JP7624440B2 - 最適化された干渉散乱顕微鏡法のための方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、最適化された干渉散乱顕微鏡法（本明細書ではｉＳＣＡＴと呼ぶ）のための方法および装置に関する。

ｉＳＣＡＴは、独自の時空間分解能を持つ単一粒子追跡と、単一分子レベルまでのラベルフリー感度の両方に対する強力なアプローチとして具現化された。
ｉＳＣＡＴは、例えば、Ｋｕｋｕｒａ等の「単一ウイルスの位置および向きの高速ナノスコピック追跡（Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｖｉｒｕｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ ６：９２３－９３５、およびＯｒｔｅｇａ Ａｒｒｏｙｏ等の「干渉散乱顕微鏡法（ｉＳＣＡＴ）：超高速および超高感度光学顕微鏡の新展開（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ｉＳＣＡＴ）：ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２０１２ １４：１５６２５－１５６３６において、開示されている。

かなりの可能性があるにもかかわらず、ｉＳＣＡＴの広範な適用は、特注の顕微鏡、従来とは異なるカメラおよび複雑なサンプル照明の要件によって制限されており、単一分子と同程度の小さな物体の確実かつ正確な検出、画像化および特性評価に対するｉＳＣＡＴの能力が制限されている。

本出願人の以前の特許であるＷＯ２０１８／０１１５９１では、参照光フィールドと散乱光フィールドの相対振幅を改善するように構成された新規のコントラスト増強空間マスクを含む干渉散乱顕微鏡を開示した。そこに記載された顕微鏡は、従来のｉＳＣＡＴ技術と同様の感度を達成することができるが、従来の顕微鏡が空間マスクの簡単な修正および包含によってｉＳＣＡＴを行うように構成され得る程度に、実装の複雑性および費用を劇的に減少させることが可能である。

しかしながら、そのアプローチを用いて達成可能な測定感度に対する多くの限界が、本願の発明者らに明らかになった。
第一に、例えばレーザノイズまたは他の干渉現象に起因する照明のバックグラウンド変動は、それらの変動が検査中のサンプルに関する情報を運ぶ可能性があるため、しばしば除去できない。このようなバックグラウンドシグネチャは、検出感度を制限する。

第二に、検査対象のサンプルを照明できる光の強度は、フルウェル容量および読み出し速度などの検出器特性によって制限される。したがって、照明強度が高い場合、検出器に到達する光量を減らすために強力な空間マスクを使用しなければならず、質量範囲が制限され、装置が外部影響に対してより敏感になる。

第三に、このような顕微鏡では、サンプルの相互作用または事象を同じ瞬間に１回しか測定できないため、単一分子の事象に対して粒子検出アルゴリズムで相関関係を導き出すことができない。

最後に、装置がサンプルの質量検出（質量光度法）に使用されるアプリケーションでは、測定のダイナミックレンジは、空間マスクの選択された強度によって制限される。つまり、高質量または低質量の検出のいずれかに装置を最適化することが必要である。

本発明は、上記の各制限に対処する最適化されたｉＳＣＡＴ技術のための方法および装置を提供する。本明細書に開示される方法は、照明光の一部がサンプルによって散乱された後に、装置の検出側で画像信号を操作することによってこれらの限界にアプローチする。

本発明の一態様によれば、干渉散乱顕微鏡法によってサンプルを画像化する方法が提供される。
この方法は、少なくとも１つのコヒーレント光源でサンプルを照明するステップであって、サンプルは屈折率変化を有する界面を含むサンプル位置に保持され、照明放射でサンプルを照明して、界面で反射した光とサンプルで散乱した光とを含む逆伝播信号をサンプルから発生させる、ステップと、逆伝播信号を第１の信号と第２の信号に分割するステップと、第２の信号が第１の信号と異なるように、修正素子を用いて第２の信号を修正するステップと、第１の信号および第２の信号を第１の検出器および第２の検出器に導き、第１の画像および第２の画像をそれぞれ生成するステップと、プロセッサによって、第１の画像および第２の画像を比較し、サンプルの１つまたは複数の特性を決定するステップと、を含む。

任意選択の空間フィルタは、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、強度の減衰は、所定の開口数内でより大きい。したがって、空間フィルタは、反射された照明光の開口数とサンプル位置のサンプル内の物体から散乱した光の開口数との間のミスマッチを利用して、散乱光よりも照明光の強度を選択的に低減させる。このように、空間フィルタは、これら２つの光源の異なる指向性を利用する。反射された照明光は通常、比較的小さな開口数を持つが、サンプルの表面付近にあるサブ回折サイズの物体は、高い開口数に優先的に光を散乱させる。したがって、低い開口数での空間フィルタによる強度の減衰は、主に照明光に影響し、散乱光には最小限の影響しか及ぼさないため、画像コントラストを最大化することができる。

逆伝播信号を分割することにより、同じ瞬間からサンプルの２つの画像を取得することができるため、連続した画像取得によってもたらされる照明源の不整合などの時間依存的な強度変動なしにサンプルを調べることができるなど、多くの利点がある。

また、２つに分割された信号の一方を検出器に到達する前に独立して修正することで、質量光度法実験でのサンプルの質量など、サンプルの特性を調べることもできる。これは、バックグラウンドノイズシグネチャを除去し、測定感度を向上させるためにも行うことができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコヒーレント光源は、第１のレーザおよび第２のレーザを含み、これらのビームは、サンプルの照明の前に結合される。複数の光源を設けると、サンプルの光子束が大きくなるため、反射信号を２つの信号にビーム分割することがより実用的になり、それぞれの信号がサンプルの画像を独立して形成するのに十分な情報を含んでいる。

いくつかの実施形態では、信号を分割するステップは、逆伝播信号を、直交する偏光を有する２つの信号に分割するステップを含む。画像チャネルを２つの直交する偏光に分離することにより、サンプルの複屈折特性を調べることができる。

いくつかの実施形態では、信号を分割するステップは、逆伝播信号を、異なる光パワーを有する２つの信号に分割するステップを含む。画像チャネルを異なる光パワーを有する２つの信号に分離することにより、参照ビームとサンプルからの散乱光との間の異なるバランスを達成することができる。

