JP7615134B2

JP7615134B2 - 液体がんの治療のための組成物および方法

Info

Publication number: JP7615134B2
Application number: JP2022519460A
Authority: JP
Inventors: ジェイソンマイケルゲールケ、; アーロンディー．エドワーズ、; ライアンマーレイ、; ワシームカシム、
Original assignee: UCL Biomedica PLC; UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2025-01-16
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: WO2021062227A3; CA3155667A1; WO2021062227A2; EP4034138A2; CN115279398A; US20230021636A1; JP2025066723A; US12594301B2; JP2022549916A; AU2020355222A1; CN120905310A; KR20220090512A; CN115279398B; EP4034138A4

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２７日に出願された米国仮出願第６２／９０７，２５４号の優先権および利益を主張する国際ＰＣＴ出願であり、その内容全体が、参照によりその全体が本明細書に援用される。

自己免疫療法および同種免疫療法は、腫瘍治療アプローチであり、対象に、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞が投与される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を生成するために、免疫細胞は、最初に、対象（自己）または治療を受ける対象とは別個のドナー（同種）から採取され、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子修飾（改変）される。得られた細胞は、その細胞表面（例えばＣＡＲＴ細胞）にキメラ抗原受容体を発現し、対象に投与した場合、キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞によって発現されたマーカーに結合する。腫瘍マーカーとのこの相互作用は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、次いで、細胞が腫瘍細胞を死滅させる。しかし、自己または同種細胞療法が効果的かつ効率的であるためには、Ｔ細胞シグナル伝達の阻害などの有意な条件および細胞応答を克服または回避しなければならない。移植片対宿主病およびＣＡＲ－Ｔ細胞の宿主拒絶は、同種細胞療法に対して、さらなる課題を提供し得る。これらのプロセスに関与する遺伝子を編集することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を増強し、免疫抑制または免疫阻害に対する耐性を増強することができるが、かかる編集を行うための現在の方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞内の大きなゲノム再編成を誘導する可能性があり、それによって、その有効性に悪影響を与える。したがって、免疫細胞（特に、ＣＡＲ－Ｔ細胞）をより正確に修飾（改変）するための技術が非常に必要とされている。この用途は、このニーズおよびその他の重要なニーズを対象とする。

以下に記載されるように、本発明は、遺伝子修飾免疫細胞を特徴とし、遺伝子修飾免疫細胞は、増強された抗腫瘍活性、免疫抑制への耐性、および、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞が移植片を非自己として認識する場合（例えば、移植レシピエントが移植臓器に対する免疫応答を生成する）、移植片対宿主反応もしくは宿主対移植片反応を誘発する低減されたリスク、またはそれらの組み合わせを有する。一実施形態では、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有するか、またはそれを発症する傾向がある対象に、機能的なＴＲＡＣを欠くか、またはそのレベルが低下しているＣＡＲ－Ｔ細胞が投与される。一実施形態では、宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）を有するか、またはそれを発症する傾向がある対象に、機能的なβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を欠くか、またはそのレベルが低下しているＣＡＲ－Ｔ細胞が投与される。また、本発明は、これらの修飾された免疫細胞を産生および使用するための方法も特徴とする。

一態様では、本発明は、２つ以上の免疫細胞を含む組成物を提供し、各免疫細胞は、ａ）ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体であって、免疫細胞が、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異を含む、異なるキメラ抗原受容体と、ｂ）ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される免疫原性ポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異と、を含む。一部の実施形態では、免疫細胞のうちの１つは、ＣＤ５を標的とするキメラ抗原受容体を含み、別の免疫細胞は、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも３つの免疫細胞を含み、各々が、異なる抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含み、標的とされた抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７である。一部の実施形態では、免疫細胞のうちの１つは、ＣＤ７を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、別の免疫細胞は、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、免疫細胞のうちの１つは、ＣＤ３を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、別の免疫細胞は、ＣＤ３３およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、免疫細胞のうちの１つは、ＣＤ３３を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、別の免疫細胞は、ＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、１つの免疫細胞が、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のうちの１つは、ＣＤ５を標的とし、別のキメラ抗原受容体は、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のうちの１つは、ＣＤ７を標的とし、別のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のうちの１つは、ＣＤ３を標的とし、別のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３３およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のうちの１つは、ＣＤ３３を標的とし、別のキメラ抗原受容体は、ＣＤ１２３を標的とする。

別の態様では、本発明は、少なくとも３つの免疫細胞を含む組成物を提供し、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体は、ＣＤ３を標的とし、１つは、ＣＤ５を標的とし、および３つ目は、ＣＤ７を標的とし、細胞は、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む。

さらに別の態様では、本発明は、少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物を提供し、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体は、ＣＤ３を標的とし、別の受容体は、ＣＤ７を標的とし、細胞は、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む。

一態様では、本発明は、少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物を提供し、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体は、ＣＤ５を標的とし、別の受容体は、ＣＤ７を標的とし、細胞は、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む。

別の態様では、本発明は、少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物を提供し、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体は、ＣＤ３を標的とし、別の受容体は、ＣＤ５を標的とし、細胞は、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む。

さらに別の態様では、本発明は、少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物を提供し、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体は、ＣＤ３３を標的とし、別の受容体は、ＣＤ１２３を標的とし、細胞は、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む。

一部の実施形態では、変異は、遺伝子をサイレンシングするか、または遺伝子に終止コドンを導入するＣからＴまたはＡからＧの変異である。一部の実施形態では、変異は、未熟終止コドンを導入するか、またはスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を変化させる。一部の実施形態では、変異は、デアミナーゼドメインを含む塩基エディターによって生成される。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＢＥ４である。一部の実施形態では、変異は、変異を欠く対応する対照細胞と比較して、コードされたポリペプチドの発現を約５０％以上低減する。一部の実施形態では、組成物は、免疫細胞の集団を含む。一部の実施形態では、集団の少なくとも５０％は、標的とされた抗原および／または免疫原性ポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）耐性である。一部の実施形態では、免疫細胞は、増加した抗腫瘍活性を有する。一部の実施形態では、免疫細胞は、検出可能な転座を含まない。一部の実施形態では、免疫細胞は、１％未満のインデル（indel）を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞またはげっ歯類細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、もしくはＮＫ細胞、またはそれらの前駆細胞である。一部の実施形態では、前駆細胞は、造血幹細胞である。

一態様では、本発明は、薬学的組成物を提供し、有効量の本明細書に提供される組成物のうちのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む。

別の態様では、本発明は、塩基エディターシステムを提供し、核酸プログラマブル（プログラム可能）ＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ：nucleic acid programmable DNA binding protein）およびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と、各々異なる抗原を標的とする少なくとも２つのガイドポリヌクレオチドと、を含み、抗原は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つのガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ５を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、システムは、３つのガイドポリヌクレオチドを含み、その各々は、抗原ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７のうちの１つを標的とする。一部の実施形態では、１つのガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ７を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、１つのガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ３を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ３３およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、１つのガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ３３を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドは、ＣＤ１２３を標的とする。

一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、各々、表２６から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＡＧＣＧＡＣＵＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧまたはＣＡＵＡＣＣＡＧＣＵＧＡＧＣＣＧＵＣＣＧから選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）および／または１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦポリペプチドまたはその一部を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ポリペプチドまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、不活性型（ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、修飾ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、または修飾ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を含む。一部の実施形態では、改変ＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＧＣ－３’に対する特異性を有する。

一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンまたはアデノシンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊８バリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８バリアントは、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊９バリアントである。

一態様では、本発明は、本明細書に提供される塩基エディターシステムのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に提供される塩基エディターシステムおよびガイドポリヌクレオチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。

一態様では、本発明は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドまたはベクターのうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。

一態様では、本発明は、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＡＲ発現免疫細胞で、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と、各々異なる抗原をコードするポリヌクレオチドを標的とする２つのガイドポリヌクレオチドと、を含む塩基エディターシステムを発現させることを含み、抗原は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択され、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生する。一部の実施形態では、免疫細胞は、ガイドポリヌクレオチドを発現するか、またはそれと接触し、ガイドポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とする。

一部の実施形態では、本方法は、（ａ）ＣＡＲ発現免疫細胞で、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）と、デアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と、を含む塩基エディターシステムを発現させることと、（ｂ）ＣＡＲ発現免疫細胞を、各々異なる抗原をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも２つのガイドポリヌクレオチドと接触させることと、を含み、抗原は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択され、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生する。

一部の実施形態では、本方法は、ＣＡＲ発現免疫細胞を、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とするガイドポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。一部の実施形態では、本方法は、免疫細胞に、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現を低減または排除する変異を導入し、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生することをさらに含む。

一態様では、本発明は、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ａ）１つの免疫細胞に、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原の発現を低減または排除する変異を導入し、第２の免疫細胞に、当該抗原のうちの１つの異なる変異を導入することと、ｂ）免疫細胞に、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現を低減または排除する変異を導入し、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生することと、を含む。一部の実施形態では、免疫細胞によって発現されたキメラ抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする。一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、ＣＤ３、ＣＤ５、および／またはＣＤ７抗原を標的とし、ＣＤ３、ＣＤ５、および／もしくはＣＤ７抗原を発現できないか、または減少したレベルのＣＤ３、ＣＤ５、および／もしくはＣＤ７抗原を発現するキメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を標的とし、ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現できないか、または減少したレベルのＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現するキメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ５キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の実施形態では、ＣＤ５ＣＡＲは、表２８に提示されるＣＤ５ＣＡＲ構築物によってコードされる。

別の態様では、本発明は、低減された免疫原性を有する免疫細胞を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ａ）ＣＤ５の発現を低減または排除する内因性ＣＤ５の遺伝子配列または調節エレメントに変異を導入することと、ｂ）細胞において、表２８に提示されるＣＤ５ＣＡＲ構築物を発現させることと、を含む。一部の実施形態では、ＣＤ５ＣＡＲ構築物は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤ５ＣＡＲポリペプチドをコードする：
ａ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300
301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360
361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 420
421 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ 480
481 LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE 540
541 RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 573;
ｂ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300
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361 RPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK 420
421 RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT 480
481 KDTYDALHMQALPPR 495;
ｃ）
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61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
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301 PLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR 360
361 KHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP 420
421 EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA 480
481 LHMQALPPR 489;
ｄ）
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241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300
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421 CRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMR 480
481 PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL 540
541 DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST 600
601 ATKDTYDALHMQALPPR 617; または
ｅ）
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421 DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD 480
481 DALHMQALPPRX 494。

一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、対応する対照細胞と比較して、フラトリサイド耐性および／または増加した抗腫瘍活性を示す。一部の実施形態では、本方法は、インビボまたはエクスビボで実施される。一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、検出可能な転座を含まない。一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、１％未満のインデルを含む。一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、５％未満の非標的編集を含む。一部の実施形態では、本方法によって産生された免疫細胞は、５％未満のオフターゲット編集を含む。一部の実施形態では、変異は、核酸塩基修飾によって生成される。一部の実施形態では、変異は、エキソンにある。一部の実施形態では、変異は、タンパク質発現を低減または排除する未熟終止コドンをもたらす。一部の実施形態では、変異は、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、１つ以上の変異は、標的ポリヌクレオチドを、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、デアミナーゼ、および１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含む融合タンパク質を含む塩基エディターシステムと接触させることによって生成される。

一部の実施形態では、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＢＥ４である。一部の実施形態では、変異は、変異を欠く対応する対照細胞と比較して、コードされたポリペプチドの発現を少なくとも約５０％以上低減する。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、表２６に提供されるものから選択される配列を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＡＧＣＧＡＣＵＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧまたはＣＡＵＡＣＣＡＧＣＵＧＡＧＣＣＧＵＣＣＧから選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、１つ以上のガイド核酸配列の各々は、ＣＤ５、ＦＡＳ、ＬＡＧ－３、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／またはＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子もしくは調節エレメントを標的とする。一部の実施形態では、塩基エディターおよび１つ以上のガイド核酸配列は、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、カチオン性脂質媒介方法、ウイルス形質導入、またはそれらの組み合わせを介して、免疫細胞に導入される。一部の実施形態では、本方法は、培養中の免疫細胞を増殖させて、免疫細胞の集団を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、抗原またはポリペプチドの発現は、免疫細胞の集団の少なくとも約５０％において減少する。一部の実施形態では、本方法は、修飾免疫細胞の集団からＴＣＲα／β＋細胞を枯渇させることをさらに含む。

一態様では、本発明は、本明細書に提供される方法のうちのいずれかによって産生された、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に提供される免疫細胞のうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。

さらに別の態様では、本発明は、腫瘍細胞を死滅させるための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を発現する腫瘍細胞を、２つ以上の免疫細胞と接触させることを含み、各免疫細胞は、細胞によって発現された当該抗原のうちの２つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、標的抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、本方法は、インビトロまたはインビボで実施される。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍に由来する。

一態様では、本発明は、対象における腫瘍を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される対象の腫瘍細胞によって発現された抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、免疫細胞の各々は、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む。

一部の実施形態では、腫瘍は、血液がんである。一部の実施形態では、腫瘍は、液体がんである。一部の実施形態では、血液がんは、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である。一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞がんである。一部の実施形態では、血液がんは、以下のうちの少なくとも１つから選択される：Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、末梢性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫ＡＬＫ^＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０^＋リンパ増殖性障害、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、および腸症関連Ｔ細胞リンパ腫。一部の実施形態では、血液がんは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である。一部の実施形態では、血液がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

別の態様では、本発明は、選択された対象における腫瘍を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、選択された対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、対象の腫瘍細胞によって発現された抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、抗原は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択され、免疫細胞は、抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、免疫細胞の各々は、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含み、対象は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を発現する腫瘍を有するものとして選択される。一部の実施形態では、血液がんは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である。一部の実施形態では、血液がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態では、異なるキメラ抗原受容体を発現する２つ以上の免疫細胞は、順次投与される。一部の実施形態では、異なるキメラ抗原受容体を発現する２つ以上の免疫細胞は、同時に投与される。

さらに別の態様では、本発明は、対象における腫瘍細胞の抗原依存性死滅のための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を発現する腫瘍を有する対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、当該抗原のうちの１つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、標的抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む。

一態様では、本発明は、対象における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の抗原依存性死滅のための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現するＡＭＬを有する対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、当該抗原のうちの１つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、標的抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む。

一態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞の抗原依存性死滅のための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を発現するＴ－ＡＬＬを有する対象に、少なくとも３つの免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、当該抗原のうちの１つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、標的抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む。

別の態様では、本発明は、選択された対象におけるがんを治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象に、少なくとも２つの免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、ＣＤ３３またはＣＤ１２３抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、標的抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、対象は、がんをＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現しているものとして特徴付けることによって、選択される。一部の実施形態では、ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現しているがんは、ＡＭＬである。

さらに別の態様では、本発明は、選択された対象におけるがんを治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象に、３つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞は、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、免疫細胞は、標的抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、対象は、がんをＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を発現しているものとして特徴付けることによって、選択される。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を発現しているがんは、Ｔ－ＡＬＬである。

一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、対象は、以前にリンパ枯渇により治療されたことがある。一部の実施形態では、リンパ枯渇は、シクロホスファミド、フルダラビン、および／またはアレムツズマブ（Ｃｙ／Ｆｌｕ／Ｃａｍｐａｔｈ）の投与を伴う。一部の実施形態では、対象は、化学療法に対して不応性であるか、または高い腫瘍負荷を有する。一部の実施形態では、対象は、その後、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）により治療される。一部の実施形態では、免疫細胞は、単一のヒトドナーに由来する。一部の実施形態では、免疫細胞は、対象に対して自己由来である。一部の実施形態では、免疫細胞は、対象に対して同種である。一部の実施形態では、対象は、哺乳類対象である。一部の実施形態では、対象は、ヒト対照またはげっ歯類対象である。一部の実施形態では、対象は、小児ヒト対象である。

一態様では、本発明は、がんの治療に使用するための、本明細書に提供される組成物のうちのいずれかを含むキットを提供する。別の態様では、本発明は、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を生成する際に使用するための、本明細書に提供される塩基エディターシステムのいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態では、本明細書に提供されるキットのうちのいずれかは、キットの使用に関する書面による説明書を含む。

本明細書の説明および実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。当業者は、本開示の範囲内に包含される本開示の多くの変形および修正が存在することを認識するであろう。

本明細書に開示される一部の実施形態の実践には、別段の指示がない限り、当該分野の技術の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えＤＮＡの従来の技術が用いられる。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＧｒｅｅｎ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（２０１２）、ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣＲ２：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓａｎｄＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒｅｄｓ．（１９９５））、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、およびＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄＳｐｅｃｉａｌｉｚｅｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））を参照されたい。

本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で説明され得るが、その特徴はまた、別個に、または任意の好適な組み合わせで提供され得る。逆に、本開示は、明確性のために、別個の実施形態の文脈で本明細書で説明され得るが、本開示はまた、単一の実施形態でも実施され得る。本明細書で使用されるセクションの見出しは、組織化の目的のためにのみ使用され、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明を参照することにより、また、以下に記載される添付の図面を考慮して、本発明の特徴および利点をより良く理解することができるであろう。

定義
以下の定義は、当該技術分野における定義を補完し、本出願を対象とするものであり、任意の関連するまたは関連しない事例（例えば、任意の併有される特許または出願）に帰属するものではない。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料を本開示の試験の実施に使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載されている。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を、当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔａｌ．，ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄｅｄ．１９９４）、ＴｈｅＣａｍｂｒｉｄｇｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒｅｄ．，１９８８）、ＴｈｅＧｌｏｓｓａｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈＥｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴｈｅＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。

本出願では、単数形の使用は、特に断りのない限り、複数形を含む。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本出願において、「または」の使用は、別段の定めのない限り、「および／または」を意味し、包含的であることが理解される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのその任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などのその任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに、「含む（”ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む」（ｉｎｃｌｕｄｅ）などのその任意の形態）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などのその任意の形態）という単語は、包含的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施され得、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差の範囲内であることを意味し、それは、部分的には、どのようにその値が測定または決定されるか（すなわち、測定システムの限界）に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１標準偏差以内または１を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関して、この用語は、値の５倍以内または２倍以内など、１桁以内であることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値について許容誤差の範囲内であることを意味する。

本明細書に提供される範囲は、範囲内のすべての値の略記であることが理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数字の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。

本明細書における「一部の実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」または「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特徴が、本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。

「アデノシンデアミナーゼ」とは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的な脱アミノ化を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼであり、アデノシンのイノシンへの加水分解的な脱アミノ化、またはデオキシアデノシンのデオキシイノシンへの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンまたはアデノシンの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は、細菌などの任意の生物由来であり得る。

一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの生物由来の天然に存在するデアミナーゼのバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在しない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、またはＧ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）デアミナーゼまたはその断片である。

一部の実施形態では、ｅｃＴａｄＡデアミナーゼは、切断型ｅｃＴａｄＡである。例えば、切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡに対して１つ以上のＮ末端アミノ酸を欠損し得る。一部の実施形態では、切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠損し得る。一部の実施形態では、切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠損し得る。一部の実施形態では、ｅｃＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端メチオニンを含まない。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端切断型ＴａｄＡである。特定の実施形態では、ＴａｄＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１に記載されているＴａｄＡのうちのいずれか１つである（その全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０である。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ａ、ＴａｄＡ＊８ｂ、ＴａｄＡ＊８ｃ、ＴａｄＡ＊８ｄ、またはＴａｄＡ＊８ｅである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ｅである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊９である。

「アデノシンデアミナーゼ塩基エディター８（ＡＢＥ８）ポリペプチド」または「ＡＢＥ８」とは、以下の参照配列のアミノ酸位置８２および／または１６６に改変を含むアデノシンデアミナーゼのバリアントを含む、本明細書で定義される塩基エディターを意味する。ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、参照配列と比較して、本明細書に記載されるように、さらなる改変を含む。

「アデノシンデアミナーゼ塩基エディター８（ＡＢＥ８）ポリヌクレオチド」とは、ＡＢＥ８をコードするポリヌクレオチドを意味する。

「アデノシンデアミナーゼ塩基エディター９（ＡＢＥ９）ポリペプチド」または「ＡＢＥ９」とは、本明細書で定義される塩基エディターを意味し、以下の改変のうちの１つ以上を含むアデノシンデアミナーゼのバリアントを含む：以下の参照配列におけるＲ２１Ｎ、Ｒ２３Ｈ、Ｅ２５Ｆ、Ｎ３８Ｇ、Ｌ５１Ｗ、Ｐ５４Ｃ、Ｍ７０Ｖ、Ｑ７１Ｍ、Ｎ７２Ｋ、Ｙ７３Ｓ、Ｖ８２Ｔ、Ｍ９４Ｖ、Ｐ１２４Ｗ、Ｔ１３３Ｋ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１３９Ｍ、Ｃ１４６Ｒ、およびＡ１５８Ｋ。

参照配列で改変された関連する塩基を、下線および太字で示す。一部の実施形態では、ＡＢＥ９は、参照配列と比較して、本明細書に記載されるように、さらなる変化を含む。ＡＢＥ９塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０２０／０４９９７５号に記載されている（その全体が、参照により本明細書に援用される）。

「アデノシンデアミナーゼ塩基エディター９（ＡＢＥ９）ポリヌクレオチド」とは、ＡＢＥ９をコードするポリヌクレオチドを意味する。

「投与すること」は、本明細書において、本明細書に記載の１つ以上の組成物を患者または対象に提供することを指す。例として、限定されないが、組成物の投与（例えば、注射）は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ）注射によって行うことができる。１つ以上のかかる経路を用いることができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によるか、または経時的に徐々に灌流することによって行うことができる。一部の実施形態では、非経口投与は、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌｌｙ）に注入または注射を含む。代替的にまたは同時に、投与を経口経路によって行うことができる。

「薬剤」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。

「変化」とは、技術分野で既知の標準的な方法（本明細書に記載されているものなど）によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの構造、発現レベル、または活性の変化（例えば、増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、変化（例えば、増加または減少）は、ポリヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列の変化、または発現レベルの変化（例えば、１０％の変化、２５％の変化、４０％の変化、および５０％の変化、またはそれ以上の変化）を含む。

「同種」は、本明細書で使用される場合、細胞と比較して遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。

「緩和する」は、疾患の発症または進行を、減少、抑制、減弱、軽減、停止、または安定させることを意味する。

「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的特徴または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの類似体は、対応する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物学的活性を保持し、一方で、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して、類似体の機能を増強する特定の修飾を有する。かかる修飾は、例えば、リガンド結合を変化させることなく、類似体のＤＮＡに対する親和性、効率、特異性、プロテアーゼ耐性もしくはヌクレアーゼ耐性、膜透過性、および／または半減期を増加させることができる。類似体は、非天然ヌクレオチドまたは非天然アミノ酸を含み得る。

「抗腫瘍活性」とは、腫瘍の成熟および／または増殖を防止または阻害することを意味する。

本明細書で使用される「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合するか、またはそれと免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、抗体のポリクローナル形態、モノクローナル形態、遺伝子操作された形態、および他の方法で修飾された形態を含み、これらに限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロ結合抗体（例えば、二重、三重、および四重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ならびにテトラボディ）、および抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒｌｇＧ、およびｓｃＦｖ断片が含まれる）を含む。別段の指示がない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合することができるインタクトな分子と抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を含む）との両方を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、インタクトな抗体のＦｃ断片を欠く抗体断片を指す。これらの抗体断片の例は、本明細書に記載されている。

「Ｂ細胞成熟抗原または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７ポリペプチド（ＢＣＭＡ）」とは、成熟Ｂリンパ球で発現されるＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１１８３またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。例示的なＢＣＭＡポリペプチド配列を以下に提供する。

＞ＮＰ＿００１１８３．２腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］

ＭＬＱＭＡＧＱＣＳＱＮＥＹＦＤＳＬＬＨＡＣＩＰＣＱＬＲＣＳＳＮＴＰＰＬＴＣＱＲＹＣＮＡＳＶＴＮＳＶＫＧＴＮＡＩＬＷＴＣＬＧＬＳＬＩＩＳＬＡＶＦＶＬＭＦＬＬＲＫＩＮＳＥＰＬＫＤＥＦＫＮＴＧＳＧＬＬＧＭＡＮＩＤＬＥＫＳＲＴＧＤＥＩＩＬＰＲＧＬＥＹＴＶＥＥＣＴＣＥＤＣＩＫＳＫＰＫＶＤＳＤＨＣＦＰＬＰＡＭＥＥＧＡＴＩＬＶＴＴＫＴＮＤＹＣＫＳＬＰＡＡＬＳＡＴＥＩＥＫＳＩＳＡＲ

この抗原は、再発性または難治性の多発性骨髄腫および他の血液腫瘍療法において標的とされ得る。

「Ｂ細胞成熟抗原または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＢＣＭＡ）ポリヌクレオチド」とは、ＢＣＭＡポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。ＢＣＭＡ遺伝子は、Ｂ細胞活性化因子を認識する細胞表面受容体をコードする。例示的なＢ２Ｍポリヌクレオチド配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００１１９２．２ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ｍＲＮＡ
ＡＡＧＡＣＴＣＡＡＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＧＴＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＴＣＴＡＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＴＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＣＧＴＧＣＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＧＡＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＣＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＧＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣＴＡＣＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＡＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＣＴＡＧＧＴＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＴＡＧＡＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡ

「塩基エディター（ＢＥ）」または「核酸塩基エディター（ＮＢＥ）」は、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基修飾活性を有する薬剤を意味する。一実施形態では、薬剤は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質を使用して、特定の配列でポリヌクレオチドに結合する。別の実施形態では、塩基エディターは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ）内のシチジン塩基を修飾することができる酵素である。一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子内の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡのシチジンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合されたＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン）に融合される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼと、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン）と、を含む。

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターポリペプチドは、以下のドメインＡ－Ｂ：ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ］－ＣＯＯＨを含み、式中、Ａは、シチジンデアミナーゼドメイン、アデノシンデアミナーゼドメイン、またはその活性断片を含み、Ｂは、核酸配列特異的結合活性を有する１つ以上のドメインを含む。一実施形態では、前の態様のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼの核酸塩基エディターポリペプチドは、ＮＨ_２－［Ａ_ｎ－Ｂ_ｏ］－ＣＯＯＨを含み、式中、Ａは、シチジンデアミナーゼドメイン、アデノシンデアミナーゼドメイン、またはその活性断片を含み、ｎは、整数：１、２、３、４、または５であり、Ｂは、核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含み、ｏは、整数：１、２、３、４、または５である。一実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上の核局在化配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端にある当該核局在化配列のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、核局在化シグナルを含み、二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナルである。一実施形態では、ポリペプチドは、リンカーによって連結された１つ以上のドメインを含む。

一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）およびシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、円順列変異体Ｃａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９）である。円順列変異体Ｃａｓ９は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｏａｋｅｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１７６，２５４－２６７，２０１９に記載されている。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン、またはｄＩＳＮドメイン）に融合される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼと、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメインまたはｄＩＳＮドメイン）と、を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、脱塩基（ａｂａｓｉｃ）塩基エディターである。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡから進化している。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連（例えば、ＣａｓまたはＣｐｆ１）酵素である。一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合された触媒的に失活したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復（ＢＥＲ）の阻害因子に融合される。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）である。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子である。

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）を、円順列変異体Ｃａｓ９（例えば、ｓｐＣＡＳ９）および二分核局在化配列を含む足場にクローニングすることによって生成される。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）を、円順列変異体Ｃａｓ９（例えば、ｓｐＣＡＳ９またはｓａＣＡＳ９）および二分核局在化配列を含む足場にクローニングすることによって生成される（例えば、ＡＢＥ８）。円順列変異体Ｃａｓ９は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｏａｋｅｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１７６，２５４－２６７，２０１９に記載されている。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連（例えば、ＣａｓまたはＣｐｆ１）酵素である。一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合された触媒的に失活したＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復（ＢＥＲ）の阻害因子に融合される。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）である。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子である。

塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）、およびＲｅｅｓ，Ｈ．Ａ．，ｅｔａｌ．，“Ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ．”ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ．２０１８Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１８－００５９－１も参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

例として、本明細書に記載の塩基エディター組成物、システム、および方法で使用されるアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、以下に提供される核酸配列（８８７７塩基対）を有する（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ．；ＧａｕｄｅｌｌｉＮＭ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７Ｎｏｖ２３；５５１（７６８１）：４６４－４７１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４；ＫｏｂｌａｎＬＷ，ｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８Ｏｃｔ；３６（９）：８４３－８４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４１７２．）。ＡＢＥの核酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列も包含される。
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ＡＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＴＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＴＡＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧＧＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧＣＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ塩基エディター８（ＡＢＥ８）である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、以下の表１３、１４、または１６からの塩基エディターから選択される。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡから進化したアデノシンデアミナーゼのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥ８のアデノシンデアミナーゼのバリアントは、以下の表１１、１３、または１４に記載されるＴａｄＡ＊８のバリアントである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒの群から選択される改変のうちの１つ以上を含むＴａｄＡ＊７．１０バリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）である。様々な実施形態では、ＡＢＥ８は、以下の群から選択される改変の組み合わせを有するＴａｄＡ＊７．１０バリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含む：Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、単量体構築物である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ヘテロ二量体構築物である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８塩基エディターは、以下の配列を含む：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＴＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ。

一例として、本明細書に記載の塩基編集組成物、システム、および方法で使用されるシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）は、以下に提供される核酸配列（８８７７塩基対）を有する（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ．；ＫｏｍｏｒＡＣ，ｅｔａｌ．，２０１７，ＳｃｉＡｄｖ．，３０；３（８）：ｅａａｏ４７７４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｏ４７７４）。ＢＥ４核酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列も包含される。
1 ATATGCCAAG TACGCCCCCT ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG
61 CCCAGTACAT GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCATCG
121 CTATTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACATCAATGG GCGTGGATAG CGGTTTGACT
181 CACGGGGATT TCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT TGGCACCAAA
241 ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAACA ACTCCGCCCC ATTGACGCAA ATGGGCGGTA
301 GGCGTGTACG GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTGGTTT AGTGAACCGT CAGATCCGCT
361 AGAGATCCGC GGCCGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG CCGCCACCAT GAGCTCAGAG
421 ACTGGCCCAG TGGCTGTGGA CCCCACATTG AGACGGCGGA TCGAGCCCCA TGAGTTTGAG
481 GTATTCTTCG ATCCGAGAGA GCTCCGCAAG GAGACCTGCC TGCTTTACGA AATTAATTGG
541 GGGGGCCGGC ACTCCATTTG GCGACATACA TCACAGAACA CTAACAAGCA CGTCGAAGTC
601 AACTTCATCG AGAAGTTCAC GACAGAAAGA TATTTCTGTC CGAACACAAG GTGCAGCATT
661 ACCTGGTTTC TCAGCTGGAG CCCATGCGGC GAATGTAGTA GGGCCATCAC TGAATTCCTG
721 TCAAGGTATC CCCACGTCAC TCTGTTTATT TACATCGCAA GGCTGTACCA CCACGCTGAC
781 CCCCGCAATC GACAAGGCCT GCGGGATTTG ATCTCTTCAG GTGTGACTAT CCAAATTATG
841 ACTGAGCAGG AGTCAGGATA CTGCTGGAGA AACTTTGTGA ATTATAGCCC GAGTAATGAA
901 GCCCACTGGC CTAGGTATCC CCATCTGTGG GTACGACTGT ACGTTCTTGA ACTGTACTGC
961 ATCATACTGG GCCTGCCTCC TTGTCTCAAC ATTCTGAGAA GGAAGCAGCC ACAGCTGACA
1021 TTCTTTACCA TCGCTCTTCA GTCTTGTCAT TACCAGCGAC TGCCCCCACA CATTCTCTGG
1081 GCCACCGGGT TGAAATCTGG TGGTTCTTCT GGTGGTTCTA GCGGCAGCGA GACTCCCGGG
1141 ACCTCAGAGT CCGCCACACC CGAAAGTTCT GGTGGTTCTT CTGGTGGTTC TGATAAAAAG
1201 TATTCTATTG GTTTAGCCAT CGGCACTAAT TCCGTTGGAT GGGCTGTCAT AACCGATGAA
1261 TACAAAGTAC CTTCAAAGAA ATTTAAGGTG TTGGGGAACA CAGACCGTCA TTCGATTAAA
1321 AAGAATCTTA TCGGTGCCCT CCTATTCGAT AGTGGCGAAA CGGCAGAGGC GACTCGCCTG
1381 AAACGAACCG CTCGGAGAAG GTATACACGT CGCAAGAACC GAATATGTTA CTTACAAGAA
1441 ATTTTTAGCA ATGAGATGGC CAAAGTTGAC GATTCTTTCT TTCACCGTTT GGAAGAGTCC
1501 TTCCTTGTCG AAGAGGACAA GAAACATGAA CGGCACCCCA TCTTTGGAAA CATAGTAGAT
1561 GAGGTGGCAT ATCATGAAAA GTACCCAACG ATTTATCACC TCAGAAAAAA GCTAGTTGAC
1621 TCAACTGATA AAGCGGACCT GAGGTTAATC TACTTGGCTC TTGCCCATAT GATAAAGTTC
1681 CGTGGGCACT TTCTCATTGA GGGTGATCTA AATCCGGACA ACTCGGATGT CGACAAACTG
1741 TTCATCCAGT TAGTACAAAC CTATAATCAG TTGTTTGAAG AGAACCCTAT AAATGCAAGT
1801 GGCGTGGATG CGAAGGCTAT TCTTAGCGCC CGCCTCTCTA AATCCCGACG GCTAGAAAAC
1861 CTGATCGCAC AATTACCCGG AGAGAAGAAA AATGGGTTGT TCGGTAACCT TATAGCGCTC
1921 TCACTAGGCC TGACACCAAA TTTTAAGTCG AACTTCGACT TAGCTGAAGA TGCCAAATTG
1981 CAGCTTAGTA AGGACACGTA CGATGACGAT CTCGACAATC TACTGGCACA AATTGGAGAT
2041 CAGTATGCGG ACTTATTTTT GGCTGCCAAA AACCTTAGCG ATGCAATCCT CCTATCTGAC
2101 ATACTGAGAG TTAATACTGA GATTACCAAG GCGCCGTTAT CCGCTTCAAT GATCAAAAGG
2161 TACGATGAAC ATCACCAAGA CTTGACACTT CTCAAGGCCC TAGTCCGTCA GCAACTGCCT
2221 GAGAAATATA AGGAAATATT CTTTGATCAG TCGAAAAACG GGTACGCAGG TTATATTGAC
2281 GGCGGAGCGA GTCAAGAGGA ATTCTACAAG TTTATCAAAC CCATATTAGA GAAGATGGAT
2341 GGGACGGAAG AGTTGCTTGT AAAACTCAAT CGCGAAGATC TACTGCGAAA GCAGCGGACT
2401 TTCGACAACG GTAGCATTCC ACATCAAATC CACTTAGGCG AATTGCATGC TATACTTAGA
2461 AGGCAGGAGG ATTTTTATCC GTTCCTCAAA GACAATCGTG AAAAGATTGA GAAAATCCTA
2521 ACCTTTCGCA TACCTTACTA TGTGGGACCC CTGGCCCGAG GGAACTCTCG GTTCGCATGG
2581 ATGACAAGAA AGTCCGAAGA AACGATTACT CCATGGAATT TTGAGGAAGT TGTCGATAAA
2641 GGTGCGTCAG CTCAATCGTT CATCGAGAGG ATGACCAACT TTGACAAGAA TTTACCGAAC
2701 GAAAAAGTAT TGCCTAAGCA CAGTTTACTT TACGAGTATT TCACAGTGTA CAATGAACTC
2761 ACGAAAGTTA AGTATGTCAC TGAGGGCATG CGTAAACCCG CCTTTCTAAG CGGAGAACAG
2821 AAGAAAGCAA TAGTAGATCT GTTATTCAAG ACCAACCGCA AAGTGACAGT TAAGCAATTG
2881 AAAGAGGACT ACTTTAAGAA AATTGAATGC TTCGATTCTG TCGAGATCTC CGGGGTAGAA
2941 GATCGATTTA ATGCGTCACT TGGTACGTAT CATGACCTCC TAAAGATAAT TAAAGATAAG
3001 GACTTCCTGG ATAACGAAGA GAATGAAGAT ATCTTAGAAG ATATAGTGTT GACTCTTACC
3061 CTCTTTGAAG ATCGGGAAAT GATTGAGGAA AGACTAAAAA CATACGCTCA CCTGTTCGAC
3121 GATAAGGTTA TGAAACAGTT AAAGAGGCGT CGCTATACGG GCTGGGGACG ATTGTCGCGG
3181 AAACTTATCA ACGGGATAAG AGACAAGCAA AGTGGTAAAA CTATTCTCGA TTTTCTAAAG
3241 AGCGACGGCT TCGCCAATAG GAACTTTATG CAGCTGATCC ATGATGACTC TTTAACCTTC
3301 AAAGAGGATA TACAAAAGGC ACAGGTTTCC GGACAAGGGG ACTCATTGCA CGAACATATT
3361 GCGAATCTTG CTGGTTCGCC AGCCATCAAA AAGGGCATAC TCCAGACAGT CAAAGTAGTG
3421 GATGAGCTAG TTAAGGTCAT GGGACGTCAC AAACCGGAAA ACATTGTAAT CGAGATGGCA
3481 CGCGAAAATC AAACGACTCA GAAGGGGCAA AAAAACAGTC GAGAGCGGAT GAAGAGAATA
3541 GAAGAGGGTA TTAAAGAACT GGGCAGCCAG ATCTTAAAGG AGCATCCTGT GGAAAATACC
3601 CAATTGCAGA ACGAGAAACT TTACCTCTAT TACCTACAAA ATGGAAGGGA CATGTATGTT
3661 GATCAGGAAC TGGACATAAA CCGTTTATCT GATTACGACG TCGATCACAT TGTACCCCAA
3721 TCCTTTTTGA AGGACGATTC AATCGACAAT AAAGTGCTTA CACGCTCGGA TAAGAACCGA
3781 GGGAAAAGTG ACAATGTTCC AAGCGAGGAA GTCGTAAAGA AAATGAAGAA CTATTGGCGG
3841 CAGCTCCTAA ATGCGAAACT GATAACGCAA AGAAAGTTCG ATAACTTAAC TAAAGCTGAG
3901 AGGGGTGGCT TGTCTGAACT TGACAAGGCC GGATTTATTA AACGTCAGCT CGTGGAAACC
3961 CGCCAAATCA CAAAGCATGT TGCACAGATA CTAGATTCCC GAATGAATAC GAAATACGAC
4021 GAGAACGATA AGCTGATTCG GGAAGTCAAA GTAATCACTT TAAAGTCAAA ATTGGTGTCG
4081 GACTTCAGAA AGGATTTTCA ATTCTATAAA GTTAGGGAGA TAAATAACTA CCACCATGCG
4141 CACGACGCTT ATCTTAATGC CGTCGTAGGG ACCGCACTCA TTAAGAAATA CCCGAAGCTA
4201 GAAAGTGAGT TTGTGTATGG TGATTACAAA GTTTATGACG TCCGTAAGAT GATCGCGAAA
4261 AGCGAACAGG AGATAGGCAA GGCTACAGCC AAATACTTCT TTTATTCTAA CATTATGAAT
4321 TTCTTTAAGA CGGAAATCAC TCTGGCAAAC GGAGAGATAC GCAAACGACC TTTAATTGAA
4381 ACCAATGGGG AGACAGGTGA AATCGTATGG GATAAGGGCC GGGACTTCGC GACGGTGAGA
4441 AAAGTTTTGT CCATGCCCCA AGTCAACATA GTAAAGAAAA CTGAGGTGCA GACCGGAGGG
4501 TTTTCAAAGG AATCGATTCT TCCAAAAAGG AATAGTGATA AGCTCATCGC TCGTAAAAAG
4561 GACTGGGACC CGAAAAAGTA CGGTGGCTTC GATAGCCCTA CAGTTGCCTA TTCTGTCCTA
4621 GTAGTGGCAA AAGTTGAGAA GGGAAAATCC AAGAAACTGA AGTCAGTCAA AGAATTATTG
4681 GGGATAACGA TTATGGAGCG CTCGTCTTTT GAAAAGAACC CCATCGACTT CCTTGAGGCG
4741 AAAGGTTACA AGGAAGTAAA AAAGGATCTC ATAATTAAAC TACCAAAGTA TAGTCTGTTT
4801 GAGTTAGAAA ATGGCCGAAA ACGGATGTTG GCTAGCGCCG GAGAGCTTCA AAAGGGGAAC
4861 GAACTCGCAC TACCGTCTAA ATACGTGAAT TTCCTGTATT TAGCGTCCCA TTACGAGAAG
4921 TTGAAAGGTT CACCTGAAGA TAACGAACAG AAGCAACTTT TTGTTGAGCA GCACAAACAT
4981 TATCTCGACG AAATCATAGA GCAAATTTCG GAATTCAGTA AGAGAGTCAT CCTAGCTGAT
5041 GCCAATCTGG ACAAAGTATT AAGCGCATAC AACAAGCACA GGGATAAACC CATACGTGAG
5101 CAGGCGGAAA ATATTATCCA TTTGTTTACT CTTACCAACC TCGGCGCTCC AGCCGCATTC
5161 AAGTATTTTG ACACAACGAT AGATCGCAAA CGATACACTT CTACCAAGGA GGTGCTAGAC
5221 GCGACACTGA TTCACCAATC CATCACGGGA TTATATGAAA CTCGGATAGA TTTGTCACAG
5281 CTTGGGGGTG ACTCTGGTGG TTCTGGAGGA TCTGGTGGTT CTACTAATCT GTCAGATATT
5341 ATTGAAAAGG AGACCGGTAA GCAACTGGTT ATCCAGGAAT CCATCCTCAT GCTCCCAGAG
5401 GAGGTGGAAG AAGTCATTGG GAACAAGCCG GAAAGCGATA TACTCGTGCA CACCGCCTAC
5461 GACGAGAGCA CCGACGAGAA TGTCATGCTT CTGACTAGCG ACGCCCCTGA ATACAAGCCT
5521 TGGGCTCTGG TCATACAGGA TAGCAACGGT GAGAACAAGA TTAAGATGCT CTCTGGTGGT
5581 TCTGGAGGAT CTGGTGGTTC TACTAATCTG TCAGATATTA TTGAAAAGGA GACCGGTAAG
5641 CAACTGGTTA TCCAGGAATC CATCCTCATG CTCCCAGAGG AGGTGGAAGA AGTCATTGGG
5701 AACAAGCCGG AAAGCGATAT ACTCGTGCAC ACCGCCTACG ACGAGAGCAC CGACGAGAAT
5761 GTCATGCTTC TGACTAGCGA CGCCCCTGAA TACAAGCCTT GGGCTCTGGT CATACAGGAT
5821 AGCAACGGTG AGAACAAGAT TAAGATGCTC TCTGGTGGTT CTCCCAAGAA GAAGAGGAAA
5881 GTCTAACCGG TCATCATCAC CATCACCATT GAGTTTAAAC CCGCTGATCA GCCTCGACTG
5941 TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG
6001 AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA
6061 GTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG
6121 AAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA
6181 CCAGCTGGGG CTCGATACCG TCGACCTCTA GCTAGAGCTT GGCGTAATCA TGGTCATAGC
6241 TGTTTCCTGT GTGAAATTGT TATCCGCTCA CAATTCCACA CAACATACGA GCCGGAAGCA
6301 TAAAGTGTAA AGCCTAGGGT GCCTAATGAG TGAGCTAACT CACATTAATT GCGTTGCGCT
6361 CACTGCCCGC TTTCCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT GCATTAATGA ATCGGCCAAC
6421 GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC
6481 TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
6541 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG
6601 CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG
6661 AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT
6721 ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA
6781 CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
6841 GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC
6901 CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA
6961 GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG
7021 TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGAACAG
7081 TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT
7141 GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA
7201 CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC
7261 AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA
7321 CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA
7381 CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT
7441 TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT
7501 TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT
7561 TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT
7621 CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA
7681 ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG
7741 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT
7801 TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG
7861 CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG
7921 TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC
7981 GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA TACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA
8041 CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC
8101 CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT
8161 TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG
8221 GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA
8281 GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA
8341 AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC GACGGATCGG
8401 GAGATCGATC TCCCGATCCC CTAGGGTCGA CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT
8461 AGTTAAGCCA GTATCTGCTC CCTGCTTGTG TGTTGGAGGT CGCTGAGTAG TGCGCGAGCA
8521 AAATTTAAGC TACAACAAGG CAAGGCTTGA CCGACAATTG CATGAAGAAT CTGCTTAGGG
8581 TTAGGCGTTT TGCGCTGCTT CGCGATGTAC GGGCCAGATA TACGCGTTGA CATTGATTAT
8641 TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT
8701 TCCGCGTTAC ATAACTTACG GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC
8761 CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC
8821 GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATC

一部の実施形態では、シチジン塩基エディターは、ＢＥ４であり、以下のうちの１つから選択される核酸配列を有する：

元のＢＥ４核酸配列：
ＡＴＧａｇｃｔｃａｇａｇａｃｔｇｇｃｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｃｃａｃａｔｔｇａｇａｃｇｇｃｇｇａｔｃｇａｇｃｃｃｃａｔｇａｇｔｔｔｇａｇｇｔａｔｔｃｔｔｃｇａｔｃｃｇａｇａｇａｇｃｔｃｃｇｃａａｇｇａｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｔｔａｃｇａａａｔｔａａｔｔｇｇｇｇｇｇｇｃｃｇｇｃａｃｔｃｃａｔｔｔｇｇｃｇａｃａｔａｃａｔｃａｃａｇａａｃａｃｔａａｃａａｇｃａｃｇｔｃｇａａｇｔｃａａｃｔｔｃａｔｃｇａｇａａｇｔｔｃａｃｇａｃａｇａａａｇａｔａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｇａａｃａｃａａｇｇｔｇｃａｇｃａｔｔａｃｃｔｇｇｔｔｔｃｔｃａｇｃｔｇｇａｇｃｃｇｃｇａａｔｇｔａｇｔａｇｇｇｃｃａｔｃａｃｔｇａａｔｔｃｃｔｇｔｃａａｇｇｔａｔｃｃｃｃａｃｇｔｃａｃｔｃｔｇｔｔｔａｔｔｔａｃａｔｃｇｃａａｇｇｃｔｇｔａｃｃａｃｃａｃｇｃｔｇａｃｃｃｃｃｇｃａａｔｃｇａｃａａｇｇｃｃｔｇｃｇｇｇａｔｔｔｇａｔｃｔｃｔｔｃａｇｇｔｇｔｇａｃｔａｔｃｃａａａｔｔａｔｇａｃｔｇａｇｃａｇｇａｇｔｃａｇｇａｔａｃｔｇｃｔｇｇａｇａａａｃｔｔｔｇｔｇａａｔｔａｔａｇｃｃｃｇａｇｔａａｔｇａａｇｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｔａｇｇｔａｔｃｃｃｃａｔｃｔｇｔｇｇｇｔａｃｇａｃｔｇｔａｃｇｔｔｃｔｔｇａａｃｔｇｔａｃｔｇｃａｔｃａｔａｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｃｔｃｃｔｔｇｔｃｔｃａａｃａｔｔｃｔｇａｇａａｇｇａａｇｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｇａｃａｔｔｃｔｔｔａｃｃａｔｃｇｃｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｔｇｔｃａｔｔａｃｃａｇｃｇａｃｔｇｃｃｃｃｃａｃａｃａｔｔｃｔｃｔｇｇｇｃｃａｃｃｇｇｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇａｇａｃｔｃｃｃｇｇｇａｃｃｔｃａｇａｇｔｃｃｇｃｃａｃａｃｃｃｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔｇａｔａａａａａｇｔａｔｔｃｔａｔｔｇｇｔｔｔａｇｃｃａｔｃｇｇｃａｃｔａａｔｔｃｃｇｔｔｇｇａｔｇｇｇｃｔｇｔｃａｔａａｃｃｇａｔｇａａｔａｃａａａｇｔａｃｃｔｔｃａａａｇａａａｔｔｔａａｇｇｔｇｔｔｇｇｇｇａａｃａｃａｇａｃｃｇｔｃａｔｔｃｇａｔｔａａａａａｇａａｔｃｔｔａｔｃｇｇｔｇｃｃｃｔｃｃｔａｔｔｃｇａｔａｇｔｇｇｃｇａａａｃｇｇｃａｇａｇｇｃｇａｃｔｃｇｃｃｔｇａａａｃｇａａｃｃｇｃｔｃｇｇａｇａａｇｇｔａｔａｃａｃｇｔｃｇｃａａｇａａｃｃｇａａｔａｔｇｔｔａｃｔｔａｃａａｇａａａｔｔｔｔｔａｇｃａａｔｇａｇａｔｇｇｃｃａａａｇｔｔｇａｃｇａｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｃａｃｃｇｔｔｔｇｇａａｇａｇｔｃｃｔｔｃｃｔｔｇｔｃｇａａｇａｇｇａｃａａｇａａａｃａｔｇａａｃｇｇｃａｃｃｃｃａｔｃｔｔｔｇｇａａａｃａｔａｇｔａｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａｔａｔｃａｔｇａａａａｇｔａｃｃｃａａｃｇａｔｔｔａｔｃａｃｃｔｃａｇａａａａａａｇｃｔａｇｔｔｇａｃｔｃａａｃｔｇａｔａａａｇｃｇｇａｃｃｔｇａｇｇｔｔａａｔｃｔａｃｔｔｇｇｃｔｃｔｔｇｃｃｃａｔａｔｇａｔａａａｇｔｔｃｃｇｔｇｇｇｃａｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｇａｇｇｇｔｇａｔｃｔａａａｔｃｃｇｇａｃａａｃｔｃｇｇａｔｇｔｃｇａｃａａａｃｔｇｔｔｃａｔｃｃａｇｔｔａｇｔａｃａａａｃｃｔａｔａａｔｃａｇｔｔｇｔｔｔｇａａｇａｇａａｃｃｃｔａｔａａａｔｇｃａａｇｔｇｇｃｇｔｇｇａｔｇｃｇａａｇｇｃｔａｔｔｃｔｔａｇｃｇｃｃｃｇｃｃｔｃｔｃｔａａａｔｃｃｃｇａｃｇｇｃｔａｇａａａａｃｃｔｇａｔｃｇｃａｃａａｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｇａａｇａａａａａｔｇｇｇｔｔｇｔｔｃｇｇｔａａｃｃｔｔａｔａｇｃｇｃｔｃｔｃａｃｔａｇｇｃｃｔｇａｃａｃｃａａａｔｔｔｔａａｇｔｃｇａａｃｔｔｃｇａｃｔｔａｇｃｔｇａａｇａｔｇｃｃａａａｔｔｇｃａｇｃｔｔａｇｔａａｇｇａｃａｃｇｔａｃｇａｔｇａｃｇａｔｃｔｃｇａｃａａｔｃｔａｃｔｇｇｃａｃａａａｔｔｇｇａｇａｔｃａｇｔａｔｇｃｇｇａｃｔｔａｔｔｔｔｔｇｇｃｔｇｃｃａａａａａｃｃｔｔａｇｃｇａｔｇｃａａｔｃｃｔｃｃｔａｔｃｔｇａｃａｔａｃｔｇａｇａｇｔｔａａｔａｃｔｇａｇａｔｔａｃｃａａｇｇｃｇｃｃｇｔｔａｔｃｃｇｃｔｔｃａａｔｇａｔｃａａａａｇｇｔａｃｇａｔｇａａｃａｔｃａｃｃａａｇａｃｔｔｇａｃａｃｔｔｃｔｃａａｇｇｃｃｃｔａｇｔｃｃｇｔｃａｇｃａａｃｔｇｃｃｔｇａｇａａａｔａｔａａｇｇａａａｔａｔｔｃｔｔｔｇａｔｃａｇｔｃｇａａａａａｃｇｇｇｔａｃｇｃａｇｇｔｔａｔａｔｔｇａｃｇｇｃｇｇａｇｃｇａｇｔｃａａｇａｇｇａａｔｔｃｔａｃａａｇｔｔｔａｔｃａａａｃｃｃａｔａｔｔａｇａｇａａｇａｔｇｇａｔｇｇｇａｃｇｇａａｇａｇｔｔｇｃｔｔｇｔａａａａｃｔｃａａｔｃｇｃｇａａｇａｔｃｔａｃｔｇｃｇａａａｇｃａｇｃｇｇａｃｔｔｔｃｇａｃａａｃｇｇｔａｇｃａｔｔｃｃａｃａｔｃａａａｔｃｃａｃｔｔａｇｇｃｇａａｔｔｇｃａｔｇｃｔａｔａｃｔｔａｇａａｇｇｃａｇｇａｇｇａｔｔｔｔｔａｔｃｃｇｔｔｃｃｔｃａａａｇａｃａａｔｃｇｔｇａａａａｇａｔｔｇａｇａａａａｔｃｃｔａａｃｃｔｔｔｃｇｃａｔａｃｃｔｔａｃｔａｔｇｔｇｇｇａｃｃｃｃｔｇｇｃｃｃｇａｇｇｇａａｃｔｃｔｃｇｇｔｔｃｇｃａｔｇｇａｔｇａｃａａｇａａａｇｔｃｃｇａａｇａａａｃｇａｔｔａｃｔｃｃａｔｇｇａａｔｔｔｔｇａｇｇａａｇｔｔｇｔｃｇａｔａａａｇｇｔｇｃｇｔｃａｇｃｔｃａａｔｃｇｔｔｃａｔｃｇａｇａｇｇａｔｇａｃｃａａｃｔｔｔｇａｃａａｇａａｔｔｔａｃｃｇａａｃｇａａａａａｇｔａｔｔｇｃｃｔａａｇｃａｃａｇｔｔｔａｃｔｔｔａｃｇａｇｔａｔｔｔｃａｃａｇｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｃａｃｇａａａｇｔｔａａｇｔａｔｇｔｃａｃｔｇａｇｇｇｃａｔｇｃｇｔａａａｃｃｃｇｃｃｔｔｔｃｔａａｇｃｇｇａｇａａｃａｇａａｇａａａｇｃａａｔａｇｔａｇａｔｃｔｇｔｔａｔｔｃａａｇａｃｃａａｃｃｇｃａａａｇｔｇａｃａｇｔｔａａｇｃａａｔｔｇａａａｇａｇｇａｃｔａｃｔｔｔａａｇａａａａｔｔｇａａｔｇｃｔｔｃｇａｔｔｃｔｇｔｃｇａｇａｔｃｔｃｃｇｇｇｇｔａｇａａｇａｔｃｇａｔｔｔａａｔｇｃｇｔｃａｃｔｔｇｇｔａｃｇｔａｔｃａｔｇａｃｃｔｃｃｔａａａｇａｔａａｔｔａａａｇａｔａａｇｇａｃｔｔｃｃｔｇｇａｔａａｃｇａａｇａｇａａｔｇａａｇａｔａｔｃｔｔａｇａａｇａｔａｔａｇｔｇｔｔｇａｃｔｃｔｔａｃｃｃｔｃｔｔｔｇａａｇａｔｃｇｇｇａａａｔｇａｔｔｇａｇｇａａａｇａｃｔａａａａａｃａｔａｃｇｃｔｃａｃｃｔｇｔｔｃｇａｃｇａｔａａｇｇｔｔａｔｇａａａｃａｇｔｔａａａｇａｇｇｃｇｔｃｇｃｔａｔａｃｇｇｇｃｔｇｇｇｇａｃｇａｔｔｇｔｃｇｃｇｇａａａｃｔｔａｔｃａａｃｇｇｇａｔａａｇａｇａｃａａｇｃａａａｇｔｇｇｔａａａａｃｔａｔｔｃｔｃｇａｔｔｔｔｃｔａａａｇａｇｃｇａｃｇｇｃｔｔｃｇｃｃａａｔａｇｇａａｃｔｔｔａｔｇｃａｇｃｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｃｔｃｔｔｔａａｃｃｔｔｃａａａｇａｇｇａｔａｔａｃａａａａｇｇｃａｃａｇｇｔｔｔｃｃｇｇａｃａａｇｇｇｇａｃｔｃａｔｔｇｃａｃｇａａｃａｔａｔｔｇｃｇａａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｔｔｃｇｃｃａｇｃｃａｔｃａａａａａｇｇｇｃａｔａｃｔｃｃａｇａｃａｇｔｃａａａｇｔａｇｔｇｇａｔｇａｇｃｔａｇｔｔａａｇｇｔｃａｔｇｇｇａｃｇｔｃａｃａａａｃｃｇｇａａａａｃａｔｔｇｔａａｔｃｇａｇａｔｇｇｃａｃｇｃｇａａａａｔｃａａａｃｇａｃｔｃａｇａａｇｇｇｇｃａａａａａａａｃａｇｔｃｇａｇａｇｃｇｇａｔｇａａｇａｇａａｔａｇａａｇａｇｇｇｔａｔｔａａａｇａａｃｔｇｇｇｃａｇｃｃａｇａｔｃｔｔａａａｇｇａｇｃａｔｃｃｔｇｔｇｇａａａａｔａｃｃｃａａｔｔｇｃａｇａａｃｇａｇａａａｃｔｔｔａｃｃｔｃｔａｔｔａｃｃｔａｃａａａａｔｇｇａａｇｇｇａｃａｔｇｔａｔｇｔｔｇａｔｃａｇｇａａｃｔｇｇａｃａｔａａａｃｃｇｔｔｔａｔｃｔｇａｔｔａｃｇａｃｇｔｃｇａｔｃａｃａｔｔｇｔａｃｃｃｃａａｔｃｃｔｔｔｔｔｇａａｇｇａｃｇａｔｔｃａａｔｃｇａｃａａｔａａａｇｔｇｃｔｔａｃａｃｇｃｔｃｇｇａｔａａｇａａｃｃｇａｇｇｇａａａａｇｔｇａｃａａｔｇｔｔｃｃａａｇｃｇａｇｇａａｇｔｃｇｔａａａｇａａａａｔｇａａｇａａｃｔａｔｔｇｇｃｇｇｃａｇｃｔｃｃｔａａａｔｇｃｇａａａｃｔｇａｔａａｃｇｃａａａｇａａａｇｔｔｃｇａｔａａｃｔｔａａｃｔａａａｇｃｔｇａｇａｇｇｇｇｔｇｇｃｔｔｇｔｃｔｇａａｃｔｔｇａｃａａｇｇｃｃｇｇａｔｔｔａｔｔａａａｃｇｔｃａｇｃｔｃｇｔｇｇａａａｃｃｃｇｃｃａａａｔｃａｃａａａｇｃａｔｇｔｔｇｃａｃａｇａｔａｃｔａｇａｔｔｃｃｃｇａａｔｇａａｔａｃｇａａａｔａｃｇａｃｇａｇａａｃｇａｔａａｇｃｔｇａｔｔｃｇｇｇａａｇｔｃａａａｇｔａａｔｃａｃｔｔｔａａａｇｔｃａａａａｔｔｇｇｔｇｔｃｇｇａｃｔｔｃａｇａａａｇｇａｔｔｔｔｃａａｔｔｃｔａｔａａａｇｔｔａｇｇｇａｇａｔａａａｔａａｃｔａｃｃａｃｃａｔｇｃｇｃａｃｇａｃｇｃｔｔａｔｃｔｔａａｔｇｃｃｇｔｃｇｔａｇｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃａｔｔａａｇａａａｔａｃｃｃｇａａｇｃｔａｇａａａｇｔｇａｇｔｔｔｇｔｇｔａｔｇｇｔｇａｔｔａｃａａａｇｔｔｔａｔｇａｃｇｔｃｃｇｔａａｇａｔｇａｔｃｇｃｇａａａａｇｃｇａａｃａｇｇａｇａｔａｇｇｃａａｇｇｃｔａｃａｇｃｃａａａｔａｃｔｔｃｔｔｔｔａｔｔｃｔａａｃａｔｔａｔｇａａｔｔｔｃｔｔｔａａｇａｃｇｇａａａｔｃａｃｔｃｔｇｇｃａａａｃｇｇａｇａｇａｔａｃｇｃａａａｃｇａｃｃｔｔｔａａｔｔｇａａａｃｃａａｔｇｇｇｇａｇａｃａｇｇｔｇａａａｔｃｇｔａｔｇｇｇａｔａａｇｇｇｃｃｇｇｇａｃｔｔｃｇｃｇａｃｇｇｔｇａｇａａａａｇｔｔｔｔｇｔｃｃａｔｇｃｃｃｃａａｇｔｃａａｃａｔａｇｔａａａｇａａａａｃｔｇａｇｇｔｇｃａｇａｃｃｇｇａｇｇｇｔｔｔｔｃａａａｇｇａａｔｃｇａｔｔｃｔｔｃｃａａａａａｇｇａａｔａｇｔｇａｔａａｇｃｔｃａｔｃｇｃｔｃｇｔａａａａａｇｇａｃｔｇｇｇａｃｃｃｇａａａａａｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｔｃｇａｔａｇｃｃｃｔａｃａｇｔｔｇｃｃｔａｔｔｃｔｇｔｃｃｔａｇｔａｇｔｇｇｃａａａａｇｔｔｇａｇａａｇｇｇａａａａｔｃｃａａｇａａａｃｔｇａａｇｔｃａｇｔｃａａａｇａａｔｔａｔｔｇｇｇｇａｔａａｃｇａｔｔａｔｇｇａｇｃｇｃｔｃｇｔｃｔｔｔｔｇａａａａｇａａｃｃｃｃａｔｃｇａｃｔｔｃｃｔｔｇａｇｇｃｇａａａｇｇｔｔａｃａａｇｇａａｇｔａａａａａａｇｇａｔｃｔｃａｔａａｔｔａａａｃｔａｃｃａａａｇｔａｔａｇｔｃｔｇｔｔｔｇａｇｔｔａｇａａａａｔｇｇｃｃｇａａａａｃｇｇａｔｇｔｔｇｇｃｔａｇｃｇｃｃｇｇａｇａｇｃｔｔｃａａａａｇｇｇｇａａｃｇａａｃｔｃｇｃａｃｔａｃｃｇｔｃｔａａａｔａｃｇｔｇａａｔｔｔｃｃｔｇｔａｔｔｔａｇｃｇｔｃｃｃａｔｔａｃｇａｇａａｇｔｔｇａａａｇｇｔｔｃａｃｃｔｇａａｇａｔａａｃｇａａｃａｇａａｇｃａａｃｔｔｔｔｔｇｔｔｇａｇｃａｇｃａｃａａａｃａｔｔａｔｃｔｃｇａｃｇａａａｔｃａｔａｇａｇｃａａａｔｔｔｃｇｇａａｔｔｃａｇｔａａｇａｇａｇｔｃａｔｃｃｔａｇｃｔｇａｔｇｃｃａａｔｃｔｇｇａｃａａａｇｔａｔｔａａｇｃｇｃａｔａｃａａｃａａｇｃａｃａｇｇｇａｔａａａｃｃｃａｔａｃｇｔｇａｇｃａｇｇｃｇｇａａａａｔａｔｔａｔｃｃａｔｔｔｇｔｔｔａｃｔｃｔｔａｃｃａａｃｃｔｃｇｇｃｇｃｔｃｃａｇｃｃｇｃａｔｔｃａａｇｔａｔｔｔｔｇａｃａｃａａｃｇａｔａｇａｔｃｇｃａａａｃｇａｔａｃａｃｔｔｃｔａｃｃａａｇｇａｇｇｔｇｃｔａｇａｃｇｃｇａｃａｃｔｇａｔｔｃａｃｃａａｔｃｃａｔｃａｃｇｇｇａｔｔａｔａｔｇａａａｃｔｃｇｇａｔａｇａｔｔｔｇｔｃａｃａｇｃｔｔｇｇｇｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔａｃｔａａｔｃｔｇｔｃａｇａｔａｔｔａｔｔｇａａａａｇｇａｇａｃｃｇｇｔａａｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｔｃｃａｇｇａａｔｃｃａｔｃｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｇａｇｇｔｇｇａａｇａａｇｔ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ＢＥ４コドン最適化１核酸配列：
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ＢＥ４コドン最適化２核酸配列：
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「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に変化させるように作用することを意味する。一実施形態では、第１の塩基は、第２の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、アデノシンデアミナーゼ活性またはアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性（例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する）、およびアデノシンデアミナーゼ活性またはアデニンデアミナーゼ活性（例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する）である。

一部の実施形態では、塩基編集活性は、編集の効率によって評価される。塩基編集効率は、任意の好適な手段（例えば、サンガー配列決定または次世代配列決定）によって測定され得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、塩基エディターによって実現される核酸塩基変換を伴う全配列決定リードのパーセンテージ（例えば、標的Ａ・Ｔ塩基対がＧ・Ｃ塩基対に変換された、または標的Ｃ・Ｇ塩基対がＴ・Ａ塩基対に変換された全配列決定リードのパーセンテージ）によって測定される。一部の実施形態では、塩基編集効率は、塩基編集が細胞集団において行われる場合、塩基エディターによって実現される核酸塩基変換を有する全細胞のパーセンテージによって測定される。

「塩基エディターシステム」という用語は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するためのシステムを指す。様々な実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、（２）当該核酸塩基を脱アミノ化するためのデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）、および（３）１つ以上のガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニンまたはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、アデノシンデアミナーゼ塩基エディター８（ＡＢＥ８）である。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、単量体構築物である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１－ｍ、ＡＢＥ８．２－ｍ、ＡＢＥ８．３－ｍ、ＡＢＥ８．４－ｍ、ＡＢＥ８．５－ｍ、ＡＢＥ８．６－ｍ、ＡＢＥ８．７－ｍ、ＡＢＥ８．８－ｍ、ＡＢＥ８．９－ｍ、ＡＢＥ８．１０－ｍ、ＡＢＥ８．１１－ｍ、ＡＢＥ８．１２－ｍ、ＡＢＥ８．１３－ｍ、ＡＢＥ８．１４－ｍ、ＡＢＥ８．１５－ｍ、ＡＢＥ８．１６－ｍ、ＡＢＥ８．１７－ｍ、ＡＢＥ８．１８－ｍ、ＡＢＥ８．１９－ｍ、ＡＢＥ８．２０－ｍ、ＡＢＥ８．２１－ｍ、ＡＢＥ８．２２－ｍ、ＡＢＥ８．２３－ｍ、ＡＢＥ８．２４－ｍである。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ヘテロマー構築物である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１－ｄ、ＡＢＥ８．２－ｄ、ＡＢＥ８．３－ｄ、ＡＢＥ８．４－ｄ、ＡＢＥ８．５－ｄ、ＡＢＥ８．６－ｄ、ＡＢＥ８．７－ｄ、ＡＢＥ８．８－ｄ、ＡＢＥ８．９－ｄ、ＡＢＥ８．１０－ｄ、ＡＢＥ８．１１－ｄ、ＡＢＥ８．１２－ｄ、ＡＢＥ８．１３－ｄ、ＡＢＥ８．１４－ｄ、ＡＢＥ８．１５－ｄ、ＡＢＥ８．１６－ｄ、ＡＢＥ８．１７－ｄ、ＡＢＥ８．１８－ｄ、ＡＢＥ８．１９－ｄ、ＡＢＥ８．２０－ｄ、ＡＢＥ８．２１－ｄ、ＡＢＥ８．２２－ｄ、ＡＢＥ８．２３－ｄ、またはＡＢＥ８．２４－ｄである。

一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、２つ以上の塩基編集成分を含んでもよい。例えば、塩基エディターシステムは、２つ以上のデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、１つ以上のシチジンデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、１つ以上のアデノシンデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、シングルガイドポリヌクレオチドを利用して、異なるデアミナーゼを標的核酸配列に標的指向化してもよい。一部の実施形態では、一対のガイドポリヌクレオチドを利用して、異なるデアミナーゼを標的核酸配列に標的指向化してもよい。

塩基エディターシステムの核酸塩基成分およびポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合成分は、互いに共有結合的もしくは非共有結合的に、またはそれらの会合および相互作用の任意の組み合わせで、会合することができる。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって、標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインと非共有結合的に相互作用するか、またはデアミナーゼドメインと会合することによって、デアミナーゼドメインを標的ヌクレオチド配列に標的指向化することができる。例えば、一部の実施形態では、核酸塩基編集成分（例えば、デアミナーゼドメイン）は、追加の異種部分または異種ドメインを含むことができ、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である追加の異種部分または異種ドメインと相互作用し得るか、会合し得るか、もしくは複合体を形成し得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドに結合し得るか、ポリペプチドと相互作用し得るか、ポリペプチドと会合し得るか、またはポリペプチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドに結合し得るか、ポリヌクレオチドと相互作用し得るか、ポリヌクレオチドと会合し得るか、またはポリヌクレオチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合し得る場合がある。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリル（ｓｔｅｒｉｌ）αモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。

塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチド成分をさらに含んでもよい。塩基エディターシステムの成分が、共有結合、非共有結合性相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに会合し得ることを理解されたい。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターシステムの核酸塩基編集成分（例えば、デアミナーゼドメイン）は、追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含むことができ、ガイドポリヌクレオチドの一部分またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る。一部の実施形態では、追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドに結合し得るか、ポリペプチドと相互作用し得るか、ポリペプチドと会合し得るか、またはポリペプチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドに結合し得るか、ポリヌクレオチドと相互作用し得るか、ポリヌクレオチドと会合し得るか、またはポリヌクレオチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合し得る場合がある。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。

一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、塩基除去修復（ＢＥＲ）成分の阻害因子をさらに含み得る。塩基エディターシステムの成分が、共有結合、非共有結合性相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに会合し得ることを理解されたい。ＢＥＲ成分の阻害因子は、ＢＥＲ阻害因子を含み得る。一部の実施形態では、ＢＥＲの阻害因子は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）であり得る。一部の実施形態では、ＢＥＲの阻害因子は、イノシンＢＥＲ阻害因子であり得る。一部の実施形態では、ＢＥＲの阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって、標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ＢＥＲの阻害因子に融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよびＢＥＲ阻害因子に融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ＢＥＲの阻害因子と非共有結合的に相互作用するか、またはＢＥＲの阻害因子と会合することによって、ＢＥＲの阻害因子を標的ヌクレオチド配列に標的指向化することができる。例えば、一部の実施形態では、ＢＥＲ成分の阻害因子は、追加の異種部分または異種ドメインを含むことができ、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である追加の異種部分または異種ドメインと相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る。

一部の実施形態では、ＢＥＲの阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドによって、標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。例えば、一部の実施形態では、ＢＥＲの阻害因子は、追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含むことができ、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドの追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、ＢＥＲの阻害剤に融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドに結合し得るか、ポリヌクレオチドと相互作用し得るか、ポリヌクレオチドと会合し得るか、またはポリヌクレオチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合し得る場合がある。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。

「β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリペプチド」とは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ６１７６９またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なＢ２Ｍポリペプチド配列を以下に提供する。
＞ｓｐ｜Ｐ６１７６９｜Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ β２マイクログロブリンＯＳ＝ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＯＸ＝９６０６ＧＮ＝Ｂ２ＭＰＥ＝１ＳＶ＝１
ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭ

「β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ポリヌクレオチド」とは、Ｂ２Ｍポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。β２マイクログロブリン遺伝子は、主要組織適合複合体と会合した血清タンパク質をコードする。Ｂ２Ｍは、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞による非自己認識に関与している。例示的なＢ２Ｍポリヌクレオチド配列を以下に提供する。
＞ＤＱ２１７９３３．１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ β２ミクログロビン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、完全長ＣＤＳ
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ＣＴＴＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡＣＴＴＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＴＡＴＡＧＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＣＴＣＴＡＣＴＡＧＡＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＣＡＴＧＴＡＧＡＣＴＣＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＴＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＡＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＣＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＴＧＴＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＧＴＣＡＣＧＧＴＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＧＴＡＡＡＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＡＧＴＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＴＧＴＣＴＴＴＴＣＣＣＧＡＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＡＡＧＴＣＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＣＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＡＣＴＡＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＴＡＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡＣＴＣＴＴＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＴＡＴＴＴＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＴＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＴＡＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＴＡＡＣＡＴＧＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＧＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＡＴＡＣＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＧＧＴＴＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＣＴＡＴＡＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＧＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＧＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＣＡＴＧＧＴＡＴＡＧＣＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＡＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＧＴＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＡＡＣＡＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＧＴＡＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＡＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＴＡＧＧＧＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＡＡＧＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＡＡＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧＴＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＡＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＴＡＣＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＡＴＴＴＡＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣＣＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＡＴＡＣＣＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＡＡＧＡＣＡＣＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＧＧＡＡＧＧＣＣＣＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡ

「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ドメイン」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性、不活性、もしくは部分的に活性なＤＮＡ切断ドメイン、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（「クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復」）関連ヌクレアーゼとも呼ばれることがある。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝要素（ウイルス、転位要素、および接合性プラスミド）に対する保護を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行可動要素に相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターが転写され、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に加工される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｃｒＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）の正しいプロセシングには、トランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９タンパク質が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼ３支援プロセシングのガイドとして機能する。続いて、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖または環状のｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ分解的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まず、エンドヌクレアーゼ分解的に切断され、次いで、３’－５’エキソヌクレアーゼ分解的にトリミングされる。本質的に、ＤＮＡ結合およびＤＮＡ切断は、典型的には、タンパク質および両方のＲＮＡを必要とする。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の態様を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作することができる。例えば、ＪｉｎｅｋＭ．，ｅｔａｌ．，ＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒＥ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己の区別を助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知である（例えば、“ＣｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎＭ１ｓｔｒａｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ．”Ｆｅｒｒｅｔｔｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）、“ＣＲＩＳＰＲＲＮＡｍａｔｕｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌＲＮＡａｎｄｈｏｓｔｆａｃｔｏｒＲＮａｓｅＩＩＩ．”ＤｅｌｔｃｈｅｖａＥ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４７１：６０２－６０７（２０１１）、および“Ａｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ．”ＪｉｎｅｋＭ．，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい（その各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９オーソログは、これらに限定されないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む様々な種で記載されている。さらなる好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて、当業者には明らかであり、かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，“ＴｈｅｔｒａｃｒＲＮＡａｎｄＣａｓ９ｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｔｙｐｅＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｉｍｍｕｎｉｔｙｓｙｓｔｅｍｓ”（２０１３）ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ１０：５，７２６－７３７に開示されている生物および遺伝子座に由来するＣａｓ９配列が含まれる（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質は、互換的に、「ｄＣａｓ９」タンパク質（ヌクレアーゼ－「不活性型（ｄｅａｄ）」Ｃａｓ９の場合）または触媒不活性Ｃａｓ９と称され得る。不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成するための方法は既知である。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１（２０１２）、Ｑｉｅｔａｌ．，“ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ－ＧｕｉｄｅｄＰｌａｔｆｏｒｍｆｏｒＳｅｑｕｅｎｃｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＣｏｎｔｒｏｌｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（２０１３）Ｃｅｌｌ．２８；１５２（５）：１１７３－８３を参照されたい（それらの各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン（ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメイン）を含むことが知られている。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的な鎖を切断し、一方、ＲｕｖＣ１サブドメインは、非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をサイレンシングすることができる。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１（２０１２）；Ｑｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２８；１５２（５）：１１７３－８３（２０１３））。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１つ以上の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に、部分的もしくは全体的に対応するか、またはそれを含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、別のＣａｓ９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異または対応する変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例えば、不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有し、すなわち、（「ニッカーゼ」Ｃａｓ９の場合）Ｃａｓ９は、ニッカーゼであり、「ｎＣａｓ９」タンパク質と称される。追加のＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９）は、そのバリアントおよびホモログを含めて、本開示の範囲内であることを理解されたい。例示的なＣａｓ９タンパク質としては、本明細書に提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９である。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、以下の２つのＣａｓ９ドメインのうちの１つを含む：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン、または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン。一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその断片を含むタンパク質は、「Ｃａｓ９バリアント」と称される。Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９またはその断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、そのため、その断片は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。

一部の実施形態では、断片は、少なくとも１００アミノ酸長である。一部の実施形態では、断片は、長さが少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または少なくとも１３００アミノ酸長である。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１２８４．１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１７８６１．１）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１８４６．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１３１４．１）、Ｂｅｌｌｉｅｌｌａｂａｌｔｉｃａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８０１０．１）、ＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓｔｏｒｑｕｉｓＩ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８７２１．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿８２０８３２．１）、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿４７２０７３．１）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４４９００．１）またはＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４２１００．１）に由来するＣａｓ９、または任意の他の生物由来のＣａｓ９を指す。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍｅ）に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｎｍｅ１、Ｎｍｅ２またはＮｍｅ３である。一部の実施形態では、Ｎｍｅ１、Ｎｍｅ２、またはＮｍｅ３のＰＡＭ相互作用ドメインは、それぞれ、Ｎ_４ＧＡＴ、Ｎ_４ＣＣ、およびＮ_４ＣＡＡＡである（例えば、Ｅｄｒａｋｉ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＡＣｏｍｐａｃｔ，Ｈｉｇｈ－ＡｃｃｕｒａｃｙＣａｓ９ｗｉｔｈａＤｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰＡＭｆｏｒＩｎＶｉｖｏＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｉｎｇ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ（２０１８）を参照されたい）。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列（例えば、本明細書に提供されるＣａｓ９配列のうちの１つ）を含む。しかしながら、他の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、全長Ｃａｓ９配列を含まず、１つ以上のその断片のみを含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９断片を含み、断片は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに結合するが、機能的ヌクレアーゼドメインを含まない（例えば、ヌクレアーゼドメインの切断型バージョンのみを含むか、またはヌクレアーゼドメインを全く含まない）。

好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片の例示的なアミノ酸配列が本明細書に提供され、Ｃａｓ９ドメインおよび断片のさらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、単細胞性原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌）由来のＣａｓ９を指す。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹを指し、これらは、例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，“ＮｅｗＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓｆｒｏｍｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｍｉｃｒｏｂｅｓ．”ＣｅｌｌＲｅｓ．２０１７Ｆｅｂ２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１７．２１に記載されている（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。ゲノム解像メタゲノミクスを使用して、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが同定されており、生命の古細菌ドメインで最初に報告されたＣａｓ９が含まれる。この多岐にわたるＣａｓ９タンパク質は、活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの一部として、ほとんど研究されていなかったナノ古細菌において見出された。細菌では、これまでに知られていなかった２つの系、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＹが発見されたが、これらは、これまでに発見された中で最もコンパクトなシステムのうちの１つである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸ、またはＣａｓＸのバリアントを指す。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ＣａｓＹ、またはＣａｓＹのバリアントを指す。他のＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）として使用されてもよく、それらが本開示の範囲内であることを理解されたい。

特定の実施形態では、本発明の方法で有用なｎａｐＤＮＡｂｐｓには、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｏａｋｅｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１７６，２５４－２６７，２０１９に記載されている円順列変異体が含まれる。

塩基エディターに組み込まれ得るポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。

一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）または本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかは、ＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質であり得る。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＸタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＹタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に記載の任意のＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示に従って、他の細菌種由来のＣａｓＸおよびＣａｓＹも使用され得ることを理解されたい。

「Ｃａｓ１２ｂ」または「Ｃａｓ１２ｂドメイン」という用語は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１タンパク質またはその断片（例えば、Ｃａｓ１２ｂの活性、不活性、もしくは部分的に活性なＤＮＡ切断ドメイン、および／またはＣａｓ１２ｂのｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す（これらの各々の内容は、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ１２ｂオーソログには、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｅｎｇｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＤｉｓｃｏｖ．２０１８Ｎｏｖ２７；４：６３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３が含まれるが、これらに限定されない。さらなる好適なＣａｓ１２ｂヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて、当業者には明らかであろう。

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂまたはその断片を含むタンパク質は、「Ｃａｓ１２ｂバリアント」と称される。Ｃａｓ１２ｂバリアントは、Ｃａｓ１２ｂまたはその断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ１２ｂバリアントは、野生型Ｃａｓ１２ｂと、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂバリアントは、野生型Ｃａｓ１２ｂと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂバリアントは、Ｃａｓ１２ｂの断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、そのため、その断片は、野生型Ｃａｓ１２ｂの対応する断片と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、断片は、対応する野生型Ｃａｓ１２ｂのアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。例示的なＣａｓ１２ｂポリペプチドは、本明細書に列挙されている。

「Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）ポリペプチド」とは、免疫応答の調節に関与するＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＣ８６７００．１またはその断片と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。例示的なＣＢＬＢポリペプチド配列を以下に提供する。
＞ＡＢＣ８６７００．１ＣＢＬ－Ｂ［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＡＮＳＭＮＧＲＮＰＧＧＲＧＧＮＰＲＫＧＲＩＬＧＩＩＤＡＩＱＤＡＶＧＰＰＫＱＡＡＡＤＲＲＴＶＥＫＴＷＫＬＭＤＫＶＶＲＬＣＱＮＰＫＬＱＬＫＮＳＰＰＹＩＬＤＩＬＰＤＴＹＱＨＬＲＬＩＬＳＫＹＤＤＮＱＫＬＡＱＬＳＥＮＥＹＦＫＩＹＩＤＳＬＭＫＫＳＫＲＡＩＲＬＦＫＥＧＫＥＲＭＹＥＥＱＳＱＤＲＲＮＬＴＫＬＳＬＩＦＳＨＭＬＡＥＩＫＡＩＦＰＮＧＱＦＱＧＤＮＦＲＩＴＫＡＤＡＡＥＦＷＲＫＦＦＧＤＫＴＩＶＰＷＫＶＦＲＱＣＬＨＥＶＨＱＩＳＳＧＬＥＡＭＡＬＫＳＴＩＤＬＴＣＮＤＹＩＳＶＦＥＦＤＩＦＴＲＬＦＱＰＷＧＳＩＬＲＮＷＮＦＬＡＶＴＨＰＧＹＭＡＦＬＴＹＤＥＶＫＡＲＬＱＫＹＳＴＫＰＧＳＹＩＦＲＬＳＣＴＲＬＧＱＷＡＩＧＹＶＴＧＤＧＮＩＬＱＴＩＰＨＮＫＰＬＦＱＡＬＩＤＧＳＲＥＧＦＹＬＹＰＤＧＲＳＹＮＰＤＬＴＧＬＣＥＰＴＰＨＤＨＩＫＶＴＱＥＱＹＥＬＹＣＥＭＧＳＴＦＱＬＣＫＩＣＡＥＮＤＫＤＶＫＩＥＰＣＧＨＬＭＣＴＳＣＬＴＡＷＱＥＳＤＧＱＧＣＰＦＣＲＣＥＩＫＧＴＥＰＩＩＶＤＰＦＤＰＲＤＥＧＳＲＣＣＳＩＩＤＰＦＧＭＰＭＬＤＬＤＤＤＤＤＲＥＥＳＬＭＭＮＲＬＡＮＶＲＫＣＴＤＲＱＮＳＰＶＴＳＰＧＳＳＰＬＡＱＲＲＫＰＱＰＤＰＬＱＩＰＨＬＳＬＰＰＶＰＰＲＬＤＬＩＱＫＧＩＶＲＳＰＣＧＳＰＴＧＳＰＫＳＳＰＣＭＶＲＫＱＤＫＰＬＰＡＰＰＰＰＬＲＤＰＰＰＰＰＰＥＲＰＰＰＩＰＰＤＮＲＬＳＲＨＩＨＨＶＥＳＶＰＳＲＤＰＰＭＰＬＥＡＷＣＰＲＤＶＦＧＴＮＱＬＶＧＣＲＬＬＧＥＧＳＰＫＰＧＩＴＡＳＳＮＶＮＧＲＨＳＲＶＧＳＤＰＶＬＭＲＫＨＲＲＨＤＬＰＬＥＧＡＫＶＦＳＮＧＨＬＧＳＥＥＹＤＶＰＰＲＬＳＰＰＰＰＶＴＴＬＬＰＳＩＫＣＴＧＰＬＡＮＳＬＳＥＫＴＲＤＰＶＥＥＤＤＤＥＹＫＩＰＳＳＨＰＶＳＬＮＳＱＰＳＨＣＨＮＶＫＰＰＶＲＳＣＤＮＧＨＣＭＬＮＧＴＨＧＰＳＳＥＫＫＳＮＩＰＤＬＳＩＹＬＫＧＤＶＦＤＳＡＳＤＰＶＰＬＰＰＡＲＰＰＴＲＤＮＰＫＨＧＳＳＬＮＲＴＰＳＤＹＤＬＬＩＰＰＬＧＥＤＡＦＤＡＬＰＰＳＬＰＰＰＰＰＰＡＲＨＳＬＩＥＨＳＫＰＰＧＳＳＳＲＰＳＳＧＱＤＬＦＬＬＰＳＤＰＦＶＤＬＡＳＧＱＶＰＬＰＰＡＲＲＬＰＧＥＮＶＫＴＮＲＴＳＱＤＹＤＱＬＰＳＣＳＤＧＳＱＡＰＡＲＰＰＫＰＲＰＲＲＴＡＰＥＩＨＨＲＫＰＨＧＰＥＡＡＬＥＮＶＤＡＫＩＡＫＬＭＧＥＧＹＡＦＥＥＶＫＲＡＬＥＩＡＱＮＮＶＥＶＡＲＳＩＬＲＥＦＡＦＰＰＰＶＳＰＲＬＮＬ

「Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）ポリヌクレオチド」とは、ＣＢＬＢポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。ＣＢＬＢ遺伝子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする。例示的なＣＢＬＢ核酸配列を以下に提供する。
＞ＤＱ３４９２０３．１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＢＬ－ＢｍＲＮＡ、完全長ＣＤＳ
ＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＴＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＣＧＴＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＡＴＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴＴＴＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧＴＴＡＣＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＡＧＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＧＧＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＣＴＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＴＡＣＣＴＣＡＴＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＴＧＡＧＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＣＴＡＧＡＣＴＴＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＧＴＧＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＣＧＴＣＣＧＡＡＡＧＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＣＴＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＡＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＣＣＣＡＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＴＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＴＡＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＧＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＣＴＡＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＣＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＧＣＴＴＡＴＧＣＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＧＴＴＡＧＣＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＡＡＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴＡＡＴＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣＧＴＧＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＧＧＧＡＣＡＡＴＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＡＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＣＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＴＣＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＴＧＴＣＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＡＣＧＴＣＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧ

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、免疫エフェクター細胞に抗原に対する特異性を付与する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン）に連結された細胞外抗原結合ドメインを含む合成または操作された受容体を意味する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。

「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」または「ＣＡＲ－Ｔ細胞」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、ＣＡＲの抗体由来標的指向化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、ＣＡＲまたはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作された細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、任意選択的に、所定の割合のＴヘルパーＣＤ４＋細胞および／またはＴエフェクターＣＤ８＋細胞であり得る。（例えば、がんの治療用に）ＣＡＲを作製する方法は、公的に利用可能である（例えば、Ｐａｒｋｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：５５０－５５７，２０１１、Ｇｒｕｐｐｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．，３６８：１５０９－１５１８，２０１３、Ｈａｎｅｔａｌ．，Ｊ．ＨｅｍａｔｏｌＯｎｃｏｌ．６：４７，２０１３、Ｈａｓｏｅｔａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，１１６５－１１７４；ＰＣＴＰｕｂｓ、ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１３／０５９５９３、および米国公開第２０１２／０２１３７８３号を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。

「クラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２７３３３１．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００１２７３３３１．１ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターアイソフォーム１［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＲＣＬＡＰＲＰＡＧＳＹＬＳＥＰＱＧＳＳＱＣＡＴＭＥＬＧＰＬＥＧＧＹＬＥＬＬＮＳＤＡＤＰＬＣＬＹＨＦＹＤＱＭＤＬＡＧＥＥＥＩＥＬＹＳＥＰＤＴＤＴＩＮＣＤＱＦＳＲＬＬＣＤＭＥＧＤＥＥＴＲＥＡＹＡＮＩＡＥＬＤＱＹＶＦＱＤＳＱＬＥＧＬＳＫＤＩＦＩＥＨＩＧＰＤＥＶＩＧＥＳＭＥＭＰＡＥＶＧＱＫＳＱＫＲＰＦＰＥＥＬＰＡＤＬＫＨＷＫＰＡＥＰＰＴＶＶＴＧＳＬＬＶＧＰＶＳＤＣＳＴＬＰＣＬＰＬＰＡＬＦＮＱＥＰＡＳＧＱＭＲＬＥＫＴＤＱＩＰＭＰＦＳＳＳＳＬＳＣＬＮＬＰＥＧＰＩＱＦＶＰＴＩＳＴＬＰＨＧＬＷＱＩＳＥＡＧＴＧＶＳＳＩＦＩＹＨＧＥＶＰＱＡＳＱＶＰＰＰＳＧＦＴＶＨＧＬＰＴＳＰＤＲＰＧＳＴＳＰＦＡＰＳＡＴＤＬＰＳＭＰＥＰＡＬＴＳＲＡＮＭＴＥＨＫＴＳＰＴＱＣＰＡＡＧＥＶＳＮＫＬＰＫＷＰＥＰＶＥＱＦＹＲＳＬＱＤＴＹＧＡＥＰＡＧＰＤＧＩＬＶＥＶＤＬＶＱＡＲＬＥＲＳＳＳＫＳＬＥＲＥＬＡＴＰＤＷＡＥＲＱＬＡＱＧＧＬＡＥＶＬＬＡＡＫＥＨＲＲＰＲＥＴＲＶＩＡＶＬＧＫＡＧＱＧＫＳＹＷＡＧＡＶＳＲＡＷＡＣＧＲＬＰＱＹＤＦＶＦＳＶＰＣＨＣＬＮＲＰＧＤＡＹＧＬＱＤＬＬＦＳＬＧＰＱＰＬＶＡＡＤＥＶＦＳＨＩＬＫＲＰＤＲＶＬＬＩＬＤＧＦＥＥＬＥＡＱＤＧＦＬＨＳＴＣＧＰＡＰＡＥＰＣＳＬＲＧＬＬＡＧＬＦＱＫＫＬＬＲＧＣＴＬＬＬＴＡＲＰＲＧＲＬＶＱＳＬＳＫＡＤＡＬＦＥＬＳＧＦＳＭＥＱＡＱＡＹＶＭＲＹＦＥＳＳＧＭＴＥＨＱＤＲＡＬＴＬＬＲＤＲＰＬＬＬＳＨＳＨＳＰＴＬＣＲＡＶＣＱＬＳＥＡＬＬＥＬＧＥＤＡＫＬＰＳＴＬＴＧＬＹＶＧＬＬＧＲＡＡＬＤＳＰＰＧＡＬＡＥＬＡＫＬＡＷＥＬＧＲＲＨＱＳＴＬＱＥＤＱＦＰＳＡＤＶＲＴＷＡＭＡＫＧＬＶＱＨＰＰＲＡＡＥＳＥＬＡＦＰＳＦＬＬＱＣＦＬＧＡＬＷＬＡＬＳＧＥＩＫＤＫＥＬＰＱＹＬＡＬＴＰＲＫＫＲＰＹＤＮＷＬＥＧＶＰＲＦＬＡＧＬＩＦＱＰＰＡＲＣＬＧＡＬＬＧＰＳＡＡＡＳＶＤＲＫＱＫＶＬＡＲＹＬＫＲＬＱＰＧＴＬＲＡＲＱＬＬＥＬＬＨＣＡＨＥＡＥＥＡＧＩＷＱＨＶＶＱＥＬＰＧＲＬＳＦＬＧＴＲＬＴＰＰＤＡＨＶＬＧＫＡＬＥＡＡＧＱＤＦＳＬＤＬＲＳＴＧＩＣＰＳＧＬＧＳＬＶＧＬＳＣＶＴＲＦＲＡＡＬＳＤＴＶＡＬＷＥＳＬＱＱＨＧＥＴＫＬＬＱＡＡＥＥＫＦＴＩＥＰＦＫＡＫＳＬＫＤＶＥＤＬＧＫＬＶＱＴＱＲＴＲＳＳＳＥＤＴＡＧＥＬＰＡＶＲＤＬＫＫＬＥＦＡＬＧＰＶＳＧＰＱＡＦＰＫＬＶＲＩＬＴＡＦＳＳＬＱＨＬＤＬＤＡＬＳＥＮＫＩＧＤＥＧＶＳＱＬＳＡＴＦＰＱＬＫＳＬＥＴＬＮＬＳＱＮＮＩＴＤＬＧＡＹＫＬＡＥＡＬＰＳＬＡＡＳＬＬＲＬＳＬＹＮＮＣＩＣＤＶＧＡＥＳＬＡＲＶＬＰＤＭＶＳＬＲＶＭＤＶＱＹＮＫＦＴＡＡＧＡＱＱＬＡＡＳＬＲＲＣＰＨＶＥＴＬＡＭＷＴＰＴＩＰＦＳＶＱＥＨＬＱＱＱＤＳＲＩＳＬＲ

「クラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）」とは、ＣＩＩＴＡポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＣＩＩＴＡ核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００１２８６４０２．１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓクラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ
ＧＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＣＴＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＧＧＴＧＡＧＡＧＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＧＡＴＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＣＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＣＧＡＧＣＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＡＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＧＴＡＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＴＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＡＣＡＣＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧＧＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＣＧＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＡＴＴＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＴＡＣＣＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＴＴＡＧＴＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＡＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＴＡＣＣＴＡＧＣＡＴＴＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＡＣＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＣＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＡＴＡＡＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＧＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＡＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＣＴＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＡＧＣＧＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＣＧＧＧＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＴＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＴＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＣＴＡＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＧＣＴＴＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡ

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに付与される意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。同様に、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、米国特許法において付与される意味を有し、その用語は、オープンエンドであり、列挙されているものの基本的な特徴または新規の特徴が、列挙されているものよりも多くの存在によって変わらない限り、列挙されているものよりも多くのの存在が可能になるが、先行技術の実施形態は除外される。

「細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＥＡＷ７０３５４．１またはその断片と少なくとも約８５％の配列同一性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する：
＞ＥＡＷ７０３５４．１細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ

「細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）ポリヌクレオチド」とは、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。ＣＴＬＡ－４遺伝子は、免疫グロブリンスーパーファミリーをコードし、抑制性シグナルをＴ細胞に伝達するタンパク質をコードする。例示的なＣＴＬＡ－４核酸配列を以下に提供する。
＞ＢＣ０７４８４２．２Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：１０４０９９ＩＭＡＧＥ：３０９１５５５２）、完全長ＣＤＳ
ＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＡＡＣＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＡＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＴＴＣＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＡＣＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＣＣＣＡＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＣＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧ

「表面抗原分類２（ＣＤ２）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１７５８．２またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００１７５８．２Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２アイソフォーム２前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＣＤ２細胞質ドメイン（アミノ酸残基２３５～３５１）を太字で示す。図４に、ＨｏｍｏＳａｐｉｅｎｓ由来の例示的なＣＤ２ポリペプチドのアーキテクチャを示す。

「表面抗原分類２（ＣＤ２）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ２ポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＣＤ２核酸配列を以下に提供する。＞ＮＭ＿００１７６７．５ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＤ２分子（ＣＤ２）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ
1 agtctcactt cagttccttt tgcatgaaga gctcagaatc aaaagaggaa accaacccct
61 aagatgagct ttccatgtaa atttgtagcc agcttccttc tgattttcaa tgtttcttcc
121 aaaggtgcag tctccaaaga gattacgaat gccttggaaa cctggggtgc cttgggtcag
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421 aaaatatttg atttgaagat tcaagagagg gtctcaaaac caaagatctc ctggacttgt
481 atcaacacaa ccctgacctg tgaggtaatg aatggaactg accccgaatt aaacctgtat
541 caagatggga aacatctaaa actttctcag agggtcatca cacacaagtg gaccaccagc
601 ctgagtgcaa aattcaagtg cacagcaggg aacaaagtca gcaaggaatc cagtgtcgag
661 cctgtcagct gtccagagaa aggtctggac atctatctca tcattggcat atgtggagga
721 ggcagcctct tgatggtctt tgtggcactg ctcgttttct atatcaccaa aaggaaaaaa
781 cagaggagtc ggagaaatga tgaggagctg gagacaagag cccacagagt agctactgaa
841 gaaaggggcc ggaagcccca ccaaattcca gcttcaaccc ctcagaatcc agcaacttcc
901 caacatcctc ctccaccacc tggtcatcgt tcccaggcac ctagtcatcg tcccccgcct
961 cctggacacc gtgttcagca ccagcctcag aagaggcctc ctgctccgtc gggcacacaa
1021 gttcaccagc agaaaggccc gcccctcccc agacctcgag ttcagccaaa acctccccat
1081 ggggcagcag aaaactcatt gtccccttcc tctaattaaa aaagatagaa actgtctttt
1141 tcaataaaaa gcactgtgga tttctgccct cctgatgtgc atatccgtac ttccatgagg
1201 tgttttctgt gtgcagaaca ttgtcacctc ctgaggctgt gggccacagc cacctctgca
1261 tcttcgaact cagccatgtg gtcaacatct ggagtttttg gtctcctcag agagctccat
1321 cacaccagta aggagaagca atataagtgt gattgcaaga atggtagagg accgagcaca
1381 gaaatcttag agatttcttg tcccctctca ggtcatgtgt agatgcgata aatcaagtga
1441 ttggtgtgcc tgggtctcac tacaagcagc ctatctgctt aagagactct ggagtttctt
1501 atgtgccctg gtggacactt gcccaccatc ctgtgagtaa aagtgaaata aaagctttga
1561 ctaga

「表面抗原分類５（ＣＤ５）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３３３３８５．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００１３３３３８５．１Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５アイソフォーム２［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＶＣＳＱＳＷＧＲＳＳＫＱＷＥＤＰＳＱＡＳＫＶＣＱＲＬＮＣＧＶＰＬＳＬＧＰＦＬＶＴＹＴＰＱＳＳＩＩＣＹＧＱＬＧＳＦＳＮＣＳＨＳＲＮＤＭＣＨＳＬＧＬＴＣＬＥＰＱＫＴＴＰＰＴＴＲＰＰＰＴＴＴＰＥＰＴＡＰＰＲＬＱＬＶＡＱＳＧＧＱＨＣＡＧＶＶＥＦＹＳＧＳＬＧＧＴＩＳＹＥＡＱＤＫＴＱＤＬＥＮＦＬＣＮＮＬＱＣＧＳＦＬＫＨＬＰＥＴＥＡＧＲＡＱＤＰＧＥＰＲＥＨＱＰＬＰＩＱＷＫＩＱＮＳＳＣＴＳＬＥＨＣＦＲＫＩＫＰＱＫＳＧＲＶＬＡＬＬＣＳＧＦＱＰＫＶＱＳＲＬＶＧＧＳＳＩＣＥＧＴＶＥＶＲＱＧＡＱＷＡＡＬＣＤＳＳＳＡＲＳＳＬＲＷＥＥＶＣＲＥＱＱＣＧＳＶＮＳＹＲＶＬＤＡＧＤＰＴＳＲＧＬＦＣＰＨＱＫＬＳＱＣＨＥＬＷＥＲＮＳＹＣＫＫＶＦＶＴＣＱＤＰＮＰＡＧＬＡＡＧＴＶＡＳＩＩＬＡＬＶＬＬＶＶＬＬＶＶＣＧＰＬＡＹＫＫＬＶＫＫＦＲＱＫＫＱＲＱＷＩＧＰＴＧＭＮＱＮＭＳＦＨＲＮＨＴＡＴＶＲＳＨＡＥＮＰＴＡＳＨＶＤＮＥＹＳＱＰＰＲＮＳＨＬＳＡＹＰＡＬＥＧＡＬＨＲＳＳＭＱＰＤＮＳＳＤＳＤＹＤＬＨＧＡＱＲＬ

「表面抗原分類５（ＣＤ５）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ５ポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＣＤ５核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００１３４６４５６．１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＤ５分子（ＣＤ５）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ
1 gagtcttgct gatgctcccg gctgaataaa ccccttcctt ctttaacttg gtgtctgagg
61 ggttttgtct gtggcttgtc ctgctacatt tcttggttcc ctgaccagga agcaaagtga
121 ttaacggaca gttgaggcag ccccttaggc agcttaggcc tgccttgtgg agcatccccg
181 cggggaactc tggccagctt gagcgacacg gatcctcaga gcgctcccag gtaggcaatt
241 gccccagtgg aatgcctcgt cagagcagtg catggcaggc ccctgtggag gatcaacgca
301 gtggctgaac acagggaagg aactggcact tggagtccgg acaactgaaa cttgtcgctt
361 cctgcctcgg acggctcagc tggtatgacc cagatttcca ggcaaggctc acccgttcca
421 actcgaagtg ccagggccag ctggaggtct acctcaagga cggatggcac atggtttgca
481 gccagagctg gggccggagc tccaagcagt gggaggaccc cagtcaagcg tcaaaagtct
541 gccagcggct gaactgtggg gtgcccttaa gccttggccc cttccttgtc acctacacac
601 ctcagagctc aatcatctgc tacggacaac tgggctcctt ctccaactgc agccacagca
661 gaaatgacat gtgtcactct ctgggcctga cctgcttaga accccagaag acaacacctc
721 caacgacaag gcccccgccc accacaactc cagagcccac agctcctccc aggctgcagc
781 tggtggcaca gtctggcggc cagcactgtg ccggcgtggt ggagttctac agcggcagcc
841 tggggggtac catcagctat gaggcccagg acaagaccca ggacctggag aacttcctct
901 gcaacaacct ccagtgtggc tccttcttga agcatctgcc agagactgag gcaggcagag
961 cccaagaccc aggggagcca cgggaacacc agcccttgcc aatccaatgg aagatccaga
1021 actcaagctg tacctccctg gagcattgct tcaggaaaat caagccccag aaaagtggcc
1081 gagttcttgc cctcctttgc tcaggtttcc agcccaaggt gcagagccgt ctggtggggg
1141 gcagcagcat ctgtgaaggc accgtggagg tgcgccaggg ggctcagtgg gcagccctgt
1201 gtgacagctc ttcagccagg agctcgctgc ggtgggagga ggtgtgccgg gagcagcagt
1261 gtggcagcgt caactcctat cgagtgctgg acgctggtga cccaacatcc cgggggctct
1321 tctgtcccca tcagaagctg tcccagtgcc acgaactttg ggagagaaat tcctactgca
1381 agaaggtgtt tgtcacatgc caggatccaa accccgcagg cctggccgca ggcacggtgg
1441 caagcatcat cctggccctg gtgctcctgg tggtgctgct ggtcgtgtgc ggcccccttg
1501 cctacaagaa gctagtgaag aaattccgcc agaagaagca gcgccagtgg attggcccaa
1561 cgggaatgaa ccaaaacatg tctttccatc gcaaccacac ggcaaccgtc cgatcccatg
1621 ctgagaaccc cacagcctcc cacgtggata acgaatacag ccaacctccc aggaactccc
1681 acctgtcagc ttatccagct ctggaagggg ctctgcatcg ctcctccatg cagcctgaca
1741 actcctccga cagtgactat gatctgcatg gggctcagag gctgtaaaga actgggatcc
1801 atgagcaaaa agccgagagc cagacctgtt tgtcctgaga aaactgtccg ctcttcactt
1861 gaaatcatgt ccctatttct accccggcca gaacatggac agaggccaga agccttccgg
1921 acaggcgctg ctgccccgag tggcaggcca gctcacactc tgctgcacaa cagctcggcc
1981 gcccctccac ttgtggaagc tgtggtgggc agagccccaa aacaagcagc cttccaacta
2041 gagactcggg ggtgtctgaa gggggccccc tttccctgcc cgctggggag cggcgtctca
2101 gtgaaatcgg ctttctcctc agactctgtc cctggtaagg agtgacaagg aagctcacag
2161 ctgggcgagt gcattttgaa tagttttttg taagtagtgc ttttcctcct tcctgacaaa
2221 tcgagcgctt tggcctcttc tgtgcagcat ccacccctgc ggatccctct ggggaggaca
2281 ggaaggggac tcccggagac ctctgcagcc gtggtggtca gaggctgctc acctgagcac
2341 aaagacagct ctgcacattc accgcagctg ccagccaggg gtctgggtgg gcaccaccct
2401 gacccacagc gtcaccccac tccctctgtc ttatgactcc cctccccaac cccctcatct
2461 aaagacacct tcctttccac tggctgtcaa gcccacaggg caccagtgcc acccagggcc
2521 cggcacaaag gggcgcctag taaaccttaa ccaacttggt tttttgcttc acccagcaat
2581 taaaagtccc aagctgaggt agtttcagtc catcacagtt catcttctaa cccaagagtc
2641 agagatgggg ctggtcatgt tcctttggtt tgaataactc ccttgacgaa aacagactcc
2701 tctagtactt ggagatcttg gacgtacacc taatcccatg gggcctcggc ttccttaact
2761 gcaagtgaga agaggaggtc tacccaggag cctcgggtct gatcaaggga gaggccaggc
2821 gcagctcact gcggcggctc cctaagaagg tgaagcaaca tgggaacaca tcctaagaca
2881 ggtcctttct ccacgccatt tgatgctgta tctcctggga gcacaggcat caatggtcca
2941 agccgcataa taagtctgga agagcaaaag ggagttacta ggatatgggg tgggctgctc
3001 ccagaatctg ctcagctttc tgcccccacc aacaccctcc aaccaggcct tgccttctga
3061 gagcccccgt ggccaagccc aggtcacaga tcttcccccg accatgctgg gaatccagaa
3121 acagggaccc catttgtctt cccatatctg gtggaggtga gggggctcct caaaagggaa
3181 ctgagaggct gctcttaggg agggcaaagg ttcgggggca gccagtgtct cccatcagtg
3241 ccttttttaa taaaagctct ttcatctata gtttggccac catacagtgg cctcaaagca
3301 accatggcct acttaaaaac caaaccaaaa ataaagagtt tagttgagga gaaaaaaaaa
3361 aaaaaaaaaa aaaaaa

