JP7624478B2 - 癌治療において壊死を標的とするヒト化抗核抗体 - Google Patents

Description

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本出願は、２０１７年３月２０日出願の米国仮特許出願第６２／４７３，５５４号明細書の優先権の利益を主張する。この出願の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明の分野は、抗体、とりわけ腫瘍における壊死を標的とするヒト化抗体である。

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以前に、細胞死の後にアクセス可能となるユニバーサルな細胞内抗原に向けられるモノクローナル抗体が、固形腫瘍の免疫療法に使用された（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８：５８４２－５８４８，１９８８；Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１２（６）：６８９－６９８，１９９３；又はＣａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１３（４）：２５５－６８，１９９８参照）。有利には、そのようなアプローチは、全ての腫瘍に存在するが、体の正常な組織において通常存在しない、腫瘍の壊死領域を標的とする。例えば、３つの「腫瘍壊死標的化（ＴＮＴ）」マウスモノクローナル抗体が研究されており、ヒストンＨ１及びＤＮＡに向けられるｍｕＴＮＴ－１、ヒストン画分Ｈ１及びＨ３の共通エピトープに結合するｍｕＴＮＴ－２、並びに一本鎖ＤＮＡに主に結合するｍｕＴＮＴ－３が挙げられる。特に、腫瘍マウスにおける生体内分布分析により、ＴＮＴ－３が、ｍｕＴＮＴ－１及びｍｕＴＮＴ－２と比較して、腫瘍における最も高い吸収を示すことが実証されており、そしてＴＮＴ－３が、固形腫瘍の放射免疫療法に提案されている（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １９９８ Ａｕｇ；１３（４）：２５５－６８参照）。代替アプローチにおいて、キメラＴＮＴ－３抗体／マウスインターフェロン－ガンマ融合タンパク質が、固形悪性腫瘍の免疫療法のために構築されており（例えば、Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ ２００３ Ａｕｇ；２２（４）：１９７－２０７参照）、種々の所望の特性を示した。

不運にも、マウスのモノクローナル抗体は、ヒトにおいて免疫原性であるので、ヒト患者において治療能が大きく制限される。免疫原性に関連した問題に対処する一助とするために、分子及びマウス可変領域の６５％を占めるヒト定常領域を用いて、キメラＴＮＴ－３抗体が構築された。しかしながら、そのようなキメラ抗体は、約３５％のマウス残基をなお含有したので、抗体は免疫原性のままであった。

キメラ抗体の免疫原性をさらに引き下げるために、種々のアプローチが企てられ得る。最も単純なヒト化アプローチの１つが、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフトであり、そこでは６つの抗体ＣＤＲが単純に、対応するヒトフレームワーク領域中にグラフトされて、これによりマウス残基の数がさらに約２５％少なくなる。不運にも、ＣＤＲグラフトは、少なくとも場合によっては、いくつかの抗体のヒト化に首尾よく用いられた一方、グラフトは多くの場合、結合プロファイルを変えて、抗原への親和性の不所望の低下をもたらし（例えば、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２４：４８７－４９９，１９９２参照）、他の文献では低下が最大数百倍と報告されている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１０）：４２８５－９，１９９２参照）。したがって、ほとんどの場合、ＣＤＲグラフトは、ヒト化抗体の親和性を回復させるのに潜在的に重要な一部のフレームワーク残基の微細な回転（ｆｉｎｅ ｔｕｒｎｉｎｇ）と組み合わされなければならない。しかしながら、ＣＤＲ構造に潜在的に寄与し得る重要なフレームワーク残基の数は比較的多く、そして多くの場合、論理的根拠に基づく抗体設計を妨げる。さらに、フレームワーク残基と１つ以上のＣＤＲとの相互作用がさらに、分析を複雑にして、微調整方法を概して時間のかかるものにし、且つ予測困難なものにする。

さらに別のアプローチにおいて、ヒト化抗体の親和性は、ＣＤＲのステップワイズ突然変異によって回復した（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，６０３７－６０４２，１９９８参照）。さらに、ＶＨ鎖のＣＤＲ領域における多様性が、ほとんどの抗体特異性にとって十分であると報告し、そして体細胞突然変異が、驚くべきことに、高い親和性を許容することができると指摘したものもある。実際に、Ｈ－ＣＤＲ３は、より初期の研究によって示唆されたように、抗原結合において主要な役割を果たすことが示された。このことは、重鎖が単独で、又は単一のＶＨドメインですら、無傷抗体と匹敵する親和性で抗原に結合することができることを示している（例えば、Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６，１９８９；及びＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９３，１７７－１８７，１９９６参照）。勿論、選択されたＣＤＲの修飾が、結合部位の全体的な構成を再度変化させて、もう一度高いレベルの予測不能性を招く虞がある。

ゆえに、腫瘍微環境、とりわけ壊死細胞の標的化が、腫瘍に対する免疫応答の部位特異的調節を許容することができるようにするヒト化抗体組成物及び方法が必要とされている。

本発明の主題は、結合特性が向上したヒト化ＴＮＴ抗体の組成物、その生成方法、及びその使用に関する。

本発明の主題の一面において、発明者らは、核標的（例えば、ＤＮＡ、とりわけ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ））への結合親和性が、対応する非ヒト化抗体と比較して向上したヒト化抗核抗体を意図する。とりわけ、意図されるヒト化抗体は、結合親和性が、対応する非ヒト化抗体よりも少なくとも２倍、より典型的には少なくとも４倍、最も典型的には少なくとも８倍高い。さらに、好ましいヒト化抗体は、対応する非ヒト化抗体に対して、突然変異したアミノ酸をＨ－ＣＤＲ３内に有する。例えば、Ｈ－ＣＤＲ３内の突然変異したアミノ酸は、１０７Ｐｈｅ→Ａｒｇ、１０１Ｉｌｅ→Ｈｉｓ、１０２Ｇｌｙ→Ａｒｇ、１０９Ｔｙｒ→Ｔｈｒ、１０３Ｖａｌ→Ｓｅｒ、１０４Ａｒｇ→Ｔｈｒ、１０９Ｔｙｒ→Ａｒｇ、及び１０４Ａｒｇ→Ｌｅｕであってよい。

異なる観点から見て、ヒト化抗体は、ＴＲＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＨ－ＣＤＲ１配列、ＧＡＩＹＰＧＮＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）を含むＨ－ＣＤＲ２配列、ＥＥＩＧＶＲＲＷＦＡＹ（配列番号３）を含むＨ－ＣＤＲ３配列、ＲＡＲＱＳＩＳＮＹＬＨ（配列番号４）を含むＬ－ＣＤＲ１配列、ＡＳＱＳＩＳ（配列番号５）を含むＬ－ＣＤＲ２配列、及びＱＱＳＮＳＷＰＬＴ（配列番号６）を含むＬ－ＣＤＲ３配列の少なくとも１つを有してよい。したがって、意図される更なる面において、ヒト化抗体は、以下を含むＶＨ配列：
及び／又は以下を含むＶＬ配列：
を有してよい。

本発明の主題の別の面において、発明者らはまた、治療剤及び／又は造影剤に結合する、本明細書中で意図されるヒト化抗体の少なくとも結合部分を含むハイブリッド分子を意図する。例えば、抗体の適切な結合部分として、完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆａｂ_２フラグメント、及びｓｃＦｖが挙げられる一方、意図される治療剤として、サイトカイン若しくはその一部、ケモカイン若しくはその一部、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）のインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、Ｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）アゴニスト若しくはリガンド、上皮間葉転換（「ＥＭＴ」）を妨げる分子、及び／又は化学療法薬が挙げられる。意図される造影剤として、放射性同位体、ポジトロン放射形断層撮影（ＰＥＴ）標識、及び／又は単一光子放射形コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）標識が挙げられる。したがって、発明者らはまた、本明細書中で示される抗体又はハイブリッド分子を含む医薬組成物を意図する。最も典型的には、そのような医薬組成物は、注射用に製剤化されることとなる。

