JP7616353B2

JP7616353B2 - サリチル酸メチルをセンシングする方法、サリチル酸メチルセンサー、及び植物の病気感染の検出方法

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Publication number: JP7616353B2
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Description

本発明は、植物が病気に感染した際に放出する植物ホルモンであるサリチル酸メチルのセンシング方法、サリチル酸メチルセンサー、及び植物の病気感染を早期に検出する方法等に関する。

植物は、糸状菌等の病原菌の感染を受けたり、害虫等による食害を受けたり、さらに環境の変動によるストレスを受けたりすると、それに対抗して独自の防御機構が働くことが知られている。具体的には、植物は病原菌による感染を受けると感染した場所でシグナル物質であるサリチル酸を合成する。そして、サリチル酸が師管組織を経由して植物体内を移動し、未感染組織に防御機構を誘導することで、結果として病原菌に対して全身で抵抗性を発現する（全身獲得抵抗性）。また、害虫による食害を受けることでエチレンやジャスモン酸を合成し、サリチル酸と同様に植物体内を移動することで全身に防御機構を誘導する（誘導全身抵抗性）。さらに乾燥、低温、塩害などの生育環境の変動に対してはアブシジン酸を植物体内で合成し環境ストレスに適用することが知られている。

また、植物は病原菌感染や害虫による食害を受けた際に、被害を受けた植物自身だけでなく、周囲の植物にも知らせるメカニズムが存在することが知られている（非特許文献１）。具体的には、病原菌に感染した際に合成されるサリチル酸はメチル化されてサリチル酸メチルになり、揮発性シグナル物質として植物から放出されて周囲の植物に病原菌の感染を知らせることで予め防御機構を促す。また、害虫の被害の際に合成されるジャスモン酸もメチル化されてジャスモン酸メチルとなり揮発性シグナルとなり植物から放出されることで、周囲の植物に予め抵抗性を誘導することが知られている。

このように植物は病害虫による被害を受けた際にシグナル物質として植物ホルモンを放出することが知られており、そのシグナル物質をいち早くセンシングすることで病害虫被害を早期に検出することが可能となる。

害虫被害の際に揮発性シグナルとして放出されるジャスモン酸をセンシングすることで被害の早期発見する方法として、栽培している農作物の傍に、発光タンパク質遺伝子を有するモニター植物を一緒に栽培し、そして農作物が害虫被害を受けた際に放出されたジャスモン酸メチルをモニター植物が感知してモニター植物が発光する現象を利用する方法が開示されている（特許文献１）。

ＷＯ２０１９／０８２９４２号公報

J. Japan Association on Odor Environment, Vol.36, No.3, 153-155(2005).

本発明の課題は、農作物を含む植物の栽培において、病気感染した際に放出される植物ホルモンであるサリチル酸メチルをセンシングする方法、及びサリチル酸メチルセンサーを提供し、それによって植物の病気感染を早期に、その場で検出する方法を提供することにある。

本発明の一態様は、揮発性植物ホルモンであるサリチル酸メチルを選択的に認識して錯体を形成する亜鉛化合物をセンサーのレセプターとして利用する。また、本発明の一態様はサリチル酸メチルと亜鉛化合物が反応して生成した錯体の蛍光発光現象を利用することによって、植物の病気感染を早期に検出する。さらに、本発明の一態様はサリチル酸メチルと亜鉛化合物が反応して、電気化学的挙動が変化する現象を利用することによって、植物の病気感染を早期に検出する。

本発明によると、亜鉛化合物をセンサーのレセプターに用いることにより、植物が病原菌に感染した際に放出される揮発性植物ホルモンのサリチル酸メチルを選択的にセンシングができる。さらに、本発明の一態様によると、植物の病原菌による感染を早期に検出することができる。

実施例１において蛍光発光を確認した写真である。実施例１において蛍光発光を確認した写真である。比較例１において蛍光発光を確認した写真である。比較例１において蛍光発光を確認した写真である。実施例２において蛍光発光を確認した写真である。実施例３において蛍光発光を確認した写真である。実施例４において蛍光発光を確認した写真である。実施例５で得られた蛍光スペクトル曲線を示す図である。実施例６で得られた蛍光スペクトル曲線を示す図である。実施例７で得られたＺｎＡ／ＭＳＡ混合溶液の蛍光スペクトル曲線を示す図である。実施例７で得られたＭＳＡの比率と蛍光強度の関係をプロットした図である。実施例８において蛍光発光を確認した写真である。実施例９において得られた電流－電圧曲線（サイクリックボルタモグラム）を示す図である。本実施形態のサリチル酸メチルセンサーの構成の概要図の一例である。

