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JP7610672B2 - ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物 - Google Patents
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JP7610672B2 - ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物 - Google Patents

ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１１月３０日に出願された米国特許出願第６２／５９２，９０５号、および２０１８年４月２３日に出願された米国特許出願第６２／６６１，３７３号の利益を主張するものであり、これらの米国特許出願はそれぞれ、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳウェブ経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５２３３８０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに書き込まれている配列表は、１５４キロバイトであり、２０１８年１１月３０日に作成されており、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）は、緑内障等の神経変性疾患における神経保護のための有望な標的である。ＴＲＫＢは、脳における最も広く分布した神経栄養性受容体（ＮＴＲ）の１つであり、これは、新皮質、海馬、線条体および脳幹において高度に濃縮されている。ＴＲＫＢ受容体への脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合は、コンフォメーション変化によるその二量体化、および細胞内ドメインにおけるチロシン残基の自己リン酸化を誘発し、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびホスホリパーゼＣ－γ（ＰＬＣ－γ）が関与するシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
ＴＲＫＢは、ニューロンの生存、分化および機能に重要であり、ＴＲＫＢアゴニストは、多数の神経学的、精神的および代謝的障害における治療上の潜在性を有し得る。しかし、依然として、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の真のヒト標的または真のヒト標的の密接な近似を提供し、これにより、生きている動物における斯かる薬剤の有効性および作用機序の検査、ならびに薬物動態および薬力学研究を可能にする、適した非ヒト動物が必要である。
ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物が、斯かる非ヒト動物を使用する方法と共に提供される。ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムまたは細胞も提供される。
一態様では、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物が提供される。斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むことができ、ＴＲＫＢタンパク質は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの全体または一部は、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる。
一態様では、ヒト化ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。斯かる非ヒト動物は、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むことができ、ＴＲＫＢタンパク質は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの全体または一部は、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる。
別の態様では、そのゲノムに、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞であって、ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物細胞が提供される。
別の態様では、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物ゲノムが提供される。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、ＴＲＫＢタンパク質は、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含む。必要に応じて、細胞外ドメインは、配列番号６０に表記されている配列を含む。必要に応じて、細胞外ドメインの全体は、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされ、必要に応じて、細胞外ドメインのコード配列は、配列番号７２に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、ＴＲＫＢタンパク質は、内在性シグナルペプチドを含む。必要に応じて、シグナルペプチドは、配列番号５１または５５に表記されている配列を含む。必要に応じて、シグナルペプチドの全体は、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、シグナルペプチドのコード配列は、配列番号６３または６７に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、ＴＲＫＢタンパク質は、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインを含む。必要に応じて、膜貫通ドメインは、配列番号５３または５７に表記されている配列を含む。必要に応じて、膜貫通ドメインの全体は、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、膜貫通ドメインのコード配列は、配列番号６５または６９に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、ＴＲＫＢタンパク質は、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む。必要に応じて、細胞質ドメインは、配列番号５４または５８に表記されている配列を含む。必要に応じて、細胞質ドメインの全体は、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、細胞質ドメインのコード配列は、配列番号６６または７０に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、ＴＲＫＢタンパク質は、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメイン、および内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む。必要に応じて、シグナルペプチドは、配列番号５１に表記されている配列を含み、膜貫通ドメインは、配列番号５３に表記されている配列を含み、細胞質ドメインは、配列番号５４に表記されている配列を含む。必要に応じて、シグナルペプチドは、配列番号５５に表記されている配列を含み、膜貫通ドメインは、配列番号５７に表記されている配列を含み、細胞質ドメインは、配列番号５８に表記されている配列を含む。必要に応じて、シグナルペプチドの全体、膜貫通ドメインの全体、および細胞質ドメインの全体は、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされる。必要に応じて、シグナルペプチドのコード配列は、配列番号６３に表記されている配列を含み、膜貫通ドメインのコード配列は、配列番号６５に表記されている配列を含み、細胞質ドメインのコード配列は、配列番号６６に表記されている配列を含む。必要に応じて、シグナルペプチドのコード配列は、配列番号６７に表記されている配列を含み、膜貫通ドメインのコード配列は、配列番号６９に表記されている配列を含み、細胞質ドメインのコード配列は、配列番号７０に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、ＴＲＫＢタンパク質は、キメラ非ヒト動物／ヒトＴＲＫＢタンパク質である。必要に応じて、細胞外ドメインは、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインであり、膜貫通ドメインは、内在性ＴＲＫＢタンパク質膜貫通ドメインであり、細胞質ドメインは、内在性ＴＲＫＢタンパク質細胞質ドメインである。必要に応じて、ＴＲＫＢタンパク質は、配列番号４または５に表記されている配列を含む。必要に応じて、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列は、配列番号１２または１３に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性である。一部の斯かる非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してホモ接合性である。
一部の斯かる非ヒト動物は、哺乳動物である。必要に応じて、非ヒト動物は、齧歯類である。必要に応じて、齧歯類は、ラットまたはマウスである。
一部の斯かる非ヒト動物は、ラットである。必要に応じて、ＴＲＫＢタンパク質は、配列番号５に表記されている配列を含む。必要に応じて、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列は、配列番号１３に表記されている配列を含む。
一部の斯かる非ヒト動物は、マウスである。必要に応じて、ＴＲＫＢタンパク質は、配列番号４に表記されている配列を含む。必要に応じて、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列は、配列番号１２に表記されている配列を含む。
別の態様では、上述の非ヒト動物を使用して、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法が提供される。一部の斯かる方法は、（ａ）ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を非ヒト動物に投与するステップと、（ｂ）非ヒト動物におけるヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するステップとを含む。
一部の斯かる方法では、評価される活性は、神経保護活性である。
一部の斯かる方法では、ステップ（ａ）は、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を非ヒト動物に注射するステップを含む。
一部の斯かる方法では、ステップ（ｂ）は、対照非ヒト動物と比べて、体重、体組成、代謝および移動運動のうち１種または複数または全種の変化を評価するステップを含む。必要に応じて、体組成の変化を評価するステップは、対照非ヒト動物と比べて、除脂肪量（lean mass）および／または体脂肪量（fat mass）を評価するステップを含む。必要に応じて、代謝の変化を評価するステップは、食物消費および／または水消費の変化を評価するステップを含む。
一部の斯かる方法では、ステップ（ｂ）は、対照非ヒト動物と比べて、ＴＲＫＢリン酸化、および／またはＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を評価するステップを含む。
一部の斯かる方法では、ステップ（ｂ）は、神経保護活性を評価するステップを含む。一部の斯かる方法では、ステップ（ｂ）は、神経保護活性を評価するステップを含み、非ヒト動物は、ラットである。一部の斯かる方法では、ステップ（ｂ）は、網膜神経節細胞生存度を評価するステップを含む。必要に応じて、網膜神経節細胞生存度を評価するステップは、網膜神経節細胞密度を評価するステップを含む。必要に応じて、網膜神経節細胞密度は、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜において測定される。必要に応じて、網膜神経節細胞生存度は、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて評価される。必要に応じて、網膜神経節細胞生存度は、視神経挫滅モデルにおいて評価される。
一部の斯かる方法では、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、抗原結合性タンパク質である。必要に応じて、抗原結合性タンパク質は、ヒトＴＲＫＢアゴニスト抗体である。一部の斯かる方法では、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、小分子である。必要に応じて、小分子は、ヒトＴＲＫＢアゴニストである。
別の態様では、ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされ、標的化ベクターが、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列を標的化する５’相同性アーム、および内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列を標的化する３’相同性アームに挟まれたオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含むインサート核酸を含む、標的化ベクターが提供される。
別の態様では、上に記載されている非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。一部の斯かる方法は、（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、および内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む外因性修復鋳型であって、インサート核酸が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含む、外因性修復鋳型、ならびに（ｉｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ゲノムが、遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように改変される、ステップと、（ｂ）改変された非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、（ｃ）宿主胚を代理母に移植して、遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生させるステップとを含むことができる。必要に応じて、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。必要に応じて、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質、および内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡである。必要に応じて、ステップ（ａ）は、非ヒト動物多能性細胞に、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む。必要に応じて、外因性修復鋳型は、少なくとも１０ｋｂの長さの大型の標的化ベクターである、または外因性修復鋳型は、その５’相同性アームおよび３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである大型の標的化ベクターである。
一部の斯かる方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、および内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む外因性修復鋳型であって、インサート核酸が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含む、外因性修復鋳型、ならびに（ｉｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ゲノムが、遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように改変される、ステップと、（ｂ）改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生させるステップとを含む。必要に応じて、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質、および内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡである。必要に応じて、ステップ（ａ）は、非ヒト１細胞期胚に、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む。
図１（正確な拡大比でない）は、ＴＲＫＢの細胞外ドメインをコードするマウスＴｒｋＢ（マウスＮｔｒｋ２）遺伝子座の領域のヒト化の標的化スキームの概略図を示す。図の上部は内在性マウスＴｒｋＢ（マウスＮｔｒｋ２）遺伝子座を示し、図の下部は大型の標的化ベクターを示す。
図２（正確な拡大比でない）は、マウスＴｒｋＢ（マウスＮｔｒｋ２）遺伝子座のヒト化をスクリーニングするためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの概略図を示す。対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイは７１３８ｈＵおよび７１３８ｈＤを含む。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは７１３８Ｕおよび７１３８Ｄを含む。
図３は、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２またはアイソタイプ対照抗体を直接海馬に注射した後、１時間、４時間、および１８時間でのホモ接合性ヒト化ＴＲＫＢマウスにおける全ＴＲＫＢレベルおよびホスホ－ＴＲＫＢレベルを評価するウエスタンブロットを示す。
図４（正確な拡大比でない）は、ＴＲＫＢの細胞外ドメインをコードするラットＴｒｋＢ（ラットＮｔｒｋ２）遺伝子座の領域のヒト化の標的化スキームの概略図を示す。図の上部は内在性ラットＴｒｋＢ（ラットＮｔｒｋ２）遺伝子座を示し、図の下部は大型の標的化ベクターを示す。
図５（正確な拡大比でない）は、ラットＴｒｋＢ（ラットＮｔｒｋ２）遺伝子座のヒト化をスクリーニングするためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの概略図およびラットＴｒｋＢ（ラットＮｔｒｋ２）遺伝子座を標的化するためのガイドＲＮＡの位置（配列番号４１～４４に表記されているガイド標的配列）を示す。対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイは７１３８ｈＵおよび７１３８ｈＤを含む。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイはｒｎｏＴＵ、ｒｎｏＴＭ、およびｒｎｏＴＤを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化によって中断された領域を包含するように設計されたＣＲＩＳＰＲアッセイは、ｒｎｏＴＧＵおよびｒｎｏＴＧＤを含む。保持アッセイはｒｎｏＴＡＵ２およびｒｎｏＴＡＤ２を含む。
図６は、マウス、ラット、およびヒトＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）タンパク質のアラインメントを示す。 図６は、マウス、ラット、およびヒトＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）タンパク質のアラインメントを示す。
図７は、生後１日のホモ接合性ヒト化ＴＲＫＢ幼若マウスから単離した初代皮質ニューロンを種々のＴｒｋＢアゴニスト抗体またはＢＤＮＦで処理した後、１５分または２時間におけるホスホ－ＴｒｋＢ、全ＴｒｋＢ、ホスホ－Ａｋｔ、全ＡＫＴ、ホスホ－ＥＲＫ、および全ＥＲＫのウエスタンブロットを示す。
図８は、ホモ接合性ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスおよび野生型マウスにおける抗ＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の薬物動態プロファイルを示す。
図９は、種々の用量のＴｒｋＢアゴニスト抗体またはＢＤＮＦで処理した分化したヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における細胞生存を示す。ＴｒｋＢ ｍＡｂ１はＨ４Ｈ９８１６Ｐ２であり、ＴｒｋＢ ｍＡｂ２はヒトＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ、およびマウスＴｒｋＢに親和性を有する対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体である。陰性対照としてヒトアイソタイプ対照抗体を用いた。データは抗体を含まない無血清培地に正規化した。
図１０は、種々の用量のＴｒｋＢアゴニスト抗体またはＢＤＮＦで処理したマウス初代網膜神経節細胞における細胞生存を示す。ＴｒｋＢ ｍＡｂ２はヒトＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ、およびマウスＴｒｋＢに親和性を有する対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体である。データは抗体を含まない無血清培地に正規化した。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、視神経切断およびＢＤＮＦ、ＴｒｋＢアゴニスト抗体、アイソタイプ対照抗体、またはビヒクル対照による処置の後の、それぞれ野生型ラットおよびマウスの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す。ラットには、ＢＤＮＦ（５μｇ）、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（１８μｇ）、アイソタイプ対照抗体（１８μｇ）、またはビヒクル対照を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した。マウスには、ＢＤＮＦ（２．５μｇ）、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（１０μｇ）、アイソタイプ対照抗体（１０μｇ）、またはビヒクル対照を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した。ＴｒｋＢ ｍＡｂ２はヒトＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ、およびマウスＴｒｋＢに親和性を有する対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体である。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、視神経切断または視神経挫滅および種々の用量のＢＤＮＦによる処置の後の、それぞれ野生型マウスおよびラットの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す。図１２Ａは、ＷＴマウスの視神経挫滅（ＯＮＣ）モデルにおけるＢＤＮＦの用量応答を示す。図１２Ｂは、ＷＴラットの視神経切断モデルにおける０．１３μｇ～３０μｇのＢＤＮＦの用量応答を示す。
図１３Ａは、視神経切断後３日目および１０日目にＴｒｋＢアゴニスト抗体またはアイソタイプ対照抗体を硝子体内投与したホモ接合性ＴｒｋＢラット、ヘテロ接合性ＴｒｋＢラット、または野生型ＴｒｋＢラットの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す（＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、二元配置ＡＮＯＶＡ）。網膜は切断の１４日後に切除した。ＴｒｋＢ ｍＡｂ１はＨ４Ｈ９８１６Ｐ２である。
図１３Ｂは、ホモ接合性ＴｒｋＢラット、ヘテロ接合性ＴｒｋＢラット、または野生型ＴｒｋＢラットから切除した傷害を受けていない眼における網膜神経節細胞の密度を示す。
図１３Ｃは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２、ＴｒｋＢ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５、対照）を投与したヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスの体重を示す。
図１４は、視神経切断後３日目および１０日目にＴｒｋＢアゴニスト抗体（ｈＴｒｋＢ、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を硝子体内投与したヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す。網膜は切断の１４日後に切除した。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、視神経切断後３日目および１０日目に種々のＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２－Ｌ９、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ－Ｌ９、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ－Ｌ５、または３つ全ての組合せ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を硝子体内投与したヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す（＊＊ｐ＜０．０１、アイソタイプ対照抗体と比較したＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）。網膜は切断の１４日後に切除した。図１５Ａはナイーブ対照（傷害を受けていない反対側の眼）を含み、図１５Ｂはこれを含まない。
図１６は、視神経切断後３日目および１０日目に種々のＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９７８０ＰおよびＨ４Ｈ９８１４Ｐ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を硝子体内投与した野生型ラットの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す。網膜は切断の１４日後に切除した。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、視神経切断後３日目および１０日目にＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を硝子体内投与したヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスの、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における網膜神経節細胞の密度を示す。網膜は切断の１４日後に切除した。図１７Ａは正常対照（傷害を受けていない反対側の眼）を含み、図１７Ｂはこれを含まない。
図１７Ｃは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を投与したヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスの体重を示す。
定義
本明細書で互換的に使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、コードされるおよびコードされないアミノ酸、ならびに化学的にまたは生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。この用語は、改変されたペプチド骨格を有するポリペプチド等、改変されたポリマーも含む。用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有する、タンパク質またはポリペプチドのいずれかの部分を指す。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われる。用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸で終わる、タンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で終わる、アミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終止部に関する。
本明細書で互換的に使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらのアナログもしくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらの用語は、一本鎖、二本鎖および多重鎖（multistranded）ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基または他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
ある１個のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル連結を介して一方向で、その近隣の３’酸素に取り付けられるような様式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作製するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されていない場合、「３’末端」と称される。核酸配列は、より大型のオリゴヌクレオチドの内部にある場合であっても、５’および３’末端を有すると言うこともできる。直鎖状または環状いずれかのＤＮＡ分子において、別々のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’であると称される。
用語「ゲノムに組み込まれた」は、ヌクレオチド配列が、細胞のゲノム内に組み込まれ、その後代に遺伝され得るように、細胞内に導入された核酸を指す。いずれかのプロトコールを、細胞のゲノム内への核酸の安定した取り込みに使用することができる。
用語「標的化ベクター」は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または他のいずれかの組換え手段によって、細胞のゲノム内の標的位置に導入され得る組換え核酸を指す。
用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも１個のエレメントを含み、ウイルスベクター粒子内へのパッケージングに十分なまたは許容的なエレメントを含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、細胞にＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を移入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多数の形態が公知である。
用語「野生型」は、正常（変異体、罹患された、変更されたその他と対比して）状態または文脈において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
用語「内在性」は、細胞または非ヒト動物内に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内在性ＴｒｋＢ配列は、非ヒト動物におけるＴｒｋＢ遺伝子座に天然に存在するネイティブＴｒｋＢ配列を指す。
「外因性」分子または配列は、当該形態で細胞に通常存在しない分子または配列を含む。通常の存在は、細胞の特定の発生ステージおよび環境条件に関する存在を含む。外因性分子または配列は、例えば、内在性配列のヒト化バージョン等、細胞内における対応する内在性配列の変異したバージョンを含むことができる、または細胞内における内在性配列に対応するが、異なる形態における（すなわち、染色体内にない）配列を含むことができる。それに対比して、内在性分子または配列は、特定の環境条件下における特定の発生ステージで特定の細胞に当該形態で通常存在する分子または配列を含む。
用語「異種」は、核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合、核酸またはタンパク質が、同じ分子において天然では一緒に存在しない少なくとも２個の部分を含むことを指し示す。例えば、用語「異種」は、核酸の部分またはタンパク質の部分を参照しつつ使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界では互いに同じ関係性で（例えば、一体に連結されて）見出されない、２個またはそれよりも多い部分配列を含むことを指し示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、別の核酸分子内にあるまたはそれに取り付けられた、自然界ではその他の分子に付随した状態では見出されない核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界では当該のコード配列に付随した状態では見出されない配列と隣接したコード配列を含むことができる。同様に、タンパク質の「異種」領域は、別のペプチド分子内にあるまたはそれに取り付けられた、自然界ではその他のペプチド分子に付随した状態では見出されないアミノ酸のセグメントである（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きのタンパク質）。類似して、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含むことができる。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対コドン組合せの多重度によって示される通り、コドンの縮重を活用し、一般に、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブ配列の少なくとも１個のコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンに置き換えることにより、特定の宿主細胞における発現増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞または他のいずれかの宿主細胞を含む所与の原核または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを代わりに使用するように改変することができる。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース（Codon Usage Database）」において容易に利用できる。このような表は、多数の仕方で適応させることができる。その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも、利用できる（例えば、Gene Forgeを参照）。