本発明の主題のさらに別の面において、発明者らは、壊死細胞を標的とする方法を意図しており、そのような方法は、壊死細胞を、本明細書中で示される抗体又はハイブリッド分子と接触させる工程を含むこととなる。本発明の主題に限定されないが、典型的には、壊死細胞が腫瘍微環境内の壊死腫瘍細胞であることが、そして／又は接触工程がインビボで実行されることが好ましい。

ゆえに、発明者らはまた、壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に治療剤又は造影剤を送達する方法を意図する。そのような方法において、本明細書中で示される抗体に結合されている治療剤又は造影剤が提供される。次に、壊死腫瘍細胞は、腫瘍微環境内で抗体が壊死細胞内の核標的に結合し得る条件下で、治療剤又は造影剤と微環境内で接触させられる。

好ましい面において、治療剤は、サイトカイン又はその一部、ケモカイン又はその一部、ＭＤＳＣのインヒビタ、Ｍ２マクロファージのインヒビタ、放射性同位体、共刺激分子、ＴＬＲアゴニスト又はリガンド、ＥＭＴを妨げる分子、及び化学療法薬の少なくとも１つを含む一方、造影剤は、放射性同位体、ＰＥＴ標識、及びＳＰＥＣＴ標識の少なくとも１つを含む。最も典型的には、腫瘍は固形腫瘍である。そして治療剤又は造影剤の送達は、血管透過性増強剤（例えばＩＬ－２）を用いて増強されてよい。

本発明の主題の更なる面において、発明者らはさらに、マウス抗体由来の、親和性が最適化されたヒト化抗体を生成する方法を意図する。最も典型的には、そのような方法は、マウス抗体配列との所定の最小限の同一性（例えば、ＣＤＲを除外して、少なくとも９０％、９２％、９４％、又は９６％）を有するヒト抗体配列を同定する工程を含むこととなる。別の工程において、ＶＨ及びＶＬについてのマウスＣＤＲが、同定されたヒト抗体配列のＶＨ及びＶＬ中にそれぞれグラフトされて、キメラＶＨ及びＶＬ配列が得られ、そしてｓｃＦｖ－ハイブリッドが、キメラＶＨ及びＶＬ配列を用いて生成される。次に、部位特異的突然変異誘発が、Ｈ－ＣＤＲ３において実行されて、ｓｃＦｖ－ハイブリッドライブラリが生成され、そして親和性選択（及び／又は成熟）が用いられて、ｓｃＦｖ－ハイブリッドライブラリからバインダが同定される。さらに別の工程において、バインダのキメラＶＨ及びＶＬ配列が、ヒト抗体配列中にグラフトされて、親和性が最適化されたヒト化抗体が得られる。

最も典型的には、ｓｃＦｖ－ハイブリッドは、ファージディスプレイハイブリッドであるが、ＲＮＡディスプレイハイブリッドであってもよい。さらに、Ｈ－ＣＤＲ３における部位特異的突然変異誘発は、Ｈ－ＣＤＲ３の単一のアミノ酸位置に向けられることが概して好ましい（が、必須ではない）。同様に、親和性選択が、少なくとも３つの連続する選択／濃縮サイクルの全体にわたって実行されることが概して好ましい（が、必須ではない）。所望される場合、親和性選択はさらに、Ｈ－ＣＤＲ３及び／又はフレームワーク領域における追加の部位特異的突然変異誘発の少なくとも１工程を含んでよい。

本発明の主題の種々の目的、特徴、面、及び利点が、同様の符号が同様の構成要素を表す添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明から、より明らかとなろう。

ヒト、マウス、及びヒト化タンパク質部分のＶＨ（図１Ａ）及びＶＬ（図１Ｂ）配列の例示的なアラインメント、並びに例示的なＥＰ／ｓｃＦｖの一般的なアセンブリ（図１Ｃ）を示す概略図を示す。図１Ａにおいて、ｍＴＮＴ－３／ＨＶは配列番号９であり、ＥＰ／ＨＶは配列番号１０であり、ＨｕＦｄｌ３８／ＨＶは配列番号１１である。図１Ｂにおいて、ｍＴＮＴ／ＬＶは配列番号１２であり、ＥＰ／ＬＶは配列番号１３であり、ｈｕＢ－Ｂ１０／ＬＶは配列番号１４である。 ＥＰ／ＳｃＦｖのＨ－ＣＤＲ３の突然変異、及びその、粗ＤＮＡに対するライブラリのパンニング(panning)を示す。ＥＥＩＧＶＲＲＷＦＡＹ（配列番号３）ドメインは、重鎖ＣＤＲ３配列である。影付きの「Ｘ」は、２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれか１つであり得る。プライマーＰｒ１～Ｐｒ１１は、それぞれ配列番号１６～２６である。 パンニングの連続ラウンドの全体にわたる結合の例示的な増大を示すグラフである。 結合したファージミドのクローン結果を示すプロットである。 例示的なヒト化ＩｇＧサンプルのＳＤＳゲルの写真である。 ＥＰ２７、ＥＰ７、ＥＰ３５、ＥＰ１０３、ＥＰ５４、ＥＰ１０２、及びＥＰ５１である選択された突然変異抗体タンパク質の例示的な相対親和性を示すグラフである 本発明の主題に従う、選択されたヒト化抗体の免疫染色の種々の顕微鏡写真を示す。 ＥＰ２及びＥＰ５１ヒト化抗体に対する親和性測定値を示すグラフである。 本発明の主題に従う、種々のヒト化抗体の種々の組織及び時点の全体にわたる生体内分布についての例示的なグラフを示す。 本発明の主題に従う一ヒト化抗体の、血管浸透の増強なしでの、種々の組織の全体にわたる生体内分布についての例示的なグラフを示す。

発明者らは、今般、種々の標的に対する抗体が、ヒト化され得るだけでなく、抗原親和性に関して概念的に単純且つ効果的に向上し得ることを発見した。例えば、そして以下でより詳細に説明されるように、発明者らは、マウスの抗核抗体を、親和性が実質的に向上したヒト化抗体に変換した。

より詳細には、そして所望のマウス抗体（例えば、ｓｓＤＮＡに結合するマウス抗体）に基づいて、アミノ酸同一性が最も高い対応するヒト抗体配列を、抗体データベースにおいて同定した。最も典型的には、適切なヒト抗体配列は、所定の最小限の同一性が、ＣＤＲを除外して、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、又は少なくとも９６％となることとなる。一旦同定されると、ＶＨ及びＶＬについてのマウスＣＤＲは次に、ヒト配列中にグラフトされることによって、当該技術において周知の従来の方法を用いて、キメラＶＨ及びＶＬ配列が得られる。勿論、そのようなグラフト工程は、実際のキメラ配列が実験に必要とされない場合、インビトロ又はインシリコでなされ得ることが理解されるべきである。次に、グラフトの方法に関係なく、必要に応じて、キメラＶＨ及びＶＬ配列を、親和性成熟又は他の向上用のベース構造として用いて、ｓｃＦｖ－ハイブリッドが生成される。再度、実際の核酸部分、又は当該技術において知られている配列情報からｓｃＦｖを製造する多数の方法があり、そのようなｓｃＦｖを生成する方法は全て、本明細書中での使用に適しているとみなされる。とりわけ好ましい面において、ｓｃＦｖは、所望の親和性又は他の分子の性質を有する変異体の迅速な同定及びクローン増幅を許容する選択系に融合される。例えば、本明細書中での使用に適した選択系として、種々のファージパニング系（例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸに基づく）及びＲＮＡディスプレイ系（例えば、ピューロマイシン結合ベースのもの）が挙げられ、そして親和性成熟、及び選択されたクローズ（ｃｌｏｓｅｓ）の単離の知られている方法が全て、本明細書中での使用に適しているとみなされることが理解されるべきである。したがって、クローン選択及び／又は親和性成熟は、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域の少なくとも１つを標的とする断続的な部位特異的突然変異誘発の１つ以上の工程を含んでよい。

