JP7600487B2 - Ｐｄ－ｌ１と結合する抗体及びその使用 - Google Patents

Description

［関連出願及び参照による組み込み］
本出願は、２０２１年３月１６日に出願された中国特許出願第２０２１１０２８４４０４．８号の優先権を主張する。

上記の出願、及びそこに引用されたか又はその出願手続き中に引用されたすべての文献（「出願引用文献」）、及び本明細書に引用又は参照されたすべての文献（本明細書に引用されたすべての文献資料、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書での引用文献」）、及び本明細書での引用文献において引用又は参照されたすべての文献は、本明細書又は本明細書に参照によって組み込まれる任意の文献に言及された任意の製品に関する任意の製造元の指示、説明、製品仕様、及び製品シートと共に、ここで本明細書に参照によって組み込まれて、本発明の実施で利用できるものである。より具体的には、参照されたすべての文献は、個々の各文献が参照によって組み込まれるように具体的かつ個々に示された場合と同程度まで、参照によって組み込まれる。本開示で言及されるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最も早い有効出願日のＧｅｎｂａｎｋ配列とすることにより、参照によって組み込まれる。

本出願における任意の文献の引用又は同定は、そのような文献が本開示の従来技術として利用可能であることを承認するものではない。

本開示は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分、その調製及び使用、特に癌及び感染性疾患などのＰＤ－Ｌ１シグナル伝達と関連する疾患の処置におけるその使用に関する。

Ｔ細胞性免疫は、病原体感染細胞及び癌細胞を含む異常な細胞を認識及び破壊するように進化してきた。Ｔ細胞活性は、免疫系が組織を無差別に攻撃することを予防する自己寛容に重要な、免疫チェックポイントとして知られる、一連の共刺激及び共抑制受容体並びにそれらのリガンドによって制御されている。

免疫チェックポイント経路のうち、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達は、大きな臨床上の利益を明らかにしている。免疫応答を負に制御するＩ型膜貫通タンパク質であるＰＤ－１は、末梢組織における抗原経験メモリーＴ細胞に主に発現し、Ｂ細胞、活性化単球、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞には一般にあまり発現しない（Ｋｅｉｒ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７－７０４；Ｉｓｈｉｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１（１１）：３８８７－３８９５）。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２はＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、２つの細胞外ドメイン（ＩｇＶ及びＩｇＣ様ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインから成るＩ型膜貫通タンパク質である。それは、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、及び上皮細胞に恒常的に発現しており、これらの細胞の多くの種類において、炎症誘発性サイトカインの存在時に上方制御される（上記のＫｅｉｒ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，（２００８）；Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２７（３）：４０９－４１６）。複数の研究は、ＰＤ－Ｌ１がＩＬ－１０放出を誘導し、したがってＴ細胞に対する抑制作用を生じることを示している（Ｄｏｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ Ｍｅｄ．５（１２）：１３６５－１３６９）。ＰＤ－Ｌ２発現は、抗原提示細胞にほとんど制限され、誘導発現は、例えば樹状細胞及びマクロファージに見出すことができる。累積的な証拠は、ＰＤ－１軸が、ＰＤ－Ｌ１と結合した場合、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２）産生に影響を及ぼして、正常細胞／組織に対するＴ細胞応答を減衰させることを示した（上記のＫｅｉｒ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，（２００８）；上記のＣｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２０１６））。ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用はまた、細胞生存因子の分泌、エフェクター細胞機能と関連する転写因子の発現、及び活性化Ｂ細胞及びＮＫ細胞の溶解活性も抑制する（Ｔｅｒｍｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１（１６）：５３９３－５３９９；Ｆａｎｏｎｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．１３４（２）：１５７－１６０）。ＰＤ－１は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）にも高度に発現し、Ｔｒｅｇ活性化及び増殖を促進して免疫応答を更に抑制し得る（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＬＭ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０６（１３）：３０１５－３０２９）。

ＰＤ－１経路は、腫瘍細胞によって、宿主の免疫監視機構を逃れるために利用され得る。具体的には、多くの割合の腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ＴＩＬ）が高レベルのＰＤ－１を発現しており、黒色腫、卵巣癌、肺癌及び腎癌細胞を含む多くの腫瘍細胞は、ＰＤ－１のリガンド、特にＰＤ－Ｌ１を恒常的に発現している（Ｄｏｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｍｅｄ．８（８）：７９３－８００；Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３３（３）：２８０－２８９；Ｌｅｅ ＳＫ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ．４０（２）：９５－１０３）。ＰＤ－Ｌ１は、微小環境中のマクロファージ及び樹状細胞を含む骨髄細胞にも発現している。したがって、微小環境では、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用は、Ｔ細胞機能不全及び疲弊、ＩＬ－１０放出、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞による腫瘍細胞に対する細胞傷害性の低下を引き起こし、腫瘍細胞成長をもたらす（Ｚｏｕ Ｗ，Ｃｈｅｎ Ｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（６）：４６７－４７７；Ｓｕｎ Ｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７５（８）：１６３５－１６４４）。免疫応答は、微小環境中のＴｒｅｇ（上記のＦｒａｎｃｉｓｃｏ ＬＭ ｅｔ ａｌ．，（２００９））、及びＣＤ８０－ＣＴＬＡ４相互作用を減衰させるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ８０ヘテロ二量体（Ｂｕｔｔｅ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２７（１）：１１１－１２２；Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７（３）：１０９７－１１０５）によって更に抑えられる場合がある。

例えば抗体によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断は、固形腫瘍及び血液腫瘍を含むいくつかの癌において持続的腫瘍寛解を誘導することができる。ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１軸を標的とする抗体は、現在まで、１，０００を超える臨床試験において、黒色腫、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌腫（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＲＣＣ）、ホジキンリンパ腫、膀胱癌、頭頸部癌腫、神経内分泌腫瘍、高頻度マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｌｅ－ｈｉｇｈ：ＭＳＩ－Ｈ）及びミスマッチ修復欠損（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ：ｄＭＭＲ）固形腫瘍などの固形腫瘍、及びマントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫などの血液腫瘍の処置に対して評価されている（Ａｋｉｎｌｅｙｅ Ａ，Ｒａｓｏｏｌ Ｚ．（２０１９）Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１２（１）：９２；Ｃｈｏｎｇ Ｓｕｎ ｅｔ．ａｌ．（２０１８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０；４８（３）：４３４－４５２）。３つの抗ＰＤ－Ｌ１抗体、すなわちアテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びアベルマブはＦＤＡによって承認されている。アテゾリズマブは、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１－ＣＤ８０結合を遮断することができるヒト化ＩｇＧ１抗体であり、そのＦｃ領域は、ＰＤ－Ｌ１^＋Ｔ細胞に対する損傷を除去するために、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）を誘導しないように設計されている。アテゾリズマブは、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、ＲＣＣ、結腸直腸癌、胃癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、及び尿路上皮癌腫を含む固形及び非固形腫瘍において臨床上の有効性を示している。同様に、ヒト化抗体のデュルバルマブは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１又はＣＤ８０との結合を遮断することができ、ＰＤ－Ｌ１^＋Ｔ細胞に対するＡＤＣＣを回避するように設計されている。それは、例えば尿路上皮癌腫及びＮＳＣＬＣの処置において有効である。改変されていないＦｃ領域を有する別のヒト化ＩｇＧ１抗体であるアベルマブは、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１－ＣＤ８０相互作用を遮断し、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを誘導することができ、メルケル細胞癌腫、尿路上皮癌腫、及びトリプルネガティブ乳癌の処置における良好な臨床転帰を示している。臨床試験中の他の抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、エンバフォリマブ及びＢＭＳ－９３６５５９が挙げられる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、腫瘍成長をより良好に阻害するために、他の抗体、標的剤、及び／又は化学療法剤と組み合わせて使用されてもよい。

しかしながら、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法の広域スペクトルな抗腫瘍効果にもかかわらず、すべての患者がこの療法に応答性であるわけではなく、一部の患者は、有望な初期応答を報告したが、最終的には療法に抵抗性となった。そのような耐性の獲得の原因を発見すること、及び新たな薬剤／療法を開発することは極めて重要であり得る。異なる及び／又は改善した薬学的特徴を有するより多くの抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、異なる結合親和性、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１に対する異なる遮断能、及び／又は異なる結合エピトープを有する抗体に対する必要が依然として存在する。

ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断はまた、急性又は慢性ウイルス、細菌、又は寄生虫感染症の臨床又は前臨床研究において良好な効果を示した（Ｊｕｂｅｌ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４８７）。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）、又はサル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ＳＩＶ）による慢性感染症において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦα放出を増加し、Ｔ細胞疲弊を機能的に逆転し、ウイルス血症を改善した。したがって、より多くの抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、感染性疾患処置に対しても必要である。

本開示は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１、及びサルＰＤ－Ｌ１）に結合する単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。それは、アテゾリズマブなどの従来技術の抗体と比較して、同等か又はより高いヒト及びサルＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合能、同等のＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用に対する遮断活性、同等か又はより良好なＴ細胞活性化能、及び同等か又はより高いｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の検出及びＰＤ－Ｌ１関連疾患の処置を含む様々な用途に使用することができる。

したがって、一態様において、本開示は、ｉ）ＶＨ－ＣＤＲ１領域、ＶＨ－ＣＤＲ２領域及びＶＨ－ＣＤＲ３領域を有し得、ＶＨ－ＣＤＲ１領域、ＶＨ－ＣＤＲ２領域及びＶＨ－ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号１、２及び３；又は（２）それぞれ、配列番号７、８及び９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するか又はそれに記載されるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；及び／又はｉｉ）ＶＬ－ＣＤＲ１領域、ＶＬ－ＣＤＲ２領域及びＶＬ－ＣＤＲ３領域を有し得、ＶＬ－ＣＤＲ１領域、ＶＬ－ＣＤＲ２領域及びＶＬ－ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号４、５及び６；又は（２）それぞれ、配列番号１０、１１及び１２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するか又はそれに記載されるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域を備え得る、ＰＤ－Ｌ１と結合する単離モノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）又はその抗原結合部分に関連する。