以下に、本発明を実施するための形態について図面等を用いて説明する。ただし、以下に述べる実施形態には、本発明を実施するために技術的に好ましい限定がされているが、発明の範囲を以下に限定するものではない。

本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、植物が病原菌に感染した際に放出する揮発性シグナル物質であるサリチル酸メチルは亜鉛化合物を用いることで選択的にセンシングできることを見出し、本発明を完成した。さらに、本発明者らは、サリチル酸メチルと亜鉛化合物が反応して形成された錯体からの蛍光発光現象を利用したり、電気化学的挙動の変化を利用したりすることにより、植物の病原菌による感染を早期に検出することができることを見出した。

以下に、本実施形態について詳述する。
＜サリチル酸メチルのレセプター：亜鉛化合物＞
サリチル酸メチルをセンシングするためのレセプターに利用できる亜鉛化合物としては、特に限定はされないが、カルボン酸亜鉛等の有機酸亜鉛、ハロゲン化亜鉛、またはそれらの水和物が好ましい。亜鉛化合物として、例えば、酢酸亜鉛（ＩＩ）、ぎ酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、酪酸亜鉛（ＩＩ）、しゅう酸亜鉛二水和物、ヘキサン酸亜鉛（ＩＩ）、プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）、安息香酸亜鉛（ＩＩ）、オクタン酸亜鉛（ＩＩ）、オレイン酸亜鉛（ＩＩ）、硝酸亜鉛（ＩＩ）、塩化亜鉛（ＩＩ）等の化合物が挙げられるが、これらだけに限定されるものではない。亜鉛化合物は、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

例えば、酢酸亜鉛（ＩＩ）はサリチル酸メチルと下記式（１）に示す反応により錯体を形成することでサリチル酸メチルを選択的に認識することができる。

よって、本発明の一部の実施形態は、亜鉛化合物とサリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法に関する。

また、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターとして、亜鉛化合物を用いる、サリチル酸メチルのセンシング方法に関する。

一部の実施形態では、亜鉛化合物として、酢酸亜鉛（ＩＩ）が用いられうる。

一部の実施形態では、亜鉛化合物とサリチル酸メチルとの反応は溶液中で行われる。溶液は、例えば、ジメチルスルホキシド溶液、メタノール溶液、または水溶液でありうるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、亜鉛化合物の濃度は、例えば、０．００００１ｍｏｌ／Ｌ～５ｍｏｌ／Ｌの範囲内、例えば、０．００００４ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度でありうる。

一部の実施形態では、亜鉛化合物とサリチル酸メチルとの反応は亜鉛化合物を含有する固体媒体中で行われる。固体媒体は、例えば、紙またはガラス（例えば、ガラス繊維、多孔質ガラス基板等）、または樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ナイロン樹脂、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンオキサイド、水溶性ポリマー（セルロース系、アガロース、でんぷん系、アルギン酸ナトリウム、アクリル酸系、アクリルアミド系、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン等）でありうるが、これらに限定されるものではない。

＜蛍光発光現象＞
亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応により生成した錯体は、新たに蛍光発光を示す。具体的には、亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応で形成された錯体に、波長が２００～４００ｎｍの励起光をあてることで蛍光発光を示す。一方、亜鉛化合物のみではほとんど蛍光発光を示さず、これによってサリチル酸メチルを検出することが可能となる。

よって、本発明の一部の実施形態は、（ｉ）亜鉛化合物とサリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程、（ｉｉ）錯体に励起光をあてる工程、（ｉｉｉ）錯体が発する蛍光を検出する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法に関する。一部の実施態様では、励起波長として２００～４００ｎｍの範囲内の適切な波長が選択される。さらに、一部の実施形態では、検出された蛍光の強度をあらかじめ決められた参照値と比較することにより、サリチル酸メチルの濃度を決定する工程も実施されうる。
また、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルが、亜鉛化合物と反応して、亜鉛錯体を形成することで蛍光発光する現象を利用する、サリチル酸メチルのセンシング方法に関する。

＜電気化学的挙動＞
亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応により生成した錯体は、レセプターの亜鉛化合物とは異なる電気化学的挙動を示す。具体的には、亜鉛化合物とサリチル酸メチルから成る錯体を含有する電気化学セルのサイクリックボルタンメトリの測定により、ある特定の電位付近で電流値の大きな変化が生ずる。これによって、この電流値をモニターすることでサリチル酸メチルを検出することが可能となる。