用語「遺伝子座」は、遺伝子（または有意な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列の特異的な箇所、または生物のゲノムの染色体上の位置を指す。例えば、「ＴｒｋＢ遺伝子座」は、ＴｒｋＢ遺伝子、ＴｒｋＢ ＤＮＡ配列、ＴｒｋＢコード配列の特異的な箇所、または斯かる配列が存在する箇所について同定された生物のゲノムの染色体上のＴｒｋＢ位置を指すことができる。「ＴｒｋＢ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはこれらの組合せを含む、ＴｒｋＢ遺伝子の調節エレメントを含むことができる。
用語「遺伝子」は、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードし、非コードイントロンにより中断されるコード領域、ならびに遺伝子が全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するような、５’および３’末端の両方におけるコード領域に近接して配置された配列を含む、染色体中のＤＮＡ配列を指す。用語「遺伝子」は、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、インスレーター配列（insulating sequence）およびマトリクス付着領域を含む、他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域の近くにあっても（例えば、１０ｋｂ以内）、遠隔部位にあってもよく、遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響する。
用語「対立遺伝子」は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は、染色体上の同じ位置または遺伝子座位に配置された種々の異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座位に２個の対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特異的遺伝子座位の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２個の同一対立遺伝子が存在する場合、ホモ接合性として、また、２個の対立遺伝子が異なる場合、ヘテロ接合性として記載される。
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位においてＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを通常含む、ＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、その上、転写開始速度に影響する他の領域を含むことができる。本明細書に開示されているプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示されている細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化した細胞、またはこれらの組合せ）のうち１種または複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性があるプロモーター、コンディショナルプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」ことは、両方の構成成分が、正常に機能し、構成成分のうち少なくとも１個が、他の構成成分のうち少なくとも１個により発揮される機能を媒介することができるという可能性を許容するような、２個またはそれよりも多い構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並置を含む。例えば、プロモーターが、１種または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結することができる。作動可能な連結は、互いに近接している、またはトランスで作用する（例えば、調節配列は、コード配列の転写を制御するために、ある距離で作用することができる）斯かる配列を含むことができる。
用語「バリアント」は、集団内で最も普及している配列とは異なる（例えば、１ヌクレオチドだけ）ヌクレオチド配列、または集団内で最も普及している配列とは異なる（例えば、１アミノ酸だけ）タンパク質配列を指す。
用語「断片」は、タンパク質を指す場合、全長タンパク質よりも短い、またはそれよりも少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。用語「断片」は、核酸を指す場合、全長核酸よりも短い、またはそれよりも少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端側の端の部分の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端側の端の部分の除去）または内部断片であり得る。
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、指定の比較ウィンドウにわたる最大一致のために整列された場合に同じである、２種の配列における残基を参照する。配列同一性のパーセンテージが、タンパク質を参照しつつ使用される場合、同一ではない残基位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なり、この保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代わりに使用され、したがって、分子の機能的特性を変化させない。配列が、保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、上向きに調整して、置換の保存的性質に関して補正することができる。斯かる保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を為すための手段は周知である。典型的には、これは、完全ではなく部分的ミスマッチとしての保存的置換のスコアリングが関与し、これにより、パーセンテージ配列同一性を増加させる。よって、例えば、同一アミノ酸に、１のスコアを与え、非保存的置換に、ゼロのスコアを与える場合、保存的置換には、ゼロ～１の間のスコアを与える。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行される通りに計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２種の最適に整列された配列（最大数の完璧にマッチした残基）を比較することにより決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２種の配列の最適整列のために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。両方の配列における同一核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、パーセンテージは計算される。他に指定がなければ（例えば、短い方の配列が、連結された異種配列を含む）、比較ウィンドウは、比較されている２種の配列のうち短い方の全長である。
特段の記述がなければ、配列同一性／類似性値は、次のパラメーターを使用したＧＡＰバージョン１０を使用して得られる値を含む：ギャップウエイト５０および長さウエイト３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリクスを使用した、ヌクレオチド配列の％同一性および％類似性；ギャップウエイト８および長さウエイト２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用した、アミノ酸配列の％同一性および％類似性；またはこれらのいずれかの等価なプログラム。「等価なプログラム」は、問題のいずれか２種の配列に関して、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応する整列と比較した場合に、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一パーセント配列同一性を有する整列を生成する、いずれかの配列比較プログラムを含む。
用語「保存的アミノ酸置換」は、配列に通常存在するアミノ酸の、同様のサイズ、電荷または極性を有する異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例として、イソロイシン、バリンまたはロイシン等の非極性（疎水性）残基による、別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間等、ある極性（親水性）残基による、別の極性（親水性）残基の置換が挙げられる。その上、リシン、アルギニンもしくはヒスチジン等の塩基性残基による、別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のある酸性残基による、別の酸性残基の置換が、保存的置換の追加的な例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニンもしくはメチオニン等の非極性（疎水性）アミノ酸残基による、システイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシン等の極性（親水性）残基の置換、および／または極性残基の非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を下に要約する。
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、公知参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるような、公知参照配列と同一または実質的に同様のいずれかである配列を含む。相同配列は、例えば、オルソロガス配列およびパラロガス配列を含むことができる。相同遺伝子は、例えば、典型的に、種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを経て、共通祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソロガス」遺伝子は、種分化によって共通祖先遺伝子から進化した異なる種における遺伝子を含む。オルソログは、典型的に、進化の過程において同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内の重複によって関係付けられた遺伝子を含む。パラログは、進化の過程において新たな機能を進化させることができる。
用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、人為的な環境、および人為的な環境（例えば、試験管）内で発生するプロセスまたは反応を含む。用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、天然の環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然の環境内で発生するプロセスまたは反応を含む。用語「ｅｘ ｖｉｖｏ」は、個体の身体から除去された細胞、および斯かる細胞内で発生するプロセスまたは反応を含む。
用語「レポーター遺伝子」は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結したレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含有する（またはこれを含有するように作製することができる）細胞に導入された場合、簡単にかつ定量化可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例として、ベータ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
用語「蛍光レポータータンパク質」は、本明細書で使用される場合、蛍光に基づき検出可能なレポータータンパク質を意味し、この場合、蛍光は、直接的にレポータータンパク質、蛍光原基質におけるレポータータンパク質の活性、または蛍光タグ付けされた化合物への結合に対し親和性を有するタンパク質のいずれかに由来し得る。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、タグＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰおよびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰおよびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、ＳａｐｐｈｉｒｅおよびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌおよびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－タンデム、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅおよびｔｄＴｏｍａｔｏ）、および細胞におけるその存在をフローサイトメトリー方法によって検出することができる、他のいずれかの適した蛍光タンパク質が挙げられる。
用語「組換え」は、２種のポリヌクレオチド間での遺伝情報交換のいずれかのプロセスを含み、いずれかの機構によって発生し得る。二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した組換えは、主に、２種の保存されたＤＮＡ修復経路を経て発生する：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）。その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２種のポリヌクレオチド間での遺伝情報交換のいずれかのプロセスを含むことができる。
ＮＨＥＪは、相同鋳型の必要がない、互いへの、または外因性配列への、切断末端の直接的ライゲーションによる核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非近接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の付近に欠失、挿入または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、外因性ドナー核酸の末端による切断末端の直接的ライゲーションを介した外因性ドナー核酸の標的化された組み込みをもたらす場合もある（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。斯かるＮＨＥＪに媒介された標的化された組み込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞において）、外因性ドナー核酸の挿入に好まれる場合がある。加えて、相同組換え修復と対比して、切断部位に隣接する配列同一性の大型領域に関する知識が必要とされず、このことは、限られたゲノム配列知識しかないゲノムを有する生物への標的化挿入を試みる際に有益となり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸および切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列におけるヌクレアーゼ剤によって生成されたものと適合性のオーバーハングに挟まれた外因性ドナー核酸を使用して、粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進むことができる。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびMaresca et al. (2013) Genome Res. 23(3):539-546を参照されたい。平滑末端がライゲーションされる場合、標的および／またはドナーの切除が、断片連結に必要とされるマイクロホモロジーの領域の生成に必要とされる場合があり、これは、標的配列において望まれない変更を生じ得る。
組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して発生することもできる。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列相同性を要求し得る核酸修復の形態を含み、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のための鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらす。いかなる特定の理論にも制約されることは望まないが、斯かる移入は、切断された標的およびドナーの間で形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または標的の一部になるであろう遺伝情報の再合成にドナーが使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関係するプロセスが関与し得る。一部の場合、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの部分は、標的ＤＮＡへと組み込む。それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al. (2013) Cell 153:910-918；Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9；およびWang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532を参照されたい。
用語「抗原結合性タンパク質」は、抗原に結合するいずれかのタンパク質を含む。抗原結合性タンパク質の例として、抗体、抗体の抗原結合性断片、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビス－ｓｃＦＶ、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗原結合性タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合性タンパク質）、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager）（ＢｉＴＥ）またはデイビスボディ（Davisbody）（その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、表現「抗ＴＲＫＢ抗体」は、単一の特異性を有する一価抗体、ならびにＴＲＫＢに結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二特異性抗体の両方を含み、抗ＴＲＫＢアームは、例えば、本明細書の表２２に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む。表現「抗ＴｒｋＢ抗体」は、薬物または毒素（すなわち、細胞傷害剤）にコンジュゲートされた抗ＴＲＫＢ抗体またはその抗原結合性部分を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も含む。表現「抗ＴＲＫＢ抗体」は、放射性核種にコンジュゲートされた抗ＴＲＫＢ抗体またはその抗原結合性部分を含む抗体－放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）も含む。
用語「抗ＴＲＫＢ抗体」は、本明細書で使用される場合、ＴＲＫＢまたはＴＲＫＢの部分に特異的に結合するまたはこれと相互作用する、少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むいずれかの抗原結合性分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖である、４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと省略）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと省略）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１個のドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名されるより保存された領域がちりばめられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される高頻度可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ＴＲＫＢ抗体（またはその抗原結合性部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得る、または天然にもしくは人為的に改変することができる。アミノ酸コンセンサス配列は、２種またはそれよりも多いＣＤＲのサイド・バイ・サイドの（side-by-side）解析に基づき定義することができる。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、全長抗体分子の抗原結合性断片も含む。抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性断片」、その他の用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの、酵素により得ることができる、合成のまたは遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、タンパク質分解性消化、または抗体可変および必要に応じて定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現が関与する組換え遺伝子操作技法等のいずれか適した標準技法を使用して、完全抗体分子から得ることができる。斯かるＤＮＡは、公知である、および／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に利用できる、または合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的に、または分子生物学技法を使用することにより操作して、例えば、適した構成に１個または複数の可変および／または定常ドメインを配置する、またはコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を改変、付加もしくは欠失させる等を、行うことができる。
抗原結合性断片の非限定的な例として、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の高頻度可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチド等、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または制約されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（minibody）、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫医薬品（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン等、他の操作された分子も、本明細書で使用される場合の表現「抗原結合性断片」の内に包含される。
抗体の抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも１個の可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、いかなるサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、１個または複数のフレームワーク配列に近接した、またはこれとインフレームにある、少なくとも１個のＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合性断片において、ＶＨおよびＶＬドメインは、互いに対して、任意の適した配置にあり得る。例えば、可変領域は、二量体となり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有することができる。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有することができる。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１個の定常ドメインに共有結合により連結された少なくとも１個の可変ドメインを含有することができる。本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出すことができる可変および定常ドメインの非限定的で例示的な構成は、次のものを含む：（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬ。上に収載されている例示的な構成のいずれかを含む可変および定常ドメインのいずれかの構成において、可変および定常ドメインは、互いに直接的に連結することができる、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域によって連結することができる。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子における近接可変および／または定常ドメインの間に可撓性または半可撓性連結をもたらす、少なくとも２（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれよりも多い）アミノ酸からなることができる。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いにおよび／または１個もしくは複数の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインと非共有結合的に会合した（例えば、ジスルフィド結合（複数可）によって）、上に収載されている可変および定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異性または多特異性（例えば、二特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合性断片は、典型的に、各可変ドメインが、別々の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる、少なくとも２個の異なる可変ドメインを含むであろう。本明細書に開示されている例示的な二特異性抗体フォーマットを含むいずれかの多特異性抗体フォーマットは、ルーチン技法を使用した本発明の抗体の抗原結合性断片の文脈における使用に適応させることができる。
用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合性部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２個以上のエピトープを有することができる。よって、異なる抗体が、抗原における異なる区域に結合することができ、異なる生物学的効果を有することができる。エピトープは、コンフォメーション性または直鎖状のいずれかであり得る。コンフォメーションエピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖における近接アミノ酸残基によって産生されるエピトープである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原における糖類、ホスホリル基またはスルホニル基の部分を含むことができる。
用語「特異的に結合」または「に特異的に結合する」その他は、抗体またはその抗原結合性断片が、生理学的条件下で比較的安定した複合体を抗原と形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍまたはそれ未満の平衡解離定数（例えば、より小さいＫＤは、より緊密な結合を表示する）によって特徴付けることができる。２個の分子が特異的に結合するか決定するための方法は、周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴その他を含む。本明細書に記載されている通り、ＴＲＫＢに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって同定された。さらに、ＴＲＫＢタンパク質および１種もしくは複数の追加的な抗原に結合する多特異性抗体、またはＴＲＫＢの２個の異なる領域に結合する二特異性抗体は、それにもかかわらず、本明細書で使用される場合、「特異的に結合」する抗体と考慮される。
本明細書に開示されている抗ＴＲＫＢ抗体は、重および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域において１個または複数のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含むことができる。斯かる変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから利用できる配列と比較することにより容易に確かめることができる。ひとたび得られたら、１個または複数の変異を含有する抗体および抗原結合性断片は、例えば、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善されたまたは増強されたアンタゴニストまたはアゴニスト生物学的特性（場合による）、低下した免疫原性等、１種または複数の所望の特性に関して簡単に検査することができる。この一般様式で得られる抗体および抗原結合性断片が含まれる。
１個または複数の保存的置換を有する、本明細書に開示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＴＲＫＢ抗体も、含まれる。例えば、本発明は、例えば、表２２に表記されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて、１０個またはそれよりも少ない、８個またはそれよりも少ない、６個またはそれよりも少ない、４個またはそれよりも少ない等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＴＲＫＢ抗体を含む。
用語「実質的同一性」または「実質的に同一」は、抗ＴＲＫＢ抗体の文脈において核酸またはその断片を指す場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失により、別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列されると、後述するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ等の配列同一性のいずれか周知のアルゴリズムによって測定された場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％にヌクレオチド配列同一性が存在することを指し示す。参照核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、ある特定の実例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
抗ＴＲＫＢ抗体の文脈においてポリペプチドに適用される通り、用語「実質的類似性」または「実質的に同様の」は、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップウエイトを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等により最適に整列されると、少なくとも９５％配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。抗ＴＲＫＢ抗体の文脈においてポリペプチドに適用される場合の「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２種またはそれよりも多いアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度を上向きに調整して、置換の保存的性質に関して補正することができる。この調整を為すための手段は、当業者に周知である。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。同様の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例を次に挙げる：（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに（７）硫黄含有側鎖、これは、システインおよびメチオニンである。好まれる保存的アミノ酸置換群を次に示す：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミン。あるいは、保存的置き換えは、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Gonnet et al. (1992) Science 256:1443-1445に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負ではない値を有するいずれかの変化である。
１種または複数の列挙されたエレメントを「含む（comprising）」または「含む（including）」組成物または方法は、特に列挙されていない他のエレメントを含むことができる。例えば、タンパク質を「含む（comprise）」または「含む（include）」組成物は、タンパク質を、単独で、または他の成分と組み合わせて含有することができる。移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙された指定のエレメント、ならびに請求されている発明の基本および新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えないエレメントを包含するものと解釈されるべきであることを意味する。よって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲において使用される場合、「含む（comprising）」と均等であると解釈されることを意図しない。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、発生してもしなくてもよいこと、また、記載が、事象または状況が発生する実例、およびそれが発生しない実例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、範囲内のまたは範囲を定義する全ての整数、および範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。
そうでないことが文脈から明らかとならない限り、用語「約」は、記述されている値の測定の標準許容誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
用語「および／または（and/or）」は、関連する収載された項目のうち１種または複数のありとあらゆる可能な組合せと共に、二者択一（「または（or）」）において解釈された場合には組合せの欠如を指し、これを包含する。
用語「または（or）」は、特定のリストのうちいずれか１メンバーを指し、当該リストのメンバーのいずれかの組合せも含む。
単数形の冠詞「１つの（a）」、「１つの（an）」および「それ（the）」は、そうでないことを文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「１つのタンパク質（a protein）」または「少なくとも１つのタンパク質」は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含むことができる。
統計的に有意は、ｐ≦０．０５を意味する。
詳細な説明
Ｉ．概要
ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびに斯かる非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が、本明細書に開示されている。ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトＴＲＫＢタンパク質、またはヒトＴＲＫＢタンパク質の１個もしくは複数の断片（例えば、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインの全体または一部）を含むキメラＴＲＫＢタンパク質を発現する。
ヒト化ＴＲＫＢ対立遺伝子（例えば、１対１での（one-for-one）、オルソロガスヒトゲノムＤＮＡによる、非ヒト動物ゲノムＤＮＡの全体または一部の置き換えに起因する）は、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬（例えば、ヒトＴＲＫＢを標的化するように設計されたアゴニスト抗体またはアゴニスト小分子）の真のヒト標的または真のヒト標的の密接な近似を提供し、これにより、生きている動物における斯かる薬剤の有効性および作用機序の検査、ならびに薬物動態および薬力学研究を可能にするであろう。例えば、本明細書に開示されている実施例に示す通り、ヒトＴＲＫＢアゴニスト抗体の硝子体内投与は、ヒト化ＴｒｋＢラットにおける視神経傷害後に有意な神経保護的効果を有する。
ＩＩ．ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示されている非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む。ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む細胞または非ヒト動物は、ヒトＴＲＫＢタンパク質、またはネイティブＴＲＫＢタンパク質の１個もしくは複数の断片がヒトＴＲＫＢ由来の対応する断片（例えば、細胞外ドメインの全体または一部）に置き換えられた、部分的にヒト化されたキメラＴＲＫＢタンパク質を発現する。
Ａ．ＴＲＫＢ
本明細書に記載されている細胞および非ヒト動物は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む。ＴＲＫＢ（ＢＤＮＦ－ＮＴ－３増殖因子受容体、ＧＰ１４５－ＴｒｋＢ、Ｔｒｋ－Ｂ、ＴｒｋＢ、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体２型、ＴｒｋＢチロシンキナーゼ、トロポミオシン関連キナーゼＢ、トロポミオシン受容体キナーゼＢ、神経栄養性受容体チロシンキナーゼ２およびＮＴＲＫ２としても公知）は、ＴＲＫＢ遺伝子（ＮＴＲＫ２、ＯＢＨＤ、ＴＲＫ－ＢおよびＧＰ１４５－ＴＲＫＢとしても公知）によってコードされる。ＴＲＫＢは、ニューロン生存、増殖、遊走、分化、ならびにシナプス形成および可塑性の調節を介して中枢および末梢神経系の発生および成熟に関与する受容体チロシンキナーゼである。ＴＲＫＢは、ＢＤＮＦ／脳由来神経栄養因子およびＮＴＦ４／ニューロトロフィン－４の受容体である。あるいは、ＴＲＫＢは、ＮＴＦ３／ニューロトロフィン－３に結合することもでき、これは、受容体の活性化における効率が低いが、ＴＲＫＢを介してニューロン生存を調節する。リガンド結合後に、ＴＲＫＢは、ホモ二量体化、自己リン酸化および活性化を起こす。ＴＲＫＢの正準アイソフォームは、中枢および末梢神経系において発現される。中枢神経系（ＣＮＳ）において、発現は、大脳皮質、海馬、視床、脈絡叢、小脳の顆粒層、脳幹および脊髄において観察される。末梢神経系において、これは、多くの頭蓋神経節、眼神経、前庭系、複数の顔面構造、顎下腺および後根神経節において発現される。
ヒトＴＲＫＢは、第９染色体上のヒト９ｑ２１．３３にマッピングされる（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＩＤ ４９１５；アセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ７；位置ＮＣ＿０００００９．１２（８４６６８３６８．．８５０２７０７０））。この遺伝子は、２３個のエクソンを有することが報告されている。野生型ヒトＴＲＫＢタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１６６２０を割り当てられた。少なくとも７種のアイソフォームが公知である（Ｑ１６６２０－１からＱ１６６２０－７）。１種のアイソフォーム、Ｑ１６６２０－４（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００６１７１．２と同一）の配列は、配列番号３に表記されている。正準アイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＦ４１０８９９．１を割り当てられ、配列番号８に表記されている。ヒトＴＲＫＢアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の別の例は、ＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡ ＩＤ ＮＭ＿００６１８０．４を割り当てられる。例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１１に表記されている。配列番号３に表記されている全長ヒトＴＲＫＢタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～３１）、細胞外ドメイン（アミノ酸３２～４３０）、膜貫通ドメイン（アミノ酸４３１～４５４）および細胞質ドメイン（アミノ酸４５５～８３８）を含む８３８アミノ酸を有する。これらのドメインの間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔに指定されている通りのものである。ヒトＴＲＫＢの参照は、正準（野生型）形態と共に、あらゆる対立遺伝子形態およびアイソフォームを含む。ヒトＴＲＫＢの他のいずれかの形態は、野生型形態との最大整列のためにナンバリングされたアミノ酸を有し、整列されたアミノ酸は、同じ番号を指定される。ヒトＴＲＫＢの別のアイソフォームの例は、配列番号７５に表記されているＱ１６６２０－１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０１８０７４．１と同一）である。このアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０１８０６４．２を割り当てられ、配列番号７６に表記されている。このアイソフォームの例示的なコード配列（ＣＤＳ）（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ３５０５０．１）は、配列番号７７に表記されている。
ラットＴｒｋＢは、第１７染色体上のラット１７ｐ１４にマッピングされる（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＩＤ ２５０５４；アセンブリＲｎｏｒ＿６．０；位置ＮＣ＿００５１１６．４（５９３４６５１．．６２４５７７８、相補体））。この遺伝子は、２３個のエクソンを有することが報告されている。野生型ラットＴＲＫＢタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ６３６０４を割り当てられた。少なくとも３種のアイソフォームが公知である（Ｑ６３６０４－１からＱ６３６０４－３）。正準アイソフォーム、Ｑ６３６０４－１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３６８６３．１と同一）の配列は、配列番号２に表記されている。正準アイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１２７３１．２を割り当てられ、配列番号７に表記されている。ラットＴＲＫＢアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の別の例は、ＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡ ＩＤ Ｍ５５２９１を割り当てられる。例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１０に表記されている。配列番号２に表記されている正準全長ラットＴＲＫＢタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～３１）、細胞外ドメイン（アミノ酸３２～４２９）、膜貫通ドメイン（アミノ酸４３０～４５３）および細胞質ドメイン（アミノ酸４５４～８２１）を含む８２１アミノ酸を有する。これらのドメインの間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔに指定されている通りのものである。ラットＴＲＫＢの参照は、正準（野生型）形態と共に、あらゆる対立遺伝子形態およびアイソフォームを含む。ラットＴＲＫＢの他のいずれかの形態は、野生型形態との最大整列のためにナンバリングされたアミノ酸を有し、整列されたアミノ酸は、同じ番号を指定される。
マウスＴｒｋＢは、第１２染色体上のマウス１３ Ｂ１；１３ ３１．２ｃＭにマッピングされる（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＩＤ １８２１２；アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ４（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２４）；位置ＮＣ＿００００７９．６（５８８０６５６９．．５９１３３９７０））。この遺伝子は、２３個のエクソンを有することが報告されている。野生型マウスＴＲＫＢタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５２０９を割り当てられた。少なくとも４種のアイソフォームが公知である（Ｐ１５２０９－１からＰ１５２０９－４）。正準アイソフォーム、Ｐ１５２０９－１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０２０２４５．１およびＮＰ＿００１２６９８９０．１と同一）の配列は、配列番号１に表記されている。正準アイソフォームをコードする例示的なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）アイソフォームは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０２５０７４．２を割り当てられ、配列番号６に表記されている。例示的なコード配列（ＣＤＳ）（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ２６５７３．１）は、配列番号９に表記されている。配列番号１に表記されている正準全長マウスＴＲＫＢタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～３１）、細胞外ドメイン（アミノ酸３２～４２９）、膜貫通ドメイン（アミノ酸４３０～４５３）および細胞質ドメイン（アミノ酸４５４～８２１）を含む８２１アミノ酸を有する。これらのドメインの間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔに指定されている通りのものである。マウスＴＲＫＢの参照は、正準（野生型）形態と共に、あらゆる対立遺伝子形態およびアイソフォームを含む。マウスＴＲＫＢの他のいずれかの形態は、野生型形態との最大整列のためにナンバリングされたアミノ酸を有し、整列されたアミノ酸は、同じ番号を指定される。
Ｂ．ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座
ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座は、ＴｒｋＢ遺伝子全体が対応するオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた、ＴｒｋＢ遺伝子座であり得る、またはＴｒｋＢ遺伝子の部分のみが対応するオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた（すなわち、ヒト化された）、ＴｒｋＢ遺伝子座であり得る。必要に応じて、対応するオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列は、非ヒト動物におけるコドン使用に基づきコドン最適化されるように改変される。置き換えられた（すなわち、ヒト化された）領域は、エクソン等のコード領域、イントロン等の非コード領域、非翻訳領域もしくは調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写リプレッサー結合エレメント）、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。一例として、ヒトＴＲＫＢ遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または全２３個のエクソンに対応するエクソンは、ヒト化することができる。例えば、ヒトＴＲＫＢ遺伝子のエクソン３～１０に対応するエクソンは、ヒト化することができ、シグナルペプチドの直後に始まる、アミノ酸３３をコードするコドン由来のエクソン２（コーディングエクソン１）のセグメントを含む。あるいは、抗ヒトＴＲＫＢ抗原結合性タンパク質によって認識されるエピトープをコードするＴｒｋＢの領域、またはヒトＴＲＫＢ標的化試薬（例えば、小分子）によって標的化される領域は、ヒト化することができる。同様に、ヒトＴＲＫＢ遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または全２２個のイントロンに対応するイントロンは、ヒト化することができる、または内在性のままであってよい。例えば、ヒトＴＲＫＢ遺伝子のエクソン２および１０の間のイントロン（すなわち、イントロン２～９、コーディングエクソン１およびエクソン１０の間）に対応するイントロンは、ヒト化することができ、必要に応じて、エクソン１０に続くイントロン（すなわち、イントロン１０）の一部を含む。調節配列を含む隣接する非翻訳領域もまた、ヒト化しても内在性のままであってもよい。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方は、ヒト化することができる、または５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方は、内在性のままであってよい。具体例では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方は、内在性のままとなる。オルソロガス配列による置き換えの度合に応じて、プロモーター等の調節配列は、内在性であり得る、またはヒトオルソロガス配列を置き換えることにより供給することができる。例えば、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座は、内在性非ヒト動物ＴｒｋＢプロモーターを含むことができる。
シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインもしくは細胞外ドメインをコードする領域のうち１種もしくは複数もしくは全種は、ヒト化することができる、または斯かる領域のうち１種もしくは複数は、内在性のままであってよい。マウスＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの例示的なコード配列は、それぞれ配列番号６３～６６に表記されている。ラットＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの例示的なコード配列は、それぞれ配列番号６７～７０に表記されている。ヒトＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの例示的なコード配列は、それぞれ配列番号７１～７４に表記されている。
例えば、シグナルペプチドをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域の全体もしくは一部は、ヒト化することができる、および／または細胞外ドメインをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域の全体もしくは一部は、ヒト化することができる、および／または膜貫通ドメインをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域の全体もしくは一部は、ヒト化することができる、および／または細胞質ドメインをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域の全体もしくは一部は、ヒト化することができる。一例では、細胞外ドメインをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域の全体または一部は、ヒト化される。必要に応じて、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインのＣＤＳは、配列番号７２（またはその縮重体（degenerate））と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。ＴＲＫＢタンパク質は、ネイティブＴＲＫＢの活性を保持することができる（例えば、リン酸化されるようになる能力を保持する、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路等の下流シグナル伝達経路を活性化する能力を保持する、またはニューロン生存、増殖、遊走、分化、もしくはシナプス形成および可塑性を調節する、または本明細書の他の箇所に開示されている表現型のいずれかを産生する能力を保持する）。例えば、内在性シグナルペプチド、内在性細胞質ドメイン、内在性膜貫通ドメインおよびヒト化細胞外ドメインを有するキメラＴＲＫＢタンパク質が産生されるように、細胞外ドメインをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域は、ヒト化することができる。
シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞外ドメインをコードする領域のうち１種または複数は、内在性のままであってよい。例えば、シグナルペプチドおよび／または細胞質ドメインおよび／または膜貫通ドメインをコードする領域は、内在性のままであってよい。必要に応じて、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチドのＣＤＳは、配列番号６３または６７（またはその縮重体）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。必要に応じて、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインのＣＤＳは、配列番号６５または６９（またはその縮重体）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。必要に応じて、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインのＣＤＳは、配列番号６６または７０（またはその縮重体）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。各場合において、ＴＲＫＢタンパク質は、ネイティブＴＲＫＢの活性を保持することができる。
ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、ヒトＴＲＫＢタンパク質に由来する１種もしくは複数のドメイン、および／または内在性（すなわち、ネイティブ）ＴＲＫＢタンパク質に由来する１種もしくは複数のドメインを含むことができる。マウスＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１～５４に表記されている。ラットＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５５～５８に表記されている。ヒトＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５９～６２に表記されている。
ＴＲＫＢタンパク質は、ヒトＴＲＫＢシグナルペプチド、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメイン、ヒトＴＲＫＢ膜貫通ドメイン、およびヒトＴＲＫＢ細胞質ドメインのうち１種または複数または全種を含むことができる。一例として、ＴＲＫＢタンパク質は、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含むことができる。
ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、内在性（すなわち、ネイティブ）非ヒト動物ＴＲＫＢタンパク質に由来する１種または複数のドメインを含むこともできる。一例として、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、内在性（すなわち、ネイティブ）非ヒト動物ＴＲＫＢタンパク質由来のシグナルペプチド、および／または内在性（すなわち、ネイティブ）非ヒト動物ＴＲＫＢタンパク質由来の細胞質ドメイン、および／または内在性（すなわち、ネイティブ）非ヒト動物ＴＲＫＢタンパク質由来の膜貫通ドメインを含むことができる。
ヒトＴＲＫＢタンパク質に由来するキメラＴＲＫＢタンパク質におけるドメインは、完全にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、当該ドメインをコードする配列全体が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられる）、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、当該ドメインをコードする配列の一部が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられ、コードされるドメインが、ヒトＴＲＫＢタンパク質における当該ドメインと同一となるように、当該ドメインをコードする残っている内在性（すなわち、ネイティブ）配列が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列と同じアミノ酸をコードする）。同様に、内在性ＴＲＫＢタンパク質に由来するキメラタンパク質におけるドメインは、完全に内在性の配列によってコードされ得る（すなわち、当該ドメインをコードする配列全体が、内在性ＴｒｋＢ配列である）、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、当該ドメインをコードする配列の一部が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられるが、コードされるドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質における当該ドメインと同一となるように、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列が、置き換えられた内在性ＴｒｋＢ配列と同じアミノ酸をコードする）。例えば、膜貫通ドメインをコードするＴｒｋＢ遺伝子座の領域の一部（例えば、膜貫通ドメインのＮ末端領域をコードする）は、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えることができ、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列によってコードされる膜貫通ドメインの領域のアミノ酸配列は、対応する内在性アミノ酸配列と同一である。
一例として、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含むことができる。必要に応じて、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインは、配列番号６０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。ＴＲＫＢタンパク質は、ネイティブＴＲＫＢの活性を保持する（例えば、リン酸化されるようになる能力を保持する、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路等の下流シグナル伝達経路を活性化する能力を保持する、またはニューロン生存、増殖、遊走、分化、もしくはシナプス形成および可塑性を調節する、または本明細書の他の箇所に開示されている表現型のいずれかを産生する能力を保持する）。別の例として、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、内在性非ヒト動物ＴＲＫＢ細胞質ドメイン（例えば、マウスＴＲＫＢ細胞質ドメインまたはラットＴＲＫＢ細胞質ドメイン）を含むことができる。必要に応じて、非ヒト動物ＴＲＫＢ細胞質ドメインは、配列番号５４または５８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。別の例として、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、内在性非ヒト動物ＴＲＫＢ膜貫通ドメイン（例えば、マウスＴＲＫＢ膜貫通ドメインまたはラットＴＲＫＢ膜貫通ドメイン）を含むことができる。必要に応じて、非ヒト動物ＴＲＫＢ膜貫通ドメインは、配列番号５３または５７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。別の例として、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、内在性非ヒト動物ＴＲＫＢシグナルペプチド（例えば、マウスＴＲＫＢシグナルペプチドまたはラットＴＲＫＢシグナルペプチド）を含むことができる。必要に応じて、非ヒト動物ＴＲＫＢシグナルペプチドは、配列番号５１または５５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなる。各場合において、ＴＲＫＢタンパク質は、ネイティブＴＲＫＢの活性を保持することができる。例えば、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢタンパク質は、配列番号４または５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなることができる。必要に応じて、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるＴＲＫＢ ＣＤＳは、配列番号１２または１３（またはその縮重体）と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、これから本質的になる、またはこれからなることができる。各場合において、ＴＲＫＢタンパク質は、ネイティブＴＲＫＢの活性を保持することができる。
必要に応じて、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座は、他のエレメントを含むことができる。斯かるエレメントの例として、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位または他のエレメントを挙げることができる。あるいは、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座は、他のエレメントを欠如することができる（例えば、選択マーカーまたは選択カセットを欠如することができる）。適したレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書の他の箇所に開示されている。適した選択マーカーの例として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が挙げられる。リコンビナーゼの例として、Ｃｒｅ、ＦｌｐおよびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅｉであり、この遺伝子において、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２個のエクソンは、原核細胞におけるその発現を防止するためにイントロンによって分離されている。斯かるリコンビナーゼは、核への局在化を容易にする核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列を含み、組換え事象のための基質として機能することができる。リコンビナーゼ認識部位の例として、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２およびｌｏｘ５１７１等のｌｏｘ部位が挙げられる。
レポーター遺伝子または選択カセット等、他のエレメントは、リコンビナーゼ認識部位に挟まれた自己欠失（self-deleting）カセットであり得る。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。例として、自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結したＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離された、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２個のエクソンを含む）、およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結したネオマイシン抵抗性遺伝子を含むことができる。Ｐｒｍ１プロモーターを用いることにより、Ｆ０動物の雄性胚細胞において自己欠失カセットを特異的に欠失させることができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的化されている細胞において活性があるプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に記載されている。別の具体例として、自己欠失選択カセットは、１個または複数のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結したハイグロマイシン抵抗性遺伝子コード配列、それに続いて、ポリアデニル化シグナル、それに続いて、１個または複数のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結したＣｒｅｉコード配列、それに続いて、別のポリアデニル化シグナルを含むことができ、カセット全体は、ｌｏｘＰ部位に挟まれている。
ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座は、コンディショナル対立遺伝子であってもよい。例えば、コンディショナル対立遺伝子は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されている通り、多機能性対立遺伝子であり得る。例えば、コンディショナル対立遺伝子は、次のものを含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向性にある発動配列；（ｂ）センスまたはアンチセンス配向性にある薬物選択カセット（ＤＳＣ）；（ｃ）アンチセンス配向性にある目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）；および（ｄ）逆向きの配向性にある反転によりコンディショナルなモジュール（ＣＯＩＮ、これは、エクソン分断イントロンおよび反転可能な遺伝子トラップ様モジュールを利用する）。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。コンディショナル対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露後に組換えを行って、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠如し、（ｉｉ）センス配向性にあるＮＳＩおよびアンチセンス配向性にあるＣＯＩＮを含有するコンディショナル対立遺伝子を形成する、組換え可能（recombinable）単位をさらに含むことができる。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
例示的なヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座（例えば、ヒト化マウスＴｒｋＢ遺伝子座またはヒト化ラットＴｒｋＢ遺伝子座）の１つは、シグナルペプチドの直後に始まる、アミノ酸３３をコードするコドン（またはそれぞれマウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢもしくはヒトＴＲＫＢ ＣＤＳと最適に整列された場合に、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢもしくはヒトＴＲＫＢにおけるアミノ酸３３をコードするコドンに対応するコドン）由来のエクソン２／コーディングエクソン１から、イントロン１０の部分を必要に応じて含む、エクソン１０（またはそれぞれマウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢもしくはヒトＴＲＫＢ ＣＤＳと最適に整列された場合に、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢもしくはヒトＴＲＫＢエクソン１０に対応するエクソン）における領域が、対応するヒト配列に置き換えられた、遺伝子座である。置き換えられた領域は、ＴＲＫＢの細胞外ドメインをコードする。図１および図４ならびに配列番号４および５を参照されたい。
Ｃ．ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物
本明細書の他の箇所に記載されているヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞または非ヒト動物は、雄または雌であり得る。ゲノム、細胞または非ヒト動物は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座位に２個の対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特異的遺伝子座位の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２個の同一対立遺伝子が存在する場合、ホモ接合性として、２個の対立遺伝子が異なる場合、ヘテロ接合性として記載される。
本明細書に提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、ＴｒｋＢ遺伝子座またはヒトＴＲＫＢ遺伝子座と相同またはオルソロガスであるゲノム遺伝子座を含む、いずれかの非ヒト動物ゲノムまたは細胞であり得る。ゲノムは、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む、真核細胞に由来することができる、または細胞は、そのような細胞であり得る。用語「動物」は、例えば、哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類および虫（worm）を含む、動物界のいずれかのメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞またはハムスター細胞であり得る。他の非ヒト哺乳動物は、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、雌ウシ、去勢雄牛（steer）等のウシ種；羊、ヤギ等のヒツジ種；ならびに豚およびイノシシ等のブタ種）を含む。鳥類は、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルその他を含む。飼い慣らされた動物および農業用動物も含まれる。用語「非ヒト」は、ヒトを除外する。
