、前記糖を生成するグラム陰性細菌中でｗｚｚファミリータンパク質を過剰発現させることを含む、培養物中のグラム陰性細菌によって産生されるＯ多糖の反復単位を増加させることによって生産される、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１１８．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質が、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２からなる群から選択される、項目Ｃ１１７に記載の組成物。
Ｃ１１９．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢである、項目Ｃ１１７に記載の組成物。
Ｃ１２０．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質がｆｅｐＥである、項目Ｃ１１７に記載の組成物。
Ｃ１２１．過剰発現されるｗｚｚファミリータンパク質がｗｚｚＢおよびｆｅｐＥである、項目Ｃ１１７に記載の組成物。
Ｃ１２２．糖が合成的に合成される、項目Ｃ１０８に記載の組成物。
Ｃ１２３．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および担体タンパク質に共有結合した、項目Ｃ１０８に記載の糖を含むコンジュゲートを含む組成物。
Ｃ１２４．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、項目Ｃ１２３に記載の組成物。
Ｃ１２５．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１２３に記載の組成物。
Ｃ１２６．前記糖が、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも５個の反復単位の増加を含む、項目Ｃ１２３に記載の組成物。
Ｃ１２７．薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ１２８．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１２９．アルミニウムをさらに含む、項目Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１３０．ＱＳ－２１をさらに含む、項目Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１３１．アジュバントを含まない、項目Ｃ１２７に記載の組成物。
Ｃ１３２．対象に、項目Ｃ１２７に記載の組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。
Ｃ１３３．薬学的に許容できる希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１２３に記載の組成物。
Ｃ１３４．対象に、項目Ｃ１３３に記載の組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。
Ｃ１３５．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ１３２またはＣ１３４に記載の方法。
Ｃ１３６．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体がＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３５に記載の方法。
Ｃ１３７．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３５に記載の方法。
Ｃ１３８．多糖がカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合され、担体タンパク質がアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合されている、ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む免疫原性組成物。
Ｃ１３９．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４０．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４１．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４２．糖が７５～１００％のＯアセチル化度を有する、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４３．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４４．ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合された２～２０個のリシン残基を含む、項目Ｃ１４３に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４５．ＣＲＭ１９７が、ｅＴＥＣスペーサーを介して多糖に共有結合された４～１６個のリシン残基を含む、項目Ｃ１４３に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４６．さらなる抗原をさらに含む、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４７．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４８．アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムに基づくアジュバントである、項目Ｃ１４７に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４９．アジュバントを含まない、項目Ｃ１３８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５０．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および担体タンパク質にコンジュゲートされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖を含む糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、糖コンジュゲートが還元的アミノ化を使用して調製されている、免疫原性組成物。
Ｃ１５１．薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５２．糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＯ抗原である、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５３．糖が、式Ｏ１、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ５、式Ｏ６、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、および式Ｏ１８７（式中、ｎは５～１０００の整数である）から選択される構造を含む、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５４．糖が７５～１００％のＯアセチル化度を有する、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５５．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５６．さらなる抗原をさらに含む、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５７．アジュバントをさらに含む、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５８．アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムに基づくアジュバントである、項目Ｃ１５７に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５９．アジュバントを含まない、項目Ｃ１５０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１６０．対象に、項目Ｃ１３８からＣ１５９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を誘導するための方法。