「表面抗原分類７（ＣＤ７）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６１２８．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００６１２８．１Ｔ細胞抗原ＣＤ７前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MAGPPRLLLL PLLLALARGL PGALAAQEVQ QSPHCTTVPV GASVNITCST SGGLRGIYLR
61 QLGPQPQDII YYEDGVVPTT DRRFRGRIDF SGSQDNLTIT MHRLQLSDTG TYTCQAITEV
121 NVYGSGTLVL VTEEQSQGWH RCSDAPPRAS ALPAPPTGSA LPDPQTASAL PDPPAASALP
181 AALAVISFLL GLGLGVACVL ARTQIKKLCS WRDKNSAACV VYEDMSHSRC NTLSSPNQYQ

「表面抗原分類７（ＣＤ７）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ７ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なＣＤ７核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００６１３７．７ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＤ７分子（ＣＤ７）、ｍＲＮＡ
1 ctctctgagc tctgagcgcc tgcggtctcc tgtgtgctgc tctctgtggg gtcctgtaga
61 cccagagagg ctcagctgca ctcgcccggc tgggagagct gggtgtgggg aacatggccg
121 ggcctccgag gctcctgctg ctgcccctgc ttctggcgct ggctcgcggc ctgcctgggg
181 ccctggctgc ccaagaggtg cagcagtctc cccactgcac gactgtcccc gtgggagcct
241 ccgtcaacat cacctgctcc accagcgggg gcctgcgtgg gatctacctg aggcagctcg
301 ggccacagcc ccaagacatc atttactacg aggacggggt ggtgcccact acggacagac
361 ggttccgggg ccgcatcgac ttctcagggt cccaggacaa cctgactatc accatgcacc
421 gcctgcagct gtcggacact ggcacctaca cctgccaggc catcacggag gtcaatgtct
481 acggctccgg caccctggtc ctggtgacag aggaacagtc ccaaggatgg cacagatgct
541 cggacgcccc accaagggcc tctgccctcc ctgccccacc gacaggctcc gccctccctg
601 acccgcagac agcctctgcc ctccctgacc cgccagcagc ctctgccctc cctgcggccc
661 tggcggtgat ctccttcctc ctcgggctgg gcctgggggt ggcgtgtgtg ctggcgagga
721 cacagataaa gaaactgtgc tcgtggcggg ataagaattc ggcggcatgt gtggtgtacg
781 aggacatgtc gcacagccgc tgcaacacgc tgtcctcccc caaccagtac cagtgaccca
841 gtgggcccct gcacgtcccg cctgtggtcc ccccagcacc ttccctgccc caccatgccc
901 cccaccctgc cacacccctc accctgctgt cctcccacgg ctgcagcaga gtttgaaggg
961 cccagccgtg cccagctcca agcagacaca caggcagtgg ccaggcccca cggtgcttct
1021 cagtggacaa tgatgcctcc tccgggaagc cttccctgcc cagcccacgc cgccaccggg
1081 aggaagcctg actgtccttt ggctgcatct cccgaccatg gccaaggagg gcttttctgt
1141 gggatgggcc tgggcacgcg gccctctcct gtcagtgccg gcccacccac cagcaggccc
1201 ccaaccccca ggcagcccgg cagaggacgg gaggagacca gtcccccacc cagccgtacc
1261 agaaataaag gcttctgtgc ttcc

「表面抗原分類３３（ＣＤ３３）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７６３．３またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＣＤ３３は、Ｓｉｇｌｅｃ－３としても知られている。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００１７６３．３骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３アイソフォーム１前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MPLLLLLPLL WAGALAMDPN FWLQVQESVT VQEGLCVLVP CTFFHPIPYY DKNSPVHGYW
61 FREGAIISRD SPVATNKLDQ EVQEETQGRF RLLGDPSRNN CSLSIVDARR RDNGSYFFRM
121 ERGSTKYSYK SPQLSVHVTD LTHRPKILIP GTLEPGHSKN LTCSVSWACE QGTPPIFSWL
181 SAAPTSLGPR TTHSSVLIIT PRPQDHGTNL TCQVKFAGAG VTTERTIQLN VTYVPQNPTT
241 GIFPGDGSGK QETRAGVVHG AIGGAGVTAL LALCLCLIFF IVKTHRRKAA RTAVGRNDTH
301 PTTGSASPKH QKKSKLHGPT ETSSCSGAAP TVEMDEELHY ASLNFHGMNP SKDTSTEYSE
361 VRTQ

「表面抗原分類３３（ＣＤ３３）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ３３ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なＣＤ３３核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００１７７２．４ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＤ３３分子（ＣＤ３３）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ
1 ctgctcacac aggaagccct ggaagctgct tcctcagaca tgccgctgct gctactgctg
61 cccctgctgt gggcaggggc cctggctatg gatccaaatt tctggctgca agtgcaggag
121 tcagtgacgg tacaggaggg tttgtgcgtc ctcgtgccct gcactttctt ccatcccata
181 ccctactacg acaagaactc cccagttcat ggttactggt tccgggaagg agccattata
241 tccagggact ctccagtggc cacaaacaag ctagatcaag aagtacagga ggagactcag
301 ggcagattcc gcctccttgg ggatcccagt aggaacaact gctccctgag catcgtagac
361 gccaggagga gggataatgg ttcatacttc tttcggatgg agagaggaag taccaaatac
421 agttacaaat ctccccagct ctctgtgcat gtgacagact tgacccacag gcccaaaatc
481 ctcatccctg gcactctaga acccggccac tccaaaaacc tgacctgctc tgtgtcctgg
541 gcctgtgagc agggaacacc cccgatcttc tcctggttgt cagctgcccc cacctccctg
601 ggccccagga ctactcactc ctcggtgctc ataatcaccc cacggcccca ggaccacggc
661 accaacctga cctgtcaggt gaagttcgct ggagctggtg tgactacgga gagaaccatc
721 cagctcaacg tcacctatgt tccacagaac ccaacaactg gtatctttcc aggagatggc
781 tcagggaaac aagagaccag agcaggagtg gttcatgggg ccattggagg agctggtgtt
841 acagccctgc tcgctctttg tctctgcctc atcttcttca tagtgaagac ccacaggagg
901 aaagcagcca ggacagcagt gggcaggaat gacacccacc ctaccacagg gtcagcctcc
961 ccgaaacacc agaagaagtc caagttacat ggccccactg aaacctcaag ctgttcaggt
1021 gccgccccta ctgtggagat ggatgaggag ctgcattatg cttccctcaa ctttcatggg
1081 atgaatcctt ccaaggacac ctccaccgaa tactcagagg tcaggaccca gtgaggaacc
1141 cacaagagca tcaggctcag ctagaagatc cacatcctct acaggtcggg gaccaaaggc
1201 tgattcttgg agatttaaca ccccacaggc aatgggttta tagacattat gtgagtttcc
1261 tgctatatta acatcatctt agactttgca agcagagagt cgtggaatca aatctgtgct
1321 ctttcatttg ctaagtgtat gatgtcacac aagctcctta accttccatg tctccatttt
1381 cttctctgtg aagtaggtat aagaagtcct atctcatagg gatgctgtga gcattaaata
1441 aaggtacaca tggaaaacac ca

「表面抗原分類５２（ＣＤ５２）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７９４．２またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＣＤ５２は、ＣＡＭＰＡＴＨ－１としても知られている。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００１７９４．２ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MKRFLFLLLT ISLLVMVQIQ TGLSGQNDTS QTSSPSASSN ISGGIFLFFV ANAIIHLFCF
61 S

「表面抗原分類５２（ＣＤ５２）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ５２ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なＣＤ５２核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００１８０３．３ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＤ５２分子（ＣＤ５２）、ｍＲＮＡ
1 agacagccct gagatcacct aaaaagctgc taccaagaca gccacgaaga tcctaccaaa
61 atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa
121 actggactct caggacaaaa cgacaccagc caaaccagca gcccctcagc atccagcaac
181 ataagcggag gcattttcct tttcttcgtg gccaatgcca taatccacct cttctgcttc
241 agttgaggtg acacgtctca gccttagccc tgtgccccct gaaacagctg ccaccatcac
301 tcgcaagaga atcccctcca tctttgggag gggttgatgc cagacatcac caggttgtag
361 aagttgacag gcagtgccat gggggcaaca gccaaaatag gggggtaatg atgtaggggc
421 caagcagtgc ccagctgggg gtcaataaag ttacccttgt acttgca

「表面抗原分類１２３（ＣＤ１２３）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１７４．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＣＤ１２３は、インターロイキン－３受容体としても知られている。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００２１７４．１インターロイキン－３受容体サブユニットαアイソフォーム１前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MVLLWLTLLL IALPCLLQTK EDPNPPITNL RMKAKAQQLT WDLNRNVTDI ECVKDADYSM
61 PAVNNSYCQF GAISLCEVTN YTVRVANPPF STWILFPENS GKPWAGAENL TCWIHDVDFL
121 SCSWAVGPGA PADVQYDLYL NVANRRQQYE CLHYKTDAQG TRIGCRFDDI SRLSSGSQSS
181 HILVRGRSAA FGIPCTDKFV VFSQIEILTP PNMTAKCNKT HSFMHWKMRS HFNRKFRYEL
241 QIQKRMQPVI TEQVRDRTSF QLLNPGTYTV QIRARERVYE FLSAWSTPQR FECDQEEGAN
301 TRAWRTSLLI ALGTLLALVC VFVICRRYLV MQRLFPRIPH MKDPIGDSFQ NDKLVVWEAG
361 KAGLEECLVT EVQVVQKT

「表面抗原分類１２３（ＣＤ１２３）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ１２３ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なＣＤ１２３核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００２１８３．４Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓインターロイキン３受容体サブユニットα（ＩＬ３ＲＡ）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ
1 cttcggtttc tcttcgggga aagctgcttt cagcgcacac gggaagatat cagaaacatc
61 ctaggatcag gacaccccag atcttctcaa ctggaaccac gaaggctgtt tcttccacac
121 agtactttga tctccattta agcaggcacc tctgtcctgc gttccggagc tgcgttcccg
181 atggtcctcc tttggctcac gctgctcctg atcgccctgc cctgtctcct gcaaacgaag
241 gaagatccaa acccaccaat cacgaaccta aggatgaaag caaaggctca gcagttgacc
301 tgggacctta acagaaatgt gaccgatatc gagtgtgtta aagacgccga ctattctatg
361 ccggcagtga acaatagcta ttgccagttt ggagcaattt ccttatgtga agtgaccaac
421 tacaccgtcc gagtggccaa cccaccattc tccacgtgga tcctcttccc tgagaacagt
481 gggaagcctt gggcaggtgc ggagaatctg acctgctgga ttcatgacgt ggatttcttg
541 agctgcagct gggcggtagg cccgggggcc cccgcggacg tccagtacga cctgtacttg
601 aacgttgcca acaggcgtca acagtacgag tgtcttcact acaaaacgga tgctcaggga
661 acacgtatcg ggtgtcgttt cgatgacatc tctcgactct ccagcggttc tcaaagttcc
721 cacatcctgg tgcggggcag gagcgcagcc ttcggtatcc cctgcacaga taagtttgtc
781 gtcttttcac agattgagat attaactcca cccaacatga ctgcaaagtg taataagaca
841 cattccttta tgcactggaa aatgagaagt catttcaatc gcaaatttcg ctatgagctt
901 cagatacaaa agagaatgca gcctgtaatc acagaacagg tcagagacag aacctccttc
961 cagctactca atcctggaac gtacacagta caaataagag cccgggaaag agtgtatgaa
1021 ttcttgagcg cctggagcac cccccagcgc ttcgagtgcg accaggagga gggcgcaaac
1081 acacgtgcct ggcggacgtc gctgctgatc gcgctgggga cgctgctggc cctggtctgt
1141 gtcttcgtga tctgcagaag gtatctggtg atgcagagac tctttccccg catccctcac
1201 atgaaagacc ccatcggtga cagcttccaa aacgacaagc tggtggtctg ggaggcgggc
1261 aaagccggcc tggaggagtg tctggtgact gaagtacagg tcgtgcagaa aacttgagac
1321 tggggttcag ggcttgtggg ggtctgcctc aatctccctg gccgggccag gcgcctgcac
1381 agactggctg ctggacctgc gcacgcagcc caggaatgga cattcctaac gggtggtggg
1441 catgggagat gcctgtgtaa tttcgtccga agctgccagg aagaagaaca gaactttgtg
1501 tgtttatttc atgataaagt gatttttttt tttttaaccc a

「表面抗原分類１３７（ＣＤ１３７）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１５５２．２またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＣＤ１３７は、４－１ＢＢとしても知られている。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００１５５２．２腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR
61 TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC
121 CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE
181 PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG
241 CSCRFPEEEE GGCEL

「表面抗原分類１３７（ＣＤ１３７）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ１３７ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なＣＤ１３７核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００１５６１．６ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、ｍＲＮＡ
1 gcagaagcct gaagaccaag gagtggaaag ttctccggca gccctgagat ctcaagagtg
61 acatttgtga gaccagctaa tttgattaaa attctcttgg aatcagcttt gctagtatca
121 tacctgtgcc agatttcatc atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc
181 tggtcctcaa ctttgagagg acaagatcat tgcaggatcc ttgtagtaac tgcccagctg
241 gtacattctg tgataataac aggaatcaga tttgcagtcc ctgtcctcca aatagtttct
301 ccagcgcagg tggacaaagg acctgtgaca tatgcaggca gtgtaaaggt gttttcagga
361 ccaggaagga gtgttcctcc accagcaatg cagagtgtga ctgcactcca gggtttcact
421 gcctgggggc aggatgcagc atgtgtgaac aggattgtaa acaaggtcaa gaactgacaa
481 aaaaaggttg taaagactgt tgctttggga catttaacga tcagaaacgt ggcatctgtc
541 gaccctggac aaactgttct ttggatggaa agtctgtgct tgtgaatggg acgaaggaga
601 gggacgtggt ctgtggacca tctccagccg acctctctcc gggagcatcc tctgtgaccc
661 cgcctgcccc tgcgagagag ccaggacact ctccgcagat catctccttc tttcttgcgc
721 tgacgtcgac tgcgttgctc ttcctgctgt tcttcctcac gctccgtttc tctgttgtta
781 aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa
841 ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg
901 aactgtgaaa tggaagtcaa tagggctgtt gggactttct tgaaaagaag caaggaaata
961 tgagtcatcc gctatcacag ctttcaaaag caagaacacc atcctacata atacccagga
1021 ttcccccaac acacgttctt ttctaaatgc caatgagttg gcctttaaaa atgcaccact
1081 tttttttttt ttttgacagg gtctcactct gtcacccagg ctggagtgca gtggcaccac
1141 catggctctc tgcagccttg acctctggga gctcaagtga tcctcctgcc tcagtctcct
1201 gagtagctgg aactacaagg aagggccacc acacctgact aacttttttg ttttttgttt
1261 ggtaaagatg gcatttcacc atgttgtaca ggctggtctc aaactcctag gttcactttg
1321 gcctcccaaa gtgctgggat tacagacatg aactgccagg cccggccaaa ataatgcacc
1381 acttttaaca gaacagacag atgaggacag agctggtgat aaaaaaaaaa aaaaaaaagc
1441 attttctaga taccacttaa caggtttgag ctagtttttt tgaaatccaa agaaaattat
1501 agtttaaatt caattacata gtccagtggt ccaactataa ttataatcaa aatcaatgca
1561 ggtttgtttt ttggtgctaa tatgacatat gacaataagc cacgaggtgc agtaagtacc
1621 cgactaaagt ttccgtgggt tctgtcatgt aacacgacat gctccaccgt caggggggag
1681 tatgagcaga gtgcctgagt ttagggtcaa ggacaaaaaa cctcaggcct ggaggaagtt
1741 ttggaaagag ttcaagtgtc tgtatatcct atggtcttct ccatcctcac accttctgcc
1801 tttgtcctgc tcccttttaa gccaggttac attctaaaaa ttcttaactt ttaacataat
1861 attttatacc aaagccaata aatgaactgc atatgatagg tatgaagtac agtgagaaaa
1921 ttaacacctg tgagctcatt gtcctaccac agcactagag tgggggccgc caaactccca
1981 tggccaaacc tggtgcacca tttgcctttg tttgtctgtt ggtttgcttg agacagtctt
2041 gctctgttgc ccaggctgga atggagtggc tattcacagg cacaatcata gcacacttta
2101 gccttaaact cctgggctca agtgatccac ccgcctcagt ctcccaagta gctgggatta
2161 caggtgcaaa cctggcatgc ctgccattgt ttggcttatg atctaaggat agctttttaa
2221 attttattca ttttattttt ttttgagaca gtgtctcact ctgtctccca ggctggagta
2281 cagtggtaca atcttggatc accgcctccc agtttcaagt gatctccctg cctcagcctc
2341 ctaagtagct gggactacag gtatgtgcca ccacgcctgg ctaattttta tatttttagt
2401 agagacgggg tttcaccatg ttgtccaggc tggtctcaaa ctcctgacct caggtgatct
2461 gcccacctct gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcatg agccaccatg cctggccatt
2521 tcttacactt ttgtatgaca tgcctattgc aagcttgcgt gcctctgtcc catgttattt
2581 tactctggga tttaggtgga gggagcagct tctatttgga acattggcca tcgcatggca
2641 aatgggtatc tgtcacttct gctcctattt agttggttct actataacct ttagagcaaa
2701 tcctgcagcc aagccaggca tcaatagggc agaaaagtat attctgtaaa taggggtgag
2761 gagaagatat ttctgaacaa tagtctactg cagtaccaaa ttgcttttca aagtggctgt
2821 tctaatgtac tcccgtcagt catataagtg tcatgtaagt atcccattga tccacatcct
2881 tgctaccctc tggtactatc aggtgccctt aattttgcca agccagtggg tatagaatga
2941 gatctcactg tggtcttagt ttgcatttgc ttggttactg atgagcacct tgtcaaatat
3001 ttatatacca tttgtgttta tttttttaaa taaaatgctt gctcatgctt ttttgcccat
3061 ttgcaaaaaa acttggggcc gggtgcagtg gctcatgcct gtagtcccag ctctttggga
3121 ggccaaggtg ggcagatcgc ttgagcccag gagttcgaga ccagccttgg caacatggcg
3181 aaaccctgtc tttacaaaaa atacaaaaat tagccgggtg tggtggtgtg cacctgaagt
3241 cccagctact cagtaggttc gctttgagcc tgggaggcag aggttgcagt gagctgggac
3301 cgcatcacta cacttcagcc tgggcaacag agaaaaacct tttctcagaa acaaacaaac
3361 ccaaatgtgg ttgtttgtcc tgattcctaa aaggtcttta tgtattctag ataataatct
3421 ttggtcagtt atatgtgtta aaaaatatct tctttgtggc caggcacggt agctcacacc
3481 tgtaatccca gcactttgcg gggctgaggt gggtggatca tctgaggtca agagttcaag
3541 atcagcctgg ccaacacagt gaaaccccat ctctactaaa catgtacaaa acttagctgg
3601 gtatggtggc gggtgcctgt aaccccagct gctccagagg ctgtggcaga agaatcgctt
3661 gaacccagga ggcagaggtt gcagcgagcc aagattgtgc cattgcactc cagactgggt
3721 gacaagagtg aaattctgcc tatctatcta tctatctatc tatatctata tatatatata
3781 tatatatcct ttgtaattta tttttccctt tttaaaattt tttataaaat tcttttttat
3841 ttttattttt agcagaggtg aggtttctga ggtttcatta tgttgcccag gctggtcttg
3901 aactcctgag ctcaagtgat cctcccacct cagccttcca aagtgctgga attgcagaca
3961 tgagccaccg cgcccctcct gtttttctct aattaatggt gtctttcttt gtctttctgg
4021 taataagcaa aaagttcttc atttgatttg gttaaattta taactgtttt ctcatatggt
4081 taacattttt tcttgcctgg ctaaagaaat ccttttctgc ccaatactat aaagaggttt
4141 gcccacattt tattccaaaa gttttaagtt ttgtctttca tcttgaagtc taatgtatca
4201 ggaactggct tttgtgcctg ttgggaggta gtgatccaat tccatgtctt gcatgtaggt
4261 aaccactggt ccctgcgcca tgtattcaat acgtcgtctt tctcctgcgg gtctgcaatc
4321 tcacctacca tccatcaagt ttccataggg ccatgggtct gcttctgggc tccctgttct
4381 gttccattgt caatttgtct atcctgtgcc agtatcacac tgtgtttatt acaatagctt
4441 tgtaacagct ctcgatatcc ggtaggacat ctccctccac cttctttttc tacttcagaa
4501 gtgtcttagc taggtcaggc acggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc
4561 gacgcggatg gatcacctga ggtcaggagt tttgagacag cctggccaac atggtgaaac
4621 cccatctcta ctaaaaaata caaaaattag tcaggcatgg tggcatgtgc ctgtaatccc
4681 agctatttgg gaggctgagg ccggagaatt gcttgaaccc ggggggcgga ggttgcagtg
4741 agccgagatc gtaccattgc actccagcct gggtgacaga gcgaaactct gtctcaggaa
4801 aaaaaagaaa agagatgtct tggttattct tggttcttta ttattcaata taaattttag
4861 aagctgaatt tgaaaagatt tggattggaa tttcattaaa tctacaggtc aatttaggga
4921 gagttgataa ttttacagaa ttgagtcatc tggtgttcca ataagaataa gagaacaatt
4981 attggctgta caattcttgc caaatagtag gcaaagcaaa gcttaggaag tatactggtg
5041 ccatttcagg aacaaagcta ggtgcgaata tttttgtctt tctgaatcat gatgctgtaa
5101 gttctaaagt gatttctcct cttggctttg gacacatggt gtttaattac ctactgctga
5161 ctatccacaa acagaaagag actggtcatg ccccacaggg ttggggtatc caagataatg
5221 gagcgaggct ctcatgtgtc ctaggttaca caccgaaaat ccacagttta ttctgtgaag
5281 aaaggaggct atgtttatga tacagactgt gatattttta tcatagccta ttctggtatc
5341 atgtgcaaaa gctataaatg aaaaacacag gaacttggca tgtgagtcat tgctccccct
5401 aaatgacaat taataaggaa ggaacattga gacagaataa aatgatcccc ttctgggttt
5461 aatttagaaa gttccataat taggtttaat agaaataaat gtaaatttct atgattaaaa
5521 ataaattagc acatttaggg atacacaaat tataaatcat tttctaaatg ctaaaaacaa
5581 gctcaggttt ttttcagaag aaagttttaa ttttttttct ttagtggaag atatcactct
5641 gacggaaagt tttgatgtga ggggcggatg actataaagt gggcatcttc ccccacagga
5701 agatgtttcc atctgtgggt gagaggtgcc caccgcagct agggcaggtt acatgtgccc
5761 tgtgtgtggt aggacttgga gagtgatctt tatcaacgtt tttatttaaa agactatcta
5821 ataaaacaca aaactatgat gttcacagga aaaaaagaat aagaaaaaaa ga

「表面抗原分類２４７（ＣＤ２４７）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９３２１７０．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＣＤ１３７は、ＣＤ３ζとしても知られている。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿９３２１７０．１Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ζ鎖アイソフォーム１前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD
61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA
121 EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR

「表面抗原分類２４７（ＣＤ２４７）ポリヌクレオチド」とは、ＣＤ２４７ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なＣＤ２４７核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿ＮＭ＿１９８０５３．３ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＣＤ２４７分子（ＣＤ２４７）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ
1 aaccgtcccg gccaccgctg cctcagcctc tgcctcccag cctctttctg agggaaagga
61 caagatgaag tggaaggcgc ttttcaccgc ggccatcctg caggcacagt tgccgattac
121 agaggcacag agctttggcc tgctggatcc caaactctgc tacctgctgg atggaatcct
181 cttcatctat ggtgtcattc tcactgcctt gttcctgaga gtgaagttca gcaggagcgc
241 agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg
301 aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa
361 gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat
421 ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga
481 tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca
541 ggccctgccc cctcgctaac agccagggga tttcaccact caaaggccag acctgcagac
601 gcccagatta tgagacacag gatgaagcat ttacaacccg gttcactctt ctcagccact
661 gaagtattcc cctttatgta caggatgctt tggttatatt tagctccaaa ccttcacaca
721 cagactgttg tccctgcact ctttaaggga gtgtactccc agggcttacg gccctggcct
781 tgggccctct ggtttgccgg tggtgcaggt agacctgtct cctggcggtt cctcgttctc
841 cctgggaggc gggcgcactg cctctcacag ctgagttgtt gagtctgttt tgtaaagtcc
901 ccagagaaag cgcagatgct agcacatgcc ctaatgtctg tatcactctg tgtctgagtg
961 gcttcactcc tgctgtaaat ttggcttctg ttgtcacctt cacctccttt caaggtaact
1021 gtactgggcc atgttgtgcc tccctggtga gagggccggg cagaggggca gatggaaagg
1081 agcctaggcc aggtgcaacc agggagctgc aggggcatgg gaaggtgggc gggcagggga
1141 gggtcagcca gggcctgcga gggcagcggg agcctccctg cctcaggcct ctgtgccgca
1201 ccattgaact gtaccatgtg ctacaggggc cagaagatga acagactgac cttgatgagc
1261 tgtgcacaaa gtggcataaa aaacatgtgg ttacacagtg tgaataaagt gctgcggagc
1321 aagaggaggc cgttgattca cttcacgctt tcagcgaatg acaaaatcat ctttgtgaag
1381 gcctcgcagg aagacccaac acatgggacc tataactgcc cagcggacag tggcaggaca
1441 ggaaaaaccc gtcaatgtac taggatactg ctgcgtcatt acagggcaca ggccatggat
1501 ggaaaacgct ctctactctg ctttttttct actgttttaa tttatactgg catgctaaag
1561 ccttcctatt ttgcataata aatgcttcag tgaaaatgca

「同時投与」または「同時投与された」とは、治療過程で２つ以上の治療剤または薬学的組成物を投与することを指す。かかる同時投与は、同時投与または逐次投与であり得る。後で投与される治療剤または薬学的組成物の逐次投与は、第１の薬学的組成物または治療剤の投与後、治療過程の任意の時点で行われ得る。

「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」という用語は、１つのアミノ酸が、共通の特性を有する別のアミノ酸に置換されることを指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方法は、類似の生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄＳｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７９））。このような分析に従って、アミノ酸のグループは、グループ内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、したがって、タンパク質構造全体に対するそれらの影響が互いに最も類似している場合に、定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄＳｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．、上記）。保存的変異の非限定的な例としては、アミノ酸のアミノ酸置換（例えば、正電荷が維持され得るようにアルギニンに対してリジン、またはその逆、負電荷が維持され得るようにアスパラギン酸に対してグルタミン酸、またはその逆、遊離－ＯＨが維持され得るようにスレオニンに対してセリン、および遊離－ＮＨ_２が維持され得るようにアスパラギンに対してグルタミン）が挙げられる。

「コード配列」または「タンパク質コード配列」という用語は、本明細書で互換的に使用され、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列は、５’末端により近い開始コドンによって、および３’末端により近い終止コドンによって境界付けられる。コード配列は、オープンリーディングフレームとも称され得る。

「コドン最適化」とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または以上のコドン）において、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、目的の宿主細胞における発現を向上させるための核酸配列を修飾するプロセスを意味する。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、これは次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、概して、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用率表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日に参照）で入手可能な「コドン使用率データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適合され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．“ＣｏｄｏｎｕｓａｇｅｔａｂｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓｆｏｒｔｈｅｙｅａｒ２０００”Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列を最適化するためのコドンに関するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、ＧｅｎｅＦｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上のコドン、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。

「シチジンデアミナーゼ」とは、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒し得るポリペプチドまたはその断片を意味する。一実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンをウラシルに、または５－メチルシトシンをチミンに変換する。Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓに由来するＰｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓシトシンデアミナーゼ１（「ＰｍＣＤＡ１」））、または哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サルなど）に由来するＡＩＤ（活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＣＤＡ」））、およびＡＰＯＢＥＣは、例示的なシチジンデアミナーゼである。

ＰｍＣＤＡ１の塩基配列およびアミノ酸配列、ならびにヒトＡＩＤの塩基配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
＞ｔｒ｜Ａ５Ｈ７１８｜Ａ５Ｈ７１８＿ＰＥＴＭＡシトシンデアミナーゼＯＳ＝ＰｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓＯＸ＝７７５７ＰＥ＝２ＳＶ＝１ヤツメウナギ
ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＩＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶ
＞ＥＦ０９４８２２．１Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓ単離体ＰｍＣＤＡ．２１シトシンデアミナーゼｍＲＮＡ、完全長ＣＤＳ
ＴＧＡＣＡＣＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＧＣＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＴＣＧＣＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＡＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣ
＞ｔｒ｜Ｑ６ＱＪ８０｜Ｑ６ＱＪ８０＿ＨＵＭＡＮ活性化誘導シチジンデアミナーゼＯＳ＝ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＯＸ＝９６０６ＧＮ＝ＡＩＣＤＡＰＥ＝２ＳＶ＝１
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＡＰＶ
＞ＮＧ＿０１１５８８．１：５００１－１５６８１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、１２番染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ（ＬＲＧ＿１７）
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ＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＴＡＴＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧ

アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）は、進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーである。このファミリーのメンバーは、ＣからＵの編集酵素である。ＡＰＯＢＥＣ様タンパク質のＮ末端ドメインは、触媒ドメインであり、Ｃ末端ドメインは、偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは、亜鉛依存性シチジンデアミナーゼドメインであり、シチジンの脱アミノ化に重要である。ＡＰＯＢＥＣファミリーメンバーには、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（現在、「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、これを指す）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、および活性化誘導（シチジン）デアミナーゼが含まれる。多くの修飾シチジンデアミナーゼが市販されており、これらに限定されないが、ＳａＢＥ３、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＥＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、およびＹＥＥ－ＢＥ３が挙げられ、これらは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である（プラスミド８５１６９、８５１７０、８５１７１、８５１７２、８５１７３、８５１７４、８５１７５、８５１７６、８５１７７）。

本開示の態様によるＣａｓ９に融合され得る他の例示的なデアミナーゼが本明細書に提供される。一部の実施形態では、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナルがないドメイン（核局在化配列、核輸送シグナルなし、細胞質局在化シグナル）が使用され得ることを理解されたい。

「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質または酵素を指す。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼであり、シチジンまたはデオキシシチジンを、それぞれウリジンまたはデオキシウリジンに加水分解的に脱アミノ化するのを触媒する。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼであり、シトシンのウラシルへの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼであり、アデニンのヒポキサンチンへの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼであり、アデノシンまたはアデニン（Ａ）のイノシン（Ｉ）への加水分解的な脱アミノ化を触媒する。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼであり、アデノシンまたはデオキシアデノシンを、それぞれイノシンまたはデオキシイノシンに加水分解的に脱アミノ化するのを触媒する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のアデノシンの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は、細菌などの任意の生物由来であり得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、またはＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）由来である。

一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの生物由来の天然に存在するデアミナーゼのバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在しない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一である。

例えば、デアミナーゼドメインは、国際ＰＣＴ出願第２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載される（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）、およびＲｅｅｓ，Ｈ．Ａ．，ｅｔａｌ．，“Ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ．”ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ．２０１８Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１８－００５９－１も参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

「検出する」とは、検出される分析物の存在、不在、または量を特定することを指す。

「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結された場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段を介して、目的の分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で一般的に使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。

「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を意味する。一実施形態では、疾患は、腫瘍またはがんである。一部の実施形態では、疾患は、血液がんである。「血液がん」とは、免疫系細胞の悪性腫瘍を意味する。一部の実施形態では、血液がんは、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である。リンパ腫および白血病は、血液中に存在する「液体がん」またはがんの例であり、骨髄中の造血前駆細胞または血液中の成熟造血細胞のいずれかの形質転換に由来する。白血病は、リンパ系または骨髄系、ならびに急性または慢性であり得る。骨髄腫の場合、形質転換細胞は、完全に分化した形質細胞であり、悪性細胞の分散集合体として、または骨髄中の固体塊として存在し得る。リンパ腫の場合、二次リンパ組織中の形質転換リンパ球は、固体塊を生成する。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のいずれかに分類される。

一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞がんである。一部の実施形態では、Ｂ細胞がんは、リンパ腫または白血病である。場合によっては、白血病は、前白血病を含む。場合によっては、白血病は、急性白血病である。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。急性白血病には、例えば、急性リンパ性白血病または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）も含まれ、ＡＬＬには、Ｂ系統ＡＬＬ、Ｔ系統ＡＬＬ、およびＴ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）が含まれる。

疾患の非限定的な例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、末梢性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫ＡＬＫ^＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０^＋リンパ増殖性障害、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、および腸症関連Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。一部の実施形態では、疾患は、液体腫瘍である。一部の実施形態では、疾患は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である。一部の実施形態では、疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を誘発するのに十分な生物学的活性剤の量を指す。一部の実施形態では、有効量は、未治療の患者と比較して、疾患の症状を緩和するのに必要な量である。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性剤の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、および全般的な健康状態に応じて変化する。最終的には、主治医または獣医が適切な量と投薬レジメンを決定する。このような量は、「有効」量と称される。一実施形態では、有効量は、細胞（例えば、細胞インビトロまたはインビボ）における目的の遺伝子の変化を導入するのに十分な本発明の塩基エディター（例えば、プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、核酸塩基エディター、およびｇＲＮＡを含む融合タンパク質）の量である。一実施形態では、有効量は、治療効果を達成するために（例えば、疾患またはその症状もしくは状態を低減または制御するために）必要とされる塩基エディターの量である。かかる治療効果は、対象、組織、または器官のすべての細胞で目的の遺伝子が改変されるのに十分である必要はなく、対象、組織、または器官に存在する細胞の約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上で目的の遺伝子が改変されるだけでよい。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質（例えば、ｎＣａｓ９ドメインおよびデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）を含む核酸塩基エディター）の有効量は、本明細書に記載の核酸塩基エディターによって特異的に結合および編集される標的部位の編集を誘導するのに十分な融合タンパク質の量を指す。当業者によって理解されるように、薬剤（例えば、融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質（またはタンパク質二量体）とポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチド）の有効量は、様々な要因（例えば、所望の生物学的応答、例えば、編集される特定のアレル、ゲノム、もしくは標的部位、標的となる細胞もしくは組織、および／または使用される薬剤など）に応じて変化し得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞の文脈において、「有効量」とは、治療応答を達成するために、患者に投与するのに必要な細胞の量を指す。

本明細書で使用される「エピトープ」とは、抗原決定基を意味する。エピトープは、抗原分子の一部であり、その構造によって、エピトープを認識し、それに結合する特異的な抗体分子が決定される。

「Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００００３４．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００００３４．１腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６アイソフォーム１前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MLGIWTLLPL VLTSVARLSS KSVNAQVTDI NSKGLELRKT VTTVETQNLE GLHHDGQFCH
61 KPCPPGERKA RDCTVNGDEP DCVPCQEGKE YTDKAHFSSK CRRCRLCDEG HGLEVEINCT
121 RTQNTKCRCK PNFFCNSTVC EHCDPCTKCE HGIIKECTLT SNTKCKEEGS RSNLGWLCLL
181 LLPIPLIVWV KRKEVQKTCR KHRKENQGSH ESPTLNPETV AINLSDVDLS KYITTIAGVM
241 TLSQVKGFVR KNGVNEAKID EIKNDNVQDT AEQKVQLLRN WHQLHGKKEA YDTLIKDLKK
301 ANLCTLAEKI QTIILKDITS DSENSNFRNE IQSLV

「Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）ポリヌクレオチド」とは、ＦＡＳポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＦＡＳ核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００００４３．６ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＦａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ
1 ctcttctccc gcgggttggt ggacccgctc agtacggagt tggggaagct ctttcacttc
61 ggaggattgc tcaacaacca tgctgggcat ctggaccctc ctacctctgg ttcttacgtc
121 tgttgctaga ttatcgtcca aaagtgttaa tgcccaagtg actgacatca actccaaggg
181 attggaattg aggaagactg ttactacagt tgagactcag aacttggaag gcctgcatca
241 tgatggccaa ttctgccata agccctgtcc tccaggtgaa aggaaagcta gggactgcac
301 agtcaatggg gatgaaccag actgcgtgcc ctgccaagaa gggaaggagt acacagacaa
361 agcccatttt tcttccaaat gcagaagatg tagattgtgt gatgaaggac atggcttaga
421 agtggaaata aactgcaccc ggacccagaa taccaagtgc agatgtaaac caaacttttt
481 ttgtaactct actgtatgtg aacactgtga cccttgcacc aaatgtgaac atggaatcat
541 caaggaatgc acactcacca gcaacaccaa gtgcaaagag gaaggatcca gatctaactt
601 ggggtggctt tgtcttcttc ttttgccaat tccactaatt gtttgggtga agagaaagga
661 agtacagaaa acatgcagaa agcacagaaa ggaaaaccaa ggttctcatg aatctccaac
721 tttaaatcct gaaacagtgg caataaattt atctgatgtt gacttgagta aatatatcac
781 cactattgct ggagtcatga cactaagtca agttaaaggc tttgttcgaa agaatggtgt
841 caatgaagcc aaaatagatg agatcaagaa tgacaatgtc caagacacag cagaacagaa
901 agttcaactg cttcgtaatt ggcatcaact tcatggaaag aaagaagcgt atgacacatt
961 gattaaagat ctcaaaaaag ccaatctttg tactcttgca gagaaaattc agactatcat
1021 cctcaaggac attactagtg actcagaaaa ttcaaacttc agaaatgaaa tccaaagctt
1081 ggtctagagt gaaaaacaac aaattcagtt ctgagtatat gcaattagtg tttgaaaaga
1141 ttcttaatag ctggctgtaa atactgcttg gttttttact gggtacattt tatcatttat
1201 tagcgctgaa gagccaacat atttgtagat ttttaatatc tcatgattct gcctccaagg
1261 atgtttaaaa tctagttggg aaaacaaact tcatcaagag taaatgcagt ggcatgctaa
1321 gtacccaaat aggagtgtat gcagaggatg aaagattaag attatgctct ggcatctaac
1381 atatgattct gtagtatgaa tgtaatcagt gtatgttagt acaaatgtct atccacaggc
1441 taaccccact ctatgaatca atagaagaag ctatgacctt ttgctgaaat atcagttact
1501 gaacaggcag gccactttgc ctctaaatta cctctgataa ttctagagat tttaccatat
1561 ttctaaactt tgtttataac tctgagaaga tcatatttat gtaaagtata tgtatttgag
1621 tgcagaattt aaataaggct ctacctcaaa gacctttgca cagtttattg gtgtcatatt
1681 atacaatatt tcaattgtga attcacatag aaaacattaa attataatgt ttgactatta
1741 tatatgtgta tgcattttac tggctcaaaa ctacctactt ctttctcagg catcaaaagc
1801 attttgagca ggagagtatt actagagctt tgccacctct ccatttttgc cttggtgctc
1861 atcttaatgg cctaatgcac ccccaaacat ggaaatatca ccaaaaaata cttaatagtc
1921 caccaaaagg caagactgcc cttagaaatt ctagcctggt ttggagatac taactgctct
1981 cagagaaagt agctttgtga catgtcatga acccatgttt gcaatcaaag atgataaaat
2041 agattcttat ttttccccca cccccgaaaa tgttcaataa tgtcccatgt aaaacctgct
2101 acaaatggca gcttatacat agcaatggta aaatcatcat ctggatttag gaattgctct
2161 tgtcataccc ccaagtttct aagatttaag attctcctta ctactatcct acgtttaaat
2221 atctttgaaa gtttgtatta aatgtgaatt ttaagaaata atatttatat ttctgtaaat
2281 gtaaactgtg aagatagtta taaactgaag cagatacctg gaaccaccta aagaacttcc
2341 atttatggag gatttttttg ccccttgtgt ttggaattat aaaatatagg taaaagtacg
2401 taattaaata atgtttttgg tatttctggt tttctctttt ttggtagggg cttgcttttt
2461 ggttttgtct tccttttctc taactgatgc taaatataac ttgtctttaa tgcttcttgg
2521 atcccttaga aggtacttcc tttttaacct taaccctttt agtagttaaa taattatttc
2581 cataggttgc tattgccaag aagacctctt ccaaacagca catgattatt cgtcaaacag
2641 tttcgtattc cagatactgg aatgtggata agaaagtata catttcaagg ggtaggtttt
2701 attattaaga aagccaaatg aggattttga aatattcttt cctgcatatt atccattcta
2761 gctacatgct ggccagtggg ccacctttct tttctgcaat ttaatgctag taatatattc
2821 tatttaaccc atgagtccca aagtattagc atttcaacat gtaagcatgt cggtaagata
2881 gttgtgcttt gcttagggtt ccctcctgtg ttatggtctg gaaagtgtct ttaggcagaa
2941 agtctgagtg atcacagggt tcactcatta atttctcttt tctgagccat catagtctgt
3001 gctgtctgct ctccagtttt ctatttctag acagaagtag ggcaagttag gtactagtta
3061 ttcttcatgg ccagaagtgc aagttctact ttgcaagaca agattaagtt agagaacacc
3121 ctattccact ttggtgaact cagagcaaga actttgagtt cctttgggag gaagacagtg
3181 gagaagtctt tgtacttggt gatgtggttt ttttcctcat ggcttcacct agtggcccca
3241 agcatgactt ctcccatgtc aatgagcaca gccacattcc cgagttgagg tgaccccacg
3301 gtccagaatc atcctcattc tggtgaacct ggttctcttt gtggtgggca tactgggtag
3361 gagaatcacc caaaggtcac ccatgagctg cagaaaaaaa ggctatttgc agaaggagct
3421 cacagatcac attgaaagca ttgcatattc aaacatcttg gtcttcttta ttggcatgcc
3481 cacagggtct tctgacctct gattagatca gacacttttt agatattgaa tcatcagttt
3541 ctgtacaact atctgaataa ggtatataat caatgaaatt tagaattttt ttctatgctt
3601 actcctgatt ggtaatttgt ttgggtttag aattctatac aaggccattt gtaattttcc
3661 tcagcacttt aaaaatatta aaccatgttt tcttaa

「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、参照核酸分子または参照ポリペプチドの全長の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。

「フラトリサイド」とは、他の免疫細胞による免疫細胞の死滅を意味し、免疫細胞の自己抗原で駆動される死滅が含まれる。特定の実施形態では、本発明の免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞によって認識される抗原の発現を防止または低減するように遺伝子修飾され、それによって、フラトリサイドを防止または低減する。様々な実施形態では、フラトリサイドは、インビボ（例えば、対象において）またはエクスビボ（例えば、免疫細胞調製物において）で生じ得る。

「移植片対宿主病」（ＧＶＨＤ）は、ドナーの移植細胞が宿主の細胞に対して免疫応答を生成する病理学的状態を指す。

「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とは、標的配列に特異的であり得、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）と複合体を形成し得るポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体として、または単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称され得るが、「ｇＲＮＡ」は、単一の分子として、または２つ以上の分子の複合体として存在するガイドＲＮＡを指すように互換的に使用される。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２つのドメイン：（１）標的核酸と相同性を共有する（例えば、また、標的へのＣａｓ９複合体の結合を指示する）ドメイン、および（２）Ｃａｓ９タンパク質に結合するドメインを含む。一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる配列に対応し、ステム・ループ構造を含む。例えば、一部の実施形態では、ドメイン（２）は、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）に提供されるｔｒａｃｒＲＮＡと同一または相同である（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。ｇＲＮＡの他の例（例えば、ドメイン２を含むもの）は、「切替可能Ｃａｓ９ヌクレアーゼとその使用」と題するＵＳ２０１６／０２０８２８８、および「機能性ヌクレアーゼのための送達システム」と題するＵＳ９，７３７，６０４に見出すことができる（各々の内容全体が、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ドメイン（１）および（２）のうちの２つ以上を含み、「伸長ｇＲＮＡ」と称され得る。伸長ｇＲＮＡは、本明細書に記載の２つ以上のＣａｓ９タンパク質に結合し、２つ以上の異なる領域で標的核酸に結合する。ｇＲＮＡは、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これが、ヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の当該標的部位への結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。当業者に理解されるように、ＲＮＡポリヌクレオチド配列（例えば、ｇＲＮＡ配列）には、ＤＮＡポリヌクレオチド配列に含まれる核酸塩基チミン（Ｔ）ではなく、ピリミジン誘導体である核酸塩基ウラシル（Ｕ）が含まれる。ＲＮＡでは、ウラシルは、アデニンと塩基対を形成し、ＤＮＡ転写中にチミンを置き換える。

「ヘテロ二量体」は、野生型ＴａｄＡドメインとＴａｄＡドメインのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）、または２つのバリアントＴａｄＡドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０とＴａｄＡ＊８、または２つのＴａｄＡ＊８ドメイン）など、２つのドメインを含む融合タンパク質を意味する。

「宿主対移植片病」（ＨＶＧＤ）は、宿主の免疫系が、ドナーの移植細胞に対する免疫応答を生成する病理学的状態を指す。

「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸塩基間の水素結合を意味し、ワトソン－クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的な核酸塩基である。

「免疫細胞」とは、免疫応答を生成することができる免疫系の細胞を意味する。

「免疫エフェクター細胞」とは、一旦活性化されると、標的細胞に対して免疫応答をもたらし得るリンパ球を意味する。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、エフェクターＴ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、エフェクターＮＫ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔヘルパー細胞である。一部の実施形態では、Ｔヘルパー細胞は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞、またはＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。

「免疫応答調節遺伝子」または「免疫応答調節因子」とは、免疫応答の調節に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。免疫応答調節遺伝子は、複数のメカニズムで、または異なるレベルで免疫応答を調節し得る。例えば、免疫応答調節遺伝子は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化を抑制または促進し得る。免疫応答調節遺伝子は、免疫細胞の活性化閾値を増加または減少させ得る。一部の実施形態では、免疫応答調節遺伝子は、免疫細胞のシグナル伝達経路を正に調節する。一部の実施形態では、免疫応答調節遺伝子は、免疫細胞のシグナル伝達経路を負に調節する。一部の実施形態では、免疫応答調節遺伝子は、抗原、抗体、サイトカイン、または神経内分泌をコードする。

「免疫原性遺伝子」とは、免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。例えば、免疫原性遺伝子は、免疫応答を誘発する免疫原をコードし得る。一部の実施形態では、免疫原性遺伝子は、細胞表面タンパク質をコードする。一部の実施形態では、免疫原性遺伝子は、細胞表面抗原または細胞表面マーカーをコードする。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、Ｔ細胞マーカーまたはＢ細胞マーカーである。一部の実施形態では、免疫原性遺伝子は、ＣＤ２、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１３０、ＣＤ１３２、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、ＣＤ９９、ＣＤ１０３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＬＡ、ＣＤ１６１、Ｂ２Ｍ、またはＣＩＩＴＡポリペプチドをコードする。

「塩基修復の阻害因子」または「ＩＢＲ」という用語は、核酸修復酵素、例えば、塩基除去修復（ＢＥＲ）酵素の活性を阻害し得るタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＩＢＲは、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。塩基修復の例示的な阻害因子としては、ＡＰＥ１、ＥｎｄｏＩＩＩ、ＥｎｄｏＩＶ、ＥｎｄｏＶ、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、ｈＯＧＧ１、ｈＮＥＩＬ１、Ｔ７Ｅｎｄｏ１、Ｔ４ＰＤＧ、ＵＤＧ、ｈＳＭＵＧ１、およびｈＡＡＧの阻害因子が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＢＲは、ＥｎｄｏＶまたはｈＡＡＧの阻害因子である。一部の実施形態では、ＩＢＲは、触媒不活性ＥｎｄｏＶまたは触媒不活性ｈＡＡＧである。一部の実施形態では、塩基修復阻害因子は、ＥｎｄｏＶまたはｈＡＡＧの阻害因子である。一部の実施形態では、塩基修復阻害因子は、触媒不活性ＥｎｄｏＶまたは触媒不活性ｈＡＡＧである。

一部の実施形態では、塩基修復阻害因子はウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）である。ＵＧＩは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩまたは野生型ＵＧＩの断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるＵＧＩタンパク質は、ＵＧＩの断片およびＵＧＩまたはＵＧＩ断片に相同なタンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基修復阻害因子は、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。一部の実施形態では、塩基修復阻害因子は、「触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼ」または「不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ」である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、触媒不活性イノシングリコシラーゼ（例えば、アルキルアデニングリコシラーゼ（ＡＡＧ））は、イノシンに結合することができるが、脱塩基部位を生成することも、イノシンを除去することもできず、それによって、新たに形成されたイノシン部分をＤＮＡ損傷／修復機構から立体的に遮断することができる。一部の実施形態では、触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼは、核酸のイノシンに結合することができるが、核酸を切断しない。非限定的な例示的な触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼとしては、例えば、ヒト由来の触媒不活性アルキルアデノシングリコシラーゼ（ＡＡＧヌクレアーゼ）、および例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の触媒不活性エンドヌクレアーゼＶ（ＥｎｄｏＶヌクレアーゼ）が挙げられる。一部の実施形態では、触媒不活性ＡＡＧヌクレアーゼは、Ｅ１２５Ｑ変異を含むか、または別のＡＡＧヌクレアーゼにおける対応する変異を含む。

「増加」は、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の正の変化を意味する。

「インテイン」は、タンパク質スプライシングとして知られているプロセスにおいて、自身を切除し、残りの断片（エクステイン）をペプチド結合で連結することができるタンパク質の断片である。インテインは、「タンパク質イントロン」とも称される。インテインが、自身を切除し、タンパク質の残りの部分を連結するプロセスは、本明細書では、「タンパク質スプライシング」または「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と称される。一部の実施形態では、前駆体タンパク質のインテイン（インテイン媒介性タンパク質スプライシングの前のインテイン含有タンパク質）は、２つの遺伝子に由来する。かかるインテインは、本明細書では、スプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン－Ｎおよびスプリットインテイン－Ｃ）と称される。例えば、シアノバクテリアでは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒サブユニットであるＤｎａＥは、ｄｎａＥ－ｎとｄｎａＥ－ｃの２つの別個の遺伝子によってコードされている。ｄｎａＥ－ｎ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書では、「インテイン－Ｎ」と称され得る。ｄｎａＥ－Ｃ遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書において「インテイン－Ｃ」と称され得る。

他のインテインシステムも使用され得る。例えば、ｄｎａＥインテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えば、スプリットインテイン－Ｎ）とＣｆａ－Ｃ（例えば、スプリットインテイン－Ｃ）のインテイン対に基づく合成インテインが記載されている（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｅｔａｌ．，ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ．２０１６Ｆｅｂ．２４；１３８（７）：２１６２－５）。本開示に従って使用され得るインテイン対の非限定的な例としては、ＣｆａＤｎａＥインテイン、ＳｓｐＧｙｒＢインテイン、ＳｓｐＤｎａＸインテイン、ＴｅｒＤｎａＥ３インテイン、ＴｅｒＴｈｙＸインテイン、ＲｍａＤｎａＢインテイン、およびＣｎｅＰｒｐ８インテインが挙げられる（例えば、米国特許第８，３９４，６０４号に記載されている。参照により本明細書に援用される）。

インテインの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に提供する。
ＤｎａＥインテイン－ＮＤＮＡ：
ＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＣＧＡＡＡＣＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＣＧＧＡＴＡＧＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＧＡＴＡＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＡＣＧＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＡＧＡＣＧＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＧＡＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＧＡＧＴＴＧＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴ
ＤｎａＥインテイン－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ
ＤｎａＥインテイン－ＣＤＮＡ：
ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴ
インテイン－Ｃ：ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ
Ｃｆａ－ＮＤＮＡ：
ＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＧＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＣＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＡＴＡＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＣＡ
Ｃｆａ－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ
Ｃｆａ－ＣＤＮＡ：
ＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＧＡＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣ
Ｃｆａ－Ｃタンパク質：ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ

スプリットＣａｓ９のＮ末端部分およびスプリットＣａｓ９のＣ末端部分の連結のために、インテイン－Ｎおよびインテイン－Ｃを、それぞれ、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分およびスプリットＣａｓ９のＣ末端部分に融合することができる。例えば、一部の実施形態では、インテイン－Ｎは、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分のＣ末端に融合され、すなわち、Ｎ－［スプリットＣａｓ９のＮ末端部分］－［インテイン－Ｎ］－Ｃの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分のＮ末端に融合され、すなわち、Ｎ－［インテイン－Ｃ］－［スプリットＣａｓ９のＣ末端部分］－Ｃの構造を形成する。インテインが（例えば、スプリットＣａｓ９）に融合されるタンパク質を連結するためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングのメカニズムは既知であり、例えば、Ｓｈａｈｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＳｃｉ．２０１４；５（１）：４４６－４６１に記載されている（参照により本明細書に援用される）。インテインを設計および使用するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ２０１４／００４３３６、ＷＯ２０１７／１３２５８０、ＵＳ２０１５／０３４４５４９、およびＵＳ２０１８／０１２７７８０に記載されている（これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。

「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然状態で見出されるような通常それに付随する成分を、異なる程度で含まない材料を指す。「分離する」とは、元の供給源または周囲物からの分離の程度を示す。「精製する」とは、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、十分に他の材料を含まず、そのため、任意の不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えたり、他の有害な結果を引き起こしたりしない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含んでいなければ精製されており、または化学合成された場合、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含んでいなければ精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせることを示し得る。例えば、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）を受け得るタンパク質の場合、異なる修飾は、異なる単離されたタンパク質を生じ得、別個に精製され得る。

「単離されたポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、または他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。加えて、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、ならびに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。

「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を、少なくとも６０重量％含まない場合、単離されている。好ましくは、調製物は、本発明のポリペプチドが、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも９０重量％、最も好ましくは、少なくとも９９重量％である。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源から抽出することによって、かかるポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることによって、またはそのタンパク質を化学的に合成することによって、得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。「リーダーペプチド」とは、新たに合成された分泌タンパク質または膜タンパク質を、膜（例えば、小胞体膜）に誘導し、通過させる短いアミノ酸配列（例えば、約１６～３０アミノ酸長）を意味する。リーダーペプチドは、典型的には、ポリペプチドのＮ末端に位置し、ポリペプチドが膜を通過した後、シグナルペプチダーゼによって除去され得る。リーダーペプチド配列は、典型的には、３つの一般的な構造的特徴：Ｎ末端極性塩基性領域（ｎ領域）、疎水性コア、および親水性領域（ｃ領域）を含む。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、リーダーペプチド配列（例えば、抗原結合ドメインのＮ末端）を含む。例示的なリーダーペプチドのアミノ酸配列は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧである。

「リンカー」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの分子もしくは部分、例えば、タンパク質複合体もしくはリボ核複合体の２つの成分、または融合タンパク質の２つのドメイン（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９）とデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ））を連結する、結合（例えば、共有結合）、化学基、または分子を指す。リンカーは、塩基エディターシステムの異なる成分、または成分の異なる部分を連結することができる。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのガイドポリヌクレオチド結合ドメインとデアミナーゼの触媒ドメインを連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドとデアミナーゼを連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９とデアミナーゼを連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９とデアミナーゼを連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ｎＣａｓ９とデアミナーゼを連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ガイドポリヌクレオチドとデアミナーゼを連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化成分とポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合成分を連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化成分のＲＮＡ結合部分とポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合成分を結合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化成分のＲＮＡ結合部分とポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合成分のＲＮＡ結合部分を連結することができる。リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置するか、またはそれに隣接し、共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用を介して各々に連結され得、したがって、両者を連結する。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＤＮＡリンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＲＮＡリンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、リガンドに結合することができるアプタマーを含み得る。一部の実施形態では、リガンドは、炭水化物、ペプチド、タンパク質、または核酸であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、リボスイッチに由来し得るアプタマーを含み得る。アプタマーが由来するリボスイッチは、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）リボスイッチ、アデノシンコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）リボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、ＧｌｍＳリボスイッチ、またはプレキューオシン１（ＰｒｅＱ１）リボスイッチから選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインに結合したアプタマー（例えば、ポリペプチドリガンド）を含んでもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、塩基エディターシステム成分の一部であり得る。例えば、核酸塩基編集成分は、デアミナーゼドメインおよびＲＮＡ認識モチーフを含み得る。

一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、約５～１００アミノ酸長、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、約１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、または４５０～５００アミノ酸長であり得る。また、より長いまたはより短いリンカーも企図され得る。

一部の実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含む、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと核酸編集タンパク質（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）の触媒ドメインを連結する。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９と核酸編集タンパク質を連結する。例えば、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、またはそれらに隣接し、共有結合を介して各々に連結され、したがって、両者を連結する。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、５～２００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３５、４５、５０、５５、６０、６０、６５、７０、７０、７５、８０、８５、９０、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、１８０、１９０、または２００アミノ酸長である。また、より長いまたはより短いリンカーも企図される。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含み、ＸＴＥＮリンカーとも称され得る。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、（Ｇ）_ｎ、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ、（ＧＧＳ）_ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、または（ＸＰ）_ｎモチーフ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ｎは、独立して、１～３０の整数であり、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、リンカーは、複数のプロリン残基を含み、５～２１、５～１４、５～９、５～７アミノ酸長、例えば、ＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡ、ＰＡＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡＰＡ、Ｐ（ＡＰ）_４、Ｐ（ＡＰ）_７、Ｐ（ＡＰ）_１０である。このようなプロリンに富むリンカーは、「剛性」リンカーとも称される。

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、少なくとも１つのリンカーを含む。少なくとも１つのリンカーは、キメラ抗原受容体の細胞外結合ドメインの重鎖可変（ＶＨ）領域を、重鎖定常（ＣＨ）領域に連結または結合する。リンカーはまた、細胞外結合ドメインの軽鎖可変（ＶＬ）領域を、可変定常（ＶＣ）領域に連結することもできる。

一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、以下のアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される：
ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ、
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ、または
ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ。

一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含むリンカーを介して融合され、これはＸＴＥＮリンカーとも称され得る。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、２４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、６４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、９２アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳを含む。

本明細書で使用される「液体がん」という用語は、例えば、血液、リンパ、および骨髄などの体液中に存在するがん細胞を指す。液体がんには、白血病、骨髄腫、および液体リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される液体がんには、肉腫およびがん腫などの固形腫瘍、または固形リンパ腫（嚢胞もしくは液体領域を含まない）は含まれない。「液体がん」は、再発性、難治性、または転移性であり得る。本明細書に記載の方法で治療される液体がんは、例えば、液体リンパ腫であり得る。液体リンパ腫には、嚢胞または液体領域を含むリンパ腫が含まれる。

「リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００２２７７．４またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿００２２７７．４リンパ球活性化遺伝子３タンパク質前駆体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
1 MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL QDLSLLRRAG
61 VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV
121 QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR
181 ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG
241 CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP
301 PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI ITVTPKSFGS
361 PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPW QCQLYQGERL
421 LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP
481 RRFSALEQGI HPPQAQSKIE ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL

「リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）ポリヌクレオチド」とは、ＬＡＧ－３ポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＬＡＧ－３核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＭ＿００２２８６．６Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓリンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、ｍＲＮＡ
1 agagaccagc agaacggcat cccagccacg acggccactt tgctctgtct gctctccgcc
61 acggccctgc tctgttccct gggacacccc cgcccccacc tcctcaggct gcctgatctg
121 cccagctttc cagctttcct ctggattccg gcctctggtc atccctcccc accctctctc
181 caaggccctc tcctggtctc ccttcttcta gaaccccttc ctccacctcc ctctctgcag
241 aacttctcct ttacccccca ccccccacca ctgccccctt tccttttctg acctcctttt
301 ggagggctca gcgctgccca gaccatagga gagatgtggg aggctcagtt cctgggcttg
361 ctgtttctgc agccgctttg ggtggctcca gtgaagcctc tccagccagg ggctgaggtc
421 ccggtggtgt gggcccagga gggggctcct gcccagctcc cctgcagccc cacaatcccc
481 ctccaggatc tcagccttct gcgaagagca ggggtcactt ggcagcatca gccagacagt
541 ggcccgcccg ctgccgcccc cggccatccc ctggcccccg gccctcaccc ggcggcgccc
601 tcctcctggg ggcccaggcc ccgccgctac acggtgctga gcgtgggtcc cggaggcctg
661 cgcagcggga ggctgcccct gcagccccgc gtccagctgg atgagcgcgg ccggcagcgc
721 ggggacttct cgctatggct gcgcccagcc cggcgcgcgg acgccggcga gtaccgcgcc
781 gcggtgcacc tcagggaccg cgccctctcc tgccgcctcc gtctgcgcct gggccaggcc
841 tcgatgactg ccagcccccc aggatctctc agagcctccg actgggtcat tttgaactgc
901 tccttcagcc gccctgaccg cccagcctct gtgcattggt tccggaaccg gggccagggc
961 cgagtccctg tccgggagtc cccccatcac cacttagcgg aaagcttcct cttcctgccc
1021 caagtcagcc ccatggactc tgggccctgg ggctgcatcc tcacctacag agatggcttc
1081 aacgtctcca tcatgtataa cctcactgtt ctgggtctgg agcccccaac tcccttgaca
1141 gtgtacgctg gagcaggttc cagggtgggg ctgccctgcc gcctgcctgc tggtgtgggg
1201 acccggtctt tcctcactgc caagtggact cctcctgggg gaggccctga cctcctggtg
1261 actggagaca atggcgactt tacccttcga ctagaggatg tgagccaggc ccaggctggg
1321 acctacacct gccatatcca tctgcaggaa cagcagctca atgccactgt cacattggca
1381 atcatcacag tgactcccaa atcctttggg tcacctggat ccctggggaa gctgctttgt
1441 gaggtgactc cagtatctgg acaagaacgc tttgtgtgga gctctctgga caccccatcc
1501 cagaggagtt tctcaggacc ttggctggag gcacaggagg cccagctcct ttcccagcct
1561 tggcaatgcc agctgtacca gggggagagg cttcttggag cagcagtgta cttcacagag
1621 ctgtctagcc caggtgccca acgctctggg agagccccag gtgccctccc agcaggccac
1681 ctcctgctgt ttctcatcct tggtgtcctt tctctgctcc ttttggtgac tggagccttt
1741 ggctttcacc tttggagaag acagtggcga ccaagacgat tttctgcctt agagcaaggg
1801 attcaccctc cgcaggctca gagcaagata gaggagctgg agcaagaacc ggagccggag
1861 ccggagccgg aaccggagcc cgagcccgag cccgagccgg agcagctctg acctggagct
1921 gaggcagcca gcagatctca gcagcccagt ccaaataaac tccctgtcag cagcaa

「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。

「変異」という用語は、本明細書で使用される場合、配列（例えば、核酸配列もしくはアミノ酸配列）内の残基の別の残基による置換、または配列内の１つ以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。変異は、典型的には、元の残基、続いて、配列内の残基の位置、および新たに置換された残基の同一性を特定することによって、本明細書に記載される。本明細書に提供されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＧｒｅｅｎａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））に提供されている。一部の実施形態では、本開示の塩基エディターは、相当数の意図されていない変異（例えば、意図されていない点変異）を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）の点変異などの「意図された変異」を効率的に生成することができる。一部の実施形態では、意図された変異は、意図された変異を生成するように特異的に設計されたガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）に結合した特異的な塩基エディター（例えば、シチジン塩基エディターまたはアデノシン塩基エディター）によって生成される変異である。

一般に、配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列）において作製または特定される変異は、参照（または野生型）配列、すなわち、変異を含まない配列に関連して番号付けされる。当業者は、参照配列に対して、アミノ酸配列および核酸配列における変異の位置を決定する方法を容易に理解するであろう。

「腫瘍」は、異常な成長もしくは増殖を示す細胞または組織を指す。腫瘍という用語は、がん、液状腫瘍、および固形腫瘍を包含する。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、血液がんである。一部の実施形態では、血液がんは、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である。一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞がんである。一部の実施形態では、Ｂ細胞がんは、リンパ腫または白血病である。場合によっては、白血病は、前白血病を含む。場合によっては、白血病は、急性白血病である。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。急性白血病には、例えば、急性リンパ性白血病または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）も含まれ、ＡＬＬには、Ｂ系統ＡＬＬ、Ｔ系統ＡＬＬ、およびＴ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）が含まれる。

腫瘍の非限定的な例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、末梢性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫ＡＬＫ^＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０^＋リンパ増殖性障害、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、および腸症関連Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である。一部の実施形態では、腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

「活性化Ｔ細胞核内因子１（ＮＦＡＴｃ１）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿１７２３９０．２またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、活性化Ｔ細胞ＤＮＡ結合転写複合体の成分であるタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＮＰ＿７６５９７８．１活性化Ｔ細胞核内因子、細胞質１アイソフォームＡ［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＰＳＴＳＦＰＶＰＳＫＦＰＬＧＰＡＡＡＶＦＧＲＧＥＴＬＧＰＡＰＲＡＧＧＴＭＫＳＡＥＥＥＨＹＧＹＡＳＳＮＶＳＰＡＬＰＬＰＴＡＨＳＴＬＰＡＰＣＨＮＬＱＴＳＴＰＧＩＩＰＰＡＤＨＰＳＧＹＧＡＡＬＤＧＧＰＡＧＹＦＬＳＳＧＨＴＲＰＤＧＡＰＡＬＥＳＰＲＩＥＩＴＳＣＬＧＬＹＨＮＮＮＱＦＦＨＤＶＥＶＥＤＶＬＰＳＳＫＲＳＰＳＴＡＴＬＳＬＰＳＬＥＡＹＲＤＰＳＣＬＳＰＡＳＳＬＳＳＲＳＣＮＳＥＡＳＳＹＥＳＮＹＳＹＰＹＡＳＰＱＴＳＰＷＱＳＰＣＶＳＰＫＴＴＤＰＥＥＧＦＰＲＧＬＧＡＣＴＬＬＧＳＰＲＨＳＰＳＴＳＰＲＡＳＶＴＥＥＳＷＬＧＡＲＳＳＲＰＡＳＰＣＮＫＲＫＹＳＬＮＧＲＱＰＰＹＳＰＨＨＳＰＴＰＳＰＨＧＳＰＲＶＳＶＴＤＤＳＷＬＧＮＴＴＱＹＴＳＳＡＩＶＡＡＩＮＡＬＴＴＤＳＳＬＤＬＧＤＧＶＰＶＫＳＲＫＴＴＬＥＱＰＰＳＶＡＬＫＶＥＰＶＧＥＤＬＧＳＰＰＰＰＡＤＦＡＰＥＤＹＳＳＦＱＨＩＲＫＧＧＦＣＤＱＹＬＡＶＰＱＨＰＹＱＷＡＫＰＫＰＬＳＰＴＳＹＭＳＰＴＬＰＡＬＤＷＱＬＰＳＨＳＧＰＹＥＬＲＩＥＶＱＰＫＳＨＨＲＡＨＹＥＴＥＧＳＲＧＡＶＫＡＳＡＧＧＨＰＩＶＱＬＨＧＹＬＥＮＥＰＬＭＬＱＬＦＩＧＴＡＤＤＲＬＬＲＰＨＡＦＹＱＶＨＲＩＴＧＫＴＶＳＴＴＳＨＥＡＩＬＳＮＴＫＶＬＥＩＰＬＬＰＥＮＳＭＲＡＶＩＤＣＡＧＩＬＫＬＲＮＳＤＩＥＬＲＫＧＥＴＤＩＧＲＫＮＴＲＶＲＬＶＦＲＶＨＶＰＱＰＳＧＲＴＬＳＬＱＶＡＳＮＰＩＥＣＳＱＲＳＡＱＥＬＰＬＶＥＫＱＳＴＤＳＹＰＶＶＧＧＫＫＭＶＬＳＧＨＮＦＬＱＤＳＫＶＩＦＶＥＫＡＰＤＧＨＨＶＷＥＭＥＡＫＴＤＲＤＬＣＫＰＮＳＬＶＶＥＩＰＰＦＲＮＱＲＩＴＳＰＶＨＶＳＦＹＶＣＮＧＫＲＫＲＳＱＹＱＲＦＴＹＬＰＡＮＧＮＡＩＦＬＴＶＳＲＥＨＥＲＶＧＣＦＦ

「活性化Ｔ細胞核内因子１（ＮＦＡＴｃ１）ポリヌクレオチド」とは、ＮＦＡＴｃ１ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。ＮＦＡＴｃ１遺伝子は、Ｔ細胞においてサイトカイン遺伝子（特に、ＩＬ－２およびＩＬ－４）の誘導性発現に関与するタンパク質をコードする。配列決定された例示的な核酸を以下に提供する。
＞ＮＭ＿１７２３９０．２Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ活性化Ｔ細胞核内因子１（ＮＦＡＴＣ１）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ
ＧＧＣＧＧＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＡＣＴＣＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＣＧＣＣＡＣＧＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＣＣＣＣＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＧＧＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＧＧＧＧＴＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＧＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＧＣＧＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＣＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＧＴＣＣＣＣＴＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＣＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＡＣＧＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＣＡＣＴＣＡＧＧＣＣＣＧＴＡＴＧＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＣＣＣＡＣＴＡＣＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＴＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＣＧＡＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＣＧＧＧＴＡＣＧＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＣＡＣＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＣＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＴＴＴＣＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＴＣＡＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＡＣＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＴＡＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣＧＴＧＧＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＧＣＡＣＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＣＣＣＧＴＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＴＧＣＡＴＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＡＡＧＣＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ

「非保存的変異」という用語は、異なるグループ間のアミノ酸置換（例えば、トリプトファンに対してリジン、またはセリンに対してフェニルアラニンなど）を含む。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性が、野生型タンパク質と比較して増加するように、機能的バリアントの生物学的活性を増強することができる。

「核局在化配列」、「核局在化シグナル」、または「ＮＬＳ」という用語は、タンパク質の細胞核への移入を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｐｌａｎｋらの２０００年１１月２３日に出願された国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０（ＷＯ／２００１／０３８５４７として２００１年５月３１日に公開）に記載されている（それらの内容は、例示的な核局在化配列のそれらの開示のために、参照により本明細書に援用される）。他の実施形態では、ＮＬＳは、例えば、Ｋｏｂｌａｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２０１８ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４１７２に記載されている最適化ＮＬＳである。一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ、ＰＫＫＫＲＫＶ、またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣを含む。

本明細書で使用される「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸塩基および酸性部分（例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマー）を含む化合物を指す。典型的には、ポリマー核酸（例えば、３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子）は、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結されている直鎖分子である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドの鎖）を指すように、互換的に使用され得る。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡを包含する。核酸は、天然に存在する核酸分子（例えば、ゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体の文脈で）、または他の天然に存在する核酸分子であり得る。他方、核酸分子は、天然に存在しない分子（例えば、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムもしくはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）であり得、または非天然のヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含んでもよい。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または類似の用語には、核酸類似体（例えば、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体）が含まれる。核酸は、天然源から精製され、組換え発現システムを使用して産生され、任意選択的に、精製され、化学的に合成されるなどされ得る。該当する場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、および骨格修飾を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。核酸配列は、別段の記載がない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）、化学修飾塩基、生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、挿入塩基、修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、ならびに／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト架橋）であるか、またはそれらを含む。「核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質」または「ｎａｐＤＮＡｂｐ」という用語は、「ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン」と互換的に使用され得、ｎａｐＤＮＡｂｐを特定の核酸配列に誘導するガイド核酸またはガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）などの核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と会合するタンパク質を指し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を、ガイドＲＮＡに相補的である特異的ＤＮＡ配列に誘導するガイドＲＮＡと会合することができる。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦが挙げられる。Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの修飾もしくは操作されたバージョンが挙げられる。他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質もまた、本開示の範囲内であるが、それらは本開示に具体的に列挙されていない場合がある。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．“ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ：ＷｈｅｒｅｆｒｏｍＨｅｒｅ？”ＣＲＩＳＰＲＪ．２０１８Ｏｃｔ；１：３２５－３３６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０１８．００３３、Ｙａｎｅｔａｌ．，“ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｄｉｖｅｒｓｅｔｙｐｅＶＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９Ｊａｎ４；３６３（６４２２）：８８－９１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１を参照されたい（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

「核酸塩基」、「窒素塩基」、または「塩基」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ヌクレオチドの成分であるヌクレオシドを形成する窒素含有生物学的化合物を指す。核酸塩基が塩基対を形成し、互いに積み重なる能力は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの長鎖ヘリックス構造に直接つながる。アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）の５つの核酸塩基は、一次または正準と呼ばれる。アデニンおよびグアニンは、プリンに由来し、シトシン、ウラシル、およびチミンは、ピリミジンに由来する。ＤＮＡおよびＲＮＡはまた、修飾された他の（非一次）塩基を含むことができる。非限定的な例示的な修飾核酸塩基としては、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、および５－ヒドロメチルシトシン（ｈｙｄｒｏｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）が挙げられる。ヒポキサンチンとキサンチンは、両方とも、変異誘発物質の存在により、脱アミノ化（アミン基をカルボニル基で置換すること）を介して生成され得る。ヒポキサンチンは、アデニンから修飾され得る。キサンチンは、グアニンから修飾され得る。ウラシルは、シトシンの脱アミノから生じ得る。「ヌクレオシド」は、核酸塩基および五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）からなる。ヌクレオシドの例として、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、およびデオキシシチジンが挙げられる。修飾核酸塩基を有するヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、キサントシン（Ｘ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、およびシュードウリジン（Ψ）が挙げられる。「ヌクレオチド」は、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、および少なくとも１つのリン酸基からなる。

「核酸塩基編集ドメイン」または「核酸塩基編集タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、シトシン（もしくはシチジン）のウラシル（もしくはウリジン）またはチミン（もしくはチミジン）への脱アミノ化、およびアデニン（もしくはアデノシン）のヒポキサンチン（もしくはイノシン）への脱アミノ化、ならびに非鋳型ヌクレオチド付加および挿入などの、ＲＮＡもしくはＤＮＡにおける核酸塩基修飾を触媒することができるタンパク質または酵素を指す。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメイン（例えば、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ；またはシチジンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼ）である。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、２つ以上のデアミナーゼドメイン（例えば、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼ）である。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、天然に存在する核酸塩基編集ドメインであり得る。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、天然に存在する核酸塩基編集ドメイン由来の操作されたもしくは進化した核酸塩基編集ドメインであり得る。核酸塩基編集ドメインは、細菌、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの任意の生物由来であり得る。

本明細書で使用される場合、「薬剤を取得すること」における「取得すること」は、薬剤を合成すること、購入すること、またはその他の取得することを含む。本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、疾患または障害と診断されているか、それを有するリスクもしくは発症するリスクがあるか、またはそれを有する疑いもしくは発症する疑いがある、哺乳動物の対象または個体を指す。一部の実施形態では、「患者」という用語は、疾患または障害を発症する可能性が平均よりも高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ラクダ、ラマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ウサギ、ラット、またはモルモット）および本明細書に開示される療法から利益を得ることができる他の哺乳動物であり得る。例示的なヒト患者は、男性および／または女性であり得る。

「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では、疾患または障害（例えば、Ｔ細胞性またはＮＫ細胞性の悪性腫瘍）を有すると診断されているか、それを有するリスクがあるか、それを有すると既定されているか、またはそれを有すると疑われる患者を指す。

「病原性変異」、「病原性バリアント」、「疾患ケーシング（ｄｉｓｅａｓｅｃａｓｉｎｇ）変異」、「病因性バリアント」、「有害な変異」、または「素因のある変異」という用語は、特定の疾患または障害に対する個体の感受性もしくは素因を増加させる遺伝子の変化または変異を指す。一部の実施形態では、病原性変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質において、少なくとも１つの病原性アミノ酸によって置換された少なくとも１つの野生型アミノ酸を含む。

「薬学的に許容される担体」という用語は、化合物を体のある部位（例えば、送達部位）から別の部位（例えば、臓器、組織、または体の一部）に運搬もしくは輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、または立体酸（ｓｔｅｒｉｃａｃｉｄ））、または溶媒封入材などの、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものであり、対象の組織に害を及ぼさない（例えば、生理学的に適合する、無菌、生理学的ｐＨなど）。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。

「薬学的組成物」という用語は、薬学的使用のために製剤化される組成物を意味する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、追加の薬剤（例えば、特異的送達用、半減期の増加、または他の治療用化合物）を含む。

「プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１またはＰＤ－１）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＡＪＳ１０３６０．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。ＰＤ－１タンパク質は、免疫反応中および許容条件下でＴ細胞の機能調節に関与していると考えられている。例示的なＢ２Ｍポリペプチド配列を以下に提供する。
＞ＡＪＳ１０３６０．１プログラム細胞死１タンパク質［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶＶＧＶＶＧＧＬＬＧＳＬＶＬＬＶＷＶＬＡＶＩＣＳＲＡＡＲＧＴＩＧＡＲＲＴＧＱＰＬＫＥＤＰＳＡＶＰＶＦＳＶＤＹＧＥＬＤＦＱＷＲＥＫＴＰＥＰＰＶＰＣＶＰＥＱＴＥＹＡＴＩＶＦＰＳＧＭＧＴＳＳＰＡＲＲＧＳＡＤＧＰＲＳＡＱＰＬＲＰＥＤＧＨＣＳＷＰＬ

「プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１またはＰＤ－１）ポリヌクレオチド」とは、ＰＤ－１ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。ＰＤＣＤ１遺伝子は、抑制性の細胞表面受容体をコードし、抗原特異的な様式で、Ｔ細胞のエフェクター機能を阻害する。例示的なＰＤＣＤ１核酸配列を以下に提供する。
＞ＡＹ２３８５１７．１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓプログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１）ｍＲＮＡ、完全長ＣＤＳ
ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＣＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡ

「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」という用語、およびそれらの文法的等価物は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合体を指し得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸のうちの１つ以上は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカー（共役、官能化、または他の修飾用）などの化学物質の添加によって修飾することができる。また、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する、組換え、もしくは合成のもの、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、ハイブリッドポリペプチドを指し、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含む。１つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分、またはタンパク質のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置することができ、したがって、アミノ末端融合タンパク質またはカルボキシ末端融合タンパク質をそれぞれ形成する。タンパク質は、異なるドメイン例えば、核酸結合ドメイン（例えば、タンパク質の標的部位への結合を誘導するＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）および核酸切断ドメイン、または核酸編集タンパク質の触媒ドメインを含み得る。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質性部分（例えば、核酸結合ドメイン）を構成するアミノ酸配列、および有機化合物（例えば、核酸切断剤）として機能し得る化合物を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と複合体を形成しているか、または核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と会合している。本明細書に提供されるタンパク質のいずれかは、当該技術分野で既知の任意の方法によって産生され得る。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生され得、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、ＧｒｅｅｎａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））に記載されているものが含まれる（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

本明細書に開示されるポリペプチドおよびタンパク質（その機能部分および機能性バリアントを含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該技術分野で既知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノ－ｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α、γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、ならびにα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチド構築物の１つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾物と会合し得る。翻訳後修飾の非限定的な例としては、リン酸化、アシル化（アセチル化およびホルミル化を含む）、グリコシル化（Ｎ結合およびＯ結合を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、アルキル化（メチル化およびエチル化を含む）、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション、リポイル化、およびヨウ素化が挙げられる。

「プロモーター」とは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイを意味する。プロモーターは、転写の開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意選択的に、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー配列要素を含む。「構成的プロモーター」は、持続的に活性であり、外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子（例えば、転写因子）によって調節される。例として、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。

タンパク質または核酸の文脈で本明細書で使用される「組換え」という用語は、天然には存在せず、人工の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、一部の実施形態では、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含む。

「減少する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変化を意味する。

「参照」とは、標準条件または対照条件を意味する。一実施形態では、参照は、野生型または健康な細胞である。他の実施形態では、参照は、未処理細胞であり、試験条件に供されないか、あるいはプラセボもしくは生理食塩水、培地、緩衝液、および／または目的のポリヌクレオチドを保有しない対照ベクターに供される。

「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットまたはその全体、例えば、全長のｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、概して、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、および約１００ヌクレオチドもしくは約３００ヌクレオチド、またはその辺りのもしくはその間の任意の整数である。一部の実施形態では、参照配列は、目的のタンパク質の野生型配列である。他の実施形態では、参照配列は、野生型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。

「ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ」および「ＲＮＡガイドヌクレアーゼ」という用語は、切断の標的ではない１つ以上のＲＮＡとともに（例えば、それと結合または会合して）使用される。一部の実施形態では、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼは、ＲＮＡと複合体を形成している場合、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と称され得る。典型的には、結合したＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体として、または単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称され得るが、「ｇＲＮＡ」は、単一の分子として、または２つ以上の分子の複合体として存在するガイドＲＮＡを指すように互換的に使用される。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２つのドメイン：（１）標的核酸と相同性を共有する（例えば、また、標的へのＣａｓ９複合体の結合を指示する）ドメイン、および（２）Ｃａｓ９タンパク質に結合するドメインを含む。一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる配列に対応し、ステム・ループ構造を含む。例えば、一部の実施形態では、ドメイン（２）は、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）に提供されるｔｒａｃｒＲＮＡと同一または相同である（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。ｇＲＮＡの他の例（例えば、ドメイン２を含むもの）は、「切替可能なＣａｓ９ヌクレアーゼとその使用」と題する２０１３年９月６日に出願された米国仮特許出願第６１／８７４，６８２号、および「機能的ヌクレアーゼのための送達システム」と題する２０１３年９月６日に出願された米国仮特許出願第６１／８７４，７４６号に見出すことができる（各々の内容全体が、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ドメイン（１）および（２）のうちの２つ以上を含み、「伸長ｇＲＮＡ」と称され得る。例えば、伸長ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるように、２つ以上のＣａｓ９タンパク質に結合し、２つ以上の異なる領域で標的核酸に結合する。ｇＲＮＡは、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これが、ヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の当該標的部位への結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。

一部の実施形態では、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（Ｃｓｎｌ）である（例えば、“ＣｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎＭｌｓｔｒａｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ．”ＦｅｒｒｅｔｔｉＪ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）、“ＣＲＩＳＰＲＲＮＡｍａｔｕｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌＲＮＡａｎｄｈｏｓｔｆａｃｔｏｒＲＮａｓｅＩＩＩ．”ＤｅｌｔｃｈｅｖａＥ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４７１：６０２－６０７（２０１１）を参照されたい）。ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用してＤＮＡ切断部位を標的化するため、これらのタンパク質は、原則として、ガイドＲＮＡによって指定される任意の配列を標的化することができる。部位特異的切断のために（例えば、ゲノムを修飾するために）Ｃａｓ９などのＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼを使用する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔａｌ．，ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８１９－８２３（２０１３）、Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔａｌ．，ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖｉａＣａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８２３－８２６（２０１３）、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔａｌ．，ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｕｓｉｎｇａＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１，２２７－２２９（２０１３）、Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＲＮＡ－ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．ｅＬｉｆｅ２，ｅ００４７１（２０１３）、Ｄｉｃａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）、Ｊｉａｎｇ，Ｗ．ｅｔａｌ．ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１，２３３－２３９（２０１３）を参照されたい。各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

「シグナル伝達ドメイン」とは、Ｔ細胞で発現するタンパク質の細胞内部分を意味し、これは、エフェクター機能シグナル（例えば、活性化シグナル）をＴ細胞に伝達し、特化した機能を行うようにＴ細胞に指示する。Ｔ細胞の活性化は、いくつかの要因によって誘導され得、同種抗原が、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体に結合すること、および同種リガンドが、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子に結合すること、が含まれる。Ｔ細胞共刺激分子は、Ｔ細胞上の同種結合パートナーであり、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、Ｔ細胞による共刺激応答（例えば、限定されないが、増殖）を媒介する。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２の細胞質ドメインである。Ｔ細胞の活性化は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞の増殖および分化）につながる（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５９１－６１９，２００９を参照されたい）。例示的なＴ細胞シグナル伝達ドメインは、当該技術分野で既知である。非限定的な例としては、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のシグナル伝達ドメインが挙げられる。

「一本鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、遺伝子的に融合された一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結された１つ以上の抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む、遺伝子操作された分子を意味する（例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：５８７９－５８８３，１９８８：Ａｈｍａｄｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０：Ｍａｒｂｒｙ，ＩＤｒｕｇｓ，１３：５４３－５４９，２０１０を参照されたい）。一部の実施形態では、ｓｃＦｖにおけるＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、ＶＨドメイン－リンカードメイン－ＶＬドメインである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖにおけるＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、ＶＬドメイン－リンカードメイン－ＶＨドメインである。

「一塩基多型（ＳＮＰ）」という用語は、ゲノムの特定の位置で生じる一塩基におけるバリエーションであり、各バリエーションは、集団内にある程度存在する（例えば、＞１％）。例えば、ヒトゲノムの特定の塩基位置において、ほとんどの個体では、Ｃのヌクレオチドが現れ得るが、少数の個体では、その位置がＡによって占められる。これは、この特定の位置にＳＮＰが存在することを意味し、２つの可能なヌクレオチドのバリエーション（ＣまたはＡ）は、この位置について、アレルであると言われる。ＳＮＰは、疾患に対する感受性の違いの根底にある。病気の重症度および治療に対する私たちの身体の反応もまた、遺伝的バリエーションの現れである。ＳＮＰは、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、または遺伝子間領域（遺伝子間の領域）に含まれ得る。一部の実施形態では、コード配列内のＳＮＰは、遺伝コードの縮重のため、必ずしも、産生されたタンパク質のアミノ酸配列を変化させるわけではない。コード領域のＳＮＰは、同義ＳＮＰと非同義ＳＮＰの２種類がある。同義ＳＮＰは、タンパク質配列に影響を与えないが、非同義ＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させる。非同義のＳＮＰは、ミスセンスとナンセンスの２種類がある。タンパク質コード領域にないＳＮＰは、遺伝子スプライシング、転写因子の結合、メッセンジャーＲＮＡの分解、または非コードＲＮＡの配列に依然として影響を及ぼし得る。このタイプのＳＮＰによって影響を受ける遺伝子発現は、ｅＳＮＰ（発現ＳＮＰ）と称され、遺伝子の上流または下流にあり得る。一塩基バリアント（ＳＮＶ）は、頻度の制限のない単一ヌクレオチドにおけるバリエーションであり、体細胞において生じ得る。体細胞の一塩基バリエーション（例えば、がんに関連付けられる）もまた、一塩基変化と呼ぶこともできる。

「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子を認識し、結合するが、試料（例えば、生体試料）中の他の分子を実質的に認識せず、結合しない、核酸分子、ポリペプチド、またはその複合体（例えば、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、ガイド核酸、およびキメラ抗原受容体）、化合物、または分子を意味する。例えば、キメラ抗原受容体は、細胞の表面で発現された特定のマーカーと特異的に結合するが、他のポリペプチド、炭水化物、脂質、または細胞の表面上の任意の他の化合物とは結合しない。

本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。かかる核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列との「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。かかる核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列との「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々な厳密性の条件下で、相補ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）またはその一部の間に二本鎖分子を形成する対を意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。

例えば、厳密な塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、より好ましくは、約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。低い厳密性のハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの不在下で得られ得るが、高い厳密性のハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得られ得る。厳密な温度条件には、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、および最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれる。ハイブリダイゼーションの時間、洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、および担体ＤＮＡの包含または除外などの様々な追加のパラメータは、当業者に周知である。必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルの厳密性が達成される。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および１％のＳＤＳ中で、３０℃で行われる。別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中で、３７℃で行われる。別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、および２００μｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ中で、４２℃で行われる。これらの条件における有用な変形は、当業者には明らかであろう。

ほとんどの用途において、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもまた、厳密性が異なるであろう。洗浄の厳密性の条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄の厳密性は、塩濃度を低下させることによって、または温度を上昇させることによって、増加させることができる。例えば、洗浄ステップのための厳密な塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、および最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄ステップのための厳密な温度条件には、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度が含まれる。一実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中で、２５℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中で、４２℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中で、６８℃で行われる。これらの条件におけるさらなる変形は、当業者には明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎａｎｄＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６：１８０，１９７７）、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎａｎｄＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７２：３９６１，１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００１）、ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ（ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。

「スプリット（ｓｐｌｉｔ）」は、２つ以上の断片に分割されることを意味する。

「スプリットＣａｓ９タンパク質」または「スプリットＣａｓ９」は、２つの別個のヌクレオチド配列によってコードされるＮ末端断片およびＣ末端断片として提供されるＣａｓ９タンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分に対応するポリペプチドをスプライシングして、「再構築された」Ｃａｓ９タンパク質を形成することができる。特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ１５６，Ｉｓｓｕｅ５，ｐｐ．９３５－９４９，２０１４，ｏｒａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＪｉａｎｇｅｔａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３５１：８６７－８７１．ＰＤＢｆｉｌｅ：５Ｆ９Ｒに記載されているように、タンパク質の無秩序領域内で２つの断片に分割される（その各々は、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、タンパク質は、約アミノ酸Ａ２９２～Ｇ３６４、Ｆ４４５～Ｋ４８３、もしくはＥ５６５～Ｔ６３７の間のＳｐＣａｓ９の領域内の任意のＣ、Ｔ、Ａ、もしくはＳにおいて、または任意の他のＣａｓ９、Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｎＣａｓ９、ｄＣａｓ９）もしくは他のｎａｐＤＮＡｂｐにおける対応する位置において、２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９のＴ３１０、Ｔ３１３、Ａ４５６、Ｓ４６９、またはＣ５７４において、２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質を２つの断片に分割するプロセスは、タンパク質を「スプリットする」と称される。

他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９野生型（ＳｐＣａｓ９）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２７３７．２、Ｕｎｉｐｒｏｔ参照配列：Ｑ９９ＺＷ２）のアミノ酸１～５７３もしくは１～６３７を含み、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端部分は、ＳｐＣａｓ９野生型のアミノ酸５７４～１３６８もしくは６３８～１３６８の部分、またはそれらの対応する位置を含む。

スプリットＣａｓ９のＣ末端部分を、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分と連結して、完全なＣａｓ９タンパク質を形成することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端部分は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分が終わるところから始まる。したがって、一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分は、ｓｐＣａｓ９のアミノ酸（５５１～６５１）～１３６８の一部を含む。「（５５１～６５１）～１３６８」とは、アミノ酸５５１～６５１（境界値を含む）の間のアミノ酸から始まり、アミノ酸１３６８で終わることを意味する。例えば、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分は、ｓｐＣａｓ９のアミノ酸５５１～１３６８、５５２～１３６８、５５３～１３６８、５５４～１３６８、５５５～１３６８、５５６～１３６８、５５７～１３６８、５５８～１３６８、５５９～１３６８、５６０～１３６８、５６１～１３６８、５６２～１３６８、５６３～１３６８、５６４～１３６８、５６５～１３６８、５６６～１３６８、５６７～１３６８、５６８～１３６８、５６９～１３６８、５７０～１３６８、５７１～１３６８、５７２～１３６８、５７３～１３６８、５７４～１３６８、５７５～１３６８、５７６～１３６８、５７７～１３６８、５７８～１３６８、５７９～１３６８、５８０～１３６８、５８１～１３６８、５８２～１３６８、５８３～１３６８、５８４～１３６８、５８５～１３６８、５８６～１３６８、５８７～１３６８、５８８～１３６８、５８９～１３６８、５９０～１３６８、５９１～１３６８、５９２～１３６８、５９３～１３６８、５９４～１３６８、５９５～１３６８、５９６～１３６８、５９７～１３６８、５９８～１３６８、５９９～１３６８、６００～１３６８、６０１～１３６８、６０２～１３６８、６０３～１３６８、６０４～１３６８、６０５～１３６８、６０６～１３６８、６０７～１３６８、６０８～１３６８、６０９～１３６８、６１０～１３６８、６１１～１３６８、６１２～１３６８、６１３～１３６８、６１４～１３６８、６１５～１３６８、６１６～１３６８、６１７～１３６８、６１８～１３６８、６１９～１３６８、６２０～１３６８、６２１～１３６８、６２２～１３６８、６２３～１３６８、６２４～１３６８、６２５～１３６８、６２６～１３６８、６２７～１３６８、６２８～１３６８、６２９～１３６８、６３０～１３６８、６３１～１３６８、６３２～１３６８、６３３～１３６８、６３４～１３６８、６３５～１３６８、６３６～１３６８、６３７～１３６８、６３８～１３６８、６３９～１３６８、６４０～１３６８、６４１～１３６８、６４２～１３６８、６４３～１３６８、６４４～１３６８、６４５～１３６８、６４６～１３６８、６４７～１３６８、６４８～１３６８、６４９～１３６８、６５０～１３６８、または６５１～１３６８のうちのいずれか１つの部分を含み得る。一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９タンパク質のＣ末端部分は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸５７４～１３６８または６３８～１３６８の一部分を含む。

「対象」とは、哺乳動物を意味し、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ウシ、またはネコ）を含むが、これらに限定されない。対象には、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、労働力を生み出し、食料などの商品を提供するために飼育された家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄａｎｉｍａｌ）が含まれ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウサギ、およびヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。

「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または参照核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のうちのいずれか１つ）と、少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。一実施形態では、かかる配列は、比較のために使用される配列と、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも６０％、８０％または８５％、９０％、９５％またはさらに９９％同一である。

配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ、１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＢＡＬＴ、ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得、ｅ^－３～ｅ^－１００の確率スコアは、密接に関連する配列を示す。

ＣＯＢＡＬＴは、例えば、以下のパラメータで使用される。
ａ）整列パラメータ：ギャップペナルティ－１１，－１およびエンドギャップペナルティ－５，－１、
ｂ）ＣＤＤパラメータ：ＲＰＳＢＬＡＳＴを使用する；ＢｌａｓｔＥ値０．００３；保存された列を検索して再計算する、および
ｃ）クエリクラスタリングパラメータ：クエリクラスタを使用する；ワードサイズ４；最大クラスタ距離０．８；アルファベット通常。

ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅは、例えば、以下のパラメータを用いて使用される。
ａ）マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、
ｂ）ＧＡＰＯＰＥＮ：１０、
ｃ）ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ：０．５、
ｄ）ＯＵＴＰＵＴＦＯＲＭＡＴ：ｐａｉｒ、
ｅ）ＥＮＤＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ：ｆａｌｓｅ、
ｆ）ＥＮＤＧＡＰＯＰＥＮ：１０、および
ｇ）ＥＮＤＧＡＰＥＸＴＥＮＤ：０．５。

「標的部位」という用語は、核酸塩基エディターによって修飾される核酸分子内の配列を指す。一実施形態では、標的部位は、デアミナーゼまたはデアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼ）を含む融合タンパク質によって脱アミノ化される。

「Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０１８４８．２またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ｓｐ｜Ｐ０１８４８．２｜ＴＲＡＣ＿ＨＵＭＡＮＲｅｃＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝Ｔ細胞受容体α定常領域
ＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ

「Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）ポリヌクレオチド」とは、ＴＲＡＣポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＴＲＡＣ核酸配列を以下に提供する。
ＵＣＳＣヒトゲノムデータベース、遺伝子ＥＮＳＧ０００００２７７７３４．８ヒトＴ細胞受容体α鎖（ＴＣＲ－α）
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上記の小文字のヌクレオチドは、非翻訳領域またはイントロンであり、大文字のヌクレオチドは、エキソンである。
＞Ｘ０２５９２．１Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲ－α）のヒトｍＲＮＡ
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「Ｔ細胞受容体β定常領域１ポリペプチド（ＴＲＢＣ１）」とは、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０１８５０またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ｓｐ｜Ｐ０１８５０｜ＴＲＢＣ１＿ＨＵＭＡＮＴ細胞受容体β定常領域１ＯＳ＝ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＯＸ＝９６０６ＧＮ＝ＴＲＢＣ１ＰＥ＝１ＳＶ＝４
ＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ

「Ｔ細胞受容体β定常領域１ポリヌクレオチド（ＴＲＢＣ１）」とは、ＴＲＢＣ１ポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＴＲＢＣ１核酸配列を以下に提供する。
＞Ｘ００４３７．１
ＣＴＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＣＣＧＡＴＡＧＡＴＧＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＴＴＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＣＣＧＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＣＣＡＡＴＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＣ

「Ｔ細胞受容体β定常領域２ポリペプチド（ＴＲＢＣ２）」とは、ＮＣＢＩ受託番号Ａ０Ａ５Ｂ９またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ｓｐ｜Ａ０Ａ５Ｂ９｜ＴＲＢＣ２＿ＨＵＭＡＮＴ細胞受容体β定常領域２ＯＳ＝ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＯＸ＝９６０６ＧＮ＝ＴＲＢＣ２ＰＥ＝１ＳＶ＝２
ＤＬＫＮＶＦＰＰＫＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ

「Ｔ細胞受容体β定常領域２ポリヌクレオチド（ＴＲＢＣ２）」とは、ＴＲＡＣポリペプチドをコードする核酸を意味する。例示的なＴＲＢＣ２核酸配列を以下に提供する。
＞ＮＧ＿００１３３３．２：６５５０９５－６５６５８３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ染色体７上のＴ細胞受容体β遺伝子座（ＴＲＢ）
ＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＣＡＡＧＡＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＡＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＡＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＡＡＧＧＣＴＣＡＡＴＧＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴＧＡＧＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＴＧＣＴＣＴＣＧＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＣＣＴＡＣＴＣＡＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧ

「５－メチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＦＭ９９２３６９．１またはその断片と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、メチルシトシンを５－ヒドロキシメチルシトシンに変換する触媒活性を有するタンパク質を意味する。遺伝子の欠陥は骨髄増殖性障害と関連しており、酵素がシトシンをメチル化する能力は転写調節に寄与する。例示的なＴＥＴ２アミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＣＡＸ３０４９２．１ｔｅｔがん遺伝子ファミリーメンバー２［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＥＱＤＲＴＮＨＶＥＧＮＲＬＳＰＦＬＩＰＳＰＰＩＣＱＴＥＰＬＡＴＫＬＱＮＧＳＰＬＰＥＲＡＨＰＥＶＮＧＤＴＫＷＨＳＦＫＳＹＹＧＩＰＣＭＫＧＳＱＮＳＲＶＳＰＤＦＴＱＥＳＲＧＹＳＫＣＬＱＮＧＧＩＫＲＴＶＳＥＰＳＬＳＧＬＬＱＩＫＫＬＫＱＤＱＫＡＮＧＥＲＲＮＦＧＶＳＱＥＲＮＰＧＥＳＳＱＰＮＶＳＤＬＳＤＫＫＥＳＶＳＳＶＡＱＥＮＡＶＫＤＦＴＳＦＳＴＨＮＣＳＧＰＥＮＰＥＬＱＩＬＮＥＱＥＧＫＳＡＮＹＨＤＫＮＩＶＬＬＫＮＫＡＶＬＭＰＮＧＡＴＶＳＡＳＳＶＥＨＴＨＧＥＬＬＥＫＴＬＳＱＹＹＰＤＣＶＳＩＡＶＱＫＴＴＳＨＩＮＡＩＮＳＱＡＴＮＥＬＳＣＥＩＴＨＰＳＨＴＳＧＱＩＮＳＡＱＴＳＮＳＥＬＰＰＫＰＡＡＶＶＳＥＡＣＤＡＤＤＡＤＮＡＳＫＬＡＡＭＬＮＴＣＳＦＱＫＰＥＱＬＱＱＱＫＳＶＦＥＩＣＰＳＰＡＥＮＮＩＱＧＴＴＫＬＡＳＧＥＥＦＣＳＧＳＳＳＮＬＱＡＰＧＧＳＳＥＲＹＬＫＱＮＥＭＮＧＡＹＦＫＱＳＳＶＦＴＫＤＳＦＳＡＴＴＴＰＰＰＰＳＱＬＬＬＳＰＰＰＰＬＰＱＶＰＱＬＰＳＥＧＫＳＴＬＮＧＧＶＬＥＥＨＨＨＹＰＮＱＳＮＴＴＬＬＲＥＶＫＩＥＧＫＰＥＡＰＰＳＱＳＰＮＰＳＴＨＶＣＳＰＳＰＭＬＳＥＲＰＱＮＮＣＶＮＲＮＤＩＱＴＡＧＴＭＴＶＰＬＣＳＥＫＴＲＰＭＳＥＨＬＫＨＮＰＰＩＦＧＳＳＧＥＬＱＤＮＣＱＱＬＭＲＮＫＥＱＥＩＬＫＧＲＤＫＥＱＴＲＤＬＶＰＰＴＱＨＹＬＫＰＧＷＩＥＬＫＡＰＲＦＨＱＡＥＳＨＬＫＲＮＥＡＳＬＰＳＩＬＱＹＱＰＮＬＳＮＱＭＴＳＫＱＹＴＧＮＳＮＭＰＧＧＬＰＲＱＡＹＴＱＫＴＴＱＬＥＨＫＳＱＭＹＱＶＥＭＮＱＧＱＳＱＧＴＶＤＱＨＬＱＦＱＫＰＳＨＱＶＨＦＳＫＴＤＨＬＰＫＡＨＶＱＳＬＣＧＴＲＦＨＦＱＱＲＡＤＳＱＴＥＫＬＭＳＰＶＬＫＱＨＬＮＱＱＡＳＥＴＥＰＦＳＮＳＨＬＬＱＨＫＰＨＫＱＡＡＱＴＱＰＳＱＳＳＨＬＰＱＮＱＱＱＱＱＫＬＱＩＫＮＫＥＥＩＬＱＴＦＰＨＰＱＳＮＮＤＱＱＲＥＧＳＦＦＧＱＴＫＶＥＥＣＦＨＧＥＮＱＹＳＫＳＳＥＦＥＴＨＮＶＱＭＧＬＥＥＶＱＮＩＮＲＲＮＳＰＹＳＱＴＭＫＳＳＡＣＫＩＱＶＳＣＳＮＮＴＨＬＶＳＥＮＫＥＱＴＴＨＰＥＬＦＡＧＮＫＴＱＮＬＨＨＭＱＹＦＰＮＮＶＩＰＫＱＤＬＬＨＲＣＦＱＥＱＥＱＫＳＱＱＡＳＶＬＱＧＹＫＮＲＮＱＤＭＳＧＱＱＡＡＱＬＡＱＱＲＹＬＩＨＮＨＡＮＶＦＰＶＰＤＱＧＧＳＨＴＱＴＰＰＱＫＤＴＱＫＨＡＡＬＲＷＨＬＬＱＫＱＥＱＱＱＴＱＱＰＱＴＥＳＣＨＳＱＭＨＲＰＩＫＶＥＰＧＣＫＰＨＡＣＭＨＴＡＰＰＥＮＫＴＷＫＫＶＴＫＱＥＮＰＰＡＳＣＤＮＶＱＱＫＳＩＩＥＴＭＥＱＨＬＫＱＦＨＡＫＳＬＦＤＨＫＡＬＴＬＫＳＱＫＱＶＫＶＥＭＳＧＰＶＴＶＬＴＲＱＴＴＡＡＥＬＤＳＨＴＰＡＬＥＱＱＴＴＳＳＥＫＴＰＴＫＲＴＡＡＳＶＬＮＮＦＩＥＳＰＳＫＬＬＤＴＰＩＫＮＬＬＤＴＰＶＫＴＱＹＤＦＰＳＣＲＣＶＥＱＩＩＥＫＤＥＧＰＦＹＴＨＬＧＡＧＰＮＶＡＡＩＲＥＩＭＥＥＲＦＧＱＫＧＫＡＩＲＩＥＲＶＩＹＴＧＫＥＧＫＳＳＱＧＣＰＩＡＫＷＶＶＲＲＳＳＳＥＥＫＬＬＣＬＶＲＥＲＡＧＨＴＣＥＡＡＶＩＶＩＬＩＬＶＷＥＧＩＰＬＳＬＡＤＫＬＹＳＥＬＴＥＴＬＲＫＹＧＴＬＴＮＲＲＣＡＬＮＥＥＲＴＣＡＣＱＧＬＤＰＥＴＣＧＡＳＦＳＦＧＣＳＷＳＭＹＹＮＧＣＫＦＡＲＳＫＩＰＲＫＦＫＬＬＧＤＤＰＫＥＥＥＫＬＥＳＨＬＱＮＬＳＴＬＭＡＰＴＹＫＫＬＡＰＤＡＹＮＮＱＩＥＹＥＨＲＡＰＥＣＲＬＧＬＫＥＧＲＰＦＳＧＶＴＡＣＬＤＦＣＡＨＡＨＲＤＬＨＮＭＱＮＧＳＴＬＶＣＴＬＴＲＥＤＮＲＥＦＧＧＫＰＥＤＥＱＬＨＶＬＰＬＹＫＶＳＤＶＤＥＦＧＳＶＥＡＱＥＥＫＫＲＳＧＡＩＱＶＬＳＳＦＲＲＫＶＲＭＬＡＥＰＶＫＴＣＲＱＲＫＬＥＡＫＫＡＡＡＥＫＬＳＳＬＥＮＳＳＮＫＮＥＫＥＫＳＡＰＳＲＴＫＱＴＥＮＡＳＱＡＫＱＬＡＥＬＬＲＬＳＧＰＶＭＱＱＳＱＱＰＱＰＬＱＫＱＰＰＱＰＱＱＱＱＲＰＱＱＱＱＰＨＨＰＱＴＥＳＶＮＳＹＳＡＳＧＳＴＮＰＹＭＲＲＰＮＰＶＳＰＹＰＮＳＳＨＴＳＤＩＹＧＳＴＳＰＭＮＦＹＳＴＳＳＱＡＡＧＳＹＬＮＳＳＮＰＭＮＰＹＰＧＬＬＮＱＮＴＱＹＰＳＹＱＣＮＧＮＬＳＶＤＮＣＳＰＹＬＧＳＹＳＰＱＳＱＰＭＤＬＹＲＹＰＳＱＤＰＬＳＫＬＳＬＰＰＩＨＴＬＹＱＰＲＦＧＮＳＱＳＦＴＳＫＹＬＧＹＧＮＱＮＭＱＧＤＧＦＳＳＣＴＩＲＰＮＶＨＨＶＧＫＬＰＰＹＰＴＨＥＭＤＧＨＦＭＧＡＴＳＲＬＰＰＮＬＳＮＰＮＭＤＹＫＮＧＥＨＨＳＰＳＨＩＩＨＮＹＳＡＡＰＧＭＦＮＳＳＬＨＡＬＨＬＱＮＫＥＮＤＭＬＳＨＴＡＮＧＬＳＫＭＬＰＡＬＮＨＤＲＴＡＣＶＱＧＧＬＨＫＬＳＤＡＮＧＱＥＫＱＰＬＡＬＶＱＧＶＡＳＧＡＥＤＮＤＥＶＷＳＤＳＥＱＳＦＬＤＰＤＩＧＧＶＡＶＡＰＴＨＧＳＩＬＩＥＣＡＫＲＥＬＨＡＴＴＰＬＫＮＰＮＲＮＨＰＴＲＩＳＬＶＦＹＱＨＫＳＭＮＥＰＫＨＧＬＡＬＷＥＡＫＭＡＥＫＡＲＥＫＥＥＥＣＥＫＹＧＰＤＹＶＰＱＫＳＨＧＫＫＶＫＲＥＰＡＥＰＨＥＴＳＥＰＴＹＬＲＦＩＫＳＬＡＥＲＴＭＳＶＴＴＤＳＴＶＴＴＳＰＹＡＦＴＲＶＴＧＰＹＮＲＹＩ