よって、本発明の一部の実施形態は、（ｉ）溶液中で亜鉛化合物とサリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程、（ｉｉ）一定の電圧下で流れる電流を測定する工程、（ｉｉｉ）錯体の形成により生じる電流値の変化を検出する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法に関する。一部の実施態様では、電圧の値として－１～２Ｖ（ｖｓ．ＮＨＥ）の範囲内の適切な値が選択される。溶液は、支持電解質として、例えば、テトラブチルアンモニウムパークロレート等を含みうるが、これに限定はされない。さらに、一部の実施形態では、検出された電流値の変化をあらかじめ決められた参照値と比較することにより、サリチル酸メチルの濃度を決定する工程も実施されうる。

また、本発明の一部の実施形態は、亜鉛化合物が、サリチル酸メチルとの反応により錯体を生成し、その錯体の電気化学的挙動が亜鉛化合物とは異なる現象を利用する、サリチル酸メチルのセンシング方法に関する。

さらに、本発明の一部の実施形態は、亜鉛化合物が、サリチル酸メチルとの反応により錯体を生成し、その錯体のある電位領域での電流値が亜鉛化合物とは異なる現象を利用する、サリチル酸メチルのセンシング方法に関する。

一部の実施形態において、本発明のサリチル酸メチルのセンシング方法は、農作物の病原菌感染の検出のために用いられうる。

＜サリチル酸メチルセンサー＞
図１２に、本実施形態のサリチル酸メチルセンサーの構成の概要図の一例を示す。本実施形態の亜鉛化合物をレセプターに用いたサリチル酸メチルセンサー１は、少なくともサリチル酸メチル（ＭＳＡ）の認識部２と、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部３から構成される。認識部２には、少なくともレセプターである亜鉛化合物を含む。亜鉛化合物は、サリチル酸メチル以外の他の植物ホルモン、例えばジャスモン酸メチルとは反応せず認識しないため、サリチル酸メチルを選択的に認識することができる。前記検出部３は、前記サリチル酸メチルの認識部２にサリチル酸メチルが認識されたことを光学的、及び／または電気化学的に検出できるように構成されている。例えば、光学的な検出部では、亜鉛化合物とサリチル酸メチルで生成した錯体の蛍光発光を検出するため、少なくとも励起光源と検出素子から構成され、蛍光強度の変化からサリチル酸メチルの検出並びにその濃度を測定する。また、電気化学的な検出部では電気化学的挙動の変化を検出するため、例えば亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応で生成した錯体の酸化還元反応により生じる電流を検出するように電極を有する電気化学セル（検出素子）を構築して、該電気化学セルの電気化学的挙動の変化（例えば、ある電位での電流値の変化）を用いてサリチル酸メチルの検出、及びその濃度を測定する。

よって、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターである亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサーに関する。一部の実施形態において、本発明のサリチル酸メチルセンサーは、農作物が病原菌に感染した際に放出される植物ホルモンのサリチル酸メチルを検出する。よって、本発明のサリチル酸メチルセンサーは、農作物の病原菌感染検出用のセンサーとして用いられうる。一部の実施形態において、本発明のサリチル酸メチルセンサーは、ジャスモン酸メチルに比べて、サリチル酸メチルを選択的に検出することができる。

また、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、（ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、（ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを光学的に検出する検出部を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサーに関する。一部の実施形態において、光学的な検出部は、少なくとも励起光源と検出素子とを含む。一部の実施形態において、本発明のサリチル酸メチルセンサーは、観測された蛍光強度の変化に基づき、サリチル酸メチルの検出及び／または濃度測定を行うことができる。

さらに、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、（ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、（ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを電気化学的に検出する検出部を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサーに関する。一部の実施形態において、電気化学的な検出部は、亜鉛化合物とサリチル酸メチルが形成する錯体の酸化還元反応により生じる電流を検出する電極を有する電気化学セルを含む。一部の実施形態において、本発明のサリチル酸メチルセンサーは、電気化学セルの電流値の変化に基づき、サリチル酸メチルの検出及び／または濃度測定を行うことができる。

一部の実施態様では、検出部は、サリチル酸メチルの検出及び／または濃度測定を処理するプログラムを実行するコンピュータを含みうる。そのようなプログラムは、例えば、コンピュータに、光学的及び／または電気化学的な検出素子からの信号を受信する段階、受信した信号を分析してサリチル酸メチルの有無及び／またはその濃度を決定する段階、並びに、分析結果を出力する段階を実行させるプログラムでありうる。一部の実施態様において、受信した信号の分析は、例えば、受信した信号をあらかじめ決められた参照値と比較することにより、サリチル酸メチルの有無及び／またはその濃度を決定することを含みうる。また、一部の実施態様において、分析結果は、例えば、センサーに接続されたディスプレイ装置、またはネットワークを介して接続された他の機器等に出力されうる。

