JP7621053B2 - キメラ抗原受容体に関する方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づき2015年11月23日に出願された米国特許仮出願第62/258,712号（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）の恩典を主張する。

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって付与された契約番号第186574号の下、政府支援を受けて達成された。政府は、本発明に特定の権利を保有する。

配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表（全体が参照により本明細書に組み入れられる）を含有する。2016年11月17日に作成された該ASCIIコピーは、701586-082751-PCT_SL.txtと命名され、サイズは1,780バイトである。

技術分野
本明細書に記載の技法は、キメラ抗原受容体（CAR）、例えば多成分CARに関する。

背景
がんを処置する1つのアプローチは免疫療法であり、免疫療法は、がん細胞に有毒な薬物を与える代わりに、患者身体の免疫系ががん自体をより効果的に攻撃することを促す治療法を患者に与えるアプローチである。T細胞は、体内の外来細胞または病的細胞の存在を認識すること、および病的細胞を死滅させること、または目標を達成するために他の免疫細胞の援助を集めること、のいずれかを担う免疫系の部分である。

T細胞は、T細胞受容体（TCR）と呼ばれる自らの細胞表面の受容体を使用することによって標的細胞を認識する。TCRは、認識部分およびシグナル伝達部分を有する。認識部分が、病的細胞の存在下で体内に形成される天然の複合体と結合すると、シグナル伝達部分が活性化され、それにより、T細胞が殺傷活性に従事することまたは他の免疫細胞を動員して病的細胞を破壊することに至る。

「CAR-T」と呼ばれる治療法は、T細胞ががん細胞を認識するのを助けることを追求している。これは、T細胞がキメラ抗原受容体（CAR）を発現するようにT細胞を遺伝子改変することによって達成される。CARは、天然の認識部分が除去されており、がん細胞に固有の分子（例えば、がん細胞マーカー）の存在を非常に特異的に検出することによってがん細胞をより効果的に認識するように設計された合成認識部分によって置換されている、改変TCRである。次に、これらのCAR-T細胞は、がん患者に与えられる。患者の内部で、それらの合成CAR分子は、マーカーを発現しているがん細胞と結合し、その結合の最中にT細胞を活性化させ、患者自身の免疫系ががんを攻撃することを招く。

概要
従来のCAR-Tは、強力なツールであるものの、柔軟性を顕著に失いつつある。例えば、CAR-T細胞は、投与された後、がん細胞を発見するやいなや免疫系を活性化させ、がんが根絶されるか、またはT細胞が死滅するまで活性化は続く。一部の患者では、例えば免疫系の活動が副作用を引き起こしているまたは別の治療法が施される予定であるならば、免疫系の活性化を遅らせる、または遮断することが望ましい場合がある。さらに、CAR-Tは、がん細胞上の単一のマーカーの認識に限られる。複数のマーカーの使用は、複数の異なるCARを必要とし、いったん細胞が改変されて患者に与えられたならば、それがどのマーカーおよび何種のマーカーを認識するかを変更することは不可能である。

多成分CARに関係するCAR-T技法の改良を本明細書に記載する。多成分CARでは、CARのシグナル伝達部分および認識部分が分離されており、2つの異なるポリペプチドとして存在する。多成分CARの認識部分は、単独でがん細胞マーカーと結合できるが、T細胞を活性化させることはできない。多成分CARのシグナル伝達部分は、単独では動作を開始できず、したがって、T細胞を活性化させない。しかし、認識ポリペプチドおよびシグナル伝達ポリペプチドが一緒に存在すると、それらは相互に結合して、続いて完全なCARとして機能できる。

CARの構造におけるこの変更は、CARをずっとより柔軟にする。例えば、多成分CARのシグナル伝達部分だけを有するようにT細胞が改変され、続いて対象に与えられるならば、医師は、多成分CARの認識部分を別の薬物として提供でき、医師が、いつ、どれぐらい長く免疫系を活性化させるかを制御できるようになる。さらに、特定のがん細胞マーカーの使用が無効または逆効果と判明したならば、医師は、単に新しい認識ポリペプチドを投与することによって第2の認識ポリペプチドの使用に切り替えることができる。これは、完全に新しいCAR-T細胞を改変する必要があり、かつ／または本来のCAR-T細胞によって引き起こされる副作用が過ぎ去るのを患者が待つことを強いる従来のCAR-Tとは対照的である。

さらに、非常に進歩した治療法を可能にする多成分CARが、本明細書に記載されている。例えば、複数の認識分子を使用することによる本明細書に記載の技法は、認識分子がマーカー1またはマーカー2のいずれかを認識したならば活性化せよという命令を免疫系に提供できる。あるいは、（がん細胞上で見出される）マーカー1は認識されるが、それと同じ位置で（健康な細胞上で見出される）マーカー3は認識されない場合に、免疫系に活性化せよという命令を提供できる。論理計算を行うこの能力は、従来のCAR-T療法では不可能な方法であり、はるかに低コストでCAR-T療法を個々の患者のニーズに迅速に適応させることができるようにする。

任意の態様の一局面では、多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって、多成分CARが、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できる細胞外タンパク質相互作用ドメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとを含む、組成物が本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ロイシンジッパードメインである。任意の局面の一部の態様では、一方のロイシンジッパードメインは、BZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインは、AZip（EE）である。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメインである。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、ストレプトアビジンであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）である。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、mTORのFKBP結合ドメイン（FRB）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、シクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、カルシニューリンA（CNA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、ジベレリン非感受性（GIA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ジベレリン非感受性矮性1（GID1）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、Snapタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、Haloタグである；または一方のタンパク質相互作用ドメインは、T14-3-3-cdeltaCであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、PMA2のC末端ペプチド（CT52）である。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、PYLであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ABIである。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、ヌクレオチドタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ジンクフィンガードメインである。任意の局面の一部の態様では、認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインは、ヌクレオチドタグであり、シグナル伝達ポリペプチドの細胞外タンパク質相互作用ドメインは、ジンクフィンガードメインである。任意の局面の一部の態様では、ヌクレオチドタグは、DNAタグである。任意の局面の一部の態様では、DNAタグは、dsDNAタグである。

任意の局面の一部の態様では、組成物は、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合についてシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインとを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに含む。任意の局面の一部の態様では、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きい。任意の局面の一部の態様では、第2の認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。

任意の局面の一部の態様では、組成物は、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と2）タンパク質相互作用ドメインとを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに含み；シグナル伝達ポリペプチドは、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱い。任意の局面の一部の態様では、第1および第2の認識ポリペプチドは、それぞれ、第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；第2のタンパク質相互作用ドメインは、相互に特異的に結合する。

任意の態様の一局面では、多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって、多成分CARが、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第1の部分を含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第2の部分を含む、第2の認識ポリペプチドと；c）1）ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全なヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとを含み；ヌクレオチドタグの個々の部分が、それらが相互に会合していないかぎり、ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、組成物が本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり、ヌクレオチドタグの第2の部分は、相補的ssDNAである。任意の局面の一部の態様では、組成物は、1）第3の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）ヌクレオチドタグの第3の部分とをコードする第3の認識ポリペプチドをさらに含み；ヌクレオチドタグの個々の部分または個々の部分のうち2つの組合せはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができないが、3つの部分全てが相互に会合している場合は結果として生じる複合体はジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができる。任意の局面の一部の態様では、1）ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり；2）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、それぞれ第1の部分と相補的なssDNAであり、かつ3）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、相互に重複しない配列を有する。

任意の態様の一局面では、多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって、多成分CARが、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1のヌクレオチドタグを含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のヌクレオチドタグを含む、第2の認識ポリペプチドと；c）1）第1のヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとを含み；ヌクレオチドタグが相互に会合している場合は、それらはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、組成物が本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、第1のヌクレオチドタグはヘアピンループ構造を形成し、第2のヌクレオチドタグは、第1のヌクレオチドタグのヘアピンループの1本の足の一部およびヘアピンループのループの一部を包含する部分と相補的である。任意の局面の一部の態様では、第2の標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。

任意の局面の一部の態様では、標的リガンドは、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上ではなく病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、病的細胞は、がん性細胞である。

任意の局面の一部の態様では、抗体試薬は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（diabody）、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体からなる群より選択される。任意の局面の一部の態様では、細胞内TCRシグナル伝達ドメインは、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインである。

任意の局面の一部の態様では、組成物は、任意の態様による第2の多成分CARをさらに含む。任意の局面の一部の態様では、第2の多成分CARの抗体試薬は、第1の多成分CARの抗体試薬によって結合される標的リガンドとは異なる標的リガンドと特異的に結合する。任意の局面の一部の態様では、第2の多成分CARの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインは、T細胞活性を阻害する。任意の局面の一部の態様では、T細胞活性を阻害する第2の多成分CARの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインは、PD1；CTLA4；BTLA；KIR；LAG-3；TIM-3；A2aR；LAIR-1；およびTGITからなる群より選択されるポリペプチドのシグナル伝達ドメインを含む。任意の局面の一部の態様では、第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである。

任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、細胞の膜上に存在する。任意の局面の一部の態様では、1種または複数種の認識ポリペプチドが、細胞外空間に存在する。

任意の態様の一局面では、前記態様のいずれかの組成物を発現する改変細胞が本明細書に記載されている。任意の態様の一局面では、前記態様のいずれかの組成物をコードする核酸配列を含む改変細胞が本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、細胞は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である。任意の局面の一部の態様では、細胞は、T細胞である。

任意の態様の一局面では、標的細胞を死滅させる方法であって、該細胞を前記態様のいずれかの組成物または細胞と接触させる段階を含む方法が、本明細書に記載されている。任意の態様の一局面では、疾患を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に前記態様のいずれかの組成物または細胞を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、疾患は、がん；固形がん；乳がん；肺がん；急性リンパ芽球性白血病；多発性骨髄腫；および難治性多発性骨髄腫からなる群より選択される。任意の態様の一局面では、がんを処置する方法であって、その処置を必要とする対象に前記態様のいずれかの組成物または細胞を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、細胞は、対象にとって自己由来である。任意の局面の一部の態様では、投与される細胞は、対象から得られた細胞に由来しかつ／またはその子孫であり、少なくとも1種の多成分CARを含むようにエクスビボで改変されている。

任意の態様の一局面では、多成分キメラ抗原受容体（CAR）シグナル伝達ポリペプチドを含む改変細胞が、本明細書に記載されており、該シグナル伝達ポリペプチドは、1）細胞外タンパク質相互作用ドメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ロイシンジッパードメインである。任意の局面の一部の態様では、ロイシンジッパードメインは、BZip（RR）またはAZip（EE）である。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメインである。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）である。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、mTORのFKBP結合ドメイン（FRB）またはFK506結合タンパク質（FKBP）である。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、PYLまたはABIである。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ヌクレオチドタグまたはジンクフィンガードメインである。任意の局面の一部の態様では、ヌクレオチドタグは、DNAタグである。任意の局面の一部の態様では、DNAタグは、dsDNAタグである。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ジンクフィンガードメインである。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、細胞の膜上に存在する。任意の局面の一部の態様では、細胞は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である。任意の局面の一部の態様では、細胞は、T細胞である。任意の局面の一部の態様では、細胞内TCRシグナル伝達ドメインは、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインである。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む。任意の局面の一部の態様では、細胞は、任意の態様による第2の多成分CARシグナル伝達ペプチドをさらに含む。

任意の態様の一局面では、疾患を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、多成分キメラ抗原受容体（CAR）シグナル伝達ポリペプチドと；1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるタンパク質相互作用ドメインを含む、第1の認識ポリペプチドとを含む、細胞を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載されている。任意の局面の一部の態様では、抗体試薬は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体からなる群より選択される。任意の局面の一部の態様では、細胞は、対象にとって自己由来である。任意の局面の一部の態様では、投与される細胞は、対象から得られた細胞に由来しかつ／またはその子孫であり、少なくとも1種の多成分CARを含むようにエクスビボで改変されている。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ロイシンジッパードメインである。任意の局面の一部の態様では、一方のロイシンジッパードメインは、BZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインは、AZip（EE）である。任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメインである。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、ストレプトアビジンであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）である。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、mTORのFKBP結合ドメイン（FRB）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、シクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、カルシニューリンA（CNA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、FK506結合タンパク質（FKBP）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、ジベレリン非感受性（GIA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ジベレリン非感受性矮性1（GID1）である；一方のタンパク質相互作用ドメインは、Snapタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、Haloタグである；または一方のタンパク質相互作用ドメインは、T14-3-3-cdeltaCであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、PMA2のC末端ペプチド（CT52）である。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがmTORのFKBP結合ドメイン（FRB）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、方法は、タクロリムス、ラパログ（rapalog）、もしくはエベロリムスを投与する段階をさらに含み；一方のタンパク質相互作用ドメインがシクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、方法は、FKCsAを投与する段階をさらに含み；一方のタンパク質相互作用ドメインがカルシニューリンA（CNA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、方法は、FK506を投与する段階をさらに含み；一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性（GIA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性矮性1（GID1）である場合、方法は、ジベレリンを投与する段階をさらに含み；一方のタンパク質相互作用ドメインがSnapタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがHaloタグである場合、方法は、HaXSを投与する段階をさらに含み；または、一方のタンパク質相互作用ドメインがT14-3-3-cdeltaCであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがPMA2のC末端ペプチド（CT52）である場合、方法は、フシコクシンを投与する段階をさらに含む。任意の局面の一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインは、PYLであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインは、ABIである。任意の局面の一部の態様では、認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインは、ヌクレオチドタグであり、シグナル伝達ポリペプチドの細胞外タンパク質相互作用ドメインは、ジンクフィンガードメインである。任意の局面の一部の態様では、ヌクレオチドタグは、DNAタグである。任意の局面の一部の態様では、DNAタグは、dsDNAタグである。任意の局面の一部の態様では、方法は、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合についてシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドを投与する段階をさらに含む。任意の局面の一部の態様では、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きい。任意の局面の一部の態様では、第2の認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。

任意の局面の一部の態様では、方法は、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドを投与する段階をさらに含み；シグナル伝達ポリペプチドは、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱い。任意の局面の一部の態様では、第1および第2の認識ポリペプチドは、それぞれ、第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；該第2のタンパク質相互作用ドメインが、相互に特異的に結合する。

任意の局面の一部の態様では、方法は、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第1の部分を含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第2の部分を含む、第2の認識ポリペプチドとを投与する段階を含み；シグナル伝達ポリペプチドが、1）ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全なヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインを含み；ヌクレオチドタグの個々の部分は、それらが相互に会合していないかぎり、ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない。任意の局面の一部の態様では、ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり、ヌクレオチドタグの第2の部分は、相補的ssDNAである。任意の局面の一部の態様では、方法は、1）第3の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第3の部分をコードする第3の認識ポリペプチドを投与する段階をさらに含み；ヌクレオチドタグの個々の部分または個々の部分のうち2つの組合せはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができないが、3つの部分全てが相互に会合している場合は結果として生じる複合体はジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができる。任意の局面の一部の態様では、1）ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり；2）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、それぞれ第1の部分と相補的なssDNAであり、かつ3）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、相互に重複しない配列を有する。

任意の局面の一部の態様では、方法は、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1のヌクレオチドタグを含む第1の認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のヌクレオチドタグを含む、第2の認識ポリペプチドとを、投与する段階を含み；シグナル伝達ポリペプチドが、1）第1のヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインを含み；ヌクレオチドタグが相互に会合している場合は、それらはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない。任意の局面の一部の態様では、第1のヌクレオチドタグはヘアピンループ構造を形成し、第2のヌクレオチドタグは、第1のヌクレオチドタグのヘアピンループの1本の足の一部およびヘアピンループのループの一部を包含する部分と相補的である。任意の局面の一部の態様では、第2の標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。

任意の局面の一部の態様では、標的リガンドは、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上でなく、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、病的細胞は、がん性細胞である。

任意の局面の一部の態様では、細胞は、第2の多成分CARシグナル伝達ポリペプチドを含み、対象に、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるタンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドがさらに投与される。任意の局面の一部の態様では、第2の多成分CARシグナル伝達ポリペプチドの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインは、T細胞活性を阻害する。任意の局面の一部の態様では、第2のシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドである。任意の局面の一部の態様では、第2のシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである。

図1A～1Bは、様々なCARの設計についての模式図を示す。図1Aは、診療所においてCARを使用する養子免疫療法を示す。 図1Bは、様々な既存のCARの設計の比較を示す。scFv：単鎖抗体。CD3ζ：CD3ζ鎖のT細胞受容体シグナル伝達ドメイン。 図2A～2Bは、SUPRA CARプラットフォーム設計の模式図を示す。図2Aは、SUPRAが複数の抗原シグナルの統合をどのように可能にするかを示す。 図2Bは、ロイシンジッパーまたはジンクフィンガーをプログラム可能な相互作用ドメインとして使用してSURPAを実現できることを示す。 図3A～3Cは、ロイシンジッパーCARの設計、論理計算およびT細胞シグナル伝達の直交制御を示す。図3Aは、ロイシンジッパーCARの設計の模式図を示す。本プロジェクトで使用されるロイシンジッパーは、酸性（AZip）ドメインおよび塩基性（BZip）ドメインからなる。BZipに対して異なる親和性を有するAZipが利用可能である。 図3Bは、zipCARを使用して論理計算（例えばNOTゲート）を生み出すことができることを示す。 図3Cは、直交ジッパーと結合することで、様々なT細胞シグナル伝達経路の独立制御を可能にするようにzipCARを作製できることを示す。 zipCARによるプライマリーCD4 T細胞の活性化を示す。RRまたはEEジッパーのいずれかを発現している細胞と混合した場合のBZip（RR） CARを発現しているCD4 T細胞によるIFN-gおよびIL-2の分泌。EEジッパー（RRの相補対）を発現している細胞だけが、BZip CARを活性化させる。 抗体-ジッパー融合体および標的腫瘍細胞によるプライマリーCD4 T細胞の活性化を示す。RR-CARで改変されたCD4 T細胞およびHer2発現腫瘍細胞を含有する培地に抗Her2-ジッパー融合タンパク質を添加する。EEジッパーを含有する抗体-ジッパー融合タンパク質は、プライマリーT細胞におけるIFN-γの産生を活性化できる。 図6A～6Dは、SUPRA CARの設計における37種のロイシンジッパーの交差反応性を示すヒートマップを示す。図6Aは、各ロイシンジッパーとそれ自体および他のロイシンジッパーとの結合性について試験したことを示す。他のジッパーとの親和性および特異性が広範囲にわたるようにジッパーを選択した。CARにおけるロイシンジッパー対間の相互作用をNFATの転写活性によって測定した。1から37の番号は、以前の論文に記載された異なるロイシンジッパーを表す［Reinke et al, (2010)］。上部の番号は、エフェクター細胞上に発現したロイシンジッパーを表し、側部の番号は、標的細胞上に発現したロイシンジッパーを表す。 図6Bは、図6Aに示すデータから3つの直交対が特定されたことを示す。 図6Cは、同じセットのデータから、より潜在性の高い4つの直交ジッパー対が特定されたことを示す。エフェクター細胞がロイシンジッパー11を発現しているしている場合、および標的細胞がロイシンジッパー33を発現している場合は、NFATの活性化が観察されなかったことに留意されたい。しかし、ロイシンジッパー33を発現しているエフェクター細胞およびロイシンジッパー11を発現している標的細胞を一緒に共培養すると、高いNFATの転写活性が測定された。潜在的に、エフェクター細胞上で発現するようにロイシンジッパー33を使用し、がん細胞を標的化できるscFvと融合させるためにロイシンジッパー11を使用できる。 図6Dは、BZIPとAZIPとの間の異なる結合親和性は、異なるNFATの転写活性をもたらすことを示す。2つのロイシンジッパー対の間の結合親和性は、以前に報告されたデータから得た。 小型分子誘導物質を用いた、FKBP CARを発現しているJurkat T細胞の活性化を示す。この改変T細胞を、表面にFRBを発現している標的細胞と混合した場合、小型分子ラパログの添加は、NFATの転写応答の活性化をもたらす。 図8A～8Cは、ジンクフィンガーCARの設計、論理計算およびT細胞シグナル伝達の直交制御を示す。図8Aは、ジンクフィンガーCARの設計の模式図を示す。 図8Bは、zfCARを使用して論理計算（例えば、ANDゲートおよびNOTゲート）を生み出すことができることを示す。 図8Cは、直交2本鎖（ds）DNAと結合することで、様々なT細胞シグナル伝達経路を独立して制御できるようなzfCARを容易に作製できることを示す。 ジンクフィンガーCARの活性化を示す。ジンクフィンガードメイン（zf15 11）は、CARの細胞外ドメインとして役立つ。このCARは、zf15に特異的な2本鎖DNA配列 (CCCaTGGGTGGCAtAAAaTGGGTGGCAtAAAaTGGGTGGCAtAAAaTGGGTGGCAtAAAaTGGGTGGCAtAAAaTGGGTGGCAtAAA) (SEQ ID NO: 1)と、同じく表面にzf15を発現している別の細胞とを混合することによって活性化されることができる。Jurkat T細胞における活性化のレポーターとしてNFATの転写活性を用いている。 活性化ドメインにタグ付けされたdCas9による遺伝子の標的活性化のためのCRISPRシステムの使用についての模式図を示す。 ガイドRNAの間に切断部位（CS）を発現する単一の転写物から複数のガイドRNAを生成するためにCsy4を使用する多重活性化のためのCRISPRシステムの使用についての模式図を示す。 TetO結合部位（左欄）およびGal4結合部位（右欄）を含有するプロモーターの、当該プロモーターを標的とするsgRNAおよびdCas9-VP64の使用による活性化を示す。 本明細書に記載の局面の例示的な態様の模式図を示す。 図13A～13Cは、ヒトプライマリーCD4 T細胞およびCD8 T細胞におけるSUPRA CARプラットフォームの結果を示す。図13Aは、実験の設定の模式図を示す。 図13Bでは、CD4+ T細胞にZipCARを導入した。活性化zipFv（抗Her2-AZIP）の添加は、Her2を発現しているK562細胞に曝露した場合にIFN-γの産生をもたらす。 図13Cは、zipCAR+ CD8 T細胞が用量依存的に標的K562 Her2+細胞の溶解をもたらすことを示す。改変T細胞が存在せずzipFv単独の場合は、細胞殺傷はもたらされなかった。 図14A～14Cは、SUPRA CARの特性に影響する可能性があるパラメーターの特徴付けを示す。図14Aは、SUPRAプラットフォームの特徴付けのために体系的に調節されたパラメーターおよび成分の概略図を示す。 図14Bは、抗Her2-AZIP zipFv上のジッパーの親和性を変えることによって、対応するzipCARを発現しているプライマリーCD8 T細胞による腫瘍細胞の殺傷を調節できることを示す。 図14Cは、抗Her2-AZIP zipFv上の抗Her2 scFvの親和性を変えることによっても、zipCARを発現しているCD8 T細胞の細胞殺傷効率を調節できることを示す。 図15A～15Bは、SUPRA CARプラットフォームによるインビボでの樹立腫瘍の殺傷を示す。図15Aは、従来のCARまたはSUPRA CARで改変されたT細胞で処置されたマウスにおける、腫瘍植込みの42日後の腫瘍におけるルシフェラーゼの発現を示す。ルシフェラーゼを構成的に発現しているHer2+腫瘍細胞をマウス15匹の腹腔内に植え込んだ。12日後に、CAR T細胞をマウスに注射し、翌日に抗HER2 zipFvを添加した。IVISによる腫瘍イメージングを定期的に行った。 図15Bは、SUPRA T細胞または対照で処置されたマウスにおける12日目から40日目のHer2+腫瘍のサイズのグラフを示す。 論理演算のためのSURPA CARプラットフォームの設計を示す。ブール論理演算を生み出すために使用できるzipCARおよびzipFvの設計。ゼロの状態（抗原も入力もなし）は出力を産生しない8つの可能な2入力ブール論理動作がある。OR、NIMPLY、AND、およびXOR論理を表すためにSUPRAシステムをどのように改変できるかを示すために概略図を提供する。 図16-1の続きを示す。 Axlに対する新規なCARの設計および特徴付けを示す。IL-2産生によって測定される、ヒトプライマリーCD4+ T細胞におけるAxl CARの用量反応活性。 競合結合性ロイシンジッパーによる阻害因子zipFvの設計を示す。左では、阻害性zipFvの設計の一例の模式図を提供する。阻害性zipFvは、scFvにBZIPが取り付けられており、活性化zipFvについてzipCARと競合して、zipCARの活性化を阻害できる。右は、zipCARおよび活性化抗Her2-AZIP zipFvによるNFAT転写活性化によって測定されるJurkat活性化のグラフである。示すように、競合する抗Her2-BZIP zipFvによって活性化を低下させることができる。ジッパーの親和性を変更することによって、低下のレベルを調節できる。非競合性BZIP（syn6）は、zipCARの活性化を低下させなかった。 図19A～19Cは、SUPRA CARプラットフォームにおける直交ロイシンジッパーおよびPD-1シグナル伝達ドメインの使用を示す。図19Aは、細胞内シグナル伝達ドメインとしてCD3ζ、CD28、および4-1BBを有するzipCARを生成するために使用した37種のジッパー（AZIPおよびBZIPの両方）のヒートマップを示す。レンチウイルス形質導入によって、NFAT転写レポーター（pNFAT-GFP）を含むJurkat T細胞に各zipCARを形質導入した。zipCARが活性化すると、pNFAT-GFPレポーターが活性化し、GFPの発現をもたらす。フローサイトメトリーを使用してGFPの発現を定量した。別のジッパーの「デッド（dead）」バージョン（いかなるシグナル伝達ドメインとも融合されなかった）を発現しているJurkat標的細胞株と共に共培養することによって各ジッパーをアッセイした。各zipCARを全ての他のジッパーについての標的細胞株に対して試験して、SUPRA CARプラットフォームに使用できる直交ジッパー対を特定した。 図19Bは、Jurkat T細胞におけるNFAT転写活性に基づいてジッパーの3つの直交対が特定されたことを示す。 図19Cは、PD-1細胞内シグナル伝達ドメインを（zipCARではなく）抗メソセリンscFvと融合させたことを示し、Jurkat T細胞においてPD-1が抗HER2 CAR活性を阻害できることを示す。 異なる経路を制御するSUPRA CARの例示的な動作を示す。 ヒトT細胞へのPiggyBACの多重組込みを示す。それぞれGFP、mCherry、またはBFPと、個々に3種の異なる抗生物質耐性遺伝子とを発現している3種のpiggyBACベクターを同時にJurkat T細胞に組み込んだ。3種の抗生物質を用いて選択した後、細胞の85％超が、3種全ての蛍光レポータータンパク質を発現している。

