JP7627556B2 - 測定方法、測定装置、及び測定プログラム - Google Patents

Description

本明細書には、測定方法、測定装置、及び測定プログラムが開示される。

特許文献１には、自動血球計数装置において、フローサイトメータにより血球を計数する際に、蛍光強度の差が生じる血球を蛍光色素で染色し、散乱光と蛍光との強度差を用いて、骨髄有核細胞、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を、それぞれ分類して計数することが記載されている。また、特許文献１には、脂質粒子が測定試料に含まれる場合であっても、脂質粒子は蛍光色素によって染色されないため、蛍光強度の差を利用して骨髄有核細胞、赤芽球系細胞及び白血球系細胞と、脂質粒子とを区別できることが記載されている。

特開2002-223791号公報

しかしながら、蛍光色素を使用しない測定モードでは、測定試料に脂質粒子が含まれる場合に、有核細胞の計数結果が脂質粒子の影響を受ける場合がある。
本発明は、蛍光色素を使用せずに調製した測定試料に脂質粒子が含まれる場合であっても、測定試料に含まれる粒子数の正確な測定結果を提供可能な測定方法、測定装置、及び測定プログラムを提供することを課題とする。

本発明のある実施形態は、蛍光色素を使用せずに調製した測定試料中の粒子数を測定する測定方法に関する。前記測定方法は、図２に示すように、前記測定試料に含まれる個々の粒子からフローサイトメータによって取得した、各粒子における光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得すること、を含む。

本発明のある実施形態は、蛍光色素を使用せずに調製した測定試料中の粒子数を測定する測定装置（２００）に関する。測定装置（２００）は、図７に示すように、フローサイトメータ（２３０）と処理部（２０１）を備える。処理部（２０１）は、前記測定試料に含まれる個々の粒子からフローサイトメータ（２３０）によって取得した、各粒子における光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得する。

本発明のある実施形態は、蛍光色素を使用せずに調製した測定試料中の粒子数を測定する測定プログラムに関する。前記測定プログラムは、図２に示すように、コンピュータに実行させたときに、前記測定試料に含まれる個々の粒子からフローサイトメータによって取得した、各粒子における光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得するステップ、を実行する。

これらの実施形態によれば、フローサイトメータによって取得した、各粒子における散乱光に関する複数の測定値から、測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得することができる。

本発明によれば、光散乱に関する特徴値に基づいて測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得することにより、蛍光色素を使用しない測定モードによって脂質粒子を含む測定試料を測定する場合であっても正確な粒子数の測定結果を提供することができる。

スキャッタグラムの例を示す。（Ａ）は側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示す。（Ｂ）は、前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）により示したスキャッタグラムを示す。（Ｃ）は、脂質粒子ドットが識別されたスキャッタグラムを示す。 脂質粒子に関する情報の取得方法の例を示す。（Ａ）は、ｘ軸方向を前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）とし、ｙ軸方向を前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）としたスキャッタグラムを示す。（Ｂ）は、変換後の二次元ドットプロットを示す。（Ｃ）は、（Ｂ）を第１主成分方向に投影したヒストグラムを示す。 （Ａ）は脂質粒子を含む測定試料から得られたヒストグラムの例である。（Ｂ）は脂質粒子を含まない測定試料から得られたヒストグラムの例である。 抽出された脂質粒子ドット群の色（コントラスト）を変えて表示した例を示す。 （Ａ）有核細胞数が多い検体における側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示す。（Ｂ）有核細胞数が多い検体における前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示す。（Ｃ）（Ｂ）のスキャッタグラムを回転し、投影したヒストグラムを示す。 測定システム１００の外観を示す。 測定システム１００のハードウエア構成を示す。 ＦＣＭ検出部２３０の構成を示す。 測定プログラムの処理の流れを示す。 測定プログラムの解析処理の流れを示す。 脂質粒子領域の設定及び脂質粒子ドットの抽出処理の流れを示す。 （Ａ）に各検体の最大極大値、極大値、分画位置を示す。（Ｂ）は、脂質粒子を含む４検体の対策前と対策後の側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示す。 （Ａ）は、各データ群における脂質粒子陽性検体の頻度を示す。（Ｂ）は脂質粒子陽性検体の中で、脂質粒子の含有量が最も少なかった検体（＃6）と脂質粒子の含有量が最も多かった検体（＃7）の側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムと、前方散乱光信号のパルス幅－前方散乱光信号のパルスピークのスキャッタグラムを示す。 末梢血検体について、ＤＩＦＦモードで測定した白血球数（ＷＢＣ－Ｄ）、通常のＣＢＣモードで測定した白血球数（ＷＢＣ－Ｃ補正前）、本実施形態の測定方法で補正した後の白血球数（ＷＢＣ－Ｃ補正後）を示す。