よって、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターである亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部を少なくとも備え、該検出部が検出素子とコンピュータを含むサリチル酸メチルセンサーであって、コンピュータに、（ｉ）光学的及び／または電気化学的な検出素子からの信号を受信する段階、（ｉｉ）受信した信号を分析してサリチル酸メチルの有無及び／またはその濃度を決定する段階、並びに（ｉｉｉ）分析結果を出力する段階を実行させるプログラムを有するサリチル酸メチルセンサーに関する。

＜農作物の病原菌感染を早期に検出する方法＞
本発明のサリチル酸メチルセンサーの用途の一つとして、サリチル酸メチルセンサーを農作物が植えられている傍らに設置し、センサーによりサリチル酸メチルを検出することによって、農作物の病原菌感染を早期に検出することが可能である。

よって、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルセンサーを農作物の近傍に設置し、該センサーによりサリチル酸メチルを検出することにより農作物の病原菌感染を検出する方法に関する。一部の実施態様において、サリチル酸メチルセンサーは、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターである亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部を少なくとも備えている、サリチル酸メチルセンサーである。また、一部の実施態様において、サリチル酸メチルセンサーは、（ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、（ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを光学的及び／又は電気化学的に検出する検出部、を少なくとも備えている、サリチル酸メチルセンサーである。

監視対象となりうる農作物としては、例えば、キュウリ、スイカ、トマト、ナス、ピーマン、パプリカ、ピクルス、シシトウ、メロン、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、レタス、ネギ、ブロッコリー、タマネギ、ニンニク、ヤマノイモ、アスパラガス、ニンジン、バレイショ、セルリー、タバコ、イネ、イチゴが挙げられるが、これらに限定はされない。

検出されうる病害としては、例えば、輪紋病、白星病、褐色輪紋病、葉かび病、萎凋病、根腐萎凋病、半身萎凋病、褐色根腐病、灰色疫病、根腐病、黒点根腐病、白絹病、苗立枯病、褐斑病、ベと病、うどんこ病、灰色かび病、炭疽病、黒星病、菌核病、つる枯病、斑点病、疫病、モザイク病、黄化えそ病、黄化葉巻病、青枯病、軟腐病、かいよう病、茎えそ細菌病、黒班細菌病、斑点細菌病等が挙げられるが、これらに限定はされず、また、検出されうる病原菌感染としては、上記の病害の原因菌による感染が挙げられるが、これらに限定はされない。

本開示の文脈において、センサーを農作物の近傍に設置すると言った場合、用語「近傍」の例としては、例えば、監視対象の農作物から２ｍ以内、１ｍ以内、７５ｃｍ以内、５０ｃｍ以内、４０ｃｍ以内、３０ｃｍ以内、２０ｃｍ以内、１０ｃｍ以内、または５ｃｍ以内の距離が挙げられるが、これらに限定はされず、適切な距離が種々の要因を考慮して適宜選択される。当業者であれば、センサーを設置する位置を様々な条件を考慮した上で適宜設定することが可能であろう。

さらに、本発明の一部の実施形態は、農作物の病原菌感染の検出における、サリチル酸メチルセンサーの使用に関する。また、本発明の一部の実施形態は、サリチル酸メチルセンサーの製造における、亜鉛化合物の使用に関する。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

（実施例１）
酢酸亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＡ）０．１ｇをメタノール３ｍｌに溶解した溶液０．２ｍｌを円形ろ紙（４５ｍｍΦ）に滴下し乾燥させて、ＺｎＡを含むろ紙を得た。得られたろ紙にＵＶランプ（波長３６５ｎｍ）で励起させて蛍光発光があるか確認した（図１Ａの（ａ））。次にそのろ紙に植物が病原菌に感染した際に放出するサリチル酸メチル（ＭＳＡ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）０．０３ｍｌを滴下し乾燥させ、得られたろ紙に同様にＵＶランプで励起させて蛍光発光があるか確認した（図１Ｂの（ｂ））。その結果、（ａ）は発光せず、ＺｎＡはサリチル酸メチルと反応し、蛍光発光を示し、サリチル酸メチルをセンシングできることが分かった。

