JP7615425B2

JP7615425B2 - 膜タンパク質の安定化のための液体組成物および方法

Info

Publication number: JP7615425B2
Application number: JP2024025659A
Authority: JP
Inventors: 恭子藤田; 栄一溝端; 祐詞古谷
Original assignee: Osaka University NUC; Nagoya Institute of Technology NUC; Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
Current assignee: Nagoya Institute of Technology NUC; Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences; University of Osaka NUC
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2024-02-22
Publication date: 2025-01-17
Anticipated expiration: 2044-02-22
Also published as: JP2024122906A

Description

本発明は、膜タンパク質を安定化するための液体組成物および方法に関する。

膜タンパク質は、主に細胞膜上に存在し、生物学的に重要な役割を果たしており、創薬研究において特に重要なターゲットと考えられているが、生体外での取り扱いが難しく、研究範囲が限定されている。具体的に、膜タンパク質は、発現量が少なく、水溶性タンパク質とは異なり、溶液への溶解性が低く、溶液中で十分な安定性を得ることが難しい。

界面活性剤などを用いて単離した膜タンパク質を安定化させるために、リポソームおよび脂質ナノディスクなどを使用することが提案されている（非特許文献１および非特許文献２）。

しかしながら、リポソームの作製には、減圧濃縮および透析などの操作が必要であることに加え、液体窒素を用いた凍結と、融解とを繰り返す操作を必要とし、調製に特別な技術と数日間に亘る時間とを要する。リポソームはまた、小胞の大きさによっては、物理化学的測定が困難なこともある。さらに、膜タンパク質のリポソームへの取り込み効率の評価にも多段階の操作が必要とされる。また、リポソーム中での膜タンパク質の配向については、単一状態になっていないものもあり、制御が容易ではない。

脂質ナノディスクは、ヒト由来リポプロテインＡを改変したタンパク質とリン脂質とから構成される円板状粒子である。脂質ナノディスクの調製には、ナノディスクを構成するタンパク質の発現および精製などに日数を要し、煩雑な操作および熟練した技術が必要である。また、ナノディスクへの膜タンパク質の再構成において、ディスクとリン脂質とのモル比を調整する必要がある。さらに、再構成操作の後、膜タンパク質が取込まれたナノディスクと、膜タンパク質を含まない空のナノディスクとが混在することがあり、空のナノディスクおよび／または過剰な膜タンパク質の除去のために更なる操作が必要になることがある。

このように、膜タンパク質を生体外で安定に存在させるための技術には改善の余地があり、従来の手法に代わる、膜タンパク質の安定化のための簡便な手法が必要とされていた。

ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，４６４，２１１，２００９Ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎ，１２，２２０２，２０２１

本発明は、膜タンパク質を安定化するための液体組成物および方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、これまでに、１００℃以下に融点を有するイオン液体（Ｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ；ＩＬ）にわずかな水を添加して調製される液体（以下「水和イオン液体（Ｈｙｄｒａｔｅｄｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ；ＨｙＩＬ）」と称する。）に、水溶性タンパク質を溶解することができ、溶解後の水溶性タンパク質の保存安定性および熱安定性が飛躍的に向上することを報告している（参考文献１および２）。この研究では、水和イオン液体中に溶解した水溶性タンパク質の熱安定性について、赤外吸収スペクトルからアミドバンドの変化を観測した。

次いで、本発明者らは、水溶性タンパク質とは構造および特性が大きく異なる膜タンパク質について、水和イオン液体の適用を検討したところ、驚くべきことに、水和イオン液体中に膜タンパク質の高次構造を保持したまま溶解させることができることを見出した。具体的には、本発明者らは、鋭意研究の結果、特定のカチオンと特定のアニオンとを含み、かつ、イオンペアに対してわずかな水を含む水和イオン液体に、膜タンパク質を、高次構造を保持したまま良好に溶解することができることを見出し、本発明を成すに至った。さらに、本発明者らは、水和イオン液体中に溶解した膜タンパク質は、保存安定性および熱安定性の少なくとも１つが向上していることを見出した。

即ち、本発明は以下のとおりである：
［１］（ａ）下記：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、水素またはＣ１～Ｃ４炭化水素基である（但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４のすべてがアルキルであるカチオンを除く）。）
から選択されるカチオンと、
（ｂ）下記：

から選択されるアニオンと
を含み、
前記カチオンおよび前記アニオンの対１つに対して水分子が３～１３個含まれる、液体組成物；
［２］式（Ｉ）中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキルであるか、または、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が一緒に五員または六員環を形成しており、当該環は、Ｃ１～Ｃ４アルキルで置換されていてもよく、
Ｒ_４は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基である、［１］に記載の液体組成物；
［３］前記カチオンが、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキルであり、
Ｒ_４１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ_４２は、水素、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ４アシルである。）
から選択されるか、または、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、さらに１つ以上の窒素原子および／またはリン原子を含んでいてもよく、
Ｒ_６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ_７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択される、［１］または［２］に記載の液体組成物；
［４］前記カチオンが、下記：

（式中、Ｘ_１およびＸ_２は同じであっても異なっていてもよく、窒素原子またはリン原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、
Ｒ_６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ_７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択される、［３］に記載の液体組成物。
［５］前記カチオンが、下記：