細胞は、いずれかの種類の未分化または分化状態であってもよい。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞等の非ヒト多能性細胞）または非多能性細胞であり得る。全能性細胞は、いかなる細胞型を生じることもできる未分化細胞を含み、多能性細胞は、２種以上の分化した細胞型へと発生する能力を保有する未分化細胞を含む。斯かる多能性および／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞等のＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞は、胚への導入の際に発生中の胚のいずれかの組織に寄与することができる胚由来全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来することができ、３種の脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）のいずれかの細胞へと分化することができる。
本明細書に提供される細胞は、胚細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有糸分裂する能力がある（competent）細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂する能力がある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。類似して、細胞は、初代体細胞、または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子でも、胚細胞でも、生殖母細胞でも、未分化幹細胞でもない、いずれかの細胞を含む。例えば、細胞は、海馬ニューロンまたは皮質ニューロン等、ニューロンであり得る。
本明細書に提供される適した細胞は、初代細胞も含む。初代細胞は、生物、臓器または組織から直接的に単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず、不死でもない細胞を含む。これは、組織培養を以前に経験していない、または組織培養を以前に経験したことがあるが、組織培養を無制限に経験することができない、生物、臓器または組織から得られるいずれかの細胞を含む。斯かる細胞は、従来技法によって単離することができ、例えば、海馬ニューロンまたは皮質ニューロンを含む。
本明細書に提供される他の適した細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、正常では無制限に増殖しないが、変異または変更により、正常な細胞老化を逃れ、その代わりに、分裂を起こし続けることができる、多細胞生物由来の細胞を含む。斯かる変異または変更は、天然に発生し得る、または意図的に誘導することができる。不死化細胞系の具体例は、Ｎ１８ＴＧ２もしくはＴ４８等の神経芽細胞腫細胞系またはＮＩＨ－３Ｔ３細胞系等の細胞系である。多数の種類の不死化細胞が周知である。不死化または初代細胞は、培養に、または組換え遺伝子もしくはタンパク質の発現に典型的に使用される細胞を含む。
本明細書に提供される細胞は、１細胞期胚（すなわち、受精した卵母細胞または接合子）も含む。斯かる１細胞期胚は、いずれの遺伝的背景（例えば、マウスに関してＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９またはこれらの組合せ）に由来することもでき、新鮮であっても凍結してもよく、自然交配またはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精に由来することができる。
本明細書に提供される細胞は、正常で健康な細胞であり得る、または罹患したもしくは変異体を有する細胞であり得る。
本明細書に記載されているヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物は、本明細書の他の箇所に記載されている方法によって作製することができる。用語「動物」は、例えば、哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類および虫を含む、動物界のいずれかのメンバーを含む。具体例では、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、羊、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）および家畜（例えば、雌ウシおよび去勢雄牛等のウシ種；羊およびヤギ等のヒツジ種；ならびに豚およびイノシシ等のブタ種）を含む。鳥類は、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウおよびアヒルを含む。飼い慣らされた動物および農業用動物も含まれる。用語「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。好まれる非ヒト動物は、例えば、マウスおよびラット等の齧歯類を含む。
非ヒト動物は、いずれかの遺伝的背景に由来することができる。例えば、適したマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９およびＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター（Swiss Webster）系統に由来することができる。１２９系統の例として、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例として、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＣｒおよびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。適したマウスは、上述の１２９系統および上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来することもできる。同様に、適したマウスは、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来することができる。
類似して、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、ダークアグーチ（Dark Agouti）（ＤＡ）ラット系統、ウィスター（Wistar）ラット系統、ＬＥＡラット系統、スプラーグドーリー（Sprague Dawley）（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャー（Fisher）Ｆ３４４もしくはフィッシャーＦ６等のフィッシャー（Fischer）ラット系統を含む、いずれかのラット系統に由来することができる。ラットは、上に列挙されている２種またはそれよりも多い系統のミックスに由来する系統から得ることもできる。例えば、適したラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来することができる。ＡＣＩラット系統は、白色の腹部および足ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを含む黒色アグーチを有するものとして特徴付けられる。斯かる系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給源から入手することができる。ダークアグーチ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有するものとして特徴付けられる。斯かるラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給源から入手することができる。いくつかの適したラットは、純系ラット系統に由来することができる。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
ＩＩＩ．ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の有効性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで評価するためにヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用する方法
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬（例えば、治療アゴニスト分子）の送達または有効性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで評価または最適化するために、本明細書の他の箇所に記載されているヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用するための様々な方法が提供される。非ヒト動物は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むため、非ヒト動物は、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の有効性をより正確に反映するであろう。
Ａ．ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の有効性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検査する方法
本明細書の他の箇所に記載されているヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の送達または有効性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するための様々な方法が提供される。斯かる方法は、（ａ）非ヒト動物にヒトＴＲＫＢ標的化試薬を導入するステップと、（ｂ）ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するステップとを含むことができる。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢ標的化抗体もしくは抗原結合性タンパク質、またはヒトＴＲＫＢを標的化する他のいずれかの大分子もしくは小分子であり得る。あるいは、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢ遺伝子座（ヒトＴＲＫＢ遺伝子）、ヒトＴＲＫＢ ｍＲＮＡまたはヒトＴＲＫＢタンパク質を標的化する、いずれかの生物学的または化学的薬剤であり得る。ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
斯かるヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、本明細書の他の箇所においてより詳細に開示されているいずれかの送達方法（例えば、注射、ＡＡＶ、ＬＮＰまたはＨＤＤ）、およびいずれかの投与経路によって投与することができる。治療分子を送達する手段および投与経路は、本明細書の他の箇所においてより詳細に開示されている。特定の方法では、試薬は、注射（例えば、直接的海馬注射、皮下注射または硝子体内注射）により送達される。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するための方法は、周知であり、本明細書の他の箇所に提供されている。一部の方法では、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性（例えば、アゴニスト活性または阻害活性）を評価するステップは、本明細書の他の箇所に開示されているＴＲＫＢ活性（例えば、ＴＲＫＢリン酸化、下流シグナル伝達経路のＴＲＫＢ媒介性活性化、またはＴＲＫＢ誘導性表現型）を評価するステップを含む。活性の評価は、本明細書の他の箇所に開示されているいずれかの細胞型、いずれかの組織型、またはいずれかの臓器型において行うことができる。一部の方法では、活性の評価は、脳組織（例えば、海馬または線条体）またはニューロン（例えば、網膜神経節細胞、海馬ニューロンまたは皮質ニューロン）におけるものである。
ＴＲＫＢ標的化試薬が、ゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、斯かる方法は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座の改変を評価するステップを含むことができる。例えば、評価するステップは、非ヒト動物から単離された１個または複数の細胞におけるヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を配列決定（例えば、次世代配列決定）するステップを含むことができる。評価は、非ヒト動物から標的臓器（例えば、脳）または組織を単離するステップと、標的臓器または組織におけるヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座の改変を評価するステップを含むことができる。評価は、標的臓器または組織内の２種またはそれよりも多い異なる細胞型におけるヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座の改変を評価するステップを含むこともできる。類似して、評価は、非ヒト動物から非標的臓器または組織（例えば、２種またはそれよりも多い非標的臓器または組織）を単離するステップと、非標的臓器または組織におけるヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座の改変を評価するステップとを含むことができる。
斯かる方法は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によって産生されたｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップ、またはヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するステップを含むこともできる。例えば、タンパク質レベルは、特定の細胞、組織もしくは臓器型（例えば、脳）において測定することができる、または分泌レベルは、血清において測定することができる。ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座から発現されるＴＲＫＢ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を評価するための方法は、本明細書の他の箇所に提供されており、周知である。
活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価するための上に提供されている様々な方法を使用して、本明細書の他の箇所に記載されている通り、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性をｅｘ ｖｉｖｏで評価することもできる。
Ｂ．ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の送達または有効性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで最適化する方法
細胞もしくは非ヒト動物へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬の送達を最適化するための、またはヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性もしくは有効性をｉｎ ｖｉｖｏで最適化するための様々な方法が提供される。斯かる方法は、例えば、（ａ）１回目に、第１の非ヒト動物または第１の細胞において、上に記載されているヒトＴＲＫＢ標的化試薬の有効性を検査する方法を行うステップと、（ｂ）変数を変化させ、２回目に、第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞において、変化させた変数により方法を行うステップと、（ｃ）ステップ（ａ）におけるヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を、ステップ（ｂ）におけるヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性と比較し、より高い有効性または活性をもたらす方法を選択するステップとを含むことができる。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の送達、有効性または活性を測定する方法は、本明細書の他の箇所に開示されている。より高い有効性は、非ヒト動物または細胞内の所望の効果に応じて異なる事柄を意味することができる。例えば、より高い有効性は、より高い活性および／またはより高い特異性を意味することができる。より高い活性は、例えば、ＴＲＫＢの活性化における活性またはＴＲＫＢの阻害における活性であり得る。これは、特定の標的細胞型（例えば、網膜神経節細胞等のニューロン）内でまたは特定の標的組織もしくは臓器（例えば、脳）内で、より高いパーセンテージの細胞が標的化されることを指すことができる。より高い特異性は、オフターゲット効果と比較してＴＲＫＢに関するより高い特異性、標的化された細胞型に関するより高い特異性、または標的化された組織もしくは臓器型に関するより高い特異性を指すことができる。
変化される変数は、いずれかのパラメーターであり得る。一例として、変化される変数は、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬（単数または複数）が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であり得る。送達方法の例は、本明細書の他の箇所に開示されている。別の例として、変化される変数は、細胞または非ヒト動物へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬（単数または複数）の導入のための投与経路であり得る。投与経路の例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
別の例として、変化される変数は、導入されるヒトＴＲＫＢ標的化試薬（単数または複数）の濃度または量であり得る。別の例として、変化される変数は、試薬の活性または有効性を評価するタイミングと比べた、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬（単数または複数）を導入するタイミングであり得る。別の例として、変化される変数は、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬（単数または複数）が導入される回数または頻度であり得る。別の例として、変化される変数は、導入されるヒトＴＲＫＢ標的化試薬（単数または複数）（例えば、ある試薬を異なる試薬と比較する）であり得る。
Ｃ．ヒトＴＲＫＢ標的化試薬
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢタンパク質、ヒトＴＲＫＢ遺伝子またはヒトＴＲＫＢ ｍＲＮＡを標的化するいずれかの試薬であり得る。ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、例えば、アゴニスト（すなわち、ヒトＴＲＫＢを間接的にまたは直接的に活性化する分子）であり得る、またはアンタゴニスト（すなわち、ヒトＴＲＫＢ活性を遮断する阻害剤または阻害性試薬）であり得る。具体例では、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ＴＲＫＢアゴニストである。本明細書に開示されている方法におけるヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、公知ヒトＴＲＫＢ標的化試薬であり得る、推定上のヒトＴＲＫＢ標的化試薬（例えば、ヒトＴＲＫＢを標的化するように設計された候補試薬）であり得る、またはヒトＴＲＫＢ標的化活性に関してスクリーニングされている試薬であり得る。
例えば、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢタンパク質のエピトープを標的化する抗原結合性タンパク質（例えば、アゴニスト抗体）であり得る。斯かる試薬の例は、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２である。他の抗ＴＲＫＢ抗体は、本明細書の他の箇所に開示されている。一部の場合、抗ＴＲＫＢ抗体は、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、約２００ｎＭ未満のＫＤで、ヒトＴＲＫＢに結合する。他の場合では、抗ＴＲＫＢ抗体は、約６００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約３ｐＭ未満または約１ｐＭ未満のＫＤで、ヒトＴＲＫＢに結合する。一部の場合、抗ＴＲＫＢ抗体は、２５℃または３７℃の表面プラズモン共鳴によって測定された場合に、約１０分間を超える解離半減期（ｔ１／２）で、ヒトＴＲＫＢに結合する。他の場合では、抗ＴＲＫＢ抗体は、約２０分間を超える、約５０分間を超える、約１００分間を超える、約１２０分間を超える、約１５０分間を超える、約３００分間を超える、約３５０分間を超える、約４００分間を超える、約４５０分間を超える、約５００分間を超える、約５５０分間を超える、約６００分間を超える、約７００分間を超える、約８００分間を超える、約９００分間を超える、約１０００分間を超える、約１１００分間を超えるまたは約１２００分間を超えるｔ１／２で、ヒトＴＲＫＢに結合する。具体例として、抗ＴＲＫＢ抗体は、表２２に表記されている群から選択される６個のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有する実質的に同様の配列のセットを含むことができる。
他のヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢタンパク質を標的化する小分子（例えば、アゴニスト）を含む。小分子ＴＲＫＢアゴニストの例として、７，８－ジヒドロキシフラボン（７，８－ＤＨＦ）、デオキシゲデュニン（deoxygedunin）、ＬＭ２２Ａ－４（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－トリス（２－ヒドロキシエチル）－１，３，５－ベンゼントリカルボキサミド）およびＬＭ２２Ｂ－１０（２－［［４－［［４－［ビス－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ］－フェニル］－（４－クロロ－フェニル）－メチル］－フェニル］－（２－ヒドロキシ－エチル）－アミノ］－エタノール）が挙げられる。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Liu et al. (2015) Translational Neurodegeneration 5:2；Massa et al. (2010) J. Clin. Invest. 120(5):1774-1785；およびYang et al. (2016) Neuropharmacology 110:343-361を参照されたい。阻害剤であるＴＲＫＢ標的化試薬の例は、Ｋ２５２ａである。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Yang et al. (2016) Neuropharmacology 110:343-361を参照されたい。
他のヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢタンパク質を標的化するペプチドまたはペプチドミメティック（例えば、アゴニスト）を含む。ヒトＴＲＫＢアゴニストとして機能するペプチドミメティックの例は、例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、O'Leary et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(28):25738-25744に開示されている。
他のヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢ遺伝子内の認識部位を切断するヌクレアーゼ剤（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Clustered Regularly Interspersed short Palindromic Repeat）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））等のゲノム編集試薬を含むことができる。同様に、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢ遺伝子と組換えるように設計された外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクターまたは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ））であり得る）。
他のヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、ヒトＴＲＫＢ ｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアンチセンスＲＮＡは、標的化されたタンパク質をコードするＲＮＡに選択的に結合し、これにより、翻訳を防止することにより、標的化されたタンパク質の発現を防止するように設計されたヌクレオチドの短い合成ストリングである。これらの化合物は、十分に特徴付けられたワトソン・クリック塩基対形成（ハイブリダイゼーション）により、高い親和性および選択性でＲＮＡに結合する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の切断を媒介する、遺伝子発現を制御するための内在性細胞機構である。
本明細書に開示されている非ヒト動物を使用して、他のいずれかの公知のまたは推定上のヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価することもできる。類似して、本明細書に開示されている非ヒト動物を使用して、他のいずれかの分子を、ヒトＴＲＫＢ標的化活性に関してスクリーニングすることができる。
Ｄ．ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を非ヒト動物または細胞に投与するステップ
本明細書に開示されている方法は、核酸、タンパク質、核酸－タンパク質複合体、ペプチドミメティック、抗原結合性タンパク質または小分子を含む様々な分子（例えば、抗体または小分子等のヒトＴＲＫＢ標的化試薬）を非ヒト動物または細胞に導入するステップを含むことができる。「導入すること」は、分子（例えば、核酸またはタンパク質または小分子）を、細胞内部または非ヒト動物内の細胞内部に到達するような様式で、細胞または非ヒト動物へと与えることを含む。導入は、いずれかの手段によって達成することができる。複数の構成成分が導入される場合、複数の構成成分を、いずれかの組合せで同時にまたは逐次に導入することができる。加えて、構成成分のうち２種またはそれよりも多くは、同じ送達方法または異なる送達方法によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。類似して、構成成分のうち２種またはそれよりも多くは、同じ投与経路または異なる投与経路によって非ヒト動物に導入することができる。
非ヒト動物または細胞に導入される分子は、導入される分子の安定性を増加させる（例えば、分解産物が、出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満等の、閾値未満を維持する、所与の貯蔵条件（例えば、－２０℃、４℃または外界温度）下での期間を延長させる；またはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を増加させる）担体を含む組成物中に提供することができる。斯かる担体の非限定的な例として、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻形（cochleate）および脂質微小管（lipid microtubule）が挙げられる。
細胞または非ヒト動物へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入を可能にするために様々な方法および組成物が本明細書に提供される。様々な細胞型に核酸を導入するための方法が公知であり、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法およびウイルス媒介性方法を含む。
トランスフェクションプロトコールと、細胞に核酸配列を導入するためのプロトコールは変動し得る。非限定的なトランスフェクション方法は、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67、Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4およびKriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーを使用した化学物質に基づくトランスフェクション方法を含む。化学物質によらない方法は、電気穿孔、ソノポレーション（Sono-poration）および光学的トランスフェクションを含む。粒子に基づくトランスフェクションは、遺伝子銃の使用または磁石支援トランスフェクション（Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28）を含む。ウイルス方法をトランスフェクションに使用することもできる。
細胞へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入は、電気穿孔、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介性トランスフェクションまたはヌクレオフェクション（nucleofection）が媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基質が細胞質のみならず、核膜を通って核内に送達されることを可能にする、改善された電気穿孔技術である。加えて、本明細書に開示されている方法におけるヌクレオフェクションの使用は典型的に、通常の電気穿孔よりもはるかに少ない細胞を要求する（例えば、通常の電気穿孔による７百万個と比較して、僅か約２百万個）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞（例えば、接合子）へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入は、マイクロインジェクションによって達成することもできる。接合子（すなわち、１細胞期胚）において、マイクロインジェクションは、母性および／または父性前核中に、または細胞質中に為すことができる。マイクロインジェクションが、１個の前核中にのみ為される場合、そのより大型なサイズのため、父性前核が好ましい。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、細胞質中に為されることが好ましい（例えば、翻訳機構に直接的にｍＲＮＡを送達するため）一方、タンパク質またはタンパク質をコードするもしくはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのマイクロインジェクションは、核／前核中に為されることが好ましい。あるいは、マイクロインジェクションは、核／前核および細胞質の両方への注射によって実行することができる：針は、先ず、核／前核中に導入し、第１の量を注射することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、第２の量を細胞質中に注射することができる。タンパク質は、細胞質中に注射され、核に標的化される必要がある場合、核／前核への送達を確実にするための核局在化シグナルを含むことができる。マイクロインジェクションを実行するための方法は周知である。例えば、Nagy et al. (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい；また、Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026およびMeyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359も参照されたい。
細胞または非ヒト動物にヒトＴＲＫＢ標的化試薬を導入するための他の方法は、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過ペプチド媒介性送達または移植型デバイス媒介性送達を含むことができる。具体例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻形または脂質微小管等の担体において細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達の一部の具体例として、水力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
細胞または非ヒト動物へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入は、水力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。水力学的送達は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内ＤＮＡ送達のための方法として登場した。実質細胞への遺伝子送達のため、必須ＤＮＡ配列のみが、選択された血管を経由して注射され、現在のウイルスおよび合成ベクターに伴う安全上の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは、血液に到達可能な異なる組織における細胞に達することができる。水力学的送達は、循環における非圧縮性血液への大きい体積の溶液の急速注射によって生成される力を用いて、大型で膜不透過性の化合物が実質細胞に進入するのを防止する内皮および細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡ、タンパク質および他の小型の化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Bonamassa et al. (2011) Pharm. Res. 28(4):694-701を参照されたい。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入は、ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達等、ウイルス媒介性送達によって達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスを含む。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂および非分裂細胞の両方に感染することができる。ウイルスは、宿主ゲノム中に組み込むことができる、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まない。斯かるウイルスは、低下した免疫を有するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有することができる、または複製欠損であり得る（例えば、追加的なラウンドのビリオン複製および／またはパッケージングに必要な１種または複数の遺伝子を欠損する）。ウイルスは、一過性発現、持続性発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間または３ヶ月間）または永続的発現を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にする、２個の逆位末端配列に挟まれた２個のオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐからなる。ＡＡＶ移入プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２個のＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐおよびＣａｐは、トランスで供給することができる。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶは、アデノウイルス由来の遺伝子を含有するヘルパープラスミドを要求する場合がある。そのような遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介した。例えば、移入プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐおよびヘルパープラスミドは、アデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を産生することができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐおよびアデノウイルスヘルパー遺伝子は、単一のプラスミドへと組み合わせることができる。同様のパッケージング細胞および方法を、レトロウイルス等、他のウイルスのために使用することができる。