本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備え得、ＶＨ－ＣＤＲ１領域、ＶＨ－ＣＤＲ２領域、ＶＨ－ＣＤＲ３領域、ＶＬ－ＣＤＲ１領域、ＶＬ－ＣＤＲ２領域及びＶＬ－ＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５及び６；又は（２）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１及び１２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するか又はそれに記載されるアミノ酸配列を含み得る。

本開示の重鎖可変領域は、配列番号１３～２３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するか又はそれに記載されるアミノ酸配列を有し得る。

本開示の軽鎖可変領域は、配列番号２４～３２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するか又はそれに記載されるアミノ酸配列を有し得る。

本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、（１）それぞれ、配列番号１３及び２４；（２）それぞれ、配列番号１４及び２５；（３）それぞれ、配列番号１４及び２６；（４）それぞれ、配列番号１４及び２７；（５）それぞれ、配列番号１５及び２５；（６）それぞれ、配列番号１５及び２６；（７）それぞれ、配列番号１５及び２７；（８）それぞれ、配列番号１６及び２５；（９）それぞれ、配列番号１６及び２６；（１０）それぞれ、配列番号１６及び２７；（１１）それぞれ、配列番号１７及び２５；（１２）それぞれ、配列番号１７及び２６；（１３）それぞれ、配列番号１７及び２７；（１４）それぞれ、配列番号１８及び２８；（１５）それぞれ、配列番号１９及び２９；（１６）それぞれ、配列番号２０及び３０；（１７）それぞれ、配列番号２０及び３１；（１８）それぞれ、配列番号２０及び３２；（１９）それぞれ、配列番号２１及び３０；（２０）それぞれ、配列番号２１及び３１；（２１）それぞれ、配列番号２１及び３２；（２２）それぞれ、配列番号２２及び３０；（２３）それぞれ、配列番号２２及び３１；（２４）それぞれ、配列番号２２及び３２；（２５）それぞれ、配列番号２３及び３０；（２６）それぞれ、配列番号２３及び３１；又は（２７）それぞれ、配列番号２３及び３２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するか又はそれに記載されるアミノ酸配列を有し得る重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を備え得る。

本開示の単離モノクローナル抗体は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を備え得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域、又はその機能的断片であり得る。重鎖定常領域は、ＰＤ－Ｌ１^＋細胞に対する減少したＡＤＣＣを誘導するように改変され得るか、又はＰＤ－Ｌ１^＋細胞に対するＡＤＣＣを誘導しないように改変され得る。例えば、重鎖定常領域は、例えば配列番号３３のアミノ酸配列を有する、Ｎ２９７Ａ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域であり得る。軽鎖定常領域は、例えば配列番号３４のアミノ酸配列を有する、ヒトカッパ軽鎖定常領域などのカッパ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域のＮ末端は、重鎖可変領域のＣ末端に連結されており、軽鎖定常領域のＮ末端は、軽鎖可変領域のＣ末端に連結されている。

特定の実施形態において、本開示の抗体は、ジスルフィド結合によって接続されている２つの重鎖及び２つの軽鎖を備え得るか又はそれから成り得、各重鎖は、上で言及した重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を有し、各軽鎖は、上で言及した軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を有する。本開示の抗体は、例えばＩｇＧ４、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２アイソタイプの完全長抗体であり得る。他の実施形態における本開示の抗体又はその抗原結合部分は、一本鎖抗体であり得るか、又はＦａｂ又はＦ（ａｂ'）_２断片などの抗体断片から成る。

本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、アンタゴニストであり、ヒト／サルＰＤ－Ｌ１に結合する、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用を遮断する、Ｔ細胞活性化を誘導する、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を有する。

本開示はまた、細胞毒又は抗癌剤などの治療剤に連結されている、抗体又はその抗原結合部分を備える免疫複合体を提供する。本開示はまた、本開示の抗体又はその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能部分（例えば、第２の抗体）に連結されている、本開示の抗体又はその抗原結合部分を備える二重特異性分子を提供する。別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）の一部にすることができる。本開示は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの、本開示のＣＡＲ又はＴＣＲを備える免疫細胞を更に提供する。本開示の抗体又はその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってエンコードされ得るか又はそれと併せて使用され得る。

本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合部分をエンコードする核酸分子、並びにそのような核酸分子を備える発現ベクター及びそのような発現ベクターを備える宿主細胞を更に提供する。本開示の宿主細胞を使用して抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合部分を調製するための方法であって、（ｉ）抗体又はその抗原結合部分を宿主細胞において発現させる段階、及び（ｉｉ）抗体又はその抗原結合部分を宿主細胞又はその細胞培養液から単離する段階を備える、方法が提供される。

本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合部分、免疫複合体、二重特異性分子、免疫細胞、腫瘍溶解性ウイルス、核酸分子、発現ベクター、又は宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を備える組成物を提供する。

別の態様において、本開示は、免疫応答の増強を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、治療有効量の本開示の組成物を投与する段階を備える、方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞活性化を誘導する段階を備える。

別の態様において、本開示は、癌の処置又は緩和を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、治療有効量の本開示の組成物を投与する段階を備える、方法を提供する。癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、ホジキンリンパ腫、膀胱癌、頭頸部癌、神経内分泌腫瘍、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫を含むがこれらに限定されない固形癌又は血液癌であり得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、抗ＲＯＲ１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体などの少なくとも１つの追加の抗癌抗体が、本開示の組成物と共に投与され得る。特定の実施形態において、本開示の組成物は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－２１）、又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与され得る。別の実施形態において、本開示の組成物は、細胞毒性剤であってもよい化学療法剤と共に投与され得る。

別の態様において、本開示は、感染性疾患の処置又は緩和を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、治療有効量の本開示の抗体又はその抗原結合部分を投与する段階を備える、方法を提供する。感染性疾患は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染症などの慢性ウイルス、細菌、真菌又はマイコプラズマ感染症であり得る。特定の実施形態において、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、又は抗マイコプラズマ剤などの少なくとも１つの追加の抗感染症剤が、本開示の抗体又はその抗原結合部分と共に投与され得る。

本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び例から明らかとなるが、これは限定として解釈されるべきではない。本出願全体において引用されるすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。

したがって、本発明の目的は、任意の従来公知の製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法を本発明に包含しないことであり、したがって、出願人らは、任意の従来公知の製品、プロセス、又は方法の権利を留保し、これによりその免責事項を開示する。更に、本発明はＵＳＰＴＯ（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の記載要件及び実施可能要件を満たさない任意の製品、プロセス、又は製品の製造又は製品の使用方法を本発明の範囲に包含する意図するものではない、ということが留意され、したがって、出願人らは、過去に記載した任意の製品、製品の製造プロセス又は製品の使用方法の権利を留保し、これによりその免責事項を開示する。ＥＰＣ第５３条（ｃ）、及びＥＰＣ規則２８（ｂ）及び（ｃ）に適合していることは、本発明の実施において有利であり得る。本出願の系統、又は任意の他の系統、又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の許諾特許の対象である任意の実施形態を明示的に否認するすべての権利は、明示的に留保される。本明細書のいかなる内容も、約束と解釈されるものではない。

本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落において、用語、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれに帰属する意味を有することができ；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ；「から本質的に成ること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記載されていない要素を許容するが、従来技術に見出されているか又は本発明の基本的な又は新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。

例として与えられるが、記載される特定の実施形態のみに本発明を限定することを意図したものではない以下の詳細な説明は、添付図面と併せて最もよく理解され得る。

１００μｇ／ｍｌ（Ａ）又は０．１～１０μｇ／ｍｌ（Ｂ）のマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体の処理がＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を増加させたことを示す。

キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体の、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）、及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞（Ｃ）に対する結合能を示す。

キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する能力を示す。

キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を用量依存的に誘導したことを示す。

ヒト化３Ｃ２抗体の、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）、及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞（Ｃ）に対する結合能を示す。

ヒト化５６Ｅ５抗体の、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂ）、及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞（Ｃ）に対する結合能を示す。

ヒト化５６Ｅ５及び３Ｃ２抗体がＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を用量依存的に誘導したことを示す。

ＰＤ－Ｌ１結合に関する３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４（Ａ）、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４（Ｂ）、アテゾリズマブ（Ｃ）、アベルマブ（Ｄ）及びデュルバルマブ（Ｅ）との競合における、抗ＰＤＬ１抗体５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４のＳＰＲ曲線を示す。

ＰＤ－Ｌ１結合に関する３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４（Ａ）、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４（Ｂ）、アテゾリズマブ（Ｃ）、アベルマブ（Ｄ）及びデュルバルマブ（Ｅ）との競合における、抗ＰＤＬ１抗体３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４のＳＰＲ曲線を示す。

それぞれ５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４、３Ｃ２ＶＨ６ＶＬ５及びアベルマブを用いて処置した群における、ヒトＰＤ－Ｌ１を有するトランスジェニックマウスの平均腫瘍体積（Ａ）及び平均腫瘍重量（Ｂ）を示す。

本開示がより容易に理解され得ることを保証するべく、特定の用語をまず定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載される。

「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、プログラム細胞死リガンド１を指す。「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、及びパラログを含む。例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的な抗体は、場合により、サルなどのヒト以外の種由来のＰＤ－Ｌ１タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に完全に特異的で、他の種に対する又は他のタイプの交差反応性を示し得ないか、又は、他のすべての種ではないが他の特定の種由来のＰＤ－Ｌ１と交差反応し得る。

「ヒトＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ１３７３５．１を有する（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６）：１６８９９－１６９０３）か又は配列番号３５に記載されるアミノ酸配列などの、ヒト由来のアミノ酸配列を有するＰＤ－Ｌ１タンパク質を指す。「サルＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００５５８１８３６．１を有するか又は配列番号３６に記載されるアミノ酸配列などの、サル由来のアミノ酸配列を有するＰＤ－Ｌ１タンパク質を指す。「マウスＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ６６８４１．１を有する（上記のＳｔｒａｕｓｂｅｒｇ Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００２））か又は配列番号３７に記載されるアミノ酸配列などの、マウス由来のアミノ酸配列を有するＰＤ－Ｌ１タンパク質を指す。

