JP7619682B2 - Ｃｄ２２に特異的なヒト化抗体およびそれを用いたキメラ抗原受容体 - Google Patents

Description

本発明は、ＣＤ２２に特異的なヒト化抗体及びそれを用いたキメラ抗原受容体に関し、より具体的には、ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体、前記抗体又はＣＤ１９×ＣＤ２２抗体を含むキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、およびそれらを含むＢ細胞によって媒介される疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。

ＣＤ２２は、ＮＨＬ、急性リンパ球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、特に急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）を含むほとんどのＢ細胞性白血病およびリンパ腫で発現しています。

このようなＣＤ２２発現に関連する疾患などの治療または診断のためにＣＤ２２に特異的な抗体の開発がなされている。国際公開特許ＷＯ１９９８－０４１６４１号は、ＶＨ４４およびＶＬ１００位置にシステイン残基を有する組換え抗－ＣＤ２２抗体を開示し、国際公開特許ＷＯ１９９８－０４２３７８号には、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のための抗－ＣＤ２２抗体を開示している。

上記のような治療用抗体を作製するために、通常はマウスを用いてモノクローナル抗体を作製します。しかし、マウス由来のモノクローナル抗体などの非ヒト抗体は、人体では外来抗原とみなされ、免疫応答を誘発することや半減期が短いことから治療効果が限定的であるという問題がある。

上記の問題を解決するために、抗体の抗原に結合する領域のみを除いた残りの部分をヒト抗体に置換したヒト化抗体が開発されている。現在使用されているマウス抗体のヒト化抗体への置換方法としては、置換する抗体に対する最も類似したヒト抗体遺伝子を選定し、ＣＤＲ移植と呼ばれる方法でマウス抗体のＣＤＲ部位のみをヒト抗体ＣＤＲ位置に置換することである。このようなヒト化抗体は遺伝子の大部分をヒト化したため、人体内での免疫反応を減らすことができる利点がある。

一方、Ｂ細胞の疾患や障害、自己免疫疾患、移植拒絶反応などの治療のために、上記の様々なＢ細胞表面マーカー（抗原）に特異的な抗体が開発されており、ＣＤ２２抗原に加えて、ＣＤ１９は標的として一般的に使用される抗原であり、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の臨床研究も大幅に進んでいます。しかし、ＣＤ１９を発現していない白血病等細胞によって標的抗原発現量に差があり、１つの抗原のみを標的とする単一ＣＡＲまたは単一ＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、腫瘍細胞の免疫回避戦略により標的抗原が失われるなどの問題が発生する可能性があります。実際、Ｂ細胞ＡＬＬ（急性リンパ球白血病）患者では、ＣＤ１９を発現しなかったＣＤ１９陰性再発が観察され（ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法に最初に反応したＢ細胞ＡＬＬ患者の最大２５％）、この現象はＣＡＲ－Ｔ細胞治療に対する腫瘍細胞の抵抗器前に発見された（Maude、S.L.、et al.、N. Engl. J. Med.、378:439-448、2018）．

この問題を解決するために、二重または複数の抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞が研究されており、同時に２つの抗原を標的とすることで、抗原喪失変異体の可能性を減らすことができる。

本発明では、人体内で免疫反応を減らすためにＣＤ２２に結合する抗体を選択し、これを用いてヒト化抗－ＣＤ２２抗体を作製し、本発明のヒト化抗ＣＤ２２抗体を用いてＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体およびＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。

さらに、ＣＤ２２のみならずＣＤ１９を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（Ｂｉｖａｌｅｎｔ ＣＡＲまたはＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＡＲ）および二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製し、本発明で製造したＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞および二重特異的ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体が正常に発現することを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、ＣＤ２２に特異的なヒト化抗体、前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記抗体を発現するベクター、および前記ベクターで形質転換された組換え細胞を提供することである。

本発明の別の目的は、前記ＣＤ２２に特異的なヒト化抗体を含むキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含むキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を提供することである。

本発明の別の目的は、ＣＤ１９およびＣＤ２２に特異的な抗体を含む二重特異性キメラ抗原受容体、前記二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む二重特異性キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を提供することである。

本発明の他の目的は、前記免疫エフェクター細胞を含む、Ｂ細胞によって媒介される疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することにある。

上記目的のうちの一つの目的を達成するために、
本発明は、配列番号１１のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；または、配列番号１５のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；を含むＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片を提供する。

さらに、本発明は、前記ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。

または、本発明は、前記ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

さらに、本発明は、前記ベクターで形質転換されたＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片を産生する組換え細胞を提供する。

別の目的を達成するために、
本発明は、ＣＤ２２結合ドメイン；膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；共刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）；および細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；を含む、キメリック抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）であって、
ここで、前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号１１のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；または、配列番号１５のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；を含む、ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であることを特徴とする、ＣＤ２２を標的とするキメリック抗原受容体を提供する。

本発明の好ましい例示的な実施形態では、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２およびＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質であり得、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０およびＩＣＯＳからなる群から選択されるタンパク質であり得、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来であり得る。

本発明の好ましい例示的な実施形態では、前記結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間にヒンジ領域をさらに含むことができ、ヒンジ部位はＣＤ８α由来である場合もある。

さらに、本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

さらに、本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

さらに、本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含み、キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を提供する。

別の目的を達成するために、
本発明は、ＣＤ１９結合ドメインおよびＣＤ２２結合ドメイン；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位；及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で示されるＣＤＲ２領域、および配列番号６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片；を含むＣＤ２２に特異的に結合する抗体またはその断片であることを特徴とする、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体を提供する。

本発明の好ましい例示的な実施形態において、前記ＣＤ１９結合ドメインとＣＤ２２結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域－ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領の順に連結され得る。

本発明の別の好ましい例示的な実施形態において、前記ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位は、配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含むことができ、好ましくは、配列番号４８のアミノ酸配列で表すことができる。

本発明のさらに別の好ましい例示的な実施形態では、前記ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位は、配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域および配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含むことができ、好ましくは配列番号４７のアミノ酸配列で表すことができる。

本発明のさらに別の好ましい例示的な実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２およびＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質であり得、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、およびＩＣＯＳからなるグループであり得、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来に由来であり得る。

本発明の好ましい例示的な実施形態では、前記結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間にヒンジ領域をさらに含むことができ、ヒンジ部位はＣＤ８α由来である場合もある。

さらに、本発明は、前記二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

さらに、本発明は、前記二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

さらに、本発明は、前記二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含み、二重特異性キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を提供する。

別の目的を達成するために、
本発明は、前記ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片；または前記免疫エフェクター細胞；を含む、Ｂ細胞が介在する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。

本発明の好ましい例示的な実施形態では、前記Ｂ細胞によって媒介される疾患が、腫瘍、リンパ腫、非ホッキンスリンパ腫（ｎｏｎ－ Ｈｏｇｋｉｎｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＮＨＬ）、攻撃的ＮＨＬ、再発性攻撃的ＮＨＬ、再発性遅延性ＮＨＬ、不応性ＮＨＬ、不応性遅延性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小型リンパ性リンパ腫、白血病、毛髪細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＬＬ）、バーキットリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群から選択することができる。

本発明では、ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体を作製し、これを用いてＣＤ２２を標的とする単一のＣＡＲ－Ｔ細胞、およびＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。

本発明で作製したＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞および二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本発明において、ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体に基づいて作製されたＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞および二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２２抗原を効果的に認識してＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化がなされたことを確認し、ＣＤ２２を発現する細胞を効果的に死滅させることを確認した。

さらに、本発明の二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は動物モデルにおいて優れた抗腫瘍効果を示すことが確認されたので、本発明のＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞および二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２２（または、ＣＤ１９）発現に関連する疾患、またはＢ細胞に関連する疾患の予防または治療用組成物として有用に利用することができる。