いくつかの実施形態では、第１の信号および第２の信号の少なくとも一方を空間フィルタに通すステップは、第１の信号を第１の空間フィルタに通すステップを含み、第２の信号が第１の信号と異なるように第２の信号を修正するステップは、第２の信号を第２の空間フィルタに通すステップを含み、第１の空間フィルタおよび第２の空間フィルタはそれぞれ、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、強度の減衰は、所定の開口数内でより大きく、第１の信号は、第２の信号より大きな光パワーを有し、第２の空間フィルタは、第１の空間フィルタより大きな強度減衰を入射放射に及ぼす。第１の空間フィルタおよび第２の空間フィルタは、それぞれ、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成されてもよく、強度の減衰は、所定の開口数内でより大きくなる。第１の信号は、第２の信号よりも大きな光パワーを有していてもよく、第２の空間フィルタは、第１の空間フィルタより大きな強度減衰を入射放射に及ぼしてもよい。

従来のセットアップでは、単一の「キャッチオール」空間フィルタの使用により、測定のダイナミックレンジが制限され、装置を高質量用または低質量用に最適化することを余儀なくされた。高強度のマスクは低分子量の粒子の画像キャプチャを最適化するが、高分子量の粒子に対しては弱いマスク、あるいはマスクなしで十分である。反射信号を異なる強度（例えば９０：１０）の２つの信号に分割し、各信号に適切な強度（例えば０．１％と１％）の空間フィルタを適用すると、低質量に最適化された１つの分割アームと高質量に最適化された別の分割アームによって、より幅広い質量スペクトルを調べることができる。

いくつかの実施形態では、第１の信号および第２の信号を第１の検出器および第２の検出器に向けるステップは、第１の信号に対する第２の信号の位相を調整するステップを含む。第１の信号に対する第２の信号の位相を調整するステップは、第２の信号を位相シフトマスクに通すステップ、および／または第２の信号の光路に沿った適切な位置で第２の信号を結像レンズに通すステップを含み得る。第２の信号は、第１の信号に対して、照明放射の波長の半分だけ調整されてもよい。

サンプル照明のいくつかの変動（例えば、システムの反射率変化、バッファ寄与、二次反射、レーザノイズおよび他の干渉現象）は、従来のセットアップでは除去することができなかった。このようなバックグラウンドシグネチャは、変動がノイズなのか、それともサンプルからの散乱光によるものなのかが分からないため、セットアップからノイズを除去する能力を制限する。

第１の信号または第２の信号の位相を独立して調整し、同時に生成された２つの（請求項１に関連して規定されるように有利な）画像を比較することによって、２つの画像において相関のない変動を強調し、画像平面から生じていないものとして分類することが可能である。

そうすることで、単一分子イベントの画像を相関させるための第２の測定結果が得られるが、従来のセットアップでは、時間内の瞬間ごとに単一の測定値を用いてのみ処理することができたため、相関を導き出すことが困難であるか、または不可能であったことを意味する。

いくつかの実施形態では、第２の信号を修正するステップは、第２の信号を、第２の検出器の画素グリッドのｘ次元に対応する第１の次元に沿って第２の信号に非対称な拡大を適用するように構成された光学素子に通すステップを含む。いくつかの実施形態では、第１の信号は、第２の次元に沿って第１の信号に非対称な拡大を適用するように構成された光学素子に通されてもよく、第２の方向は、第１の方向と直交し、第２の検出器の画素グリッドのｙ次元に対応する。

従来のセットアップで使用できる光量は、デジタルカメラの読み出しによって制限され、より強い空間フィルタを使用する必要があり、その結果、振動に対する感度が高まり、質量光度法において記録される質量分布の幅が広がっていた。信号を２つに分割し、それぞれの信号に対してｘとｙの各次元で１次元の拡大処理を行うことで、カメラは同じ数の光子を同じかより多くの画素で受け取ることができ、さらに重要なことは、読み出し速度を最適化する方法で配置できることである。これは、デジタルカメラの読み出し速度を上げることなく、検出された光子のより高い束を処理する能力に等しい。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコヒーレント光源は、少なくとも２つの異なる検査波長を有する照明光を提供するように構成され、信号を分割するステップは、第１の検査波長を有する光が第１の検出器に向けられ、第２の検査波長を有する光が第２の検出器に向けられるように、波長によって信号を分割するステップを含む。

同じサンプルを２つの異なるプロービング波長で測定することにより、光学システムの不完全な構成要素によって引き起こされる測定変化、または（例えば、散乱に影響を与える蛍光タグまたはサンプルに加えられた別の色素による、またはサンプルキャリア上のコーティング上のある波長の吸収による）サンプルがある波長で吸収するが別の波長で吸収しないことに起因する測定変化を特定することができる。

いくつかの実施形態では、所定の開口数は、逆伝播信号においてサンプル位置から反射される照明光の開口数と同一または類似する。これにより、空間フィルタによって提供される画像コントラスト効果が最大化される。

いくつかの実施形態では、第２の信号を修正するステップは、位相シフト、第１の方向における拡大、または第１の信号に適用される空間フィルタリングよりも大きな強度での空間フィルタリング、を含む。

本発明の別の態様によれば、任意の先行する請求項の方法を実施するように構成された干渉散乱顕微鏡が提供される。この顕微鏡は、反射面を含むサンプル位置と、サンプル位置を照明するように構成された少なくとも１つのコヒーレント光源と、第１の検出器および第２の検出器と、サンプル位置からの逆伝播信号を第１の信号および第２の信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、第２の信号が第１の信号と異なるように第２の信号を修正するように構成された修正素子と、を含み、システムは、第１の信号および第２の信号を第１の検出器および第２の検出器にそれぞれ向けるように構成される。

いくつかの実施形態では、干渉散乱顕微鏡は、第１の信号および第２の信号の少なくとも一方をフィルタリングするように配置された少なくとも１つの空間フィルタをさらに含み、空間フィルタは、所定の開口数内でより大きい入射放射の強度の減衰をもたらすように構成される。