から選択される、［１］～［４］のいずれか一項に記載の液体組成物；
［６］膜タンパク質を更に含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の液体組成物；
［７］前記膜タンパク質が、αヘリックス膜貫通型タンパク質である、［６］に記載の液体組成物；
［８］前記αヘリックス膜貫通型タンパク質が、１～１７個の膜貫通ドメインを有する、［７］に記載の液体組成物；
［９］カチオンとアニオンとを含む液体組成物に、膜タンパク質を添加することを含む、膜タンパク質を安定化する方法であって、
（ａ）前記カチオンが、下記：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、水素またはＣ１～Ｃ４炭化水素基である（但し、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４のすべてがアルキルであるカチオンを除く）。）
から選択され、
（ｂ）前記アニオンが、下記：

から選択され、
前記液体組成物中に、前記カチオンおよび前記アニオンの対１つ当たりに対して水分子が３～１３個含まれる、方法。

本発明によれば、膜タンパク質を安定化するための液体組成物および方法を提供することができる。

緩衝液中および水和イオン液体中のＴｅｈＡのＣＤスペクトルを示す図である。緩衝液中のＴｅｈＡの温度によるＣＤスペクトル変化を示す図である。水和イオン液体中のＴｅｈＡの温度によるＣＤスペクトル変化を示す図である。緩衝液中および水分子数の異なる水和イオン液体中のＴｅｈＡのＣＤスペクトルを示す図である。緩衝液中および水分子数の異なる水和イオン液体中のＴｅｈＡのＣＤスペクトル強度（２０８ｎｍ）の温度による変化を示す図である。緩衝液中、［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４中およびＴｒｅ－３０中のＴｅｈＡのＣＤスペクトル強度（２０８ｎｍ）の温度による変化を示す図である。緩衝液中および水分子数の異なる［ｃｈ］［ｄｈｐ］水和イオン液体中のＴｅｈＡのＣＤスペクトル強度（２０８ｎｍ）の温度による変化を示す図である。緩衝液中および水分子数の異なる［ｃｈ］［ｄｈｐ］水和イオン液体中のＴｅｈＡの変性温度を示す。緩衝液中および水和イオン液体中に溶解したｂＲを示す図である。緩衝液中、ＰＥＧおよび各種水和イオン液体中に溶解したｂＲを示す図である。緩衝液中および各種水和イオン液体中に溶解したｂＲを示す図である。緩衝液中および水和イオン液体中のｂＲのＵＶ可視吸収を示す図である。緩衝液中および水和イオン液体中のｂＲを９０℃インキュベーションした経時変化を示す図である。緩衝液中および水和イオン液体中のｂＲの色の加熱による変化を示す図である。水和イオン液体中のｂＲの閃光励起による光吸収の経時変化を示す図である。緩衝液中のｂＲの閃光励起による光吸収の経時変化を示す図である。ｂＲの光反応サイクルの概略と時定数の対応を示す図である。緩衝液中および水和イオン液体中のｂＲの光反応サイクルにおける時定数を示す図である。水和イオン液体中のｂＲの閃光測定前後のＵＶ可視吸収の変化を示す図である。緩衝液中のｂＲのＵＶ可視吸収を示す図である。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４中のｂＲのＵＶ可視吸収を示す図である。Ｂｅｔａｉｎ－７中のｂＲのＵＶ可視吸収を示す図である。緩衝液および各水和イオン液体中のｂＲの熱変性温度を示す図である。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４中のｂＲのＵＶ可視吸収の温度変化を示す図である。［ｃｈ］［ｂｉｔ］－６中のｂＲのＵＶ可視吸収の温度変化を示す図である。［Ｃ２ｍｉｍＯＨ］［ｄｈｐ］－３中のｂＲのＵＶ可視吸収を示す図である。各水和イオン液体中のｂＲの５０％および８０％のｂＲの熱変性温度を示す図である。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４中のｂＲのＵＶ可視吸収の温度変化を示す図である。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－７中のｂＲのＵＶ可視吸収の温度変化を示す図である。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－１５中のｂＲのＵＶ可視吸収の温度変化を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について具体的に説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本発明は、特定のカチオンと特定のアニオンとを含む水和イオン液体中に、膜タンパク質を、高次構造を保持したまま溶解させることができるという知見に基づきなされたものである。ここで「イオン液体（ＩＬ）」は、難揮発性および難燃性であり、かつ、広い温度域で液状となる特徴を有することから、生体分子の溶媒としての利用可能性が考えられるものの、一般的に用いられるイオン液体中への生体分子の溶解は困難であり、溶解したとしても高次構造は大きく変化する。また、ポリマー等による生体分子表面の修飾、または、添加剤の使用を必要とした。一方、「水和イオン液体（ＨｙＩＬ）」は、生体分子との親和性を考慮してイオン構造を選択したイオン液体（ＩＬ）とわずかな水とを混合したものであり、水和イオン液体中に存在する水は、水溶液中で存在する自由水ではなく、イオンと相互作用した結合水として存在する。「水和イオン液体（ＨｙＩＬ）」とは、このように、自由水が存在しないイオン液体－水混合系をいう。なお、本明細書において、「高次構造」の語は、αヘリックスおよびβストランドなどの２次構造および当該構造よりも高次元の構造を意味し、２次構造に加え、３次構造および／または４次構造を含み得る。「高次構造」の語には「３次構造」の語が包含されるものとする。本願明細書において、「３次構造」、「３次元構造」および「立体構造」の語は同義であり、互換可能に使用されるものとする。