図１は、本発明で選択された２Ｇ１抗体及びヒト化２Ｇ１抗体のＣＤ２２に対する結合力をＦＡＣＳにより確認したデータを示す。
図２は、ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体（ｓｉｎｇｌｅ ＣＡＲ）を示す模式図である。
図３は、ＣＤ２２－ＣＡＲ発現レンチウイルスを用いたＣＤ２２－ＣＡＲ発現細胞の作製方法を示す模式図である。
図４は、（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞株をＣＤ２２－ＣＡＲ発現レンチウイルスで形質転換する方法、および（Ｂ）形質転換したＨＥＫ２９３細胞のＣＤ２２ペプチドに対する結合能を確認する方法を示す模式図である。
図５は、ヒト化抗ＣＤ２２抗体である２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）ベースのＣＤ２２－ＣＡＲを発現するレンチウイルスで形質転換されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＣＤ２２－ＣＡＲの発現レベルを確認するデータを示す。
図６は、ＣＤ２２－ＣＡＲ発現レンチウイルスを用いたＣＤ２２－ＣＡＲＴ細胞の作製方法を示す模式図である。
図７は、（Ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＣＤ２２－ＣＡＲＴ細胞の作製方法、（Ｂ）作製したＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２２ペプチドに対する結合能の確認方法を示す模式図である。
図８は、ヒト化抗ＣＤ２２抗体である２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２２結合能力を確認するデータを示す。
図９は、ヒト化抗ＣＤ２２抗体である２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＵ２９３２細胞（ＣＤ２２発現細胞）およびＫ５６２細胞（ＣＤ２２非発現細胞）に対するアポトーシス効果を確認するデータを示す。
図１０は、ヒト化抗ＣＤ２２抗体である２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＮＡＬＭ６細胞（ＣＤ２２発現細胞）およびＫ５６２細胞（ＣＤ２２非発現細胞）に対するアポトーシス効果を確認するデータを示す。
図１１は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（二重特異性ＣＡＲ）を示す模式図である。
図１２は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲを発現するレンチウイルスを用いてＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ ＣＤ１９発現細胞を作製する方法を示す模式図である。
図１３は、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３およびヒト化抗ＣＤ２２抗体２Ｇ１（Ｖ４）ベースのＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲを発現するレンチウイルスで形質転換されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＣＤ１９×ＣＤ２２（Ｖ４）－ＣＡＲの発現レベルを確認するデータを示す。
図１４は、抗ＣＤ１９抗体およびヒト化抗ＣＤ２２抗体２Ｇ１（Ｖ１２）ベースのＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ（Ｖ１２）を発現するレンチウイルスで形質転換されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＣＤ１９×ＣＤ２２（Ｖ１２）－ＣＡＲの発現レベルを確認するデータを示す。
図１５は、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲを発現するレンチウイルスを用いてＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する方法を示す模式図である。
図１６は、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を確認するデータを示す。
ＣＤ３＋ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ 細胞（Ｂ）、ＣＤ８＋ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃ）では、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ２２ペプチドおよびＣＤ１９ペプチドと同時に結合することが確認された。
図１７は、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を確認するために、標的細胞の存在下で（Ａ）抗ＣＤ１９抗体およびマウス２Ｇ１抗体ベースのＣＤ１９×ＣＤ２２（マウス）－ＣＡＲ－Ｔ細胞、（Ｂ）抗ＣＤ１９抗体および２Ｇ１（Ｖ４）抗体ベースのＣＤ１９×ＣＤ２２（Ｖ４）－ＣＡＲ－Ｔ細胞、および（Ｃ）抗ＣＤ１９抗体および２Ｇ１（Ｖ１２）抗体ベースのＣＤ１９×ＣＤ２２（Ｖ１２）－ＣＡＲ－Ｔ細胞、によるＩＦＮγの発現レベルを確認するデータを示す。
図１８は、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞による（Ａ）ＮＡＬＭ６細胞（ＣＤ１９とＣＤ２２発現細胞）、（Ｂ）Ｋ５６２細胞（ＣＤ１９とＣＤ２２未発現細胞）、Ｋ５６２／ＣＤ１９＋細胞（ＣＤ１９発現細胞）、Ｋ５６２／ＣＤ２２＋細胞（ＣＤ２２発現細胞）、Ｋ５６２／ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋細胞（ＣＤ１９とＣＤ２２発現細胞）の死滅効果を確認したデータである。
図１９は、ＣＤ１９×ＣＤ２２（Ｖ４）－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を確認するために、（Ａ）マウスに注入したＮＡＬＭ６／Ｌｕｃ細胞で発現する発光をＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴで撮影し、（Ｂ）（Ａ）での実施した実験でマウスの生存率曲線で抗腫瘍効果を示したデータである。

以下、本発明を詳細に説明する。

ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体
本発明は、一態様において、配列番号１１のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；または、

配列番号１５のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；を含むＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片に関する。

本発明において、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体のものに対応するアミノ酸配列を所有および／または本明細書に開示されるようなヒト抗体を作製するための技術のうちの１つを使用して作製された抗体である。ヒト化抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合部分を含むヒト化抗体を特異的に排除する。

本発明において、抗体はモノクローナル抗体であり得る。本発明において、用語「モノクローナル抗体」はシングルクローン抗体またはモノクローン抗体とも呼ばれ、単一抗体形成細胞が産生する抗体であり、一次構造（アミノ酸配列）が均一な特徴がある。ただ一つの抗原決定基のみを認識し、一般にがん細胞と抗体産生細胞を融合したハイブリドーマ細胞を培養して産生されるが、確保された抗体遺伝子配列を用いて他の組換えタンパク質発現宿主細胞を用いて生産することもできる。また、上記抗体は、必要に応じてＣＤＲ部分を除いた残りの部分をヒト化して用いることもできる。

本明細書で使用される「ＣＤＲ」、すなわち「相補性決定領域」という用語は、重鎖領域および軽鎖領域の両方の可変領域に見られる非連続の抗原結合部位を指す。

本発明において、用語「抗体」は、２つの全長の軽鎖および２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の断片（断片）も使用することができる。抗体分子の断片とは、少なくともペプチドタグ（エピトープ）結合機能を保持している断片を意味し、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）などを含む。

抗体断片のうちＦａＢは、軽鎖と重鎖の可変領域と、軽鎖の定常領域と重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）を有する構造の抗原結合部位を１つ有する。ＦａＢ’は、ＦａＢ’が重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点でＦａＢとは異なる。Ｆ（Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、ＦａＢ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成する間に産生されます。Ｆｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体断片であり、二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）はジスルフィド結合によって軽鎖可変領域と連結された重鎖可変領域を有し、単鎖Ｆｖは（ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して共有結合により軽鎖可変領域に連結された重鎖可変領域を有する。このような抗体断片は、タンパク質分解酵素を用いて得ることができ、または好ましくは遺伝子組換え技術によって構築することができる。

本発明のＣＤ２２に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ＣＤ２２タンパク質の全部または一部のペプチドを免疫原（または抗原）として利用して調製することができる。より具体的には、まず免疫原としてＣＤ２２、ＣＤ２２タンパク質を含む融合タンパク質、またはＣＤ２２タンパク質を含むキャリアを必要に応じて免疫増強剤であるアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、ヒト以外の哺乳動物の皮下、筋肉、静脈、イントラフットパッド、または腹腔内に１回以上の注射により免疫感作をさせる。ヒト以外の哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマまたはウシ（ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスなどの他の動物由来の抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物を含む）であり、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、鶏やウサギである。最初の免疫から約１～２１日ごとに１～４回免疫を行い、最終免疫から約１～１０日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生する細胞を得ることができる。免疫をさせる回収及び時間的間隔は、使用する免疫原の特徴等により適宜変更することができる。

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の製造は、ケイラおよびミルシュタインなどの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、Ｖｏｌ。２５６、ｐ．４９５－４９７）およびそれに準ずる方法に従って行うことができる。上記のように免疫感作されたヒトを除く動物から採取した脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃からなる群から選択されるいずれか、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生する細胞と自己抗体産生能力のない哺乳動物由来の骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）を細胞融合させることによりハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を製造することができる。哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギまたはヒトであり得、好ましくはマウス、ラット、ニワトリまたはヒトであり得る。

細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを含む融合促進剤や電気パルスによる方法が用いられ、例えば、融合促進剤を含む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を約１：１～１：１０の割合で浮遊させ、この状態で、約３０～４０℃で約１～５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコブ修飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を含む通常の一般的なものを用いるとよく、ウシ血清などの血清流は除いておくことが好ましい。