本発明は、１０^－１５ｍ^２以下の照明光に対する散乱断面積を有する物体を含むサンプルに有利に適用され得る。典型的には、そのような物体は、１０^－２６ｍ^２以上、すなわち１０^－１５ｍ^２から１０^－２６ｍ^２までの範囲内の照明光に関する散乱断面積を有することもできる。研究され得る物体の例としては、タンパク質またはその小さな凝集体、ならびに金属、有機または無機のナノ粒子が挙げられる。

非常に弱い散乱体である物体を画像化するために、空間フィルタは、所定の開口数内で強度が入射強度の１０^－２以下に減衰した出力光を通過させるように配置される。典型的には、空間フィルタは、例えば入射強度の１０^－２から１０^－４の範囲において、所定の開口数内で強度を入射強度の１０^－４以上に減衰させた出力光を通過させるように配置されてもよい。

以下、より良い理解を得るために、本発明の実施形態は、次に、添付の図面を参照して、非限定的な例として説明される。

従来技術のｉＳＣＡＴ顕微鏡の概略図である。 従来技術のｉＳＣＡＴ顕微鏡の改良版の概略図である。 本発明によるｉＳＣＡＴ顕微鏡の例示的な実施形態を示す図である。 本発明によるｉＳＣＡＴ顕微鏡の例示的な実施形態を示す図である。 本発明によるｉＳＣＡＴ顕微鏡の例示的な実施形態を示す図である。 本発明によるｉＳＣＡＴ顕微鏡の例示的な実施形態を示す図である。 本発明による方法および装置を使用して得られた実験結果を示す図である。 本発明による方法および装置を使用して得られた実験結果を示す図である。 本発明による方法および装置を使用して得られた実験結果を示す図である。

本明細書に記載のシステムおよび方法において、使用される光は、紫外線（本明細書において、１０ｎｍ～３８０ｎｍの範囲の波長を有すると定義され得る）、可視光（本明細書において、３８０ｎｍ～７４０ｎｍの範囲の波長を有すると定義され得る）、または赤外線（本明細書において、７４０ｎｍ～３００μｍの範囲の波長を有すると定義され得る）であり得る。光は、波長の混合物であってもよい。本明細書において、「光学の」および「光学」という用語は、方法が適用される光に一般的に言及するために使用される。

図１および図２は、本発明の装置および方法と共通する多くの構造的特徴および機能性を有する、ＷＯ２０１８／０１１５９１に開示されたｉＳＣＡＴ顕微鏡の構成を示す図である。

ＷＯ２０１８／０１１５９１の開示は、参照により本明細書に組み込まれるが、完全を期すために、以下の説明では、ＷＯ２０１８／０１１５９１のものと共通し、図１および図２に示される本発明のｉＳＣＡＴ顕微鏡の構成および機能性を示し、次に、本開示によってもたらされる上記構成の種々の改良を述べ、その実施形態例を提供する。

したがって、図１を参照すると、顕微鏡１は、サンプル３をサンプル位置に保持するためのサンプルホルダ２を含む。サンプル３は、以下により詳細に説明する撮像対象物を含む液体サンプルであってもよい。サンプルホルダ２は、サンプル３を保持するのに適した任意の形態をとることができる。典型的には、サンプルホルダ２は、サンプルホルダ２とサンプル３との間の界面を形成する表面上にサンプル３を保持する。例えば、サンプルホルダ２は、カバースリップであってもよく、および／またはガラスから作られてもよい。サンプル３は、例えばマイクロピペットを用いて、簡単な方法でサンプルホルダ２上に提供されてもよい。

顕微鏡１は、さらに、照明源４と検出器５とを備える。照明源４は、照明光を提供するように配置される。照明光は、コヒーレント光であってもよい。例えば、照明源４は、レーザであってもよい。照明光の波長は、サンプル３の性質および／または検査される性質に依存して選択され得る。一例では、照明光は、４０５ｎｍの波長を有する。

任意選択で、照明光は、例えばＫｕｋｕｒａ等の「単一ウイルスの位置および向きの高速ナノスコピック追跡（Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｖｉｒｕｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ ６：９２３－９３５に詳述されているように、照明およびレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するために空間的に変調されてもよい。

検出器５は、サンプル位置からの反射で出力光を受光する。検出器に到達する照明光は、サンプルの表面、典型的にはサンプルとサンプルホルダの間の界面から主に反射され、それによってその表面に近いサンプル中の物体との干渉がもたらされる。

ガラスと水の界面が使用される例では、比較的少量（典型的にはわずか０．５％）の照明光が反射されるが、界面にあるナノスコピックの物体で散乱した光は、照明光の方向へ戻ってくる量が非常に多い（典型的には９０％を超える）。これにより、散乱光と反射光の比が透過型の幾何学的形状に比べて本質的に１０００倍超向上し、干渉計のコントラストが大きくなる。その結果、特定の散乱体、照明強度、および露光時間が与えられた場合に、同じ公称Ｓ／Ｎを達成するために検出する必要がある光子の数は、透過型セットアップの場合よりも３桁少なくなる。

典型的には、顕微鏡１は、広視野モードで動作してもよく、この場合、検出器５は、サンプル３の画像を捕捉する画像センサであってもよい。顕微鏡１は、代替的に共焦点モードで動作してもよく、この場合、検出器５は、イメージセンサであってもよく、またはフォトダイオードのような点状検出器であってもよく、この場合、走査配置が、画像を構築するためにサンプル３の領域を走査するために使用されてもよい。検出器５として採用され得るイメージセンサの例としては、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサまたはＣＣＤ（電荷結合素子）などが挙げられる。

顕微鏡１は、サンプルホルダ２と照明源４と検出器５との間に配置された光学系１０をさらに備える。光学系１０は、サンプル３を照明するために照明光をサンプル位置に照射し、サンプル位置からの反射で出力光を集め、出力光を検出器５に導くように、以下のように配置されている。

光学系１０は、サンプルホルダ２の前方に配置されたレンズ系である対物レンズ１１を含む。また、光学系１０は、集光レンズ１２と、チューブレンズ１３とを含む。集光レンズ１２は、光源１１（図１に連続線で示す）からの照明光を、対物レンズ１１を通してサンプル位置のサンプル３に集光する。