本発明の第一の側面は、
（ａ）下記：

から選択されるアニオンと
を含む、液体組成物に関する。

本願発明にかかる液体組成物にはさらに、カチオンおよびアニオンの対１つ（以下「１イオンペア」とも称する。）に対して水分子が、例えば３～１３個含まれる。水分子の数が少なすぎるとイオン液体が室温で完全に液体にならず、一方、水分子の数が多過ぎると膜タンパク質に特徴的な構造が保持されない場合がある。また、水分子の数が多過ぎる場合、水分子の数が増加するにつれて熱安定性を得ることが難しくなる。一態様において、水分子は、１イオンペアに対して４～１３個含まれる。別の一態様において、水分子は、１イオンペアに対して３～１０個含まれる。別の一態様において、水分子は、１イオンペアに対して３～７個含まれる。

本発明にかかる液体組成物は、わずかな水分子と特定のカチオンと特定のアニオンとを含むことにより、膜タンパク質を安定化することができる。したがって、本願発明にかかる液体組成物は、膜タンパク質を更に含んでもよい。本発明にかかる液体組成物は、カチオンおよび／またはアニオンとして有機塩を使用するため、イオン間の相互作用が小さくなり、構造デザイン性を有することから、水および有機溶媒等の従来の溶媒よりも溶媒特性の制御が容易である。

一態様において、カチオンは、（ａ）下記：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキルであるか、または、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が一緒に五員または六員環を形成しており、当該環は、Ｃ１～Ｃ４アルキルで置換されていてもよく、
Ｒ_４は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基である。）
から選択される。

別の態様において、カチオンは、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキルであり、
Ｒ_４１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ_４２は、水素、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ４アシルである。）
から選択される。

式（Ｉ－１）中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は好ましくは、水素またはＣ１～Ｃ２アルキルであり、より好ましくは、Ｃ１～Ｃ２アルキルである。

式（Ｉ－１）中、好ましくは：
Ｒ_４１は、Ｃ１～Ｃ２アルキレンであり、Ｒ_４２は、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ４アシルであるか、または、
Ｒ_４１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ_４２は、水素であり、
より好ましくは：
Ｒ_４１は、Ｃ１～Ｃ２アルキレンであり、Ｒ_４２は、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ２アシルであるか、または、
Ｒ_４１は、Ｃ２～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ_４２は、水素であり、
さらに好ましくは：
Ｒ_４１は、Ｃ１～Ｃ２アルキレンであり、Ｒ_４２は、アセチルもしくはメチルであるか、または、
Ｒ_４１は、Ｃ２～Ｃ３アルキレンであり、Ｒ_４２は、水素であり、
さらにより好ましくは：
Ｒ_４１は、Ｃ２アルキレンであり、Ｒ_４２は、アセチルもしくはメチルであるか、または、
Ｒ_４１は、Ｃ２アルキレンであり、Ｒ_４２は、水素である。

更に別の態様において、カチオンは、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、さらに１つ以上の窒素原子および／またはリン原子を含んでいてもよく、
Ｒ_６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ_７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択される。

更に別の態様において、カチオンは、以下：

（式中、Ｘ_１およびＸ_２は同じであっても異なっていてもよく、窒素原子またはリン原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、
Ｒ_６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ_７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択される。

式（Ｉ－２）および（Ｉ－２’）中、環Ａは好ましくは、五員または六員の複素芳香環であり、より好ましくは、五員の複素芳香環であり、さらに好ましくは、イミダゾリウム環である。

式（Ｉ－２）および（Ｉ－２’）中、Ｒ_６は、好ましくは：
－Ｒ_６１ＯＲ_６２（式中、Ｒ_６１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ_６２は、水素、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ４アシルである。）であり、
より好ましくは：
－Ｒ_６１ＯＲ_６２（式中、Ｒ_６１は、Ｃ１～Ｃ２アルキレンであり、Ｒ_６２は、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ２アシルであるか、または、Ｒ_６１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ_６２は、水素である）である。

式（Ｉ－２）および（Ｉ－２’）中、Ｒ_７は好ましくは、Ｃ１～Ｃ２アルキルであり、より好ましくは、メチルである。

本明細書において、「炭化水素基」の語には、炭素原子および水素原子のみからなる基だけでなく、炭素原子および水素原子に加えて官能基、例えばヒドロキシ基、エーテル結合、アルデヒド基、カルボキシ基などを含む基も包含されるものとする。

別の好ましい態様において、カチオンは、下記：

から選択される。

本発明にかかる液体組成物において、カチオンとアニオンとの好ましい具体的な組合せは、例えば：
－コリニウムカチオン（Ｉａ）とリン酸二水素アニオン（ＩＩａ）、
－コリニウムカチオン（Ｉａ）とクエン酸二水素アニオン（ＩＩｂ）、
－コリニウムカチオン（Ｉａ）とチオシアネートアニオン（ＩＩｃ）、
－コリニウムカチオン（Ｉａ）と重酒石酸（ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）イオン（ＩＩｄ）、
－コリニウムカチオン（Ｉａ）と臭素イオン、
－アセチルコリンカチオン（Ｉｂ）と塩素イオン、
－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍカチオン（Ｉｃ）とリン酸二水素アニオン（ＩＩａ）、
－１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍカチオン（Ｉｃ）と塩素イオン、および
－Ｎ，Ｎ－Ｄｉｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍカチオン（Ｉｄ）と臭素イオン、
であるが、これらに限定されない。かかるカチオンとアニオンとの具体的な組合せは、特に、膜タンパク質の安定化に適している。