本発明の主題の更なる面において、発明者らは、親和性が、そして生体利用性／吸収ですら、Ｈ－ＣＤＲ３部分のみを修飾することによって向上し得ることに注目した。特に、発明者らは、単回のアミノ酸スキャニングを実行して、選択された突然変異体が、以下でもより詳細に示されるように、結合が実質的に増大していることを発見した。有利には、そのような突然変異誘発は、完全長抗体（典型的にはＩｇＧ）を試験するのではなく、ｓｃＦｖフォーマットを用いてなされ得る。容易に理解されるように、ｓｃＦｖの、親和性が向上したキメラＶＨ及びＶＬ配列は、次に、ヒト抗体配列中にグラフトされるので、親和性が最適化されたヒト化抗体が得られ得る。次に、調製されたヒト化親和性向上抗核抗体を、以下でもより詳細に示されるように、適切且つ選択的な結合を確認するための種々のアッセイで試験した。

このように調製された抗体の意図される使用に関して、本明細書中に示される抗核抗体は、壊死の、そしてとりわけ、腫瘍微環境内の壊死細胞を標的とするのに、特に有益であることが理解されるべきである。免疫回避の種々の機構を促進する腫瘍微環境が、多くの場合、標的化が困難な環境（例えば、ＮＫ細胞の活性を引き下げる低酸素、ＥＭＴを促進する栄養素及び酸素の欠乏等）であるので、微環境に対する種々の免疫刺激因子の特異的な送達及び保持が、免疫治療に特に有益であると思われる。

その点に関して、用語「アポトーシス」及び「壊死」は、本明細書中で互換的に用いられず、細胞死の互いに異なる主に２つの機構及び経路を指すことが理解されるべきである。アポトーシスは、特殊なシグナル伝達事象及び段階的な細胞閉鎖（例えば、ブレブ形成、細胞収縮、核フラグメンテーション、クロマチン凝集、ＤＮＡフラグメンテーション、ｍＲＮＡ崩壊）を包含するプログラム細胞死の明確に定義されたプロセスである一方、壊死は、典型的に、細胞小器官機能の付随する喪失、細胞破壊、及び環境中への細胞内容物の放出による細胞死の崩壊プロセスとして明示される。さらに、壊死は典型的に、炎症性の細胞応答を伴う。さらに、壊死は、免疫系が腫瘍を「見て」、免疫学的に反応する部位であることが理解されるべきである。これは重要である。なぜなら、壊死へのペイロードの送達が、免疫系の腫瘍の認識、及び腫瘍への反応を助けることとなるため、治療的に有効なペイロードの送達の好ましい部位となるからである。

したがって、発明者らはまた、抗体及びそのフラグメントの、腫瘍微環境に造影剤及び／又は治療剤を送達するための使用を意図している。最も典型的には、抗体又はそのフラグメントは、核標的、そしてとりわけｓｓＤＮＡへの結合が特異的となることとなる（すなわち、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は他の技術によって判定して、Ｋｄが１０^－７Ｍ未満、より典型的には１０^－８Ｍ未満である結合）。最も典型的には（必ずしも全てのケースにおいてでない）、ｓｓＤＮＡへの結合は、ヒストン及び他の核タンパク質の存在とは独立することとなる。

勿論、造影剤及び／又は治療剤が、多くの様式（共有結合及び非共有結合が挙げられる）で抗体（又はそのフラグメント）に結合されてよいことが理解されるべきである。最も典型的には、結合は、共有結合であることとなり、これは、従来の結合化学、例えばアミノ基反応性試薬（例えば、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル、種々のアルデヒド、カルボジイミド化合物、エポキシド、イミドエステル等）、若しくはスルフヒドリル基反応性試薬（例えば、種々のマレイミド、チオール等）を用いて達成され得、又は組換えクローニング技術を介して実行され得、そこでは抗体（フラグメント）が、注目する第２のタンパク質にフレーム単位で融合される任意選択のリンカーにフレーム単位で融合される。適切なリンカーは、所望の長さ（例えば、所望の空間距離を提供するような長さ）、アミノ酸組成（例えば、切断可能リンカー又は可撓性のあるリンカーを提供するような長さ）その他によって選択されてよい。結合の意図される更なる態様において、結合は、非共有結合であってよく、そしてとりわけ好ましい方法で、結合は、知られている結合対、例えば、ビオチン／アビジン、セルロース／セルロース結合タンパク質、ニッケル－ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）／オリゴ－ヒスチジル等の要素によって提供される。

診断薬に関して、検出可能な（且つ、好ましくは定量的に検出可能な）剤は全て、本明細書中での使用に適しているとみなされることが意図される。さらに、検出は、当該技術において知られている適切な方法を用いて、エクスビボで（例えば、組織切片上で）、且つ／又はインビボで実行され得る点に留意すべきである。例えば、視覚的に検出可能な造影剤として、フルオロフォア、発光基、触媒活性基（例えば、色素を析出させ、且つ／又はクロモゲン若しくはルミノゲンを活性化するような触媒活性基）、Ｘ線撮影で検出可能な基（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＮＭＲ標識、放射性同位体等）が挙げられる。

同様に、そして治療剤に関して、治療剤は全て、本明細書中での使用に適しているとみなされることが意図される。しかしながら、本発明の主題の特に好ましい態様において、治療剤は、免疫刺激作用を有することとなる。最も典型的には、そのような刺激因子の作用は、１つ以上の機構を取り消し、又は中和して、腫瘍微環境内の癌細胞の免疫回避に至ることとなる。例えば、免疫回避が、Ｍ２マクロファージ又は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の動員に基づく場合、適切な治療剤として、そのような阻害細胞を特異的に不活化又は破壊するもの（例えば、ゲムシタビン、ＲＰ－１８２（米国特許第９４９２４９９号明細書の配列番号１２１参照）、又はシクロホスファミド）が挙げられることとなる。加えて、又は代わりに、免疫回避が、エフェクタ細胞及び／又はヘルパー細胞によるチェックポイント阻害に基づく場合、ＣＴＬＡ４又はＰＤ１に対するバインダ又はアンタゴニスト（例えば、イピリムマブ、ペムブロリズマブ等）が意図される。

逆に、治療剤が免疫刺激活性を有する場合、治療剤の使用によって免疫治療が増強され得ることも理解されるべきである。そのような免疫刺激活性は、好ましくは１つ以上の腫瘍（ネオ）抗原の文脈において、抗体又はそのフラグメントに結合される共刺激性シグナルの使用を介して達成され得る。例えば、共刺激性シグナルとして、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＭ３、ＬＦＡ３、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳＬその他が挙げられる。また、免疫刺激剤として、免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、及びリガンドが挙げられることとなることが理解されるべきである。またさらに、治療剤が、免疫コンピテント細胞をさらに誘引することとなる（炎症誘発性）ケモカインを含んでもよいことが理解されるべきである。この文脈において、治療剤は、典型的に、（壊死細胞が既に生きられないため）壊死の部位にて腫瘍細胞を死滅させることにはならないが、壊死組織に近位の腫瘍細胞に対する免疫反応の増強を（例えば、抗原拡散及び抗原カスケーディングを利用して、又は免疫抑制機構の反転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）によって）促進することとなることが理解されるべきである。

所望される場合、治療剤は、ＩＬ－８及びＴＧＦ－βが挙げられる、腫瘍微環境内のＥＭＴ（上皮間葉転換）に寄与する因子を標的化することとなる剤を含んでもよい。したがって、適切な治療剤はまた、ＩＬ－８及びＴＧＦ－βに結合し、又はそれ以外ではこれらを封鎖するものを含むこととなる。