対物レンズ１１は、（ａ）サンプル位置からの反射した照明光（図１に連続線で示す）と、（ｂ）サンプル位置のサンプル３からの散乱光（図１に点線で示す）の双方を含む出力光を集光する。反射光は、サンプルホルダ２とサンプル３との界面からの反射が主である。

典型的には、これは比較的弱い反射、例えばガラス－水反射である。例えば、反射照明光の強度は、入射した照明光の強度の０．５％程度であり得る。この散乱光は、サンプル３内の物体によって散乱する。サンプルの表面または表面に近い物体からの散乱光は、反射光と建設的に干渉するので、検出器５によって捕捉された画像において視認可能である。

図１に示すように、反射照明光と散乱光は、異なる指向性を有する。特に、反射照明光は、光源４および光学系６によって出力された光ビームの幾何学的形状に起因する開口数を有する。散乱光は、大きな範囲の角度で散乱するため、反射照明光よりも大きな開口数を満たす。チューブレンズ１３は、対物レンズ１１からの出力光を検出器５上に集光する。

光学系１０は、光源４からの照明光と検出器５に向けられた出力光との光路を分割するように配置されたビームスプリッタ１４も含む。ビームスプリッタ１４は、そこに入射する光の部分反射と部分透過を提供する従来の構造を有し得る。

本開示の実施例では、光源４は、光源４からの照明光がビームスプリッタ１４によって対物レンズ１１に反射されるように対物レンズ１１の光路からオフセットされ、逆に検出器５は、サンプル位置からの出力光がビームスプリッタ１４を介して検出器５に向かって透過するように対物レンズ１１の光路に整合される。

従来の構造であってよい上述の構成要素に加えて、顕微鏡１は、空間マスクまたはフィルタ２０を含む。図１の例では、空間フィルタ２０は、ビームスプリッタ１４上に形成され、これにより対物レンズ１１のバックアパーチャの後方に、したがって対物レンズ１１のバックフォーカルプレーン１５の直後方に配置されるが、空間フィルタ２０は、以下に述べるような同じ効果を達成するために、ｉＳＣＡＴ顕微鏡の光路に沿って他のポイントに配置されてもよい。

空間フィルタ２０は、サンプルホルダインターフェースから検出器５へ通過する逆伝播出力光をフィルタリングするように配置される。検出器５が対物レンズ１１の光路と整列している本開示の実施例では、空間フィルタ２０は、したがって、透過性である。

空間フィルタ２０は、部分的に透過性であるため、反射した照明光を含む出力光を通過させるが、強度が低下する。また、空間フィルタ２０は、光軸と整合しており、所定の開口を有するので、所定の開口数内で強度の低減を提供する。ここで、開口数は、出力光が由来するサンプル位置に対する角度の範囲を特徴付ける無次元量であるとして、その通常の態様で定義される。

具体的には、開口数ＮＡは、以下の式で定義することができる。ＮＡ＝ｎ・ｓｉｎ（θ）、ここでθは収集の半角、ｎは出力光が通過する材料（例えば、光学系１０の構成要素の材料）の屈折率である。

空間フィルタ２０は、任意の適切な方法で形成されてもよく、典型的には、堆積材料の層を含む。材料は、例えば、銀のような金属であってもよい。いくつかの実施形態では、空間フィルタは、１つまたは複数の誘電体コーティングを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、空間フィルタは、所定の角度範囲内で入射放射に対して部分的に反射するように形成されてもよい。蒸着は、任意の適切な技術を用いて行われてもよい。

界面付近のサブ回折の大きさの物体は、反射照明光よりも大きな開口数に優先的に光を散乱させるので、空間フィルタ２０によって与えられる強度の低減は、散乱光よりも反射照明光の検出強度を優先的に低減させる。したがって、低開口数における空間フィルタ２０による強度の低減は、反射照明光に主に影響を与え、散乱光には最小限の影響を与えるので、キャプチャ画像におけるコントラストを最大化することができる。撮像コントラストが向上することで、弱い散乱体である物体を高コントラストで検出することが可能となる。

コントラストの向上は、以下のように理解することができる。空間フィルタ２０が所定の開口数の出力光の一部を通過させる（すなわち、この例では部分的に透過性である）ので、照明光および散乱光フィールドのフラクションは検出器に到達し、十分にコヒーレントな照明源について干渉する。そして、検出器に到達する光強度Ｉｄｅｔは、次式で与えられる。

Ｉｄｅｔ＝│Ｅ_ｉｎｃ│^２｛ｒ^２ｔ^２＋│ｓ│^２＋２ｒｔ│ｓ│ｃｏｓΦ｝
ここで、Ｅ_ｉｎｃは入射光フィールド、ｒ^２は界面の反射率、ｔ^２は空間フィルタ２０の透過率、ｓは物体の散乱振幅、Φは透過した照明光と散乱光との位相差である。

空間フィルタ２０によって提供される追加のフィルタリングは、標準的なｉＳＣＡＴのようにガラス－水界面の反射率によって固定されるのではなく、空間フィルタ２０の透過率ｔ^２の選択によって、参照フィールドの振幅を直接調整することを可能にする。空間フィルタ２０が堆積材料の層である場合、透過率ｔ^２は、層の材料および／または厚さの選択によって選択され得る。このような調整は、例えば、関心のある散乱体、カメラのフルウェル容量、および倍率に応じて行うことができる。

明視野照明は、通常対物レンズに由来する最も強い不要な後方反射が検出器５から遠ざかるようにし、撮像バックグラウンドを最小化し、照明光ビームの複雑な走査なしに広い視野を可能にする。

比較的弱い散乱体である物体を撮像するために、空間フィルタ２０は、所定の開口数内で、入射強度（この文脈では、空間フィルタ２０に入射する出力光の強度）の１０^－２から１０^－４の範囲内の強度まで低減した反射照明光を通過させるように配置されてもよい。