ＡＡＶの複数の血清型が同定された。これらの血清型は、感染する細胞の型（すなわち、そのトロピズム）において異なり、特異的な細胞型の優先的形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織のための血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む。心臓組織のための血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む。腎臓組織のための血清型は、ＡＡＶ２を含む。肺組織のための血清型は、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ９を含む。膵臓組織のための血清型は、ＡＡＶ８を含む。光受容体細胞のための血清型は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８を含む。網膜色素上皮組織のための血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８を含む。骨格筋組織のための血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む。肝臓組織のための血清型は、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９、特に、ＡＡＶ８を含む。
トロピズムは、異なるウイルス血清型由来のカプシドおよびゲノムの混合であるシュードタイプ化によりさらに精緻化することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５由来のカプシドにパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを指し示す。シュードタイプ化ウイルスの使用は、形質導入効率を改善すると共に、トロピズムを変更することができる。異なる血清型に由来するハイブリッドカプシドを使用して、ウイルストロピズムを変更することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪは、８種の血清型由来のハイブリッドカプシドを含有し、広い範囲の細胞型にわたる高い感染力をｉｎ ｖｉｖｏで呈する。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を呈するが、脳取り込みが増強された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異により改変することもできる。ＡＡＶ２の変異による改変の例として、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０ＦおよびＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の変異による改変の例として、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１ＦおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の変異による改変の例として、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。他のシュードタイプ化／改変されたＡＡＶバリアントは、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧを含む。
導入遺伝子発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するために細胞のＤＮＡ複製機構に依存するため、導入遺伝子発現は遅延され得る。この遅延に取り組むため、感染の際に自発的にアニーリングすることができる相補配列を含有するｓｃＡＡＶを使用して、宿主細胞ＤＮＡ合成の要件を排除することができる。
パッケージング容量を増加させるために、より長い導入遺伝子は、２個のＡＡＶ移入プラスミドの間で分断し、３’スプライスドナーを有する第１のもの、および５’スプライスアクセプターを有する第２のものとすることができる。細胞の同時感染後に、これらのウイルスは、コンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、全長導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能となるが、発現効率は低くなる。容量を増加させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は、２個の移入プラスミドの間で分割することができるが、両者は、同時発現が全長導入遺伝子の相同組換えおよび発現を誘導するように、実質的な配列重複を有する。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。脂質製剤は、その細胞取り込みを改善しつつ、分解から生物学的分子を保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の脂質分子を含む粒子である。これは、マイクロスフェア（単層および多重層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルションにおける分散相、ミセル、または懸濁物における内部相を含む。斯かる脂質ナノ粒子を使用して、送達のために１種または複数の核酸またはタンパク質を被包することができる。カチオン性脂質を含有する製剤は、核酸等のポリアニオンの送達に有用である。含まれ得る他の脂質は、中性脂質（すなわち、無電荷または双性イオン性脂質）、アニオン性脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを増加させるステルス（stealth）脂質である。適したカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質およびステルス脂質の例は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１種または複数の他の構成成分を含むことができる。一例では、他の構成成分は、コレステロール等のヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の構成成分は、コレステロール等のヘルパー脂質、およびＤＳＰＣ等の中性脂質を含むことができる。別の例では、他の構成成分は、コレステロール等のヘルパー脂質、ＤＳＰＣ等の必要に応じた中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１またはＳ０３３等のステルス脂質を含むことができる。
送達機序は、免疫原性を減少させるように選択することができる。例えば、複数の構成成分が送達される場合、それらを異なる機序によって送達することができる（例えば、二峰性送達）。これらの異なる機序は、対象の送達される分子に異なる薬力学または薬物動態特性を付与することができる。例えば、異なる機序は、異なる組織分布、異なる半減期または異なる時間的分布をもたらすことができる。一部の送達機序（例えば、自律的複製またはゲノム組み込みによって細胞において持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続性の発現および存在をもたらす一方、他の送達機序は、一過性であり持続性がより低い（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、外用、鼻腔内または筋肉内を含むいずれか適した経路によって為すことができる。全身性投与機序は、例えば、経口および非経口的経路を含む。非経口的経路の例として、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内および腹腔内経路が挙げられる。具体例は、静脈内注入である。経鼻滴下および硝子体内注射は、他の具体例である。局所的投与機序は、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻中への）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域中への）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、視蓋、被蓋または黒質への局在化された実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下（subconjuctival）、硝子体内、網膜下および経強膜的経路を含む。有意により少ない量の構成成分（全身性アプローチと比較して）は、局所的に（例えば、実質内または硝子体内）投与された場合に、全身性に（例えば、静脈内）投与された場合と比較して、効果を発揮することができる。局所的投与機序は、治療有効量の構成成分が全身性投与された場合に発生し得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低下または排除することもできる。具体例では、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬は、直接的海馬注射、皮下注射または硝子体内注射により投与される。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を含む組成物は、１種または複数の生理学的におよび薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存し得る。用語「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、賦形剤または補助剤が、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって実質的に有害でないことを意味する。
投与の頻度および投薬量の数は、因子の中でもとりわけ、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の半減期および投与経路に依存し得る。細胞または非ヒト動物へのヒトＴＲＫＢ標的化試薬の導入は、ある期間にわたって１回または複数回行うことができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回行うことができる。
Ｅ．ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の送達、活性または有効性のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの測定
本明細書に開示されている方法は、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を検出または測定するステップをさらに含むことができる。斯かる試薬の活性（例えば、アゴニスト活性または阻害剤活性）を測定するステップは、ＴＲＫＢ活性を測定するステップを含むことができる。ＴＲＫＢ活性は、いずれか公知の手段によって測定することができる。例えば、ＴＲＫＢリン酸化を評価することができる（例えば、脳またはニューロンにおける）、ＴＲＫＢによるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ等の下流経路の活性化を評価することができる（例えば、初代皮質ニューロン等、脳またはニューロンにおける）、または細胞生存を評価することができる（例えば、網膜神経節細胞生存等、ニューロン細胞生存）。例えば、リン酸化または下流シグナル伝達経路の活性化は、投薬後１５分、３０分、１時間、２時間、４時間または１８時間目に評価することができる。ＴＲＫＢリン酸化、下流シグナル伝達経路の活性化または細胞生存の増加は、ＴＲＫＢ活性化の指標となることができる一方、減少は、ＴＲＫＢ阻害の指標となることができる。
非ヒト動物において、評価するステップは、対照非ヒト動物と比べて、体重、体組成、代謝および移動運動のうち１種または複数または全種を評価するステップを含むことができる（例えば、投薬後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間または１２０時間目に）。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Lin et al. (2008) PLoS ONE 3(4):e1900；Rios et al. (2013) Trends in Neurosciences 36(2):83-90；およびZorner et al. (2003) Biol. Psychiatry 54:972-982を参照されたい。体組成の変化を評価するステップは、例えば、除脂肪量および／または体脂肪量を評価するステップを含むことができる。代謝の変化を評価するステップは、例えば、食物消費および／または水消費の変化を評価するステップを含むことができる。体重、体脂肪量、除脂肪量、食物摂取および水摂取の減少は、ＴＲＫＢ活性化の指標となることができる一方、増加は、ＴＲＫＢ阻害の指標となることができる。移動運動の増加は、ＴＲＫＢ活性化の指標となることができる一方、減少は、ＴＲＫＢ阻害の指標となることができる。
評価するステップは、神経保護活性を評価するステップを含むことができる。一例として、細胞生存は、非ヒト動物において評価することができる。例えば、多くの場合、齧歯類網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を使用して、軸索病変に伴う神経変性プロセスを研究すると共に、神経保護療法をアッセイする。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Nadal-Nicolas et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sic. 50(8):3860-3868を参照されたい。網膜神経節細胞生存／生存度は、対照非ヒト動物と比べて、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬による処置後に評価することができる（例えば、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて）。例えば、網膜神経節細胞生存／生存度は、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて評価することができる。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Nadal-Nicolas et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sic. 50(8):3860-3868を参照されたい。別の例として、網膜神経節細胞生存／生存度は、視神経挫滅モデルにおいて評価することができる。このモデルにおいて、視神経に対する挫滅傷害は、漸進的網膜神経節細胞アポトーシスをもたらす。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Tang et al. (2011) J. Vis. Exp. 50:2685を参照されたい。網膜神経節細胞生存／生存度は、例えば、網膜神経節細胞密度（例えば、切除して網膜神経節細胞を染色した網膜における）を測定することにより評価することができる。生存／生存度増加は、ＴＲＫＢ活性化の指標となることができる一方、生存／生存度減少は、ＴＲＫＢ阻害の指標となることができる。
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、ゲノム編集試薬である場合、測定するステップは、改変に関してヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を評価するステップを含むことができる。様々な方法を使用して、標的化された遺伝子改変を有する細胞を同定することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等の定量的ＰＣＲにより実行することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット、および標的化されていない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。適した定量的アッセイの他の例として、蛍光媒介性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されているプローブ（複数可）、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブまたはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術に対する定量的ハイブリダイゼーションが挙げられる（例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照）。次世代配列決定（ＮＧＳ）をスクリーニングに使用することもできる。次世代配列決定は、「ＮＧＳ」または「大規模並列配列決定」または「ハイスループット配列決定」と称される場合もある。ＮＧＳは、標的化された遺伝子改変の正確な性質を明らかにするために、またそれが細胞型または組織型または臓器型にわたって一貫しているかについて明らかにするために、ＭＯＡアッセイに加えて、スクリーニングツールとして使用することができる。
非ヒト動物において評価するステップは、いずれかの組織または臓器由来のいずれかの細胞型において為すことができる。例えば、評価は、同じ組織もしくは臓器（例えば、脳）由来の複数の細胞型において、または組織もしくは臓器（例えば、海馬および線条体）内の複数の位置由来の細胞において為すことができる。これにより、標的組織もしくは臓器内のいずれの細胞型が標的化されているか、または組織もしくは臓器のいずれのセクションに、ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が達しているかに関する情報を提供することができる。別の例として、評価は、組織の複数の型または複数の臓器において為すことができる。特定の組織、臓器または細胞型が標的化されている方法において、これにより、どの程度有効に当該組織または臓器が標的化されているか、また、他の組織または臓器にオフターゲット効果があるか否かに関する情報を提供することができる。
試薬が、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を不活性化するように、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座の発現に影響を与えるように、またはヒト化ＴＲＫＢ ｍＲＮＡの翻訳を防止するように設計されている場合、測定するステップは、ヒト化ＴＲＫＢ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を評価するステップを含むことができる。この測定ステップは、脳または特定の細胞型（例えば、網膜神経節細胞等、ニューロン）内で為すことができる。
ＩＶ．ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書の他の箇所に開示されているヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変された生物を産生するためのいずれか簡便な方法またはプロトコールが、斯かる遺伝子改変された非ヒト動物の産生に適する。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Cho et al. (2009) Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22およびGama Sosa et al. (2010) Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109を参照されたい。斯かる遺伝子改変された非ヒト動物は、例えば、標的化されたＴｒｋＢ遺伝子座における遺伝子ノックインにより生成することができる。
例えば、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むように、多能性細胞のゲノムを改変するステップと、（２）ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップと、（４）代理母に宿主胚を移植し、懐胎させるステップとを含むことができる。例えば、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む非ヒト動物を産生する方法は、（１）ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むように、多能性細胞のゲノムを改変するステップと、（２）ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップと、（４）代理母に宿主胚を懐胎させるステップとを含むことができる。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、代理母への移植および懐胎に先立ち、胚盤胞期までインキュベートして、Ｆ０非ヒト動物を産生することができる。次に、代理母は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むＦ０世代非ヒト動物を産生することができる。
本方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含むことができる。様々な方法を使用して、標的化された遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
ゲノムを改変するステップは、例えば、外因性修復鋳型（例えば、標的化ベクター）を利用して、本明細書に開示されているヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むようにＴｒｋＢ遺伝子座を改変することができる。一例として、標的化ベクターは、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座（例えば、内在性非ヒト動物ＴｒｋＢ遺伝子座）にヒト化ＴＲＫＢ遺伝子を生成するためのものであり得、標的化ベクターは、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列を標的化する５’相同性アームおよび内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列を標的化する３’相同性アームを含む。外因性修復鋳型は、ＴｒｋＢ遺伝子座に組み込まれるべきＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含むこともできる。ＴｒｋＢ遺伝子座における核酸インサートの組み込みは、ＴｒｋＢ遺伝子座における目的の核酸配列の付加、ＴｒｋＢ遺伝子座における目的の核酸配列の欠失、またはＴｒｋＢ遺伝子座における目的の核酸配列の置き換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらすことができる。相同性アームは、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を生成するためのヒトＴＲＫＢ配列を含むインサート核酸を挟むことができる（例えば、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントを欠失させ、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えるために）。
外因性修復鋳型は、非相同末端結合媒介性挿入または相同組換えのためのものであり得る。外因性修復鋳型は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、これは、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖状または環状形態であり得る。例えば、修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。
外因性修復鋳型は、標的化されていない内在性ＴｒｋＢ遺伝子座には存在しない異種配列を含むこともできる。例えば、外因性修復鋳型は、リコンビナーゼ認識部位に挟まれた選択カセット等、選択カセットを含むことができる。
一部の外因性修復鋳型は、相同性アームを含む。外因性修復鋳型核酸が、核酸インサートも含む場合、相同性アームは、核酸インサートを挟むことができる。参照を容易にするために、相同性アームは、本明細書において、５’および３’（すなわち、上流および下流）相同性アームと称される。この用語法は、外因性修復鋳型内における核酸インサートに対する相同性アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同性アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称される、ＴｒｋＢ遺伝子座内の領域に対応する。
相同性アームおよび標的配列は、この２種の領域が、互いに十分なレベルの配列同一性を共有して、相同組換え反応のための基質として作用する場合、互いに「対応」する、または「対応している」。用語「相同性」は、対応する配列と同一であるまたは配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列および外因性修復鋳型に見出される対応する相同性アームの間の配列同一性は、相同組換えが発生することを可能にするいずれかの程度の配列同一性であり得る。例えば、外因性修復鋳型の相同性アーム（またはその断片）および標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを起こすように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性であり得る。さらに、相同性アームおよび対応する標的配列の間の相同性の対応する領域は、相同組換えの促進に十分な任意の長さのものであり得る。一部の標的化ベクターにおいて、内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における意図される変異が、相同性アームに挟まれたインサート核酸に含まれる。
１細胞期胚以外の細胞において、外因性修復鋳型は、細胞において相同組換えを行うことを意図した他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大型の核酸配列に対応し、これに由来する相同性アームを含む標的化ベクターを含む、「大型の標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であり得る。ＬＴＶＥＣは、細胞において相同組換えを行うことを意図した他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大型の核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、そのサイズ限界のために伝統的なプラスミドに基づく標的化ベクターによって収容することができない大型の遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的化される遺伝子座は、従来方法を使用しては標的化不可能な、またはヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下では、不正確にもしくは有意に低い効率でしか標的化することができない、細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’および３’相同性アームは、これに対応することができる）。ＬＴＶＥＣは、任意の長さのものであり得、典型的には、少なくとも１０ｋｂの長さである。ＬＴＶＥＣにおける５’相同性アームおよび３’相同性アームの合計は典型的に、少なくとも１０ｋｂである。
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等の定量的ＰＣＲにより実行することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット、および標的化されていない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。
適した定量的アッセイの他の例として、蛍光媒介性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されているプローブ（複数可）、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブまたはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術に対する定量的ハイブリダイゼーション（例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照）が挙げられる。
適した多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞は、例えば、（ａ）細胞に、例えば、５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む１種または複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入するステップであって、インサート核酸が、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を生成するためのヒトＴＲＫＢ配列を含む、ステップと、（ｂ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に組み込まれたインサート核酸をそのゲノム内に含む少なくとも１個の細胞を同定するステップ（すなわち、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む少なくとも１個の細胞を同定するステップ）による組換えにより生成することができる。改変された多能性細胞は、例えば、（ａ）細胞に、５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む１種または複数の標的化ベクターを導入するステップであって、インサート核酸が、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む、ステップと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたインサート核酸をそのゲノム内に含む少なくとも１個の細胞を同定するステップによる組換えにより生成することができる。
あるいは、改変された多能性細胞は、（ａ）細胞に、（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的部位にニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤；ならびに（ｉｉ）例えば、ヌクレアーゼ標的部位に十分に近接して配置している５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を必要に応じて含む１種または複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入するステップであって、インサート核酸が、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を生成するためのヒトＴＲＫＢ配列を含む、ステップと、（ｃ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に組み込まれたインサート核酸をそのゲノム内に含む少なくとも１個の細胞を同定するステップ（すなわち、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む少なくとも１個の細胞を同定するステップ）によって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞は、（ａ）細胞に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤；ならびに（ｉｉ）認識部位に十分に近接して配置している５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む１種または複数の標的化ベクターを導入するステップであって、インサート核酸が、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む、ステップと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、インサート核酸の組み込み）を含む少なくとも１個の細胞を同定するステップによって生成することができる。所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導するいかなるヌクレアーゼ剤を使用してもよい。適したヌクレアーゼの例として、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）または斯かる系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚（pre-morula）期（すなわち、４細胞期または８細胞期）等、いずれかの期の宿主胚に導入することができる。生殖系列を通して遺伝子改変を伝えることができる後代が生成される。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
あるいは、本明細書の他の箇所に記載されている非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上に記載されている方法を使用して、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変するステップと、（２）遺伝子改変された胚を選択するステップと、（３）代理母に遺伝子改変された胚を移植し、懐胎させるステップとを含むことができる。あるいは、本明細書の他の箇所に記載されている非ヒト動物を産生する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上に記載されている方法を使用して、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変するステップと、（２）遺伝子改変された胚を選択するステップと、（３）代理母に遺伝子改変された胚を懐胎させるステップとを含むことができる。生殖系列を通して遺伝子改変を伝えることができる後代が生成される。