本明細書において言及される「抗体」という用語は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの全抗体、及びその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略記される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略記される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣ_Ｌで構成される。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域の間に挿入されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介できる。

本明細書において使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＰＤ－Ｌ１タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）_２断片；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域であるナノボディが挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を使用して、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ｓｃＦｖ）として知られる）としてこれらを作ることを可能にする合成リンカーによって結合することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して取得され、断片は、完全な抗体と同じ方式で、有用性に関してスクリーニングされる。

本明細書において使用される場合、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＰＤ－Ｌ１タンパク質と特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質と特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＰＤ－Ｌ１タンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。更に、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないことがあり得る。

本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、天然に存在し得る変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向性がある。異なる決定基（エピトープ）に対して指向性がある異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対して指向性がある。

本明細書において使用される場合、「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も、マウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖系列免疫グロブリン配列によってエンコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダム又は部位特異的変異導入、又は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される場合、「マウス抗体」という用語は、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト供給源からの遺伝物質をヒトの遺伝物質と組み合わせることによって作られる抗体を指す。又はより一般的には、キメラ抗体とは、特定の種の遺伝物質と別の種の遺伝物質とを有する抗体のことである。

本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を増加させるようにタンパク質配列が改変された、非ヒト種の抗体を指す。

「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。

本明細書において使用される場合、「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する」抗体とは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（及び、場合によっては、１又は複数の非ヒト種由来のＰＤ－Ｌ１タンパク質）に結合するが、非ＰＤ－Ｌ１タンパク質には実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高親和性」で、すなわち、５．０×１０^－８Ｍ又はそれ未満、より好ましくは１．０×１０^－９Ｍ又はそれ未満のＫ_ＤでヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合する。

本明細書において使用される場合、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか、又は高親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０^－６Ｍ又はそれよりも大きい、より好ましくは１．０×１０^－５Ｍ又はそれよりも大きい、より好ましくは１．０×１０^－４Ｍ又はそれよりも大きい、より好ましくは１．０×１０^－３Ｍ又はそれよりも大きい、更により好ましくは１．０×１０^－２Ｍ又はそれよりも大きいＫ_Ｄでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。

ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対して、１．０×１０^－６Ｍ又はそれ未満、より好ましくは５．０×１０^－８Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは１．０×１０^－８Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは５．０×１０^－９Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは１．０×１０^－９Ｍ又はそれ未満のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０^－６Ｍ又はそれ未満、より好ましくは１０^－７Ｍ又はそれ未満、更により好ましくは１０^－８Ｍ又はそれ未満のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

本明細書において使用される場合、「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」又は「Ｋ_ａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことが意図され、本明細書において使用される場合、「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、Ｋ_ａに対するＫ_ｄの比（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から取得され、モル濃度（Ｍ）で表される解離定数を指すことが意図される。抗体のＫ_Ｄ値は、本技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用した表面プラズモン共鳴を使用することによるものである。

半数効果濃度としても知られる「ＥＣ_５０」という用語は、ベースライン及び指定された曝露時間後の最大値の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「ＡＤＣＣ」という用語は、抗体が結合した標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が積極的に溶解する細胞介在性の免疫防御機構を指す。

「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、及びウマなどの哺乳類が好ましい。

「アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は、ＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－Ｌ１とそのリガンド、例えばＰＤ－１との相互作用によって誘導されるＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を指す。アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出を促進して免疫を増強し得るため、例えば癌及び慢性感染症を処置するために使用することができる。

「治療有効量」という用語は、疾患又は状態（例えば癌）と関連する症状を予防又は改善する及び／又は疾患又は状態の重症度を軽減するのに十分な、本開示の抗体又はその抗原結合部分の量を意味する。治療有効量は、処置されている状態の状況に沿うものと理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に認識される。

本開示の様々な態様は、以下のサブセクションで更に詳細に説明される。

本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、アテゾリズマブなどの従来技術の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のものと同様か又はそれよりも高い、高い結合能でヒト及びサルＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合する。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１結合又は相互作用を遮断することができ、遮断活性は、アテゾリズマブなどの従来技術の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のものと同等である。

より重要なことに、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、アテゾリズマブなどの従来技術の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較してより高いわけではないが同等の、Ｔ細胞を活性化する能力及びｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有する。

本開示の好ましい抗体又はその抗原結合部分は、モノクローナルである。追加的に、抗体又はその抗原結合部分は、例えば、マウス、キメラ又はヒト化であり得る。

本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、以下で構造的及び化学的に特徴付けられる。それらの重鎖及び軽鎖可変領域及びＣＤＲの配列番号を表１に要約し、一部の抗体又はその抗原結合部分は、同じ重鎖／軽鎖可変領域を共有する。

表１における重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって定義された。しかしながら、本技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔナンバリングシステム／方法などの他のシステムによっても決定できる。

本開示の抗体は各々、重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１定常領域、例えば配列番号３３のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域、又はその機能的断片を備え得る。
本開示の抗体は各々、軽鎖定常領域、例えばカッパ軽鎖定常領域、例えば配列番号３４のアミノ酸配列を有するヒトカッパ定常領域、又はその機能的断片を備え得る。

ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する他の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び対形成」することができる。好ましくは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖（又はそのような鎖の中のＣＤＲ）が混合及び対形成される場合、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_ＬペアからのＶ_Ｈ配列は、構造的に同様のＶ_Ｈ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_ＬペアからのＶ_Ｌ配列は、構造的に同様のＶ_Ｌ配列で置き換えられる。

したがって、一実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１における、上に列挙したアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１における、上に列挙したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は別の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶ_Ｌ
を備え、抗体はヒトＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する。
表１．重鎖／軽鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列番号

別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１における、上に列挙した重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１における、上に列挙した軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域、又は別の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＣＤＲ
を備え、抗体はヒトＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する。

更に別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１と結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域由来のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３、及び／又は軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３と組み合わされた、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域を備える。

加えて、ＣＤＲ３ドメインが、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインとは無関係に単独で、抗体の同種抗原に対する結合特異性を決定できること、及び、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測的に生成できることは本技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照されたい。米国特許第６，９５１，６４６号；同第６，９１４，１２８号；同第６，０９０，３８２号；同第６，８１８，２１６号；同第６，１５６，３１３号；同第６，８２７，９２５号；同第５，８３３，９４３号；同第５，７６２，９０５号及び同第５，７６０，１８５号もまた参照されたい。これらの参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

したがって、別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又は別の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ３を備え、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能である。これらの抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは、（ａ）結合に関してＰＤ－Ｌ１と競合する；（ｂ）機能的特徴を保持する；（ｃ）同じエピトープに結合する；及び／又は（ｄ）本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と同様の結合親和性を有する。更に別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を更に備えてもよく、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能である。別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１を備えてもよく、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能である。

別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合部分のものと１又は複数の保存的改変の点で異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を備える。本技術分野において、抗原結合を除去しない特定の保存的配列改変が行われ得ることが理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。

したがって、一実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域、及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を備え、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上の表１に列挙された配列、及び／又はその保存的改変を含む；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上の表１に列挙された配列、及び／又はその保存的改変を含む；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上の表１に列挙された配列、及びその保存的改変を含む；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上の表１に列挙された配列；及び／又はその保存的改変を含む；及び
（ｅ）抗体はヒトＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する高親和性結合、及びＰＤ－Ｌ１陽性細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力の低減又は除去などの、上に記載された機能特性のうちの１又は複数を有する。

様々な実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えば、マウス、キメラ、ヒト、又はヒト化であり得る。

本明細書において使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しくは影響しないか、又は、それを変更しないアミノ酸改変を指すことが意図される。そのような保存的改変はアミノ酸置換、付加及び欠失を含む。部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発など、本技術分野において知られている標準的な技法によって、本開示の抗体に改変が導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられることである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域における１又は複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられ得、変更された抗体は、本明細書において記載された機能的アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上に記載された機能）について試験され得る。

本開示の抗体は、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列のうちの１又は複数を有する抗体を、改変抗体を操作するための出発物質として使用して調製することができる。抗体は、一方又は両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ）における、例えば、１又は複数のＣＤＲ領域における及び／又は１又は複数のフレームワーク領域における１又は複数の残基を改変することによって操作され得る。追加的又は代替的に、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、抗体は、定常領域内の残基を改変することによって操作され得る。

特定の実施形態において、抗体の可変領域を操作するために、ＣＤＲ移植が使用され得る。抗体は、主に６の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より、個々の抗体間の多様性が高い。ＣＤＲ配列は大半の抗体－抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号もまた参照されたい。）

したがって、本開示の別の実施形態は、上に記載された本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域、及び／又は、上に記載された本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を備える単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関連する。これらの抗体は本開示のモノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ ＣＤＲ配列を含有するが、異なるフレームワーク配列を含有し得る。

そのようなフレームワーク配列は、公共のＤＮＡデータベース、又は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開されている参考文献から取得できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいて入手可能）、並びに前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６で見ることができ；それらの各々の内容は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋデータベースで見ることができる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）及び３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３－２３（ＡＪ４０６６７８）において入手可能である。

抗体タンパク質配列は、当業者に周知である、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７））と呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される。

本開示の抗体において使用される好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と同様の構造である。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得るか（フレームワーク配列は生殖系列免疫グロブリン遺伝子に由来する）、又は、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１又は複数の変異を含有するフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かった（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。

別のタイプの可変領域改変は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３領域におけるアミノ酸残基を変異させ、これによって、目的の抗体の１又は複数の結合特性（例えば親和性）を改善することである。変異を導入するために、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発が実行され得、抗体結合に対する影響、又は、他の目的の機能特性が、本技術分野において知られているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価され得る。好ましくは、保存的改変（本技術分野において知られている）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加、又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。更に、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５以下の残基が変更される。

したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、又は１、２、３、４又は５のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域；（ｂ）本開示の配列、又は１、２、３、４又は５のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｃ）本開示の配列、又は１、２、３、４又は５のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３領域；（ｄ）本開示の配列、又は１、２、３、４又は５のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｅ）本開示の配列、又は１、２、３、４又は５のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本開示の配列、又は１、２、３、４又は５のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を備える単離抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。

操作された本開示の抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に改変が行われたものを含む。典型的には、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１又は複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を経験した抗体は、抗体の由来元である生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体の由来元である生殖系列配列と比較することによって同定され得る。

別のタイプのフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去するために、フレームワーク領域内、又は、更には１又は複数のＣＤＲ領域内の１又は複数の残基を変異させ、これによって、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公開第２００３０１５３０４３号に更に詳細に記載されている。

フレームワーク又はＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて、又は替えて、本開示の抗体は、典型的には、血中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は、抗原依存性細胞傷害などの抗体の１又は複数の機能特性を変更するために、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作され得る。更に、本開示の抗体は、化学的に改変され得る（例えば、１又は複数の化学的部分が抗体に結合し得る）か、又は、そのグリコシル化を変更するために改変され得、これにより、同様に抗体の１又は複数の機能特性が変更される。

一実施形態において、Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加又は減少するように改変される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号に更に記載されている。Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は、抗体の安定性を増加又は減少させるために変更される。

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために、変異される。より具体的には、天然のＦｃヒンジドメインのスタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合と比べて弱いＳｐＡ結合を抗体が有するように、１又は複数のアミノ酸変異が、Ｆｃヒンジ断片のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン境界領域に導入される。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号に更に詳細に記載されている。

更に別の実施形態において、抗体のグリコシル化は改変される。例えば、グリコシル化された抗体が作られ得る（すなわち、抗体はグリコシル化を有しない）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更され得る。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１又は複数の部位を変更することによって達成され得る。例えば、１又は複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１又は複数のアミノ酸置換が行われ得、これによって、当該部位のグリコシル化を除去する。そのような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号を参照されたい。

追加的又は代替的に、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体、又は、二分ＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体など、グリコシル化のタイプが変更された抗体が作られ得る。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証された。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変更した宿主細胞において、抗体を発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構を変更した細胞は本技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現させるための宿主細胞として使用され得、これによって、グリコシル化が変更された抗体が産生される。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現する抗体がそれらの炭水化物にフコースを有しないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠如している。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化された破壊によって作製された（米国特許公開第２００４０１１０７０４号及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、ＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラーゼをエンコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載し、したがって、そのような細胞株において発現する抗体は、α－１，６結合関連酵素を低減又は除去することによって低フコシル化を示す。ＥＰ１，１７６，１９５はまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを追加するための酵素活性が低いか又はその酵素活性を有しない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力が低下したバリアントＣＨＯ細胞株のＬｅｃ１３細胞を記載しており、これもまた、その宿主細胞において発現する抗体の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０もまた参照されたい）。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／０８９２３１号に記載されているように、ニワトリの卵において産生され得る。代替的に、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサなどの植物細胞において産生され得る。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２号は、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載し、したがって、操作された細胞株において発現する抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示す（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０もまた参照されたい）。代替的に、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断することができ；例えば、フコシダーゼであるα－Ｌ－フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

本開示によって想定される本明細書の抗体の別の改変はＰＥＧ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血中）半減期を増加させるためにＰＥＧ化され得る。抗体をＰＥＧ化するために、抗体又はその断片は典型的には、１又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体又は抗体断片に結合するようになる条件下において、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応される。好ましくは、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実行される。本明細書において使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１－Ｃ_１０）アルコキシ又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することが意図される。特定の実施形態において、ＰＥＧ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は本技術分野において知られ、本開示の抗体に適用され得る。例えば、ＥＰＯ１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照されたい。

本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために様々な物理的特性によって特徴付けることができる。

例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１又は複数のグリコシル化部位を含有し得る。そのようなグリコシル化部位は、変更された抗原結合に起因して、抗体の免疫原性の増加、又は、抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２；Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフにおいて発生することが知られている。いくつかの場合において、可変領域グリコシル化を含有しない抗ＰＤ－Ｌ１抗体を有することが好ましい。これは、可変領域においてグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択すること、又は、グリコシル化領域内の残基を変異させることのいずれかによって達成され得る。

好ましい実施形態において、抗体はアスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列で発生し、ポリペプチド鎖にねじれを導入してその安定性を減少させる（イソアスパラギン酸作用）イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る。

各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲に収まる固有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には、７～９．５のｐＨ範囲に収まり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的には、６～８のｐＨ範囲に収まる。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下において、いくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると考えられる。したがって、正常範囲に収まるｐＩ値を含有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲におけるｐＩを有する抗体を選択すること、又は、荷電表面残基を変異させることのいずれかによって達成できる。

別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はＣＤＲをエンコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解液中に、又は、部分的に精製されたか又は実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技法によって、他の細胞成分又は他の混入物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製される場合、「単離」されるか又は「実質的に純粋」になる。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有してもよく、又はしなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下で更に説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作られる抗体の軽鎖及び重鎖をエンコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技法によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）取得される抗体については、そのような抗体をエンコードする核酸は、遺伝子ライブラリから回収され得る。

本開示の好ましい核酸分子は、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列、又はＣＤＲをエンコードするものを含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬセグメントをエンコードするＤＮＡ断片が取得されると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技法によって更に処理され得る。これらの処理において、Ｖ_Ｌ又はＶ_ＨをエンコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの、別のタンパク質をエンコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってエンコードされるアミノ酸配列がインフレームに留まるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することが意図される。

Ｖ_Ｈ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３）をエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

Ｖ_Ｌ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＬをエンコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域Ｃ_Ｌをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得る。

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬをエンコードするＤＮＡ断片は、フレキシブルリンカーをエンコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をエンコードする別の断片に作動可能に連結され、その結果、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列は、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域がフレキシブルリンカーによって結合された連続的な一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技法を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換、及び、ファージディスプレイ技法を含む。キメラ又はヒト化抗体も本技術分野において周知である。例えば、その内容の全体が参照によって本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号を参照されたい。

本開示の抗体はまた、本技術分野において周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技法及び遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技法によって取得される部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をエンコードするＤＮＡは、１又は複数の発現ベクターに挿入される。その結果、遺伝子は、転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するという意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することが意図される。

「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び、抗体遺伝子の転写又は翻訳を調節する他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌに記載されている（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマなど、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメントを含む。代替的に、ユビキチンプロモーター又はβグロビンプロモーターなど、非ウイルス性制御配列が使用され得る。更に、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長鎖末端反復配列由来の配列を含有するＳＲαプロモーターシステム（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）などの、異なる供給源由来の配列から構成される制御エレメント。発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。

抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ、又は別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、可変領域を使用して、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にエンコードしている発現ベクターに挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製する。その結果、Ｖ_Ｈセグメントは、ベクター内のＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントは、ベクター内のＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結される。追加的又は代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをエンコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、又は、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。

抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子など、追加の配列を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、選択マーカー遺伝子は典型的には、ベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と共に、ｄｈｆｒ宿主細胞において使用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。

軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をエンコードする発現ベクターが、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物の宿主細胞に導入するために一般に使用される幅広い様々な技法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本開示の抗体を原核生物又は真核生物のいずれの宿主細胞において発現させることも理論的に可能であるが、真核細胞（哺乳類宿主細胞が最も好ましい）における抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核生物の細胞よりも、適切に折り畳まれた、免疫活性抗体を組み立てて分泌する可能性が高いからである。

本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用する場合、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８，８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をエンコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又は、より好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収され得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）などのイムノコンジュゲートを形成するために、治療剤にコンジュゲートされてもよい。好適な治療剤としては、細胞毒、アルキル化剤、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核輸送阻害剤、プロテアソーム阻害薬、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質及び有糸分裂阻害剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジルリンカー、ジスルフィドリンカー、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号；同第６，９８９，４５２号；及び同第７，１２９，２６１号；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０号；同第ＷＯ０７／０３８，６５８号；同第ＷＯ０７／０５１，０８１号；同第ＷＯ０７／０５９，４０４号；同第ＷＯ０８／０８３，３１２号；及び同第ＷＯ０８／１０３，６９３号；米国特許公開第２００６００２４３１７号；同第２００６０００４０８１号；及び同第２００６０２４７２９５号に記載されているように調製することができ；これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。

別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成する、少なくとも１つの他の機能分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に連結されている本開示の抗体又はその抗原結合部分を備える二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される場合、「二重特異性分子」は、３又はそれよりも多い特異性を有する分子を含む。

二重特異性分子には多くの異なるフォーマット及びサイズがあり得る。サイズの範囲の一端では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、異なる特異性を各々が有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持する。他端は、ペプチド鎖によって連結された２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）から成る二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２コンストラクトである。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片を含む。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子操作、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製され得る。例えば、前掲のＫｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、及びそこに引用された参考文献を参照されたい。

本開示は、本開示の重鎖及び軽鎖可変領域及び／又はＣＤＲを有する抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を備えるキメラ抗原受容体を提供する。

キメラ抗原受容体は、（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含有する細胞外抗原認識ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを備え得る。

腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に優先的に感染し、それを死滅させる。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、腫瘍溶解性ウイルスと併せて使用され得る。代替的に、本開示の抗体又はその抗原結合部分をエンコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの体内に導入され得る。

別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本開示の抗体又はその抗原結合部分、イムノコンジュゲート、二重特異性分子、キメラ抗原受容体を保有する免疫細胞、腫瘍溶解性ウイルス、核酸分子、発現ベクター、及び／又は宿主細胞を備える医薬組成物を提供する。組成物は、任意選択で、抗腫瘍剤、抗感染症剤、又は免疫増強のための薬剤などの１又は複数の追加の薬学的に活性な成分を含有してもよい。本開示の医薬組成物は、併用療法において、例えば抗腫瘍剤、抗感染症剤、又は免疫増強のための薬剤と共に投与されてもよい。