詳細な説明
CARの認識部分およびシグナル伝達部分が別々のポリペプチドであるキメラ抗原受容体（CAR）が、本明細書に記載されている。完全なCARを構成する2つの別々のポリペプチドは、相互作用して、タンパク質相互作用ドメインを介して完全なCARを形成できる。これは、複雑な論理計算が可能な、柔軟なモジュール式CAR-T療法を可能にし、免疫療法のためのより正確で有効なアプローチを提供する。

任意の態様の一局面は、多成分キメラ抗原受容体（CAR）および／または多成分CARを含む組成物である。多成分CARは、本明細書においてSMART CARまたはSUPRAとも様々に称される。

本明細書において使用される「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、細胞シグナル伝達および／または細胞活性化ドメインと連結した抗原結合ドメイン（例えば抗体の抗原結合部分（例えばscFV））を含む人工的に構築された雑種ポリペプチドを表す。一部の態様では、細胞シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナル伝達ドメインであることができる。一部の態様では、細胞活性化ドメインは、T細胞活性化ドメインであることができる。CARは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、T細胞および他の免疫細胞の特異性および反応性を、選択された標的に非MHC拘束的な方法で再方向付けする能力を有する。非MHC拘束性の抗原認識は、CARを発現しているT細胞に、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することで、腫瘍回避の主なメカニズムをバイパスする能力を与える。そのうえCARは、T細胞で発現すると、有利には内因性T細胞受容体（TCR）α鎖およびβ鎖と二量体化しない。通常、CARの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を融合させることに由来する単鎖可変断片（scFv）からなる。あるいは、Fab（抗体からの代わりに、例えばFabライブラリーから得られた）由来のscFvが使用される場合があり、様々な態様では、このscFvは、膜貫通ドメインと融合され、続いて細胞内シグナル伝達ドメインと融合される。「第一世代の」CARは、抗原が結合するとCD3ゼータシグナル単独を提供するCARを含み、「第二世代の」CARは、共刺激（例えばCD28またはCD137）および活性化（CD3Qの両方を提供するCARを含む。「第三世代の」CARは、複数の共刺激（例えばCD28およびCD137）および活性化（CO3Q）を提供するCARを含む。様々な態様では、CARは、抗原に対して高い親和性またはアビディティーを有するように選択される。CARのさらなる論考は、例えば、Maus et al. Blood 2014 123:2624-35； Reardon et al. Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458； Hoyos et al. Haematologica 2012 97:1622； Byrd et al. J Clin Oncol 2014 32:3039-47； Maher et al. Cancer Res 2009 69:4559-4562；およびTamada et al. Clin Cancer Res 2012 18:6436-6445に見出すことができ、これらのそれぞれは、その全体として参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書において使用される「多成分CAR」は、少なくとも2つの別々のポリペプチドを含むCARであって、どちらのポリペプチドも、リガンド認識およびそれ自体のシグナル伝達活性化の両方はできない、CARを表す。一部の態様では、少なくとも2つの別々のポリペプチドはそれぞれ、相互作用（例えば、別々のポリペプチドの結合）を可能にするタンパク質相互作用ドメインを含む。一部の態様では、少なくとも2つの別々のポリペプチドのうち1つは、細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを有する膜貫通ポリペプチドであり、少なくとも2つの別々のポリペプチドの2つ目は、リガンド結合ドメインを有する細胞外ポリペプチドである。一部の態様では、多成分CARは、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれより多い別々のポリペプチドを含むことができる。

態様の一局面では、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できる細胞外タンパク質相互作用ドメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとを含む、多成分キメラ抗原受容体（CAR）が、本明細書に記載されている。

本明細書において使用される「認識ポリペプチド」は、リガンド結合ドメインを有する細胞外ポリペプチドを表す。一部の態様では、リガンド結合ドメインは、抗体試薬であることができる。一部の態様では、認識ポリペプチドは、タンパク質相互作用ドメインをさらに含むことができる。

本明細書において使用される「シグナル伝達ポリペプチド」は、細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを有する膜貫通ポリペプチドを表す。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、タンパク質相互作用ドメインをさらに含むことができる。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、細胞外タンパク質相互作用ドメインをさらに含むことができる。

本明細書において使用される「タンパク質相互作用ドメイン」は、2つの別々のポリペプチドの相互の特異的結合を可能にするドメインを表す。いくつかの例示的なタンパク質相互作用ドメインおよびタンパク質相互作用ドメイン対は、本明細書の他の箇所に提供される。一部の態様では、多成分CARのポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインは特異的に結合でき、例えば、タンパク質相互作用ドメインのうちの1つは、多成分CARの2つ目のタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できる。一部の態様では、特異的結合は、2つの別々のタンパク質相互作用ドメインが存在する場合に起こることができる。一部の態様では、特異的結合は、3つ以上の別々のタンパク質相互作用ドメインが存在する場合に起こることができる。例示的なタンパク質相互作用ドメインは、当技術分野において公知であり、かつ本明細書に記載の局面の態様に使用できる。

本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、ロイシンジッパードメインであることができる。ロイシンジッパードメインは、通例、αヘリックスにわたり均等に間隔が空いたロイシン残基によって特徴付けられる転写因子に見出される、タンパク質-タンパク質相互作用ドメインの1種である。ロイシンジッパーは、ヘテロ二量体またはホモ二量体を形成する場合がある。いくつかのロイシンジッパードメインおよびそれらが相互に結合する能力は、当技術分野において公知であり、例えば、それぞれがその全体として参照により本明細書に組み入れられるReinke et al. JACS 2010 132:6025-31およびThomposon et al. ACS Synth Biol 2012 1:118-129にさらに論考されている。一部の態様では、一方のロイシンジッパードメインはBZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインはAZip（EE）である。一部の態様では、BZip（RR）ロイシンジッパードメインの配列は、

である。一部の態様では、AZip（EE）ロイシンジッパードメインの配列は、

である。さらに例示的なロイシンジッパードメインは、その全体として参照により本明細書に組み入れられるReinke et al. JACS 2010 132:6025-31に記載されている。例えば、適切なロイシンジッパードメインは、SYNZIP1～SYNZIP48、およびBATF、FOS、ATF4、ATF3、BACH1、JUND、NFE2L3、およびHEPTADを含むことができる。これらのドメインの様々な組合せの結合親和性は、例えば、Reinkeらの図1に記載されている。一部の態様では、ロイシンジッパードメインの適切な対は、1000nM以下の解離定数（Kd）を有する。一部の態様では、ロイシンジッパードメインの適切な対は、100nM以下の解離定数（Kd）を有する。一部の態様では、ロイシンジッパードメインの適切な対は、10nM以下の解離定数（Kd）を有する。一部の態様では、ロイシンジッパードメインの適切な対は、1nM以下の解離定数（Kd）を有する。

タンパク質相互作用ドメインのさらに例示的な対は、a）PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメイン；b）ストレプトアビジンドメインおよびストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）ドメイン；ならびに c）PYLドメインおよびABIドメインを含むことができる。

本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、化学的に誘導されるタンパク質相互作用ドメイン、例えば、第3の分子（例えば、小型分子または薬物）の存在下でのみ特異的に結合するドメインであることができる。化学的に誘導されるタンパク質相互作用ドメインの例示的な対は、mTORのFKBP結合ドメイン（FRB）およびFK506 結合タンパク質（FKBP）（その結合は、タクロリムス、エベロリムス、またはラパログによって活性化される）；シクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）およびFK506結合タンパク質（FKBP）（その結合は、FKCsAによって活性化される）；カルシニューリンA（CNA）およびFK506結合タンパク質（FKBP）（その結合は、FK506によって活性化される）；ジベレリン非感受性（GIA）およびジベレリン非感受性矮性1（GID1）（その結合は、ジベレリンによって活性化される）；SnapタグおよびHaloタグ（その結合は、HaXSによって活性化される）；ならびにT14-3-3-cdeltaCおよびPMA2のC末端ペプチド（CT52）（その結合は、フシコクシンによって活性化される）を含むことができる。化学的に誘導されるタンパク質相互作用ドメインのさらなる記載は、当技術分野において、例えば、そのそれぞれが、その全体として参照により本明細書に組み入れられる、Miyamoto et al. Nat Chem Biol. 2012 Mar 25； 8(5):465-470およびBelshaw et al. PNAS 1996 93:4604-4607に見出すことができる。

本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、タンパク質相互作用ドメインは、少なくとも1つのヌクレオチドタグおよび少なくとも1つのジンクフィンガードメインを含むことができる。ジンクフィンガードメインは、その三次構造を安定化するための亜鉛イオンの配位によって特徴付けられる。ジンクフィンガーに現れる特定の折畳みは多様であり得る。一部の態様では、ジンクフィンガードメインは、ヌクレオチド結合性ジンクフィンガードメインであることができる。一部の態様では、ジンクフィンガードメインは、DNA結合性ジンクフィンガードメインであることができる。一部の態様では、認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインは、ヌクレオチドタグであり、シグナル伝達ポリペプチドの細胞外タンパク質相互作用ドメインは、ジンクフィンガードメインである。一部の態様では、ヌクレオチドタグは、DNAタグであることができる。一部の態様では、ヌクレオチドタグは、使用されるジンクフィンガードメインについての認識配列全体を含むdsDNAタグであることができる。例示的なジンクフィンガードメインおよびそれらのコグネイトヌクレオチドタグは、当技術分野において、例えば、その全体として参照により本明細書に組み入れられるMali et al. Nature Methods 2013 10:403-406に記載されている。一部の態様では、ジンクフィンガードメインは、Mali et al. Nature Methods 2013 10:403-406に記載されているようなsZF15であることができる。

第3のポリペプチドなしで特異的に結合できる単一の認識ポリペプチドおよび単一のシグナル伝達ポリペプチドの局面では、本明細書に記載の多成分CARは、標的リガンドの存在下で活性化し、それによって、標的リガンドの近傍でT細胞活性を誘導する。論理計算が可能な多成分CAR、例えば、AND、OR、またはNOT論理ゲートとして役立つ多成分CARが、本明細書にさらに記載されている。

一部の局面では、ANDゲート論理を可能とする多成分CARが、本明細書に記載されている。これらの局面では、多成分CARの活性化は、2つの標的リガンドの存在下でのみ起こり；単一の標的リガンドの認識では、活性化に不十分である。そのような多成分CARは、より高い特異性を可能にし、オフターゲット効果を低減することができる。標的細胞または組織に関する優れたマーカーである任意の単一のリガンドが、対象のどこか他に存在する場合があり、オフターゲット効果を招く。しかし、2つの別々のマーカーリガンドの認識を必要とすることは、オフターゲット活性の可能性を低下させる。任意の態様の一局面では、多成分キメラ抗原受容体（CAR）であって、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第1の部分を含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第2の部分を含む、第2の認識ポリペプチドと；c）1）ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全なヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとを含み；ヌクレオチドタグの個々の部分が、相互に会合していないかぎり、ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、多成分CARが本明細書に記載されている。一部の態様では、ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり、ヌクレオチドタグの第2の部分は、相補的ssDNAであることにより、2つのタグがハイブリダイズすると、それらは、ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができるdsDNAを形成する。一部の態様では、ヌクレオチドタグの第1の部分は、第1のオーバーハングを有するdsDNAであり、ヌクレオチドタグの第2の部分は、相補的オーバーハングを有するdsDNAであることにより、どちらのdsDNAもジンクフィンガーの結合に必要な全体認識配列を含まず、オーバーハングがハイブリダイズすると、ジンクフィンガーの結合に必要な全体認識配列を含む単一のdsDNAが形成される。図8A～8Cに、ジンクフィンガードメインを含む例示的な多成分CARを示す。

一部の態様では、多成分キメラ抗原受容体（CAR）であって、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第1の部分を含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第2の部分を含む、第2の認識ポリペプチドと；c）1）第3の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第3の部分をコードする第3の認識ポリペプチドと；d）1）ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全なヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとを含み；ヌクレオチドタグの個々の部分が、それらが相互に会合していないかぎり、ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、多成分CARが本明細書に記載されている。例えば、ヌクレオチドタグの個々の部分または個々の部分のうち2つの組合せはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができないが、3つの部分全てが相互に会合している場合は結果として生じる複合体はジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができる。一部の態様では、1）ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり；2）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、それぞれ第1の部分と相補的なssDNAであり、かつ3）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、相互に重複しない配列を有する。ジンクフィンガードメインの結合を調節するための3つのヌクレオチドタグのさらなる配置が本明細書において考えられている（例えば、DNA origamiを使用）。そのような配置は、当技術分野に記載されており、例えば、そのそれぞれが、その全体として参照により本明細書に組み入れられる、Wei et al. Nature 2012 485:623-626； Ke et al. Science 2012 338:1177-1183；およびDouglas et al. Nature 2009 459:414-418を参照されたい。

AND論理ゲート多成分CARのさらなる態様が、本明細書に記載されている。一局面では、タンパク質相互作用ドメインを含む認識ポリペプチドおよびタンパク質相互作用ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドを含む多成分CARは、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに含むことができ、シグナル伝達ポリペプチドは、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱い。本明細書の他のどこかに記載するように、タンパク質相互作用ドメインの相対的親和性は、当業者によって容易に決定されることができ、かついくつかの特異的タンパク質相互作用ドメインに関して当技術分野において公知である。一部の態様では、第1および第2の認識ポリペプチドはそれぞれ第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；第2のタンパク質相互作用ドメインは相互に特異的に結合する。

本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、本明細書に記載の多成分CARは、NOT論理ゲートを含むことができる（例えば、図8Bを参照されたい）。例えば、第2の認識ポリペプチドによる第2の標的リガンドの認識は、シグナル伝達ポリペプチドと第1の認識ポリペプチドとの相互作用（例えば特異的結合）を防止できる。そのような態様は、不適切なおよび／またはオフターゲットの組織におけるT細胞活性の抑制を可能にする。例えば、第2の標的リガンドは、T細胞活性に特に感受性であり、オフターゲット活性が公知の領域であり、かつ／または所望の標的組織とマーカーを共有する、組織のマーカーであることができる。一部の態様では、NOTゲート多成分CARにおいて、第2の標的リガンドは、標的組織および／または細胞において（例えば、がん細胞中またはがん細胞上で）見出されるリガンドではない。一部の態様では、NOT論理ゲート多成分CARの第2の標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。一局面では、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1のヌクレオチドタグを含む、認識ポリペプチドと；b）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のヌクレオチドタグを含む、第2の認識ポリペプチドと；c）1）第1のヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドとが、本明細書に記載され；ヌクレオチドタグが相互に会合している場合は、それらはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない。ヌクレオチド対のそのような対の様々な二次元および三次元配置は、当技術分野において公知であり、例えば、本明細書におけるどこか他の箇所のDNA origamiの論考を参照されたい。例示的な態様では、第1のヌクレオチドタグはヘアピンループ構造を形成し、第2のヌクレオチドタグは、第1のヌクレオチドタグのヘアピンループの1本の足の一部およびヘアピンループのループの一部を包含する部分に相補的である。したがって、第2のヌクレオチドタグの非存在下で、第1のヌクレオチドタグは、コグネイトジンクフィンガーによって結合されることができるdsDNA部分を含む。第2のヌクレオチドタグの存在下で、タグはハイブリダイズし、第1のヌクレオチドタグを強制的にヘアピンループ構造からアンフォールディングさせ、同じコグネイトジンクフィンガーに必要な認識配列を欠如するdsDNA分子をもたらす。そのような配置を、例えば図8Bにグラフとして示す。

NOT論理ゲート多成分CARの他の態様が、本明細書に記載されている。一局面では、本明細書に記載の多成分CAR、例えば、タンパク質相互作用ドメインを有する第1の認識ポリペプチドを含む多成分CARは、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合についてシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに含むことができる。一局面では、NOT論理ゲート多成分キメラ抗原受容体（CAR）であって、a）1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第1の認識ポリペプチドと；b）1）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できる細胞外タンパク質相互作用ドメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチドと；c）1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合についてシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドとを含む、NOT論理ゲート多成分CARが本明細書に記載されている。一部の態様では、第2の認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。一部の態様では、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きい。相対的結合親和性は、実験的に、例えば当技術分野において公知の結合親和性アッセイによって決定でき、相対的結合親和性は、本明細書に記載のタンパク質相互作用ドメインのいくつかの組合せについて公知であり、例えば、その全体として参照により本明細書に組み入れられるReinke et al. JACS 2010 132:6025-31を参照されたい。一部の態様では、認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの結合親和性は、第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインとシグナル伝達ポリペプチドの相互作用ドメインとの結合親和性よりも少なくとも2倍大きいことができる。一部の態様では、認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの結合親和性は、第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインとシグナル伝達ポリペプチドの相互作用ドメインとの結合親和性よりも少なくとも5倍大きいことができる。一部の態様では、認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの結合親和性は、第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインとシグナル伝達ポリペプチドの相互作用ドメインとの結合親和性よりも少なくとも10倍大きいことができる。

本明細書において使用される「標的リガンド」は、リガンド結合ドメインによって結合されることができる細胞中または細胞上の分子を表す。そのような分子の非限定的な例は、ポリペプチド、脂質、糖類などを含むことができる。一部の態様では、標的リガンドは、細胞外分子であることができる。一部の態様では、標的リガンドは、細胞表面分子であることができる。

一部の態様、例えば、単一の認識ポリペプチドを有する多成分CARまたはANDゲート多成分CARに関する態様では、標的リガンド（例えば、第1および／または第2の標的リガンド）は、標的組織において発現するリガンドであることができる。一部の態様では、標的リガンドは、標的組織および／または細胞において構成的に発現していてもよい。一部の態様では、標的リガンドは、独占的に標的組織および／または細胞において発現していてもよい。一部の態様では、標的リガンドは、他の組織および／または細胞よりも標的組織および／または細胞において高いレベルで発現していてもよい。単一の認識ポリペプチドを有する多成分CARまたはANDゲート多成分CARに関する態様における標的リガンドの認識は、T細胞活性化（例えば、標的リガンドを含む細胞の細胞殺傷活性）を招くことができるので、標的リガンドは、例えばがん細胞を標的化することによって、望ましいおよび／または治療的な方法でT細胞活性を標的化するように選択できる。一部の態様では、標的リガンドは、病的および／または標的細胞中／上で見出されるリガンドである。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる、またはANDゲート多成分CARの一部である、認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、病的および／または標的細胞中／上で見出されるリガンドである。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる、またはANDゲート多成分CARの一部である、認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上でなく、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである。一部の態様では、病的細胞は、がん性細胞である。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる、またはANDゲート多成分CARの一部である認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、がん細胞の表面に見出される。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる、またはANDゲート多成分CARの一部である認識ポリペプチドは、例えば、正常細胞との結合と比較して、がん細胞の表面上の標的リガンドと特異的に結合する。

一部の態様では、本明細書に記載の組成物および／または細胞は、第1の多成分CARについて本明細書に記載された局面および態様のいずれかに従って第2の多成分CARをさらに含むことができる。非限定的な例として、第2のCARは、第1の多成分CARが特異的に結合する（および、例えばそれによって活性化または阻害される）標的リガンドとは異なる標的リガンドと特異的に結合する（および、例えばそれによって活性化または阻害される）ように設計できる。これは、本明細書に記載の方法に関して、増加した特異性、低下したオフターゲット効果、および／または低下した有効投薬量を提供できる。一部の態様では、第2の多成分CARの抗体試薬は、第1の多成分CARの抗体試薬によって結合される標的リガンドとは異なる標的リガンドと特異的に結合する。

一部の態様では、第2の多成分CARは、阻害性細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメイン、例えばT細胞活性を阻害するドメインを含むことができる。したがってそのような態様では、第2の多成分は、第1の多成分CARに対抗して動作するように、例えば、第1の多成分CARがT細胞活性の活性化を可能とする一方で、T細胞活性化の阻害を可能とするように、設計できる。阻害性細胞内TCRシグナル伝達ドメインは、当技術分野において公知であり、かつ非限定的な例として、PD1；CTLA4；BTLA；KIR；LAG-3；TIM-3；A2aR；LAIR-1；およびTGITを含むことができる。一部の態様では、阻害性細胞内TCRシグナル伝達ドメインを含む第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドである。一部の態様では、阻害性細胞内TCRシグナル伝達ドメインを含む第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである。一部の態様では、阻害性細胞内TCRシグナル伝達ドメインを含む第2の多成分CARは、本明細書に記載の態様のいずれかに従ってOR論理ゲートであることができ、第2の標的リガンドは、病的（例えばがん性）細胞中／上で見出されるまたは病的（例えばがん性）細胞に特異的なリガンドであることができる。

任意の局面の一部の態様では、リガンド結合ドメインは、抗体試薬を含むかまたは本質的に抗体試薬からなることができる。一部の態様では、抗体試薬は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および／または二重特異性抗体であることができる。

一部の態様では、細胞内TCRシグナル伝達ドメインは、T細胞活性化ドメインであることができる。一部の態様では、細胞内TCRシグナル伝達ドメインは、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインである。

本明細書に記載の多成分CARは、細胞活性、例えば、T、NK、またはNKT細胞活性、例えば、そのような細胞によって仲介および／または実行される細胞殺傷活性の調節を可能にできる。したがって、一部の態様では、本明細書に記載の1種または複数種の多成分CARは、細胞中／上に存在できる。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、細胞の膜上に存在する。一部の態様では、1種または複数種の認識ポリペプチドは、細胞外空間に存在し、例えば、認識ポリペプチドは、細胞によって発現および分泌されることができ、または細胞は、別の供給源から提供される（例えば、合成的にまたは別の細胞によって産生され、かつ任意で接触させる段階の前に精製または加工される）認識ポリペプチドによって接触されることができる。

一局面では、本明細書に記載の1種または複数種の多成分CAR、例えば少なくとも1つのシグナル伝達ポリペプチドおよび少なくとも1種の認識ポリペプチドを発現しているおよび／または含む、改変細胞が、本明細書に記載されている。一部の態様では、細胞は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である。一部の態様では、細胞は、T細胞である。多成分CARの、シグナル伝達ポリペプチドおよび少なくとも1種の認識ポリペプチドの両方を発現しているおよび／または含むそのような細胞は、本明細書において「完全多成分CAR」細胞と称される。一部の態様では、完全多成分CAR細胞は、多成分CARの、シグナル伝達ポリペプチドおよび少なくとも1種の認識ポリペプチドの両方を発現している。一部の態様では、完全多成分CAR細胞は、多成分CARの、シグナル伝達ポリペプチドおよび少なくとも1種の認識ポリペプチドの両方をコードする核酸配列を含む。

本明細書に記載の任意の局面、例えば完全または部分多成分CAR細胞のいずれかに関する局面において、認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、誘導性および／または抑制性プロモーターの制御下にあることができる。そのようなプロモーターは、ポリペプチドの発現を所望により増加または減少させることができ、構成的プロモーターとは対照的である。用語「構成的活性プロモーター」は、所与の細胞内で常で発現する遺伝子のプロモーターを表す。哺乳動物細胞に使用するための例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス（CMV）などが含まれる。用語「誘導性プロモーター」は、所与のシグナル、例えば薬剤の添加または減少に応答して発現できる遺伝子のプロモーターを表す。誘導性プロモーターの非限定的な例は、特定の組織型において調節されるプロモーター、ステロイドホルモンによって、ポリペプチドホルモンによって（例えばシグナル形質導入経路により）、または異種ポリペプチド（例えば、テトラサイクリン誘導性システム、「Tet-On」および「Tet-Off」；例えば、そのそれぞれが、その全体として参照により本明細書に組み入れられるClontech Inc., CA, Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547, 1992、およびPaillard, Human Gene Therapy 9:983, 1989を参照されたい）によって調節されるプロモーターである。一部の態様では、ポリペプチドの発現は、例えば、ある特定の生理学的調節因子、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンに感受性である誘導性調節配列を使用することによって正確に調節されることができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物における発現制御に適切な、そのような誘導性発現システムには、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル-β-D1-チオガラクトピラノシド（IPTG）による調節が含まれる。当業者は、ポリペプチドの意図される使用に基づき適切な調節／プロモーター配列を選択できる。

一部の態様では、認識ポリペプチドまたはシグナル伝達ポリペプチドのうちの1つまたは複数の発現は、構成的であることができる。一部の態様では、認識ポリペプチドまたはシグナル伝達ポリペプチドのうちの1つまたは複数の発現は、一過性であることができる。一過性発現は、例えば一過性および／もしくは誘導性発現プロモーターの使用によってまたは一過性ベクター、例えばゲノムに組み込まれず、かつ／もしくは標的細胞中に存続するベクターの使用によって達成できる。非限定的な例として、ウシパピローマウイルス（BPV-1）、またはエプスタイン-バーウイルス（pHEBo、pREP由来およびp205）のようなウイルス派生物を、真核細胞における核酸の一過性発現のために使用できる。他の適切な発現システムおよび一般的な組換え手順については、その全体として参照により本明細書に組み入れられるMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis（Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989） Chapters 16 and 17を参照されたい。一部の態様では、多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドは構成的に発現でき、認識ポリペプチドは、一過性で発現できる。一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドは構成的に発現でき、シグナル伝達ポリペプチドは、一過性で発現できる。