Ｃ１６１．免疫応答が抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体の誘導を含む、項目Ｃ１６０に記載の方法。
Ｃ１６２．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体がＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３５に記載の方法。
Ｃ１６３．抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ特異的多糖血清抗体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する殺菌活性を有するＩｇＧ抗体である、項目Ｃ１３５に記載の方法。
Ｃ１６４．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７（式中、ｎは、対応する野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖中の反復単位数よりも大きい）のいずれか１つから選択される構造を含む糖を含む組成物。
Ｃ１６５．ｎが３１～１００の整数である、項目Ｃ１６４に記載の組成物。
Ｃ１６６．糖が、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ６、ならびに式Ｏ２５Ｂのいずれか１つに記載の構造を含む、項目Ｃ１６４に記載の組成物。
Ｃ１６７．糖が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するｗｚｚファミリータンパク質を発現する組換え宿主細胞中で産生される、項目Ｃ１６４に記載の組成物。
Ｃ１６８．タンパク質が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４のいずれか１つを含む、項目Ｃ１６７に記載の組成物。
Ｃ１６９．合成的に合成される、項目Ｃ１６４に記載の糖。
Ｃ１７０．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む組成物であって、前記糖が、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式Ｏ６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７（式中、ｎは１～１００の整数である）のいずれか１つから選択される構造を含む、組成物。
Ｃ１７１．糖が、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１Ａ、式Ｏ２、および式Ｏ６のいずれか１つを含む、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７２．糖が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分のいずれか１つをさらに含む、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７３．糖が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１部分、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３部分、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４部分、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２部分のいずれか１つをさらに含まない、項目Ｃ１７０に記載の組成物。糖が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２部分をさらに含まない、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７４．糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７５．担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７６．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７７．担体タンパク質が破傷風トキソイドである、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７８．糖のタンパク質に対する比が少なくとも０．５から、最大でも２である、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１７９．還元的アミノ化によって調製されている、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１８０．糖が（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１８１．糖が単一末端結合コンジュゲート化糖である、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１８２．糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）残基を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ１７４に記載の組成物。
Ｃ１８３．ＣＤＡＰ化学反応によって調製されている、項目Ｃ１７０に記載の組成物。
Ｃ１８４．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；ならびに（ａ）式Ｏ２５ｂ（式中、ｎは３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｂ）式Ｏ１Ａ（式中、ｎは３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、（ｃ）式Ｏ２（式中、ｎは３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲート、および（ｄ）式Ｏ６（式中、ｎは３１～９０の整数である）を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートを含む組成物。
Ｃ１８５．式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８および式Ｏ７５（式中、ｎは３１～９０の整数である）のうちのいずれか１つから選択される構造を含む糖に共有結合した担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに含む、項目Ｃ１８４に記載の組成物。
Ｃ１８６．組成物中の糖の総量と比較して最大でも約２５％の遊離糖を含む、項目Ｃ１８４に記載の組成物。
Ｃ１８７．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ１８４からＣ１８６のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ１８８．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、項目Ｃ１８７に記載の方法。