医薬組成物は、任意の数の賦形剤を備えてもよい。使用できる賦形剤としては、担体、表面活性剤、増粘又は乳化剤、固体結合剤、分散又は懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、保存剤、等張剤、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な賦形剤の選択及び使用は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれるＧｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）に教示されている。

医薬組成物は、好ましくは（例えば注射又は注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与に好適である。投与経路に応じて、活性成分を材料でコーティングして、酸の作用及びそれを不活性化し得る他の天然の条件から保護することができる。本明細書において使用される場合、「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含むが、これらに限定されない。代替的に、本開示の抗体は、局所、表皮又は粘膜の投与経路などの非経口ではない経路を介して、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所により投与することができる。

医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散剤の形態であり得る。医薬組成物は、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の秩序構造に製剤化することもできる。

単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象及び特定の投与様式に応じて変動し得、一般に、治療効果を生じさせる組成物の量であり得る。一般に、この量は、１００パーセントのうち、約０．０１％～約９９％の、薬学的に許容される担体と組み合わされる活性成分の範囲であり得る。

最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与計画が調整される。例えば、単回ボーラスを投与する場合も、いくつかの分割された用量を経時的に投与する場合も、又は、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例的に低減又は増加させる場合もある。投与を容易にするために、及び、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される場合、単位用量形態とは、処置される対象のための単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じさせるために算出された活性成分の予め定められた量を含有する。抗体は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度は少なくなる。

抗体又はその抗原結合部分の投与に関して、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。例示的な治療計画は、週に１回の投与を伴う。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体に好ましい投与計画は、静脈内投与を含む。

本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の「治療有効投与量」は好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状がない期間の頻度及び長さの増加、又は疾患の罹患に起因する機能障害又は能力障害の予防をもたらし得る。例えば、担癌の対象を処置する場合、「治療有効投与量」は好ましくは、未処置の対象と比べて、腫瘍成長を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更により好ましくは少なくとも約６０％、なお更に好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療抗体の治療有効量は、腫瘍サイズを低減できるか、又は、そうでなければ、典型的にはヒトであるか、又は別の哺乳類であり得る対象における症状を改善できる。

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；及び同第４，５９６，５５６号）；（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）；（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）；（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３号及び同第４，４４７，２２４号）；及び（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６号及び同第４，４７５，１９６号）などの医療装置を介して投与され得；これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適切な分布を確実にするように製剤化され得る。例えば、本開示の治療抗体が血液脳関門を越えることを確実にするために、それらは、特定の細胞又は臓器への選択的輸送を強化する標的化部分を追加的に含み得るリポソームにおいて製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；同第５，４１６，０１６号；及び同第５，３９９，３３１号；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。

本開示の医薬組成物は、例えば、癌及び感染性疾患の処置及び／又は予防を伴う、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ有用性を有する。本開示の医薬組成物は、腫瘍成長を阻害するか又は病原体を減少又は除去するためにヒト対象に投与され得る。

本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の、癌細胞の増殖及び生存を阻害する能力を考慮すると、本開示は、対象における腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、対象に、対象において腫瘍の成長を阻害するような本開示の医薬組成物を投与する段階を備える、方法を提供する。本開示の抗体によって処置され得る腫瘍の非限定的な例としては、原発性及び／又は転移性の黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、ホジキンリンパ腫、膀胱癌、頭頸部癌、神経内分泌腫瘍、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。追加的に、難治性又は再発性悪性腫瘍は、本開示の医薬組成物を使用して阻害され得る。

別の態様において、本開示の医薬組成物は病原体を減少又は除去し得るため、本開示は、感染性疾患の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、本開示の医薬組成物を投与する段階を備える、方法を提供する。感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌、又はマイコプラズマ感染症によって引き起こされ得る。前記感染性疾患は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染症であり得る。

別の態様において、本開示は、本開示の医薬組成物が、対象における腫瘍成長を阻害するのに効果的な１又は複数の追加の抗体又は非抗体剤と同時投与される併用療法の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、対象における腫瘍成長を阻害するための方法であって、対象に、本開示の医薬組成物を、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体などの１又は複数の追加の抗体と共に投与する段階を備える、方法を提供する。本開示の医薬組成物は、細胞に毒性である化学療法剤と組み合わせて使用されてもよい。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせることができる他の療法としては、インターロイキン－２（ＩＬ－２）投与、放射線照射、外科的処置、又はホルモン除去が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象はヒトである。

本開示の医薬組成物は、ウイルス、細菌、真菌、又はマイコプラズマなどの対象における病原体を効果的に減少又は除去するために、１又は複数の他の抗体又は非抗体剤と組み合わせて使用されてもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、及び抗マイコプラズマ剤を含むがこれらに限定されない抗感染症剤と共に使用されてもよい。

本明細書において説明される治療剤の組み合わせは、薬学的に許容される担体における単一の組成物として同時に投与され得るか、又は、薬学的に許容される担体における各薬剤と共に別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組み合わせは、順次に投与され得る。

更に、併用療法の１より多くの用量が順次に投与される場合、順次投与の順序は、投与の各時点において、逆になり得るか、又は、同じ順序に維持され得、順次投与は、同時投与、又は、それらの任意の組み合わせと組み合わされ得る。

本開示は以下の実施例において更に示されるが、これは、更なる限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用される、すべての図面及びすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
［実施例］
［実施例１．ヒト、サル又はマウスＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株の構築］

ヒト、サル又はマウスＰＤ－Ｌ１を安定的に過剰発現する細胞株を、ＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、Ｃｈｉｎａ）を使用して構築した。簡潔に説明すると、ヒト、サル及びマウスＰＤ－Ｌ１タンパク質それぞれをエンコードするｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号３５、３６及び３７に記載のアミノ酸配列）を合成し、次にｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏベクターにサブクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）における指示書に従ったｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏ－ＰＤ－Ｌ１、ｐｓＰＡＸ及びｐＭＤ２．Ｇプラスミドの共トランスフェクションによって、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、Ｃｈｉｎａ）においてレンチウイルスを生成した。共トランスフェクションの３日後、レンチウイルスを細胞培養培地（１０％ＦＢＳ（カタログ番号：ＦＮＤ５００、Ｅｘｃｅｌｌ）を含有するＤＭＥＭ培地（カタログ番号：ＳＨ３００２２．０１、Ｇｉｂｃｏ））から回収した。最終的に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にレンチウイルスを感染させて、ヒト、サル及びマウスＰＤ－Ｌ１それぞれを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株、すなわちＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞を生成した。次に、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ａ細胞を、０．２μｇ／ｍｌピューロマイシン（カタログ番号：Ａ１１１３８－０３、Ｇｉｂｃｏ）を含有する培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で７日間培養した。ヒトＰＤ－Ｌ１及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１の発現を、市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＥ抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体、カタログ番号：３９３６０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳ）を使用するＦＡＣＳによって確認した。同様に、マウスＰＤ－Ｌ１の発現を、市販の抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＥ抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体、カタログ番号：１２４３０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＳ）を使用するＦＡＣＳによって確認した。
［実施例２．ヒトＰＤ－Ｌ１に対するモノクローナルマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の生成］

マウス抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、以下のように、いくらかの変更を加えた従来のハイブリドーマ融合技術を使用して生成した。
［免疫化］

１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）に組換えヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（カタログ番号：１００８４－Ｈ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）及び組換えカニクイザルＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（カタログ番号：９０２５１－Ｃ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を、以下の表２のスキームに従って注射した。ヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈＦｃ及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈＦｃは、等容量の完全フロイントアジュバント（カタログ番号：Ｆ５８８１－１０＊１０ＭＬ、ＳＩＧＭＡ、ＵＳ）、不完全フロイントアジュバント（カタログ番号：Ｆ５５０６－６＊１０ＭＬ、ＳＩＧＭＡ、ＵＳ）、又はＰＢＳを用いて、超音波処理によって乳化した。
表２．免疫化スキーム

各追加免疫の１週間後、組換えヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（カタログ番号：９０２５１－Ｃ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を使用するＥＬＩＳＡによる力価測定のために、各マウスから５０μｌのマウス血清を採取した。力価測定は、実施例１において調製した、ヒトＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１及びマウスＰＤ－Ｌ１それぞれを過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用するＦＡＣＳによっても行った。

最終追加免疫後のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの結果に基づいて、１０匹のマウスすべてをハイブリドーマ細胞株生成のために使用した。
［ハイブリドーマ細胞株の生成］

ハイブリドーマ細胞株を、以下のように、わずかな変更を加えた従来のハイブリドーマ融合技術を使用して生成した。

最終追加免疫の４日後、マウスを屠殺し、脾臓を採取して、ＰＢＳにおいて単一細胞懸濁液として調製した。脾細胞をＤＭＥＭ培地（カタログ番号：ＳＨ３０２４３．０１Ｂ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）で３回洗浄した。対数期の生存骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＣＲＬ－１５８１、ＡＴＣＣ、ＵＳ）をマウス脾細胞と１：４の比で混合した。次に、細胞を２回洗浄し、その後ＰＥＧ（カタログ番号：Ｐ７１８１、Ｓｉｇｍａ、ＵＳ）を用いて細胞融合を実行した。融合後の細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、１０％ＦＢＳ及び１Ｘ ＨＡＴ（カタログ番号：Ｈ０２６２、Ｓｉｇｍａ）を補充した細胞成長培地（ＲＰＭＩ培地１６４０（カタログ番号：Ｃ２２４００５００ＣＰ、Ｇｉｂｃｏ））に懸濁した。細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェル当たり２００μｌ（約５×１０^４個の細胞を含有）でプレーティングし、３７℃の湿潤５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて７日間インキュベートした。次に、成長培地を、１０％ＦＢＳ及び１Ｘ ＨＡＴを補充した新鮮なものと交換した。２～３日後、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによるハイブリドーマ細胞スクリーニングのために細胞培養上清を採取した。
［ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング］

ヒトＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンをスクリーニングするために、ヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を使用してハイスループットＥＬＩＳＡ結合アッセイを実行した。ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を産生したハイブリドーマクローンを、カニクイザルＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（カタログ番号：９０２５１－Ｃ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を使用して、カニクイザルＰＤ－Ｌ１と交差反応する能力について更に試験した。

ＥＬＩＳＡアッセイにより、２４９のハイブリドーマクローンが、ヒトＰＤ－Ｌ１及びサルＰＤ－Ｌ１の両方に対して特異的結合を有すると同定された。
［ＦＡＣＳによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング］

２４９のハイブリドーマクローンを、実施例１において調製した、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞を使用して、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に発現するヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１に対する結合能について更に試験した。

ＦＡＣＳスクリーニングに基づいて、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞及びＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞の両方に対して高い結合能を示した８８の陽性クローンが取得された。
［抗ＰＤ－Ｌ１抗体を産生するハイブリドーマクローンのサブクローニング］

８８のハイブリドーマクローンを２回のサブクローニングに供した。サブクローニング中、各親クローンからの複数のサブクローン（ｎ＞３）を選択し、上に記載のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳアッセイによって試験した。このプロセスを通じて選択されたサブクローンを、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞として定義した。最終的に、ヒトＰＤ－Ｌ１及びサルＰＤ－Ｌ１の両方に対して高い結合能を有する７９のサブクローン（各親クローンから１つのサブクローン）が取得された。
［実施例３．マウス抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の精製］

実施例２において取得された７９のクローンから、ヒト及びサルＰＤ－Ｌ１に対して比較的高い結合能を有する１０のクローンを更に特徴付けた。初めに、１０のクローンからのモノクローナルマウス抗体を精製した。簡潔に説明すると、各サブクローンのハイブリドーマ細胞を、１％ＨＴ補充物質（カタログ番号：１１０６７－０３０、Ｇｉｂｃｏ）を含有する１００ｍｌの新鮮無血清培地（カタログ番号：１２０４５－０７６、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）を各々有するＴ１７５細胞培養フラスコにおいて成長させた。５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターに細胞培養液を１０日間置いた。細胞培養液を採取し、５分間３５００ｒｐｍの遠心分離に供し、その後、０．２２μｍカプセルを使用して濾過して細胞残屑を除去した。次に、モノクローナル抗体を、予め平衡化したプロテインＡアフィニティーカラム（カタログ番号：１７０４０５０１、ＧＥ、ＵＳ）を使用して精製し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０～ｐＨ３．５）で溶出した。次に、抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で維持し、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置を使用して、その濃度を決定した。

各精製抗体のアイソタイプを、カッパ及びラムダ－マウスを有する迅速アイソタイピングキット（カタログ番号：２６１７９、Ｔｈｅｒｍａｌ、ＵＳ）及びマウスモノクローナル抗体アイソタイピング試薬（カタログ番号：ＩＳ０２－１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳ）を製造元のマニュアルに従って使用することによって決定した。

３Ｃ２及び５６Ｅ５を含む大半のクローンはＩｇＧ１／カッパ抗体を産生したが、残りのものはＩｇＧ２ａ／カッパ又はＩｇＧ２ｂ／カッパ抗体を産生した。クローン３Ｃ２及び５６Ｅ５の発現力価は、それぞれ６．３ｍｇ／Ｌ及び７．８ｍｇ／Ｌであった。
［実施例４．マウス抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体はＨＥＫ２９３Ａ細胞に発現するヒト及びサルＰＤ－Ｌ１に結合した］

抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＨＥＫ２９３Ａ細胞に発現するヒト、サル又はマウスＰＤ－Ｌ１に結合するか否かを決定するために、細胞ベースの結合アッセイを、実施例１において生成した、ヒト、サル及びマウスＰＤ－Ｌ１それぞれを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用するＦＡＣＳによって実行した。簡潔に説明すると、１００μｌの培養培地中１０^５個のＨＥＫ２９３Ａ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、そこに５０μｌの段階希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加した。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、５００倍に希釈したＡＰＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（カタログ番号：４０５３０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳ）をプレートに添加した。４℃での１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）を使用して細胞蛍光をモニタリングした。

すべてのマウス抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１及びサルＰＤ－Ｌ１の両方に対しては高い結合能を示したが、マウスＰＤ－Ｌ１とは結合しなかった。代表的な抗体のＥＣ_５０値を以下の表３に要約した。
表３．マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヒト、サル及びマウスＰＤ－Ｌ１に対する結合能
［実施例５．エピトープビニング］

エピトープビニングのために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。簡潔に説明すると、９６ウェルプレートを、１ウェル当たり１００μｌの０．５μｇ／ｍｌヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－Ｈｉｓ（カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。２００μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ）を用いて、ウェルを室温で２時間ブロッキングした。ＷＯ２０２０２２６９８６に開示されているアミノ酸配列をヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）／カッパ定常領域と共に使用して調製したアテゾリズマブ、ＷＯ２０１３０７９１７４Ａ１に開示されているアミノ酸配列をヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域と共に使用して調製したアベルマブ、ＵＳ２０１９０２７６５４３Ａ１に開示されているアミノ酸配列をヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ）／カッパ定常領域と共に使用して調製したデュルバルマブ、及び抗Ｈｅｌ抗体（カタログ番号：ＬＴ１２０３１、ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＵＳ）をそれぞれ５μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェル当たり１００μｌをプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、本開示の１μｇ／ｍｌ抗体１００μｌを添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２００００に希釈した抗マウスＦｃ－ＨＲＰ（カタログ番号：Ａ９３０９－１ＭＣ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって３回洗浄し、新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（カタログ番号：ＴＭＢ－Ｓ－００３、Ｈｕｚｈｏｕ Ｙｉｎｇｃｈｕａｎｇ、ＣＮ）を用いて、室温で５分間発色させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣ）において測定した。

クローン３Ｃ２からのものを含む９つのマウス抗体は、エピトープ結合に関してアテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブと競合せず、それらが参照抗体と比較して異なるエピトープに結合したことを示した。クローン５６Ｅ５からの抗体は、エピトープ結合に関して３つの参照抗体すべてと競合し、５６Ｅ５抗体が、参照が結合したのと同じか又は同様のエピトープに結合したことを示した。
［実施例６．マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を阻害した］

報告されているように、ＰＤ－１はＰＤ－Ｌ１の受容体である。ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用に対する抗体の遮断能を測定するために、細胞ベースの遮断アッセイを、実施例１において生成した、ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用するＦＡＣＳによって実行した。簡潔に説明すると、１００μｌの培養培地中１０^５個のＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、そこに５０μｌの段階希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加した。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、２００μｇ／ｍｌのＰＤ１－ｈＦｃタンパク質（カタログ番号：１０３７７－Ｈ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を１ウェル当たり１００μｌでプレートに添加した。４℃での１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５００倍に希釈したＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号：ＰＡＩ－８６０７８、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＵＳ）を添加した。４℃での１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）を使用して細胞蛍光をモニタリングした。

データは、２つの抗体のみがＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用を遮断できず、３Ｃ２及び５６Ｅ５を含む残りの８つがＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用を遮断したことを示した。代表的な抗体のＥＣ_５０値を以下の表４に要約した。
表４．ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用に対するマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体の遮断能
［実施例７．マウス抗ＰＤＬ１抗体はＴ細胞活性化を促進した］

マウス抗ＰＤＬ１抗体のＡＰＣ媒介Ｔ細胞活性化に対する効果を、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＭＬＲ）アッセイにおいて研究した。

簡潔に説明すると、ＰＢＭＣを１名の健康なヒトドナーの血液試料から密度勾配遠心分離によって採取し、次にＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。ＰＢＭＣを３７℃のインキュベーターで２時間培養し、容器の壁に付着した細胞を単離単球として採取した。単球を、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（カタログ番号：７９５４－ＧＭ、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）及び１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－４（カタログ番号：６５０７－ＩＬ、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。３日後、培地の半分を新鮮なものと交換した。培養６日目に、培養培地を、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－４、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＴＮＦ－α（カタログ番号：２１０－ＴＡ－１００、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）、１０００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ－６（カタログ番号：７２７０－ＩＬ－０２５、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）、１μｇ／ｍｌ ＰＧＥ２（カタログ番号：３６３－２４－６、ＴＯＣＲＩＳ、ＵＳ）及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（カタログ番号：２１０－ＬＢ－０２５、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）を含有する新鮮培地と交換した。細胞を更に２日間培養した。次に、別の健康なヒトドナーの血液試料からＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、次にＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＵｎｔｏｕｃｈｅｄヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（カタログ番号：１１３４６Ｄ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）を製造元の指示に従って使用して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。第１のドナーからの樹状細胞及び第２のドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞を、９６ウェルＵ底プレートに、１ウェル当たり合計１５０μｌの培養培地中、それぞれ２．５×１０^４細胞／ウェル及び５×１０^４細胞／ウェルで播種した。プレートに５０μｌの抗ＰＤ－Ｌ１抗体（０．１～１０μｇ／ｍｌ）又は抗Ｈｅｌ対照（カタログ番号：ＬＴ１２０３１、ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＵＳ）を添加し、更に７２時間インキュベートした。ＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＳＩＦ５０、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）によって、製造元のプロトコルに従って決定した。アッセイを３連で行った。

図１の（Ａ）に示すように、最も高いＩＦＮ－γレベルは、３Ｃ２及び５６Ｅ５抗体を用いて処理したウェルにおいて検出された。これらの抗体は、抗Ｈｅｌアイソタイプ対照と比較して、Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を用量依存的に増加させた（図１の（Ｂ））。
［実施例８．キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現及び精製］