一局面では、標的細胞を殺傷する方法であって、本明細書に記載の態様のいずれかに従って該細胞を完全多成分CAR細胞と接触させる段階を含む方法が、本明細書に記載されている。一部の態様では、標的細胞は、病的細胞、例えばがん細胞であることができる。一局面では、疾患を処置する方法であって、本明細書に記載の態様のいずれかに従って完全多成分CAR細胞を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載されている。一部の態様では、疾患は、がん；固形がん；乳がん；肺がん；急性リンパ芽球性白血病；多発性骨髄腫；または難治性多発性骨髄腫であることができる。一局面では、がんを処置する方法であって、本明細書に記載の態様のいずれかに従って完全多成分CAR細胞を投与する段階を含む方法が、本明細書に記載されている。一部の態様では、完全多成分CAR細胞は、対象にとって自己由来であることができる。一部の態様では、完全多成分CAR細胞は、対象から得られた細胞に由来しかつ／またはその子孫であることができ、かつ少なくとも1種の多成分CARを含むようにエクスビボで改変されており、例えば多成分CARの、シグナル伝達ポリペプチドおよび少なくとも1種の認識ポリペプチドの両方をコードする核酸配列を含むように遺伝子改変されている。一部の態様では、方法は、対象から細胞（例えばT、NK、もしくはNKT細胞またはその前駆細胞）を得る段階、多成分CARの、シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列および少なくとも1種の認識ポリペプチドをコードする核酸配列の両方を含むように細胞を改変する段階、および続いて細胞を対象に投与する段階をさらに含むことができる。

一局面では、本明細書に記載の態様のいずれかに従って1種または複数種の多成分CARシグナル伝達ポリペプチドを発現しているおよび／または含む改変細胞が本明細書に記載されている。一部の態様では、細胞は、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である。一部の態様では、細胞は、T細胞である。多成分CARシグナル伝達ポリペプチドを発現しているおよび／または含むそのような細胞は、本明細書において「部分多成分CAR」細胞と称される。一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、多成分CAR認識ポリペプチドを発現しない、例えばそれをコードする核酸配列を含まない。一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、少なくとも1種の多成分CARシグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の態様では、多成分CARシグナル伝達ポリペプチドは、細胞の膜上に存在する、例えば膜貫通タンパク質として検出可能なレベルで発現する。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドは、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、例えばシグナル伝達ポリペプチドは、本明細書の他の箇所に記載されるようなANDゲート多成分CARの部分である。一部の態様では、細胞は、第2の多成分CARシグナル伝達ポリペプチド、例えば本明細書に記載の態様のいずれかに従って第2の多成分CARの部分であるシグナル伝達ポリペプチドをさらに含むことができる。

一局面では、標的細胞を殺傷する方法であって、本明細書に記載の態様のいずれかに従って標的細胞を多成分CAR細胞の部分と接触させる段階、および標的細胞を多成分CARの少なくとも1種の認識ポリペプチドと接触させる段階を含む方法が、本明細書に記載されている。一部の態様では、標的細胞は、病的細胞、例えばがん細胞であることができる。一局面では、疾患を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、部分多成分CAR細胞と、1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）部分多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるタンパク質相互作用ドメインを含む、第1の認識ポリペプチドとを投与する段階を含む方法が、本明細書に記載されている。一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、対象にとって自己由来であることができる。一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、対象から得られた細胞に由来しかつ／またはその子孫であることができ、例えば多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列を含むように遺伝子改変された、少なくとも1つの部分多成分CARを含むようにエクスビボで改変されている。一部の態様では、方法は、対象から細胞（例えばT、NK、もしくはNKT細胞またはその前駆細胞）を得る段階、多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列を含むように細胞を改変する段階、および続いて細胞を対象に投与する段階をさらに含むことができる。

一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、本明細書に記載の態様のいずれかに従うNOTゲート多成分CARを含む。一部の態様では、部分多成分CAR細胞および第1の認識ポリペプチドを投与された対象に、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合についてシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに投与できる。一部の態様では、第2の認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。一部の態様では、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きい。一部の態様では、第1の認識ポリペプチドは、1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1のヌクレオチドタグを含み；第2の認識ポリペプチドが、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のヌクレオチドタグを含み；シグナル伝達ポリペプチドが、1）第1のヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインを含み；ヌクレオチドタグが相互に会合している場合は、それらはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない。一部の態様では、第1のヌクレオチドタグはヘアピンループ構造を形成し、第2のヌクレオチドタグは、第1のヌクレオチドタグのヘアピンループの1本の足の一部およびヘアピンループのループの一部を包含する部分と相補的である。一部の態様では、第2の標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない。

一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、本明細書に記載の態様のいずれかに従うANDゲート多成分CARを含む。一部の態様では、部分多成分CAR細胞および第1の認識ポリペプチドを投与された対象に、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに投与でき；シグナル伝達ポリペプチドが、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む。一部の態様では、第1および第2の認識ポリペプチドは、それぞれ第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；第2のタンパク質相互作用ドメインが、相互に特異的に結合する。一部の態様では、シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性は、シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱い。一部の態様では、第1の認識ポリペプチドは、1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第1の部分を含み；第2の認識ポリペプチドは、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第2の部分を含み；シグナル伝達ポリペプチドが、1）ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全なヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインを含み；ヌクレオチドタグの個々の部分が、それらが相互に会合していないかぎり、ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない。一部の態様では、ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり、ヌクレオチドタグの第2の部分は、相補的ssDNAである。一部の態様では、方法は、1）第3の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第3の部分をコードする第3の認識ポリペプチドを投与する段階を含むことができ；ヌクレオチドタグの個々の部分または個々の部分のうち2つの組合せはジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができないが、3つの部分全てが相互に会合している場合は結果として生じる複合体はジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができる。一部の態様では、1）ヌクレオチドタグの第1の部分は、ssDNAであり；2）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、それぞれ第1の部分と相補的なssDNAであり、3）ヌクレオチドタグの第2および第3の部分は、相互に重複しない配列を有する。

一部の態様では、部分多成分CAR細胞は、本明細書に記載の態様のいずれかに従う第2の多成分CARの部分である第2のシグナル伝達ポリペプチドを含むことができる。一部の態様では、対象に、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるタンパク質相互作用ドメインを含む、第2の認識ポリペプチドがさらに投与される。一部の態様では、第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインは、T細胞活性を阻害する。一部の態様では、第2のシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドである。一部の態様では、第2のシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドは、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである。

本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の態様では、多成分CARのタンパク質相互作用ドメインの対は、化学的に誘導される結合ドメインを含むことができ、方法は、ドメインの結合を誘導する化合物を投与する段階をさらに含むことができる。一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがmTORのFKBP結合ドメイン（FRB）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、方法は、タクロリムス、ラパログ、またはエベロリムスを投与する段階をさらに含む。一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがシクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、方法は、FKCsAを投与する段階をさらに含む。一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがカルシニューリンA（CNA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、方法は、FK506を投与する段階をさらに含む。一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性（GIA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性矮性1（GID1）である場合、方法は、ジベレリンを投与する段階をさらに含む。一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがSnapタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがHaloタグである場合、方法は、HaXSを投与する段階をさらに含む。一部の態様では、一方のタンパク質相互作用ドメインがT14-3-3-cdeltaCであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがPMA2のC末端ペプチド（CT52）である場合、方法は、フシコクシンを投与する段階をさらに含む。

本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドを改変できる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、トランスジェニックであることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、組換えであることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、細胞にとって異種であることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、T細胞にとって異種であることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CAR認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、ヒトT細胞にとって異種であることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、細胞にとって外因性であることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、T細胞にとって外因性であることができる。本明細書に記載の任意の局面の一部の態様では、多成分CARの認識ポリペプチドおよび／またはシグナル伝達ポリペプチドは、ヒトT細胞にとって外因性であることができる。

本明細書に記載の個々の態様のそれぞれを、例えば単一の細胞において組み合わせることができることが、本明細書において具体的に考えられている。非限定的な例として、単一の細胞は、第1の完全多成分CARおよび第2の部分多成分CARを含むこともでき、各多成分CARが、本明細書に記載の態様のいずれかに従うことができる。

一部の態様では、本明細書に記載の方法は、CAR-T療法のようなCAR免疫細胞療法に関する。標準的なCAR-T療法および関連療法は、対象を処置するための標的細胞型（例えばがん細胞）と特異的に結合するCARを発現している免疫細胞（例えばT細胞）の養子細胞移入に関する。一部の態様では、治療法の一部として投与される細胞は、対象にとって自己由来であることができる。一部の態様では、治療の一部として投与される細胞は、対象にとって自己由来ではない。一部の態様では、細胞は、本明細書に記載の多成分CARまたはその一部を発現するように改変および／または遺伝子改変されている。CAR-T療法のさらなる論考は、例えば、そのそれぞれがその全体として参照により本明細書に組み入れられる、Maus et al. Blood 2014 123:2624-35； Reardon et al. Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458； Hoyos et al. Haematologica 2012 97:1622； Byrd et al. J Clin Oncol 2014 32:3039-47； Maher et al. Cancer Res 2009 69:4559-4562；およびTamada et al. Clin Cancer Res 2012 18:6436-6445に見出すことができる。

一部の態様では、本明細書に記載の技法は、本明細書に記載の組成物の治療有効量を含む、シリンジまたは器官特異性カテーテル（例えば、腎臓カテーテル、胆道カテーテル、心臓カテーテルなど）を含むカテーテルに関する。

一部の態様では、本明細書に記載の方法は、がんを有するまたはがんを有すると診断された対象を、本明細書に記載の1種または複数種の多成分CARで処置することに関する。がんを有する対象は、医師によってがんを診断する現行方法を使用して特定されることができる。これらの状態を特徴付け、診断を助けるがんの症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、非限定的に、腫瘍の存在、臓器機能障害または不全、血球数の異常、体重減少などを含む。例えばがんの、診断を助け得る検査は、非限定的に、血球数、X線、およびCTスキャンを含む。がんの家族歴、またはがんについてのリスク因子への曝露（例えば喫煙もしくは放射線曝露）も、対象ががんを有する可能性があるか判定することまたはがんの診断を行うことを助けることができる。

本明細書において使用される用語「がん」は、一般的に、異常細胞が制御されずに分裂し、近くの組織に浸潤する可能性がある疾患または状態のクラスに関する。がん細胞は、血液およびリンパ系を経由して身体の他の部分にも拡散する可能性がある。いくつかの主な種類のがんがある。がん腫は、皮膚または内臓を裏打ちするもしくは覆う組織から始まるがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合もしくは支持組織から始まるがんである。白血病は、骨髄のような血液形成組織から始まり、多数の異常血液細胞を産生させ、血中に入らせるがんである。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系細胞から始まるがんである。中枢神経系のがんは、脳および脊髄の組織から始まるがんである。

本明細書において使用される用語「悪性」は、腫瘍細胞の一群が、制御されない成長（すなわち、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入および破壊）、および転移（すなわち、リンパまたは血液を介した身体の他の位置への拡散）のうちの1つまたは複数を示すがんを表す。本明細書において使用される用語「転移する」は、身体のある部分から別の部分へのがんの拡散を表す。拡散した細胞によって形成される腫瘍は、「転移腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移腫瘍は、本来の（原発性）腫瘍に似た細胞を含む。

本明細書において使用される用語「良性」または「非悪性」は、より大きく成長する場合があるが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を表す。良性腫瘍は、自己限定性であり、典型的には浸潤または転移しない。

「がん細胞」または「腫瘍細胞」は、がん性成長または組織の個々の細胞を表す。腫瘍は、一般的に、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を表す。多くのがん細胞は、腫瘍を形成するが、一部、例えば白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するがん細胞について、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、互換的に使用される。

がんまたは腫瘍を有する対象は、対象の身体に存在する客観的に測定可能ながん細胞を有する対象である。悪性で活発に増殖するがん、および潜在的に休眠中の腫瘍または微小転移が、この定義に含まれる。その本来の位置から移動して他の重要臓器に播種するがんは、罹患臓器の機能的悪化を経て最終的に対象の死をもたらす可能性がある。白血病のような造血器のがんは、対象における正常な造血区画を打ち負かすことが可能であり、それによって造血不全（貧血、血小板減少、好中球減少の形で）を導き、最終的に死亡を引き起こす。

本明細書に記載の組成物および方法は、がんを有するまたはがんを有すると診断された対象に投与されることができる。一部の態様では、本明細書に記載の方法は、がんの症状を軽減するために本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与する段階を含む。本明細書において使用される「がんの症状を軽減する」は、がんと関連する任意の状態または症状を回復させることである。等価の未処置対照と比較して、そのような減少は、任意の標準的な技法によって測定された、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％またはそれより多い。本明細書に記載の組成物を対象に投与するための多様な手段は、当業者に公知である。そのような方法は、非限定的に、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、局所、注射、または腫瘍内投与を含むことができる。投与は、局所または全身であることができる。

本明細書において考えられている組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、植込みまたは移植を含む任意の好都合な方法によって実施され得る。好ましい態様では、組成物は、非経口的に投与される。本明細書において使用される語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を表し、非限定的に、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、関節包内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内および頬骨内の注射および注入を含む。一態様では、本明細書において考えられている組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射によって対象に投与される。

本明細書に記載の細胞（例えば、T細胞または多成分CAR細胞）を含む薬学的組成物は、細胞10²～10¹⁰個/kg体重、好ましくは細胞10⁵～10⁶個/kg体重の投薬量（その範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得ると概説することができる。細胞数は、組成物の意図される最終用途に依存し、その中に含まれる細胞型も同様である。本明細書において提供される使用について、細胞は、一般的に体積1リットル以下であり、500mL以下、250mLまたは100mL以下でさえあることができる。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には細胞10⁶個/ml超であり、一般的に細胞10⁷個/ml超であり、一般的に細胞10⁸個/mlまたはそれより大きい。臨床的に関連する数の免疫細胞は、累積的に細胞10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、または10¹²個以上である複数の注入に配分できる。本発明の一部の局面では、特に全ての融合細胞が特定の標的抗原に再方向付けされるので、10⁶個/キログラム（患者1人あたり10⁶～10¹¹個）の範囲のより少ない細胞数が投与され得る。多成分CAR発現細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、治療を受けている患者に対して同種、同系、異種、または自己由来であり得る。所望であれば、処置は、本明細書において免疫応答の誘導を高めると記載されているようなマイトジェン（例えばPHA）またはリンホカイン、サイトカイン、および／もしくはケモカイン（例えば、IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18、およびTNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1αなど）の投与も含み得る。一部の態様では、投薬量は、細胞約1×10⁵個～細胞約1×10⁸個/kg体重であることができる。一部の態様では、投薬量は、細胞約1×10⁶個～細胞約1×10⁷個/kg体重であることができる。一部の態様では、投薬量は、細胞約1×10⁶個/kg体重であることができる。一部の態様では、細胞の1用量を投与できる。一部の態様では、細胞用量を、例えば1、2回、またはそれより多い回数繰り返すことができる。一部の態様では、細胞用量を、例えば毎日、毎週、または毎月ベースで投与できる。

薬剤の投薬量範囲は、効力に依存し、所望の効果（例えば腫瘍の成長の減速または腫瘍サイズの減少）を生じさせるために十分大きな量を包含する。投薬量は、許容されない有害副作用を引き起こすほど大きくあるべきでない。一般的に、投薬量は、患者の年齢、状態、および性別により変動し、かつ当業者によって決定されることができる。万一、任意の合併症が発生した場合には、投薬量は、個々の医師によって調整されることもできる。一部の態様では、投薬量は、0.001mg/kg体重～0.5mg/kg体重の範囲である。一部の態様では、用量範囲は、5μg/kg体重～100μg/kg体重である。あるいは、用量範囲は、血清レベルを1μg/mL～1000μg/mLの間に維持するように設定（titrate）できる。全身投与の場合は、例えば、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、またはそれより多い治療量を対象に投与できる。

上で列挙された用量の投与を繰り返すことができる。一部の態様では、用量は、1日1回または1日複数回、例えば非限定的に、1日3回与えられる。一部の態様では、上記で列挙された用量は、毎日、数週間、または数カ月間投与される。処置の持続期間は、対象の臨床的進行および治療に対する応答性に依存する。

一部の態様では、用量は、約2mg/kg～約15mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約2mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約4mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約5mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約6mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約8mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約10mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約15mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、約100mg/m²～約700mg/m²であることができる。一部の態様では、用量は、約250mg/m²であることができる。一部の態様では、用量は、約375mg/m²であることができる。一部の態様では、用量は、約400mg/m²であることができる。一部の態様では、用量は、約500mg/m²であることができる。

一部の態様では、用量は、静脈内投与されることができる。一部の態様では、静脈内投与は、約10分～約3時間にわたって起こる注入であることができる。一部の態様では、静脈内投与は、約30分～約90分間にわたって起こる注入であることができる。

一部の態様では、用量は、およそ毎週投与されることができる。一部の態様では、用量は、毎週投与されることができる。一部の態様では、用量は、毎週、約12週間～約18週間投与されることができる。一部の態様では、用量は、およそ2週間毎に投与されることができる。一部の態様では、用量は、およそ3週間毎に投与されることができる。一部の態様では、用量は、およそ2週間毎に投与される約2mg/kg～約15mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、およそ3週間毎に投与される約2mg/kg～約15mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、およそ2週間毎に静脈内投与される約2mg/kg～約15mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、およそ3週間毎に静脈内投与される約2mg/kg～約15mg/kgであることができる。一部の態様では、用量は、およそ毎週静脈内投与される約200mg/m²～約400mg/m²であることができる。一部の態様では、用量は、およそ2週間毎に静脈内投与される約200mg/m²～約400mg/m²であることができる。一部の態様では、用量は、およそ3週間毎に静脈内投与される約200mg/m²～約400mg/m²であることができる。一部の態様では、合計で約2つ～約10個の用量が投与される。一部の態様では、合計で4つの用量が投与される。一部の態様では、合計で5つの用量が投与される。一部の態様では、合計で6つの用量が投与される。一部の態様では、合計で7つの用量が投与される。一部の態様では、合計で8つの用量が投与される。一部の態様では、投与は、合計で約4週間～約12週間にわたり起こる。一部の態様では、投与は、合計約6週間にわたり起こる。一部の態様では、投与は、合計約8週間にわたり起こる。一部の態様では、投与は、合計約12週間にわたり起こる。一部の態様では、初回用量は、後続の用量よりも約1.5から約2.5倍大きいことができる。

一部の態様では、用量は、約1mg～約2000mgであることができる。一部の態様では、用量は、約3mgであることができる。一部の態様では、用量は、約10mgであることができる。一部の態様では、用量は、約30mgであることができる。一部の態様では、用量は、約1000mgであることができる。一部の態様では、用量は、約2000mgであることができる。一部の態様では、用量は、静脈内注入によって毎日与えられる約3mgであることができる。一部の態様では、用量は、静脈内注入によって毎日与えられる約10mgであることができる。一部の態様では、用量は、静脈内注入によって1週間に3回与えられる約30mgであることができる。

治療有効量は、腫瘍のサイズ、腫瘍の成長などに統計的に有意な測定可能な変化を生じるために十分な薬剤の量である（効力の測定は、本明細書において以下に記載される）。そのような有効量は、臨床試験および動物試験で計測できる。

薬剤は、経時的な注射または緩徐注入によって静脈内投与できる。所与の経路に適切な製剤ならば、例えば、本明細書に記載の方法および組成物に有用な薬剤は、静脈内、鼻腔内に、吸入により、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内に投与されることができ、所望であれば蠕動手段によって、または当業者に公知の他の手段によって送達されることができる。本明細書において使用される化合物は、がんを有する患者に経口、静脈内または筋肉内投与されることが好ましい。腫瘍塊への直接局所投与も、具体的に考えられている。

少なくとも1種の薬剤を含有する治療用組成物は、例えば単位用量で好都合に投与されることができる。治療用組成物を参照して使用される場合の用語「単位用量」は、対象に適切な単位投薬量としての物理的に別個の単位であって、それぞれが、必要とされる生理学的に許容される希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと関連して所望の治療効果を生じると計算される所定量の活性物質を含有する単位を表す。

組成物は、投薬製剤と適合するやり方および治療有効量で投与される。投与されるべき量およびタイミングは、処置されるべき対象、対象のシステムが活性成分を利用する能力、および所望の治療効果の度合に依存する。

対象に部分多成分CAR細胞および認識ポリペプチドが投与される態様では、部分多成分CAR細胞および認識ポリペプチドが一緒にまたは別々に投与されることができる。対象に部分多成分CAR細胞および認識ポリペプチドが別々に投与される態様では、各組成物は、本明細書に記載の任意の投薬量および投与経路／通例に従って別々に投与されることができる。

投与される必要のある活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に特定である。しかし、全身適用に適切な投薬範囲が、本明細書に開示され、投与経路に依存する。投与に適切な投与計画も変動するが、初回投与に続く、後続の注射または他の投与による1時間または複数時間の間隔の反復用量によって代表される。あるいは、インビボ療法のために特定化された範囲内に血中濃度を維持するために十分な連続静脈内注入が、考えられている。

一部の態様では、方法は、組合せ療法の部分として1種または複数種の追加的な化学療法剤、生物製剤（biologic）、薬物、または処置と一緒に本明細書に記載の薬学的組成物を投与する段階をさらに含む。一部のそのような態様では、化学療法剤、生物製剤、薬物、または処置は、放射線療法、外科手術、抗体試薬、および／または小型分子からなる群より選択される。

本明細書に記載の方法の一部の態様では、方法は、本明細書に記載の薬学的組成物を投与されている対象に1種または複数種の化学療法剤を投与する段階をさらに含む。化学療法剤の非限定的な例は、チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミド（cyclosphosphamide）のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル；ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドパ（uredopa）のようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレン（triethiylene）チオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）を含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン（carzelesin）およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン（dolastatin）；デュオカルマイシン（合成類似体、KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチン（sarcodictyin）；スポンジスタチン（spongistatin）；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）のようなニトロソウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質のような抗生物質（例えばカリチアマイシン、特にカリチアマイシンγ1IおよびカリチアマイシンオメガI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照されたい）；ジネミシン（dynemicin）Aを含むジネミシン；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）のような代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗アドレナリン薬；フロリン酸（frolinic acid）のような葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル、アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン（lonidainine）；メイタンシンおよびアンサミトシン（ansamitocin）のようなメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラクリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン（losoxantrone）；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products、Eugene、Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフィラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリン（verracurin）A、ロリジンAおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（登録商標）クレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）、およびTAXOTERE（登録商標）ドセタキセル（doxetaxel）（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Camptosar、CPT-11）（イリノテカンと5-FUおよびロイコボリンとの処置レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン処置レジメン（FOLFOX）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb（登録商標））；細胞増殖を低下させるPKC-α、Raf、H-Ras、EGFRおよびVEGF-Aの阻害剤（例えば、エルロチニブ（Tarceva（登録商標）））ならびに上記のうちの任意の1つの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含むことができる。

本明細書において使用される用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を表す。用語は、放射性同位体（例えば、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、およびLuの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物または動物起源の小型分子毒素または酵素活性毒素のような毒素をその断片および／または変異体を含めて含むことが意図される。

本明細書において使用される用語「化学療法」または「化学療法剤」は、異常細胞の成長によって特徴付けられる疾患の処置に治療有用性を有する任意の化学薬剤を表す。そのような疾患は、腫瘍、新生物およびがんならびに肥厚成長によって特徴付けられる疾患を含む。本明細書において使用される化学療法剤は、化学薬剤および生物薬剤の両方を包含する。これらの薬剤は、生存継続のためにがん細胞が依存する細胞活性を阻害するように機能する。化学療法剤の部類には、アルキル化／アルカロイド剤、代謝拮抗薬、ホルモンまたはホルモン類似体、および種々の抗腫瘍薬が含まれる。これらの薬剤の全てではないにしろ大部分が、がん細胞に対して直接有毒であり、免疫刺激を必要としない。一態様では、化学療法剤は、固形腫瘍のような新生物の処置に有用な薬剤である。一態様では、化学療法剤は、放射性分子である。当業者は、有用な化学療法剤を容易に特定できる（例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition； Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2^nd Edition, 2000 Churchill Livingstone, Inc； Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995； Fischer D S, Knobf M F, Durivage H J (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993を参照されたい）。本明細書に記載の二重特異性および多重特異性ポリペプチド剤は、追加的な化学療法剤と共に使用できる。

「放射線療法」は、細胞が正常に機能する能力を限定するまたは細胞を完全に破壊するのに十分な損傷を細胞に誘導するように方向付けられたγ線またはβ線の使用を意味する。投薬量および処置の持続期間を決定するために当技術分野においてにおいて公知の多くの方法があることが認識されている。典型的な処置が、1回投与として与えられ、典型的な投薬量は、1日10～200単位（グレイ）の範囲である。

一部の態様では、本明細書に記載の方法は、対象に追加的な免疫療法を投与する段階をさらに含むことができる。本明細書において使用される「免疫療法」は、腫瘍と闘うように患者の自身の免疫系を誘導するために設計された治療戦略の多様なセットを表し、かつ非限定的に、表在性膀胱がんのための膀胱内BCG免疫療法、悪性黒色腫および腎細胞がんに対するような特異的免疫応答を生成するためのワクチン、前立腺由来細胞に対する特異的免疫応答を誘導するために患者由来の樹状細胞に前立腺酸性ホスファターゼペプチドが負荷される、前立腺がんのためのシプロイセルTの使用、1つもしくは複数の免疫細胞型を刺激するサイトカイン、成長因子および／もしくはシグナル伝達分子（例えばインターロイキン）の投与、患者への再導入の前に腫瘍抗原に特異的なリンパ球および／もしくは樹状細胞のエクスビボ拡大培養および／もしくは刺激、イミキモド、養子細胞移入、ならびに／または例えば、国際公開公報第2003/063792号および米国特許第8,329,660号に記載された方法を含む。一部の態様では、免疫療法は、NK応答を刺激する。一部の態様では、免疫療法は、養子細胞移入アプローチ、すなわち、養子免疫療法である。