Ｃ１８９．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ１８７に記載の方法。
Ｃ１９０．（ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードする第１の目的の遺伝子を含む哺乳動物細胞であって、遺伝子が少なくとも２つの組換え標的部位（ＲＴＳ）の間に組み込まれている、哺乳動物細胞。
Ｃ１９１．２つのＲＴＳが、ＮＬ１遺伝子座またはＮＬ２遺伝子座内に染色体的に組み込まれている、項目Ｃ１９０に記載の実施形態。
Ｃ１９２．第１の目的の遺伝子が、リポーター遺伝子、発現させるのが困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子またはその組合せをさらに含む、項目Ｃ１９０に記載の実施形態。
Ｃ１９３．（ａ）の遺伝子座とは異なる第２の染色体遺伝子座内に組み込まれている第２の目的の遺伝子をさらに含み、第２の目的の遺伝子が、リポーター遺伝子、発現させるのが困難なタンパク質をコードする遺伝子、補助遺伝子またはその組合せを含む、項目Ｃ１９０に記載の実施形態。
Ｃ１９４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え哺乳動物細胞。
Ｃ１９５．ポリペプチドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）線毛Ｈ（ＦｉｍＨ）に由来する、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ１９６．ポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端にフェニルアラニン残基を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ１９７．ポリペプチドが、Ｎ末端の最初の２０残基以内の位置にフェニルアラニン残基を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ１９８．ポリペプチドが、ポリペプチドの１位にフェニルアラニン残基を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ１９９．ポリペプチドが、ポリペプチドの１位のフェニルアラニン残基の直前にグリシン残基を含まない、Ｃ１９８に記載の組換え細胞。
Ｃ２００．ポリペプチドが、ポリペプチドの７位にＮグリコシル化部位を含まない、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２０１．ポリペプチドが、ポリペプチドの７位にＡｓｎ残基を含まない、Ｃ１９９に記載の組換え細胞。
Ｃ２０２．ポリペプチドが、７位にＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎからなる群から選択される残基を含む、Ｃ２０１に記載の組換え細胞。
Ｃ２０３．ポリペプチドが、ポリペプチドの７０位にＮグリコシル化部位を含まない、Ｃ１９８に記載の組換え細胞。
Ｃ２０４．ポリペプチドが、ポリペプチドの７０位にＡｓｎ残基を含まない、Ｃ２０３に記載の組換え細胞。
Ｃ２０５．ポリペプチドが、ポリペプチドの７０位にＳｅｒ残基を含まない、Ｃ２０３に記載の組換え細胞。
Ｃ２０６．ポリペプチドが、ポリペプチドのＮグリコシル化部位にＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎからなる群から選択される残基置換を含む、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２０７．Ｎグリコシル化部位が、ポリペプチドのＮ２３５位を含む、Ｃ２０６に記載の組換え細胞。
Ｃ２０８．Ｎグリコシル化部位が、ポリペプチドのＮ２２８位を含む、Ｃ２０６に記載の組換え細胞。
Ｃ２０９．Ｎグリコシル化部位が、ポリペプチドのＮ２３５位およびＮ２２８位を含む、Ｃ２０６に記載の組換え細胞。
Ｃ２１０．ポリペプチドが、配列番号３を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２１１．ポリペプチドが、配列番号２を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２１２．ポリペプチドが、ポリペプチドの１位に脂肪族疎水性アミノ酸残基を含む、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２１３．脂肪族疎水性アミノ酸残基が、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌからなる群から選択される、Ｃ２１２に記載の組換え細胞。
Ｃ２１４．ポリペプチドが、ＦｉｍＨの断片を含む、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２１５．ポリペプチドが、ＦｉｍＨのレクチンドメインを含む、Ｃ２１４に記載の組換え細胞。
Ｃ２１６．レクチンドメインが、約１７０２２ダルトンの質量を含む、Ｃ２１５に記載の組換え細胞。
Ｃ２１７．ポリペプチドが、ＦｉｍＣポリペプチドまたはその断片と複合体化されている、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２１８．ＦｉｍＣポリペプチドまたはその断片が、ＦｉｍＣポリペプチドまたはその断片の３７位にグリシン残基を含む、Ｃ２１７に記載の組換え細胞。
Ｃ２１９．ポリペプチドが、低親和性コンフォメーションである、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２２０．ポリペプチドが、ＦｉｍＧによって安定化されている、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２２１．ポリペプチドが、ＦｉｍＧ（ＤｓＧ）のドナー鎖ペプチドによって安定化されている、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２２２．ポリヌクレオチド配列が、リンカー配列をさらにコードする、Ｃ２２１に記載の組換え細胞。
Ｃ２２３．リンカーが、少なくとも４個のアミノ酸残基および多くても１５個のアミノ酸残基を含む、Ｃ２２２に記載の組換え細胞。
Ｃ２２４．リンカーが、少なくとも５個のアミノ酸残基および多くても１０個のアミノ酸残基を含む、Ｃ２２２に記載の組換え細胞。
Ｃ２２５．リンカーが、７個のアミノ酸残基を含む、Ｃ２２２に記載の組換え細胞。
Ｃ２２６．ポリペプチドが、天然ＦｉｍＨリーダーペプチド、インフルエンザヘマグルチニンシグナルペプチド、およびヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ（Ａ２株）融合糖タンパク質Ｆ０シグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含まない、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２２７．ポリペプチドが、マウスＩｇＫシグナルペプチド配列を含む、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２２８．ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ受容体ＦｃＲｎラージサブユニットｐ５１シグナルペプチドおよびヒトＩＬ１０タンパク質シグナルペプチドから選択されるいずれか１つのシグナルペプチド配列を含む、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２２９．ポリペプチドが、配列番号３の番号付けによる、アミノ酸６０位でのアルギニンからプロリンへの突然変異（Ｒ６０Ｐ）を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２３０．ポリペプチドの発現レベルが、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のペリプラズム中で発現される対応する野生型ポリペプチドの発現レベルよりも高い、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２３１．ポリペプチドの発現レベルが、１０ｍｇ／Ｌよりも高い、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２３２．ポリヌクレオチド配列が、前記哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２３３．ポリヌクレオチド配列が、細胞中での発現のためにコドン最適化される、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２３４．ヒト胚性腎細胞である、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２３５．ヒト胚性腎細胞が、ＨＥＫ２９３細胞を含む、Ｃ２３４に記載の組換え細胞。