（比較例１）
酢酸亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＡ）０．１ｇをメタノール３ｍｌに溶解した溶液０．２ｍｌを円形ろ紙（４５ｍｍΦ）に滴下し乾燥させて、ＺｎＡを含むろ紙を得た。得られたろ紙にＵＶランプ（波長３６５ｎｍ）で励起させて蛍光発光があるか確認した（図２Ａの（ａ））。次にそのろ紙に植物が害虫被害を受けた際に放出するシグナル物質であるジャスモン酸メチル（ＭＪＡ）のアセトニトリル溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）０．０３ｍｌを滴下し乾燥させ、得られたろ紙に同様にＵＶランプで励起させて蛍光発光があるか確認した（図２Ｂの（ｂ））。その結果、ＺｎＡはジャスモン酸メチルとは反応せず、蛍光発光を示さないことが分かった。

実施例１と比較例１の結果から、ＺｎＡは植物が病原菌感染時に放出するサリチル酸メチルを選択的にセンシングできることが分かった。

（実施例２）
酢酸亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＡ）０．１ｇをメタノール３ｍｌに溶解した溶液０．２ｍｌを円形ろ紙（４５ｍｍΦ）に滴下し乾燥させて、ＺｎＡを含むろ紙を得た。次にこのろ紙とサリチル酸メチル０．０５ｇをシャーレに入れたものを容量約１．８Ｌのデシケータ内に直接接触しないように静置し保管した。１時間後にろ紙を取り出し、ろ紙にＵＶランプ（波長３６５ｎｍ）で励起させて蛍光発光があるか評価した結果、青白い色の蛍光が確認された（図３）。この結果から、植物が病原菌感染の際に放出するサリチル酸メチルを揮発性シグナルとしてセンシングできることが分かった。

（実施例３）
プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＰ）０．０１ｇをメタノール３ｍｌに溶解した溶液０．２ｍｌを円形ろ紙（４５ｍｍΦ）に滴下し乾燥させて、ＺｎＰを含むろ紙を得た。このろ紙とサリチル酸メチル０．０５ｇをシャーレに入れたものを容量約１．８Ｌのデシケータ内に直接接触しないように静置し保管した。３時間後にろ紙を取り出し、未処理のろ紙と一緒にＵＶランプ（波長３６５ｎｍ）で励起させて蛍光発光があるか評価した結果、青白い色の蛍光が確認された（図４（ｂ））。一方、未処理のろ紙では蛍光発光が見られなかった（図４（ａ））。この結果から、植物が病原菌感染の際に放出するサリチル酸メチルを揮発性シグナルとしてセンシングできることが分かった。

（実施例４）
プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＰ）０．０１ｇをメタノール３ｍｌに溶解し、ＺｎＰ溶液を調製した。次にＺｎＰ溶液１ｍｌにＭＳＡを１滴加えてＭＳＡ含有のＺｎＰ溶液を調製した。また、ＺｎＰ溶液１ｍｌにＭＪＡを１滴加えてＭＪＡ含有のＺｎＰ溶液を調製した。得られた３種の溶液にＵＶランプ（波長３６５ｎｍ）で励起させて蛍光発光があるか確認した（図５）。その結果、ＺｎＰのみの溶液（ａ）、及びＭＪＡを加えた溶液（ｃ）では蛍光発光がみられなかったが、ＭＳＡを加えた溶液（ｂ）では、青白い蛍光発光を示し、サリチル酸メチルを選択的にセンシングできることが分かった。

（実施例５）
［蛍光スペクトル測定］
プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）（ＺｎＰ）のＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．９ｍｌとサリチル酸メチル（ＭＳＡ）のＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．１ｍｌを混合し、１０分後に２０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３６５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。また、ＺｎＰのＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．９ｍｌとＤＭＳＯ０．１ｍｌを混合し、さらに２０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３６５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。同様に、ＭＳＡのＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．１ｍｌとＤＭＳＯ０．９ｍｌを混合し、さらに２０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３６５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。得られた蛍光スペクトル曲線を図６に示す。実線はＺｎＰ＋ＭＳＡの蛍光スペクトル、一点鎖線はＺｎＰのみの蛍光スペクトル、破線はＭＳＡのみの蛍光スペクトルを表す。この結果から、ＺｎＰはそれ自身では蛍光を示さないがＭＳＡと反応することで蛍光発光（極大波長４１８ｎｍ）を示すことが分かった。また、ＭＳＡ単体では蛍光強度は非常に小さいことも分かった。