一部の態様では、本明細書に記載の方法は、追加的な抗体、その抗原結合部分、またはCARを含むT細胞を対象に投与する段階をさらに含むことができる。一部の態様では、本明細書に記載の方法は、サイトカインを対象に投与する段階をさらに含むことができる。抗体ベースおよびサイトカインベース療法は、当技術分野において公知であり、かつ非限定的な例として、アレムツズマブ；ベバシズマブ；ブレンツキシマブベドチン；セツキシマブ；ゲムツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；イピリムマブ；オファツムマブ；パンチブムマブ（pantibumumab）；リツキシマブ；トシツモマブ；トラスツズマブ；インターロイキン-2、およびインターフェロン-αを含むことができる。

がんのための所与の処置の効力は、熟練の臨床家によって決定されることができる。しかし、例えば腫瘍の徴候もしくは症状の任意の1つもしくは全てが有益な方式で改変される、または他の臨床的に許容される症状が、本明細書に記載の薬剤を用いた処置の後に、例えば少なくとも10％改善もしくは回復までするならば、処置は、本明細書においてその用語が使用されるところの「有効な処置」と見なされる。効力は、入院または医学的介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化しないこと（すなわち、疾患の進行が停止すること）によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。

疾患の処置のための有効量は、それを必要とする哺乳動物に投与された場合に、その疾患について、本明細書においてその用語が定義されるところの有効な処置を招くために十分な量を意味する。薬剤の効力は、例えばがんの物理指標、例えば腫瘍サイズ、腫瘍量、腫瘍密度、血管新生、腫瘍成長速度などを評価することによって決定できる。

有効量、毒性、および治療効力は、例えば、LD50（集団の50％に致死的な用量）およびED50（集団の50％に治療有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定できる。投薬量は、採用される投薬剤形および利用される投与経路に依存して変動できる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比LD50/ED50として表現されることができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、最初、細胞培養アッセイから推定できる。また、用量は、細胞培養または適切な動物モデルにおいて決定されるIC50（すなわち、症状の最大半値阻害を達成する活性成分濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて配合できる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えばとりわけ腫瘍サイズまたは腫瘍成長のためのアッセイによって監視できる。投薬量は、医師によって決定されることができ、必要により処置の観察された効果に適合するように調整できる。

効力は、入院または医学的介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化しないこと（すなわち、疾患の進行が停止すること）によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例は、ヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の処置を含み、かつ（1）疾患を阻害すること、例えば、症状（例えば疼痛もしくは炎症）の悪化を防止すること；または（2）疾患の重症度を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすことを含む。疾患の処置のための有効量は、それを必要とする対象に投与した場合に、その疾患についてその用語が本明細書において定義されるところの有効な処置を招くために十分な量を意味する。薬剤の効力は、状態または所望の応答（例えば、腫瘍成長の阻害）の物理指標を評価することによって決定できる。そのようなパラメーターの任意の1つまたはパラメーターの任意の組合せを測定することによって投与および／または処置の効力を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書に記載の状態、例えばがんの処置の動物モデルにおいて効力を評価できる。実験動物モデルを使用する場合、マーカー、例えば腫瘍サイズに統計的に有意な変化が観察される場合に処置の効力が証明される。

一部の態様では、本明細書に記載の技法は、本明細書に記載の多成分CAR（もしくはその部分、または多成分CARを含む細胞）および任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。一部の態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載の多成分CAR（もしくはその部分、または多成分CARを含む細胞）を含む。一部の態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載の多成分CAR（もしくはその部分、または多成分CARを含む細胞）から本質的になる。一部の態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載の多成分CAR（もしくはその部分、または多成分CARを含む細胞）からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤は、食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒を含む。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として役立つことができる材料のいくつかの非限定的な例は、（1）ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；（2）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；（3）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロースおよび酢酸セルロースのようなその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤；（8）カカオ脂および坐剤用ロウのような賦形剤；（9）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油；（10）プロピレングリコールのようなグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）のようなポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤；（23）血清アルブミン、HDLおよびLDLのような血清構成成分；（22）エタノールのようなC₂-C₁₂アルコール；ならびに（23）医薬製剤に採用される他の無毒の適合性物質を含む。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤も製剤中に存在できる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」または同様のものなどの用語が、本明細書において互換的に使用される。一部の態様では、担体は、本明細書に記載の活性薬剤の分解を阻害する。

一部の態様では、本明細書に記載の多成分CAR（もしくはその部分、または多成分CARを含む細胞）を含む薬学的組成物は、非経口剤形であることができる。非経口投薬剤形の投与は、典型的には汚染物質に対する患者の自然防御をバイパスするので、非経口投薬剤形は、好ましくは無菌である、または患者に投与する前に滅菌されることができる。非経口投薬剤形の例には、非限定的に、注射の準備が完了した溶液、薬学的に許容される注射用ビヒクル中に溶解または懸濁する準備が完了した乾燥製品、注射の準備が完了した懸濁液、およびエマルションが含まれる。さらに、非限定的にDUROS（登録商標）型投薬剤形および用量ダンピング（dose-dumping）を含む制御放出非経口投薬剤形は、患者の投与のために調製されることができる。

開示された多成分CAR（もしくはその部分、または多成分CARを含む細胞）の非経口投薬剤形を提供するために使用できる適切なビヒクルは、当業者に周知である。例には、非限定的に、無菌水；注射用水USP；食塩水溶液；グルコース溶液；非限定的に塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、および乳酸リンゲル注射液のような水性ビヒクル；非限定的にエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールのような水混和性ビヒクル；ならびに非限定的にトウモロコシ油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルのような非水性ビヒクルが含まれる。活性成分の薬学的に許容される塩の溶解度を改変または修飾する化合物も、従来の非経口投薬剤形および制御放出非経口投薬剤形を含む本開示の非経口投薬剤形に組み入れることができる。

薬学的組成物は、経口投与に適切であるように、例えば非限定的に、錠剤（非限定的に分割錠またはコーティング錠を含む）、丸剤、カプレット、カプセル剤、咀嚼錠、粉末パケット、カシェ剤、トローチ剤、ウエハース、エアロゾル噴霧剤、または非限定的にシロップ剤、エリキシル剤、水性液体中の溶液または懸濁液、非水性液体、水中油型エマルション、または油中水型エマルションのような液剤のような別個の投薬剤形として製剤化することもできる。そのような組成物は、開示された化合物の薬学的に許容される塩の予め決定された量を含有し、当業者に周知の薬学の方法によって調製され得る。一般的に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照されたい。

従来の投薬剤形は、一般的に、製剤からの迅速または即時薬物放出を提供する。薬物の薬理および薬物動態に依存して、従来の投薬剤形の使用は、患者の血液および他の組織中の薬物濃度に大きな変動をもたらすことができる。これらの変動は、投薬回数、作用の開始、効力の持続期間、治療血中レベルの維持、毒性、副作用などのいくつかのパラメーターに影響する可能性がある。有利には、制御放出製剤を使用して、薬物の作用開始、作用持続期間、治療濃度域内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御できる。特に、薬物の過少投与（すなわち、最小治療レベルを下回る）および薬物についての毒性レベルを超過することの両方から起こる可能性がある潜在的有害作用および安全性への懸念を最小限にしながら、薬物の最大有効性が達成されることを確実にするために、制御放出または持続放出投薬剤形または製剤を使用できる。一部の態様では、組成物は、徐放製剤の状態で投与できる。

制御放出医薬品は、非制御放出対応物によって達成される薬物療法よりも薬物療法を改善するという共通の目標を有する。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小の時間で状態を治癒または制御するために採用されている最小限の薬物物質によって特徴付けられる。制御放出製剤の利点には、1）薬物の長時間活性；2）投薬回数の減少；3）患者のコンプライアンス増加；4）より少ない薬物合計量の使用；5）局所または全身副作用の減少；6）薬物蓄積の最小化；7）血中レベルの変動減少；8）処置の効力改善；9）薬物活性の増強減少または喪失；および10）疾患または状態の制御速度の改善が含まれる。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。

多くの制御放出製剤は、所望の治療効果を直ちに生じる量の薬物（活性成分）を最初に放出し、このレベルの治療または予防効果を長期間にわたり維持するために他の薬物量を徐々に連続的に放出するように設計されている。この一定レベルの薬物を体内に維持するために、薬物は、代謝され身体から排泄されつつある薬物の量に代わる速度で投薬剤形から放出されなければならない。活性成分の制御放出は、非限定的に、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理的条件または化合物を含む、様々な条件によって刺激されることができる。

様々な公知の制御放出または持続放出投薬剤形、製剤、および機器を、本開示の塩および組成物用に適応させることができる。例には、非限定的に、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185B1号に記載されているものが含まれる。これらの投薬剤形を使用して、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧システム（OROS（登録商標）（例えばAlza Corporation, Mountain View, Calif. USA））、または所望の放出プロファイルを提供するための様々な比率のその組合せを使用する1種または複数種の活性成分の緩徐放出または制御放出を提供できる。

便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用される一部の用語および語句の意味を下に提供する。特に述べないかぎり、または文脈から暗に意味されないかぎり、以下の用語および語句は、下に提供される意味を含む。特定の態様の説明を助けるために定義が提供され、発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は、請求された発明を限定することを意図しない。特に定義されないかぎり、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用と、本明細書において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書内に提供される定義が優先されるものとする。

便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に採用されるある特定の用語をここに集める。

用語「低下する」、「減少した」、「減少」、または「阻害する」は、全て、本明細書において、統計的に有意な量の低下を意味するために使用される。一部の態様では、「減少する」、「減少」または「低下する」または「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置の非存在）と比較して少なくとも10％の低下を意味し、かつ例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれより多い低下を含むことができる。本明細書において使用される「低下」または「阻害」は、参照レベルと比較した完全な阻害または減少を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比較した100％阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有さない個体について正常範囲内として受け入れられるレベルへの低下であることができる。

用語「増加した」、「増加する」、「高める」、または「活性化する」は、全て、本明細書において、統計的に有意な量だけの増加を意味するために使用される。一部の態様では、用語「増加した」、「増加する」、「高める」、または「活性化する」は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、もしくは100％を含む最大100％の増加、もしくは10～100％の間の任意の増加、または参照レベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍から10倍またはそれより大きい間の任意の増加を意味できる。マーカーまたは症状に関連して、「増加する」は、そのようなレベルにおける統計的に有意な増加である。

本明細書において使用される「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザル（Rhesus）が含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ類、例えば、イエネコ、イヌ類、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えば、マス、ナマズおよびサケが含まれる。一部の態様では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「個体」、「患者」および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。

好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであることができるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、がんの動物モデルを表す対象として有利に使用できる。対象は、男性または女性であることができる。

対象は、処置の必要のある状態（例えばがん）またはそのような状態に関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断された、またはそれを患うもしくは有すると特定された対象であって、任意で、がんまたはがんと関係する1つもしくは複数の合併症のための処置をすでに受けた対象であることができる。あるいは、対象は、がんまたはがんと関係する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていない対象であることもできる。例えば、対象は、がんまたはがんと関係する1つもしくは複数の合併症についての1つまたは複数のリスク因子を示す対象またはリスク因子を示さない対象であることができる。

特定の状態についての処置を「必要とする対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、またはその状態を発生するリスクがある、対象であることができる。

一部の態様では、本明細書に記載の多成分CARまたはその部分をコードする核酸は、ベクターによって含まれる。本明細書に記載の局面の一部では、本明細書に記載の多成分CARもしくはその部分をコードする核酸配列、またはその任意のモジュールは、ベクターと機能的に連結されている。本明細書において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞の間の移行のために設計された核酸構築物を表す。本明細書において使用されるベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であることができる。用語「ベクター」は、適当な制御要素と関連した場合に複製が可能であり、かつ細胞に遺伝子配列を移行させることができる任意の遺伝要素を包含する。ベクターは、非限定的に、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含むことができる。

本明細書において使用される用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列と連結される配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを表す。発現する配列は、多くの場合に細胞に対して異種であるが、必ずしも異種であるわけではない。発現ベクターは、追加的な要素を含む場合があり、例えば、発現ベクターは、2つの複製システムを有することで、それが2つの生物に、例えば発現についてヒト細胞に、ならびにクローニングおよび増幅について原核生物宿主に維持されることを可能にし得る。用語「発現」は、RNAおよびタンパク質を産生することならびに適宜、タンパク質を分泌することに関与する細胞過程を表し、この細胞過程は、該当する場合、非限定的に例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳ならびにタンパク質のフォールディング、修飾およびプロセシングを含む。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適切な調節配列と機能的に連結される場合にインビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コード領域、例えば5'非翻訳（5'UTR）配列または「リーダー」配列および3'UTR配列または「トレーラー（trailer）」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）に先行および後続する領域を含む場合または含まない場合がある。

本明細書において使用される用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する、核酸ベクター構築物を表す。ウイルスベクターは、可欠ウイルス遺伝子の代わりに本明細書に記載の多成分CARまたはその部分をコードする核酸を含有できる。ベクターおよび／または粒子は、任意の核酸をインビトロまたはインビボのいずれかで細胞内に導入する目的で利用され得る。多くの形態のウイルスベクターが、当技術分野において公知である。

「組換えベクター」は、インビボで発現することが可能な異種核酸配列または「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書に記載のベクターを、一部の態様では、他の適切な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解すべきである。一部の態様では、ベクターは、エピソーム性である。適切なエピソームベクターの使用は、対象において関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外DNAとして維持する手段を与えることによって、染色体組込みの潜在的影響を排除する。

本明細書において使用される用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体の単位を組み入れている任意の分子、好ましくはポリマー分子を表す。核酸は、1本鎖または2本鎖のいずれかであることができる。1本鎖核酸は、変性した2本鎖DNAの一方の核酸鎖であることができる。あるいは、1本鎖核酸は、いかなる2本鎖DNA由来でもない1本鎖核酸であることができる。一局面では、核酸は、DNAであることができる。別の局面では、核酸は、RNAであることができる。適切な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適切な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。

本明細書において使用される用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣合う残基のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって相互に結び付いた一連のアミノ酸残基を呼ぶために本明細書において互換的に使用される。用語「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを表す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、多くの場合、比較的大型のポリペプチドを参照して使用され、一方で用語「ペプチド」は、多くの場合、小型のポリペプチドを参照して使用されるが、これらの用語の用法は、当技術分野において重複している。遺伝子産物およびその断片を表す場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然タンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、断片ならびに前記の他の等価物、変異体、断片、および類似体を含む。

本明細書において使用される「抗体」は、抗体を自然に産生する任意の種から得られようと、組換えDNA技法によって生み出されようと；血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されようと、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE分子またはその抗原特異的抗体断片（非限定的に、Fab、F(ab')₂、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、閉鎖立体配座多重特異性抗体、ジスルフィド結合scfv、ダイアボディを含む）を表す。

本明細書に記載の「抗原」は、抗体薬剤上の結合部位によって結合される分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドによって結合され、インビボで抗体応答を生じることが可能である。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸もしくは他の分子またはその部分であることができる。用語「抗原決定基」は、抗原結合分子によって、より詳細には、該分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。

本明細書において使用される用語「抗体試薬」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつ所与の抗原と特異的に結合する、ポリペプチドを表す。抗体試薬は、抗体の抗原結合ドメインを含む、抗体またはポリペプチドを含むことができる。一部の態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。例えば、抗体は、重（H）鎖可変領域（本明細書においてVHと略す）および軽（L）鎖可変領域（本明細書においてVLと略す）を含むことができる。別の例では、抗体は、2つの重（H）鎖可変領域および2つの軽（L）鎖可変領域を含む。用語「抗体試薬」は、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、およびドメイン抗体（dAb）断片（例えば、その全体として参照により本明細書に組み入れられるde Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996； 26(3):629-39を参照されたい））および完全抗体を包含する。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgMという構造特徴（ならびにそのサブタイプおよび組合せ）を有できる。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）および霊長類化抗体を含む、任意の起源であることができる。抗体は、ミディボディー（midibody）、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含む。

VH領域およびVL領域は、より大きく保存されている「フレームワーク領域」（「FR」）と呼ばれる領域が散在した、「相補性決定領域」（「CDR」）と呼ばれる超可変領域にさらに細分できる。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、正確に定義されている（その全体として参照により本明細書に組み入れられる、Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242およびChothia, C. et al.(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照されたい）。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配列した3つのCDRおよび4つのFRから構成される。

本明細書において互換的に使用される用語「抗原結合断片」または「抗原結合ドメイン」は、関心対象の標的と特異的に結合する能力を保持する完全長抗体の1つまたは複数の断片を表すために使用される。完全長抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例は、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；（iii）VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単腕のVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインまたはVLドメインからなるdAb断片（その全体として参照により本明細書に組み入れられるWard et al.,(1989) Nature 341:544-546）；ならびに（vi）特異的抗原結合機能性を保持する単離された相補性決定領域（CDR）を含む。

本明細書において使用される用語「特異的結合」は、第1の実体が、非標的である第3の実体と結合するよりも大きな特異性および親和性で第2の標的実体と結合する、2つの分子、化合物、細胞および／または粒子の間の化学相互作用を表わす。一部の態様では、特異的結合は、第3の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍またはそれより大きい、第2の標的実体に対する第1の実体の親和性を表すことができる。所与の標的に特異的な試薬は、利用されているアッセイの条件下、標的に対して特異的結合を示す試薬である。

さらに、および本明細書に記載のように、組換えヒト化抗体は、ヒトにおける治療のために機能的活性を維持しながら潜在的免疫原性を減少するようにさらに最適化できる。これに関して、機能的活性は、本明細書に記載の組換え抗体またはその抗体試薬と関連する1つまたは複数の公知の機能的活性を示すことが可能なポリペプチドを意味する。そのような機能的活性は、例えば標的と結合する能力を含む。

「がん細胞」は、新しい遺伝物質の取込みを必ずしも伴わない、自然発生的なまたは誘導された表現型変化を有する、インビボ、エクスビボ、または組織培養の状態のいずれかのがん性、前がん性の、または形質転換された細胞である。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染および新しいゲノム核酸の組込み、または外因性核酸の取込みから発生する可能性があるものの、また、自然発生的にまたは発がん物質への曝露後にも発生し、それによって内因性遺伝子を変異させる可能性がある。形質転換／がんは、例えば、形態変化、細胞の不死化、異常な成長制御、病巣形成、足場非依存性、悪性、接触阻害および成長の密度限界の欠如、成長因子または血清への非依存性、腫瘍特異マーカー、侵襲性または転移、ならびにヌードマウスのような適切な動物宿主における腫瘍成長と関連する。例えば、Freshney, CULTURE ANIMAL CELLS: MANUAL BASIC TECH. (3rd ed., 1994)を参照されたい。本明細書において使用される用語「がん」は、身体器官およびシステムの正常な機能発揮を妨害する、細胞の制御されない成長を表す。がんまたは腫瘍を有する対象は、対象の体内に存在する客観的に測定可能ながん細胞を有する対象である。良性および悪性のがん、ならびに休眠中の腫瘍または微小転移巣が、本定義に含まれる。その本来の場所から移動して重要器官に播種するがんは、罹患した器官の機能悪化により、最終的に対象の死をもたらす可能性がある。

本明細書において使用される「腫瘍」は、身体器官およびシステムの正常な機能発揮を妨害する腫瘍細胞の制御されない成長を表す。用語「がん」および「悪性腫瘍」は、転移性の、すなわち、浸潤性になって本来の腫瘍部位から離れた組織に腫瘍成長を播種する、腫瘍を表す。がんまたは腫瘍を有する対象は、客観的に測定可能ながん細胞が対象の身体に存在する対象である。良性腫瘍および悪性がんならびに潜在的に休眠中の腫瘍または微小転移巣が、本定義に含まれる。その本来の場所から遊走し、他の重要器官に播種するがんは、罹患した器官の機能的悪化により、最終的に対象の死をもたらす可能性がある。白血病のような造血器のがんは、対象における正常な造血区画を打ち負かし、それによって、造血不全（貧血、血小板減少および好中球減少の形態）に導き、最終的に死亡を引き起こすことが可能である。

がんの例には、非限定的に、がん腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん；膀胱がん；骨がん；脳およびCNSのがん；乳がん；腹膜がん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸直腸がん；結合組織のがん；消化系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼がん；頭頸部がん；胃がん（胃腸がんを含む）；神経膠芽腫（GBM）；肝がん；肝細胞腫；上皮内新生物.；腎がんまたは腎臓がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、および肺扁平上皮がん）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔がん（例えば口唇、舌、口、および咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺がん；肉腫；皮膚がん；扁平上皮細胞がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮または子宮内膜がん；泌尿器系のがん；外陰がん；ならびに他のがん腫および肉腫；ならびにB細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）；小リンパ球性（SL）NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽細胞性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小型非開裂性細胞NHL；巨大病変NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高γグロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（CLL）；急性リンパ芽球性白血病（ALL）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（PTLD）ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連するもの）、およびメージュ症候群と関連する異常な血管増殖が含まれる。

本明細書において使用される用語「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「回復」は、目標が、疾患または障害、例えばがんに関連する状態の進行または重症度を後退させる、軽減させる、回復する、阻害する、減速させるまたは停止させることである、治療的処置を表す。用語「処置すること」は、例えばがんと関連する、状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を減少または軽減させることを含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少するならば、処置は一般的に「有効である」。あるいは、疾患の進行が減少または停止するならば、処置は「有効である」。すなわち、「処置」は、ただ症状またはマーカーの改善だけでなく、処置の非存在下で予想される症状と比較して、症状の進行または悪化の休止または少なくとも減速を含む。有益なまたは所望の臨床結果には、非限定的に、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定した（すなわち悪化していない）状態、疾患進行の遅延もしくは減速、病状の回復もしくは一時的緩和、寛解（部分もしくは完全のいずれにせよ）、および／または死亡率低下が含まれる。疾患の「処置」という用語は、疾患の症状または副作用の緩和を提供することも含む（対症療法を含む）。

本明細書において使用される用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば医薬品工業で通常使用される担体と組み合わせた活性薬剤を表す。語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に適切な、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を有さない、合理的な便益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または投薬剤形を表すために本明細書において採用される。

本明細書において使用される用語「投与すること」は、所望の部位での薬剤の少なくとも部分送達を招く方法または経路により、本明細書開示の化合物を対象中に配置することを表す。本明細書開示の化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置を招く任意の適切な経路によって投与されることができる。

用語「統計的に有意」または「有意に」は、統計的有意性を表し、一般的に2標準偏差（2SD）以上の差を意味する。

実施例以外に、または特に指摘しないかぎり、本明細書使用の成分量または反応条件を表現する全ての数は、全ての場合に用語「約」で修飾されていると理解すべきである。パーセンテージと共に使用されている場合の用語「約」は、±1％を意味できる。

本明細書において使用される用語「含んでいる」または「含む」は、組成物、方法、および方法または組成物に必須のそれらの各成分に関連して使用されるものの、必須であろうとなかろうと、未特定の要素の包含に限定はない。

用語「からなる」は、態様の説明に列挙されないいかなる要素も排除した、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれらの各成分を表す。

本明細書において使用される用語「から本質的になる」は、所与の態様に必要な要素を表す。本用語は、その態様の基本特徴および新規または機能的な特徴に著しく影響しない要素の存在を容認する。

単数の用語「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、複数の指示対象を含む。同様に、語句「または」は、文脈が明らかに他のことを示さないかぎり、「および」を含むことが意図される。本開示の実施または試験に本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の方法および材料を使用できるとはいえ、適切な方法および材料が、下に記載されている。略語「e.g.」は、ラテン語の「exempli gratia」由来であり、本明細書において非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「e.g.」は、用語「例えば」と同義である。

本明細書において特に定義されないかぎり、本出願と関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の技術者に通常理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、それ自体で変動する可能性があることを理解すべきである。本明細書において使用される用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することが意図されない。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見出すことができ、これらの内容は、その全体として参照により本明細書に全て組み入れられる。

当業者は、有用な化学療法剤を容易に特定できる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning； Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition； Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff's Clinical Oncology, 2013 Elsevier； およびFischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照されたい）。

他の用語は、本明細書において、本発明の様々な局面の説明の中で定義される。

本出願全体にわたり引用される参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属特許出願を含む全ての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技法に関して使用され得るそのような刊行物に記載された方法論を説明および開示するために参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日前に、それらの開示のためにのみ提供される。この点に関して何物も、本発明者が先行発明によりまたは任意の他の理由のためにそのような開示に先行する権利を与えられないとの承認として解釈されるべきではない。これらの文書の日付の全ての記述または内容に関する表現は、出願者が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。

本開示の態様の説明は、網羅的であることまたは開示された正確な形態に本開示を限定することが、意図されない。本開示の特定の態様およびその例が、例証的な目的で本明細書に記載されるとはいえ、関連する技術分野の技術者が認識するように、本開示の範囲内で様々な等価の修飾が可能である。例えば、方法の段階または機能が所与の順序で提示されるとはいえ、代替的な態様が、異なる順序で機能を果たす場合があり、または機能が実質的に同時に果たされる場合がある。本明細書において提供される本開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用されることができる。さらなる態様を提供するために本明細書に記載の様々な態様を組み合わせることができる。本開示の局面は、上記の参考文献および出願の組成、機能、および概念を採用して、本開示のいっそうさらなる態様を提供するために、必要に応じて修飾できる。そのうえ、生物学的機能等価性の考察により、種類または量における生物学的または化学的作用に影響を与えずにタンパク質の構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、本開示にこれらおよび他の変更を加えることができる。そのような全ての修飾は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