「５－メチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）ポリヌクレオチド」とは、ＴＥＴ２ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。ＴＥＴポリペプチドは、メチルシトシンジオキシゲナーゼをコードし、転写調節活性を有する。例示的なＴＥＴ２核酸を以下に提示する。
＞ＦＭ９９２３６９．１ｔｅｔがん遺伝子ファミリーメンバー２（ＴＥＴ２遺伝子）のＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍＲＮＡ
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「形質転換増殖因子受容体２（ＴＧＦＢＲＩＩ）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＡＢＧ６５６３２．１またはその断片と少なくとも約８５％の配列同一性を有し、免疫抑制活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＡＢＧ６５６３２．１形質転換増殖因子β受容体ＩＩ［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ

「形質転換増殖因子受容体２（ＴＧＦＢＲＩＩ）ポリヌクレオチド」とは、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドをコードする核酸を意味する。ＴＧＦＢＲＩＩ遺伝子は、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質をコードする。例示的なＴＧＦＢＲＩＩ核酸を以下に提供する。
Ｍ８５０７９．１ヒトＴＧＦ－βＩＩ型受容体ｍＲＮＡ、完全長ＣＤＳ
ＧＴＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧＴＣＴＡＴＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＣＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＴＡＴＣＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＣＧＣＧＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＡＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＣＴＧＴＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＴＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＡＡＴＡＧＣＴＣＴＴＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＡ

「ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＡＣＤ７４７５７．１と少なくとも約８５％の配列同一性を有し、免疫調節活性を有するタンパク質を意味する。例示的なＴＩＧＩＴアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＡＣＤ７４７５７．１ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＲＷＣＬＬＬＩＷＡＱＧＬＲＱＡＰＬＡＳＧＭＭＴＧＴＩＥＴＴＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦＴＥＴＧ

「ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）ポリヌクレオチド」とは、ＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする核酸を意味する。ＴＩＧＩＴ遺伝子は、腫瘍およびＴ細胞枯渇に関連する抑制性免疫受容体をコードする。例示的な核酸配列を以下に提供する。
ＥＵ６７５３１０．１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）ｍＲＮＡ、完全長ＣＤＳ
ＣＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＡＣＡＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＣＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＣＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧ

本明細書で使用される場合、「形質導入」は、遺伝子または遺伝物質を、ウイルスベクターを介して細胞に移すことを意味する。

「形質転換」は、本明細書で使用される場合、細胞に遺伝子変化を導入するプロセスを指し、外因性核酸の導入によってもたらされる。

「トランスフェクション」は、遺伝子または遺伝物質を、化学的手段または物理的手段を介して細胞に移すことを指す。

「転座」とは、非相同染色体間の核酸セグメントの再編成を意味する。

「膜貫通ドメイン」とは、脂質二重層（例えば、細胞またはウイルスもしくはウイルス様粒子の脂質二重層）に挿入されるアミノ酸配列を意味する。膜貫通ドメインを使用して、目的のタンパク質（例えば、ＣＡＲ）を膜に固定することができる。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示のＣＡＲで使用される膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含むことができる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、およびＣＤ３ζに由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインである。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、障害および／またはそれに関連する症状を低減もしくは緩和すること、あるいは所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。除外されないが、障害または状態を治療することは、障害、状態またはそれに関連する症状が完全に排除される必要がないことを理解されたい。一部の実施形態では、効果は治療的であり、すなわち、限定されないが、その効果は、疾患および／または疾患に起因する有害な症状を、部分的または完全に、低減、減少、抑制、軽減、緩和、（その強度を）低下、または治癒する。一部の実施形態では、効果は予防的であり、すなわち、効果は、疾患または状態の発生または再発を、保護または予防する。この目的のために、本開示の方法は、治療有効量の本明細書に記載される組成物を投与することを含む。
「ウラシルグリコシラーゼ阻害因子」または「ＵＧＩ」という用語は、ウラシル除去修復系を阻害する薬剤を意味する。一実施形態では、薬剤は、タンパク質またはその断片であり、宿主のウラシルＤＮＡグリコシラーゼに結合し、ＤＮＡからのウラシル残基の除去を防止する。一実施形態では、ＵＧＩは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質、その断片、またはドメインである。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩまたはその修飾バージョンを含む。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、以下に記載される例示的なアミノ酸配列の断片を含む。一部の実施形態では、ＵＧＩ断片は、以下に提供される例示的なＵＧＩ配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＵＧＩは、以下に記載される例示的なＵＧＩアミノ酸配列またはその断片に相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＵＧＩまたはその一部は、以下に記載されるように、野生型ＵＧＩもしくはＵＧＩ配列またはその一部と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％同一である。例示的なＵＧＩは、以下のアミノ酸配列を含む：
＞ｓｐｌＰ１４７３９ＩＵＮＧＩ＿ＢＰＰＢ２ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害因子

ＭＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ。「ベクター」という用語は、核酸配列を細胞に導入し、形質転換細胞もたらす手段を指す。ベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン、ファージ、ウイルス、リポソーム、およびエピソームが挙げられる。「発現ベクター」は、レシピエント細胞において発現されるヌクレオチド配列を含む核酸配列である。発現ベクターは、導入配列（例えば、開始、停止、エンハンサー、プロモーター、および分泌配列）の発現を促進（ｐｒｏｍｏｔｅ）および／または促進（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ）するための追加の核酸配列を含んでもよい。

「Ｔ細胞受容体ζ鎖関連プロテインキナーゼ７０（ＺＡＰ７０）ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ５３８７８．１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、キナーゼ活性を有するタンパク質を意味する。例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
＞ＡＡＨ５３８７８．１ ζ鎖（ＴＣＲ）関連プロテインキナーゼ７０ｋＤａ［Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ］
ＭＰＤＰＡＡＨＬＰＦＦＹＧＳＩＳＲＡＥＡＥＥＨＬＫＬＡＧＭＡＤＧＬＦＬＬＲＱＣＬＲＳＬＧＧＹＶＬＳＬＶＨＤＶＲＦＨＨＦＰＩＥＲＱＬＮＧＴＹＡＩＡＧＧＫＡＨＣＧＰＡＥＬＣＥＦＹＳＲＤＰＤＧＬＰＣＮＬＲＫＰＣＮＲＰＳＧＬＥＰＱＰＧＶＦＤＣＬＲＤＡＭＶＲＤＹＶＲＱＴＷＫＬＥＧＥＡＬＥＱＡＩＩＳＱＡＰＱＶＥＫＬＩＡＴＴＡＨＥＲＭＰＷＹＨＳＳＬＴＲＥＥＡＥＲＫＬＹＳＧＡＱＴＤＧＫＦＬＬＲＰＲＫＥＱＧＴＹＡＬＳＬＩＹＧＫＴＶＹＨＹＬＩＳＱＤＫＡＧＫＹＣＩＰＥＧＴＫＦＤＴＬＷＱＬＶＥＹＬＫＬＫＡＤＧＬＩＹＣＬＫＥＡＣＰＮＳＳＡＳＮＡＳＧＡＡＡＰＴＬＰＡＨＰＳＴＬＴＨＰＱＲＲＩＤＴＬＮＳＤＧＹＴＰＥＰＡＲＩＴＳＰＤＫＰＲＰＭＰＭＤＴＳＶＹＥＳＰＹＳＤＰＥＥＬＫＤＫＫＬＦＬＫＲＤＮＬＬＩＡＤＩＥＬＧＣＧＮＦＧＳＶＲＱＧＶＹＲＭＲＫＫＱＩＤＶＡＩＫＶＬＫＱＧＴＥＫＡＤＴＥＥＭＭＲＥＡＱＩＭＨＱＬＤＮＰＹＩＶＲＬＩＧＶＣＱＡＥＡＬＭＬＶＭＥＭＡＧＧＧＰＬＨＫＦＬＶＧＫＲＥＥＩＰＶＳＮＶＡＥＬＬＨＱＶＳＭＧＭＫＹＬＥＥＫＮＦＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＬＶＮＲＨＹＡＫＩＳＤＦＧＬＳＫＡＬＧＡＤＤＳＹＹＴＡＲＳＡＧＫＷＰＬＫＷＹＡＰＥＣＩＮＦＲＫＦＳＳＲＳＤＶＷＳＹＧＶＴＭＷＥＡＬＳＹＧＱＫＰＹＫＫＭＫＧＰＥＶＭＡＦＩＥＱＧＫＲＭＥＣＰＰＥＣＰＰＥＬＹＡＬＭＳＤＣＷＩＹＫＷＥＤＲＰＤＦＬＴＶＥＱＲＭＲＡＣＹＹＳＬＡＳＫＶＥＧＰＰＧＳＴＱＫＡＥＡＡＣＡ

「Ｔ細胞受容体ζ鎖関連プロテインキナーゼ７０（ＺＡＰ７０）ポリヌクレオチド」とは、ＺＡＰ７０ポリペプチドをコードする核酸を意味する。ＺＡＰ７０遺伝子は、Ｔ細胞の発生およびリンパ球の活性化に関与するチロシンキナーゼをコードする。機能的なＺＡＰ１０の不在は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の欠如を特徴とする、重度の複合免疫不全をもたらし得る。例示的なＺＡＰ７０核酸配列を以下に提供する。
＞ＢＣ０５３８７８．１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ ζ鎖（ＴＣＲ）関連プロテインキナーゼ７０ｋＤａ、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：６１７４３ＩＭＡＧＥ：５７５７１６１）、完全長ＣＤＳ
ＧＣＴＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＣＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＣＴＧＣＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＣＧＴＧＡＣＴＡＣＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＣＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＡＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＧＣＧＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＧＧＡＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＴＡＣＧＣＡＣＴＣＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＧＣＴＴＡＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＡＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ

本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの記載は、任意の単一の基として、または列挙された基の組み合わせとして、その変数の定義を含む。本明細書における変数または態様に関する実施形態の記載は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせて、その実施形態を含む。

本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される１つ以上の任意の他の組成物および方法と組み合わせることができる。

ＤＮＡ編集は、遺伝子レベルで病原性変異を修正することによって、疾患状態を修飾するための実行可能な手段として浮上してきている。最近まで、すべてのＤＮＡ編集プラットフォームは、特定のゲノム部位でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、内因性ＤＮＡ修復経路に依存して、半確率的な様式で生成物の成果を決定することによって機能しており、結果として、遺伝子産物の複雑な集団がもたらされる。正確なユーザ定義の修復の成果は、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を通して達成することができるが、いくつかの課題により、治療に関連する細胞型において、ＨＤＲを使用した高効率の修復が妨げられている。実際には、この経路は、競合するエラーが起こりやすい非相同末端結合経路と比較して非効率的である。さらに、ＨＤＲは、細胞周期のＧ１期およびＳ期に厳しく制限され、有糸分裂後の細胞におけるＤＳＢの正確な修復を妨げる。その結果、ゲノム配列を、ユーザ定義のプログラマブルな様式で、これらの集団において高い効率で改変することが困難または不可能であることが証明されている。

参照による援用
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られるであろう。

図１Ａ～１Ｂは、Ｔ細胞の機能に影響を与える３つのタンパク質の図である。図１Ａは、移植片対宿主病における重要な成分であるＴＲＡＣタンパク質の図である。図１Ｂは、宿主のＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され得る有核細胞上に存在するＭＨＣクラス１抗原提示複合体の成分であるＢ２Ｍタンパク質の図である。図１Ｃは、ＰＤＣＤ１遺伝子の発現につながるＴ細胞シグナル伝達の図であり、結果として生じるＰＤ－１タンパク質は、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害するように作用する。

塩基編集後、標的遺伝子の発現がノックダウンされた細胞の割合のグラフである。「ＥＰ」は、エレクトロポレーションを示す。

非形質導入細胞、またはＢＥ４塩基エディターシステムもしくはＣａｓ９ヌクレアーゼで形質導入された細胞における、観察された種類の遺伝子修飾の割合のグラフである。

ＢＥ４およびＢＥ４をスプライス部位アクセプター（ＳＡ）もしくはドナー（ＳＤ）に導くかまたは終止（ＳＴＯＰ）コドンを生成するｓｇＲＮＡで形質導入された細胞における、フローサイトメトリー（ＦＣ）により決定される標的タンパク質の発現が陰性である細胞の割合によって測定された標的ヌクレオチド修飾の割合を示すグラフである。対照細胞は、モック（ｍｏｃｋ）でエレクトロポレーション（ＥＰ）された。

スプライス部位アクセプター（ＳＡ）、スプライスドナー（ＳＤ）を破壊するか、または終止コドンを生成するＢＥ４システムの図である。

標的遺伝子を破壊するために用いられるｓｇＲＮＡのオフターゲット結合部位をまとめたチャートである。

低減されたタンパク質発現を示すＢＥ４またはＣａｓ９が編集された細胞のパーセンテージのフローサイトメトリー（ＦＣ）データを要約したグラフである。細胞は、Ｂ２ＭまたはＣＤ３のいずれかにゲーティングされ、後者はＴＲＡＣ発現のためのプロキシである。

図８Ａは未編集対照細胞のＦＡＣＳデータの散布図である。図８ＢはＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１遺伝子座で編集された細胞のＦＡＣＳデータの散布図である。

ＣＡＲ－Ｔ免疫療法に悪影響を及ぼし得る特定の遺伝子を修飾するための、本明細書に記載の塩基編集技術の有効性を示すグラフである。

遺伝子修飾および転座を検出および定量するためのドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のプロトコルを示す図である。

ＢＥ４システムまたはＣａｓ９システムのいずれかを使用して編集された細胞の次世代配列決定（ＮＧＳ）分析またはｄｄＰＣＲから生成されたデータを示す２つのグラフを提示する。

Ｃｂｌ－ｂがＴ細胞の活性化を抑制する役割を示す概略図である。

スプライス部位の破壊によるＣｂｌ－ｂノックダウンの効率を示すグラフである。ＳＡ＝スプライスアクセプター、ＳＤ＝スプライスドナー、ＳＴＯＰ＝生成された終止コドン、２°のみ＝二次抗体のみ、Ｃ３７３は、機能喪失バリアント（Ｃ３７３Ｒ）を指す、ＲＬ１－Ａ：：ＡＰＣ－Ａ＝レーザー、ＩＣＳ＝細胞内染色。

Ｔ細胞におけるＧＲＩＮ２ＢおよびＤＮＭＴ１遺伝子におけるＣａｓ１２ｂ媒介性インデルの速度を示すグラフである。ＥＰは、エレクトロポレーションを表す。

ｂｖＣａｓ１２ｂ、ならびにＴＲＡＣ、ＧＲＩＮ２Ｂ、およびＤＮＭＴ１に特異的なガイドＲＮＡを用いたエレクトロポレーション（ＥＰ）を介して形質導入された細胞の蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）のデータ（ＣＤ３についてゲーティングされている）を要約するグラフである。

ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙレンチウイルスを形質導入した細胞の蛍光支援細胞選別データの散布図であり、ＣＡＲの発現を実証している。

蛍光支援細胞選別データの散布図であり、ポリ（１，８－オクタンジオールクエン酸塩）（ＰＯＣ）レンチウイルスベクターで形質導入された細胞におけるＣＡＲの発現を示す。

ＢＥ４が、高い生成物純度で、効率的で耐久性のある遺伝子ノックアウトを生成したことを示すグラフである。

図１９Ａは、ＢＥ４またはｓｐＣａｓ９による遺伝子ノックアウトに起因するタンパク質の表面発現の喪失を示す代表的なＦＡＣＳ分析である。図１９Ｂは、ＢＥ４またはｓｐＣａｓ９による遺伝子ノックアウトが、Ｂ２Ｍの表面発現の喪失を生じさせることを示すグラフである。

Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ－１標的部位の位置を示す概略図である。転座は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ－１の配列が組換えられるときに検出され得る。

多重化塩基編集が細胞増殖を有意に損なわないことを示すグラフである。

ＢＥ４が、ｓｐＣａｓ９と同様のオンターゲット編集効率および細胞表現型を有する三重編集Ｔ細胞を生成したことを示すグラフである。

三重編集ＣＤ３^－、Ｂ２Ｍ^－、ＰＤ１^－Ｔ細胞の生成を示すフローサイトメトリー分析を示す。

ＢＥ４およびＣａｓ９編集細胞におけるＣＡＲの発現を示すフローサイトメトリー分析を示す。

ＣＡＲ－Ｔ細胞死滅または抗原陽性細胞を示すグラフである。

Ｃａｓ１２ｂおよびＢＥ４が、Ｔ細胞における効率的な多重編集のために対にされ得ることを示すグラフである。

Ｃａｓ１２ヌクレアーゼおよび遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡの存在下で、ＣＡＲをコードする二本鎖ＤＮＡ鋳型を細胞内に導入することによって、Ｃａｓ１２ｂが遺伝子座へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の挿入を導き得ることを示すグラフである。

図２８Ａ～Ｂは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作するために、遺伝子をサイレンシングするための塩基編集アプローチを示す描写である。図２８Ａは、ＣＡＲ－Ｔ編集のための標的を示す。図２８Ｂは、塩基エディターを用いてサイレンシングするための２つの戦略を示す：ＣＢＥを用いて終止コドンを生成すること、およびＣＢＥを用いてスプライス破壊を生成すること。

場合によっては、ＡＭＬにおける疾患のクローン性に対処するために必要な複数のＣＡＲ－Ｔを示す例示的な模式的表現である。

場合によっては、Ｔ－ＡＬＬＣＡＲ－Ｔの組み合わせのためのフラトリサイドを排除するために複数の編集が必要とされ得る例示的な模式的表現である。

図３１Ａ～Ｂは、Ｔ－ＡＬＬに対して４つの同時塩基編集を試験する実験の結果を例示する。ＣＡＲ－Ｔは、ヌクレアーゼと比較して収率に影響を与えない。図３１Ａは、エレクトロポレーションなし（ＥＰなし；暗色の円）、ＥＰのみ（暗色の正方形）、ＣＢＥバリアント１（淡色、直立の三角形）、ＣＢＥバリアント２（淡色、逆さの三角形）、およびＣａｓ９（淡色の菱形）の四重Ｔ－ＡＬＬ編集の競合における理論的収率を示す。図３１Ｂは、エレクトロポレーション後の細胞の生存率を示す。２４時間（ｈｒ）、４８時間、７２時間、９６時間、および１６８時間での各セットの結果について、結果を、右から左へ、ＥＰなし、ＥＰのみ、ＣＢＥバリアント１、ＣＢＥバリアント２、およびＣａｓ９として示す。

ＢＥ４による９０％超の四重ノックアウトを示す。エレクトロポレーションを５Ｍ細胞スケールで実施し、四重編集を単一のエレクトロポレーション（ＥＰ）ステップで実施した。ｒＢＥ４を用いて、４つの標的すべてについて、９０％超の編集効率が達成された。各結果グループについて、データは、左から右へ示されている：ＰＤ１、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、およびＣＤ５２。

塩基編集が、細胞収率に差を生じさせないことを示す。データは、ＥＰ（円）なし、ＥＰのみ（正方形）、ｒＢＥ４（三角形）、ｐｐＢＥ４（逆さの三角形）、およびＣａｓ９（菱形）である。

編集されたＣＡＲ－Ｔが、モデル腫瘍細胞上のＣＤ３およびＣＤ７を標的とすることを示す。データは、ＵＴＤ１：１（円）、７ＣＡＲ８１：１（正方形）、および３ＣＡＲ２１：１（三角形）である。

Ｔ－ＡＬＬ腫瘍細胞を標的とするための例示的なＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の概略図である。

ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて患者を治療するための臨床プロトコルを示すフローチャートである。

図３７Ａ～３７Ｃは、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生を示す。図３７Ａは、ＴＡＬＬ０１７異種解凍ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するためのプロトコルを示すフローチャートである。図３７Ｂは、ＴＡＬＬ０８３ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するためのプロトコルを示すフローチャートである。図３７Ｃは、ＴＡＬＬ０１７ＣＡＲ－Ｔ細胞が解凍後に高度に活性化されていることを実証する、蛍光支援細胞選別データの散布図である。

次世代配列決定（ＮＧＳ）によるＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞における全編集を示すグラフである。

図３９Ａ～３９Ｂは、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲα／β、ＣＤ７、およびＣＤ５２の解凍後２４時間のタンパク質発現を示す。図３９Ａは、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の蛍光支援細胞選別データの散布図である。図３９Ｂは、ＦＡＣＳを介した残留タンパク質発現を示すグラフである。

同一性パネルのゲーティングスキームを示す。

ＣＤ２＋／－細胞およびＣＤ５６＋／－細胞の混合物としての最終細胞産物の同一性を示すグラフである。

解凍後２４時間および４８時間のＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の発現を示すグラフである。

ＴＡＬＬ０１７ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞において、解凍後のＣＤ２５の発現が低いことを示すグラフを含む。

インビトロでの特徴付けのためのＣＤ７ＣＡＲ－Ｔビーズに基づく力価プロトコルを示すフローチャートである。

図４５Ａ～４５Ｂは、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ７抗原に応答して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２を放出することを示す。図４５Ａは、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮγの放出を示すグラフである。図４５Ｂは、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴＮＦα、ＩＬ－１０、およびＩＬ－２の放出を示すグラフである。

腫瘍細胞のＣＡＲ指向性Ｔ細胞死滅の測定のための共培養プロトコルを示す概略図である。

図４７Ａ～４７Ｂは、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＴＡＬＬ０１７ＣＡＲＴ細胞と比較して、再チャレンジした場合、ＣＣＲＦの増加を示すことを示す。図４７Ａは、一次チャレンジを示すグラフである。図４７Ｂは、二次チャレンジを示すグラフである。

ＣＣＲＦ移植後１０日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置のー１日目の生物発光輝度データ（平均、ＳＥＭ）を示すグラフである。総フラックスは、線形スケールで測定される。

図４９Ａ～４９Ｂは、ＣＣＲＦ移植後１９日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置後８日目の生物発光輝度データ（平均、ＳＥＭ）を示す。図４９Ａは、平均腫瘍負荷を示すグラフである。総フラックスは、線形スケールで測定される。図４９Ｂは、平均マウス体重を示すグラフである。

図５０Ａ～５０Ｂは、ＣＣＲＦ移植後３８日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置後２７日目の生物発光輝度データ（平均、ＳＥＭ）を示す。図５０Ａは、平均腫瘍負荷を示すグラフである。総フラックスは、線形スケールで測定される。図５０Ｂは、平均腫瘍負荷を示すグラフである。総フラックスを、対数スケールで測定した。

図５１Ａ～５１Ｂは、ＣＣＲＦ移植後３８日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置後２７日目の生物発光輝度データ（個々のマウス）を示す。図５１Ａは、平均腫瘍負荷を示すグラフである。総フラックスは、線形スケールで測定される。図５１Ｂは、平均腫瘍負荷を示すグラフである。総フラックスは、対数スケールで測定される。

図５２Ａ～５２Ｂは、ＣＣＲＦ移植後３８日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処理後２７日目の生物発光輝度データ（個々のマウス）を示す。図５２Ａは、平均腫瘍負荷を示すグラフを含む。総フラックスは、線形スケール（上）および対数スケール（下）で測定される。図５２Ｂは、平均腫瘍負荷を示すグラフを含む。総フラックスは、線形スケール（上）および対数スケール（下）で測定される。

ＣＤ５ｇＲＮＡ候補の編集効率を示すグラフである。

ＢＥ４と組み合わせたＣＤ５ｇＲＮＡ候補（ｇ１０３およびｇ１０４）のＮＧＳによる編集効率を示すグラフである。

例示的なＣＤ５ＣＡＲ構築物の産生を示す概略図である。

ＣＤ５ｇＲＮＡ候補（ｇ１０３およびｇ１０４）を使用したレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）スクリーニングからのＣＡＲ発現を示すグラフである。

ヒンジ配列に基づいてＣＡＲＬＶＶ発現を示すグラフである。

図５８Ａ～５８Ｄは、編集および未編集構築物を示すグラフであり、ライブイメージングの細胞死滅アッセイにおいてＣＤ５＋ＣＣＲＦに対して十分に細胞傷害性である。

図５９Ａ～５９Ｂは、ＣＤ５＋ＣＣＲＦ－ＣＥＭ白血病細胞株の存在下で、ｓｇＲＮＡ１０３またはｓｇＲＮＡ１０４を使用したＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ構築物によるサイトカイン（ＩＦＮγ）産生を示す。図５９Ａ（左）は、ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ（ＬＶ６３－６９）で形質導入されたＴ細胞単独、またはｓｇＲＮＡ１０３を用いて編集されたＣＣＲＦ細胞によるＩＦＮγの産生を示すグラフである。図５９Ａ（右）は、ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ（ＬＶ６３－６９）で形質導入されたＴ細胞単独、またはｓｇＲＮＡ１０４を使用して編集されたＣＣＲＦ細胞によるＩＦＮγの産生を示すグラフである。図５９Ａ（下）は、未編集ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ（ＬＶ６３－６９）で形質導入されたＴ細胞またはＣＣＲＦ細胞を使用したＩＦＮγの産生を示すグラフである。図５９Ｂ（上）は、ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ（ＬＶ６３－６９）で形質導入された（未編集の、またはｓｇＲＮＡ１０３もしくは１０４を使用して編集された）Ｔ細胞単独でのＩＦＮγの産生を示すグラフである。図５９Ｂ（下）は、ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ（ＬＶ６３－６９）で形質導入された（未編集の、またはｓｇＲＮＡ１０３もしくは１０４を使用して編集された）ＣＣＲＦ細胞のＩＦＮγの産生を示すグラフである。

本発明は、増強された抗腫瘍活性、免疫抑制に対する耐性、および移植片対宿主反応もしくは宿主対移植片反応を誘発する低減されたリスク、またはそれらの組み合わせを有する遺伝子修飾免疫細胞を特徴とする。また、本発明は、これらの修飾免疫細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞）の産生および使用するための方法を特徴とする。

一実施形態では、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有するか、またはそれを発症する傾向がある対象に、機能的なＴＲＡＣを欠くか、またはそのレベルが低下しているＣＡＲ－Ｔ細胞が投与される。一実施形態では、宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）を有するか、またはそれを発症する傾向がある対象に、機能的なβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を欠くか、またはそのレベルが低下しているＣＡＲ－Ｔ細胞が投与される。

キメラ抗原受容体を発現させ、かつ特定の遺伝子をノックアウトまたはノックダウンして、それらの発現の免疫細胞機能に及ぼし得る負の影響を軽減するための免疫エフェクター細胞の修飾は、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターシステムを使用して達成される。

自己由来、患者由来のキメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、いくつかの血液がんの治療において顕著な有効性を示している。これらの製品は、患者に著しい臨床的利益をもたらしたが、個別化された療法を生み出す必要性は、製造上の大きな課題と経済的負担をもたらす。同種ＣＡＲ－Ｔ療法は、これらの課題に対する潜在的な解決策として開発され、単一の健康なドナーに由来する細胞を用いて多くの患者を治療しながら、自己産物と同様の臨床有効性のプロファイルを有し、それによって、商品のコストおよびロット間の変動性を実質的に低減した。

ほとんどの第１世代の同種ＣＡＲ－Ｔは、ヌクレアーゼを使用して、標的Ｔ細胞集団に２つ以上の標的ゲノムＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、エラーが起こりやすいＤＮＡ修復に依存して、標的遺伝子を半確率的にノックアウトする変異を生成する。このようなヌクレアーゼベースの遺伝子ノックアウト戦略は、移植片対宿主病およびＣＡＲ－Ｔの宿主拒絶のリスクを低減することを目的とする。しかしながら、複数のＤＳＢの同時誘導により、均衡転座および不均衡転座などの大規模なゲノム再編成、ならびに逆位および大きな欠失を含む比較的多量の局所的再編成を含む最終細胞産物がもたらされる。さらに、誘導ＤＳＢによって作製される同時遺伝子修飾の数が増加すると、処理された細胞集団において、かなりの遺伝毒性が観察される。これは、各製造工程からの細胞増殖の可能性を著しく低下させ、それによって、健康なドナー当たりの治療可能な患者数を減少させる可能性がある。

塩基エディター（ｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ、ＢＥ）は、ＤＳＢを生成することなく、標的ゲノムＤＮＡの高効率でユーザ定義の修飾を可能にする新しい遺伝子編集試薬のクラスである。ここで、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する代替的な手段は、検出可能なゲノム再編成を低減または排除し、同時に細胞増殖も改善する塩基編集技術を使用することによって提案される。本明細書に示されるように、ヌクレアーゼのみの編集戦略とは対照的に、塩基編集による１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、夜、１０個、またはそれ以上）の遺伝子座の同時修飾は、検出可能な転座事象を伴わずに、非常に効率的な遺伝子ノックアウトを生成する。

一部の実施形態では、少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントは、本明細書に提供される塩基編集組成物および方法を用いて、免疫細胞内で修飾される。一部の実施形態では、少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントは、ＡＣＡＴ１、ＡＣＬＹ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＸＬ、Ｂ２Ｍ、ＢＡＴＦ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＴＬＡ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ｃＡＭＰ、ＣＡＳＰ８、ＣＢＬＢ、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ８２、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、ＣＤ２７６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ｂ、Ｃｈｉ３ｌ１、ＣＩＩＴＡ、ＣＩＳＨ、ＣＳＦ２ＣＳＫ、ＣＴＬＡ－４、ＣＵＬ３、Ｃｙｐ１１ａ１、ＤＣＫ、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＺ、ＤＨＸ３７、ＥＬＯＢ（ＴＣＥＢ２）、ＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＧＡＴＡ３、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＪＵＮＢ、Ｌａｇ３、、ＬＡＩＲ－１（ＣＤ３０５）、ＬＤＨＡ、ＬＩＦ、ＬＹＮ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＭＡＰＫ１４、ＭＣＪ、ＭＥＦ２Ｄ、ＭＧＡＴ５、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）、ＯＤＣ１、ＯＴＵＬＩＮＬ（ＦＡＭ１０５Ａ）、ＰＡＧ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＩＡ３、ＰＨＤ１（ＥＧＬＮ２）、ＰＨＤ２（ＥＧＬＮ１）、ＰＨＤ３（ＥＧＬＮ３）、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫＦＹＶＥ、ＰＰＡＲａ、ＰＰＡＲｄ、ＰＲＤＭＩ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ１１、ＰＶＲＩＧ（ＣＤ１１２Ｒ）、ＲＡＳＡ２、ＲＦＸＡＮＫ、ＳＥＬＰＧ／ＰＳＧＬ１、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＯＣＳ１、Ｓｐｒｙ１、Ｓｐｒｙ２、ＳＴＫ４、ＳＵＶ３９、Ｈ１ＴＥＴ２、ＴＧＦｂＲＩＩ、ＴＩＧＩＴ、Ｔｉｍ－３、ＴＭＥＭ２２２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＶＨＬ、ＶＩＳＴＡ、ＸＢＰ１、ＹＡＰ１、およびＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントは、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡおよびＰＤ－１から選択される。一部の実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ５と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡおよびＰＤ－１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントと、における修飾を含む。一部の実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ７と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡおよびＰＤ－１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントと、における修飾を含む。一部の実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡおよびＰＤ－１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントと、における修飾を含む。一部の実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡおよびＰＤ－１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントと、における修飾を含む。一部の実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ１２３と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡおよびＰＤ－１から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子またはその調節エレメントと、における修飾を含む。遺伝子の多重編集（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｉｔｉｎｇ）は、改善された治療特性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の生成において有用であり得る。この方法は、多重編集Ｔ細胞産物の既知の制約に対処し、次世代の精密な細胞ベースの療法に向けた有望な進展である。

一態様では、本明細書において、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種細胞である。一部の実施形態では、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞であり、所望のＣＡＲを発現するために使用することができ、ドナーおよびレシピエントの免疫原的適合性に関係なく、普遍的に適用可能であり得る。同種免疫細胞は、１つ以上のドナーに由来し得る。特定の実施形態では、同種免疫細胞は、単一のヒトドナーに由来する。例えば、同種Ｔ細胞は、単一の健康なヒトドナーのＰＢＭＣに由来し得る。特定の実施形態では、同種免疫細胞は、複数のヒトドナーに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載のように、複数の遺伝子座（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の遺伝子座）で同時編集を導入するために、遺伝子修飾を使用することによって生成され得る。本明細書に記載される修飾または同時修飾は、塩基エディターによって生成される、塩基編集などの遺伝子編集であってもよい。塩基エディターは、Ｃ塩基エディターまたはＡ塩基エディターであり得る。本明細書で論じられるように、遺伝子が発現されないように、遺伝子破壊を達成するために塩基編集を使用することができる。遺伝子発現の低減を達成するために、塩基編集による修飾を使用することができる。一部の実施形態では、編集された遺伝子が構造的または機能的に実用可能なタンパク質産物を生成しないように、遺伝子修飾を導入するために塩基エディターを使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される同時修飾などの修飾は、遺伝子産物の発現または機能性が任意の方法で変化するように、塩基編集などの遺伝子編集を含んでもよい。例えば、遺伝子産物の発現は、ベースライン発現レベルと比較して、増強または上方制御され得る。一部の実施形態では、遺伝子産物の活性または機能性は、塩基編集、または協調して作用する複数の塩基編集事象の結果として上方制御され得る。

一部の実施形態では、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の生成は、緊急使用のために生成することが困難な場合がある自己Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）よりも有利であり得る。同種アプローチは、ＣＡＲを発現し、医療緊急時に移植のための所望の細胞産物を最終的に達成するための操作された自己Ｔ細胞の不確実性に関連するいくつかの状況に対して、自己細胞調製よりも好ましい。しかしながら、同種Ｔ細胞、または「既製の」Ｔ細胞の場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＨＶＧＤ）に対する宿主の反応性ならびに同種Ｔ細胞の宿主細胞（ＧＶＨＤ）に対する潜在的な敵対性を慎重に協議することが重要である。このシナリオを考えると、塩基編集をうまく使用して、複数の同時遺伝子編集事象を生成することができ、その結果、（ａ）抗原の発現を低減もしくは下方制御して、フラトリサイド耐性の免疫細胞を生成することが可能であり、（ｂ）内因性Ｔ細胞受容体、例えば、ＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣの塩基編集を介するような）もしくはＴＣＲβ鎖（ＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２の塩基編集を介するような）を欠いているか、または少量発現するプラットフォーム細胞型を生成することが可能であり、かつ／あるいは（ｃ）宿主組織系に適合しない可能性がある抗原の発現を低減または下方制御すること（その逆も同様）が可能である。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、ＣＡＲ－Ｔを発現する自己Ｔ細胞を生成することができる。一部の実施形態では、複数の塩基編集事象は、単一のエレクトロポレーション事象で達成することができ、それによって、エレクトロポレーション事象に付随する毒性が低減される。細胞に外因性遺伝物質を組み込むための任意の既知の方法を使用して、エレクトロポレーションを置き換えることができ、かかる方法は、当該技術分野で既知であり、それゆえ、本明細書に記載の方法のいずれかにおける使用が企図される。

一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象は、ＣＤ２を欠くかまたはそのレベルが低減され、かつＣＤ２共刺激ドメインを含むＣＤ２キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与される。一部の実施形態では、対象に投与されるＣＤ２修飾免疫細胞は、本明細書に提供される塩基編集組成物および方法を用いて、１つ以上の遺伝子または調節エレメント（例えば、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、ＰＤ－１）がさらに修飾される。

本明細書に示されるように、ＣＡＲ挿入と組み合わせた塩基編集は、ゲノム再編成を最小化しながらフラトリサイド耐性の同種Ｔ細胞を生成するための有用な戦略である。また、遺伝子の多重編集は、改善された治療特性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の生成において有用であり得る。この方法は、ＣＡＲ－Ｔ療法の既知の制約に対処し、次世代の精密な細胞ベースの療法に向けた有望な進展である。

ある実験では、塩基エディターＢＥ４は、Ｔ細胞における３つの細胞表面標的（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ－１）の高効率な多重塩基編集を実証し、単一のエレクトロポレーションで、遺伝子発現をそれぞれ９５％、９５％、および８８％ノックアウトして、Ｂ２ＭおよびＣＤ３のタンパク質発現が低下した細胞の割合が高い細胞集団を生成した。これらの遺伝子の各々を編集することは、改善された治療特性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の生成において有用であり得る。遺伝子の各々を、二本鎖切断を生成することなく、単一の標的塩基改変（ＣからＴ）によってサイレンシングした。結果として、ＢＥ４で処理された細胞はまた、測定可能な転座（大規模なゲノム再編成）も示さなかった。しかし、ヌクレアーゼによる同じ３つの編集を受けた細胞は、検出可能なゲノム再編成を示した。

したがって、ＴＲＡＣ遺伝子のヌクレアーゼベースのノックアウトを、２つの追加の遺伝子の同時ＢＥ媒介性ノックアウトとカップリングすることで、ゲノム再編成を最小化しながら均一な同種Ｔ細胞集団が得られ、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＣＡＲ導入遺伝子の標的化挿入が可能となる。まとめると、これは、塩基編集単独、または単一ヌクレアーゼノックアウトおよびＣＡＲ挿入と組み合わせが、ヌクレアーゼ単独のアプローチと比較して、ゲノム再編成を最小化しながら同種Ｔ細胞を生成するための有用な戦略であることを示す。この方法は、多重編集Ｔ細胞産物の既知の制約に対処し、次世代の精密な細胞ベースの療法に向けた有望な進展である。

キメラ抗原受容体およびＣＡＲ－Ｔ細胞
本発明は、本明細書に記載の核酸塩基エディターを使用して修飾されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を提供する。キメラ抗原受容体を発現するための免疫細胞の修飾は、免疫細胞の免疫反応活性を増強することができる。ここで、キメラ抗原受容体は、抗原上のエピトープに対する親和性を有し、抗原は、生物の変化した適合性に関連付けられる。例えば、キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞で発現されたタンパク質上のエピトープに対する親和性を有することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）とは独立して作用することができるため、活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原を発現する腫瘍細胞を死滅させることができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞の直接作用は、免疫細胞に対する抗原のＭＨＣ提示に応答して進化した腫瘍細胞の防御機構を回避する。

一部の実施形態では、本発明は、免疫エフェクター細胞を提供し、それは、自己免疫応答に関与するＢ細胞（例えば、対象自身の組織に対して生成された抗体を発現する対象のＢ細胞）を標的とするキメラ抗原受容体を発現する。

一部の実施形態は、自己免疫細胞免疫療法を含み、免疫細胞は、表面マーカーを発現するがん性細胞またはその他の変化した細胞を特徴とする疾患または変化した適合性を有する対象から得られる。得られた免疫細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子修飾され、特定の抗原に対して効果的に再誘導される。したがって、一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ免疫療法を必要とする対象から得られる。一部の実施形態では、これらの自己免疫細胞は、対象から得られた直後に培養および修飾される。他の実施形態では、自己細胞を得て、次いで、将来使用するために保存される。この慣行は、将来的に免疫細胞数を減少させる並列治療を受けている可能性がある個体に推奨され得る。同種免疫細胞免疫療法において、免疫細胞は、治療を受ける対象以外のドナーから得ることができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、健康な対象またはドナーから得られ、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子修飾され、特定の抗原に対して効果的に再誘導される。免疫細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように修飾された後、腫瘍（例えば、白血病）を治療するために対象に投与される。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を発現するように修飾される免疫細胞は、免疫細胞の既存のストック培養物から得ることができる。

免疫細胞および／または免疫エフェクター細胞は、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して、対象またはドナーから収集された試料から単離または精製され得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、赤血球を溶解し、遠心分離で末梢単核血球を除去することによって、全血試料から単離または精製することができる。免疫エフェクター細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、またはＣＤ４５ＲＯなどの細胞特異的マーカーに基づいて免疫エフェクター細胞を単離する選択的精製方法を使用して、さらに単離または精製され得る。一実施形態では、ＣＤ２５＋は、制御性Ｔ細胞を選択するためのマーカーとして使用される。一実施形態では、ＣＤ４^＋は、Ｔ細胞を選択するためのマーカーとして使用される。一実施形態では、ＣＤ８^＋は、Ｔ細胞を選択するためのマーカーとして使用される。一実施形態では、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋は、Ｔ細胞を選択するためのマーカーとして使用される。一実施形態では、ＣＤ４^＋およびＣＤ２５^＋は、Ｔ細胞を選択するためのマーカーとして使用される。

別の実施形態では、本発明は、ＴＣＲαβの表面発現を担うＴＣＲ定常領域（ＴＲＡＣ）に標的化遺伝子ノックアウトを有するＴ細胞を提供する。ＴＣＲαβ欠損ＣＡＲＴ細胞は、同種免疫療法と適合性である（Ｑａｓｉｍｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．９，ｅａａｊ２０１３（２０１７）；Ｖａｌｔｏｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１５Ｓｅｐ；２３（９）：１５０７－１５１８）。所望により、残留ＴＣＲαβＴ細胞は、ＧＶＨＤのリスクを最小化するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ磁気ビーズ枯渇を使用して除去される。別の実施形態では、本発明は、レシピエント造血細胞で発現するマイナー組織適合抗原を認識するために、エクスビボで選択されるドナーＴ細胞を提供し、それによって、移植後の罹患率および死亡率の主な原因である移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを最小化する（Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ２０１０；１１５（１９）：３８６９－３８７８）。免疫エフェクター細胞を単離または精製するための別の技術は、フローサイトメトリーである。蛍光活性化細胞選別において、免疫エフェクター細胞マーカーに対して親和性を有する蛍光標識抗体を使用して、試料中の免疫エフェクター細胞を標識する。マーカーを発現する細胞に適したゲーティング戦略を使用して細胞を分離する。例えば、Ｔリンパ球は、例えば、免疫エフェクター細胞マーカーに特異的な蛍光標識抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５）および対応するゲーティング戦略を使用することによって、試料中の他の細胞から分離され得る。一実施形態では、ＣＤ４５ゲーティング戦略が用いられる。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的な他のマーカーのゲーティング戦略が、ＣＤ４５ゲーティング戦略の代わりに用いられるか、またはＣＤ４５ゲーティング戦略と組み合わせて用いられる。一実施形態では、ＣＤ４ゲーティング戦略が用いられる。一実施形態では、ＣＤ８ゲーティング戦略が用いられる。一実施形態では、ＣＤ２５ゲーティング戦略が用いられる。一実施形態では、ＣＤ４およびＣＤ８ゲーティング戦略が用いられる。一実施形態では、ＣＤ４およびＣＤ２５ゲーティング戦略が用いられる。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的な他のマーカーのゲーティング戦略が、ＣＤ４、ＣＤ２５、および／またはＣＤ８ゲーティング戦略の代わりに用いられるか、またはそれと組み合わせて用いられる。一部の実施形態では、図４０に提供されるゲーティング戦略が用いられる。

本発明で企図される免疫エフェクター細胞は、エフェクターＴ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔヘルパー細胞である。一部の実施形態では、Ｔヘルパー細胞は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞、またはＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、エフェクターＮＫ細胞である。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞の任意の他のサブセットである。修飾された免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体に加えて、外因性サイトカイン、異なるキメラ受容体、または免疫エフェクター細胞のシグナル伝達または機能を増強する任意の他の薬剤を発現し得る。例えば、キメラ抗原受容体とサイトカインの共発現は、標的細胞を溶解するＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を増強することができる。

本発明で企図されるキメラ抗原受容体は、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。抗原の細胞外結合ドメインへの結合は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生、および抗原発現細胞の死につながる他のプロセスを含むエフェクター応答を生成し得る。本発明の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーである。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、リーダーペプチド配列（例えば、抗原結合ドメインのＮ末端）を含む。例示的なリーダーペプチドのアミノ酸配列は、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧである。

本明細書で企図されるキメラ抗原受容体の細胞外結合ドメインは、特定の抗原に対する親和性を有する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、ＣＡＲは、５Ｔ４に特異的に結合する。例示的な抗５Ｔ４ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＡＲＴ－５Ｔ４（ＯｘｆｏｒｄＢｉｏＭｅｄｉｃａｐｌｃ）およびＵＣＡＲＴ－５Ｔ４（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、αフェトプロテインに特異的に結合する。例示的な抗αフェトプロテインＣＡＲとしては、限定されないが、ＥＴ－１４０２（ＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ａｘｌに特異的に結合する。例示的な抗ＡｘｌＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＣＴ－３０１－３８（Ｆ１ＯｎｃｏｌｏｇｙＩｎｃ．）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する。例示的な抗Ｂ７Ｈ６ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＹＡＤ－０４（ＣｅｌｙａｄＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合する。例示的な抗ＢＣＭＡＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＣＴＲ－０８７＋ＳＥＡ－ＢＣＭＡ（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｃ）、ＡＬＬＯ－７１５（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）、ＡＲＩ－０００２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｄ’ＩｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｓＢｉｏｍｅｄｉｑｕｅｓＡｕｇｕｓｔＰｉＩＳｕｎｙｅｒ）、ｂｂ－２１２１（ｂｌｕｅｂｉｒｄｂｉｏＩｎｃ）、ｂｂ－２１２１７（ｂｌｕｅｂｉｒｄｂｉｏＩｎｃ）、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ＣＴ－０５３（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－０８（ＣａｒｔｅｓｉａｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＦＣＡＲＨ－１４３（ＪｕｎｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＩＣＴＣＡＲ－０３２（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＣｏＬｔｄ）、ＩＭ２１ＣＡＲＴ（ＢｅｉｊｉｎｇＩｍｍｕｎｏｃｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、ＪＣＡＲＨ－１２５（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、ＫＩＴＥ－５８５（ＫｉｔｅＰｈａｒｍａＩｎｃ）、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ（ＮａｎｊｉｎｇＬｅｇｅｎｄＢｉｏｔｅｃｈＣｏＬｔｄ）、ＬＣＡＲ－Ｂ４８２２Ｍ（ＮａｎｊｉｎｇＬｅｇｅｎｄＢｉｏｔｅｃｈＣｏＬｔｄ）、ＭＣＡＲＨ－１７１（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１（ＰｏｓｅｉｄａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、Ｐ－ＢＣＭＡ－ＡＬＬＯ１（ＰｏｓｅｉｄａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ｓｐＣＡＲＴ－２６９（ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｃａｒ－ＴｈｅｒａｐｙＢｉｏ－ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、およびＢＣＭＡ０２／ｂｂ２１２１（ｂｌｕｅｂｉｒｄｂｉｏＩｎｃ）が挙げられる。ＢＣＭＡ０２／ｂｂ２１２１ＣＡＲのポリペプチド配列を以下に提供する：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＶＬＴＱＳＰＰＳＬＡＭＳＬＧＫＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＴＬＬＩＱＬＡＳＮＶＱＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＥＤＤＶＡＶＹＹＣＬＱＳＲＴＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＳＩＮＷＶＫＲＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＥＴＲＥＰＡＹＡＹＤＦＲＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＹＥＤＴＡＴＹＦＣＡＬＤＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＣＫ２Ｒに特異的に結合する。例示的な抗ＣＣＫ２ＲＣＡＲとしては、限定されないが、抗ＣＣＫ２ＲＣＡＲ－Ｔアダプター分子（ＣＡＭ）＋抗ＦＩＴＣＣＡＲＴ細胞療法（がん）、Ｅｎｄｏｃｙｔｅ／Ｐｕｒｄｕｅ（ＰｕｒｄｕｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ抗原に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ抗原ＣＡＲとしては、限定されないが、ＶＭ－８０２（ＶｉｒｏＭｅｄＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１２３に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ１２３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＭＢ－１０２（ＦｏｒｔｒｅｓｓＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）、ＲＮＡＣＡＲＴ１２３（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ＳＦＧ－ｉＭＣ－ＣＤ１２３．ｚｅｔａ（ＢｅｌｌｉｃｕｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）、およびＵＣＡＲＴ－１２３（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３３に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ１３３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＫＤ－０３０（ＮａｎｊｉｎｇＫａｅｄｉＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３８に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ１３８ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＴＬＣＡＲ．ＣＤ１３８（ＵＮＣＬｉｎｅｂｅｒｇｅｒＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）およびＣＡＲＴ－１３８（ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１７１に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ１７１ＣＡＲとしては、限定されないが、ＪＣＡＲ－０２３（ＪｕｎｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ１９ＣＡＲとしては、限定されないが、１９２８ｚ－４１ＢＢＬ（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、１９２８ｚ－Ｅ２７（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、１９－２８ｚ－Ｔ２（ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＨｅａｌｔｈ）、４Ｇ７－ＣＡＲＤ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ）、４ＳＣＡＲ１９（ＳｈｅｎｚｈｅｎＧｅｎｏ－ＩｍｍｕｎｅＭｅｄｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＡＬＬＯ－５０１（ＰｆｉｚｅｒＩｎｃ）、ＡＴＡ－１９０（ＱＩＭＲＢｅｒｇｈｏｆｅｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＡＵＴＯ－１（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ）、ＡＶＡ－００８（ＡｖａｃｔａＬｔｄ）、ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ（ＫｉｔｅＰｈａｒｍａＩｎｃ）、ＢＧ－Ｔ１９（ＧｕａｎｇｚｈｏｕＢｉｏ－ｇｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、ＢｉｎＤ－１９（ＳｈｅｎｚｈｅｎＢｉｎＤｅＢｉｏＬｔｄ．）、ＢＰＸ－４０１（ＢｅｌｌｉｃｕｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）、ＣＡＲ１９ｈ２８ＴＭ４１ＢＢｚ（ＷｅｓｔｍｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）、Ｃ－ＣＡＲ－０１１（ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）、ＣＤ１９ＣＡＲＴ（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＣｏＬｔｄ）、ＣＩＫ－ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＦｏｒｍｕｌａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）、ＣＬＩＣ－１９０１（ＯｔｔａｗａＨｏｓｐｉｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＣＳＧ－ＣＤ１９（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、ＣＴＬ－１１９（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ＣＴＸ－１０１（ＣＲＩＳＰＲＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＡＧ）、ＤＳＣＡＲ－０１（ＳｈａｎｇｈａｉＨｒａｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＴ－１９０（ＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＦＴ－８１９（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、ＩＣＡＲ－１９（ＩｍｍｕｎｅＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙＩｎｃ）、ＩＭ１９ＣＡＲ－Ｔ（ＢｅｉｊｉｎｇＩｍｍｕｎｏｃｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、ＪＣＡＲ－０１４（ＪｕｎｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＪＷＣＡＲ－０２９（ＭｉｎｇＪｕＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、ＫＤ－Ｃ－１９（ＮａｎｊｉｎｇＫａｅｄｉＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）、ＬｉｎＣＡＲＴ１９（ｉＣｅｌｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ｌｉｓｏｃａｂｔａｇｅｎｅｍａｒａｌｅｕｃｅｌ（ＪｕｎｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＭａｔｃｈＣＡＲＴ（ＳｈａｎｇｈａｉＨｒａｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＭＢ－ＣＡＲＴ１９．１（ＳｈａｎｇｈａｉＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ）、ＰＢＣＡＲ－０１９１（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ）、ＰＣＡＲ－０１９（ＰｅｒｓｏｎＧｅｎＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｓｕｚｈｏｕ）ＣｏＬｔｄ）、ｐＣＡＲ－１９Ｂ（ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＰｒｅｃｉｓｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈＣｏＬｔｄ）、ＰＺ－０１（ＰｉｎｚｅＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、ＲＢ－１９１６（ＲｅｆｕｇｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ）、ＳＫＬＢ－０８３０１９（ＣｈｅｎｇｄｕＹｉｎｈｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＣｏＬｔｄ）、ｓｐＣＡＲＴ－１９（ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｃａｒ－ＴｈｅｒａｐｙＢｉｏ－ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、ＴＢＩ－１５０１（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ）、ＴＣ－１１０（ＴＣＲ２ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＴＩ－１００７（ＴｉｍｍｕｎｅＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）、ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ（ＡｂｒａｍｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、Ｕ－ＣＡＲＴ（ＳｈａｎｇｈａｉＢｉｏｒａｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｃ）、ＵＣＡＲＴ－１９（ＷｕｇｅｎＩｎｃ）、ＵＣＡＲＴ－１９（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）、ｖａｄａｃａｂｔａｇｅｎｅｌｅｒａｌｅｕｃｅｌ（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、ＸＬＣＡＲＴ－００１（ＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびｙｉｎｎｕｏｋａｔｉ－１９（ＳｈｅｎｚｈｅｎＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ２ＣＡＲとしては、限定されないが、ＵＣＡＲＴ－２（ＷｕｇｅｎＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ２０ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＣＴＲ－０８７（ＮａｔｉｏｎａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｉｎｇａｐｏｒｅ）、ＡＣＴＲ－７０７（ＵｎｕｍＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＣＢＭ－Ｃ２０．１（ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）、ＭＢ－１０６（ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）、およびＭＢ－ＣＡＲＴ２０．１（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ２２ＣＡＲとしては、限定されないが、抗ＣＤ２２ＣＡＲＴ－ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙ（Ｂ－ｃｅｌｌａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ＣＤ２２－ＣＡＲＴ（ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｃａｒ－ＴｈｅｒａｐｙＢｉｏ－ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）、ＪＣＡＲ－０１８（ＯｐｕｓＢｉｏＩｎｃ）、ＭｅｎｄＣＡＲＴ（ＳｈａｎｇｈａｉＨｒａｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＵＣＡＲＴ－２２（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３０に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ３０ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＴＬＣＡＲ．ＣＤ３０（ＵＮＣＬｉｎｅｂｅｒｇｅｒＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、ＣＢＭ－Ｃ３０．１（ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）、およびＨｕ３０－ＣＤ２８ｚｅｔａ（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３３に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ３３ＣＡＲとしては、限定されないが、抗ＣＤ３３ＣＡＲｇａｍｍａｄｅｌｔａＴ－ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙ（ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＴＣＢｉｏＰｈａｒｍ／ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ）、ＣＡＲ３３ＶＨ（ＯｐｕｓＢｉｏＩｎｃ）、ＣＡＲＴ－３３（ＣｈｉｎｅｓｅＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ）、ＣＩＫ－ＣＡＲ．ＣＤ３３（ＦｏｒｍｕｌａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）、ＵＣＡＲＴ－３３（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）、およびＶＯＲ－３３（ＣｏｌｕｍｂｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ３８ＣＡＲとしては、限定されないが、ＵＣＡＲＴ－３８（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８Ａ２に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ３８Ａ２ＣＡＲとしては、限定されないが、Ｔ－００７（ＴＮＫＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ４ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＤ４ＣＡＲ（ｉＣｅｌｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４４に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ４４ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＡＲ－ＣＤ４４ｖ６（ＩｓｔｉｔｕｔｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏＨＳａｎＲａｆｆａｅｌｅ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ５に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ５ＣＡＲとしては、これらに限定されないが、ＣＤ５ＣＡＲ（ｉＣｅｌｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例示的なＣＤ５ＣＡＲアミノ酸配列は、以下に提供される：
＞５ＣＡＲ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３Ｚ
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60

61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120

121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180

181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240

241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300

301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360

361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 420

421 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ 480

481 LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE 540

541 RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 573
＞５ＣＡＲ－ＣＤ８ａＨ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３Ｚ
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60

61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120

121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180

181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240

241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300

301 AGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPR 360

361 RPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK 420

421 RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT 480

481 KDTYDALHMQALPPR 495
＞５ＣＡＲ－ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３Ｚ
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60

61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120

121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180

181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240

241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPS 300

301 PLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR 360

361 KHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP 420

421 EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA 480

481 LHMQALPPR 489
＞５ＣＡＲ－ＣＨ３－ＣＤ８ａＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３Ｚ
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60

61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120

121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180

181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240

241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300

301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360

361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEA 420

421 CRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMR 480

481 PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL 540

541 DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST 600

601 ATKDTYDALHMQALPPR 617
＞５ＣＡＲ－ＣＤ８ａＨ－ＣＤ８ａＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３Ｚ
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60

61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120

121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180

181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240

241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300

301 AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT 360

361 TQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR 420

421 GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD 480

481 TYDALHMQALPPRX 494

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤ７ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＡＲ－ｐＮＫ（ＰｅｒｓｏｎＧｅｎＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｓｕｚｈｏｕ）ＣｏＬｔｄ）、およびＣＤ７．ＣＡＲ／２８ｚｅｔａＣＡＲＴｃｅｌｌｓ（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）、ＵＣＡＲＴ７（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＳｔＬｏｕｉｓ）が挙げられる。例示的なＣＤ７ＣＡＲアミノ酸配列は、以下のとおりである：
＞７ＣＡＲ８
1 MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQ 60
61 KSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGG 120
121 GTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWV 180
181 RQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCA 240
241 RQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA 300
301 VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRK 360
361 HYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE 420
421 MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL 480
481 HMQALPPR 488

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤＨ１７に特異的に結合する。例示的な抗ＣＤＨ１７ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＲＢ－００１．Ｔ（ＡｒｂｅｌｅＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＥＡに特異的に結合する。例示的な抗ＣＥＡＣＡＲとしては、限定されないが、ＨＯＲＣ－０２０（ＨｕｍＯｒｉｇｉｎＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、キメラＴＧＦβ受容体（ＣＴＢＲ）に特異的に結合する。例示的な抗キメラＴＧＦ－β受容体（ＣＴＢＲ）ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＡＲ－ＣＴＢＲＴ細胞（ｂｌｕｅｂｉｒｄｂｉｏＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、クローディン１８．２に特異的に結合する。例示的な抗クローディン１８．２ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＡＲ－ＣＬＤ１８Ｔ細胞（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）およびＫＤ－０２２（ＮａｎｊｉｎｇＫａｅｄｉＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＬＬ１に特異的に結合する。例示的な抗ＣＬＬ１ＣＡＲとしては、限定されないが、ＫＩＴＥ－７９６（ＫｉｔｅＰｈａｒｍａＩｎｃ．）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３に特異的に結合する。例示的な抗ＤＬＬ３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＭＧ－１１９（ＡｍｇｅｎＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＢＣＭＡ／ＴＡＣＩ（ＡＰＲＩＬ）に特異的に結合する。例示的な抗デュアルＢＣＭＡ／ＴＡＣＩ（ＡＰＲＩＬ）ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＵＴＯ－２（ＡｕｔｏｌｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｉｍｉｔｅｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＣＤ１９／ＣＤ２２に特異的に結合する。例示的な抗デュアルＣＤ１９／ＣＤ２２ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＵＴＯ－３（ＡｕｔｏｌｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｉｍｉｔｅｄ）およびＬＣＡＲ－Ｌ１０Ｄ（ＮａｎｊｉｎｇＬｅｇｅｎｄＢｉｏｔｅｃｈＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的に結合する。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＣＬＬ１／ＣＤ３３に特異的に結合する。例示的な抗デュアルＣＬＬ１／ＣＤ３３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＩＣＧ－１３６（ｉＣｅｌｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＥｐＣＡＭ／ＣＤ３に特異的に結合する。例示的な抗デュアルＥｐＣＡＭ／ＣＤ３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＩＫＴ－７０１（ＩｃｅｌｌＫｅａｌｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＥｒｂＢ／４ａｂに特異的に結合する。例示的な抗デュアルＥｒｂＢ／４ａｂＣＡＲとしては、限定されないが、ＬＥＵ－００１（Ｋｉｎｇ’ｓＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、デュアルＦＡＰ／ＣＤ３に特異的に結合する。例示的な抗デュアルＦＡＰ／ＣＤ３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＩＫＴ－７０２（ＩｃｅｌｌＫｅａｌｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＥＢＶに特異的に結合する。例示的な抗ＥＢＶＣＡＲとしては、限定されないが、ＴＴ－１８（ＴｅｓｓａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＰｔｅＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。例示的な抗ＥＧＦＲＣＡＲとしては、限定されないが、抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞療法（ＣＢＬＢＭｅｇａＴＡＬ、ｃａｎｃｅｒ）、ｂｌｕｅｂｉｒｄｂｉｏ（ｂｌｕｅｂｉｒｄｂｉｏＩｎｃ）、ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害因子＋ＰＤ－１チェックポイント阻害因子ｍＡｂｓを発現する抗ＥＧＦＲＣＡＲＴ細胞療法（ＥＧＦＲ陽性進行固形腫瘍）、ＳｈａｎｇｈａｉＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳｈａｎｇｈａｉＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＣＳＧ－ＥＧＦＲ（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、およびＥＧＦＲ－ＩＬ１２－ＣＡＲＴ（Ｐｒｅｇｅｎｅ（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する。例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲとしては、限定されないが、ＫＤ－０３５（ＮａｎｊｉｎｇＫａｅｄｉＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）およびＵＣＡＲＴ－ＥｇｆｒＶＩＩＩ（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｆｌｔ３に特異的に結合する。例示的な抗Ｆｌｔ３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＬＬＯ－８１９（ＰｆｉｚｅｒＩｎｃ）およびＡＭＧ－５５３（ＡｍｇｅｎＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、葉酸受容体に特異的に結合する。例示的な抗葉酸受容体ＣＡＲとしては、限定されないが、ＥＣ１７／ＣＡＲＴ（ＥｎｄｏｃｙｔｅＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｇ２５０に特異的に結合する。例示的な抗Ｇ２５０ＣＡＲとしては、限定されないが、自己Ｔリンパ球療法（Ｇ２５０－ｓｃＦＶ導入、腎細胞がん）、Ｅｒａｓｍｕｓ医療センター（ＤａｎｉｅｌｄｅｎＨｏｅｄＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＧＤ２に特異的に結合する。例示的な抗ＧＤ２ＣＡＲとしては、限定されないが、１ＲＧ－ＣＡＲＴ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ）、４ＳＣＡＲ－ＧＤ２（ＳｈｅｎｚｈｅｎＧｅｎｏ－ＩｍｍｕｎｅＭｅｄｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｃ７Ｒ－ＧＤ２．ＣＡＲＴ細胞（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）、ＣＭＤ－５０１（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）、ＣＳＧ－ＧＤ２（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、ＧＤ２－ＣＡＲＴ０１（ＢａｍｂｉｎｏＧｅｓｕＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＧＩＮＡＫＩＴ細胞（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）、ｉＣ９－ＧＤ２－ＣＡＲ－ＩＬ－１５Ｔ細胞（ＵＮＣＬｉｎｅｂｅｒｇｅｒＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、およびＩＫＴ－７０３（ＩｃｅｌｌＫｅａｌｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＧＤ２およびＭＵＣ１に特異的に結合する。例示的な抗ＧＤ２／ＭＵＣ１ＣＡＲとしては、限定されないが、ＰＳＭＡＣＡＲ－Ｔ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＧＰＣ３に特異的に結合する。例示的な抗ＧＰＣ３ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＲＢ－００２．Ｔ（ＡｒｂｅｌｅＬｔｄ）、ＣＳＧ－ＧＰＣ３（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、ＧＬＹＣＡＲ（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）、およびＴＴ－１４（ＴｅｓｓａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＰｔｅＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｈｅｒ２に特異的に結合する。例示的な抗Ｈｅｒ２ＣＡＲとしては、限定されないが、ＡＣＴＲ－０８７＋トラスツズマブ（ＵｎｕｍＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＡＣＴＲ－７０７＋トラスツズマブ（ＵｎｕｍＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＣＩＤｅＣＡＲ（ＢｅｌｌｉｃｕｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）、ＭＢ－１０３（ＭｕｓｔａｎｇＢｉｏＩｎｃ）、ＲＢ－Ｈ２１（ＲｅｆｕｇｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ）、およびＴＴ－１６（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＩＬ１３Ｒに特異的に結合する。例示的な抗ＩＬ１３ＲＣＡＲとしては、限定されないが、ＭＢ－１０１（ＣｉｔｙｏｆＨｏｐｅ）およびＹＹＢ－１０３（ＹｏｏＹｏｕｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、インテグリンβ－７に特異的に結合する。例示的な抗インテグリンβ－７ＣＡＲとしては、限定されないが、ＭＭＧ４９ＣＡＲＴ細胞療法（ＯｓａｋａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＬＣ抗原に特異的に結合する。例示的な抗ＬＣ抗原ＣＡＲとしては、限定されないが、ＶＭ－８０３（ＶｉｒｏＭｅｄＣｏＬｔｄ）およびＶＭ－８０４（ＶｉｒｏＭｅｄＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、メソテリンに特異的に結合する。例示的な抗メソテリンＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＡＲＭＡ－ｈＭｅｓｏ（ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＣＳＧ－ＭＥＳＯ（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、ｉＣａｓｐ９Ｍ２８ｚ（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）、ＫＤ－０２１（ＮａｎｊｉｎｇＫａｅｄｉＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）、ｍ－２８ｚ－Ｔ２（ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＨｅａｌｔｈ）、ＭｅｓｏＣＡＲＴ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、ｍｅｓｏ－ＣＡＲ－Ｔ＋ＰＤ－７８（ＭｉｒＩｍｍｕｎｅＬＬＣ）、ＲＢ－Ｍ１（ＲｅｆｕｇｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ）、およびＴＣ－２１０（ＴＣＲ２ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＭＵＣ１に特異的に結合する。例示的な抗ＭＵＣ１ＣＡＲとしては、限定されないが、抗ＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞療法＋ＰＤ－１ノックアウトＴ細胞療法（食道がん／ＮＳＣＬＣ）、ＧｕａｎｇｚｈｏｕＡｎｊｉｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｙｄｎｅｙ（ＧｕａｎｇｚｈｏｕＡｎｊｉｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏＬＴＤ）、ＩＣＴＣＡＲ－０４３（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＣｏＬｔｄ）、ＩＣＴＣＡＲ－０４６（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＣｏＬｔｄ）、Ｐ－ＭＵＣ１Ｃ－１０１（ＰｏｓｅｉｄａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、およびＴＡＢ－２８ｚ（ＯｎｃｏＴａｂＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＭＵＣ１６に特異的に結合する。例示的な抗ＭＵＣ１６ＣＡＲとしては、限定されないが、４Ｈ１１２８Ｚ－Ｅ２７（ＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）およびＪＣＡＲ－０２０（ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ－ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ｎｆＰ２Ｘ７に特異的に結合する。例示的な抗ｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲとしては、限定されないが、ＢＩＬ－０２２ｃ（ＢｉｏｓｃｅｐｔｒｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＣＡに特異的に結合する。例示的な抗ＰＳＣＡＣＡＲとしては、限定されないが、ＢＰＸ－６０１（ＢｅｌｌｉｃｕｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＭＡに特異的に結合する。ＣＩＫ－ＣＡＲ．ＰＳＭＡ（ＦｏｒｍｕｌａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ）、およびＰ－ＰＳＭＡ－１０１（ＰｏｓｅｉｄａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＲＯＲ１に特異的に結合する。例示的な抗ＲＯＲ１ＣＡＲとしては、限定されないが、ＪＣＡＲ－０２４（ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＲＯＲ２に特異的に結合する。例示的な抗ＲＯＲ２ＣＡＲとしては、限定されないが、ＣＣＴ－３０１－５９（Ｆ１ＯｎｃｏｌｏｇｙＩｎｃ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する。例示的な抗ＳＬＡＭＦ７ＣＡＲとしては、限定されないが、ＵＣＡＲＴ－ＣＳ１（ＣｅｌｌｅｃｔｉｓＳＡ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＴＲＢＣ１に特異的に結合する。例示的な抗ＴＲＢＣ１ＣＡＲとしては、ＡＵＴＯ－４（ＡｕｔｏｌｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｉｍｉｔｅｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＴＲＢＣ２に特異的に結合する。例示的な抗ＴＲＢＣ２ＣＡＲとしては、ＡＵＴＯ－５（ＡｕｔｏｌｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｉｍｉｔｅｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＴＳＨＲに特異的に結合する。例示的な抗ＴＳＨＲＣＡＲとしては、限定されないが、ＩＣＴＣＡＴ－０２３（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＣｅｌｌｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＣｏＬｔｄ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＶＥＧＦＲ－１に特異的に結合する。例示的な抗ＶＥＧＦＲ－１ＣＡＲとしては、ＳＫＬＢ－０８３０１７（ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が挙げられる。

様々な実施形態では、ＣＡＲは、ＡＴ－１０１（ＡｂＣｌｏｎＩｎｃ）、ＡＵ－１０１、ＡＵ－１０５、およびＡＵ－１８０（ＡｕｒｏｒａＢｉｏｐｈａｒｍａＩｎｃ）、ＣＡＲＭＡ－０５０８（ＣａｒｉｓｍａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＡＲ－Ｔ（ＦａｔｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＣＡＲ－Ｔ（ＣｅｌｌＤｅｓｉｇｎＬａｂｓＩｎｃ）、ＣＭ－ＣＸ１（ＣｅｌｄａｒａＭｅｄｉｃａｌＬＬＣ）、ＣＭＤ－５０２、ＣＭＤ－５０３、およびＣＭＤ－５０４（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）、ＣＳＧ－００２ａｎｄＣＳＧ－００５（ＣａｒｓｇｅｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＬｔｄ）、ＥＴ－１５０１、ＥＴ－１５０２、およびＥＴ－１５０４（ＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＦＴ－６１３１４（ＦａｔｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ）、ＧＢ－７００１（ＳｈａｎｇｈａｉＧｅｎｅＣｈｅｍＣｏＬｔｄ）、ＩＭＡ－２０１（ＩｍｍａｔｉｃｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ）、ＩＭＭ－００５およびＩＭＭ－０３９（ＩｍｍｕｎｏｍｅＩｎｃ）、ＩｍｍｕｎｉＣＡＲ（ＴＣＢｉｏＰｈａｒｍＬｔｄ）、ＮＴ－０００４ａｎｄＮＴ－０００９（ＢｉｏＮＴｅｃｈＣｅｌｌａｎｄＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｉｅｓＧｍｂＨ）、ＯＧＤ－２０３（ＯＧＤ２ＰｈａｒｍａＳＡＳ）、ＰＭＣ－００５Ｂ（ＰｈａｒｍＡｂｃｉｎｅ）、ならびにＴＩ－７００７（ＴｉｍｍｕｎｅＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）である。

本明細書に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸も本明細書に提供される。一部の実施形態では、核酸は、単離または精製される。エクスビボの核酸の送達は、当該技術分野で既知の方法を使用して達成することができる。例えば、対象から得られた免疫細胞を、キメラ抗原受容体をコードする核酸ベクターで形質転換してもよい。次に、ベクターを使用して、レシピエント免疫細胞を形質転換し、次いで、これらの細胞がキメラ抗原受容体を発現するようにしてもよい。免疫細胞を形質転換する効率的な手段としては、トランスフェクションおよびトランスダクションが挙げられる。かかる方法は、当該技術分野で周知である。例えば、キメラ抗原受容体（および塩基エディターをコードする核酸）をコードする核酸分子を送達するための適用可能な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４００４０号、ならびに米国特許第８，４５０，１１２号、同第９，１３２，１５３号、および同第９，６６９，０５８号に見出すことができる（それらの各々は、その全体が本明細書に援用される。加えて、塩基エディターをコードする核酸を送達するための本明細書に記載のこれらの方法およびベクターは、キメラ抗原受容体をコードする核酸を送達するために適用可能である。

細胞外結合ドメイン
本発明のキメラ抗原受容体は、細胞外結合ドメインを含む。本明細書で企図されるキメラ抗原受容体の細胞外結合ドメインは、特定の抗原に対する親和性を有する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ３である。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ５である。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ７である。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ３３である。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ１２３である。

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体の抗原結合断片のアミノ酸配列を含む。細胞外結合ドメインの抗体（またはその断片）部分は、抗原のエピトープを認識し、それに結合する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗体断片部分は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体の軽鎖断片および可変断片を含む。他の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗体断片部分は、多鎖可変断片であり、複数の細胞外結合ドメインを含むことができ、したがって、複数の抗原に同時に結合することができる。多鎖可変断片の実施形態では、ヒンジ領域は、異なる可変断片を分離することができ、必要な空間配置および柔軟性を提供する。

他の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗体部分は、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗体部分は、ジスルフィド架橋によって連結された２つの重鎖、および２つの軽鎖を含み、軽鎖は各々、ジスルフィド架橋によって重鎖のうちの１つに連結される。一部の実施形態では、軽鎖は、定常領域および可変領域を含む。抗体の可変領域に存在する相補性決定領域は、特定の抗原に対する抗体の親和性に関与している。したがって、異なる抗原を認識する抗体は、異なる相補性決定領域を含む。相補性決定領域は、細胞外結合ドメインの可変ドメインに存在し、可変ドメイン（すなわち、重鎖可変領域および軽鎖可変領域）は、リンカーと連結されるか、または一部の実施形態では、ジスルフィド架橋と連結され得る。一部の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、（ＧＧＧＧＳ）_ｎリンカーによって連結され、ｎは、１～１０の整数である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーである。

一部の実施形態では、細胞外ドメインによって認識および結合される抗原は、タンパク質もしくはペプチド、核酸、脂質、または多糖である。抗原は、病原性細菌またはウイルスで発現されるものなどの異種であり得る。抗原はまた、合成であってもよく、例えば、いくつかの個体は、合成ラテックスに対して極端なアレルギーを有し、この抗原への曝露は、極端な免疫反応をもたらし得る。一部の実施形態では、抗原は、自己由来であり、病気またはその他の改変された細胞上で発現する。例えば、一部の実施形態では、抗原は、腫瘍細胞で発現する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。他の実施形態では、腫瘍細胞は、液性腫瘍細胞である。他の実施形態では、腫瘍細胞は、Ｂ細胞がんなどの血液がんである。一部の実施形態では、Ｂ細胞がんは、リンパ腫または白血病である。

本明細書に記載の方法で治療される液体がんは、例えば、白血病であり得る。場合によっては、白血病は、前白血病を含む。場合によっては、白血病は、急性白血病である。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。急性白血病には、例えば、急性リンパ性白血病または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）も含まれ、ＡＬＬには、Ｂ系統ＡＬＬ、Ｔ系統ＡＬＬ、およびＴ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）が含まれる。

抗体－抗原相互作用は、水素結合、静電もしくは疎水性相互作用、またはファンデルワールス力から生じる非共有結合性相互作用である。抗原に対するキメラ抗原受容体の細胞外結合ドメインの親和性は、以下の式で計算することができる：
Ｋ_Ａ＝［抗体－抗原］／［抗体］［抗原］、式中、
［Ａｂ］＝抗体上の非占有結合部位のモル濃度、
［Ａｇ］＝抗原上の非占有結合部位のモル濃度、および
［Ａｂ－Ａｇ］＝抗体－抗原複合体のモル濃度。

抗体－抗原相互作用は、抗原の抗体からの解離に基づいて特徴付けることもできる。解離定数（Ｋ_Ｄ）は、解離速度に対する会合速度の比率であり、親和定数に反比例する。したがって、Ｋ_Ｄ＝１／Ｋ_Ａである。当業者は、これらの概念に精通し、ＥＬＩＳＡアッセイなどの従来の方法を使用して、これらの定数が計算され得ることを知っているであろう。

膜貫通ドメイン
本発明のキメラ抗原受容体には、膜貫通ドメインが含まれる。本明細書に記載のキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の脂質二重層細胞膜にまたがり、細胞外結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを分離する。一部の実施形態では、このドメインは、膜貫通ドメインを有する他の受容体に由来し、他の実施形態では、このドメインは合成である。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、非ヒト膜貫通ドメインに由来してもよく、一部の実施形態では、ヒト化されてもよい。「ヒト化」とは、膜貫通ドメインをコードする核酸の配列が、ヒト対象においてより確実にまたは効率的に発現されるように最適化されることを意味する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒト免疫エフェクター細胞において発現された別の膜貫通タンパク質に由来する。かかるタンパク質の例としては、免疫エフェクター細胞において発現され、膜貫通ドメインを有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のサブユニット、ＰＤ１、もしくは表面抗原分類タンパク質のうちのいずれか、または他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは合成であり、そのような配列は多くの疎水性残基を含む。

本開示のＣＡＲで使用される膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含むことができる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＣＤ３ζに由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインである。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインは、以下に提供される例示的なアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である：
ＳＤＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ

キメラ抗原受容体は、一部の実施形態では、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間のスペーサー、細胞内ドメイン、またはその両方を含むように設計される。そのようなスペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、スペーサーは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸長であり得る。さらに他の実施形態では、スペーサーは、１００～５００アミノ酸長であり得る。スペーサーは、あるドメインを別のドメインに連結する任意のポリペプチドであり得、キメラ抗原受容体の機能を増強または最適化するように、かかる連結されるドメインを配置するのに使用される。一部の実施形態では、ヒンジ／スペーサーは、ＣＨ３、ＣＤ８α、またはＣＤ２８から選択される。

細胞内シグナル伝達ドメイン
本発明のキメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞で発現するタンパク質の細胞内部分であり、Ｔ細胞エフェクター機能シグナル（例えば、活性化シグナル）を伝達し、Ｔ細胞に特化された機能を行わせるように指示する。Ｔ細胞の活性化は、いくつかの要因によって誘導され得、同種抗原が、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体に結合すること、および同種リガンドが、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子に結合すること、が含まれる。Ｔ細胞共刺激分子は、Ｔ細胞上の同種結合パートナーであり、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、Ｔ細胞による共刺激応答（例えば、限定されないが、増殖）を媒介する。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞の活性化は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞の増殖および分化）につながる（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５９１－６１９，２００９を参照されたい）。例示的なＴ細胞シグナル伝達ドメインは、当該技術分野で既知である。非限定的な例としては、ＣＤ３ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のシグナル伝達ドメインが挙げられる。

本明細書で企図されるキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、一次シグナル伝達ドメインおよび二次または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ以上の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、またはＩＴＡＭを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、２つ以上のＩＴＡＭを含む。キメラ抗原受容体に組み込まれたＩＴＡＭは、他の細胞の受容体からのＩＴＡＭに由来し得る。一部の実施形態では、ＩＴＡＭを含む一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３δなどのＴＣＲ複合体のサブユニットに由来し得る（図１Ａを参照）。一部の実施形態では、ＩＴＡＭを含む一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来し得る。

一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、およびＣＤ３ζからなる群から選択される。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下に提供される例示的なアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）シグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）シグナル伝達ドメインは、以下に提供される例示的なアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である：
ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ

一部の実施形態では、二次的または共刺激的シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＣＤ８α、ＣＤ８３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、またはＣＤ１５４に由来する。一部の実施形態では、二次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、以下に提供される例示的なアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である：
ＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ

一部の実施形態では、二次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメインは、以下に提供される例示的なアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ

一部の実施形態では、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメインは、以下に提供される例示的なアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である：
ＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ．

一部の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。

免疫細胞における標的遺伝子の編集
本発明は、キメラ抗原（ＣＡＲ）、および１つ以上の編集された遺伝子、１つ以上のその調節エレメント、またはそれらの組み合わせを含む免疫細胞を提供し、編集された遺伝子の発現は、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲおよび改変された内因性遺伝子を含み、フラトリサイドに対する耐性、増強された免疫細胞機能、免疫抑制もしくは免疫阻害に対する耐性、またはそれらの組み合わせを提供する。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、各編集された遺伝子は、単一の塩基編集を含んでもよい。一部の実施形態では、各編集された遺伝子は、遺伝子の異なる領域に複数の塩基編集を含んでもよい。

一部の実施形態では、単一の修飾事象（例えば、エレクトロポレーション）は、１つ以上の遺伝子編集を導入し得る。一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の編集が、１つ以上の遺伝子に同時に導入され得る。一部の実施形態では、免疫細胞（前述の遺伝子編集のうちのいずれかから選択される編集された遺伝子を含む任意の免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない）を編集して、ＣＡＲ－Ｔの機能を増強するか、または細胞の免疫抑制もしくは免疫阻害を低減する他の遺伝子に変異を生成することができる。

一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、類似のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、増加したフラトリサイド耐性を有するが、本明細書に記載される１つ以上の編集された遺伝子をさらに有することはない。一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、類似のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、低減された免疫原性を有するが、本明細書に記載される１つ以上の編集された遺伝子をさらに有することはない。一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、類似のＣＡＲ－Ｔと比較して、より低い活性化閾値を有するが、本明細書に記載される１つ以上の編集された遺伝子をさらに有することはない。一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、類似のＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、増加した抗腫瘍活性を有するが、本明細書に記載される１つ以上の編集された遺伝子をさらに有することはない。

一部の実施形態では、内因性遺伝子またはその調節エレメントに少なくとも１つの修飾を有する免疫細胞が本明細書に提供される。一部の実施形態では、免疫細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の内因性遺伝子またはその調節エレメントにおけるさらなる修飾を含み得る。

一部の実施形態では、１つ以上の遺伝子、または１つ以上のその調節エレメント、またはそれらの組み合わせは、ＣＤ３抗原（ＣＤ３）、ＣＤ５抗原（ＣＤ５）、ＣＤ７抗原（ＣＤ７）、ＣＤ３３抗原（ＣＤ３３）、ＣＤ５２抗原（ＣＤ５２）、ＣＤ１２３抗原（ＣＤ１２３）、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１またはＰＤ－１）、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、クラスＩＩ主要組織適合複合体活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体β定常領域１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常領域２（ＴＲＢＣ２）、およびβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３が編集される。一部の実施形態では、免疫細胞は、編集されたＣＤ３遺伝子、および加えて、少なくとも１つの編集された遺伝子を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、編集されたＣＤ５遺伝子、および加えて、少なくとも１つの編集された遺伝子を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、編集されたＣＤ７遺伝子、および加えて、少なくとも１つの編集された遺伝子を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、編集されたＣＤ３３遺伝子、および加えて、少なくとも１つの編集された遺伝子を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、編集されたＣＤ１２３遺伝子、および加えて、少なくとも１つの編集された遺伝子を含む。少なくとも１つの編集された遺伝子は、先行する段落で言及された遺伝子のリストから選択され得る。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３は、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上と組み合わせて編集される。

様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ５、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ５、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ５における変異と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異と、を含む。一実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ５、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１における変異を含む。

様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ７における変異と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異と、を含む。一実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１における変異を含む。

様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３における変異と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異と、を含む。一実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１における変異を含む。

様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３における変異と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異と、を含む。一実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１における変異を含む。

様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ１２３における変異と、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異と、を含む。一実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１における変異を含む。

一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、単一の核酸塩基修飾である。一部の実施形態では、修飾された内因性遺伝子は、塩基編集によって作製され得る。一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子発現を減少または減弱させ得る。一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子活性化を減少または減弱させ得る。一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子産物の機能性を減少または減弱させ得る。一部の他の実施形態では、塩基編集は、遺伝子発現を活性化または強化し得る。一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子産物の機能性を増加させ得る。

内因性免疫細胞受容体ならびにキメラ抗原受容体を発現する同種免疫細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）と呼ばれる状況で、宿主細胞を認識および攻撃し得る。免疫細胞受容体複合体のα成分は、ＴＲＡＣ遺伝子によってコードされ、一部の実施形態では、この遺伝子は、ＴＣＲ複合体のαサブユニットが非機能的であるか、または存在しないように編集される。このサブユニットは内因性免疫細胞シグナル伝達に必要であるため、この遺伝子を編集することで、同種免疫細胞によって引き起こされる移植片対宿主病のリスクを低減することができる。

一部の実施形態では、フラトリサイド耐性を提供するか、免疫細胞の機能を増強するか、または免疫抑制もしくは免疫阻害を低減するための遺伝子の編集は、免疫細胞において、細胞がキメラ抗原受容体を発現するように形質転換される前に行われ得る。他の態様では、免疫細胞の機能を増強するか、または免疫抑制もしくは免疫阻害を低減するための遺伝子の編集は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、すなわち、免疫細胞がキメラ抗原受容体を発現するように形質転換された後で行われ得る。

本発明の一部の実施形態では、ＣＤ５遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。次いで、ＣＡＲ－Ｔを形質転換して、ＣＤ５ｓｃＦｖを有するキメラ抗原受容体を発現させる。ＣＤ５遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることにより、修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞がフラトリサイドを行う可能性が低くなる。

本発明の一部の実施形態では、ＣＤ７遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。次いで、ＣＡＲ－Ｔを形質転換して、ＣＤ７ｓｃＦｖを有するキメラ抗原受容体を発現させる。ＣＤ７遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることにより、修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞がフラトリサイドを行う可能性が低くなる。

本発明の一部の実施形態では、ＣＤ３３遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。次いで、ＣＡＲ－Ｔを形質転換して、ＣＤ３３ｓｃＦｖを有するキメラ抗原受容体を発現させる。ＣＤ３３遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることにより、修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞がフラトリサイドを行う可能性が低くなる。

本発明の一部の実施形態では、ＣＤ３遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。次いで、ＣＡＲ－Ｔを形質転換して、ＣＤ３ｓｃＦｖを有するキメラ抗原受容体を発現させる。ＣＤ３遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることにより、修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞がフラトリサイドを行う可能性が低くなる。

本発明の一部の実施形態では、ＣＤ１２３遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。次いで、ＣＡＲ－Ｔを形質転換して、ＣＤ１２３ｓｃＦｖを有するキメラ抗原受容体を発現させる。ＣＤ１２３遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることにより、修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞がフラトリサイドを行う可能性が低くなる。

宿主免疫細胞は、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞を非自己として潜在的に認識し、免疫応答を誘発して、非自己細胞を除去することができる。Ｂ２Ｍは、ほぼすべての有核細胞において発現され、ＭＨＣクラスＩ複合体と会合している（図１Ｂ）。循環宿主ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、このＢ２Ｍタンパク質を非自己として認識し、同種細胞を死滅させることができる。この移植片拒絶を克服するために、一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。一部の実施形態では、編集されたＢ２Ｍ遺伝子を有する免疫細胞が本明細書に提供され、そのため、免疫細胞は、内因性の機能的なＢ２Ｍを発現しない。一部の実施形態では、編集されたＢ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が本発明に提供され、そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、内因性Ｂ２Ｍの低下した発現、無視できる発現、または発現の不在を示す。

一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、１つ以上の編集された遺伝子、それらの調節エレメント、またはそれらの組み合わせと、を含む。編集された遺伝子は、免疫応答調節遺伝子、免疫原性遺伝子、チェックポイント阻害因子遺伝子、免疫応答に関与する遺伝子、細胞表面マーカー、例えばＴ細胞表面マーカー、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、活性化Ｔ細胞増殖、α－βＴ細胞活性化、γ－δＴ細胞活性化、Ｔ細胞増殖の正の調節、Ｔヘルパー細胞の増殖もしくは分化の負の調節、またはそれらの調節エレメント、またはそれらの組み合わせに関連する編集された遺伝子とを含む。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、チェックポイント阻害因子遺伝子（例えば、ＰＤ１遺伝子、ＰＤＣ１遺伝子、またはそれらの形成もしくは活性化の経路に関連もしくは調節するメンバー）であり得る。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＴＲＡＣ遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ５遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ７遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ３３遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ３遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ１２３遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、Ｂ２Ｍ遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＩＩＴＡ遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＴＲＢＣ１／２遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ５遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ７遺伝子である。一部の実施形態では、編集された遺伝子は、ＣＤ５２遺伝子である。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子が編集され、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＴＲＢＣ１／２、ＣＩＩＴＡ、およびＴＲＡＣ、またはそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ５２、およびＴＲＡＣ遺伝子が編集される。一部の実施形態では、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＴＲＢＣ１／２、ＣＩＩＴＡ、およびＴＲＡＣ遺伝子が編集される。一部の実施形態では、ＰＤ－１、ＣＤ５、ＣＤ５２、およびＴＲＡＣ遺伝子が編集される。一部の実施形態では、ＰＤ－１、ＣＤ３、ＣＤ７、およびＣＤ５２遺伝子が編集される。

一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、遺伝子の発現を低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、修飾を伴わない対照細胞と比較して、遺伝子の発現を少なくとも５０％低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、修飾を伴わない対照細胞と比較して、遺伝子の発現を少なくとも６０％低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、修飾を伴わない対照細胞と比較して、遺伝子の発現を少なくとも７０％低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、修飾を伴わない対照細胞と比較して、遺伝子の発現を少なくとも８０％低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、修飾を伴わない対照細胞と比較して、遺伝子の発現を少なくとも９０％低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、修飾を伴わない対照細胞と比較して、遺伝子の発現を少なくとも１００％低下させる。一部の実施形態では、内因性遺伝子の編集は、遺伝子発現を排除する。

本発明の一部の実施形態では、ＰＤＣＤ１遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、発現をノックアウトまたはノックダウンするように編集される。ＰＤＣＤ１遺伝子は、免疫細胞で発現する免疫系チェックポイントである細胞表面受容体ＰＤ－１をコードし、抗原特異的な免疫細胞のアポトーシスを促進することによって、自己免疫の低減に関与する。ＰＤＣＤ１遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンすることにより、修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、アポトーシスを起こす可能性がより低く、増殖する可能性がより高く、プログラム細胞死免疫チェックポイントから回避することができる。

ＣＢＬＢ遺伝子は、免疫エフェクター細胞活性化の阻害に重要な役割を果たすＥ３ユビキチンリガーゼをコードする。図１Ｃを参照すると、ＣＢＬＢタンパク質は、免疫エフェクター細胞の寛容性をもたらすシグナル伝達経路に有利に働き、免疫エフェクター細胞の活性化をもたらすシグナル伝達を能動的に阻害する。免疫エフェクター細胞の活性化は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が移植後にインビボで増殖するために必要であることから、本発明の一部の実施形態では、ＣＢＬＢ遺伝子は、発現がノックアウトまたはノックダウンされるように編集される。

一部の実施形態では、編集されたＴＲＡＣ遺伝子（ここで、ＴＲＡＣ遺伝子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の塩基編集を含み得る）を有する免疫細胞が本明細書に提供され、そのため、免疫細胞は、内因性の機能的なＴ細胞受容体α鎖を発現しない。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子に塩基編集を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が本発明に提供され、そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、内因性のＴ細胞受容体αタンパク質の低下した発現、無視できる発現、または無発現を有する。

一部の実施形態では、編集されたＣＩＩＴＡ遺伝子を有する免疫細胞が本明細書に提供され、そのため、免疫細胞は、内因性の機能的なクラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーターを発現しない。一部の実施形態では、編集されたＣＩＩＴＡ遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が本発明に提供され、そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、内因性のクラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーターの低下した発現、無視できる発現、または無発現を示す。

一部の実施形態では、編集されたＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子を有する免疫細胞が本明細書に提供され、そのため、免疫細胞は、内因性の機能的なＴ細胞受容体β鎖を発現しない。一部の実施形態では、編集されたＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書に提供され、そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体β鎖の低下した発現、無視できる発現、または無発現を示す。

一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ遺伝子、またはそれらの組み合わせと、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣおよびＰＤＣＤ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣおよびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞または免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原と、編集されたＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤＣＤ１、およびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＢ２Ｍ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＢ２ＭおよびＰＤＣＤ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＢ２ＭおよびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＢ２Ｍ、ＰＤＣＤ１、およびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＰＤＣＤ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＰＤＣＤおよびＣＢＬＢ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＢＬＢと、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。

一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＤ５遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＤ７遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＤ３３遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＤ３遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＤ１２３遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＦＡＳ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＬＡＧ－３遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＩＩＴＡ遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＢＣ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＲＢＣ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＣＤ５２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、１つ以上の編集されたＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、および／またはＰＤ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。

塩基編集は、遺伝子の任意の好適な位置に、または遺伝子の調節エレメントに配置されてもよい。したがって、開始コドンにおける単一の塩基編集は、例えば、遺伝子の発現を完全に消失させ得ることが理解され得る。一部の実施形態では、改変された内因性遺伝子は、エキソン、イントロン、エキソン－イントロン命令、またはそのそれらの調節エレメントにおいて修飾または編集され得る。修飾は、遺伝子またはその調節エレメントにおける単一の核酸塩基に編集され得る。修飾は、エキソン、複数のエキソン、イントロン、もしくは複数のイントロン、またはそれらの組み合わせ内にあり得る。修飾は、遺伝子のオープンリーディングフレーム内にあり得る。修飾は、遺伝子の非翻訳領域（例えば、３’－ＵＴＲまたは５’－ＵＴＲ）内にあり得る。一部の実施形態では、修飾は、内因性遺伝子の調節エレメント内にある。一部の実施形態では、修飾は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、インスレーター、ターミネーター、転写開始配列、翻訳開始配列（例えば、コザック配列）、またはそれらの任意の組み合わせ内にある。一部の実施形態では、塩基編集により、エキソンに未熟終止コドンが導入されてもよく、翻訳産物の欠如もしくは切断（ミスフォールディングされ、それによって、分解により排除され得る）をもたらすか、または不安定なｍＲＮＡ（容易に分解される）を産生し得る。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子のエキソン１、エキソン２、またはエキソン３、またはエキソン４、またはエキソン５で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。

一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１Ａ遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、７、８、または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１Ａ遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、７、８、または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１Ａ遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７、８または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１Ａ遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＰＤＣ１／ＰＤ－１Ａ遺伝子における塩基編集は、エキソン５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５または８を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＣＤ７遺伝子のエキソン１、エキソン２、またはエキソン３で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＣＤ７遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の位置４、８、９で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、７、８、または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または９を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＬＡＧ－３遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、またはエキソン８で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン６内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン７内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン８内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＬＡＧ－３遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、６、または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、８、または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン６を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン７を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３遺伝子における塩基編集は、エキソン８を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＣＤ３３遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、またはエキソン６で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン６内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＣＤ３３遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７、８、または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、６、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、６、または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３３遺伝子における塩基編集は、エキソン６を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、または６を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＣＤ１２３遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン７、エキソン８、エキソン１０、またはエキソン１１で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン７内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン８内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン１０内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン１１内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＣＤ１２３遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン７、エキソン８、エキソン１０、エキソン１１、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５または６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン７を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン８を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン１０を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１２３遺伝子における塩基編集は、エキソン１１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５または８を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＦＡＳ遺伝子のエキソン１、またはエキソン３、またはエキソン４、またはエキソン５、またはエキソン６、またはエキソン７、またはエキソン８、またはエキソン９で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳにおける塩基編集は、エキソン６内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳにおける塩基編集は、エキソン７内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳにおける塩基編集は、エキソン８内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳにおける塩基編集は、エキソン９内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＦＡＳ遺伝子に対して、エキソン１、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。

一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン６を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン７を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン８を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＦＡＳ遺伝子における塩基編集は、エキソン９を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５または６を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＣＤ５２遺伝子のエキソン１、エキソン２、またはエキソン３で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５２遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５２遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ７遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＣＤ５２遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５２遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５２遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、または７を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＣＤ５遺伝子のエキソン１、エキソン２、またはエキソン３、またはエキソン４、またはエキソン５、またはエキソン６、またはエキソン７、またはエキソン８、またはエキソン９、またはエキソン１０で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン６内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン７内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン８内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン９内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン１０内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＣＤ５遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、エキソン１０、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。

一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５および／または６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５および／または６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、８および／または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、７、８または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン６を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、６、７、８、および／または９を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン７を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン８を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン９を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５遺伝子における塩基編集は、エキソン１０を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置９を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＴＲＡＣ遺伝子（ＵＣＳＣゲノムデータベースＥＮＳＧ０００００２７７７３４．８）のエキソン１、またはエキソン２、またはエキソン３、またはエキソン４で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＴＲＡＣ遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＡＣ遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＡＣ遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＡＣ遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＴＲＡＣ遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＴＲＡＣ遺伝子における塩基編集は、エキソン１内のガイドＲＮＡスペーサー配列を標的とする位置５、６、または９で編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＢ２Ｍ遺伝子（染色体１５，ＮＣ＿００００１５．１０，４４７１１４９２－４４７１８８７７；例示的なｍＲＮＡ配列ＮＭ＿００４０４８）のエキソン１、エキソン２、エキソン３、またはエキソン４で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＢ２Ｍ遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、または９を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４、エキソン１５、エキソン１６、エキソン１７、エキソン１８、またはエキソン１９で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＣＤ５２遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン６内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン７内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン８内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン９内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１０内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１３内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１４内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１５内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１６内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１７内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１８内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１９内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、エキソン８、エキソン９、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４、エキソン１５、エキソン１６、エキソン１７、エキソン１８、エキソン１９、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。

一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン７を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、７または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン８を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン９を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、６、または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１０を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、または７を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、５、６、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置６を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１４を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１５を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１６を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１７を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１８を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子における塩基編集は、エキソン１９を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、７、または８を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子のエキソン１、エキソン２、またはエキソン３で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ１遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４または５を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、例えば、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子のエキソン１、エキソン２、またはエキソン３で行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子における塩基編集は、エキソン１内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子における塩基編集は、エキソン２内の部位で行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子における塩基編集は、エキソン３内の部位で行われる。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集作用は、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子に対して、エキソン１、エキソン２、エキソン３、またはそれらの任意の組み合わせで行われ得る。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子における塩基編集は、エキソン１を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置５、６、７、または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子における塩基編集は、エキソン２を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置７または８を編集することによって行われる。一部の実施形態では、ヒトＴＲＢＣ２遺伝子における塩基編集は、エキソン３を標的とするガイドＲＮＡスペーサー配列の位置４を編集することによって行われる。

一部の実施形態では、塩基編集は、イントロンで行われ得る。例えば、塩基編集は、イントロンで行われてもよい。一部の実施形態では、塩基編集は、イントロン内の部位で行われ得る。一部の実施形態では、塩基編集は、１つ以上のイントロンの部位で行われ得る。一部の実施形態では、塩基編集は、遺伝子の複数のイントロンの任意のエキソンで行われ得る。一部の実施形態では、１つ以上の塩基編集は、エキソン、イントロン、またはエキソンおよびイントロンの任意の組み合わせで行われ得る。

一部の実施形態では、修飾または塩基編集は、プロモーター部位内であり得る。一部の実施形態では、塩基編集は、選択的プロモーター部位内に導入され得る。一部の実施形態では、ベース編集は、エンハンサーなどの５’調節エレメント内にあり得る。一部の実施形態では、塩基編集を導入して、核酸結合タンパク質の結合部位を破壊することができる。例示的な核酸結合タンパク質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼ、メチラーゼまたはメチルトランスフェラーゼ、転写因子、エンハンサー、ＰＡＢＰ、ジンクフィンガータンパク質などであり得る。

一部の実施形態では、塩基編集は、標的タンパク質発現をサイレンシングするためのスプライス破壊のために使用され得る。一部の実施形態では、塩基編集は、スプライスアクセプター－スプライスドナー（ＳＡ－ＳＤ）部位を生成することができる。ＳＡ－ＳＤを生成する標的化塩基編集、またはＳＡ－ＳＤ部位での標的化塩基編集は、遺伝子の発現の低下をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集（例えば、ＡＢＥ、ＣＢＥ）は、スプライスアクセプターおよびスプライスドナー部位（各イントロンの最初と最後の２つのヌクレオチドである）を構成するジヌクレオチドモチーフを標的化するために使用される。例えば、ＣＤ２のエキソン３のスプライスドナー（ＳＤ）部位は、塩基編集のために標的化され得る。一部の実施形態では、スプライス破壊は、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）で達成される。一部の実施形態では、スプライス破壊は、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）で達成される。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ、ＣＢＥ）は、終止コドン（ＳＴＯＰｃｏｄｏｎ）を作成することによってエキソンを編集するために使用される。未熟終止コドンは、エキソン、イントロン、または非翻訳領域で生成され得る。一部の実施形態では、塩基編集を使用して、１つ以上の選択的リーディングフレームに複数の終止コドンを導入することができる。例えば、未熟終止コドンは、エキソン２内の位置８、エキソン３内の位置４、エキソン３内の位置６、エキソン３内の位置９、エキソン４内の位置４、エキソン４内の位置５、またはエキソン５内の位置４で導入され得る。一部の実施形態では、終止コドンは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）によって生成される。一部の実施形態では、終止コドンは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）によって生成される。一部の実施形態では、ＣＢＥは、終止コドンを生成するために、以下の編集（下線部のフォントで示される）のうちのいずれか１つを生成する：
CAG→TAG; CAA→TAA; CGA→TGA; TGG→TGA; TGG→TAG; または TGG→TAA
一部の実施形態では、修飾／塩基編集は、３’－ＵＴＲ、例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）部位に導入され得る。一部の実施形態では、塩基編集は、５’－ＵＴＲ領域上で行われ得る。