（実施例６）
［蛍光スペクトル測定］
硝酸亜鉛（ＩＩ）六水和物（ＺｎＮ）のＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．９ｍｌとサリチル酸メチル（ＭＳＡ）のＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．１ｍｌを混合し、１０分後に２０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３６５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。また、ＺｎＮのＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．９ｍｌとＤＭＳＯ０．１ｍｌを混合し、さらに２０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３６５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。同様に、ＭＳＡのＤＭＳＯ溶液（濃度１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．１ｍｌとＤＭＳＯ０．９ｍｌを混合し、さらに２０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３６５ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。得られた蛍光スペクトル曲線を図７に示す。実線はＺｎＮ＋ＭＳＡの蛍光スペクトル、一点鎖線はＺｎＮのみの蛍光スペクトル、破線はＭＳＡのみの蛍光スペクトルを表す。この結果から、ＺｎＮはそれ自身では蛍光を示さないがＭＳＡと反応することで蛍光発光（極大波長４１８ｎｍ）を示すことが分かった。

（実施例７）
［蛍光強度の定量性評価］
ＺｎＡのメタノール溶液（濃度０．０１ｍｏｌ／Ｌ）０．１５ｍｌとＭＳＡのメタノール溶液（濃度０．０２ｍｏｌ／Ｌ）０．１５ｍｌを加え、１０分後に１０倍に希釈してその溶液を石英セルに入れ、励起波長３４３ｎｍで蛍光スペクトルを測定した結果、図８に示す蛍光スペクトル曲線が得られた。その時の蛍光強度が一番強いピーク波長は３８１ｎｍであった。次に、ＺｎＡのメタノール溶液ａ（濃度０．０１ｍｏｌ／Ｌ）０．９ｍｌとＭＳＡのメタノール溶液ｂ（濃度０．０２ｍｏｌ／Ｌ）０．１ｍｌを加え、１０分後に２００倍に希釈して励起波長３４３ｎｍで蛍光スペクトルを測定し、波長３８１ｎｍでの蛍光強度を求めた。同様にＺｎＡ溶液ａ０．８ｍｌとＭＳＡ溶液ｂ０．２ｍｌでの蛍光強度、さらにＺｎＡ溶液ａ０．７ｍｌとＭＳＡ溶液ｂ０．３ｍｌでの蛍光強度を求めた。得られた蛍光強度をプロットしたものを図９に示す。この結果から、ＭＳＡの比率が増大するとともに蛍光強度も増大しており、ＭＳＡを定量的に検出できることが分かった。図９の横軸は、「ＭＳＡ溶液ｂの容量／（ＭＳＡ溶液ｂの容量＋ＺｎＡ溶液ａの容量）」を表し、縦軸は蛍光強度を表す。

（実施例８）
［亜鉛化合物含有アガロースゲルによるＭＳＡの検出］
酢酸亜鉛（ＺｎＡ）０．０４５９ｇとアガロース０．５ｇを水２５ｍｌに分散させ、９５℃で加熱攪拌することでアガロースを溶解してゾル化した。その後、放冷することによりＺｎＡ含有のゲルを得た。得られたＺｎＡ含有ゲルの一部を入れたシャーレと、サリチル酸メチル１２ｍｇを入れた別のシャーレをデシケータ内に直接接触しないように静置して保管した。２４時間後にゲルを取り出し、ＵＶランプ（波長３６５ｎｍ）で励起させて蛍光発光があるか評価した結果、青白い蛍光が確認された（図１０（ｂ））。一方、未曝露（サリチル酸メチルに曝露していない）のＺｎＡ含有ゲルでは蛍光発光が見られなかった（図１０（ａ））。この結果から、ＺｎＡ含有ゲルは、植物が病原菌感染の際に放出するサリチル酸メチルを揮発性シグナルとしてセンシングできることが分かった。

（実施例９）
［電気化学的挙動の測定］
支持電解質としてテトラブチルアンモニウムパークロレートをＤＭＳＯに溶解し電解液を調製し（濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）、ガラス容器に電解液１０ｍｌを入れ、作用極、対極、参照電極から成る三電極方式の電気化学セルを構成した。なお作用極にはグラッシーカーボン、対極にはＰｔ、参照電極にはＡｇ／Ａｇ^＋電極を用いた。そこにプロピオン酸亜鉛（ＺｎＰ）のＤＭＳＯ溶液（濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）を１ｍｌ加え、室温でサイクリックボルタンメトリ（ＣＶ）を測定した（掃引電位：－０．８～１．２Ｖ、掃引速度：０．１Ｖ／ｓ）。

次にそこにサリチル酸メチル（ＭＳＡ）のＤＭＳＯ溶液（濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）を１ｍｌ加え、同様にＣＶ測定を行った。