核移植技法を使用して、非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡潔に説明すると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するステップ、または除核された卵母細胞を提供するステップと、（２）除核された卵母細胞と組み合わされるべきドナー細胞または核を単離または提供するステップと、（３）除核された卵母細胞に細胞または核を挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）動物の子宮に再構成された細胞を移植して、胚を形成させるステップと、（５）胚を発生させるステップとを含むことができる。斯かる方法において、卵母細胞は一般に、死亡した動物から回収されるが、生きている動物の輸卵管および／または卵巣のいずれかから単離することもできる。卵母細胞は、除核に先立ち、種々の周知培地において成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多数の周知様式で行うことができる。再構成された細胞を形成するための、除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合に先立つ透明帯下へのドナー細胞のマイクロインジェクションによって為すことができる。融合は、接触／融合平面にわたるＤＣ電気パルスの印加によって（電気融合）、ポリエチレングリコール等の融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルス等の不活性化ウイルスによって誘導することができる。再構成された細胞は、核ドナーおよびレシピエント卵母細胞の融合の前、その間、および／またはその後に、電気的および／または非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法は、電気的パルス、化学物質により誘導されるショック、精子による透過、卵母細胞における増加するレベルの二価カチオン、および卵母細胞における細胞タンパク質の低下するリン酸化（キナーゼ阻害剤によるものとして）を含む。活性化された再構成された細胞または胚は、周知培地において培養し、次いで、動物の子宮に移すことができる。例えば、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
本明細書に提供される様々な方法は、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含む。Ｆ０動物の生成に使用される方法に応じて、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を有する、Ｆ０動物内の細胞の数が変動するであろうことが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法による、対応する生物由来の前桑実胚期の胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入は、Ｆ０動物の細胞集団のより大きいパーセンテージが、標的化された遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、標的化された改変を有する細胞集団を含むことができる。
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性であり得る、またはヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座に関してホモ接合性であり得る。
上または下に引用されているあらゆる特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号その他は、それらの全体があらゆる目的のため、あたかも個々の項目それぞれが、参照により本明細書に組み込まれていると特異的にかつ個々に指し示されているのと同じ度合まで、参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが、異なる時点においてある受託番号に関連付けられる場合、本願の有効な出願日においてその受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日は、実際の出願日、または該当する場合はその受託番号を参照する優先出願の出願日のうち早い方の日付を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトその他の異なるバージョンが、異なる時点において公開されている場合、別段の指示がない限り、本願の有効な出願日において直近に公開されたバージョンを意味する。本発明のいずれかの特色、ステップ、エレメント、実施形態または態様は、特に別の指示がない限り、他のいずれかと組み合わせて使用することができる。本発明について、明確さおよび理解を得ることを目的として、例証および例示としてある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある一定の変化および改変を実施し得ることが明らかであろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に収載されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準文字略語、およびアミノ酸のための３文字コードを使用して示されている。
ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、３’末端へと順方向に進む（すなわち、各行において左から右に）、標準の慣例に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示されている鎖のいずれかの参照によって含まれるものと理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されていることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、カルボキシ末端へと順方向に進む（すなわち、各行において左から右に）、標準の慣例に従う。
（実施例１ ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むマウスの作製）
４１．６ｋｂのマウスＴｒｋＢ遺伝子座を含む５’相同性アームおよび６２．４ｋｂのマウスＴｒｋＢ遺伝子座を含む３’相同性アームを含む大型の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製し、マウスＴＲＫＢ細胞外ドメインをコードするマウスＴｒｋＢ遺伝子の６５．７ｋｂの領域を、対応する７４．４ｋｂのヒトＴＲＫＢ配列で置換した。マウスおよびヒトＴＲＫＢに関する情報を表２に示す。大型の標的化ベクターの作製の説明を表３に示す。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を用いる細菌の相同組換え（ＢＨＲ）反応による細菌の人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに由来する大型の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の作製および使用は、例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(6):652-659に記載されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの作製は、例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０３７６６２８号およびＷＯ２０１５／２００３３４号に記載されている。
具体的には、エクソン２（コーディングエクソン１、アミノ酸３２から、シグナルペプチドを保存する）から始まるエクソン１０までの領域を、イントロン１０の最初の１３７塩基対およびエクソン２と１０との間（すなわちコーディングエクソン１とエクソン１０との間）の全てのイントロンを含めて、マウスＴｒｋＢ遺伝子座から欠失させた（エクソン１０および１１によってコードされたマウス膜貫通ドメインを保存する）。エクソン２／コーディングエクソン１（シグナルペプチドの後で始まるアミノ酸３２から）を含むエクソン１０までの領域を、イントロン１０の最初の１７７塩基対およびエクソン２と１０との間（すなわちコーディングエクソン１とエクソン１０との間）の全てのイントロンを含めて、欠失させたラットの領域の代わりに挿入した（エクソン１０および１１によってコードされたラット膜貫通ドメインを保存する）。
マウスＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの配列を、それぞれ配列番号６３～６６に表記されている対応するコード配列とともに、それぞれ配列番号５１～５４に表記する。ヒトＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの配列を、それぞれ配列番号７１～７４に表記されている対応するコード配列とともに、それぞれ配列番号５９～６２に表記する。予想されるコードされたキメラＴＲＫＢタンパク質は、マウスＴＲＫＢ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、マウスＴＲＫＢシグナルペプチド、ならびにヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを有している。図１を参照されたい。マウスおよびヒトＴＲＫＢタンパク質のアラインメントを図６に示す。マウスおよびヒトＴｒｋＢ／ＴＲＫＢコード配列をそれぞれ配列番号９および１１に表記する。マウスおよびヒトＴＲＫＢタンパク質配列をそれぞれ配列番号１および３に表記する。予想されるキメラマウス／ヒトＴＲＫＢコード配列および予想されるキメラマウス／ヒトＴＲＫＢタンパク質の配列をそれぞれ配列番号１２および４に表記する。
変異体対立遺伝子を生成するため、大型の標的化ベクターをＦ１Ｈ４マウス胚幹細胞に導入した。抗生剤による選択に続いて、コロニーを採取し、増殖させ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によってスクリーニングした。図２を参照されたい。表４に示すプライマーおよびプローブを用いて、内在性ラット対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを行い、ヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを行った。
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号、ＷＯ２０１６／０８１９２３号、およびFrendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307に記載されている。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは従来のスクリーニングの論理を逆転させ、変異が導かれたネイティブ遺伝子座のゲノムＤＮＡ試料におけるコピー数を定量するものである。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞クローンにおいては、２つのネイティブ対立遺伝子の一方が（Ｘ染色体上にもＹ染色体上にもない遺伝子について）ＬＯＡアッセイによって検出され、他方の対立遺伝子は標的化された改変によって中断される。ゲノムＤＮＡ試料中に挿入された標的化ベクターのコピー数を定量する対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイとして、同じ原理を逆に適用することができる。
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を用いてＦ０マウスを作製した。例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、米国特許出願公開第２００８／００７８０００号、およびPoueymirou et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(1):91-99を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、標的化されたマウス胚幹（ＥＳ）細胞をレーザー補助注射によって前桑実胚期の胚、例えば８細胞期の胚に注射する。これにより、完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代のマウスが効率的に得られる。以下に記載するヒト化ＴＲＫＢマウスにおいて実施した全ての実験は、自己欠失選択カセットが自己欠失したマウスで行った。
（実施例２ ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス（ＭＡＩＤ７１３９）の体重および代謝に対するＨ４Ｈ９８１６抗体とアイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５抗体の効果のｉｎ ｖｉｖｏ比較）
実験手順
ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の体重および体組成に対する効果を決定するため、抗体の単回皮下注射に続いて、マウスＴＲＫＢ受容体を代替するヒトＴＲＫＢ受容体の発現に関するホモ接合性マウス（ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス）の代謝研究を行った。これらの研究の一部は、ＴｒｋＢアゴニストおよびＴｒｋＢノックアウトマウスに関する以前の研究に基づいて行った。例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるLin et al. (2008) PLoS ONE 3(4):e1900；Rios et al. (2013) Trends in Neurosciences 36(2):83-90；およびZorner et al. (2003) Biol. Psychiatry 54:972-982を参照されたい。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス（雄、２０週齢）は、２週間の馴化のため、最初にグループケージからシングルケージハウジングに移した。この期間の後、抗体投与に続く食物および水の消費、移動運動、エネルギー消費、および呼吸の変化を評価するため、マウスを代謝ケージ（ＣＬＡＭＳ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移した。通常の粉末の固形飼料をフロアチャンバー内でばね荷重天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、ＰＬ６０２Ｅ）の上に保存し、固形飼料の全重量の変化から食物の消費を測定した。水はケージ上の飲み口から摂取可能とし、ポンプラインの体積（Ｏｘｙｍａｘ（登録商標）／ＣＬＡＭＳ Ｌｉｑｕｉｄ Ｕｎｉｔ）の変化を追跡することによって、摂取量を測定した。本研究の期間を通して、ＣＬＡＭＳ代謝ケージによって、１６～１８分の間隔で連続的にこれらのパラメーターのそれぞれを測定した。代謝データを単一の手段で解析し、ＯＸＹＭＡＸ（登録商標）／ＣＬＡＭＳソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ｖ５．３５）を用いて１つの完全な明暗サイクルを含む２４時間の間隔でまとめた。２週間ケージに馴化した後、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２の、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２、またはＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体のいずれかの５０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量をＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスに投与した。ナイーブ対照ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの群には注射しなかった。投薬の直前、ならびに投薬後２４、４８、７２、９６、および１２０時間でマウスを秤量した。それぞれのマウスの体組成を測定するため、ＥｃｈｏＭＲＩ（商標）－５００Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＥｃｈｏＭＲＩ ＬＬＣ）を用いる核磁気共鳴リラキソメトリー（定量的磁気共鳴とも称される）を行った。投薬に先立って、マウスを透明なプラスチックのホルダーに入れ、ＮＭＲ－ＭＲＩデバイスに挿入して、それぞれの対象の除脂肪量、体脂肪量、および水分補給状態を測定した。測定はマウス１匹あたり０．５～３．２分の過程にわたって行い、投薬後約１２０時間で再び行った。
結果および結論
ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいてＨ４Ｈ９８１６Ｐ２の単回皮下注射が体重減少を誘起するか否かを決定するため、毎日の体重モニタリングを行った。投薬に先立って、３つの処置群の平均体重に有意差はなかった。なぜなら、各々の用量前の平均体重は２８．３９～２９．８５ｇであったからである（表５）。しかし投薬後４８時間では、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは平均１．７０ｇ、すなわち用量前体重の５．９６％を失っていた。同じ時点で、ナイーブおよびアイソタイプ対照抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの体重はそれらの用量前体重より１．７９～２．３７％増加していた。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは研究の全時間経過を通して体重が減少し続け、投薬後７２時間および９６時間までにこれらのマウスはそれぞれ用量前体重より平均８．４２％および１１．８０％減少した。投薬後１２０時間で、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスはそれらの用量前体重の平均１２．６７％を失っていた。逆に、ナイーブおよびアイソタイプ対照で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは、研究を通じて用量前体重からの喪失を示さなかった。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの体重は投薬後４８、７２、９６、および１２０時間においてナイーブ対照およびアイソタイプ対照の両方と比較して有意に減少したので、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２はＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて有意な体重減少を誘起すると決定された。
投薬の前後にそれぞれの対象についてＮＭＲ－ＭＲＩを実施することによって、体組成に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射の効果をも測定した。投薬に先立って、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの３つの処置群の体脂肪量または除脂肪量に有意差はなかった。なぜなら、各群は平均４．１９～４．７５ｇの体脂肪量および２１．３２～２１．７０ｇの除脂肪量を有していたからである（表６）。しかし抗体の投与後、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を投薬したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは研究の過程にわたってそれらの全体脂肪量の平均４８．９０％を失っていた（表６）。ナイーブおよびアイソタイプ対照抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスはそれぞれそれらの投薬前体脂肪量の平均８．４９％および９．４８％を失っており、これはＨ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置した対象より有意に低かった（表６）。さらに、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは研究を通してそれらの除脂肪量の平均７．８４％を失っており、これはナイーブ群およびアイソタイプ対照抗体処置群がそれぞれ失った投薬前除脂肪量の平均２．４１％および１．７５％より有意に大きかった（表６）。したがって、記述した体重減少はＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおけるＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射に続く体脂肪量の有意な喪失および除脂肪量の小幅な喪失によって説明することができよう。
ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの体重および体組成に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射の効果の評価に加えて、代謝ケージによって給餌、飲水、および運動活性を継続的に測定した。投薬に先立って、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは１日あたり平均３．４９～３．７３ｇの固形飼料を消費していた。しかしＨ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスでは投薬後２４時間以内に食物摂取量が１日あたり固形飼料２．２０ｇに有意に減少した。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの食物摂取量の平均レベルは研究の残りの期間を通して１日あたり固形飼料２．４９ｇを上回ることがなかった。一方、ナイーブおよびアイソタイプ抗体で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは１日あたり平均３．６２～４．０７ｇの固形飼料を継続的に消費した（表７）。
同様に、投薬前の処置群の間で毎日の水の消費量に有意差はなかった。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスはそれぞれの処置群で１日あたり平均４．６７～５．５５ｍＬの水を消費した（表８）。投薬後、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの１日あたりの水摂取量は２．０５～３．２４ｍＬに減少した。これは研究を通して１日あたり４．５０～５．７７ｍＬの水を継続的に消費したナイーブおよびアイソタイプ対照抗体処置ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスより有意に低かった（表８）。したがって、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射は、ナイーブおよびアイソタイプ対照マウスの両方と比較して、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて食物摂取量および水摂取量の両方の有意な低減をもたらすと考えられる。
活動性に対する抗体処置の効果を決定するため、ＯＸＹＭＡＸ（登録商標）／ＣＬＡＭＳソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ｖ５．３５）によって移動運動を解析した。これは、それぞれのマウスのｘ平面歩行の全数を連続的に測定するものである。１匹のマウスは投薬前に多動を示し、用量後の統計解析から除外された。ナイーブ対象およびアイソタイプ抗体で処置した対象は研究を通して１日あたり平均１１，０００～１５，０００回の歩行を継続的に記録した。一方、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは投薬後２４～４８時間の間に２８，２６０回の歩行、投薬後４８～７２時間および７２～９６時間の間にそれぞれ２１，１９３回および２７，０２８回の歩行を記録した（表９）。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置したＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスは抗体投与後それぞれの時点で、より多い全歩行数を記録し、多動がＨ４Ｈ９８１６Ｐ２の注射の追加的な効果であることが示唆された。これらを組み合わせると、これらの効果はＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の単回皮下注射がＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて体重、体組成、代謝、および移動運動に有意な変化を誘起したことを示唆している。
（実施例３ ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス（ＭＡＩＤ７１３９）における定位注射の後の脳におけるＴＲＫＢリン酸化に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２およびＩｇＧ４アイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５の効果のｉｎ ｖｉｖｏ比較）
実験手順
チロシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）はそのリガンドである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の細胞外受容体ドメインにおける結合によって活性化され、それにより細胞内受容体ドメインにおけるチロシン残基の二量化および自己リン酸化が誘起され、引き続いて細胞質シグナル伝達経路が活性化される。例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるHaniu et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(40):25296-25303およびRogalski et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(33):25082-25088を参照されたい。ＴＲＫＢ活性化動力学に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の効果を決定するため、細胞外ドメインをヒト化したキメラマウス／ヒトＴＲＫＢ受容体についてホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ７１３９）（ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスと称する）において、海馬への直接注射に引き続くＴＲＫＢリン酸化の経時的研究を行った。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウス（Ｎ＝４８）のブレグマの－２ｍｍ後方、＋１．５ｍｍ側方の海馬に、２μＬのビヒクル（ＰＢＳ）、本明細書でＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と称するＲＥＧＮ１９４５（最終濃度２７．５ｍｇ／ｍＬ）、またはＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２（最終濃度２７．５ｍｇ／ｍＬ）の両側定位注射を行った。組織の損傷を最小化するため、注射および針の除去はいずれも５分の間隔にわたってゆっくりと行った。次いで注射後約３０分、１時間、４時間、または１８時間にＣＯ２安楽死によってＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスを屠殺した。心穿刺によって最終出血を行って血液を回収し、次いで冷却したヘパリン化食塩水を心臓を経由してマウスを潅流した。頭蓋から脳を注意深く取り出し、注射部位を取り囲む組織の２ｍｍ３の切片を切除し、エッペンドルフ管に集め、氷上で保存した。次いで２×プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃７８４４４）を含有する３００μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃８９９０１）で脳の切片を溶解し、氷上で保存した。溶解した組織をさらなる処理のため次にホモジナイズし、アリコートにして－８０℃で保存した。
脳組織中のＴＲＫＢリン酸化を評価するため、免疫沈降法およびウエスタンブロットを実施した。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２との結合に関して競合しない抗ヒトＴＲＫＢ抗体Ｈ４Ｈ１０１０８ＮをＮＨＳ活性化セファロースビーズ（製造業者のプロトコールを用いて調製、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃１７－０９０６）にカップリングし、ＤＰＢＳで３回洗浄してあらゆる残存保存溶液を除去した。ホモジナイズした脳溶解物を氷上で解凍し、ＴＢＳＴ中１％のＮＰ－４０、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤からなる緩衝液で１ｍｇ／ｍＬ（脳重量対緩衝液体積）の濃度に希釈した。ホモジナイズした脳溶解物のタンパク質濃度は、製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ＃２３２２５）に従って標準的なＢＣＡアッセイを実施することによって定量した。タンパク質１００μｇについて１５μＬの抗ヒトＴＲＫＢ抗体（Ｈ４Ｈ１０１０８Ｎ）ＮＨＳ活性化セファロースビーズを脳溶解物溶液に添加し、混合物を２０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら（Ｔｈｅｒｍｏローテーター）４℃で終夜インキュベートした。翌日、試料を１０００×ｇで１分遠心分離し、次いで上清を注意深く除いた。続いて１％のＴｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｐ９４１６）を含む４００μＬのトリス緩衝食塩水（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１７０６４３５）（ＴＢＳＴ）でビーズを２回洗浄した。洗浄緩衝液を注意深く吸引した後、水中、ｐＨ３．０の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ６２２００）６０μＬをそれぞれの試料に添加した。溶液を混合して２分間静置し、その後採取して別の管に移した。ｐＨ３．０の０．１％ＴＦＡ６０μＬをさらに用いてこの処理を繰り返した。次に各試料についての２つの０．１％ＴＦＡ溶液を合わせて、２μＬのｐＨ８．５の１ＭトリスＨＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃１５５６７－０２７）を添加した。
急速真空を用いて溶液を乾燥し、再懸濁して、１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１６１０７３７）と３５５ｎＭの２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ；Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃２１９８５－０２３）の混合物２０μＬで還元した。試料を９５℃で１０分間煮沸し、１０ウェルのＭｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ４～１５％トリスグリシンゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃４５６１０８６）にローディングした。電気泳動の後、タンパク質試料をトリスグリシンゲルからＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１７０４１５６）を介して３０分にわたって１．３Ａおよび２５Ｖの一定速度でＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１７０－４１５６）に移した。移送の後、ＴＢＳＴ中２．５％のミルク（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１７０－６４０６）で、室温で１時間、膜をブロックし、続いて３０ｒｐｍの振とう器上、４℃で終夜、２．５％ＢＳＡ溶液で１：１０００に希釈した抗ホスホ－ＴＲＫＢ抗体（Ｎｏｖｕｓ、Ｃａｔ＃ＮＢ１００－９２６５６）または２．５％のミルクＴＢＳＴで１：１０００に希釈した抗ＴＲＫＢ一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ＃４６０３）でプローブした。翌日、ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳＴ中１％のミルクで１：１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１１１－０３５－１４４）と室温で１時間インキュベートした。次いでブロットを再び洗浄し、ＥＣＬ溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ． Ｃａｔ＃ＲＰＮ２１０６）で発光させ、続いて３０秒ごとに画像の露光を取得した。
結果および結論
図３に示すように、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスの脳溶解物由来のタンパク質の免疫沈降法および引き続くウエスタンブロットにより、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を注射したマウスでは海馬ＴＲＫＢリン酸化が検出可能であったが、ビヒクルまたはアイソタイプ対照抗体で処置したマウスでは検出されないことが示された。評価した時点の中では、ＴＲＫＢリン酸化はＨ４Ｈ９８１６Ｐ２を投薬したマウスで定位注射の後、４時間でピークに達した。全てではないが数匹のマウスで、投薬後１８時間でも、ウエスタンブロットによりＴＲＫＢリン酸化が検出された。逆に、ビヒクルおよびＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体の注射では、いずれの時点でもＴＲＫＢリン酸化は誘起されなかった。ウエスタンブロットにより、全ＴＲＫＢ受容体レベルは、ビヒクルおよびアイソタイプ対照で処置したマウスと比較して、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２を投薬した全てではないが数匹のＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスで下方制御されていることも示された。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２で処置した対象では投薬後１８時間で全ＴＲＫＢレベルが僅かに下方制御されているように思われた。したがって、これらの結果は、ＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の直接注射によりＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいて海馬ＴＲＪＢ受容体のリン酸化が誘起されることを示している。
（実施例４ 生後１日のＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスからの初代皮質ニューロンにおけるＴｒｋＢアゴニスト抗体による下流シグナル伝達経路の活性化）
実験手順