前記態様のいずれかの特定の要素を他の態様における要素と組み合わせるまたは取り替えることができる。さらに、本開示のある特定の態様と関連する利点が、これらの態様と関連して記載されているものの、他の態様がそのような利点を示す場合もあり、必ずしも全ての態様が本開示の範囲内に入るそのような利点を示す必要はない。

単鎖可変断片（scFv）と受容体シグナル伝達ドメインとの融合体であるキメラ抗原受容体（CAR）を発現しているT細胞は、B細胞悪性腫瘍に対する臨床試験において素晴らしい成功を収めた_1、2。しかし、CAR T細胞は、オフターゲッティングおよび過剰活性化が原因で毒性を有する可能性がある。複数のT細胞シグナル伝達経路の組合せ制御、時間制御、および論理制御のための万能（universal）アプローチを提供することによってCAR T細胞の改善された安全性および効力を提供する方法および組成物が、本明細書に記載されている。

一態様では、2種の抗原を検出できるCARを使用することによって特異性を高めることができることが開発されている^3-6。2種を超える抗原を感知する能力は、腫瘍特異性をさらに改善できる。加えて、CAR T細胞が標的上にある場合であっても、T細胞の過剰活性化がサイトカイン放出症候群をもたらすと、有害副作用がまだ起こる可能性がある。これらの副作用のいくつかを軽減するために、殺傷スイッチおよびONスイッチが開発されている。それでもなお、これらのスイッチは、主として親スイッチとして役立ち、そのため精密制御には不十分である。天然のT細胞活性化の制御は、複数の共刺激および共阻害シグナル伝達経路の均衡により達成されるので⁷、そのようなシグナル伝達経路に調整可能な時間制御を与える戦略は、CAR T細胞の性能を最適化するために重要である。これらの課題は、T細胞応答のインテリジェント制御の必要性を例証している。

（a）ON/OFFスイッチとして役立つ能力、（b）複数種の抗原を感知して論理計算を実行する能力、および（c）複数のシグナル伝達経路を独立して調節する能力を有する万能CARプラットフォームが、CAR T細胞療法を最適化するために必要な制御を提供することについて本明細書に記載されている。この目的のために、本明細書に記載の分割型（split）、万能（universal）、プログラム可能（programmable）かつ再構成可能（reconfigurable）な（SUPRA）CARプラットフォームが使用される。重要なことに、SUPRA CARプラットフォームは、患者のT細胞をさらに改変せずに新しい標的に適応できる。SUPRA CARプラットフォームは、T細胞上に発現した万能受容体と、腫瘍標的化scFvアダプターとからなる、二成分受容体システムである（図12）。万能受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインとしてのロイシンジッパーとの融合体（zipCAR）から生成される。アダプター分子は、コグネイトロイシンジッパーとscFvとの融合体（zipFv）から生成される。zipFv上のscFvは、抗原と結合し、ロイシンジッパーは、T細胞上のzipCARと結合し、それを活性化させる。このシステムは、設定可能な（titratable）誘導物質としてzipFvを有する調整可能なスイッチとしても機能する。しかし、他の既存の分割型CARシステム^8-11とは異なり、複数のシグナル伝達経路の独立した制御および論理演算の実行を可能にする直交zipCAR/zipFv対が、本明細書に記載されている。

以下が、本明細書に記載されている：
ON/OFFスイッチとしてのSUPRA CARプラットフォームの特徴付け。SUPRA CARの設計規則は、様々な設計パラメーターがT細胞活性化にどのように影響するかを考慮して提供される。
SUPRA CARプラットフォームを用いた組合せ論理演算の開発。タンパク質工学アプローチは、ロイシンジッパーの結合における協同性および競合を発生させて、単一の受容体において2入力ブール論理ゲートのパネルを生成させるために利用される。
複数のシグナル伝達経路（シグナル伝達ミキサー）を別々に制御するためのSUPRA CARの開発。組合せおよび時間調節のために、CD3ζ、ならびに共刺激（例えばCD28および4-1BB）および共阻害（例えば、PD-1）シグナル伝達経路を独立して制御するために、直交zipCARが構築された。

SUPRA CARプラットフォームは、インビトロおよびマウスモデルにおいて試験された。モジュール式設計は、細胞性がん免疫療法の安全性および効力を改善するためのツールを提供するだけでなく、高レベルの特異性、柔軟性、および精度を与える。

CAR T細胞療法。患者への腫瘍標的化T細胞の移入は、がん免疫療法のための有望なアプローチである^1、2。特に、CARで改変されたT細胞は、臨床試験において約90％の完全寛解が観察されて、急性リンパ芽球性白血病に対して前例のない効力を示した^1、2。これらの有望な結果にもかかわらず、CAR T細胞療法がこのがんおよび他のがんのために広く採用されるように改善を行うことができる。特に、効力を損なわずにCAR T細胞の特異性を改善することおよび毒性を制限することである。

現在の臨床試験に見出されるCARの設計は、T細胞受容体（TCR）ならびにCD28および4-1BBのような他の共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達ドメインと融合した、固定された抗原特異的scFvから構成される。これらのCARは、1種の抗原だけを検出でき、したがって、腫瘍を健康な組織と識別する能力に限界がある。実際に、T細胞が健康な肺上皮細胞上の低レベルのHer2を認識したので、抗Her2 CARを発現しているT細胞で処置された転移性結腸がんの患者に関して致死性が観察された¹²。腫瘍特異的バイオマーカーを特定するために著しい努力が払われている一方で、それは、依然として非常に困難な目標である。加えて、現在のCARの固定された設計は、標的抗原を発現していないクローンの反乱が原因で患者が再発した場合に、標的を切り替えることを困難にする。さらに、単一の抗原を標的化するCARは、異種腫瘍に対して限られた効力も有し得る。したがって、複数種の抗原を感知し、健康な組織からがんを知的に見分け、かつ腫瘍成長の動的で不均一な性質に適応できるシステムが、非常に望ましい。

現在のCARの設計はまた、T細胞活性化の強度およびタイミングに関して融通が利かない。さらに、この設計は、処置の間にシグナル伝達ドメインを追加または除去することが困難である。したがって、この固定された設計は、T細胞機能を調節できる範囲をストリンジェントに束縛する。CD28または4-1BBのいずれかを含むCARは、臨床試験において成功を実証しているが、シグナル伝達ドメインの現在の選択が理想的であるかどうかは、不確定なままである。例えば、CD28ドメインを有するCARを発現しているT細胞は、より迅速でより強力な殺腫瘍活性を有するが、より短いインビボ持続性を有する。対照的に、4-1BBドメインを含むCARを有するT細胞は、より低速の殺腫瘍キネティクスを有するが、インビボでより良好に増殖および生存する^13、14。加えて、固定されたCARの設計は、CAR上の全てのシグナル伝達経路も同レベルで同時にトリガーする。しかし、一態様では、最適なCAR T細胞応答は、異なる経路が様々なレベルおよび時間尺度で活性化されることを伴う。例えば、インフルエンザ感染の間のような天然のT細胞活性化状態では、4-1BBシグナル伝達は、TCRおよびCD28経路の最初の誘導の48～72時間後まで活性化されない^15-17。そのような態様では、CAR T細胞応答は、異なるシグナル伝達経路を異なる時間に活性化することを伴う。天然のT細胞活性化は多くの共刺激シグナル伝達経路を伴う動的過程であることを考えると、T細胞シグナル伝達用の音楽ミキサーによく似た動的な方法で別々の共刺激（または共阻害）経路を調整することを可能にするCARシステムは、T細胞応答の最適化を大きく促進する。

CAR T細胞が腫瘍を適正に標的化し、完全寛解を達成できる場合であっても、有害副作用（ASE）が観察されうる。CAR T細胞療法の最もよく見られる副作用は、蔓延したT細胞の活性化および増殖と関連するサイトカイン上昇に起因する炎症症状の組合せであるサイトカイン放出症候群（CRS）である。CRSの管理は改善されたものの²、CRSは依然として困難で危険な合併症である。実際に、抗CD19 CAR T細胞を用いた最近の治験では、患者はCRS関連合併症により死亡した¹⁸。CRSに加えて、CAR T細胞で処置された多くの患者に神経毒性も観察され^1、2、最近の治験では4人の患者が脳浮腫のため死亡した。これらの生死にかかわる副作用の多様で複雑な性質を考えると、それらを管理することと対照的に、それらを予防することが重要である。ASEの発生を最小限にする一方法は、CAR T細胞活性化のタイミング、レベル、および持続性に制御を加えることである。これは、患者に注射されるT細胞の量を調節することにより達成できる。しかし、T細胞がそれでも増殖する場合があるので、それは、CRSを排除するよりも遅延させるだけである場合がある。相補的な戦略は、ON/OFFスイッチと同様に分子の投与によりT細胞の活性を設定できるように、T細胞にスイッチを導入することである。一態様では、「殺傷」スイッチを導入できる。

組合せ抗原感知は、CAR T細胞療法の腫瘍特異性を改善するための一戦略である。改変T細胞において単純論理計算を実行するために、いくつかの技法がすでに存在する。例えば、2つの異なる抗原特異的scFvを一緒に融合させて1つのCARにすることで、いずれかの抗原がT細胞活性化をトリガーすることを可能にしている^3、4。これらのシステムは、OR論理ゲートを要約しており、かつ腫瘍の回避の機会を減少させることができる。理由は、CAR T細胞による検出を避けるには腫瘍による2種の抗原への変異が必要だからである。しかし、この縦列型のscFv CARの設計は、OR論理のみを実行できる。ORゲートに加えて、1種の抗原に対して特異性を有する活性化欠損CARおよび第2の抗原に対して特異性を有するキメラ共刺激受容体がT細胞に形質導入される、AND論理の組合せCARシステムも創製されている^5、6。そのうえ、共刺激シグナル伝達ドメインを、PD-119のような阻害受容体のドメインと置き換えることができる。これらの戦略は、成功したものの、一緒に追加できるCARが最大で2種であり、より多くの抗原を含むように拡張できない。

現在の組合せCARシステムの大部分は、1種または2種の特異的抗原をディスプレイする細胞を探索および攻撃するように設計された。しかし、一部のがん細胞は、抗原の存在とは対照的に非存在によって分類される場合がある。例えば、多くのがん細胞は、T細胞応答から逃れるためにHLAの発現を下方調節する²²。NK細胞は、HLAが見つからない細胞を検出して殺傷できる²³。HLAは、多くの細胞型に広く発現するので、この免疫メカニズムは強固であり、したがって、HLAの非存在は、異常および悪性と解釈できる。しかし、一部のがんにおいて下方調節される表面マーカー²⁴は、組織のサブセットにだけ発現する。そのように、非遍在性抗原を欠如しているがん細胞を正確に検出するために、関心対象の細胞型を特定または排除する抗原を検出することもできなければならない。これは、AであるがBでない（A BUT NOT B）論理（A NIMPLY B）または排他的論理和OR（XOR）を表す。これらの計算を実行できるCARプラットフォームは、新規なメカニズムを使用して幅広い範囲の腫瘍を検出できる。そのようなシステムは、CAR T細胞によって標的化できる抗原セットも拡大することで、新規で十分な腫瘍抗原の必要性を和らげる。

腫瘍特異性を改善することに加えて、CAR T細胞の活性化レベルのタイミングおよび強度を制御することは、改変T細胞免疫療法の安全性プロファイルを高めるために重大である。誘導性カスパーゼ9²⁵またはヒト単純ウイルス（human simplex virus）チミジンキナーゼ²⁶のような薬物誘導性自殺遺伝子（すなわち、キルスイッチ）の結果、小型分子誘導物質の添加が自殺遺伝子をトリガーし、それを発現している改変T細胞を殺傷する。これらの特徴は、CRSが発生し、生命を脅かすようになた場合に、臨床家がCAR T細胞を殺傷除去できるようにする。しかし、CRSが発生した後でCAR T細胞を殺傷することが、ASEを軽減できるかどうかは不確かなままである。代替的なアプローチでは、小型分子の添加がCARにシグナルを伝達させる、薬物制御可能なCARを使用できる^27、28。そのようなONスイッチシステムは、T細胞活性化を用量依存的に調節する時間制御を提供できる。

同様にONスイッチとして作用できる別のCARの設計は、通常は腫瘍特異的scFvである抗原認識モチーフがCARのシグナル伝達モチーフと解離されている分割型受容体配置であり；そのような配置では、生体分子相互作用を介して分割受容体ドメインを相互に動員できる。この分割型CAR配置は、全ての相互作用の共通基盤として万能受容体を使用するので、免疫細胞を再改変せずに大きな抗原パネルを標的化できるようにもする。改変T細胞上のシグナル伝達モチーフに抗原認識モチーフを動員するために、他の態様が利用可能である。そのような分割型CARの設計の最も単純なバージョンは、CD16細胞外ドメインと細胞内TCRシグナル伝達ドメインとの融合によって達成される。CD16は、ヒトIgG抗体の定常領域と結合する低親和性Fc受容体である。適切な抗体の添加は、CD16 CAR T細胞の活性化をトリガーすることで、ONスイッチとしても作用する¹¹。便利であるものの、このCD16 CARは、患者が産生する内因性抗体との結合により多くの潜在的オフターゲット効果を有する場合がある。したがって、CD16とFcとの対に加えて、追加的な予防措置が好ましくは使用され、ストレプトアビジンおよびビオチン¹⁰、FITCおよび抗FITC scFv⁸、またはペプチドおよび抗ペプチドscFv⁹のような他のヘテロ二量体化ドメインも、分割型CARを生成するために使用されている。これらの設計では、ストレプトアビジンまたはscFvがTCRシグナル伝達ドメインと融合され、T細胞表面にディスプレイされた。ビオチン、FITC、または合成ペプチドで修飾された腫瘍特異的抗体が、がん細胞と、分割型CARを発現しているT細胞との間のアダプターとして作用し、T細胞応答をトリガーするために使用された。今日まで、これらのシステムは、一度に1種のCARを制御するために使用されているだけである。直交動員対は、複数のシグナル伝達経路の同時制御を可能にすることで、異なる経路活性の組合せ感知および微妙なバランス維持を可能にする。

分割型（split）、万能（universal）、プログラム可能（programmable）かつ再構成可能（reconfigurable）な（SUPRA）CARプラットフォーム
この研究のために、本明細書に記載のSUPRA CARプラットフォームに以下の機能性を含ませる：
ON/OFFスイッチ、
抗原の検出に基づく論理的な意思決定、および
異なるシグナル伝達経路の独立した多重調整。

SUPRAプラットフォームは、CARの細胞外部分としてロイシンジッパーおよび細胞内ドメインとして様々なシグナル伝達タンパク質を使用する（図12）。コグネイトロイシンジッパーは、抗原特異的scFv抗体と融合される。抗体／ジッパー融合体の投与は、T細胞を活性化させることで、用量依存的にONスイッチとして役立つ。ロイシンジッパーは、電荷相互作用によってヘテロマー構造を形成できるタンパク質ドメインのクラスである²⁹。ロイシンジッパーの多くの直交対が利用可能であり、それにより、設計活動のための候補の大型プールが提供されるので、ロイシンジッパーは、SUPRAプラットフォームに有益である²⁸。ロイシンジッパードメインは、同じ結合パートナーを相互に競合するように改変することで、阻害および「NOT」機能性を可能にすることもできる（図12）。そのうえ、本発明者らは、OR、NIMPLY、AND、XORのような複雑な機能を改変するためにロイシンジッパー対の間で異なる親和性を利用できる（図12）。構成的に活性でない8つの可能な2入力ブール論理動作がある（16個の可能な2入力ブール論理ゲートがある。しかし、入力が非存在の場合にそのうちの8つ（FALSE、A、B、OR、AND、A NIMPLY B、B NIMPLY A、およびXOR）だけが不活性である）。

さらに、複数の直交対が、分割型シグナル伝達ドメイン（例えば、CD3ζ、CD28、4-1BB、PD-1）を有するCARを可能にすることで、これらの経路の独立した調整可能な制御ができるようになる（図12）。各個別のCARは、異なる抗原を標的化するscFvと容易に対形成されることができ、したがって、組合せおよび論理抗原感知を可能にする。インビトロ特徴付けは、SUPRA CARプラットフォームの応答（例えば、細胞傷害性、サイトカイン産生、およびメモリーT細胞形成）をマッピングして、パラメーター（例えば、zipCARの発現レベル、zipFvの濃度、scFvの親和性、およびジッパーの親和性）を設計できる。本明細書に記載の機能性は、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてインビボで試験することもできる。

現在のCARの設計は、限られた制御能力および計算能力を有する。これらの欠陥は、現在のCARを危険な過剰活性化に感受性にし、健康な組織から腫瘍細胞を識別するCARの能力を減少させる。例えば、T細胞における複数のシグナル伝達経路を独立して調節するために、論理的およびシグナル伝達ミキサー機能を付与するSUPRA CARプラットフォームを使用することによって、制御能力および／または計算能力に対処する方法および組成物が、本明細書に記載されている。

方法および組成物は、利点を提供し、例えば、その利点は、ON/OFFスイッチ、論理的な検出および統合、＞2種の抗原の処理、ならびに異なるシグナル伝達経路の独立した調節を特徴とする第1の機能豊富ユニバーサルCARプラットフォームを提供する。これらの特徴は、単一のシステムにおいて一緒に示されたことは、かつてなかった。特に、CARを使用する、T細胞における複数のシグナル経路の第1の独立した調整が、本明細書において提供される。異なるパラメーターが、設定可能なON/OFF CARスイッチを設計するために有用な分割型万能CARシステムにどのように影響できるかが、本明細書に記載されている。CARを用いた、OR、NIMPLY、ANDおよびXOR論理ゲートを含む2入力ブール論理ゲートの第1の完全なセットの生成が、本明細書にさらに記載されている。この論理動作は、がん細胞に対するCAR T細胞の特異性を改善するためおよび腫瘍の回避を防止するために非常に有用である。加えて、論理動作のいくつかは、改変が困難であるので、合成生物学的の見地から関心対象である。例えば、各入力シグナルが活性化し、他方の入力の存在に依存して出力を抑制することが可能であったので、XOR論理ゲートは、最も改変が困難なものの1つである。さらに、複数のシグナル伝達経路を制御するためにがん性細胞および健康細胞からの＞2種の抗原を統合できる第1のCARシステムの開発が、本明細書に記載されている。CAR T細胞システムにおいて初めて、CD3ζ、CD28、4-1BBおよびPD-1シグナル伝達を別々に制御し、各経路についての活性化のタイミングおよび強度がどのようにCAR T細胞応答およびメモリーT細胞形成に影響するかを探索することが可能である。

試薬およびDNA構築物：親和性、受容体の発現レベル、およびSUPRA CARプラットフォームの特性の間の相関を系統的にマッピングするために多くのzipCARおよびzipFvを開発できる。それゆえに、結果から引き出される結論は、他の研究に通例見られる少数の試薬とは対照的に、試薬および条件の広範囲なセット全体から得られるものである。これは、一部の試薬からの例外がSUPRA CARの機能を完全に隠蔽してしまうことがないよう保証することを助けている。

プライマリーT細胞：一部の態様では、プライマリーT細胞は、多数の匿名のドナーから単離される。1体のドナーのT細胞から得られた結果は、異性の別のドナー由来のT細胞を用いて検証される。

動物：マウスの性別による偏りを減らすために、雄性および雌性マウスの両方が使用される。

測定基準：論理動作の機能的妥当性を決定するための新規な不偏測定基準が、本明細書に記載されている（より詳細には下記参照）。透明性を確保し、データ共有を促進するために、遺伝回路の重要な仕様および性能をウェブベースのデータシートに表示する革新的な方法も開発されている（ワールドワイドウェブのdatasheets.synbiotools.org/から入手可能）。

ON/OFFスイッチとしてのSUPRA CARプラットフォームの特徴付け
重要な質問：SUPRAプラットフォームの設計パラメーターとT細胞応答との間の関係は何か？（1）zipCARの発現レベル、（2）ロイシンジッパーの親和性、（3）scFvの親和性、および（4）zipFvの濃度が、最終的に抗原発現細胞に対するインビトロT細胞活性化および腫瘍に対するインビボT細胞活性化にどのように影響するかの系統的特徴付けが、本明細書に記載されている（図14A）。

設計規則についての洞察を得るためのSUPRA CARのインビトロ系統的特徴付け。以下のパラメーターを変化させることが、SUPRA CAR T細胞の活性化にどのように影響するかを決定できる：
（1）ZipCARの発現レベル：様々な感染多重度でのレンチウイルス形質導入を介してプライマリーヒトT細胞にzipCARを導入して、3つの別々の発現レベルのzipCARからなるT細胞を生み出すことができる。zipCARの発現は、mCherryまたはmyc染色測定を用いて検証できる。
（2）ロイシンジッパーの親和性：zipCAR BZIPと様々な親和性で結合できる少なくとも3つの異なるロイシンジッパー（AZIP）が特定されており、これらのAZIPを使用してzipFvを構築できる（図14B）。
（3）scFvの親和性：zipFvを生成するために使用できる、異なる親和性を有する少なくとも3つ抗Her2 scFvが利用可能である（図14C）。3つのロイシンジッパー対と一緒に、少なくとも9つのユニークなzipFvを精製できる。タンパク質をHEK293T細胞において発現させ、培地中に分泌させることができる。細胞培養上清からFPLCを用いてzipFvを精製できる。
（4）ZipFvの濃度：SUPRA CARプラットフォームの用量依存性を探索するために、様々な量のzipFv（例えば5μg/ml、0.5μg/mLまたは50ng/mL）を使用できる。

上に概要を述べた各条件を3つのエフェクター対標的（E：T）比（1：1、10：1、1：10）で試験できる。この実験のために選択された標的がん細胞株は、SK-BR-3と呼ばれるHer2+乳がん細胞株であり、その理由は、SK-BR-3細胞が、異種移植腫瘍モデルで使用される標準乳がん細胞株であるからである36。SK-BR-3株をルシフェラーゼで改変して、インビトロ細胞傷害アッセイおよびインビボイメージングを容易にする。この実験のために、異なる数のSK-BR-3細胞を96ウェルプレート上に蒔き、一晩成長させることができる。改変T細胞およびzipFvを、翌日、SK-BR-3細胞を含む96ウェルプレートに加えることができる。加えるべきT細胞の数およびzipFvの濃度は、条件に応じて変動できる。T細胞活性化は、例えば、標準的なELISAアッセイを使用して培地中のIL-2およびIFN-γのサイトカイン産生を測定することによって定量できる。SK-BR-3細胞に対する細胞傷害性は、ルシフェラーゼアッセイによって残りの生存細胞（すなわちT細胞によって殺傷されなかった細胞）を定量することによって測定できる¹⁴。活性化されなかったT細胞のパーセンテージを決定するために、T細胞表面のCD69の発現を測定できる。

活性とパラメーターとの相関を検証するためのインビボマウス研究。様々なパラメーターがSUPRAプラットフォームの抗腫瘍活性にどのように影響するかを、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて検討できる。マウス異種移植腫瘍モデルにおけるSUPRAプラットフォームの性能を試験するために、ルシフェラーゼを発現しているSK-BR-3細胞を、免疫不全マウス（NOD scidγ（NSG）、4～6週齢、Jackson Laboratory）に植え込むことができる。がん細胞500万個を腹腔内（ip）に植え込むことができる。腫瘍が樹立した14～20日後に、zipCARを発現しているCD8+ T細胞500万個をip注射により導入できる。異なるジッパーおよびscFvの親和性を有する抗体を1日後にip注射を介して導入できる。各条件についてマウス6匹を一緒の群にして（雄3匹および雌3匹）、マウスの性別による偏りを減らすことができる。腫瘍成長は、ルシフェラーゼおよびIVISイメージングを介して測定できる。3週間後、マウスを屠殺し、骨髄細胞および脾臓細胞を回収して、フローサイトメトリーを介して総T細胞および他のT細胞サブセット（例えば、中枢性メモリー細胞）の数を決定できる。上記の実験条件に基づき、SUPRAシステムがマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍量を実際に軽減できることが実証された（図15Aおよび15B）。SUPRAプラットフォームの効率は、完全長Her2 CARを発現しているT細胞に匹敵する。加えて、zipCARを発現しているT細胞は、対応するzipFvなしで腫瘍サイズを有意に減少させなかった。

SUPRA CARの設計パラメーターと改変T細胞の抗腫瘍活性との間のインビトロおよびインビボの両方の関係のマッピングが本明細書に記載されている。これは、将来の前臨床試験および臨床試験にSUPRAシステムを有効に利用する方法に関する設計規則を提供できる。

SUPRA CARプラットフォームを用いた組合せ論理演算の開発
入力なし状態（0,0）が出力を産生しない8つの可能な2入力1出力（2-Input-1-Output）論理ゲートがある（図16）。これらの論理ゲートは、安全で有効なT細胞療法の要件である構成的活性T細胞を生成しない。理論に縛られることを望むわけではないが、本明細書において、scFvおよびロイシンジッパーの親和性が論理動作のうちのいくつか（例えばXOR、NIMPLY、およびANDゲート）についての成果の決定に重要な役割を果たすことができると考えられる。強すぎるまたは弱すぎる親和性は、システムの性能を損なう可能性もある。したがって、これらの論理演算を設計してzipCARにするために、ロイシンジッパーのライブラリーおよびタンパク質工学のアプローチを使用して、論理計算を達成するために競合するまたは共同して結合できるzipCARおよびzipFvを生み出すことができる。ジッパー／scFvの親和性とがん細胞のCAR T論理検出との間の関係を決定できる。全ての設計において、T細胞にzipCARが1つだけ導入される。論理動作を実証するために、本発明者らは、Her2またはAxlのいずれかを標的化するzipFvを設計できる。Axlは、多くのがんで過剰発現する受容体型チロシンキナーゼである³⁷。Axlに対する新規なCAR（図17）が開発されており、Axlに対するscFvを使用してzipFvを生成することができる。