加えて、治療剤は、癌の処置に用いられるより従来の薬物を含んでもよい。例えば、典型的な抗癌薬物として、代謝拮抗薬、微小管の形成又は脱アセンブリに干渉する薬物、ＤＮＡアルキル化剤、及びトポイソメラーゼインヒビタ、細胞毒性薬物その他が挙げられ、これらは全て、腫瘍微環境において一般的な条件下で切断可能であり得る。また、意図される治療剤として、放射線治療剤、例えばアルファエミッタ及びベータエミッタ（例えば、Ｂｉ－２１３、Ｐｂ－２１２、Ｉ－１３１、Ａｃ－２２５、Ｓｒ－８９その他）が挙げられる。そのような剤は通常、腫瘍又は腫瘍微環境内で非壊死腫瘍細胞に影響を及ぼすこととなる。

結果的に、そして以下でより詳細に示されるように、発明者らは、通常、核標的に、そしてとりわけｓｓＤＮＡに特異的に結合する結合剤と、壊死細胞（典型的には腫瘍細胞、最も典型的には腫瘍微環境内の壊死腫瘍細胞）を接触させる工程を含む、壊死細胞を標的とする方法を意図する。さらに、接触は、そのような方法で、インビボ又はインビトロで実行され得る。例えば、工程がインビトロで実行される場合、比較的少量（例えば、０．００１～１００μｇ、０．０１～０．１μｇ、又は０．００１～０．０１μｇ）の抗体が必要とされ得る。他方、工程がインビボで実行される場合、比較的大量（例えば、０．０１～１００ｍｇ、０．１～１０ｍｇ、又は１～１０ｍｇ）の抗体が必要とされ得る。勿論、抗体が造影剤及び／又は治療剤に結合される場合、抗体の量は、所望の効果のために必要とされる造影剤及び／又は治療剤のタイプ及び量によって、少なくとも部分的に決定されることとなることが理解されるべきである。

結果的に、発明者らはまた、壊死腫瘍細胞を含有する腫瘍微環境に治療剤及び／又は造影剤を送達する方法を意図する。上記したように、そのような方法は、典型的に、核標的（そして、とりわけｓｓＤＮＡ）に結合する抗体に結合されている治療剤又は造影剤を用意する工程と、抗体が、腫瘍微環境内の壊死細胞中の核標的に結合し得る条件下で、微環境内の壊死腫瘍細胞を、治療剤又は造影剤と（好ましくはインビボで）接触させる更なる工程とを含むこととなる。

また、本明細書中で意図される方法はさらに、腫瘍壊死を増大させることによって、腫瘍中への修飾抗体の吸収を増強することで、治療ペイロード又は診断ペイロードの送達を最適化する１つ以上の工程を含んでよい。例えば、適切な更なる工程として、放射線療法、化学療法、又は免疫療法、そしてとりわけ低用量のメトロノミック化学療法及び放射線療法が挙げられる。

試薬：グルタミン合成酵素遺伝子増幅系を有するプラスミドｐＥＥ６ｈＣＭＶ－Ｂ及びｐＥＥ１２を、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及び他の分子生物学試薬を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、分解された粗ＤＮＡ、ＡＢＴＳ（２，２’－アゾベンゼン－２－カルボン酸）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ハイブリドーマ無血清培地（ＳＦＭ培地）（グルタミン入り、そしてグルタミンなし）を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入し、そして透析された胎仔ウシ血清を、ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から得た。Ｉｏｄｉｎｅ－１２５を、ＤｕＰｏｎｔ／Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｎｏｒｔｈ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から、０．１Ｎ水酸化ナトリウム中ヨウ化ナトリウムとして得た。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｈａｒｌａｎ－Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。

ＥＰ／ＳｃＦｖの設計及びアセンブリング：ヒト抗体データベースを検索することによって、２つの配列、ｈｕＦｄ１３８ ＨＶ及びｈｕ Ｂ－Ｂ１０ ＬＶがそれぞれ、重鎖及び軽鎖の元のＴＮＴ－３アミノ酸配列に最も同一性があった。このため、これらをそれぞれ、ＥＰ可変重鎖及び可変軽鎖を構築するマスター鋳型として用いた。次に、６つのＣＤＲを、対応するヒトフレームワーク領域中に単純にグラフトした。６つのマウスＴＮＴ－３ ＣＤＲ配列を、知られているヒト抗体において観察されるコドン使用を用いて、対応するヌクレオチド配列に変換した。可変重鎖及び可変軽鎖の配列を、（ＧＳＳＳＳ）３リンカーと組み合わせて、ＥＰ／ＳｃＦｖを構築した。設計したＤＮＡ配列を、８つの重なり合うオリゴヌクレオチドに分けて、合成した。

全長ＳｃＦｖを、シリアルアセンブリングＰＣＲによって得て、５’末端と３’末端にて一対のプライマーで増幅した。ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化して、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）中にクローニングした。ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列を有する１クローンを、次の突然変異用の標準的な鋳型として選択した。ＥＰ抗体候補（本明細書中でＥＰ、ｈｕＴＮＴ ＩｇＧ１、又は抗体とも呼ぶ）の親和性を回復且つ向上させるために、１１個のコドンを包含するＨ－ＣＤＲ３ドメイン上の部位特異的ランダム突然変異(a site-specific random mutation)を実行した。１１個の部位特異的突然変異を含有する一組のプライマーを設計した。ＰＣＲを用いて、１１個のアミノ残基のランダムな突然変異を、段階的に導入した。１１個の突然変異したヒト化ＳｃＦｖを、５’末端と３’末端にて一対のプライマーによるＰＣＲによって増幅した。次に、ＰＣＲ産物を精製して、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化して、消化したラムダファージＳｕｒｆＺＡＰ ＴＭベクター中に挿入した。次に、宿主細胞ＸＬ－１に感染させた、パッケージ化したＳｕｒｆＺＡＰ ＴＭベクターを増幅して切り出して、ＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭヘルプファージ(help pharge)によりファージミドｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔＴＭ ＳＫ（－）中に入れた。ヘルプファージを消失させるためにＳＯＬＲ細胞中で増殖させたファージミドを、ＸＬ－１細胞中で増幅した。ＥＰ／ＳｃＦｖを、融合タンパク質（ＳｃＦｖ／ｃｐＩＩＩ）として発現させて、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージにより組換えファージミド粒子のコートタンパク質中に組み込ませた。ファージミドを、増幅された上清からＰＥＧ沈殿によって回収して濃縮した。

２５ｍｌフラスコ上にコーティングした粗ＤＮＡに対する４ラウンドのバイオパンニングを、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥプロトコルに従って行った。手短に言えば、各パンニングについて、３ｍｌのＰＢＳ中＞１０^１２個のファージミドを用いた。結合していないファージを、１０ ＰＢＳＴ洗浄で除去して、結合したファージを、５ｍｌグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出した。１００μｌの感染した細菌を選択プレート上にプレーティングして、コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）をカウントすることによって、溶出したファージの力価を判定した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにコーティングした１００μｌの１０μｇ／ｍｌ粗ＤＮＡによるファージ－ＥＬＩＳＡによって、パンニングの第４ラウンド由来のＳｃＦｖファージを、粗ＤＮＡとの反応性について試験した。結合したファージを、ウサギ抗Ｍ１３抗体に続く、ヤギ抗ウサギ抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体で検出した。Ａ_４０５値を、基質（ＡＢＴＳ）との１０分間のインキュベーション後に判定して、ＥＬＩＳＡリーダによって測定した。