全ての手順はARVO Statement for Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research and the Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IACUCに従って実施した。ヒト化ＴｒｋＢマウス（ＭＡＩＤ７１３９）からマウス初代皮質ニューロンを単離して培養した。例えばその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるBeaudoin et al. (2012) Nat. Protoc. 7(9):1741-1754を参照されたい。ＡｋｔおよびＥｒｋの下流経路（ｐ－Ａｋｔ、ｐ－Ｅｒｋ１／２）に対するＴｒｋＢアゴニスト抗体の効果を決定するため、ウエスタンブロットを実施した。生後１日（Ｐ１）のヒト化ＴｒｋＢ幼若マウスの初代皮質ニューロンを、ＧＳ２１Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ、ｃａｔ＃ＧＳＭ－３１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃３５０５０－０６１）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＮｅｕｒａｌＱ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ、ｃａｔ＃ＧＳＭ－９４２０）中で４日間（ＤＩＶ－４）培養した。細胞を、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ－Ｌ１（１０μｇ／ｍＬ）、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ－Ｌ１（１０μｇ／ｍＬ）、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ－Ｌ１（１０μｇ／ｍＬ）、ＩｇＧ４アイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５（１０μｇ／ｍＬ）、対照抗体Ｈ１Ｍ８０３７Ｃ－Ｌ１（１０μｇ／ｍＬ）、またはＢＤＮＦ（１μｇ／ｍＬ）で１５分間または２時間処理した。アゴニストが下流シグナル伝達の維持および強度において相違を有するかを決定するために、ウエスタンブロットを実施した。処理した細胞をすすぎ、１％のプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含有する冷ＰＢＳ中で擦過した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によってタンパク質濃度を決定した。試料（５０μｇ）を３～８％のトリスアセテート還元ゲル（Ｎｏｖｅｘ）中のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。
５％のミルクおよび０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するｐＨ７．６のブロッキング溶液中で膜を１時間インキュベートした。続いて５％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、およびウサギ抗ホスホ－Ｔｒｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９１４１、１：５００）、ウサギ抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９２７１、１：１０００）、またはウサギ抗ホスホ－ＥＲＫ１／２抗体（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｅ７０２８、１：５０００）を含有するブロッキング緩衝液中、４℃で終夜インキュベートした。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヤギ、抗マウス、または抗ウサギＩｇＧとインキュベートし、ＨＲＰの化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発光させることによって、標識したタンパク質を可視化した。それぞれのレーンに存在する全ＴｒｋＢ、ＭＡＰＫ、またはＡｋｔの量を決定するため、ストリッピング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で２０分、ニトロセルロース膜から抗体をストリッピングし、ウサギ抗ＴｒｋＢ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃４６０３、１：１０００）、ウサギ抗Ｅｒｋ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃０６－１８２、１：１０００）、またはウサギ抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９２７２、１：１０００）とインキュベートし、次いで上述のように可視化した。試料ローディング対照としてベータ－アクチン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ａ５３１６、１：２００００）およびＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｇ９２９５）をプローブした。
材料
結果および結論
図７に示すように、全てのＴｒｋＢアゴニスト抗体はインキュベーション後１５分でＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を示したが、ＢＤＮＦおよびＨ４Ｈ９８１４ＰのみがＴｒｋＢリン酸化を示した。インキュベーション後２時間で、全てのＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢの活性化を示した。
（実施例５ ヒト化ＴｒｋＢマウスおよび野生型マウスにおける抗ＴｒｋＢ抗体の薬物動態評価）
実験手順
抗ＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２（ロットＨ４Ｈ９８１６Ｐ２－Ｌ７）の薬物動態の評価を、ヒト化ＴｒｋＢ（キメラマウス／ヒトＴｒｋＢ発現についてホモ接合性マウス、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕ）（ＭＡＩＤ７１３９）および野生型（ＷＴ）マウスについて行った。コホートにはマウスの１血統について５匹のマウスが含まれていた。全てのマウスに１０ｍｇ／ｋｇ用量の単回皮下（ＳＣ）投与を行った。投薬後６時間ならびに１、２、３、６、９、１６、２１、および３０日で血液試料を回収した。血液を血清に処理して解析まで－８０℃で凍結した。
ＧｙｒｏＬａｂ ｘＰｌｏｒｅ（商標）（Ｇｙｒｏｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる全ヒトＩｇＧ４／ｈＩｇＧ１抗体解析によって、循環抗体濃度を決定した。手短には、抗体希釈緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋ＰＢＳ）中、１００μｇ／ｍＬに希釈したビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４／ＩｇＧ１特異的モノクローナル抗体（ＲＥＧＮ２５６７、ロットＲＳＣＨ１５０８８）を、ストレプトアビジンコートビーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標））を予めローディングした親和性カラムを含有するＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ＣＤに捕捉した。このアッセイにおける較正に用いた標準は、０．１％の正常マウス血清（ＮＭＳ）を含有する希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）中、０．４８８～２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＨ４Ｈ９８１６Ｐであった。血清試料は抗体希釈緩衝液で１：１００に希釈した。室温で試行したＣＤ上の抗ＲＥＧＮ２５６７コート親和性カラムに捕捉されたヒトＩｇＧを、検出緩衝液（Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液）で希釈した０．５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ－６４７コンジュゲートマウス抗ヒトカッパモノクローナル抗体（ＲＥＧＮ６５４、ロットＲＳＣＨ１３０６７）の添加によって検出し、得られる蛍光シグナルを、ＧｙｒｏＬａｂ ｘＰｌｏｒｅ装置によって応答ユニット（ＲＵ）で記録した。Ｇｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いる５パラメーターロジスティック曲線フィットを用いてフィットさせた標準曲線の内挿によって、試料濃度を決定した。２回の反復実験の平均濃度を引き続くＰＫ解析のために用いた。
Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアバージョン６．３（Ｃｅｒｔａｒａ，Ｌ．Ｐ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を用いる非コンパートメント解析（ＮＣＡ）および血管外投薬モデルによって、ＰＫパラメーターを決定した。各抗体についてのそれぞれの平均濃度値を用い、観察された血清中最大濃度（Ｃｍａｘ）、観察された推定半減期（ｔ１／２）、および測定可能な最終濃度までの時間に対する濃度曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）を含む全てのＰＫパラメーターを、直線的内挿および均一な重みづけによる直線的台形規則を用いて決定した。
結果および結論
抗ＴｒｋＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与の後、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスおよびＷＴマウスの両方において１日目または２日目までに同様の最大抗体濃度（Ｃｍａｘ）が観察された（それぞれ１３５および１３１μｇ／ｍＬ）。９日目までに、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２はＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおいてＷＴマウスよりも急速な薬物排出を示し、標的媒介効果を示した。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスでは３０日目の抗体濃度は約３５分の１であった。ＷＴマウスにおけるＨ４Ｈ９８１６Ｐ２への抗体曝露（ＡＵＣｌａｓｔ）は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスで見られたものよりも約１．７倍高かった（それぞれ１７３０および１０２０ｄ＊μｇ／ｍＬ）。ＷＴマウスはまた、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスに対して約３倍の半減期（Ｔ１／２）の増大を示した（それぞれ８．４および２．９日）。
全抗ＴｒｋＢ抗体濃度のデータの要約を表１５にまとめ、平均ＰＫパラメーターを表１６に記載し、時間に対する平均全抗体濃度を図８に示す。図８において、マウスには０日目で単回の１０ｍｇ／ｋｇの皮下用量を投与した。血清中の全Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の濃度は、Ｇｙｒｏｓイムノアッセイによって測定した。用量後６時間、１、２、３、６、９、１６、２１、および３０日目のデータ点は、平均抗体濃度を示す。Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２の全抗体濃度は、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスについては黒丸で、野生型マウスについては黒四角で表す。データは平均±ＳＤとしてプロットしている。
（実施例６ ヒト化ＴＲＫＢ遺伝子座を含むラットの作製）
７ｋｂのラットＴｒｋＢ遺伝子座を含む５’相同性アームおよび４７ｋｂのラットＴｒｋＢ遺伝子座を含む３’相同性アームを含む大型の標的化ベクターを作製し、ラットＴＲＫＢ細胞外ドメインをコードするラットＴｒｋＢ遺伝子の６８．５ｋｂの領域を、対応する７４．４ｋｂのヒトＴＲＫＢ配列で置換した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を用いる細菌の相同組換え（ＢＨＲ）反応による細菌の人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに由来する大型の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の作製および使用は、例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(6):652-659に記載されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの作製は、例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０３７６６２８号およびＷＯ２０１５／２００３３４号に記載されている。ラットおよびヒトＴＲＫＢに関する情報を表１７に示す。大型の標的化ベクターの作製に関する説明を表１８に示す。
具体的には、エクソン２（コーディングエクソン１、アミノ酸３２から、シグナルペプチドを保存する）から始まるエクソン１０までの領域を、イントロン１０の最初の５０塩基対およびエクソン２と１０との間（すなわちコーディングエクソン１とエクソン１０との間）の全てのイントロンを含めて、ラットＴｒｋＢ遺伝子座から欠失させた（エクソン１０および１１によってコードされたラット膜貫通ドメインを保存する）。エクソン２／コーディングエクソン１（シグナルペプチドの後で始まるアミノ酸３２から）を含むエクソン１０までの領域を、イントロン１０の最初の６６塩基対およびエクソン２と１０との間（すなわちコーディングエクソン１とエクソン１０との間）の全てのイントロンを含めて、欠失させたラットの領域の代わりに挿入した（エクソン１０および１１によってコードされたラット膜貫通ドメインを保存する）。
ラットＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの配列を、それぞれ配列番号６７～７０に表記されている対応するコード配列とともに、それぞれ配列番号５５～５８に表記する。ヒトＴＲＫＢシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの配列を、それぞれ配列番号７１～７４に表記されている対応するコード配列とともに、それぞれ配列番号５９～６２に表記する。予想されるコードされたキメラＴＲＫＢタンパク質は、ラットＴＲＫＢ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、ラットＴＲＫＢシグナルペプチド、ならびにヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを有している。図４を参照されたい。ラットおよびヒトＴＲＫＢタンパク質のアラインメントを図６に示す。ラットおよびヒトＴｒｋＢ／ＴＲＫＢコード配列をそれぞれ配列番号１０および１１に表記する。ラットおよびヒトＴＲＫＢタンパク質配列をそれぞれ配列番号２および３に表記する。予想されるキメララット／ヒトＴＲＫＢコード配列および予想されるキメララット／ヒトＴＲＫＢタンパク質の配列をそれぞれ配列番号１３および５に表記する。
変異体対立遺伝子を生成するため、４つのガイドＲＮＡ（配列番号４１～４４に表記されているガイドＲＮＡ標的配列）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を、大型の標的化ベクターとともにラット胚幹細胞に導入した。具体的には、４×１０６個のラットＥＳ細胞（ダークアグーチ系統ＤＡ２Ｂ）を、以下：２ｍｇのＴｒｋＢ ＬＴＶＥＣ、５ｍｇのＣａｓ９発現プラスミド、およびそれぞれ５ｍｇのｇＲＮＡ、すなわちｇＵ、ｇＵ２、ｇＤ、およびｇＤ２とともに電気穿孔した。電気穿孔の条件は、電圧４００Ｖ、キャパシタンス１００ｍＦ、抵抗０Ｗであった。濃度７５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて抗生剤選択を行った。コロニーを採取し、増殖させ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によってスクリーニングした。図５を参照されたい。表１９に示すプライマーおよびプローブを用いて、内在性ラット対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを行い、ヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを行い、ＣＲＩＳＰＲおよび保持アッセイを行った。
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えばそれぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号、米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号、ＷＯ２０１６／０８１９２３号、およびFrendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476:295-307に記載されている。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは従来のスクリーニングの論理を逆転させ、変異が導かれたネイティブ遺伝子座のゲノムＤＮＡ試料におけるコピー数を定量するものである。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞クローンにおいては、２つのネイティブ対立遺伝子の一方が（Ｘ染色体上にもＹ染色体上にもない遺伝子について）ＬＯＡアッセイによって検出され、他方の対立遺伝子は標的化された改変によって中断される。ゲノムＤＮＡ試料中に挿入された標的化ベクターのコピー数を定量する対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイとして、同じ原理を逆に適用することができる。
保持アッセイは、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号およびＷＯ２０１６／０８１９２３号に記載されている。保持アッセイは、標的化ベクターの５’および３’相同性アームにそれぞれ対応する５’および３’の標的配列のＤＮＡ鋳型のコピー数を評価することによって、標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートの正しく標的化された挿入と、標的ゲノム遺伝子座の外のゲノム位置への核酸インサートのランダムなトランスジェニック挿入とを区別するものである。具体的には、保持アッセイによって、改変された標的ゲノム遺伝子座の中に保持することが意図された５’標的配列ＤＮＡ鋳型および／または改変された標的ゲノム遺伝子座の中に保持することが意図された３’標的配列ＤＮＡ鋳型のゲノムＤＮＡ試料中のコピー数を決定する。２倍体細胞においては、正しく標的化されたクローンは２のコピー数を保持することになる。２より大きいコピー数は一般に、標的ゲノム遺伝子座ではなく標的ゲノム遺伝子座の外でのランダムな標的化ベクターのトランスジェニック組み込みを示す。未満のコピー数は一般に、欠失のために標的化した領域を超えて延びる大きな欠失を示す。
ＣＲＩＳＰＲアッセイは、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡによって中断された領域を包含するように設計されたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイである。ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡによってインデル（挿入または欠失）が切断されおよび作製されると、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによって増幅することができず、したがってＣＲＩＳＰＲ開裂が報告される。
陽性クローンＣＢ１を解凍し、増殖させ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって再確認した。ＣＢ１はヒト置換配列の５’末端から５’相同性アームの末端を超え、隣接するラットゲノム配列までのＰＣＲの成功によっても確認された。末端のシーケンシングによって、ＰＣＲアンプリコンは正しいことが確認された。
Ｆ０およびＦ１ラットは、それぞれその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２３５９３３号、同第２０１４／０３１０８２８号、ＷＯ２０１４／１３０７０６号、およびＷＯ２０１４／１７２４８９号に記載された方法を用いて作製した。これらの方法において、確認され標的化されたラットＥＳ細胞クローン（例えばダークアグーチＥＳ細胞クローン）を胚盤胞（例えばＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）胚盤胞）に微量注入し、つぎに偽妊娠したレシピエント雌（例えばＳＤレシピエント雌）に標準的な技術によって妊娠のために移す。キメラを（例えばコート色によって）同定し、雄のＦ０キメラを同じ血統（例えばＳＤ雌）の野生型雌ラットと交配させる。次いで生殖細胞系列（例えばアグーチ）Ｆ１幼若ラットを標的化された対立遺伝子の存在について遺伝子型決定する。以下に記載するヒト化ＴＲＫＢラットにおいて実施した全ての実験は、自己欠失選択カセットが自己欠失したラットで行った。
（実施例７ ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕラットにおける網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２とＩｇＧ４アイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５の効果のｉｎ ｖｉｖｏ比較）
実験手順
全ての手順はARVO Statement for Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research and the Regeneron Pharmaceuticals Inc. IACUCに従って実施した。８～１０週齢でそれぞれ体重２００～２５０ｇの成体の雌ＴｒｋＢヒト化ラット（ＭＡＩＤ１０００１０）を用いた。ラットに対する全ての手術手順は、ケタミン（６３ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（６．０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いて全身麻酔下に行った。角膜を保護するためにエリスロマイシン（０．５％、Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）を含有する眼軟膏を適用した。
眼窩内視神経軸索切断および硝子体内注射。左の視神経（ＯＮ）を眼窩内で露出し、その硬膜を開いた。眼球の約１．５ｍｍ後ろでＯＮを切断した。網膜への血液の供給を損傷しないように注意した。５０μＬのハミルトンシリンジに連結した、引伸ばしたガラスピペットを用いて毛様体輪の真後ろで硝子体内注射を行った。水晶体を損傷しないよう注意した。顕著な術後合併症（例えば網膜虚血、白内障）を有したラットがあれば、さらなる解析から除外した。動物は異なった実験群に割り付けた。ＯＮ軸索切断の後、３日目および１０日目に、対照群には３μＬのアイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５（４６．６μｇ／μＬ）を硝子体内注射し、他の群には３μＬの抗ヒトＴＲＫＢ抗体Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２（４５．７μｇ／μＬ）を注射した。
免疫組織化学染色および生存している網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の計数。生存している網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のマーカーとしてＢＲＮ３Ａ（脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ）を用いた。なぜなら、これがＯＮ傷害後の網膜ホールマウントにおける生存ＲＧＣの選択的標識のための効率よく信頼できる方法であることが示されているからである。例えばその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるNadal-Nicolas et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sic. 50(8):3860-3868を参照されたい。ＢＲＮ３Ａを免疫染色するため、網膜を１０％正常ロバ血清および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００中で１時間ブロッキングし、次いでＢＲＮ３Ａ抗体（１：４００、Ｃａｔ＃ｓｃ－３１９８４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含む同じ培地中で室温、２時間インキュベートした。さらに洗浄した後、網膜をＡｌｅｘａ５９４コンジュゲートロバ抗ヤギ二次抗体（１：４００、Ｃａｔ＃Ａ－１１０５８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と４℃で終夜インキュベートした。
結果および結論
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＧＣの生存に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体の効果を評価するため、完全視神経切断モデルを用いた。術後３日目および１０日目に、ＴＲＫＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）またはアイソタイプ対照抗体を適用した。軸索切断後１４日目に動物を安楽死させた。傷害を受けていない反対側の眼におけるＲＧＣ密度は３つのＴＲＫＢ遺伝子型（ホモ接合性ヒト化、ヘテロ接合性ヒト化、および野生型）で同様で、表２０に示すように平均して約１６００／ｍｍ２である。ＢＲＮ３Ａ染色を用いて、網膜ホールマウントにおける生存ＲＧＣの密度を評価した。ホモ接合性ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕヒト化ラットにおいて、ＴＲＫＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）は、対照と比較して有意に（ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）ＲＧＣの生存を増大させたことが見出された（６８５±１０６対２５５±６６ＲＧＣ／ｍｍ２）。ヘテロ接合性ＴｒｋＢｈｕ／＋ヒト化ラットにおいても、ＴｒｋＢアゴニストＡｂの有意な（ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）生存効果がある（４４４±９０対２０８±５０ＲＧＣ／ｍｍ２）。野生型ラットでは、ＴＲＫＢアゴニスト抗体で処置したラットで、アイソタイプ対照と比較して僅かであり有意でないＲＧＣ数の増加があった（表２１）。結論として、ＴＲＫＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）はＴｒｋＢｈｕ／ｈｕヒト化ラットにおいてＲＧＣの生存を有意に増大させた。
（実施例８ 実施例で用いた抗ＴＲＫＢ抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列）
Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ、およびＨ４Ｈ９８１６Ｐ２として表される抗体を含むいくつかの完全ヒト抗ＴＲＫＢ抗体（すなわちヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を実施例で試験した。表２２に、実施例で用いた選択された抗ＴＲＫＢ抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列の識別子を示す。表２３に、実施例で用いた選択された抗ＴＲＫＢ抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲの核酸配列の識別子を示す。これらの抗体は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１１月２８日に出願された米国特許出願公開第１６／２０２，８８１号により詳細に記載されている。
抗体は本明細書において典型的には以下の命名法に従って称する。Ｆｃ接頭辞（例えば「Ｈ４Ｈ」）、続いて数字識別子（例えば表２２に示す「９７８０」、「９８１６」等）、続いて「Ｐ」または「Ｐ２」接尾辞。抗体表示におけるＨ４Ｈ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。したがって、この命名法に従えば、本明細書において抗体は例えば「Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ」と称され、これはヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を示す。抗体表示において最初の「Ｈ」によって表されれば、可変領域は完全にヒトの可変領域である。当業者には認識されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は異なったＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えばマウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体はヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換できる等）が、いずれにしても、（ＣＤＲを含む）可変ドメイン（これは表２２に示す数字識別子によって示されている）は同じままであり、抗原との結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず同一または実質的に同様であることが予想される。
（実施例９ ヒト化ＴｒｋＢラットにおける抗ヒトＴｒｋＢアゴニスト抗体の神経保護効果）
以下の実験は、野生型（ＷＴ）マウスおよびラット、ならびにヒト化ＴｒｋＢマウスおよびラットにおける内在性ＴＲＫＢアゴニスト、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ならびにＴＲＫＢアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の神経保護効果を評価するために行った。
分化したヒト神経芽細胞腫細胞系ＳＨ－ＳＹ５Ｙを用いる細胞生存アッセイによって、ＢＤＮＦおよびＴＲＫＢ Ａｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を定量した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＢＤＮＦまたはＴＲＫＢ Ａｂはレチノイン酸分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存を有意に増大させた。効果はベル型の用量応答を示し、最適用量はＢＤＮＦで１μｇ／ｍＬ、ＴＲＫＢ Ａｂで１０μｇ／ｍＬであった。神経芽細胞腫細胞系ＳＨ－ＳＹ５Ｙを、１０μＭのオールトランスレチノイン酸を含有する分化培地中で４日間培養した。種々の用量の抗体（０．０１～１００μｇ／ｍＬ）を含有する無血清分化培地に培養物を交換した。２日後にＣＣＫ８試薬を添加し、プレートを３～４時間インキュベートし、ＯＤ４５０を測定して生存細胞のパーセンテージを決定した。データは抗体を含まない無血清培地に正規化した。図９に示すように、ＴＲＫＢ ｍＡｂ（ＴｒｋＢ ｍＡｂ１はＨ４Ｈ９８１６Ｐ２であり、ＴｒｋＢ ｍＡｂ２は対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体である）は用量依存的にＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存を増大させた。ヒトアイソタイプ対照はＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存に効果がなかった。抗体を含まない無血清培地は１００％の生存をもたらした。
次いでＰ２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜を切除し、解離させた。網膜神経節細胞をイムノパニング（immuno-panning）によって精製し、処置しまたは処置せずに、９６ウェルプレート中で培養した。２４時間後に、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を各ウェルに添加して、各群についての細胞生存を計算した。図１０に示すように、ＢＤＮＦはベル型の応答曲線を有し、最適用量は１μｇ／ｍＬであった。ＴｒｋＢ ｍＡｂ２（ヒトＴｒｋＢ、マウスＴｒｋＢ、およびラットＴｒｋＢに親和性を有する対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体）も高い用量ではベル型曲線を有するようであるが、神経保護効果を示す。
ｉｎ ｖｉｖｏの神経保護効果を試験するため、ＷＴおよびヒト化ＴｒｋＢマウスならびにラットを用いた。視神経切断（ＯＮＴ）の３日後および１０日後に、動物にＢＤＮＦまたはＴＲＫＢ ｍＡｂを硝子体内（ＩＶＴ）注射した。視神経切断の後、マウスでは１週間、ラットでは２週間で、網膜フラットマウントのＢｒｎ３ａ ＩＨＣにより、ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を用いて網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の数を定量した。
視神経切断後１週または２週で、ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおけるＲＧＣの死はＷＴマウスと同様であった。ＢＤＮＦまたはＴＲＫＢ ＡｂのＷＴまたはＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスにおける神経保護効果は小さいか、顕著でなかった。対照的に、ＩＶＴ ＴＲＫＢ
ＡｂではＴｒｋＢｈｕ／ｈｕラットにおいて顕著なＲＧＣ神経保護があった。ＴｒｋＢｈｕ／ｈｕマウスでは体重減少が観察されたが、ＩＶＴ ＴＲＫＢ Ａｂ処置後のラットでは観察されなかった。ＢＤＮＦはマウスおよびラットのいずれにおいても体重への影響がなかった。
図１１Ａおよび図１１Ｂに、ＷＴマウスおよびラットの視神経切断モデルにおける神経保護を評価する実験の結果を示す。図１１Ａでは、８～９週齢のダークアグーチラットに、ＢＤＮＦ（５μｇ）、ＴｒｋＢ ｍＡｂ２（１８μｇ）、アイソタイプ対照抗体（１８μｇ）、またはビヒクル対照を、切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した。ＴｒｋＢ ｍＡｂ２はヒトＴｒｋＢ、マウスＴｒｋＢ、およびラットＴｒｋＢに親和性を有する対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体である。切断の１４日後に網膜を切除し、網膜神経節細胞を染色した。ＢＤＮＦおよびＴＲＫＢ ｍＡｂは、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）密度によって測定される顕著な神経保護を示した。図１１Ｂでは、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴマウスに、ＢＤＮＦ（２．５μｇ）、ＴｒｋＢ ｍＡｂ２（１０μｇ）、アイソタイプ対照抗体（１０μｇ）、またはビヒクル対照を、切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した。ＴｒｋＢ ｍＡｂ２はヒトＴｒｋＢ、マウスＴｒｋＢ、およびラットＴｒｋＢに親和性を有する対照ＴｒｋＢアゴニスト抗体である。顕著な神経保護はなかった。したがって、ＢＤＮＦおよびＴＲＫＢ ｍＡｂ処置により、視神経切断後の野生型ラットの切除した網膜においてＲＧＣ密度の顕著な増大がもたらされたが、野生型マウスの同じモデルではＲＧＣ密度に対する顕著な効果は観察されなかった。