本願発明にかかる液体組成物には、カチオン対アニオンが１：１のモル比で含まれることが好ましい。かかるモル比でカチオンおよびアニオンが含まれることにより、膜タンパク質の解析により適した場を提供することができる。

本発明にかかる液体組成物は、例えば緩衝液中に、アニオンとカチオンとのイオンペアを含む。緩衝液としては、例えば、トリス塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）緩衝液が使用される。液体組成物中、イオンペアの濃度は、例えば５０ｍＭ未満である。

一態様において、膜タンパク質は、αヘリックス膜貫通型タンパク質である。上記した特定のカチオンと特定のアニオンとの組合せを含む水和イオン液体は、αヘリックスの占める割合の多い膜貫通型タンパク質の構造の安定化に作用することが本発明者らにより見出されている。αヘリックス膜貫通型タンパク質は、安定性が水溶性タンパク質と類似するβバレル膜貫通型タンパク質とは異なり、従来、生体外でのフォールディングが難しいとされていたところ、特定のカチオンと特定のアニオンとの組合せを含む水和イオン液体により安定化されたことは驚くべきことであった。例えば、従来、膜タンパク質の溶解に使用されていた界面活性剤は、親水性部位と疎水性部位の調整によって、膜タンパク質の可溶化を達成していると考えられているが、本発明で使用する水和イオン液体は明らかな疎水性部位を有さない点で、界面活性剤とは可溶化のメカニズムが異なるものと考えられる。

αヘリックス膜貫通型タンパク質は、単量体において、例えば１～１７個、好ましくは４～１２個、より好ましくは７～１０個の膜貫通ドメインを有する。

本明細書において、タンパク質に関して「安定化」および「安定である」とは、膜タンパク質の高次構造が保持されることをいい、好ましくは膜タンパク質の立体構造が保持されることをいう。具体的には、「安定化」および「安定である」とは、天然状態で観察されるタンパク質の高次構造、例えば、αヘリックスおよびβシートなどが維持されることをいい、天然状態のタンパク質の高次構造および／または立体構造は、それぞれのタンパク質に適した方法で抽出および精製したｉｎｖｉｔｒｏの環境においても保持され、水、適切な濃度範囲の食塩水、および、当該分野で慣用のｐＨ条件を満たす各種緩衝液中で形成される構造をいう。膜タンパク質の場合は、例えば、水、食塩水、緩衝液等において、適切な種類と濃度の界面活性剤の存在下で形成される高次構造および／または立体構造をいう。タンパク質の高次構造および／または立体構造は、当該分野で既知の手法によって測定することができ、例えば、円二色性（ＣｉｒｃｕｌａｒＤｉｃｈｒｏｉｓｍ；ＣＤ）分光法、紫外可視（ＵｌｔｒａＶｉｏｌｅｔ（ＵＶ）－Ｖｉｓｉｂｌｅ）分光法、フーリエ変換赤外線（Ｆｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄ；ＦＴＩＲ）分光法、全反射法（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｔｏｔａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＲ）、示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃａｎｎｉｎｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ＤＳＣ）、核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＮＭＲ）、Ｘ線構造解析、電子顕微鏡、高速原子間力顕微鏡および蛍光分光法などによって測定することができるが、これらの手法に限定されない。タンパク質の高次構造および／または立体構造は、これらの手法を単独で使用して測定しても、複数を組み合わせて測定してもよい。

例えば、ＣＤスペクトルにおけるαヘリックス構造に特徴的なピークとして、２０５～２１０ｎｍ付近のピークおよび２２０～２２５ｎｍ付近のピークが挙げられる。αヘリックスに関し、高次構造および／または立体構造が維持されていることは、例えば、濃度で補正をした結果、ピーク強度および／または形状が維持されていることにより確認することができる。ピーク形状については、例えば、αヘリックス構造に特徴的な２０８ｎｍ付近および２２２ｎｍ付近にピークを有する形状が維持されていることにより、高次構造および／または立体構造が維持されていることが確認される。また、ピーク強度については、例えば、ＣＤスペクトルの上記波長範囲内のある波長（例えば２０８ｎｍ）におけるピーク強度が、天然状態のピーク強度の、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上または７５％以上、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上、より好ましくは、天然状態のピーク強度と同等であることによって高次構造および／または立体構造が維持されていることが確認される。

本明細書において、膜タンパク質の安定性には、好ましくは、熱安定性が含まれる。ここで、熱安定性は耐熱性ともいう。本明細書において、膜タンパク質に関して、「安定化」および「安定である」とは、好ましくは、膜タンパク質が高次構造を保持したまま溶解されることに加え、膜タンパク質の熱安定性が向上することをいう。より好ましくは、「安定化」および「安定である」とは、膜タンパク質が立体構造を保持したまま溶解されることに加え、膜タンパク質の熱安定性が向上することをいう。熱安定性は、先に例示した手法のいずれかを用いて、異なる温度で測定を行うことによって評価することができる。熱安定性は、例えばタンパク質の変性温度を測定することによって確認することができ、例えば緩衝液中でのタンパク質の変性温度と比較して、本発明にかかる液体組成物中でのタンパク質の変性温度が上昇している場合、熱安定性が向上したことが確認される。膜タンパク質が発色団を有する場合、加熱前および加熱後において、着色の変化を目視または慣用の装置によって確認してもよい。