３Ｃ２及び５６Ｅ５抗体を更に研究した。この２つの抗体の重鎖／軽鎖可変領域配列を、文献（Ｊｕｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４９（１）：１５９－６１）に記載されているように、１組のプライマーを用いる標準的なＰＣＲ法を使用してハイブリドーマ細胞からクローニングして、配列決定した。配列を表１及び表８に要約した。可変領域配列とヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）／カッパ定常領域配列（それぞれ配列番号３３及び３４に記載の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列）とをエンコードする配列をｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳ）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ制限部位に挿入することによって、発現ベクターを構築した。

発現ベクターをＨＥＫ－２９３Ｆ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、ＣＮ）にＰＥＩトランスフェクトした。具体的には、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（カタログ番号：１２３３８－０１８、Ｇｉｂｃｏ）において培養し、１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比のポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ）、細胞培地１ミリリットル当たり１．５μｇのＤＮＡを使用して発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を、１２０ＲＰＭで振とうしながら、５％ＣＯ_２下で、３７℃でインキュベーターにおいて培養した。１０～１２日後、上清を回収し、モノクローナル抗体を実施例３に記載したように精製した。
［実施例９．キメラ抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体はヒト及びサルＰＤ－Ｌ１に結合した］

キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、ヒトＰＤ－Ｌ１、サルＰＤ－Ｌ１、及びマウスＰＤ－Ｌ１に結合する能力について更に特徴付けた。簡潔に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり１００μｌの５００ｎｇ／ｍｌヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。２００μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ）を用いて、ウェルを室温で２時間ブロッキングし、１００μｌの段階希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体（４０μｇ／ｍｌから出発）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で３回洗浄し、５０００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（カタログ番号：３１４１０、Ｔｈｅｒｍａｌ、ＵＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（カタログ番号：５５５２１４、ＢＤ、ＵＳ）を用いて、室温で５分間発色させた。４５０ｎｍの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳ）において読み取った。

抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂのサル又はマウスＰＤ－Ｌ１に対する種交差反応性を、直接ＥＬＩＳＡによって更に評価した。簡潔に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり１００μｌの５００ｎｇ／ｍｌサルＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（カタログ番号：９０２５１－Ｃ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）又はマウスＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（カタログ番号：５００１０－Ｍ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）を用いてコーティングし、次に１００μｌの段階希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体（４０μｇ／ｍｌから出発）を添加し、インキュベートした。次に、プレートにＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号：３１４１０、Ｔｈｅｒｍａｌ、ＵＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（カタログ番号：５５５２１４、ＢＤ、ＵＳ）を用いて、室温で５分間発色させ、４５０ｎｍの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳ）において読み取った。アテゾリズマブを参照抗体として使用した。

結合能試験における代表的な抗体のＥＣ_５０値を表５に要約した。データは、すべてのキメラ抗体がヒト及びサルＰＤ－Ｌ１に対しては高い結合能を有したが、マウスＰＤ－Ｌ１とは結合しなかったことを示した。キメラ３Ｃ２及び５６Ｅ５抗体の結合能は、それらの親抗体のものと同等であり、アテゾリズマブのものよりも高かった。
表５．キメラ抗ＰＤＬ１ ｍＡｂのヒト、サル及びマウスＰＤ－Ｌ１に対する結合能

抗体を、実施例４のプロトコルに従って、実施例１において生成した、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞に対する結合能についても試験した。試験結果を図２に示した。

図２に示すように、キメラ抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１（図２の（Ａ））及びサルＰＤ－Ｌ１（図２の（Ｂ））の両方に対しては高い結合能を有したが、マウスＰＤ－Ｌ１（図２の（Ｃ））には結合しなかった。
［実施例１０．キメラ抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体はＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用を阻害した］

キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、実施例６のプロトコルに従って、実施例１において生成したＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞を使用して、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用に対する遮断能力について更に特徴付けた。試験結果を図３に示した。

図３に基づくと、キメラ抗体はＰＤ１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を明らかに遮断し、キメラ５６Ｅ５が最も良好な遮断効果を示し、これはアテゾリズマブのものよりも良好であった。
［実施例１１．キメラ抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体はＴ細胞活性化を促進した］

これらのキメラ抗体を、実施例７のプロトコルに従って、Ｔ細胞機能アッセイにおいて、Ｔ細胞応答を刺激する能力について更に試験した。市販のキット（カタログ番号：ＳＴＡ００Ｃ、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）を製造元の指示に従って使用して、ＩＦＮ－γレベルを決定した。

図４に示すように、試験したすべてのキメラ抗体はＴ細胞活性を促進し、ＩＦＮ－γ分泌を増加させた。キメラ５６Ｅ５抗体は、低用量、例えば０．０１μｇ／ｍＬにおいて、Ｔ細胞活性化に関してアテゾリズマブよりも強力であった。キメラ３Ｃ２抗体のＴ細胞活性化における能力は、すべての試験用量においてアテゾリズマブよりも高かった。
［実施例１２．抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヒト化］

上のアッセイに基づいて、３Ｃ２及び５６Ｅ５をヒト化し、更に検討した。マウス抗体のヒト化は、以下に詳細に記載されるような、十分に確立されたＣＤＲ移植方法（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２５，５３９号）を使用して実行した。

マウス抗体３Ｃ２及び５６Ｅ５のヒト化のためのアクセプターフレームワークを選択するために、３Ｃ２及び５６Ｅ５の軽鎖及び重鎖可変領域配列を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）において、ヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴ検索した。３Ｃ２及び５６Ｅ５に対する相同性が最も高いヒト生殖系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶＫをヒト化のためのアクセプターとして選択した。３Ｃ２について、選択したヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ１－４６＊０１であり、選択したヒト軽鎖アクセプターはＩＧＫＶ１－３３＊０１であった。５６Ｅ５について、選択したヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ４－３１＊０２であり、選択したヒト軽鎖アクセプターはＩＧＫＶ４－１＊０１であった。

ＣＤＲループ構造の支持において重要な役割を果たし得る重要なフレームワーク残基を同定し、したがってヒト化抗体における復帰変異を設計するために、３Ｃ２及び５６Ｅ５の可変ドメインについて３次元構造をシミュレートした。

上に記載した構造モデリングに基づいて、３Ｃ２の重鎖について１０の潜在的な復帰変異（Ｍ４８Ｉ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｒ８７Ｔ、Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ、Ｔ２８Ｓ、Ｙ９５Ｆ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ）、及び軽鎖について７の復帰変異（Ｋ４５Ｒ、Ｙ４９Ｓ、Ｆ７１Ｙ、Ｔ２２Ｓ、Ｋ４２Ｎ、Ｔ８５Ｖ、Ｆ７３Ｌ）を同定した。５６Ｅ５では、重鎖について１０の潜在的な復帰変異（Ｓ３０Ｔ、Ｗ４７Ｙ、Ｉ４８Ｍ、Ｓ７０Ｔ、Ｒ８７Ｔ、Ｋ４３Ｎ、Ｇ４４Ｋ、Ｖ７１Ｒ、Ｖ６７Ｉ、Ｔ６８Ｓ）を同定し、軽鎖について４の復帰変異（Ｉ２１Ｍ、Ｒ１８Ｋ、Ａ１９Ｖ、Ｖ８９Ｌ）を同定した。

３Ｃ２について、５つのヒト化重鎖可変領域及び４つのヒト化軽鎖可変領域を設計し、合計で１３のヒト化抗体を取得した。５６Ｅ５について、４つのヒト化重鎖可変領域及び３つのヒト化軽鎖可変領域を設計し、合計で１２のヒト化抗体を取得した。これらのヒト化抗体の配列を表１及び表８に要約した。
表６．復帰変異

重鎖可変領域とＮ２９７Ａ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域とをエンコードする配列、及び軽鎖可変領域とヒトカッパ定常領域とをエンコードする配列（それぞれ配列番号３３及び３４に記載の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列）を化学合成し、次に、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ及びＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をそれぞれ使用して、ＧＳ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にサブクローニングした。すべての発現コンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。実施例８に記載のプロトコルに従って、ＥＸＰｉＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に重鎖及び軽鎖発現ベクターをトランスフェクトし、２５のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体を一過性に発現させた。ヒト化抗体を実施例３に記載したように精製した。
［実施例１３．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合能／親和性］

ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、実施例４に記載のプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＰＤ－Ｌ１細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／サルＰＤ－Ｌ１細胞及びＨＥＫ２９３Ａ／マウスＰＤ－Ｌ１細胞に対する結合能力について特徴付けた。結果を図５及び図６に示した。

これらの抗体を、ＳＰＲアッセイにおいて、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）８Ｋ装置（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてヒト及びサルＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性についても試験した。簡潔に説明すると、１００～２００応答単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ：ＲＵ）のヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓタンパク質（カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）又はサルＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓタンパク質（カタログ番号：９０２５１－Ｃ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）をＣＭ５バイオセンサチップ（カタログ番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳ）に結合し、未反応基を１Ｍエタノールアミンでブロッキングした。０．３μＭ～１０μＭの範囲の濃度の段階希釈した抗体を、ＳＰＲ用緩衝液（ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液、ｐＨ７．４、カタログ番号：ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳ）に３０μＬ／分で注入した。結合親和性を、ブランク対照のＲＵを減算して算出した。会合速度（ｋ_ａ）及び解離速度（ｋ_ｄ）を、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して算出し、平衡解離定数Ｋ_Ｄをｋ_ｄ／ｋ_ａ比として算出した。結果を表７に示した。

図５及び図６に示すように、ヒト化抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１及びサルＰＤ－Ｌ１の両方に対して高い結合能力を有し、これは、それらのそれぞれのキメラ抗体のものと同等であった。

表７に基づくと、ヒト化３Ｃ２及び５６Ｅ５抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対して、アテゾリズマブと比較して同等か又はより高い結合親和性を有した。
表７．ヒト化抗ＰＤＬ１抗体のヒト／サルＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性
［実施例１４．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＴ細胞を活性化した］