一部の実施形態では、免疫細胞（前述の遺伝子編集のうちのいずれかを含む任意の免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない）を編集して、ＣＡＲ－Ｔの機能を増強するか、または細胞の免疫抑制もしくは免疫阻害を低減する他の遺伝子に変異を生成することができる。例えば、一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２、ＺＡＰ７０、ＮＦＡＴｃ１、ＴＥＴ２遺伝子、またはそれらの組み合わせと、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２およびＺＡＰ７０遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２およびＺＡＰ７０遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２およびＮＦＡＴＣ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２、ＺＡＰ７０、およびＮＦＡＴＣ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２、ＺＡＰ７０、およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＧＦＢＲ２、ＮＦＡＴＣ１、およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原および編集されたＴＧＦＢＲ２、ＺＡＰ７０、ＮＦＡＴＣ１、およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＺＡＰ７０遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＺＡＰ７０およびＮＦＡＴＣ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＺＡＰ７０およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＺＡＰ７０、ＰＤＣＤ１、およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＰＤＣＤ１遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＰＤＣＤ１およびＴＥＴ２遺伝子と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体と、編集されたＴＥＴ２と、を含み、編集された遺伝子の発現が、ノックアウトまたはノックダウンされる。

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＴＲＡＣ遺伝子に挿入される。これには利点がある。第一に、ＴＲＡＣは免疫細胞で高度に発現しているため、キメラ抗原受容体をＴＲＡＣ遺伝子に挿入して、受容体の発現がＴＲＡＣプロモーターによって駆動されるようにその構築物を設計すると、キメラ抗原受容体が同様に発現するであろう。第二に、キメラ抗原受容体をＴＲＡＣ遺伝子に挿入すると、ＴＲＡＣの発現がノックアウトされるであろう。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子編集システムを使用して、キメラ抗原受容体をＴＲＡＣ遺伝子座に挿入することができる。ＴＲＡＣ遺伝子座に特異的なｇＲＮＡは、遺伝子編集システムをその遺伝子座に誘導し、二本鎖ＤＮＡ切断を開始することができる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｂと組み合わせて使用される。様々な実施形態では、遺伝子編集システムは、ＣＡＲ受容体をコードする配列を有する核酸と併せて使用される。以下の表１Ａに、例示的なガイドＲＮＡが提供される。

ＤＮＡ構築物は、キメラ抗原受容体と、ｇＲＮＡの標的化配列に隣接する延びた一続きのＴＲＡＣＤＮＡを含む核酸と、をコードする。理論に縛られることなく、構築物は、相補的なＴＲＡＣ配列に結合し、次いで、構築物上のＴＲＡＣ配列に近接して存在するキメラ抗原受容体のＤＮＡが、破壊部位に挿入され、ＴＲＡＣ遺伝子が効果的にノックアウトされ、かつキメラ抗原受容体核酸がノックインされる。表１Ｂは、ＴＲＡＣ遺伝子のガイドＲＮＡを提供する。これは、塩基編集機構をＴＲＡＣ遺伝子座に誘導することができ、キメラ抗原受容体核酸の挿入を可能にする。最初の１１個のｇＲＮＡは、ＢｈＣａｓ１２ｂヌクレアーゼ用である。第２のセットの１１個は、ＢｖＣａｓ１２ｂヌクレアーゼ用である。これらはすべて、二本鎖切断を生成することによって、ＣＡＲをＴＲＡＣに挿入するためのものであり、塩基編集のためのものではない。

最初の１１個のｇＲＮＡは、ＢｈＣａｓ１２ｂヌクレアーゼ用である。第２のセットの１１個は、ＢｖＣａｓ１２ｂヌクレアーゼ用である。太字は足場配列（最初の例において）。

一部の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸は、ＢＥ４塩基エディターを使用してＴＲＡＣ遺伝子座を標的化することができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９塩基編集システムを使用してＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする。

上に記載の遺伝子編集を生成するために、免疫細胞を対象から収集し、２つ以上のガイドＲＮＡおよび核酸塩基エディターポリペプチド（核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとを含む）と接触させる。一部の実施形態では、収集された免疫細胞は、少なくとも１つの核酸と接触する。ここで、少なくとも１つの核酸は、２つ以上のガイドＲＮＡおよび核酸塩基エディターポリペプチド（核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とシチジンデアミナーゼとを含む）をコードする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド類似体を含む。これらのヌクレオチド類似体は、細胞プロセスによるｇＲＮＡの分解を阻害することができる。表２は、使用されるｇＲＮＡの標的配列を提供する。

本発明で使用されるシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターは、一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡに作用することができる。それらを使用して、免疫細胞の標的核酸塩基配列における修飾を生成する方法が提示される。

特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する１つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、または二重鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖を切断するＣａｓ９ドメイン（Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される）を有し得る。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在により、標的核酸塩基の反対側の未編集（例えば、メチル化されていない）鎖を切断するＣａｓ９の活性が維持される。触媒残基の変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０）は、標的Ａ残基を含む編集された鎖の切断を防ぐ。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡで定義された標的配列に基づいて、特定の位置で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、未編集鎖の修復をもたらし、最終的には、未編集鎖で核酸塩基の変化をもたらす。

核酸塩基エディター
ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、修飾、または改変するための塩基エディターまたは核酸塩基エディターが本明細書に開示される。ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと、核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）と、を含む、核酸塩基エディターまたは核酸塩基エディターが本明細書に記載される。ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、結合したガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）と併せた場合、標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し（すなわち、結合したガイド核酸の塩基と標的ポリヌクレオチド配列の塩基との間の相補的な塩基対形成を介して）、それによって、塩基エディターを編集が望まれる標的核酸配列に局在化させ得る。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。

ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン
ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインはまた、ＲＮＡに結合する核酸プログラマブルタンパク質を含み得ることを理解されたい。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、核酸と会合することができ、これが、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインをＲＮＡに誘導する。また、他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質も本開示の範囲内であるが、それらは本開示に具体的に列挙されていない。

塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、それ自体が１つ以上のドメインを含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含むことができる。本明細書において、「エキソヌクレアーゼ」という用語は、遊離末端から核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を分解することができるタンパク質またはポリペプチドを指し、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）内の内部領域を触媒（例えば、切断）することができるタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸の１つの鎖を切断することができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の両方の鎖を切断することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デオキシリボヌクレアーゼであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、リボヌクレアーゼであり得る。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、標的ポリヌクレオチドの０、１、または２本の鎖を切断することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ニッカーゼドメインを含むことができる。本明細書において、「ニッカーゼ」という用語は、二重鎖核酸分子（例えばＤＮＡ）の２本鎖のうちの１つの鎖のみを切断することができるヌクレアーゼドメインを含む、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを指す。一部の実施形態では、ニッカーゼは、活性ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに１つ以上の変異を導入することによって、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの完全な触媒活性（例えば、天然）形態に由来し得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインが、Ｃａｓ９に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメインは、Ｄ１０Ａ変異および位置８４０のヒスチジンを含み得る。かかる実施形態では、残基Ｈ８４０は、触媒活性を保持し、それによって、核酸二重鎖の一本鎖を切断することができる。別の例では、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメインは、Ｈ８４０Ａ変異を含んでもよいが、位置１０のアミノ酸残基はＤのままである。一部の実施形態では、ニッカーゼは、ニッカーゼ活性に必要とされないヌクレアーゼドメインの全部または一部を除去することによって、完全に触媒活性な（例えば、天然の）形態のポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに由来し得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインがＣａｓ９に由来するニッカーゼドメインを含む場合、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメインは、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインの全部または一部の欠失を含み得る。

例示的な触媒活性Ｃａｓ９のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ。

したがって、ニッカーゼドメインを含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、特定のポリヌクレオチド標的配列（例えば、結合したガイド核酸の相補配列によって決定される）で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができる。一部の実施形態では、ニッカーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメイン）を含む塩基エディターによって切断される核酸二重鎖標的ポリヌクレオチド配列の鎖は、塩基エディターによって編集されない鎖である（すなわち、塩基エディターによって切断される鎖は、編集される塩基を含む鎖と反対である）。他の実施形態では、ニッカーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメイン）を含む塩基エディターは、編集のために標的化されているＤＮＡ分子の鎖を切断することができる。かかる実施形態では、非標的鎖は切断されない。

また、触媒的に不活性な（すなわち、標的ポリヌクレオチド配列を切断することができない）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターも本明細書に提供される。本明細書において、「触媒的に不活性な（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙｄｅａｄ）」および「ヌクレアーゼ不活性型（ｎｕｃｌｅａｓｅｄｅａｄ）」という用語は、核酸の鎖を切断することができないようにする１つ以上の変異および／または欠失を有するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを指すように互換的に使用される。一部の実施形態では、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン塩基エディターは、１つ以上のヌクレアーゼドメインにおける特異的な点変異の結果として、ヌクレアーゼ活性を欠損し得る。例えば、Ｃａｓ９ドメインを含む塩基エディターの場合、Ｃａｓ９はＤ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異の両方を含むことができる。そのような変異は、両方ともヌクレアーゼドメインを不活性化し、それによってヌクレアーゼ活性の喪失をもたらす。他の実施形態では、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、触媒ドメイン（例えば、ＲｕｖＣ１および／またはＨＮＨドメイン）の全部または一部の１つ以上の欠失を含むことができる。さらなる実施形態では、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、点変異（例えば、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ）、ならびにヌクレアーゼドメインの全部または一部の欠失を含む。

また、本明細書では、以前の機能的バージョンのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインから、触媒的に不活性なポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを生成することができる変異も企図される。例えば、触媒的に不活性なＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）の場合、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するバリアントが提供され、これにより、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９がもたらされる。そのような変異としては、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメインにおける置換）が挙げられる。さらなる好適なヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本開示および当該分野の知識に基づいて、当業者には明らかであり得、本開示の範囲内である。かかる追加の例示的で好適なヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインとしては、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメインが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｐｒａｓｈａｎｔｅｔａｌ．，ＣＡＳ９ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｐａｉｒｅｄｎｉｃｋａｓｅｓｆｏｒｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（９）：８３３－８３８を参照されたい。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

塩基エディターに組み込まれ得るポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含み、結合したガイド核酸を介して、核酸のＣＲＩＳＰＲ（すなわち、クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復）媒介性修飾の間に核酸配列に結合することができる天然または修飾されたタンパク質もしくはその一部を含む。かかるタンパク質は、本明細書において「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」と称される。したがって、本明細書において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部を含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディター（すなわち、塩基エディターの「ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン」とも称されるＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部をドメインとして含む塩基エディター）が開示される。塩基エディターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の野生型または天然バージョンと比較して、修飾され得る。例えば、以下に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の野生型または天然バージョンと比較して、１つ以上の変異、挿入、欠失、再編、および／または組換えを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝要素（ウイルス、転位要素、および接合性プラスミド）に対する保護を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行可動要素に相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターが転写され、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に加工される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｃｒＲＮＡ前駆体の正しいプロセシングには、トランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９タンパク質が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼ３支援プロセシングのガイドとして機能する。続いて、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖または環状のｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ分解的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まず、エンドヌクレアーゼ分解的に切断され、次いで、３’－５’エキソヌクレアーゼ分解的にトリミングされる。本質的に、ＤＮＡ結合およびＤＮＡ切断は、典型的には、タンパク質および両方のＲＮＡを必要とする。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の態様を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作することができる。例えば、ＪｉｎｅｋＭ．，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己の区別を助ける。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、操作されたＣａｓタンパク質を利用することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ結合に必要な足場配列と、修飾されるゲノム標的を定義するユーザ定義の約２０ヌクレオチドのスペーサーとからなる短い合成ＲＮＡである。したがって、当業者は、Ｃａｓタンパク質特異性のゲノム標的を変えることができ、ｇＲＮＡの標的配列がゲノムの残部と比較して、ゲノム標的に対してどの程度特異的であるかによって部分的に決定される。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡ足場配列は、以下のとおりである：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ。

一実施形態では、ＲＮＡ足場は、ステム・ループを含む。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、以下の核酸配列を含む：
ＧＵＵＵＵＵＧＵＡＣＵＣＵＣＡＡＧＡＵＵＵＡＡＧＵＡＡＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＡＡＣＵＵＡＣＡＣＡＧＵＵＡＣＵＵＡＡＡＵＣＵＵＧＣＡＧＡＡＧＣＵＡＣＡＡＡＧＡＵＡＡＧＧＣＵＵＣＡＵＧＣＣＧＡＡＡＵＣＡＡＣＡＣＣＣＵＧＵＣＡＵＵＵＵＡＵＧＧＣＡＧＧＧＵＧ。

一実施形態では、ＲＮＡ足場は、正準ステム・ループを含む。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、以下の核酸配列を含む：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ
ここで、ｍ＝２’－Ｏ－メチル修飾、および＊＝３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、ここに示されるように、第１の３’末端のＲＮＡ残基）。

一実施形態では、ＲＮＡ足場は、以下の核酸配列を含む：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
ここで、ｍ＝２’－Ｏ－メチル修飾、および＊＝３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、ここに示されるように、第１の３’末端のＲＮＡ残基）。

一実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓｓｇＲＮＡ足場のポリヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ。

一実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓｓｇＲＮＡ足場のポリヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＵＡＡＵＧＡＡＡＡＵＵＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡ。

一実施形態では、ＢｈＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ足場は、以下のポリヌクレオチド配列を有する：
ＧＵＵＣＵＧＴＣＵＵＵＵＧＧＵＣＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＵＣＵＡＧＣＵＡＵＡＡＧＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＵＧＵＧＡＧＡＡＡＣＵＣＣＵＡＵＵＧＣＵＧＧＡＣＧＡＵＧＵＣＵＣＵＵＡＣＧＡＧＧＣＡＵＵＡＧＣＡＣ。

一実施形態では、ＢｖＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ足場は、以下のポリヌクレオチド配列を有する：ＧＡＣＣＵＡＵＡＧＧＧＵＣＡＡＵＧＡＡＵＣＵＧＵＧＣＧＵＧＵＧＣＣＡＵＡＡＧＵＡＡＵＵＡＡＡＡＡＵＵＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＵＧＡＡＡＡＣＡＧＧＵＧＣＵＵＧＧＣＡＣ。

一実施形態では、ＲＮＡ足場は、非正準配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡ足場は、以下の核酸配列を含む：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ
ここで、ｍ＝２’－Ｏ－メチル修飾、および＊＝３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、ここに示されるように、第１の３’末端のＲＮＡ残基）。

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、エンドヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ）であり、結合したガイド核酸と併せた場合、標的ポリヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、ニッカーゼであり、結合したガイド核酸と併せた場合、標的ポリヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、触媒的に不活性なドメインであり、結合したガイド核酸と併せた場合、標的ポリヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインが結合する標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインが結合する標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。

本明細書で使用され得るＣａｓタンパク質としては、クラス１およびクラス２が挙げられる。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが挙げられる。未修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つの機能的なエンドヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）を有する、Ｃａｓ９などのＤＮＡ切断活性を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内などの標的配列における一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の塩基対内の一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。

変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）と、少なくとも、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来）と、最大、または最大約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質の野生型または修飾形態を指すことができ、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含み得る。

一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１２８４．１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１７８６１．１）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１８４６．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１３１４．１）、Ｂｅｌｌｉｅｌｌａｂａｌｔｉｃａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８０１０．１）、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓｔｏｒｑｕｉｓ（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８７２１．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿８２０８３２．１）、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿４７２０７３．１）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４４９００．１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４２１００．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の全部または一部を含み得る。

核酸塩基エディターのＣａｓ９ドメイン
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は、当業者に周知である（例えば、“ＣｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎＭｌｓｔｒａｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ．”Ｆｅｒｒｅｔｔｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）、“ＣＲＩＳＰＲＲＮＡｍａｔｕｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌＲＮＡａｎｄｈｏｓｔｆａｃｔｏｒＲＮａｓｅＩＩＩ．”ＤｅｌｔｃｈｅｖａＥ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４７１：６０２－６０７（２０１１）、および“Ａｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ．”ＪｉｎｅｋＭ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい。それらの各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９オーソログは、これらに限定されないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む様々な種で記載されている。さらなる好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであり、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，“ＴｈｅｔｒａｃｒＲＮＡａｎｄＣａｓ９ｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｔｙｐｅＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｉｍｍｕｎｉｔｙｓｙｓｔｅｍｓ”（２０１３）ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ１０：５，７２６－７３７に開示されている生物および遺伝子座に由来するＣａｓ９配列が含まれる（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ９ドメインである。非限定的な例示的なＣａｓ９ドメインが本明細書に提供される。Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Ｃａｓ９ドメインは、二重鎖核酸の両方の鎖（例えば、二重鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖）を切断するＣａｓ９ドメインであり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、以下の２つのＣａｓ９ドメインのうちの１つを含む：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン、または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン。一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその断片を含むタンパク質は、「Ｃａｓ９バリアント」と称される。Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９またはその断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、そのため、その断片は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。一部の実施形態では、断片は、少なくとも１００アミノ酸長である。一部の実施形態では、断片は、長さが少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または少なくとも１３００アミノ酸長である。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列（例えば、本明細書に提供されるＣａｓ９配列のうちの１つ）を含む。しかしながら、他の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、全長Ｃａｓ９配列を含まず、１つ以上のその断片のみを含む。好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片の例示的なアミノ酸配列が本明細書に提供され、Ｃａｓ９ドメインおよび断片のさらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。

Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を、ガイドＲＮＡに相補的な特異的ＤＮＡ配列に誘導するガイドＲＮＡと会合することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の例としては、限定されないが、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦが挙げられる。Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの修飾もしくは操作されたバージョンが挙げられる。

一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１７０５３．１）由来のＣａｓ９に対応する。代表的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）核酸配列を以下に提供する：
ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＴＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＴＡＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＡＴＴＡＡＣＧＣＡＡＧＴＡＧＡＧＴＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＣＣＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＧＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＧＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＣＴＴＡＧＣＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡＡＣＧＣＧＴＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＧＧＴＡＡＡＴＣＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＣＧＴＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＴＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＧＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＴＡＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＴＡＣＣＴＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡ

例示的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）アミノ酸配列を以下に提供する：
（単一下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）

一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、以下のヌクレオチド配列に対応するか、またはそれを含む：
ＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＣＴＡＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＴＡＡＴＴＣＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＡＴＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＴＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＧＡＴＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＣＴＣＧＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＣＣＧＣＴＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＧＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＴＡＣＣＣＡＡＣＧＡＴＴＴＡＴＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＡＴＡＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＣＣＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＡＴＡＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＧＣＧＴＧＧＡＴＧＣＧＡＡＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＴＴＣＧＧＴＡＡＣＣＴＴＡＴＡＧＣＧＣＴＣＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＣＡＡＡＡＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＡＧＴＣＣＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＡＴＡＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＴＴＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＴＣＣＡＣＴＴＡＧＧＣＧＡＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＴＴＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＡＴＡＣＣＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＣＧＧＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＴＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＡＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＣＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＡＡＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＴＧＣＧＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＧＴＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＣＴＴＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＧＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＡＡＡＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＴＴＧＴＣＧＣＧＧＡＡＡＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＣＧＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＧＡＡＣＡＴＡＴＴＧＣＧＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＣＣＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＣＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＣＣＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＡＣＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＡＡＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＡＣＡＧＡＴＡＣＴＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＣＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＴＣＴＴＡＡＴＧＣＣＧＴＣＧＴＡＧＧＧＡＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣＧＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＧＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＣＧＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＧＧＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＧＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＣＡＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＣＣＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＣＴＡＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＡＴＴＡＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＧＴＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＡＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＣＡＣＴＡＣＣＧＴＣＴＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＴＴＴＣＣＴＧＴＡＴＴＴＡＧＣＧＴＣＣＣＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＴＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＡＧＣＡＡＡＴＴＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴＴＡＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＴＡＡＡＣＣＣＡＴＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＡＣＴＣＴＴＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡＣＧＡＴＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＣＧＣＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＡＧＡＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡ

一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、以下のアミノ酸配列に対応するか、またはそれを含む：
（単一下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）。

一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２７３７．２（以下のヌクレオチド配列））由来のＣａｓ９に対応する：
ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＴＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＴＡＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＡＴＴＡＡＣＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＡＣＣＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＧＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＧＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＧＧＴＡＡＡＴＣＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＣＧＴＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＴＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＧＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＴＡＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＴＡＣＣＴＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡ

一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照配列：Ｑ９９ＺＷ２（以下のアミノ酸配列））由来のＣａｓ９に対応する：
（単一下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）

追加のＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９）は、そのバリアントおよびホモログを含めて、本開示の範囲内であることを理解されたい。例示的なＣａｓ９タンパク質としては、以下に提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９である。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９ドメインは、二重鎖核酸分子のいずれかの鎖を切断することなく、二重鎖核酸分子に結合することができる（例えば、ｇＲＮＡ分子を介して）。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ変異およびＨ８４０Ｘ変異（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸変化である）を含むか、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異を含むか、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。一例として、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインは、クローニングベクターｐＰｌａｔＴＥＴ－ｇＲＮＡ２（受託番号ＢＡＶ５４１２４）に記載されるアミノ酸配列を含む。

例示的な触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＡＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（例えば、Ｑｉｅｔａｌ．，“ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３－８３を参照されたい。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

さらなる好適なヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本開示および当該分野の知識に基づいて、当業者には明らかであり、本開示の範囲内である。かかる追加の例示的で好適なヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインとしては、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメインが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｐｒａｓｈａｎｔｅｔａｌ．，ＣＡＳ９ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｐａｉｒｅｄｎｉｃｋａｓｅｓｆｏｒｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（９）：８３３－８３８を参照されたい。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例えば、不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有し、すなわち、（「ニッカーゼ」Ｃａｓ９の場合）Ｃａｓ９は、ニッカーゼであり、「ｎＣａｓ９」タンパク質と称される。ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質は、互換的に、「ｄＣａｓ９」タンパク質（ヌクレアーゼ－「不活性型（ｄｅａｄ）」Ｃａｓ９の場合）または触媒不活性Ｃａｓ９と称され得る。不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成するための方法は既知である。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１（２０１２）、Ｑｉｅｔａｌ．，“ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ－ＧｕｉｄｅｄＰｌａｔｆｏｒｍｆｏｒＳｅｑｕｅｎｃｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＣｏｎｔｒｏｌｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（２０１３）Ｃｅｌｌ．２８；１５２（５）：１１７３－８３を参照されたい（それらの各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン（ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメイン）を含むことが知られている。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的な鎖を切断し、一方、ＲｕｖＣ１サブドメインは、非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をサイレンシングすることができる。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１（２０１２）；Ｑｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２８；１５２（５）：１１７３－８３（２０１３））。

一部の実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるｄＣａｓ９ドメインのいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１つ以上の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に、部分的もしくは全体的に対応するか、またはそれを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ変異およびＨ８４０Ｘ変異（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸変化である）を含むか、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異を含むか、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインは、クローニングベクターｐＰｌａｔＴＥＴ－ｇＲＮＡ２（受託番号ＢＡＶ５４１２４）に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、以下のｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）のアミノ酸配列を含む：
（単一下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）。

一部の実施形態では、例示的な触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＡＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ
（例えば、Ｑｉｅｔａｌ．，“ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３－８３を参照されたい。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、例示的な触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＡＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ変異を含み、一方、位置８４０の残基は、上に提供されるアミノ酸配列において、または本明細書に提供される任意のアミノ酸配列における対応する位置において、ヒスチジンのままである。

他の実施形態では、例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するｄＣａｓ９バリアントが提供される。そのような変異としては、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメインにおける置換）が挙げられる。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９のバリアントは、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸以上より短いまたはより長いアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例えば、不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有し、すなわち、（「ニッカーゼ」Ｃａｓ９の場合）Ｃａｓ９は、ニッカーゼであり、「ｎＣａｓ９」タンパク質と称される。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖核酸分子（例えば、二重鎖ＤＮＡ分子）の一方の鎖のみを切断することができるＣａｓ９タンパク質であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖核酸分子の標的鎖を切断し、つまり、Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｃａｓ９に結合しているｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と塩基対を形成している（相補的な）鎖を切断する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ変異を含み、位置８４０にヒスチジンを有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖核酸分子の非標的の未塩基編集鎖を切断し、つまり、Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｃａｓ９に結合しているｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と塩基対を形成していない鎖を切断することを意味する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｈ８４０Ａ変異を含み、位置１０にアスパラギン酸残基、または対応する変異を有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書に提供されるＣａｓ９ニッカーゼのいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる好適なＣａｓ９ニッカーゼは、本開示および当該分野の知識に基づいて、当業者には明らかであり、本開示の範囲内である。

例示的な触媒的Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、単細胞性原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌）由来のＣａｓ９を指す。一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質であってもよく、それらは、例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，“ＮｅｗＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓｆｒｏｍｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｍｉｃｒｏｂｅｓ．”ＣｅｌｌＲｅｓ．２０１７Ｆｅｂ２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１７．２１に記載されている（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。ゲノム解像メタゲノミクスを使用して、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが同定されており、生命の古細菌ドメインで最初に報告されたＣａｓ９が含まれる。この多岐にわたるＣａｓ９タンパク質は、活性なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの一部として、ほとんど研究されていなかったナノ古細菌において見出された。細菌では、これまでに知られていなかった２つの系、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＹが発見されたが、これらは、これまでに発見された中で最もコンパクトなシステムのうちの１つである。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムにおいて、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸ、またはＣａｓＸのバリアントによって置き換えられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムにおいて、Ｃａｓ９は、ＣａｓＹ、またはＣａｓＹのバリアントによって置き換えられる。他のＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）として使用されてもよく、それらが本開示の範囲内であることを理解されたい。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質であり得る。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＸタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＹタンパク質である。一部の実施形態では、プログラマブルヌクレオチド結合タンパク質は、本明細書に記載の任意のＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、プログラマブルヌクレオチド結合タンパク質は、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示に従って、他の細菌種由来のＣａｓＸおよびＣａｓＹも使用され得ることを理解されたい。

例示的なＣａｓＸ（（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｆ０ＮＮ８７；ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｆ０ＮＨ５３）ｔｒ｜Ｆ０ＮＮ８７｜Ｆ０ＮＮ８７＿ＳＵＬＩＨＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＣａｓｘタンパク質ＯＳ＝Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ（ＨＶＥ１０／４株）ＧＮ＝ＳｉＨ＿０４０２ＰＥ＝４ＳＶ＝１）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＥＶＰＬＹＮＩＦＧＤＮＹＩＩＱＶＡＴＥＡＥＮＳＴＩＹＮＮＫＶＥＩＤＤＥＥＬＲＮＶＬＮＬＡＹＫＩＡＫＮＮＥＤＡＡＡＥＲＲＧＫＡＫＫＫＫＧＥＥＧＥＴＴＴＳＮＩＩＬＰＬＳＧＮＤＫＮＰＷＴＥＴＬＫＣＹＮＦＰＴＴＶＡＬＳＥＶＦＫＮＦＳＱＶＫＥＣＥＥＶＳＡＰＳＦＶＫＰＥＦＹＥＦＧＲＳＰＧＭＶＥＲＴＲＲＶＫＬＥＶＥＰＨＹＬＩＩＡＡＡＧＷＶＬＴＲＬＧＫＡＫＶＳＥＧＤＹＶＧＶＮＶＦＴＰＴＲＧＩＬＹＳＬＩＱＮＶＮＧＩＶＰＧＩＫＰＥＴＡＦＧＬＷＩＡＲＫＶＶＳＳＶＴＮＰＮＶＳＶＶＲＩＹＴＩＳＤＡＶＧＱＮＰＴＴＩＮＧＧＦＳＩＤＬＴＫＬＬＥＫＲＹＬＬＳＥＲＬＥＡＩＡＲＮＡＬＳＩＳＳＮＭＲＥＲＹＩＶＬＡＮＹＩＹＥＹＬＴＧＳＫＲＬＥＤＬＬＹＦＡＮＲＤＬＩＭＮＬＮＳＤＤＧＫＶＲＤＬＫＬＩＳＡＹＶＮＧＥＬＩＲＧＥＧ．

例示的なＣａｓＸ（＞ｔｒ｜Ｆ０ＮＨ５３｜Ｆ０ＮＨ５３＿ＳＵＬＩＲＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＣａｓｘＯＳ＝Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ（ＲＥＹ１５Ａ株）ＧＮ＝ＳｉＲｅ＿０７７１ＰＥ＝４ＳＶ＝１）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＥＶＰＬＹＮＩＦＧＤＮＹＩＩＱＶＡＴＥＡＥＮＳＴＩＹＮＮＫＶＥＩＤＤＥＥＬＲＮＶＬＮＬＡＹＫＩＡＫＮＮＥＤＡＡＡＥＲＲＧＫＡＫＫＫＫＧＥＥＧＥＴＴＴＳＮＩＩＬＰＬＳＧＮＤＫＮＰＷＴＥＴＬＫＣＹＮＦＰＴＴＶＡＬＳＥＶＦＫＮＦＳＱＶＫＥＣＥＥＶＳＡＰＳＦＶＫＰＥＦＹＫＦＧＲＳＰＧＭＶＥＲＴＲＲＶＫＬＥＶＥＰＨＹＬＩＭＡＡＡＧＷＶＬＴＲＬＧＫＡＫＶＳＥＧＤＹＶＧＶＮＶＦＴＰＴＲＧＩＬＹＳＬＩＱＮＶＮＧＩＶＰＧＩＫＰＥＴＡＦＧＬＷＩＡＲＫＶＶＳＳＶＴＮＰＮＶＳＶＶＳＩＹＴＩＳＤＡＶＧＱＮＰＴＴＩＮＧＧＦＳＩＤＬＴＫＬＬＥＫＲＤＬＬＳＥＲＬＥＡＩＡＲＮＡＬＳＩＳＳＮＭＲＥＲＹＩＶＬＡＮＹＩＹＥＹＬＴＧＳＫＲＬＥＤＬＬＹＦＡＮＲＤＬＩＭＮＬＮＳＤＤＧＫＶＲＤＬＫＬＩＳＡＹＶＮＧＥＬＩＲＧＥＧ．

デルタプロテオバクテリアＣａｓＸ
ＭＥＫＲＩＮＫＩＲＫＫＬＳＡＤＮＡＴＫＰＶＳＲＳＧＰＭＫＴＬＬＶＲＶＭＴＤＤＬＫＫＲＬＥＫＲＲＫＫＰＥＶＭＰＱＶＩＳＮＮＡＡＮＮＬＲＭＬＬＤＤＹＴＫＭＫＥＡＩＬＱＶＹＷＱＥＦＫＤＤＨＶＧＬＭＣＫＦＡＱＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱＬＫＰＶＫＤＳＤＥＡＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶＤｆＡＹＮＥＶＩＡＲＶＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳＦＰＶＶＥＲＲＥＮＥＶＤＷＷＮＴＩＮＥＶＫＫＬＩＤＡＫＲＤＭＧＲＶＦＷＳＧＶＴＡＥＫＲＮＴＩＬＥＧＹＮＹＬＰＮＥＮＤＨＫＫＲＥＧＳＬＥＮＰＫＫＰＡＫＲＱＦＧＤＬＬＬＹＬＥＫＫＹＡＧＤＷＧＫＶＦＤＥＡＷＥＲＩＤＫＫＩＡＧＬＴＳＨＩＥＲＥＥＡＲＮＡＥＤＡＱＳＫＡＶＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳＦＶＬＥＲＬＫＥＭＤＥＫＥＦＹＡＣＥＩＱＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧＮＰＦＡＶＥＡＥＮＲＶＶＤＩＳＧＦＳＩＧＳＤＧＨＳＩＱＹＲＮＬＬＡＷＫＹＬＥＮＧＫＲＥＦＹＬＬＭＮＹＧＫＫＧＲＩＲＦＴＤＧＴＤＩＫＫＳＧＫＷＱＧＬＬＹＧＧＧＫＡＫＶＩＤＬＴＦＤＰＤＤＥＱＬＩＩＬＰＬＡＦＧＴＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧＬＩＫＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴＩＹＮＫＫＩＧＲＤＥＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥＲＲＥＶＶＤＰＳＮＩＫＰＶＮＬＩＧＶＡＲＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰＬＰＥＦＫＤＳＳＧＧＰＴＤＩＬＲＩＧＥＧＹＫＥＫＱＲＡＩＱＡＡＫＥＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳＲＫＦＡＳＫＳＲＮＬＡＤＤＭＶＲＮＳＡＲＤＬＦＹＨＡＶＴＨＤＡＶＬＶＦＡＮＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦＭＴＥＲＱＹＴＫＭＥＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥＧＬＴＳＫＴＹＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣＳＮＣＧＦＴＩＴＹＡＤＭＤＶＭＬＶＲＬＫＫＴＳＤＧＷＡＴＴＬＮＮＫＥＬＫＡＥＹＱＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱＴＶＥＫＥＬＳＡＥＬＤＲＬＳＥＥＳＧＮＮＤＩＳＫＷＴＫＧＲＲＤＥＡＬＦＬＬＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱＥＱＦＶＣＬＤＣＧＨＥＶＨＡＡＥＱＡＡＬＮＩＡＲＳＷＬＦＬＮＳＮＳＴＥＦＫＳＹＫＳＧＫＱＰＦＶＧＡＷＱＡＦＹＫＲＲＬＫＥＶＷＫＰＮＡ

例示的なＣａｓＹ（（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＡＰＧ８０６５６．１）＞ＡＰＧ８０６５６．１ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ＣａｓＹ［難培養パルクバクテリア群の細菌］）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＳＫＲＨＰＲＩＳＧＶＫＧＹＲＬＨＡＱＲＬＥＹＴＧＫＳＧＡＭＲＴＩＫＹＰＬＹＳＳＰＳＧＧＲＴＶＰＲＥＩＶＳＡＩＮＤＤＹＶＧＬＹＧＬＳＮＦＤＤＬＹＮＡＥＫＲＮＥＥＫＶＹＳＶＬＤＦＷＹＤＣＶＱＹＧＡＶＦＳＹＴＡＰＧＬＬＫＮＶＡＥＶＲＧＧＳＹＥＬＴＫＴＬＫＧＳＨＬＹＤＥＬＱＩＤＫＶＩＫＦＬＮＫＫＥＩＳＲＡＮＧＳＬＤＫＬＫＫＤＩＩＤＣＦＫＡＥＹＲＥＲＨＫＤＱＣＮＫＬＡＤＤＩＫＮＡＫＫＤＡＧＡＳＬＧＥＲＱＫＫＬＦＲＤＦＦＧＩＳＥＱＳＥＮＤＫＰＳＦＴＮＰＬＮＬＴＣＣＬＬＰＦＤＴＶＮＮＮＲＮＲＧＥＶＬＦＮＫＬＫＥＹＡＱＫＬＤＫＮＥＧＳＬＥＭＷＥＹＩＧＩＧＮＳＧＴＡＦＳＮＦＬＧＥＧＦＬＧＲＬＲＥＮＫＩＴＥＬＫＫＡＭＭＤＩＴＤＡＷＲＧＱＥＱＥＥＥＬＥＫＲＬＲＩＬＡＡＬＴＩＫＬＲＥＰＫＦＤＮＨＷＧＧＹＲＳＤＩＮＧＫＬＳＳＷＬＱＮＹＩＮＱＴＶＫＩＫＥＤＬＫＧＨＫＫＤＬＫＫＡＫＥＭＩＮＲＦＧＥＳＤＴＫＥＥＡＶＶＳＳＬＬＥＳＩＥＫＩＶＰＤＤＳＡＤＤＥＫＰＤＩＰＡＩＡＩＹＲＲＦＬＳＤＧＲＬＴＬＮＲＦＶＱＲＥＤＶＱＥＡＬＩＫＥＲＬＥＡＥＫＫＫＫＰＫＫＲＫＫＫＳＤＡＥＤＥＫＥＴＩＤＦＫＥＬＦＰＨＬＡＫＰＬＫＬＶＰＮＦＹＧＤＳＫＲＥＬＹＫＫＹＫＮＡＡＩＹＴＤＡＬＷＫＡＶＥＫＩＹＫＳＡＦＳＳＳＬＫＮＳＦＦＤＴＤＦＤＫＤＦＦＩＫＲＬＱＫＩＦＳＶＹＲＲＦＮＴＤＫＷＫＰＩＶＫＮＳＦＡＰＹＣＤＩＶＳＬＡＥＮＥＶＬＹＫＰＫＱＳＲＳＲＫＳＡＡＩＤＫＮＲＶＲＬＰＳＴＥＮＩＡＫＡＧＩＡＬＡＲＥＬＳＶＡＧＦＤＷＫＤＬＬＫＫＥＥＨＥＥＹＩＤＬＩＥＬＨＫＴＡＬＡＬＬＬＡＶＴＥＴＱＬＤＩＳＡＬＤＦＶＥＮＧＴＶＫＤＦＭＫＴＲＤＧＮＬＶＬＥＧＲＦＬＥＭＦＳＱＳＩＶＦＳＥＬＲＧＬＡＧＬＭＳＲＫＥＦＩＴＲＳＡＩＱＴＭＮＧＫＱＡＥＬＬＹＩＰＨＥＦＱＳＡＫＩＴＴＰＫＥＭＳＲＡＦＬＤＬＡＰＡＥＦＡＴＳＬＥＰＥＳＬＳＥＫＳＬＬＫＬＫＱＭＲＹＹＰＨＹＦＧＹＥＬＴＲＴＧＱＧＩＤＧＧＶＡＥＮＡＬＲＬＥＫＳＰＶＫＫＲＥＩＫＣＫＱＹＫＴＬＧＲＧＱＮＫＩＶＬＹＶＲＳＳＹＹＱＴＱＦＬＥＷＦＬＨＲＰＫＮＶＱＴＤＶＡＶＳＧＳＦＬＩＤＥＫＫＶＫＴＲＷＮＹＤＡＬＴＶＡＬＥＰＶＳＧＳＥＲＶＦＶＳＱＰＦＴＩＦＰＥＫＳＡＥＥＥＧＱＲＹＬＧＩＤＩＧＥＹＧＩＡＹＴＡＬＥＩＴＧＤＳＡＫＩＬＤＱＮＦＩＳＤＰＱＬＫＴＬＲＥＥＶＫＧＬＫＬＤＱＲＲＧＴＦＡＭＰＳＴＫＩＡＲＩＲＥＳＬＶＨＳＬＲＮＲＩＨＨＬＡＬＫＨＫＡＫＩＶＹＥＬＥＶＳＲＦＥＥＧＫＱＫＩＫＫＶＹＡＴＬＫＫＡＤＶＹＳＥＩＤＡＤＫＮＬＱＴＴＶＷＧＫＬＡＶＡＳＥＩＳＡＳＹＴＳＱＦＣＧＡＣＫＫＬＷＲＡＥＭＱＶＤＥＴＩＴＴＱＥＬＩＧＴＶＲＶＩＫＧＧＴＬＩＤＡＩＫＤＦＭＲＰＰＩＦＤＥＮＤＴＰＦＰＫＹＲＤＦＣＤＫＨＨＩＳＫＫＭＲＧＮＳＣＬＦＩＣＰＦＣＲＡＮＡＤＡＤＩＱＡＳＱＴＩＡＬＬＲＹＶＫＥＥＫＫＶＥＤＹＦＥＲＦＲＫＬＫＮＩＫＶＬＧＱＭＫＫＩ．

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能的なエンドヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）を有する。Ｃａｓ９は、標的結合時にコンフォメーション変化を起こし、ヌクレアーゼドメインを標的ＤＮＡの反対側の鎖を切断するように位置付ける。Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断の最終結果は、標的ＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）である（ＰＡＭ配列の約３～４ヌクレオチド上流）。次いで、得られたＤＳＢは、以下の２つの一般的な修復経路のうちの１つによって修復される：（１）効率的だがエラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、または（２）効率は低いが忠実度が高い相同組換え修復（ＨＤＲ）経路。

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および／または相同組換え修復（ＨＤＲ）の「効率」は、任意の好都合な方法によって計算することができる。例えば、一部の実施形態では、効率は、成功したＨＤＲのパーセンテージで表すことができる。例えば、サーベイヤーヌクレアーゼアッセイを使用して切断生成物を生成することができ、生成物と基質との比を使用してパーセンテージを計算することができる。例えば、サーベイヤーヌクレアーゼ酵素を使用して、ＨＤＲの成功で得られる新たに組み込まれた制限配列を含むＤＮＡを、直接切断することができる。より多くの基質の切断は、より高いパーセントのＨＤＲを示す（より高い効率のＨＤＲ）。例示的な例として、ＨＤＲの割合（パーセンテージ）は、以下の式［（切断生成物）／（基質＋切断生成物）］を使用して計算することができる（例えば、（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）。式中、「ａ」はＤＮＡ基質のバンド強度であり、「ｂ」および「ｃ」は切断生成物のバンド強度である）。

一部の実施形態では、効率は、成功したＮＨＥＪのパーセンテージで表し得る。例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイを使用して、切断生成物を生成することができ、生成物と基質との比を使用して、ＮＨＥＪの割合を計算することができる。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、野生型および変異型ＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションから生じる不一致のヘテロ二重鎖ＤＮＡを切断する（ＮＨＥＪは、元の切断部位で小さなランダムな挿入または欠失（インデル）を生成する）。より多くの切断は、より高いパーセントのＮＨＥＪ（より高い効率のＮＨＥＪ）を示す。例示的な例として、ＮＨＥＪの割合（パーセンテージ）を、以下の式を使用して計算することができる：（１－（１－（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））^１／２）×１００（式中、「ａ」は、ＤＮＡ基質のバンド強度であり、「ｂ」および「ｃ」は、切断生成物のバンド強度である）（Ｒａｎｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３Ｓｅｐ．１２；１５４（６）：１３８０－９；ａｎｄＲａｎｅｔａｌ．，ＮａｔＰｒｏｔｏｃ．２０１３Ｎｏｖ．；８（１１）：２２８１－２３０８）。

ＮＨＥＪ修復経路は、最も活性な修復機構であり、ＤＳＢ部位において小さなヌクレオチドの挿入または欠失（インデル）を頻繁に引き起こす。Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ、またはガイドポリヌクレオチドを発現する細胞集団は、多様な変異をもたらし得るため、ＮＨＥＪ媒介性ＤＳＢ修復のランダム性は、重要な実用的な意味を有する。ほとんどの実施形態では、ＮＨＥＪは、標的ＤＮＡ内に小さなインデルを生じさせ、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の未熟終止コドンにつながるアミノ酸の欠失、挿入、またはフレームシフト変異をもたらす。理想的な最終結果は、標的遺伝子内の機能喪失変異である。

ＮＨＥＪ媒介性ＤＳＢ修復は、しばしば遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊するが、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、単一のヌクレオチド変化から大きな挿入（例えば、フルオロフォアまたはタグの添加）までの範囲の特定のヌクレオチド変化を生成することができる。

ＨＤＲを遺伝子編集に利用するために、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型を、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを用いて目的の細胞型に送達することができる。修復鋳型は、所望の編集、ならびに標的のすぐ上流および下流の追加の相同配列（左相同性アームおよび右相同性アームと称される）を含むことができる。各相同性アームの長さは、導入される変化のサイズに依存し得、より大きな挿入は、より長い相同性アームを必要とする。修復鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡプラスミドであってもよい。Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および外因性修復鋳型を発現する細胞でさえ、ＨＤＲの効率は概して低い（修飾アレルの１０％未満）。ＨＤＲは、細胞周期のＳ期およびＧ２期の間に行われるため、ＨＤＲの効率は、細胞を同期させることによって増強され得る。ＮＨＥＪに関与する遺伝子を化学的または遺伝的に阻害することで、ＨＤＲ頻度を増加させることもできる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、修飾Ｃａｓ９である。所与のｇＲＮＡ標的配列は、部分的な相同性が存在するゲノム全体にわたって追加の部位を有することができる。これらの部位はオフターゲットと呼ばれ、ｇＲＮＡを設計する際に考慮する必要がある。ｇＲＮＡ設計を最適化することに加えて、Ｃａｓ９への修飾を通して、ＣＲＩＳＰＲの特異性を増加させることもできる。Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の複合活性を介して二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であるＣａｓ９ニッカーゼは、１つのヌクレアーゼドメインを保持し、ＤＳＢではなくＤＮＡニックを生成する。ニッカーゼシステムは、特定の遺伝子編集のためのＨＤＲ媒介性遺伝子編集と組み合わせることもできる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、バリアントＣａｓ９タンパク質である。バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）。場合によっては、バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を有する。例えば、場合によっては、バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満のヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、実質的なヌクレアーゼ活性を有しない。対象のＣａｓ９タンパク質が、実質的なヌクレアーゼ活性を有しないバリアントＣａｓ９タンパク質である場合、「ｄＣａｓ９」と称され得る。

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、減少したヌクレアーゼ活性を有する。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質）の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満のエンドヌクレアーゼ活性を示す。

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインの機能を低下させる変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ（アミノ酸位置１０のアスパラギン酸がアラニン）を有し、したがって、二本鎖ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している（したがって、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖標的核酸を切断する際、二本鎖切断（ＤＳＢ）の代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす）（例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１を参照されたい）。

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインの機能を低下させる変異（アミノ酸置換）を有し得る（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ）。非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０のヒスチジンがアラニン）を有し、したがって、ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低下している（したがって、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖ガイド標的配列を切断する際、ＤＳＢの代わりにＳＳＢをもたらす）。かかるＣａｓ９タンパク質は、ガイド標的配列（例えば、一本鎖ガイド標的配列）を切断する能力が低下しているが、ガイド標的配列（例えば、一本鎖ガイド標的配列）に結合する能力を保持する。

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異の両方を有し、そのため、ポリペプチドが二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｗ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９は、Ｃａｓ９ＨＮＨドメイン（Ａ８４０Ｈ）の位置８４０で触媒Ｈｉｓ残基を回復した。

別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質がＷ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ変異を有する場合、またはバリアントＣａｓ９タンパク質がＰ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を有する場合、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列に効率的に結合しない。したがって、一部のかかる実施形態では、このようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法に使用される場合、本方法は、ＰＡＭ配列を必要としない。言い換えると、一部の実施形態では、このようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法に使用される場合、本方法は、ガイドＲＮＡを含み得るが、本方法は、ＰＡＭ配列の不在下で実施することができる（したがって、結合の特異性が、ガイドＲＮＡの標的化セグメントによって提供される）。他の残基を変異させて、上記の効果を達成することができる（すなわち、一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７を改変（すなわち、置換）することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。

一部の実施形態では、触媒活性が低下したバリアントＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７変異（例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａ）を有する場合）、バリアントＣａｓ９タンパク質は、それがガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持する限り、依然として部位特異的な様式で標的ＤＮＡに結合することができる（依然としてガイドＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列に誘導されるため）。

一部の実施形態では、バリアントＣａｓタンパク質は、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ、またはｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬであり得る。

一部の実施形態では、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲ）を含み、かつ改変されたＰＡＭ５’－ＮＧＣ－３’に対して特異性を有する修飾ＳｐＣａｓ９が使用された。

Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９の代替物としては、哺乳動物細胞において切断活性を示すＣｐｆ１ファミリー由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを挙げることができる。ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似したＤＮＡ編集技術である。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。この後天性免疫機構は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ菌およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ菌で見られる。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と関連付けられ、ガイドＲＮＡを使用してウイルスＤＮＡを発見および切断するエンドヌクレアーゼをコードしている。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さく単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのいくつかの制約を克服している。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断は、短い３’オーバーハングを有する二本鎖切断をもたらす。Ｃｐｆ１の互い違い（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）の切断パターンは、従来の制限酵素によるクローニングに類似した定方向遺伝子導入の可能性を開き、遺伝子編集の効率を高めることができる。上に記載のＣａｓ９バリアントおよびオーソログと同様に、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲによって標的化され得る部位の数を、ＳｐＣａｓ９に適したＮＧＧＰＡＭ部位を欠くＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムまで拡張することができる。Ｃｐｆ１遺伝子座は、混合されたα／βドメイン、ＲｕｖＣ－Ｉ、続いてヘリカル領域、ＲｕｖＣ－ＩＩ、およびジンクフィンガー様ドメインを含む。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。

さらに、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なり、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のαヘリカル認識ローブを有しない。Ｃｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓドメインアーキテクチャは、Ｃｐｆ１が機能的に固有であり、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムとして分類されることを示す。Ｃｐｆ１遺伝子座は、ＩＩ型システムよりもＩ型およびＩＩＩ型システムに類似したＣａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣａｓ４タンパク質をコードする。機能的なＣｐｆ１は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とせず、したがって、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）のみが必要である。これは、Ｃｐｆ１がＣａｓ９よりも小さいだけでなく、より小さなｓｇＲＮＡ分子（Ｃａｓ９の約半分のヌクレオチド数）を有するため、ゲノム編集に有益である。Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９によって標的化されるＧリッチＰＡＭとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（５’－ＹＴＮ－３’または５’－ＴＴＮ－３’）を識別することによって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する。ＰＡＭの識別後、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを有する粘着末端様のＤＮＡ二本鎖切断を導入する。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、改変ＰＡＭ配列に対する特異性を有するＣａｓ９バリアントである。一部の実施形態では、追加のＣａｓ９バリアントおよびＰＡＭ配列は、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＳｐＣａｓ９ｖａｒｉａｎｔｓｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｗｉｔｈｎｏｎ－ＧＰＡＭｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）に記載されている（その全体が、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、特定のＰＡＭ要件を有しない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９バリアント）は、ＮＲＮＨＰＡＭに対する特異性を有する（ここで、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＴである）。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＰＡＭ配列ＡＡＡ、ＴＡＡ、ＣＡＡ、ＧＡＡ、ＴＡＴ、ＧＡＴ、またはＣＡＣに対する特異性を有する。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、位置１１１４、１１３４、１１３５、１１３７、１１３９、１１５１、１１８０、１１８８、１２１１、１２１８、１２１９、１２２１、１２４９、１２５６、１２６４、１２９０、１３１８、１３１７、１３２０、１３２１、１３２３、１３３２、１３３３、１３３５、１３３７、もしくは１３３９、またはそれらの対応する位置に、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、位置１１１４、１１３５、１２１８、１２１９、１２２１、１２４９、１３２０、１３２１、１３２３、１３３２、１３３３、１３３５、もしくは１３３７、またはそれらの対応する位置に、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、位置１１１４、１１３４、１１３５、１１３７、１１３９、１１５１、１１８０、１１８８、１２１１、１２１９、１２２１、１２５６、１２６４、１２９０、１３１８、１３１７、１３２０、１３２３、１３３３、またはそれらの対応する位置に、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、位置１１１４、１１３１、１１３５、１１５０、１１５６、１１８０、１１９１、１２１８、１２１９、１２２１、１２２７、１２４９、１２５３、１２８６、１２９３、１３２０、１３２１、１３３２、１３３５、１３３９、またはそれらの対応する位置に、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、位置１１１４、１１２７、１１３５、１１８０、１２０７、１２１９、１２３４、１２８６、１３０１、１３３２、１３３５、１３３７、１３３８、１３４９、またはそれらの対応する位置に、アミノ酸置換を含む。表３Ａ～３Ｄに、ＳｐＣａｓ９バリアントの例示的なアミノ酸置換およびＰＡＭ特異性を示す。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９（ＮｍｅＣａｓ９）またはそのバリアントである。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＧＡＹＷＰＡＭに対する特異性を有する（ここで、Ｙは、ＣまたはＴであり、Ｗは、ＡまたはＴである）。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＧＹＴＴＰＡＭに対する特異性を有する（ここで、Ｙは、ＣまたはＴである）。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＧＴＣＴＰＡＭに対する特異性を有する。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９はＮｍｅ１Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＧＡＴＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＡＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＣＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＧＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＧＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＧＧＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＣＡＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＣＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＣＣＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＡＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＡＧＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＡＴＰＡＭ、またはＮＮＮＧＡＴＴＰＡＭに対する特異性を有する。一部の実施形態では、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、ＮＮＮＮＧＡＴＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＡＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＣＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＴＴＰＡＭ、またはＮＮＮＮＣＣＴＧＰＡＭに対する特異性を有する。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＣＡＡＰＡＭ、ＣＡＡＡＰＡＭ、またはＣＣＡＰＡＭに対する特異性を有する。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＣＣ（Ｎ４ＣＣ）ＰＡＭに対する特異性を有する（ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれか１つである）。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＣＣＧＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＧＧＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＣＡＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＣＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＣＣＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＡＴＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＡＧＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＡＴＰＡＭ、またはＮＮＮＧＡＴＴＰＡＭに対する特異性を有する。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、Ｎｍｅ３Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＮｍｅＣａｓ９は、ＮＮＮＮＣＡＡＡＰＡＭ、ＮＮＮＮＣＣＰＡＭ、またはＮＮＮＮＣＮＮＮＰＡＭに対する特異性を有する。Ｅｄｒａｋｉｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２０１９）７３（４）：７１４－７２６に記載されている追加のＮｍｅＣａｓ９の特徴およびＰＡＭ配列は、その全体が参照により本明細書に援用される。

例示的なＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９タンパク質であるＮｍｅ１Ｃａｓ９（ＮＣＢＩ参照：ＷＰ＿００２２３５１６２．１；ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼＣａｓ９）は、以下のアミノ酸配列を有する：
1 MAAFKPNPIN YILGLDIGIA SVGWAMVEID EDENPICLID LGVRVFERAE VPKTGDSLAM
61 ARRLARSVRR LTRRRAHRLL RARRLLKREG VLQAADFDEN GLIKSLPNTP WQLRAAALDR
121 KLTPLEWSAV LLHLIKHRGY LSQRKNEGET ADKELGALLK GVADNAHALQ TGDFRTPAEL
181 ALNKFEKESG HIRNQRGDYS HTFSRKDLQA ELILLFEKQK EFGNPHVSGG LKEGIETLLM
241 TQRPALSGDA VQKMLGHCTF EPAEPKAAKN TYTAERFIWL TKLNNLRILE QGSERPLTDT
301 ERATLMDEPY RKSKLTYAQA RKLLGLEDTA FFKGLRYGKD NAEASTLMEM KAYHAISRAL
361 EKEGLKDKKS PLNLSPELQD EIGTAFSLFK TDEDITGRLK DRIQPEILEA LLKHISFDKF
421 VQISLKALRR IVPLMEQGKR YDEACAEIYG DHYGKKNTEE KIYLPPIPAD EIRNPVVLRA
481 LSQARKVING VVRRYGSPAR IHIETAREVG KSFKDRKEIE KRQEENRKDR EKAAAKFREY
541 FPNFVGEPKS KDILKLRLYE QQHGKCLYSG KEINLGRLNE KGYVEIDHAL PFSRTWDDSF
601 NNKVLVLGSE NQNKGNQTPY EYFNGKDNSR EWQEFKARVE TSRFPRSKKQ RILLQKFDED
661 GFKERNLNDT RYVNRFLCQF VADRMRLTGK GKKRVFASNG QITNLLRGFW GLRKVRAEND
721 RHHALDAVVV ACSTVAMQQK ITRFVRYKEM NAFDGKTIDK ETGEVLHQKT HFPQPWEFFA
781 QEVMIRVFGK PDGKPEFEEA DTPEKLRTLL AEKLSSRPEA VHEYVTPLFV SRAPNRKMSG
841 QGHMETVKSA KRLDEGVSVL RVPLTQLKLK DLEKMVNRER EPKLYEALKA RLEAHKDDPA
901 KAFAEPFYKY DKAGNRTQQV KAVRVEQVQK TGVWVRNHNG IADNATMVRV DVFEKGDKYY
961 LVPIYSWQVA KGILPDRAVV QGKDEEDWQL IDDSFNFKFS LHPNDLVEVI TKKARMFGYF
1021 ASCHRGTGNI NIRIHDLDHK IGKNGILEGI GVKTALSFQK YQIDELGKEI RPCRLKKRPP
1081 VR

例示的なＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９タンパク質であるＮｍｅ２Ｃａｓ９（ＮＣＢＩ参照：ＷＰ＿００２２３０８３５；ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼＣａｓ９）は、以下のアミノ酸配列を有する：
1 MAAFKPNPIN YILGLDIGIA SVGWAMVEID EEENPIRLID LGVRVFERAE VPKTGDSLAM
61 ARRLARSVRR LTRRRAHRLL RARRLLKREG VLQAADFDEN GLIKSLPNTP WQLRAAALDR
121 KLTPLEWSAV LLHLIKHRGY LSQRKNEGET ADKELGALLK GVANNAHALQ TGDFRTPAEL
181 ALNKFEKESG HIRNQRGDYS HTFSRKDLQA ELILLFEKQK EFGNPHVSGG LKEGIETLLM
241 TQRPALSGDA VQKMLGHCTF EPAEPKAAKN TYTAERFIWL TKLNNLRILE QGSERPLTDT
301 ERATLMDEPY RKSKLTYAQA RKLLGLEDTA FFKGLRYGKD NAEASTLMEM KAYHAISRAL
361 EKEGLKDKKS PLNLSSELQD EIGTAFSLFK TDEDITGRLK DRVQPEILEA LLKHISFDKF
421 VQISLKALRR IVPLMEQGKR YDEACAEIYG DHYGKKNTEE KIYLPPIPAD EIRNPVVLRA
481 LSQARKVING VVRRYGSPAR IHIETAREVG KSFKDRKEIE KRQEENRKDR EKAAAKFREY
541 FPNFVGEPKS KDILKLRLYE QQHGKCLYSG KEINLVRLNE KGYVEIDHAL PFSRTWDDSF
601 NNKVLVLGSE NQNKGNQTPY EYFNGKDNSR EWQEFKARVE TSRFPRSKKQ RILLQKFDED
661 GFKECNLNDT RYVNRFLCQF VADHILLTGK GKRRVFASNG QITNLLRGFW GLRKVRAEND
721 RHHALDAVVV ACSTVAMQQK ITRFVRYKEM NAFDGKTIDK ETGKVLHQKT HFPQPWEFFA
781 QEVMIRVFGK PDGKPEFEEA DTPEKLRTLL AEKLSSRPEA VHEYVTPLFV SRAPNRKMSG
841 AHKDTLRSAK RFVKHNEKIS VKRVWLTEIK LADLENMVNY KNGREIELYE ALKARLEAYG
901 GNAKQAFDPK DNPFYKKGGQ LVKAVRVEKT QESGVLLNKK NAYTIADNGD MVRVDVFCKV
961 DKKGKNQYFI VPIYAWQVAE NILPDIDCKG YRIDDSYTFC FSLHKYDLIA FQKDEKSKVE
1021 FAYYINCDSS NGRFYLAWHD KGSKEQQFRI STQNLVLIQK YQVNELGKEI RPCRLKKRPP
1081 VR

核酸塩基エディターのＣａｓ１２ドメイン
典型的には、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス１およびクラス２システムに分けられる。クラス１システムは、マルチサブユニットエフェクター複合体を有し、クラス２システムは、単一のタンパク質エフェクターを有する。例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は、異なるタイプであるが、クラス２エフェクターである（それぞれ、ＩＩ型およびＶ型）。Ｃｐｆ１、クラス２に加えて、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはまた、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦを含む）。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，“ＤｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＤｉｖｅｒｓｅＣｌａｓｓ２ＣＲＩＳＰＲＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５Ｎｏｖ．５；６０（３）：３８５－３９７；Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．，“ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ：ＷｈｅｒｅｆｒｏｍＨｅｒｅ？”ＣＲＩＳＰＲＪｏｕｒｎａｌ，２０１８，１（５）：３２５－３３６；ａｎｄＹａｎｅｔａｌ．，“ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙＤｉｖｅｒｓｅＴｙｐｅＶＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９Ｊａｎ．４；３６３：８８－９１を参照されたい（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ（または、ＲｕｖＣ様）エンドヌクレアーゼドメインを含む。成熟ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の産生は、概して、ｔｒａｃｒＲＮＡ非依存性であるが、例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１は、ｃｒＲＮＡの産生にｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断について、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。

本発明で企図される核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質は、クラス２、Ｖ型（Ｃａｓ１２タンパク質）に分類されるＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓクラス２、Ｖ型タンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦそのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが挙げられる。本明細書で使用される場合、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ドメイン、またはＣａｓ１２タンパク質ドメインとも称され得る。一部の実施形態では、本発明のＣａｓ１２タンパク質は、デアミナーゼドメインなどの内部融合タンパク質ドメインによって中断されたアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ１２ドメインまたはＣａｓ１２ニッカーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ドメインは、ヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Ｃａｓ１２ドメインは、二重鎖核酸（例えば、二重鎖ＤＮＡ分子）の一方の鎖をニックするＣａｓ１２ドメインであってもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、以下の２つのＣａｓ１２ドメインのうちの１つを含む：（１）Ｃａｓ１２のｇＲＮＡ結合ドメイン、または（２）Ｃａｓ１２のＤＮＡ切断ドメイン。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２またはその断片を含むタンパク質は、「Ｃａｓ１２バリアント」と称される。Ｃａｓ１２バリアントは、Ｃａｓ１２またはその断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ１２バリアントは、野生型Ｃａｓ１２と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２バリアントは、野生型Ｃａｓ１２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２バリアントは、Ｃａｓ１２の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、そのため、その断片は、野生型Ｃａｓ１２の対応する断片と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、断片は、対応する野生型Ｃａｓ１２のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。一部の実施形態では、断片は、少なくとも１００アミノ酸長である。一部の実施形態では、断片は、長さが少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または少なくとも１３００アミノ酸長である。

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２は、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ活性を改変する１つ以上の変異を有するＣａｓ１２アミノ酸配列に、部分的もしくは全体的に対応するか、またはそれを含む。そのような変異としては、例えば、Ｃａｓ１２のＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内のアミノ酸置換が挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２のバリアントまたはホモログは、野生型Ｃａｓ１２と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２のバリアントは、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸以上より短いまたはより長いアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ１２融合タンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質の全長アミノ酸配列（例えば、本明細書に提供されるＣａｓ１２配列のうちの１つ）を含む。しかしながら、他の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、全長Ｃａｓ１２配列を含まず、１つ以上のその断片のみを含む。好適なＣａｓ１２ドメインの例示的なアミノ酸配列が本明細書に提供され、Ｃａｓ１２ドメインおよび断片のさらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。

一般に、クラス２、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、単一の機能的なＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインを有する（例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａｔａｒｇｅｔｂｉｎｄｉｎｇｕｎｌｅａｓｈｅｓｉｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ３６０：４３６－４３９（２０１８）を参照されたい）。場合によっては、Ｃａｓ１２タンパク質は、バリアントＣａｓ１２ｂタンパク質である（Ｓｔｒｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１９，１０（１）：Ａｒｔ．Ｎｏ．：２１２を参照されたい）。一実施形態では、バリアントＣａｓ１２ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ１２タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、１、２、３、４、５個、またはそれ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）。場合によっては、バリアントＣａｓ１２ポリペプチドは、Ｃａｓ１２ポリペプチドの活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を有する。例えば、場合によっては、バリアントＣａｓ１２は、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドであり、対応する野生型Ｃａｓ１２ｂタンパク質の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満のニッカーゼ活性を有する。場合によっては、バリアントＣａｓ１２ｂタンパク質は、実質的なニッカーゼ活性を有しない。

場合によっては、バリアントＣａｓ１２ｂタンパク質は、ニッカーゼ活性を低下させる。例えば、バリアントＣａｓ１２ｂタンパク質は、野生型Ｃａｓ１２ｂタンパク質の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満のニッカーゼ活性を示す。

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、哺乳動物細胞において活性を示すＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ファミリー由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを含む。ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似したＤＮＡ編集技術である。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。この後天性免疫機構は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ菌およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ菌で見られる。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と関連付けられ、ガイドＲＮＡを使用してウイルスＤＮＡを発見および切断するエンドヌクレアーゼをコードしている。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さく単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのいくつかの制約を克服している。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断は、短い３’オーバーハングを有する二本鎖切断をもたらす。Ｃｐｆ１の互い違い（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）の切断パターンは、従来の制限酵素によるクローニングに類似した定方向遺伝子導入の可能性を開き、遺伝子編集の効率を高めることができる。上に記載のＣａｓ９バリアントおよびオーソログと同様に、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲによって標的化され得る部位の数を、ＳｐＣａｓ９に適したＮＧＧＰＡＭ部位を欠くＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムまで拡張することができる。Ｃｐｆ１遺伝子座は、混合されたα／βドメイン、ＲｕｖＣ－Ｉ、続いてヘリカル領域、ＲｕｖＣ－ＩＩ、およびジンクフィンガー様ドメインを含む。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なり、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のαヘリカル認識ローブを有しない。Ｃｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓドメインアーキテクチャは、Ｃｐｆ１が機能的に固有であり、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムとして分類されることを示す。Ｃｐｆ１遺伝子座は、ＩＩ型システムよりもＩ型およびＩＩＩ型システムに類似したＣａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣａｓ４タンパク質をコードする。機能的なＣｐｆ１は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とせず、したがって、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）のみが必要である。これは、Ｃｐｆ１がＣａｓ９よりも小さいだけでなく、より小さなｓｇＲＮＡ分子（Ｃａｓ９の約半分のヌクレオチド数）を有するため、ゲノム編集に有益である。Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９によって標的化されるＧリッチＰＡＭとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（５’－ＹＴＮ－３’または５’－ＴＴＴＮ－３’）を識別することによって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する。ＰＡＭの識別後、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを有する粘着末端様のＤＮＡ二本鎖切断を導入する。

本発明の一部の態様では、ベクターは、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓ１２は、野生型の例示的なＣａｓ１２ポリペプチド（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉ由来のＣａｓ１２）と、少なくとも、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ１２は、野生型の例示的なＣａｓ１２ポリペプチド（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉ（ＢｈＣａｓ１２ｂ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３（ＢｖＣａｓ１２ｂ）、およびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ（ＡａＣａｓ１２ｂ））と、最大、または最大約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ１２は、Ｃａｓ１２タンパク質の野生型または修飾形態を指すことができ、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含み得る。

一部の実施形態では、ＢｈＣａｓ１２ｂガイドポリヌクレオチドは、以下の配列を有する：
ＢｈＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ足場（下線）＋２０ｎｔ～２３ｎｔガイド配列（Ｎ_ｎで示される）
5’GUUCUGTCUUUUGGUCAGGACAACCGUCUAGCUAUAAGUGCUGCAGGGUGUGAGAAACUCCUAUUGCUGGACGAUGUCUCUUACGAGGCAUUAGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

一部の実施形態では、ＢｖＣａｓ１２ｂおよびＡａＣａｓ１２ｂのガイドポリヌクレオチドは、以下の配列を有する。
ＢｖＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ足場（下線）＋２０ｎｔ～２３ｎｔガイド配列（Ｎ_ｎで示される）
5’GACCUAUAGGGUCAAUGAAUCUGUGCGUGUGCCAUAAGUAAUUAAAAAUUACCCACCACAGGAGCACCUGAAAACAGGUGCUUGGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
ＡａＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ足場（下線）＋２０ｎｔ～２３ｎｔガイド配列（Ｎ_ｎで示される）
5’GUCUAAAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAACUUCUCAAAAAGAACGAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質
本開示の一部の態様は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質として機能するドメインを含む融合タンパク質を提供し、これは、タンパク質（例えば、塩基エディター）を特定の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列に誘導するために使用され得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインおよびデアミナーゼドメインを含む。核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、およびＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦが挙げられる。Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの修飾もしくは操作されたバージョンが挙げられる。他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質もまた、本開示の範囲内であるが、それらは本開示に具体的に列挙されていない場合がある。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．“ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ：ＷｈｅｒｅｆｒｏｍＨｅｒｅ？”ＣＲＩＳＰＲＪ．２０１８Ｏｃｔ；１：３２５－３３６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０１８．００３３、Ｙａｎｅｔａｌ．，“ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｄｉｖｅｒｓｅｔｙｐｅＶＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９Ｊａｎ４；３６３（６４２２）：８８－９１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１を参照されたい（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

Ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ特異性を有する核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の一例は、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１（Ｃｐｆ１）由来のクラスター化された規則的な間隔の短い回文反復である。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１もクラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なる特徴に対する強力なＤＮＡ干渉を媒介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、またはＹＴＮ）を利用する。さらに、Ｃｐｆ１は、互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。１６個のＣｐｆ１ファミリータンパク質のうち、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓおよびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来の２つの酵素は、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Ｃｐｆ１タンパク質は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｙａｍａｎｏｅｔａｌ．，“ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＣｐｆ１ｉｎｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｇｕｉｄｅＲＮＡａｎｄｔａｒｇｅｔＤＮＡ．”Ｃｅｌｌ（１６５）２０１６，ｐ．９４９－９６２に以前に記載されている（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

本組成物および本方法において、ガイドヌクレオチド配列プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインとして使用され得るヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）バリアントが有用である。Ｃｐｆ１タンパク質は、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有し、これは、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似しているが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端が、Ｃａｓ９のαヘリカル認識ローブを有しない。Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３，７５９－７７１，２０１５（参照により本明細書に援用される）では、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ドメインが、ＤＮＡ鎖の切断を担い、ＲｕｖＣ様ドメインの不活性化が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活性化することが示されている例えば、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活性化する。一部の実施形態では、本開示のｄＣｐｆ１は、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。本開示に従って、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインを不活性化する任意の変異（例えば、置換変異、欠失、または挿入）が使用され得ることを理解されたい。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質はＣｐｆ１ニッカーゼ（ｎＣｐｆ１）である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１、ｎＣｐｆ１、またはｄＣｐｆ１は、本明細書に開示されるＣｐｆ１配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｄＣｐｆ１は、本明細書に開示されるＣｐｆ１配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。本開示に従って、他の細菌種由来のＣｐｆ１も使用され得ることを理解されたい。

野生型ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５が、太字および下線で示されている）
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ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｄ９１７Ａ（Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５が、太字および下線で示されている）
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ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｅ１００６Ａ（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５が、太字および下線で示されている）
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ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｄ１２５５Ａ（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５が、太字および下線で示されている）
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ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５が、太字および下線で示されている）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFADLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN

ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ（Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５が、太字および下線で示されている）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDAAANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN

ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５が、太字および下線で示されている）
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFADLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDAAANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN

ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５が、太字および下線で示されている）
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一部の実施形態では、融合タンパク質に存在するＣａｓ９ドメインのうちの１つは、ＰＡＭ配列を必要としないガイドヌクレオチド配列プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインで置き換えられ得る。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来のＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９は、本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおけるＮ５７９Ａ変異、または対応する変異を含む。

一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非正準ＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＴＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｘ、Ｎ９６７Ｘ、およびＲ１０１４Ｘ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、またはＲ１０１４Ｈ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。

例示的なＳａＣａｓ９配列
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
上記の残基Ｎ５７９を、（例えば、Ａ５７９に）変異させて、ＳａＣａｓ９ニッカーゼを得ることができる（下線および太字で示されている）。

例示的なＳａＣａｓ９ｎ配列
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
上記の残基Ａ５７９を、Ｎ５７９から変異させて、ＳａＣａｓ９ニッカーゼを得ることができる（下線および太字で示されている）。

代表的なＳａＫＫＨＣａｓ９
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上記の残基Ａ５７９を、Ｎ５７９から変異させて、ＳａＣａｓ９ニッカーゼを得ることができる（下線および太字で示されている）。上記の残基Ｋ７８１、Ｋ９６７、およびＨ１０１４を、Ｅ７８１、Ｎ９６７、およびＲ１０１４から変異させて、ＳａＫＫＨＣａｓ９を得ることができる（下線および太字で示されている）。

一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、円順列変異体である。以下の配列において、平文（ｐｌａｉｎｔｅｘｔ）は、アデノシンデアミナーゼ配列を示し、太字の配列は、Ｃａｓ９に由来する配列を示し、斜体の配列は、リンカー配列を示し、下線の配列は、二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化配列を示し、二重下線の配列は、変異を示す。アスタリスク（＊）は、終止コドン（ＳＴＯＰｃｏｄｏｎ）を示す。

ＣＰ５（ＭＳＰを含む「ＮＧＣ＝変異を有するＰａｍバリアントのレギュラーＣａｓ９様ＮＧＧ」ＰＩＤ＝タンパク質相互作用ドメインおよび「Ｄ１０Ａ」ニッカーゼ）：

一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの単一エフェクターである。微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの単一のエフェクターとしては、限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３が挙げられる。典型的には、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス１およびクラス２システムに分けられる。クラス１システムは、マルチサブユニットエフェクター複合体を有し、クラス２システムは、単一のタンパク質エフェクターを有する。例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は、クラス２エフェクターである。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１に加えて、３つの異なるクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３）が、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，“ＤｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＤｉｖｅｒｓｅＣｌａｓｓ２ＣＲＩＳＰＲＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５Ｎｏｖ．５；６０（３）：３８５－３９７に記載されている（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。システムのうちの２つのエフェクター（Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３）は、Ｃｐｆ１に関連するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。第３のシステムは、２つの所定のＨＥＰＮＲＮａｓｅドメインを有するエフェクターを含む。成熟ＣＲＩＳＰＲＲＮＡの産生は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲＲＮＡの産生とは異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡ非依存性である。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断のためのＣＲＩＳＰＲＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。

ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒａｓｔｒｉｓＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造は、キメラ単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体で報告されている。例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．，“Ｃ２ｃ１－ｓｇＲＮＡＣｏｍｐｌｅｘＳｔｒｕｃｔｕｒｅＲｅｖｅａｌｓＲＮＡ－ＧｕｉｄｅｄＤＮＡＣｌｅａｖａｇｅＭｅｃｈａｎｉｓｍ”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１７Ｊａｎ．１９；６５（２）：３１０－３２２を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。三元複合体としての標的ＤＮＡに結合したＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓＣ２ｃ１にも結晶構造が報告されている。例えば、Ｙａｎｇｅｔａｌ．，“ＰＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＴａｒｇｅｔＤＮＡＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄＣｌｅａｖａｇｅｂｙＣ２Ｃ１ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ”，Ｃｅｌｌ，２０１６Ｄｅｃ．１５；１６７（７）：１８１４－１８２８を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。標的ＤＮＡ鎖および非標的ＤＮＡ鎖の両方を有するＡａｃＣ２ｃ１の触媒能のあるコンフォメーションが捉えられており、これらは、単一のＲｕｖＣ触媒ポケット内に独立して配置され、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１媒介性切断により標的ＤＮＡの互い違いの７ヌクレオチド切断をもたらす。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１の三元複合体と、以前に特定されたＣａｓ９およびＣｐｆ１対応物との構造比較は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによって使用されるメカニズムの多様性を実証する。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質であり得る。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に提供されるｎａｐＤＮＡｂｐ配列のうちのいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示に従って、他の細菌種由来のＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３も使用され得ることを理解されたい。

Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１（（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｔ０Ｄ７Ａ２＃２）ｓｐ｜Ｔ０Ｄ７Ａ２｜Ｃ２Ｃ１＿ＡＬＩＡＧＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣ２ｃ１ＯＳ＝Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏ－ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（株ＡＴＣＣ４９０２５／ＤＳＭ３９２２／ＣＩＰ１０６１３２／ＮＣＩＭＢ１３１３７／ＧＤ３Ｂ）ＧＮ＝ｃ２ｃ１ＰＥ＝１ＳＶ＝１）アミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＡＶＫＳＩＫＶＫＬＲＬＤＤＭＰＥＩＲＡＧＬＷＫＬＨＫＥＶＮＡＧＶＲＹＹＴＥＷＬＳＬＬＲＱＥＮＬＹＲＲＳＰＮＧＤＧＥＱＥＣＤＫＴＡＥＥＣＫＡＥＬＬＥＲＬＲＡＲＱＶＥＮＧＨＲＧＰＡＧＳＤＤＥＬＬＱＬＡＲＱＬＹＥＬＬＶＰＱＡＩＧＡＫＧＤＡＱＱＩＡＲＫＦＬＳＰＬＡＤＫＤＡＶＧＧＬＧＩＡＫＡＧＮＫＰＲＷＶＲＭＲＥＡＧＥＰＧＷＥＥＥＫＥＫＡＥＴＲＫＳＡＤＲＴＡＤＶＬＲＡＬＡＤＦＧＬＫＰＬＭＲＶＹＴＤＳＥＭＳＳＶＥＷＫＰＬＲＫＧＱＡＶＲＴＷＤＲＤＭＦＱＱＡＩＥＲＭＭＳＷＥＳＷＮＱＲＶＧＱＥＹＡＫＬＶＥＱＫＮＲＦＥＱＫＮＦＶＧＱＥＨＬＶＨＬＶＮＱＬＱＱＤＭＫＥＡＳＰＧＬＥＳＫＥＱＴＡＨＹＶＴＧＲＡＬＲＧＳＤＫＶＦＥＫＷＧＫＬＡＰＤＡＰＦＤＬＹＤＡＥＩＫＮＶＱＲＲＮＴＲＲＦＧＳＨＤＬＦＡＫＬＡＥＰＥＹＱＡＬＷＲＥＤＡＳＦＬＴＲＹＡＶＹＮＳＩＬＲＫＬＮＨＡＫＭＦＡＴＦＴＬＰＤＡＴＡＨＰＩＷＴＲＦＤＫＬＧＧＮＬＨＱＹＴＦＬＦＮＥＦＧＥＲＲＨＡＩＲＦＨＫＬＬＫＶＥＮＧＶＡＲＥＶＤＤＶＴＶＰＩＳＭＳＥＱＬＤＮＬＬＰＲＤＰＮＥＰＩＡＬＹＦＲＤＹＧＡＥＱＨＦＴＧＥＦＧＧＡＫＩＱＣＲＲＤＱＬＡＨＭＨＲＲＲＧＡＲＤＶＹＬＮＶＳＶＲＶＱＳＱＳＥＡＲＧＥＲＲＰＰＹＡＡＶＦＲＬＶＧＤＮＨＲＡＦＶＨＦＤＫＬＳＤＹＬＡＥＨＰＤＤＧＫＬＧＳＥＧＬＬＳＧＬＲＶＭＳＶＤＬＧＬＲＴＳＡＳＩＳＶＦＲＶＡＲＫＤＥＬＫＰＮＳＫＧＲＶＰＦＦＦＰＩＫＧＮＤＮＬＶＡＶＨＥＲＳＱＬＬＫＬＰＧＥＴＥＳＫＤＬＲＡＩＲＥＥＲＱＲＴＬＲＱＬＲＴＱＬＡＹＬＲＬＬＶＲＣＧＳＥＤＶＧＲＲＥＲＳＷＡＫＬＩＥＱＰＶＤＡＡＮＨＭＴＰＤＷＲＥＡＦＥＮＥＬＱＫＬＫＳＬＨＧＩＣＳＤＫＥＷＭＤＡＶＹＥＳＶＲＲＶＷＲＨＭＧＫＱＶＲＤＷＲＫＤＶＲＳＧＥＲＰＫＩＲＧＹＡＫＤＶＶＧＧＮＳＩＥＱＩＥＹＬＥＲＱＹＫＦＬＫＳＷＳＦＦＧＫＶＳＧＱＶＩＲＡＥＫＧＳＲＦＡＩＴＬＲＥＨＩＤＨＡＫＥＤＲＬＫＫＬＡＤＲＩＩＭＥＡＬＧＹＶＹＡＬＤＥＲＧＫＧＫＷＶＡＫＹＰＰＣＱＬＩＬＬＥＥＬＳＥＹＱＦＮＮＤＲＰＰＳＥＮＮＱＬＭＱＷＳＨＲＧＶＦＱＥＬＩＮＱＡＱＶＨＤＬＬＶＧＴＭＹＡＡＦＳＳＲＦＤＡＲＴＧＡＰＧＩＲＣＲＲＶＰＡＲＣＴＱＥＨＮＰＥＰＦＰＷＷＬＮＫＦＶＶＥＨＴＬＤＡＣＰＬＲＡＤＤＬＩＰＴＧＥＧＥＩＦＶＳＰＦＳＡＥＥＧＤＦＨＱＩＨＡＤＬＮＡＡＱＮＬＱＱＲＬＷＳＤＦＤＩＳＱＩＲＬＲＣＤＷＧＥＶＤＧＥＬＶＬＩＰＲＬＴＧＫＲＴＡＤＳＹＳＮＫＶＦＹＴＮＴＧＶＴＹＹＥＲＥＲＧＫＫＲＲＫＶＦＡＱＥＫＬＳＥＥＥＡＥＬＬＶＥＡＤＥＡＲＥＫＳＶＶＬＭＲＤＰＳＧＩＩＮＲＧＮＷＴＲＱＫＥＦＷＳＭＶＮＱＲＩＥＧＹＬＶＫＱＩＲＳＲＶＰＬＱＤＳＡＣＥＮＴＧＤＩ

ＡａｃＣａｓ１２ｂ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）－ＷＰ＿０６７６２３８３４
ＭＡＶＫＳＭＫＶＫＬＲＬＤＮＭＰＥＩＲＡＧＬＷＫＬＨＴＥＶＮＡＧＶＲＹＹＴＥＷＬＳＬＬＲＱＥＮＬＹＲＲＳＰＮＧＤＧＥＱＥＣＹＫＴＡＥＥＣＫＡＥＬＬＥＲＬＲＡＲＱＶＥＮＧＨＣＧＰＡＧＳＤＤＥＬＬＱＬＡＲＱＬＹＥＬＬＶＰＱＡＩＧＡＫＧＤＡＱＱＩＡＲＫＦＬＳＰＬＡＤＫＤＡＶＧＧＬＧＩＡＫＡＧＮＫＰＲＷＶＲＭＲＥＡＧＥＰＧＷＥＥＥＫＡＫＡＥＡＲＫＳＴＤＲＴＡＤＶＬＲＡＬＡＤＦＧＬＫＰＬＭＲＶＹＴＤＳＤＭＳＳＶＱＷＫＰＬＲＫＧＱＡＶＲＴＷＤＲＤＭＦＱＱＡＩＥＲＭＭＳＷＥＳＷＮＱＲＶＧＥＡＹＡＫＬＶＥＱＫＳＲＦＥＱＫＮＦＶＧＱＥＨＬＶＱＬＶＮＱＬＱＱＤＭＫＥＡＳＨＧＬＥＳＫＥＱＴＡＨＹＬＴＧＲＡＬＲＧＳＤＫＶＦＥＫＷＥＫＬＤＰＤＡＰＦＤＬＹＤＴＥＩＫＮＶＱＲＲＮＴＲＲＦＧＳＨＤＬＦＡＫＬＡＥＰＫＹＱＡＬＷＲＥＤＡＳＦＬＴＲＹＡＶＹＮＳＩＶＲＫＬＮＨＡＫＭＦＡＴＦＴＬＰＤＡＴＡＨＰＩＷＴＲＦＤＫＬＧＧＮＬＨＱＹＴＦＬＦＮＥＦＧＥＧＲＨＡＩＲＦＱＫＬＬＴＶＥＤＧＶＡＫＥＶＤＤＶＴＶＰＩＳＭＳＡＱＬＤＤＬＬＰＲＤＰＨＥＬＶＡＬＹＦＱＤＹＧＡＥＱＨＬＡＧＥＦＧＧＡＫＩＱＹＲＲＤＱＬＮＨＬＨＡＲＲＧＡＲＤＶＹＬＮＬＳＶＲＶＱＳＱＳＥＡＲＧＥＲＲＰＰＹＡＡＶＦＲＬＶＧＤＮＨＲＡＦＶＨＦＤＫＬＳＤＹＬＡＥＨＰＤＤＧＫＬＧＳＥＧＬＬＳＧＬＲＶＭＳＶＤＬＧＬＲＴＳＡＳＩＳＶＦＲＶＡＲＫＤＥＬＫＰＮＳＥＧＲＶＰＦＣＦＰＩＥＧＮＥＮＬＶＡＶＨＥＲＳＱＬＬＫＬＰＧＥＴＥＳＫＤＬＲＡＩＲＥＥＲＱＲＴＬＲＱＬＲＴＱＬＡＹＬＲＬＬＶＲＣＧＳＥＤＶＧＲＲＥＲＳＷＡＫＬＩＥＱＰＭＤＡＮＱＭＴＰＤＷＲＥＡＦＥＤＥＬＱＫＬＫＳＬＹＧＩＣＧＤＲＥＷＴＥＡＶＹＥＳＶＲＲＶＷＲＨＭＧＫＱＶＲＤＷＲＫＤＶＲＳＧＥＲＰＫＩＲＧＹＱＫＤＶＶＧＧＮＳＩＥＱＩＥＹＬＥＲＱＹＫＦＬＫＳＷＳＦＦＧＫＶＳＧＱＶＩＲＡＥＫＧＳＲＦＡＩＴＬＲＥＨＩＤＨＡＫＥＤＲＬＫＫＬＡＤＲＩＩＭＥＡＬＧＹＶＹＡＬＤＤＥＲＧＫＧＫＷＶＡＫＹＰＰＣＱＬＩＬＬＥＥＬＳＥＹＱＦＮＮＤＲＰＰＳＥＮＮＱＬＭＱＷＳＨＲＧＶＦＱＥＬＬＮＱＡＱＶＨＤＬＬＶＧＴＭＹＡＡＦＳＳＲＦＤＡＲＴＧＡＰＧＩＲＣＲＲＶＰＡＲＣＡＲＥＱＮＰＥＰＦＰＷＷＬＮＫＦＶＡＥＨＫＬＤＧＣＰＬＲＡＤＤＬＩＰＴＧＥＧＥＦＦＶＳＰＦＳＡＥＥＧＤＦＨＱＩＨＡＤＬＮＡＡＱＮＬＱＲＲＬＷＳＤＦＤＩＳＱＩＲＬＲＣＤＷＧＥＶＤＧＥＰＶＬＩＰＲＴＴＧＫＲＴＡＤＳＹＧＮＫＶＦＹＴＫＴＧＶＴＹＹＥＲＥＲＧＫＫＲＲＫＶＦＡＱＥＥＬＳＥＥＥＡＥＬＬＶＥＡＤＥＡＲＥＫＳＶＶＬＭＲＤＰＳＧＩＩＮＲＧＤＷＴＲＱＫＥＦＷＳＭＶＮＱＲＩＥＧＹＬＶＫＱＩＲＳＲＶＲＬＱＥＳＡＣＥＮＴＧＤＩ

ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉ）ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０９５１４２５１５
ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＡＴＲＳＦＩＬＫＩＥＰＮＥＥＶＫＫＧＬＷＫＴＨＥＶＬＮＨＧＩＡＹＹＭＮＩＬＫＬＩＲＱＥＡＩＹＥＨＨＥＱＤＰＫＮＰＫＫＶＳＫＡＥＩＱＡＥＬＷＤＦＶＬＫＭＱＫＣＮＳＦＴＨＥＶＤＫＤＥＶＦＮＩＬＲＥＬＹＥＥＬＶＰＳＳＶＥＫＫＧＥＡＮＱＬＳＮＫＦＬＹＰＬＶＤＰＮＳＱＳＧＫＧＴＡＳＳＧＲＫＰＲＷＹＮＬＫＩＡＧＤＰＳＷＥＥＥＫＫＫＷＥＥＤＫＫＫＤＰＬＡＫＩＬＧＫＬＡＥＹＧＬＩＰＬＦＩＰＹＴＤＳＮＥＰＩＶＫＥＩＫＷＭＥＫＳＲＮＱＳＶＲＲＬＤＫＤＭＦＩＱＡＬＥＲＦＬＳＷＥＳＷＮＬＫＶＫＥＥＹＥＫＶＥＫＥＹＫＴＬＥＥＲＩＫＥＤＩＱＡＬＫＡＬＥＱＹＥＫＥＲＱＥＱＬＬＲＤＴＬＮＴＮＥＹＲＬＳＫＲＧＬＲＧＷＲＥＩＩＱＫＷＬＫＭＤＥＮＥＰＳＥＫＹＬＥＶＦＫＤＹＱＲＫＨＰＲＥＡＧＤＹＳＶＹＥＦＬＳＫＫＥＮＨＦＩＷＲＮＨＰＥＹＰＹＬＹＡＴＦＣＥＩＤＫＫＫＫＤＡＫＱＱＡＴＦＴＬＡＤＰＩＮＨＰＬＷＶＲＦＥＥＲＳＧＳＮＬＮＫＹＲＩＬＴＥＱＬＨＴＥＫＬＫＫＫＬＴＶＱＬＤＲＬＩＹＰＴＥＳＧＧＷＥＥＫＧＫＶＤＩＶＬＬＰＳＲＱＦＹＮＱＩＦＬＤＩＥＥＫＧＫＨＡＦＴＹＫＤＥＳＩＫＦＰＬＫＧＴＬＧＧＡＲＶＱＦＤＲＤＨＬＲＲＹＰＨＫＶＥＳＧＮＶＧＲＩＹＦＮＭＴＶＮＩＥＰＴＥＳＰＶＳＫＳＬＫＩＨＲＤＤＦＰＫＶＶＮＦＫＰＫＥＬＴＥＷＩＫＤＳＫＧＫＫＬＫＳＧＩＥＳＬＥＩＧＬＲＶＭＳＩＤＬＧＱＲＱＡＡＡＡＳＩＦＥＶＶＤＱＫＰＤＩＥＧＫＬＦＦＰＩＫＧＴＥＬＹＡＶＨＲＡＳＦＮＩＫＬＰＧＥＴＬＶＫＳＲＥＶＬＲＫＡＲＥＤＮＬＫＬＭＮＱＫＬＮＦＬＲＮＶＬＨＦＱＱＦＥＤＩＴＥＲＥＫＲＶＴＫＷＩＳＲＱＥＮＳＤＶＰＬＶＹＱＤＥＬＩＱＩＲＥＬＭＹＫＰＹＫＤＷＶＡＦＬＫＱＬＨＫＲＬＥＶＥＩＧＫＥＶＫＨＷＲＫＳＬＳＤＧＲＫＧＬＹＧＩＳＬＫＮＩＤＥＩＤＲＴＲＫＦＬＬＲＷＳＬＲＰＴＥＰＧＥＶＲＲＬＥＰＧＱＲＦＡＩＤＱＬＮＨＬＮＡＬＫＥＤＲＬＫＫＭＡＮＴＩＩＭＨＡＬＧＹＣＹＤＶＲＫＫＫＷＱＡＫＮＰＡＣＱＩＩＬＦＥＤＬＳＮＹＮＰＹＥＥＲＳＲＦＥＮＳＫＬＭＫＷＳＲＲＥＩＰＲＱＶＡＬＱＧＥＩＹＧＬＱＶＧＥＶＧＡＱＦＳＳＲＦＨＡＫＴＧＳＰＧＩＲＣＳＶＶＴＫＥＫＬＱＤＮＲＦＦＫＮＬＱＲＥＧＲＬＴＬＤＫＩＡＶＬＫＥＧＤＬＹＰＤＫＧＧＥＫＦＩＳＬＳＫＤＲＫＣＶＴＴＨＡＤＩＮＡＡＱＮＬＱＫＲＦＷＴＲＴＨＧＦＹＫＶＹＣＫＡＹＱＶＤＧＱＴＶＹＩＰＥＳＫＤＱＫＱＫＩＩＥＥＦＧＥＧＹＦＩＬＫＤＧＶＹＥＷＶＮＡＧＫＬＫＩＫＫＧＳＳＫＱＳＳＳＥＬＶＤＳＤＩＬＫＤＳＦＤＬＡＳＥＬＫＧＥＫＬＭＬＹＲＤＰＳＧＮＶＦＰＳＤＫＷＭＡＡＧＶＦＦＧＫＬＥＲＩＬＩＳＫＬＴＮＱＹＳＩＳＴＩＥＤＤＳＳＫＱＳＭＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂは、ＢｖＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）であり、これは、ＢｈＣａｓ１２ｂのバリアントであり、ＢｈＣａｓ１２ｂに対して以下の変化を含む：Ｓ８９３Ｒ、Ｋ８４６Ｒ、Ｅ８３７Ｇ。ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）は、以下のように表される：５’ｍＲＮＡキャップ－５’ＵＴＲ－ｂｈＣａｓ１２ｂ－ＳＴＯＰ配列－３’ＵＴＲ－１２０ｐｏｌｙＡテール。
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ
３’ＵＴＲ（ＴｒｉＬｉｎｋ標準ＵＴＲ）
ＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＡ
ｂｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）の核酸配列
ＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＴＡＣＣＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＴＣＣＧＡＴＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＧＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴＡＴＴＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＧＧＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＴＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＧＡＡＴＧＧＧＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧ

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂは、ＢｖＣａｓ１２Ｂである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂは、以下に提供されるＢｖＣａｓ１２ｂの例示的な配列において番号付けされたアミノ酸置換Ｓ８９３Ｒ、Ｋ８４６Ｒ、およびＥ８３７Ｇを含む。
ＢｖＣａｓ１２ｂ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３）ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿１０１６６１４５１．１
ＭＡＩＲＳＩＫＬＫＭＫＴＮＳＧＴＤＳＩＹＬＲＫＡＬＷＲＴＨＱＬＩＮＥＧＩＡＹＹＭＮＬＬＴＬＹＲＱＥＡＩＧＤＫＴＫＥＡＹＱＡＥＬＩＮＩＩＲＮＱＱＲＮＮＧＳＳＥＥＨＧＳＤＱＥＩＬＡＬＬＲＱＬＹＥＬＩＩＰＳＳＩＧＥＳＧＤＡＮＱＬＧＮＫＦＬＹＰＬＶＤＰＮＳＱＳＧＫＧＴＳＮＡＧＲＫＰＲＷＫＲＬＫＥＥＧＮＰＤＷＥＬＥＫＫＫＤＥＥＲＫＡＫＤＰＴＶＫＩＦＤＮＬＮＫＹＧＬＬＰＬＦＰＬＦＴＮＩＱＫＤＩＥＷＬＰＬＧＫＲＱＳＶＲＫＷＤＫＤＭＦＩＱＡＩＥＲＬＬＳＷＥＳＷＮＲＲＶＡＤＥＹＫＱＬＫＥＫＴＥＳＹＹＫＥＨＬＴＧＧＥＥＷＩＥＫＩＲＫＦＥＫＥＲＮＭＥＬＥＫＮＡＦＡＰＮＤＧＹＦＩＴＳＲＱＩＲＧＷＤＲＶＹＥＫＷＳＫＬＰＥＳＡＳＰＥＥＬＷＫＶＶＡＥＱＱＮＫＭＳＥＧＦＧＤＰＫＶＦＳＦＬＡＮＲＥＮＲＤＩＷＲＧＨＳＥＲＩＹＨＩＡＡＹＮＧＬＱＫＫＬＳＲＴＫＥＱＡＴＦＴＬＰＤＡＩＥＨＰＬＷＩＲＹＥＳＰＧＧＴＮＬＮＬＦＫＬＥＥＫＱＫＫＮＹＹＶＴＬＳＫＩＩＷＰＳＥＥＫＷＩＥＫＥＮＩＥＩＰＬＡＰＳＩＱＦＮＲＱＩＫＬＫＱＨＶＫＧＫＱＥＩＳＦＳＤＹＳＳＲＩＳＬＤＧＶＬＧＧＳＲＩＱＦＮＲＫＹＩＫＮＨＫＥＬＬＧＥＧＤＩＧＰＶＦＦＮＬＶＶＤＶＡＰＬＱＥＴＲＮＧＲＬＱＳＰＩＧＫＡＬＫＶＩＳＳＤＦＳＫＶＩＤＹＫＰＫＥＬＭＤＷＭＮＴＧＳＡＳＮＳＦＧＶＡＳＬＬＥＧＭＲＶＭＳＩＤＭＧＱＲＴＳＡＳＶＳＩＦＥＶＶＫＥＬＰＫＤＱＥＱＫＬＦＹＳＩＮＤＴＥＬＦＡＩＨＫＲＳＦＬＬＮＬＰＧＥＶＶＴＫＮＮＫＱＱＲＱＥＲＲＫＫＲＱＦＶＲＳＱＩＲＭＬＡＮＶＬＲＬＥＴＫＫＴＰＤＥＲＫＫＡＩＨＫＬＭＥＩＶＱＳＹＤＳＷＴＡＳＱＫＥＶＷＥＫＥＬＮＬＬＴＮＭＡＡＦＮＤＥＩＷＫＥＳＬＶＥＬＨＨＲＩＥＰＹＶＧＱＩＶＳＫＷＲＫＧＬＳＥＧＲＫＮＬＡＧＩＳＭＷＮＩＤＥＬＥＤＴＲＲＬＬＩＳＷＳＫＲＳＲＴＰＧＥＡＮＲＩＥＴＤＥＰＦＧＳＳＬＬＱＨＩＱＮＶＫＤＤＲＬＫＱＭＡＮＬＩＩＭＴＡＬＧＦＫＹＤＫＥＥＫＤＲＹＫＲＷＫＥＴＹＰＡＣＱＩＩＬＦＥＮＬＮＲＹＬＦＮＬＤＲＳＲＲＥＮＳＲＬＭＫＷＡＨＲＳＩＰＲＴＶＳＭＱＧＥＭＦＧＬＱＶＧＤＶＲＳＥＹＳＳＲＦＨＡＫＴＧＡＰＧＩＲＣＨＡＬＴＥＥＤＬＫＡＧＳＮＴＬＫＲＬＩＥＤＧＦＩＮＥＳＥＬＡＹＬＫＫＧＤＩＩＰＳＱＧＧＥＬＦＶＴＬＳＫＲＹＫＫＤＳＤＮＮＥＬＴＶＩＨＡＤＩＮＡＡＱＮＬＱＫＲＦＷＱＱＮＳＥＶＹＲＶＰＣＱＬＡＲＭＧＥＤＫＬＹＩＰＫＳＱＴＥＴＩＫＫＹＦＧＫＧＳＦＶＫＮＮＴＥＱＥＶＹＫＷＥＫＳＥＫＭＫＩＫＴＤＴＴＦＤＬＱＤＬＤＧＦＥＤＩＳＫＴＩＥＬＡＱＥＱＱＫＫＹＬＴＭＦＲＤＰＳＧＹＦＦＮＮＥＴＷＲＰＱＫＥＹＷＳＩＶＮＮＩＩＫＳＣＬＫＫＫＩＬＳＮＫＶＥＬ

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂは、ＢＴＣａｓ１２ｂ．ＢＴＣａｓ１２ｂ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）である。ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０４１９０２５１２
ＭＡＴＲＳＦＩＬＫＩＥＰＮＥＥＶＫＫＧＬＷＫＴＨＥＶＬＮＨＧＩＡＹＹＭＮＩＬＫＬＩＲＱＥＡＩＹＥＨＨＥＱＤＰＫＮＰＫＫＶＳＫＡＥＩＱＡＥＬＷＤＦＶＬＫＭＱＫＣＮＳＦＴＨＥＶＤＫＤＶＶＦＮＩＬＲＥＬＹＥＥＬＶＰＳＳＶＥＫＫＧＥＡＮＱＬＳＮＫＦＬＹＰＬＶＤＰＮＳＱＳＧＫＧＴＡＳＳＧＲＫＰＲＷＹＮＬＫＩＡＧＤＰＳＷＥＥＥＫＫＫＷＥＥＤＫＫＫＤＰＬＡＫＩＬＧＫＬＡＥＹＧＬＩＰＬＦＩＰＦＴＤＳＮＥＰＩＶＫＥＩＫＷＭＥＫＳＲＮＱＳＶＲＲＬＤＫＤＭＦＩＱＡＬＥＲＦＬＳＷＥＳＷＮＬＫＶＫＥＥＹＥＫＶＥＫＥＨＫＴＬＥＥＲＩＫＥＤＩＱＡＦＫＳＬＥＱＹＥＫＥＲＱＥＱＬＬＲＤＴＬＮＴＮＥＹＲＬＳＫＲＧＬＲＧＷＲＥＩＩＱＫＷＬＫＭＤＥＮＥＰＳＥＫＹＬＥＶＦＫＤＹＱＲＫＨＰＲＥＡＧＤＹＳＶＹＥＦＬＳＫＫＥＮＨＦＩＷＲＮＨＰＥＹＰＹＬＹＡＴＦＣＥＩＤＫＫＫＫＤＡＫＱＱＡＴＦＴＬＡＤＰＩＮＨＰＬＷＶＲＦＥＥＲＳＧＳＮＬＮＫＹＲＩＬＴＥＱＬＨＴＥＫＬＫＫＫＬＴＶＱＬＤＲＬＩＹＰＴＥＳＧＧＷＥＥＫＧＫＶＤＩＶＬＬＰＳＲＱＦＹＮＱＩＦＬＤＩＥＥＫＧＫＨＡＦＴＹＫＤＥＳＩＫＦＰＬＫＧＴＬＧＧＡＲＶＱＦＤＲＤＨＬＲＲＹＰＨＫＶＥＳＧＮＶＧＲＩＹＦＮＭＴＶＮＩＥＰＴＥＳＰＶＳＫＳＬＫＩＨＲＤＤＦＰＫＦＶＮＦＫＰＫＥＬＴＥＷＩＫＤＳＫＧＫＫＬＫＳＧＩＥＳＬＥＩＧＬＲＶＭＳＩＤＬＧＱＲＱＡＡＡＡＳＩＦＥＶＶＤＱＫＰＤＩＥＧＫＬＦＦＰＩＫＧＴＥＬＹＡＶＨＲＡＳＦＮＩＫＬＰＧＥＴＬＶＫＳＲＥＶＬＲＫＡＲＥＤＮＬＫＬＭＮＱＫＬＮＦＬＲＮＶＬＨＦＱＱＦＥＤＩＴＥＲＥＫＲＶＴＫＷＩＳＲＱＥＮＳＤＶＰＬＶＹＱＤＥＬＩＱＩＲＥＬＭＹＫＰＹＫＤＷＶＡＦＬＫＱＬＨＫＲＬＥＶＥＩＧＫＥＶＫＨＷＲＫＳＬＳＤＧＲＫＧＬＹＧＩＳＬＫＮＩＤＥＩＤＲＴＲＫＦＬＬＲＷＳＬＲＰＴＥＰＧＥＶＲＲＬＥＰＧＱＲＦＡＩＤＱＬＮＨＬＮＡＬＫＥＤＲＬＫＫＭＡＮＴＩＩＭＨＡＬＧＹＣＹＤＶＲＫＫＫＷＱＡＫＮＰＡＣＱＩＩＬＦＥＤＬＳＮＹＮＰＹＥＥＲＳＲＦＥＮＳＫＬＭＫＷＳＲＲＥＩＰＲＱＶＡＬＱＧＥＩＹＧＬＱＶＧＥＶＧＡＱＦＳＳＲＦＨＡＫＴＧＳＰＧＩＲＣＳＶＶＴＫＥＫＬＱＤＮＲＦＦＫＮＬＱＲＥＧＲＬＴＬＤＫＩＡＶＬＫＥＧＤＬＹＰＤＫＧＧＥＫＦＩＳＬＳＫＤＲＫＬＶＴＴＨＡＤＩＮＡＡＱＮＬＱＫＲＦＷＴＲＴＨＧＦＹＫＶＹＣＫＡＹＱＶＤＧＱＴＶＹＩＰＥＳＫＤＱＫＱＫＩＩＥＥＦＧＥＧＹＦＩＬＫＤＧＶＹＥＷＧＮＡＧＫＬＫＩＫＫＧＳＳＫＱＳＳＳＥＬＶＤＳＤＩＬＫＤＳＦＤＬＡＳＥＬＫＧＥＫＬＭＬＹＲＤＰＳＧＮＶＦＰＳＤＫＷＭＡＡＧＶＦＦＧＫＬＥＲＩＬＩＳＫＬＴＮＱＹＳＩＳＴＩＥＤＤＳＳＫＱＳＭ

