JP7623668B2

JP7623668B2 - 機能性微粒子

Info

Publication number: JP7623668B2
Application number: JP2020134258A
Authority: JP
Inventors: 真人中村; 武俊黒岡; 進太郎岩永
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2025-01-29
Anticipated expiration: 2040-08-07
Also published as: JP2022030324A

Description

特許法第３０条第２項適用１．刊行物令和元年度富山大学大学院理工学教育部修士課程生命工学専攻修士論文発表会要旨集，配布日令和２年２月１３日２．集会名令和元年度富山大学理工学教育部修士課程生命工学専攻修士論文発表会，開催場所富山大学工学部総合教育研究棟１１講義室（富山県富山市五福３１９０）

本発明はアルギン酸ゲルビーズを用いた機能性微粒子に関し、特にインクジェットドライ法にて作製された微粒子に係る。

本発明者らは、これまでもインクジェットドライ法を用いた微粒子の作製に関する研究を進めてきている。
例えば、非特許文献１にアルギン酸ナトリウムとヘモグロビンとを脱水縮合により化学結合させた後に、インクジェットヘッドから打ち出してゲルビーズを作製した例を示す。
この場合に、アルギン酸ナトリウムとヘモグロビンとの縮合反応工程では未反応のヘモグロビンも有することから、この未反応のヘモグロビンを除去する透析処理が必要で、さらにこのアルギン酸ヘモグロビンの保存や試薬化のために凍結乾燥処理などの工程も必要としていた。
そこで本発明は、工程の短縮と収率の向上を目的に研究した結果、本発明に至った。

特許文献１には、エオシン化ゼラチン等の可視光架橋物質，還元糖などのハイドロゲンドナー，ヘモグロビンを親油性液体に添加，分散されている状態で可視光を照射することで、ゲル化粒子よりなる人工赤血球を得る方法を開示する。
しかし、同公報に開示するプロセスは人工赤血球の製造を目的としたものであり、工程も複雑である。

中村真人，他，「印刷技術で生命を守る：印刷技術で拓く未来医療」，ＪＳＴ「富山大学新技術説明会」，２０１７年，１０月３１日（火）

特開２００６－１８２７２１号公報

本発明は、酸素運搬体やドラッグデリバリーシステムの担体等の機能性を有する微粒子及びその製造方法の提供を目的とする。

本発明に係る機能性微粒子は、アルギン酸微粒子に機能性タンパク質又は薬剤が固定されていることを特徴とする。
ここでアルギン酸微粒子とは、アルギン酸ゲルに機能性タンパク質又は薬剤が化学的修飾にて固定化されたものをいい、平均粒子径で１０μｍ以下のものをいう。
赤血球は直径７～８μｍ，厚み約２μｍ程度の円盤状の形状を有しているが、本発明に係るアルギン酸微粒子は、この赤血球サイズレベルのアルギン酸ゲルビーズをいう。

このようなアルギン酸ゲルビーズとすることで、いろいろな機能性を付与することができる。
例えば、機能性タンパク質としてヘモグロビンを修飾固定することで酸素運搬体としての機能を有するようになる。
また、いろいろな機能性タンパク質や薬剤で修飾することでドラッグ，デリバリーシステムの担体として用いることができる。

本発明は、アルギン酸を構成するカルボキシル基と前記機能性タンパク質又は薬剤が化学結合しているのが好ましい。
例えば、前記アルギン酸を構成するカルボキシル基とヘモグロビンに有するアミノ基とを縮合結合させることができる。

アルギン酸は、マンヌロン酸（Ｍ）とグルロン酸（Ｇ）のユニットで構成されており、これらのユニットの割合はＭ／Ｇ比で表される。
ここで、Ｇユニット２０以上からなるＧＧブロックはアルギン酸のゲル化に重要な働きを示し、Ｇユニットのゲル化に使用されなかったカルボキシル基及びＭユニットのカルボキシル基にヘモグロビンのアミノ基が縮合反応により結合される。

本発明に係る機能性微粒子は、アルギン酸微粒子をインクジェットドライ法で作成し、前記にて作成されたアルギン酸微粒子に機能性タンパク質又は薬剤を化学修飾することで製造することができる。

例えば、ヘモグロビンを化学修飾する例で説明すると、以下のとおりである（詳細は後述する）。
インクジェットプリンターに使用されているインクジェットヘッドと、このノズルから吐出される液滴を落下乾燥させるための乾燥塔を配置する。
アルギン酸ナトリウムの水溶液をインクジェットヘッドのノズルから吐出し、乾燥筒を落下しゲル化したアルギン酸ナトリウムゲルビーズを、撹拌保持された塩化カルシウム溶液のディッシュに収集する。
このディッシュから遠心分離等により、アルギン酸ナトリウムゲルビーズを分離回収しＰＢＳに再懸濁する。
この再懸濁液にヘモグロビンを添加し、縮合剤の下にヘモグロビンをアルギン酸ゲルビーズに固定する。

ヘモグロビン（Ｈｂ）は酸素結合能を有する分子量６４５００Ｄａのタンパク質であり、赤血球中の主成分である。
ヘモグロビンは、２種のグロビン（α，β）が各２個集まった四量体タンパク質である。
α鎖は１４１個のアミノ酸、β鎖は１４６個のアミノ酸で構成されている。
このアミノ基を利用して、アルギン酸のカルボキシル基と縮合反応させることができる。
縮合剤としては、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,hydrochloride等のＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）を用いることができる。
また、縮合反応の際にＮＨＳ(N-Hydroxysuccinimide)等のカルボン酸活性化試薬も用いてもよい。