前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンをスクリーニングする方法は、まず、上記のように取得した融合細胞をＨＡＴ培地などの選択用培地に移し、約３０～４０℃で約３日～３週間培養して、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。続いて、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）等でハイブリドーマを培養した後、上述したヒトを除く動物の免疫反応に用いた免疫原と培養上清との反応性が増加した部分をＲＩＡ（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ－ｍａｒｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ＬｉＮＫｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）などのイムノアッセイ方法を用いて見つける方法によって行うことができる。そして、上記で見つけたモノクローナル抗体を産生するクローンは、前記免疫原に対して特異的な結合力を示す。

本発明のモノクローナル抗体は、このようなハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳動物由来の細胞を培養するための通常の方法が用いられ、培養物などからモノクローナル抗体を採取するためには、抗体一般を精製するためのこの分野における通常の方法が用いられる。それぞれの方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動等電点電気泳動などが挙げられ、これらは必要に応じて組み合わせて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮、乾燥し、用途に応じて液相または固相とする。

また、本発明のモノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、重鎖及び軽鎖の正常領域をコードする既知のＤＮＡ（例えば、特開２００７－２５２３７２号公報）号公報参照）とそれぞれ連結した遺伝子を、ＰＣＲ法、または、化学合成により合成し、その遺伝子の発現を可能にする公知の発現ベクター（ｐＣＤＮＡ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社販売）等に移植して形質転換体を製造し、ＣＨＯ細胞や大腸菌などの宿主中で発現させることにより抗体を産生し、このような培養液から、タンパク質ＡまたはＧカラムなどを用いて抗体を精製することにより得ることができる。

本発明の特定の例示的な実施形態では、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体を作製するために、抗ＣＤ２２抗体を産生するハイブリドーマを作製およびスクリーニングすることにより、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体（ｓｃＦｖ）を選択し、２Ｇ１と命名した。

２Ｇ１抗体は、配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＦＳＬＴＳＹＤＩ）、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＷＴＧＧＧＴ）及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＶＰＨＹＹＧＹＡＭＤＹＷ）を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＤＩＮＫＹ）、配列番号５のアミノ酸および配列番号６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＬＱＹＤＮＬＬＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。

具体的には、前記２Ｇ１抗体は、配列番号７のアミノ酸で表される重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸で表される軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は配列番号９の塩基配列によりコードされ、軽鎖可変領域は配列番号１０の塩基配列によりコードされることが確認された。

本発明の別の特定の実施形態では、抗ＣＤ２２抗体２Ｇ１をヒトに相当する構造に改変したヒト化抗体を作製し、２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）と命名した。

前記２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）の重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲは２Ｇ１と同様であり、ＣＤＲ部分を除く残りの部分はヒト化された。好ましくは、２Ｇ１（Ｖ４）は、配列番号１１のアミノ酸配列で表される重鎖可変部位と配列番号１２のアミノ酸配列で表される軽鎖可変部位から構成され、２Ｇ１（Ｖ１２）抗体の重鎖可変部位は配列番号１３の塩基配列に、軽鎖可変部位は配列番号１４の塩基配列にコードされ得る。

または、２Ｇ１（Ｖ１２）は、配列番号１５のアミノ酸配列で表される重鎖可変部位と配列番号１６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変部位から構成され、２Ｇ１（Ｖ１２）抗体の重鎖可変部位は配列番号１７の塩基配列に、軽鎖可変部位は配列番号１８の塩基配列にコードされ得る。

本発明のＣＤ２２特異的抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結できるように遺伝子組換え技術により構築することができる。リンカーは、好ましくは、配列番号１９のアミノ酸で表されるか、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２の塩基配列によってコードされ得るが、これらに限定されない。

軽鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域として連結される場合、２Ｇ１抗体（マウス抗体）は、配列番号２３のアミノ酸配列で表されてもよいし、配列番号２４の塩基配列としてコードされてもよく、２Ｇ１（Ｖ４）抗体は配列番号２５のアミノ酸配列で表されてもよいし、配列番号２６の塩基配列としてコードされてもよく、２Ｇ１（Ｖ１２）抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列で表されてもよく、または配列番号２８の塩基配列でコードされてもよい。

別の局面において、本発明は、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明において、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、任意の長さに単離された核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、
（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などのインビトロ増幅；
（２）クローニングおよび組換え；
（３）切断およびゲル電気泳動分離などの精製；
（４）化学合成などの合成；によって製造することができ、好ましくは単離されたポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ技術によって製造される。本発明において、抗体またはその抗原結合断片をコードするための核酸は、合成オリゴヌクレオチドの制限断片操作（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）またはＳＯＥ ＰＣＲの適用を含むがこれらに限定されず、当技術分野で公知の様々な方法により、製造することができる。

さらに別の局面において、本発明は、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターで形質転換された組換え細胞に関する。

本発明において、「ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、適切な宿主細胞内で目的遺伝子が発現できるように、プロモーターなどの必須の調節要素を含む遺伝子調製物である。ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターのうちの１つ以上から選択することができる。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは無関係に複製および機能することができ、または場合によってはゲノム自体に組み込むことができる。

さらに、ベクターは、コード領域が適切な宿主において正確に発現されることを可能にする発現制御要素を含み得る。そのような調節要素は当業者に周知であり、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子転写またはｍＲＮＡ翻訳を調節するための他の調節要素を含み得る。発現制御配列の特定の構造は、種または細胞型の機能に応じて変わり得るが、通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などの転写開始および翻訳開始にそれぞれ関与する５’非－転写配列、および５’または３’非翻訳配列を含む。例えば、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸を転写および制御するためのプロモーター配列を含み得るプロモーター領域を含み得る。

本発明において、用語「プロモーター」は、転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。さらに、細胞型特異的または外部のシグナルまたは制裁によって誘導される調節可能なプロモーター依存性遺伝子を発現させるのに十分なプロモーター構成を含めることができ、そのような構成は遺伝子の５’または３’部分に配置することができる。保存的プロモーターと誘導的プロモーターの両方が含まれる。プロモーター配列は、原核生物、真核生物またはウイルスに由来し得る。

本発明において、「形質転換体」という用語は、１つ以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するベクターが宿主細胞に導入されて形質転換された細胞を意味し、発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造する方法としては文献（Sambrook、J.、et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(2版)、Cold Spring Harbor Laboratory、1.74、1989）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カンシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などを用いる方法などがある。

前記ベクターが発現される形質転換体を栄養培地で培養すると、抗体タンパク質を大量に製造、分離可能である。培地と培養条件は、宿主細胞によって慣用されるものを適宜選択して用いることができる。培養時の細胞の生育とタンパク質の大量生産に適するように、温度、培地のｐＨ、培養時間などの条件を適切に調節しなければならない。

本発明によるベクターは、抗体の産生のために宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞に形質転換することができる。完全なグリコシル化タンパク質を発現できる適切な宿主細胞株の数は当分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）およびＢＳＣ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８６５３、ＳＰ２／０－Ａｇｌ４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを含み、これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から容易に利用可能である。好ましい宿主細胞は、黒色腫およびリンパ腫細胞などのリンパ球起源の細胞を含む。

ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体
本発明は、他の観点から、
ＣＤ２２結合ドメイン；膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメリック抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）で、
前記ＣＤ２２結合ドメインが、配列番号１１のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；または、配列番号１５のアミノ酸で表される重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸で表される軽鎖可変領域；を含むＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であることを特徴とする、ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体に関する。

本発明において、用語「キメリック抗原受容体（ＣＡＲ）」は、一般に、抗原および１つ以上の細胞内ドメインと結合する能力を有する細胞外ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＣＡＲはキメリック抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の重要な部分であり、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲは、抗体の抗原（例えばＣＤ２２）特異性に基づいてＴ細胞受容体－活性化細胞内ドメインと組み合わせることができる。遺伝子改変されたＣＡＲ発現Ｔ細胞は、標的抗原発現悪性細胞を特異的に同定し除去することができる。

本発明において、「ＣＤ２２結合ドメイン」という用語は、一般にＣＤ２２タンパク質に特異的に結合することができるドメインを指す。例えば、ＣＤ２２結合ドメインは、Ｂ細胞で発現されたヒトＣＤ２２ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合することができる抗ＣＤ２２抗体またはその断片を含み得る。