一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ｃを指す。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｃタンパク質は、Ｃａｓ１２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ１のバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｃ２またはＣａｓ１２ｃ２のバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ種ＨＩ０００９（すなわち、ＯｓｐＣａｓ１２ｃ）由来のＣａｓ１２ｃタンパク質またはＯｓｐＣａｓ１２ｃのバリアントである。これらのＣａｓ１２ｃ分子は、Ｙａｎｅｔａｌ．，“ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙＤｉｖｅｒｓｅＴｙｐｅＶＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９Ｊａｎ．４；３６３：８８－９１に記載されている（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に記載の任意のＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示に従って、他の細菌種由来のＣａｓ１２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ２、またはＯｓｐＣａｓ１２ｃも使用され得ることを理解されたい。

Ｃａｓ１２ｃ１
ＭＱＴＫＫＴＨＬＨＬＩＳＡＫＡＳＲＫＹＲＲＴＩＡＣＬＳＤＴＡＫＫＤＬＥＲＲＫＱＳＧＡＡＤＰＡＱＥＬＳＣＬＫＴＩＫＦＫＬＥＶＰＥＧＳＫＬＰＳＦＤＲＩＳＱＩＹＮＡＬＥＴＩＥＫＧＳＬＳＹＬＬＦＡＬＩＬＳＧＦＲＩＦＰＮＳＳＡＡＫＴＦＡＳＳＳＣＹＫＮＤＱＦＡＳＱＩＫＥＩＦＧＥＭＶＫＮＦＩＰＳＥＬＥＳＩＬＫＫＧＲＲＫＮＮＫＤＷＴＥＥＮＩＫＲＶＬＮＳＥＦＧＲＫＮＳＥＧＳＳＡＬＦＤＳＦＬＳＫＦＳＱＥＬＦＲＫＦＤＳＷＮＥＶＮＫＫＹＬＥＡＡＥＬＬＤＳＭＬＡＳＹＧＰＦＤＳＶＣＫＭＩＧＤＳＤＳＲＮＳＬＰＤＫＳＴＩＡＦＴＮＮＡＥＩＴＶＤＩＥＳＳＶＭＰＹＭＡＩＡＡＬＬＲＥＹＲＱＳＫＳＫＡＡＰＶＡＹＶＱＳＨＬＴＴＴＮＧＮＧＬＳＷＦＦＫＦＧＬＤＬＩＲＫＡＰＶＳＳＫＱＳＴＳＤＧＳＫＳＬＱＥＬＦＳＶＰＤＤＫＬＤＧＬＫＦＩＫＥＡＣＥＡＬＰＥＡＳＬＬＣＧＥＫＧＥＬＬＧＹＱＤＦＲＴＳＦＡＧＨＩＤＳＷＶＡＮＹＶＮＲＬＦＥＬＩＥＬＶＮＱＬＰＥＳＩＫＬＰＳＩＬＴＱＫＮＨＮＬＶＡＳＬＧＬＱＥＡＥＶＳＨＳＬＥＬＦＥＧＬＶＫＮＶＲＱＴＬＫＫＬＡＧＩＤＩＳＳＳＰＮＥＱＤＩＫＥＦＹＡＦＳＤＶＬＮＲＬＧＳＩＲＮＱＩＥＮＡＶＱＴＡＫＫＤＫＩＤＬＥＳＡＩＥＷＫＥＷＫＫＬＫＫＬＰＫＬＮＧＬＧＧＧＶＰＫＱＱＥＬＬＤＫＡＬＥＳＶＫＱＩＲＨＹＱＲＩＤＦＥＲＶＩＱＷＡＶＮＥＨＣＬＥＴＶＰＫＦＬＶＤＡＥＫＫＫＩＮＫＥＳＳＴＤＦＡＡＫＥＮＡＶＲＦＬＬＥＧＩＧＡＡＡＲＧＫＴＤＳＶＳＫＡＡＹＮＷＦＶＶＮＮＦＬＡＫＫＤＬＮＲＹＦＩＮＣＱＧＣＩＹＫＰＰＹＳＫＲＲＳＬＡＦＡＬＲＳＤＮＫＤＴＩＥＶＶＷＥＫＦＥＴＦＹＫＥＩＳＫＥＩＥＫＦＮＩＦＳＱＥＦＱＴＦＬＨＬＥＮＬＲＭＫＬＬＬＲＲＩＱＫＰＩＰＡＥＩＡＦＦＳＬＰＱＥＹＹＤＳＬＰＰＮＶＡＦＬＡＬＮＱＥＩＴＰＳＥＹＩＴＱＦＮＬＹＳＳＦＬＮＧＮＬＩＬＬＲＲＳＲＳＹＬＲＡＫＦＳＷＶＧＮＳＫＬＩＹＡＡＫＥＡＲＬＷＫＩＰＮＡＹＷＫＳＤＥＷＫＭＩＬＤＳＮＶＬＶＦＤＫＡＧＮＶＬＰＡＰＴＬＫＫＶＣＥＲＥＧＤＬＲＬＦＹＰＬＬＲＱＬＰＨＤＷＣＹＲＮＰＦＶＫＳＶＧＲＥＫＮＶＩＥＶＮＫＥＧＥＰＫＶＡＳＡＬＰＧＳＬＦＲＬＩＧＰＡＰＦＫＳＬＬＤＤＣＦＦＮＰＬＤＫＤＬＲＥＣＭＬＩＶＤＱＥＩＳＱＫＶＥＡＱＫＶＥＡＳＬＥＳＣＴＹＳＩＡＶＰＩＲＹＨＬＥＥＰＫＶＳＮＱＦＥＮＶＬＡＩＤＱＧＥＡＧＬＡＹＡＶＦＳＬＫＳＩＧＥＡＥＴＫＰＩＡＶＧＴＩＲＩＰＳＩＲＲＬＩＨＳＶＳＴＹＲＫＫＫＱＲＬＱＮＦＫＱＮＹＤＳＴＡＦＩＭＲＥＮＶＴＧＤＶＣＡＫＩＶＧＬＭＫＥＦＮＡＦＰＶＬＥＹＤＶＫＮＬＥＳＧＳＲＱＬＳＡＶＹＫＡＶＮＳＨＦＬＹＦＫＥＰＧＲＤＡＬＲＫＱＬＷＹＧＧＤＳＷＴＩＤＧＩＥＩＶＴＲＥＲＫＥＤＧＫＥＧＶＥＫＩＶＰＬＫＶＦＰＧＲＳＶＳＡＲＦＴＳＫＴＣＳＣＣＧＲＮＶＦＤＷＬＦＴＥＫＫＡＫＴＮＫＫＦＮＶＮＳＫＧＥＬＴＴＡＤＧＶＩＱＬＦＥＡＤＲＳＫＧＰＫＦＹＡＲＲＫＥＲＴＰＬＴＫＰＩＡＫＧＳＹＳＬＥＥＩＥＲＲＶＲＴＮＬＲＲＡＰＫＳＫＱＳＲＤＴＳＱＳＱＹＦＣＶＹＫＤＣＡＬＨＦＳＧＭＱＡＤＥＮＡＡＩＮＩＧＲＲＦＬＴＡＬＲＫＮＲＲＳＤＦＰＳＮＶＫＩＳＤＲＬＬＤＮ

Ｃａｓ１２ｃ２
ＭＴＫＨＳＩＰＬＨＡＦＲＮＳＧＡＤＡＲＫＷＫＧＲＩＡＬＬＡＫＲＧＫＥＴＭＲＴＬＱＦＰＬＥＭＳＥＰＥＡＡＡＩＮＴＴＰＦＡＶＡＹＮＡＩＥＧＴＧＫＧＴＬＦＤＹＷＡＫＬＨＬＡＧＦＲＦＦＰＳＧＧＡＡＴＩＦＲＱＱＡＶＦＥＤＡＳＷＮＡＡＦＣＱＱＳＧＫＤＷＰＷＬＶＰＳＫＬＹＥＲＦＴＫＡＰＲＥＶＡＫＫＤＧＳＫＫＳＩＥＦＴＱＥＮＶＡＮＥＳＨＶＳＬＶＧＡＳＩＴＤＫＴＰＥＤＱＫＥＦＦＬＫＭＡＧＡＬＡＥＫＦＤＳＷＫＳＡＮＥＤＲＩＶＡＭＫＶＩＤＥＦＬＫＳＥＧＬＨＬＰＳＬＥＮＩＡＶＫＣＳＶＥＴＫＰＤＮＡＴＶＡＷＨＤＡＰＭＳＧＶＱＮＬＡＩＧＶＦＡＴＣＡＳＲＩＤＮＩＹＤＬＮＧＧＫＬＳＫＬＩＱＥＳＡＴＴＰＮＶＴＡＬＳＷＬＦＧＫＧＬＥＹＦＲＴＴＤＩＤＴＩＭＱＤＦＮＩＰＡＳＡＫＥＳＩＫＰＬＶＥＳＡＱＡＩＰＴＭＴＶＬＧＫＫＮＹＡＰＦＲＰＮＦＧＧＫＩＤＳＷＩＡＮＹＡＳＲＬＭＬＬＮＤＩＬＥＱＩＥＰＧＦＥＬＰＱＡＬＬＤＮＥＴＬＭＳＧＩＤＭＴＧＤＥＬＫＥＬＩＥＡＶＹＡＷＶＤＡＡＫＱＧＬＡＴＬＬＧＲＧＧＮＶＤＤＡＶＱＴＦＥＱＦＳＡＭＭＤＴＬＮＧＴＬＮＴＩＳＡＲＹＶＲＡＶＥＭＡＧＫＤＥＡＲＬＥＫＬＩＥＣＫＦＤＩＰＫＷＣＫＳＶＰＫＬＶＧＩＳＧＧＬＰＫＶＥＥＥＩＫＶＭＮＡＡＦＫＤＶＲＡＲＭＦＶＲＦＥＥＩＡＡＹＶＡＳＫＧＡＧＭＤＶＹＤＡＬＥＫＲＥＬＥＱＩＫＫＬＫＳＡＶＰＥＲＡＨＩＱＡＹＲＡＶＬＨＲＩＧＲＡＶＱＮＣＳＥＫＴＫＱＬＦＳＳＫＶＩＥＭＧＶＦＫＮＰＳＨＬＮＮＦＩＦＮＱＫＧＡＩＹＲＳＰＦＤＲＳＲＨＡＰＹＱＬＨＡＤＫＬＬＫＮＤＷＬＥＬＬＡＥＩＳＡＴＬＭＡＳＥＳＴＥＱＭＥＤＡＬＲＬＥＲＴＲＬＱＬＱＬＳＧＬＰＤＷＥＹＰＡＳＬＡＫＰＤＩＥＶＥＩＱＴＡＬＫＭＱＬＡＫＤＴＶＴＳＤＶＬＱＲＡＦＮＬＹＳＳＶＬＳＧＬＴＦＫＬＬＲＲＳＦＳＬＫＭＲＦＳＶＡＤＴＴＱＬＩＹＶＰＫＶＣＤＷＡＩＰＫＱＹＬＱＡＥＧＥＩＧＩＡＡＲＶＶＴＥＳＳＰＡＫＭＶＴＥＶＥＭＫＥＰＫＡＬＧＨＦＭＱＱＡＰＨＤＷＹＦＤＡＳＬＧＧＴＱＶＡＧＲＩＶＥＫＧＫＥＶＧＫＥＲＫＬＶＧＹＲＭＲＧＮＳＡＹＫＴＶＬＤＫＳＬＶＧＮＴＥＬＳＱＣＳＭＩＩＥＩＰＹＴＱＴＶＤＡＤＦＲＡＱＶＱＡＧＬＰＫＶＳＩＮＬＰＶＫＥＴＩＴＡＳＮＫＤＥＱＭＬＦＤＲＦＶＡＩＤＬＧＥＲＧＬＧＹＡＶＦＤＡＫＴＬＥＬＱＥＳＧＨＲＰＩＫＡＩＴＮＬＬＮＲＴＨＨＹＥＱＲＰＮＱＲＱＫＦＱＡＫＦＮＶＮＬＳＥＬＲＥＮＴＶＧＤＶＣＨＱＩＮＲＩＣＡＹＹＮＡＦＰＶＬＥＹＭＶＰＤＲＬＤＫＱＬＫＳＶＹＥＳＶＴＮＲＹＩＷＳＳＴＤＡＨＫＳＡＲＶＱＦＷＬＧＧＥＴＷＥＨＰＹＬＫＳＡＫＤＫＫＰＬＶＬＳＰＧＲＧＡＳＧＫＧＴＳＱＴＣＳＣＣＧＲＮＰＦＤＬＩＫＤＭＫＰＲＡＫＩＡＶＶＤＧＫＡＫＬＥＮＳＥＬＫＬＦＥＲＮＬＥＳＫＤＤＭＬＡＲＲＨＲＮＥＲＡＧＭＥＱＰＬＴＰＧＮＹＴＶＤＥＩＫＡＬＬＲＡＮＬＲＲＡＰＫＮＲＲＴＫＤＴＴＶＳＥＹＨＣＶＦＳＤＣＧＫＴＭＨＡＤＥＮＡＡＶＮＩＧＧＫＦＩＡＤＩＥＫ

ＯｓｐＣａｓ１２ｃ
ＭＴＫＬＲＨＲＱＫＫＬＴＨＤＷＡＧＳＫＫＲＥＶＬＧＳＮＧＫＬＱＮＰＬＬＭＰＶＫＫＧＱＶＴＥＦＲＫＡＦＳＡＹＡＲＡＴＫＧＥＭＴＤＧＲＫＮＭＦＴＨＳＦＥＰＦＫＴＫＰＳＬＨＱＣＥＬＡＤＫＡＹＱＳＬＨＳＹＬＰＧＳＬＡＨＦＬＬＳＡＨＡＬＧＦＲＩＦＳＫＳＧＥＡＴＡＦＱＡＳＳＫＩＥＡＹＥＳＫＬＡＳＥＬＡＣＶＤＬＳＩＱＮＬＴＩＳＴＬＦＮＡＬＴＴＳＶＲＧＫＧＥＥＴＳＡＤＰＬＩＡＲＦＹＴＬＬＴＧＫＰＬＳＲＤＴＱＧＰＥＲＤＬＡＥＶＩＳＲＫＩＡＳＳＦＧＴＷＫＥＭＴＡＮＰＬＱＳＬＱＦＦＥＥＥＬＨＡＬＤＡＮＶＳＬＳＰＡＦＤＶＬＩＫＭＮＤＬＱＧＤＬＫＮＲＴＩＶＦＤＰＤＡＰＶＦＥＹＮＡＥＤＰＡＤＩＩＩＫＬＴＡＲＹＡＫＥＡＶＩＫＮＱＮＶＧＮＹＶＫＮＡＩＴＴＴＮＡＮＧＬＧＷＬＬＮＫＧＬＳＬＬＰＶＳＴＤＤＥＬＬＥＦＩＧＶＥＲＳＨＰＳＣＨＡＬＩＥＬＩＡＱＬＥＡＰＥＬＦＥＫＮＶＦＳＤＴＲＳＥＶＱＧＭＩＤＳＡＶＳＮＨＩＡＲＬＳＳＳＲＮＳＬＳＭＤＳＥＥＬＥＲＬＩＫＳＦＱＩＨＴＰＨＣＳＬＦＩＧＡＱＳＬＳＱＱＬＥＳＬＰＥＡＬＱＳＧＶＮＳＡＤＩＬＬＧＳＴＱＹＭＬＴＮＳＬＶＥＥＳＩＡＴＹＱＲＴＬＮＲＩＮＹＬＳＧＶＡＧＱＩＮＧＡＩＫＲＫＡＩＤＧＥＫＩＨＬＰＡＡＷＳＥＬＩＳＬＰＦＩＧＱＰＶＩＤＶＥＳＤＬＡＨＬＫＮＱＹＱＴＬＳＮＥＦＤＴＬＩＳＡＬＱＫＮＦＤＬＮＦＮＫＡＬＬＮＲＴＱＨＦＥＡＭＣＲＳＴＫＫＮＡＬＳＫＰＥＩＶＳＹＲＤＬＬＡＲＬＴＳＣＬＹＲＧＳＬＶＬＲＲＡＧＩＥＶＬＫＫＨＫＩＦＥＳＮＳＥＬＲＥＨＶＨＥＲＫＨＦＶＦＶＳＰＬＤＲＫＡＫＫＬＬＲＬＴＤＳＲＰＤＬＬＨＶＩＤＥＩＬＱＨＤＮＬＥＮＫＤＲＥＳＬＷＬＶＲＳＧＹＬＬＡＧＬＰＤＱＬＳＳＳＦＩＮＬＰＩＩＴＱＫＧＤＲＲＬＩＤＬＩＱＹＤＱＩＮＲＤＡＦＶＭＬＶＴＳＡＦＫＳＮＬＳＧＬＱＹＲＡＮＫＱＳＦＶＶＴＲＴＬＳＰＹＬＧＳＫＬＶＹＶＰＫＤＫＤＷＬＶＰＳＱＭＦＥＧＲＦＡＤＩＬＱＳＤＹＭＶＷＫＤＡＧＲＬＣＶＩＤＴＡＫＨＬＳＮＩＫＫＳＶＦＳＳＥＥＶＬＡＦＬＲＥＬＰＨＲＴＦＩＱＴＥＶＲＧＬＧＶＮＶＤＧＩＡＦＮＮＧＤＩＰＳＬＫＴＦＳＮＣＶＱＶＫＶＳＲＴＮＴＳＬＶＱＴＬＮＲＷＦＥＧＧＫＶＳＰＰＳＩＱＦＥＲＡＹＹＫＫＤＤＱＩＨＥＤＡＡＫＲＫＩＲＦＱＭＰＡＴＥＬＶＨＡＳＤＤＡＧＷＴＰＳＹＬＬＧＩＤＰＧＥＹＧＭＧＬＳＬＶＳＩＮＮＧＥＶＬＤＳＧＦＩＨＩＮＳＬＩＮＦＡＳＫＫＳＮＨＱＴＫＶＶＰＲＱＱＹＫＳＰＹＡＮＹＬＥＱＳＫＤＳＡＡＧＤＩＡＨＩＬＤＲＬＩＹＫＬＮＡＬＰＶＦＥＡＬＳＧＮＳＱＳＡＡＤＱＶＷＴＫＶＬＳＦＹＴＷＧＤＮＤＡＱＮＳＩＲＫＱＨＷＦＧＡＳＨＷＤＩＫＧＭＬＲＱＰＰＴＥＫＫＰＫＰＹＩＡＦＰＧＳＱＶＳＳＹＧＮＳＱＲＣＳＣＣＧＲＮＰＩＥＱＬＲＥＭＡＫＤＴＳＩＫＥＬＫＩＲＮＳＥＩＱＬＦＤＧＴＩＫＬＦＮＰＤＰＳＴＶＩＥＲＲＲＨＮＬＧＰＳＲＩＰＶＡＤＲＴＦＫＮＩＳＰＳＳＬＥＦＫＥＬＩＴＩＶＳＲＳＩＲＨＳＰＥＦＩＡＫＫＲＧＩＧＳＥＹＦＣＡＹＳＤＣＮＳＳＬＮＳＥＡＮＡＡＡＮＶＡＱＫＦＱＫＱＬＦＦＥＬ

一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉを指し、例えば、Ｙａｎｅｔａｌ．，“ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙＤｉｖｅｒｓｅＴｙｐｅＶＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９Ｊａｎ．４；３６３：８８－９１に記載されている（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。１０テラバイト超の配列データを集約することにより、Ｖ型Ｃａｓタンパク質の新しい分類が特定され、これは、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、およびＣａｓ１２ｉを含む以前に特徴付けられたクラスＶタンパク質との弱い類似性を示した。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｇまたはＣａｓ１２ｇのバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｈまたはＣａｓ１２ｈのバリアントである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ｉまたはＣａｓ１２ｉのバリアントである。他のＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、ｎａｐＤＮＡｂｐとして使用されてもよく、本開示の範囲内であることを理解されたい。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に記載の任意のＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示に従って、他の細菌種由来のＣａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉも使用され得ることを理解されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｉは、Ｃａｓ１２ｉ１またはＣａｓ１２ｉ２である。

Ｃａｓ１２ｇ１
ＭＡＱＡＳＳＴＰＡＶＳＰＲＰＲＰＲＹＲＥＥＲＴＬＶＲＫＬＬＰＲＰＧＱＳＫＱＥＦＲＥＮＶＫＫＬＲＫＡＦＬＱＦＮＡＤＶＳＧＶＣＱＷＡＩＱＦＲＰＲＹＧＫＰＡＥＰＴＥＴＦＷＫＦＦＬＥＰＥＴＳＬＰＰＮＤＳＲＳＰＥＦＲＲＬＱＡＦＥＡＡＡＧＩＮＧＡＡＡＬＤＤＰＡＦＴＮＥＬＲＤＳＩＬＡＶＡＳＲＰＫＴＫＥＡＱＲＬＦＳＲＬＫＤＹＱＰＡＨＲＭＩＬＡＫＶＡＡＥＷＩＥＳＲＹＲＲＡＨＱＮＷＥＲＮＹＥＥＷＫＫＥＫＱＥＷＥＱＮＨＰＥＬＴＰＥＩＲＥＡＦＮＱＩＦＱＱＬＥＶＫＥＫＲＶＲＩＣＰＡＡＲＬＬＱＮＫＤＮＣＱＹＡＧＫＮＫＨＳＶＬＣＮＱＦＮＥＦＫＫＮＨＬＱＧＫＡＩＫＦＦＹＫＤＡＥＫＹＬＲＣＧＬＱＳＬＫＰＮＶＱＧＰＦＲＥＤＷＮＫＹＬＲＹＭＮＬＫＥＥＴＬＲＧＫＮＧＧＲＬＰＨＣＫＮＬＧＱＥＣＥＦＮＰＨＴＡＬＣＫＱＹＱＱＱＬＳＳＲＰＤＬＶＱＨＤＥＬＹＲＫＷＲＲＥＹＷＲＥＰＲＫＰＶＦＲＹＰＳＶＫＲＨＳＩＡＫＩＦＧＥＮＹＦＱＡＤＦＫＮＳＶＶＧＬＲＬＤＳＭＰＡＧＱＹＬＥＦＡＦＡＰＷＰＲＮＹＲＰＱＰＧＥＴＥＩＳＳＶＨＬＨＦＶＧＴＲＰＲＩＧＦＲＦＲＶＰＨＫＲＳＲＦＤＣＴＱＥＥＬＤＥＬＲＳＲＴＦＰＲＫＡＱＤＱＫＦＬＥＡＡＲＫＲＬＬＥＴＦＰＧＮＡＥＱＥＬＲＬＬＡＶＤＬＧＴＤＳＡＲＡＡＦＦＩＧＫＴＦＱＱＡＦＰＬＫＩＶＫＩＥＫＬＹＥＱＷＰＮＱＫＱＡＧＤＲＲＤＡＳＳＫＱＰＲＰＧＬＳＲＤＨＶＧＲＨＬＱＫＭＲＡＱＡＳＥＩＡＱＫＲＱＥＬＴＧＴＰＡＰＥＴＴＴＤＱＡＡＫＫＡＴＬＱＰＦＤＬＲＧＬＴＶＨＴＡＲＭＩＲＤＷＡＲＬＮＡＲＱＩＩＱＬＡＥＥＮＱＶＤＬＩＶＬＥＳＬＲＧＦＲＰＰＧＹＥＮＬＤＱＥＫＫＲＲＶＡＦＦＡＨＧＲＩＲＲＫＶＴＥＫＡＶＥＲＧＭＲＶＶＴＶＰＹＬＡＳＳＫＶＣＡＥＣＲＫＫＱＫＤＮＫＱＷＥＫＮＫＫＲＧＬＦＫＣＥＧＣＧＳＱＡＱＶＤＥＮＡＡＲＶＬＧＲＶＦＷＧＥＩＥＬＰＴＡＩＰ

Ｃａｓ１２ｈ１
ＭＫＶＨＥＩＰＲＳＱＬＬＫＩＫＱＹＥＧＳＦＶＥＷＹＲＤＬＱＥＤＲＫＫＦＡＳＬＬＦＲＷＡＡＦＧＹＡＡＲＥＤＤＧＡＴＹＩＳＰＳＱＡＬＬＥＲＲＬＬＬＧＤＡＥＤＶＡＩＫＦＬＤＶＬＦＫＧＧＡＰＳＳＳＣＹＳＬＦＹＥＤＦＡＬＲＤＫＡＫＹＳＧＡＫＲＥＦＩＥＧＬＡＴＭＰＬＤＫＩＩＥＲＩＲＱＤＥＱＬＳＫＩＰＡＥＥＷＬＩＬＧＡＥＹＳＰＥＥＩＷＥＱＶＡＰＲＩＶＮＶＤＲＳＬＧＫＱＬＲＥＲＬＧＩＫＣＲＲＰＨＤＡＧＹＣＫＩＬＭＥＶＶＡＲＱＬＲＳＨＮＥＴＹＨＥＹＬＮＱＴＨＥＭＫＴＫＶＡＮＮＬＴＮＥＦＤＬＶＣＥＦＡＥＶＬＥＥＫＮＹＧＬＧＷＹＶＬＷＱＧＶＫＱＡＬＫＥＱＫＫＰＴＫＩＱＩＡＶＤＱＬＲＱＰＫＦＡＧＬＬＴＡＫＷＲＡＬＫＧＡＹＤＴＷＫＬＫＫＲＬＥＫＲＫＡＦＰＹＭＰＮＷＤＮＤＹＱＩＰＶＧＬＴＧＬＧＶＦＴＬＥＶＫＲＴＥＶＶＶＤＬＫＥＨＧＫＬＦＣＳＨＳＨＹＦＧＤＬＴＡＥＫＨＰＳＲＹＨＬＫＦＲＨＫＬＫＬＲＫＲＤＳＲＶＥＰＴＩＧＰＷＩＥＡＡＬＲＥＩＴＩＱＫＫＰＮＧＶＦＹＬＧＬＰＹＡＬＳＨＧＩＤＮＦＱＩＡＫＲＦＦＳＡＡＫＰＤＫＥＶＩＮＧＬＰＳＥＭＶＶＧＡＡＤＬＮＬＳＮＩＶＡＰＶＫＡＲＩＧＫＧＬＥＧＰＬＨＡＬＤＹＧＹＧＥＬＩＤＧＰＫＩＬＴＰＤＧＰＲＣＧＥＬＩＳＬＫＲＤＩＶＥＩＫＳＡＩＫＥＦＫＡＣＱＲＥＧＬＴＭＳＥＥＴＴＴＷＬＳＥＶＥＳＰＳＤＳＰＲＣＭＩＱＳＲＩＡＤＴＳＲＲＬＮＳＦＫＹＱＭＮＫＥＧＹＱＤＬＡＥＡＬＲＬＬＤＡＭＤＳＹＮＳＬＬＥＳＹＱＲＭＨＬＳＰＧＥＱＳＰＫＥＡＫＦＤＴＫＲＡＳＦＲＤＬＬＲＲＲＶＡＨＴＩＶＥＹＦＤＤＣＤＩＶＦＦＥＤＬＤＧＰＳＤＳＤＳＲＮＮＡＬＶＫＬＬＳＰＲＴＬＬＬＹＩＲＱＡＬＥＫＲＧＩＧＭＶＥＶＡＫＤＧＴＳＱＮＮＰＩＳＧＨＶＧＷＲＮＫＱＮＫＳＥＩＹＦＹＥＤＫＥＬＬＶＭＤＡＤＥＶＧＡＭＮＩＬＣＲＧＬＮＨＳＶＣＰＹＳＦＶＴＫＡＰＥＫＫＮＤＥＫＫＥＧＤＹＧＫＲＶＫＲＦＬＫＤＲＹＧＳＳＮＶＲＦＬＶＡＳＭＧＦＶＴＶＴＴＫＲＰＫＤＡＬＶＧＫＲＬＹＹＨＧＧＥＬＶＴＨＤＬＨＮＲＭＫＤＥＩＫＹＬＶＥＫＥＶＬＡＲＲＶＳＬＳＤＳＴＩＫＳＹＫＳＦＡＨＶ

Ｃａｓ１２ｉ１
ＭＳＮＫＥＫＮＡＳＥＴＲＫＡＹＴＴＫＭＩＰＲＳＨＤＲＭＫＬＬＧＮＦＭＤＹＬＭＤＧＴＰＩＦＦＥＬＷＮＱＦＧＧＧＩＤＲＤＩＩＳＧＴＡＮＫＤＫＩＳＤＤＬＬＬＡＶＮＷＦＫＶＭＰＩＮＳＫＰＱＧＶＳＰＳＮＬＡＮＬＦＱＱＹＳＧＳＥＰＤＩＱＡＱＥＹＦＡＳＮＦＤＴＥＫＨＱＷＫＤＭＲＶＥＹＥＲＬＬＡＥＬＱＬＳＲＳＤＭＨＨＤＬＫＬＭＹＫＥＫＣＩＧＬＳＬＳＴＡＨＹＩＴＳＶＭＦＧＴＧＡＫＮＮＲＱＴＫＨＱＦＹＳＫＶＩＱＬＬＥＥＳＴＱＩＮＳＶＥＱＬＡＳＩＩＬＫＡＧＤＣＤＳＹＲＫＬＲＩＲＣＳＲＫＧＡＴＰＳＩＬＫＩＶＱＤＹＥＬＧＴＮＨＤＤＥＶＮＶＰＳＬＩＡＮＬＫＥＫＬＧＲＦＥＹＥＣＥＷＫＣＭＥＫＩＫＡＦＬＡＳＫＶＧＰＹＹＬＧＳＹＳＡＭＬＥＮＡＬＳＰＩＫＧＭＴＴＫＮＣＫＦＶＬＫＱＩＤＡＫＮＤＩＫＹＥＮＥＰＦＧＫＩＶＥＧＦＦＤＳＰＹＦＥＳＤＴＮＶＫＷＶＬＨＰＨＨＩＧＥＳＮＩＫＴＬＷＥＤＬＮＡＩＨＳＫＹＥＥＤＩＡＳＬＳＥＤＫＫＥＫＲＩＫＶＹＱＧＤＶＣＱＴＩＮＴＹＣＥＥＶＧＫＥＡＫＴＰＬＶＱＬＬＲＹＬＹＳＲＫＤＤＩＡＶＤＫＩＩＤＧＩＴＦＬＳＫＫＨＫＶＥＫＱＫＩＮＰＶＩＱＫＹＰＳＦＮＦＧＮＮＳＫＬＬＧＫＩＩＳＰＫＤＫＬＫＨＮＬＫＣＮＲＮＱＶＤＮＹＩＷＩＥＩＫＶＬＮＴＫＴＭＲＷＥＫＨＨＹＡＬＳＳＴＲＦＬＥＥＶＹＹＰＡＴＳＥＮＰＰＤＡＬＡＡＲＦＲＴＫＴＮＧＹＥＧＫＰＡＬＳＡＥＱＩＥＱＩＲＳＡＰＶＧＬＲＫＶＫＫＲＱＭＲＬＥＡＡＲＱＱＮＬＬＰＲＹＴＷＧＫＤＦＮＩＮＩＣＫＲＧＮＮＦＥＶＴＬＡＴＫＶＫＫＫＫＥＫＮＹＫＶＶＬＧＹＤＡＮＩＶＲＫＮＴＹＡＡＩＥＡＨＡＮＧＤＧＶＩＤＹＮＤＬＰＶＫＰＩＥＳＧＦＶＴＶＥＳＱＶＲＤＫＳＹＤＱＬＳＹＮＧＶＫＬＬＹＣＫＰＨＶＥＳＲＲＳＦＬＥＫＹＲＮＧＴＭＫＤＮＲＧＮＮＩＱＩＤＦＭＫＤＦＥＡＩＡＤＤＥＴＳＬＹＹＦＮＭＫＹＣＫＬＬＱＳＳＩＲＮＨＳＳＱＡＫＥＹＲＥＥＩＦＥＬＬＲＤＧＫＬＳＶＬＫＬＳＳＬＳＮＬＳＦＶＭＦＫＶＡＫＳＬＩＧＴＹＦＧＨＬＬＫＫＰＫＮＳＫＳＤＶＫＡＰＰＩＴＤＥＤＫＱＫＡＤＰＥＭＦＡＬＲＬＡＬＥＥＫＲＬＮＫＶＫＳＫＫＥＶＩＡＮＫＩＶＡＫＡＬＥＬＲＤＫＹＧＰＶＬＩＫＧＥＮＩＳＤＴＴＫＫＧＫＫＳＳＴＮＳＦＬＭＤＷＬＡＲＧＶＡＮＫＶＫＥＭＶＭＭＨＱＧＬＥＦＶＥＶＮＰＮＦＴＳＨＱＤＰＦＶＨＫＮＰＥＮＴＦＲＡＲＹＳＲＣＴＰＳＥＬＴＥＫＮＲＫＥＩＬＳＦＬＳＤＫＰＳＫＲＰＴＮＡＹＹＮＥＧＡＭＡＦＬＡＴＹＧＬＫＫＮＤＶＬＧＶＳＬＥＫＦＫＱＩＭＡＮＩＬＨＱＲＳＥＤＱＬＬＦＰＳＲＧＧＭＦＹＬＡＴＹＫＬＤＡＤＡＴＳＶＮＷＮＧＫＱＦＷＶＣＮＡＤＬＶＡＡＹＮＶＧＬＶＤＩＱＫＤＦＫＫＫ

Ｃａｓ１２ｉ２
ＭＳＳＡＩＫＳＹＫＳＶＬＲＰＮＥＲＫＮＱＬＬＫＳＴＩＱＣＬＥＤＧＳＡＦＦＦＫＭＬＱＧＬＦＧＧＩＴＰＥＩＶＲＦＳＴＥＱＥＫＱＱＱＤＩＡＬＷＣＡＶＮＷＦＲＰＶＳＱＤＳＬＴＨＴＩＡＳＤＮＬＶＥＫＦＥＥＹＹＧＧＴＡＳＤＡＩＫＱＹＦＳＡＳＩＧＥＳＹＹＷＮＤＣＲＱＱＹＹＤＬＣＲＥＬＧＶＥＶＳＤＬＴＨＤＬＥＩＬＣＲＥＫＣＬＡＶＡＴＥＳＮＱＮＮＳＩＩＳＶＬＦＧＴＧＥＫＥＤＲＳＶＫＬＲＩＴＫＫＩＬＥＡＩＳＮＬＫＥＩＰＫＮＶＡＰＩＱＥＩＩＬＮＶＡＫＡＴＫＥＴＦＲＱＶＹＡＧＮＬＧＡＰＳＴＬＥＫＦＩＡＫＤＧＱＫＥＦＤＬＫＫＬＱＴＤＬＫＫＶＩＲＧＫＳＫＥＲＤＷＣＣＱＥＥＬＲＳＹＶＥＱＮＴＩＱＹＤＬＷＡＷＧＥＭＦＮＫＡＨＴＡＬＫＩＫＳＴＲＮＹＮＦＡＫＱＲＬＥＱＦＫＥＩＱＳＬＮＮＬＬＶＶＫＫＬＮＤＦＦＤＳＥＦＦＳＧＥＥＴＹＴＩＣＶＨＨＬＧＧＫＤＬＳＫＬＹＫＡＷＥＤＤＰＡＤＰＥＮＡＩＶＶＬＣＤＤＬＫＮＮＦＫＫＥＰＩＲＮＩＬＲＹＩＦＴＩＲＱＥＣＳＡＱＤＩＬＡＡＡＫＹＮＱＱＬＤＲＹＫＳＱＫＡＮＰＳＶＬＧＮＱＧＦＴＷＴＮＡＶＩＬＰＥＫＡＱＲＮＤＲＰＮＳＬＤＬＲＩＷＬＹＬＫＬＲＨＰＤＧＲＷＫＫＨＨＩＰＦＹＤＴＲＦＦＱＥＩＹＡＡＧＮＳＰＶＤＴＣＱＦＲＴＰＲＦＧＹＨＬＰＫＬＴＤＱＴＡＩＲＶＮＫＫＨＶＫＡＡＫＴＥＡＲＩＲＬＡＩＱＱＧＴＬＰＶＳＮＬＫＩＴＥＩＳＡＴＩＮＳＫＧＱＶＲＩＰＶＫＦＤＶＧＲＱＫＧＴＬＱＩＧＤＲＦＣＧＹＤＱＮＱＴＡＳＨＡＹＳＬＷＥＶＶＫＥＧＱＹＨＫＥＬＧＣＦＶＲＦＩＳＳＧＤＩＶＳＩＴＥＮＲＧＮＱＦＤＱＬＳＹＥＧＬＡＹＰＱＹＡＤＷＲＫＫＡＳＫＦＶＳＬＷＱＩＴＫＫＮＫＫＫＥＩＶＴＶＥＡＫＥＫＦＤＡＩＣＫＹＱＰＲＬＹＫＦＮＫＥＹＡＹＬＬＲＤＩＶＲＧＫＳＬＶＥＬＱＱＩＲＱＥＩＦＲＦＩＥＱＤＣＧＶＴＲＬＧＳＬＳＬＳＴＬＥＴＶＫＡＶＫＧＩＩＹＳＹＦＳＴＡＬＮＡＳＫＮＮＰＩＳＤＥＱＲＫＥＦＤＰＥＬＦＡＬＬＥＫＬＥＬＩＲＴＲＫＫＫＱＫＶＥＲＩＡＮＳＬＩＱＴＣＬＥＮＮＩＫＦＩＲＧＥＧＤＬＳＴＴＮＮＡＴＫＫＫＡＮＳＲＳＭＤＷＬＡＲＧＶＦＮＫＩＲＱＬＡＰＭＨＮＩＴＬＦＧＣＧＳＬＹＴＳＨＱＤＰＬＶＨＲＮＰＤＫＡＭＫＣＲＷＡＡＩＰＶＫＤＩＧＤＷＶＬＲＫＬＳＱＮＬＲＡＫＮＩＧＴＧＥＹＹＨＱＧＶＫＥＦＬＳＨＹＥＬＱＤＬＥＥＥＬＬＫＷＲＳＤＲＫＳＮＩＰＣＷＶＬＱＮＲＬＡＥＫＬＧＮＫＥＡＶＶＹＩＰＶＲＧＧＲＩＹＦＡＴＨＫＶＡＴＧＡＶＳＩＶＦＤＱＫＱＶＷＶＣＮＡＤＨＶＡＡＡＮＩＡＬＴＶＫＧＩＧＥＱＳＳＤＥＥＮＰＤＧＳＲＩＫＬＱＬＴＳ

塩基エディターの代表的な核酸配列およびタンパク質配列は、以下のとおりである：
ＢｈＣａｓ１２ｂＧＧＳＧＧＳ－ＡＢＥ８－Ｘｔｅｎ２０（Ｐ１５３における）

ＢｈＣａｓ１２ｂＧＧＳＧＧＳ－ＡＢＥ８－Ｘｔｅｎ２０（Ｋ２５５における）

ＢｈＣａｓ１２ｂＧＧＳＧＧＳ－ＡＢＥ８－Ｘｔｅｎ２０（Ｄ３０６における）

ＢｈＣａｓ１２ｂＧＧＳＧＧＳ－ＡＢＥ８－Ｘｔｅｎ２０（Ｄ９８０における）

ＢｈＣａｓ１２ｂＧＧＳＧＧＳ－ＡＢＥ８－Ｘｔｅｎ２０（Ｋ１０１９における）

上記の配列に関して、Ｋｏｚａｋ配列は、太字および下線で示され、Ｎ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、マークされ、小文字は、ＧＧＧＳＧＧＳリンカーを示し、ＡＢＥ８をコードする配列は、マークされ、非修飾配列は、ＢｈＣａｓ１２ｂをコードし、二重下線は、Ｘｔｅｎ２０リンカーを示し、一重下線は、Ｃ末端ＮＬＳを示し、GGATCC（点下線）は、ＧＳリンカーを示し、斜体文字は、３×ヘマグルチニン（ＨＡ）タグのコード配列を示す。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質であり得る。Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦは、Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓΦ ｆｒｏｍｈｕｇｅｐｈａｇｅｓｉｓａｈｙｐｅｒｃｏｍｐａｃｔｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｏｒ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７Ｊｕｌｙ２０２０，Ｖｏｌ．３６９，Ｉｓｓｕｅ６５０１，ｐｐ．３３３－３３７に記載されている（その全体が、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ヌクレアーゼ不活性（「不活性型（ｄｅａｄ）」）Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦタンパク質である。本開示に従って、他の種由来のＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦも使用され得ることを理解されたい。

例示的なＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦアミノ酸配列は、以下のとおりである：

＞ＣａｓΦ－１
ＭＡＤＴＰＴＬＦＴＱＦＬＲＨＨＬＰＧＱＲＦＲＫＤＩＬＫＱＡＧＲＩＬＡＮＫＧＥＤＡＴＩＡＦＬＲＧＫＳＥＥＳＰＰＤＦＱＰＰＶＫＣＰＩＩＡＣＳＲＰＬＴＥＷＰＩＹＱＡＳＶＡＩＱＧＹＶＹＧＱＳＬＡＥＦＥＡＳＤＰＧＣＳＫＤＧＬＬＧＷＦＤＫＴＧＶＣＴＤＹＦＳＶＱＧＬＮＬＩＦＱＮＡＲＫＲＹＩＧＶＱＴＫＶＴＮＲＮＥＫＲＨＫＫＬＫＲＩＮＡＫＲＩＡＥＧＬＰＥＬＴＳＤＥＰＥＳＡＬＤＥＴＧＨＬＩＤＰＰＧＬＮＴＮＩＹＣＹＱＱＶＳＰＫＰＬＡＬＳＥＶＮＱＬＰＴＡＹＡＧＹＳＴＳＧＤＤＰＩＱＰＭＶＴＫＤＲＬＳＩＳＫＧＱＰＧＹＩＰＥＨＱＲＡＬＬＳＱＫＫＨＲＲＭＲＧＹＧＬＫＡＲＡＬＬＶＩＶＲＩＱＤＤＷＡＶＩＤＬＲＳＬＬＲＮＡＹＷＲＲＩＶＱＴＫＥＰＳＴＩＴＫＬＬＫＬＶＴＧＤＰＶＬＤＡＴＲＭＶＡＴＦＴＹＫＰＧＩＶＱＶＲＳＡＫＣＬＫＮＫＱＧＳＫＬＦＳＥＲＹＬＮＥＴＶＳＶＴＳＩＤＬＧＳＮＮＬＶＡＶＡＴＹＲＬＶＮＧＮＴＰＥＬＬＱＲＦＴＬＰＳＨＬＶＫＤＦＥＲＹＫＱＡＨＤＴＬＥＤＳＩＱＫＴＡＶＡＳＬＰＱＧＱＱＴＥＩＲＭＷＳＭＹＧＦＲＥＡＱＥＲＶＣＱＥＬＧＬＡＤＧＳＩＰＷＮＶＭＴＡＴＳＴＩＬＴＤＬＦＬＡＲＧＧＤＰＫＫＣＭＦＴＳＥＰＫＫＫＫＮＳＫＱＶＬＹＫＩＲＤＲＡＷＡＫＭＹＲＴＬＬＳＫＥＴＲＥＡＷＮＫＡＬＷＧＬＫＲＧＳＰＤＹＡＲＬＳＫＲＫＥＥＬＡＲＲＣＶＮＹＴＩＳＴＡＥＫＲＡＱＣＧＲＴＩＶＡＬＥＤＬＮＩＧＦＦＨＧＲＧＫＱＥＰＧＷＶＧＬＦＴＲＫＫＥＮＲＷＬＭＱＡＬＨＫＡＦＬＥＬＡＨＨＲＧＹＨＶＩＥＶＮＰＡＹＴＳＱＴＣＰＶＣＲＨＣＤＰＤＮＲＤＱＨＮＲＥＡＦＨＣＩＧＣＧＦＲＧＮＡＤＬＤＶＡＴＨＮＩＡＭＶＡＩＴＧＥＳＬＫＲＡＲＧＳＶＡＳＫＴＰＱＰＬＡＡＥ＊
＞ＣａｓΦ－２
ＭＰＫＰＡＶＥＳＥＦＳＫＶＬＫＫＨＦＰＧＥＲＦＲＳＳＹＭＫＲＧＧＫＩＬＡＡＱＧＥＥＡＶＶＡＹＬＱＧＫＳＥＥＥＰＰＮＦＱＰＰＡＫＣＨＶＶＴＫＳＲＤＦＡＥＷＰＩＭＫＡＳＥＡＩＱＲＹＩＹＡＬＳＴＴＥＲＡＡＣＫＰＧＫＳＳＥＳＨＡＡＷＦＡＡＴＧＶＳＮＨＧＹＳＨＶＱＧＬＮＬＩＦＤＨＴＬＧＲＹＤＧＶＬＫＫＶＱＬＲＮＥＫＡＲＡＲＬＥＳＩＮＡＳＲＡＤＥＧＬＰＥＩＫＡＥＥＥＥＶＡＴＮＥＴＧＨＬＬＱＰＰＧＩＮＰＳＦＹＶＹＱＴＩＳＰＱＡＹＲＰＲＤＥＩＶＬＰＰＥＹＡＧＹＶＲＤＰＮＡＰＩＰＬＧＶＶＲＮＲＣＤＩＱＫＧＣＰＧＹＩＰＥＷＱＲＥＡＧＴＡＩＳＰＫＴＧＫＡＶＴＶＰＧＬＳＰＫＫＮＫＲＭＲＲＹＷＲＳＥＫＥＫＡＱＤＡＬＬＶＴＶＲＩＧＴＤＷＶＶＩＤＶＲＧＬＬＲＮＡＲＷＲＴＩＡＰＫＤＩＳＬＮＡＬＬＤＬＦＴＧＤＰＶＩＤＶＲＲＮＩＶＴＦＴＹＴＬＤＡＣＧＴＹＡＲＫＷＴＬＫＧＫＱＴＫＡＴＬＤＫＬＴＡＴＱＴＶＡＬＶＡＩＤＬＧＱＴＮＰＩＳＡＧＩＳＲＶＴＱＥＮＧＡＬＱＣＥＰＬＤＲＦＴＬＰＤＤＬＬＫＤＩＳＡＹＲＩＡＷＤＲＮＥＥＥＬＲＡＲＳＶＥＡＬＰＥＡＱＱＡＥＶＲＡＬＤＧＶＳＫＥＴＡＲＴＱＬＣＡＤＦＧＬＤＰＫＲＬＰＷＤＫＭＳＳＮＴＴＦＩＳＥＡＬＬＳＮＳＶＳＲＤＱＶＦＦＴＰＡＰＫＫＧＡＫＫＫＡＰＶＥＶＭＲＫＤＲＴＷＡＲＡＹＫＰＲＬＳＶＥＡＱＫＬＫＮＥＡＬＷＡＬＫＲＴＳＰＥＹＬＫＬＳＲＲＫＥＥＬＣＲＲＳＩＮＹＶＩＥＫＴＲＲＲＴＱＣＱＩＶＩＰＶＩＥＤＬＮＶＲＦＦＨＧＳＧＫＲＬＰＧＷＤＮＦＦＴＡＫＫＥＮＲＷＦＩＱＧＬＨＫＡＦＳＤＬＲＴＨＲＳＦＹＶＦＥＶＲＰＥＲＴＳＩＴＣＰＫＣＧＨＣＥＶＧＮＲＤＧＥＡＦＱＣＬＳＣＧＫＴＣＮＡＤＬＤＶＡＴＨＮＬＴＱＶＡＬＴＧＫＴＭＰＫＲＥＥＰＲＤＡＱＧＴＡＰＡＲＫＴＫＫＡＳＫＳＫＡＰＰＡＥＲＥＤＱＴＰＡＱＥＰＳＱＴＳ
＞ＣａｓΦ－３
ＭＥＫＥＩＴＥＬＴＫＩＲＲＥＦＰＮＫＫＦＳＳＴＤＭＫＫＡＧＫＬＬＫＡＥＧＰＤＡＶＲＤＦＬＮＳＣＱＥＩＩＧＤＦＫＰＰＶＫＴＮＩＶＳＩＳＲＰＦＥＥＷＰＶＳＭＶＧＲＡＩＱＥＹＹＦＳＬＴＫＥＥＬＥＳＶＨＰＧＴＳＳＥＤＨＫＳＦＦＮＩＴＧＬＳＮＹＮＹＴＳＶＱＧＬＮＬＩＦＫＮＡＫＡＩＹＤＧＴＬＶＫＡＮＮＫＮＫＫＬＥＫＫＦＮＥＩＮＨＫＲＳＬＥＧＬＰＩＩＴＰＤＦＥＥＰＦＤＥＮＧＨＬＮＮＰＰＧＩＮＲＮＩＹＧＹＱＧＣＡＡＫＶＦＶＰＳＫＨＫＭＶＳＬＰＫＥＹＥＧＹＮＲＤＰＮＬＳＬＡＧＦＲＮＲＬＥＩＰＥＧＥＰＧＨＶＰＷＦＱＲＭＤＩＰＥＧＱＩＧＨＶＮＫＩＱＲＦＮＦＶＨＧＫＮＳＧＫＶＫＦＳＤＫＴＧＲＶＫＲＹＨＨＳＫＹＫＤＡＴＫＰＹＫＦＬＥＥＳＫＫＶＳＡＬＤＳＩＬＡＩＩＴＩＧＤＤＷＶＶＦＤＩＲＧＬＹＲＮＶＦＹＲＥＬＡＱＫＧＬＴＡＶＱＬＬＤＬＦＴＧＤＰＶＩＤＰＫＫＧＶＶＴＦＳＹＫＥＧＶＶＰＶＦＳＱＫＩＶＰＲＦＫＳＲＤＴＬＥＫＬＴＳＱＧＰＶＡＬＬＳＶＤＬＧＱＮＥＰＶＡＡＲＶＣＳＬＫＮＩＮＤＫＩＴＬＤＮＳＣＲＩＳＦＬＤＤＹＫＫＱＩＫＤＹＲＤＳＬＤＥＬＥＩＫＩＲＬＥＡＩＮＳＬＥＴＮＱＱＶＥＩＲＤＬＤＶＦＳＡＤＲＡＫＡＮＴＶＤＭＦＤＩＤＰＮＬＩＳＷＤＳＭＳＤＡＲＶＳＴＱＩＳＤＬＹＬＫＮＧＧＤＥＳＲＶＹＦＥＩＮＮＫＲＩＫＲＳＤＹＮＩＳＱＬＶＲＰＫＬＳＤＳＴＲＫＮＬＮＤＳＩＷＫＬＫＲＴＳＥＥＹＬＫＬＳＫＲＫＬＥＬＳＲＡＶＶＮＹＴＩＲＱＳＫＬＬＳＧＩＮＤＩＶＩＩＬＥＤＬＤＶＫＫＫＦＮＧＲＧＩＲＤＩＧＷＤＮＦＦＳＳＲＫＥＮＲＷＦＩＰＡＦＨＫＡＦＳＥＬＳＳＮＲＧＬＣＶＩＥＶＮＰＡＷＴＳＡＴＣＰＤＣＧＦＣＳＫＥＮＲＤＧＩＮＦＴＣＲＫＣＧＶＳＹＨＡＤＩＤＶＡＴＬＮＩＡＲＶＡＶＬＧＫＰＭＳＧＰＡＤＲＥＲＬＧＤＴＫＫＰＲＶＡＲＳＲＫＴＭＫＲＫＤＩＳＮＳＴＶＥＡＭＶＴＡ＊
＞ＣａｓΦ－４
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＞ＣａｓΦ－５
ＭＳＳＬＰＴＰＬＥＬＬＫＱＫＨＡＤＬＦＫＧＬＱＦＳＳＫＤＮＫＭＡＧＫＶＬＫＫＤＧＥＥＡＡＬＡＦＬＳＥＲＧＶＳＲＧＥＬＰＮＦＲＰＰＡＫＴＬＶＶＡＱＳＲＰＦＥＥＦＰＩＹＲＶＳＥＡＩＱＬＹＶＹＳＬＳＶＫＥＬＥＴＶＰＳＧＳＳＴＫＫＥＨＱＲＦＦＱＤＳＳＶＰＤＦＧＹＴＳＶＱＧＬＮＫＩＦＧＬＡＲＧＩＹＬＧＶＩＴＲＧＥＮＱＬＱＫＡＫＳＫＨＥＡＬＮＫＫＲＲＡＳＧＥＡＥＴＥＦＤＰＴＰＹＥＹＭＴＰＥＲＫＬＡＫＰＰＧＶＮＨＳＩＭＣＹＶＤＩＳＶＤＥＦＤＦＲＮＰＤＧＩＶＬＰＳＥＹＡＧＹＣＲＥＩＮＴＡＩＥＫＧＴＶＤＲＬＧＨＬＫＧＧＰＧＹＩＰＧＨＱＲＫＥＳＴＴＥＧＰＫＩＮＦＲＫＧＲＩＲＲＳＹＴＡＬＹＡＫＲＤＳＲＲＶＲＱＧＫＬＡＬＰＳＹＲＨＨＭＭＲＬＮＳＮＡＥＳＡＩＬＡＶＩＦＦＧＫＤＷＶＶＦＤＬＲＧＬＬＲＮＶＲＷＲＮＬＦＶＤＧＳＴＰＳＴＬＬＧＭＦＧＤＰＶＩＤＰＫＲＧＶＶＡＦＣＹＫＥＱＩＶＰＶＶＳＫＳＩＴＫＭＶＫＡＰＥＬＬＮＫＬＹＬＫＳＥＤＰＬＶＬＶＡＩＤＬＧＱＴＮＰＶＧＶＧＶＹＲＶＭＮＡＳＬＤＹＥＶＶＴＲＦＡＬＥＳＥＬＬＲＥＩＥＳＹＲＱＲＴＮＡＦＥＡＱＩＲＡＥＴＦＤＡＭＴＳＥＥＱＥＥＩＴＲＶＲＡＦＳＡＳＫＡＫＥＮＶＣＨＲＦＧＭＰＶＤＡＶＤＷＡＴＭＧＳＮＴＩＨＩＡＫＷＶＭＲＨＧＤＰＳＬＶＥＶＬＥＹＲＫＤＮＥＩＫＬＤＫＮＧＶＰＫＫＶＫＬＴＤＫＲＩＡＮＬＴＳＩＲＬＲＦＳＱＥＴＳＫＨＹＮＤＴＭＷＥＬＲＲＫＨＰＶＹＱＫＬＳＫＳＫＡＤＦＳＲＲＶＶＮＳＩＩＲＲＶＮＨＬＶＰＲＡＲＩＶＦＩＩＥＤＬＫＮＬＧＫＶＦＨＧＳＧＫＲＥＬＧＷＤＳＹＦＥＰＫＳＥＮＲＷＦＩＱＶＬＨＫＡＦＳＥＴＧＫＨＫＧＹＹＩＩＥＣＷＰＮＷＴＳＣＴＣＰＫＣＳＣＣＤＳＥＮＲＨＧＥＶＦＲＣＬＡＣＧＹＴＣＮＴＤＦＧＴＡＰＤＮＬＶＫＩＡＴＴＧＫＧＬＰＧＰＫＫＲＣＫＧＳＳＫＧＫＮＰＫＩＡＲＳＳＥＴＧＶＳＶＴＥＳＧＡＰＫＶＫＫＳＳＰＴＱＴＳＱＳＳＳＱＳＡＰ＊
＞ＣａｓΦ－６
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＞ＣａｓΦ－７
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＞ＣａｓΦ－８
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＞ＣａｓΦ－９
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＞ＣａｓΦ－１０
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上記の配列中のアスタリスク（＊）は、終止コドンを示す。あるいは、ＣａｓΦ－１は、Ｃａｓ１２ｊオーソログ１とも呼ばれる。したがって、ＣａｓΦ－１、ＣａｓΦ－１０はまた、それぞれ、Ｃａｓ１２ｊオーソログ１、１０とも称され得る。

ガイドポリヌクレオチド
一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語およびその文法的等価物は、標的ＤＮＡに特異的であり、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができるＲＮＡを指し得る。ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに「誘導（ｇｕｉｄｉｎｇ）」するのを支援し得る。Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖または環状ｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ分解的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まず、エンドヌクレアーゼ分解的に切断され、次いで、３’－５’エキソヌクレアーゼ分解的にトリミングされる。本質的に、ＤＮＡ結合およびＤＮＡ切断は、典型的には、タンパク質および両方のＲＮＡを必要とする。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の態様を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作することができる。例えば、ＪｉｎｅｋＭ．，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己の区別を助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知である（例えば、“ＣｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎＭ１ｓｔｒａｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ．”ＦｅｒｒｅｔｔｉＪ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）、“ＣＲＩＳＰＲＲＮＡｍａｔｕｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌＲＮＡａｎｄｈｏｓｔｆａｃｔｏｒＲＮａｓｅＩＩＩ．”ＤｅｌｔｃｈｅｖａＥ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４７１：６０２－６０７（２０１１）、および“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ．”ＪｉｎｅｋＭ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい。それらの各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ９オーソログは、これらに限定されないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む様々な種で記載されている。さらなる好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであり得、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，“ＴｈｅｔｒａｃｒＲＮＡａｎｄＣａｓ９ｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｔｙｐｅＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｉｍｍｕｎｉｔｙｓｙｓｔｅｍｓ”（２０１３）ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ１０：５，７２６－７３７に開示されている生物および遺伝子座に由来するＣａｓ９配列が含まれる（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例えば、不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有し、すなわち、Ｃａｓ９は、ニッカーゼである。

一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」）である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を標的ヌクレオチド配列に誘導するためのＰＡＭ配列を必要としない。

本明細書に開示される塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ由来ドメイン）は、ガイドポリヌクレオチドと会合することによって、標的ポリヌクレオチド配列を認識することができる。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、典型的には一本鎖であり、部位特異的に（すなわち、相補的な塩基対形成を介して）ポリヌクレオチドの標的配列に結合するようにプログラムすることができ、それによって、ガイド核酸と併せて塩基エディターを標的配列に誘導する。ガイドポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。当業者に理解されるように、ガイドポリヌクレオチド配列において、配列中のチミン（Ｔ）が、ウラシル（Ｕ）で置き換えられる。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチド（例えば、アデノシン）を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、非天然（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ）（または、非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ））ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸またはヌクレオチド類似体）を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸配列の標的領域は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。ガイド核酸の標的領域は、１０～３０ヌクレオチド長、または１５～２５ヌクレオチド長、または１５～２０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、特に、５’末端の１、２、３、４ヌクレオチドなどが切断され得る。非限定的な例として、２０ヌクレオチド長のガイドポリヌクレオチドは、特に、５’末端の１、２、３、４ヌクレオチドなどが切断され得る。

一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、２つ以上の個々のポリヌクレオチドを含み、例えば、相補的な塩基対形成（例えば、デュアルガイドポリヌクレオチド）を介して、互いに相互作用し得る。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、１つ以上のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）による核酸の標的化は、典型的には、標的配列を認識する配列を含む第１のＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体を安定化する足場領域を形成する反復配列を含む第２のＲＮＡ分子（ｔｒＲＮＡ）との間の相補的な塩基対形成を必要とする。かかるデュアルガイドＲＮＡシステムは、本明細書に開示される塩基エディターを標的ポリヌクレオチド配列に誘導するためのガイドポリヌクレオチドとして用いられ得る。

一部の実施形態では、本発明に提供される塩基エディターは、シングルガイドポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、本発明に提供される塩基エディターは、デュアルガイドポリヌクレオチド（例えば、デュアルｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、１つ以上のガイドポリヌクレオチド（例えば、マルチプルｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、シングルガイドポリヌクレオチドは、本明細書に記載の異なる塩基エディター用に利用される。例えば、シングルガイドポリヌクレオチドは、シチジン塩基エディターおよびアデノシン塩基エディター用に利用され得る。

他の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、単一分子（すなわち、単一分子ガイド核酸）中の核酸のポリヌクレオチド標的化部分と核酸の足場部分との両方を含むことができる。例えば、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）であり得る。本明細書において、ガイドポリヌクレオチド配列という用語は、塩基エディターと相互作用し、標的ポリヌクレオチド配列に誘導し得る任意のシングル、デュアル、またはマルチプル核酸を企図する。

典型的には、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｃｒＲＮＡ／ｔｒＲＮＡ複合体またはｇＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列を認識して結合することができる配列を含む「ポリヌクレオチド標的化セグメント」、および塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン成分内のガイドポリヌクレオチドを安定化する「タンパク質結合セグメント」を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的化セグメントは、ＤＮＡポリヌクレオチドを認識して結合し、それによって、ＤＮＡ中の塩基の編集を促進する。他の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的化セグメントは、ＲＮＡポリヌクレオチドを認識して結合し、それによって、ＲＮＡ中の塩基の編集を促進する。本明細書において、「セグメント」とは、分子のセクションまたは領域、例えば、ガイドポリヌクレオチド内のヌクレオチドの連続したストレッチを指す。セグメントはまた、セグメントが複数の分子の領域を含むことができるような、複合体の領域／セクションも指し得る。例えば、ガイドポリヌクレオチドが複数の核酸分子を含む場合、のタンパク質結合セグメントは、例えば、相補領域に沿ってハイブリダイズする複数の別個の分子の全部または一部を含み得る。一部の実施形態では、２つの別個の分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、（ｉ）長さが１００塩基対である第１のＲＮＡ分子の４０～７５塩基対、および（ｉｉ）長さが５０塩基対である第２のＲＮＡ分子の１０～２５塩基対、を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈において別途具体的に定義されない限り、特定の数の総塩基対に限定されず、所与のＲＮＡ分子からの任意の特定の数の塩基対に限定されず、複合体内の特定の数の別個の分子に限定されず、任意の全長であり、かつ他の分子と相補性を有する領域を含み得るＲＮＡ分子の領域を含み得る。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、２つ以上のＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの一部分（例えば、機能部分）の融合によって形成される一本鎖ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む場合がある。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡであり得る。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。

上述のように、ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、単離されたガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡおよびプロモーターをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡを用いて、細胞をトランスフェクトすることによって、細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、ウイルス媒介性遺伝子送達を使用するなどの他の方法で、細胞内に導入することもできる。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、単離され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態で細胞または生物にトランスフェクトされ得る。ガイドＲＮＡは、当該技術分野で既知の任意のインビトロ転写システムを使用して、インビトロ転写によって調製することができる。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたＲＮＡの形態で、細胞に導入され得る。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、３つの領域（染色体配列における標的部位に相補的であり得る５’末端の第１の領域、ステム・ループ構造を形成し得る第２の内部領域、および一本鎖であり得る第３の３’領域）を含むことができる。各ガイドＲＮＡの第１の領域も、各ガイドＲＮＡが融合タンパク質を特定の標的部位に誘導するように異なり得る。さらに、各ガイドＲＮＡの第２の領域および第３の領域は、すべてのガイドＲＮＡにおいて同一であり得る。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの第１の領域は、ガイドＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対を形成することができるように、染色体配列中の標的部位の配列に相補的であり得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、約１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド（すなわち、１０ヌクレオチド～ヌクレオチド、もしくは約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、もしくは１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、もしくは約１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド）、またはそれ以上を含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対形成の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長、もしくはそれ以上であり得るか、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長、もしくは約それ以上であり得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド長であり得るか、または約１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド長であり得る。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、二次構造を形成する第２の領域も含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含むことができる。ループおよびステムの長さは、異なり得る。例えば、ループは、３～１０ヌクレオチド長または約３～１０ヌクレオチド長の範囲であり得、ステムは、６～２０塩基対長または約６～２０塩基対長の範囲であり得る。ステムは、１～１０ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチドの１つ以上のバルジを含むことができる。第２の領域の全長は、１６～６０ヌクレオチド長または約１６～６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、ループは、約４ヌクレオチド長または約４ヌクレオチド長であり得、ステムは、１２塩基対長または約１２塩基対であり得る。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、本質的に一本鎖であり得る３’末端の第３の領域を含むことができる。例えば、第３の領域は、目的の細胞における任意の染色体配列に対して相補的ではない場合があり、ガイドＲＮＡの残部に対して相補的ではない場合がある。さらに、第３の領域の長さは、異なり得る。第３の領域は、４ヌクレオチド長以上または約４ヌクレオチド長以上であり得る。例えば、第３の領域の長さは、５～６０ヌクレオチド長または約５～６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、遺伝子標的の任意のエキソンまたはイントロンを標的とすることができる。一部の実施形態では、ガイドは、遺伝子のエキソン１またはエキソン２を標的とすることができ、他の実施形態では、ガイドは、遺伝子のエキソン３またはエキソン４を標的とすることができる。組成物は、すべて同じエキソンを標的とする複数のガイドＲＮＡを含むことができ、または一部の実施形態では、異なるエキソンを標的とすることができる複数のガイドＲＮＡを含むことができる。遺伝子のエキソンおよびイントロンを標的とすることができる。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、２０ヌクレオチドまたは約２０ヌクレオチドの核酸配列を標的とすることができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満または約２０ヌクレオチド未満であり得る。標的核酸は、少なくともまたは少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、または１～１００ヌクレオチド長の任意の長さであり得る。標的核酸は、最大または最大約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、または１～１００ヌクレオチド長の任意の長さであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ５’の２０塩基または約２０塩基であり得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列を標的とすることができる。標的核酸は、少なくともまたは少なくとも約１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、または１～１００ヌクレオチドであり得る。

ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、別の核酸（例えば、細胞のゲノム中の標的核酸またはプロトスペーサー）にハイブリダイズすることができる核酸を指し得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。ガイドポリヌクレオチドは、部位特異的に核酸の配列に結合するようにプログラムまたは設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖を含み得、シングルガイドポリヌクレオチドと呼ぶことができる。ガイドポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、ダブルガイドポリヌクレオチドと呼ぶことができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、インビトロで転写され得、および／または化学的に合成され得る。ＲＮＡは、合成ＤＮＡ分子、例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片から転写され得る。次いで、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、非ＲＮＡ核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の形態で細胞または胚に導入することもできる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚におけるガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。ガイドＲＮＡを発現するために使用され得るプラスミドベクターには、ｐｘ３３０ベクターおよびｐｘ３３３ベクターが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プラスミドベクター（例えば、ｐｘ３３３ベクター）は、少なくとも２つのガイドＲＮＡコードＤＮＡ配列を含むことができる。

ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）および標的化配列を選択、設計、および検証するための方法は、本明細書に記載されており、当業者に既知である。例えば、核酸塩基エディターシステムのデアミナーゼドメイン（例えば、ＡＩＤドメイン）の潜在的な基質混乱の影響を最小化するために、非意図的に脱アミノ化の標的となり得る残基（例えば、標的核酸遺伝子座内のｓｓＤＮＡ上に潜在的に存在し得るオフターゲットのＣ残基）の数を最小化してもよい。さらに、ソフトウェアツールを使用して、標的核酸配列に対応するｇＲＮＡを最適化し、例えば、ゲノムにわたって総オフターゲット活性を最小化することができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９を使用する各可能な標的化ドメインの選択の場合、すべてのオフターゲット配列（前述の選択されたＰＡＭ、例えば、ＮＡＧまたはＮＧＧ）は、最大で一定数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の不一致塩基対を含むゲノムにわたって特定され得る。標的部位に相補的なｇＲＮＡの第１の領域を特定することができ、すべての第１の領域（例えば、ｃｒＲＮＡ）は、その総予測オフターゲットスコアに従ってランク付けすることができ、上位の標的化ドメインは、最大のオンターゲット活性および最小のオフターゲット活性を有する可能性が高いものを表す。ｇＲＮＡを標的とする候補は、当該技術分野で既知である方法、および／または本明細書に記載の方法を使用することによって機能的に評価することができる。

非限定的な例として、Ｃａｓ９を使用するガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡにおける標的ＤＮＡがハイブリダイズする配列は、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して特定することができる。ｇＲＮＡの設計は、公的ツールベースのカスタムｇＲＮＡ設計ソフトウェアであるｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒを使用して実施してもよい（ＢａｅＳ．，ＰａｒｋＪ．，＆ＫｉｍＪ．－Ｓ．Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ：Ａｆａｓｔａｎｄｖｅｒｓａｔｉｌｅａｌｇｏｒｉｔｈｍｔｈａｔｓｅａｒｃｈｅｓｆｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓｏｆＣａｓ９ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３０，１４７３－１４７５（２０１４）に記載されている）。このソフトウェアは、ゲノム全体のオフターゲット傾向を計算した後、ガイドをスコア付けする。典型的には、長さが１７～２４の範囲のガイドの場合、完全一致から７つの不一致までの範囲の一致が考慮される。オフターゲット部位が計算的に決定されると、各ガイドについて集計スコアが計算され、ウェブインターフェースを使用して表形式出力で要約される。本ソフトウェアは、ＰＡＭ配列に隣接する潜在的な標的部位を特定することに加えて、選択された標的部位から１、２、３個、または３個超のヌクレオチドが異なるすべてのＰＡＭ隣接配列も特定する。標的核酸配列（例えば、標的遺伝子）のゲノムＤＮＡ配列を取得してもよく、公的に利用可能なツール（例えば、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラム）を使用して、反復エレメントをスクリーニングしてもよい。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、入力ＤＮＡ配列を、反復エレメントおよび低複雑度領域について検索する。出力は、所与のクエリ配列に存在する反復の詳細な注釈である。

特定後、ガイドＲＮＡの第１の領域（例えば、ｃｒＲＮＡ）を、標的部位までのそれらの距離、それらの直交性、および関連するＰＡＭ配列との密接な一致についての５’ヌクレオチドの存在に基づいて（例えば、関連するＰＡＭ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＮＧＧＰＡＭ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶＰＡＭ）を含むヒトゲノム内の密接な一致の特定に基づく５’Ｇ）、階層にランク付けしてもよい。本明細書で使用される場合、直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）は、標的配列に対する最小数の不一致を含むヒトゲノム内の配列の数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、ヒトゲノム中に、意図された標的以外に同一の配列を有しないか、または標的配列中に１つもしくは２つの不一致を含む任意の配列も有しない２０量体の標的化ドメインを指し得る。良好な直交性を有する標的化ドメインは、オフターゲットＤＮＡ切断を最小化するために選択され得る。

一部の実施形態では、レポーターシステムを使用して、塩基編集活性を検出し、候補ガイドポリヌクレオチドを試験することができる。一部の実施形態では、レポーターシステムは、塩基編集活性がレポーター遺伝子の発現につながるレポーター遺伝子ベースのアッセイを含み得る。例えば、レポーターシステムは、非活性化開始コドン（例えば、鋳型鎖上の３’－ＴＡＣ－５’から３’－ＣＡＣ－５’への変異）を含むレポーター遺伝子を含み得る。標的Ｃの脱アミノ化に成功すると、対応するｍＲＮＡは、５’－ＧＵＧ－３’の代わりに５’－ＡＵＧ－３’として転写され、レポーター遺伝子の翻訳を可能にする。好適なレポーター遺伝子は、当業者には明らかであろう。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする遺伝子、または当業者にとって検出可能であり、かつ明らかな任意の他の遺伝子が挙げられる。レポーターシステムを使用して、例えば、標的ＤＮＡ配列に関して、それぞれのデアミナーゼが標的とするヌクレオチド残基を決定するために、多くの異なるｇＲＮＡを試験することができる。非鋳型鎖ヌクレオチド残基を標的とするｓｇＲＮＡもまた、特定の塩基編集タンパク質（例えば、Ｃａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質）のオフターゲット効果を評価するために試験することができる。一部の実施形態では、このようなｇＲＮＡは、変異した開始コドンがｇＲＮＡと塩基対を形成しないように設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、標準ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン）、ヌクレオチド異性体、および／またはヌクレオチド類似体を含むことができる。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは少なくとも１つの検出可能な標識を含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏタグ、または任意の他の好適な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であり得る。

ガイドポリヌクレオチドは、化学的および／または酵素的に合成することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、標準的なホスホロアミダイトベースの固相合成法を使用して合成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結することによって、インビトロで合成することができる。好適なファージプロモーター配列の例としては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらのバリエーションが挙げられる。ガイドＲＮＡが２つの別個の分子（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む実施形態では、ｃｒＲＮＡを化学的に合成することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡを酵素的に合成することができる。

一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、複数のガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、塩基エディターを、１つ以上の標的遺伝子座（例えば、少なくとも１個（１）のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、または少なくとも５０個のｇＲＮＡ）に標的指向化させることができる。一部の実施形態では、複数のｇＲＮＡ配列は、直列に配置することができ、好ましくは、直列反復（ｄｉｒｅｃｔｒｅｐｅａｔ）によって分離される。

ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列もまた、ベクターの一部であり得る。一部の実施形態では、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、ＧＦＰまたはピューロマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含む。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ分子は、環状または直鎖状であり得る。

一部の実施形態では、塩基エディターシステムの１つ以上の成分は、ＤＮＡ配列によってコードされ得る。かかるＤＮＡ配列は、発現システム（例えば、細胞）に、一緒にまたは別々に導入され得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、細胞に導入されてもよく、各ＤＮＡ配列は、別個の分子（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのコード配列を含む１つのベクター、およびガイドＲＮＡのコード配列を含む第２のベクター）の一部であってもよく、または両方とも同じ分子（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとガイドＲＮＡの両方のコード配列（および調節配列）を含む１つのベクター）の一部であってもよい。

ガイドポリヌクレオチドは、新しい特徴または増強された特徴を有する核酸を提供するために、１つ以上の修飾を含むことができる。ガイドポリヌクレオチドは、核酸親和性タグを含むことができる。ガイドポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含むことができる。

一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、修飾を含むことができる。修飾は、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの任意の位置で行われ得る。単一のｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドに対して、２つ以上の修飾を行うことができる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、修飾後に、品質管理に供され得る。一部の実施形態では、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの修飾は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。

また、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９，３’－３’修飾、５’－５’修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’－デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’－デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ウォブル／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’－フルオロＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－三リン酸、５’－メチルシチジン－５’－三リン酸、またはそれらの任意の組み合わせによって修飾されてもよい。

一部の実施形態では、修飾は、持続的である。他の実施形態では、修飾は、一過的である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドに、複数の修飾が行われる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチド修飾は、ヌクレオチドの生理化学的特性（例えば、ヌクレオチドの立体構造、極性、疎水性、化学反応性、塩基対相互作用、またはそれらの任意の組み合わせ）を変化させることができる。

修飾は、ホスホロチオエート置換体であり得る。一部の実施形態では、天然のホスホジエステル結合は、細胞のヌクレアーゼによる急速な分解を受けやすく、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換体を使用するヌクレオチド間結合の修飾は、細胞分解による加水分解に対してより安定であり得る。修飾は、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドにおける安定性を増加させることができる。修飾はまた、生物学的活性を増強することもできる。一部の実施形態では、ホスホロチオエート増強型ＲＮＡのｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＴ１、仔牛血清ヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、インビボまたはインビトロでヌクレアーゼに曝露される可能性が高い用途において、ＰＳ－ＲＮＡｇＲＮＡの使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、ｇＲＮＡの５’末端または’’末端の最後の３～５ヌクレオチド間に導入して、エキソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。一部の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減するために、ｇＲＮＡ全体にわたって付加することができる。

一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、スプライス部位（すなわち、スプライスアクセプター（ＳＡ）またはスプライスドナー（ＳＤ））を破壊するように設計される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、塩基編集が未熟終止コドンをもたらすように設計される。表４Ａ～４Ｂは、スプライス部位を破壊するか、または未熟終止コドンをもたらすように設計されたｇＲＮＡ標的配列の非網羅的なリストを提供する。

プロトスペーサー隣接モチーフ
「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」またはＰＡＭ様モチーフという用語は、ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫系において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって標的化されるＤＮＡ配列の直後の２～６塩基対のＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＰＡＭは、５’ＰＡＭであり得る（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’ＰＡＭであり得る（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）。ＰＡＭ配列は、標的結合に必須であるが、正確な配列はＣａｓタンパク質の種類に依存する。ＰＡＭ配列は、当該技術分野で既知の任意のＰＡＭ配列であり得る。好適なＰＡＭ配列には、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＮ、ＮＧＴ、ＮＧＴＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＣＧ、ＮＧＴＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＴＴＴＶ、ＴＹＣＶ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡＷ、またはＮＡＡＡＡＣが含まれるが、これらに限定されない。Ｙは、ピリミジンであり、Ｎは、任意のヌクレオチド塩基であり、Ｗは、ＡまたはＴである。

本明細書に提供される塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインを含むことができ、これは、正準または非正準プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含むヌクレオチド配列に結合することができる。ＰＡＭ部位は、標的ポリヌクレオチド配列に近接したヌクレオチド配列である。本開示の一部の態様は、塩基エディターを提供し、異なるＰＡＭ特異性を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部を含む。

例えば、典型的には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｓｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９などのＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために正準ＮＧＧＰＡＭ配列を必要とする（ここで、「ＮＧＧ」における「Ｎ」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇは、グアニンである）。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質特異的であり得、異なるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインを含む異なる塩基エディター間で異なり得る。ＰＡＭは、標的配列の５’または３’であり得る。ＰＡＭは、標的配列の上流または下流であり得る。ＰＡＭは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。多くの場合、ＰＡＭは、２～６ヌクレオチド長である。

一部の実施形態では、ＰＡＭは、「ＮＲＮ」ＰＡＭであるか（ここで、「ＮＲＮ」の「Ｎ」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｒは、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）である）、またはＰＡＭは、「ＮＹＮ」ＰＡＭである（ここで、「ＮＹＮ」の「Ｎ」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｙは、シチジン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）である）。例えば、Ｒ．Ｔ．Ｗａｌｔｏｎｅｔａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂａ８８５３（２０２０）に記載されている（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

以下の表５に、いくつかのＰＡＭバリアントを記載する。

一部の実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＣである。一部の実施形態では、ＮＧＣＰＡＭは、Ｃａｓ９バリアントによって認識される。一部の実施形態では、ＮＧＣＰＡＭバリアントは、Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む（総称して「ＭＱＫＦＲＡＥＲ」）。

一部の実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＴである。一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭは、Ｃａｓ９バリアントによって認識される。一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、１つ以上の残基１３３５、１３３７、１１３５、１１３６、１２１８、および／または１２１９における標的化変異導入を介して作製される。一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、１つ以上の残基１２１９、１３３５、１３３７、１２１８における標的化変異導入を介して作製される。一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、１つ以上の残基１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、および１３３５における標的化変異導入を介して作製される。一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、以下の表６Ａおよび６Ｂに提供される標的化変異導入のセットから選択される。

一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、表６Ａおよび表６Ｂのバリアント５、７、２８、３１、または３６から選択される。一部の実施形態では、バリアントは、改善されたＮＧＴＰＡＭ認識を有する。

一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、残基１２１９、１３３５、１３３７、および／または１２１８に変異を有する。一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭバリアントは、認識を改善するための変異を有する、以下の表７に提供されるバリアントから選択される。

一部の実施形態では、ＮＧＴＰＡＭは、以下の表８に提供されるバリアントから選択される。

一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント１である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント２である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント３である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント４である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント５である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントは、バリアント６である。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｄ９Ｘ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘは、Ｄを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｄ９Ａ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、非正準ＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。

一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｇ１２１８Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のうちのいずれかにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかのＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載のＣａｓ９ポリペプチドと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかのＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載される任意のＣａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかのＣａｓ９ドメインは、本明細書において記載の任意のＣａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。

一部の実施例では、本明細書に開示される塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインによって認識されるＰＡＭは、塩基エディターをコードする挿入物（例えば、ＡＡＶ挿入物）に別個に対するオリゴヌクレオチド上で、細胞に提供され得る。かかる実施形態では、別個のオリゴヌクレオチド上にＰＡＭを提供することで、標的配列の切断を可能になり、さもなければ、隣接するＰＡＭが標的配列と同じポリヌクレオチド上に存在しないため、切断することができない。

一実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、ゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして使用することができる。ただし、他のものも使用することができる。一部の実施形態では、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、特定のゲノム標的を標的とすることができる。一部の実施形態では、非ＮＧＧＰＡＭ配列を有する合成ＳｐＣａｓ９由来バリアントを使用することができる。加えて、様々な種に由来する他のＣａｓ９オーソログが同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、本開示にも有用であり得る様々なＰＡＭ配列に結合することができる。例えば、比較的大きなサイズのＳｐＣａｓ９（約４ｋｂのコード配列）は、細胞内で効率的に発現され得ないＳｐＣａｓ９ｃＤＮＡを有するプラスミドをもたらす可能性がある。逆に、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりも約１キロ塩基短く、おそらく、細胞内でそれを効率的に発現させる。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、インビトロおよびマウスにおけるインビボで、哺乳動物細胞の標的遺伝子を修飾することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、Ｃａｓ９ＰＡＭ、５’－ＮＧＧに隣接し得る。他の実施形態では、他のＣａｓ９オーソログは、異なるＰＡＭ要件を有し得る。例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＣＲＩＳＰＲ１では５’－ＮＮＡＧＡＡ、ＣＲＩＳＰＲ３では５’－ＮＧＧＮＧ）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ）などの他のＰＡＭも、標的遺伝子に隣接して見出され得る。

一部の実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓシステムの場合、標的遺伝子配列は、５’－ＮＧＧＰＡＭに先行し得る（すなわち、５’側）。２０ｎｔガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭに隣接するＣａｓ９切断を媒介するために、反対側の鎖と塩基対を形成し得る。一部の実施形態では、隣接カットは、ＰＡＭの３塩基対上流であり得るか、または約１０塩基対上流であり得る。一部の実施形態では、隣接カットは、ＰＡＭの１０塩基対上流であり得るか、または約１０塩基対上流であり得る。一部の実施形態では、隣接カットは、ＰＡＭの０～２０塩基対上流であり得るか、または約０～２０塩基対上流であり得る。例えば、隣接カットは、ＰＡＭの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対上流に隣接し得る。隣接カットは、ＰＡＭの１～３０塩基対下流であり得る。ＰＡＭ配列に結合することができる例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質の配列は、以下のとおりである。

例示的なＰＡＭ結合ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

例示的なＰＡＭ結合ＳｐＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

例示的なＰＡＭ結合ＳｐＥＱＲＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESVLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

上記の配列では、残基Ｅ１１３５、Ｑ１３３５、およびＲ１３３７が、下線および太字で示されている（Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７から変異させて、ＳｐＥＱＲＣａｓ９を得ることができる）。

例示的なＰＡＭ結合ＳｐＶＱＲＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

上記の配列では、残基Ｖ１１３５、Ｑ１３３５、およびＲ１３３７が、下線および太字で示されている（Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７から変異させて、ＳｐＶＱＲＣａｓ９を得ることができる）。

例示的なＰＡＭ結合ＳｐＶＲＥＲＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.

上記の配列では、残基Ｖ１１３５、Ｒ１２１８、Ｑ１３３５、およびＲ１３３７が、下線および太字で示されている（Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７から変異させて、ＳｐＶＲＥＲＣａｓ９を得ることができる）。

一部の実施形態では、操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、３’Ｈ（非ＧＰＡＭ）に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識することができる（表３Ａ～３Ｄを参照されたい）。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＮＲＮＨＰＡＭを認識する（ここで、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＴである）。一部の実施形態では、非ＧＰＡＭは、ＮＲＲＨ、ＮＲＴＨ、またはＮＲＣＨである（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＳｐＣａｓ９ｖａｒｉａｎｔｓｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｗｉｔｈｎｏｎ－ＧＰＡＭｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）を参照されたい（その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、組換えＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、組換えＣａｓ９ドメインは、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳｐｙＭａｃＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳｐｙＭａｃＣａｓ９（ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ｄ）、またはＳｐｙＭａｃＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非正準ＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＡＡＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。

天然の５’－ＮＡＡＮ－３’ＰＡＭ特異性を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍａｃａｃａｅにおける例示的なＣａｓ９Ａホモログの配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｊａｋｉｍｏｅｔａｌ．，（ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｂｉｏｒｘｉｖ／ｅａｒｌｙ／２０１８／０９／２７／４２９６５４．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ）に記載されており、以下に提供される。

ＳｐｙＭａｃＣａｓ９
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＤＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＧＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＡＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＩＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＲＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＲＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＳＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＡＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＧＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＨＳＬＨＥＱＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＩＶＤＥＬＶＫＶＭＧＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＩＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＩＱＴＶＧＱＮＧＧＬＦＤＤＮＰＫＳＰＬＥＶＴＰＳＫＬＶＰＬＫＫＥＬＮＰＫＫＹＧＧＹＱＫＰＴＴＡＹＰＶＬＬＩＴＤＴＫＱＬＩＰＩＳＶＭＮＫＫＱＦＥＱＮＰＶＫＦＬＲＤＲＧＹＱＱＶＧＫＮＤＦＩＫＬＰＫＹＴＬＶＤＩＧＤＧＩＫＲＬＷＡＳＳＫＥＩＨＫＧＮＱＬＶＶＳＫＫＳＱＩＬＬＹＨＡＨＨＬＤＳＤＬＳＮＤＹＬＱＮＨＮＱＱＦＤＶＬＦＮＥＩＩＳＦＳＫＫＣＫＬＧＫＥＨＩＱＫＩＥＮＶＹＳＮＫＫＮＳＡＳＩＥＥＬＡＥＳＦＩＫＬＬＧＦＴＱＬＧＡＴＳＰＦＮＦＬＧＶＫＬＮＱＫＱＹＫＧＫＫＤＹＩＬＰＣＴＥＧＴＬＩＲＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＶＤＬＳＫＩＧＥＤ．

一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ポリペプチドが標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する能力が低下するように、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ変異を有する。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。別の非限定的な例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ変異を有し、そのため、ポリペプチドが標的ＤＮＡを切断する能力が低下している。かかるＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低下しているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質がＷ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ変異を有する場合、またはバリアントＣａｓ９タンパク質がＰ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ変異を有する場合、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列に効率的に結合しない。したがって、一部のかかる事例では、このようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法に使用される場合、本方法は、ＰＡＭ配列を必要としない。言い換えると、一部の実施形態では、このようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法に使用される場合、本方法は、ガイドＲＮＡを含み得るが、本方法は、ＰＡＭ配列の不在下で実施することができる（したがって、結合の特異性が、ガイドＲＮＡの標的化セグメントによって提供される）。他の残基を変異させて、上記の効果を達成することができる（すなわち、一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７を改変（すなわち、置換）することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。

一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、正準ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を有するＣａｓ９タンパク質の全部または一部を含み得る。他の実施形態では、塩基エディターのＣａｓ９由来ドメインは、非正準ＰＡＭ配列を用いることができる。かかる配列は当該技術分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非正準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，“ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｗｉｔｈａｌｔｅｒｅｄＰＡＭｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ５２３，４８１－４８５（２０１５）、およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，“ＢｒｏａｄｅｎｉｎｇｔｈｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｒａｎｇｅｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｂｙｍｏｄｉｆｙｉｎｇＰＡＭｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３，１２９３－１２９８（２０１５）、Ｒ．Ｔ．Ｗａｌｔｏｎｅｔａｌ．“Ｕｎｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｇｅｎｏｍｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｗｉｔｈｎｅａｒ－ＰＡＭｌｅｓｓｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｖａｒｉａｎｔｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂａ８８５３（２０２０）、Ｈｕｅｔａｌ．“ＥｖｏｌｖｅｄＣａｓ９ｖａｒｉａｎｔｓｗｉｔｈｂｒｏａｄＰＡＭｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｈｉｇｈＤＮＡｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｎａｔｕｒｅ，２０１８Ａｐｒ．５，５５６（７６９９），５７－６３、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，“ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＳｐＣａｓ９ｖａｒｉａｎｔｓｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｗｉｔｈｎｏｎ－ＧＰＡＭｓ”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０２０Ａｐｒ；３８（４）：４７１－４８１に記載されている（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

排他性が低下したＣａｓ９ドメイン
典型的には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｓｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９などのＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために正準ＮＧＧＰＡＭ配列を必要とする（ここで、「ＮＧＧ」における「Ｎ」は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇは、グアノシンである）。これにより、ゲノム内で所望の塩基を編集する能力が制限され得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置（例えば、ＰＡＭの上流にある標的塩基を含む領域）に配置される必要があり得る。例えば、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、正準（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含まないヌクレオチド配列に結合することができるＣａｓ９ドメインを含み得る。非正準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、当該技術分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非正準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，“ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｗｉｔｈａｌｔｅｒｅｄＰＡＭｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ５２３，４８１－４８５（２０１５）、およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，“ＢｒｏａｄｅｎｉｎｇｔｈｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｒａｎｇｅｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｂｙｍｏｄｉｆｙｉｎｇＰＡＭｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３，１２９３－１２９８（２０１５）に記載されている（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

内部挿入を有する融合タンパク質
核酸プログラマブル核酸結合タンパク質（例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐ）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質が本明細書に提供される。異種ポリペプチドは、天然または野生型ｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチド配列には見られないポリペプチドであり得る。異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端、またはｎａｐＤＮＡｂｐの内部の位置に挿入されたｎａｐＤＮＡｂｐに融合することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐの内部位置に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、デアミナーゼまたはその機能的断片である。例えば、融合タンパク質は、Ｎ末端断片に隣接するデアミナーゼと、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１）ポリペプチドのＣ末端断片とを含むことができる。融合タンパク質中のデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼであってもよい。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１）である。融合タンパク質中のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０またはＴａｄＡ＊８）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡ＊８またはＴａｄＡ＊９である。本明細書に記載されるＴａｄＡ配列（例えば、ＴａｄＡ７．１０またはＴａｄＡ＊８）は、上記の融合タンパク質に好適なデアミナーゼである。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造を含む：
ＮＨ２－［ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端断片］－［デアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端断片］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ９のＮ末端断片］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２のＮ末端断片］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ９のＮ末端断片］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２のＮ末端断片］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２のＣ末端断片］－ＣＯＯＨ、
式中、「］－［」の各事例は、任意のリンカーである。

デアミナーゼは、円順列変異体（ｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｎｔ）デアミナーゼであり得る。例えば、デアミナーゼは、円順列変異体アデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、デアミナーゼは、円順列変異体ＴａｄＡであり、アミノ酸残基１１６（ＴａｄＡ参照配列において番号付けされている）で円順列変異導入されている。一部の実施形態では、デアミナーゼは、円順列変異体ＴａｄＡであり、アミノ酸残基１３６（ＴａｄＡ参照配列において番号付けされている）で円順列変異導入されている。一部の実施形態では、デアミナーゼは、円順列変異体ＴａｄＡであり、アミノ酸残基６５（ＴａｄＡ参照配列において番号付けされている）で円順列変異導入されている。

融合タンパク質は、複数のデアミナーゼを含むことができる。融合タンパク質は、例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は１つのデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つのデアミナーゼを含む。融合タンパク質中の２つ以上のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはそれらの組み合わせであってもよい。２つ以上のデアミナーゼは、ホモ二量体であり得る。２つ以上のデアミナーゼは、ヘテロ二量体であり得る。２つ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐにおいて直列に挿入され得る。一部の実施形態では、２つ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐにおいて直列ではない場合がある。

一部の実施形態では、融合タンパク質中のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片である。Ｃａｓ９ポリペプチドは、バリアントＣａｓ９ポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドまたはその断片である。融合タンパク質中のＣａｓ９ポリペプチドは、全長Ｃａｓ９ポリペプチドであり得る。場合によっては、融合タンパク質中のＣａｓ９ポリペプチドは、全長Ｃａｓ９ポリペプチドではない場合がある。Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、天然に存在するＣａｓ９タンパク質に対して、Ｎ末端またはＣ末端で切断され得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、円順列変異導入Ｃａｓ９タンパク質であり得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドの断片、部分、またはドメインであり得、標的ポリヌクレオチドおよびガイド核酸配列に依然として結合することができる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、またはそれらの断片もしくはバリアントである。

融合タンパク質のＣａｓ９ポリペプチドは、天然に存在するＣａｓ９ポリペプチドと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

融合タンパク質のＣａｓ９ポリペプチドは、以下に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列（以下、「Ｃａｓ９参照配列」と称される）と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
（一重下線：ＨＮＨドメイン、二重下線：ＲｕｖＣドメイン）。

Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片に隣接する異種触媒ドメインを含む融合タンパク質は、本明細書に記載される方法における塩基編集にも有用である。Ｃａｓ９および１つ以上のデアミナーゼドメインを含む（例えば、アデノシンデアミナーゼ、またはＣａｓ９配列に隣接するアデノシンデアミナーゼドメインを含む）融合タンパク質は、標的配列の非常に特異的かつ効率的な塩基編集にも有用である。一実施形態では、キメラＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチド内に挿入された異種触媒ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、アデノシンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。

アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼならびにＣａｓ９を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように提供される：
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、上記の一般的なアーキテクチャで使用される「－」は、任意のリンカーの存在を示す。

様々な実施形態では、触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性などのＤＮＡ修飾活性（例えば、デアミナーゼ活性）を有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡ＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、Ｃａｓ９内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、ＴａｄＡ＊８は、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ９内で融合され、ＴａｄＡ＊８は、Ｎ末端に融合される。ＴａｄＡ＊８およびシチジンデアミナーゼならびにＣａｓ９を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように提供される：
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡ＊８）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡ＊８）］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐが標的ポリヌクレオチドおよびガイド核酸に結合する能力を保持するように、好適な位置でｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１））に挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、デアミナーゼ（例えば、塩基編集活性）またはｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、標的核酸およびガイド核酸に結合する能力）の機能を損なうことなく、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、結晶学的研究によって示されるように、例えば、無秩序領域、または高温因子（ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆａｃｔｏｒ）もしくはＢ因子を含む領域で、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。タンパク質の秩序領域、無秩序領域、または非構造化領域（例えば、溶媒曝露領域およびループ）は、構造または機能を損なうことなく、挿入に使用することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、可動性ループ（ｆｌｅｘｉｂｌｅｌｏｏｐ）領域または溶媒曝露領域においてｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１ポリペプチドの可動性ループに挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）の挿入位置は、Ｃａｓ９ポリペプチドの結晶構造のＢ因子分析によって決定される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、平均Ｂ因子よりも高い（例えば、全タンパク質または無秩序領域を含むタンパク質ドメインと比較して、より高いＢ因子）を含むＣａｓ９ポリペプチドの領域に挿入される。Ｂ因子または温度因子は、（例えば、温度依存性の原子振動または結晶格子内の静的乱れ（ｓｔａｔｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒ）の結果としての）原子のそれらの平均位置からの変動を示し得る。骨格原子の高いＢ因子（例えば、平均よりも高いＢ因子）は、比較的高い局所移動度（ｌｏｃａｌｍｏｂｉｌｉｔｙ）を有する領域を示し得る。このような領域は、構造または機能を損なうことなくデアミナーゼを挿入するために使用することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、全タンパク質の平均Ｂ因子よりも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、または２００％超であるＢ因子を有するＣα原子を有する残基を含む位置に挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、残基を含むＣａｓ９タンパク質ドメインの平均Ｂ因子よりも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、または２００％超であるＢ因子を有する残基を含む位置に挿入することができる。平均よりも高いＢ因子を含むＣａｓ９ポリペプチドの位置は、例えば、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７６８、７９２、１０５２、１０１５、１０２２、１０２６、１０２９、１０６７、１０４０、１０５４、１０６８、１２４６、１２４７、および１２４８を含むことができる。平均Ｂ因子よりも高いＢ因子を含むＣａｓ９ポリペプチド領域は、例えば、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７９２～８７２、７９２～９０６、および２～７９１を含むことができる。

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入され得る：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７６８、７９１、７９２、１０１５、１０１６、１０２２、１０２３、１０２６、１０２９、１０４０、１０５２、１０５４、１０６７、１０６８、１０６９、１２４６、１２４７、および１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸位置７６８－７６９、７９１－７９２、７９２－７９３、１０１５－１０１６、１０２２－１０２３、１０２６－１０２７、１０２９－１０３０、１０４０－１０４１、１０５２－１０５３、１０５４－１０５５、１０６７－１０６８、１０６８－１０６９、１２４７－１２４８、もしくは１２４８－１２４９、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸位置７６９－７７０、７９２－７９３、７９３－７９４、１０１６－１０１７、１０２３－１０２４、１０２７－１０２８、１０３０－１０３１、１０４１－１０４２、１０５３－１０５４、１０５５－１０５６、１０６８－１０６９、１０６９－１０７０、１２４８－１２４９、もしくは１２４９－１２５０、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基を置き換える：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７６８、７９１、７９２、１０１５、１０１６、１０２２、１０２３、１０２６、１０２９、１０４０、１０５２、１０５４、１０６７、１０６８、１０６９、１２４６、１２４７、および１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。挿入位置に関して、上記のＣａｓ９参照配列への言及は、例示的な目的のためであることを理解されたい。本明細書で論じられる挿入は、上記のＣａｓ９参照配列のＣａｓ９ポリペプチド配列に限定されないが、バリアントＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ヌクレアーゼドメインを欠くＣａｓ９バリアント、切断型Ｃａｓ９、またはＨＮＨドメインを部分的または完全に欠くＣａｓ９ドメイン）における対応する場所における挿入を含む。

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入され得る：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、７９２、１０２２、１０２６、１０４０、１０６８、および１２４７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸位置７６８－７６９、７９２－７９３、１０２２－１０２３、１０２６－１０２７、１０２９－１０３０、１０４０－１０４１、１０６８－１０６９、もしくは１２４７－１２４８、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸位置７６９－７７０、７９３－７９４、１０２３－１０２４、１０２７－１０２８、１０３０－１０３１、１０４１－１０４２、１０６９－１０７０、もしくは１２４８－１２４９、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基を置き換える：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、７９２、１０２２、１０２６、１０４０、１０６８、および１２４７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、本明細書に記載のアミノ酸残基または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入され得る。一実施形態では、異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基において、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入され得る：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１００２、１００３、１０２５、１０５２～１０５６、１２４２～１２４７、１０６１～１０７７、９４３～９４７、６８６～６９１、５６９～５７８、５３０～５３９、および１０６０～１０７７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、残基のＮ末端またはＣ末端で挿入されるか、または残基を置き換えることができる。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、残基のＣ末端において挿入される。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）は、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基において挿入され得る：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７９２～８７２、７９２～９０６、もしくは２～７９１、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基の代わりに挿入される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下からなる群から選択されるアミノ酸のＮ末端において挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下からなる群から選択されるアミノ酸のＣ末端において挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下からなる群から選択されるアミノ酸を置き換えるために挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１）は、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基において挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、以下からなる群から選択されるアミノ酸のＮ末端において挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、以下からなる群から選択されるアミノ酸のＣ末端において挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、以下からなる群から選択されるアミノ酸を置き換えるために挿入される：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７９１もしくはアミノ酸残基７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基７９１のＮ末端もしくはアミノ酸７９２のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸７９１のＣ末端もしくはアミノ酸７９２のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸７９１もしくはアミノ酸７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２２もしくはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２２のＮ末端もしくはアミノ酸残基１０２３のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２２のＣ末端もしくはアミノ酸残基１０２３のＣ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２２もしくはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２６もしくはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２６のＮ末端もしくはアミノ酸残基１０２９のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２６のＣ末端もしくはアミノ酸残基１０２９のＣ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０２６もしくはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０５２もしくはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０５２のＮ末端もしくはアミノ酸残基１０５４のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０５２のＣ末端もしくはアミノ酸残基１０５４のＣ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０５２もしくはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０６７もしくはアミノ酸残基１０６８もしくはアミノ酸残基１０６９、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０６７のＮ末端もしくはアミノ酸残基１０６８のＮ末端もしくはアミノ酸残基１０６９のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０６７のＣ末端もしくはアミノ酸残基１０６８のＣ末端もしくはアミノ酸残基１０６９のＣ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０６７もしくはアミノ酸残基１０６８もしくはアミノ酸残基１０６９、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１２４６もしくはアミノ酸残基１２４７もしくはアミノ酸残基１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１２４６のＮ末端もしくはアミノ酸残基１２４７のＮ末端もしくはアミノ酸残基１２４８のＮ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＮ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１２４６のＣ末端もしくはアミノ酸残基１２４７のＣ末端もしくはアミノ酸残基１２４８のＣ末端、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基のＣ末端において挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１２４６もしくはアミノ酸残基１２４７もしくはアミノ酸残基１２４８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基を置き換えるために挿入される。

一部の実施形態では、異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの可動性ループに挿入される。可動性ループ部分は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基５３０～５３７、５６９～５７０、６８６～６９１、９４３～９４７、１００２～１０２５、１０５２～１０７７、１２３２～１２４７、もしくは１２９８～１３００、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基からなる群から選択することができる。可動性ループ部分は、以下からなる群から選択することができる：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１～５２９、５３８～５６８、５８０～６８５、６９２～９４２、９４８～１００１、１０２６～１０５１、１０７８～１２３１、もしくは１２４８～１２９７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。

異種ポリペプチド（例えば、アデニンデアミナーゼ）は、以下のアミノ酸残基に対応するＣａｓ９ポリペプチド領域に挿入され得る：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１７～１０６９、１２４２～１２４７、１０５２～１０５６、１０６０～１０７７、１００２～１００３、９４３～９４７、５３０～５３７、５６８～５７９、６８６～６９１、１２４２～１２４７、１２９８～１３００、１０６６～１０７７、１０５２～１０５６、もしくは１０６０～１０７７、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。

異種ポリペプチド（例えば、アデニンデアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの欠失領域の代わりに挿入され得る。欠失領域は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端部分またはＣ末端部分に対応し得る。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７９２～８７２、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基に対応する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基７９２～９０６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基に対応する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基２～７９１、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基に対応する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされた残基１０１７～１０６９、またはその対応するアミノ酸残基に対応する。

以下の表９に、例示的な内部融合塩基エディターが提供される。

異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの構造または機能ドメイン内に挿入され得る。異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの２つの構造または機能ドメイン間に挿入され得る。異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドからドメインを欠失させた後に、Ｃａｓ９ポリペプチドの構造または機能ドメインの代わりに挿入され得る。Ｃａｓ９ポリペプチドの構造または機能ドメインは、例えば、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＰＩ、またはＨＮＨを含むことができる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、以下からなる群から選択される１つ以上のドメインを欠く：ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＰＩ、またはＨＮＨドメイン。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインを欠く。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインを欠く。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメインの一部を欠き、そのため、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ活性が低下または消失している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの欠失を含み、デアミナーゼが、ヌクレアーゼドメインを置き換えるために挿入される。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインが欠失され、デアミナーゼが、その場所に挿入される。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインのうちの１つ以上が欠失され、デアミナーゼが、その場所に挿入される。

異種ポリペプチドを含む融合タンパク質は、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端断片およびＣ末端断片に隣接し得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端断片に隣接するデアミナーゼと、Ｃａｓ９ポリペプチドのＣ末端断片と、を含む。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、標的ポリヌクレオチド配列に結合することができる。Ｎ末端断片のＣ末端またはＣ末端断片のＮ末端は、Ｃａｓ９ポリペプチドの可動性ループの一部を含むことができる。Ｎ末端断片のＣ末端またはＣ末端断片のＮ末端は、Ｃａｓ９ポリペプチドのαヘリックス構造の一部を含むことができる。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＲｕｖＣドメインを含むことができる。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＨＮＨドメインを含むことができる。一部の実施形態では、Ｎ末端断片およびＣ末端断片のいずれかは、ＨＮＨドメインを含まない。

一部の実施形態では、Ｎ末端Ｃａｓ９断片のＣ末端は、融合タンパク質が標的核酸塩基を脱アミノ化するときに標的核酸塩基に近接しているアミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｃ末端Ｃａｓ９断片のＮ末端は、融合タンパク質が標的核酸塩基を脱アミノ化するときに標的核酸塩基に近接しているアミノ酸を含む。異なるデアミナーゼの挿入場所は、標的核酸塩基とＮ末端Ｃａｓ９断片のＣ末端またはＣ末端Ｃａｓ９断片のＮ末端のアミノ酸との間に近接性を持たせるために、異なり得る。例えば、デアミナーゼの挿入位置は、以下からなる群から選択されるアミノ酸残基にあり得る：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。