Ｃ２３６．ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３ＴＳ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｅ細胞のいずれか１つから選択される、Ｃ２３５に記載の組換え細胞。
Ｃ２３７．ＣＨＯ細胞である、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２３８．前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、またはＣＨＯ－Ｓ細胞である、Ｃ２３７に記載の組換え細胞。
Ｃ２３９．ポリペプチドが可溶性である、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２４０．ポリペプチドが細胞から分泌される、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２４１．ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによる、Ｎ２８Ｑ置換を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２４２．ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによる、Ｎ２８Ｄ置換を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２４３．ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによる、Ｎ２８Ｓ置換を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２４４．ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによる、Ｎ２８Ｑ、Ｖ４８Ｃ、およびＬ５５Ｃのいずれか１つから選択される置換を含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２４５．ポリペプチドが、配列番号１の番号付けによる、置換Ｎ９２Ｓを含む、Ｃ１９５に記載の組換え細胞。
Ｃ２４６．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片が、配列番号１の番号付けによる、Ｖ４８ＣおよびＬ５５Ｃのいずれか１つから選択される置換を含む、Ｃ１９４に記載の組換え細胞。
Ｃ２４７．少なくとも５リットルのサイズである、Ｃ１９４に記載の組換え細胞を含む培養物。
Ｃ２４８．ポリペプチドまたはその断片の収率が、少なくとも０．０５ｇ／Ｌである、Ｃ２４２に記載の培養物。
Ｃ２４９．ポリペプチドまたはその断片の収率が、少なくとも０．１０ｇ／Ｌである、Ｃ２４８に記載の培養物。
Ｃ２５０．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するポリペプチドまたはその断片を生産するための方法であって、好適な条件下でＣ１９４に記載の組換え哺乳動物細胞を培養することによって、ポリペプチドまたはその断片を発現させること；およびポリペプチドまたはその断片を収集することを含む方法。
Ｃ２５１．ポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含む、Ｃ２５０に記載の方法。
Ｃ２５２．細胞が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号２７のいずれか１つをコードする核酸を含む、Ｃ２５０に記載の方法。
Ｃ２５３．ポリペプチドまたはその断片の収率が、少なくとも０．０５ｇ／Ｌである、Ｃ２５０に記載の方法。
Ｃ２５４．ポリペプチドまたはその断片の収率が、少なくとも０．１０ｇ／Ｌである、Ｃ２５０に記載の方法。
Ｃ２５５．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む組成物。
Ｃ２５６．表１中のいずれか１つの式から選択される構造を含む糖をさらに含む、Ｃ２５５に記載の組成物。
Ｃ２５７．糖が担体タンパク質に共有結合している、Ｃ２５６に記載の組成物。
Ｃ２５８．担体タンパク質が、ポリ（Ｌ－リシン）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、ならびにカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質のいずれか１つから選択される、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２５９．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６０．担体タンパク質が破傷風トキソイド（ＴＴ）である、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６１．担体タンパク質がポリ（Ｌ－リシン）である、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６２．糖が還元的アミノ化によって担体タンパク質に共有結合している、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６３．糖がＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質に共有結合している、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６４．糖が単一末端結合コンジュゲーションによって担体タンパク質に共有結合している、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６５．糖が（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合している、Ｃ２５７に記載の組成物。
Ｃ２６６．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
Ｃ２６７．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；および式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む糖を含む組成物。