提唱された受容体ゲートのうち3つ、FALSE、A only、およびB onlyは、他の論理設計のための対照として作用できる。ORゲートは、2つの抗原のうちの一方または両方がT細胞応答をトリガーするのを許す。したがって、腫瘍が改変T細胞による検出を回避するためには2種の抗原への変異が必要であるので、ORゲートは、腫瘍の回避を防止するために有用であることができる。ANDゲートは、T細胞応答を活性化させるために2種の抗原が同じ腫瘍上に存在することを必要とすることによって、腫瘍標的化特異性を改善できる。NIMPLYゲートは、抗原のうちの1種の欠如によってマークされる腫瘍を検出するために有用である。同様に、XORゲートは、表面プロファイルが2種の抗原のいずれかの欠如によって識別される腫瘍細胞を検出できる。この種の阻害は、リガンドの結合がPD-1シグナル伝達経路をトリガーする下記の阻害性CAR（iCAR）の設計とは異なることに留意されたい。この設計は、iCARへの代替戦略に相当し、T細胞をアネルギー状態に追いやる危険を冒さない。

zipCARにおける論理演算の設計および特徴付け、受容体の設計：
FALSE、A only、およびB onlyゲート（図16）：これらの論理動作は、その他の論理設計のための対照として作用し、本例において上に記載されている。

ORゲート（図16）：ORゲートは、SUPRAプラットフォームで達成できる最も単純な論理のうちの1つである。2つの入力シグナルの一方または両方の存在が、T細胞応答をトリガーできる。SUPRAでこの論理動作を成し遂げるために、レンチウイルス形質導入を介してzipCARを最初にプライマリーT細胞に導入できる。同じロイシンジッパーを有するがHer2またはAxlのいずれかを標的化するscFvを有する、2つのzipFvを使用できる。さらなるT細胞改変なしに、このORゲートの設計をより多くの抗原入力に対処するように容易にスケール変更できることに留意されたい。

NIMPLY BおよびB NIMPLY Aゲート（図16）：NIMPLY論理ゲートでは、1つだけの入力が出力をトリガーでき、第2の入力の存在は、システムをオフにする。例えば、A NIMPLY Bは、抗原Aだけを有するがん細胞が応答をトリガーすることを意味する。抗原を発現しない、抗原Bのみを発現している、または抗原AおよびBを発現している細胞は、SUPRA CARを活性化させない。SUPRAを用いてこの論理動作を成し遂げるために、異なるロイシンジッパーを有する2つのzipFv（例えば、Her2-AZIPおよびAxl-BZIP-weak）を設計できる。Axl zipFv上の弱いBZIPは、Her2-AZIP zipFvと結合できるが、zipCAR上のBZIPよりも弱い親和性を有する。細胞上にHer2だけが存在する場合、Her2-AZIPは、受容体と結合し、T細胞活性化をトリガーする。しかし、Her2およびAxlの両方が同じ細胞上に存在すると、scFv-抗原結合は、Her2-AZIPをAxl-BZIP-weakで競合的に飽和させるために必要な近接協同作用を与えることができ、T細胞を活性化させることができない。本明細書において、競合性ジッパー結合が、zipCARの活性化を遮断するのに有効であることができると実証されている。1つがAZIP（活性化）を有し、残りの3つがAZIPと強くまたは弱くのいずれかで結合するBZIPを有する4つの抗Her2 zipFvを生成させた。抗Her2-AZIP zipFvは、zipCARを活性化させることができ、抗Her2-BZIPは、抗Her2-AZIPによってトリガーされる活性化を用量依存的に強く阻害できる（図18）。

様々な親和性を有する2種のAxl scFvおよび5種のHer2 scFvs38が入手可能である。scFvとBZIP親和性変異体との組合せを用いてNIMPLYゲート用の阻害性scFvの変異体を構築できる。活性化zipFv上のAZIPの同一性は不変のままである。zipCAR上のBZIPも一定のままである。ジッパーは、本明細書の他の箇所に記載されるように試験されたジッパーのライブラリーから得ることができる。ジッパー上の相互作用残基を改変することによって、文献³⁰に記載されたタンパク質工学原理に基づき、より多くのジッパー変異体を生成することができる。

ANDゲート（図16）：ANDゲートを生成させるために、zipCARと弱く結合するが、両方のzipFvが同じ細胞上の抗原と結合している場合に2つのzipFvの間の協同相互作用のせいでzipCARとずっと緊密に結合できる、2つのzipFvを生み出すことができる。2つの直交BZIPジッパーをzipCAR上に取り付けることができる。2つの対応するAZIPをそれぞれのzipFvに取り付けることができる。最後に、直交ヘテロ二量体相互作用ドメインも各zipFvに取り付けて、2つのzipFvの間の弱い相互作用を可能にできる。zipFvとzipCARとの間の弱い相互作用のこの組合せは、両方のzipFvの存在下でのみ、zipCAR T細胞が活性化されることを確実にするために必要な協同作用を提供できる。DZドメインおよびその対応するリガンドをzipFv上の直交ヘテロ二量体相互作用ドメインとして使用できる。理由は、多くの弱く相互作用するPDZ／リガンド対が、入手可能であり³⁹、かつシグナル伝達タンパク質または転写因子における協同作用を改変するために使用されているからである^40-42。ANDゲートとして機能できるドメインのセットを特定するために、PDZおよびジッパードメインからなるzipCARおよびzipFvの小ライブラリーを生成することができる。

XOR（図16）：XORゲートを生成させるために、ANDゲートと同様に、2つの直交BZIPジッパーをzipCAR上に取り付けることができる。対応する直交AZIPジッパーをzipFv上に取り付け、その結果、異なるBZIP上の受容体とそれぞれが結合できるようにする。加えて、各zipFvにBZIP-weakを備えることにより（もう1種のzipFv）、両方のzipFvの存在が受容体を活性化させないようにすることもできる。しかし、BZIP-weakの親和性は、抗原による協同結合を必要とし、かつzipFvが溶液中で結合することを可能にしないほど、十分に低い。したがって、2つのzipFvは、scFvを経由して同じ細胞と結合している場合にのみ、互いを阻害することで、両方のzipFvがzipCARを活性化させることを防止する。その他の論理ゲートと同様に、AZIPに対して様々なBZIPの親和性を有する一連のzipFvを生成させて最適な設計を特定できる。

受容体の特徴付け：
レンチウイルス形質導入を介してZipCARをプライマリー（すなわちCD4およびCD8）T細胞に導入できる。myc染色およびフローサイトメトリーを用いてzipCARの発現を定量できる。HEK293T細胞においてZipFvを産生し、FPLCを用いて精製できる。SUPRAシステムの論理動作をインビトロで決定するために、改変T細胞およびzipFvを、（a）リガンドを発現していない、（b）Her2のみを発現している、（c）Axlのみを発現している、または（d）Her2およびAxlを発現している、SK-BR-3細胞と混合することによってシステムを活性化できる。CRISPR-Cas9によるHer2のノックアウトを用いてリガンドなしのSK-BR-3株を生成することができる。レンチウイルス形質導入を介してAxlをSK-BR-3に導入できる。これらの4つのSK-BR-3株は、この目的のための4つの可能なブール論理入力を表す。各システムをE：T比3で試験できる。ジッパーおよびscFvの親和性に加えて、zipFv濃度およびzipCARの発現は変動できる。サイトカイン産生（すなわちIL-2およびIFN-γ）、腫瘍細胞に対する細胞傷害性、およびT細胞上のCD69発現を測定することによってT細胞の活性化を監視できる。

これらの受容体の論理性能を偏りなしに定量的に決定するために、ベクトル近接度（VP）と呼ばれる測定規準が開発されている。VPは、回路の生物学的実装とそれの意図される真理値表からの理想的実装との間のずれを測定する。真理値表および得られた実験結果を四次元ベクトル空間中のベクトル、それぞれ真理値表ベクトルおよびシグナルベクトルとして表す。これらの2つのベクトルの間の角度誤差（VP角の計量）が計算され、その際、0°は、データが意図される真理値表を完全に表すことを意味し、90°は、データが完全に不正確な出力（意図される真理値表に対して逆の応答）を示すことを意味する。任意の実現された回路について、全部で16個の可能な2入力ブール論理真理値表からそのVP角を測定し、結果を昇順に分類する。このソート後のリストにおける目的の真理値表の順位を回路のVP全体的順位として定義する。各出力測定（例えば細胞傷害性、サイトカイン、CD69）が、それ自体のVP角および全体的順位を有することに留意されたい。回路が、全ての出力について最良の（すなわち最小の）VP全体的順位を有する場合、この回路は、この測度で関数的に恒真であるといわれる。最良の受容体は、関数的に恒真であり、ON状態とOFF状態との間で最大の差（ダイナミックレンジ）を有する受容体である。

マウス異種移植腫瘍モデルにおけるzipCARの論理動作の特徴付け。上記の4つのSK-BR-3がん細胞株が別々のマウス群にip注射を介して導入される、かなり標準的なインビボ腫瘍モデルを使用できる。これらの細胞株を、NSGマウスに植え込み、腫瘍を2週間成長させる。zipCARを含むT細胞500万個をip注射によりマウスに導入する。1日後にZipFvもip注射により注射する。zipFvのいくつかの機能的セットを有する一部のゲートについて、少なくとも2つのセットを試験して、どれがインビボでより良好に働くかを決定する。各組合せについてマウス5匹を一緒の群に分ける。ルシフェラーゼおよびIVISイメージャーを用いて腫瘍の成長を測定する。3週間後に、マウスを屠殺し、骨髄細胞および脾臓細胞を回収して、フローサイトメトリーを介して別個のT細胞サブセットの数を決定する。マウスの性別が原因の偏りを減らすために、各条件についてマウス6匹（雄マウス3匹および雌マウス3匹）を一緒の群に分ける。8つの可能な2入力論理受容体を試験し、受容体の論理実行をインビボで客観的に決定するためにVP計測を使用する。

現在の任意のCARの設計には肩を並べるものがない論理演算を実行するためのzipCARとzipFvとのセットの設計および特徴付けであり、よってがん患者に精密医療を提供するためのインテリジェントなプラットフォームを届けることが本明細書に記載されている。

最良のzipCARの設計を特定するために、ジッパー間のリンカー長さおよびジッパーの順序のようなパラメーターを変えることができる。

同じ受容体が3つの入力を処理でき、かつより複雑な論理を達成できるように、3つのジッパーを含むように設計を修飾することもできる。さらに、様々な親和性を有するロイシンジッパーとPDZリガンドとの対のライブラリーが提供され、その結果、それらをより複雑なSUPRA CARの設計のために使用できる。

複数のシグナル伝達経路を制御するためのSUPRA CARの開発
CD28および4-1BBのような共刺激経路をトリガーすることは、迅速殺腫瘍活性およびより中枢性のT細胞形成の両方をもたらすことができる。改変T細胞上でのみPD-1シグナル伝達経路を活性化させることは、過剰活性CAR T細胞を和らげ、かつ有害副作用が発生するリスクを低下させることができる。各経路の強度および活性化のタイミングが全体的なT細胞応答、T細胞の分化、および抗腫瘍効果にどのように寄与するかに取り組むために、異なる細胞内シグナル伝達ドメインおよびロイシンジッパーを有する直交zipCARを調べることができる。

異なるシグナル伝達ドメインを有する直交zipCARの設計、構築、および特徴付け
Jurkat T細胞においてSUPRA CARプラットフォーム内で40個のロイシンジッパー対⁴³（図19A）がスクリーニングされており、SUPRAプラットフォームと適合性の3つの直交ジッパー対（図19B）が特定されている。CD3γ、CD28、4-1BBおよびPD-1シグナル伝達ドメインを有する直交zipCARを生み出すためにこれらのジッパーを使用できる。上記のレンチウイルスベクターを使用してこれらのzipCARがT細胞に形質導入される。例えば、Jurkat T細胞において異なるCARの活性化を阻害するPD-1細胞内シグナル伝達ドメインを有する阻害性CARの生成が、本明細書において実証されている（図19C）。

CD3γ、CD28、および4-1BB zipCARの試験：異なるシグナル伝達ドメインを有するzipCARがT細胞においてどのように機能するかを検証するために、ヒトCD4プライマリーT細胞およびCD8プライマリーT細胞の両方にレンチウイルス形質導入を介してzipCARが形質導入される。特徴付け実験を開始する前に、細胞を休止状態に到達させる（約12日）。zipCAR CD28および4-1BBドメインの機能性を試験するために、これらのドメインを含むzipCARが、CD3ζシグナル伝達ドメインのみを含む抗Her2 CARをすでに安定発現しているT細胞に別々に導入される。これらのzipCARの動作が、それぞれのシグナル伝達ドメインをすでに含む完全長（伝統的）Her2-CARと比較される。zipCARの発現は、抗myc染色およびフローサイトメトリーを用いて検証される。殺傷アッセイでは、Her2およびルシフェラーゼを発現しているK562細胞が、抗原提示細胞として利用される。zipCARを活性化させるために対応する抗Her2 zipFvが添加される。さらに、抗体濃度を変動させ、異なるジッパーの親和性を有するzipFvを生成させて、これらのパラメーターがどのようにT細胞応答に影響するかを決定できる。活性化レベルを決定するためにT細胞のIL-2産生およびCD69発現が測定される。細胞の計数によりT細胞増殖が監視される。CD28の活性化は、4-1BBの活性化と比較して高い割合の中枢性メモリーT細胞をもたらす^13、14。したがって、CCR7およびCD45ROなどの表面マーカーが、刺激存在下および非存在下の中枢性メモリーT細胞またはエフェクターメモリーT細胞の相対レベルを決定するためにフローサイトメトリーにより監視される。

PD-1 zipCARの試験：PD-1シグナル伝達ドメインを有するzipCARがT細胞活性化を阻害できるかどうかを検証するために、すでに抗Her2 CARを含むプライマリーT細胞に、レンチウイルス形質導入を介してzipCARを導入する。Her2+ K562細胞を用いてT細胞を活性化させ、zipFvを用いて阻害する。抗体濃度およびジッパーの親和性を変えることができ、これらのパラメーターを使用して、T細胞応答の阻害に影響を与えることができる。IL-2産生、CD69の発現、および増殖を測定することによって、阻害が監視される。

zipCARのインビトロ多重制御の特徴付け。zipCARを使用する異なるシグナル伝達経路の組合せ制御：同じT細胞におけるシグナル伝達経路の別々の制御を実証するために、2回の順次レンチウイルス形質導入を介して、様々なシグナル伝達ドメインを有する3つのzipCARをプライマリーT細胞に導入する。各zipCARは、直交ジッパーおよびエピトープタグも有する。zipCARの2つのセットを図20に示す。zipCARのこの集まりは、各scFvに取り付けられたzipFvに応じて多種多様な動作を示す。図20において、3つのzipFv全てが異なる抗原を標的化して3-入力論理動作を生成すると仮定することによって、論理演算および表現型が得られる。しかし、これらのzipCARを、より少ない抗原を標的化するように容易に適合させることができる。加えて、全てのzipCARを同時に活性化する必要があるわけではない。

Her2、Axl、およびメソセリンに対するzipFvを生成することができる。3つの異なる入力リガンドの場合、（1）リガンドなし、（2）Her2のみ、（3）Axlのみ（4）メソセリンのみ、（5）Her2＋Axl、（6）Her2＋メソセリン、（7）Axl＋メソセリン、または（8）Her2＋Axl＋メソセリンという、8つの可能な組合せがある。K562細胞株においてHer2、Axlおよび／またはメソセリンの細胞外部分を安定的に過剰発現させることによって、8つの可能な標的細胞株全てを生成することができる。このセットの新しいK562株も、ルシフェラーゼ遺伝子およびmCherry遺伝子を構成的に発現している。インビトロ細胞傷害性アッセイおよびインビボイメージングのためにルシフェラーゼを使用でき、一方でmCherryは、フローサイトメトリー分析のために細胞をマークする。中枢性メモリーT細胞の表面マーカーおよびサイトカイン産生ならびにがん細胞株に対する細胞傷害性が監視される。

個々の経路の多重用量反応プロファイル：異なるシグナル伝達経路を備える直交zipCARは、各経路を異なるレベルで活性化する固有の機会を与え、これは、現在の固定されたCARの設計では達成不可能な特性である。図20に概略を述べる2つのセットのzipCARについて、全部で3種のzipCARを含むT細胞および各zipCARについて5つの異なるzipFv濃度を用いて、各経路についてインビトロ用量反応分析を実施できる。この実験では、各zipFvは、同じ抗Her2 scFvを有する。標的細胞は、Her2+ K562細胞である。サイトカイン産生（すなわちIL-2およびIFN-γ）は、K562細胞のELISAおよび細胞傷害性により測定される。刺激の存在下および非存在下で中枢性メモリーT細胞およびエフェクターメモリーT細胞の相対レベルを決定するために、CCR7およびCD45ROのような表面マーカーも測定される。

個々の経路の時間制御：異なる活性化レベルに加えて、直交zipCARによって支配される各経路を、異なる時間にトリガーできる。CD28および4-1BB活性化の相対的タイミングは、CAR T細胞応答およびメモリーT細胞の形成に影響を与えることができる。CD3ζおよびCD28を制御するzipCARを実験の初めに同時に活性化できる。次に、Her2+ K562細胞および抗Her2 zipFvを使用するCD3ζおよびCD28の初期活性化の0時間、8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、または96時間後に、4-1BBを制御するzipCARが活性化される。さらに、サイトカイン産生が、ELISAおよび細胞傷害性により測定される。中枢性メモリーT細胞またはエフェクターメモリーT細胞の相対レベルを決定するために、CCR7およびCD45ROのような表面マーカーも測定される。

マウス異種移植腫瘍モデルにおけるzipCARの多重制御の特徴付け。T細胞シグナル伝達の多重制御を、直交zipCARのセットを用いてインビボで達成できる。zipCARは、myc、FLAG、またはHAエピトープタグを含有し、2つのレンチウイルスベクターにクローニングされる。2つのセットのzipCARを分析するために、レンチウイルスが、2つの順次形質導入によりヒトプライマリーT細胞に導入される。抗エピトープタグ染色およびフローサイトメトリーを用いてzipCARの発現が検証される。8つの改変K562細胞株を、NSGマウスの皮下に植え込み、2週間成長させる。次に、zipCARを含有するT細胞が、ip注射を介してマウスに導入される。1日後に3種のzipFvの全てが尾静脈注射を介して注射される。マウスの性別が原因の偏りを減らすために、各条件についてマウス6匹（雄マウス3匹および雌マウス3匹）を一緒の群に分ける。ルシフェラーゼアッセイおよびIVISイメージングを介して腫瘍成長が測定される。3週間後に、マウスが屠殺され、骨髄細胞および脾臓細胞が回収され、フローサイトメトリーを介して別個のT細胞サブセットの数が決定される。

SUPRAシステムのインビボ多重用量反応プロファイルを評価するために、同じセットの上記T細胞が利用されるが、3種のzipFvが異なる用量でマウスに注射される。腫瘍細胞は、Her2のみを発現しているK562である。残りの実験は、上記の実験と同じである。

SUPRAシステムのインビボ時間制御を評価するために、同じセットのT細胞が再度使用されるが、4-1BBに対するzipFvは、CD3ζおよびCD28に対するzipFvの添加の0時間、24時間、48時間、72時間、または96時間後に添加される。植え込まれた腫瘍細胞は、Her2のみを発現しているK562である。残りの実験は、上記の実験と同じである。

ヒトT細胞において複数のシグナル伝達経路を柔軟に制御できる直交zipCARの集まりが、本明細書に記載されている。これらのzipCARは、腫瘍を正確に処置することが必要な（例えば、1つの抗原が腫瘍を説明するために不十分な）場合に、新しいクラスのCARの基盤である。上に概略を述べた受容体設計と共役する場合、利用可能な論理演算の数の増加が、腫瘍細胞の効率的な特定を可能にする。

CARのような導入遺伝子のレンチウイルス形質導入効率を高めるために、形質導入手順の前にT細胞受容体（TCR）の活性化がしばしば行われる。活性化段階は、T細胞分化を異なるメモリー細胞に駆動できるので、TCRの活性化は、メモリーT細胞形成の分析を複雑にする可能性がある。導入遺伝子を導入するための代替的なアプローチは、導入遺伝子をコードするインビトロ転写されたRNAの一過性トランスフェクションを経たものである。zipCARをインビトロRNA転写のために特異的に設計されたベクターにクローニングすることが、本明細書において考えられている⁴⁴。市販のキットを使用してzipCAR RNAを生成させ、ヌクレオフェクション（nucleofection）を経て休止プライマリーCD4 T細胞またはCD8 T細胞に形質移入できる。

PiggyBAC45またはSleeping Beauty⁴⁶のようなトランスポサーゼによってzipCARを送達できることが、さらに考えられている。これらのシステムは、ずっと高い遺伝子送達能を有し、PiggyBACを使用して3種の別々のプラスミドをヒトT細胞に同時に組み込むことができることが本明細書において実証されている（図21）。