得られた電流－電圧曲線（サイクリックボルタモグラム）を図１１に示す。破線はＺｎＰのみ、実線はＺｎＰにＭＳＡを添加した後の測定結果である。この結果から、ＭＳＡ添加後には、添加前に比べて、電位が－０．０９Ｖと－０．４６Ｖに新たに還元ピークが現れることが分かった。このことは、例えばＭＳＡとの反応前後で電流値が大きく変化する電圧（Ａｇ／Ａｇ^＋電極に対して－０．０９Ｖと－０．４６Ｖ）で電極に流れる電流値をモニターすることで、電流値の変化によりサリチル酸メチルをセンシングできることを示している。

上記の実施形態の一部または全部は、以下の付記のようにも記載されうるが、本出願の開示事項は以下の付記に限定されない。
（付記１）
サリチル酸メチルをセンシングする方法であり、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターに亜鉛化合物を用いるセンシング方法。
（付記２）
亜鉛化合物が酢酸亜鉛（ＩＩ）、ぎ酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、酪酸亜鉛（ＩＩ）、しゅう酸亜鉛二水和物、ヘキサン酸亜鉛（ＩＩ）、プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）、酒石酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、安息香酸亜鉛（ＩＩ）、オクタン酸亜鉛（ＩＩ）、オレイン酸亜鉛（ＩＩ）、硝酸亜鉛（ＩＩ）及び塩化亜鉛（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物である付記１に記載のセンシング方法。
（付記３）
サリチル酸メチルが亜鉛化合物と反応して錯体を形成することで蛍光発光する現象を利用する付記１または２に記載のセンシング方法。
（付記４）
亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応により電気化学的挙動が変化する現象を利用する付記１～３のいずれか一項に記載のセンシング方法。
（付記５）
亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応により生じる電流値の変化を利用する付記４に記載のセンシング方法。
（付記６）
サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、
ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、
ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部
を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサー。
（付記７）
付記６に記載のサリチル酸メチルセンサーを農作物の近傍に設置し、該サリチル酸メチルセンサーによりサリチル酸メチルを検出することにより農作物の病原菌感染を検出する方法。
（付記８）
サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターである亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部を少なくとも備え、該検出部が光学的及び／または電気化学的な検出素子とコンピュータを含み、該コンピュータに、
ｉ）光学的及び／または電気化学的な検出素子からの信号を受信する段階、
ｉｉ）受信した信号を分析してサリチル酸メチルの有無及び／またはその濃度を決定する段階、並びに
ｉｉｉ）分析結果を出力する段階
を実行させるプログラムを有するサリチル酸メチルセンサー。
（付記９）
サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーを制御するプログラムであって、該サリチル酸メチルセンサーが、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターである亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部を少なくとも備え、該検出部が光学的及び／または電気化学的な検出素子とコンピュータを含むことを特徴とし、該コンピュータに、
ｉ）光学的及び／または電気化学的な検出素子からの信号を受信する段階、
ｉｉ）受信した信号を分析してサリチル酸メチルの有無及び／またはその濃度を決定する段階、並びに
ｉｉｉ）分析結果を出力する段階
を実行させるプログラム。
（付記１０）
（ｉ）亜鉛化合物と、サリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程、（ｉｉ）錯体に励起光をあてる工程、及び（ｉｉｉ）錯体が発する蛍光を検出する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法。
（付記１１）
励起光の励起波長として２００～４００ｎｍの範囲内の波長を用いる付記１０に記載の検出方法。
（付記１２）
検出された蛍光の強度をあらかじめ決められた参照値と比較することにより、サリチル酸メチルの濃度を決定する工程をさらに含む付記１０または１１に記載の検出方法。
（付記１３）
（ｉ）溶液中で亜鉛化合物と、サリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程、（ｉｉ）一定の電圧下で溶液に流れる電流を測定する工程、及び（ｉｉｉ）錯体の形成により生じる電流値の変化を検出する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法。
（付記１４）
電圧の値が－１～２Ｖの範囲内である付記１３に記載の検出方法。
（付記１５）
溶液が、支持電解質として、テトラブチルアンモニウムパークロレートを含む付記１３または１４に記載の検出方法。
（付記１６）
検出された電流値の変化をあらかじめ決められた参照値と比較することにより、サリチル酸メチルの濃度を決定する工程をさらに含む付記１３～１５のいずれか一項に記載の検出方法。
（付記１７）
亜鉛化合物が酢酸亜鉛（ＩＩ）、ぎ酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、酪酸亜鉛（ＩＩ）、しゅう酸亜鉛二水和物、ヘキサン酸亜鉛（ＩＩ）、プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）、酒石酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、安息香酸亜鉛（ＩＩ）、オクタン酸亜鉛（ＩＩ）、オレイン酸亜鉛（ＩＩ）、硝酸亜鉛（ＩＩ）及び塩化亜鉛（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物である付記１０～１６のいずれか一項記載の検出方法。
（付記１８）
サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、（ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、（ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを光学的に検出する検出部を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサー。
（付記１９）
光学的な検出部が、少なくとも励起光源と検出素子とを含む付記１８に記載のサリチル酸メチルセンサー。
（付記２０）
サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、（ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、（ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを電気化学的に検出する検出部を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサー。
（付記２１）
電気化学的な検出部が、亜鉛化合物とサリチル酸メチルが形成する錯体の酸化により生じる電流を検出する電極を有する電気化学セルを含む付記２０に記載のサリチル酸メチルセンサー。
（付記２２）
付記８および１８～２１のいずれか一項に記載のサリチル酸メチルセンサーを農作物の近傍に設置し、該サリチル酸メチルセンサーによりサリチル酸メチルを検出することにより農作物の病原菌感染を検出する方法。
（付記２３）
該センサーを農作物から２ｍ以内に設置することを特徴とする、付記７または付記２２に記載の農作物の病原菌感染を検出する方法。