本発明において、用語「結合ドメイン」は、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」は互換的に使用することができ、標的抗原（例えばＣＤ２２）に特異的に結合する能力を有するＣＡＲドメインまたは断片をという。

本発明において、前記抗ＣＤ２２抗体またはその断片は、上述の抗ＣＤ２２抗体であり、モノクローナル抗体（モノクローナル抗体）、好ましくはｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。具体的には、抗ＣＤ２２抗体またはその断片は、本発明のＣＤ２２に特異的なヒト化抗体である２Ｇ１（Ｖ４）または２Ｇ１（Ｖ１２）抗体を用いて調製することができる。

本発明において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ２２結合ドメインに加えてＢ細胞表面マーカー結合ドメインをさらに含む二重特異性キメラ抗原受容体であってもよく、Ｂ細胞表面マーカーは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５またはＣＤ８６であり得、好ましくはＣＤ１９であり得る。

本発明において、ＣＤ２２結合ドメインのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含むことができ、前記「シグナルペプチド」は一般にタンパク質送達を誘導するためのペプチド鎖を指す。

シグナルペプチドは、５～３０のアミノ酸長を有する短いペプチドであり得、本発明では、好ましくは配列番号３６のアミノ酸配列を好ましく用いた。

本発明において、ＣＤ２２結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジ領域をさらに含むことができ、ヒンジ部位はＣＤ８α由来であり、好ましくは配列番号３７のアミノ酸配列で表すことができる。

前記「ヒンジ領域」は、一般に、抗原結合領域と免疫細胞Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合領域との間の結合領域を指す。

本発明において、「膜貫通ドメイン」とは、一般に細胞膜を通過し、細胞内シグナル伝達ドメインに連結されてシグナル伝達の役割を果たすＣＡＲのドメインを指す。膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２およびＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質に由来し得、好ましくは配列番号３８のアミノ酸配列で表され得る。

本発明において、「共刺激ドメイン」とは、一般に、リンパ球の抗原に対する効果的な反応に必要な細胞表面分子である免疫刺激分子を提供することができる細胞内ドメインを指す。上記の共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインを含み、ＯＸ４０および４－１ＢＢの共刺激ドメインなどのＴＮＦ受容体ファミリーの共刺激ドメインを含むことができ、好ましくは配列番号３９のアミノ酸配列で表される４－１ＢＢであり得る。

本発明において、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、一般に、細胞内に位置し、シグナルを伝達することができるドメインを指す。本発明において、細胞内シグナル伝達ドメインはキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインである。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＯＸ４０細胞内ドメインから選択することができ、好ましくは配列番号４０のアミノ酸配列で表されるＣＤ３ζであり得る。

キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドおよびキメラ抗原受容体発現ベクター
本発明はさらに別の観点から、キメリック抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明において、キメリック抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；共刺激ドメインをコーティングするポリヌクレオチド；細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド；を含み得る。

前記ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＣＤ２２に特異的なヒト化２Ｇ１（Ｖ４）または２Ｇ１（Ｖ１２）抗体をコードするポリヌクレオチドであり得、軽鎖可変部位および重鎖可変部位がリンカーで連結されたｓｃＦｖの形態で、具体的な塩基配列は上述した通りである。

好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６の塩基配列によって表される２Ｇ１（Ｖ４）抗体または配列番号２８の塩基配列によって表される２Ｇ１（Ｖ１２）抗体；
配列番号３２の塩基配列で表される膜貫通ドメイン；
配列番号３３の塩基配列で表される４－１ＢＢ（共刺激ドメイン）；および
配列番号３４の塩基配列で表されるＣＤ３ζ（細胞内シグナル伝達ドメイン）；を含み得る。

ＣＤ２２結合ドメインのＮ末端にシグナルペプチドが含まれる場合、配列番号３０の塩基配列で表されるシグナルペプチドがさらに含まれていてもよい。または、ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をコードするポリヌクレオチドがさらに含まれていてもよく、好ましくは、配列番号３１の塩基配列で表されるＣＤ８ヒンジ領域であり得る。

さらに別の局面において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

本発明において、前記ベクターは組換えウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターであり、作動可能に連結されたＥＦ１αプロモーター；シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド；を含み、タンパク質の発現を増加させるためにＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）をさらに含み得る（図３）。

前記ＥＦ１αプロモーターは配列番号２９の塩基配列で表され、必要に応じて前記配列番号２７の塩基配列と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同じ配列を含み得る。

さらに、プロモーターは、ＣＤ２２結合ドメインである抗ＣＤ２２抗体（ｓｃＦｖ）の発現を誘導するように作動可能に連結されている。

本発明の特定の例示的な実施形態では、図３に示すように、ＣＤ２２－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを挿入したレンチウイルスベクターを作製し、作製したベクターで２９３ＦＴ細胞を形質転換してＣＤ２２－ＣＡＲ発現細胞を作製した。さらに、図５に示すように、作製したＣＤ２２－ＣＡＲ発現細胞において、ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体が発現していることが確認された。

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースシステムを含みます。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。核酸の最新技術の標的化送達、例えば、標的化ナノ粒子または他の適切なマイクロメータ未満の送達システムを用いたポリヌクレオチドの送達のための他の方法が利用可能である。

非－ウイルス送達システムが使用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロまたはインビボ）のために企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合することができる。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されるか、リポソームの脂質二重層に点在するか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに結合するか、リポソーム内に捕捉されるか、リポソームと複合体化されるか、脂質含有溶液中に分散させるか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質中に懸濁液として含有するか、ミセルと共に含有または複合体化するか、または脂質とは異なり会合することができる。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞
本発明はさらに別の観点から、ＣＤ２２に特異的なヒト化抗体ベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドまたはキメリック抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ＣＤ２２に特異的なヒト化抗体ベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞に関する。

本発明において、免疫エフェクター細胞は、哺乳動物由来の単離細胞、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単核細胞またはマクロファージであり得、より好ましくはＴ細胞である。

本発明において、キメリック抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞は、本発明のＣＡＲベクターを免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に導入することにより製造することができる。

具体的には、ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーション、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの当技術分野で公知の方法によって細胞に導入することができる。例えば、免疫エフェクター細胞をレンチウイルスベクターでトランスフェクトして、ＣＡＲ分子を運ぶウイルスゲノムを宿主ゲノムに組み込むことによって標的遺伝子の長期的かつ安定した発現を確実にすることができる。他の例では、転移因子を用いてＣＡＲ輸送プラスミドおよび転移酵素輸送プラスミドを標的細胞に導入することができる。他の例では、ＣＡＲ分子を遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によってゲノムに添加することができる。

キメリック抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞を調製するための免疫エフェクター細胞は、対象から得ることができ、「対象」は免疫応答を引き出すことができる生きている生物（例えば哺乳動物）を含む。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。

Ｔ細胞は、当業者に知られている多くの技術、例えばＦｉｃｏｌｌ（商標）単離を用いて対象から収集された血液単位から得ることができる。血液からの細胞は単離輸出によって得られ、単離輸出産物は典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。

分離エクスポートによって収集された細胞は、血漿画分を除去し、細胞をその後の処理工程のために適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄することができる。Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばパーコール（ＰＥＲＣＯＬＬ）^ＴＭ勾配による遠心分離によってまたは逆流遠心分離によって単球を枯渇させることによって末梢血リンパ球から単離される。

本発明のさらに別の特定の例示的な実施形態では、図６および図７に示すように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から活性化Ｔ細胞を単離した後、ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスをＴ細胞に導入してＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。具体的には、ヒト化２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）を用いてＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ調製した。

作製したＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を確認するために、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８を活性化したＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２２ペプチド結合能を確認しました。

図８に示すように、本発明で調製されたＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ２２ペプチドに結合することが確認された。

本発明のさらに別の特定の例示的実施形態では、ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞に対するアポトーシス効果を確認した結果、図９に示すように、ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｕ２９３２細胞およびＣＤ２２を発現するＮＡＬＭ６細胞に対して特異的にアポトーシス効果を示すことが確認された。

すなわち、本発明のヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２））ベースのキメラ抗原受容体およびそれを用いたＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞またはＣＤ２２発現に関連する疾患の予防または治療用組成物として有用に利用することができる。

ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
さらに別の局面において、本発明は、
ＣＤ１９結合ドメインおよびＣＤ２２結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
ここで、前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位；及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で示されるＣＤＲ２領域、および配列番号６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体またはその断片であることを特徴とする、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９×ＣＤ２２二重特異性ＣＡＲ）に関する。

本発明において、前記ＣＤ２２に特異的に結合する抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列で表される重鎖可変部位および配列番号８のアミノ酸配列で表される軽鎖可変部位からなる抗ＣＤ２２抗体であるか、または、配列番号１１のアミノ酸配列で表される重鎖可変部位および配列番号１２のアミノ酸配列で表される軽鎖可変部位；または配列番号１５のアミノ酸配列で表される重鎖可変部位および配列番号１６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変部位；からなるヒト化抗ＣＤ２２抗体であり得る。

本発明において、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）キメラ抗原受容体は、２つの異なる種類の抗原に同時に結合することができるＣＡＲであり、本発明において、好ましくは、ＣＤ１９およびＣＤ２２の両方を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体が調製され、ＣＤ１９結合ドメイン、任意の既知の抗ＣＤ１９抗体配列を制限なく使用することができる。

キメラ抗原受容体の具体的な内容は上記と同じであり、二重特異性キメラ抗原受容体のＣＤ１９結合ドメインおよびＣＤ２２結合ドメインは、図１１に示すようにループ（ＬｏｏｐＣＡＲ）形態で連結した。すなわち、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位（ＣＤ１９ＶＬ）－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位（ＣＤ２２ＶＨ）－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位（ＣＤ２２ＶＬ）－ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位（ＣＤ１９ＶＨ）の順序で連結することができる。

前記ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位は、配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含むことができ、好ましくは、配列番号４８のアミノ酸配列で表すことができる。

前記ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位は、配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含むことができ、好ましくは、配列番号４７のアミノ酸配列で表すことができる。

前記ＣＤ１９結合ドメイン及びＣＤ２２結合ドメインは、リンカーで連結できるように遺伝子組換え技術により作製することができ、好ましくはＣＤ１９ＶＬ及びＣＤ２２ＶＨ又はＣＤ２２ＶＬ及びＣＤ１９ＶＨは配列番号５１のアミノ酸配列で表されるリンカー（図１１のリンカー）で連結することができ、ＣＤ２２ＶＨ及びＣＤ２２ＶＬは、配列番号５４のアミノ酸配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）で連結することができるが、これに限定されず、抗体活性に影響を及ぼさない任意のアミノ酸配列からなる。ペプチドを使用することができる。

ＣＤ１９／ＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドおよびＣＤ１９／ＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体発現ベクター
さらに別の局面において、本発明は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明において、二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ１９結合ドメインをコードするポリヌクレオチドおよびＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；共刺激ドメインをコードするポリヌクレオチド；細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド；を含み得る。

好ましくは、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＣＤ１９ＶＬ；配列番号５０）－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域（ＣＤ２２ＶＨ；配列番号９、配列番号１３または配列番号１７）－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域（ＣＤ２２ＶＬ；配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８）－ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域（ＣＤ１９ＶＨ；配列番号４９）；
配列番号３２の塩基配列で表される膜貫通ドメイン；
配列番号３３の塩基配列で表される４－１ＢＢ（共刺激ドメイン）；および
配列番号３４の塩基配列で表されるＣＤ３ζ（細胞内シグナル伝達ドメイン）；を含み得る。

前記「ＣＤ１９ＶＬ及びＣＤ２２ＶＨ」又は「ＣＤ２２ＶＬ及びＣＤ１９ＶＨ」が配列番号５１のアミノ酸配列で表されるリンカーで連結される場合、前記リンカーのポリヌクレオチドは配列番号５２又は配列番号５３の塩基配列で表され得、「ＣＤ２２ＶＨ及びＣＤ２２ＶＬ」が配列番号５４のアミノ酸配列で表されるリンカーで連結される場合、前記リンカーに対するポリヌクレオチドは配列番号５５の塩基配列で表され得るが、これに限定されず、抗体活性に影響を及ぼさない任意のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。

ＣＤ１９／ＣＤ２２結合ドメインのＮ末端にシグナルペプチドが含まれる場合、配列番号３０の塩基配列で表されるシグナルペプチドがさらに含まれていてもよい。また、ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと膜貫通ドメインとの間に、ヒンジ領域をコードするポリヌクレオチドがさらに含まれていてもよく、好ましくは、配列番号３１の塩基配列で表されるＣＤ８ヒンジ領域であり得る。

さらに別の局面において、本発明は、二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

本発明の特定の実施形態では、ベクターは組換えウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターであり、作動可能に連結されたＥＦ１αプロモーター；シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＣＤ１９結合ドメインおよびＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド；を含み、タンパク質の発現を増加させるためにＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）をさらに含み得る（図１２）。

前記ＥＦ１αプロモーターは配列番号２９の塩基配列で表され、必要に応じて前記配列番号２７の塩基配列と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同じ配列を含み得る。

さらに、プロモーターは、ＣＤ１９×ＣＤ２２結合ドメインである抗ＣＤ１９／ＣＤ２２抗体（ＣＤ１９ＶＬ－ＣＤ２２ＶＨ－ＣＤ２２ＶＬ－ＣＤ１９ＶＨ）の発現を誘導するように機能的に連結されており、ベクター上の具体的な内容は上記の通りである。

本発明の特定の例示的な実施形態では、図１２に示すように、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを挿入したレンチウイルスベクターを作製し、作製したベクターで２９３ＦＴ細胞を形質転換してＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ発現細胞を作製した。さらに、図１３および図１４に示すように、作製したＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ発現細胞において、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性抗原受容体が発現していることが確認された。

ＣＤ１９×ＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞
さらに別の局面において、本発明は、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドまたは二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、前記二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞に関する。

本発明において、免疫エフェクター細胞は、哺乳動物由来の単離細胞、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単核細胞またはマクロファージであり得、より好ましくはＴ細胞である。または、キメラ抗原受容体発現免疫エフェクター細胞に関する具体的な内容は上記の通りである。

本発明の具体的な一実施形態では、ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞調製と同様の方法（図７）で末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）から活性化されたＴ細胞を分離した後、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスをＴ細胞に形質導入してＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、具体的には２Ｇ１抗体（ｍｏｕｓｅ）、ヒト化２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）を用いてＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ作製した。

作製したＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を確認するために、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８を活性化させたＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２２ペプチドとＣＤ１９ペプチドの結合能を確認しました。

図１６に示すように、本発明で作製したＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２２ペプチドとＣＤ１９ペプチドの両方に結合することが確認された。

本発明の別の特定の例示的な実施形態では、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を確認するために、標的細胞の存在下でＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮγの発現レベルを確認した。その結果、図１７Ａ～図１７Ｃに示すように、ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現しないＫ５６２細胞ではＴ細胞が活性化されないのに対し、ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現するＮＡＬＭ６細胞存在下ではＴ細胞が活性化され、ＩＦＮγの発現が上昇することが確認された。

本発明の別の特定の例示的な実施形態では、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞に対するアポトーシス効果を確認した結果、図１８に示すように、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を発現するＮＡＬＭ６細胞に対して特異的にアポトーシス効果を示すことが確認された。

さらに、本発明のさらに別の特定の例示的な実施形態では、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を確認するために、さらに、本発明の具体的な別の一実施形態では、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を確認するために、腫瘍細胞を異種移植したマウスモデルにヒト化された２Ｇ１－Ｖ４抗体を用いて製造したＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を腫瘍内注射した後、腫瘍サイズの変化を観察した。その結果、図１９に示すように、陽性対照群として使用したＳＶ４０ウイルスと結合する抗体ベースのパリビズマブ－ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、本発明のＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果が優れたことを確認し、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を５×１０^６個以上で処理した場合、腫瘍細胞がほとんど死滅して腫瘍組織が観察されなかったことを確認した。

すなわち、本発明のＣＤ１９×ＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体およびＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞またはＣＤ１９×ＣＤ２２発現に関連する疾患を予防または治療するための組成物として有用に使用され得る。