参考文献

本明細書に記載の技法が以下の実施例によってさらに例証されるが、当該実施例はさらなる限定を与えるものと解釈すべきでない。

以下の番号付きの項目のうちのいずれかにより、本明細書に記載の技法のいくつかの態様を定義できる。
項1． 多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって、該多成分CARが、
a. 1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）タンパク質相互作用ドメインを含む、第1の認識ポリペプチド；ならびに
b. 1）該第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できる細胞外タンパク質相互作用ドメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチド
を含む、前記組成物。
項2． 前記タンパク質相互作用ドメインが、ロイシンジッパードメインである、項1記載の組成物。
項3． 一方のロイシンジッパードメインがBZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインがAZip（EE）である、項2記載の組成物。
項4． 前記タンパク質相互作用ドメインが、PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメインである、項1記載の組成物。
項5． 一方のタンパク質相互作用ドメインがストレプトアビジンであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）である、項1記載の組成物。
項6． a. 一方のタンパク質相互作用ドメインがmTORのFKBP結合ドメイン（FRB）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である；
b. 一方のタンパク質相互作用ドメインがシクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である；
c. 一方のタンパク質相互作用ドメインがカルシニューリンA（CNA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である；
d. 一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性（GIA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性矮性1（GID1）である；
e. 一方のタンパク質相互作用ドメインがSnapタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがHaloタグである；または
f. 一方のタンパク質相互作用ドメインがT14-3-3-cdeltaCであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがPMA2のC末端ペプチド（CT52）である、
項1記載の組成物。
項7． 一方のタンパク質相互作用ドメインがPYLであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがABIである、項1記載の組成物。
項8． 一方のタンパク質相互作用ドメインがヌクレオチドタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがジンクフィンガードメインである、項1記載の組成物。
項9． 前記認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインがヌクレオチドタグであり、前記シグナル伝達ポリペプチドの細胞外タンパク質相互作用ドメインがジンクフィンガードメインである、項8記載の組成物。
項10． 前記ヌクレオチドタグがDNAタグである、項8～9のいずれか一項記載の組成物。
項11． 前記DNAタグがdsDNAタグである、項8～10のいずれか一項記載の組成物。
項12． 1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）前記第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合について前記シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインとを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに含む、項1～11のいずれか一項記載の組成物。
項13． 前記第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと前記第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性が、前記シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと該第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きい、項12記載の組成物。
項14． 前記第2の認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない、項12～13のいずれか一項記載の組成物。
項15． 前記組成物が、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）タンパク質相互作用ドメインとを含む、第2の認識ポリペプチドをさらに含み；
前記シグナル伝達ポリペプチドが、該第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む、
項1～11のいずれか一項記載の組成物。
項16． 前記シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと前記第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性が、該シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと前記第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱い、項15記載の組成物。
項17． 前記第1および第2の認識ポリペプチドがそれぞれ第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；かつ該第2のタンパク質相互作用ドメインが相互に特異的に結合する、項15～16のいずれか一項記載の組成物。
項18． 多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって；該多成分CARが、
a. 1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ヌクレオチドタグの第1の部分を含む、第1の認識ポリペプチド；
b. 1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）該ヌクレオチドタグの第2の部分を含む、第2の認識ポリペプチド；ならびに
c. 1）該ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全なヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチド
を含み；
該ヌクレオチドタグの該個々の部分が、それらが相互に会合していないかぎり、該ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、
前記組成物。
項19． 前記ヌクレオチドタグの第1の部分がssDNAであり、該ヌクレオチドタグの第2の部分が相補的ssDNAである、項18記載の組成物。
項20． 前記組成物が、1）第3の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）前記ヌクレオチドタグの第3の部分とをコードする、第3の認識ポリペプチドをさらに含み；
該ヌクレオチドタグの個々の部分または個々の部分のうち2つの組合せは前記ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができないが、3つの部分全てが相互に会合している場合は結果として生じる複合体は該ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができる、
項18～19のいずれか一項記載の組成物。
項21． 1）前記ヌクレオチドタグの第1の部分がssDNAであり；2）該ヌクレオチドタグの第2および第3の部分が、それぞれ該第1の部分と相補的なssDNAであり、かつ3）該ヌクレオチドタグの第2および第3の部分が、相互に重複しない配列を有する、項20記載の組成物。
項22． 多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって；該多成分CARが、
a. 1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第1のヌクレオチドタグを含む、第1の認識ポリペプチド；
b. 1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）第2のヌクレオチドタグを含む、第2の認識ポリペプチド；ならびに
c. 1）該第1のヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、シグナル伝達ポリペプチド
を含み；
該ヌクレオチドタグが相互に会合している場合は、それらは該ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、
前記組成物。
項23． 前記第1のヌクレオチドタグがヘアピンループ構造を形成し、前記第2のヌクレオチドタグが、該第1のヌクレオチドタグの、該ヘアピンループの1本の足の一部および該ヘアピンループのループの一部を包含する部分と相補的である、項22記載の組成物。
項24． 前記第2の標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない、項22～23のいずれか一項記載の組成物。
項25． 標的リガンドが、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである、項1～24のいずれか一項記載の組成物。
項26． シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである、項1～24のいずれか一項記載の組成物。
項27． シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、病的および／または標的細胞上では見出されるが健康および／または非標的細胞上では見出されないリガンドである、項1～26のいずれか一項記載の組成物。
項28． 前記病的細胞が、がん性細胞である、項1～27のいずれか一項記載の組成物。
項29． 前記抗体試薬が、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（diabody）、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体からなる群より選択される、項1～28のいずれか一項記載の組成物。
項30． 前記細胞内TCRシグナル伝達ドメインが、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインである、項1～29のいずれか一項記載の組成物。
項31． 項1～30のいずれか一項記載の第2の多成分CARをさらに含む、項1～30のいずれか一項記載の組成物。
項32． 前記第2の多成分CARの抗体試薬が、第1の多成分CARの抗体試薬によって結合される標的リガンドとは異なる標的リガンドに特異的に結合する、項31記載の組成物。
項33． 前記第2の多成分CARの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインが、T細胞活性を阻害する、項30～32のいずれか一項記載の組成物。
項34． T細胞活性を阻害する前記第2の多成分CARの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインが、PD1；CTLA4；BTLA；KIR；LAG-3；TIM-3；A2aR；LAIR-1；およびTGITからなる群より選択されるポリペプチドのシグナル伝達ドメインを含む、項33記載の組成物。
項35． 前記第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドである、項33～34のいずれか一項記載の組成物。
項36． 前記第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである、項33～34のいずれか一項記載の組成物。
項37． 前記シグナル伝達ポリペプチドが、細胞の膜上に存在する、項1～36のいずれか一項記載の組成物。
項38． 1種または複数種の前記認識ポリペプチドが、細胞外空間に存在する、項37記載の組成物。
項39． 項1～38のいずれか一項記載の組成物を発現する、改変細胞。
項40． 前記細胞が、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である、項1～39のいずれか一項記載の細胞または組成物。
項41． 前記細胞がT細胞である、項1～40のいずれか一項記載の細胞または組成物。
項42． 標的細胞を殺傷する方法であって、該細胞を、項1～41のいずれか一項記載の組成物または細胞と接触させる段階を含む、前記方法。
項43． 疾患を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に項1～41のいずれか一項記載の組成物または細胞を投与する段階を含む、前記方法。
項44． 前記疾患が、がん；固形がん；乳がん；肺がん；急性リンパ芽球性白血病；多発性骨髄腫；および難治性多発性骨髄腫からなる群より選択される、項42記載の方法。
項45． がんを処置する方法であって、その処置を必要とする対象に項1～41のいずれか一項記載の組成物または細胞を投与する段階を含む、前記方法。
項46． 前記細胞が、前記対象にとって自己由来である、項45記載の方法。
項47． 投与される前記細胞が、前記対象から得られた細胞に由来しかつ／またはその子孫であり、少なくとも1種の多成分CARを含むようにエクスビボで改変されている、項46記載の方法。
項48． 多成分キメラ抗原受容体（CAR）シグナル伝達ポリペプチドを含む改変細胞であって、該シグナル伝達ポリペプチドが、1）細胞外タンパク質相互作用ドメインおよび 2）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含む、前記改変細胞。
項49． 前記タンパク質相互作用ドメインが、ロイシンジッパードメインである、項48記載の細胞。
項50． 前記ロイシンジッパードメインが、BZip（RR）またはAZip（EE）である、項49記載の細胞。
項51． 前記タンパク質相互作用ドメインが、PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメインである、項48記載の細胞。
項52． 前記タンパク質相互作用ドメインが、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）である、項48記載の細胞。
項53． 前記タンパク質相互作用ドメインが、mTORのFKBP結合ドメイン（FRB）またはFK506結合タンパク質（FKBP）である、項48記載の細胞。
項54． 前記タンパク質相互作用ドメインが、PYLまたはABIである、項48記載の細胞。
項55． 前記タンパク質相互作用ドメインが、ヌクレオチドタグまたはジンクフィンガードメインである、項48記載の細胞。
項56． 前記ヌクレオチドタグがDNAタグである、項55記載の細胞。
項57． 前記DNAタグがdsDNAタグである、項56記載の細胞。
項58． 前記タンパク質相互作用ドメインが、ジンクフィンガードメインである、項55記載の細胞。
項59． 前記シグナル伝達ポリペプチドが、前記細胞の膜上に存在する、項48～58のいずれか一項記載の細胞。
項60． 前記細胞が、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である、項48～59のいずれか一項記載の細胞。
項61． 前記細胞が、T細胞である、項48～60のいずれか一項記載の細胞。
項62． 前記細胞内TCRシグナル伝達ドメインが、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインである、項48～61のいずれか一項記載の細胞。
項63． 前記シグナル伝達ポリペプチドが、第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む、項48～62のいずれか一項記載の細胞。
項64． 項48～62のいずれか一項記載の第2の多成分CARシグナル伝達ペプチドをさらに含む、項48～62のいずれか一項記載の細胞。
項65． 疾患を処置する方法であって、
項48～64のいずれか一項記載の細胞；および
1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるタンパク質相互作用ドメインとを含む、第1の認識ポリペプチド
を、その処置を必要とする対象に投与する段階を含む、前記方法。
項66． 前記抗体試薬が、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体からなる群より選択される、項65記載の方法。
項67． 前記細胞が、前記対象にとって自己由来である、項65～66のいずれか一項記載の方法。
項68． 投与される前記細胞が、前記対象から得られた細胞に由来しかつ／またはその子孫であり、かつ少なくとも1種の多成分CARを含むようにエクスビボで改変されている、項65～67のいずれか一項記載の方法。
項69． 前記タンパク質相互作用ドメインが、ロイシンジッパードメインである、項65～68のいずれか一項記載の方法。
項70． 一方のロイシンジッパードメインがBZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインがAZip（EE）である、項69記載の方法。
項71． 前記タンパク質相互作用ドメインが、PSD95-Dlg1-zo-1（PDZ）ドメインである、項65～68のいずれか一項記載の方法。
項72． 一方のタンパク質相互作用ドメインがストレプトアビジンであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）である、項65～68のいずれか一項記載の方法。
項73． a. 一方のタンパク質相互作用ドメインがmTORのFKBP-結合ドメイン（FRB）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である；
b. 一方のタンパク質相互作用ドメインがシクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である；
c. 一方のタンパク質相互作用ドメインがカルシニューリンA（CNA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である；
d. 一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性（GIA）であり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性矮性1（GID1）である；
e. 一方のタンパク質相互作用ドメインがSnapタグであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがHaloタグである；または
f. 一方のタンパク質相互作用ドメインがT14-3-3-cdeltaCであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがPMA2のC末端ペプチド（CT52）である、
項65～68のいずれか一項記載の方法。
項74． a. 一方のタンパク質相互作用ドメインがmTORのFKBP-結合ドメイン（FRB）でありかつもう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、タクロリムス、ラパログ（rapalog）、またはエベロリムスを投与する段階をさらに含み；
b. 一方のタンパク質相互作用ドメインがシクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）でありかつもう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、FKCsAを投与する段階をさらに含み；
c. 一方のタンパク質相互作用ドメインがカルシニューリンA（CNA）でありかつもう一方のタンパク質相互作用ドメインがFK506結合タンパク質（FKBP）である場合、FK506を投与する段階をさらに含み；
d. 一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性（GIA）でありかつもう一方のタンパク質相互作用ドメインがジベレリン非感受性矮性1（GID1）である場合、ジベレリンを投与する段階をさらに含み；
e. 一方のタンパク質相互作用ドメインがSnapタグでありかつもう一方のタンパク質相互作用ドメインがHaloタグである場合、HaXSを投与する段階をさらに含み；または
f. 一方のタンパク質相互作用ドメインがT14-3-3-cdeltaCでありかつもう一方のタンパク質相互作用ドメインがPMA2のC末端ペプチド（CT52）である場合、フシコクシンを投与する段階をさらに含む、
項74記載の方法。
項75． 一方のタンパク質相互作用ドメインがPYLであり、もう一方のタンパク質相互作用ドメインがABIである、項65～68のいずれか一項記載の方法。
項76． 前記認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインがヌクレオチドタグであり、前記シグナル伝達ポリペプチドの細胞外タンパク質相互作用ドメインがジンクフィンガードメインである、項65～68のいずれか一項記載の方法。
項77． 前記ヌクレオチドタグがDNAタグである、項76記載の方法。
項78． 前記DNAタグがdsDNAタグである、項77記載の方法。
項79． 1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）前記第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合について前記シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインとを含む第2の認識ポリペプチドを投与する段階をさらに含む、項65～78のいずれか一項記載の方法。
項80． 前記第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと前記第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性が、前記シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと該第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きい、項79記載の方法。
項81． 前記第2の認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない、項79～80のいずれか一項記載の方法。
項82． 前記方法が、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）タンパク質相互作用ドメインとを含む第2の認識ポリペプチドを投与する段階をさらに含み；
前記シグナル伝達ポリペプチドが、該第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含む、
項65～78のいずれか一項記載の方法。
項83． 前記シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと前記第2の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性が、該シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと前記第1の認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱い、項82記載の方法。
項84． 前記第1および第2の認識ポリペプチドが、それぞれ第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；かつ
該第2のタンパク質相互作用ドメインが、相互に特異的に結合する、
項82～83のいずれか一項記載の方法。
項85． 前記方法が、
c. 1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）ヌクレオチドタグの第1の部分とを含む、第1の認識ポリペプチド；および
d. 1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）該ヌクレオチドタグの第2の部分とを含む、第2の認識ポリペプチド
を投与する段階をさらに含み；
前記シグナル伝達ポリペプチドが、1）該ヌクレオチドタグの個々の部分の会合によって形成される完全ヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインを含み；
該ヌクレオチドタグの該個々の部分が、それらが相互に会合していないかぎり、該ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、
項65～78のいずれか一項記載の方法。
項86． 前記ヌクレオチドタグの第1の部分がssDNAであり、該ヌクレオチドタグの第2の部分が相補的ssDNAである、項85記載の方法。
項87． 前記方法が、1）第3の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）前記ヌクレオチドタグの第3の部分とをコードする第3の認識ポリペプチドを投与する段階をさらに含み；
該ヌクレオチドタグの個々の部分または個々の部分のうち2つの組合せは前記ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができないが、3つの部分全てが相互に会合している場合は結果として生じる複合体は該ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができる、
項85～86のいずれか一項記載の方法。
項88． 1）前記ヌクレオチドタグの第1の部分が、ssDNAであり；2）該ヌクレオチドタグの第2および第3の部分が、それぞれ該第1の部分と相補的であるssDNAであり；かつ3）該ヌクレオチドタグの該第2および該第3の部分が、相互に重複しない配列を有する、項87記載の方法。
項89． 前記方法が、
c. 1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）第1のヌクレオチドタグとを含む、第1の認識ポリペプチド；
d. 1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）第2のヌクレオチドタグとを含む、第2の認識ポリペプチド
を投与する段階を含み；
前記シグナル伝達ポリペプチドが、1）該第1のヌクレオチドタグと特異的に結合できる細胞外ジンクフィンガードメインを含み；
該ヌクレオチドタグが相互に会合している場合は、それらは該ジンクフィンガードメインによって特異的に結合されることができない、
項65～78のいずれか一項記載の方法。
項90． 前記第1のヌクレオチドタグがヘアピンループ構造を形成し、前記第2のヌクレオチドタグが、該第1のヌクレオチドタグの、該ヘアピンループの1本の足の一部および該ヘアピンループのループの一部を包含する部分と相補的である、項89記載の方法。
項91． 前記第2の標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない、項89～90のいずれか一項記載の方法。
項92． 標的リガンドが、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである、項65～91のいずれか一項記載の方法。
項93． シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、病的および／または標的細胞上で見出されるリガンドである、項65～92のいずれか一項記載の方法。
項94． シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、病的および／または標的細胞上では見出されるが健康および／または非標的細胞上では見出されないリガンドである、項65～93のいずれか一項記載の方法。
項95． 前記病的細胞が、がん性細胞である、項65～94のいずれか一項記載の方法。
項96． 前記細胞が項64記載の細胞であり、かつ、前記対象に、1）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、2）第2のシグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるタンパク質相互作用ドメインとを含む第2の認識ポリペプチドがさらに投与される、項65～95のいずれか一項記載の方法。
項97． 第2の多成分CARシグナル伝達ポリペプチドの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインが、T細胞活性を阻害する、項96記載の方法。
項98． 前記第2のシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドである、項96記載の方法。
項99． 前記第2のシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである、項96～98のいずれか一項記載の方法。

実施例1
養子T細胞療法は、がん治療のためのパラダイムシフト技法になりつつある。患者へのキメラ抗原受容体（CAR）発現T細胞の移入は、B細胞悪性腫瘍に対する臨床試験で素晴らしい大成功を収め、近年にいくつかの大きな商業投資取引に導いた。有望であるものの、がん特異性は、それが単一の腫瘍関連バイオマーカーを特定することに依存しているので、依然として大きな制限がある。既存のCARシステムは、2種の抗原だけを組み入れることができ、さらなる増強のための能力を有さない。多くのがん標的を感知し、複雑な論理計算を実行し、がん細胞の殺傷を遂行できる、新規なCARプラットフォーム（本明細書において多成分CARまたはSMART CARと呼ばれる）が、本明細書において提供される。

さらに、本明細書に記載のCARは、患者のT細胞のさらなる遺伝子改変なしにインビボで新しい標的に適応できるようにモジュール式に設計される。この高度モジュール式設計は、がんに対する細胞ベースの治療に斬新な影響を持ち、無類の特異性および柔軟性を与える。本明細書に記載の技法は、養子T細胞療法を患者自身のニーズに調整可能にすることによって、それをより強力にする。既存のCARを用いた治療は、治療が適用された後にその治療に変更を加えることが困難なせいで、選ばれた患者群のために実行可能である。本明細書に記載の多成分CARを用いた治療は、ベッドサイドでの治療活動を変更する手段を可能にし、医師に養子T細胞療法を制御するための簡単で有効な手段を提供する。

患者へのキメラ抗原受容体（CAR）発現T細胞の移入は、がん免疫療法のための有望なアプローチである。この治療アプローチは、悪性細胞を破壊するようにT細胞を方向付ける合成免疫受容体を用いたT細胞の遺伝的リプログラミングに基づく。CARは、典型的には、細胞外抗原認識ドメインとしての単鎖可変断片（scFv）抗体およびT細胞活性化をトリガーするためのシグナル伝達細胞質ドメインからなる（図1A）。CD19に標的化されたCAR発現T細胞は、臨床試験において白血病を治癒することが好結果に示されており、この臨床試験では、患者の最大92％が処置後に長期完全寛解になった。有望であるものの、この技法は欠点も有する。臨床試験から、担CAR T細胞が低レベルの標的腫瘍抗原を発現している正常宿主組織に応答する致命的事象が出現した。抗CD19 CARが他のCARよりも好結果である理由は、CD19 CARに関するオフターゲット効果が予期され、処理しやすいからである。CD19の発現は、ほとんどB細胞に限られる。CD19 CARを発現しているT細胞は、健康B細胞および悪性B細胞の両方を破壊するものの、B細胞の長期欠乏は、免疫グロブリン補充療法で管理可能である。

残念ながら、これは、がん抗原が非常に限定されたセットの組織だけに見出される他の多くの腫瘍にはあてはまらない。危険なオフターゲットの問題に対抗するために、2種の異なる抗原認識抗体がTCRおよび共刺激ドメインと別々に融合されることにより、両方の抗原を有する腫瘍だけが完全なT細胞活性化プログラムをトリガーする、組合せ受容体アプローチが開発されている。しかし、このアプローチは、2種の抗原を同時に認識させるだけであるので、このアプローチの潜在性をひどく束縛している。

本明細書においてSMART CARとも呼ばれる本明細書に記載のCARプラットフォームは、複数のバイオマーカーを使用してT細胞ががん細胞を検出し、これらのマーカーに基づき複雑な組合せ論理計算を実行することを可能にする。この計算能力は、任意の他の形態の治療剤（例えば生物製剤および小型分子）では達成することがほぼ不可能であり、極めて高い腫瘍特異性を可能にする。

特に、既存のCAR技法は、がんを健康な細胞と特異的に識別する単一のバイオマーカー、すなわち「魔法の弾丸」を見つけることに頼っており、これは、極めて困難であることが判明している。実際、他のがんにCAR技法を採用する大きな支障は、格好な標的を見出すことである。本明細書に記載の技法は、標的化可能ながん抗原の数を大きく増やすことで、養子免疫療法の分野を一変させるものである。

キメラ抗原受容体は、がん抗原特異的単鎖抗体と、T細胞受容体（TCR）および／または他の共刺激経路の細胞内シグナル伝達ドメインとの融合体である。既存のCAR技法は、単鎖抗体による1つの抗原の認識にもっぱら依存しており、このことがCAR技法の特異性を妨げている。より多くのがん抗原を同時に検出できるならば、特異性を大きく改善できる。本明細書に記載の技法は、複数種の抗原の認識を可能にする。そのうえ、正常組織の特定を助ける抗原も本明細書に記載のT細胞によって検出されることができ、その結果、健康な細胞上のこれらの抗原の存在は、T細胞活性化を阻害する。したがって、がん細胞および正常細胞の両方からの抗原を検出でき、複雑な組合せ型論理計算を実行できる本明細書に記載の技法は、特異性を大きく改善する。

分子計算を実行するためにプログラム可能な相互作用を利用する多成分CARが、本明細書に記載されている。一部の態様では、電荷相互作用によってヘテロマー構造を形成できるタンパク質ドメインであるロイシンジッパーが、今回の受容体設計に使用される。この新しいCARの設計では、ロイシンジッパーは、CAR上の細胞外ドメインと置き換わり、コグネイトロイシンジッパーが抗体と融合される。コグネイトロイシンジッパーが相互に結合すると、それらは、CARのシグナル伝達活性を活性化できる。ロイシンジッパードメインは、相互に同じ結合パートナーを競合することで、阻害および「OFF」機能性を可能にすることもできる。そのうえ、複数の直交対は、異なるシグナル伝達ドメイン（例えばPD-1、CTLA-4）の制御を独立して可能にする。また、ロイシンジッパー対の間の異なる親和性は、複雑な機能の改変を可能にする。例えば、zipCARの出力シグナルの強度を調整でき、ロイシンジッパー対の間の弱い相互作用により協同動作の使用が可能になり、「AND」機能性を可能にする。

例えば、2つのjurkat細胞株に2つの異なるレンチウイルスベクターを形質導入した。一方のjurkat細胞株は、シグナル伝達ドメイン（CD3ゼータ）がmCherryと融合したzipCARを発現した。その他のjurkat細胞株は、コグネイトロイシンジッパーを有するzipCARを発現し、シグナル伝達ドメイン（CD3ゼータ）を有さず、mCherryとも融合していなかった。シグナル伝達ドメインを有するzipCARを発現しているJurkat T細胞が、コグネイトzipCARを発現している細胞と相互作用することによってシグナル伝達経路を活性化および開始できたことが観察された。このことは、プライマリーT細胞におけるzipCARの機能性を実証している（データは示さず）。

さらなる例では、zipCARと結合できるロイシンジッパーと結び付いたHER2を標的化する単鎖可変断片（scFv）を含有する抗体を精製した。プライマリーCD4+ T細胞（分泌されたサイトカインを測定した）およびJurkat細胞株（NFATプロモーター活性を測定した）において精製抗体によってzipCARを活性化できることが検証された（データは示さず）。

そのうえ、異なるシグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激、共阻害シグナル伝達ドメイン）を制御するために使用できるロイシンジッパー対のうちのいくつかの直交対を本明細書に記載する。

細胞外ドメインとして、抗体、ストレプトアビジン、またはCD16を使用する既存の技法とは対照的に、ロイシンジッパーのこの使用は、洗練された分子計算を可能にする。

複数の入力の感知を可能にするために多くのロイシン-ジッパードメインを選択できる。異なる経路を制御できるように、シグナル伝達ドメインを改変および／または選択することもできる。さらに、ロイシンジッパーの相互作用の親和性における変動は、活性化強度の制御を可能にする。最後に、任意のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインが、PDZドメイン、SBP（ストレプトアビジン結合タンパク質）-ストレプトアビジン、または薬物誘導性FKBP-FRB対もしくはPYL-ABI対のようなロイシンジッパードメインと置き換わることができると、本明細書において考えられている。

実施例2
一部の態様では、本明細書に記載の多成分CARは、CAR（zfCAR）の細胞外部分としてジンクフィンガータンパク質および細胞内伝達ドメインとして様々なシグナル伝達タンパク質を利用する。さらに、ジンクフィンガータンパク質を、予め定義された2本鎖DNA配列と高い親和性および特異性で結合するように改変できる。抗体を任意のDNA配列で標識できる。まとめて言えば、抗体が抗原と結合すると、zfCARはDNAと結合し、T細胞活性化をトリガーする。zfCARを異なる抗原について再設計する必要がないので、そのような分割型システムは非常に柔軟である。さらに、本明細書に記載の技法は、既存のシステムによって複製できない複雑な分子計算を実施できる。例えば、異なる抗体は、全ての抗体の存在下でのみジンクフィンガーとの結合に必要である適切な2本鎖DNAが形成される、異なる相補的1本鎖DNA配列とコンジュゲートされることができる。この配置は、多入力ANDゲートを表す。3種だけの抗体を使用することによって、本明細書に記載のシステムは、CARによってこれまでに実証された多くの抗原認識（2）をすでに凌いでいる。さらに、DNA配列は、ジンクフィンガードメインと結合する2本鎖DNAを破壊することで、NOTゲートを形成するように作ることができる。これらの中断的なDNA配列を、正常細胞と結合する抗体に取り付けることで、T細胞が健康な組織を攻撃することを防止できる。まとめると、CARベース療法において高度に洗練された論理計算を初めて達成できる。

zfCARの別のユニークな特徴は、異なるDNA配列と結合するようにジンクフィンガータンパク質を容易に設計できることである。そのように、別個のシグナル伝達経路を活性化させる異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有する複数の直交zfCARを改変できる。この設計には少なくとも2つの利点がある。1）これは、より多くの抗原を検出することおよび全体的なT細胞応答に組み入れることを可能にする。2）異なるシグナル伝達経路を独立して制御することで、T細胞応答を調整する高度にカスタマイズした方法を提供できる。阻害性シグナル伝達経路も使用でき、したがって、安全性および特異性をさらに改善できる「OFF」スイッチを提供する。生物科学の3つの新興分野、すなわちDNAナノテクノロジー、合成生物学、および養子免疫療法を合併することによって、がんの治療を大きく改善することを期待させる革新的な受容体技法が、本明細書において提供される。

複数のジンクフィンガードメインを利用して、複数の入力の感知を可能にできる。シグナル伝達ドメインを変えることができ、その結果、異なる経路を制御できる。さらに、活性化強度を制御するためにDNAに対するジンクフィンガーの親和性を変えることができる。一部の態様では、ジンクフィンガードメインの代わりに別のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインを用いることができる。

実施例3：分割型（split）、万能（universal）、プログラム可能（programmable）かつ再構成可能（reconfigurable）な（SUPRA: split, universal, programmable, and reconfigurable）CARプラットフォーム
多重抗原標的化を実行し、論理計算を実行し、かつがん細胞の殺傷を遂行できるCARプラットフォームの開発を介したCARベース療法の特異性および安全性の改善が、本明細書に記載されている。本明細書に記載の例示的な態様では、万能受容体を生成するためにTCR細胞内シグナル伝達ドメインへの細胞外ドメインとして、ヘテロ二量体性ロイシンジッパータンパク質を利用した。該受容体を、単鎖抗体およびコグネイトロイシンジッパードメインからなる融合タンパク質によって活性化できる。抗体-ジッパー融合体は、抗原と改変T細胞との間のアダプターとして役立つ。抗体は、抗原特異性を提供し、ロイシンジッパーの同一性は、どの受容体を活性すべきかについて指令する。このCARプラットフォームは、T細胞のさらなる遺伝子改変なしに、改変T細胞が新しい標的をインビボで標的化できるようにする。このモジュール式設計は、特異性、柔軟性、およびプログラム可能性をもたらす。

患者へのキメラ抗原受容体（CAR）発現T細胞の移入は、がん免疫療法のための有望なアプローチである^1、2。この治療アプローチは、悪性細胞を破壊するようにT細胞を方向付ける合成免疫受容体を用いたT細胞の遺伝的リプログラミングに基づく。CARは、典型的には、細胞外抗原認識ドメインとしての単鎖可変断片（scFv）抗体およびT細胞活性化をトリガーするための細胞質シグナル伝達ドメインからなる（図1A）。CD19に標的化されたCAR発現T細胞は、臨床試験において白血病を治癒することが好結果に示されており、この臨床試験では、患者の最大90％が処置後に長期完全寛解になった¹。有望であるものの、この技法は欠点も有する。担CAR T細胞が低レベルの標的腫瘍抗原を発現している正常宿主組織に応答する臨床試験から致命的事象が出現した³。抗CD19 CARが他のCARよりも好結果である理由は、CD19 CARに対するオフターゲット効果が予期され、処理しやすいからである。CD19の発現は、ほとんどB細胞に限られる。CD19 CARを発現しているT細胞は、健康B細胞および悪性B細胞の両方を破壊するものの、B細胞の長期欠乏は、免疫グロブリン補充療法で管理可能である。不幸にも、これは、がん抗原が非常に限定された組織セットにだけ見出される他の多くの腫瘍にはあてはまらない。