融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片（すなわち、融合タンパク質のデアミナーゼに隣接するＮ末端Ｃａｓ９断片）は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端を含むことができる。融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片は、少なくとも約：１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸の鎖長を含むことができる。融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片は、以下のアミノ酸残基に対応する配列を含むことができる：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１～５６、１～９５、１～２００、１～３００、１～４００、１～５００、１～６００、１～７００、１～７１８、１～７６５、１～７８０、１～９０６、１～９１８、もしくは１～１１００、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。Ｎ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１～５６、１～９５、１～２００、１～３００、１～４００、１～５００、１～６００、１～７００、１～７１８、１～７６５、１～７８０、１～９０６、１～９１８、もしくは１～１１００、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を含む配列を含むことができる。

融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片（すなわち、融合タンパク質のデアミナーゼに隣接するＣ末端Ｃａｓ９断片）は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＣ末端を含むことができる。融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片は、少なくとも約：１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸の鎖長を含むことができる。融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片は、以下のアミノ酸残基に対応する配列を含むことができる：上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０９９～１３６８、９１８～１３６８、９０６～１３６８、７８０～１３６８、７６５～１３６８、７１８～１３６８、９４～１３６８、もしくは５６～１３６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基。Ｎ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列において番号付けされたアミノ酸残基１０９９～１３６８、９１８～１３６８、９０６～１３６８、７８０～１３６８、７６５～１３６８、７１８～１３６８、９４～１３６８、もしくは５６～１３６８、または別のＣａｓ９ポリペプチドの対応するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を含む配列を含むことができる。

融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片およびＣ末端Ｃａｓ９断片は、一緒にまとめて、例えば、上記のＣａｓ９参照配列に記載されるような、天然に存在する全長のＣａｓ９ポリペプチド配列に対応しない場合がある。

本明細書に記載の融合タンパク質は、標的化された脱アミノ化をもたらすことができ、非標的部位（例えば、オフターゲット部位）における脱アミノ化が低減される（例えば、ゲノムワイドの擬脱アミノ化が低減される）。本明細書に記載の融合タンパク質は、標的化された脱アミノ化をもたらすことができ、非標的部位におけるバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）脱アミノが低減される。望ましくない脱アミノまたはオフターゲット脱アミノは、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されたデアミナーゼを含む末端（ｅｎｄｔｅｒｍｉｎｕｓ）融合タンパク質と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減され得る。望ましくない脱アミノ化またはオフターゲット脱アミノ化は、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されたデアミナーゼを含む末端融合タンパク質と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍低減され得る。

一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、Ｒループの範囲内の２つ以下の核酸塩基を脱アミノ化する。一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼは、Ｒループの範囲内の３つ以下の核酸塩基を脱アミノ化する。一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼは、Ｒループの範囲内の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の核酸塩基を脱アミノ化する。Ｒループは、三本鎖核酸構造であり、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡ、またはＲＮＡ：ＲＮＡ相補構造を含み、一本鎖ＤＮＡと会合している。本明細書で使用される場合、Ｒループは、標的ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ複合体または塩基編集複合体と接触すると形成され得、ガイドポリヌクレオチドの一部分（例えば、ガイドＲＮＡ）が、標的ポリヌクレオチドの一部分（例えば、標的ＤＮＡ）とハイブリダイズし、それを置換する。一部の実施形態では、Ｒループは、スペーサー配列のハイブリダイゼーション領域と標的ＤＮＡの相補配列とを含む。Ｒループ領域は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０核酸塩基対長の領域であり得る。一部の実施形態では、Ｒループ領域は、約２０核酸塩基対長である。本明細書で使用される場合、Ｒループ領域は、ガイドポリヌクレオチドとハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖に限定されないことを理解されたい。例えば、Ｒループ領域内の標的核酸塩基の編集は、ガイドＲＮＡに対する相補鎖を含むＤＮＡ鎖に対するものであってもよく、またはガイドＲＮＡに対する相補鎖の反対側の鎖であるＤＮＡ鎖に対するものであってもよい。一部の実施形態では、Ｒループの領域における編集は、標的ＤＮＡ配列におけるガイドＲＮＡに対する非相補鎖（プロトスペーサー鎖）上の核酸塩基を編集することを含む。

本明細書に記載の融合タンパク質は、正準塩基編集とは異なる編集ウィンドウにおける標的脱アミノ化をもたらすことができる。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の約１～約２０塩基上流にある。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の約２～約１２塩基上流にある。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、約１～９塩基対、約２～１０塩基対、約３～１１塩基対、約４～１２塩基対、約５～１３塩基対、約６～１４塩基対、約７～１５塩基対、約８～１６塩基対、約９～１７塩基対、約１０～１８塩基対、約１１～１９塩基対、約１２～２０塩基対、約１～７塩基対、約２～８塩基対、約３～９塩基対、約４～１０塩基対、約５～１１塩基対、約６～１２塩基対、約７～１３塩基対、約８～１４塩基対、約９～１５塩基対、約１０～１６塩基対、約１１～１７塩基対、約１２～１８塩基対、約１３～１９塩基対、約１４～２０塩基対、約１～５塩基対、約２～６塩基対、約３～７塩基対、約４～８塩基対、約５～９塩基対、約６～１０塩基対、約７～１１塩基対、約８～１２塩基対、約９～１３塩基対、約１０～１４塩基対、約１１～１５塩基対、約１２～１６塩基対、約１３～１７塩基対、約１４～１８塩基対、約１５～１９塩基対、約１６～２０塩基対、約１～３塩基対、約２～４塩基対、約３～５塩基対、約４～６塩基対、約５～７塩基対、約６～８塩基対、約７～９塩基対、約８～１０塩基対、約９～１１塩基対、約１０～１２塩基対、約１１～１３塩基対、約１２～１４塩基対、約１３～１５塩基対、約１４～１６塩基対、約１５～１７塩基対、約１６～１８塩基対、約１７～１９塩基対、約１８～２０塩基対、ＰＡＭ配列から離れているか、またはＰＡＭ配列の上流にある。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基対、もしくはそれ以上、ＰＡＭ配列から離れているか、またはＰＡＭ配列の上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列の約１、２、３、４、５、６、７、８、または９塩基対上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列の約２、３、４、または６塩基対上流である。

融合タンパク質は、複数の異種ポリペプチドを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、１つ以上のＵＧＩドメインおよび／または１つ以上の核局在化シグナルをさらに含むことができる。２つ以上の異種ドメインは、直列に挿入され得る。２つ以上の異種ドメインは、それらがＮａｐＤＮＡｂｐにおいて直列ではないような位置に挿入され得る。

融合タンパク質は、デアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチドとの間にリンカーを含むことができる。リンカーは、ペプチドまたは非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、リンカーは、ＸＴＥＮ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳであり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端断片およびＣ末端断片は、リンカーでデアミナーゼに接続されている。一部の実施形態では、Ｎ末端断片およびＣ末端断片は、リンカーなしでデアミナーゼドメインに連結される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含むが、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含まない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含むが、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含まない。

一部の実施形態では、融合タンパク質中のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１）またはその断片である。Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バリアントＣａｓ１２ポリペプチドであり得る。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片またはＣ末端断片は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインまたはＲｕｖＣドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ポリペプチドと触媒ドメインとの間にリンカーを含む。他の実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＳＧＧＳまたはＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧである。他の実施形態では、リンカーは、剛性リンカー（ｒｉｇｉｄｌｉｎｋｅｒ）である。上記の態様の他の実施形態では、リンカーは、ＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣまたはＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣによってコードされる。

Ｃａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片に隣接する異種触媒ドメインを含む融合タンパク質は、本明細書に記載される方法における塩基編集にも有用である。Ｃａｓ１２および１つ以上のデアミナーゼドメインを含む（例えば、アデノシンデアミナーゼ、またはＣａｓ１２配列に隣接するアデノシンデアミナーゼドメインを含む）融合タンパク質は、標的配列の非常に特異的かつ効率的な塩基編集にも有用である。一実施形態では、キメラＣａｓ１２融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ポリペプチド内に挿入された異種触媒ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ１２内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ１２内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｃａｓ１２内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ１２内で融合され、アデノシンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ１２内で融合され、アデノシンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼならびにＣａｓ１２を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように提供される：
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。

様々な実施形態では、触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性などのＤＮＡ修飾活性（例えば、デアミナーゼ活性）を有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡは、ＴａｄＡ＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、Ｃａｓ１２内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、Ｃａｓ１２内で融合され、シチジンデアミナーゼは、Ｎ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ１２内で融合され、ＴａｄＡ＊８は、Ｃ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｃａｓ１２内で融合され、ＴａｄＡ＊８は、Ｎ末端に融合される。ＴａｄＡ＊８およびシチジンデアミナーゼならびにＣａｓ１２を有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように提供される：
Ｎ－［Ｃａｓ１２（ＴａｄＡ＊８）］－［シチジンデアミナーゼ］－Ｃ、
Ｎ－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（ＴａｄＡ＊８）］－Ｃ、
Ｎ－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡ＊８］－Ｃ、または
Ｎ－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－Ｃ。

他の実施形態では、融合タンパク質は１つ以上の触媒ドメインを含む。他の実施形態では、１つ以上の触媒ドメインのうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ１２ポリペプチド内に挿入されるか、またはＣａｓ１２のＮ末端もしくはＣ末端で融合される。他の実施形態では、１つ以上の触媒ドメインのうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ１２ポリペプチドのループ、αヘリックス領域、非構造化部分、または溶媒アクセス可能部分内に挿入される。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、またはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦである。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、ＢａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉＣａｓ１２ｂ、ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓＣａｓ１２ｂ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓＣａｓ１２ｂと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、ＢａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉＣａｓ１２ｂ、ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓＣａｓ１２ｂ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓＣａｓ１２ｂと、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、ＢａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉＣａｓ１２ｂ、ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓＣａｓ１２ｂ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓＣａｓ１２ｂと、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、ＢａｃｉｌｌｕｓｈｉｓａｓｈｉｉＣａｓ１２ｂ、ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓＣａｓ１２ｂ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、もしくはＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓＣａｓ１２ｂの断片を含むか、または本質的にそれからなる。

他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸位置１５３－１５４、２５５－２５６、３０６－３０７、９８０－９８１、１０１９－１０２０、５３４－５３５、６０４－６０５、もしくは３４４－３４５の間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦの対応するアミノ酸残基の間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１５３とＳ１５４との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ２５５とＥ２５６との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｄ９８０とＧ９８１との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ１０１９とＬ１０２０との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｆ５３４とＰ５３５との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ６０４とＧ６０５との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｈ３４４とＦ３４５との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸位置１４７と１４８、２４８と２４９、２９９と３００、９９１と９９２、もしくは１０３１と１０３２との間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦの対応するアミノ酸残基の間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１４７とＤ１４８との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ２４８とＧ２４９との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ２９９とＥ３００との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ９９１とＥ９９２との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ１０３１とＭ１０３２との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸位置１５７と１５８、２５８と２５９、３１０と３１１、１００８と１００９、もしくは１０４４と１０４５との間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦの対応するアミノ酸残基の間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１５７とＧ１５８との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｖ２５８とＧ２５９との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｄ３１０とＰ３１１との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ１００８とＥ１００９との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ１０４４とＫ１０４５との間に挿入される。

他の実施形態では、融合タンパク質は、核局在化シグナル（例えば、二分核局在化シグナル）を含む。他の実施形態では、核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡである。上記の態様の他の実施形態では、核局在化シグナルは、以下の配列によってコードされる：

ＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣ。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインの触媒活性をサイレンシングする変異を含む。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、Ｄ５７４Ａ、Ｄ８２９Ａおよび／またはＤ９５２Ａ変異を含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、タグ（例えば、インフルエンザヘマグルチニンタグ）をさらに含む。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン（例えば、Ｃａｓ１２由来ドメイン）を含み、内部融合核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメイン）の全部または一部）を有する。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ｂである。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＢｈＣａｓ１２ｂドメインを含み、以下の表１０に提供される遺伝子座に挿入された内部融合ＴａｄＡ＊８ドメインを有する。

非限定的な例として、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ＊８．１３）をＢｈＣａｓ１２ｂに挿入して、核酸配列を効果的に編集する融合タンパク質（例えば、ＴａｄＡ＊８．１３－ＢｈＣａｓ１２ｂ）を生成することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、ＴａｄＡがＣａｓ９に挿入されたＡＢＥである。ＴａｄＡがＣａｓ９に挿入された関連するＡＢＥの配列が提供される。
１０１Ｃａｓ９ＴａｄＡｉｎｓ１０１５
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ
１０２Ｃａｓ９ＴａｄＡｉｎｓ１０２２
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ
１０３Ｃａｓ９ＴａｄＡｉｎｓ１０２９
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１１３Ｎ－末端単一ＴａｄＡヘリックス切断型１６５－ｅｎｄ
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１１４Ｎ－末端単一ＴａｄＡヘリックス切断型１６５－ｅｎｄ Δ５９－６５
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１１６．１Ｃａｓ９ＴａｄＡｉｎｓＣ－末端切断型２７９２
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１１６．２Ｃａｓ９ＴａｄＡｉｎｓＣ－末端切断型２７９１
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１１６．３Ｃａｓ９ＴａｄＡｉｎｓＣ－末端切断型２７９０
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１１７Ｃａｓ９ Δ１０１７－１０６９
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１２５Ｃａｓ９ｄｅｌｔａ７９２－９０６ＴａｄＡｉｎｓ
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一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ塩基エディターを生成して、ＴａｄＡまたはそのバリアントを、特定された位置でＣａｓ９ポリペプチドに挿入した。

例示的であるが非限定的な融合タンパク質は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１６２８５号および米国仮出願第６２／８５２，２２８号および同第６２／８５２，２２４号に記載されている（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。

ＡからＧの編集
一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質を含む。塩基エディターのかかるアデノシンデアミナーゼドメインは、Ａを脱アミノ化して、Ｇの塩基対形成の特性を示すイノシン（Ｉ）を形成することによって、アデニン（Ａ）核酸塩基のグアニン（Ｇ）核酸塩基への編集を促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化する（すなわち、アミン基を除去する）ことができる。

一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸塩基エディターは、１つ以上のタンパク質ドメインを一緒に融合することによって作製することができ、それによって、融合タンパク質が生成される。特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、１つ以上の特徴を含み、融合タンパク質の塩基編集活性（例えば、効率、選択性、および特異性）を改善する。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される二重鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有し得る。いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在により、Ｃａｓ９の活性が維持され、標的となるＡとは反対のＴを含む未編集（例えば、脱アミノ化されていない）鎖が切断される。Ｃａｓ９の触媒残基の変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０）により、標的となるＡ残基を含む編集鎖の切断が妨げられる。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡが規定する標的配列に基づいて、特定の位置で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、未編集鎖の修復をもたらし、最終的には、未編集鎖のＴからＣへの変化をもたらす。一部の実施形態では、ＡからＧの（Ａ－ｔｏ－Ｇ）塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害因子、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメインまたは触媒不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼをさらに含む。いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＵＧＩドメインまたは触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化アデノシン残基（例えば、イノシン）の塩基除去修復を阻害または防止することができ、これは、塩基エディターの活性または効率を改善することができる。

アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチドに作用することができる。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインを含むことができる。一実施形態では、塩基エディターに組み込まれるアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ（ＡＤＡＲ、例えば、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）に作用するアデノシンデアミナーゼの全部または一部を含む。別の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるアデノシンデアミナーゼは、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）の全部または一部を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＤＮＡポリヌクレオチドのＡ核酸塩基を脱アミノ化することもできる。一実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＴがＤＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化することを可能にする１つ以上の変異を含むＡＤＡＴの全部または一部を含む。例えば、塩基エディターは、以下の変異のうちの１つ以上を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＡＤＡＴ（ＥｃＴａｄＡ）の全部または一部を含むことができる：Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｉ１５６Ｆ、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異。

アデノシンデアミナーゼは、任意の好適な生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける変異）のいずれかに対応する１つ以上の変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。任意の相同タンパク質における対応する残基は、例えば、配列整列および相同残基の決定によって特定することができる。本明細書に記載の変異のいずれか（例えば、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれか）に対応する、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼにおける（例えば、ｅｃＴａｄＡと相同性を有する）変異は、それに応じて生成することができる。

アデノシンデアミナーゼ
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１つ以上のアデノシンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、本発明に提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化することができる。アデノシンデアミナーゼは、任意の好適な生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し得る。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける変異）のいずれかに対応する１つ以上の変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、例えば、配列整列および相同残基の決定によって、任意の相同タンパク質の対応する残基を特定することができるであろう。したがって、当業者であれば、本明細書に記載の変異のいずれか（例えば、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれか）に対応する、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼにおける（例えば、ｅｃＴａｄＡと相同性を有する）変異を生成することができるであろう。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。

本発明は、効率（＞５０～６０％）および特異性を向上させたアデノシンデアミナーゼのバリアントを提供する。特に、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼのバリアントは、ポリヌクレオチド内で所望の塩基を編集する可能性が高く、改変されることが意図されない塩基（すなわち、「バイスタンダー」）を編集する可能性が低い。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。特定の実施形態では、ＴａｄＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）に記載されるＴａｄＡのいずれか１つである（その全体が、参照により本明細書に援用される）。

野生型ＴａｄＡ（ｗｔ）アデノシンデアミナーゼは、以下の配列（ＴａｄＡ参照配列とも称される）を有する：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、全長Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＲＲＡＦＩＴＧＶＦＦＬＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ．

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。

しかしながら、本出願において有用な追加のアデノシンデアミナーゼが、当業者には明らかであり、本開示の範囲内であることを理解されたい。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）のホモログであり得る。限定されないが、例示的なＡＤＡＴホモログのアミノ酸配列は、以下を含む：
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＴａｄＡ：
ＭＧＳＨＭＴＮＤＩＹＦＭＴＬＡＩＥＥＡＫＫＡＡＱＬＧＥＶＰＩＧＡＩＩＴＫＤＤＥＶＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＬＱＱＰＴＡＨＡＥＨＩＡＩＥＲＡＡＫＶＬＧＳＷＲＬＥＧＣＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＴＩＶＭＳＲＩＰＲＶＶＹＧＡＤＤＰＫＧＧＣＳＧＳＬＭＮＬＬＱＱＳＮＦＮＨＲＡＩＶＤＫＧＶＬＫＥＡＣＳＴＬＬＴＴＦＦＫＮＬＲＡＮＫＫＳＴＮ
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡ：
ＭＴＱＤＥＬＹＭＫＥＡＩＫＥＡＫＫＡＥＥＫＧＥＶＰＩＧＡＶＬＶＩＮＧＥＩＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＥＱＲＳＩＡＨＡＥＭＬＶＩＤＥＡＣＫＡＬＧＴＷＲＬＥＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＰＭＣＡＧＡＶＶＬＳＲＶＥＫＶＶＦＧＡＦＤＰＫＧＧＣＳＧＴＬＭＮＬＬＱＥＥＲＦＮＨＱＡＥＶＶＳＧＶＬＥＥＥＣＧＧＭＬＳＡＦＦＲＥＬＲＫＫＫＫＡＡＲＫＮＬＳＥ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴａｄＡ：
ＭＰＰＡＦＩＴＧＶＴＳＬＳＤＶＥＬＤＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＨＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＬＱＮＹＲＬＬＤＴＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＩＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＩＥＧＶＬＲＤＥＣＡＴＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＬＫＫＡＤＲＡＥＧＡＧＰＡＶ
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴａｄＡ：
ＭＤＥＹＷＭＱＶＡＭＱＭＡＥＫＡＥＡＡＧＥＶＰＶＧＡＶＬＶＫＤＧＱＱＩＡＴＧＹＮＬＳＩＳＱＨＤＰＴＡＨＡＥＩＬＣＬＲＳＡＧＫＫＬＥＮＹＲＬＬＤＡＴＬＹＩＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＡＲＶＶＹＧＡＲＤＥＫＴＧＡＡＧＴＶＶＮＬＬＱＨＰＡＦＮＨＱＶＥＶＴＳＧＶＬＡＥＡＣＳＡＱＬＳＲＦＦＫＲＲＲＤＥＫＫＡＬＫＬＡＱＲＡＱＱＧＩＥ
ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＦ３０３１（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＴａｄＡ：
ＭＤＡＡＫＶＲＳＥＦＤＥＫＭＭＲＹＡＬＥＬＡＤＫＡＥＡＬＧＥＩＰＶＧＡＶＬＶＤＤＡＲＮＩＩＧＥＧＷＮＬＳＩＶＱＳＤＰＴΑΗＡＥＩＩＡＬＲＮＧＡＫＮＩＱＮＹＲＬＬＮＳＴＬＹＶＴＬＥＰＣＴＭＣＡＧＡＩＬＨＳＲＩＫＲＬＶＦＧＡＳＤＹＫＴＧＡＩＧＳＲＦＨＦＦＤＤＹＫＭＮＨＴＬＥＩＴＳＧＶＬＡＥＥＣＳＱＫＬＳＴＦＦＱＫＲＲＥＥＫＫＩＥＫＡＬＬＫＳＬＳＤＫ
Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＴａｄＡ：
ＭＲＴＤＥＳＥＤＱＤＨＲＭＭＲＬＡＬＤＡＡＲＡＡＡＥＡＧＥＴＰＶＧＡＶＩＬＤＰＳＴＧＥＶＩＡＴＡＧＮＧＰＩＡＡＨＤＰＴＡＨＡＥＩＡＡＭＲＡＡＡＡＫＬＧＮＹＲＬＴＤＬＴＬＶＶＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＩＳＨＡＲＩＧＲＶＶＦＧＡＤＤＰＫＧＧＡＶＶＨＧＰＫＦＦＡＱＰＴＣＨＷＲＰＥＶＴＧＧＶＬＡＤＥＳＡＤＬＬＲＧＦＦＲＡＲＲＫＡＫＩ
Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＴａｄＡ：
ＭＳＳＬＫＫＴＰＩＲＤＤＡＹＷＭＧＫＡＩＲＥＡＡＫＡＡＡＲＤＥＶＰＩＧＡＶＩＶＲＤＧＡＶＩＧＲＧＨＮＬＲＥＧＳＮＤＰＳＡＨＡＥＭＩＡＩＲＱＡＡＲＲＳＡＮＷＲＬＴＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＬＭＣＭＧＡＩＩＬＡＲＬＥＲＶＶＦＧＣＹＤＰＫＧＧＡＡＧＳＬＹＤＬＳＡＤＰＲＬＮＨＱＶＲＬＳＰＧＶＣＱＥＥＣＧＴＭＬＳＤＦＦＲＤＬＲＲＲＫＫＡＫＡＴＰＡＬＦＩＤＥＲＫＶＰＰＥＰ
Ｅ．ＣｏｌｉＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）の一実施形態は、以下を含む：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼが、１つ以上の変異（例えば、本明細書に提供される変異のいずれか）を含み得ることを理解されたい。本開示は、特定のパーセント同一性、加えて、本明細書に記載の変異またはそれらの組み合わせのうちのいずれかを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書に提供される変異のいずれか（例えば、ＴａｄＡ参照配列に基づく）が、Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）などの他のアデノシンデアミナーゼに導入され得ることを理解されたい。追加のデアミナーゼを、同様に整列させて相同アミノ酸残基を特定することができ、本明細書に提供されるように変異導入され得ることは、当業者には明らかであろう。したがって、ＴａｄＡ参照配列において特定された変異のいずれかは、相同アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄａ）において作製され得る。本明細書に提供される変異のいずれかは、ＴａｄＡ参照配列または別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個別に、または任意の組み合わせで作製され得ることも理解されたい。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、Ｄ１０８Ａ、もしくはＤ１０８Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。しかしながら、追加のデアミナーゼを、同様に整列させて相同アミノ酸残基を特定することができ、本明細書に提供されるように変異導入され得ることを理解されたい。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ１５５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、またはＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ）を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１４７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｄ１４７Ｙ、ＴａｄＡ参照配列における変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ）を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ａ１０６Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、またはＤ１４７Ｘ、ＴａｄＡ参照配列における変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、またはＥ１５５Ｖ変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｄ１４７Ｙを含む。

本明細書に提供される変異のいずれか（例えば、ＴａｄＡ参照配列のｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）などの他のアデノシンデアミナーゼに導入され得ることを理解されたい。当業者には、ｅｃＴａｄＡにおける変異残基とどの程度相同であるかが明らかであろう。したがって、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれかは、相同アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼにおいて作製され得る。本明細書に提供される変異のいずれかは、ｅｃＴａｄＡまたは別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個別に、または任意の組み合わせで作製され得ることも理解されたい。

例えば、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、および／もしくはＤ１４７Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含み得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列における以下の変異群（変異群は、「；」によって分離される）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む：Ｄ１０８ＮおよびＡ１０６Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６ＶおよびＥ１５５Ｖ；Ａ１０６ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｅ１５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；ならびにＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ。しかしながら、本明細書に提供される対応する変異の任意の組み合わせが、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において作製され得ることを理解されたい。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｔ１７Ｘ、Ｌ１８Ｘ、Ｗ２３Ｘ、Ｌ３４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ａ５６Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ８５Ｘ、Ｍ９４Ｘ、Ｉ９５Ｘ、Ｖ１０２Ｘ、Ｆ１０４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｋ１１０Ｘ、Ｍ１１８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｆ１４９Ｘ、Ｍ１５１Ｘ、Ｒ１５３Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、および／もしくはＫ１５７Ｘの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む（ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｔ１７Ｓ、Ｌ１８Ｅ、Ｗ２３Ｌ、Ｌ３４Ｓ、Ｗ４５Ｌ、Ｒ５１Ｈ、Ａ５６ＥもしくはＡ５６Ｓ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ８５ＫもしくはＥ８５Ｇ、Ｍ９４Ｌ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ１０２Ａ、Ｆ１０４Ｌ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７ＣもしくはＲ１０７ＨもしくはＲ１０７Ｐ、Ｄ１０８ＧもしくはＤ１０８ＮもしくはＤ１０８ＶもしくはＤ１０８ＡもしくはＤ１０８Ｙ、Ｋ１１０Ｉ、Ｍ１１８Ｋ、Ｎ１２７Ｓ、Ａ１３８Ｖ、Ｆ１４９Ｙ、Ｍ１５１Ｖ、Ｒ１５３Ｃ、Ｑ１５４Ｌ、Ｉ１５６Ｄ、および／またはＫ１５７Ｒ変異のうちの１つ以上、あるいは別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、および／もしくはＮ１２７Ｘの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、および／もしくはＮ１２７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｋ１６１Ｘ、Ｑ１６３Ｘ、および／もしくはＴ１６６Ｘの変異のうちの１つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｍ６１Ｉ、Ｌ６８Ｑ、Ｍ７０Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、Ｑ１５４ＨもしくはＱ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧもしくはＥ１５５ＶもしくはＥ１５５Ｄ、Ｋ１６１Ｑ、Ｑ１６３Ｈ、および／もしくはＴ１６６Ｐのうちの１つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、およびＱ１５４Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＱ１６３Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＴ１６６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、およびＤ１０８Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（複数可）を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（複数可）を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、およびＱ１５４Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｍ６１Ｉ、Ｍ７０Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｑ１５４Ｒ、Ｅ１５５Ｇ、およびＱ１６３Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｖ、およびＴ１６６Ｐからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｄ、およびＫ１６１Ｑからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｌ６８Ｑ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、およびＥ１５５Ｇからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異（複数可）を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｇ、もしくはＤ１０８Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７ＣおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＱ１５４Ｈ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、およびＮ１２７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ｘ、Ｈ８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、および／もしくはＫ１６０Ｘの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｉ１５６Ｆ、および／もしくはＫ１６０Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｌ８４Ｘ変異アデノシンデアミナーゼを含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ１２３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ１２３Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＩ１５６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＩ１５６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＫ１６０Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（複数可）を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す）。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ２Ａ、Ｉ４９Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つの変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、およびＫ１６０Ｓからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（複数可）を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ａ１４２Ｘ、および／もしくはＡ１４３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、Ｅ２５Ｙ、Ｒ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｋ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、Ｒ１０７Ｓ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、および／もしくはＡ１４３Ｒのうちの１つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に対応する本明細書に記載の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異のうちの１つ以上を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、もしくはＥ２５Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ２６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、もしくはＲ２６Ｋ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、もしくはＲ１０７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）の対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、および／もしくはＡ１４３Ｒの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｘ、Ｎ３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｅ１３４Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｋ１５７Ｘ、および／もしくはＫ１６１Ｘの変異のうちの１つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む（ここで、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｌ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｌ、Ｉ４９Ｖ、Ｒ５１Ｈ、Ｒ５１Ｌ、Ｍ７０Ｌ、Ｎ７２Ｓ、Ｄ７７Ｇ、Ｅ１３４Ｇ、Ｓ１４６Ｒ、Ｓ１４６Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、Ｋ１５７Ｎ、および／もしくはＫ１６１Ｔの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）における１つ以上の対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＨ３６Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＮ３７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＮ３７ＴもしくはＮ３７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８ＴもしくはＰ４８Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ５１Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ５１ＨもしくはＲ５１Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ１４６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＳ１４６ＲもしくはＳ１４６Ｃ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＫ１５７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＰ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、もしくはＰ４８Ａ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＡ１４２Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＷ２３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＷ２３ＲもしくはＷ２３Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１５２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む（ここで、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す）。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列におけるＲ１５２ＰもしくはＲ５２Ｈ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。

一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、変異Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、およびＫ１５７Ｎを含み得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に対する以下の変異の組み合わせを含む（ここで、組み合わせの各変異は、「＿」によって区切られ、変異の各組み合わせは、括弧の間にある：
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｒ１０７Ｃ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｋ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｉ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｆ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａｃａｔｄｅａｄ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｙ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｇ２２Ｐ＿Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ＿Ｓ１３８Ａ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｍ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｐ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｃ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ａ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｎ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｎ３７Ｔ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｍ７０Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｅ１３４Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｒ５１Ｈ＿Ｄ７７Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｈ９６Ｌ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６０Ｅ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｇ６７Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｔ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｑ７１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｌ１３７Ｍ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ９１Ｔ＿Ｆ１０４Ｉ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｄ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｇ１２５Ａ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｓ９７Ｃ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｗ２３Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ）、（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ａ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ｒ９８Ｑ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｒ１２９Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｌ１５７Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）。

一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡバリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡ＊７．１０ドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、ヘテロ二量体を形成することができるＴａｄＡ＊７．１０およびＴａｄＡ（ｗｔ）を含む。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＴａｄＡ＊７．１０に結合した野生型ＴａｄＡを含み、これはＣａｓ９ニッカーゼに結合している。

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、少なくとも１つの改変を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列における改変を含む：
ＴａｄＡ＊７．１０
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、アミノ酸８２および／または１６６における改変を含む。特定の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、以下の改変のうちの１つ以上を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／またはＱ１５４Ｒ。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０のバリアントは、以下の群から選択される改変の組み合わせを含む：Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）は、欠失を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、Ｃ末端の欠失を含む。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、および１５７から始まるＣ末端の欠失、または別のＴａｄＡにおける対応する変異を含む。

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）は、以下の改変のうちの１つ以上を含む単量体である：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＹ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／もしくはＱ１５４Ｒ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアント（ＴａｄＡ＊８）は、以下の群から選択される改変の組み合わせを含む単量体である：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＹ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含むホモ二量体であり、各々、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して以下の改変Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／もしくはＱ１５４Ｒのうちの１つ以上、または別のＴａｄＡにおける対応する変異を有する。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含む単量体であり、各々、以下の群から選択される改変の組み合わせを有する：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＹ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して以下の改変Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／もしくはＱ１５４Ｒのうちの１つ以上、または別のＴａｄＡにおける対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、以下の群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＹ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して以下の改変Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、および／もしくはＱ１５４Ｒのうちの１つ以上、または別のＴａｄＡにおける対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、以下の群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＹ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼヘテロ二量体は、ＴａｄＡ＊８ドメインと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＴａｄＡ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴａｄＡ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴａｄＡ、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＦ３０３１（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＴａｄＡ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＴａｄＡ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＴａｄＡ、またはＴａｄＡ＊７．１０．から選択されるアデノシンデアミナーゼドメインとを含む。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８である。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列またはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、または本質的にそれからなるＴａｄＡ＊８である。
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＴＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）である。一部の実施形態では、切断型ＴａｄＡ＊８は、全長ＴａｄＡ＊８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠く。一部の実施形態では、切断型ＴａｄＡ＊８は、全長ＴａｄＡ＊８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠く。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアントは、全長ＴａｄＡ＊８である。

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。

他の実施形態では、本開示の塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）単量体を含み、以下の改変のうちの１つ以上を含む：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＲ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／もしくはＤ１６７Ｎ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼのバリアント（ＴａｄＡ＊８）単量体は、以下の群から選択される改変の組み合わせを含む：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＲ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して以下の改変Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、および／もしくはＤ１６７Ｎのうちの１つ以上、または別のＴａｄＡにおける対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインのヘテロ二量体と、以下の群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＲ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して以下の改変Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／もしくはＤ１６７Ｎのうちの１つ以上、または別のＴａｄＡにおける対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体である。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、以下の群から選択される改変の組み合わせを含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とのヘテロ二量体を含む：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＲ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ、およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、表１１に示されるバリアントである。表１１は、ＴａｄＡアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置の番号、およびＴａｄＡ－７．１０アデノシンデアミナーゼにおけるそれらの位置に存在するアミノ酸を示す。また、表１１は、Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒｅｔａｌ．，２０２０，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚ（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）に記載されているファージ支援非持続的進化（ＰＡＮＣＥ）およびファージ支援持続的進化（ＰＡＣＥ）後のＴａｄＡ－７．１０に対するＴａｄＡバリアントのアミノ酸変化を示す。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ａ、ＴａｄＡ＊８ｂ、ＴａｄＡ＊８ｃ、ＴａｄＡ＊８ｄ、またはＴａｄＡ＊８ｅである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ｅである。

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、野生型ＴａｄＡを含み、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）に連結され、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一のＴａｄＡ＊８ドメイン（例えば、単量体として提供される）を含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、これらは、ヘテロ二量体を形成することができる。

特定の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、太字で示される以下の位置のいずれかにおいて、１つ以上の変異を含む。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、以下の下線で示される位置のいずれかにおいて、１つ以上の変異を含む：
MSEVEFSHEY WMRHALTLAK RARDEREVPV GAVLVLNNRV IGEGWNRAIG ⁵⁰
LHDPTAHAEI MALRQGGLVM QNYRLIDATL YVTFEPCVMC AGAMIHSRIG ¹⁰⁰
RVVFGVRNAK TGAAGSLMDV LHYPGMNHRV EITEGILADE CAALLCYFFR ¹⁵⁰
MPRQVFNAQK KAQSSTD

例えば、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対して、アミノ酸位置８２および／もしくは１６６（例えば、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ）単独での改変、または以下のＹ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、および／もしくはＱ１５４Ｒのうちのいずれか１つ以上との組み合わせでの改変、あるいは別のＴａｄＡにおける対応する変異を含む。特定の実施形態では、改変の組み合わせは、以下の群から選択される：ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に対してＹ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｔ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ、Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、または別のＴａｄＡにおける対応する変異。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８であり、以下の配列またはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、または本質的にそれからなる：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＴＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、野生型ＴａｄＡを含み、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）に連結され、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一のＴａｄＡ＊８ドメイン（例えば、単量体として提供される）を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、ヘテロ二量体を形成することができる。

特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一の（例えば、単量体として提供される）ＴａｄＡ＊８を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結される。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヘテロ二量体としてのＴａｄＡ＊８に連結された野生型ＴａｄＡ（ＴａｄＡ（ｗｔ））を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヘテロ二量体としてのＴａｄＡ＊８に連結されたＴａｄＡ＊７．１０を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８バリアント単量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ＊７．１０とのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８のヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、表１１、１３、または１４から選択される。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、表１３、１４、または１６から選択される。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊９バリアントである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊９バリアントであり、以下に記載されるバリアントから選択され、以下の配列（ＴａｄＡ＊７．１０と称される）を参照する：

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変のうちの１つ以上を含む：Ｒ２１Ｎ、Ｒ２３Ｈ、Ｅ２５Ｆ、Ｎ３８Ｇ、Ｌ５１Ｗ、Ｐ５４Ｃ、Ｍ７０Ｖ、Ｑ７１Ｍ、Ｎ７２Ｋ、Ｙ７３Ｓ、Ｖ８２Ｔ、Ｍ９４Ｖ、Ｐ１２４Ｗ、Ｔ１３３Ｋ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１３９Ｍ、Ｃ１４６Ｒ、およびＡ１５８Ｋ。１つ以上の変更が、下線および太字で上記の配列に示されている。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変の組み合わせのうちの１つ以上を含む：Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ、Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ、Ｉ７６Ｙ＿Ｖ８２Ｓ＿Ｙ１２３Ｈ＿Ｙ１４７Ｒ＿Ｑ１５４Ｒ、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｈ１２３Ｈ、およびＶ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変の組み合わせのうちの１つ以上を含む：Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ，Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｐ１２４Ｗ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２３Ｈ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２１Ｎ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ、Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＭ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の改変の組み合わせのうちの１つ以上を含む：Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｙ７３Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、およびＶ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ、Ｍ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｍ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ、Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ、およびＭ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、単量体として発現される。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヘテロ二量体として発現される。一部の実施形態では、デアミナーゼまたは他のポリペプチド配列は、例えば、融合タンパク質の成分として含まれる場合、メチオニンを欠く。これにより、位置の番号付けが変化する場合がある。しかしながら、当業者は、かかる対応する変異が、同じ変異（例えば、Ｙ７３ＳおよびＹ７２Ｓ、ならびにＤ１３９ＭおよびＤ１３８Ｍ）を指すことを理解するであろう。

一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、本明細書に記載されるように、表１７に記載の改変を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、単量体である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、野生型ＴａｄＡアデノシンデアミナーゼを有するヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊９バリアントは、別のＴａｄＡバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８、ＴａｄＡ＊９）を有するヘテロ二量体である。ＴａｄＡ＊９アデノシンデアミナーゼのさらなる詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０２０／０４９９７５号に記載されている（その全体が、参照により本明細書に援用される）。

本明細書に提供される変異のいずれか、および（例えば、ｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）任意の追加の変異は、任意の他のアデノシンデアミナーゼに導入され得る。本明細書に提供される変異のいずれかは、ＴａｄＡ参照配列または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において個別にまたは任意の組み合わせで作製され得る。

ＡからＧの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＧａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ，５５１，４６４－４７１（２０１７）に記載されている（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

ＣからＴの編集
一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターは、シチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質を含み、ポリヌクレオチドの標的シチジン（Ｃ）塩基を脱アミノ化して、チミンの塩基対形成の特性を有するウリジン（Ｕ）を生成することができる。一部の実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドが二本鎖（例えば、ＤＮＡ）である場合、ウリジン塩基は、次いで、（例えば、細胞の修復機構によって）チミジン塩基で置換されて、Ｃ：ＧからＴ：Ａへの遷移が生じ得る。他の実施形態では、塩基エディターによる核酸のＣからＵへの脱アミノ化は、ＵからＴへの置換を伴うことはできない。

Ｕを生じさせるためのポリヌクレオチドの標的Ｃの脱アミノ化は、塩基編集の種類の非限定的な例であり、本明細書に記載の塩基エディターによって実行され得る。別の例では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、シトシン（Ｃ）塩基のグアニン（Ｇ）塩基への変換を媒介することができる。例えば、塩基エディターのシチジンデアミナーゼドメインによるシチジンの脱アミノ化によって産生されたポリヌクレオチドのＵは、塩基除去修復機構によって（例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）ドメインによって）ポリヌクレオチドから除去され、脱塩基部位を産生することができる。次いで、脱塩基部位と反対側の核酸塩基を、別の塩基（例えば、Ｃ）で、例えば、損傷乗り越え（ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ）ポリメラーゼによって（例えば、塩基修復機構によって）置換することができる。脱塩基部位と反対側の核酸塩基がＣで置き換わることが典型的であるが、他の置換（例えば、Ａ、ＧまたはＴ）も生じ得る。

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターは、ポリヌクレオチドの標的ＣをＵに脱アミノ化することができる脱アミノ化ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。さらに、以下に記載されるように、塩基エディターは、一部の実施形態では、脱アミノ化から生じるＵからＴまたはＵからＧの変換を促進する追加のドメインを含み得る。例えば、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＴによるＵの置換を媒介するウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメインをさらに含み得、ＣからＴの塩基編集事象を完了する。別の例では、損傷乗り越えポリメラーゼが、脱塩基部位と反対側のＣの組み込みを促進することができる（すなわち、脱塩基部位でＧの組み込みをもたらし、ＣからＧの塩基性編集事象を完了する）ため、塩基エディターに、損傷乗り越えポリメラーゼを組み込んで、ＣからＧの塩基編集の効率を向上させることができる。

ドメインとしてシチジンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む、任意のポリヌクレオチドの標的Ｃを脱アミノ化することができる。典型的には、シチジンデアミナーゼは、ポリヌクレオチドの一本鎖部分の文脈に位置するＣ核酸塩基を触媒する。一部の実施形態では、標的Ｃを含むポリヌクレオチド全体が、一本鎖であり得る。例えば、塩基エディターに組み込まれたシチジンデアミナーゼは、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの標的Ｃを脱アミノ化することができる。他の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、二本鎖ポリヌクレオチドに作用し得るが、標的Ｃは、脱アミノ化反応時に一本鎖状態にあるポリヌクレオチドの一部に位置し得る。例えば、ＮＡＧＰＢドメインがＣａｓ９ドメインを含む実施形態では、いくつかのヌクレオチドは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ標的ＤＮＡ複合体の形成中に不対のままであり得、Ｃａｓ９の「Ｒ－ループ複合体」の形成をもたらす。これらの不対のヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡのバブル（ｂｕｂｂｌｅ）を形成することができ、一本鎖特異的ヌクレオチドデアミナーゼ酵素（例えば、シチジンデアミナーゼ）の基質として機能することができる。

一部の実施形態では、塩基エディターのシチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼの全部または一部を含むことができる。ＡＰＯＢＥＣは進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーである。このファミリーのメンバーは、ＣからＵの編集酵素である。ＡＰＯＢＥＣ様タンパク質のＮ末端ドメインは、触媒ドメインであり、Ｃ末端ドメインは、偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは、亜鉛依存性シチジンデアミナーゼドメインであり、シチジンの脱アミノ化に重要である。ＡＰＯＢＥＣファミリーメンバーには、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（現在、「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、これを指す）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、および活性化誘導（シチジン）デアミナーゼが含まれる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）の全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）の全部または一部を含む。塩基エディターは、任意の好適な生物（例えば、ヒトまたはラット）由来のデアミナーゼを含み得ることを理解されたい。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウス由来である。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ラット（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１）に由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１である。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ｐｍＣＤＡ１である。

ＰｍＣＤＡ１のアミノ酸配列および核酸配列を、以下に示す。
＞ｔｒ｜Ａ５Ｈ７１８｜Ａ５Ｈ７１８＿ＰＥＴＭＡシトシンデアミナーゼＯＳ＝ＰｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓＯＸ＝７７５７ＰＥ＝２ＳＶ＝１アミノ酸配列：
ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＩＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶ

核酸配列：＞ＥＦ０９４８２２．１Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓ単離菌ＰｍＣＤＡ．２１シトシンデアミナーゼｍＲＮＡ、完全長ＣＤＳ：
ＴＧＡＣＡＣＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＧＣＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＴＣＧＣＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＧＴＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＡＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣ

ヒト活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のコード配列（ＣＤＳ）のアミノ酸配列および核酸配列を、以下に示す。
＞ｔｒ｜Ｑ６ＱＪ８０｜Ｑ６ＱＪ８０＿ＨＵＭＡＮ活性化誘導シチジンデアミナーゼＯＳ＝ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＯＸ＝９６０６ＧＮ＝ＡＩＣＤＡＰＥ＝２ＳＶ＝１アミノ酸配列：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＡＰＶ

核酸配列：＞ＮＧ＿０１１５８８．１：５００１－１５６８１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、１２番染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ（ＬＲＧ＿１７）：
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ＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＴＡＴＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧ

本開示の態様に従って、Ｃａｓ９に融合され得る他の例示的なデアミナーゼを、以下に提供する。実施形態では、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態では、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナルがないドメイン（核局在化配列、核輸送シグナルなし、細胞質局在化シグナル）が使用され得ることを理解されたい。

ヒトＡＩＤ：
（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）

マウスＡＩＤ：
（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）

イヌＡＩＤ：
（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）

ウシＡＩＤ：
（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）

ラットＡＩＤ：
（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）

ｃｌＡＩＤ（Ｃａｎｉｓｌｕｐｕｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）：
ＭＤＳＬＬＭＫＱＲＫＦＬＹＨＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＨＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＨＬＲＮＫＳＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＹＰＮＬＳＬＲＩＦＡＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＲＥＫＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ

ｂｔＡＩＤ（ＢｏｓＴａｕｒｕｓ）：
ＭＤＳＬＬＫＫＱＲＱＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＨＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＰＴＳＦＳＬＤＦＧＨＬＲＮＫＡＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＹＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＤＫＥＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ

ｍＡＩＤ（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ

ｒＡＰＯＢＥＣ－１（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ

ｍａＡＰＯＢＥＣ－１（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓａｕｒａｔｕｓ）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＶＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＤＡＦＦＤＱＧＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＲＷＧＧＲＨＮＩＷＲＨＴＧＱＮＴＳＲＨＶＥＩＮＦＩＥＫＦＴＳＥＲＹＦＹＰＳＴＲＣＳＩＶＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＫＡＩＴＥＦＬＳＧＨＰＮＶＴＬＦＩＹＡＡＲＬＹＨＨＴＤＱＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＲＧＶＴＩＲＩＭＴＥＱＥＹＣＹＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＳＮＥＶＹＷＰＲＹＰＮＬＷＭＲＬＹＡＬＥＬＹＣＩＨＬＧＬＰＰＣＬＫＩＫＲＲＨＱＹＰＬＴＦＦＲＬＮＬＱＳＣＨＹＱＲＩＰＰＨＩＬＷＡＴＧＦＩ

ｐｐＡＰＯＢＥＣ－１（Ｐｏｎｇｏｐｙｇｍａｅｕｓ）：
ＭＴＳＥＫＧＰＳＴＧＤＰＴＬＲＲＲＩＥＳＷＥＦＤＶＦＹＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＫＷＧＭＳＲＫＩＷＲＳＳＧＫＮＴＴＮＨＶＥＶＮＦＩＫＫＦＴＳＥＲＲＦＨＳＳＩＳＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＱＡＩＲＥＦＬＳＱＨＰＧＶＴＬＶＩＹＶＡＲＬＦＷＨＭＤＱＲＮＲＱＧＬＲＤＬＶＮＳＧＶＴＩＱＩＭＲＡＳＥＹＹＨＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＧＤＥＡＨＷＰＱＹＰＰＬＷＭＭＬＹＡＬＥＬＨＣＩＩＬＳＬＰＰＣＬＫＩＳＲＲＷＱＮＨＬＡＦＦＲＬＨＬＱＮＣＨＹＱＴＩＰＰＨＩＬＬＡＴＧＬＩＨＰＳＶＴＷＲ

ｏｃＡＰＯＢＥＣ１（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）：
ＭＡＳＥＫＧＰＳＮＫＤＹＴＬＲＲＲＩＥＰＷＥＦＥＶＦＦＤＰＱＥＬＲＫＥＡＣＬＬＹＥＩＫＷＧＡＳＳＫＴＷＲＳＳＧＫＮＴＴＮＨＶＥＶＮＦＬＥＫＬＴＳＥＧＲＬＧＰＳＴＣＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＭＡＩＲＥＦＬＳＱＨＰＧＶＴＬＩＩＦＶＡＲＬＦＱＨＭＤＲＲＮＲＱＧＬＫＤＬＶＴＳＧＶＴＶＲＶＭＳＶＳＥＹＣＹＣＷＥＮＦＶＮＹＰＰＧＫＡＡＱＷＰＲＹＰＰＲＷＭＬＭＹＡＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＫＩＳＲＲＨＱＫＱＬＴＦＦＳＬＴＰＱＹＣＨＹＫＭＩＰＰＹＩＬＬＡＴＧＬＬＱＰＳＶＰＷＲ

ｍｄＡＰＯＢＥＣ－１（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）：
ＭＮＳＫＴＧＰＳＶＧＤＡＴＬＲＲＲＩＫＰＷＥＦＶＡＦＦＮＰＱＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＫＷＧＮＱＮＩＷＲＨＳＮＱＮＴＳＱＨＡＥＩＮＦＭＥＫＦＴＡＥＲＨＦＮＳＳＶＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＫＡＩＲＫＦＬＤＨＹＰＮＶＴＬＡＩＦＩＳＲＬＹＷＨＭＤＱＱＨＲＱＧＬＫＥＬＶＨＳＧＶＴＩＱＩＭＳＹＳＥＹＨＹＣＷＲＮＦＶＤＹＰＱＧＥＥＤＹＷＰＫＹＰＹＬＷＩＭＬＹＶＬＥＬＨＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＫＩＳＧＳＨＳＮＱＬＡＬＦＳＬＤＬＱＤＣＨＹＱＫＩＰＹＮＶＬＶＡＴＧＬＶＱＰＦＶＴＷＲ

ｐｐＡＰＯＢＥＣ－２（Ｐｏｎｇｏｐｙｇｍａｅｕｓ）：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＡＡＴＥＡＡＳＱＮＧＥＤＬＥＮＬＤＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＧＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＡＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＲＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＩＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＬＥＩＱＤＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＶＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＱＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ

ｂｔＡＰＯＢＥＣ－２（ＢｏｓＴａｕｒｕｓ）：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＡＡＡＥＰＡＳＱＮＧＥＥＶＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＨＹＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＳＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＴＮＨＡＥＥＡＦＦＮＳＩＭＰＴＦＤＰＡＬＲＹＭＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＶＫＴＬＮＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＰＥＩＱＡＡＬＲＫＬＫＥＡＧＣＲＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＩＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ

ｍＡＰＯＢＥＣ－３－（１）（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）：
ＭＱＰＱＲＬＧＰＲＡＧＭＧＰＦＣＬＧＣＳＨＲＫＣＹＳＰＩＲＮＬＩＳＱＥＴＦＫＦＨＦＫＮＬＧＹＡＫＧＲＫＤＴＦＬＣＹＥＶＴＲＫＤＣＤＳＰＶＳＬＨＨＧＶＦＫＮＫＤＮＩＨＡＥＩＣＦＬＹＷＦＨＤＫＶＬＫＶＬＳＰＲＥＥＦＫＩＴＷＹＭＳＷＳＰＣＦＥＣＡＥＱＩＶＲＦＬＡＴＨＨＮＬＳＬＤＩＦＳＳＲＬＹＮＶＱＤＰＥＴＱＱＮＬＣＲＬＶＱＥＧＡＱＶＡＡＭＤＬＹＥＦＫＫＣＷＫＫＦＶＤＮＧＧＲＲＦＲＰＷＫＲＬＬＴＮＦＲＹＱＤＳＫＬＱＥＩＬＲＰＣＹＩＳＶＰＳＳＳＳＳＴＬＳＮＩＣＬＴＫＧＬＰＥＴＲＦＷＶＥＧＲＲＭＤＰＬＳＥＥＥＦＹＳＱＦＹＮＱＲＶＫＨＬＣＹＹＨＲＭＫＰＹＬＣＹＱＬＥＱＦＮＧＱＡＰＬＫＧＣＬＬＳＥＫＧＫＱＨＡＥＩＬＦＬＤＫＩＲＳＭＥＬＳＱＶＴＩＴＣＹＬＴＷＳＰＣＰＮＣＡＷＱＬＡＡＦＫＲＤＲＰＤＬＩＬＨＩＹＴＳＲＬＹＦＨＷＫＲＰＦＱＫＧＬＣＳＬＷＱＳＧＩＬＶＤＶＭＤＬＰＱＦＴＤＣＷＴＮＦＶＮＰＫＲＰＦＷＰＷＫＧＬＥＩＩＳＲＲＴＱＲＲＬＲＲＩＫＥＳＷＧＬＱＤＬＶＮＤＦＧＮＬＱＬＧＰＰＭＳ

マウスＡＰＯＢＥＣ－３－（２）：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ラットＡＰＯＢＥＣ－３：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ｈＡＰＯＢＥＣ－３Ａ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＥＡＳＰＡＳＧＰＲＨＬＭＤＰＨＩＦＴＳＮＦＮＮＧＩＧＲＨＫＴＹＬＣＹＥＶＥＲＬＤＮＧＴＳＶＫＭＤＱＨＲＧＦＬＨＮＱＡＫＮＬＬＣＧＦＹＧＲＨＡＥＬＲＦＬＤＬＶＰＳＬＱＬＤＰＡＱＩＹＲＶＴＷＦＩＳＷＳＰＣＦＳＷＧＣＡＧＥＶＲＡＦＬＱＥＮＴＨＶＲＬＲＩＦＡＡＲＩＹＤＹＤＰＬＹＫＥＡＬＱＭＬＲＤＡＧＡＱＶＳＩＭＴＹＤＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（

ｈＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＫＰＨＦＲＮＴＶＥＲＭＹＲＤＴＦＳＹＮＦＹＮＲＰＩＬＳＲＲＮＴＶＷＬＣＹＥＶＫＴＫＧＰＳＲＰＲＬＤＡＫＩＦＲＧＱＶＹＳＱＰＥＨＨＡＥＭＣＦＬＳＷＦＣＧＮＱＬＰＡＹＫＣＦＱＩＴＷＦＶＳＷＴＰＣＰＤＣＶＡＫＬＡＥＦＬＡＥＨＰＮＶＴＬＴＩＳＡＡＲＬＹＹＹＷＥＲＤＹＲＲＡＬＣＲＬＳＱＡＧＡＲＶＫＩＭＤＤＥＥＦＡＹＣＷＥＮＦＶＹＳＥＧＱＰＦＭＰＷＹＫＦＤＤＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＮＰＭＥＡＭＹＰＨＩＦＹＦＨＦＫＮＬＲＫＡＹＧＲＮＥＳＷＬＣＦＴＭＥＶＶＫＨＨＳＰＶＳＷＫＲＧＶＦＲＮＱＶＤＰＥＴＨＣＨＡＥＲＣＦＬＳＷＦＣＤＤＩＬＳＰＮＴＮＹＥＶＴＷＹＴＳＷＳＰＣＰＥＣＡＧＥＶＡＥＦＬＡＲＨＳＮＶＮＬＴＩＦＴＡＲＬＹＹＦＷＤＴＤＹＱＥＧＬＲＳＬＳＱＥＧＡＳＶＥＩＭＧＹＫＤＦＫＹＣＷＥＮＦＶＹＮＤＤＥＰＦＫＰＷＫＧＬＫＹＮＦＬＦＬＤＳＫＬＱＥＩＬＥ

アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
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（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）

チンパンジーＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）

ミドリザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ラットＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
ＭＱＰＱＧＬＧＰＮＡＧＭＧＰＶＣＬＧＣＳＨＲＲＰＹＳＰＩＲＮＰＬＫＫＬＹＱＱＴＦＹＦＨＦＫＮＶＲＹＡＷＧＲＫＮＮＦＬＣＹＥＶＮＧＭＤＣＡＬＰＶＰＬＲＱＧＶＦＲＫＱＧＨＩＨＡＥＬＣＦＩＹＷＦＨＤＫＶＬＲＶＬＳＰＭＥＥＦＫＶＴＷＹＭＳＷＳＰＣＳＫＣＡＥＱＶＡＲＦＬＡＡＨＲＮＬＳＬＡＩＦＳＳＲＬＹＹＹＬＲＮＰＮＹＱＱＫＬＣＲＬＩＱＥＧＶＨＶＡＡＭＤＬＰＥＦＫＫＣＷＮＫＦＶＤＮＤＧＱＰＦＲＰＷＭＲＬＲＩＮＦＳＦＹＤＣＫＬＱＥＩＦＳＲＭＮＬＬＲＥＤＶＦＹＬＱＦＮＮＳＨＲＶＫＰＶＱＮＲＹＹＲＲＫＳＹＬＣＹＱＬＥＲＡＮＧＱＥＰＬＫＧＹＬＬＹＫＫＧＥＱＨＶＥＩＬＦＬＥＫＭＲＳＭＥＬＳＱＶＲＩＴＣＹＬＴＷＳＰＣＰＮＣＡＲＱＬＡＡＦＫＫＤＨＰＤＬＩＬＲＩＹＴＳＲＬＹＦＷＲＫＫＦＱＫＧＬＣＴＬＷＲＳＧＩＨＶＤＶＭＤＬＰＱＦＡＤＣＷＴＮＦＶＮＰＱＲＰＦＲＰＷＮＥＬＥＫＮＳＷＲＩＱＲＲＬＲＲＩＫＥＳＷＧＬ

ウシＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
ＤＧＷＥＶＡＦＲＳＧＴＶＬＫＡＧＶＬＧＶＳＭＴＥＧＷＡＧＳＧＨＰＧＱＧＡＣＶＷＴＰＧＴＲＮＴＭＮＬＬＲＥＶＬＦＫＱＱＦＧＮＱＰＲＶＰＡＰＹＹＲＲＫＴＹＬＣＹＱＬＫＱＲＮＤＬＴＬＤＲＧＣＦＲＮＫＫＱＲＨＡＥＲＦＩＤＫＩＮＳＬＤＬＮＰＳＱＳＹＫＩＩＣＹＩＴＷＳＰＣＰＮＣＡＮＥＬＶＮＦＩＴＲＮＮＨＬＫＬＥＩＦＡＳＲＬＹＦＨＷＩＫＳＦＫＭＧＬＱＤＬＱＮＡＧＩＳＶＡＶＭＴＨＴＥＦＥＤＣＷＥＱＦＶＤＮＱＳＲＰＦＱＰＷＤＫＬＥＱＹＳＡＳＩＲＲＲＬＱＲＩＬＴＡＰＩ

チンパンジーＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
ＭＮＰＱＩＲＮＰＭＥＷＭＹＱＲＴＦＹＹＮＦＥＮＥＰＩＬＹＧＲＳＹＴＷＬＣＹＥＶＫＩＲＲＧＨＳＮＬＬＷＤＴＧＶＦＲＧＱＭＹＳＱＰＥＨＨＡＥＭＣＦＬＳＷＦＣＧＮＱＬＳＡＹＫＣＦＱＩＴＷＦＶＳＷＴＰＣＰＤＣＶＡＫＬＡＫＦＬＡＥＨＰＮＶＴＬＴＩＳＡＡＲＬＹＹＹＷＥＲＤＹＲＲＡＬＣＲＬＳＱＡＧＡＲＶＫＩＭＤＤＥＥＦＡＹＣＷＥＮＦＶＹＮＥＧＱＰＦＭＰＷＹＫＦＤＤＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＩＲＨＬＭＤＰＤＴＦＴＦＮＦＮＮＤＰＬＶＬＲＲＨＱＴＹＬＣＹＥＶＥＲＬＤＮＧＴＷＶＬＭＤＱＨＭＧＦＬＣＮＥＡＫＮＬＬＣＧＦＹＧＲＨＡＥＬＲＦＬＤＬＶＰＳＬＱＬＤＰＡＱＩＹＲＶＴＷＦＩＳＷＳＰＣＦＳＷＧＣＡＧＱＶＲＡＦＬＱＥＮＴＨＶＲＬＲＩＦＡＡＲＩＹＤＹＤＰＬＹＫＥＡＬＱＭＬＲＤＡＧＡＱＶＳＩＭＴＹＤＥＦＥＹＣＷＤＴＦＶＹＲＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＶＲＡＳＳＬＣＭＶＰＨＲＰＰＰＰＰＱＳＰＧＰＣＬＰＬＣＳＥＰＰＬＧＳＬＬＰＴＧＲＰＡＰＳＬＰＦＬＬＴＡＳＦＳＦＰＰＰＡＳＬＰＰＬＰＳＬＳＬＳＰＧＨＬＰＶＰＳＦＨＳＬＴＳＣＳＩＱＰＰＣＳＳＲＩＲＥＴＥＧＷＡＳＶＳＫＥＧＲＤＬＧ

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ゴリラＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ
（斜体：核酸編集ドメイン）

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ウシＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：
ＭＡＬＬＴＡＫＴＦＳＬＱＦＮＮＫＲＲＶＮＫＰＹＹＰＲＫＡＬＬＣＹＱＬＴＰＱＮＧＳＴＰＴＲＧＨＬＫＮＫＫＫＤＨＡＥＩＲＦＩＮＫＩＫＳＭＧＬＤＥＴＱＣＹＱＶＴＣＹＬＴＷＳＰＣＰＳＣＡＧＥＬＶＤＦＩＫＡＨＲＨＬＮＬＲＩＦＡＳＲＬＹＹＨＷＲＰＮＹＱＥＧＬＬＬＬＣＧＳＱＶＰＶＥＶＭＧＬＰＥＦＴＤＣＷＥＮＦＶＤＨＫＥＰＰＳＦＮＰＳＥＫＬＥＥＬＤＫＮＳＱＡＩＫＲＲＬＥＲＩＫＳＲＳＶＤＶＬＥＮＧＬＲＳＬＱＬＧＰＶＴＰＳＳＳＩＲＮＳＲ

ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｄ：
（斜体：核酸編集ドメイン）

ヒトＡＰＯＢＥＣ－１：
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ラットＡＰＯＢＥＣ－１：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ

ヒトＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＶＡＴＥＡＡＳＱＮＧＥＤＬＥＮＬＤＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＧＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＡＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＲＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＩＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＰＥＩＱＡＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＶＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＱＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ

マウスＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＥＡＡＡＰＡＳＱＮＧＤＤＬＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＤＬＰＰＦＥＩＶＴＧＶＲＬＰＶＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＶＱＳＫＧＧＱＡＱＡＴＱＧＹＬＥＤＥＨＡＧＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＫＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＬＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＳＲＬＦＭＷＥＥＰＥＶＱＡＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＩＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ

ラットＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＥＡＡＡＰＡＳＱＮＧＤＤＬＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＤＬＰＰＦＥＩＶＴＧＶＲＬＰＶＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＳＫＧＧＱＶＱＡＴＱＧＹＬＥＤＥＨＡＧＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＫＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＬＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＳＲＬＦＭＷＥＥＰＥＶＱＡＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＬＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ

ウシＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＡＡＡＥＰＡＳＱＮＧＥＥＶＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＨＹＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＳＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＴＮＨＡＥＥＡＦＦＮＳＩＭＰＴＦＤＰＡＬＲＹＭＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＶＫＴＬＮＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＰＥＩＱＡＡＬＲＫＬＫＥＡＧＣＲＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＩＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ

ヤツメウナギＣＤＡ１（ｐｍＣＤＡｌ）：
ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＦＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶ

ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧＤ３１６ＲＤ３１７Ｒ：
ＭＫＰＨＦＲＮＴＶＥＲＭＹＲＤＴＦＳＹＮＦＹＮＲＰＩＬＳＲＲＮＴＶＷＬＣＹＥＶＫＴＫＧＰＳＲＰＰＬＤＡＫＩＦＲＧＱＶＹＳＥＬＫＹＨＰＥＭＲＦＦＨＷＦＳＫＷＲＫＬＨＲＤＱＥＹＥＶＴＷＹＩＳＷＳＰＣＴＫＣＴＲＤＭＡＴＦＬＡＥＤＰＫＶＴＬＴＩＦＶＡＲＬＹＹＦＷＤＰＤＹＱＥＡＬＲＳＬＣＱＫＲＤＧＰＲＡＴＭＫＦＮＹＤＥＦＱＨＣＷＳＫＦＶＹＳＱＲＥＬＦＥＰＷＮＮＬＰＫＹＹＩＬＬＨＦＭＬＧＥＩＬＲＨＳＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＶＲＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＲＲＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＦＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＥＮ

ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧＡ鎖：
ＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＷＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＮＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＤＤＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＦＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱ

ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧＡ鎖Ｄ１２０ＲＤ１２１Ｒ：
ＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＶＲＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＮＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＲＲＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＦＭＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱ

ｈＡＰＯＢＥＣ－４（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＥＰＩＹＥＥＹＬＡＮＨＧＴＩＶＫＰＹＹＷＬＳＦＳＬＤＣＳＮＣＰＹＨＩＲＴＧＥＥＡＲＶＳＬＴＥＦＣＱＩＦＧＦＰＹＧＴＴＦＰＱＴＫＨＬＴＦＹＥＬＫＴＳＳＧＳＬＶＱＫＧＨＡＳＳＣＴＧＮＹＩＨＰＥＳＭＬＦＥＭＮＧＹＬＤＳＡＩＹＮＮＤＳＩＲＨＩＩＬＹＳＮＮＳＰＣＮＥＡＮＨＣＣＩＳＫＭＹＮＦＬＩＴＹＰＧＩＴＬＳＩＹＦＳＱＬＹＨＴＥＭＤＦＰＡＳＡＷＮＲＥＡＬＲＳＬＡＳＬＷＰＲＶＶＬＳＰＩＳＧＧＩＷＨＳＶＬＨＳＦＩＳＧＶＳＧＳＨＶＦＱＰＩＬＴＧＲＡＬＡＤＲＨＮＡＹＥＩＮＡＩＴＧＶＫＰＹＦＴＤＶＬＬＱＴＫＲＮＰＮＴＫＡＱＥＡＬＥＳＹＰＬＮＮＡＦＰＧＱＦＦＱＭＰＳＧＱＬＱＰＮＬＰＰＤＬＲＡＰＶＶＦＶＬＶＰＬＲＤＬＰＰＭＨＭＧＱＮＰＮＫＰＲＮＩＶＲＨＬＮＭＰＱＭＳＦＱＥＴＫＤＬＧＲＬＰＴＧＲＳＶＥＩＶＥＩＴＥＱＦＡＳＳＫＥＡＤＥＫＫＫＫＫＧＫＫ

ｍＡＰＯＢＥＣ－４（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）：
ＭＤＳＬＬＭＫＱＫＫＦＬＹＨＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＨＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＣＳＬＤＦＧＨＬＲＮＫＳＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＥＦＬＲＷＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＧＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＲＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＴＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＭＬＧＦ

ｒＡＰＯＢＥＣ－４（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）：
ＭＥＰＬＹＥＥＹＬＴＨＳＧＴＩＶＫＰＹＹＷＬＳＶＳＬＮＣＴＮＣＰＹＨＩＲＴＧＥＥＡＲＶＰＹＴＥＦＨＱＴＦＧＦＰＷＳＴＹＰＱＴＫＨＬＴＦＹＥＬＲＳＳＳＧＮＬＩＱＫＧＬＡＳＮＣＴＧＳＨＴＨＰＥＳＭＬＦＥＲＤＧＹＬＤＳＬＩＦＨＤＳＮＩＲＨＩＩＬＹＳＮＮＳＰＣＤＥＡＮＨＣＣＩＳＫＭＹＮＦＬＭＮＹＰＥＶＴＬＳＶＦＦＳＱＬＹＨＴＥＮＱＦＰＴＳＡＷＮＲＥＡＬＲＧＬＡＳＬＷＰＱＶＴＬＳＡＩＳＧＧＩＷＱＳＩＬＥＴＦＶＳＧＩＳＥＧＬＴＡＶＲＰＦＴＡＧＲＴＬＴＤＲＹＮＡＹＥＩＮＣＩＴＥＶＫＰＹＦＴＤＡＬＨＳＷＱＫＥＮＱＤＱＫＶＷＡＡＳＥＮＱＰＬＨＮＴＴＰＡＱＷＱＰＤＭＳＱＤＣＲＴＰＡＶＦＭＬＶＰＹＲＤＬＰＰＩＨＶＮＰＳＰＱＫＰＲＴＶＶＲＨＬＮＴＬＱＬＳＡＳＫＶＫＡＬＲＫＳＰＳＧＲＰＶＫＫＥＥＡＲＫＧＳＴＲＳＱＥＡＮＥＴＮＫＳＫＷＫＫＱＴＬＦＩＫＳＮＩＣＨＬＬＥＲＥＱＫＫＩＧＩＬＳＳＷＳＶ

ｍｆＡＰＯＢＥＣ－４（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）：
ＭＥＰＴＹＥＥＹＬＡＮＨＧＴＩＶＫＰＹＹＷＬＳＦＳＬＤＣＳＮＣＰＹＨＩＲＴＧＥＥＡＲＶＳＬＴＥＦＣＱＩＦＧＦＰＹＧＴＴＹＰＱＴＫＨＬＴＦＹＥＬＫＴＳＳＧＳＬＶＱＫＧＨＡＳＳＣＴＧＮＹＩＨＰＥＳＭＬＦＥＭＮＧＹＬＤＳＡＩＹＮＮＤＳＩＲＨＩＩＬＹＣＮＮＳＰＣＮＥＡＮＨＣＣＩＳＫＶＹＮＦＬＩＴＹＰＧＩＴＬＳＩＹＦＳＱＬＹＨＴＥＭＤＦＰＡＳＡＷＮＲＥＡＬＲＳＬＡＳＬＷＰＲＶＶＬＳＰＩＳＧＧＩＷＨＳＶＬＨＳＦＶＳＧＶＳＧＳＨＶＦＱＰＩＬＴＧＲＡＬＴＤＲＹＮＡＹＥＩＮＡＩＴＧＶＫＰＦＦＴＤＶＬＬＨＴＫＲＮＰＮＴＫＡＱＭＡＬＥＳＹＰＬＮＮＡＦＰＧＱＳＦＱＭＴＳＧＩＰＰＤＬＲＡＰＶＶＦＶＬＬＰＬＲＤＬＰＰＭＨＭＧＱＤＰＮＫＰＲＮＩＩＲＨＬＮＭＰＱＭＳＦＱＥＴＫＤＬＥＲＬＰＴＲＲＳＶＥＴＶＥＩＴＥＲＦＡＳＳＫＱＡＥＥＫＴＫＫＫＫＧＫＫ

ｐｍＣＤＡ－１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓ）：
ＭＡＧＹＥＣＶＲＶＳＥＫＬＤＦＤＴＦＥＦＱＦＥＮＬＨＹＡＴＥＲＨＲＴＹＶＩＦＤＶＫＰＱＳＡＧＧＲＳＲＲＬＷＧＹＩＩＮＮＰＮＶＣＨＡＥＬＩＬＭＳＭＩＤＲＨＬＥＳＮＰＧＶＹＡＭＴＷＹＭＳＷＳＰＣＡＮＣＳＳＫＬＮＰＷＬＫＮＬＬＥＥＱＧＨＴＬＴＭＨＦＳＲＩＹＤＲＤＲＥＧＤＨＲＧＬＲＧＬＫＨＶＳＮＳＦＲＭＧＶＶＧＲＡＥＶＫＥＣＬＡＥＹＶＥＡＳＲＲＴＬＴＷＬＤＴＴＥＳＭＡＡＫＭＲＲＫＬＦＣＩＬＶＲＣＡＧＭＲＥＳＧＩＰＬＨＬＦＴＬＱＴＰＬＬＳＧＲＶＶＷＷＲＶ

ｐｍＣＤＡ－２（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓ）：
ＭＥＬＲＥＶＶＤＣＡＬＡＳＣＶＲＨＥＰＬＳＲＶＡＦＬＲＣＦＡＡＰＳＱＫＰＲＧＴＶＩＬＦＹＶＥＧＡＧＲＧＶＴＧＧＨＡＶＮＹＮＫＱＧＴＳＩＨＡＥＶＬＬＬＳＡＶＲＡＡＬＬＲＲＲＲＣＥＤＧＥＥＡＴＲＧＣＴＬＨＣＹＳＴＹＳＰＣＲＤＣＶＥＹＩＱＥＦＧＡＳＴＧＶＲＶＶＩＨＣＣＲＬＹＥＬＤＶＮＲＲＲＳＥＡＥＧＶＬＲＳＬＳＲＬＧＲＤＦＲＬＭＧＰＲＤＡＩＡＬＬＬＧＧＲＬＡＮＴＡＤＧＥＳＧＡＳＧＮＡＷＶＴＥＴＮＶＶＥＰＬＶＤＭＴＧＦＧＤＥＤＬＨＡＱＶＱＲＮＫＱＩＲＥＡＹＡＮＹＡＳＡＶＳＬＭＬＧＥＬＨＶＤＰＤＫＦＰＦＬＡＥＦＬＡＱＴＳＶＥＰＳＧＴＰＲＥＴＲＧＲＰＲＧＡＳＳＲＧＰＥＩＧＲＱＲＰＡＤＦＥＲＡＬＧＡＹＧＬＦＬＨＰＲＩＶＳＲＥＡＤＲＥＥＩＫＲＤＬＩＶＶＭＲＫＨＮＹＱＧＰ

ｐｍＣＤＡ－５（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓ）：
ＭＡＧＤＥＮＶＲＶＳＥＫＬＤＦＤＴＦＥＦＱＦＥＮＬＨＹＡＴＥＲＨＲＴＹＶＩＦＤＶＫＰＱＳＡＧＧＲＳＲＲＬＷＧＹＩＩＮＮＰＮＶＣＨＡＥＬＩＬＭＳＭＩＤＲＨＬＥＳＮＰＧＶＹＡＭＴＷＹＭＳＷＳＰＣＡＮＣＳＳＫＬＮＰＷＬＫＮＬＬＥＥＱＧＨＴＬＭＭＨＦＳＲＩＹＤＲＤＲＥＧＤＨＲＧＬＲＧＬＫＨＶＳＮＳＦＲＭＧＶＶＧＲＡＥＶＫＥＣＬＡＥＹＶＥＡＳＲＲＴＬＴＷＬＤＴＴＥＳＭＡＡＫＭＲＲＫＬＦＣＩＬＶＲＣＡＧＭＲＥＳＧＭＰＬＨＬＦＴ

ｙＣＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：
ＭＶＴＧＧＭＡＳＫＷＤＱＫＧＭＤＩＡＹＥＥＡＡＬＧＹＫＥＧＧＶＰＩＧＧＣＬＩＮＮＫＤＧＳＶＬＧＲＧＨＮＭＲＦＱＫＧＳＡＴＬＨＧＥＩＳＴＬＥＮＣＧＲＬＥＧＫＶＹＫＤＴＴＬＹＴＴＬＳＰＣＤＭＣＴＧＡＩＩＭＹＧＩＰＲＣＶＶＧＥＮＶＮＦＫＳＫＧＥＫＹＬＱＴＲＧＨＥＶＶＶＶＤＤＥＲＣＫＫＩＭＫＱＦＩＤＥＲＰＱＤＷＦＥＤＩＧＥ

ｒＡＰＯＢＥＣ－１（Δ１７７－１８６）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ

ｒＡＰＯＢＥＣ－１（Δ２０２－２１３）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ

マウスＡＰＯＢＥＣ－３：
（斜体：核酸編集ドメイン）

本開示の一部の態様は、例えば、デアミナーゼドメインにおける点変異を作製することによって、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかのデアミナーゼドメインの触媒活性を調節することが、融合タンパク質（例えば、塩基エディター）の処理性に影響するという認識に基づく。例えば、塩基編集融合タンパク質内のデアミナーゼドメインの触媒活性を低下させるが除去しない変異は、デアミナーゼドメインが標的残基に隣接する残基の脱アミノ化を触媒し、それによって、脱アミノ化のウィンドウを狭める可能性を低くすることができる。脱アミノ化のウィンドウを狭める能力は、特定の標的残基に隣接する残基の望ましくない脱アミノ化を防ぐことができ、オフターゲット効果を低減または防止することができる。

例えば、一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１Ｘ、Ｈ１２２Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１１８Ｘ、Ｗ９０Ｘ、Ｗ９０Ｘ、およびＲ１３２Ｘ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）からなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１Ｒ、Ｈ１２２Ｒ、Ｒ１２６Ａ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１１８Ａ、Ｗ９０Ａ、Ｗ９０Ｙ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むことができる。

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６Ｘ、Ｄ３１７Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３１３Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｒ３２６Ｘ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）からなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６Ｒ、Ｄ３１７Ｒ、Ｒ３２０Ａ、Ｒ３２０Ｅ、Ｒ３１３Ａ、Ｗ２８５Ａ、Ｗ２８５Ｙ、Ｒ３２６Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１ＲおよびＨ１２２Ｒ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１１８Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ｙ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０ＹおよびＲ１２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６ＥおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０ＹおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。

一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６ＲおよびＤ３１７Ｒ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３１３Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ｙ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５ＹおよびＲ３２０Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０ＥおよびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５ＹおよびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含むことができる。

いくつかの修飾シチジンデアミナーゼが市販されており、これらに限定されないが、ＳａＢＥ３、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＥＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、およびＹＥＥ－ＢＥ３が挙げられ、これらは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である（プラスミド８５１６９、８５１７０、８５１７１、８５１７２、８５１７３、８５１７４、８５１７５、８５１７６、８５１７７）。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部または一部を含む。

ＣからＴの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）に記載されている（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

シチジンデアミナーゼ
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１つ以上のシチジンデアミナーゼドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼは、シトシンまたは５－メチルシトシンをウラシルまたはチミンに脱アミノすることができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼは、ＤＮＡのシトシンを脱アミノ化することができる。シチジンデアミナーゼは、任意の好適な生物に由来し得る。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、本明細書に提供される変異のいずれかに対応する１つ以上の変異を含む、天然に存在するシチジンデアミナーゼである。当業者は、例えば、配列整列および相同残基の決定によって、任意の相同タンパク質の対応する残基を特定することができるであろう。したがって、当業者であれば、本明細書に記載の変異のいずれかに対応する任意の天然に存在するシチジンデアミナーゼにおける変異を生成することができるであろう。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、原核生物由来である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、細菌由来である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、哺乳動物（例えば、ヒト）由来である。

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼが、１つ以上の変異（例えば、本明細書に提供される変異のいずれか）を含み得ることを理解されたい。一部の実施形態は、任意の以前の態様または本明細書に記載のシチジンデアミナーゼ核酸塩基エディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化される。

本開示は、特定のパーセント同一性、加えて、本明細書に記載の変異またはそれらの組み合わせのうちのいずれかを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼのいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。

本発明第２のタンパク質の融合タンパク質は、２つ以上の核酸編集ドメインを含む。一部の実施形態では、核酸編集ドメインは、ＣからＵの塩基変化を触媒することができる。一部の実施形態では、核酸編集ドメインは、デアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、脊椎動物デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、無脊椎動物デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスのデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒトデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ラットデアミナーゼ（例えば、ｒＡＰＯＢＥＣ１）である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓシチジンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡ１）である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇの断片である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇバリアントであり、Ｄ３１６ＲＤ３１７Ｒ変異を含む。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇの断片であり、Ｄ３１６ＲＤ３１７Ｒ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態では、核酸編集ドメインは、本明細書に記載の任意のデアミナーゼのデアミナーゼドメインと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。

特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する１つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、または二本鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖を切断するＣａｓ９ドメイン（Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される）を有し得る。

高忠実度Ｃａｓ９ドメイン
本開示の一部の態様は、高忠実度Ｃａｓ９ドメインを提供する。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、操作されたＣａｓ９ドメインであり、対応する野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格との間の静電相互作用を減少させる１つ以上の変異を含む。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、ＤＮＡの糖－リン酸骨格との静電相互作用が減少しており、より少ないオフターゲット効果を有し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、野生型Ｃａｓ９ドメイン）は、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格との間の会合を減少させる１つ以上の変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格との間の会合を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％減少させる１つ以上の変異を含む。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９融合タンパク質のいずれかは、Ｎ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／もしくはＱ９２６Ｘ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異のうちの１つ以上を含む（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）。一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９融合タンパク質のいずれかは、本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおけるＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、および／もしくはＱ９２６Ａ変異、または対応する変異のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれにおける対応する変異を含む。高い忠実度を有するＣａｓ９ドメインは、当該技術分野で既知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高い忠実度を有するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔａｌ．“Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｗｉｔｈｎｏｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔｓ．”Ｎａｔｕｒｅ５２９，４９０－４９５（２０１６）；ａｎｄＳｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔａｌ．“ＲａｔｉｏｎａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ３５１，８４－８８（２０１５）に記載されている（各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、修飾Ｃａｓ９は、高忠実度Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、または超正確Ｃａｓ９バリアント（ＨｙｐａＣａｓ９）である。修飾Ｃａｓ９ｅＳｐＣａｓ９（１．１）は、ＨＮＨ／ＲｕｖＣグルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）と非標的ＤＮＡ鎖との間の相互作用を弱めるアラニン置換を含み、鎖の分離を防止し、オフターゲット部位での切断を防止する。同様に、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は、Ｃａｓ９とＤＮＡリン酸骨格との相互作用を破壊するアラニン置換を介してオフターゲット編集を低下させる。ＨｙｐａＣａｓ９は、ＲＥＣ３ドメイン内に、Ｃａｓ９プルーフリーディングおよび標的識別を高める変異（ＳｐＣａｓ９Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ）を含む。３つすべての高忠実度酵素は、野生型Ｃａｓ９よりも少ないオフターゲット編集を生成する。

例示的な高忠実度Ｃａｓ９を、以下に提供する。Ｃａｓ９に対する高忠実度Ｃａｓ９ドメインの変異を、太字および下線で示す。
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

ｎａｐＤＮＡｂｐと、シチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼとを含む融合タンパク質
本開示の一部の態様は、Ｃａｓ９ドメインまたは他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２）、および１つ以上のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼドメイン、および／またはＤＮＡグリコシラーゼドメインを含む融合タンパク質を提供する。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）のいずれであり得ることを理解されたい。一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）のうちのいずれかが、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼのうちのいずれかと融合され得る。本明細書に開示される塩基エディターのドメインは、任意の順序で配置され得る。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下のドメインＡ～Ｃ、Ａ～Ｄ、またはＡ～Ｅを含み：
ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ－Ｃ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ］－ＣＯＯＨ、
式中、ＡおよびＣ、またはＡ、Ｃ、およびＥは、各々、以下のうちの１つ以上を含み：
アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
ＤＮＡグリコシラーゼドメインまたはその活性断片、
式中、Ｂ、またはＢおよびＤは、各々、核酸配列特異的結合活性を有する１つ以上のドメインを含む。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造を含み：
ＮＨ_２－［Ａ_ｎ－Ｂ_ｏ－Ｃ_ｎ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ_２－［Ａ_ｎ－Ｂ_ｏ－Ｃ_ｎ－Ｄ_ｏ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［Ａ_ｎ－Ｂ_ｏ－Ｃ_ｐ－Ｄ_ｏ－Ｅ_ｑ］－ＣＯＯＨ、
式中、ＡおよびＣ、またはＡ、Ｃ、およびＥは、各々、以下のうちの１つ以上を含み：
アデノシンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
シチジンデアミナーゼドメインまたはその活性断片、
ＤＮＡグリコシラーゼドメインまたはその活性断片、
式中、ｎは整数：１、２、３、４、または５であり、ｐは、整数：０、１、２、３、４、または５であり、ｑは、整数：０、１、２、３、４、または５であり、式中、Ｂ、またはＢおよびＤは、各々、核酸配列特異的結合活性を有するドメインを含み、式中、ｏは、整数：１、２、３、４、または５である。

例えば、限定されないが、一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造を含む：
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓ１２ドメインまたはＣａｓ１２タンパク質のうちのいずれかが、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼのうちのいずれかと融合され得る。例えば、限定されないが、一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造を含む：
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８である。例示的な融合タンパク質の構造としては、以下が挙げられる：
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ１２ドメイン］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［Ｃａｓ１２ドメイン］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、融合タンパク質のアデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８と、シチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼとを含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。

例示的な融合タンパク質の構造としては、以下が挙げられる：
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、融合タンパク質のアデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊９と、シチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼとを含む。例示的な融合タンパク質の構造としては、以下が挙げられる：
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊９］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ＊９］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［ＴａｄＡ＊９］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２］－［ＴａｄＡ＊９］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端断片に隣接するデアミナーゼと、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ポリペプチドのＣ末端断片とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端断片に隣接するシチジンデアミナーゼと、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ポリペプチドのＣ末端断片とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端断片に隣接するアデノシンデアミナーゼと、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ポリペプチドのＣ末端断片とを含む。

一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼと、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ドメイン）とを含む融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態では、リンカーは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。一部の実施形態では、上記の一般的なアーキテクチャで使用される「－」は、任意のリンカーの存在を示す。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼと、ｎａｐＤＮＡｂｐとは、本明細書に提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。例えば、一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼと、ｎａｐＤＮＡｂｐとは、本明細書に提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。

本開示の融合タンパク質は、１つ以上の追加の特徴を含み得ることを理解されたい。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、阻害因子、細胞質局在化配列、輸送配列（例えば、核外輸送配列）、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含んでもよい。本明細書に提供される好適なタンパク質タグとしては、これらに限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、ソフトタグ（例えば、ソフトタグ１、ソフトタグ３）、ストレプタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが挙げられる。さらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のＨｉｓタグを含む。

例示的であるが非限定的な融合タンパク質は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４４９３５号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４４９３５号、および第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１６２８８号に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。

核局在化配列（ＮＬＳ）を含む融合タンパク質
一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５）核標的化配列、例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。一実施形態では、二分ＮＬＳが使用される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、（例えば、核内輸送によって）細胞核へのＮＬＳを含むタンパク質の移入を促進するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ｎＣａｓ９ドメインまたはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ１２ドメインのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ１２ドメインのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、１つ以上のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、リンカーなしで融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書で提供または参照されるＮＬＳ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。追加の核局在化配列は、当該技術分野で既知であり、当業者には明らかであろう。例えば、ＮＬＳ配列は、Ｐｌａｎｋｅｔａｌ．，ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０に記載されている（それらの内容は、例示的な核局在化配列の開示のために、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ、またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣを含む。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＮＬＳを含む融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態では、ドメインまたはタンパク質（例えば、シチジンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、またはＮＬＳ）のうちの１つ以上の間に、リンカー配列が存在する。一部の実施形態では、リンカーは、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼドメインと、ｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。一部の実施形態では、以下の一般的なアーキテクチャで使用される「－」は、任意のリンカーの存在を示す。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼと、ｎａｐＤＮＡｂｐとは、本明細書に提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。例えば、一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼと、ｎａｐＤＮＡｂｐとが、本明細書に提供されるリンカーのいずれかを介して融合される。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼと、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）ドメインとを有する例示的なｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）融合タンパク質の一般的アーキテクチャは、以下の構造のいずれか１つを含む。ここで、ＮＬＳは、核局在化配列（例えば、本明細書に提供される任意のＮＬＳ）であり、ＮＨ_２は、融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは、融合タンパク質のＣ末端である：
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－ＮＬＳ－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］［シチジンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ、または

ＮＨ_２－［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ。一部の実施形態では、ＮＬＳは、例えば、本明細書に記載されるように、リンカー内に存在するか、またはＮＬＳは、リンカーに隣接している。二分ＮＬＳは、２つの塩基性アミノ酸クラスターを含み、比較的短いスペーサー配列によって分離されている（したがって、二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）－２つの部分であり、一方、一分（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳはそうではない）。ヌクレオプラズミンのＮＬＳ、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫは、約１０アミノ酸のスペーサーによって分離された２つのクラスターの塩基性アミノ酸という、普遍的な二分シグナルのプロトタイプである。例示的な二分ＮＬＳの配列は、以下のとおりである：
ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ

１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のＮＬＳが使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端もしくはその近くにＮＬＳを含むか、カルボキシ末端もしくはその近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳを含むか、またはそれらの任意の組み合わせのＮＬＳ（例えば、アミノ末端に１つ以上のＮＬＳ、およびカルボキシ末端に１つ以上のＮＬＳ）を含むことができる。複数のＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが複数のコピーに存在し得るように、かつ／または１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで１つ以上のコピーに存在し得るように、各々が、他とは独立して選択され得る。

本方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、約６個のＮＬＳを含むことができる。ＮＬＳは、ＮＬＳに最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端から、ポリペプチド鎖に沿って、約５０アミノ酸以内（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０アミノ酸以内）にある場合、Ｎ末端またはＣ末端付近とみなされる。

追加のドメイン
本明細書に記載の塩基エディターは、ポリヌクレオチドの核酸塩基の編集、修飾、または改変を促進するのを助ける任意のドメインを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）、および１つ以上の追加のドメインを含む。一部の実施形態では、追加のドメインは、塩基エディターの酵素機能もしくは触媒機能、塩基エディターの結合機能を促進させ得るか、または所望の塩基編集結果を妨げ得る細胞機構（例えば、酵素）の阻害因子であり得る。一部の実施形態では、塩基エディターは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、または転写リプレッサードメインを含むことができる。

一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、Ｕ：Ｇヘテロ二重鎖ＤＮＡの存在に対する細胞のＤＮＡ修復応答は、細胞における核酸塩基編集効率の低下の原因となり得る。かかる実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、細胞のＤＮＡからのＵの除去を触媒することができ、塩基除去修復（ＢＥＲ）を開始して、主に、Ｕ：Ｇ対からＣ：Ｇ対への復帰をもたらすことができる。かかる実施形態では、ＢＥＲは、一本鎖に結合し、編集された塩基をブロックし、ＵＧＩを阻害し、ＢＥＲを阻害し、編集された塩基を保護し、かつ／または編集されていない鎖の修復を促進する、１つ以上のドメインを含む塩基エディターで阻害され得る。したがって、本開示は、ＵＧＩドメインを含む塩基エディター融合タンパク質を企図する。

一部の実施形態では、塩基エディターは、ドメインとして、二本鎖切断（ＤＳＢ）結合タンパク質の全部または一部を含む。例えば、ＤＳＢ結合タンパク質は、ＤＳＢの末端に結合し、それらを分解から保護することができるバクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質を含むことができる。Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

加えて、一部の実施形態では、Ｇａｍタンパク質は、塩基エディターのＮ末端に融合され得る。一部の実施形態では、Ｇａｍタンパク質は、塩基エディターのＣ末端に融合され得る。バクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の末端に結合し、それらを分解から保護することができる。一部の実施形態では、ＤＳＢの遊離末端に結合するＧａｍを使用して、塩基編集のプロセス中のインデルの形成を低減することができる。一部の実施形態では、１７４残基のＧａｍタンパク質が、塩基エディターのＮ末端に融合される。Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい。一部の実施形態では、変異（複数可）は、野生型ドメインに対して、塩基エディタードメインの長さを変化させることができる。例えば、少なくとも１つのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、塩基エディターの長さを減少させ得る。別の場合、変異（複数可）は、野生型ドメインに対して、ドメインの長さを変化させない。例えば、任意のドメインにおける置換は、塩基エディターの長さを変化させない。

すべてのドメインの長さが野生型ドメインと同じである場合、かかる塩基エディターの非限定的な例としては、以下が挙げられる：
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ２－［ＵＧＩ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［ＡＰＯＢＥＣ１］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ。

塩基エディターシステム
塩基エディターシステムを使用して核酸塩基を編集するためのシステム、組成物、および方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）塩基エディター（ＢＥ）であって、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインおよび核酸塩基を編集するための核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）を含む、塩基エディターと、（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと併せてガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と、を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼであり得る。一部の実施形態では、アデノシン塩基エディターは、ＤＮＡのアデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡのシチジンを脱アミノ化することができる。

一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、ゲノム編集に対する新たなアプローチを提供し、触媒的に欠陥のあるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９、デアミナーゼ（例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ）、および塩基除去修復の阻害因子を含む融合タンパク質を使用して、二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく、ドナーＤＮＡ鋳型を必要とせず、また、過剰な確率的な挿入および欠失を誘発することなく、ＤＮＡにおけるプログラマブルな一本鎖ヌクレオチド変化（ＣからＴまたはＡからＧ）を誘発する。

核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）も参照されたい（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

本明細書に提供される塩基エディターシステムの使用は、（ａ）対象のポリヌクレオチド（例えば、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）の標的ヌクレオチド配列を、核酸塩基エディター（例えば、アデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター）とガイドポリ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）とを含む塩基エディターシステムと接触させるステップであって、標的ヌクレオチド配列が、標的核酸塩基対を含む、接触させるステップと、（ｂ）当該標的領域の鎖分離を誘導するステップと、（ｃ）標的領域の一本鎖における当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換するステップと、（ｄ）当該標的領域の１つ以下の鎖を切断するステップであって、第１の核酸塩基塩基に相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられる、切断するステップと、を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が省略されることを理解されたい。一部の実施形態では、当該標的核酸塩基対は、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対である。一部の実施形態では、本発明に提供される塩基エディターシステムは、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｉｔｉｎｇ）が可能である。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、１つ以上の遺伝子に位置し、少なくとも１つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。

一部の実施形態では、カットされた一本鎖（ニック鎖）は、ガイド核酸にハイブリダイズする。一部の実施形態では、カットされた一本鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖と反対側である。一部の実施形態では、塩基エディターは、Ｃａｓ９ドメインを含む。一部の実施形態では、第１の塩基は、アデニンであり、第２の塩基は、Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＴではない。一部の実施形態では、第２の塩基は、イノシンである。

一部の実施形態では、シングルガイドポリヌクレオチドを利用して、デアミナーゼを標的核酸配列に標的指向化してもよい。一部の実施形態では、一対のガイドポリヌクレオチドを利用して、異なるデアミナーゼを標的核酸配列に標的指向化してもよい。

塩基エディターシステムの核酸塩基成分およびポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合成分は、互いに共有結合的または非共有結合的に会合することができる。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって、標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインと非共有結合的に相互作用するか、またはデアミナーゼドメインと会合することによって、デアミナーゼドメインを標的ヌクレオチド配列に標的指向化することができる。例えば、一部の実施形態では、核酸塩基編集成分（例えば、デアミナーゼ成分）は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である追加の異種部分もしくは異種ドメインと相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る追加の異種部分または異種ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドに結合し得るか、ポリペプチドと相互作用し得るか、ポリペプチドと会合し得るか、またはポリペプチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドに結合し得るか、ポリヌクレオチドと相互作用し得るか、ポリヌクレオチドと会合し得るか、またはポリヌクレオチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合し得る場合がある。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。

塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチド成分をさらに含んでもよい。塩基エディターシステムの成分が、共有結合、非共有結合性相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに会合し得ることを理解されたい。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターシステムの核酸塩基編集成分（例えば、デアミナーゼ成分）は、追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含むことができ、ガイドポリヌクレオチドの一部分またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る。一部の実施形態では、追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドに結合し得るか、ポリペプチドと相互作用し得るか、ポリペプチドと会合し得るか、またはポリペプチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドに結合し得るか、ポリヌクレオチドと相互作用し得るか、ポリヌクレオチドと会合し得るか、またはポリヌクレオチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合し得る場合がある。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。

一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、塩基除去修復（ＢＥＲ）成分の阻害因子をさらに含み得る。塩基エディターシステムの成分が、共有結合、非共有結合性相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに会合し得ることを理解されたい。ＢＥＲ成分の阻害因子は、塩基除去修復阻害因子を含んでもよい。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）であり得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子であり得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって、標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよび塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子と非共有結合的に相互作用するか、または塩基除去修復の阻害因子と会合することによって、塩基除去修復の阻害因子を標的ヌクレオチド配列に標的指向化することができる。例えば、一部の実施形態では、塩基除去修復成分の阻害因子は、追加の異種部分または異種ドメインを含むことができ、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である追加の異種部分または異種ドメインと相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドによって、標的ヌクレオチド配列に標的指向化され得る。例えば、一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害因子は、追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含むことができ、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用し得るか、会合し得るか、または複合体を形成し得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドの追加の異種部分または異種ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドに結合し得るか、ポリヌクレオチドと相互作用し得るか、ポリヌクレオチドと会合し得るか、またはポリヌクレオチドと複合体を形成し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合し得る場合がある。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合し得る場合がある。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕＣｏｍコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。

一部の実施形態では、塩基エディターは、編集された鎖の塩基除去修復（ＢＥＲ）を阻害する。一部の実施形態では、塩基エディターは、未編集鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＵＧＩ活性を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ニッカーゼ活性を含む。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の上流にある。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流にある。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の下流にある。一部の実施形態では、意図される編集塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流にある。

一部の実施形態では、本方法は、正準（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ部位を必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、リンカーまたはスペーサーを含む。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、１～２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、５～２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。

一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置に配置される必要があり、例えば、標的塩基が所定の領域（例えば、「脱アミノ化ウィンドウ」）内に配置される必要がある。一部の実施形態では、標的は、４塩基領域内にあり得る。一部の実施形態では、かかる定義された標的領域は、ＰＡＭの約１５塩基上流にあり得る。Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、標的領域は、標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、標的ウィンドウ内にある。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、塩基対の意図された編集を含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用して実施される。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、脱アミノ化ウィンドウである。脱アミノ化ウィンドウは、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用し、脱アミノ化する所定の領域であり得る。一部の実施形態では、脱アミノウィンドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内にある。一部の実施形態では、脱アミノ化ウィンドウは、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流にある。

本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を容易にする任意のドメイン、特徴、またはアミノ酸配列を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、デアミナーゼドメインとポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとの間に局在する。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのＣ末端に局在する。

本明細書に開示される塩基エディターに存在し得る他の例示的な特徴は、細胞質局在化配列、輸送配列（例えば、核外輸送配列）、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグなどの局在化配列である。本明細書に提供される好適なタンパク質タグとしては、これらに限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、ソフトタグ（例えば、ソフトタグ１、ソフトタグ３）、ストレプタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが挙げられる。さらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のＨｉｓタグを含む。

一部の実施形態では、非限定的な例示的なシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）は、ＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ）、ＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）－ＵＧＩ）、ＢＥ３－Ｇａｍ、ｓａＢＥ３、ｓａＢＥ４－Ｇａｍ、ＢＥ４、ＢＥ４－Ｇａｍ、ｓａＢＥ４、またはｓａＢ４Ｅ－Ｇａｍを含む。ＢＥ４は、３２アミノ酸のＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）リンカーおよび９アミノ酸のＣａｓ９ｎ－ＵＧＩリンカーが延び、ＵＧＩの第２のコピーが、別の９アミノ酸のリンカーとともに、構築物のＣ末端に付加されて、単一の塩基エディター構築物になる。塩基エディターであるｓａＢＥ３およびｓａＢＥ４は、より小さいＳ．ａｕｒｅｕｓＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）で置き換えられたＳ．ａｕｒｅｕｓＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）を有する。ＢＥ３－Ｇａｍ、ｓａＢＥ３－Ｇａｍ、ＢＥ４－Ｇａｍ、およびｓａＢＥ４－Ｇａｍは、１６アミノ酸ＸＴＥＮリンカーを介して、ＢＥ３、ｓａＢＥ３、ＢＥ４、およびｓａＢＥ４のＮ末端に融合された１７４残基のＧａｍタンパク質を有する。

一部の実施形態では、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）は、ＤＮＡのアデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＢＥ３のＡＰＯＢＥＣ１成分を、天然または操作されたＥ．ｃｏｌｉＴａｄＡ、ヒトＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡ、またはヒトＡＤＡＴ２で置き換えることによって生成される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、進化したＴａｄＡバリアントを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ１．２（ＴａｄＡ＊－ＸＴＥＮ－ｎＣａｓ９－ＮＬＳ）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊は、Ａ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異を含む。

一部の実施形態では、ＡＢＥは、第２世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．１であり、ＴａｄＡ＊（ＴａｄＡ＊２．１）における追加の変異Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．２であり、触媒不活性化バージョンのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｅ１２５Ｑ変異を有するＡＡＧ）に融合されたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．３であり、触媒不活性化（Ｄ３５Ａ変異による不活性化）バージョンのＥ．ｃｏｌｉＥｎｄｏＶに融合された、ＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．６であり、ＡＢＥ２．１のリンカーの２倍の長さのリンカー（３２アミノ酸、（ＳＧＧＳ）_２－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）_２）を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．７であり、追加の野生型ＴａｄＡ単量体で繋がれたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．８であり、追加のＴａｄＡ＊２．１単量体で繋がれたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．９であり、進化したＴａｄＡ（ＴａｄＡ＊２．１）のＡＢＥ２．１のＮ末端への直接融合物である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．１０であり、野生型ＴａｄＡのＡＢＥ２．１のＮ末端への直接融合物である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．１１であり、ＴａｄＡ＊単量体のＮ末端に不活性化Ｅ５９Ａ変異を有するＡＢＥ２．９である。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ２．１２であり、ＴａｄＡ＊単量体の内部に不活性化Ｅ５９Ａ変異を有するＡＢＥ２．９である。

一部の実施形態では、ＡＢＥは、第３世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ３．１であり、３つの追加のＴａｄＡ変異（Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、およびＩ１５６Ｆ）を有するＡＢＥ２．３である。

一部の実施形態では、ＡＢＥは、第４世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ４．３であり、追加のＴａｄＡ変異Ａ１４２Ｎ（ＴａｄＡ＊４．３）を有するＡＢＥ３．１である。

一部の実施形態では、ＡＢＥは、第５世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ５．１であり、生存クローンからのコンセンサスセットの変異（Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｓ１４６Ｃ、およびＫ１５７Ｎ）をＡＢＥ３．１に移入することによって生成される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ５．３であり、進化したＴａｄＡ＊の内部に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ５．２、ＡＢＥ５．４、ＡＢＥ５．５、ＡＢＥ５．６、ＡＢＥ５．７、ＡＢＥ５．８、ＡＢＥ５．９、ＡＢＥ５．１０、ＡＢＥ５．１１、ＡＢＥ５．１２、ＡＢＥ５．１３、またはＡＢＥ５．１４であり、以下の表１２に示される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、第６世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ６．１、ＡＢＥ６．２、ＡＢＥ６．３、ＡＢＥ６．４、ＡＢＥ６．５、またはＡＢＥ６．６であり、以下の表１２に示される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、第７世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ７．１、ＡＢＥ７．２、ＡＢＥ７．３、ＡＢＥ７．４、ＡＢＥ７．５、ＡＢＥ７．６、ＡＢＥ７．７、ＡＢＥ７．８、ＡＢＥ７．９、またはＡＢＥ７．１０であり、以下の表１２に示される。