Ｂ細胞が介在する疾患またはＣＤ１９×ＣＤ２２の発現が介在する疾患を予防または治療するための組成物
本発明は、別の観点から、ＣＤ２２に特異的に結合するヒト化抗体、ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞、あるいは、ＣＤ１９×ＣＤ２２に特異的に結合する二重特異性キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を含む、Ｂ細胞によって媒介される疾患の予防または治療用医薬組成物に関する。

本発明において、Ｂ細胞は、好ましくは、ＣＤ１９またはＣＤ２２を発現する細胞であり得、疾患は、腫瘍／癌、リンパ腫、非ホッキンスリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｇｋｉｎｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＮＨＬ）、攻撃的ＮＨＬ、再発性攻撃的ＮＨＬ、再発性遅延性ＮＨＬ、不応性ＮＨＬ、不応性遅延性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小型リンパ性リンパ腫、白血病、毛髪細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ： ＡＬＬ）、バーキットリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群から選択することができる。

本発明において、組成物は、Ｂ細胞が介在する疾患の治療剤を含むことができ、治療剤は、ＣＤ１９またはＣＤ２２に特異的に結合する抗体と共有結合した状態で存在することができ、または本発明のＣＤ２２－ＣＡＲ免疫エフェクター細胞またはＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ免疫エフェクター細胞と併用投与することができる。

治療薬は、低分子薬物、ペプチド薬物、毒素（例えば細胞毒素）などを含む。

前記低分子薬物は目的の薬学的活性を示し、一般に分子量が約８００Ｄａ以下または２０００Ｄａ以下の化合物であり得る。無機低分子は炭素原子を１つも含まない分子を指し、一方、有機低分子は少なくとも１つの炭素原子を含有する化合物を指す。

前記ペプチド薬はポリマー化合物を含むアミノ酸を指し、これは天然および非天然ペプチド、オリゴペプチド、環状ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにペプチド模倣物を含む。ペプチド薬物は、化学合成によって得られてもよく、または遺伝的にコードされた供給源（例えば、組換え供給源）で生成されてもよい。ペプチド薬物の分子量の範囲は、２００Ｄａ～１０ｋＤａ以上であり得る。

前記毒素は好ましくは細胞毒素であり、細胞毒素には非限定的に、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素（例えば、ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、ＰＥ４０など）、サポリン、ゲルロニン、米国座空孔抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ボツリヌス毒素、ブリオジン、モモルジンおよびブガニンが含まれる。

さらに、治療薬は抗癌剤であり得る。抗癌剤は、癌細胞の増殖を減少させ、細胞傷害性薬剤および細胞増殖抑制剤を組み合わせた非ペプチド性（すなわち、非タンパク質系）化合物を含む。抗癌剤の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロソ要素、抗代謝物質、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイドおよびステロイドホルモンが含まれる。ペプチド性化合物も使用することができる。

前記医薬組成物中のＣＤ２２に特異的に結合する抗体、ＣＤ２２－ＣＡＲ免疫エフェクター細胞またはＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ免疫エフェクター細胞は、治療または診断用組成物内で唯一の活性成分であるか、または例えば抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗体などの他の抗体成分、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分と共に使用可能である。

医薬組成物は、治療的有効量の本発明の抗体を含むことが好ましい。本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、標的疾患または状態を治療、改善、または予防するのに必要な治療薬の量を意味し、または検出可能な程度の治療または予防効果を示すために必要な治療薬の量を指す。意味する。いくつかの抗体について、治療的有効投与量は、細胞培養アッセイまたは通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類などの動物モデルによって最初に決定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与ルートを決定するために使用することができる。そのような情報は、ヒトの投与に有用な投与量および根を決定するために使用することができる。

ヒト患者の正確な有効量は、疾患状態の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別、食事、投与時間、投与頻度、薬剤組成、反応感度および治療に対する耐性／反応に依存する。できる。量は従来の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、有効用量は０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇである。

組成物は患者に個別に投与することができ、または他の薬剤、薬剤またはホルモンと組み合わせて投与することができる。

本発明の抗体が投与される投与量は、治療される状態の性質、悪性リンパ腫または白血病のグレード、および抗体が疾患予防レベルで使用されるか、または存在する状態を治療するために使用されるかによって異なる。

投与頻度は、抗体分子の半減期、薬効の持続性に依存する。抗体分子が短い半減期（例えば、２～１０時間）を有する場合、１日当たり１回以上の用量を提供する必要がある。あるいは、抗体分子が長い半減期（例えば、２～１５日）を有する場合、１日に１回、１週間に１回、または毎月または２ヶ月あたり１回の用量を提供する必要がある。

さらに、医薬組成物は、抗体の投与のために薬学的に許容される担体を含有してもよい。担体は、それ自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を引き起こすべきではなく、毒性がないべきである。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポオソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの徐々に新陳代謝される高分子であり得る。

薬学的に許容される塩は、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などのミネラル酸塩、または酢酸、プロピオン酸である。マロン酸および安息香酸などの有機酸の塩を使用することができる。

治療組成物中の薬学的に許容される担体はさらに、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含み得る。さらに、湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在し得る。担体は、患者による医薬組成物の摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁剤として製剤化することができる。

投与のための好ましい形態は、例えば注射または注入（例えば、喪失注射または連続注入）による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注入または注射用である場合、油または水溶性賦形剤中の懸濁剤、溶液またはエマルジョンの形態をとることができ、これは懸濁剤、保存剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、抗体分子は無水形態であってもよく、使用前に適切な滅菌液で再構成されてもよい。

一旦製剤化されると、本発明の組成物は患者に直接投与することができる。治療を受ける患者は動物であり得る。しかしながら、組成物はヒト患者の投与のために適合することが好ましい。

本発明の医薬組成物は制限はないが、経口、静脈、筋肉内、動脈内、骨髄内、脊椎腔内、心室内、経皮、経皮（例えば、国際公開第９８／２０７３４号参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む任意の経路によって投与することができる。本発明の医薬組成物を投与するためにハイポスプレーを使用することができる。典型的には、治療用組成物は液体溶液または懸濁液として注射可能な材料として調製することができる。また、注入前に液体賦形剤内容液または懸濁液に適した固体形態を製造することができる。

組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射によって行うことができ、または組織の間質空間に送達することができる。さらに、組成物は創傷部位で投与することができる。用量処理は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。

組成物中の活性成分は抗体分子であり得る。それ自体、胃腸管内で分解に敏感である。したがって、組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、分解から抗体を保護するが消化管から吸収された抗体を放出する薬剤を一旦含む必要があるであろう。

薬学的に許容される担体の完全な議論は、レミントンの薬学科学（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＪ、１９９１）を利用することができる。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、以下の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、以下の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１：ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の作製と選択
ＣＤ２２ペプチドに特異的な抗体を選択するために、ＣＤ２２に結合する抗体を産生するハイブリドーマを作製し、抗体を選択した。

まず、ＣＤ２２タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃ＣＤ２－Ｈ５２Ｈ８、ＵＳＡ）を免疫して脾臓細胞を切り出し、マウスミエローマ細胞と細胞融合してハイブリドーマ細胞を作製した。

細胞融合に使用されるマウスミエローマ細胞は、ヒポキサンチン グアニジン－ホスホリボシル－トランスフォラーゼ（ＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅＧｕａｎｉｄｉｎｅ－Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＧＰＲＴ）遺伝子を持たないため、ＨＡＴ培地で生存できませんが、ハイブリドーマは脾臓細胞との融合によりＨＡＴ培地で生存できる。ＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマのみを増殖させることができるので、一般にハイブリドーマが確立するまでＨＡＴ培地で増殖させた。

増殖したハイブリドーマの中からＣＤ２２に結合する抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法により選択した。まず、細胞数を９６ウェル当たり１細胞以下となるようにした後、１つの細胞から増殖したクローンで得られた抗体がＣＤ２２と結合するかどうかをＥＬＩＳＡで確認し、ＣＤ２２と結合するクローンを選別した。上記のプロセスを３回繰り返し、ＣＤ２２に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。このようにしてＣＤ２２に結合する抗体を得た。

この抗体を２Ｇ１と命名し、これらの塩基配列とアミノ酸配列を解析した。配列解析結果による各抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報を下記表１に示し、表１中の下線部は相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味する。