ＥＰ ＩｇＧの構築及び発現：無傷の抗体分子を回復させるために、ＥＰ／ＳｃＦｖを、ＥＰ ＩｇＧ１に変換した。これを達成するために、ＥＰ重鎖及び軽鎖の可変領域を、適切な制限酵素部位を導入するように設計したプライマーを用いて、クローニングベクターからＰＣＲ増幅した。重鎖可変領域を、ヒトガンマ１定常領域（ＣＨ）を以前にクローニングした発現ベクターｐＥＥ６ｈＣＭＶ－Ｂ中に導入した。軽鎖可変領域を、ヒトＶＬ定常領域ｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐＥＥ１２中に挿入した。最終の発現ベクターは、ＣＭＶ主要前初期プロモータ（ＣＭＶ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下でヒト軽鎖及び重鎖用の転写カセットをそれぞれ含有するｐＥＥ６ｈＣＭＶ－Ｂ／ＥＰ ＨＣ及びｐＥＥ１２／ＥＰ ＬＣであった。ｐＥＥ１２／ＥＰ ＬＣはまた、ＳＶ４０初期プロモータの制御下で、選択可能マーカー、グルタミン合成酵素のｃＤＮＡ配列を含有する。各ベクターの完了後、ｐＥＥ６ｈＣＭＶ－Ｂ／ＥＰ ＨＣ及びｐＥＥ１２／ＥＰ ＬＣベクターを、ＥＰ ＩｇＧ１の発現用の宿主ＮＳ０マウス骨髄腫細胞中に共形質移入した。最初に、１０μｇ／ｍｌにて分解粗ＤＮＡでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いる間接ＥＬＩＳＡによって、抗体生成物を含有する上清を同定した。最高の生成クローンを、２４時間の生成率アッセイによって同定した。限界希釈による２ラウンドのサブクローニング後、最高の生成クローンを増殖させて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィによって、ＥＰ ＩｇＧ１を細胞培養上清から段階的に精製した。ＥＰ抗体の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって調査した。

ＥＬＩＳＡによる粗ＤＮＡ結合の判定：ＥＰ ＩｇＧ候補のＤＮＡ結合活性を測定するために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌの１０μｇ／ｍｌ粗ＤＮＡでコーティングして、１％ＢＳＡ－ＰＢＳでブロックして、ＥＰ ＩｇＧ候補の段階希釈液をウェル中に加えて、３７℃にて１時間インキュベートした。精製したｃｈＴＮＴ－３を、基準として用いた。結合していないあらゆる抗体を、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｗａｓｈ）して除去してから、ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体結合体ホースラディッシュペルオキシダーゼに続いて発色基質を加えた。ＯＤ_４０５を、ＥＬＩＳＡリーダによって測定した。

間接免疫蛍光染色によるラージ細胞中でのＥＰ候補の局在化：ラージ細胞中でのＥＰ ＩｇＧ候補の局在化を観察するために、間接免疫蛍光染色を実行した。手短に言えば、ラージ細胞を、１０％緩衝中性ホルマリンで固定して、ＰＢＳで洗浄した。２００μｌ ＰＢＳ中１０４個のラージ細胞を、１．５ｍｌチューブ内で３７℃にて１時間、種々のＥＰ抗体に反応させた。細胞をＰＢＳＴで５回洗浄して、結合していない抗体を遠心分離によって除去した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、１：３０の希釈で加えて、最後にラージ細胞を、２０μｌ ＰＢＳ中に収集して、スライド上に広げて蛍光顕微鏡下で観察した。

ヨウ素１２５標識ＭＡｂの調製：修飾クロラミン－Ｔ方法を用いて、ヨウ素１２５標識ＭＡｂを調製した。手短に言えば、１ｍＣｉのＩ^１２５及び２０μｌのクロラミン－Ｔ水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を、１００μｌ ＰＢＳ中１００μｇ ＭＡｂを含有する５ｍｌ試験管に加えた。溶液を２分後に、１０μｌのメタ重亜硫酸ナトリウム水溶液でクエンチした。次に、各反応混合物を、典型的には９０％～９５％の回収をもたらすＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムを用いて精製した。放射標識したＭＡｂを、注射用にＰＢＳで希釈して、４℃にて貯蔵して、標識後２時間以内に投与した。

結合及び生体内分布の研究：ラージ細胞を用いた従来の固定細胞ラジオイムノアッセイによって、放射標識したＭＡｂのインビトロ免疫反応性を評価した。手短に言えば、放射ヨウ素標識ＭＡｂ（おおよそ１００，０００ｃｐｍ／チューブ）を、１０^６個の固定ラージ細胞と３反復で１時間、断続的に混合しながらインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中１％ＢＳＡで３回洗浄した。細胞ペレットに関連する放射活性をガンマ計数器で測定することによって、結合したＭＡｂを検出した。ＥＰ抗体の結合力定数（Ｋａ）を判定するために、抗原細胞である固定ラージバーキットリンパ腫細胞を用いた。種々の濃度（１０～１１０ｎｇ）の^１２５Ｉ標識ＥＰ抗体を、１０^６個の固定ラージ細胞と、常に混合しながら室温にてインキュベートして、結合していない放射活性を、ＰＢＳＴの３回の洗浄で除去してから、結合した放射活性の量を、ガンマ計数器でカウントして、結合力定数（Ｋａ）をスキャチャード解析によって算出するのに用いた。結合力定数Ｋａを、Ｋ＝－（傾き／２）によって決定した。

ＥＰ抗体及びｃｈＴＮＴ－３の生体内分布を調査するために、６週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスに、１０^７個のＬＳ １７４Ｔヒト結腸腺癌細胞を含有する０．２ｍｌ接種原を、左歯面（ｌｅｆｔ ｆｌａｎｋ）においてｓ．ｃ注射した。腫瘍を、おおよそ直径１ｃｍに達するまで増殖させた。各群（ｎ＝５）内で、個々のマウスに、１００μＣｉ／１０μｇの^１２５Ｉ標識ＭＡｂを含有する０．１ｍｌ接種原をｉ．ｖ．注射した。種々の注射後の時点にてマウスを犠牲にして、臓器、血液、及び腫瘍を取り出して、秤量した。次に、サンプル中の放射活性を測定して、％ＩＤ／ｇ及び腫瘍／臓器比（腫瘍１グラムあたりｃｐｍ／臓器１グラムあたりｃｐｍ）として表した。有意水準を、ウイルコックス順位和検定を用いて判定した。

ヒト化ＴＮＴ－３／ＳｃＦｖの設計及び構築：Ｖ領域のヒト化ＴＮＴ－３フレームワークを設計するために、発明者らは、ヒト抗体データベースを検索して、２つのヒト抗体、ｈｕＦｄ１３８ ＨＶ及びｈｕ Ｂ－Ｂ１０ ＬＶがそれぞれ、重鎖及び軽鎖の元のＴＮＴ－３アミノ酸配列に最も同一性があることを見出した。ｈｕＦｄｌ３８ ＨＶは、ｍＴＮＴ－３重鎖配列に対するフレームワーク１、２、３、及び４の相同性が、８１％であった（図１Ａ参照）；ｈｕ Ｂ－Ｂ１０ ＬＶは、ｍＴＮＴ－３軽鎖配列に対するフレームワーク１、２、３、及び４の相同性が、７４％であった（図１Ｂ参照）。Ｈ－ＣＤＲの高次構造に及ぼすフレームワーク置換の影響を引き下げるために、又は重鎖フレームワーク上のＣＤＲ配列に近いことに起因して、重要であると推測される３つの残基（Ｉ^４８、Ｔ^７４、及びＹ^９５）を保持した。重鎖及び軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の元の配列を維持して、他の配列を全て、ヒト配列によって置換した。ＥＰ候補の可変重鎖及び軽鎖配列を、（ＧＳＳＳＳ）_３リンカーと組み合わせて、ＥＰ／ＳｃＦｖを構築した（図１Ｃ参照）。さらに図１Ａ～図１Ｂに関して、マウスＴＮＴ－３及びヒトＴＮＴ－３鋳型のアミノ酸配列アラインメントを示す。図１Ａは、マウスＴＮＴ－３（ｍＴＮＴ－３）、ｈｕＦｄ１３８ ＨＶ、及びＥＰ重鎖のアラインメントを示す；図１Ｂは、ｍＴＮＴ－３、ｈｕ Ｂ－Ｂ１０ ＬＶ、及びＥＰ軽鎖鋳型のアラインメントを示す。各ヒト鋳型のナンバリングを、本文中に記載する。カバットの定義に基づく軽鎖及び重鎖のフレームワーク及びＣＤＲ配列を標識した。^＊は、ヒトアミノ酸で置換した残基を示す；＃は、維持したマウス残基を指す。図１Ｃは、概略的に、ＥＰ／ＳｃＦｖ中に（ＧＳＳＳＳ）_３リンカーと共に構築したＨＶ及びＬＶを示す。特に、６つのＣＤＲを単純にヒトフレームワーク中にグラフトしたＥＰ／ＳｃＦｖのみが、ファージ－ＥＬＩＳＡによって、粗ＤＮＡに対して非常に弱い反応を示した。このことは、フレームワークのそのような置換が、ＥＰ／ＳｃＦｖ親和性の大きな低下を引き起こすことを示した。