一部の実施形態では、塩基エディターは、第８世代のＡＢＥ（ＡＢＥ８）である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ＊８バリアントを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ＊８バリアントを含む単量体構築物（「ＡＢＥ８．ｘ－ｍ」）を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１－ｍであり、Ｙ１４７Ｔ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２－ｍであり、Ｙ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．３－ｍであり、Ｑ１５４Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．３）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．４－ｍであり、Ｙ１２３Ｈ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．４）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．５－ｍであり、Ｖ８２Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．５）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．６－ｍであり、Ｔ１６６Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．６）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．７－ｍであり、Ｑ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．７）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．８－ｍであり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＹ１２３Ｈ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．８）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．９－ｍであり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．９）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１０－ｍであり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＴ１６６Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１０）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１１－ｍであり、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１１）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１２－ｍであり、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１２）を含む単量体構築物を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１３－ｍであり、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１３）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１４－ｍであり、Ｉ７６ＹおよびＶ８２Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１４）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１５－ｍであり、Ｖ８２ＳおよびＹ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１５）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１６－ｍであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１６）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１７－ｍであり、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１７）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１８－ｍであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１８）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１９－ｍであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１９）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２０－ｍであり、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２０）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２１－ｍであり、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２１）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２２－ｍであり、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２２）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２３－ｍであり、Ｖ８２ＳおよびＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２３）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２４－ｍであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｔ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２４）を含む単量体構築物を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ＊８バリアントに融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物（「ＡＢＥ８．ｘ－ｄ」）を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１－ｄであり、Ｙ１４７Ｔ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２－ｄであり、Ｙ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．３－ｄであり、Ｑ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．３）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．４－ｄであり、Ｙ１２３Ｈ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．４）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．５－ｄであり、Ｖ８２Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．５）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．６－ｄであり、Ｔ１６６Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．６）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．７－ｄであり、Ｑ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．７）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．８－ｄであり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＹ１２３Ｈ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．８）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．９－ｄであり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．９）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１０－ｄであり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＴ１６６Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１０）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１１－ｄであり、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１１）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１２－ｄであり、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１２）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の態様では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１３－ｄであり、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１３）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１４－ｄであり、Ｉ７６ＹおよびＶ８２Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１４）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１５－ｄであり、Ｖ８２ＳおよびＹ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１５）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１６－ｄであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１６）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１７－ｄであり、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１７）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１８－ｄであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１８）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の態様では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１９－ｄであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１９）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の態様では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２０－ｄであり、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２０）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２１－ｄであり、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２１）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２２－ｄであり、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２２）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２３－ｄであり、Ｖ８２ＳおよびＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２３）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２４－ｄであり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｔ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２４）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ＊８バリアントに融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物（「ＡＢＥ８．ｘ－７」）を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１－７であり、Ｙ１４７Ｔ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２－７であり、Ｙ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．３－７であり、Ｑ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．３）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．４－７であり、Ｙ１２３Ｈ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合されたＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．４）を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．５－７であり、Ｖ８２Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．５）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．６－７であり、Ｔ１６６Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．６）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．７－７であり、Ｑ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．７）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．８－７であり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＹ１２３Ｈ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．８）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．９－７であり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．９）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１０－７であり、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＴ１６６Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１０）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１１－７であり、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１１）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１２－７であり、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１２）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の態様では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１３－７であり、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１３）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１４－７であり、Ｉ７６Ｙ、およびＶ８２Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１４）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１５－７であり、Ｖ８２Ｓ、およびＹ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１５）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１６－７であり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１６）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１７－７であり、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１７）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１８－７であり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１８）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の態様では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．１９－７であり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．１９）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の態様では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２０－７であり、Ｉ７６Ｙ、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、Ｙ１４７Ｒ、およびＱ１５４Ｒ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２０）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２１－７であり、Ｙ１４７ＲおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２１）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２２－７であり、Ｖ８２ＳおよびＱ１５４Ｓ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２２）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２３－７であり、Ｖ８２ＳおよびＹ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２３）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８．２４－７であり、Ｖ８２Ｓ、Ｙ１２３Ｈ（Ｈ１２３Ｙから復帰したＹ１２３Ｈ）、およびＹ１４７Ｔ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８．２４）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ８．１－ｍ、ＡＢＥ８．２－ｍ、ＡＢＥ８．３－ｍ、ＡＢＥ８．４－ｍ、ＡＢＥ８．５－ｍ、ＡＢＥ８．６－ｍ、ＡＢＥ８．７－ｍ、ＡＢＥ８．８－ｍ、ＡＢＥ８．９－ｍ、ＡＢＥ８．１０－ｍ、ＡＢＥ８．１１－ｍ、ＡＢＥ８．１２－ｍ、ＡＢＥ８．１３－ｍ、ＡＢＥ８．１４－ｍ、ＡＢＥ８．１５－ｍ、ＡＢＥ８．１６－ｍ、ＡＢＥ８．１７－ｍ、ＡＢＥ８．１８－ｍ、ＡＢＥ８．１９－ｍ、ＡＢＥ８．２０－ｍ、ＡＢＥ８．２１－ｍ、ＡＢＥ８．２２－ｍ、ＡＢＥ８．２３－ｍ、ＡＢＥ８．２４－ｍ、ＡＢＥ８．１－ｄ、ＡＢＥ８．２－ｄ、ＡＢＥ８．３－ｄ、ＡＢＥ８．４－ｄ、ＡＢＥ８．５－ｄ、ＡＢＥ８．６－ｄ、ＡＢＥ８．７－ｄ、ＡＢＥ８．８－ｄ、ＡＢＥ８．９－ｄ、ＡＢＥ８．１０－ｄ、ＡＢＥ８．１１－ｄ、ＡＢＥ８．１２－ｄ、ＡＢＥ８．１３－ｄ、ＡＢＥ８．１４－ｄ、ＡＢＥ８．１５－ｄ、ＡＢＥ８．１６－ｄ、ＡＢＥ８．１７－ｄ、ＡＢＥ８．１８－ｄ、ＡＢＥ８．１９－ｄ、ＡＢＥ８．２０－ｄ、ＡＢＥ８．２１－ｄ、ＡＢＥ８．２２－ｄ、ＡＢＥ８．２３－ｄ、またはＡＢＥ８．２４－ｄであり、以下の表１３に示されている。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ａ－ｍであり、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ａ）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｂ－ｍであり、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｂ）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｃ－ｍであり、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｃ）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｄ－ｍであり、Ｖ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、およびＦ１４９Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｄ）を含む単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｅ－ｍであり、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｅ）を含む単量体構築物を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ａ－ｄであり、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ａ）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｂ－ｄであり、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎの変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｂ）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｃ－ｄであり、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｃ）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｄ－ｄであり、Ｖ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、およびＦ１４９Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｄ）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｅ－ｄであり、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｅ）に融合された野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡを含むヘテロ二量体構築物を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ａ－７であり、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ａ）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｂ－７であり、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｂ）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｃ－７であり、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｃ）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｄ－７であり、Ｖ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、およびＦ１４９Ｙ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｄ）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ８ｅ－７であり、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異を有するＴａｄＡ＊７．１０（ＴａｄＡ＊８ｅ）に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含むヘテロ二量体構築物を有する。
一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ８ａ－ｍ、ＡＢＥ８ｂ－ｍ、ＡＢＥ８ｃ－ｍ、ＡＢＥ８ｄ－ｍ、ＡＢＥ８ｅ－ｍ、ＡＢＥ８ａ－ｄ、ＡＢＥ８ｂ－ｄ、ＡＢＥ８ｃ－ｄ、ＡＢＥ８ｄ－ｄ、またはＡＢＥ８ｅ－ｄであり、以下の表１４に示される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ８ｅ－ｍまたはＡＢＥ８ｅ－ｄである。ＡＢＥ８ｅは、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓホモログ（例えば、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨ、Ｃａｓ１２ａホモログ（例えば、ＬｂＣａｓ１２ａ、ｅｎＡｓ－Ｃａｓ１２ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、および円順列変異体ＣＰ１０２８－ＳｐＣａｓ９およびＣＰ１０４１－ＳｐＣａｓ９）とともに使用した場合、効率的なアデニン塩基編集活性および低いインデル形成を示す。表１４に示されるＡＢＥ８ｅの変異に加えて、ＴａｄＡドメインにＶ１０６Ｗ置換を導入することによって、オフターゲットのＲＮＡ編集およびＤＮＡ編集が低減された（Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒｅｔａｌ．，２０２０，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚに記載されている。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ８）は、アデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）を、円順列変異体Ｃａｓ９（例えば、ＣＰ５またはＣＰ６）および二部核局在化配列を含む足場内にクローニングすることによって生成される。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＮＧＣＰＡＭＣＰ５バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＡＧＡＰＡＭＣＰ５バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＮＧＣＰＡＭＣＰ６バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＡＧＡＰＡＭＣＰ６バリアント（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲＣａｓ９）である。

一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１５に示される遺伝子型を有する。

以下の表１６に示されるように、４０個のＡＢＥ８の遺伝子型が記載されている。進化したＥ．ｃｏｌｉＴａｄＡ部分のＡＢＥの残基位置を示す。ＡＢＥ７．１０変異とは異なる場合に、ＡＢＥ８の変異変化が示される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、以下の表１６に示されるＡＢＥのうちの１つの遺伝子型を有する。

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１である：
ＡＢＥ８．１＿Ｙ１４７Ｔ＿ＣＰ５＿ＮＧＣＰＡＭ＿単量体

上記の配列において、平文（ｐｌａｉｎｔｅｘｔ）は、アデノシンデアミナーゼ配列を示し、太字の配列は、Ｃａｓ９に由来する配列を示し、斜体の配列は、リンカー配列を示し、下線の配列は、二分核局在化配列を示す。

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１である：
ｐＮＭＧ－Ｂ３３５ＡＢＥ８．１＿Ｙ１４７Ｔ＿ＣＰ５＿ＮＧＣＰＡＭ＿単量体

上記の配列において、平文は、アデノシンデアミナーゼ配列を示し、太字の配列は、Ｃａｓ９に由来する配列を示し、斜体の配列は、リンカー配列を示し、下線の配列は、二分核局在化配列を示す。

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１４である：
ＮＧＣＰＡＭＣＰ５を使用したｐＮＭＧ－３５７＿ＡＢＥ８．１４

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．８－ｍである：
ＡＢＥ８．８－ｍ

上記の配列において、平文は、アデノシンデアミナーゼ配列を示し、太字の配列は、Ｃａｓ９に由来する配列を示し、斜体の配列は、リンカー配列を示し、下線の配列は、二分核局在化配列を示し、二重下線の配列は、変異を示す。

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．８－ｄである：
ＡＢＥ８．８－ｄ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１３－ｍである：
ＡＢＥ８．１３－ｍ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１３－ｄである：
ＡＢＥ８．１３－ｄ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１７－ｍである：
ＡＢＥ８．１７－ｍ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．１７－ｄである：
ＡＢＥ８．１７－ｄ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．２０－ｍである：
ＡＢＥ８．２０－ｍ

一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むか、または本質的にそれからなるＡＢＥ８．２０－ｄである：
ＡＢＥ８．２０－ｄ

一部の実施形態では、本発明のＡＢＥ８は、以下の配列から選択される：
０１．ｍｏｎｏＡＢＥ８．１＿ｂｐＮＬＳ＋Ｙ１４７Ｔ
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＴＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＶＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＲＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＱＹＲＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ
０２．ｍｏｎｏＡＢＥ８．１＿ｂｐＮＬＳ＋Ｙ１４７Ｒ
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＲＦＦＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＶＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＲＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＱＹＲＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ
０３．ｍｏｎｏＡＢＥ８．１＿ｂｐＮＬＳ＋Ｑ１５４Ｓ
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＹＦＦＲＭＰＲＳＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＶＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＲＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＱＹＲＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ
０４．ｍｏｎｏＡＢＥ８．１＿ｂｐＮＬＳ＋Ｙ１２３Ｈ
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０５．ｍｏｎｏＡＢＥ８．１＿ｂｐＮＬＳ＋Ｖ８２Ｓ
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１４．ｍｏｎｏＡＢＥ８．１＿ｂｐＮＬＳ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ
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一部の実施形態では、塩基エディターは、第９世代ＡＢＥ（ＡＢＥ９）である。一部の実施形態では、ＡＢＥ９は、ＴａｄＡ＊９バリアントを含む。ＡＢＥ９塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼのバリアントを含み、本明細書に記載されるように、ＡＢＥ７＊１０参照配列に対する改変を含むアミノ酸配列を含む。表１９で使用される「単量体」という用語は、ＴａｄＡ＊７．１０の単量体形態を指し、表１９に記載の改変を含む。表１９で使用される「ヘテロ二量体」という用語は、ＴａｄＡ＊７．１０に融合された特定の野生型Ｅ．ｃｏｌｉＴａｄＡアデノシンデアミナーゼを指し、本明細書に記載されるように、表１９に記載の改変を含む。ＡＢＥ９塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０２０／０４９９７５号に記載されている（その全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸塩基エディタードメイン（例えば、デアミナーゼドメインの全部または一部）に融合されたポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ドメイン）を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する１つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、または二本鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖を切断するＣａｓ９ドメイン（Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される）を有し得る。

一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）の全部または一部を含むドメインをさらに含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）などのウラシル結合タンパク質（ＵＢＰ）の全部または一部を含むドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼの全部または一部を含むドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）の全部または一部をドメインとして含み得る。例えば、塩基エディターは、真核生物のＮＡＰの全部または一部を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼι、ポリメラーゼκ、またはポリメラーゼηである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、真核生物ポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、γ、η、ι、κ、λ、μ、またはν成分である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれる核酸ポリメラーゼまたはその一部は、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。

一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、複数のドメインを含むことができる。例えば、Ｃａｓ９に由来するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、野生型または天然のＣａｓ９のＲＥＣローブおよびＮＵＣローブに対応するＲＥＣローブおよびＮＵＣローブを含むことができる。別の例では、塩基エディターは、ＲｕｖＣＩドメイン、ＢＨドメイン、ＲＥＣ１ドメイン、ＲＥＣ２ドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、Ｌ１ドメイン、ＨＮＨドメイン、Ｌ２ドメイン、ＲｕｖＣＩＩＩドメイン、ＷＥＤドメイン、ＴＯＰＯドメイン、またはＣＴＤドメインのうちの１つ以上を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターの１つ以上のドメインは、ドメインを含むポリペプチドの野生型バージョンに対して変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含む。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインのＨＮＨドメインは、Ｈ８４０Ａ置換を含むことができる。別の例では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインのＲｕｖＣＩドメインは、Ｄ１０Ａ置換を含むことができる。

本明細書に開示される塩基エディターの異なるドメイン（例えば、隣接ドメイン）は、１つ以上のリンカードメイン（例えば、ＸＴＥＮリンカードメイン）の使用の有無にかかわらず、互いに接続され得る。一部の実施形態では、リンカードメインは、結合（例えば、共有結合）、化学基、または２つの分子もしくは部分（例えば、融合タンパク質の２つのドメイン、例えば、第１のドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ドメイン）および第２のドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインもしくはシチジンデアミナーゼドメイン））を連結する分子であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミド結合の炭素－窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環式または非環式、置換または非置換、分岐または非分岐の脂肪族または複素脂肪族のリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、β－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。特定の実施形態では、リンカーは、炭素環式部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含む。特定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の結合を促進する官能化部分を含むことができる。任意の求電子剤をリンカーの一部として使用することができる。例示的な求電子剤としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ（Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含む）のｇＲＮＡ結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９と、第２のドメイン（例えば、ＵＧＩなど）とを連結する。

リンカー
特定の実施形態では、リンカーを使用して、本発明のペプチドまたはペプチドドメインのいずれかを結合し得る。リンカーは、共有結合のように単純であってもよく、または数原子の長さの高分子リンカーであってもよい。特定の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ペプチド様ではない。特定の実施形態では、リンカーは、共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミド結合の炭素－窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環式または非環式、置換または非置換、分岐または非分岐の脂肪族または複素脂肪族のリンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、β－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。特定の実施形態では、リンカーは、炭素環式部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーは、ペプチドを含む。特定の実施形態では、リンカーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含む。特定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の結合を促進する官能化部分を含むことができる。任意の求電子剤をリンカーの一部として使用することができる。例示的な求電子剤としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。

典型的には、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に配置されるか、またはそれらに隣接し、共有結合を介して各々に連結され、したがって、両者を連結する。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、２～１００アミノ酸長、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約３～約１０４（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）アミノ酸長である。また、より長いまたはより短いリンカーも企図される。

一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかは、リンカーを介して互いに融合されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとを含む。シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターの活性に最適な長さを達成するために、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとの間のリンカーには、様々な鎖長および柔軟性を用いることができる（例えば、（ＧＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、および（Ｇ）_ｎの非常に柔軟なリンカーの形態から、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ、（ＳＧＧＳ）_ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（例えば、ＧｕｉｌｉｎｇｅｒＪＰ，ｅｔａｌ．ＦｕｓｉｏｎｏｆｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙｉｎａｃｔｉｖｅＣａｓ９ｔｏＦｏｋＩｎｕｃｌｅａｓｅｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｇｅｎｏｍｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５７７－８２を参照されたい。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）、および（ＸＰ）_ｎのより剛性なリンカーの形態までの範囲で）。一部の実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＳ）_ｎモチーフを含み、ｎは、１、３、または７である。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含むリンカー（ＸＴＥＮリンカーとも称され得る）を介して融合される。一部の実施形態では、リンカーは、複数のプロリン残基を含み、５～２１、５～１４、５～９、５～７アミノ酸長、例えば、ＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡ、ＰＡＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡＰＡ、Ｐ（ＡＰ）_４、Ｐ（ＡＰ）_７、Ｐ（ＡＰ）_１０である（例えば、ＴａｎＪ，ＺｈａｎｇＦ，ＫａｒｃｈｅｒＤ，ＢｏｃｋＲ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｈｉｇｈ－ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｆｏｒｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．２０１９Ｊａｎ２５；１０（１）：４３９を参照されたい。その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。このようなプロリンに富むリンカーは、「剛性」リンカーとも称される。

別の実施形態では、塩基エディターシステムは、デアミナーゼ（ＤＮＡデアミナーゼ、例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）と非共有結合的に相互作用し、かつ、特定の編集のために、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼを標的ポリヌクレオチド配列内の標的核酸塩基に一過的に引き付ける成分（タンパク質）を含み、バイスタンダー効果または標的隣接効果が最小化または低減される。デアミナーゼ相互作用タンパク質を伴うかかる非共有結合のシステムおよび方法は、ＤＮＡデアミナーゼを特定のゲノム標的核酸塩基に引き付ける役割を果たし、オンターゲットおよび標的隣接編集の事象を切り離し、したがって、より正確な単一塩基置換変異の達成を強化する。一実施形態では、デアミナーゼ相互作用タンパク質は、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）に結合し、デアミナーゼの活性（触媒）部位が標的核酸塩基（例えば、それぞれ、アデノシンまたはシチジン）に結合するのを遮断または妨害しない。例えば、「ＭａｇｎＥｄｉｔ」と称されるシステムは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの複合体に繋がれた相互作用タンパク質を伴い、特定のゲノム標的部位を編集するために共発現されたアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ（外因性または内因性のいずれか）を引き付けることができ、ＭｃＣａｎｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．，２０２０，“ＭａｇｎＥｄｉｔ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｒｅｃｒｕｉｔＤＮＡ－ｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｔｏｓｉｎｇｌｅｂａｓｅｔａｒｇｅｔｓ，”Ｌｉｆｅ－Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ａｌｌｉａｎｃｅ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４（ｅ２０１９００６０６），（ｄｏｉ１０．２６５０８／Ｉｓａ．２０１９００６０６）に記載されている（その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、ＤＮＡデアミナーゼは、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）である。

別の実施形態では、「Ｓｕｎｔａｇ」と呼ばれるシステムは、隣接する標的編集を削減した状態で、ポリヌクレオチド標的部位での塩基編集を達成するために、ポリヌクレオチド標的部位に対する塩基編集の、タンパク質（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）成分を動員するために使用される非共有結合相互作用成分またはその複数のコピーを伴い、これは、例えば、Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｅ．ｅｔａｌ．，“Ａｐｒｏｔｅｉｎｔａｇｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍｆｏｒｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ，”Ｃｅｌｌ．２０１４Ｏｃｔｏｂｅｒ２３；１５９（３）：６３５－６４６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０３９、およびＨｕａｎｇ，Ｙ．－Ｈ．ｅｔａｌ．，２０１７，“ＤＮＡｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｕｎＴａｇ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＤＮＭＴ３Ａ，”ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ１８：１７６．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１７－１３０６－ｚに記載されている（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。一実施形態では、ＤＮＡデアミナーゼは、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）である。

ガイドＲＮＡを有する核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質
宿主細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）における塩基編集のための組成物および方法が本明細書に提供される。ガイドポリ核酸配列（例えば、ガイドＲＮＡ配列）または本明細書に提供される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のガイドＲＮＡの組み合わせを含む組成物が本明細書にさらに提供される。一部の実施形態では、本明細書に提供されるよ塩基編集のための組成物は、塩基エディター（例えば、Ｃ塩基エディターまたはＡ塩基エディター）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、塩基編集のための組成物は、ＢＥ、ＢＥ４、ＡＢＥ、および提供される１つ以上のガイドＲＮＡの組み合わせをコードするｍＲＮＡ配列を含み得る。塩基編集のための組成物は、塩基エディターポリペプチドと、本明細書に提供される任意のガイドＲＮＡのうちの１つ以上の組み合わせとを含み得る。かかる組成物を使用して、異なる送達アプローチ（例えば、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入、またはトランスフェクション）を介して、免疫細胞で塩基編集を実現してもよい。一部の実施形態では、組成物は、エレクトロポレーションのために、塩基エディターをコードするｍＲＮＡ配列と、本明細書に提供される１つ以上のガイドＲＮＡ配列の組み合わせとを含む。

本開示の一部の態様は、複合体を提供し、本明細書に提供される融合タンパク質のうちのいずれかと、融合タンパク質の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン（例えば、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９、またはＣａｓ９ニッカーゼ）またはＣａｓ１２）に結合したガイドＲＮＡと、を含む。これらの複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）とも呼ばれる。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、１５～１００ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列に相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列は、ＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、または動物のゲノムの配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒトのゲノムの配列である。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、正準ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、非正準ＰＡＭ配列（例えば、表５に列挙される配列または５’－ＮＡＡ－３’）に直接隣接する。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、目的の遺伝子（例えば、疾患または障害に関連する遺伝子）の配列に相補的である。

本開示の一部の態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示の一部の態様は、ＤＮＡ分子を、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかと、少なくとも１つのガイドＲＮＡと接触させることを含む方法を提供し、ガイドＲＮＡは、約１５～１００ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＮＧＡ、ＮＧＣＧ、ＮＧＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、または５’（ＴＴＴＶ）配列に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、例えば、ＴＴＮ、ＤＴＴＮ、ＧＴＴＮ、ＡＴＴＮ、ＡＴＴＣ、ＤＴＴＮＴ、ＷＴＴＮ、ＨＡＴＹ、ＴＴＴＮ、ＴＴＴＶ、ＴＴＴＣ、ＴＧ、ＲＴＲ、またはＹＴＮＰＡＭ部位に直接隣接する。

それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けのスキームに依存することが理解されるであろう。番号付けは、例えば、成熟タンパク質の前駆体および成熟タンパク質自体において異なる場合があり、種ごとの配列の違いは番号付けに影響を及ぼす場合がある。当業者であれば、当該技術分野で周知の方法（例えば、配列整列および相同残基の決定）によって、任意の相同タンパク質およびそれぞれのコード核酸におけるそれぞれの残基を特定することができるであろう。

本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを標的部位（例えば、編集される変異を含む部位）に標的指向化するために、典型的には、融合タンパク質をガイドＲＮＡとともに共発現させる必要があることは、当業者には明らかであろう。本明細書の他箇所でより詳細に説明されるように、ガイドＲＮＡは、典型的には、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワークと、ｎａｐＤＮＡｂｐ：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列と、を含む。代替的に、ガイドＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの核酸分子として別々に提供され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、構造を含み、ガイド配列は、標的配列に相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には、２０ヌクレオチド長である。特定のゲノム標的部位にｎａｐＤＮＡｂｐ：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質を標的指向化するための好適なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて、当業者には明らかであろう。かかる好適なガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの５０ヌクレオチド上流または下流以内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供される融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的指向化するのに好適ないくつかの例示的なガイドＲＮＡ配列が本明細書に提供される。

ｓｇＲＮＡの異なる部分は、Ｃａｓ９（例えば、ＳｐｙＣａｓ９）および／またはＤＮＡ標的と相互作用する様々な特徴を形成することが予測される。６つの保存されたモジュールが、天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を指示するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内で特定されている（Ｂｒｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＧｕｉｄｅＲＮＡＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭｏｄｕｌｅｓＤｉｒｅｃｔＣａｓ９ＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙＭｏｌＣｅｌｌ．２０１４Ｏｃｔ２３；５６（２）：３３３－３３９を参照されたい）。６つのモジュールには、ＤＮＡ標的化に関与するスペーサー、ＣＲＩＳＰＲリピート：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖によって形成される上部ステム、バルジ、下部ステム、ネクサス、およびｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端由来のヘアピンが含まれる。上部ステムおよび下部ステムは、主に、リン酸骨格との配列非依存性相互作用を通してＣａｓ９と相互作用する。一部の実施形態では、上部ステムは、不要である。一部の実施形態では、下部ステムの基部の保存されたウラシルヌクレオチド配列は、不要である。バルジは、Ｃａｓ９のＲｅｃ１ドメインとの特定の側鎖相互作用に関与する。Ｕ４４の核酸塩基は、Ｔｙｒ３２５およびＨｉｓ３２８の側鎖と相互作用し、Ｇ４３は、Ｔｙｒ３２９と相互作用する。ネクサスは、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９相互作用のコアを形成し、ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９および標的ＤＮＡの両方との間の交点にある。Ａ５１およびＡ５２の核酸塩基は、Ｐｈｅ１１０５の側鎖と相互作用し、Ｕ５６は、Ａｒｇ４５７およびＡｓｎ４５９と相互作用し、Ｕ５９の核酸塩基は、Ａｒｇ７４、Ａｓｎ７７、Ｐｒｏ４７５、Ｌｅｕ４５５、Ｐｈｅ４４６、およびＩｌｅ４４８の側鎖によって既定される疎水性ポケットに挿入し、Ｃ６０は、Ｌｅｕ４５５、Ａｌａ４５６、およびＡｓｎ４５９と相互作用し、Ｃ６１は、Ａｒｇ７０の側鎖と相互作用し、次に、Ｃ１５と相互作用する。一部の実施形態では、これらの変異のうちの１つ以上は、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９相互作用を最適化するために、Ｃａｓ９（例えば、ｓｐｙＣａｓ９）に対するｓｇＲＮＡのバルジおよび／またはネクサスにおいて作製される。

さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡのネクサスおよびヘアピンは、Ｃａｓ９の対形成にとって重要であり、異なるＣａｓ９タンパク質を分離する直交性障壁（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙｂａｒｒｉｅｒ）を交差するようにスワップ（ｓｗａｐ）することができ、これは、直交Ｃａｓ９（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌＣａｓ９）タンパク質のさらなる利用に役立つ。一部の実施形態では、ネクサスおよびヘアピンは、直交Ｃａｓ９タンパク質を標的とするようにスワップされる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、よりコンパクトで、立体構造的に安定なガイドＲＮＡを設計するために、上部ステム、ヘアピン１、および／または下部ステムの配列柔軟性が省かれる。一部の実施形態では、モジュールは、様々なキメラガイドを有する単一のＣａｓ９を使用するか、またはキメラｓｇＲＮＡの異なる組み合わせを有する直交系を同時に使用することによって、多重編集を最適化するように修飾される。ガイド機能モジュールおよびその方法に関する詳細は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＧｕｉｄｅＲＮＡＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭｏｄｕｌｅｓＤｉｒｅｃｔＣａｓ９ＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＯｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙＭｏｌＣｅｌｌ．２０１４Ｏｃｔ２３；５６（２）：３３３－３３９に記載されている（その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。

本明細書に開示される塩基エディターのドメインは、任意の順序で配置され得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２）およびデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）を含む融合タンパク質を含む塩基エディターの非限定的な例としては、以下のように配置することができる：
ＮＨ_２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［デアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［デアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー２－［ＵＧＩ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［デアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［アデノシンデアミナーゼ］－リンカー１－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［デアミナーゼ］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［デアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ_２－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［核酸塩基編集ドメイン］－リンカー１－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害因子］－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－リンカー２－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ、または
ＮＨ２－［イノシンＢＥＲ阻害因子］ＮＨ２－［核酸塩基編集ドメイン］－［デアミナーゼ］－［核酸塩基編集ドメイン］－ＣＯＯＨ。

一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置に配置される必要があり、例えば、標的塩基が所定の領域（例えば、「脱アミノ化ウィンドウ」）内に配置される必要がある。一部の実施形態では、標的は、４塩基領域内にあることができる。一部の実施形態では、かかる定義された標的領域は、ＰＡＭの約１５塩基上流にあり得る。Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）を参照されたい（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

定義された標的領域は、脱アミノ化ウィンドウであり得る。脱アミノ化ウィンドウは、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用し、脱アミノ化する所定の領域であり得る。一部の実施形態では、脱アミノウィンドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内にある。一部の実施形態では、脱アミノ化ウィンドウは、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流にある。

本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を容易にする任意のドメイン、特徴、またはアミノ酸配列を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、デアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐドメインとの間に局在する。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインに局在するＣ末端である。

融合タンパク質に含まれ得るタンパク質ドメインの非限定的な例としては、デアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼもしくはシチジンデアミナーゼ）、ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメイン、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに／または以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、遺伝子サイレンシング活性、クロマチン修飾活性、エピジェネティック修飾活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。追加のドメインは、異種機能ドメインであり得る。かかる異種機能ドメインは、例えば、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンユビキチン化などをもたらす、標的ＤＮＡと会合した標的ポリペプチド（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）の修飾などの機能活性を付与することができる。付与される他の機能および／または活性としては、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リガーゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、または上記の任意の組み合わせが挙げられる。

付与される他の機能としては、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性もしくはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンセターゼ活性、および脱ミリストイル化活性、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

ドメインは、エピトープタグ、レポータータンパク質、および他の結合ドメインで検出または標識され得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、これらに限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が挙げられる。追加のタンパク質配列としては、ＤＮＡ分子に結合するアミノ酸配列、または他の細胞分子に結合するアミノ酸配列を挙げることができ、これらに限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が含まれる。

シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとを含む融合タンパク質を使用する方法
本開示の一部の態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示の一部の態様は、ＤＮＡ分子を、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかと、少なくとも１つのガイドＲＮＡと接触させることを含む方法を提供し、ガイドＲＮＡは、約１５～１００ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、正準ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、正準ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接していない。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に直接隣接する。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＮＧＡ、ＮＧＣＧ、ＮＧＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、または５’（ＴＴＴＶ）配列に直接隣接する。

一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、目的の標的を変異誘発するために使用される。特に、本明細書に記載のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターは、標的配列内で複数の変異を作製することができる。これらの変異は、標的の機能に影響を及ぼし得る。例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼの核酸塩基エディターを使用して調節領域を標的化すると、調節領域の機能が変化し、下流タンパク質の発現が低減または排除される。

本明細書に開示されるＣａｓ９ドメインとシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとを含む融合タンパク質のいずれかを標的部位（例えば、編集される変異を含む部位）に標的指向化するために、典型的には、融合タンパク質をガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と共発現させる必要があることは、当業者には明らかであろう。本明細書の他箇所でより詳細に説明されるように、ガイドＲＮＡは、典型的には、Ｃａｓ９結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワークと、Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列と、を含む。代替的に、ガイドＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの核酸分子として別々に提供され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、構造を含み、ガイド配列は、標的配列に相補的な配列を含む。ガイド配列は、典型的には、２０ヌクレオチド長である。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位に標的指向化するための好適なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて、当業者には明らかであろう。かかる好適なガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの５０ヌクレオチド上流または下流以内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供される融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的指向化するのに好適ないくつかの例示的なガイドＲＮＡ配列が本明細書に提供される。

塩基エディターの効率
一部の実施形態では、本発明に提供される方法の目的は、遺伝子編集を介して遺伝子産物の正常な機能を破壊することである。本明細書に提供される核酸塩基編集タンパク質は、インビトロでの遺伝子編集に基づくヒト治療薬について検証され得る。本明細書に提供される核酸塩基編集タンパク質（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）と核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）とを含む融合タンパク質）を使用して、ＡからＧまたはＣからＴのヌクレオチドを編集できることが、当業者には理解されるであろう。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ゲノム編集を媒介するために広く使用されている。ほとんどのゲノム編集用途において、Ｃａｓ９は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））と複合体を形成し、ｓｇＲＮＡ配列によって指定される標的部位で二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導する。細胞は、主に、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を介してこのＤＳＢに応答し、これが、確率的な挿入または欠失（インデル）をもたらし、フレームシフト変異を引き起こして、遺伝子を破壊し得る。ＤＳＢに隣接する配列に対する高度の相同性を有するドナーＤＮＡ鋳型の存在下で、遺伝子修正は、相同組換え修復（ＨＤＲ）として知られる代替経路を介して達成され得る。残念ながら、ほとんどの非摂動条件下では、ＨＤＲは、非効率であり、細胞状態および細胞型に依存し、より大きなインデル頻度によって支配される。ヒト疾患に関連する既知の遺伝的バリエーションのほとんどが点変異であるため、より効率的できれいに正確な点変異を作製し得る方法が必要である。本明細書に提供される塩基エディターシステムは、二本鎖ＤＮＡ切断を生成せず、ドナーＤＮＡ鋳型を必要とせず、かつ過剰な確率的な挿入および欠失を誘発しない、ゲノム編集を提供する新しい方法を提供する。

一部の実施形態では、本開示は、塩基エディターを提供し、相当数の意図されていない変異（例えば、意図されていない点変異）を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）の終止コドンなどの「意図された変異」を効率的に生成する。一部の実施形態では、意図された変異は、意図された変異を生成するように特異的に設計されたガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）に結合した特異的な塩基エディター（例えば、アデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター）によって生成される変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、疾患または障害、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍に関連する標的抗原に関連する遺伝子に存在する。一部の実施形態では、意図された変異は、疾患または障害、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍に関連する標的抗原に関連する遺伝子におけるアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点変異（例えば、ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、意図された変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域（例えば、調節領域または調節要素）内のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、疾患または障害、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍に関連する標的抗原に関連する遺伝子におけるチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への点変異（例えば、ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、意図された変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域（例えば、調節領域または調節要素）内のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への点変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、終止コドン（例えば、遺伝子のコード領域内の未熟終止コドン）を生成する点変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、終止コドンを排除する変異である。

本発明の塩基エディターは、有意な割合のインデルを生成することなく、タンパク質をコードする特定のヌクレオチド塩基を有利に修飾する。本明細書で使用される場合、「インデル」は、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。かかる挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異をもたらし得る。一部の実施形態では、核酸内に多数の挿入または欠失（すなわち、インデル）を生成することなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に修飾（例えば、変異）する塩基エディターを生成することが望ましい。一部の実施形態では、核酸内に多数の挿入または欠失（すなわち、インデル）を生成することなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に修飾（例えば、変異またはメチル化）する塩基エディターを生成することが望ましい。特定の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、インデルに対してより大きな割合の意図された修飾（例えば、メチル化）を生成することができる。特定の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、インデルに対してより大きな割合の意図された修飾（例えば、変異）を生成することができる。

一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、１：１（すなわち、意図された点変異：意図されていない点変異）を超えるインデルに対する意図された変異の比率を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはそれ以上であるインデルに対する意図された変異の比率を生成することができる。意図された変異およびインデルの数は、任意の好適な方法を使用して決定され得る。

一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を制限し得る。一部の実施形態では、この領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以内の領域にある。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、核酸の領域におけるインデルの形成を、１％未満、１．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、３．５％未満、４％未満、４．５％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、または２０％未満に制限し得る。核酸領域で形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝露される時間の量に依存し得る。一部の実施形態では、インデルの数または割合は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝露して少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日後に決定される。

本開示の一部の態様は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかが、相当数の意図しない変異（例えば、偽オフターゲット編集またはバイスタンダー編集）を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）において意図された変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。一部の実施形態では、意図された変異は、意図された変異を生成するように特別に設計された、ｇＲＮＡに結合した特定の塩基エディターによって生成される変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、終止コドン（例えば、遺伝子のコード領域内の未熟終止コドン）を生成する変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、終止コドンを排除する変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、遺伝子のスプライシングを変化させる変異である。一部の実施形態では、意図された変異は、遺伝子の調節配列（例えば、遺伝子のプロモーターまたは遺伝子のリプレッサー）を変化させる変異である。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、１：１（すなわち、意図された点変異：意図されていない点変異）を超える意図された変異：意図されていない変異の比率を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはそれ以上である、意図された変異：意図されていない変異の比率を生成することができる。本明細書に記載の塩基エディターの特徴が、融合タンパク質、または本明細書に提供される融合タンパク質を使用する方法のいずれかに適用され得ることを理解されたい。

塩基編集は、遺伝的修飾、遺伝子修飾、および核酸配列の修飾などの「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」と呼ばれることが多く、修飾が塩基編集修飾である文脈に基づいて、明確に理解され得る。したがって、塩基編集修飾は、例えば、本開示全体通して論じられるデアミナーゼ活性の結果として、ヌクレオチド塩基レベルでの修飾であり、これは次いで、遺伝子配列の変化をもたらし、遺伝子産物に影響を及ぼし得る。したがって、本質的には、本明細書に記載の遺伝子編集修飾は、構造的および／または機能的に、遺伝子の修飾をもたらすことができ、遺伝子産物の発現が修飾され得るか（例えば、遺伝子の発現がノックアウトされ得るか）、もしくは逆に強化され得るか、または、状況によっては、遺伝子の機能もしくは活性が修飾され得る。本明細書に開示される方法を使用する場合、塩基編集効率は、塩基編集が行われる遺伝子のノックダウン効率として決定され得、塩基編集が、遺伝子の発現をノックダウンするように意図される。ノックダウンレベルは、タンパク質発現レベルのアッセイなどの任意の検出アッセイ（例えば、フローサイトメトリー）、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット分析などのＲＮＡ発現の検出アッセイ、またはパイロ配列決定などの任意の他の好適なアッセイによって発現レベルを決定することによって定量的に検証することができ、ヌクレオチド配列決定反応によって定性的に検証することができる。

一部の実施形態では、修飾（例えば、単一塩基編集）は、遺伝子標的化発現の少なくとも１０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも１０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも２０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも３０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも４０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、遺伝子標的化発現の少なくとも５０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも６０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも７０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも８０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９０％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９１％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９２％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９３％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９４％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９５％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９６％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９７％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９８％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化遺伝子発現の少なくとも９９％の低減をもたらし得る。一部の実施形態では、塩基編集効率は、標的化される遺伝子のノックアウト（遺伝子発現の１００％ノックダウン）をもたらし得る。

一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターシステムのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のインデル形成をもたらす。

一部の実施形態では、標的化修飾（例えば、単一塩基編集）は、異なるガイドＲＮＡを用いた塩基編集に対して、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の異なる内因性配列を標的化するために同時に使用される。一部の実施形態では、標的化修飾（例えば、単一塩基編集）は、異なるガイドＲＮＡを用いた塩基編集に対して、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれ以上の異なる内因性遺伝子配列を順次標的化するために使用される。

本開示の一部の態様は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかが、意図しない点変異（すなわち、バイスタンダーの変異）などの相当数の意図しない変異を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）において意図された変異（例えば、点変異）を効率的に生成することができるという認識に基づく。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、少なくとも０．０１％の意図された変異（すなわち、少なくとも０．０１％の塩基編集効率）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、意図された変異の少なくとも０．０１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を生成することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のインデル形成をもたす。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、０．８％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、最大０．８％のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、０．３％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、記載されるＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む塩基エディターシステムと比較して、標的ポリヌクレオチド配列において、より低いインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８編集バリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７．１０を含む塩基エディターシステムと比較して、標的ポリヌクレオチド配列において、より低いインデル形成をもたらす。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む塩基エディターシステムと比較して、減少したインデル頻度を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む塩基エディターシステムと比較して、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少したインデル頻度を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムは、ＡＢＥ７．１０を含む塩基エディターシステムと比較して、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のインデル頻度の減少を有する。

本発明は、効率および特異性の増加を有するアデノシンデアミナーゼのバリアント（例えば、ＡＢＥ８バリアント）を提供する。特に、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼのバリアントは、ポリヌクレオチド内の所望の塩基を編集する可能性がより高く、改変されることを意図しない塩基（例えば、「バイスタンダー」）を編集する可能性がより低い。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、減少したバイスタンダーの編集または変異を有する。一部の実施形態では、意図しない編集または変異は、標的ヌクレオチド配列の標的ウィンドウにおける意図しない位置または非標的位置における標的塩基（例えば、ＡまたはＣ）のバイスタンダー変異またはバイスタンダー編集である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）を含む塩基エディターシステムと比較して、バイスタンダー編集または変異の減少を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）を含む塩基エディターシステムを含む塩基エディターシステムと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少している。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）を含む塩基エディターシステムと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、または少なくとも３．０倍減少したバイスタンダー編集または変異を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基編集システムのいずれかは、減少した偽編集を有する。一部の実施形態では、意図しない編集または意図しない変異は、偽変異または偽編集（例えば、ゲノムの意図しない領域または非標的領域における標的塩基（例えば、ＡまたはＣ）の非特異的編集またはガイド非依存性編集）である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）を含む塩基エディターシステムと比較して、偽編集または偽変異の減少を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）を含む塩基エディターシステムと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少した偽編集を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）を含む塩基エディターシステムと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、または少なくとも３．０倍減少した偽編集または偽変異を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、塩基編集効率は、細胞集団における編集された核酸塩基の割合を計算することによって測定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、細胞集団における編集された核酸塩基によって測定した場合、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の塩基編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディターと比較して、より高い塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高い塩基編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、または少なくとも５．０倍高い塩基編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のオンターゲット塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、細胞集団における編集された標的核酸塩基によって測定した場合、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のオンターゲット塩基編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディターと比較して、より高いオンターゲット塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高いオンターゲット塩基編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ＡＢＥ７塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、または少なくとも５．０倍高いオンターゲット塩基編集効率を有する。

本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントは、プラスミド、ベクター、ＬＮＰ複合体、またはｍＲＮＡを介して宿主細胞に送達され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡとして宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、核酸ベースの送達システム（例えば、ｍＲＮＡ）を介して送達されるＡＢＥ８塩基エディターは、編集された核酸塩基によって測定した場合、少なくとも少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のオンターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡシステムによって送達されるＡＢＥ８塩基エディターは、プラスミドまたはベクターシステムによって送達されるＡＢＥ８塩基エディターと比較して、より高い塩基編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高いオンターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．６倍、少なくとも３．７倍、少なくとも３．８倍、少なくとも３．９倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．１倍、少なくとも４．２倍、少なくとも４．３倍、少なくとも４．４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．６倍、少なくとも４．７倍、少なくとも４．８倍、少なくとも４．９倍、または少なくとも５．０倍高いオンターゲット編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む塩基エディターシステムのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のオフターゲット編集をもたす。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、より低いガイドオフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低いガイドオフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、または少なくとも３．０倍低いガイドオフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも約２．２倍減少したガイドオフターゲット編集効率を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、ガイド非依存性オフターゲット編集効率が低い。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低いガイド非依存性オフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのいずれかは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも５．０倍、少なくとも１０．０倍、少なくとも２０．０倍、少なくとも５０．０倍、少なくとも７０．０倍、少なくとも１００．０倍、少なくとも１２０．０倍、少なくとも１３０．０倍、または少なくとも１５０．０倍低いガイド非依存性オフターゲット編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントは、ｍＲＮＡシステムによって送達された場合、プラスミドまたはベクターシステムによって送達された場合と比較して、１３４．０倍低いガイド非依存性オフターゲット編集効率（例えば、偽ＲＮＡ脱アミノ化）有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントは、ゲノムにわたってガイド非依存性変異率を増加させない。

一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して（例えば、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または任意の他の方法により）、細胞のゲノム内の５つの配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の６つの配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の７つの配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一のエレクトロポレーション事象を使用して、細胞のゲノム内の８つの配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の９つの配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の１０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の２０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の３０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の４０個の配列の塩基編集を標的化することができる。一部の実施形態では、単一の遺伝子送達事象を使用して、細胞のゲノム内の５０個の配列の塩基編集を標的化することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法（例えば、塩基編集方法）は、最小限～皆無のオフターゲット効果を有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも５０％の正常に編集された細胞集団（すなわち、正常に操作された細胞）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも５５％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも６０％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも６５％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも７０％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも７５％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも８０％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも８５％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも９０％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、少なくとも９５％の正常に編集された細胞集団をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集方法は、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の正常に編集された細胞集団をもたらす。

一部の実施形態では、塩基編集介入後の生細胞の回収率は、塩基編集事象の時点で、開始細胞集団のうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％を超える。一部の実施形態では、上に記載される生細胞の回収率は、約７０％である。一部の実施形態では、上に記載される生細胞の回収率は、約７５％である。一部の実施形態では、上に記載される生細胞の回収率は、約８０％である。一部の実施形態では、上に記載される生細胞の回収率は、約８５％である。一部の実施形態では、上に記載される生細胞の回収率は、塩基編集事象の時点で、細胞集団のうちの約９０％、または約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、または１００％である。

一部の実施形態では、操作された細胞集団は、インビトロでさらに約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、または約１００倍に増殖され得る。

意図された変異およびインデルの数は、例えば、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、ならびにＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）に記載されている任意の好適な方法を使用して決定することができる（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、インデル頻度を計算するために、配列決定リード（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅａｄｓ）は、インデルが生じ得るウィンドウの両側に隣接する２つの１０ｂｐ配列と正確に一致するようにスキャンされる。正確な一致が見つからない場合、リードは、分析から除外される。このインデルウィンドウの長さが参照配列と完全に一致する場合、リードは、インデルを含まないものとして分類される。インデルウィンドウが参照配列よりも２塩基以上長いまたは短い場合、配列決定リードは、それぞれ、挿入または欠失として分類される。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を制限し得る。一部の実施形態では、この領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以内の領域にある。

標的ヌクレオチド領域で形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝露される時間の量に依存し得る。一部の実施形態では、インデルの数または割合は、標的ヌクレオチド配列（例えば、細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝露して少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日後に決定される。本明細書に記載される塩基エディターの特徴は、融合タンパク質、または本明細書に提供される融合タンパク質を使用する方法のいずれかに適用され得ることを理解されたい。

塩基エディター効率の詳細は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆａｔａｒｇｅｔｂａｓｅｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，“ＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆＡ・ＴｔｏＧ・ＣｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅ”Ｎａｔｕｒｅ５５１，４６４－４７１（２０１７）、およびＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＭｕＧａｍｐｒｏｔｅｉｎｙｉｅｌｄｓＣ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａｂａｓｅｅｄｉｔｏｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｔｙ”ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）も参照されたい（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法を使用して、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対を編集することで、少なくとも１つの意図された変異の形成がもたらされる。一部の実施形態では、当該少なくとも１つの意図された変異の当該形成は、遺伝子の正常な機能の破壊をもたらす。一部の実施形態では、当該少なくとも１つの意図された変異の当該形成は、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を低減または排除する。多重編集が、本明細書に提供される任意の方法または方法の組み合わせを使用して達成され得ることを理解されたい。

多重編集
一部の実施形態では、本発明に提供される塩基エディターシステムは、１つ以上の遺伝子において、複数の核酸塩基対を多重編集することができる。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、１つ以上の遺伝子に位置し、少なくとも１つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。一部の実施形態では、多重編集は、１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、１つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、シングルガイドポリヌクレオチドを有する１つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、複数のガイドポリヌクレオチドを有する１つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、単一の塩基エディターシステムを有する１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合に対してＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合に対してＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合に対してＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合に対してＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を含むことができる。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書に提供される任意の塩基エディターを使用する方法の任意の組み合わせに適用され得ることを理解されたい。本明細書に記載される塩基エディターのいずれを使用した多重編集は、複数の核酸塩基対の順次編集を含むこともできることを理解されたい。

一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、１つ以上の遺伝子内にある。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子内にある。一部の実施形態では、１つ以上の遺伝子内の少なくとも１つの遺伝子が、異なる遺伝子座に位置する。

一部の実施形態では、編集は、少なくとも１つのタンパク質コード領域における、複数の核酸塩基対の編集である。一部の実施形態では、編集は、少なくとも１つのタンパク質非コード領域における、複数の核酸塩基対の編集である。一部の実施形態では、編集は、少なくとも１つのタンパク質コード領域および少なくとも１つのタンパク質非コード領域における、複数の核酸塩基対の編集である。

一部の実施形態では、編集は、１つ以上のガイドポリヌクレオチドと併される。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、１つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、シングルガイドポリヌクレオチドと併せて１つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、複数のガイドポリヌクレオチドと併せて１つ以上の塩基エディターシステムを含むことができる。一部の実施形態では、編集は、単一の塩基エディターシステムを有する１つ以上のガイドポリヌクレオチドと併される。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合にＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと併される。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合にＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと併される。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合にＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への標的結合にＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドとの混合物と併される。本明細書に記載される塩基エディターのいずれかを使用する多重編集の特徴は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用する方法の組み合わせのいずれかに適用され得ることを理解されたい。また、編集は、複数の核酸塩基対の順次編集を含むことができることも理解されたい。

一部の実施形態では、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能な塩基エディターシステムは、ＡＢＥ９塩基エディターのうちの１つを含む。一部の実施形態では、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能な塩基エディターシステムは、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む。一部の実施形態では、１つ以上の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能な塩基エディターシステムは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディターシステムは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディターシステムと比較して、より高い多重編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディターシステムは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディターシステムと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、少なくとも１６０％、少なくとも１６５％、少なくとも１７０％、少なくとも１７５％、少なくとも１８０％、少なくとも１８５％、少なくとも１９０％、少なくとも１９５％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％高い多重編集効率を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＥ８塩基エディターバリアントのうちの１つを含む多重編集可能な塩基エディターシステムは、ＡＢＥ７塩基エディターのうちの１つを含む多重編集が可能な塩基エディターシステムと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、または少なくとも６．０倍高い多重編集効率を有する。

送達システム
遺伝子（例えばＣＤ２）における１つ以上のヌクレオチドを標的化するための核酸塩基エディターの適合性は、本明細書に記載されるように評価される。一実施形態では、目的の単一細胞は、レポーター（例えば、ＧＦＰ）をコードする少量のベクターと一緒に、本明細書に記載の塩基エディターシステムをコードする核酸分子（複数可）でトランスフェクトされるか、形質導入されるか、またはその他修飾される。これらの細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を含む当該技術分野で既知の任意の細胞株、または不死化ヒト細胞株（例えば、２９３Ｔ、Ｋ５６２、またはＵ２０Ｓ）であり得る。あるいは、初代細胞（例えば、ヒト）を使用してもよい。細胞は、対象または個体から（例えば、組織生検、手術、血液、血漿、血清、または他の生体液からも得ることができる。かかる細胞は、最終的な細胞標的に関連し得る。

送達は、ウイルスベクターを使用して行ってもよい。一実施形態では、トランスフェクションは、脂質トランスフェクション（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅまたはＦｕｇｅｎｅ）を使用して、またはエレクトロポレーションによって行ってもよい。トランスフェクション後、レポーター（例えば、ＧＦＰ）の発現は、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーのいずれかによって決定して、一貫した高レベルのトランスフェクションを確認することができる。これらの予備トランスフェクションは、どのエディターの組み合わせが最大の活性を与えるかを決定するために、異なる核酸塩基エディターを含むことができる。システムは、１つ以上の異なるベクターを含むことができる。一実施形態では、塩基エディターは、所望の細胞型、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞の発現のために、コドン最適化される。

核酸塩基エディターの活性は、本明細書に記載のように、すなわち、細胞のゲノムを配列決定して標的配列における改変を検出することによって、評価される。サンガー配列決定の場合、精製されたＰＣＲアンプリコンをプラスミド骨格にクローニングし、形質転換し、ミニプレッドし、単一のプライマーを用いて配列決定する。配列決定は、次世代配列決定（ＮＧＳ）技術を使用してもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは、３００～５００ｂｐであり得、非対称に配置された意図されたカット部位を有する。ＰＣＲ後、次世代配列決定のアダプターおよびバーコード（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ多重アダプターおよびマルチプレックスインデックス）を、例えば、ハイスループット配列決定（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ）で使用するために、アンプリコンの末端に添加してもよい。初期試験において最大レベルの標的特異的改変を誘導する融合タンパク質を、さらなる評価のために選択することができる。

特定の実施形態では、核酸塩基エディターは、目的のポリヌクレオチドを標的化するために使用される。一実施形態では、本発明の核酸塩基エディターは、細胞のゲノム内の１つ以上の目的の核酸配列を標的化するために使用される１つ以上のガイドＲＮＡと併せて細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞））に送達され、それによって、標的遺伝子（例えば、ＣＤ２）が改変される。一部の実施形態では、塩基エディターは、１つ以上のガイドＲＮＡによって標的指向化され、１つ以上の目的の遺伝子（例えば、ＣＤ２、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＰＤ－１、ＣＤ５２）の配列に、１つ以上の編集を導入する。一部の実施形態では、１つ以上の目的の遺伝子の配列に対する１つ以上の編集は、宿主細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞））における遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を、低減または排除する。一部の実施形態では、１つ以上の目的の遺伝子（例えば、ＣＤ２）によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現は、宿主細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞））において、完全にノックアウトまたは排除される。
一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＡＣ、およびＰＤ－１、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ２遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ５遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ７遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ２、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、およびＰＤ－１遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、およびＰＤ－１遺伝子に導入される。一部の実施形態では、１つ以上の編集は、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ５２、およびＰＤ－１遺伝子に導入される。

核酸ベースの核酸編集およびｇＲＮＡの送達
本開示によるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターをコードする核酸は、当該技術分野で既知の方法により、もしくは本明細書に記載のように、対象に投与されるか、またはインビトロもしくはインビボで細胞に送達され得る。例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、脂質ナノ粒子を使用する）、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。

シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターをコードする核酸は、例えば、トランスフェクションもしくはエレクトロポレーションの方法によって、裸のＤＮＡまたはＲＮＡとして細胞（例えば、免疫細胞）に直接送達され得るか、または標的細胞による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。本明細書に記載のベクターなどの核酸ベクターも使用することができる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、塩基エディターまたはその機能成分をコードするｍＲＮＡ）は、本明細書に記載のように、複数のガイドＲＮＡの組み合わせと共エレクトロポレーションされ得る。

核酸ベクターは、本明細書に記載の融合タンパク質のドメインをコードする１つ以上の配列を含むことができる。ベクターはまた、タンパク質をコードする配列に関連する（例えば、タンパク質をコードする配列に挿入または融合された）シグナルペプチドをコードする配列も含むことができる（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）。一例として、核酸ベクターは、１つ以上の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来の核局在化配列）、および１つ以上のデアミナーゼを含むＣａｓ９コード配列を含むことができる。

核酸ベクターはまた、任意の好適な数の調節／制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、または内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ））を含むことができる。これらのエレメントは、当該技術分野で周知である。

本開示による核酸ベクターとしては、組換えウイルスベクターが挙げられる。例示的なウイルスベクターは、上記の本明細書に記載されている。当該技術分野で既知の他のウイルスベクターも使用することができる。加えて、ウイルス粒子を使用して、核酸および／またはペプチドの形態で、ゲノム編集システムの成分を送達することができる。例えば、「空の」ウイルス粒子は、任意の好適なカーゴ（ｃａｒｇｏ）を含むように組み立てることができる。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、標的組織特異性を改変するために、標的化リガンドを組み込むように操作することもできる。

ウイルスベクターに加えて、非ウイルスベクターを使用して、本開示に従って、ゲノム編集システムをコードする核酸を送達することができる。非ウイルス核酸ベクターの１つの重要なカテゴリーは、ナノ粒子であり、有機または無機であり得る。ナノ粒子は、当該技術分野で周知である。任意の好適なナノ粒子設計を使用して、ゲノム編集システムの成分、またはかかる成分をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば脂質および／またはポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形態では、送達ビヒクルとして使用するのに好適であり得る。表１８（以下）に、ナノ粒子製剤、および／または遺伝子導入に使用するための例示的な脂質を示す。

表１９は、遺伝子導入および／またはナノ粒子製剤に使用される例示的なポリマーを列挙する。

表２０は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達方法を要約する。

別の態様では、ゲノム編集システムの成分またはかかる成分をコードする核酸（例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアントなどの核酸結合タンパク質）、ならびに目的のゲノム核酸配列を標的とするｇＲＮＡの送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達することによって達成され得る。ＲＮＰは、標的ｇＲＮＡとの複合体中に、核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。ＲＮＰは、例えば、Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：７３－８０によって報告されているように、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質媒介性の方法などの既知の方法を使用して細胞に送達され得る。ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ塩基エディターシステムでの使用に有利であり、特に、トランスフェクトが困難な細胞（例えば、初代細胞）に有利である。加えて、ＲＮＰはまた、特に、ＣＲＩＳＰＲプラスミドにおいて使用され得る真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＥＦ１Ａ）が十分に発現していない場合、細胞内のタンパク質発現で生じ得る困難を緩和することができる。有利には、ＲＮＰの使用は、細胞内への外来ＤＮＡの送達を必要としない。さらに、核酸結合タンパク質とｇＲＮＡ複合体とを含むＲＮＰは、時間とともに分解されるため、ＲＮＰの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性がある。プラスミドベースの技術の場合と同様の様式で、ＲＮＰを使用して、結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９バリアント）を送達し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導することができる。

塩基エディターをコードする核酸分子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、ＡＡＶＩＴＲを含むことができる。これは、ベクター内の空間を占有し得る追加のプロモーターエレメントの必要性を排除するために有利であり得る。解放された追加の空間を使用して、追加のエレメント（例えば、ガイド核酸または選択可能なマーカー）の発現を駆動することができる。ＩＴＲ活性は比較的弱いため、選択されたヌクレアーゼの過剰発現による潜在的な毒性を低減するために使用することができる。

任意の好適なプロモーターを使用して、塩基エディターおよび（該当する場合）ガイド核酸の発現を駆動することができる。遍在的な発現の場合、使用され得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖などが挙げられる。脳または他のＣＮＳ細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、すべてのニューロンに対してシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対してＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対してＧＡＤ６７もしくはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなどが挙げられ得る。肝細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、ＳＰ－Ｂが挙げられ得る。内皮細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＣＡＭが挙げられ得る。造血細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＦＮβまたはＣＤ４５が挙げられ得る。骨芽細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＯＧ－２が挙げられ得る。

一部の実施形態では、本開示の塩基エディターは、別個のプロモーターが、同じ核酸分子内の塩基エディターおよび適合するガイド核酸の発現を駆動させるのにサイズが十分な小さいものである。例えば、ベクターまたはウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に連結された第１のプロモーターと、ガイド核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターとを含むことができる。

ガイド核酸の発現を駆動するために使用されるプロモーターとしては、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌＩＩＩプロモーターが挙げられ得る。ｇＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を発現するには、ＰｏｌＩＩプロモーターおよびイントロンカセットを使用する。

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ１０、およびそれらのバリアント）中に存在するポリヌクレオチド、または任意のウイルスベクターの好適なカプシドタンパク質によってコードされる。したがって、一部の態様では、本開示は、融合タンパク質のウイルス送達に関する。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター（例えば、マロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス、ＭＭＬ－Ｖ）、アデノウイルスベクター（例えば、ＡＤ１００）、レンチウイルスベクター（ＨＩＶおよびＦＩＶベースのベクター）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ－２）が挙げられる。

一部の態様では、免疫細胞における特定の遺伝子を編集するための本明細書に記載の方法を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を遺伝子修飾することができる。かかるＣＡＲ－Ｔ細胞、およびかかるＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０７３６号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０７３４号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４８７３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４０６６０号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５５３３２号、第ＰＣＴ／ＩＢ２０１５／０５８６５０号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６７４４１号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７８８７６号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５９６６２号、第ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６１４０９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１９１９２号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５９１０６号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２２６０号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０６０６号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５７６４号、第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９４３９３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９８９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７６０６号、および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４２６９号に記載されている（各々の内容は、その全体が本明細書に援用される）。

ウイルスベクター
したがって、本明細書に記載の塩基エディターは、ウイルスベクターとともに送達され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターは、ウイルスベクターに含まれる核酸上にコードされ得る。一部の実施形態では、塩基エディターシステムの１つ以上の成分は、１つ以上のウイルスベクター上にコードされ得る。例えば、塩基エディターおよびガイド核酸は、単一のウイルスベクター上にコードされ得る。他の実施形態では、塩基エディターおよびガイド核酸は、異なるウイルスベクター上にコードされる。いずれの場合も、塩基エディターおよびガイド核酸は、各々、プロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結され得る。ウイルスベクター上にコードされる成分の組み合わせは、選択されたウイルスベクターのカーゴサイズ制約によって決定され得る。

塩基エディターの送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、培養物中または宿主内の特定の細胞にウイルスを標的指向化し、ウイルスペイロードを核または宿主細胞ゲノムに輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、培養物中の細胞、患者に（インビボで）直接投与することができ、または、インビトロで細胞を処理するためにそれらを使用することができ、修飾細胞は、任意選択的に（エクスビボで）患者に投与され得る。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターを含み得る。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。

ウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶおよびＦＩＶベースのベクター）、アデノウイルスベクター（例えば、ＡＤ１００）、レトロウイルスベクター（例えば、マロニーマウス白血病ウイルス、ＭＭＬ－Ｖ）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ－２）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、または他のプラスミドまたはウイルスベクタータイプが挙げられ得、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスのための製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号（ＡＡＶのための製剤、用量）、および米国特許第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）からの製剤および用量、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ、およびアデノウイルスを伴う臨床試験に関する臨床試験および刊行物からの製剤および用量が使用される。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤、および投与量は、米国特許第８，４５４，９７２号およびＡＡＶを伴う臨床試験と同様であり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤、および投与量は、米国特許第８，４０４，６５８号およびアデノウイルスを伴う臨床試験と同様であり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤、および投与量は、米国特許第５，８４６，９４６号およびプラスミドを伴う臨床試験と同様であり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成体ヒト男性）に基づくか、または推定され得、患者、対象、異なる体重および種の哺乳動物に対して調整され得る。投与頻度は、年齢、性別、全般的な健康状態、患者もしくは対象の他の状態、および対処される特定の状態もしくは症状を含む通常の要因に応じて、医師または獣医（例えば、医師、獣医）の範疇である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射され得る。細胞型特異的塩基エディターの場合、塩基エディターおよび任意のガイド核酸の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。

外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、レトロウイルスのトロピズムを変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができ、典型的には、高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存することになる。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング容量を有する、シス作用性の長鎖末端反復からなる。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで、永続的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクターは、標的細胞への効率的な組み込みのために、所与の長さよりも小さいポリヌクレオチド配列を必要とし得る。例えば、９ｋｂを超える長さのレトロウイルスベクターは、より小さいサイズのものと比較して、低いウイルス力価をもたらし得る。一部の態様では、本開示の塩基エディターは、効率的なパッケージングおよびレトロウイルスベクターを介した標的細胞への送達を可能にするように十分なサイズである。一部の実施形態では、塩基エディターは、ガイド核酸および／または標的指向化可能なヌクレアーゼシステムの他の成分と一緒に発現された場合でも、効率的なパッキングおよび送達を可能にするようなサイズである。

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ．２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を産生することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージングすることができる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染され得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。場合によっては、ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くために、かなりの量でパッケージ化されない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。

一過的な発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を有することが可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、インビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のために、標的核酸を用いて細胞を形質導入するために使用することもできる（例えば、Ｗｅｓｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、いくつかの刊行物に記載されており、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）が挙げられる。

ＡＡＶは、パルボウイルス科に属する小型の一本鎖ＤＮＡ依存性ウイルスである。４．７ｋｂの野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムは、それぞれ４つの複製タンパク質と３つのカプシドタンパク質とをコードする２つの遺伝子で構成され、両側に１４５ｂｐの逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接している。ビリオンは、３つのカプシドタンパク質であるＶｐ１、Ｖｐ２、およびＶｐ３から構成され、同じオープンリーディングフレームから１：１：１０の比率で生成されるが、差次的スプライシング（Ｖｐ１）および選択的翻訳開始部位（それぞれ、Ｖｐ２およびＶｐ３）から産生される。Ｖｐ３は、ビリオン内で最も豊富なサブユニットであり、ウイルスのトロピズムを定義する細胞表面での受容体認識に関与する。ウイルス感染性において機能するホスホリパーゼドメインは、Ｖｐ１の固有のＮ末端に特定されている。

ｗｔＡＡＶと同様に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、隣接ベクター導入遺伝子カセットに対する１４５ｂｐのシス作用性ＩＴＲを利用し、外来ＤＮＡのパッケージングのために最大４．５ｋｂを提供する。感染後、ｒＡＡＶは、本発明の融合タンパク質を発現することができ、環状ヘッド・トゥ・テール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）コンカテマーでエピソーム的に存在することによって、宿主ゲノムに組み込まれることなく持続する。このシステムをインビトロおよびインビボで使用したｒＡＡＶの成功例は多数あるが、遺伝子のコード配列の長さがｗｔＡＡＶゲノムと同等またはそれ以上である場合、パッケージング容量の制限により、ＡＡＶ媒介性遺伝子送達の使用が制限される。

ウイルスベクターは、用途に基づいて選択することができる。例えば、インビボでの遺伝子送達の場合、ＡＡＶは、他のウイルスベクターよりも有利であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは低毒性を可能にし、これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る。一部の実施形態では、ＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入変異誘発を引き起こす可能性が低くなる。アデノウイルスは、それらが強い免疫原性応答を誘導するため、ワクチンとして一般的に使用される。ウイルスベクターのパッケージング容量は、ベクターにパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを制限し得る。

ＡＡＶは、２つの１４５塩基の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、約４．５Ｋｂまたは４．７５Ｋｂのパッケージング容量を有する。これは、開示される塩基エディター、ならびにプロモーターおよび転写ターミネーターが、単一のウイルスベクターに適合され得ることを意味する。４．５Ｋｂまたは４．７５Ｋｂを超える構築物は、ウイルス産生の著しい低下をもたらし得る。例えば、ＳｐＣａｓ９はかなり大きいく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶへのパッケージングが困難になる。したがって、本開示の実施形態は、従来の塩基エディターよりも長さが短い開示される塩基エディターの利用を含む。一部の実施例では、塩基エディターは、４ｋｂ未満である。開示される塩基エディターは、４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、または１．５ｋｂ未満であり得る。一部の実施形態では、本開示の塩基エディターの長さは、４．５ｋｂ以下である。

ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶの種類を選択することができ、例えば、脳または神経細胞を標的化するためのＡＡＶ血清型１、２、５、またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの任意の組み合わせを選択することができ、心組織を標的化する場合、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の表は、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）に見出すことができる。

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターを使用して、キメラ抗原受容体を有する修飾免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を形質導入する。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、分裂細胞と分裂終了細胞の両方において感染し、それらの遺伝子を発現する能力を有する。最も一般的に知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して、広範囲の細胞型を標的化する。

レンチウイルスは、以下のように調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルス転写プラスミド骨格を含む）をクローニングした後、トランスフェクションの前日に、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で、Ｔ－７５フラスコ内で５０％コンフルエンスに播種した。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を、１０μｇのレンチウイルス導入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）および以下のパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクトする：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）、および７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００および１００μｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、培地を、１０％胎仔ウシ血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換する。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清の方法が好ましい。

レンチウイルスは、以下のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に回収する。上清は、最初にデブリを除去し、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過する。次いで、超遠心分離機で、２４，０００ｒｐｍで２時間スピンする。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中に、４℃で一晩再懸濁する。次いで、それらをアリコートし、－８０℃ですぐに凍結する。

別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）は、ウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであり、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現し、これは、網膜下注射によって送達されることが企図される。別の実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターの使用が企図される。

システムの任意のＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡまたは塩基エディターをコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達され得る。塩基エディターをコードするｍＲＮＡは、インビトロ転写を使用して生成することができる。例えば、ヌクレアーゼのｍＲＮＡは、以下のエレメントを含むＰＣＲカセットを使用して合成することができる：Ｔ７プロモーター、任意のｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、ヌクレアーゼ配列、および３’ＵＴＲ（例えば、βグロビン－ポリＡテール由来の３’ＵＴＲ）。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、Ｔ７プロモーター、続いて、配列「ＧＧ」、およびガイドポリヌクレオチド配列を含むカセットからのインビトロ転写を使用して転写することもできる。

発現を増強し、可能性のある毒性を低減するために、塩基エディターのコード配列および／またはガイド核酸は、例えば、シュードＵまたは５－メチルＣを使用して、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含むように修飾され得る。

ＡＡＶベクターの小さなパッケージング容量は、このサイズを超えるいくつかの遺伝子の送達および／または大きな生理学的調節エレメントの使用を困難にする。これらの課題は、例えば、送達されるタンパク質を２つ以上の断片に分割することによって対処することができ、Ｎ末端断片は、スプリットインテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、スプリットインテイン－Ｃに融合される。次いで、これらの断片は、２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングされる。本明細書で使用される場合、「インテイン」とは、隣接するＮ末端およびＣ末端のエクステイン（例えば、連結される断片）をライゲーションする自己スプライシングタンパク質のイントロン（例えば、ペプチド）を指す。異種タンパク質断片を連結するための特定のインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）に記載されている。インテインのＩｎｔＮおよびＩｎｔＣは、例えば、タンパク質断片を分離するために融合された場合、互いを認識し、それらがスプライシングで除かれ、同時に、それらが融合されたタンパク質断片の隣接するＮ末端エクステインおよびＣ末端エクステインがライゲーションされ、それによって、２つのタンパク質断片から全長タンパク質が再構成される。他の好適なインテインは、当業者には明らかであろう。

本発明の融合タンパク質の断片は、長さが変化し得る。一部の実施形態では、タンパク質断片は、２アミノ酸長～約１０００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、約５アミノ酸長～約５００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、約２０アミノ酸長～約２００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、約１０アミノ酸長～約１００アミノ酸長の範囲である。他の長さの好適なタンパク質断片は、当業者には明らかであろう。

一実施形態では、デュアルＡＡＶベクターは、大きな導入遺伝子発現カセットを２つの別々の半分（５’末端および３’末端、または頭部および尾部）に分割することによって生成され、カセットの各半分は、単一のＡＡＶベクター（５ｋｂ未満）にパッケージングされる。次いで、全長の導入遺伝子発現カセットの再構築は、両方のデュアルＡＡＶベクター、続いて、（１）５’ゲノムと３’ゲノムとの間の相同組換え（ＨＲ）（デュアルＡＡＶ重複ベクター）、（２）５’ゲノムと３’ゲノムとのＩＴＲ媒介性テール・トゥ・ヘッド（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｈｅａｄ）コンカテマー化（デュアルＡＡＶトランススプライシングベクター）、または（３）これらの２つの機構の組み合わせ（デュアルＡＡＶハイブリッドベクター）によって同じ細胞を同時感染させると達成される。インビボでのデュアルＡＡＶベクターの使用は、全長タンパク質の発現をもたらす。デュアルＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが４．７ｋｂ超の導入遺伝子のための効率的かつ実行可能な遺伝子導入戦略を表す。

インテイン
インテイン（介在タンパク質）は、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスを行う様々な多様な生物に見られる自動処理ドメインである。タンパク質スプライシングは、ペプチド結合の切断および形成の両方からなる多段階の生化学反応である。タンパク質スプライシングの内因性基質は、インテインを含む生物に見出されるが、インテインは、事実上、任意のポリペプチド骨格を化学的に操作するために使用することもできる。

タンパク質スプライシングでは、インテインは、２つのペプチド結合を切断することによって前駆体ポリペプチドから自ら切除し、それによって、新たなペプチド結合の形成を介して隣接するエクセイン（外部タンパク質）配列をライゲーションする。この再編成は、翻訳後（または、場合によっては翻訳時（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ））に起こる。インテイン媒介性タンパク質スプライシングは、インテインドメインのフォールディングのみを必要とする、自発的に起こる。

インテインの約５％はスプリットインテインであり、これらは２つの別個のポリペプチド（Ｎ－インテインおよびＣ－インテイン）として転写および翻訳され、それぞれが１つのエクステインに融合される。翻訳時に、インテイン断片は、正準インテイン構造に自発的かつ非共有結合的に構築され、トランスでタンパク質スプライシングを行う。タンパク質スプライシングのメカニズムは、インテイン－エクステイン接合部における２つのペプチド結合の切断、およびＮ－エクステインとＣ－エクステインとの間の新しいペプチド結合の形成をもたらす一連のアシル転位反応を伴う。このプロセスは、Ｎ－エクステインとインテインのＮ末端とを結合するペプチド結合の活性化によって開始される。ほぼすべてのインテインは、Ｃ末端Ｎ－エクステイン残基のカルボニル炭素を攻撃するシステインまたはセリンを、Ｎ末端に有する。このＮ～Ｏ／Ｓアシル転位（ａｃｙｌ－ｓｈｉｆｔ）は、一般に見出されるアスパラギン酸とともに、保存されたスレオニンおよびヒスチジン（ＴＸＸＨモチーフと称される）によって促進され、直鎖（チオ）エステル中間体の形成をもたらす。次に、この中間体は、システイン、セリン、またはスレオニンである第１のＣ－エクステイン残基（＋１）の求核攻撃によるトランス（チオ）エステル化に供される。得られた分枝（チオ）エステル中間体は、インテインの高度に保存されたＣ末端アスパラギンの環化という独自の変換によって解決される。このプロセスは、ヒスチジン（高度に保存されたＨＮＦモチーフ中に見出される）および最後から２番目のヒスチジンによって促進され、アスパラギン酸もまた関与し得る。このスクシンイミド形成反応は、反応性複合体からインテインを切除し、非ペプチド結合を介して結合したエクステインを残す。この構造は、インテイン非依存的な様式で急速に安定なペプチド結合に再編成される。

一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の一部分または断片がインテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。一部の実施形態では、融合タンパク質の一部分または断片は、インテインに融合され、ＡＡＶカプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼ、およびカプシドタンパク質は、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合され得る。一部の実施形態では、塩基エディターのＮ末端断片（例えば、ＡＢＥ、ＣＢＥ）は、スプリットインテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、スプリットインテイン－Ｃに融合される。これらの断片は、次いで、２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングされる。一部の実施形態では、インテインのＮ末端は、融合タンパク質のＣ末端に融合され、インテインのＣ末端は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端に融合される。

一実施形態では、インテインは、ＡＡＶカプシドタンパク質上に移植されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ塩基エディタータンパク質の断片または部分を接合するために利用される。異種タンパク質断片を連結するための特定のインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）に記載されている。インテインのＩｎｔＮおよびＩｎｔＣは、例えば、タンパク質断片を分離するために融合された場合、互いを認識し、それらがスプライシングで除かれ、同時に、それらが融合されたタンパク質断片の隣接するＮ末端エクステインおよびＣ末端エクステインがライゲーションされ、それによって、２つのタンパク質断片から全長タンパク質が再構成される。他の好適なインテインは、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＳｐＣａｓ９の選択された領域内のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＣｙｓ残基において、Ｎ末端断片およびＣ末端断片に分割された。これらの領域は、Ｃａｓ９結晶構造解析によって特定されたループ領域に対応する。各断片のＮ末端はインテイン－Ｎに融合され、各断片のＣ末端は、アミノ酸位置Ｓ３０３、Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ｓ３５５、Ａ４５６、Ｓ４６０、Ａ４６３、Ｔ４６６、Ｓ４６９、Ｔ４７２、Ｔ４７４、Ｃ５７４、Ｓ５７７、Ａ５８９、およびＳ５９０でインテイン－Ｃに融合される（これらは、以下の配列で、太字で示されている）。

核酸塩基エディターの使用
腫瘍細胞と会合した標的抗原は、健常な免疫細胞上で発現されてもよい。したがって、修飾免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）細胞を使用して腫瘍細胞上の抗原を標的化することで、その抗原も発現する健常な免疫細胞の死滅（フラトリサイドまたは自己死滅として知られる）がもたらされ得る。修飾免疫細胞を、修飾免疫細胞上の標的抗原（例えばＣＤ２）の発現を低減または排除してフラトリサイド耐性を提供し得る塩基エディターと組み合わせて使用することは、治療および基礎研究における応用とともに遺伝子修正を使用するための新しい戦略を提供する。
本開示は、フラトリサイド耐性修飾免疫細胞を産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、核酸塩基エディター（例えば、アデノシンデアミナーゼ塩基エディターまたはシチジンデアミナーゼ塩基エディター）と１つ以上のガイドＲＮＡとを用いて、健康な対象またはドナーから得られた免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を編集して、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）上の標的抗原（例えば、ＣＤ２）の発現を低減または排除することを含む方法が提供される。次いで、免疫細胞は、標的抗原（例えば、ＣＤ２）を対象とするキメラ抗原受容体を用いて形質導入される。得られた修飾免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）は、フラトリサイド耐性であり、健常な免疫細胞を標的化することなく、腫瘍細胞を標的化することができる。一部の実施形態では、フラトリサイド耐性修飾免疫細胞は、実施例２に提供されるように産生される。一部の実施形態では、フラトリサイド耐性ＣＤ２ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する方法が提供される。
本開示はまた、本明細書に提供される修飾免疫細胞を使用して、疾患（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）と診断された対象を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、有効量の本明細書に提供されるように産生された修飾免疫細胞を、疾患（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または疾患を有する傾向がある対象に投与することを含む方法が提供される。本開示は、デアミナーゼ媒介性遺伝子編集によって修正され得る標的とされた抗原と関連するＴ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍を治療するための方法を提供する。本明細書に提供される戦略と修飾免疫細胞とを用いて治療することができる好適な疾患は、本開示に基づいて、当業者には明らかであろう。
標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を編集するための塩基エディターまたは塩基エディターシステムを使用する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、（例えば、デアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、および１つ以上のガイドＲＮＡを含む）塩基エディターシステムの活性は、スプライス部位の破壊をもたらすか、または標的ヌクレオチド配列への未熟終止コドンの導入をもたらす。
一部の実施形態では、本発明に提供されるデアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）は、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基を脱アミノ化することができる。本開示の他の態様は、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）および特定のヌクレオチド配列に結合することができるドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質）を含む融合タンパク質を提供する。例えば、アデノシンは、典型的には、シトシン残基と塩基対を形成するイノシン残基に変換され得る。かかる融合タンパク質は、とりわけ、核酸配列の標的化編集に有用である。かかる融合タンパク質は、インビトロでのＤＮＡの標的化された編集（例えば、変異細胞または動物の生成）のために使用することができ、標的化された変異の導入（例えば、エクスビボでの細胞における遺伝子欠陥の修正、例えば、その後、同じ対象もしくは別の対象に再導入される対象から得られた細胞における遺伝子欠陥の修正）のために使用することができ、インビボでの標的化された変異の導入（例えば、遺伝子欠陥の修正、またはＧからＡもしくはＴからＣの変異の疾患関連遺伝子における非活性化変異の導入）ために使用することができ、本明細書に提供される核酸塩基エディターを使用して治療することができる。本開示は、デアミナーゼおよび核酸塩基エディターを利用する、修飾免疫細胞、融合タンパク質、核酸、ベクター、組成物、方法、キット、システムなどを提供する。

核酸を編集するための方法
本開示の一部の態様は、核酸を編集するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、核酸の核酸塩基（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列の塩基対）を編集するための方法である。一部の実施形態では、本方法は、ａ）核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列）の標的領域を、塩基エディター（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ドメイン）とガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）とを含む複合体と接触させるステップであって、標的領域が標的核酸塩基対を含む、接触させるステップと、ｂ）当該標的領域の鎖分離を誘導するステップと、ｃ）標的領域の一本鎖における当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換するステップと、ｄ）当該標的領域の１つ以下の鎖を切断するステップであって、第１の核酸塩基塩基に相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられる、切断するステップと、を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸における２０％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、ステップｂが省略されることを理解されたい。一部の実施形態では、本方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、本方法は、第２の核酸塩基が、第４の核酸塩基に相補的である第５の核酸塩基で置き換え、それによって、意図された編集された塩基対（例えば、Ｃ・ＧからＴ・Ａ）を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、意図された塩基対の少なくとも５％が編集される。一部の実施形態では、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。

一部の実施形態では、標的ヌクレオチドにおける意図された産物と意図されない産物との比率は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはそれ以上である。一部の実施形態では、インデル形成に対する意図された変異の比率は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１、またはそれ以上である。一部の実施形態では、カットされた一本鎖（ニック鎖）は、ガイド核酸にハイブリダイズする。一部の実施形態では、カットされた一本鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖と反対側である。一部の実施形態では、塩基エディターは、Ｃａｓ９ドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、未編集鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターは、ニッカーゼ活性を含む。一部の実施形態では、意図された編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の上流にある。一部の実施形態では、意図される編集塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流にある。一部の実施形態では、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の下流にある。一部の実施形態では、意図される編集塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流にある。一部の実施形態では、本方法は、正準（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ部位を必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、１～２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、５～２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。一実施形態では、リンカーは、３２アミノ酸長である。別の実施形態では、「長いリンカー」は、少なくとも約６０アミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、約３～１００アミノ酸長である。一部の実施形態では、標的領域は、標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、または１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、意図された編集された塩基対は、標的ウィンドウ内にある。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、意図された編集された塩基対を含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを使用して実施される。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、メチル化ウィンドウである。

一部の実施形態では、本開示は、ヌクレオチドを編集するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ａ）二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を、塩基エディターとガイド核酸（例えばｇＲＮＡ）とを含む複合体と接触させることであって、標的領域が、標的核酸塩基対を含む、接触させることと、ｂ）当該標的領域の鎖分離を誘導することと、ｃ）標的領域の一本鎖における当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換することと、ｄ）当該標的領域の１つ以下の鎖を切断することであって、第１の核酸塩基に相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられ、第２の核酸塩基が、第４の核酸塩基に相補的である第５の核酸塩基で置き換えられ、それによって、意図された編集された塩基対を生成し、意図された編集された塩基対を生成する効率が、少なくとも５％である、切断することと、を含む。一部の実施形態では、ステップｂが省略されることを理解されたい。一部の実施形態では、意図された塩基対の少なくとも５％が編集される。一部の実施形態では、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法による塩基編集は、任意の特定の遺伝子部位において、少なくとも１０％の塩基変換効率を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法による塩基編集は、任意の特定の遺伝子部位において、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の塩基変換効率を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法による塩基編集は、任意の特定の遺伝子部位において、少なくとも７０％の塩基変換効率を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法による塩基編集は、任意の特定の遺伝子部位において、少なくとも８０％の塩基変換効率を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法による塩基編集は、任意の特定の遺伝子部位において、少なくとも９０％の塩基変換効率を有し得る。

一部の実施形態では、本方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のインデル形成を引き起こす。一部の実施形態では、標的ヌクレオチドにおける意図された産物：意図されない産物の比率は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはそれ以上である。一部の実施形態では、インデル形成に対する意図された変異の比率は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１、またはそれ以上である。一部の実施形態では、カットされた一本鎖は、ガイド核酸にハイブリダイズする。一部の実施形態では、カットされた一本鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖と反対側である。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、ニッカーゼ活性を含む。一部の実施形態では、意図された編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の上流にある。一部の実施形態では、意図される編集塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流にある。一部の実施形態では、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の下流にある。一部の実施形態では、意図される編集塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流にある。一部の実施形態では、本方法は、正準（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ部位を必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、１～２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、５～２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。例えば、一部の実施形態では、標的領域は、標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは、標的核酸塩基対を含む。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、または１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、意図された編集された塩基対は、標的ウィンドウ内で生じる。一部の実施形態では、標的ウィンドウは、意図された編集された塩基対を含む。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、本明細書に提供される塩基エディターのいずれか１つである。

薬学的組成物
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子修飾免疫細胞、塩基エディター、融合タンパク質、または融合タンパク質－ガイドポリヌクレオチド複合体のうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。より具体的には、薬学的組成物が本明細書に提供され、遺伝子修飾免疫細胞またはかかる免疫細胞の集団を含み、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、当該修飾免疫細胞またはその集団は、少なくとも１つの編集された遺伝子を有して、フラトリサイド耐性を提供するか、修飾免疫細胞の機能を増強するか、または修飾免疫細胞の免疫抑制もしくは免疫阻害を低減し、編集された遺伝子の発現は、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、少なくとも１つの編集遺伝子は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＰＤＣＤ１／ＰＤ１、ＣＢＬＢ、ＴＧＦＢＲ２、ＺＡＰ７０、ＮＦＡＴｃ１、ＴＥＴ２、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３が編集される。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３は、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１／ＰＤ１から選択される１つ以上の遺伝子と組み合わせて編集される。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ５を欠くかまたは減少したレベルのＣＤ５を有し、ＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ７を欠くかまたは減少したレベルのＣＤ７を有し、ＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ３３を欠くかまたは減少したレベルのＣＤ３３を有し、ＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ３を欠くかまたは減少したレベルのＣＤ３を有し、ＣＤ３キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ１２３を欠くかまたは減少したレベルのＣＤ１２３を有し、ＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ５、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１／ＰＤ１から選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くかまたは減少したレベルを有し、ＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ７、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くかまたは減少したレベルを有し、ＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ３３、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くかまたは減少したレベルを有し、ＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ３、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くかまたは減少したレベルを有し、ＣＤ３キメラ抗原受容体を発現する。一部の実施形態では、薬学的組成物は、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を含み、ＣＤ１２３、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くかまたは減少したレベルを有し、ＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する。

本発明の薬学的組成物は、既知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。一般に、免疫細胞またはその集団は、投与または貯蔵の前に、好適な担体と混合され、一部の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。好適な薬学的に許容される担体は、概して、不活性物質を含み、薬学的組成物を対象に投与するのを助けるか、薬学的組成物を送達可能な調製物に加工するのを助けるか、または投与前に薬学的組成物を保管するのを助ける。薬学的に許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘性、ｐＨ、薬物動態、溶解性を、安定化、最適化、またはその他変化させ得る薬剤を含むことができる。かかる薬剤には、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、封入剤、および皮膚浸透促進剤が含まれる。例えば、担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。

薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（１）糖類（例えば、乳糖、グルコースおよびスクロース）、（２）デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン）、（３）セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロース）、（４）粉末トラガント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク）、（８）賦形剤（例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス）、（９）油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）、（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）、（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）、（１３）寒天、（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物、（２２）膨張剤（例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸）、（２３）血清アルコール（例えば、エタノール）、ならびに（２３）薬学的製剤に用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、および抗酸化剤も、製剤中に存在してもよい。

薬学的組成物は、製剤のｐＨを、生理学的ｐＨを反映する所定のレベルに（例えば、約５．０～約８．０の範囲に）維持するために、１つ以上のｐＨ緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤に使用されるｐＨ緩衝化合物は、アミノ酸、またはアミノ酸の混合物（例えば、ヒスチジン、またはヒスチジンおよびグリシンなどのアミノ酸の混合物）であり得る。あるいは、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、製剤のｐＨを所定のレベルに（例えば、約５．０～約８．０の範囲に）維持し、かつカルシウムイオンをキレートしない薬剤である。かかるｐＨ緩衝化合物の例示的な例としては、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに好適な任意の量で存在してもよい。

薬学的組成物はまた、１つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、製剤の浸透圧特性（例えば、張力、オスモラリティ、および／または浸透圧）を、レシピエント個体の血流および血液細胞で許容されるレベルに調節する化合物を含み得る。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する、当業者に既知または利用可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の製剤で使用される所与の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定することができる。好適な種類の浸透圧調節剤の例示的な例としては、塩（例えば、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウム）、糖（例えば、スクロース、デキストロース、およびマンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、ならびにこれらの薬剤および／または薬剤の種類のうちの１つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在してもよい。

修飾免疫細胞またはその集団、および担体に加えて、本発明の薬学的組成物は、疾患の治療に有用な少なくとも１つの追加の治療剤を含むことができる。例えば、本明細書に記載の薬学的組成物の一部の実施形態は、化学療法剤をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、サイトカインペプチドまたはサイトカインペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、修飾免疫細胞またはその集団を含む薬学的組成物は、追加の治療薬とは別に投与され得る。

一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、１つ以上の追加の修飾免疫細胞、またはその修飾免疫細胞の１つ以上の集団である。一部の実施形態では、１つ以上の追加の修飾免疫エフェクター細胞は、編集された遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンするために少なくとも１つの編集された遺伝子を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの編集された遺伝子は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３が編集される。一部の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３は、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、および／またはＰＤ１から選択される１つ以上の遺伝子と組み合わせて編集される。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、その修飾免疫細胞の２つ以上の集団を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、１）ＣＤ５、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、２）ＣＤ７、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、を含む。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、１）ＣＤ３３、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、２）ＣＤ１２３、およびＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、を含む。

本発明の薬学的組成物を使用して、自己または同種免疫細胞免疫療法に応答する任意の疾患または状態を治療することができる。例えば、薬学的組成物は、一部の実施形態では、腫瘍の治療に有用である。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、血液がんである。一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞がんであり、一部の実施形態では、Ｂ細胞がんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、Ｂ細胞がんは、再発／難治性多発性骨髄腫の再発である。一部の実施形態では、血液がんは、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である。場合によっては、白血病は、急性白血病である。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。急性白血病には、例えば、急性リンパ性白血病または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）も含まれ、ＡＬＬには、Ｂ系統ＡＬＬ、Ｔ系統ＡＬＬ、およびＴ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）が含まれる。

一部の実施形態では、腫瘍（例えば、白血病）を有する対象、またはそれを発症する傾向がある対象には、１）ＣＤ５、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤＣＤ１／ＰＤ１から選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、２）ＣＤ７、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、３）ＣＤ３３、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、４）ＣＤ１２３、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍから選択される少なくとも１つの編集された遺伝子を欠くか、または減少したレベルを有し、かつＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する、修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団と、のうちの１つ以上が有効量で投与される。

本発明の遺伝子修飾免疫細胞の治療的使用に関する考慮事項の１つは、最適または満足のいく効果を達成するために必要な細胞の量である。投与される細胞の量は、処置される対象によって異なり得る。一実施形態では、１０^４～１０^１０、１０^５～１０^９、または１０^６～１０^８個の本発明の遺伝子修飾免疫応答性細胞が、ヒト対象に投与される。一部の実施形態では、少なくとも約１ｘ１０^８、２ｘ１０^８、３ｘ１０^８、４ｘ１０^８、および５ｘ１０^８個の本発明の遺伝子修飾免疫細胞が、ヒト対象に投与される。正確な有効用量の決定は、各個々の対象の要因（サイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む）に基づいてもよい。用量は、本開示および当該技術分野における知識から、当業者によって容易に確かめられ得る。

当業者は、組成物中のおよび本発明の方法において投与される、細胞の数ならびに任意選択的な添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、添加剤（活性免疫細胞に加えて）は、リン酸緩衝生理食塩水中０．００１～５０％（重量）溶液の量で存在し、活性成分は、マイクログラム～ミリグラムのオーダーで、例えば、約０．０００１～約５重量％、好ましくは約０．０００１～約１重量％、さらにより好ましくは約０．０００１～約０．０５重量％、または約０．００１～約２０重量％、好ましくは約０．０１～約１０重量％、さらにより好ましくは約０．０５～約５重量％で存在する。もちろん、動物またはヒトに投与される任意の組成物、および任意の特定の投与方法に対して、したがって、毒性を決定すること（例えば、好適な動物モデル（例えば、マウスなどのげっ歯類）における致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することによる）、ならびに好適な応答を誘発する組成物の投薬量、その中の成分の濃度、および組成物の投与のタイミングを決定することが好ましい。かかる決定は、当業者の知識、本開示、および本明細書で引用される文書から、過度の実験を必要としない。また、順次投与の時間は、過度の実験なしに確かめることができる。

一実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を生成する際に使用されてもよく、かつ１つ以上の塩基編集された修飾を有してもよく、そのため、操作されたＴ細胞が標的に対して特異的な免疫応答を開始することができるようになる。ＣＡＲは、特異的に抗原標的を対象としてもよく、抗原は、宿主内の細胞によって提示され得る。一部の実施形態では、免疫応答は、細胞傷害性を包含する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、その標的に対する増強された細胞傷害性応答を有する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、操作されていないＴ細胞と比較して、その標的に対する増強された細胞傷害性応答を誘導する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、操作されていない細胞と比較して、少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはそれ以上の増強された細胞傷害性応答を示す。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、操作されていない細胞よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多く、標的細胞を死滅させることができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、より高いメモリ応答を誘発することができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、操作されていない細胞よりも低いレベルの炎症性サイトカインを誘導することができ、すなわち、操作された細胞が、サイトカインストーム応答を引き起こさない。

一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、同種宿主に投与され、操作されたＴ細胞は、宿主による拒絶を有しない。一部の実施形態では、同種Ｔ細胞は、宿主による無視可能なまたは最小限の拒絶を誘発する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、フラトリサイド耐性を有する。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、対象への送達のために製剤化される。本明細書に記載の薬学的組成物を投与する好適な経路としては、局所、皮下、皮内、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、疾患部位（例えば、腫瘍部位）に局所的に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜または繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性、またはゲル状物質である。

他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、制御放出システムにおいて送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８９，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｔａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋｅｔａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、ＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ（ＬａｎｇｅｒａｎｄＷｉｓｅｅｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９７４）、ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＢｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｔＤｅｓｉｇｎａｎｄＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＳｍｏｌｅｎａｎｄＢａｌｌｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８４）、ＲａｎｇｅｒａｎｄＰｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい。また、Ｌｅｖｙｅｔａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇｅｔａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。他の制御放出システムは、例えば、上記のＬａｎｇｅｒで論じられている。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、対象（例えば、ヒト）への静脈内または皮下投与に適した組成物として、通常の手順に従って製剤化される。一部の実施形態では、注射による投与のための薬学的組成物は、可溶化剤としての滅菌等張使用における溶液、および注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔剤である。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは単位剤形で一緒に混合されて供給される。医薬品が注入によって投与される場合、医薬品は、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて分注され得る。薬学的組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

全身投与のための薬学的組成物は、液体（例えば、滅菌生理食塩水、乳酸リンゲル溶液、またはハンクス溶液）であってもよい。加えて、薬学的組成物は、固体形態であってもよく、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も企図される。薬学的組成物は、脂質粒子または小胞（例えば、非経口投与にも好適なリポソームまたは微結晶）内に含まれ得る。粒子は、組成物がその中に含まれている限り、単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）または多層（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ）などの任意の好適な構造の粒子であり得る。化合物は、融合脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５～１０ｍｏｌ％）の陽イオン性脂質を含む「安定化プラスミド脂質粒子」（ＳＰＬＰ）に封入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（ＺｈａｎｇＹ．Ｐ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９９，６：１４３８－４７を参照されたい）。かかる粒子および小胞には、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチル硫酸塩または「ＤＯＴＡＰ」などの正に帯電した脂質が特に好ましい。そのような脂質粒子の調製は周知である。例えば、米国特許第４，８８０，６３５号、同第４，９０６，４７７号、同第４，９１１，９２８号、同第４，９１７，９５１号、同第４，９２０，０１６号、および同第４，９２１，７５７号を参照されたい（それらの各々は、参照により本明細書に援用される）。

本明細書に記載の薬学的組成物は、例えば、単位用量として投与または包装され得る。「単位用量」という用語は、本開示の薬学的組成物に関して使用される場合、対象のための単位投薬量として好適な物理的に分離された単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（すなわち、担体またはビヒクル）と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性物質を含む。

さらに、薬学的組成物は、薬学的キットとして提供され得、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含む容器、および（ｂ）薬学的に許容される希釈剤（例えば、本発明の凍結乾燥化合物の再構築または希釈に使用される滅菌物）を含む第２の容器を含む。任意選択的に、かかる容器に付随するものが、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定される形態の通知であってもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。

別の態様では、上に記載の疾患の治療に有用な材料を含む製造品（ａｒｔｉｃｌｅｏｆｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）が含まれる。一部の実施形態では、製造品は、容器およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載の疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈内輸液バッグまたはバイアルであり得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上の、または容器に付随するラベルは、組成物が、選択された疾患を治療するために使用されることを示す。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。これには、商業および使用者の観点から望ましい他の材料がさらに含まれ得、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質、ｇＲＮＡ、および／または複合体のいずれかは、薬学的組成物の一部として提供される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡとカチオン性脂質との複合体を形成するＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡ、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。

一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、対象内の標的ゲノム修飾をもたらすように、対象に（例えば、ヒト対象に）投与される。一部の実施形態では、細胞は、対象から得られ、本明細書に提供される薬学的組成物のいずれかと接触する。一部の実施形態では、対象から取り出され、エクスビボで薬学的組成物と接触させた細胞は、任意選択的に、所望のゲノム修飾が細胞内で実施または検出された後、対象に再導入される。ヌクレアーゼを含む薬学的組成物を送達する方法は既知であり、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されている（それらのすべての開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を対象とするが、かかる組成物が、概して、あらゆる種類の動物または生物への投与に（例えば、獣医学的使用に）好適であることが、当業者によって理解されるであろう。

組成物が様々な動物への投与に好適であるようにするため、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を改変することは十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、もしあったとしても単に通常の実験で、かかる改変を設計および／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象としては、ヒトおよび／もしくは他の霊長類、哺乳類、家畜化された動物、ペット、ならびに商業的に関連する哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラット）、ならびに／または鳥類（ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野で既知のまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を、賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と会合させるステップと、次いで、必要および／または望ましい場合、製品を所望の単回用量単位または複数回用量単位に成形および／または包装するステップと、を含む。薬学的製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができ、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適した、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６（その全体が参照により本明細書に援用される）には、薬学的組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤およびそれらの調製のための既知の技術が開示されている。ヌクレアーゼを含む薬学的組成物を製造するためのさらなる好適な方法、試薬、賦形剤、および溶媒については、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５１３１号（公開番号第ＷＯ２０１１／０５３９８２Ａ８号、２０１０年１１月２日出願）も参照されたい（その全体が、参照により本明細書に援用される）。

任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的作用を生み出すことによって、またはその他、薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって、物質またはその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用は、本開示の範囲内であることとが企図される。

組成物は、上に記載のように、有効量で投与され得る。有効量は、投与様式、治療される特定の状態、および所望の転帰に依存する。これはまた、状態のステージ、対象の年齢および身体状態、同時療法の性質（もしあれば）、ならびに医師に周知の同様の要因に依存し得る。それは、治療用途において、医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。

一部の実施形態では、本開示による組成物は、様々な疾患、障害、および／または状態のうちのいずれかの治療に使用することができる。

治療方法
本発明の一部の態様は、治療を必要とする対象を治療する方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含む。より具体的には、治療方法は、それを必要とする対象に、キメラ受容体（ＣＡＲ）を発現する修飾免疫細胞の集団を含み、かつ少なくとも１つの編集された遺伝子を有する１つ以上の薬学的組成物を投与することを含み、少なくとも１つの編集された遺伝子は、フラトリサイド耐性を提供し、修飾免疫細胞の機能を増強するか、または免疫抑制もしくは免疫阻害を低減し、少なくとも１つの編集された遺伝子の発現は、ノックアウトまたはノックダウンされる。一部の実施形態では、治療方法は、自己免疫細胞療法である。他の実施形態では、治療方法は、同種免疫細胞療法である。

特定の実施形態では、免疫細胞の特異性は、本明細書で企図されるキメラ抗原受容体を発現するように免疫細胞を遺伝子修飾することによって、対象における疾患細胞または改変細胞の表面上に発現されたマーカーに再誘導される。一部の実施形態では、治療方法は、対象に、本明細書に記載の免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、腫瘍細胞上で発現されたマーカーにその特異性を再誘導するように遺伝子修飾されている。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｂ細胞がん、例えば、Ｂ細胞がん（リンパ腫、白血病、または骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）など）である。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、血液がんである。一部の実施形態では、血液がんは、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である。場合によっては、白血病は、前白血病を含む。場合によっては、白血病は、急性白血病である。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。急性白血病には、例えば、急性リンパ性白血病または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）も含まれ、ＡＬＬには、Ｂ系統ＡＬＬ、Ｔ系統ＡＬＬ、およびＴ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）が含まれる。

腫瘍の非限定的な例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、末梢性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫ＡＬＫ^＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０^＋リンパ増殖性障害、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、および腸症関連Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である。一部の実施形態では、腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。したがって、本開示の一部の実施形態は、対象における腫瘍の治療方法を提供する。

一部の実施形態では、治療方法は、腫瘍（例えば、白血病）を有するか、または腫瘍を発症する傾向がある対象に、機能的Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）、表面抗原分類３３（ＣＤ３３）、表面抗原分類３（ＣＤ３）、表面抗原分類５（ＣＤ５）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、表面抗原分類５２（ＣＤ５２）、表面抗原分類１２３（ＣＤ１２３）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＦＡＳ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、クラスＩＩ主要組織適合複合体、トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体β定常領域１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常領域２（ＴＲＢＣ２）、もしくはそれらの組み合わせを欠いているか、または減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象は、ＣＤ１２３を欠くかまたはそのレベルが減少し、かつＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象は、ＣＤ５を欠くかまたはそのレベルが減少し、かつＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象は、ＣＤ７を欠くかまたはそのレベルが減少し、かつＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象は、ＣＤ３３を欠くかまたはそのレベルが減少し、かつＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象は、ＣＤ３を欠くかまたはそのレベルが減少し、かつＣＤ３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。

一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、機能的ＴＲＡＣを欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、機能的Ｂ２Ｍを欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、機能的ＦＡＳを欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、機能的ＬＡＧ－３を欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、機能的ＴＲＢＣ１および／またはＴＲＢＣ２を欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、機能的ＣＩＩＴＡを欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ５２を欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＰＤ－１を欠くかまたは減少したレベルを有する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。

一部の実施形態では、腫瘍（例えば、白血病）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ１２３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／もしくはＰＤ－１またはそれらの組み合わせを欠くかまたは減少したレベルを有し、かつ含まれるＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、白血病）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ５を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／もしくはＰＤ－１、またはそれらの組み合わせを欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、白血病）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ７を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／もしくはＰＤ－１、またはそれらの組み合わせを欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、白血病）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ３３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／もしくはＰＤ－１、またはそれらの組み合わせを欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、白血病）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／もしくはＰＤ－１、またはそれらの組み合わせを欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が投与される。

対象において腫瘍を治療する方法の一部の実施形態では、対象に、本明細書に記載の免疫細胞と１つ以上の追加の治療剤とを投与することを含む。例えば、本発明の免疫細胞は、１つ以上の追加の修飾免疫細胞またはその集団と同時投与され得る。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ１２３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、ＣＤ３３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ３３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、が同時投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ５を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ５キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、ＣＤ７を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、が同時投与される。一部の実施形態では、免疫細胞のうちのいずれかは、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、および／もしくはＰＤ１、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上における変異をさらに含む。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、ＣＤ７を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ７キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、が同時投与される。一部の実施形態では、腫瘍（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍）を有するか、または発症する傾向がある対象に、ＣＤ３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、ＣＤ１２３を欠くかまたは減少したレベルを有し、かつＣＤ１２３キメラ抗原受容体を発現する、有効量の修飾免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と、が同時投与される。

一部の実施形態では、本発明の免疫細胞は、サイトカインと同時投与され得る。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、免疫細胞は、化学療法剤と同時投与される。化学療法剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、またはリツキシマブ、またはそれらの組み合わせであり得る。他の化学療法剤としては、オビヌツズマブ、ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イブルチニブ、メトトレキサート、シタラビン、デキサメタゾン、シスプラチン、ボルテゾミブ、フルダラビン、イデラリシブ、アカラブルチニブ、レナリドミド、ベネトクラクス、シクロホスファミド、イホスファミド、エトポシド、ペントスタチン、メルファラン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、パノビノスタット、ダラツムマブ、エロツズマブ、サリドマイド、レナリドミド、またはポマリドミド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。「同時投与」は、治療の過程で、２つ以上の治療剤または薬学的組成物を投与することを指す。かかる同時投与は、同時投与または逐次投与であり得る。後で投与される治療剤または薬学的組成物の逐次投与は、第１の薬学的組成物または治療剤の投与後、治療過程の任意の時点で行われ得る。

本発明の一部の実施形態では、投与された免疫細胞は、インビボで増殖し、対象において長期間残留することができる。本発明の免疫細胞は、一部の実施形態では、メモリー免疫細胞に成熟し、対象内の循環に残留することができ、それによって、キメラ抗原受容体によって認識されるマーカーを発現する疾患細胞または改変細胞の再発に能動的に応答することができる細胞の集団を生成する。

免疫細胞に核酸塩基エディターポリペプチドを発現または導入し、細胞を少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を標的とすることができる２つ以上のガイドＲＮＡと接触させる方法によって産生された修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、第１のポリペプチドは、Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）であり、第２のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）、β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）ポリペプチドからなる群から選択され、核酸塩基エディターポリペプチドは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とシチジンデアミナーゼとを含む。かかる方法の一例では、３つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または細胞と接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、またはＣＢＬＢポリヌクレオチドを標的とする。かかる方法の別の例では、４つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または細胞と接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＣＢＬＢポリヌクレオチドのうちの１つを標的とする。一例では、２つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または接触され、各々、Ｂ２ＭまたはＴＲＡＣポリヌクレオチドを標的とする。別の例では、３つのガイドＲＮＡが細胞で発現されるか、または細胞と接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、またはＣＢＬＢポリヌクレオチドを標的とする。別の例では、４つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または細胞と接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＣＢＬＢポリヌクレオチドのうちの１つを標的とする。別の例では、３つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤＣＤ１ポリヌクレオチドを標的とする。別の例では、ガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣエキソン４スプライスアクセプター部位、Ｂ２Ｍエキソン１スプライスドナー部位、またはＰＤＣＤ１エキソン１スプライスドナー部位を標的とする。別の実施形態では、修飾免疫細胞を産生する方法は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）ポリヌクレオチドを標的とするガイドＲＮＡを、細胞で発現させることをさらに含む。