例えば、５０００ｋＤａ以下の質量を有する物体を含むサンプルを撮像することができる。典型的には、開示された技術は、１０ｋＤａ以上の質量を有する物体、例えば１０ｋＤａ～５０００ｋＤａの範囲内の質量を有する物体、および／または１０^－１２ｍ^２以下、より好ましくは１０^－１７ｍ^２以下の照明光に関する散乱断面積を有する物体を含むサンプルに適用されてもよい。典型的には、そのような物体は、例えば、１０^－１７ｍ^２～１０^－２６ｍ^２の範囲内の、照明光に関する散乱断面積を有することもできる。本開示の技術を適用して画像化することができる物体の例には、タンパク質またはその小さな凝集体、またはそれらの結合パートナーが含まれる。

より強い散乱体を同時に画像化するために、第２のフィルタの透過率は、所望の検出範囲に応じて、１～１０^－２の間の任意の範囲に設定され得る。
図２を参照すると、顕微鏡１の第２の例の構成が図示されている。図２の構成は、ＷＯ２０１８／０１１５９１にも開示されており、同様に、本発明の技術の適用により最適化するのに適している。

図２の構成は、空間フィルタ２０を、対物レンズ１１の後方開口の後方に位置させるのではなく、対物レンズ１１の後方焦点面の共役焦点面２１に位置させる。対物レンズ１１の後方焦点面１５の共役焦点面２１は、チューブレンズ１３の後方に配置された一対のテレスコープレンズ２２、２３の間に形成される。

光源４の後に音響光学デフレクタ３２が配置され、照明光の走査を行う。音響光学デフレクタ３２は、画像を構築するためにサンプル３の領域を走査するように、および／または、上述のように照明およびレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するために空間変調を提供するように、動作させることができる。

集光レンズ１２は、音響光学デフレクタ３２におけるビーム経路のあらゆる修正を結像対物レンズの後方焦点面に結像させる機能を果たす一対のテレセントリックレンズ３０および３１に置き換えられる。

光源４と検出器５の位置は、光源４からの照明光がビームスプリッタ１４を通って対物レンズ１１に透過し、逆にサンプル位置からの出力光がビームスプリッタ１４によって検出器５に向かって反射されるように、図１の構成に対して逆になっている。

ビームスプリッタ１４は偏光ビームスプリッタであり、ビームスプリッタ１４とサンプル３との間には１／４波長板３３が配置されており、ビームスプリッタ１４が光を分岐するようになっている。また、ビームスプリッタ１４で反射された出射光を偏向させるためにミラー３４が配置されている。

ここで、図３～５を参照すると、以下の説明は、ｉＳＣＡＴ顕微鏡１の上述した構成に対して本発明によって提供される様々な改良点に焦点を当てている。
空間フィルタ２０の使用は、所定の物体、入射光強度、および露光時間に対して達成可能な感度限界またはＳＮＲ（信号対雑音比）を根本的に変更しないが、照明光の一部が物体によって散乱した後に装置の検出側で逆伝播信号を操作することによって、感度を向上させることが可能である。

図３～５に示す構成例では、逆伝搬信号は、逆伝搬信号を第１および第２の信号に分割するように構成された第２のビームスプリッタ３６に通すことによって操作され、この信号は、その後、それぞれ、第１および第２の検出器５および６に向けられる。このようにして、２つの別々の画像信号が、同じ瞬間の所定の物体について捕捉され、別々の画像チャネルを通じて処理され得る。これにより、照明源からの時間依存の強度変動または光学系１０の変更を導入することなく、サンプルによって散乱された光を画像比較によって調査することができる。

さらに、ビームスプリッタ３６からの２つの分割信号の少なくとも一方を、検出器に到達する前に独立して修正することにより、サンプルの追加の特性を調べることができ、測定の感度を高めることができる。例えば、バックグラウンドノイズのシグネチャを照明から除去することができ、第１および第２の信号を互いに相対的に調整し、以下に説明するように組み合わせて、サンプルに関するより多くの情報を提供することができる。

ビームスプリッタ３６は、サンプル／逆伝播信号のどの特性が調査中であるかに依存する方法で逆伝播信号を分割するように構成される。
例えば、光パワーによって信号を分割することが望ましいいくつかの実施形態では、ビームスプリッタ３６は、光路に対して４５°で配置された、金属または誘電体であり得る膜を備えるプレートを含んでいてもよい。あるいは、ビームスプリッタ３６は、プリズム間の界面に部分的に反射する膜を有するマッチドペアのプリズムによって形成された立方体ビームスプリッタであってもよい。

いくつかの実施形態では、ビームスプリッタ３６は、ビームスプリッタ３６とサンプル３との間の１／４波長板と組み合わせて用いられる偏光ビームスプリッタであり、逆伝播信号を直交する偏光第１の信号および第２の信号に分割するよう構成される。このような構成により、検出器５および６によるサンプルの複屈折特性の分析が可能となる。

いくつかの実施形態では、照明光は、サンプルを照明するための少なくとも２つの異なる検査波長を含み、ビームスプリッタ３６は、第１の検査波長を有する光が第１の検出器５に向けられ、第２の検査波長を有する光が第２の検出器６に向けられるように、波長によって逆伝搬信号を分割するよう構成される。

同じサンプルを２つの異なるプロービング波長で測定することにより、光学系内の波長依存性成分による強度変化を特定することができる。このような構成は、例えば、蛍光タグ、または散乱に影響を与えるような別の色素をサンプルに加えた場合、あるいはサンプル担体上のコーティングに一方の波長が吸収されることによって、サンプルが一方の波長で光を吸収し他方の波長では吸収しないことによって生じる強度変化も特定することができる。

本明細書に記載された最適化の方法は相補的なものであり、別々に使用してもよく、互いに組み合わせて使用してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ビームスプリッタ３６は、逆伝播信号が３つ以上の信号に分割されるように、それぞれが異なる方法または同じ方法で信号を分割するように構成された複数のビームスプリッタを含み、それらの各々はその後別々の検出器に向けられてもよい。

図３ａを参照すると、図１の光学構成に基づく顕微鏡１の最適化された構成例が図示されている。
図１の光学構成に加えて、図３ａの構成は、第２の検出器６と、チューブレンズ１３と検出器５および６との間の逆伝播信号の光路に沿って配置され、逆伝播信号を第１および第２の信号に分割するように構成された第２のビームスプリッタ３６と、を含む。