ＥＰ／ＳｃＦｖのＨ－ＣＤＲ３の突然変異、及びそのライブラリの、粗ＤＮＡに対するパンニング：ＥＰ／ＳｃＦｖの親和性を向上させるために、Ｈ－ＣＤＲ３ドメイン上の部位特異的ランダム突然変異を、１１のプライマーで行って、図２に示すランダムに突然変異したコドンを含有するものをそれぞれ、ＰＣＲによって順々に重鎖中に導入して、突然変異したＳｃＦｖの１１のサブライブラリを生成した。

１１のサブライブラリを一緒に等しく混合して、消化したラムダファージＳｕｒｆＺＡＰ ＴＭベクター中に挿入した。ＥＰ ＳｃＦｖを、ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化して、ラムダファージＳｕｒｆＺＡＰベクター中に挿入してから、切り出して、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）ベクター中に入れた。これにより、ＥＰ／ＳｃＦｖは、融合タンパク質（ＳｃＦｖ／ｃｐＩＩＩ）として発現されて、３５２の多様性を有する一般的なライブラリが作成された。パンニング用に、このライブラリを１０^１２個のクローンに増幅して、Ｍ１３ヘルパーファージで救出した。パンニングの各ラウンドの後、粗ＤＮＡへのライブラリ結合を、ファージＥＬＩＳＡによって検出した。結合の増大を、パンニング回数（ｐａｎｎｉｎｇ ｔｉｍｅｓ）の増大として観察した（図３：ファージ提示されたＥＰを、ＤＮＡコーティングしたフラスコからの溶出によって選択且つ濃縮した。各パンニングランの後、上清を、ＤＮＡでプレコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレート内でインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体を加えて、ＡＢＴＳを基質として用いてから、４０５ｎｍにてプレートを読んだ）。３ラウンドのパンニング後のライブラリの結合は、元のものの４倍であった。４ラウンドのパンニング後の回収されたクローンの９０％超は、ＤＮＡ結合がポジティブであり（図４：ファージミド粒子を、ＰＥＧ沈殿によってクローンから調製して、１％Ｂｌｏｔｔｏ／ＴＢブロッキングバッファ中に再懸濁させた。１００μｌ中１０^９ｃｆｕの各サンプルを、粗ＤＮＡでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートウェルに加えた。結合していないファージミドを、ＰＢＳＴによる洗浄によって除去した。結合したファージミドを、抗Ｍ１３ポリクローナル抗体に続く、ＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧで検出した。ＡＢＴＳを基質として用いて、酵素活性を４０５ｎｍにて測定した）、このことは、高濃縮プロセスがなされたことを示した。

ＥＰ ＩｇＧの構築、発現、及び精製：４ラウンドのパンニングからのファージＥＬＩＳＡのスクリーニング結果に基づいて、ＯＤ_４０５値が最高の１６クローンを選択して、配列決定した。配列決定分析は、１６クローンが全て、Ｈ－ＣＤＲ３内に８つの異なるヌクレオチド及びアミノ酸配列を含有することを示した。ファージＥＬＩＳＡに基づくクローン結合の判定は、精製、及びＳｃＦｖ融合タンパク質を含有するファージの量によって制限された。二価のＩｇＧよりも親和性が８～１０倍低い一価のＳｃＦｖは、この不利を増幅するであろう。親和性間の差異をさらに評価するために、結合とＨ－ＣＤＲ３上の部位突然変異との関係を理解するために、そしてＩｇＧ抗体全体の能力を回復させるために、８つの突然変異体のＳｃＦｖの全てを、グルタミン合成酵素遺伝子増幅系で発現される対応するＩｇＧ１に変換した。最も高い収率のクローンを、２４時間のＥＬＩＳＡアッセイによって選択した。細胞株を１Ｌバイオリアクタ内で増殖させる場合、ＥＰ ＩｇＧ１を含有する上清を収集して、プロテインＡ親和性クロマトグラフィによって段階的に精製した。約１０μｇ／ｍｌのＥｐ ＩｇＧを、精製後に得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイは、ＥＰ ＩｇＧ１の８つの突然変異体（本明細書中でＥＰ又はｈｕＴＮＴ ＩｇＧ１と呼ぶ）が、適切にアセンブルされていることを実証した（図５：レーン（ａ）Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ Ｍａｒｋｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）；（ｂ）ＥＰ２；（ｃ）ＥＰ７；（ｄ）ＥＰ２７．１；ｅ．ＥＰ３５．２；（ｆ）ＥＰ５１；ｇ ＥＰ５４；（ｈ）ＥＰ１０２；（ｉ）ＥＰ１０３；（ｊ）ｃｈＴＮＴ－３）。２つのバンドが、おおよそ２５及び５５ｋＤにて示され、これらはそれぞれ、Ｅｐ ＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖の分子量に相当した。

ＥＰ突然変異体の親和性のアッセイ、及び突然変異の特性評価：ＥＰ ＩｇＧ１候補の結合活性が向上したかを測定するために、発明者らは、ＥＬＩＳＡを用いて、粗ＤＮＡに対する結合活性を検出した。図６から容易に分かるように、８つの候補は全て、親和性が、ｃｈＴＮＴ－３と比較して大きく向上していた（１．４５から８倍）。ここで、粗ＤＮＡに結合するＥＰ突然変異体の相対親和度を測定するために、精製したＥＰＩｇＧ１の種々の濃度を、ＥＬＩＳＡによって試験した。用量依存的反応の曲線を得て、０．３ＯＤでの濃度を、最良適合直線式によって判定した（精製したｃｈＴＮＴ－３を基準として用いた）。相対親和度を、０．３ＯＤでのＥＰ濃度／ｃｈＴＮＴ－３濃度の比率によって表した。

親和性及び突然変異の組合せ分析は、最高の親和性の２つの候補、ＥＰ／ｍ７及びＥＰ／２７．１が、約８倍の向上を得たことを示した（対応する突然変異は、ｍ７ Ｉｌｅ→Ｈｉｓ及び２７．１ Ｇｌｙ→Ａｒｇ）（表１参照）。別の２つのクローン、すなわち、ＥＰ／３５．２及びＥＰ／ｍ１０３（３５．２ Ｔｙｒ及びｍ１０３ Ａｒｇがそれぞれ、Ｔｈｒ及びＬｅｕに変わっている）は、親和性の４倍の増大を得た。残りの４つのクローン、すなわち、ｍ５４、ｍ１０２、ｍ２、及びｍ５１（変化はそれぞれ、ｍ５４ Ａｒｇ→Ｌｅｕ、ｍ１０２ Ｔｙｒ→Ａｒｇ、ｍ２ Ｐｈｅ→Ａｒｇ、ｍ５１ Ｖａｌ→Ｓｅｒであった）もまた、ｌ．４６から２．３４倍に及ぶ親和性の増大を示した。

親和性が向上した突然変異体のＨ－ＣＤＲ３上のアミノ酸の特性の分析は、Ａｒｇ及びＨｉｓ等の正に帯電するアミノ酸が、突然変異体の４つにおいて、既存の残基を置換している一方、その他の３つの突然変異体が、ヒドロキシル基を含有するアミノ酸との置換を示すことを示した。これらの結果は、残基の静電気又は水素結合能の変化が、粗ＤＮＡに結合する抗体において観察される向上に寄与することを意味した。１つの例外的な場合（ｍ１０３）において、ＬｅｕとのＡｒｇの置換もまた、結合活性を４倍増大させた。