Ｃ２６８．Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２６９．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２７０．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２７１．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ３に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２７２．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ５に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２７３．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１に由来する糖およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２に由来する糖をさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２７４．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ２６８に記載の組成物。
Ｃ２７５．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む、項目Ｃ２６７に記載の組成物。
Ｃ２７６．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片；ならびにＯ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖を含む組成物。
Ｃ２７７．式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれかつから選択される構造を含む少なくとも１つの糖をさらに含む、項目Ｃ２７６に記載の組成物。
Ｃ２７８．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目Ｃ２７７に記載の組成物。
Ｃ２７９．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む、項目Ｃ２７７に記載の組成物。
Ｃ２８０．Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖；ならびに式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式Ｏ１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６、式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を含む少なくとも１つの糖を含む組成物。
Ｃ２８１．ＦｉｍＨに由来するポリペプチドまたはその断片をさらに含む、項目Ｃ２８０に記載の組成物。
Ｃ２８２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖が式Ｏ８を含む、項目Ｃ２８０に記載の組成物。
Ｃ２８３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糖が式Ｏ９を含む、項目Ｃ２８０に記載の組成物。
Ｃ２８４．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含む、項目Ｃ２８０に記載の組成物。
Ｃ２８５．糖が担体タンパク質に共有結合している、項目Ｃ２６７からＣ２８４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ２８６．糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、項目Ｃ２８５に記載の組成物。
Ｃ２８７．糖が、リピドＡを含む、項目Ｃ２８５に記載の組成物。
Ｃ２８８．糖が合成的に合成される、項目Ｃ２８５からＣ２８７のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ２８９．担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の解毒された外毒素Ａ（ＥＰＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の解毒された溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシンおよびその解毒されたバリアント、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＡｃｒＡ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）天然糖タンパク質ならびに連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）のいずれか１つから選択される、項目Ｃ２８５に記載の組成物。
Ｃ２９０．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ２６７からＣ２８９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ２９１．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、項目Ｃ２９０に記載の方法。
Ｃ２９２．免疫応答が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ２９０に記載の方法。
Ｃ２９３．哺乳動物に、有効量の項目Ｃ２６７からＣ２８９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物においてクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を惹起する方法。
Ｃ２９４．免疫応答がクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、項目Ｃ２９３に記載の方法。
Ｃ２９５．免疫応答がクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染から哺乳動物を保護する、項目Ｃ２９３に記載の方法。
Ｃ２９６．Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、およびＯ５からなる群から選択されるいずれか１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型に由来する少なくとも１つの糖をさらに含む、項目Ｃ１からＣ２６６のいずれか一項に記載の組成物および方法。
Ｃ２９７．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ１が、バリアントＯ１Ｖ１またはＯ１Ｖ２を含む、項目Ｃ２９６に記載の組成物および方法。
Ｃ２９８．クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）型Ｏ２が、バリアントＯ２Ｖ１またはＯ２Ｖ２を含む、項目Ｃ２９６に記載の組成物および方法。
Ｃ２９９．本明細書に記載の項目Ｃ１からＣ２９８のいずれか一項に記載の組成物の使用。

Claims (3)

  1. ＣＲＭ １９７ にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９ａに由来する糖を含む組成物であって、前記糖が式Ｉ
    式Ｉ
    の反復単位構造を含み、前記組成物がアジュバントを含む、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３ｂに対する免疫応答を惹起するための組成物。
  2. 糖が、３－デオキシ－ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 免疫応答がクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するオプソニン貪食作用抗体を含む、請求項１または２に記載の組成物。
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