図１２Ａおよび図１２Ｂに、ＷＴマウスおよびラットにおけるＢＤＮＦの用量応答を示す。図１２Ａでは、ＷＴマウスの視神経挫滅（ＯＮＣ）モデルにおけるＢＤＮＦの用量応答は神経保護の小さなウィンドウを示す。図１２Ｂに、ＷＴラットの視神経切断モデルにおける０．１３μｇ～３０μｇのＢＤＮＦの用量応答を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏデータと同様のベル型応答があり、最適用量は０．８μｇである。切断の１４日後に網膜を切除し、網膜神経節細胞を染色した。すなわち、視神経挫滅の後の野生型マウスの切除した網膜におけるＲＧＣ密度によって測定される、それほど顕著ではないＢＤＮＦの用量応答曲線と比較して、視神経切断の後の野生型ラットの切除した網膜におけるＲＧＣ密度によって測定される、より顕著な用量応答曲線がＢＤＮＦ処置によってもたらされた。
次に、ヒト化ＴｒｋＢラットにおけるＴＲＫＢ Ａｂの神経保護効果を試験した。図１３Ａおよび図１３Ｂの結果は、視神経を切断したヒト化ＴｒｋＢラットにおけるＴＲＫＢ ｍＡｂの硝子体内注射が網膜神経節細胞の顕著な神経保護を示すことを示している。ヒトＴＲＫＢホモ接合性ラット、ヒトＴＲＫＢヘテロ接合性ラット、または野生型ＴｒｋＢラットに、ＴｒｋＢ ｍＡｂ１またはアイソタイプ対照抗体を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した（３μＬ）。切断の１４日後に網膜を切除し、ＲＧＣを染色した。ラットは１７～１９週齢の雌であった。図１３Ａに示すように、ＴｒｋＢ ｍＡｂ１（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）で処置したラットは、アイソタイプ対照抗体で処置した対応するラットと比較して３つの遺伝子型全てで神経保護を示した。アイソタイプ対照で処置したヒトＴＲＫＢについてホモ接合性およびヘテロ接合性のラットは、アイソタイプ対照で処置した野生型ラットよりも高いＲＧＣ密度を有する。図１３Ｂに、ナイーブの眼では遺伝子型の間にＲＧＣ数の差異がないことを示す。図１３Ｃに、切断後１４日目にＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を投与したヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスの体重を示す。
次いで、３つの遺伝子型における無傷の眼および傷害を受けて処置された眼のＢｒｎ３ａ標識細胞を示すラット網膜のホールマウントＲＧＣ等密度マップを作製した（データは示していない）。ホールマウントの再構築は、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ）の可動ステージを利用して調製した。ＲＧＣは画像解析ソフトウェア（ＨＡＬＯ（登録商標）、Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ、Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ、ＵＳＡ）を用いて計数した。等密度マップはＭａｔｌａｂによって生成した。ＴｒｋＢ ｍＡｂ１（Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２）で処置したヒト化ＴｒｋＢラットにおいて、アイソタイプ対照で処置したラットと比較して高いＲＧＣ密度が観察された（データは示していない）。
合わせると、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１３Ａ～図１３Ｃに示すデータは、ヒト化ＴｒｋＢラットの視神経傷害の後のＴＲＫＢアゴニストｍＡｂの硝子体内投与が顕著な神経保護効果を有し、ヒト化ＴｒｋＢマウスの視神経傷害の後に観察された小さなまたは顕著でない神経保護効果と対照的であることを示している。
ラットの視神経切断（ＯＮＴ）モデルにおけるＲＧＣの生存に対するＴＲＫＢアゴニスト抗体の効果をさらに評価するため、用量－応答研究を行った。１～９月齢のヒトＴＲＫＢホモ接合性ラット（ＭＡＩＤ１０００１０、７５％ＳＤ、２５％ＤＡ）を用いた。各群で６匹のラットを用いた。ヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットに、種々の用量のＴｒｋＢ ｍＡｂ１またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した（３μＬ）。切断の１４日後に網膜を切除し、ＲＧＣを染色した。図１４に示すように、ＴｒｋＢヒト化ラットにおいて、ＴｒｋＢ ｍＡｂ１は用量依存的にＲＧＣの生存を増大させた。
次に、ヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットの視神経切断（ＯＮＴ）モデルにおいて、種々のＴｒｋＢアゴニスト抗体の神経保護効果を比較した。８～１０週齢のヒト化ＴｒｋＢラット（ＭＡＩＤ１０００１０、７５％ＳＤ、２５％ＤＡ）を用いた。各群で５～６匹のラットを用いた。ヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットに、Ｈ４Ｈ９８１６Ｐ２－Ｌ９（１０μｇ）、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ－Ｌ９（１０μｇ）、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ－Ｌ５（１０μｇ）、３つ全ての組合せ（それぞれ３．３μｇ）、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５、１０μｇ）を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した（３μＬ）。切断の１４日後に網膜を切除し、ＲＧＣを染色した。結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。それぞれのＴｒｋＢアゴニスト抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して神経保護効果を有していた。各群の体重は同様であった（データは示していない）。
対照的に、ＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｈ４Ｈ９７８０ＰおよびＨ４Ｈ９８１４Ｐは、野生型ラットにおいて神経保護効果を何ら有しなかった。野生型ラットにおいて神経保護効果は視神経切断（ＯＮＴ）モデルを用いて評価した。８～１０週齢の雌野生型ラットを用いた。各群で５～６匹のラットを用いた。野生型ラットに、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ（１２０μｇ）、Ｈ４Ｈ９８１４Ｐ（１２０μｇ）、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５、１２０μｇ）を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した（３μＬ）。切断の１４日後に網膜を切除し、ＲＧＣを染色した。図１６に示すように、ＴｒｋＢアゴニスト抗体のいずれも、野生型ラットにおいて顕著な神経保護効果を有しなかった。
さらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ）はヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスにおいて神経保護効果を有しなかった。５月齢の雄ヒトＴＲＫＢホモ接合性マウス（ＭＡＩＤ７１３９、７５％ Ｃ５７ＢＬ／６、２５％ １２９）を用いた。各群で５～６匹のマウスを用いた。ヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスに、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ（１眼あたり４０μｇ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５、１眼あたり４０μｇ）を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した（１μＬ）。切断の１４日後に網膜を切除し、ＲＧＣを染色した。図１７Ａおよび図１７Ｂに示すように、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットで見られた神経保護効果とは対照的に、ヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスにおいて神経保護効果を有しなかった。図１７Ｃに、切断後１４日目にＨ４Ｈ９７８０Ｐまたはアイソタイプ対照抗体を与えたヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスの体重を示す。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物であって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物。
(項目２)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含む、項目１に記載の非ヒト動物。
(項目３)
前記細胞外ドメインが、配列番号６０に表記されている配列を含む、項目２に記載の非ヒト動物。
(項目４)
前記細胞外ドメインの全体が、欠失されて前記オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座の前記セグメントによってコードされ、必要に応じて、前記細胞外ドメインのコード配列が、配列番号７２に表記されている配列を含む、項目２または３に記載の非ヒト動物。
(項目５)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性シグナルペプチドを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目６)
前記シグナルペプチドが、配列番号５１または５５に表記されている配列を含む、項目５に記載の非ヒト動物。
(項目７)
前記シグナルペプチドの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３または６７に表記されている配列を含む、項目５または６に記載の非ヒト動物。
(項目８)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目９)
前記膜貫通ドメインが、配列番号５３または５７に表記されている配列を含む、項目８に記載の非ヒト動物。
(項目１０)
前記膜貫通ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５または６９に表記されている配列を含む、項目８または９に記載の非ヒト動物。
(項目１１)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目１２)
前記細胞質ドメインが、配列番号５４または５８に表記されている配列を含む、項目１１に記載の非ヒト動物。
(項目１３)
前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６または７０に表記されている配列を含む、項目１１または１２に記載の非ヒト動物。
(項目１４)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメイン、および内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目１５)
前記シグナルペプチドが、配列番号５１に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５３に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５４に表記されている配列を含む、または
前記シグナルペプチドが、配列番号５５に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５７に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５８に表記されている配列を含む、
項目１４に記載の非ヒト動物。
(項目１６)
前記シグナルペプチドの全体、前記膜貫通ドメインの全体、および前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、
必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６に表記されている配列を含む、または
必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６７に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６９に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号７０に表記されている配列を含む、
項目１４または１５に記載の非ヒト動物。
(項目１７)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、キメラ非ヒト動物／ヒトＴＲＫＢタンパク質である、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目１８)
前記細胞外ドメインが、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインであり、前記膜貫通ドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質膜貫通ドメインであり、前記細胞質ドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質細胞質ドメインである、項目１７に記載の非ヒト動物。
(項目１９)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４または５に表記されている配列を含む、項目１７または１８に記載の非ヒト動物。
(項目２０)
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２または１３に表記されている配列を含む、項目１９に記載の非ヒト動物。
(項目２１)
前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性である、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目２２)
前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してホモ接合性である、項目１～２０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目２３)
哺乳動物である、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目２４)
齧歯類である、項目２３に記載の非ヒト動物。
(項目２５)
ラットまたはマウスである、項目２４に記載の非ヒト動物。
(項目２６)
ラットである、項目２５に記載の非ヒト動物。
(項目２７)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号５に表記されている配列を含む、項目２６に記載の非ヒト動物。
(項目２８)
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１３に表記されている配列を含む、項目２７に記載の非ヒト動物。
(項目２９)
マウスである、項目２５に記載の非ヒト動物。
(項目３０)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４に表記されている配列を含む、項目２９に記載の非ヒト動物。
(項目３１)
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２に表記されている配列を含む、項目３０に記載の非ヒト動物。
(項目３２)
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法であって、
（ａ）前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を項目１～３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物に投与するステップと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するステップとを含む、方法。
(項目３３)
ステップ（ａ）が、前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を前記非ヒト動物に注射するステップを含む、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
ステップ（ｂ）が、対照非ヒト動物と比べて、体重、体組成、代謝および移動運動のうち１種または複数または全種の変化を評価するステップを含む、項目３２または３３に記載の方法。
(項目３５)
体組成の変化を評価する前記ステップが、対照非ヒト動物と比べて、除脂肪量および／または体脂肪量を評価するステップを含む、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
代謝の変化を評価する前記ステップが、食物消費および／または水消費の変化を評価するステップを含む、項目３４または３５に記載の方法。
(項目３７)
ステップ（ｂ）が、対照非ヒト動物と比べて、ＴＲＫＢリン酸化、および／またはＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を評価するステップを含む、項目３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含む、項目３２～２７のいずれか一項に記載の方法。
(項目３９)
ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含み、前記非ヒト動物が、ラットである、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
ステップ（ｂ）が、網膜神経節細胞生存度を評価するステップを含む、項目３２～３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
網膜神経節細胞生存度が、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて評価される、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
網膜神経節細胞生存度が、視神経挫滅モデルにおいて評価される、項目４０に記載の方法。
(項目４３)
前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、抗原結合性タンパク質である、項目３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４４)
前記抗原結合性タンパク質が、ヒトＴＲＫＢアゴニスト抗体である、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、小分子である、項目３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記小分子が、ヒトＴＲＫＢアゴニストである、項目４５に記載の方法。
(項目４７)
項目１～３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記インサート核酸が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含む、外因性修復鋳型、ならびに
（ｉｉ）前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤
を導入するステップであって、ゲノムが、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように改変される、ステップと、
（ｂ）改変された前記非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、
（ｃ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生させるステップと
を含む、方法。
(項目４８)
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓ９タンパク質、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡである、項目４７または４８に記載の方法。
(項目５０)
ステップ（ａ）が、前記非ヒト動物多能性細胞に、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
前記外因性修復鋳型が、少なくとも１０ｋｂの長さの大型の標的化ベクターである、または前記外因性修復鋳型が、その前記５’相同性アームおよび前記３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである大型の標的化ベクターである、項目４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
項目１～３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、
（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記インサート核酸が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含む、外因性修復鋳型、ならびに
（ｉｉ）前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤
を導入するステップであって、ゲノムが、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように改変される、ステップと、
（ｂ）改変された前記非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生させるステップと
を含む、方法。
(項目５３)
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓ９タンパク質、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡである、項目５２に記載の方法。
(項目５４)
ステップ（ａ）が、前記非ヒト１細胞期胚に、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞であって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物細胞。
(項目５６)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物ゲノム。
(項目５７)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、
前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされ、
前記標的化ベクターが、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列を標的化する５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列を標的化する３’相同性アームに挟まれた前記オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含むインサート核酸を含む、
標的化ベクター。

Claims (36)

  1. 遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むマウスであって、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座が、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）タンパク質をコードし、
    前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメイン、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインおよびヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列で置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによりコードされる、マウス。
  2. 前記ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインが、配列番号６０に表記されている配列を含む、請求項１に記載のマウス。
  3. 前記ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインのコード配列が、配列番号７２に表記されている配列を含む、請求項１または２に記載のマウス。
  4. 前記シグナルペプチドが、配列番号５１に表記されている配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のマウス。
  5. 前記シグナルペプチドの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされる、請求項１～４のいずれか一項に記載のマウス。
  6. 前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３に表記されている配列を含む、請求項５に記載のマウス。
  7. 前記膜貫通ドメインが、配列番号５３に表記されている配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のマウス。
  8. 前記膜貫通ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされる、請求項１～７のいずれか一項に記載のマウス。
  9. 前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５に表記されている配列を含む、請求項８に記載のマウス。
  10. 前記細胞質ドメインが、配列番号５４に表記されている配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のマウス。
  11. 前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマウス。
  12. 前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６に表記されている配列を含む、請求項１１に記載のマウス。
  13. 前記シグナルペプチドが、配列番号５１に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５３に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５４に表記されている配列を含む、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載のマウス。
  14. 前記シグナルペプチドの全体、前記膜貫通ドメインの全体、および前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされる、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載のマウス。
  15. 前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６に表記されている配列を含む、
    請求項１４に記載のマウス。
  16. 前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４に表記されている配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のマウス。
  17. 前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２に表記されている配列を含む、請求項１６に記載のマウス。
  18. 前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のマウス。
  19. 前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してホモ接合性である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のマウス。
  20. ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法であって、
    （ａ）前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を請求項１～１９のいずれか一項に記載のマウスに投与するステップと、
    （ｂ）前記マウスにおける前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するステップとを含む、方法。
  21. ステップ（ａ）が、前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を前記マウスに注射するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. ステップ（ｂ）が、対照マウスと比べて、体重、体組成、代謝および移動運動のうち１種または複数または全種の変化を評価するステップを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 体組成の変化を評価する前記ステップが、対照マウスと比べて、除脂肪量および／または体脂肪量を評価するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 代謝の変化を評価する前記ステップが、食物消費および／または水消費の変化を評価するステップを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. ステップ（ｂ）が、対照マウスと比べて、ＴＲＫＢリン酸化、および／またはＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を評価するステップを含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ステップ（ｂ）が、網膜神経節細胞生存度を評価するステップを含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 網膜神経節細胞生存度が、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて評価される、請求項２７に記載の方法。
  29. 網膜神経節細胞生存度が、視神経挫滅モデルにおいて評価される、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、抗原結合性タンパク質である、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記抗原結合性タンパク質が、ヒトＴＲＫＢアゴニスト抗体である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、小分子である、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記小分子が、ヒトＴＲＫＢアゴニストである、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項１～１９のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法であって、
    （Ｉ）
    （ａ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように多能性マウス細胞のゲノムを改変するステップ、
    （ｂ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む前記遺伝子改変された多能性マウス細胞を識別または選別するステップ、
    （ｃ）前記遺伝子改変された多能性マウス細胞をマウス宿主胚に導入するステップ、および
    （ｄ）前記マウス宿主胚を代理マウス母に移植し、懐胎させるステップ、または
    （ＩＩ）
    （ａ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むようにマウス１細胞期胚のゲノムを改変するステップ、
    （ｂ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む前記遺伝子改変されたマウス１細胞期胚を選別するステップ、および
    （ｃ）前記遺伝子改変されたマウス１細胞期胚を代理マウス母に移植し、懐胎させるステップ
    を含む、方法。
  35. 遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むマウス細胞であって、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座が、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）タンパク質をコードし、
    前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメイン、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインおよびヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列で置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによりコードされる、マウス細胞。
  36. 遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を生成するための標的化ベクターを含む組成物であって、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座が、マウストロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）タンパク質細胞外ドメインをコードする内在性マウスＴｒｋＢゲノム配列の、ヒトＴＲＫＢタンパク質細胞外ドメインをコードする対応するヒトＴＲＫＢゲノム配列での置き換えを含み、
    前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座が、ＴＲＫＢタンパク質をコードし、前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメイン、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインおよびヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含み、
    前記標的化ベクターが、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列を標的化する５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列を標的化する３’相同性アームに挟まれた前記ヒトＴＲＫＢゲノム配列を含むインサート核酸を含む、
    組成物。
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