本発明に用いるインクジェットは、インクジェットプリンターに使用されている各種インクジェットヘッドを用いることができる。
その中でもアルギン酸の溶液等に熱負荷がかからないピエゾ素子を用いたピエゾ式インクジェットヘッドが好ましい。

本発明に係る機能性微粒子は、インクジェットプリンターに使用されているインクジェットヘッドを用いてアルギン酸の溶液を吐出させ、これを乾燥筒中に落下させることでアルギン酸のゲルビーズが得られる。
このアルギン酸のゲルビーズにヘモグロビン等の機能性タンパク質や薬剤を固定化することで、いろいろな機能を有する微粒子が得られる。
例えば、機能性タンパク質としてヘモグロビンを選定すると、赤血球サイズレベルのヘモグロビン修飾アルギン酸ゲルビーズが得られ、酸素運搬体として優れた機能を有する。

アルギン酸ナトリウム水溶液の各濃度における微粒子の観察画像を示す。微粒子の粒子径ヒストグラムを示す。微粒子の大きさと溶液濃度の関係を示す。ＯＥＣ曲線の測定結果を示す。

以下、本発明に係る機能性微粒子の製造例を説明するが、本発明はこれに限定されない。

アルギン酸ナトリウムの水溶液を用いて、微粒子（ゲルビーズ）を製作したので以下、説明する。
（１）超純水を溶媒として０．３，０．５，０．８，１．０ｗｔ％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調整した。
（２）ピエゾ式インクジェットヘッドと、これから吐出させた液滴を落下乾燥させるために、内径１２ｃｍ，高さ１００ｃｍのガラス製筒（乾燥塔）を配置し、このガラス製筒の下部にディッシュを設け、超純水を溶媒に用いた２ｗｔ％の塩化カルシウム水溶液を注入した。
（３）インクジェットには、周波数０．８ｋＨｚを用い、アルギン酸ナトリウム水溶液の濃度に対応させて下記の電圧を印加した。
０．３ｗｔ％：２０Ｖ
０．５ｗｔ％：２５Ｖ
０．８ｗｔ％：３０Ｖ
１．０ｗｔ％：３５Ｖ
（４）アルギン酸ナトリウムの水溶液の吐出が終了すると、塩化カルシウム水溶液から遠心分離にて回収及び所定の洗浄を行った後に凍結乾燥させた。

得られた微粒子の観察画像を図１に示し、微粒子径分布を図２のヒストグラムに示す。
また図３に、アルギン酸ナトリウム水溶液の濃度毎の平均粒子径、標準偏差及び濃度（ｗｔ％）と微粒子の体積（μｍ^３）の関係をグラフに示す。

これらの結果から、粒子径３～５μｍのゲルビーズが得られるとともに得られたゲルビーズの平均体積とアルギン酸ナトリウム水溶液の濃度の間には比例関係が認められることから、水溶液の濃度を制御することでゲルビーズの平均粒子径を管理することもできる。

次に、アルギン酸ナトリウムのゲルビーズを用いてヘモグロビンを修飾する例を説明する。
（１）超純水を溶媒として１．０ｗｔ％のアルギン酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを調整し、インクジェットヘッド０．５ｋＨｚ，３５Ｖの条件で吐出及び乾燥塔下部に配置した２ｗｔ％塩化カルシウム水溶液に収集した。
（２）塩化カルシウム水溶液からゲルビーズを遠心分離にて回収し、ｐＨ６．６のＰＢＳ溶液５０ｍｌに再懸濁し、ＷＳＣ：１８．３ｍｇ，ＮＨＳ：５．５ｍｇ添加し、室温で１時間反応させた後に回収し、ＰＢＳに再懸濁し、ブタ由来精製Ｈｂ溶液２ｍｌ添加し、冷暗所で２４時間反応させた。
（３）上記反応終了後に遠心分離にて、ブタ由来ヘモグロビン修飾アルギン酸ナトリウムゲルビーズを回収し、同量の超純水に懸濁保存した。
（４）同時に、ウシ由来精製Ｈｂ溶液を用いた。
ウシ由来ヘモグロビン修飾アルギン酸ナトリウムビーズを回収し、同量の超純水に懸濁保存した。
（５）次に上記にて得られたヘモグロビン修飾アルギン酸ナトリウムゲルビーズが含まれている水溶液１ｍｌにＨＥＭＯＸＳＯＬＵＴＩＯＮ４ｍｌを加え、ＨＥＭＯＸＡＮＡＬＹＺＥＲに充填し、３７℃にてＯＥＣ（酸素解離曲線）を測定した。
その結果を図４のグラフの示す。

図４のグラフには比較のためにブタ由来Ｈｂ溶液と、ウシ由来Ｈｂ溶液のＯＥＣを示す。
ブタＨｂ微粒子（ブタ由来Ｈｂ修飾アルギン酸ゲルビーズ）とウシＨｂ微粒子（ウシ由来Ｈｂ修飾アルギン酸ゲルビーズ）とでは、ＯＥＣ曲線がやや異なるものの、酸素運搬体としての性能を有していることが明らかになった。

Claims

アルギン酸微粒子をインクジェットドライ法で作成し、前記にて作成されたアルギン酸微粒子に機能性タンパク質を化学修飾するものであり、
前記機能性タンパク質は、ヘモグロビンであることを特徴とする機能性微粒子の製造方法。