本明細書において、膜タンパク質の安定性には、好ましくは、経時安定性が含まれる。ここで、経時安定性は保存安定性ともいう。本明細書において、膜タンパク質に関して、「安定化」および「安定である」とは、好ましくは、膜タンパク質が高次構造を保持したまま溶解されることに加え、膜タンパク質が経時安定性を有することをいう。より好ましくは、「安定化」および「安定である」とは、膜タンパク質が立体構造を保持したまま溶解されることに加え、膜タンパク質が経時安定性を有することをいう。経時安定性は、先に例示した手法を用いて、異なる時点で測定を行うことによって評価することができる。例えば、温度を一定とし、ある時点と、当該時点から一定時間経過後とを比較して、高次構造および／または立体構造が維持されていることによって確認することができる。

本明細書において、膜タンパク質に関して、「安定化」および「安定である」とは、より好ましくは、膜タンパク質が高次構造および／または立体構造を保持したまま溶解されることに加え、タンパク質の機能が保持されていることをいう。膜タンパク質の機能が保持されていることは、タンパク質の種類に応じた手法を用いて確認することができる。例えば、バクテリオロドプシンの機能が保持されていることは、光反応サイクルを測定することによって確認することができる。

さらにより好ましい態様において、「安定化」および「安定である」とは、膜タンパク質の高次構造および／または立体構造が保持され、膜タンパク質の熱安定性が向上し、かつ、膜タンパク質の機能が保持されていることをいう。さらにより好ましい態様において、「安定化」および「安定である」とは、膜タンパク質の高次構造および／または立体構造が保持され、膜タンパク質が経時安定性を有し、かつ、膜タンパク質の機能が保持されていることをいう。

さらに特により好ましい態様において、膜タンパク質が「安定化」および「安定である」ことには、外的刺激に対して高次構造および／または立体構造の変化を生じないことも含み得る。外的刺激としては、例えば光照射、具体的にはレーザー照射等が挙げられる。

本発明の別の側面は、膜タンパク質を安定化させる方法に関する。当該安定化方法は、先述のカチオンと先述のアニオンとを含む液体組成物に膜タンパク質を添加することを含む。液体組成物の組成については、液体組成物に関して先述した態様が適用される。

本発明にかかる安定化方法は、膜タンパク質を含む液体組成物を攪拌すること、および／または、液温を調整することを含んでもよい。

以上、本発明によれば、従来、溶液中で十分な安定性を得ることが難しかった膜タンパク質について、安定化のための簡便な手法が提供される。一般に、膜タンパク質は生体膜から単離すると、適切な界面活性剤や脂質の存在なしには高次構造が維持されない。また、単離された膜タンパク質は、高濃度のより一般的なイオン液体中においても構造が維持されないことがわかっている。しかしながら、本発明にかかる液体組成物を使用することで、驚くべきことに、膜タンパク質の高次構造を維持したまま液体中に溶解できることが新たに見出された。

本発明で使用する水和イオン液体は、特定のカチオンと特定のアニオンとを含むイオン液体に水分子を添加するだけで調製が可能であり、単離した膜タンパク質をこの水和イオン液体に混合するだけで当該タンパク質を液体中に安定的に溶解させることができる。すなわち、膜タンパク質を溶解する場を短時間で簡便に調製可能であること、共存する水分子数を調整できること、および、調製した水和イオン液体に膜タンパク質溶液を混合することで、高次構造を保持した状態で溶解させることができること等が本発明の利点である。

また、特定のイオンペアと水とを含む水和イオン液体に膜タンパク質を溶解するだけで膜タンパク質の安定性が向上するため、煩雑な作業、熟練した技術および調製に要する時間等の負荷を軽減することができる。例えば、本発明によれば、リポソームを使用する場合のように、配向を制御する必要がなく、ナノディスクを用いた再構築のように、再構築後の操作も必要ない。

さらに、水和イオン液体はオープン環境でもほぼ揮発しないため、小スケールで長期間の利用も可能である。よって、本発明によって安定化された膜タンパク質は、長期検討を行うことのできる結合化合物スクリーニング技術として展開できることが期待される。すなわち、安定化した膜タンパク質を用いて、例えば、室温、オープン環境で、膜タンパク質と相互作用を有する化合物を効率的にスクリーニングすること、および、当該化合物の結合力を解析すること等も可能となることが期待される。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例では、膜タンパク質として１０本の膜貫通型αヘリックスを含むＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＴｅｈＡ（以下「ＴｅｈＡ」と称する。）と、光駆動プロトンポンプとしてエネルギー交換を行う、αへリックスが膜を７回貫通した構造を持つバクテリオロドプシン（以下「ｂＲ」と称する。）を使用した。ｂＲは発色団レチナールを含有する色素タンパク質である。２つの膜タンパク質は既報に従って調製した（参考文献３）。