免疫蛍光顕微鏡検査研究：抗原ラージ細胞に対するＥＰ ＩｇＧ候補の特異性を観察するために、間接免疫蛍光染色を実行した。図７に示すように、ＥＰ ＩｇＧ候補は全て、固定ラージ細胞を染色して、染色の核パターンを与えた。ＥＰ２、７、２７．１、３５．２、５１、１０２、及び１０３は、ｃｈＴＮＴ－３と類似の顕著な核リム染色をもたらした；ＥＰ５４だけが、同質の核染色パターンをもたらさなかった。細胞質染色も細胞表面染色も、全ての調製物で認められなかった。同値な用量を用いて、免疫蛍光染色の最も強い強度の順は、５１、２、ｃｈＴＮＴ３＞７、２７．１、５４、１０２＞１０３、及び３５．２であった。これは、粗ＤＮＡへの結合の結果と全く異なる。ＥＬＩＳＡ研究において粗ＤＮＡへの親和性が最高であったＥＰ７及び２７．１は、固定ラージ細胞への対応する反応を示さなかったが、粗ＤＮＡへの親和性が比較的低かったＥＰ５１及び２は、興味深いことに、最も強い染色パターンをもたらした。

ＲＩＡによるＥＰの結合力定数（Ｋａ）の判定：免疫蛍光染色の結果に基づいて、ラージ細胞に最高の親和性を示した２つのＥｐ ＩｇＧ候補（ＥＰ５１及びＥＰ２）の結合力定数（Ｋａ）を、ＲＩＡによって判定した。双方のＥＰ ＩｇＧ候補を、^１２５Ｉで標識して、固定ラージ細胞とインキュベートして、結合放射活性を用いて、結合力定数を算出した（図８）。ＥＰ５１及びＥＰ２の結合力定数はそれぞれ、２．８×１０^９Ｍ^－１及び２．１×１０^９Ｍ^－１であった。ＥＰ５１及びＥＰ２は、結合力定数が１．４×１０^９Ｍ^－１であるｃｈＴＮＴ３よりも強い、抗原ラージ細胞への親和性を示した。ＥＰ５１及びＥＰ２のＫａ値は、粗ＤＮＡ及び抗原ラージ細胞への反応と一致し、そしてｃｈＴＮＴ－３と類似した。

図９Ａ及び図９Ｃは、Ｉ－１２５標識ヒト化抗体を用いた結腸２６－マウスにおける生体内分布研究を示しており、３日後の生体内分布である。図９Ｂ及び図９Ｄは、７日後の生体内分布を示す。データを、様々な時点後の、注射した用量／グラム、及び正常な臓器対腫瘍比（ｎ＝５頭のマウス）として示す。

３、５、そして７日目での腫瘍における特異的且つ安定した吸収を示すＬＳ１７４Ｔ結腸癌ヌードマウス（ｎ＝５）におけるＥＰ５１ヒト化抗体の生体内分布分析を、図１０に示す。比較すると、正常な臓器は、標識抗体の吸収の低下を示した。これは、血液プールからのクリアランスを、そしてオフターゲット結合がないことを示している。生体内分布分析はさらに、ＥＰ５１が、表２に示すように、ｃｈＴＮＴ－３に類似の生体内分布特性を有することを示した。

ＬＳ１７４ＴモデルにおけるＥＰ５１のパーセント腫瘍吸収は、２日目及び５日目までに、それぞれ５．９０及び４．９７であり、ｃｈＴＮＴ３（５．６２及び４．２８）と匹敵した。血液吸収パーセントもまた、量が非常に類似した。しかしながら、ＥＰ２の腫瘍吸収パーセントは、ＫａがｃｈＴＮＴ－３よりも１．５倍高いにも拘らず、ｃｈＴＮＴ－３よりもかなり低いようであった。２日目及び５日目までに、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデルにおけるＥＰ２の腫瘍吸収パーセントは、それぞれ２．６９及び１．３３であった。これらは、ｃｈＴＮＴ－３よりもかなり低い。ＥＰ２７．１サブクローン及びＥＰ３５．２サブクローンについて図９に、そしてＥＰ５１について図１０に示す更なる生体内分布研究は、ｃｈＴＮＴ－３及び完全ヒトＴＮＴ抗体ＮＨＳ７６の双方と比較した、腫瘍における吸収の増強を、とりわけＥＰ５１について実証した。印象的に、ＥＰ５１は、３日目から７日目まで、注射用量／グラムの下落％がごく僅かであったことから、本ヒト抗体は、腫瘍によってかなり保持された一方、正常な組織における吸収は、負の結合及び血液からのクリアランスに起因して、反応性を失ったことが実証された。

先のデータから分かるように、ＨＶ及びＬＶ中のヒト化フレームワークの配列が、ｍＴＮＴ３に対してそれぞれ８１％及び７４％同じであるにも拘らず、フレームワーク置換に続く６つのＣＤＲのグラフトによる初期のヒト化ＴＮＴ－３構築体のみが、僅かに検出可能な親和性を示した。この発見は、単純な６つのＣＤＲのグラフトによるヒト化が、ＣＤＲの元の高次構造を変えたことを示唆する。親和性を回復させるために、Ｈ－ＣＤＲ３の部位特異的ランダム突然変異を、一組のプライマーによって導入した。Ｈ－ＣＤＲ３が突然変異したＥＰ ＳｃＦｖのライブラリを、ラムダファージ上に提示させた。粗ＤＮＡに対する４ラウンドの選択の後、初期のヒト化ＴＮＴ－３の検出可能限界の（ｍａｒｇｉｎａｌ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）親和性と比較して、親和性がかなり高い８つの突然変異体を効率的に濃縮した。

結合粗ＤＮＡのＥＬＩＳＡ研究は、８つの突然変異体が全て、親抗体ｃｈＴＮＴ－３よりもずっと高い親和性を示す（１．４５から８．２５倍）ことを示した。Ｈ－ＣＤＲ－３配列の分析は、親和性が高いほとんどの突然変異が、正に帯電するアミノ酸、例えば、Ａｒｇ及びＨｉｓ、又はヒドロキシル基を含有するアミノ酸で置換されていることを示した。これらの結果は、残基の静電気又は水素結合能の変化が、粗ＤＮＡへの抗体結合の向上に寄与しているかもしれないことを示唆した。興味深いことに、親和性が最良の２つの突然変異体、ＥＰ７及びＥＰ２７．１は、ＥＰ２７．１ Ｇｌｙ→Ａｒｇ及びＥＰ７ Ｉｌｅ→Ｈｉｓの対応する突然変異の後に、親和性の８倍の向上を得た。結合ＤＮＡに対するアミノ酸Ａｒｇ及びＨｉｓの潜在的役割は、マウス及びヒトの双方の抗ＤＮＡ自己抗体において強調された。Ａｒｇは、ＤＮＡ結合において最も重要且つ可変性のアミノ酸である。これは、塩基対形成されるグアニン、並びに対形成されないシトシン及び塩基対形成されるシトシンとの水素結合を形成し、そして主要な、又はマイナーなＤＮＡ溝中に、ＤＮＡ糖リン酸骨格との、且つ可撓性のある側鎖との広範囲にわたる相互作用を通して嵌合して、結合(biding)を促進することができる。これは部分的に、Ａｒｇによる同じ置換を有するＥＰ２７．１、ＥＰ２、及びＥＰ１０２の親和性向上を説明し得る。しかしながら、１つの例外的な場合において、ＬｅｕによるＡｒｇ１０４の置換もまた、結合活性を４倍増大させた。明らかに、Ａｒｇ置換の単純な蓄積は、結合ＤＮＡの親和性を増大させない。Ａｒｇ １０４→Ｌｅｕの修飾は、ＤＮＡとの相互作用にとってより良好な位置内に、Ａｒｇ１０５を配置し得る。