免疫細胞に核酸塩基エディターポリペプチドを発現または導入し、細胞を、Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）、β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を標的とすることができる２つ以上のガイドＲＮＡと接触させる方法によって産生された修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、核酸塩基エディターポリペプチドは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とアデノシンデアミナーゼとを含む。一例では、２つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または接触され、各々、Ｂ２ＭまたはＴＲＡＣポリヌクレオチドを標的とする。別の例では、３つのガイドＲＮＡが細胞で発現されるか、または細胞と接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、またはＣＢＬＢポリヌクレオチドを標的とする。別の例では、４つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または細胞と接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤＣＤ１、およびＣＢＬＢポリヌクレオチドのうちの１つを標的とする。別の例では、３つのガイドＲＮＡが、細胞で発現されるか、または接触され、各々、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤＣＤ１ポリヌクレオチドを標的とする。別の例では、ガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣエキソン４スプライスアクセプター部位、Ｂ２Ｍエキソン１スプライスドナー部位、またはＰＤＣＤ１エキソン１スプライスドナー部位を標的とする。別の実施形態では、修飾免疫細胞を産生する方法は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）ポリヌクレオチドを標的とするガイドＲＮＡを、細胞で発現させることをさらに含む。

免疫細胞に核酸塩基エディターポリペプチドを発現または導入し、細胞を、Ｖセット免疫調節受容体（ＶＩＳＴＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（Ｔｉｍ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）、調節因子Ｘ関連アンキリン含有タンパク質（ＲＦＸＡＮＫ）、ＰＶＲ関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、キチナーゼ３様１（Ｃｈｉ３ｌ１）、表面抗原分類９６（ＣＤ９６）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、ＳｐｒｏｕｔｙＲＴＫシグナル伝達アンタゴニスト１（Ｓｐｒｙ１）、ＳｐｒｏｕｔｙＲＴＫシグナル伝達アンタゴニスト２（Ｓｐｒｙ２）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、表面抗原分類３（ＣＤ３）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、表面抗原分類３３（ＣＤ３３）、表面抗原分類５２（ＣＤ５２）、表面抗原分類１２３（ＣＤ１２３）、Ｔ細胞受容体β定常領域１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常領域２（ＴＲＢＣ２）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、シトクロムＰ４５０ファミリー１１サブファミリーＡメンバー１（Ｃｙｐ１１ａ１）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１）、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー３（ＮＲ４Ａ３）、メチル化調節Ｊタンパク質（ＭＣＪ）、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、およびセレクチンＰリガンド／Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＳＥＬＰＧ／ＰＳＧＬ１）ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を標的とすることができる２つ以上のガイドＲＮＡと接触させる方法によって産生された修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、核酸塩基エディターポリペプチドは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とアデノシンデアミナーゼもしくはシチジンデアミナーゼとを含む。一実施形態では、細胞を産生する方法は、細胞を、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）、β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を標的化することができる２つ以上のガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む。別の実施形態では、修飾免疫細胞を産生する方法は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）ポリヌクレオチドを標的とするガイドＲＮＡを、細胞で発現させることをさらに含む。

本明細書では、腫瘍を有する対象から単離された免疫細胞において、ＣＢＬＢ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、またはマイナー組織適合ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とする１つ以上のガイドＲＮＡと、核酸ＤＮＡプログラマブル結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとを含む核酸塩基エディターポリペプチドと、を発現させることを含む方法によって産生された抗腫瘍活性を有する、修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、本明細書に記載される腫瘍または液体がんを治療する方法が本明細書に提供される。一例では、ガイドＲＮＡは、各々、ＣＢＬＢおよびＰＤＣＤ１ポリヌクレオチドを標的とする。一例では、ガイドＲＮＡは、各々、ＰＤＣＤ１およびＣＴＬＡ４ポリヌクレオチドを標的とする。一例では、ガイドＲＮＡは、各々、ＣＢＬＢ、ＰＤＣＤ１、およびＣＴＬＡ４ポリヌクレオチドを標的とする。一例では、ガイドＲＮＡは、各々、ＣＢＬＢ、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ４ポリヌクレオチドを標的とする。

上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、ガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドのスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を標的とする。上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、核酸塩基エディターポリペプチドは、標的ポリヌクレオチドにおいて終止コドンを生成する。上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、核酸塩基エディターポリペプチドは、ＰＤＣＤ１エキソン２において終止コドンを生成する。上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、核酸塩基エディターポリペプチドが、例えば、二分ＮＬＳ、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、または１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害因子などの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を発現することをさらに含む。

上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、およびＢｖＣａｓ１２ｂ、またはそれらの活性断片からなる群から選択される。上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、ｎａｐＤＮＡｂｐドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９を含む。上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、シチジンデアミナーゼは、Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｍａｒｉｎｕｓシトシンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡ１）、または活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）であり、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡである。

上に記載される修飾免疫細胞を産生するかかる方法のいずれかにおいて、一例では、本方法は、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＲ２ポリヌクレオチド、ＺＡＰ７０ポリヌクレオチド、ＮＦＡＴｃ１ポリヌクレオチド、およびＴＥＴ２ポリヌクレオチドを標的とする１つ以上のガイドＲＮＡを、免疫細胞で発現することをさらに含む。

場合によっては、対象に投与される修飾免疫細胞は、検出可能な転座を含まないことが理解される。

本明細書では、免疫原性が低下し、抗腫瘍活性が増加した修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が提供され、修飾免疫細胞は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＢＬＢ、もしくはＰＤ１ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。一例では、修飾免疫細胞は、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣポリヌクレオチドにおける変異を含む。別の例では、修飾免疫細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤＣＤ１ポリヌクレオチドにおける変異を含む。別の例では、修飾免疫細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＢＬＢポリヌクレオチドにおける変異を含む。別の例では、修飾免疫細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＢＬＢ、およびＰＤ１ポリヌクレオチドにおける変異を含む。別の例では、修飾免疫細胞は、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦＢＲ２、ＺＡＰ７０、ＮＦＡＴｃ１、またはＴＥＴ２をコードする１つ以上のポリヌクレオチドにおける変異を含む。別の例では、修飾免疫細胞は、Ｖセット免疫調節受容体（ＶＩＳＴＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（Ｔｉｍ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦｂＲＩＩ）、調節因子Ｘ関連アンキリン含有タンパク質（ＲＦＸＡＮＫ）、ＰＶＲ関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、キチナーゼ３様１（Ｃｈｉ３ｌ１）、表面抗原分類９６（ＣＤ９６）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、ＳｐｒｏｕｔｙＲＴＫシグナル伝達アンタゴニスト１（Ｓｐｒｙ１）、ＳｐｒｏｕｔｙＲＴＫシグナル伝達アンタゴニスト２（Ｓｐｒｙ２）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、表面抗原分類３（ＣＤ３）、表面抗原分類７（ＣＤ７）、表面抗原分類３３（ＣＤ３３）、表面抗原分類５２（ＣＤ５２）、表面抗原分類１２３（ＣＤ１２３）、Ｔ細胞受容体β定常領域１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体β定常領域２（ＴＲＢＣ２）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、シトクロムＰ４５０ファミリー１１サブファミリーＡメンバー１（Ｃｙｐ１１ａ１）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１）、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー３（ＮＲ４Ａ３）、メチル化調節Ｊタンパク質（ＭＣＪ）、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、およびセレクチンＰリガンド／Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＳＥＬＰＧ／ＰＳＧＬ１）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドにおける変異を含む。別の例では、修飾免疫細胞は、例えば、腫瘍に関連するマーカー（例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ））に対する親和性を有する細胞外ドメインを含む、キメラ抗原受容体を発現する。

本明細書では、免疫原性が低下し、抗腫瘍活性が増加した修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が提供され、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣポリヌクレオチドのうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、またはそれらの組み合わせのうちの２つ以上の変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、またはそれらの組み合わせのうちの３つ以上の変異を含む。一例では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、およびＴＲＡＣにおける変異を含む。

本明細書では、免疫原性が低下し、抗腫瘍活性が増加した修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が提供され、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、ＣＤ７ポリヌクレオチドのうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせにおける変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、ＣＤ７、またはそれらの組み合わせのうちの２つ以上の変異を含む。一例では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３およびＣＤ７における変異を含む。様々な実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、ＣＤ７、またはそれらの組み合わせのうちの３つ以上の変異を含む。一例では、修飾免疫細胞は、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、およびＣＤ７における変異を含む。

本明細書では、免疫細胞に核酸塩基エディターポリペプチドと、β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子を標的とすることができる２つ以上のガイドＲＮＡと、Ｃａｓ１２ポリペプチドと、ＴＲＡＣをコードする核酸分子を標的とすることができるガイドＲＮＡと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体をコードするＤＮＡドナー鋳型と、を発現または導入する方法によって産生された修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が提供され、核酸塩基エディターポリペプチドは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびシチジンデアミナーゼを含む。

本明細書では、免疫原性が低下し、抗腫瘍活性が増加した修飾免疫細胞（例えば、健常な対象から得られた免疫細胞、または、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、またはＴヘルパー細胞などのＴ細胞）を用いて、腫瘍または液体がんを治療する方法が提供され、修飾免疫細胞は、Ｂ２ＭまたはＰＤ１ポリヌクレオチドのうちの１つ以上における変異、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入、ならびに免疫細胞の細胞表面でのＣＡＲの発現を含む。

本発明の一部の実施形態では、治療を必要とする対象において液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含む。かかる方法によって治療される液体がんには、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

一例では、治療を必要とする対象において液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含み、液体がんは、リンパ腫を含む。本明細書に記載の方法を使用して治療される液体リンパ腫としては、これらに限定されないが、悪性形質細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位性ホジキンリンパ腫、真性多血症、ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間の特徴を有する未分類のＢ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンストレームマクログロブリン血症など）、節性濾胞辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（下肢型）、高齢者ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症を伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病で発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫（鼻型）、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、不特定未分化大細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型、またはリンパ球非減少型）、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫－ＤＬＢＣＬ、Ｂ細胞リンパ腫－ＤＬＢＣＬ－胚中心様、Ｂ細胞リンパ腫－ＤＬＢＣＬ活性化Ｂ細胞様、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、不特定未分化大細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型、またはリンパ球非減少型）、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、その他のリンパ腫、ならびにそのようなリンパ腫の組み合わせが挙げられる。

一例では、治療を必要とする対象において液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含み、液体がんは、白血病を含む。場合によっては、白血病は、前白血病を含む。前白血病として、例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられる。場合によっては、白血病は、急性白血病である。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。急性白血病には、例えば、急性リンパ性白血病または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）も含まれ、ＡＬＬには、Ｂ系統ＡＬＬ、Ｔ系統ＡＬＬ、およびＴ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）が含まれる。本明細書に記載の方法で治療される他の白血病としては、これらに限定されないが、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＩＶＩＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、骨髄性白血病、バーキット白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、アグレッシブナチュラルキラー（ＮＫ）細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、他の白血病、およびそのような白血病の組み合わせが挙げられる。

一例では、治療を必要とする対象において液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含み、液体がんは、骨髄腫を含む。本明細書に記載の方法を使用して治療される骨髄腫としては、これらに限定されないが、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞骨髄腫、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、他の骨髄腫、およびそのような骨髄腫の組み合わせが挙げられる。

一例では、治療を必要とする対象において液体がんを治療する方法が本明細書に提供され、必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含み、液体がんは、カーラー病、骨髄腫症、形質細胞腫、骨の弧立性形質細胞腫、髄外形質細胞腫菌状息肉症／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、好酸球増加症、慢性好酸球増加症、および他の造血細胞関連がんを含む。

一実施形態では、対象は、少なくとも０．１×１０^５個の細胞、少なくとも０．５×１０^５個の細胞、少なくとも１×１０^５個の細胞、少なくとも５×１０^５個の細胞、少なくとも１×１０^６個の細胞、少なくとも０．５×１０^７個の細胞、少なくとも１×１０^７個の細胞、少なくとも０．５×１０^８個の細胞、少なくとも１×１０^８個の細胞、少なくとも０．５×１０^９個の細胞、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも３×１０^９個の細胞、少なくとも４×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、または少なくとも１×１０^１０個の細胞が投与される。特定の実施形態では、約１×１０^７個の細胞～約１×１０^９個の細胞、約２×１０^７個の細胞～約０．９×１０^９個の細胞、約３×１０^７個の細胞～約０．８×１０^９個の細胞、約４×１０^７個の細胞～約０．７×１０^９個の細胞、約５×１０^７個の細胞～約０．６×１０^９個の細胞、または約５×１０^７個の細胞～約０．５×１０^９個の細胞が対象に投与される。

一実施形態では、対象は、少なくとも０．１×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^７細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^７細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０^８細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^８細胞／ｋｇ体重、または少なくとも１×１０^９細胞／ｋｇ体重が投与される。特定の実施形態では、約１×１０^６細胞／ｋｇ体重～約１×１０^８細胞／ｋｇ体重、約２×１０^６Ｔ細胞／ｋｇ体重～約０．９×１０^８細胞／ｋｇ体重、約３×１０^６細胞／ｋｇ体重～約０．８×１０^８細胞／ｋｇ体重、約４×１０^６細胞／ｋｇ体重～約０．７×１０^８細胞／ｋｇ体重、約５×１０^６細胞／ｋｇ体重～約０．６×１０^８細胞／ｋｇ体重、または約５×１０^６細胞／ｋｇ体重～約０．５×１０^８細胞／ｋｇ体重が対象に投与される。

特定の実施形態で企図される薬学的組成物の複数回投与が、所望の療法に影響を及ぼすために必要とされ得ることを、当業者は理解するであろう。例えば、組成物は、対象に、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上の期間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回、またはそれ以上投与され得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、対象に、有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得、本方法は、免疫応答を増加または減少させる。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１日当たり１用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１日当たり２用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１日当たり３用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１週間当たり１用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１週間当たり２用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１週間当たり３用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１ヶ月当たり１用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１ヶ月当たり２用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。かかる方法のいずれかにおいて、本方法は、１ヶ月当たり３用量以上の有効量の修飾免疫細胞を投与することを含み得る。

特定の実施形態では、活性化された薬学的組成物を対象に投与し、次いで、再採血し（または、アフェレーシスを実施し）、そこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化および増殖されたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、もしくは４００ｃｃ、またはそれ以上の採血から活性化される。

本明細書で企図される薬学的組成物の投与は、これらに限定されないが、注入、輸液、または非経口を含む従来の技術を使用して実施され得る。一部の実施形態では、非経口投与は、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、および胸骨内に注入または注射を含む。

個々の対象における奏効（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、完全奏効、部分奏効、安定した疾患、および進行性疾患として特徴付けることができる。一部の実施形態では、奏効は、完全奏効（ＣＲ）である。完全奏効は、すべての循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の消失（すなわち、任意の病理学的リンパ節（標的または非標的を問わない）は、短軸が１０ｍｍ未満に減少しなければならない）として定義することができる。一部の実施例では（例えば、ＡＭＬ）、完全奏効は、以下として定義することができる：骨髄芽球＜５％、アウエル小体を含む芽球の不在、髄外疾患の不在、絶対好中球数＞１．０×１０^９／Ｌ（１０００／μＬ）、血小板数＞１００×１０^９／Ｌ（１０００００／μＬ）、および赤血球輸血非依存性。特定の実施形態では、奏効は、不完全回復（ＣＲｉ）を有するＣＲである。一部の例では（例えば、ＡＭＬ）、不完全回復を有するＣＲは、残存好中球減少症（＜１．０×１０^９／Ｌ［１０００／μＬ］）または血小板減少症（＜１００×１０^９／Ｌ［１０００００／μＬ］）を除くすべてのＣＲ基準を含むように定義することができる。特定の実施形態では、奏効は、形態学的な白血病のない状態である。一部の実施例（例えば、ＡＭＬ）では、形態学的な白血病のない状態は、骨髄芽球＜５％、アウエル小体を含む芽球の不在、髄外疾患の不在、および血液学的な回復の不要を含むように定義することができる。特定の実施形態では、奏効は、部分奏効（ＰＲ）である。部分奏効は、ベースラインの径和（ｓｕｍｄｉａｍｅｔｅｒ）を基準として、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の径和の少なくとも３０％の減少を意味するように定義することができる。一部の実施例（例えば、ＡＭＬ）では、部分奏効は、ＣＲのすべての血液学的基準：５％～２５％への骨髄芽球の割合の減少、および少なくとも５０％の処置前の骨髄芽球の割合の減少を含むように定義され得る。特定の実施形態では、奏効は、形態学的な白血病のない状態である。一部の実施例（例えば、ＡＭＬ）では、形態学的な白血病のない状態は、骨髄芽球＜５％、アウエル小体を含む芽球の不在、髄外疾患の不在、および血液学的な回復の不要を含むように定義することができる。特定の実施形態では、奏効は、再発である。

一部の実施例（例えば、ＡＭＬ）では、再発は、骨髄芽球＜５％、アウエル小体を含む芽球の不在、髄外疾患の不在、および血液学的回復の不要を含むように定義することができる。一部の実施形態では、奏効は、進行性疾患（ＰＤ）である。進行性疾患は、試験での最小の数（これには、ベースラインの数が最小である場合が含まれる）と、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも１００、またはそれ以上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の絶対的な増加とを基準として、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の数の少なくとも２０％の増加として定義することができる。

１つ以上の新しい病変の出現も、進行とみなすことができる。一部の実施形態では、疾患は、安定した疾患（ＳＤ）であり得る。安定した疾患は、試験での最小の数のＣＴＣおよび／またはＭＮＢＣを基準として、ＰＲに適格な液体がん細胞数の十分な減少も、ＰＤに適格な十分な増加も特徴付けることができない。特定の実施形態では、奏効は、病理学的な完全奏効である。病理学的な完全奏効は、例えば、手術または生検時に取り出された組織の検査後に病理学者によって決定されるように、概して、外科標本中の侵襲性および／または非侵襲性液体がん細胞の組織学的証拠の不在を指す。

一部の実施形態では、薬学的組成物は、週に２回または３回投与される。別の実施形態では、薬学的組成物は、週に２回投与される。別の実施形態では、薬学的組成物は、２週間または３週間に１回投与される。別の実施形態では、薬学的組成物は、１週間または２週間に１回投与される。別の実施形態では、薬学的組成物は、２１日サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目に投与される。別の実施形態では、薬学的組成物は、２８日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に投与される。

一部の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約０．５～３０ｍｇである。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約０．５～２０ｍｇである。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約０．５～１０ｍｇである。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約０．０４ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．１６ｍｇ、約０．３２ｍｇ、約０．６４ｍｇ、約１．２５ｍｇ、約１．２８ｍｇ、約１．９２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３．５６ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約５．０ｍｇ、約７．１２ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１４．２４ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、または約３０ｍｇである。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約１．９２ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５．０ｍｇ、または約３０．０ｍｇであり、化合物は、週に２回投与される。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約１．２８ｍｇ、約２．５６ｍｇ、約５．０ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、化合物は、週に２回投与される。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約１．９２ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５．０ｍｇ、または約３０．０ｍｇであり、化合物は、週に１回投与される。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約１．２８ｍｇ、約２．５６ｍｇ、約５．０ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、化合物は、週に１回投与される。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約１．９２ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１５．０ｍｇ、または約３０．０ｍｇであり、化合物は、１日に１回、７日間に３回、５回、または７回投与される。別の実施形態では、化合物は、１日に１回、７日間の期間に７回静脈内投与される。別の実施形態では、投与される化合物の量は、ヒト対象の体重１キログラム当たり約１．２８ｍｇ、約２．５６ｍｇ、約５．０ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、化合物は、１日に１回、７日間に３回、５回、または７回投与される。別の実施形態では、化合物は、１日に１回、７日間の期間に７回静脈内投与される。

一部の実施形態では、化合物は、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間の期間にわたって投与される。別の実施形態では、化合物は、０．２５～２時間の期間にわたって投与される。別の実施形態では、化合物は、１時間の期間にわたって徐々に投与される。別の実施形態では、化合物は、２時間の期間にわたって徐々に投与される。

一部の実施形態では、化合物のインビボ循環半減期は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、または１２時間である。別の実施形態では、化合物のインビボ循環半減期は、約４時間である。別の実施形態では、化合物のインビボ循環半減期は、約６時間である。一部の実施形態では、化合物の生体組織半減期は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、または１２時間である。別の実施形態では、化合物の生体組織半減期は、約１０時間である。

一部の実施形態では、治療は、治療開始後１ヶ月の期間内に、液体がん細胞の数の約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後１ヶ月の期間内に、液体がん細胞の数の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後１年の期間内に、液体がん細胞の数の約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後１年の期間内に、液体がん細胞の数の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後６ヶ月の期間内に、液体がん細胞の数の約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後６ヶ月の期間内に、液体がん細胞の数の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後３ヶ月の期間内に、液体がん細胞の数の約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％の減少をもたらす。別の実施形態では、治療は、治療開始後３ヶ月の期間内に、液体がん細胞の数の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の減少をもたらす。

一部の実施形態では、治療は、ヒト対象が化合物で治療されなかった場合、ヒト対象の予想される生存時間と比較して、ヒト対象の生存時間の増加をもたらす。別の実施形態では、ヒト対象の生存時間の増加は、少なくとも３０日である。別の実施形態では、ヒト対象の生存時間の増加は、少なくとも３ヶ月である。別の実施形態では、ヒト対象の生存時間の増加は、少なくとも６ヶ月である。別の実施形態では、ヒト対象の生存時間の増加は、少なくとも１年である。

一部の実施形態では、ヒト対象は、液体がんの１つ以上の他の治療に対して、難治性および／または不耐性である。別の実施形態では、ヒト対象は、液体がんの少なくとも１つの以前の治療および／または療法に失敗したことがある。
一部の実施形態では、記載の方法で治療されるヒト対象は、子供（例えば、０～１８歳）である。他の実施形態では、記載される方法で治療されるヒト対象は、成人（例えば、１８歳以上）である。

キット
本発明は、対象における腫瘍の治療のためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、固形腫瘍の治療のためのものである。他の実施形態では、キットは、液体腫瘍の治療のためのものである。一部の実施形態では、キットは、血液がんの治療のためのものである。一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞がんである。一部の実施形態では、血液がんは、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である。一部の実施形態では、血液がんは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、末梢性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫ＡＬＫ＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０＋リンパ増殖性障害、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、および腸症関連Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択される腫瘍の治療のためのものである。一部の実施形態では、キットは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）の治療のためのものである。一部の実施形態では、キットは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のためのものである。一部の実施形態では、キットは、ヒト対象の治療のためのものである。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に提供されるキメラ抗原受容体のいずれかを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に提供されるキメラ抗原受容体のいずれかをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に提供される修飾免疫細胞のいずれかを含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＤ３ＣＡＲ、ＣＤ５ＣＡＲ、ＣＤ７ＣＡＲ、ＣＤ３３ＣＡＲおよび／またはＣＤ１２３ＣＡＲを発現する修飾免疫細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞のうちのいずれかは、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、および／もしくはＰＤ１、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上における変異をさらに含む。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に提供される修飾免疫細胞のいずれかの集団を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に提供される薬学的組成物のいずれかを含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＤ１２３修飾免疫細胞の集団、またはＣＤ１２３修飾免疫細胞もしくは修飾免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＤ５修飾免疫細胞の集団、またはＣＤ５修飾免疫細胞もしくは修飾免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＤ７修飾免疫細胞の集団、またはＣＤ７修飾免疫細胞もしくは修飾免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＤ３３修飾免疫細胞の集団、またはＣＤ３３修飾免疫細胞もしくは修飾免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＤ３修飾免疫細胞の集団、またはＣＤ３修飾免疫細胞もしくは修飾免疫細胞の集団を含む薬学的組成物を含む。

一部の実施形態では、キットは、塩基エディターポリペプチドまたは塩基エディターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、塩基エディターポリペプチドは、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とデアミナーゼとを含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２である。一部の実施形態では、塩基エディターをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。

本発明は、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディター、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含むキットを提供し、各ガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＣＢＬＢ、および／またはＣＴＬＡ４をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターの発現を駆動する異種プロモーターを含む。

本開示の一部の態様は、核酸構築物を含むキットを提供し、核酸塩基エディターとガイドＲＮＡとをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、核酸塩基エディターの発現を駆動する異種プロモーターを含む。一部の実施形態では、本開示は、核酸構築物を含むキットを提供し、（ａ）本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ドメイン（ａ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターと、を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、シチジンデアミナーゼに融合される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、アデノシンデアミナーゼに融合される。

一部の実施形態では、キットは、シチジンデアミナーゼ核酸塩基エディターとガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、キットは、アデノシンデアミナーゼ核酸塩基エディターとガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、キットは、１つ以上のガイド核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、１つ以上のガイド核酸配列は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３を標的とする。一部の実施形態では、１つ以上のガイド核酸配列は、各々、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、および／またはＰＤ１のうちの１つを標的とする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＤ５をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターとＣＤ５ガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＤ７をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターとＣＤ７ガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＤ３３をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターとＣＤ３３ガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＤ３をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターとＣＤ３ガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＤ１２３をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキットは、シチジンデアミナーゼ核酸塩基エディターとＣＤ１２３ガイドＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の追加のガイドＲＮＡをさらに含んでもよく、各ガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＰＤ１、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／またはＣＤ５２をコードする遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％相補的な核酸配列を有する。

腫瘍治療キットは、腫瘍の治療において修飾免疫細胞を使用するための書面による説明書をさらに含んでもよい。他の実施形態では、説明書は、注意事項、警告、臨床試験、および／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。説明書は、（存在する場合）容器に直接印刷されてもよく、あるいは容器に適用されるラベルとして、または容器内にもしくは容器とともに、供給される別個のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダとして印刷されてもよい。さらなる実施形態では、キットは、好適な操作パラメータのためのラベルまたは別個のインサート（添付文書）の形態の説明書を含むことができる。さらに別の実施形態では、キットは、適切な陽性対照および陰性対照または対照試料を有する１つ以上の容器を含み、検出、較正、または正規化のための標準として使用され得る。キットは、（滅菌）リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。これには、商業および使用者の観点から望ましい他の材料がさらに含まれ得、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書が挙げられる。

本発明の実践には、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術が用いられ、十分に当業者の範囲内である。かかる技術は、文献、例えば、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）、“ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）、“ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）、“ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）、“ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ”（ＭｉｌｌｅｒａｎｄＣａｌｏｓ，１９８７）、“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）、“ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）、“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、作製および本発明を実施する際に考慮され得る。特定の実施形態のための特に有用な技術は、以下のセクションで論じられる。

以下の実施例は、当業者に、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるのであって、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。

実施例１：免疫細胞で発現された遺伝子におけるスプライス部位の破壊および終止コドンの導入
核酸塩基エディターであるＢＥ４を使用して、免疫細胞で発現された遺伝子のサブセットにおいて、スプライス部位を破壊し、終止コドンを挿入した。プラスミド構築物であるｐＣＭＶ＿ＢＥ４ｍａｘは、ＢＥ４をコードし、シチジンデアミナーゼ活性を有するＡＰＯＢＥＣ－１シチジンデアミナーゼドメインと、Ｄ１０Ａ変異を含みかつニッカーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインと、２つのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）ドメインと、を含む。ＵＧＩは、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージＰＢＳ１に由来する８３アミノ酸残基のタンパク質であり、これは、免疫細胞で発現された特定の遺伝子のスプライス部位を編集するのを強力に遮断する。ＢＥ４は、Ｎ末端およびＣ末端の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。
＞ｐＣＭＶ＿ＢＥ４ｍａｘ
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免疫細胞におけるタンパク質発現のノックダウンまたはノックアウトにおけるＢＥ４の有効性を確認するために、免疫細胞の第１の集団を、ＢＥ４をコードするｍＲＮＡと、特異的な標的部位に応じて、ＴＲＡＣエキソン２、ＴＲＡＣエキソン４、またはＢ２Ｍエキソン１のドナーもしくはアクセプタースプライス部位のＧ塩基に相補的なＣ塩基を標的とするｓｇＲＮＡと、を共トランスフェクトした。ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって産生した（ＴｒｉＬｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。簡潔には、４μｇのＢＥ４ｍＲＮＡおよび２μｇの合成ｇＲＮＡを、１ＭＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｆｏｒｍ，ＬｏｎｚａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にエレクトロポレーションした。次いで、細胞を３日間培養して、塩基編集に十分な時間を与えた。比較のために、免疫細胞の第２の集団を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、Ｂ２Ｍエキソン１のドナースプライス部位のＧ塩基を標的とするｓｇＲＮＡと、を共トランスフェクトした。ＢＥ４編集とＣａｓ９編集との間に識別可能な差は観察されず、各編集された遺伝子のノックダウンは９０％を超えたが、非電気穿孔対照細胞は、有意なノックダウンを有しなかった（図２）。

細胞を、一本鎖ニックを触媒するＢＥ４をコードするｍＲＮＡ、または二本鎖切断を触媒するＣａｓ９ヌクレアーゼを用いてトランスフェクトした場合、観察される標的化遺伝子のノックダウンを担う遺伝子修飾は異なるであろうと仮定した。この仮説を試験するために、免疫細胞を、ＢＥ４塩基エディターをコードするＲＮＡと、Ｂ２Ｍエキソン１のドナースプライス部位のＧ塩基を標的とするｓｇＲＮＡとの、２μｇのＢＥ４／１μｇのｓｇＲＮＡ（中）または４μｇのＢＥ４／２μｇのｓｇＲＮＡ（高）のいずれかを用いて共トランスフェクトした。３、５、および７日間インキュベーションした後、ＤＮＡを回収および配列決定した。図３を参照すると、塩基編集の大部分は、スプライス部位のみの破壊を明らかにし、予想された様式であった（すなわち、アンチセンス鎖におけるＣからＴへの遷移が組み込まれ、センス鎖におけるＧからＡへの遷移が生じた）。これらの結果は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞から得られた結果とは対照的であり、Ｃａｓ９でトランスフェクトされた細胞における編集のほとんどがインデルであったことを示す（図３）。

スプライス部位の破壊および終止コドンの導入は、標的遺伝子の発現をノックダウンするのに有効であり得る。ＴＲＡＣエキソン４におけるスプライスアクセプター、ならびにＢ２Ｍエキソン１およびＰＤＣＤ１エキソン１におけるスプライスドナーのＢＥ４媒介性編集は、全長タンパク質の発現の低下をもたらした（図４および５）。スプライス部位において観察されたＢＥ４媒介性の変化は、ＣからＴのトランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）であったが、インデルおよびＣからＧのトランスバージョン（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）も観察された。ＰＤＣＤ１遺伝子のエキソン２へのオーカー終止コドンの挿入（エキソン内の連続したシチジン残基が標的化され、チミジン残基に編集されたもの）もまた、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子で見られるものよりも少ない減少ではあるが、遺伝子発現の有意なノックダウンをもたらした（図４）。これらの結果は、免疫細胞で発現された遺伝子のＢＥ４媒介性の単一のまたは連続したシチジン塩基編集が、遺伝子発現の効率的な減少をもたらすことをさらに示唆する。

実施例２：スプライス部位破壊および終止コドン挿入のインシリコ解析
設計されたｇＲＮＡがオフサイト標的に結合するかどうかを決定するために、ｇＲＮＡの核酸配列を、ＣＡＳ－ＯＦＦｉｎｄｅｒを使用して分析した。図６を参照すると、「Ｘ」バルジタイプは、ｇＲＮＡがゲノムＤＮＡと整列し、いかなる相違も不一致であることを示す。不一致の数が１から４に増加するにつれて、オフサイト結合の可能性が増加する。例えば、ＴＲＡＣエキソン４スプライスアクセプターの結果は、３つの不一致がある場合、２６のオフサイト結合の可能性があり、４つの不一致の場合、１６４のオフサイト結合があることを示す。

ｇＲＮＡがバルジを有し、ｇＲＮＡが２０塩基対を有するが、ゲノムＤＮＡと１９塩基対整列する場合、バルジが生じる。再び図６を参照すると、ＴＲＡＣエキソン４スプライスアクセプターｇＲＮＡが１塩基対のバルジを有する場合、不一致が増加するにつれて、オフサイト結合の可能性の数が増加するが、可能性の数は、バルジがない場合（すなわち、バルジサイズがゼロである場合）よりも有意に減少する。

実施例３：免疫細胞における多重塩基編集
ＢＥ４が複数の遺伝子の塩基編集を媒介してマルチノックダウン細胞を生成できるかどうかを判定するために、免疫細胞を、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、またはそれらの組み合わせにおける特定の部位を標的とするｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡで共トランスフェクトした。図７を参照すると、ＢＥ４システムは、フローサイトメトリーによって測定すると、有効なノックダウンを誘発し、単一、二重、および三重の遺伝子編集における減少したタンパク質産生を有する細胞の割合を特定した。細胞を、Ｂ２Ｍ発現およびＣＤ３発現に対してゲーティングし、ＣＤ３発現を、ＴＲＡＣ発現の代わりに機能させた。ＰＤ１染色が非効率であるため、このタンパク質を発現する細胞の直接測定は行わなかった。単一、二重、および三重の遺伝子編集を有する細胞集団間で、差異は観察されず、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１（三重遺伝子編集）の発現をノックダウンするように修飾された免疫細胞は、非修飾対照免疫細胞とは検出可能に異なる（図８）。

図９に、タンパク質発現の低下を担う遺伝子に対する修飾を要約する。具体的には、実施例１に記載の単一遺伝子修飾における発現の低下をもたらす機序と同様に、ＣからＴのトランジションは、修飾Ｂ２Ｍ単一修飾遺伝子細胞集団、ならびにＢ２Ｍ＋ＰＤ１、Ｂ２Ｍ＋ＴＲＡＣ、およびＢ２Ｍ＋ＴＲＡＣ＋ＰＤ１多重修飾遺伝子細胞集団において観察される膨大な数の編集を構成する。インデルおよびトランスバージョンは、編集された遺伝子において観察された遺伝子変化のわずか少数を構成する。

したがって、ベース編集による３つの遺伝子座の同時修飾は、一方向標的化配列決定（ＵＤｉＴａＳ、Ｇｉａｎｎｏｕｋｏｓｅｔａｌ．，ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ．２０１８Ｍａｒ２１；１９（１）：２１２．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８６４－０１８－４５６１－９）によって評価されるように、検出可能な転座事象のない非常に効率的な遺伝子ノックアウトを生み出した。さらに、ＢＥ４で編集された遺伝子では、転座が検出されなかった。ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）戦略（図１０）を用いて、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１ＢＥ４で編集された遺伝子間で、転座を検出した。ＢＥ４またはＣａｓ９を用いて修飾してＢ２Ｍ＋ＴＲＡＣ＋ＰＤ１編集を生成した細胞から抽出したＤＮＡを、ＱＸ２００ドロップレットデジタル機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、次世代配列決定（ＮＧＳ）を用いて分析して、ＢＥ４およびＣａｓ９編集の正確な配列を決定した。図１１の左パネルに示されるように、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１遺伝子は、ほとんどの細胞で修飾された。ｄｄＰＣＲ分析は、転座が、ＢＥ４で編集された細胞には存在しないが、Ｃａｓ９で編集された細胞の約１．７％で観察されたことを示した（図１１、右パネル）。表２１は、転座がＢＥ４編集細胞において観察されなかったことをさらに示す。

実施例４：Ｃｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）のＢＥ４媒介性編集
Ｃｂｌ－ｂは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達タンパク質であり、ＴＣＲ複合体シグナル伝達を負に調節する（図１２）。Ｃｂｌ－ｂシグナル伝達が阻害されると、Ｔ細胞はより低い活性化閾値を有するため、この遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることは、Ｔ細胞またはＣＡＲを発現するＴ細胞の有効性を有意に改善することができる。Ｃｂｌ－ｂ遺伝子がシチジン脱アミノ化媒介性修飾に感受性であったかどうかを判定するために、細胞を、ＢＥ４をコードするｍＲＮＡと、エキソン８および１６のスプライス部位アクセプター、エキソン８、１０、１１、および１２のスプライス部位ドナーを標的とするか、またはエキソン１、４、および８における終止コドンの挿入を促進させるｓｇＲＮＡとを用いて、共トランスフェクトした。得られた細胞をフローサイトメトリーで分析した。

図１３を参照すると、エキソン１２のスプライス部位ドナーおよびエキソン８のスプライス部位アクセプターの破壊は、Ｃｂｌ－ｂ発現の最大の減少（それぞれ６７．２％および５７．４％）をもたらした。エキソン８スプライス部位アクセプターおよびエキソン１２スプライス部位ドナーｓｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞のうち、６０％をわずかに超える細胞が正常に編集された（図１３、棒グラフ）。

実施例５：免疫細胞におけるＣａｓ１２ｂヌクレアーゼの特徴付け
Ｃａｓ１２ｂ／ｃ２ｃ１部位は、二本鎖核酸分子の両方の鎖を特異的に標的化し、切断する。２つの異なるＣａｓ１２ｂ／ｃ２ｃ１タンパク質（ＢｈＣａｓ１２ｂおよびＢｖＣａｓ１２ｂ）を、標的核酸分子内のインデルを媒介する酵素の傾向を決定することによって特徴付けた。Ｃａｓ１２ｂ／ｃ２ｃ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の遺伝子座およびＤＮＭＴ１遺伝子の遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡとともに、Ｔ細胞にエレクトロポレーションした。細胞を３～５日間培養し、続いて、細胞のＤＮＡを単離した。インデルの割合を、次世代配列決定によって決定した。図１４を参照すると、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子において、ＢｈＣａｓ１２ｂタンパク質で処理した細胞から単離されたＤＮＡは、ＢｖＣａｓ１２ｂタンパク質で処理した細胞から単離されたＤＮＡ（約２０％）よりも、はるかに高い割合（約７５％）のインデルを有した。ＤＮＭＴ１遺伝子におけるインデルもまた、ＢｈＣａｓ１２ｂで処理した細胞から単離されたＤＮＡ（約２０％）は、ＢｖＣａｓ１２ｂで処理した細胞から単離されたＤＮＡ（約０％）よりも高い割合で観察された。

ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）タンパク質を使用して、ＴＲＡＣ遺伝子を破壊した。ＧＲＩＮ２Ｂ、ＤＮＭＴ１、およびＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡとともにＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）タンパク質をコードするｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーションを介して、Ｔ細胞を形質導入した。エレクトロポレーションの９６時間後、細胞を、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用して評価し、細胞を（ＴＲＡＣの代わりに）ＣＤ３に対してゲーティングした。図１５を参照すると、ＧＦＰをコードするプラスミドと、またはＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）と、ＧＲＩＮ２ＢもしくはＤＮＭＴ１に特異的なガイドＲＮＡと、を用いて形質導入されたＴ細胞の約９５％は、ＣＤ３＋であった。ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）とＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡとを発現するように形質導入された細胞は、ＣＤ３＋である可能性が低かった（使用されるガイドＲＮＡに応じて約２％～約５０％）。試験した１１個のＴＲＡＣガイドＲＮＡのうちの３個は、約１００％ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）媒介性インデルをもたらした。

実施例６：ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙレンチウイルス発現の特徴付け
細胞を、ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙレンチウイルスを使用してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように形質導入し、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＣＡＲ発現について分析した。細胞を染色せずに、Ｒフィコエリスリン（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートしたＢＣＭＡタンパク質とインキュベートした。ＢＣＭＡは、ＣＡＲの標的とされた抗原であるため、ＣＡＲを発現する細胞は、色素標識ＢＣＭＡに結合する。図１６を参照すると、染色されなかった細胞について、ＦＡＣＳ分析は、形質導入された試料中のｍＣｈｅｒｒｙの存在のみを検出した（ＰＥチャネルへのいくらかのスピルオーバー（ｓｐｉｌｌｏｖｅｒ）を伴う）。ＢＣＭＡ－ＰＥチャネルは、スピルオーバーで見られたシグナルを超えて非常に陽性のシグナルを示し、これらの結果は、ＢＣＭＡ－ＦＩＴＣとインキュベートされた細胞において確認された。色素標識ＢＣＭＡタンパク質の検出結果は、ｍＣｈｅｒｒｙについて見られるものとほぼ同一のＣＡＲ発現を示唆する。図１７を参照すると、ＦＡＣＳ分析を介して、ポリ（１，８－オクタンジオールクエン酸塩）（ＰＯＣ）レンチウイルスベクターで形質導入された細胞において、８５％のＣＡＲ発現が検出された。

実施例７：ＢＥ４は、高い生成物純度を有する効率的で耐久性のある遺伝子ノックアウトを生成する。
ＢＥ４は、マルチノックダウン細胞を生成するために、複数の遺伝子の塩基編集を媒介する。免疫細胞を、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、またはそれらの組み合わせにおける特定の部位を標的とするｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡで共トランスフェクトした。配列決定データによって示されるように、塩基編集は、細胞を修飾するのに効率的であり、少なくとも７日まで持続した（図１８）。高い生成物純度が観察され、ＣからＴのトランジションが、観察された膨大な数の編集を構成した。インデルならびにＣからＧおよびＣからＡのトランスバージョンは、編集された遺伝子において観察された遺伝子変化のわずか少数を構成した。塩基編集はまた、所望の修飾を生成することにおいて、ｓｐＣａｓ９ヌクレアーゼと同様に効率的であった。

ＢＥ４システムは、フローサイトメトリーによって測定すると、効果的なノックダウンを誘発し、表面発現が減少した細胞の割合を特定した（図１９Ａ）。Ｂ２Ｍ発現に対してゲーティングされた細胞は、細胞表面上のＢ２Ｍタンパク質の喪失を示した。フローサイトメトリーによって測定した場合、塩基編集はまた、Ｂ２Ｍタンパク質のノックアウトを生成することにおいて、ｓｐＣａｓ９ヌクレアーゼと同様に効率的であった。

実施例８：直交転座検出アッセイ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙ）は、三重編集Ｔ細胞におけるＢＥ４誘発性再編成を検出することができない
免疫細胞を、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１における特定の部位を標的とするｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡで共トランスフェクトした。Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１標的遺伝子間で望ましくない特定の転座を検出することができる転座検出アッセイを使用して、三重編集Ｔ細胞を評価した（図２０）。注目すべきことに、ＢＥ４で編集された遺伝子のいずれにおいても、これらの特定の転座は検出されなかった（表２２）。対照的に、Ｃａｓ９で処理された細胞は、低いものの、検出可能なレベルの転座を示した。したがって、ＢＥ４塩基エディターを使用したＴ細胞の多重編集は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用した多重編集とは対照的に、転座を生成しなかった。

実施例９：多重化塩基編集は細胞増殖を著しく損なわない
ＢＥ４とｓｐＣａｓ９ｓｇＲＮＡの両方を用いて、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１標的にわたって、広範なガイドのスクリーニングを行った。ガイドを、シングルプレックス試験に基づいて、高い編集効率および増殖について選択した。最終細胞収率は、ＢＥ４およびｓｐＣａｓ９を使用して１、２、および３つの編集間で比較し、エレクトロポレーションのみの対照に対して正規化した。所望の編集を有するＢＥ４編集細胞は、最大３つの編集を行った場合、高い収率を示した（図２１）。対照的に、ｓｐＣａｓ９編集細胞は、多重編集の数を増やした場合、収率の減少を示した。したがって、多重塩基編集細胞は、最大３つの編集が行われた場合でも、高い細胞増殖を維持した。したがって、ＢＥ４は、ｓｐＣａｓ９で処理した試料と比較して、高い細胞増殖を維持しながら、検出可能なゲノム再編成を有しない多重編集Ｔ細胞を生成した。

実施例１０：ＢＥ４は、ｓｐＣａｓ９と同様のオンターゲット編集効率および細胞表現型を有する三重編集Ｔ細胞を生成した
Ｔ細胞を、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１における特定の部位を標的とするｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡで共トランスフェクトした。配列決定データによって示されるように、塩基編集は、３つすべての部位で細胞を修飾するのに効率的であった（図２２）。塩基編集による遺伝子の修飾は、ｓｐＣａｓ９ヌクレアーゼを使用したものと同様であった。フローサイトメトリーはまた、Ｂ２ＭおよびＣＤ３の表面発現の減少を示した（図２３、上部パネル）。エレクトロポレーションのみの対照細胞と比較して、ＢＥ４およびＣａｓ９多重編集細胞は、細胞表面上のＢ２ＭおよびＣＤ３タンパク質の有意な減少を示した（＞９５％のＣＤ３^－／Ｂ２Ｍ^－）。ＰＤ１染色の効率は低いが、エレクトロポレーションのみの対照細胞と比較して、ＢＥ４およびＣａｓ９多重編集細胞において、ＰＤ１の有意な減少（約９０％）が観察された（図２３、下部パネル）。

実施例１１：ＢＥ４編集はＣＡＲ発現または抗原依存性細胞死滅を変化させない
Ｔ細胞を、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＰＤ１における特定の部位を標的とするｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡで共トランスフェクトした。抗ＢＣＭＡＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの組み込みにより、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入した。ＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーによって、レンチウイルスベクターを受容しなかった未処置細胞と比較して、ＢＥ４およびＣａｓ９編集細胞において観察された（図２４）。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＢＣＭＡを発現する細胞の核染色および細胞死を示す核染色の喪失を検出することによって、細胞死について評価した。ＢＥ４およびＣａｓ９編集Ｔ細胞を含む、ベクターで形質導入されＣＡＲを発現する細胞において、抗原依存性の細胞死滅が観察された（図２５）。対照的に、ベクターで形質導入されなかった未処理細胞は、細胞死滅活性を示さなかった。したがって、ＢＥ４で産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ヌクレアーゼのみの対応物と比較して、同等の遺伝子破壊、細胞表現型、および抗原依存性の細胞死滅を示した。

実施例１２：Ｃａｓ１２ｂおよびＢＥ４は、Ｔ細胞における高効率の多重編集のために対にされ得る
ＣＤ３^－Ｂ２Ｍ^－Ｔ細胞を、ＢＥ４のみを使用して、またはＢＥ４およびＣａｓ１２ｂを使用して生成した。ＢＥ４のみを使用して生成されたＴ細胞について、Ｔ細胞を、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣにおける特定の部位を標的とするｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡで共コトランスフェクトした。ＢＥ４およびＣａｓ１２ｂを用いて生成されたＴ細胞について、ＢＥ４塩基エディターをコードするｍＲＮＡと、Ｂ２Ｍにおける特異的部位を標的とするｓｇＲＮＡ、ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）をコードするｍＲＮＡ、およびＴＲＡＣ遺伝子のエキソン４を標的とするＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ遺伝子を破壊するのに使用された）と、を用いて共トランスフェクトした。得られたＴ細胞を、Ｂ２ＭおよびＣＤ３の細胞表面発現を検出するために、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用して評価した。ＢＥ４のみを使用したノックアウトは、ＢＥ４およびＣａｓ１２ｂを使用したノックアウトと同様のプロファイルを示した。特に、高い割合のＴ細胞が、ＣＤ３^－Ｂ２Ｍ^－：８６％（ＢＥ４のみ）および８８％（ＢＥ４＋Ｃａｓ１２ｂ）であり、一方、他の可能な表現型であるＣＤ３^－Ｂ２Ｍ^＋、ＣＤ３^＋Ｂ２Ｍ^＋、およびＣＤ３^＋Ｂ２Ｍ^－Ｔ細胞は、細胞集団では、あまり表されていなかった（図２６）。対照的に、エレクトロポレーションのみの対照は、ＣＤ３^＋Ｂ２Ｍ^＋細胞の割合が高い集団（９７．８％）およびＣＤ３^－Ｂ２Ｍ^－細胞の割合が非常に低い集団を示した。

Ｃａｓ１２ｂを使用して、ＣＤ３^－ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を生成した。Ｔ細胞を、ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｖ４）をコードするｍＲＮＡ、ＴＲＡＣ遺伝子のエキソン４を標的とするＣａｓ１２ｂｓｇＲＮＡ、および抗ＢＣＭＡＣＡＲをコードする二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ドナー鋳型で共トランスフェクトした。Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＢＣＭＡ細胞表面発現を検出するために、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を使用して評価した。ｓｇＲＮＡの存在下でＣａｓ１２ｂの量を増やして細胞に導入した場合、細胞集団のＣＤ３^－象限へのシフトから分かるように、ＣＤ３の発現が減少した（図２７）。同じ条件下で、ドナー鋳型の量を増やして細胞に導入した場合、細胞集団のＣＤ３^－ＣＡＲ^＋象限へのシフトが観察された。

したがって、Ｃａｓ１２ｂをＢＥ４と対にして多重編集Ｔ細胞を生成し、複数の二本鎖切断によって引き起こされるゲノム再編成を最小化することができる。

実施例１３：動物モデルにおけるインビボ有効性
本明細書に記載の化合物の抗発がん性活性をインビボで決定するために、化合物は、例えば、単独で（ＩＰ、ＩＶ、ＰＯ、吸入または経鼻経路による）投与されるか、または関連する化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）の最適以下の用量と組み合わせて投与される。一実施例では、ルシフェラーゼを安定的に発現する５×１０^６個のＲＳ４；１１細胞（急性リンパ芽球性白血病を有する対象の骨髄から樹立された細胞）を、全身照射を受けて３時間後のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに、尾静脈を介して注入する。未処置のままであれば、このタイプの白血病は、このモデルでは、３週間で致命的である。白血病は、例えば、マウスにＤ－ルシフェリン（６０ｍｇ／ｋｇ）を注入し、麻酔された動物（例えば、ＸｅｎｏｇｅｎＩｎＶｉｖｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ、ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を撮像することによって容易に監視される。全身生物発光は、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＳｏｆｔｗａｒｅ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）によるフォトニックフラックス（光子／秒）の積分によって定量される。本明細書に記載の化合物は、単独でまたは最適以下の用量の関連する化学療法剤と組み合わせて、例えば、白血病マウスに、尾静脈またはＩＰ経路によって、０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で７～２１日間投与される（注射後１０日間／実験１日目、生物発光範囲１４～１６）。任意選択的に、マウスは、実験全体を通して隔日で撮像され、生存率は、実験期間中、毎日監視される。息を引き取ったマウスは、任意選択的に、実験の終了時に剖検を受ける。別の動物モデルは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの、ルシフェラーゼを安定的に発現するヒト濾胞性リンパ腫に由来する細胞株ＤｏＨＨ２の移植である。これらのインビボ試験は、任意選択的に、予備的な薬物動態、薬力学、および毒性データを生成する。

実施例１４：臨床試験
本明細書に記載の化合物がヒトの治療に適しているかどうかを決定するために、臨床試験を実施する。例えば、液体がんと診断され、治療を必要とする対象は、治療群および１つ以上の対照群において選択および分離され得、治療群は、本明細書に記載の化合物が投与され、対照群は、プラセボまたは既知の抗がん剤が投与される。したがって、本明細書に記載の化合物の治療安全性および治療有効性は、生存および生活の質などの要因に関して、対象群の比較を行うことによって評価することができる。この実施例では、本明細書に記載の化合物で治療された対象群は、プラセボで治療された対象対照群と比較して、改善された長期生存を示すことができる。

試験設計
この試験は、用量漸増２群比較試験を含み、ＷＴｐ５３タンパク質を発現する液体リンパ腫（例えば、白血病、骨髄腫、または液体リンパ腫）を有する対象において、２８日サイクルまたは２１日サイクルの２つの異なる投薬レジメンを使用して、ＩＶ注入によって投与される化合物の安全性、耐容性、ＰＫ、ＰＤ、および液体がんに対する細胞効果を評価するように設計された。例えば、本明細書に記載の化合物は、再発性／難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および／または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を有する対象において使用され得る。対象は、２８日サイクルでは３週間連続で週１回、または２１日サイクルでは２週間連続で週２回のいずれかで、本明細書に記載の化合物を受ける。液体リンパ腫を有する多くの対象は、末梢血中に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を有し、フローサイトメトリーを使用して、これを検出および分析することができる。したがって、これらの細胞における治験薬特異的標的結合の検出が可能である。

この試験は、用量漸増期（ＤＥＰ）および拡張期（ＥＸＰ）からなる。ＤＥＰは、本明細書に記載の化合物のＭＴＤまたはＯＢＤを確立するための「３＋３」用量漸増設計である。ＥＸＰは、用量レベルの臨床安全性プロファイルおよび潜在的有効性をさらに調査するために、ＭＴＤまたはＯＢＤで特定の液体がんを有する最大２つの異なる対象群を登録する。ＥＸＰの対象の選択は、ＤＥＰの結果ならびに追加の非臨床薬理試験からのデータに基づいて確定される。後者は、本明細書に記載の化合物に対する細胞株感受性の比較を促進する複数の液体がん細胞株（例えば、白血病、液体リンパ腫、骨髄腫など）の液体がん種間および液体がん種内での調査を含む。

本試験の用量漸増期および用量拡張期における対象の処置は、疾患の進行、許容できない毒性、または対象もしくは医師による療法の中止の決定の文書化まで続く。

ＭＴＤまたはＯＢＤを確立した後、追加の対象を最大２つの別個の拡大コホート（１拡大コホート当たり約３０人の対象）に登録して、この用量レベル、および特に、対象または液体がん細胞型でのさらなる経験を積むことができる。対象または液体がん細胞型の選択は、部分的には、試験の用量漸増部分で行われた観察に基づいて決定される。

安全性は、有害事象（ＡＥ）の発生率、重症度、期間、因果関係、重篤度、および種類、ならびに対象の身体検査、バイタルサイン、および臨床検査結果の変化に基づいて評価される。治験担当医師は、ＮＣＩＣＴＣＡＥバージョン４．０を使用して、有害事象の重症度を評価する。

この試験の主な目的は安全性およびＰＫに基づいているため、統計解析は本質的に記述的であり、試験されたすべての用量およびすべての観察された奏効を説明するもので、ＩＷＧ（２０１４）基準に基づいて、完全奏効（ＣＲ）もしくは部分奏効（ＰＲ）を達成した対象、または安定した疾患（ＳＤ）を維持した対象が含まれる。本明細書に記載の化合物の少なくとも１つの用量を受ける対象は、安全性集団を構成し、すべての安全性解析に含まれる。本明細書に記載の化合物の少なくとも１つのサイクルを完了し、処置後の客観的疾患評価を受ける対象は、有効性が評価可能な対象集団を構成する。

実施例１５：遺伝子を特定およびサイレンシングするための例示的な方法
本実施例では、ＣＡＲ－Ｔの標的の遺伝子をサイレンシングする方法を提供する。図２８Ａの図は、標的化される遺伝子およびそれに関する考慮事項を提供する。標的として、例えば、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＳ－１、ＴＲＡＣ、ＣＡＲ、ＦＡＳ、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、β２Ｍ、ＣＤ５２、およびＴＣＲのうちの１つ以上が挙げられる。

塩基エディターでサイレンシングするには、２つの戦略がある。第１の戦略は、標的タンパク質を評価し、次いで、グルタミン、アルギニン、またはトリプトファンのうちの１つ以上を終止コドンに変えて、タンパク質発現をサイレンシングする（図２８Ｂの項目１を参照されたい）。第２の戦略は、ＣＢＥによるスプライス破壊を伴い、タンパク質発現をサイレンシングする（図２８Ｂの項目２を参照されたい）。

実施例１６：複数のＣＡＲ－Ｔ集団を用いて、ＡＭＬまたはＴ－ＡＬＬにおける疾患のクローン性に対処する
白血病は、腫瘍微小環境における選択圧に起因するクローン増殖およびクローン選択の反復プロセスを通して疾患の進化に起因する特定の療法に照らして、耐性または再発性になることが企図される。例として、ＡＭＬがん細胞の異なるクローンは、ＣＤ３３＋ＣＤ１２３－、ＣＤ３３＋ＣＤ１２３＋、またはＣＤ３３－ＣＤ１２３＋などの様々な抗原を示すことができる。ＣＤ３３＋がん細胞を標的とする治療剤は、ＣＤ３３－ＣＤ１２３＋などのこの特定の抗原を欠く細胞に対処しないであろう。したがって、本明細書に記載の複数のＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、疾患のクローン性に対処することが企図される。

例示的な方法では、ＣＤ３３およびＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞が、図２９に示されるように生成される。ＣＤ３３およびＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３＋ＣＤ１２３＋ＡＭＬのマーカーを有するＡＭＬ患者に投与される。ＣＤ３３およびＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３３＋ＣＤ１２３－、ＣＤ３３＋ＣＤ１２３＋、およびＣＤ３３－ＣＤ１２３＋である患者のＡＭＬがん細胞を排除する。

別の例示的な方法では、ＣＤ３およびＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞は、図３０に例示されるように、本明細書に記載の方法によって生成される。ＣＤ３およびＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ７＋Ｔ－ＡＬＬのマーカーを有するＴ－ＡＬＬ患者に投与される。ＣＤ３およびＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ７－、ＣＤ３＋ＣＤ７＋、およびＣＤ３－ＣＤ７＋であるＴ－ＡＬＬがん細胞を排除する。

実施例１７：複数のＣＡＲ－Ｔ集団は、フラトリサイドを排除するように修飾される
従来のＴ細胞療法およびＣＡＲ－Ｔ療法の主な制限は、活性化された細胞が、細胞の製造・貯蔵中に、または患者に注入されたときに、自己死滅またはフラトリサイドを起こし得ることである。フラトリサイドを回避するために、本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞のＣＡＲが特異的である抗原をコードするポリヌクレオチドに変異を含むように修飾される。例として、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞は、フラトリサイドを防止するためにＣＤ７ポリヌクレオチドに変異を含むように修飾される。別の例として、ＣＤ３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、フラトリサイドを防止するために、ＣＤ３ポリヌクレオチドに変異を含むように修飾される。複数のＣＡＲ－Ｔ集団において、クロスフラトリサイドを防止するために、追加の修飾が行われる（すなわち、両方のＣＡＲ－Ｔ集団でのＣＤ３およびＣＤ７ポリヌクレオチドの両方における変異）。さらなる修飾には、免疫抑制、移植片対宿主、宿主対移植片などに関与し得る遺伝子への変異が含まれる。

例示的な方法では、ＡＭＬの治療のためのＣＤ３３およびＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞が、図２９に示されるように生成される。ＣＤ３３およびＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方は、細胞が自身を標的としないように、ＣＤ３３に変異を有するように修飾される。ＰＤ－１、ＣＤ５２、およびＴＲＡＣにおけるさらなる変異は、それぞれ、免疫抑制、宿主対移植片、および移植片対宿主を低減または防止する。

例示的な方法では、Ｔ－ＡＬＬの治療のためのＣＤ３およびＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞が、図３０に示されるように生成される。ＣＤ３およびＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方は、細胞が自身または他の集団を標的としないように、ＣＤ３（ＴＲＡＣ）およびＣＤ７に変異を有するように修飾される。ＰＤ－１、ＣＤ５２、およびＴＲＡＣにおけるさらなる変異は、それぞれ、免疫抑制、宿主対移植片、および移植片対宿主を低減または防止する。

実施例１８：Ｔ－ＡＬＬＣＡＲ－Ｔ細胞の４つの同時塩基編集は、ヌクレアーゼと比較して収率に影響を及ぼさない
ｑｕａｄ－Ｔ－ＡＬＬ編集の文脈での理論的収率は、アッセイで決定され、以下の成分が試験された。対照は、エレクトロポレーションなし（ＥＰなし）、ＥＰのみ、ＣＢＥバリアント１、ＣＢＥバリアント２、およびＣａｓ９である。その結果を図３１Ａに示し、対応する生存率の結果を図３１Ｂに示す。Ｔ－ＡＬＬＣＡＲ－Ｔに対する４つの同時塩基編集が、ヌクレアーゼと比較して、収率に影響を及ぼさないと判断された。

実施例１９：スケールアップしたＬｏｎｚａエレクトロポレーションは、Ｔ－ＡＬＬＣＡＲ－Ｔ細胞プログラムのための高効率の多重Ｔ細胞塩基編集を誘導する。
Ｔ細胞は、活性化後、３日間培養した。５×１０^６個の細胞を、エディター用の１０μｇのｍＲＮＡ（ＣＢＥ１、ＣＢＥ２、またはｓｐＣａｓ９）と、Ｔ－ＡＬＬガイド用の５μｇのｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ、ＣＤ５２、ＣＤ７、ＰＤ１）とを用いてエレクトロポレーションした。以下の表２３に、好適なガイドが提供されている。

２’－Ｏ－メチル類似体と３’ホスホロチオエートとのヌクレオチド間結合は、ＲＮＡ残基の最初の３つの５’末端および３’末端で使用され、各末端での化学修飾は、ヌクレオチドの後に「ｓ」で示されている。

ＣＢＥ１は、ラットＡＰＯＢＥＣ－ＢＥ４を指し、ＣＢＥ２は、オランウータン「ＢＥ４」（ｐｐＡＰＯＢＥＣ）を指す。ＥＰなしおよびＥＰのみは、ｚａｐなしまたはエディター／ガイドなしのｚａｐのいずれかを有する対照であった。

理論的収率を以下のように測定した：細胞を、ＡＯ／ＤＡＰＩ染色を使用した生存率測定により、毎日カウントした（生存率の読み出しは、ＥＰ生存率の読み出し後数時間のカウント－ＡＭＬ図でも実施された）。細胞を毎日０．５×１０^６細胞／ｍＬに分割し戻した（ｓｐｌｉｔｂａｃｋ）（理論的に、分割により事実上すべての細胞増が増殖しないため）。次いで、培養物がバックスプリット（ｂａｃｋｓｐｌｉｔ）されていなかった場合の理論的収率を決定するために、計算を行った。遺伝子修飾の割合を決定した（図３２）。

細胞をＮＧＳを介して取得し、理論的な細胞収率を決定した（図３３）。

モデル腫瘍細胞における蛍光マーカーの喪失によって実証された細胞死滅（図３４）。

試験したすべてのＣＡＲは、重鎖から軽鎖配向（Ｈ２Ｌ）または軽鎖から重鎖配向（Ｌ２Ｈ）のいずれか、続いて、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、およびＣＤ２８ｚシグナル伝達ドメインの結合剤クローンを含む。

実施例２０：例示的なＣＡＲ－Ｔ細胞プロセスフローおよび契約製造
健常なドナー由来の凍結アフェレーシスロイコパックを入手し、製造元の説明書に従って、Ｐａｓｍａｔｈｅｒｍを使用して解凍する。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、例えば、製造元の説明書に従って、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰｒｏｄｉｇｙを使用して単離する。Ｔ細胞を、次いで、製造元の説明書に従って、ＴｒａｎｓＡｃｔを使用して活性化する。ｍＲＮＡ／ＲＮＰ塩基エディターのエレクトロポレーション送達は、製造元の説明書に従って、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ５２、および／またはＰＤ１をノックアウトするためのＬｏｎｚａ４ＤＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒを使用して生じる。ＴＣＲα／βの枯渇は、当該技術分野で認められた技術を使用して実施される。Ｔ細胞を増殖させ、３ＣＡＲおよび７ＣＡＲのレンチウイルス形質導入を行う。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、制御速度フリーザー（ＣＲＦ）で凍結保存する。

実施例２１：ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＴ－ＡＬＬの治療
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）は、骨髄の侵襲性悪性腫瘍である。ＡＬＬ症例の約１２～１５％が小児で診断されている。再発後の５年生存率は、２５％未満である。標準的なケアは、化学療法を使用して第２の寛解を誘導し、続いて、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏＨＳＣＴ）を誘導することである。しかしながら、多くの患者は、化学療法に抵抗性であるか、または高い腫瘍負荷を有し、ａｌｌｏＨＳＣＴの架け橋として完全寛解（ｄｅｅｐｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）を誘導することができない。さらに、重度に前治療された患者は、多くの場合、自己ＣＡＲ－Ｔ治療の候補ではない。したがって、Ｔ－ＡＬＬの治療のための代替治療オプションが必要である。

ａｌｌｏＨＳＣＴでの治療を橋渡しするために、編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞が患者において完全寛解を誘導できるかどうかを調べるために、多重編集を使用して、フラトリサイド耐性のＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。図３５に示されるように、ＣＤ３^－ＣＤ７^＋またはＣＤ３^＋ＣＤ７^＋Ｔ－ＡＬＬ腫瘍細胞を標的として、ＣＤ７キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を編集して、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＣＤ５２、およびＰＤ－１の発現を低減または排除した。図３６に示されるように、リンパ枯渇は、約２０～３０人のＴ－ＡＬＬ患者において、Ｃｙ／Ｆｌｕ／Ｃａｍｐａｔｈを用いて、－７日目に実施した。０日目に、患者に、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した。次いで、６５日目に、患者は、Ｃｙ／Ｆｌｕ／ＴＢＩ／ＡＴＧで事前調整された。７０日目に、患者は、ａｌｌｏＨＳＣＴによる処置を受けた。ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞による処置は、Ｔ細胞形成不全を誘導し、Ｔ－ＡＬＬ患者をブリッジ治療なしでａｌｌｏＨＳＣＴで治療することが可能になると予想される。

実施例２２：ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生
図３７Ａに示されるように、ＴＡＬＬ０１７ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために、健常なドナーから凍結アフェレーシスを受けた。次いで、アフェレーシスを、Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ（ＢａｒｋｅｙＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）で解凍した。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰｒｏｄｉｇｙ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、解凍されたアフェレーシスから単離した。２日目に、ｍＲＮＡ塩基エディターおよびガイドＲＮＡを、ＬｏｎｚａＳＤＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して、エレクトロポレーションによりＴ細胞に送達した。塩基編集後、ＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、レンチウイルス形質導入を介してＴ細胞に送達した（７ＣＡＲ８）。次いで、Ｔ細胞を、２～８日目の培養で増殖させた。次いで、増殖後、回収したＣＡＲ－Ｔ細胞（＞１Ｂ）を凍結保存した。解凍時、ＴＡＬＬ０１７プロセスで、異種細胞集団を産生した。

未形質導入（ＵＴＤ）および形質導入ＴＡＬＬ０１７細胞を、解凍後２４時間と比較した。ＣＡＲ活性化は、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ２＋およびＣＤ４＋細胞に対して細胞をゲーティングすることによって、検証した（図３７Ｃ）。図３７Ｃに示されるように、抗ＣＤ７ＣＡＲによって誘導された中間プロセスフラトリサイドは、ＴＡＬＬ０１７凍結保存時に依然として活性化された７ＣＡＲ－Ｔをもたらした。凍結保存された７ＣＡＲ－Ｔは、中間活性化が不十分に解凍された。

図３７Ｂに示されるように、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために、健常なドナーから凍結アフェレーシスを受けた。次いで、アフェレーシスを、Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ（ＢａｒｋｅｙＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）で解凍した。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰｒｏｄｉｇｙ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、解凍されたアフェレーシスから単離した。２日目に、ｍＲＮＡ塩基エディターおよびガイドＲＮＡを、ＬｏｎｚａＳＤＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して、エレクトロポレーションによりＴ細胞に送達した。塩基編集後、ＣＤ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、レンチウイルス形質導入を介してＴ細胞に送達した（７ＣＡＲ８）。次いで、Ｔ細胞を、２～１０日目の培養で増殖させた。増殖後、ＴＣＲα／β＋細胞を枯渇させた。次いで、Ｔ細胞を、１０～１２日目からの培養でさらに増殖させた。次いで、増殖後、回収したＣＡＲ－Ｔ細胞（＞２Ｂ）を１２日目に凍結保存した。解凍時、ＴＡＬＬ０３８プロセスで、均質な単分散細胞集団を産生した。

実施例２３：ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の評価
次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞における編集効率を比較した。図３８に示されるように、両方のタイプのＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ５２、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、およびＰＤ－１の編集は、８０～９９％の効率の範囲であった。対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞を使用した。

ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞において、解凍後２４時間の、ＴＣＲα／β、ＣＤ５２、およびＣＤ７のタンパク質発現を調べた（図３９Ａおよび３９Ｂ）。ＴＡＬＬ０３８細胞は、０．４％未満のＴＣＲα／β＋細胞を実証した。タンパク質発現データは、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方について、凍結前メトリックおよび解凍後ＮＧＳデータと一致した。対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞を使用した。

ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団中の細胞の同一性を評価するために、図４０に示されるゲーティングスキームを使用した。細胞は、以下の順序でゲーティングされた：ＦＳＣ／ＳＳＣ、シングレット、生／死、ＣＤ４５（すべての白血球）、ＣＤ１９－（Ｂ細胞除外）、ＣＤ５６－／ＣＤ１４－（ＮＫ／単球除外）、ＣＤ２＋（Ｔ細胞）、およびＣＤ２＋のうちのＣＤ４：ＣＤ８。図４１に示されるように、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞集団の同一性は、ＣＤ２＋／－細胞とＣＤ５６＋／－細胞との混合物であった。検出可能な単球またはＢ細胞はなかった。

最後に、ＣＡＲの発現を評価した。図４２に示されるように、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞集団の両方が、解凍後４８時間まで、ＣＡＲ＋細胞発現を維持した。対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞を使用した。

また、ＴＡＬＬ０１７およびＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＣＤ２５およびＣＤ６９発現を、解凍後２４時間および４８時間で評価した。図４３に示されるように、解凍後のＣＤ２５発現は、ＴＡＬＬ０１７細胞と比較して、ＴＡＬＬ０３８細胞において低かった。ＣＤ２５は、中期Ｔ細胞活性化のマーカーである。ほとんどのＣＡＲとは異なり、抗ＣＤ７ＣＡＲは、培養中フラトリサイドを誘導し、７ＣＡＲＴをさらに活性化する。活性化された状態でＴＡＬＬ０１７細胞を凍結することは、細胞の健全性（ｈｅａｌｔｈ）に有害であった。ＴＡＬＬ０３８細胞は、ＴＡＬＬ０１７と比較して劇的に低いＣＤ２５発現を有し、これは、凍結に対するより高い耐性を示唆し得る。

実施例２４：ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ特徴付け
ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで特徴付けるために、ビーズベースの力価法を開発した（図４４）。０日目に、ＣＤ７を、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）と結合させ、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入（ＵＴＤ）細胞を解凍した。１日目に、ＣＤ７ビーズを精製し、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を共培養し、プレーティングし、３７℃でインキュベートした。２日目に、上清を回収し、酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）を使用して、読み出しを得た。

このアッセイを使用して、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、およびＩＬ－２放出について評価した。ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ７抗原に応答して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２を放出した（図４５Ａおよび４５Ｂ）。対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞を使用した。

ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロでさらに特徴付けるために、標的腫瘍細胞のＣＡＲ指向性Ｔ細胞死滅を測定するための共培養方法を開発した。図４６は、アッセイの概要を提供する。まず、腫瘍細胞を播種する。次いで、播種した腫瘍細胞に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加する。次いで、細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）スキャニングシステムを使用して分析する。最後に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、読み取りを得る。

播種したＣＣＲＦ－ＣＥＭＧＦＰ＋腫瘍細胞に、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加した。Ｅ：Ｔ比が、４：１のＣＡＲ：ＣＣＲＦ、２：１のＣＡＲ：ＣＣＲＦ、または１：１のＣＡＲ：ＣＣＲＦで、表２４のＴ細胞ロットを試験した。

図４７Ａおよび４７Ｂに示されるように、ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＡＬＬ０１７ＣＡＲＴ細胞と比較して、再付加時にＣＣＲＦの増加を示した。

実施例２５：ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの特徴付け
以前の試験では、ＣＣＲＦモデルがＣＤ７指向性ＣＡＲ－Ｔ療法に対する応答を示したことが示されている（例えば、Ｇｏｍｅｓ－ＳｉｌｖａＤ．，ｅｔａｌ．，ＣＤ７－ｅｄｉｔｅｄＴｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａＣＤ７－ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＡＲｆｏｒｔｈｅｔｈｅｒａｐｙｏｆＴ－ｃｅｌｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０：２８５－２９６を参照されたい）。

ＴＡＬＬ０３８ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビボで特徴付けるために、Ｔ－ＡＬＬのＣＣＲＦモデルにおけるインビボ増殖に対するＴＡＬＬ０３８医薬品の有効性を評価するための試験を開発した。表２５は、治験実施計画書を要約したものである。

１０匹の６～７週齢の雌ＮＳＧマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ：ストック００５５５７）を、ＣＣＲＦ－ＧＦＰ＋細胞（１ｅ５）を静脈内（ＩＶ）に移植した。１１日目に、マウスに、ＩＶを介して２５０μＬの１ｅ７細胞／マウスの総ＴＡＬＬ０３８を移植した。腫瘍負荷を監視するために、注射後２～３週間にわたってＩＶＩＳ撮像測定を３回／週行った。全血を１回／週に２～３週間収集した。３回／週の体重および移植後の臨床観察を行った。

図４８は、ＣＣＲＦ移植後１０日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置の－１日目（平均、ＳＥＭ）における生物発光輝度データを示す。この時点で、マウスは、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置に必要な測定可能な腫瘍負荷を示さなかった。図４９Ａおよび図４９Ｂは、ＣＣＲＦ移植後１９日目／７ＣＡＲ８処置後８日目（平均、ＳＥＭ）における生物発光輝度データを示す。この時点で、用量依存性腫瘍増殖阻害は、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置に応答して観察された。マウスは、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置に応答して減量しなかった。図５０Ａおよび５０Ｂは、ＣＣＲＦ移植後３８日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置後２７日目（平均、ＳＥＭ）における生物発光輝度データを示す。各群の第１のマウスが人道的エンドポイントに到達した日（フラックス＞１ｅ１０）以降、平均および標準誤差はもはやプロットされなかった。この時点で、再発前の各群において、持続的な用量依存性阻害が観察された。図５０Ｂに、対数スケールを使用することによって、１ｅ７個のＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ群における再発を可視化した。図５１Ａ、５１Ｂ、５２Ａ、および５２Ｂに、ＣＣＲＦ移植後３８日目／ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ処置後２７日目の生物発光輝度データを、個々のマウスについて示す。上記の実験に対して、ＵＴＤおよびビヒクルを対照として使用した。

実施例２６：Ｔ－ＡＬＬ処置およびリンパ腫単剤療法のためのＣＤ５標的化ＣＡＲ－Ｔ
以前の研究は、複数のがん抗原を標的とすることによって、改善されたＣＡＲ－Ｔ産物を生成する必要性を認識している（例えば、ＸｉｎｊｉｅＸｕ，ｅｔａｌ．，ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＲｅｌａｐｓｅＡｆｔｅｒＣＤ１９ＣＡＲＴ－ＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＡｃｕｔｅＬｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃＬｅｕｋｅｍｉａａｎｄＩｔｓＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：２６６４，Ｎｏｖ．１２，２０１９、Ｅ．Ｍｅｊｓｔｒｉｋｏｖａ，ｅｔａｌ．，ＣＤ１９－ｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｌａｐｓｅｏｆｐｅｄｉａｔｒｉｃＢ－ｃｅｌｌｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａｆｏｌｌｏｗｉｎｇｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒＪｏｕｒｎａｌ，７：６５９（２０１７）、ＨａｎｒｅｎＤａｉ，ｅｔａｌ．，ＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃＣＡＲ－ＴｃｅｌｌｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｂｏｔｈＣＤ１９ａｎｄＣＤ２２ｆｏｒｔｈｅｒａｐｙｏｆａｄｕｌｔｓｗｉｔｈｒｅｌａｐｓｅｄｏｒｒｅｆｒａｃｔｏｒｙＢｃｅｌｌａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１３：３０（２０２０）、ＲｏｂｂｉｅＧ．ＭａｊｚｎｅｒａｎｄＣｒｙｓｔａｌＬ．Ｍａｃｋａｌｌ，ＴｕｍｏｒＡｎｔｉｇｅｎＥｓｃａｐｅｆｒｏｍＣＡＲＴ－ｃｅｌｌＴｈｅｒａｐｙ．ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．２０１８Ｏｃｔ；８（１０）：１２１９－１２２６を参照されたい）。

ＣＤ５の発現は、これらに限定されないが、Ｔ－ＡＬＬ、ＭＦ／ＳＳ、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＮＯＳ）、Ｔ細胞大顆粒リンパ性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０＋ＬＰＤ、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、およびＴ細胞前リンパ性白血病を含む、Ｔ細胞およびＮＫ細胞悪性腫瘍において特定されている。ＣＤ５とＣＤ７を組み合わせると、Ｔ－ＡＬＬ、ＭＦ／ＳＳ、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＮＯＳ）、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などの特定のがんに対する液体がん療法の可能性が高まる。

Ｔ細胞におけるＣＤ５の発現を低減または排除するために、以下の表２６に提供されるように、４２個のシチジン塩基エディターのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生成した（Ａｇｉｌｅｎｔ）。

ＣＤ５編集は、フローサイトメトリー、次世代配列決定（ＮＧＳ）、ＲＮＡ分析、およびウェスタンブロット分析を使用して、エレクトロポレーションの７２時間後、最小のドナー（ｎ＝３）および最小の抗体クローン（ｎ＝５）に対するガイドをスクリーニングすることによって検証した（図５３）。エレクトロポレーションのみ（ＥＰ）を陰性対照として使用した。ＣＤ５ガイドＲＮＡを用いたシチジン塩基エディターの使用は、Ｔ細胞におけるＣＤ５発現を効率的に低減または排除した。

２つの候補ガイドであるｓｇＲＮＡ１０３（スプライス破壊）およびｓｇＲＮＡ１０４（終止コドン）を選択し、ＢＥ４と組み合わせた場合の、ＮＧＳを介した塩基編集効率についてさらに試験した。ｓｇＲＮＡ１０３およびｓｇＲＮＡ１０４の両方とも、約８５％の編集効率を示した。以下の表２７は、ｓｇＲＮＡ１０３およびｓｇＲＮＡ１０４を使用して行われたインシリコＯＴ分析の結果を提供する。

実施例２７：ＣＤ５標的化ＣＡＲ－Ｔの産生
ＣＤ５標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために、レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を、ＣＤ５ＣＡＲをコードするように操作した（図５５）。患者のＴ細胞を、ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶで形質導入した。ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロでの７～１４日間の増殖を、患者の再注入の前に行った。図５５は、例示的なＣＤ５ＣＡＲ構築物の設計を示す。例示的なＣＤ５ＣＡＲ構築物の設計は、抗ＣＤ５ｓｃＦｖ、ヒンジ／スペーサー、膜貫通ドメイン、シグナル２共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む。ヒンジ／スペーサー領域は、ＣＨ３、ＣＤ８α、またはＣＤ２８を含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８を含み得る。共刺激ドメインは、４１ｂｂまたはＣＤ２８を含み得る。

３０個のＬＶＶが生成された。以下の表２８は、様々なＬＶＶＣＤ５ＣＡＲ構築物を提供する。

ＭＮＤプロモーターまたはＰＧＫプロモーターのいずれかを有する表２７のＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ構築物の各々をスクリーニングして、ｓｇＲＮＡ１０３およびｓｇＲＮＡ１０４のいずれかを使用して、初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲ発現を調べた。対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞を使用した。図５６に示されるように、ＣＤ５ＣＡＲＬＶＶ構築物は、０％～８２％の範囲のＣＡＲ発現を有する結果となった。２４種類の構築物は、１０日間の培養期間の終了時に、Ｔ細胞の表面上で検出可能なＣＡＲ発現を示した。

ヒンジ／スペーサーＣＡＲ構築物配列がＣＡＲ発現に影響を及ぼすかどうかを決定するために、異なるヒンジ／スペーサー配列（太字）を含む表２９のＣＡＲ構築物を、ｓｇＲＮＡ１０３およびｓｇＲＮＡ１０４のいずれかと組み合わせて調べた。対照として、非形質導入（ＵＴＤ）細胞を使用した。図５７に示されるように、ヒンジ／スペーサー配列は、ＣＡＲ発現に影響を及ぼした。

インビトロでＣＤ５ＬＶＶＣＡＲ－Ｔ細胞をさらに特徴付けるために、ライブイメージング死滅アッセイを行った。ＣＤ５ＬＶＶＣＡＲ－Ｔ細胞（ＬＶ６６、ＬＶ６７、ＬＶ６８、およびＬＶ６９）をＣＣＲＦ腫瘍細胞に添加した。図５７Ａ～５７Ｄに示されるように、編集および未編集の構築物は、ＣＤ５＋ＣＣＲＦ細胞に対して細胞傷害性であった。

ＣＤ５ＣＡＲ構築物（ＬＶ６３～ＬＶ６９）を、Ｔ細胞単独またはＣＣＲＦ細胞で、ｓｇＲＮＡ１０３およびｓｇＲＮＡ１０４のいずれかを使用して、ＩＦＮγ産生についてインビトロで評価した（図５９Ａおよび５９Ｂ）。すべてのＣＤ５ＣＡＲ構築物は、ＣＤ５＋ＣＣＲＦ－ＣＥＭ白血病細胞株の存在下でＩＦＮγを放出した。

実施例２８：複数の修飾免疫エフェクター細胞を使用した併用療法
複数の遺伝子修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用により、Ｔ細胞またはＮＫ細胞悪性腫瘍（例えば、液体がん）を有する患者の治療を増強することができるかどうかを調べるために、患者に、それらの免疫表現型に基づいて、１つ以上の修飾ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。患者試料からの免疫細胞を、フローサイトメトリーおよび／または配列解析を使用して、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３の存在または不在について免疫表現型を決定した。ｍＲＮＡ塩基エディターおよびガイドＲＮＡを、エレクトロポレーションによって免疫細胞に送達して、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３のいずれかを、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、およびＰＤ－１のうちの１つ以上と組み合わせて編集して、免疫細胞におけるこれらの遺伝子の発現を低減および／または排除した。塩基編集後、ＣＤ５ＣＡＲ、ＣＤ７ＣＡＲ、ＣＤ３３ＣＡＲ、またはＣＤ１２３ＣＡＲを、レンチウイルス形質導入を介して修飾免疫細胞に送達して、それぞれ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。

ＣＤ５^＋ＣＤ７^－として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ５ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団を用いて処置した。ＣＤ５^－ＣＤ７^＋として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団を用いて処置した。ＣＤ５^＋ＣＤ７^＋として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ５ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団、および／またはＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団を用いて処置した。ＣＤ３３－ＣＤ１２３＋として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団を用いて処置した。ＣＤ３３＋ＣＤ１２３－として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団を用いて処置した。ＣＤ３３＋ＣＤ１２３＋として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団、および／またはＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団を用いて処置した。ＣＤ５＋ＣＤ７＋ＣＤ３３＋ＣＤ１２３＋として免疫表現型が決定された患者を、ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団、ＣＤ５ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団、ＣＤ７ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団、および／またはＣＤ１２３ＣＡＲ－Ｔ細胞またはその集団の任意の組み合わせを用いて治療した。

本開示は以下の実施形態を含む。
実施形態１
組成物であって、２つ以上の免疫細胞を含み、各免疫細胞が、
ａ）ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体であって、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異を含む、異なるキメラ抗原受容体と、
ｂ）ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される免疫原性ポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異と、を含む、組成物。
実施形態２
前記免疫細胞のうちの１つが、ＣＤ５を標的とするキメラ抗原受容体を含み、別の免疫細胞が、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含む、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３
前記組成物が、少なくとも３つの免疫細胞を含み、各々が、異なる抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含み、前記標的とされた抗原が、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７である、実施形態２に記載の組成物。
実施形態４
前記免疫細胞のうちの１つが、ＣＤ７を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、別の免疫細胞が、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現する、実施形態１に記載の組成物。
実施形態５
前記免疫細胞のうちの１つが、ＣＤ３を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、別の免疫細胞が、ＣＤ３３およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現する、実施形態１に記載の組成物。
実施形態６
前記免疫細胞のうちの１つが、ＣＤ３３を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、別の免疫細胞が、ＣＤ１２３を標的とするキメラ抗原受容体を発現する、実施形態１に記載の組成物。
実施形態７
１つの免疫細胞が、２、３、４個、またはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体を発現する、実施形態１～６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８
前記キメラ抗原受容体のうちの１つが、ＣＤ５を標的とし、別のキメラ抗原受容体が、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態７に記載の組成物。
実施形態９
前記キメラ抗原受容体のうちの１つが、ＣＤ７を標的とし、別のキメラ抗原受容体が、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態７に記載の組成物。
実施形態１０
前記キメラ抗原受容体のうちの１つが、ＣＤ３を標的とし、別のキメラ抗原受容体が、ＣＤ３３およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態７に記載の組成物。
実施形態１１
前記キメラ抗原受容体のうちの１つが、ＣＤ３３を標的とし、別のキメラ抗原受容体が、ＣＤ１２３を標的とする、実施形態７に記載の組成物。
実施形態１２
少なくとも３つの免疫細胞を含む組成物であって、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体が、ＣＤ３を標的とし、１つが、ＣＤ５を標的とし、３つ目が、ＣＤ７を標的とし、前記細胞が、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む、組成物。
実施形態１３
少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物であって、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体が、ＣＤ３を標的とし、別の受容体が、ＣＤ７を標的とし、前記細胞が、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む、組成物。
実施形態１４
少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物であって、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体が、ＣＤ５を標的とし、別の受容体が、ＣＤ７を標的とし、前記細胞が、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む、組成物。
実施形態１５
少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物であって、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体が、ＣＤ３を標的とし、別の受容体が、ＣＤ５を標的とし、前記細胞が、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む、組成物。
実施形態１６
少なくとも２つの免疫細胞を含む組成物であって、各々が、異なるキメラ抗原受容体を含み、１つのキメラ抗原受容体が、ＣＤ３３を標的とし、別の受容体が、ＣＤ１２３を標的とし、前記細胞が、標的とされた抗原の発現を低減または排除する変異をさらに含み、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む、組成物。
実施形態１７
前記変異が、遺伝子をサイレンシングするか、または前記遺伝子に終止コドンを導入する、ＣからＴまたはＡからＧの変異である、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１８
前記変異が、未熟終止コドンを導入するか、またはスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を改変する、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１９
前記変異が、デアミナーゼドメインを含む塩基エディターによって生成される、実施形態１８に記載の組成物。
実施形態２０
前記デアミナーゼが、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼである、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１
前記塩基エディターが、ＢＥ４である、実施形態２０に記載の組成物。
実施形態２２
前記変異が、前記変異を欠く対応する対照細胞と比較して、コードされたポリペプチドの発現を約５０％以上低減する、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２３
前記組成物が、免疫細胞の集団を含む、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２４
前記集団の少なくとも５０％が、前記標的とされた抗原および／または前記免疫原性ポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む、実施形態２３に記載の組成物。
実施形態２５
前記免疫細胞が、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）耐性である、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２６
前記免疫細胞が、増加した抗腫瘍活性を有する、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２７
前記免疫細胞が、検出可能な転座を含まない、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２８
前記免疫細胞が、１％未満のインデルを含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２９
前記免疫細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３０
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞またはげっ歯類細胞である、実施形態２９に記載の組成物。
実施形態３１
前記免疫細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、もしくはＮＫ細胞、またはそれらの前駆細胞である、実施形態１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３２
前記前駆細胞が、造血幹細胞である、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態３３
有効量の、実施形態１～３２のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
実施形態３４
核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と、各々異なる抗原を標的とする少なくとも２つのガイドポリヌクレオチドと、を含み、前記抗原が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される、塩基エディターシステム。
実施形態３５
１つのガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ５を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態３４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態３６
前記システムが、３つのガイドポリヌクレオチドを含み、各々が、抗原ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７のうちの１つを標的とする、実施形態３４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態３７
１つのガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ７を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態３４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態３８
１つのガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ３を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ３３およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態３４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態３９
１つのガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ３３を標的とし、別のガイドポリヌクレオチドが、ＣＤ１２３を標的とする、実施形態３４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４０
前記ガイドポリヌクレオチドが、各々、表２６から選択される核酸配列を含む、実施形態３４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４１
前記ガイドポリヌクレオチドが、ＡＧＣＧＡＣＵＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧまたはＣＡＵＡＣＣＡＧＣＵＧＡＧＣＣＧＵＣＣＧから選択される核酸配列を含む、実施形態４０に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４２
前記融合タンパク質が、１つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（ＵＧＩ）および／または１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む、実施形態３４～４１のいずれか一項に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４３
前記ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、もしくはＣａｓ１２ｊ／ＣａｓΦポリペプチド、またはその一部を含む、実施形態３４～４２のいずれか一項に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４４
前記ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ１２ポリペプチドまたはその断片を含む、実施形態４３に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４５
前記ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片を含む、実施形態４３に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４６
前記Ｃａｓ９が、不活性型（ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である、実施形態４５に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４７
前記Ｃａｓ９が、修飾ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、または修飾ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である、実施形態４５に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４８
前記Ｃａｓ９が、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を含む、実施形態４５に記載の塩基エディターシステム。
実施形態４９
前記改変されたＰＡＭが、前記核酸配列５’－ＮＧＣ－３’に対する特異性を有する、実施形態４８に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５０
前記デアミナーゼドメインが、シチジンまたはアデノシンを脱アミノ化することができる、実施形態３４～４９のいずれか一項に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５１
前記デアミナーゼドメインが、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼドメインである、実施形態５０に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５２
前記シチジンデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼである、実施形態５１に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５３
前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡバリアントである、実施形態５１に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５４
前記ＴａｄＡバリアントが、ＴａｄＡ＊８バリアントである、実施形態５１に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５５
前記ＴａｄＡ＊８バリアントが、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である、実施形態５４に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５６
前記ＴａｄＡバリアントが、ＴａｄＡ＊９バリアントである、実施形態５３に記載の塩基エディターシステム。
実施形態５７
実施形態３４～５６のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムを含む、薬学的組成物。
実施形態５８
実施形態３４～５６のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムおよびガイドポリヌクレオチドをコードする、ポリヌクレオチド。
実施形態５９
実施形態５８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
実施形態６０
前記ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態５９に記載のベクター。
実施形態６１
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、実施形態６０に記載のベクター。
実施形態６２
実施形態５８に記載のポリヌクレオチド、または実施形態５９～６１のいずれか一項に記載のベクターを含む、薬学的組成物。
実施形態６３
低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生するための方法であって、ＣＡＲ発現免疫細胞において、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質と、各々異なる抗原をコードするポリヌクレオチドを標的とする２つのガイドポリヌクレオチドと、を含む塩基エディターシステムを発現させることを含み、前記抗原が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択され、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生する、方法。
実施形態６４
前記免疫細胞が、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とするガイドポリヌクレオチドを発現するか、またはそれと接触する、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５
低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ＣＡＲ発現免疫細胞において、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質を含む塩基エディターシステムを発現させることと、
（ｂ）前記ＣＡＲ発現免疫細胞を、各々異なる抗原をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも２つのガイドポリヌクレオチドと接触させることであって、前記抗原が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択され、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞を産生する、接触させることと、を含む、方法。
実施形態６６
前記ＣＡＲ発現免疫細胞を、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを標的とするガイドポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７
前記免疫細胞が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、実施形態６３または６４に記載の方法。
実施形態６８
前記免疫細胞に、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現を低減または排除する変異を導入し、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生することをさらに含む、実施形態６３または６４に記載の方法。
実施形態６９
低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生するための方法であって、
ａ）１つの免疫細胞に、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原の発現を低減または排除する変異を導入し、第２の免疫細胞に、前記抗原のうちの１つにおける異なる変異を導入することと、
ｂ）前記免疫細胞に、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現を低減または排除する変異を導入し、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生することと、を含む、方法。
実施形態７０
前記免疫細胞によって発現された前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を標的とする、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１
前記方法によって産生された免疫細胞が、ＣＤ３、ＣＤ５、および／またはＣＤ７抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、ＣＤ３、ＣＤ５、および／もしくはＣＤ７抗原を発現できないか、または減少したレベルのＣＤ３、ＣＤ５、および／もしくはＣＤ７抗原を発現する、実施形態６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７２
前記方法によって産生された免疫細胞が、ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現できないか、または減少したレベルのＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現する、実施形態６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７３
前記ＣＡＲが、ＣＤ５キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７４
前記ＣＤ５ＣＡＲが、表２８に提示されるＣＤ５ＣＡＲ構築物によってコードされる、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５
低減された免疫原性を有する免疫細胞を産生するための方法であって、
ａ）ＣＤ５の発現を低減または排除する内因性ＣＤ５遺伝子配列または調節エレメントに、変異を導入することと、
ｂ）前記細胞において、表２８に提示されるＣＤ５ＣＡＲ構築物を発現させることと、を含む、方法。
実施形態７６
前記ＣＤ５ＣＡＲ構築物が、以下から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＣＤ５ＣＡＲポリペプチドをコードする、実施形態７４または７５に記載の方法：
ａ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300
301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360
361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 420
421 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ 480
481 LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE 540
541 RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 573;
ｂ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300
301 AGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPR 360
361 RPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK 420
421 RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT 480
481 KDTYDALHMQALPPR 495;
ｃ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPS 300
301 PLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR 360
361 KHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP 420
421 EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA 480
481 LHMQALPPR 489;
ｄ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300
301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360
361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEA 420
421 CRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMR 480
481 PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL 540
541 DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST 600
601 ATKDTYDALHMQALPPR 617; または
ｅ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300
301 AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT 360
361 TQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR 420
421 DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD 480
481 DALHMQALPPRX 494。
実施形態７７
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、対応する対照細胞と比較して、フラトリサイド耐性および／または増加した抗腫瘍活性を示す、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７８
前記方法が、インビボまたはエクスビボで実施される、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態７９
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、検出可能な転座を含まない、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８０
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、１％未満のインデルを含む、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８１
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、５％未満の非標的編集を含む、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８２
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、５％未満のオフターゲット編集を含む、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８３
前記変異が、核酸塩基修飾によって生成される、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８４
前記変異が、エキソン内にある、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８５
前記変異が、タンパク質発現を低減または排除する未熟終止コドンをもたらす、実施形態８３または８４に記載の方法。
実施形態８６
前記変異が、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位にある、実施形態８３または８４に記載の方法。
実施形態８７
１つ以上の変異が、標的ポリヌクレオチドを、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、デアミナーゼ、および１つ以上のガイドポリヌクレオチドを含む融合タンパク質を含む塩基エディターシステムと接触させることによって生成される、実施形態６３～７６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８８
前記デアミナーゼが、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９
前記シチジンデアミナーゼが、ＢＥ４である、実施形態８８に記載の方法。
実施形態９０
前記変異が、前記変異を欠く対応する対照細胞と比較して、コードされたポリペプチドの発現を少なくとも約５０％以上低減する、実施形態８７に記載の方法。
実施形態９１
前記ガイドポリヌクレオチドが、表２６に提供される配列から選択される配列を含む、実施形態８７に記載の方法。
実施形態９２
前記ガイドポリヌクレオチドが、ＡＧＣＧＡＣＵＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧまたはＣＡＵＡＣＣＡＧＣＵＧＡＧＣＣＧＵＣＣＧから選択される核酸配列を含む、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３
前記１つ以上のガイド核酸配列の各々が、前記ｎａｐＤＮＡｂｐを、ＣＤ５、ＦＡＳ、ＬＡＧ－３、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／またはＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子もしくは調節エレメントに標的指向化する、実施形態８７に記載の方法。
実施形態９４
前記塩基エディターおよび１つ以上のガイド核酸配列が、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、カチオン性脂質媒介方法、ウイルス形質導入、またはそれらの組み合わせを介して、前記免疫細胞に導入される、実施形態８７に記載の方法。
実施形態９５
培養中の前記免疫細胞を増殖させて、免疫細胞の集団を生成することをさらに含む、実施形態６３～９４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９６
前記抗原またはポリペプチドの発現が、前記免疫細胞の集団の少なくとも約５０％において低減する、実施形態９５に記載の方法。
実施形態９７
前記修飾免疫細胞の集団からＴＣＲα／β＋細胞を枯渇させることをさらに含む、実施形態９５に記載の方法。
実施形態９８
実施形態６３～９７のいずれか一項に記載の方法によって産生された、低減された免疫原性を有する、ＣＡＲ発現免疫細胞。
実施形態９９
実施形態９８に記載の免疫細胞を含む、薬学的組成物。
実施形態１００
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態９９に記載の薬学的組成物。
実施形態１０１
腫瘍細胞を死滅させる方法であって、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を発現する腫瘍細胞を、２つ以上の免疫細胞と接触させることを含み、各免疫細胞が、前記細胞によって発現された前記抗原のうちの２つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む、方法。
実施形態１０２
前記方法が、インビトロまたはインビボで実施される、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０３
前記腫瘍細胞が、腫瘍に由来する、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０４
対象における腫瘍を治療するための方法であって、前記対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される前記対象の腫瘍細胞によって発現された抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、前記免疫細胞の各々が、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含む、方法。
実施形態１０５
前記腫瘍が、血液がんである、実施形態１０３または１０４に記載の方法。
実施形態１０６
前記腫瘍が、液体がんである、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１０７
前記血液がんが、白血病、骨髄腫、および／またはリンパ腫である、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１０８
前記血液がんが、Ｂ細胞がんである、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９
前記血液がんが、以下のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）、セザリー症候群（ＳＳ）、末梢性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫ＡＬＫ ^＋、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、血管免疫芽球性Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０ ^＋リンパ増殖性障害、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、および腸症関連Ｔ細胞リンパ腫のうちの少なくとも１つから選択される、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１１０
前記血液がんが、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１１
前記血液がんが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１２
選択された対象における腫瘍を治療するための方法であって、前記選択された対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、前記対象の腫瘍細胞によって発現された抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記抗原が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択され、前記免疫細胞が、前記抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、前記免疫細胞の各々が、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異をさらに含み、前記対象が、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を発現する腫瘍を有するものとして選択される、方法。
実施形態１１３
前記血液がんが、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１４
前記血液がんが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１５
異なるキメラ抗原受容体を発現する前記２つ以上の免疫細胞が、順次投与される、実施形態１０１～１１２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１６
異なるキメラ抗原受容体を発現する前記２つ以上の免疫細胞が、同時に投与される、実施形態１０１～１１２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１７
対象における腫瘍細胞の抗原依存性死滅のための方法であって、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原を発現する腫瘍を有する対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、前記抗原のうちの１つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む、方法。
実施形態１１８
対象における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の抗原依存性死滅のための方法であって、ＡＭＬ発現ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を有する対象に、２つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、前記抗原のうちの１つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む、方法。
実施形態１１９
対象におけるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞の抗原依存性死滅のための方法であって、Ｔ－ＡＬＬ発現ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を有する対象に、少なくとも３つの免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、前記抗原のうちの１つを標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含む、方法。
実施形態１２０
選択された対象におけるがんを治療するための方法であって、前記対象に少なくとも２つの免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、ＣＤ３３またはＣＤ１２３抗原を標的とするキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、前記対象が、前記がんをＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現しているものとして特徴付けることによって、選択される、方法。
実施形態１２１
前記ＣＤ３３およびＣＤ１２３抗原を発現しているがんが、ＡＭＬである、実施形態１２０に記載の方法。
実施形態１２２
選択された対象におけるがんを治療するための方法であって、前記対象に、３つ以上の免疫細胞を投与することを含み、各免疫細胞が、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を標的とする異なるキメラ抗原受容体を発現し、前記免疫細胞が、前記標的とされた抗原の発現を低減または排除する１つ以上の変異、ならびにＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの発現を低減または排除する１つ以上の変異を含み、前記対象が、前記がんをＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を発現しているものとして特徴付けることによって、選択される、方法。
実施形態１２３
前記ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ７抗原を発現するがんが、Ｔ－ＡＬＬである、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２４
前記免疫細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態１０１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２５
前記対象が、以前にリンパ枯渇により治療されたことがある、実施形態１０１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２６
前記リンパ枯渇が、シクロホスファミド、フルダラビン、および／またはアレムツズマブ（Ｃｙ／Ｆｌｕ／Ｃａｍｐａｔｈ）の投与を伴う、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７
前記対象が、化学療法に対して不応性であるか、または高い腫瘍負荷を有する、実施形態１０１～１２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２８
前記対象が、その後、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）により治療される、実施形態１０１～１２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２９
前記免疫細胞が、単一のヒトドナーに由来する、実施形態１～３２のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態６３～９７もしくは１０１～１１１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３０
前記免疫細胞が、前記対象に対して自己由来である、実施形態１０１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３１
前記免疫細胞が、前記対象に対して同種である、実施形態１０１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３２
前記対象が、哺乳動物対象である、実施形態１０１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３３
前記対象が、ヒト対象またはげっ歯類対象である、実施形態１０１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３４
前記対象が、小児ヒト対象である、実施形態１０１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３５
前記がんの治療に使用するための、実施形態１～３２のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
実施形態１３６
低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞の生成に使用するための、実施形態３４～５６のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムを含む、キット。
実施形態１３７
前記キットの使用に関する書面による説明書をさらに含む、実施形態１３５または１３６に記載のキット。
他の実施形態
前述の説明から、本明細書に記載の発明に変形および修正を加えて、それを様々な用法および条件に採用することができることは明らかであろう。かかる実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素として、または列挙された要素の組み合わせ（またはサブコンビネーション）として、その変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせて、その実施形態を含む。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。別段の指示がない場合、本明細書に記載されている刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

Claims

低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞またはＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生するためのエクスビボの方法であって、
ａ）免疫細胞または免疫細胞の集団中の標的ポリヌクレオチドを、ガイドポリヌクレオチド、および核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とＴａｄＡ＊８デアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質を含む塩基エディターに、または、ガイドポリヌクレオチドと核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とＴａｄＡ＊８デアミナーゼドメインとを含む塩基エディターシステムに接触させることと、
ｂ）ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、およびＣＤ１２３からなる群から選択される抗原の発現を低減または排除する変異を核酸塩基修飾により導入することと、
ｃ）前記免疫細胞に、ＣＤ３ｅ、ＴＲＡＣ、ＬＡＧ－３、ＦＡＳ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ５２、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現を低減または排除する変異を核酸塩基修飾により導入することと、
ｄ）ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３３、またはＣＤ１２３抗原を標的とするキメラ抗原受容体を前記免疫細胞または免疫細胞の集団において発現させ、それによって、低減された免疫原性を有するＣＡＲ発現免疫細胞またはＣＡＲ発現免疫細胞の集団を産生することと、を含む、方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ５キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の方法。
前記ＣＤ５ＣＡＲが、以下から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項２に記載の方法：
ａ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300
301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360
361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 420
421 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ 480
481 LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE 540
541 RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 573;
ｂ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300
301 AGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPR 360
361 RPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK 420
421 RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT 480
481 KDTYDALHMQALPPR 495;
ｃ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPS 300
301 PLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR 360
361 KHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP 420
421 EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA 480
481 LHMQALPPR 489;
ｄ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPAEPKSPDKTHTCPGQPREPQVYTLPPSRDEL 300
301 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 360
361 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEA 420
421 CRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMR 480
481 PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL 540
541 DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST 600
601 ATKDTYDALHMQALPPR 617; または
ｅ）
1 MEFGLSWLFLVAILKGVQCIDAMGNIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNW 60
61 VKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 120
121 TRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVTITC 180
181 KASQDINSYLSWFHHKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDM 240
241 GIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEMKGSGDPATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPA 300
301 AGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT 360
361 TQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR 420
421 DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD 480
481 DALHMQALPPRX 494
。
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、対応する対照細胞と比較して、フラトリサイド耐性および／または増加した抗腫瘍活性を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、検出可能な転座を含まない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、１％未満のインデルを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記方法によって産生された前記免疫細胞が、５％未満の非標的編集を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記変異が、エキソン内、スプライスドナー部位、またはスプライスアクセプター部位にある、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記変異が、タンパク質発現を低減または排除する未熟終止コドンをもたらす、請求項８に記載の方法。
前記変異が、前記変異を欠く対応する対照細胞と比較して、コードされたポリペプチドの発現を少なくとも約５０％以上低減する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記ガイドポリヌクレオチドが、CUCUUACCUGUACCAUAACC、CCUACCUGUCACCAGGACCA、およびCACCUACCUAAGAACCAUCCから選択される核酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上のガイド核酸配列の各々が、前記ｎａｐＤＮＡｂｐを、ＣＤ３ｅ、ＣＤ５、ＦＡＳ、ＬＡＧ－３、ＣＤ５２、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、および／またはＰＤＣ１／ＰＤ－１遺伝子もしくは調節エレメントに標的指向化する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記塩基エディターおよび１つ以上のガイド核酸配列が、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、カチオン性脂質媒介方法、ウイルス形質導入、またはそれらの組み合わせを介して、前記免疫細胞に導入される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記修飾された免疫細胞の集団からＴＣＲα／β＋細胞を枯渇させることをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
前記デアミナーゼは、TadA*8.1、TadA*8.2、TadA*8.3、TadA*8.4、TadA*8.5、TadA*8.6、TadA*8.7、TadA*8.8、TadA*8.9、TadA*8.10、TadA*8.11、TadA*8.12、TadA*8.13、TadA*8.14、TadA*8.15、TadA*8.16、TadA*8.17、TadA*8.18、TadA*8.19、TadA*8.20、TadA*8.21、TadA*8.22、TadA*8.23、またはTadA*8.24である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤ７ＣＡＲが、以下のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法：
7CAR8
1 MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIELTQSPAIMSASLGEEITLTCSASSSVSYMHWYQQ 60
61 KSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSSYTFGG 120
121 GTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWV 180
181 RQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCA 240
241 RQDGYYPGWFANWGQGTTVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA 300
301 VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRK 360
361 HYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE 420
421 MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL 480
481 HMQALPPR 488。
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって産生された、低減された免疫原性を有する、ＣＡＲ発現免疫細胞。
請求項１７に記載の免疫細胞を含む、薬学的組成物。
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１８に記載の薬学的組成物。