実施例２：２Ｇ１抗体ベースのヒト化抗体の調製
実施例１で選択した２Ｇ１抗体をヒトに相当する構造に変更したヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製した。

具体的には、ヒト抗体の生殖系列配列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をフレームとして、ＣＤ２２に結合するマウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲに置き換えるＣＤＲ移植法により、マウス２Ｇ１抗体をヒト化抗体に構築した。ヒト化抗体を２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）と命名し、それらのアミノ酸配列を分析した。配列解析結果による抗体の重鎖可変領域、および軽鎖可変領域の配列情報を以下の表２および３に示し、表２および３中の下線部は相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味する。

実施例３：選択した抗体のＣＤ２２に対する特異性の確認
本発明では、実施例１の２Ｇ１抗体（マウス）、ヒト化２Ｇ１（Ｖ４）抗体および２Ｇ１（Ｖ１２）抗体のＣＤ２２に対する特異性を確認するためにフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を行った。

まず、ＣＤ２２を発現する非細胞リンパ腫Ｕ２９３２（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｕ２９３２ ｃｅｌｌ）細胞１×１０^６個を２Ｇ１抗体１μｇと３０分間反応させた後、二次抗体で表面を染色し、フローサイトメーターで測定した。

陽性対照としてＰＥ－コンジュゲーションされた抗ＣＤ２２抗体（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２２ ａｎｔｉｂｏｄｙ； Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃ ３０２５０６、米国） を陽性対照として使用し、二次抗体としてＰＥ－コンジュゲーションされた抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ； Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃ ４０５３０７，米国）を使用した。

その結果、図１に示すように、２Ｇ１抗体、ヒト化２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）抗体はいずれもＣＤ２２発現細胞に特異的に結合することが確認された。

実施例４：ＣＤ２２を標的としたキメラ抗原受容体（ＣＤ２２－ＣＡＲ）発現ベクターの構築
本発明では、実施例２で作製したヒト化２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）抗体を用いて、ＣＤ２２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター（ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルス）を構築した。

図３の模式図に示すように、
ＥＦ１αプロモーター（配列番号２９）；
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）；
ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号：２６で表される２Ｇ１－Ｖ４または、配列番号：２８で表される２Ｇ１－Ｖ１２）；
ＣＤ８ヒンジ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号：３１）；
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３２）；
４－１ＢＢ（共刺激ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号：３３）；
ＣＤ３ζ（細胞内シグナル伝達ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号：３４）；および
ＷＰＲＥをコードするポリヌクレオチド（配列番号：３５）；からなるＣＡＲ ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、第３世代レンチウイルスベクターに挿入した。

レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターは、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｃａｔ＃＃１２２５１）ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｃａｔ＃＃１２２５９）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｃａｔ＃＃１２２５３）の３つのベクターと共にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に共感染（ｃｏ －トランスフェクション）した後、ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスを産生した。共感染のために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃Ｌ３０００－０１５）とＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃５１９８５－０３４）培地を用いて３つのベクターとＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を４時間培養した。

レンチウイルスベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＦＴにおいてＣＤ２２特異的なＣＡＲが発現されることを確認した結果（図４Ｂ）、図５に示すように、抗ＣＤ２２抗体発現が正常に行われることを確認した。

実施例５：ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
本発明では、上記実施例４で製造したＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質転換してヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）及び２Ｇ１（Ｖ１２））ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ作製した。

具体的には、図７に示す模式図のように、血液から末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離した後、Ｔ細胞活性化ビーズ（Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｅａｄ； Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ、ｃａｔ＃１３０－０９１－４４１））を用いてＴ細胞を活性化した。活性化Ｔ細胞に上記実施例５で製造したＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスをＴ細胞に形質導入してＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。

ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２２ペプチド結合能はフローサイトメトリー法により確認した。上記で調製したＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞（２Ｇ１－Ｖ４および２Ｇ１－Ｖ１２）を抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８抗体を用いてＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８が活性化されたＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞でそれぞれ分類した後、ＦＩＴＣ－ＣＤ２２ペプチドと反応させた後、ＦＡＣＳ機を用いて蛍光強度を測定した。

その結果、図８に示すように、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８が活性化されたＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞ともＣＤ２２ペプチドと結合することを確認した。

実施例６：ＣＤ２２発現細胞に対するＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシス効果の確認
本発明では、ヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２））ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の死滅効果を確認した。

標的細胞としてＣＤ２２を発現しないＫ５６２細胞（ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）とＣＤ２２を発現するＵ２９３２細胞（Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）およびＮＡＬＭ６細胞（ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ）を用い、ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞と１：４、１：２、１：１、１：０．５、１：０．２５の比率になるようにそれぞれ混合して８時間インキュベートした後、ルミネセンス（ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、 ｃａｔ． ＮＯ Ｇ９２９１）を測定した。測定した値として下記式（１）を用いてアポトーシスの程度を計算した。

［数式１］
％ 細胞毒性＝［（実験的－エフェクター自発－ターゲット自発）／（ターゲットの最大－ターゲット自発）］×１００
・実験的（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）：標的細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞複合培養の培地から導出された発光値
・エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）：ＣＡＲ－Ｔ細胞のみの培地から導出された発光値
・ターゲット自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）：標的細胞のみの培地から導出された発光値
・ターゲットの最大（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）：標的細胞の１００％溶解（溶解試薬（Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）利用）から導出された発光値

その結果、図９および図１０に示すように、ヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２））ベースのＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２２を発現するＵ２９３２細胞およびＮＡＬＭ６細胞を特異的で死滅させることを確認した。

本発明では、上記実験により、ヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）及び２Ｇ１（Ｖ１２））に基づくＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞により、下垂性巨大Ｂ細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）由来Ｕ２９３２細胞及び急性リンパ球性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）由来のＮＡＬＭ６細胞を特異的に死滅させることを確認した。

すなわち、本発明のヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２））ベースのキメラ抗原受容体およびそれを用いたＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞またはＣＤ２２発現に関連する疾患予防または治療用組成物として有用に利用することができる。

実施例７：ＣＤ１９／ＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体発現ベクターの構築
上記実施例４と同様にして、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクター（ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルス）を作製した。

図１１の模式図に示すように、
ＥＦ１αプロモーター（配列番号２９）；
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）；
ＣＤ１９／ＣＤ２２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；
ＣＤ８ヒンジ部位をコードするポリヌクレオチド（配列番号３１）；
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号３２）；
４－１ＢＢ（共同刺激ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３３）；
ＣＤ３ζ（細胞内シグナル伝達ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３４）；と
ＷＰＲＥをコードするポリヌクレオチド（配列番号３５）；からなるＣＡＲ ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、第３世代レンチウイルスベクターに挿入した。

本発明では、ＣＤ１９結合ドメインは公知の抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）を用い、ＣＤ２２結合ドメインは本発明の２Ｇ１抗体、２Ｇ１（Ｖ４）抗体および２Ｇ１（Ｖ１２）抗体を用いた。

ＣＤ１９×ＣＤ２２結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位（ＣＤ１９ＶＬ）－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位（ＣＤ２２ＶＨ）－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位（ＣＤ２２ＶＬ）－ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位（ＣＤ１９ＶＨ）に順に連結し（ＬｏｏｐＣＡＲ）、それらをコードするポリヌクレオチドの配列情報は以下の通りである：
ＣＤ１９×２Ｇ１：配列番号５０の塩基配列で表されるＣＤ１９ＶＬ－配列番号５２の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）－配列番号９の塩基配列で表されるＣＤ２２ＶＨ－配列番号５５の塩基配列表示されるリンカー（図１１のリンカー６）－配列番号１０の塩基配列で表されるＣＤ２２ＶＬ－配列番号５３の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）；
ＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ４）：配列番号５０の塩基配列で表されるＣＤ１９ＶＬ－配列番号５２の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）－配列番号１３の塩基配列で表されるＣＤ２２ＶＨ－配列番号５５の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー６）－配列番号１４の塩基配列で表されるＣＤ２２ＶＬ－配列番号５３の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）なるＣＤ１９ＶＨ；
ＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ１２）：配列番号５０の塩基配列で表されるＣＤ１９ＶＬ－配列番号５２の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）－配列番号１７の塩基配列で表されるＣＤ２２ＶＨ－配列番号５５の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー６）－配列番号１８の塩基配列で表されるＣＤ２２ＶＬ－配列番号５３の塩基配列で表されるリンカー（図１１のリンカー１）なるＣＤ１９ＶＨ。