ファージディスプレイ及び結合選択由来のＥＰ突然変異体のＣＤＲ３上の突然変異部位の分析は、Ｈ－ＣＤＲ３内の残基９８～１００、１０５、１０６、及び１０８が最も保存されていること、そして置換が主に、残基１０１～１０４、１０７、及び１０９にて起こっていることを示した。これに対して、最も高い頻度の突然変異は、残基１０１、１０４、１０６、及び１０９にて観察された。完全な保存的残基は、抗原に直接接触する役割を果たし得、そして特異性を決定するようにより寄与し得る。発明者らはまた、元のＨ－ＣＤＲ３が、２つのＡｒｇ残基（Ａｒｇ１０４、Ａｒｇ１０５）を含有することを見出した。これは、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体が、少なくとも１つ、そしてほとんどの場合２つ又は３つのＡｒｇをＨ－ＣＤＲ３内に有することと一致する。Ａｒｇ１０４は置換され得、そしてＡｒｇ１０５は保存される。保存Ａｒｇ１０５は、Ｈ－ＣＤＲ３の中心に位置決めされて、水素結合及び塩架橋を介してＤＮＡと効果的に相互作用することができるような位置にあった。他の保存残基と組み合わされた保存Ａｒｇ１０５は、ＤＮＡ特異的結合の重大な役割を果たし得、そして高い突然変異頻度の残基が、抗体の親和性を調節するようにより寄与し得る。

ＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光染色における突然変異体の反応性強度の異なる順序、及びラージ細胞における分布の異なるパターンは、同じ抗原に対する一部の突然変異体のエピトープが、Ｈ－ＣＤＲ３の突然変異に起因して変化又はシフトしていることを示した。これを、選択用に粗ＤＮＡを用いて試験した。選択用に粗ＤＮＡを用いる決定は、ラージ細胞核に由来するｃｈＴＮＴ３が、大部分は一本鎖ＤＮＡに結合することができるという証拠に基づいた。ｃｈＴＮＴ－３が粗ＤＮＡへの強い反応を示したが、ｃｈＴＮＴ－３は、核内の複合体形態ＤＮＡにより結合する傾向があり得る。ＥＰ／ｍ５１は、粗ＤＮＡ及びラージ細胞に対するｃｈＴＮＴ－３の親和性が約２倍であり、ｃｈＴＮＴ－３へのインビボ生体内分布特性が類似することを示した。ＥＰ／ｍ５１の腫瘍吸収％もまた、ｃｈＴＮＴ－３よりも良好である傾向があった。これは全て、突然変異と組み合わせた、ＣＤＲグラフトによるｍＴＮＴ－３のヒト化が成功したことを、そして親和性が向上したヒト化Ｅｐ抗体が得られたことを示唆した。

したがって、（１）Ｈ－ＣＤＲ３上の突然変異は、ヒト化抗体の親和性を向上させる効率的な方法であること；（２）特異性が同じであり、且つ親和性がより高い１つのヒト化突然変異体（ＥＰ５１）が得られ、これは、臨床能にインビボで必要とされる良好な生体内分布プロファイルを示すこと；（３）結果は、同じ抗原の異なるエピトープに対するヒト化抗体が、同時に得られ得ること、そしてＣＤＲ３の突然変異に起因するヒト化抗体の特異性シフトのリスクが、適切な抗原を選択することによって回避又は制御され得ることを示すこと；並びに（４）ＥＰ突然変異体の特異性及び親和性を研究することによって得た情報は、核抗原へのｃｈＴＮＴ３結合についての知識を広げ、そしてＥＰ親和性及び特異性を向上させるのに有用であることが理解されるべきである。最後に、腫瘍マウスにおける生体内分布研究は、一候補、ＥＰ３５．２が、腫瘍における吸収が高くて優れており、研究の７日後の保持が良好であり、そしてこの実験腫瘍モデルにおけるｃｈＴＮＴ－３又は完全ヒトＮＨＳ７６よりもインビボで優れているようであることを示した。

一部の実施形態において、本発明の特定の実施形態を説明し、且つ特許請求するのに用いられる成分、特性、例えば濃度、反応条件その他の量を表す数値は、場合によっては、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、一部の実施形態において、明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。一部の実施形態において、数値パラメータは、報告される有意桁の数を考慮して、そして通常の四捨五入技術を用いることによって、解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにも拘らず、具体例に示される数値は、実行可能なほど正確に報告されている。本発明の一部の実施形態において示される数値は、それぞれの試験測定において見出される標準偏差に必然的に由来する特定の誤差を含有してよい。

本明細書中の記載に、そしてこれに従う特許請求の範囲の全体を通して用いられる「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照を含む。本明細書中の説明に用いられる「ｉｎ」の意味もまた、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。また、本明細書中で用いられる用語「に結合した」は、文脈上、そうでないとする指示がない限り、直接的な結合（２つの要素が、互いに接触して互いに結合する）及び間接的な結合（少なくとも１つの付加的な要素が、２つの要素間に位置決めされる）の双方を含むことが意図される。したがって、用語「に結合した」及び「と結合した」は、同義的に用いられる。

既に記載されるもの以外のより多くの修飾が、本明細書中で発明概念を逸脱しない範囲で可能であることは、当業者に明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて、制限されるべきでない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する際に、全ての用語は、文脈に合わせて最も広く可能なように解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含んでいる」は、要素、構成要素、又は工程に、非排他的に言及すると解釈されるべきであり、このことは、当該要素、構成要素、又は工程が、明示的に言及されていない他の要素、構成要素、又は工程と存在してもよいし、利用されてもよいし、組み合わされてもよいことを示す。本明細書又は特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つを指す場合、本文は、ＡプラスＮでもなく、ＢプラスＮその他でもない当該群由来の唯一の要素を必要とすると解釈されるべきである。

Claims (9)

1. 免疫刺激剤治療剤及びヒト化抗体の抗原結合部分を含むハイブリッド分子であって、
   前記免疫刺激剤治療剤は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニストまたはＩＬ－１２を含み、
   前記ヒト化抗体は、配列番号１で表されるＨ－ＣＤＲ１配列、配列番号２で表されるＨ－ＣＤＲ２配列、アミノ酸突然変異を有するＨ－ＣＤＲ３配列、配列番号４で表されるＬ－ＣＤＲ１配列、配列番号５で表されるＬ－ＣＤＲ２配列及び配列番号６で表されるＬ－ＣＤＲ３配列を含み、
   アミノ酸突然変異を有さないＨ－ＣＤＲ３配列は、配列番号３で表され、
   前記アミノ酸突然変異を有するＨ－ＣＤＲ３配列は、⁹Phe→Arg、³Ile→His、⁴Gly→Arg、¹¹Tyr→Thr、⁵Val→Ser、⁶Arg→Thr、¹¹Tyr→Arg及び⁶Arg→Leuからなる群から選択される一つのアミノ酸突然変異を有するものであり、ここで、前記アミノ酸突然変異の番号は、配列番号３における対応するアミノ酸の位置を示す、ヒト化抗核抗体。
2. 前記抗原結合部分は一本鎖ＤＮＡに特異的な結合親和性を有する、請求項１に記載のハイブリッド分子。
3. 前記ヒト化抗体は、
   と少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むＶＨ配列を有する、請求項１に記載のハイブリッド分子。
4. 前記ヒト化抗体は、
   と少なくとも９６％の同一性を有する配列を含むＶＬ配列を有する、請求項１に記載のハイブリッド分子。
5. 前記抗体の前記少なくとも結合部分は、完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆａｂ_２フラグメント、又はｓｃＦｖである、請求項１に記載のハイブリッド分子。
6. インビボで腫瘍微環境内の壊死腫瘍細胞の標的化に使用するための、請求項１に記載のハイブリッド分子。
7. 前記腫瘍が固形腫瘍を含む、請求項６に記載のハイブリッド分子。
8. 薬学的に許容可能な担体と請求項１に記載のハイブリッド分子を含む医薬組成物。
9. 壊死細胞をエクスビボで標的とする方法であって、請求項１に記載のハイブリッド分子と前記壊死細胞を接触させることを含む方法。