実施例１．ＴｅｈＡ
ＴｅｈＡの実験では、イオン液体に、コリニウムカチオン(ｃｈｏｌｉｎｉｕｍ、［ｃｈ］)とリン酸二水素アニオン(ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ、［ｄｈｐ］)とのイオンペア(［ｃｈ］［ｄｈｐ］)を用いた。［ｃｈ］［ｄｈｐ］１イオンペアあたりの水分子が４個または７個となるように水を添加し、水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］を作成した。緩衝液には１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ７．２～７．５)、０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ－ａｎａｇｒａｄｅを用いた。また、［ｃｈ］［ｄｈｐ］の濃度を５０ｍＭに調製した水溶液中も熱変性温度測定で使用した。膜タンパク質の濃度は約５００μｇ／ｍＬとなるよう、それぞれの溶媒に溶解した。

調製した溶液を、２５、４０、５５、６０、６５、７０および８５℃の各温度にて１０分間インキュベートした後、２００～２５０ｎｍの波長範囲でＣＤ測定を行った（図１、図２Ａおよび図２Ｂ）。含水率の異なる水和イオン液体中の熱変性温度測定では、１℃／ｍｉｎの速度で測定温度を変化させながら２０８ｎｍにおけるＣＤ強度変化を追跡した。スペクトル強度が半分になる温度を変性温度として算出した（図３Ａおよび図３Ｂ）。

その結果、水和イオン液体中でも緩衝液中と類似のスペクトルが確認され、αヘリックス構造を維持していることが明らかとなった。さらに熱変性温度は、水和イオン液体中で緩衝液中に比べて上昇し、熱安定性の向上が確認された。特に、１イオンペアあたりの水分子が４個となるよう調製した水和イオン液体中では、緩衝液中に比べて約３０℃上昇し、水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］中に溶解することで熱安定性が大きく向上することが確認された（図３Ｂ）。

次に、下記に示すイオン液体およびクラウディング剤であるＤ－（＋）－ＴｒｅｈａｌｏｓｅＡｎｈｙｄｒｏｕｓを水和させた。調製した水和混合物は以下の通りである。末尾の数字は、それぞれ１イオンペアに対する水分子数を示す。
・［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４、
・Ｄ－（＋）－ＴｒｅｈａｌｏｓｅＡｎｈｙｄｒｏｕｓ（Ｔｒｅ－３０）、および
・緩衝液
それぞれの溶媒に、濃度が１５μＭとなるようにＴｅｈＡを添加し、サンプルの調製を行った。

調製したサンプルについて、円偏光二色性（ＣＤ）測定によりＴｅｈＡの二次構造を確認したところ、［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４およびＴｒｅ－３０中で、ＴｅｈＡが緩衝液中と類似の構造を維持していることが確認され、これらのサンプルについてさらに、温度変化に伴う２０８ｎｍにおけるＣＤ強度の変化を追跡した（図３Ｃ）。ＣＤ強度の変化で得られる中点を変性温度とすると、緩衝液中に溶解したＴｅｈＡの変性温度は６４℃であったのに対し、［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４、Ｔｒｅ－３０に溶解したＴｅｈＡはいずれも緩衝液中に比べて熱変性温度の上昇が確認された。熱変性温度は、［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４で９１℃、Ｔｒｅ－３０で７３℃であった。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４では約３０℃の上昇を確認した。

次に、［ｃｈ］［ｄｈｐ］について、１イオンペア対水分子の数が１：４、１：７、１：１０、１：１３、１：１７および１：２０となるよう水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］を調製し、それぞれにＴｅｈＡを溶解してＣＤ測定を行った。温度を変化させながら得られるＣＤスペクトルの２０８ｎｍにおける強度を追跡し、強度変化の中点を熱変性温度として比較を行った（図３Ｄおよび図３Ｅ）。熱変性温度は、１イオンペアに対し水分子が最も少ない４分子で調整した水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］中で、緩衝液中に比べて約３０℃上昇し、水分子数の増加に伴い熱変性温度は低下した。

実施例２．ｂＲ
ｂＲの実験では、カチオンとして、コリニウムカチオン（［ｃｈ］）またはアセチルコリンカチオン（[Ａｃｈ]）を、アニオンとして、リン酸二水素アニオン（［ｄｈｐ］）、クエン酸二水素アニオン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｃｉｔｒａｔｅ、［ｄｈＣ］）、チオシアネートイオン（[ＳＣＮ]）、臭素イオン（Ｂｒ^－、［Ｂｒ］）または塩素イオン（Ｃｌ^－、［Ｃｌ］）を使用した。具体的には、ｂＲの実験では以下のイオンペアを使用した。末尾の数字はそれぞれ、１イオンペアに対する水分子数を示す。
・コリニウムカチオンとリン酸二水素アニオンとのイオンペア（［ｃｈ］［ｄｈｐ］－３）、
・コリニウムカチオンとクエン酸二水素アニオンとのイオンペア（［ｃｈ］［ｄｈＣ］－５）、
・コリニウムカチオンと臭素イオンとのイオンペア（［ｃｈ］［Ｂｒ］－３）
・アセチルコリンカチオンと塩素イオンとのイオンペア（[Ａｃｈ]［Ｃｌ］－３）、
・コリニウムカチオンとチオシアネートイオンとのイオンペア（［ｃｈ］[ＳＣＮ]－３）、
および
・テトラブチルアンモニウムカチオンとリン酸二水素アニオンとのイオンペア（［Ｎ４４４４］［ｄｈｐ］－５）、

さらに、分子クラウディング剤として使用されるｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ４００（ＰＥＧ４００）を使用した溶液も調製した。