図示の例では、第１の信号は検出器５に直接通過し、一方、第２の信号は、第２の検出器６に衝突する前に、反射素子３８を介して信号修正素子４０を経由して導かれる。信号修正素子４０は、所望される画像信号の最適化のタイプに応じて選択される。

一例の最適化アプローチでは、ビームスプリッタ３６は、逆伝播信号を、等しい光パワーを有する第１および第２の信号に分割し、修正素子４０は、照明光の位相に影響を与えずに第２の信号においてサンプル位置に保持された物体によって散乱された光をπ／２だけ位相シフトするように構成されるリターディングマスクを含む。そうすることで、第２の信号におけるサンプルの画像が反転し、本来ならば建設的に干渉するはずの散乱光が破壊的に干渉するようになる。

第１の信号の散乱光は位相がずれていないため、従来のｉＳＣＡＴと同様に散乱光は建設的に干渉する。したがって、検出器５と６で取得した画像を比較すると、サンプルからの散乱に起因する画像の強度変動が相関し、２つの画像間で相関しない強度変動は、例えば、照明光の不完全性などのバックグラウンドシグネチャに起因することを特定することができる。

分割された信号における散乱光の独立した「位相調整」によって得られるｉＳＣＡＴ画像におけるそのようなバックグラウンドシグネチャの識別は、シグネチャを除去することを可能にし、したがって、顕微鏡１の感度を改善することができる。

代替例では、信号修正素子４０が結像レンズを含み、上記結像レンズを第２のビームスプリッタ３６と第２の検出器６との間の第２の分割信号の光路に沿って適切なポイントに移動させることによって、散乱光の位相が代わりに反転される。このような構成により、位相シフトマスクによって提供されるのと同様の散乱光の位相に対する「調整」効果を得ることができる。これは、照明源４からの照明光の非集束性と、サブ回折限界サイズのサンプル３によって散乱した光の高集束性とに起因する。この効果は、以下に説明するように理解することができる。

平行光束を完全なレンズ／集光素子によって空間の一点に集光した場合、集光素子の焦点距離に等しい距離で焦点の反対側で測定した光束の位相は、πの位相シフトを生じる。ちょうど集光点では、位相シフトはπ／２となる。この位相シフトはガイ位相シフトと呼ばれ、焦点からの距離に対してほぼ直線的な依存性を持っている。

実際には、空間内の一点にビームを集光できる集光素子はなく、ある光ビームの距離依存性に対する位相変化の強さは、そのビームがどれだけよく集光されているかに基づく。照明源４からの照明光のような弱い集光は、ガイ位相シフトの影響をほとんど受けない。これに対し、本開示のｉＳＣＡＴ顕微鏡で検査するような単一分子または非常に小さなサンプルは、照明光の回折限界未満のサイズを有するため、ほぼ完全な集光素子として機能する。そのため、逆伝播信号の散乱光は、その光路に沿って高いガイ位相依存性を有するが、照明光はそうではない。

ｉＳＣＡＴ顕微鏡の場合、散乱光と反射照明光の両方が、ビームスプリッタ３６を通過して検出器５および６に結像する前に、サンプル位置界面／カバースリップでの屈折率変化により追加の位相変化を受ける。この光学セットアップでは、この例では修正素子４０である結像レンズの位置を変えることにより、弱く集光された照明光に影響を与えずに散乱光のガイ位相シフトの調整を行い、焦点からの距離の変化をエミュレートすることができる。

したがって、照明光の位相を変えることなく散乱光の位相を変えることができ、位相シフトマスクに関連して説明したように、検出器６で受信したサンプルの画像を反転させることができる。

図３ａは、２つのレーザ４ａ、４ｂがあり、それらがビームスプリッタ４ｃを介して組み合わされ、より強力な照明ビームを形成する配置を描いている。
この実施形態は、図１の構成の最適化として図示され、説明されているが、図２の構成の最適化として実施することも可能である。

図３ｂは、空間フィルタ２０がないことを除いて、図３ａの代替的な配置を示す図である。ビームは依然として分割されており、第２の分割信号の経路に修正素子４０が配置されている。修正素子は、装置の感度を上げるために、第２の分割信号を拡大、位相シフト、または空間的にフィルタリングするものであってもよい。

図４を参照すると、図２の光学構成に基づく顕微鏡１の最適化された構成例が示されている。
図２の光学構成要素に加えて、図４の構成は、第２の検出器６と、チューブレンズ１３と検出器５および６との間の逆伝播信号の光路に沿って配置され、逆伝播信号を第１および第２の信号に分割するように構成された第２のビームスプリッタ３６と、を含む。この構成において、１つまたは複数の空間フィルタ２０は、ビームスプリッタ３６と検出器５、６との間に配置される。

図示の例では、ビームスプリッタ３６は、逆伝播信号を、異なる光パワーを有する第１および第２の信号に非対称に分割する。第１の信号は、第１の空間フィルタ２０を通過して検出器５に到達し、第２の信号は、第２の検出器６に衝突する前に、反射素子３８を介して、第１の空間フィルタとは異なる強度を有する第２の空間フィルタである信号修正素子４０を通過して導かれる。

ｉＳＣＡＴ顕微鏡を使用して、サンプル位置に保持されたサブ回折限界の物体の質量を測定する質量光度法実験では、弱い散乱体は、照明においてより高い光パワーを必要とし、したがって、強い散乱体よりも空間フィルタ２０によって減衰される照明光の量が多いため、画像信号品質は、通常、所定の質量範囲に対して最適化される必要がある。

逆伝播信号を非対称に分割し、第１および第２の信号を上記のように異なる強度を有する空間フィルタに通すことにより、照明光（参照ビーム）と画像平面内のサンプルからの散乱光（画像信号）との間のバランスが異なる第１および第２の信号をそれぞれ生成することができる。したがって、第１および第２の画像は、高質量物体測定または低質量物体測定のいずれかに最適化された検出器５および６のそれぞれによって取得されることが可能である。これにより、顕微鏡１で測定可能な動的質量範囲が拡大する。