この出願は、２０２１年３月２４日に出願された日本出願特願２０２１－０４９７８９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

以上、実施形態及び実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態及び実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

本発明の実施形態による亜鉛化合物を植物ホルモンであるサリチル酸メチルを検出するレセプターに用いたセンシングは、サリチル酸メチルと選択的に錯体を形成し、且つ蛍光発光現象や電気化学的挙動の変化を発現することから、植物が病原菌感染の際に放出する植物ホルモンであるサリチル酸メチルを選択的に検出することを可能とする。
そして、亜鉛化合物を認識部とするセンサーを用いることで、植物の病気感染を早期に検出することができ、具体的には農作物の病気感染を早期に検出できるセンサーとしてハウス等の施設園芸での農業ＩＣＴ用の新たなセンサーとして利用することができる。

１サリチル酸メチルセンサー
２認識部
３検出部

Claims

サリチル酸メチルをセンシングする方法であり、サリチル酸メチルを選択的に認識するレセプターに亜鉛化合物を用いるセンシング方法。
前記亜鉛化合物が酢酸亜鉛（ＩＩ）、ぎ酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、酪酸亜鉛（ＩＩ）、しゅう酸亜鉛二水和物、ヘキサン酸亜鉛（ＩＩ）、プロピオン酸亜鉛（ＩＩ）、酒石酸亜鉛（ＩＩ）二水和物、安息香酸亜鉛（ＩＩ）、オクタン酸亜鉛（ＩＩ）、オレイン酸亜鉛（ＩＩ）、硝酸亜鉛（ＩＩ）及び塩化亜鉛（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一種の化合物である請求項１に記載のセンシング方法。
サリチル酸メチルが亜鉛化合物と反応して錯体を形成することで蛍光発光する現象を利用する請求項１または２に記載のセンシング方法。
亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応により電気化学的挙動が変化する現象を利用する請求項１または２に記載のセンシング方法。
亜鉛化合物とサリチル酸メチルの反応により生じる電流値の変化を利用する請求項４に記載のセンシング方法。
サリチル酸メチルを検出するサリチル酸メチルセンサーであって、
ｉ）亜鉛化合物を有するサリチル酸メチルの認識部と、
ｉｉ）該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを検出する検出部
を少なくとも備えているサリチル酸メチルセンサー。
前記検出部が、該認識部にサリチル酸メチルが認識されたことを、光学的に及び／又は電気化学的に検出する、請求項６に記載のサリチル酸メチルセンサー。
請求項６または７に記載のサリチル酸メチルセンサーを農作物の近傍に設置し、該サリチル酸メチルセンサーによりサリチル酸メチルを検出することにより農作物の病原菌感染を検出する方法。
（ｉ）亜鉛化合物と、サリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程、（ｉｉ）錯体に励起光をあてる工程、及び（ｉｉｉ）錯体が発する蛍光を検出する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法。
（ｉ）溶液中で亜鉛化合物と、サリチル酸メチルとを反応させて錯体を形成する工程、（ｉｉ）一定の電圧下で溶液に流れる電流を測定する工程、及び（ｉｉｉ）錯体の形成により生じる電流値の変化を検出する工程を含む、サリチル酸メチルの検出方法。