危険なオフターゲットの問題に対抗するために、2種の異なる抗原認識抗体がTCRおよび共刺激ドメインと別々に融合されることにより、両方の抗原を有する腫瘍だけが完全なT細胞活性化プログラムをトリガーする組合せ受容体アプローチが開発されている^4、5（図1B）。しかし、このアプローチは、2種の抗原が同時に認識されることを可能にするだけなので、このアプローチの潜在性をひどく束縛している。そのうえ、他の研究者は、異なる抗原特異性を有する2種のscFvを1つのCAR上に一緒に融合させることで、2種の抗原のどちらか一方にT細胞活性化をトリガーさせることができたことを示した⁶。このシステムは、OR論理を繰り返しており、2種の抗原への変異が必要であるので腫瘍の回避の機会を減らすことができる。しかし、現在のところ、この縦列型抗体CARの設計は、OR論理だけを実行できる。より多くのがん抗原を同時に検出できるならば、特異性を大きく改善できる。そのうえ、健康な細胞上でのこれらの抗原の存在がT細胞活性化を阻害するように、正常な組織を特定する抗原もT細胞によって検出されるはずである。したがって、複数の入力を適応させ、かつ複雑な論理を実行できる戦略が理想的である。

「固定された」CARの設計を使用する別の課題は、改変T細胞によって異なる抗原を標的化しようとする場合、受容体の新しいセットを生み出さなければならず、患者のT細胞を新しい受容体で再び改変する必要がある。

そのように、CARが2つの部分、すなわち受容体部分および抗体部分に分割された分割型または万能型CARの設計が探索されている。受容体部分は、動員ドメインと共に細胞表面で発現する。この受容体は、抗原を認識できない。抗体部分は、細胞上の受容体が認識できるリガンドまたはコグネイト結合ドメインで修飾されている。抗体は、がん細胞と結合し、抗体上のリガンドは、対応する受容体を発現しているT細胞を動員および活性化する。分割型CARの配置は、受容体および免疫細胞を再改変せずに大きな抗原パネルを標的化できるようにする。抗原認識モチーフをT細胞上のシグナル伝達モチーフに動員するために2つの異なる戦略が利用可能であり、それらは本プロジェクトの妙案として役立つ（図1b）。分割型CARの設計の最も簡単なバージョンは、CD16細胞外ドメインと細胞内TCRシグナル伝達ドメインとの融合により成し遂げられる⁷。CD16は、モノクローナル抗体の定常領域と結合する低親和性Fc受容体である。したがって、製薬会社によって製造された多くのモノクローナル抗体を修飾せずに養子免疫療法のために使用できる。便利であるものの、このCD16 CARは、患者によって産生される内因性抗体との結合によって多くの潜在的なオフターゲット効果を有する可能性がある。

養子免疫療法における抗原特異性の限界に取り組むために、開発された分割型（split）、万能（universal）、プログラム可能（programmable）かつ再構成可能（reconfigurable）な（SUPRA: Split, Universal, Programmable, and ReconfigurAble）CARプラットフォームが本明細書において開発されている（図2A）。SUPRAプラットフォームは、CARの細胞外部分としてプログラム可能な生体分子相互作用ドメインおよび細胞内ドメインとして様々なシグナル伝達タンパク質を使用する（図2B）。特に、電荷相互作用によってヘテロマー構造を形成できるタンパク質ドメインであるロイシンジッパーを、受容体設計に使用した。この新しいCARの設計では、ロイシンジッパーは、CAR上の細胞外ドメインと置き換わり、コグネイトロイシンジッパーが抗体と融合される（図3A）。ロイシンジッパーの多くの直交対が利用可能であり、したがって、本発明者らの設計活動のための候補の大型プールを提供するので、ロイシンジッパーは、SUPRAプラットフォームのための良好な候補である。ロイシンジッパードメインは、同じ結合パートナーを相互に競合するように改変することで、阻害および「OFF」機能性を可能にすることもできる（図3B）。そのうえ、scFvに融合したロイシンジッパーとzipCARとの間の弱い相互作用は、ANDゲート機能性が多重抗原標的化を実行できるようにする。加えて、ロイシンジッパー対の間の異なる親和性は、複雑な機能の改変を可能にする。そのうえ、複数の直交対は、異なるシグナル伝達ドメイン（例えばPD-1、CTLA-4）の制御を独立して可能にする（図3C）。

細胞外ドメインとしてBZip（RR）⁹ならびに細胞内ドメインとしてCD28、41BB、およびCD3zのシグナル伝達ドメインから構成されるCARをプライマリーCD4 T細胞に形質導入することによって、SUPRA CARの活性を試験した。表面にAZip（EE）またはBZip（RR）ロイシンジッパードメインのいずれかを発現しているJurkat T細胞株も生成させた。細胞株を一緒に混合すると、zipCARを発現している改変CD4 T細胞が、表面にAZip（EE）ドメインを発現しているJurkat T細胞と相互作用することによってシグナル伝達経路を活性化および開始できた（図4）。

zipCARと結合できるロイシンジッパーと結び付いたHER2を標的化する単鎖可変断片（scFv）を含有する精製抗体が産生された。Her2発現K562細胞と混合すると、プライマリーCD4+ T細胞においてBZip CAR（RR）を精製抗体によって活性化できる（分泌サイトカインを測定）（図5）。そのうえ、異なるシグナル伝達ドメイン（例えば共刺激、共阻害シグナル伝達ドメイン）を制御するために使用できるロイシンジッパー対の少なくとも3つの直交対が特定された¹⁰（図6a）。本明細書に記載の受容体によって異なる経路を独立して制御できるように、シグナル伝達ドメインを置換できる。活性化強度を制御するためにロイシンジッパーの親和性を変えることができる。実際に、より結合性の弱いジッパー対がより弱いT細胞活性化をもたらすことが実証された（図6B、6D）。最後に、任意のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインが、PDZドメイン、SBP（ストレプトアビジン結合タンパク質）-ストレプトアビジン、または薬物誘導性FKBP-FRB対、PYL-ABI対のようなロイシンジッパードメインに取って代わることができる。実際に、FKBPおよびFRBが、細胞外動員ドメインとして使用され、ラパマイシン類似体の添加によりT細胞を活性化できることが実証された（図7）。FRBドメインは、抗体と融合することで、T細胞の活性化に別の制御を与えることができる。小型分子薬は、より不安定であるので、抗体よりも速く身体から浄化される可能性があり、薬物投与を中止した後に、より迅速なOFFを可能にする。

SUPRAプラットフォームに使用できる別のプログラム可能な相互作用ドメインは、ジンクフィンガードメインである。ジンクフィンガードメインは、細胞にDNAのバーコードを付けるために細胞表面に発現する¹¹。さらに、予め定義された2本鎖DNA配列と高い親和性および特異性で結合するようにジンクフィンガータンパク質を改変できる。加えて、市販のキットおよびサービスを使用して、抗体を任意のDNA配列で標識できる。まとめると、DNA-抗体コンジュゲートががん細胞上の抗原と結合すると、ジンクフィンガーCAR（zfCAR）がDNAと結合し、T細胞活性化をトリガーできる（図8A）。そのうえ、DNAナノテクノロジーの開発により、他のシステムが真似することが困難な複雑な分子計算を実行するようにDNAをプログラムできる。例えば、抗体は、全ての抗体の存在下でのみ、ジンクフィンガータンパク質との結合に必要な格好な2本鎖DNAが形成される、異なる相補的1本鎖DNA配列とコンジュゲートできる（図8B）。この配置は、多入力ANDゲートを表す。わずか3種の抗体を使用することによって、それは、開発された任意のCARシステムよりも多い抗原を認識できる。さらに、ジンクフィンガードメインと結合する2本鎖DNAを破壊することでNOTゲートを形成するように、DNA配列を作ることができる。これらの中断的なDNA配列を、正常細胞からの抗原と結合する抗体に取り付けることで、T細胞が健康な組織を攻撃することを防止できる（図8C）。まとめると、CARベース療法において高度に洗練された論理計算を達成できる。DNAを用いてzfCARを活性化できることが、本明細書において実証されている（図8D）。

本明細書に記載のCARプラットフォームは、他の技法に比べて少なくとも2つの別個の利点を与える。第1に、ジンクフィンガーおよびロイシンジッパーから数多くの直交動員対が容易に入手可能である。これらの直交対は、異なるシグナル伝達経路の独立した制御および最適な応答を達成するためのT細胞シグナル伝達の微調整を可能にする。第2に、本明細書に記載のCARプラットフォームは、細胞外プログラム分子相互作用を経て複雑な論理計算を実行できる。この計算能力は、任意の他の形態の治療剤（例えば生物製剤および小型分子）では達成することがほぼ不可能であり、極めて高い腫瘍特異性を可能にする。

参考文献

実施例4
標的遺伝子の発現を活性化させるためにCRISPRを使用する。構成的プロモーター下で発現する遺伝子を含有する配列のレンチウイルス組込みを介して、該遺伝子を過剰発現させることが可能である。腫瘍においてT細胞機能を促進できる1つまたは2つの遺伝子を過剰発現させるためにこの設計を使用することは想像できるとはいえ、腫瘍微小環境は、多くの遺伝子を一度に過剰発現させてT細胞を制限している多くの難題に対抗することができる、より入り組んだシステム必要とする場合がある。複数の遺伝子を直接形質導入するためにレンチウイルス組込みを使用することは、遺伝子発現を確実にするためにウイルス組込みおよびスクリーニングのための時間を必要とするので、非効率になる。加えて、レンチウイルス組込みは、複数ラウンドの感染を経ると効率が下がり、多数の構成的で発現する遺伝子を組み込むには、あまり望ましくない候補になる。

CRISPRは、T細胞における多重発現のために利用できると本明細書において考えられている。II型CRISPRシステムは、DNAの標的配列を切断するCas9と呼ばれるDNAヌクレアーゼに頼っている。これらの標的は、標的DNA配列と相補的なガイドRNA（sgRNA）によって定義される。標的化のための動員は非常に簡単である：標的配列は、NGGと同じように簡単であることができる短いPAM配列に直接先行しなければならない。gRNAは、トランス活性化crRNA（tracrRNA）と結合して複合体を形成し、この複合体がCas9を特異的配列にガイドできる。

ヌクレアーゼがヌクレアーゼ欠損Cas9（dCas9）を作る能力を除去し、それをVP64のような活性化ドメインに取り付けることによって、CRISPRシステムは遺伝子活性化のために手直しされている。加えて、gRNA/tracrRNAシステムを模倣するように単一のガイドRNA（sgRNA）が設計されており、それにより、たった1つのRNA成分だけが所望の配列を標的化するために必要である。sgRNAは、VP64が遺伝子発現を作動させることができるプロモーターに向けてdCas9を標的化するように設計できる（図10A）。遺伝子発現を調節するためにCRISPRを使用するいくつかの利点がある。配列が標的化される要件は、隣接PAM配列の存在であるので、多くの潜在的標的を見出すことが非常に容易である。加えて、これらのガイドRNAは、28ヌクレオチド長切断部位でRNAを切断するためにCsy4と呼ばれる酵素を使用するIII型CRISPRシステムを使用して、多重活性化用にパッケージングできる（41）。このシステムでは、全てのガイドRNAを含む単一の転写物を1つのプロモーター下で発現させることができる。ガイドRNAは、切断部位により相隔たることができ、Csy4は、単一の転写物を切断して別個のガイドRNAにできる。ガイドRNAのサイズは小さいので、多数を1つのレンチウイルスプラスミドにパッケージングして複数の遺伝子の過剰発現をもたらすシステムを生み出すことができる。

T細胞活性、増殖、およびアポトーシスに影響するいくつかの遺伝子を標的化できる。増殖を促進するために、T細胞の成長および増殖に必要であり、養子T細胞療法のためにエクスビボでT細胞集団を拡大培養するために使用されている標的インターロイキン-2（IL-2）（12）を標的化できる。いくつかの態様では、IL-2に対するT細胞の親和性を増加させるIL-2受容体のα鎖（42）を過剰発現させることができる。CD8 T細胞を活性化させるTh1表現型に向けてCD4 T細胞を駆動するインターロイキン12（IL-12）を過剰発現することによって、T細胞活性を発現させることができることも考えられている（43）。同様に、同じくTh1表現型を促進してマクロファージを活性化させるインターフェロンγ（IFNγ）の過剰発現（44）も考えられている。

腫瘍がT細胞におけるアポトーシスを促進する能力に対処するために、アポトーシス阻害因子を誘導するインターロイキン-15（IL-15）（45）を過剰発現させることができる。これらの因子に加えて、CD8T細胞メモリーを促進するIL-7受容体α鎖、および腫瘍形成を阻害するサイトカインである腫瘍壊死因子α（TNFα）（46、47）を過剰発現させることができる。PAM配列に隣接する配列を特定するためのZiFitウェブツールを使用することによって、各遺伝子の発現を制御している内因性プロモーターを標的化するための潜在的sgRNAを設計できる。全体としてガイドRNAがプロモーターの長さに及ぶように、ガイドRNAを設計できる。

ガイドRNAは、例えば、個々のガイドsgRNAおよびdCas9-VP64を一過性形質移入されたJurkatに発現させることができる。標的に応じて、ELISA、抗体、またはqRT-PCRを使用して、それぞれの遺伝子の発現を監視できる。内因性遺伝子を標的化するためにsgRNAの組合せを使用することは、単一のsgRNAの使用よりも有効であり、プロモーターを活性化させるためにうまく働く組合せを特定しかつ試験できることが、観察されている。

腫瘍微小環境をシミュレートする。腫瘍微小環境におけるT細胞活性を増加させるためのこれらのsgRNAの使用を実証するために、T細胞がインビトロで直面する多くの課題をシミュレートできる。例えば、培地中へのTGF-βおよびPD-Lの包含は、T細胞活性を下方調節する因子を導入する。トリプトファンおよびアルギニン枯渇培地は腫瘍微小環境における栄養分の欠如を刺激できる。さらに、T細胞活性を下方調節するTregのような他の細胞の、または微小環境中でT細胞に対する傷害性に関与するインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）を分泌する細胞の導入は、腫瘍微小環境をシミュレートするのに有用であることができる。さらに、低酸素、低pHのシステムを使用できる。このシミュレートされた微小環境中のT細胞の挙動を決定し、sgRNAを発現している細胞と比較できる。レンチウイルス組込みを利用して、最もよく遺伝子を活性化させるdCas9-VPP64とsgRNAとの組合せを発現しているJurkatの安定株を生み出すことができる。これらのT細胞をシミュレートされた腫瘍微小環境に曝露し、T細胞計数、生／死アッセイ、およびCD69活性化マーカーの監視を使用してその増殖および活性化を比較できる。

多重活性化システムを設計および試験する。Csy4切断システムを使用して多重因子の組合せを構築できる。レンチウイルス骨格に3つの成分（dCas9-VP64、Csy4、および多重ガイドRNA）を発現させ、蛍光タグを付加して、組込みを追跡できる。システムの成分の全てを取り込んだ細胞について選別するために蛍光タグを使用して、これらの構築物をJurkat細胞に組み込むことができる。シミュレートされた腫瘍微小環境ならびにT細胞活性および増殖を測定するために開発されたアッセイを使用して、腫瘍微小環境にとってより優れたT細胞を生み出すための最良の組合せを決定できる。T細胞シグナル伝達は、複雑であり、かつ本発明者らが標的化している遺伝子間の多くの相互作用に依存するので、ある特定の因子が相乗的に作用できるかどうか、および2つを同時に標的化することに冗長性があるかどうかを判定する。

プライマリー細胞およびマウスにおいて試験する。プライマリー細胞に多重活性化システムを形質導入できる。シミュレートされたT細胞微小環境およびJurkatで試験されたアッセイを使用して、T細胞活性化を監視できる。加えて、人工抗原提示細胞を使用して、貧しい微小環境中でがん細胞を殺傷するプライマリーCD8 T細胞の能力を試験できる。このシステムをマウスにおいてさらに試験して、T細胞の活性および増殖能を増加させることで、腫瘍をインビボで殺傷する能力を高めることができると実証できる。

一部の態様では、CRISPRを実装するための、またはT細胞に複数の遺伝子を組み込む方法としてのトランスポゾンの使用によって、減少したトランスフェクション効率に取り組むことができる（48）。

ガイドRNAが関心対象のプロモーターに特異的であることが重要である。特に、単一の遺伝子を活性化させるために複数のガイドRNAが必要であることが観察されたことから、CRISPR活性化が特異的であり得ることが示唆される。オフターゲット活性化が観察される場合、より特異的な、sgRNAの異なる組合せを特定できる。遺伝子活性化なしに過剰発現を可能にする所望の遺伝子のトランスポゾン組込みも、利用できる。

活性化および増殖を促進する因子の発現を増加させることが、腫瘍微小環境の設定において助けになることができるとはいえ、T細胞の活性増加は、周囲の組織に有毒な高い免疫応答をトリガーする場合がある。マウスモデルにおいてこの問題を追跡することが重要である。この問題に取り組むための一つの戦略は、標的遺伝子の活性化を制御できるようにdCas9を誘導性にすることである。Tet特異的またはGal4特異的プロモーターを作動させるようにガイドRNAを設計すると、CRISPRシステムによって、Hekにおいてプラスミド遺伝子を活性化できることが、本明細書において実証されている（図11）。これらの結果によって、哺乳動物細胞において遺伝子を活性化させるためのCRISPRの使用が確認された。

参考文献

実施例5
細胞外BZIPロイシンジッパー³⁰ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインとしてのCD28、4-1BB、およびCD3ζと融合することによるSUPRA CARプラットフォーム。mCherry蛍光タンパク質およびmycエピトープタグもBZIP CAR（zipCAR）と融合され、形質導入効率の測定を容易にした。このSUPRA CARの活性を、zipCARを含有するレンチウイルスでヒトプライマリーCD4 T細胞を改変することによって試験した。AZIPロイシンジッパーと結びついた抗Her2 scFvを含有するzipFvを精製した。このzipFvは、zipCARおよびHer2と結合できる。zipCARは、K562細胞を発現しているHer2と混合されると、プライマリーCD4+ T細胞において精製抗Her2 zipFvによって活性化されることができる（分泌されたサイトカインによって測定）（図13A）。対照的に、BZIPドメインを有する抗Her2 zipFvは、zipCARおよびT細胞を活性化させなかった。SUPRA CARががん細胞に対する細胞傷害性を媒介する能力を試験するために、SUPRA CARをヒトプライマリーCD8 T細胞に形質導入し、SUPRA CAR CD8 T細胞を、zipFvおよびHer2発現K562細胞と混合した（図13B）。結果として、SUPRA CARプラットフォームは、用量依存的に標的がん細胞の殺傷をもたらすことが本明細書において実証されている。zipFv単独は、いかなる有意な細胞殺傷も導かず、したがって、細胞殺傷は改変T細胞およびzipCARによって媒介されることが確認された。

ロイシンジッパー（図14B）およびscFv（図14C）の親和性を変えて、zipCARの活性化強度を制御した。ジッパー対の結合親和性を変えることによって、がん細胞に対するzipCARを備えるヒトプライマリーCD8 T細胞の応答を調節できた。そのうえ、抗原に対するscFvの親和性を変えることによってプライマリーCD8 T細胞による標的がん細胞の殺傷を調節できたことも実証された。

Claims (12)

1. 多成分キメラ抗原受容体（CAR）を含む組成物であって、該多成分CARが、
   a. 1）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬および 2）ロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインを含み、かつ、細胞外空間に存在する、第1の細胞外認識ポリペプチド；ならびに
   b. 1）該第1の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できる細胞外ロイシンジッパータンパク質相互作用ドメイン、 2) 膜貫通ドメイン、および 3）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含み、かつ、膜貫通タンパク質である、シグナル伝達ポリペプチド
   を含む、前記組成物。
2. 一方のロイシンジッパードメインがBZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインがAZip（EE）である、請求項1記載の組成物。
3. (i）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、(ii）前記第1の細胞外認識ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインへの結合について前記シグナル伝達ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインと競合するロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインとを含む、第2の細胞外認識ポリペプチドをさらに含み、
   任意で、該第2の細胞外認識ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインと該第1の細胞外認識ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインの親和性が、該シグナル伝達ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインと該第1の細胞外認識ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きく、
   任意で、該第2の細胞外認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されない、
   請求項1または2記載の組成物。
4. 前記組成物が、(i）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、(ii）ロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインとを含む、第2の細胞外認識ポリペプチドをさらに含み；
   前記シグナル伝達ポリペプチドが、該第2の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインをさらに含み、
   任意で、該シグナル伝達ポリペプチドの第2のロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインと該第2の細胞外認識ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインの親和性が、該シグナル伝達ポリペプチドの第1のロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインと前記第1の細胞外認識ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱く、
   任意で、該第1および第2の細胞外認識ポリペプチドがそれぞれ第2のロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインを含み；かつ該第2のロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインが相互に特異的に結合する、
   請求項1～3のいずれか一項記載の組成物。
5. 標的リガンドが、病的および／もしくは標的細胞上で見出されるリガンドであるか;または
   シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる細胞外認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、病的および／もしくは標的細胞上で見出されるリガンドであるか;または
   シグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる細胞外認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、病的および／もしくは標的細胞上では見出されるが健康および／もしくは非標的細胞上では見出されないリガンドであり、
   任意で、該病的細胞が、がん性細胞である、
   請求項1～4のいずれか一項記載の組成物。
6. 前記抗体試薬が、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（diabody）、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体からなる群より選択され、
   任意で、前記細胞内TCRシグナル伝達ドメインが、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインである、
   請求項1～5のいずれか一項記載の組成物。
7. 請求項1～6のいずれか一項記載の第2の多成分CARをさらに含み、
   任意で、該第2の多成分CARの抗体試薬が、第1の多成分CARの抗体試薬によって結合される標的リガンドとは異なる標的リガンドに特異的に結合し、
   任意で、該第2の多成分CARの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインが、T細胞活性を阻害し、任意で、T細胞活性を阻害する該第2の多成分CARの細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインが、PD1；CTLA4；BTLA；KIR；LAG-3；TIM-3；A2aR；LAIR-1；およびTGITからなる群より選択されるポリペプチドのシグナル伝達ドメインを含み、
   任意で、該第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる細胞外認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上で見出されるリガンドであるか、または該第2の多成分CARのシグナル伝達ポリペプチドと特異的に結合できる細胞外認識ポリペプチドによって特異的に結合される標的リガンドが、健康および／または非標的細胞上では見出されるが病的および／または標的細胞上では見出されないリガンドである、
   請求項1～6のいずれか一項記載の組成物。
8. 請求項1～7のいずれか一項記載の組成物を発現し、任意で、細胞が、T細胞、NK細胞、またはNKT細胞である、改変細胞。
9. 請求項1～7のいずれか一項記載の組成物または請求項8記載の細胞を含む、標的細胞を殺傷するためのまたは疾患を有する対象を治療するための医薬であって、
   任意で、該疾患が、がん；固形がん；乳がん；肺がん；急性リンパ芽球性白血病；多発性骨髄腫；および難治性多発性骨髄腫からなる群より選択される、
   前記医薬。
10. 多成分キメラ抗原受容体（CAR）シグナル伝達ポリペプチドを含む改変細胞であって、該シグナル伝達ポリペプチドが、(i）細胞外ロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインおよび(ii）細胞内T細胞受容体（TCR）シグナル伝達ドメインを含み、
    任意で、該ロイシンジッパードメインが、BZip（RR）もしくはAZip（EE）であり、
    任意で、該シグナル伝達ポリペプチドが、該細胞の膜上に存在し、
    任意で、該細胞が、T細胞、NK細胞、もしくはNKT細胞であり、
    任意で、該細胞内TCRシグナル伝達ドメインが、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、および41BBからなる群より選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインであり、
    任意で、該シグナル伝達ポリペプチドが、第2の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、
    任意で、該細胞が、第2の多成分CARシグナル伝達ポリペプチドをさらに含む、
    前記改変細胞。
11. 請求項10記載の細胞を含み、
    (i）第1の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、(ii）シグナル伝達ポリペプチドのロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインと特異的に結合できるロイシンジッパータンパク質相互作用ドメインとを含む、第1の細胞外認識ポリペプチドと組み合わせて用いられる、
    疾患を有する対象を処置するための医薬であって、
    任意で、該抗体試薬が、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、デュアル特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、および二重特異性抗体からなる群より選択され；
    任意で、該細胞が、該対象にとって自己由来であり；
    任意で、該細胞が、該対象の細胞に由来しかつ／またはその子孫であり、かつ多成分CARを含むようにエクスビボで改変されており；
    任意で、一方のロイシンジッパードメインがBZip（RR）であり、もう一方のロイシンジッパードメインがAZip（EE）である、
    前記医薬。
12. (1)
    (i）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、(ii）前記第1の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインへの結合について前記シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと競合するタンパク質相互作用ドメインとを含む第2の細胞外認識ポリペプチドと組み合わせて用いられ、
    任意で、該第2の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと該第1の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性が、該シグナル伝達ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと該第1の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも大きく、
    任意で、該第2の細胞外認識ポリペプチドによって認識される標的リガンドが、健康および／もしくは非標的細胞上では見出されるが病的および／もしくは標的細胞上では見出されないか；または
    (2)
    (i）第2の標的リガンドに特異的な抗体試薬と、(ii）タンパク質相互作用ドメインとを含む第2の細胞外認識ポリペプチドと組み合わせて用いられ、
    該シグナル伝達ポリペプチドが、該第2の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインと特異的に結合する第2のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、
    任意で、該シグナル伝達ポリペプチドの第2のタンパク質相互作用ドメインと該第2の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性が、該シグナル伝達ポリペプチドの第1のタンパク質相互作用ドメインと該第1の細胞外認識ポリペプチドのタンパク質相互作用ドメインの親和性よりも弱く、
    任意で、該第1および第2の細胞外認識ポリペプチドが、それぞれ第2のタンパク質相互作用ドメインを含み；かつ該第2のタンパク質相互作用ドメインが、相互に特異的に結合する、
    請求項11記載の医薬。

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