上記溶液は、１イオンペアに対して、水が３分子となるように調製し、［ｃｈ］［ｄｈＣ］、［Ｎ４４４４］［ｄｈｐ］に関しては溶解性の観点から１イオンペアに対して水５分子となるように調製した。緩衝液には、１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．２５％（ｗ／ｖ）ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０)を用いた。

溶解したｂＲの溶解状態について、目視による観察およびＵＶ－Ｖｉｓ測定を行った（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図５Ａ、図５Ｂ）。さらに、緩衝液中と［ｃｈ］［ｄｈｐ］中とで、９０℃でインキュベートしながら、目視観察およびスペクトル測定を行った（図６）。

スペクトルが半減する時間を算出し、耐熱性の比較を行った。９０℃での半減期が緩衝液中では５．３分であるが、［ｃｈ］［ｄｈｐ］中では２１．３分と、約４倍もの安定化を確認した（図５Ｂ）。目視によっても、緩衝液中のサンプルは９０℃で４分処理すると透明になったが、［ｃｈ］［ｄｈｐ］中では着色が維持されていることが確認できた（図６）。

閃光励起による光吸収の実験（参考文献６）では、２５℃で５３２ｎｍのナノ秒パルスレーザーを２．０ｍＪ／ｐｕｌｓｅで照射した後、４１０、５１０、５７０および６３０ｎｍの吸光度変化を観測することで、ｂＲの光反応サイクルを解析した（図７Ａ、図７Ｂの点）。それぞれの吸光度変化は、６個の指数関数の和で再現することができ（図７Ａ、図７Ｂの実線）、時定数（秒）は図８に示すとおりになった。測定後、レーザー照射前後の紫外・可視吸収スペクトルを比較した（図９）。

上記試験の結果、緩衝液中と水和イオン液体中での光吸収変化の時定数の比（図８のＨＩＬ／Ｂの列）は、水素イオンの移動が関係しない前半の時定数１～３については、０．５～０．６程度と水和イオン液体中の方が２倍程度速い反応を示すことがわかった。水素イオンの移動が関与する後半の時定数４～６については、４．８～１７程度と水和イオン液体中の方が５～１７倍程度遅くなることがわかった。これは水和イオン液体中の水素イオン濃度が少ないことに起因するものと考えられる。このような差異はあるものの、イオン液体中でも緩衝液中と類似した光反応サイクルを示すことが確認された。また、水和イオン液体中では、測定に用いた約３６０回のレーザー照射による退色はほとんど確認されなかったことから、光照射に対して安定であることが示された（図９）。

さらに、以下に示す種々のカチオンおよびアニオンを用いて水和イオン液体を調製し、ｂＲが緩衝液中と同様の構造を有することが確認された。末尾の数字は、１イオンペアに対する水分子数を示す。イオン液体は、合成するか、または購入した。
・コリニウムカチオンとリン酸二水素アニオンとのイオンペア（［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４）、
・コリニウムカチオンと重酒石酸（ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）イオンとのイオンペア（［ｃｈ］［ｂｉｔ］－６）、
・コリニウムカチオンと臭素イオンとのイオンペア（［ｃｈ］［Ｂｒ］－３）、
・アセチルコリンカチオンと塩素イオンとのイオンペア（［Ａｃｈ］［Ｃｌ］－３）、
・Ｎ，Ｎ－Ｄｉｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍカチオンと臭素イオンとのイオンペア（［ＤＥＭＥ］［Ｂｒ］－３）、
・１－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍカチオンと塩素イオンとのイオンペア（［Ｃ２ｍｉｍＯＨ］［Ｃｌ］－４）、
・－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍカチオンとリン酸二水素アニオンとのイオンペア（［Ｃ２ｍｉｍＯＨ］［ｄｈｐ］－３）、
・Ｂｅｔａｉｎ－７

さらに、分子クラウディング剤として使用されるｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ４００（ＰＥＧ４００）を使用し、１イオンペアあたりの水分子が３個となるよう調製した（ＰＥＧ４００－３）。

それぞれの溶媒にＴｅｈＡの濃度が１５μＭとなるようにサンプルの調製を行った。調製したすべての水和イオン液体でｂＲの沈殿は確認されなかった。各溶液について、可視紫外分光測定を行った。

緩衝液中のｂＲではレチナールに基づいて５６０ｎｍ付近に大きな吸収帯と、４００ｎｍ付近に小さく幅広い吸収帯が確認された（図１０Ａ）。［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４では、緩衝液中と類似のスペクトルが観測され（図１０Ｂ）、Ｂｅｔａｉｎ－７では、構造の変化が示唆された（図１０Ｃ）。変化が示唆されるスペクトルに特徴的な、４００ｎｍの手前付近のピークは遊離したレチナールのスペクトルに酷似しており、ｂＲからレチナールの単離が示唆された。

次いで、水和イオン液体中で温度変化に伴うスペクトル変化を追跡し、それぞれの熱変性温度の算出を行った。２５℃から１００℃まで、５分間に５℃温度が上昇するようにインキュベーターを使って水和イオン液体に溶解したｂＲをインキュベートし、ＵＶ－ｖｉｓ法で５分ごとにスペクトル測定を行い、最大吸収波長の吸光度を観測した。熱変性温度は２５℃における吸光度に対して各測定温度での吸光度の割合として算出してプロットした。吸光度が５０％となった温度を熱変性温度とした（図１１）。すべての水和イオン液体において、緩衝液中に比べて熱変性温度が上昇することが確認された。