例えば、ビームスプリッタ３６は、第１の信号が第２の信号よりも大きな光パワーを有するように構成されてもよく、この場合、第２の空間フィルタは、第１の空間フィルタよりも大きな強度減衰を入射放射に適用する。第１の信号と第２の信号との間の光パワーの比は、例えば、９０：１０であってよく、この場合、適切な強度の空間フィルタ、例えば、それぞれ０．１％および１％に減衰する空間フィルタが使用されることになる。この比率は、いずれかの方向の所望の検出範囲に応じて調整することができ、例えば、それぞれ０．０１および１０％に減衰する９９：１である。理想的には、光パワー比と減衰の組み合わせは、常に両方の画像化チャネルで同じ光強度を維持するように選択される。

図４は、照明ビームの経路にある任意選択の音響光学デフレクタ（ＡＯＤ）２７を描いている。音響光学デフレクタは、照明光の走査を提供するために光源の後に配置される。音響光学デフレクタ２７は、画像を構築するためにサンプル３の領域を走査するように、および／または、上述のように照明およびレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するために空間変調を提供するように動作させることができる。

この実施形態は、図２の構成に基づく構成を参照して説明されているが、この最適化の方法は、図１の構成に基づいて等しく実施され得ることを認識されたい。
図５を参照すると、図１の光学的構成に基づく別の例示的な実施形態が図示されている。

従来のセットアップで使用できる光量は、デジタルカメラの読み出しによって制限され、より強い空間フィルタ２０を使用する必要があり、その結果、振動に対する感度が高まり、質量光度法において記録される質量分布の幅が広がっていた。

図３の構成と同様に、図５は、第２の検出器６と、チューブレンズ１３と検出器５および６との間の逆伝播信号の光路に沿って配置され、逆伝播信号を第１および第２の信号に分割するように構成された第２のビームスプリッタ３６と、を含む。

しかしながら、この実施形態では、第１の信号は、検出器５に直接通過する代わりに、第１の信号を第１の軸に沿って拡大するように構成された第１の拡大要素４２を通過する。

図５の実施形態では、第２の信号は、反射素子３８を介して、信号変更素子（この場合、第１の軸に垂直な軸に沿って第２の信号を拡大するように構成された第２の拡大素子４３である）を通して導かれる。

検出器５と６もまた、互いに異なる向きに配置されている。従来のピクセルベースの検出器は、ピクセル励起がグリッド上で列ごとに処理されるという事実のために、他よりも高速である一方の電子読み出し方向を有する傾向がある。したがって、検出器５および６は、カメラ読み出し電子機器がピクセル励起を最も速く処理することができる方向が、検出器５については第１の軸と、検出器６については第２の軸と整列するように、配向される。

上述した構成を用いると、検出された光子のデジタルカメラ読み出し動作へのマッチングを改善することにより、高価な特殊な検出器を用いることなく、サンプルから散乱した光子が処理される速度を向上させることが可能である。例えば、検出器５は、第１の拡大素子４２が第１の信号からの光子束を拡大した１つのＸ軸方向の列に沿ってのみ読み出し、検出器６は、第２の拡大素子４３が第２の信号からの光子束を拡大した１つのＹ軸方向の列に沿ってのみ読み出しを行ってもよい。

その後、検出器５および６の画素を互いにマッピングして、検出器５および６から取得した画像を一緒にブレンドすることができるように、両方のカメラにＸ－Ｙ位置を適切に割り当てることが可能である。場合によっては、ブレンドされた画像の歪みを補正する必要がある。しかし、全体としては、上記の方法により、従来の検出器で、画質をほとんど落とすことなく、第１および第２の拡大素子による拡大率に比例した数だけ画像を取り込む速度を増加させることができる。

このように、記載された実施形態は、上述したＩ_ｄｅｔの式から分かるように、検出された光子の総数を犠牲にして取得された画像における散乱コントラストを高める空間フィルタ２０による第１および第２の信号における光子の総数の減少を補償する。

本実施形態は、図１の構成の最適化として図示され、説明されているが、図２の構成の最適化として実施することも可能である。
さらに、実施形態のいくつかの実装（図示せず）では、第１の信号のみが拡大要素に通され、一方、第２の画像チャネルは通常の空間分布で見ることができる。このような構成において、第２の信号は、拡大素子の代わりに、別のマスクまたは一般的な強度フィルタに通されてもよい。このような実装では、第２のチャネルは完全な空間分解能を維持し、ローカライズに使用することができる。

図３～図５に関連して上述した最適化の各方法は、互いに組み合わせて用いてもよいし、独立して用いてもよい。
さらに、逆伝播信号は、より低い光子束を有するビームスプリッタ３６によって第１および第２の信号に分割されるので、説明した最適化の各方法は、より高強度の照明源４の提供によって促進されてもよい。いくつかの実施形態では、より高い強度の照明源４は、図３に例示されるように、第１および第２のレーザのビームを結合することによって提供される。

図６Ａを参照すると、１つのチップを使用した２チャネル質量光度法レシオメトリ画像である例示的な実験結果は、上述した図５のｉＳＣＡＴ顕微鏡と同様であるが拡大要素は備えていないビーム分割構成を使用して同じ時点で得られた同じサンプル混合物の２つの画像を示している。

図６Ｂを参照すると、分割ビームの１つを単一次元に沿って引き伸ばすように構成された拡大要素を含む図５のｉＳＣＡＴ顕微鏡と同様の別のｉＳＣＡＴ顕微鏡構成を使用して得られた画像を示す別の例の実験結果が表示されている。図６Ｂに見られるように、サンプル混合物の画像は、ｘ次元に沿って拡大／伸張されている。

図６Ｃを参照すると、図６Ｂに示されるのと同じ実験結果が表示されるが、引き伸ばされた次元の画素が１次元ビニングを用いて１つに再結合され、画像コンテンツおよび解像度がこの手順によって失われず、単に複数の画素上に光子を広げ、その後再結合できることが証明される。

この顕微鏡１は、単一分子の検出を含む幅広い用途のｉＳＣＡＴを行うために使用することができる。特に、弱い散乱体のラベルフリー画像化の用途では、関心のある物体を大きな背景の上に必ず検出しなければならないため、画像化コントラストが低下する。顕微鏡１は、例えば、単一分子の結合／脱離、相転移、クラスタリング、集合／分解、凝集、タンパク質／タンパク質相互作用、タンパク質／低分子相互作用、高感度ラベルフリー画像化を含む、屈折率のあらゆる変化の測定など、広範囲の研究および測定に使用することができる。