これらの抗体を、実施例７のプロトコルに従って、ＭＬＲアッセイにおいて、Ｔ細胞応答を刺激する能力について更に試験した。市販のキット（カタログ番号：ＳＴＡ００Ｃ、Ｒ＆Ｄ、ＵＳ）を製造元の指示に従って使用して、ＩＦＮ－γレベルを決定した。

図７に示すように、すべてのヒト化抗体はＴ細胞活性化を用量依存的に促進し、ＩＦＮ－γ分泌を増加させた。抗体５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４及び３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４は、Ｔ細胞活性化における最も高い能力を示した。
［実施例１５．エピトープビニング］

エピトープビニングのために、競合ＳＰＲアッセイを実行した。簡潔に説明すると、１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１（ＥＣＤ）－ｈｉｓタンパク質（カタログ番号：１００８４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＮ）をＣＭ５バイオセンサチップ（カタログ番号：ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳ）に結合し、未反応基を１Ｍエタノールアミンでブロッキングした。次に、５μｇ／ｍｌの５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４又は３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４抗体を、ＳＰＲ用緩衝液（ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液、ｐＨ７．４、カタログ番号：ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳ）に３０μＬ／分で注入し、その後、５μｇ／ｍｌの第２の抗ＰＤＬ１抗体（５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４、３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ）を３０μＬ／分で注入した。結合親和性を、ブランク対照のＲＵを減算して算出した。次に、１：１相互作用モデルを使用してデータをフィッティングした。

図８及び図９に示すように、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４及びアテゾリズマブは、同時にはＰＤ－Ｌ１分子と結合せず、これらが同じか又は同様のエピトープに結合し得ることを示唆した。同様に、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４は、エピトープ結合に関してアベルマブ及びデュルバルマブと競合した。５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４及び３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４はＰＤ－Ｌ１分子に同時に結合したが、これは、これらが異なるエピトープに結合したことを意味する。抗体３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４は、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブと同時にＰＤ－Ｌ１分子に結合し、３Ｃ２ＶＨ４ＶＬ４が、他の抗体が結合したものと異なる新規なエピトープに結合し得ることを示唆した。
［実施例１６．ヒト化抗ＰＤＬ１抗体はｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を有した］

ヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）／カッパ定常領域を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４及び３Ｃ２ＶＨ６ＶＬ５のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を、ヒトＰＤ－Ｌ１を有するトランスジェニックマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｃｈｉｎａ）にＭＣ３８マウス結腸腺癌腫を移植することによって確立された動物モデルにおいて研究した。０日目に、マウスに１×１０^６個のＭＣ３８細胞を一方の側腹部において皮下注射し、１群当たり８匹で７つの群に無作為に割り付けた。次に、これらの動物に、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４（１０ｍｇ／ｋｇ）、３Ｃ２ＶＨ６ＶＬ５（１０ｍｇ／ｋｇ）、アベルマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢＳそれぞれを、０、４、７、１１、１４及び１８日目に腹腔内投与した。

腫瘍サイズ及びマウス体重を経時的にモニタリングした。具体的には、腫瘍の長さ（最長径）及び幅（長さに対して垂直な直径）をノギスで測定し、腫瘍体積を０．５×Ｄ×ｄ^２として算出することによって腫瘍サイズを決定した。対照群の腫瘍サイズが３．５ｃｍ^３に達する前に試験を終了した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群間の腫瘍サイズ差を同定した。

図１０に示すように、すべての抗ＰＤ－Ｌ１抗体はマウスにおいて腫瘍成長を有意に阻害し、５６Ｅ５ＶＨ５ＶＬ４及び３Ｃ２ＶＨ６ＶＬ５の抗腫瘍効果はアベルマブのものよりも良好であった。

本出願における配列を以下のように表８に要約する。
表８．配列

本開示の好ましい実施形態をこのように詳細に記載したが、上の段落によって定義された本開示は上の説明に記載の特定の詳細に制限されるべきではなく、その多くの明らかな変形形態が本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく可能であることが理解されるべきである。

［項目１］
ＶＨ－ＣＤＲ１領域、ＶＨ－ＣＤＲ２領域及びＶＨ－ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、及びＶＬ－ＣＤＲ１領域、ＶＬ－ＣＤＲ２領域及びＶＬ－ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を備え、前記ＶＨ－ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ－ＣＤＲ２領域、前記ＶＨ－ＣＤＲ３領域、前記ＶＬ－ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ－ＣＤＲ２領域及び前記ＶＬ－ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５及び６；又は（２）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目２］
前記重鎖可変領域が、配列番号１３～２３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目３］
前記軽鎖可変領域が、配列番号２４～３２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目４］
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、（１）それぞれ、配列番号１３及び２４；（２）それぞれ、配列番号１４及び２５；（３）それぞれ、配列番号１４及び２６；（４）それぞれ、配列番号１４及び２７；（５）それぞれ、配列番号１５及び２５；（６）それぞれ、配列番号１５及び２６；（７）それぞれ、配列番号１５及び２７；（８）それぞれ、配列番号１６及び２５；（９）それぞれ、配列番号１６及び２６；（１０）それぞれ、配列番号１６及び２７；（１１）それぞれ、配列番号１７及び２５；（１２）それぞれ、配列番号１７及び２６；（１３）それぞれ、配列番号１７及び２７；（１４）それぞれ、配列番号１８及び２８；（１５）それぞれ、配列番号１９及び２９；（１６）それぞれ、配列番号２０及び３０；（１７）それぞれ、配列番号２０及び３１；（１８）それぞれ、配列番号２０及び３２；（１９）それぞれ、配列番号２１及び３０；（２０）それぞれ、配列番号２１及び３１；（２１）それぞれ、配列番号２１及び３２；（２２）それぞれ、配列番号２２及び３０；（２３）それぞれ、配列番号２２及び３１；（２４）それぞれ、配列番号２２及び３２；（２５）それぞれ、配列番号２３及び３０；（２６）それぞれ、配列番号２３及び３１；又は（２７）それぞれ、配列番号２３及び３２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目５］
前記重鎖可変領域に連結されている、配列番号３３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び／又は前記軽鎖可変領域に連結されている、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を備える、項目１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目６］
（ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１と結合する；（ｂ）サルＰＤ－Ｌ１と結合する；（ｃ）マウスＰＤ－Ｌ１に結合しない；（ｄ）ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用を遮断する；（ｅ）Ｔ細胞活性化を促進する；及び／又は（ｆ）ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有する、項目１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目７］
マウス、キメラ又はヒト化である、項目１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
［項目８］
項目１から７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分をエンコードする核酸分子。
［項目９］
項目８に記載の核酸分子を備える発現ベクター。
［項目１０］
項目９に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。
［項目１１］
項目１から７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を備える医薬組成物。
［項目１２］
癌の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、項目１１に記載の医薬組成物を投与する段階を備える、方法。
［項目１３］
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、ホジキンリンパ腫、膀胱癌、頭頸部癌、神経内分泌腫瘍、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫から成る群から選択される、項目１２に記載の方法。
［項目１４］
感染性疾患の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、項目１１に記載の医薬組成物を投与する段階を備える、方法。
［項目１５］
前記感染性疾患が、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染症である、項目１４に記載の方法。

Claims (13)

1. ＶＨ－ＣＤＲ１領域、ＶＨ－ＣＤＲ２領域及びＶＨ－ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、及びＶＬ－ＣＤＲ１領域、ＶＬ－ＣＤＲ２領域及びＶＬ－ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を備え、前記ＶＨ－ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ－ＣＤＲ２領域、前記ＶＨ－ＣＤＲ３領域、前記ＶＬ－ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ－ＣＤＲ２領域及び前記ＶＬ－ＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号１、２、３、４、５及び６；又は（２）それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合することが可能な単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
2. 前記重鎖可変領域が、配列番号１３～２３のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
3. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２４～３２のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
4. 前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、（１）それぞれ、配列番号１３及び２４；（２）それぞれ、配列番号１４及び２５；（３）それぞれ、配列番号１４及び２６；（４）それぞれ、配列番号１４及び２７；（５）それぞれ、配列番号１５及び２５；（６）それぞれ、配列番号１５及び２６；（７）それぞれ、配列番号１５及び２７；（８）それぞれ、配列番号１６及び２５；（９）それぞれ、配列番号１６及び２６；（１０）それぞれ、配列番号１６及び２７；（１１）それぞれ、配列番号１７及び２５；（１２）それぞれ、配列番号１７及び２６；（１３）それぞれ、配列番号１７及び２７；（１４）それぞれ、配列番号１８及び２８；（１５）それぞれ、配列番号１９及び２９；（１６）それぞれ、配列番号２０及び３０；（１７）それぞれ、配列番号２０及び３１；（１８）それぞれ、配列番号２０及び３２；（１９）それぞれ、配列番号２１及び３０；（２０）それぞれ、配列番号２１及び３１；（２１）それぞれ、配列番号２１及び３２；（２２）それぞれ、配列番号２２及び３０；（２３）それぞれ、配列番号２２及び３１；（２４）それぞれ、配列番号２２及び３２；（２５）それぞれ、配列番号２３及び３０；（２６）それぞれ、配列番号２３及び３１；又は（２７）それぞれ、配列番号２３及び３２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
5. 前記重鎖可変領域に連結されている、配列番号３３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び／又は前記軽鎖可変領域に連結されている、配列番号３４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
6. 前記重鎖可変領域のＣ末端に連結されている重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域のＣ末端に連結されている軽鎖定常領域を備え、前記重鎖定常領域が、ＰＤ－Ｌ１^＋細胞に対する減少した抗体依存性細胞介在性細胞傷害を誘導するか又はＰＤ－Ｌ１^＋細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害を誘導しない、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
7. マウス、キメラ又はヒト化抗体又はその抗原結合部分である、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分をエンコードする核酸分子。
9. 請求項８に記載の核酸分子を備える発現ベクター。
10. 請求項９に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。
11. 請求項１から７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載の発現ベクター又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を備える医薬組成物。
12. 癌の処置における、それを必要とする対象への使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、ホジキンリンパ腫、膀胱癌、頭頸部癌、神経内分泌腫瘍、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫から成る群から選択される、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。

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