緩衝液中と比較して大幅に熱変性温度の向上が確認された［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４、［ｃｈ］［ｂｉｔ］－６および［Ｃ２ｍｉｍＯＨ］［ｄｈｐ］－３において、観測される吸光度の減衰傾向についてさらなる検討を行った（図１２Ａ～図１２Ｄ）。［Ｃ２ｍｉｍＯＨ］［ｄｈｐ］－３では温度上昇で観測される減衰速度は遅いが、減衰が開始するのは４５℃付近と比較的低温である（図１２Ｃ）。これに対して、［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４の減衰開始温度は５５℃付近である（図１２Ａ）。構造変化が生じ始める減衰開始温度がより高く安定なのは［ｃｈ］［ｄｈｐ］－４であった（図１２Ｄ）。

さらに、水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］の含水率を検討すべく、１イオンペアに対して４、７、１５分子となるように溶液を調製し、ＵＶ－ｖｉｓスペクトル測定によりそれぞれの熱変性温度の測定を行った（図１３Ａ～図１３Ｃ）。水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］中においてインキュベーション前の吸光度が５０％に減衰する熱変性温度は、１：４で約８０℃、１：７で約８３℃、１：１５で約６８℃となり、１：４と１：７ではあまり変わらず、１：１５では大幅に低下することが確認された。水和［ｃｈ］［ｄｈｐ］中に自由水が存在しないほど安定性は向上することが示唆された。

先行技術には、例えば、イオン液体およびオスモライトが、膜タンパク質であるバクテリオリドプシンの構造および酸化ストレスに及ぼす影響を実験とシミュレーションから検討したものがある（参考文献４）。ここで使用しているイオンは、構造も濃度も本発明とは全く異なるものである。ｂＲの構造への大きな影響は観測されていないものの、安定性の向上は確認されていない。

また、計算を用いて耐熱化設計を行い、変異導入をすることで膜タンパク質の耐熱性の向上に成功した事例もある（参考文献５）。膜外領域の変異導入部位の選択、変性状態の自由エネルギー計算、変異による構造変化などの予測および耐熱化変異候補の決定、という手順で膜タンパク質ｂＲの耐熱化変異体を設計しているが、設計の成功率は４０％であり、耐熱化に失敗する変異体もある。

本発明によれば、特定のイオン対と水とを含む水和イオン液体に膜タンパク質を溶解させることで、膜タンパク質の安定性が向上するため、煩雑な作業、熟練した技術および調製に要する時間等の負荷を軽減することができる。また、膜タンパク質を液体に溶解させるため、全てのタンパク質分子を均一に安定化させることができる。さらには、液体中に溶解させて安定化させることができるため、結合化合物スクリーニングのための長期的な利用も期待される。

参考文献

Claims

（ａ）以下：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ _１、Ｒ _２およびＲ _３は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキルであり、
Ｒ _４１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ _４２は、水素、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ４アシルである。）
から選択されるか、または、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、さらに１つ以上の窒素原子を含んでいてもよく、
Ｒ _６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ _７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択されるカチオンと、
（ｂ）下記：

から選択されるアニオン
とを含み、
前記カチオンおよび前記アニオンの対１つに対して水分子が３～１３個含まれ、
水和イオン液体である、膜タンパク質を安定化するための液体組成物。
前記カチオンが、下記：

（式中、Ｘ_１およびＸ_２は窒素原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、
Ｒ_６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ_７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択される、請求項１に記載の液体組成物。
前記カチオンが、下記：

から選択される、請求項１に記載の液体組成物。
膜タンパク質を更に含む、請求項１または２に記載の液体組成物。
前記膜タンパク質が、αヘリックス膜貫通型タンパク質である、請求項１または２に記載の液体組成物。
前記αヘリックス膜貫通型タンパク質が、１～１７個の膜貫通ドメインを有する、請求項５に記載の液体組成物。
カチオンとアニオンとを含む液体組成物に、膜タンパク質を添加することを含む、膜タンパク質を安定化する方法であって、
（ａ）前記カチオンが、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子またはリン原子であり、
Ｒ _１、Ｒ _２およびＲ _３は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキルであり、
Ｒ _４１は、Ｃ１～Ｃ４アルキレンであり、Ｒ _４２は、水素、Ｃ１～Ｃ２アルキルもしくはＣ１～Ｃ４アシルである。）
から選択されるか、または、以下：

（式中、Ｘは、窒素原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、さらに１つ以上の窒素原子を含んでいてもよく、
Ｒ _６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ _７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択され、
（ｂ）前記アニオンが、下記：

から選択され、
前記液体組成物中に、前記カチオンおよび前記アニオンの対１つ当たりに対して水分子が３～１３個含まれ、
前記液体組成物が水和イオン液体である、方法。
前記カチオンが、下記：

（式中、Ｘ _１およびＸ _２は窒素原子であり、
環Ａは、五員または六員の複素環であり、
Ｒ _６は、鎖内に少なくとも１つの酸素原子を有するＣ１～Ｃ４炭化水素基であり、
Ｒ _７は、Ｃ１～Ｃ４アルキルである。）
から選択される、請求項７に記載の方法。
前記カチオンが、下記：

から選択される、請求項７に記載の方法。