レンチウイルスベクターは、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｃａｔ＃＃１２２５１） ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｃａｔ＃＃１２２５９）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ｃａｔ＃＃１２２５３）の３つのベクターと共にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に共感染（ｃｏ－トランスフェクション）した後、ＣＤ１９／ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスを産生した。共感染のために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃Ｌ３０００－０１５）とＯｐｔｉ－ＭＥＭ ＋ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃５１９８５－０３４）培地を用いて３つのベクターとＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を４時間培養した。

レンチウイルスベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＦＴにおいてＣＤ１９×ＣＤ２２特異的なＣＡＲが発現されることを確認したところ、図１３および図１４に示すように、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２抗体発現が正常に行われることを確認した。

実施例８：ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
本発明では、上記実施例７で作製したＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲレンチウイルスベクターを実施例５と同様の方法でＴ細胞に形質転換し、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞であるＣＤ１９×２Ｇ１、ＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ４）及びＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ１２）をそれぞれ製造した。

ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ２２ペプチドに結合する能力は、フローサイトメトリー法によって確認されました。
ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ１９×２Ｇ１、ＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ４）、ＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ１２））を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８抗体を用いてＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８が活性化されたＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞にそれぞれ分類した後、ＰＥ－ＣＤ１９ペプチドおよびＦＩＴＣ－ＣＤ２２ペプチドと反応させた後、フローサイトメーター機を用いて蛍光強度を測定した。

その結果、図１６に示すように、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８が活性化されたＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞はすべて、ＣＤ１９ペプチドおよびＣＤ２２ペプチドに結合することが確認された。

実施例９：ＣＤ２２発現細胞におけるＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化の確認
本発明では、上記実施例８で製造したＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ２２発現細胞特異的に活性化されることを確認するために、標的細胞の存在下でＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮγ発現程度を確認した。

標的細胞はＣＤ１９およびＣＤ２２を発現しないＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＣＬ－２４３）およびＣＤ１９およびＣＤ２２を発現するＮＡＬＭ６細胞（ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ）を利用し、ＣＤ１９／ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１比で一定時間反応させた後、ｓｕｒｆａｃｅ＆ｉｎｔｒａ抗体で染色し、フローサイトメーターで測定した（ＩＮＦ－ｒ、ＣＤ４、ＣＤ８染色）。

その結果、図１７Ａ～図１７Ｃに示すように、ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現しないＫ５６２細胞ではＴ細胞が活性化されていないのに対し、ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現するＮＡＬＭ６細胞の存在下でＴ細胞が活性化されてＩＦＮγ発現が増加する。することを確認した。

実施例１０：ＣＤ２２またはＣＤ１９発現細胞に対するＣＤ１９×ＣＤ２２細胞のアポトーシス効果の確認
本発明では、ヒト化抗ＣＤ２２抗体（２Ｇ１（Ｖ４）および２Ｇ１（Ｖ１２）ベースのＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞）による標的細胞の死滅効果を確認した。

標的細胞としてＣＤ１９およびＣＤ２２を発現しないＫ５６２細胞（ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）とＣＤ１９およびＣＤ２２を発現するＮＡＬＭ６細胞（ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ）を用い、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞と１：４、１：２、１：１、１：０．５および１：０．２５の比率となるようにそれぞれ混合して８時間培養した後、ルミネセンス（ＣｙｔｏＴＯＸ－Ｇｌｏ ＣｙｔｏｔＯＸｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃ Ｇ９２９１）を測定した。測定した値で実施例６の式１を用いて細胞死滅の程度を計算した。

その結果、図１８Ａに示すように、マウス由来の２Ｇ１ベースのＣＤ１９×２Ｇ１ ＣＡＲ－Ｔ、２Ｇ１のヒト化抗体ベースのＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ４）ＣＡＲ－Ｔ、および２Ｇ１の別のヒト化抗体ベースのＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ１２）ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ２２およびＣＤ１９を発現するＮＡＬＭ６細胞を特異的に死滅させることを確認した。

本発明では、ＣＤ１９とＣＤ２２を発現しないＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＣＬ－２４３）をＣＤ１９もしくはＣＤ２２もしくはＣＤ１９×ＣＤ２２を発現する３つの細胞Ｋ５６２／ＣＤ１９＋、Ｋ５６２／ＣＤ２２＋、Ｋ５６２／ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋を作製し、ヒト化抗体に基づくＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ４）ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の死滅効果を確認した。その結果、図１８Ｂに示すように、ＣＤ１９×２Ｇ１（Ｖ４）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２２もしくはＣＤ１９もしくはＣＤ１９／ＣＤ２２を発現する細胞を特異的に死滅させることを確認した。

実施例１１：動物モデルにおけるＣＤ１９／ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果の確認
本発明では、腫瘍細胞を異種移植したマウスモデルを用いてＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を確認した。

９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１×１０^６個のＮＡＬＭ６／Ｌｕｃ細胞を静脈注射で注入した後、５日目に少数（Ｌｏｗ） ０．５×１０^６個、中数（ｍｅｄｉｕｍ） １×１０^６個、多数（ｈｉｇｈ） ５×１０^６個のＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔをそれぞれ静脈注射で注入し、陽性対照群には１．２５×１０^７個の Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した。細胞注入後、３日、８日、１５日、２２日および２９日目にＮＡＭＬ６／Ｌｕｃの細胞で発現するルミネセンスをＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴでｉｎ ｖｉｔｒｏで撮影し、ＮＡＬＭ６／Ｌｕｃ細胞の増殖抑制で抗腫瘍効果を観察した。

その結果、図１９Ａに示すように、陽性対照群として使用したＳＶ４０ウイルスと結合する抗体パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）のｓｃＦｖに由来するＰａｌｉｖｉｚｕｍａｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＡＲ－Ｔを注入しなかった動物群と比較して、本発明のＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果が優れていることを確認し、ＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を５×１０^６個以上で処理する場合、腫瘍細胞がほとんど死滅してＣＡＲ－Ｔを注入して２９日まで発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を発現する腫瘍細胞が全く観察されなかったことを確認した。

これらの結果を図１９Ｂに生存率曲線で示した結果、中間数（ｍｅｄｉｕｍ）１×１０^６、多数（ｈｉｇｈ）５×１０^６のＣＤ１９×ＣＤ２２－ＣＡＲ－Ｔを注入したマウスは２９日まで全て生存したことを確認した。

Claims (10)

1. ＣＤ１９結合ドメインおよびＣＤ２２結合ドメイン；
   膜貫通ドメイン；
   共刺激ドメイン；および
   細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
   ここで、前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位；及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で示されるＣＤＲ２領域、および配列番号６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；を含む、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする、
   ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体。
2. 前記ＣＤ１９結合ドメインとＣＤ２２結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域－ＣＤ２２に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域－ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域；の順に連結されたことを特徴とする、
   請求項１に記載のＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体。
3. 前記ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変部位が配列番号４８のアミノ酸配列で表され、前記ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変部位が配列番号４７のアミノ酸配列で表されることを特徴とする、
   請求項２に記載のＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体。
4. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２およびＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質であって、
   共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０およびＩＣＯＳからなる群から選択されるタンパク質であって、
   細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζであることを特徴とする、
   請求項１に記載のＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体。
5. 前記結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間にヒンジ領域をさらに含む、
   請求項１に記載のＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体。
6. 請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
7. 請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
8. 請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド；
   または
   請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；
   を含む
   免疫エフェクター細胞。
9. 請求項８に記載の免疫エフェクター細胞；を含む、
   Ｂ細胞が介在する疾患を予防または治療するための医薬組成物。
10. 前記Ｂ細胞が介在する疾患が、腫瘍、リンパ腫、非ホジキンスリンパ腫（non-Hodgkins
    lymphoma：ＮＨＬ）、攻撃的ＮＨＬ、再発性攻撃的ＮＨＬ、再発性遅延性ＮＨＬ、不応性ＮＨＬ、不応性遅延性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小型リンパ性リンパ腫、白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ性白血病（acute
    lymphocytic leukemia：ＡＬＬ）、バーキットリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする、
    請求項９に記載のＢ細胞が介在する疾患を予防または治療するための医薬組成物。