このように、顕微鏡１には、基礎研究から製薬業界などの産業応用まで、数多くの用途がある。例えば、ｉＳＣＡＴは現在、世界で最も高感度なラベルフリー単一分子画像化バイオセンサであり、例えば表面プラズモン共鳴センシング市場に大きな影響を与える可能性がある。また、上述のように顕微鏡１は質量測定にも利用でき、溶液中で正確、精密かつ高分解能の単一分子質量分析計として機能し、研究および産業界で多くの用途がある。

Claims (16)

1. 干渉散乱顕微鏡法によってサンプルを画像化する方法であって、
   少なくとも１つのコヒーレント光源でサンプルを照明することであって、前記サンプルは屈折率変化を有する界面を含むサンプル位置に保持され、照明放射で前記サンプルを照明して、前記界面で反射した光と前記サンプルで散乱した光とを含む逆伝播信号を前記サンプルから発生させることと、
   第１の信号および第２の信号の各々が前記サンプルで散乱した光の少なくとも一部を含むように、前記逆伝播信号を、第１の信号と第２の信号とに分割することと、
   前記第２の信号が前記第１の信号と異なるように、修正素子を用いて前記第２の信号を修正することであって、前記第２の信号を修正することは、第１の次元に沿った前記第２の信号の拡大、または前記第１の信号に適用される空間フィルタリングよりも大きな強度での空間フィルタリング、を含むことと、
   前記第１の信号および前記第２の信号を第１の検出器および第２の検出器に導き、第１の画像および第２の画像をそれぞれ生成することと、
   プロセッサによって、前記第１の画像および前記第２の画像を比較し、前記サンプルの１つまたは複数の特性を決定すること
   を含む、方法。
2. 前記第１の信号および前記第２の信号の少なくとも一方を空間フィルタに通すことであって、前記空間フィルタは、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、強度の前記減衰は、所定の開口数内でより大きい、ことをさらに含む、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つのコヒーレント光源は、第１のレーザおよび第２のレーザを含み、
   前記第１のレーザおよび前記第２のレーザのビームは、前記サンプルの照明の前に結合される、
   請求項１または２に記載の方法。
4. 前記信号を分割することは、前記逆伝播信号を、直交する偏光を有する２つの信号に分割することを含む、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記信号を分割することは、前記逆伝播信号を、異なる光パワーを有する２つの信号に分割することを含む、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１の信号および前記第２の信号の少なくとも一方を空間フィルタに通すことは、前記第１の信号を第１の空間フィルタに通すことを含み、
   前記第２の信号が前記第１の信号と異なるように前記第２の信号を修正することは、前記第２の信号を第２の空間フィルタに通すことを含み、
   前記第１の空間フィルタおよび前記第２の空間フィルタはそれぞれ、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、
   強度の前記減衰は、所定の開口数内でより大きく、
   前記第１の信号は、前記第２の信号より大きな光パワーを有し、
   前記第２の空間フィルタは、前記第１の空間フィルタより大きな強度減衰を入射放射に及ぼす、
   請求項５に記載の方法。
7. 前記第２の信号を修正することは、前記第１の信号に対する前記第２の信号の位相を調整することを含む、
   請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の信号に対する前記第２の信号の位相を調整することは、前記第２の信号を位相シフトマスクに通すことを含む、
   請求項７に記載の方法。
9. 前記第２の信号を調整することは、前記第１の信号の光路に沿った適切な位置で前記第２の信号を結像レンズに通すことを含む、
   請求項７または８に記載の方法。
10. 前記第１の信号に対する前記第２の信号の位相を調整するステップは、前記第１の信号に対する前記第２の信号の位相を前記照明放射の波長の半分だけ調整するステップを含む、
    請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第２の信号を修正することは、前記第２の信号を、前記第２の検出器の画素グリッドのｘ次元に対応する前記第１の次元に沿って前記第２の信号を拡大するように構成された光学素子に通すことを含む、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の信号を、第２の次元に沿って前記第１の信号を拡大するように構成された光学素子に通すことであって、前記第２の次元は、前記第１の次元と直交し、前記第２の検出器の画素グリッドのｙ次元に対応する、こと、
    をさらに含む、
    請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つのコヒーレント光源は、少なくとも２つの異なる検査波長を有する照明光を提供するように構成され、
    前記信号を分割することは、第１の検査波長を有する光が前記第１の検出器に向けられ、第２の検査波長を有する光が前記第２の検出器に向けられるように、波長によって前記信号を分割することを含む、
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記所定の開口数は、前記逆伝播信号内の前記サンプル位置から反射される照明光の開口数と同一または類似する、
    請求項２に記載の方法。
15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された干渉散乱顕微鏡であって、
    反射面を含むサンプル位置と、
    前記サンプル位置を照明するように構成された少なくとも１つのコヒーレント光源と、
    第１の検出器および第２の検出器と、
    第１の信号および第２の信号の各々が前記サンプルで散乱した光の少なくとも一部を含むように、前記サンプル位置からの逆伝播信号を第１の信号と第２の信号とに分割するように構成されたビームスプリッタと、
    前記第２の信号が前記第１の信号と異なるように前記第２の信号を修正するように構成された修正素子であって、前記第２の信号を修正することは、第１の次元に沿った前記第２の信号の拡大、または前記第１の信号に適用される空間フィルタリングよりも大きな強度での空間フィルタリング、を含む、修正素子と、
    を含み、
    システムは、前記第１の信号および前記第２の信号を前記第１の検出器および前記第２の検出器にそれぞれ向けるように構成される、
    干渉散乱顕微鏡。
16. 前記第１の信号および前記第２の信号の少なくとも一方をフィルタリングするように配置された少なくとも１つの空間フィルタをさらに含み、
    前記空間フィルタは、入射放射の強度の減衰をもたらすように構成され、
    入射放射の強度の減衰は、所定の開口数内でより大きい、
    請求項１５に記載の干渉散乱顕微鏡。

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