１．測定方法
（１）測定方法の概要
本発明の一実施形態は、測定試料中の粒子数を測定する測定方法に関する。本実施形態における粒子数の測定は、後述する図８に示すフローサイトメータ（ＦＣＭ）検出部２３０を備える全自動血球計数装置である測定システム１００を用いて行われる。本実施形態において、粒子数の測定は、全自動血球計数装置におけるＣＢＣ測定モードにより行われ、この場合の計数の対象となる粒子とは白血球である。後述する図７に示す測定システム１００は、ＣＢＣ測定モードに加えて、白血球分類（ＤＩＦＦ）測定モードを含む複数の測定モードから、ユーザによって選択された一又は複数の測定モードによって検体に含まれる血球を計数可能である。測定システム１００は、測定装置２００が備える試料調製部２２０によって測定モードに応じて異なる試薬を用いて測定試料を調製する。ＤＩＦＦ測定モードにおいて調製される測定試料は粒子を染色するための蛍光色素、具体的にはポリメチン系色素を含むが、ＣＢＣ測定モードにおいて調製される白血球測定用の測定試料は蛍光色素を含まない。本実施形態では、測定システム１００が、ＣＢＣ測定モードにおいて蛍光色素を含まない白血球測定用の測定試料を試料調製部２２０によって調製し、測定試料に含まれる白血球と脂質粒子とを蛍光パラメータを用いずに分画する例を説明する。

本測定方法は、後述する図８に示すＦＣＭ検出部２３０を用いて、フローセル230jを流れる測定試料中の粒子にレーザ光を照射し、粒子から生じる光散乱を検出し、測定試料中の粒子の数を計数する。光散乱に関するパラメータは複数ある。パラメータには、例えば前方散乱光、側方散乱光等の散乱方向によって定義されるパラメータが含まれる。前方散乱光とは、光を粒子に照射した場合に、照射光の進行方向に対して前方に散乱した光をいう。側方散乱光とは、光を粒子に照射した場合に、照射光の進行方向に対して側方に散乱した光をいう。また、光散乱に関する他のパラメータとして、軸方向光損失がある。軸方向光損失とは、粒子がレーザを横切ったときの光散乱による受光部側の受光量の減少を定量化したパラメータである。それぞれの光散乱パラメータについて、信号の経時変化をあらわす波形を取得し、個々の粒子に対応したパルスの形状を解析することでパルスピーク（ピーク高さともいう）、パルス幅（分布幅ともいう）等の値が特徴値として得られる。前方散乱光信号のパルスピークは、主に粒子の大きさを表す特徴値である。側方散乱光信号のパルスピークは、粒子内部の構造の複雑さを表す特徴値である。前方散乱光信号のパルス幅は、粒子がフローセル内の光が照射されている領域を通過している時間を示す特徴値であり、粒子の長さを反映する。

各粒子について取得された光散乱の特徴値は、例えばスキャッタグラム（二次元ドットプロット）として示される。図１（Ａ）は、ＣＢＣ測定モードで調製した白血球測定用試料をＦＣＭ検出部２３０に測定試料を供しＣＢＣ測定モードで測定した粒子群の側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示している。すなわち、各ドットはｘ軸方向を側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）とし、ｙ軸方向を前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）としたときの各粒子の座標を示している。図１（Ａ）に示す点線で囲まれた領域内に含まれるドットは、淡い色で示されており、ＣＢＣ測定モードにおいて、「白血球数」としてカウントされる。点線で囲まれた領域を以下「カウント領域」と呼ぶことがある。図１（Ｂ）は、前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）により示したスキャッタグラムである。すなわち、各ドットはＸ軸方向を前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣＷ）とし、Ｙ軸方向を前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）としたときの各粒子の座標を示している。

図１（Ａ）の破線Xで囲まれた領域内のドットは、すべて淡い色で示されている。本発明者らは、図１（Ｃ）に示すように、本来であれば脂質粒子として分類されるべき濃い色で示されるドット（脂質粒子ドットと呼ぶ）を含む領域が白血球カウント領域と重なっていることを見出した。図１（Ａ）では脂質粒子ドットが白血球カウント領域と重なっており、区別できていない。このため、脂質粒子ドットも白血球数としてカウントされるおそれがある。また、図１（Ｂ）においても破線X内の脂質粒子ドットが点線Yで示される白血球ドットの分布領域が重なっている。

白血球ドットの分布領域に重なっている脂質粒子ドットを検出するため、本測定方法では、測定試料に含まれる個々の粒子から、上述した光散乱に関する複数の特徴値を取得した後、取得した光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得する。

図２を参照して、脂質粒子に関する情報の取得方法の例を説明する。便宜上、前方散乱光信号のパルス幅の測定値と、前方散乱光信号のパルスピークの測定値を用いて、脂質粒子に関する情報の取得方法を説明する。

図２（Ａ）は、ｘ軸方向を前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）とし、ｙ軸方向を前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）としたスキャッタグラムである。図２（Ａ）に示す各ドットの座標は（ｘ，ｙ）＝（前方散乱光信号のパルス幅の測定値，前方散乱光信号のパルスピークの測定値）で表される。
第１ステップとして、各ドットの二次元座標（ｘ，ｙ）を回転行列により変換し、変換後の座標として二次元座標（ｘ’，ｙ’）を得る。

変換式は、

で表される。ここでθは、回転行列の回転角度を示す。
変換後の二次元座標（ｘ’，ｙ’）の二次元ドットプロットは、図２（Ｂ）に示すプロットとなる。

回転角度θは、変換後の座標群の分散が最大となるように設定される。より具体的には、θは次元変換により、好ましくは主成分分析により決定される。主成分分析によって、次元変換を行う場合、ｘ’軸方向は、第１主成分（ＰＣＡ１）を表し、ｙ’軸方向は、第２主成分（ＰＣＡ２）となる。

また、変換前の二次元ドットプロットは、各軸のスケールが、例えば０から２５５までのチャンネルで表されるが、変換後のｘ’軸のスケールは、例えば０から２５５までのチャンネルの表示範囲を０から５０までのチャンネルに制限している。

回転角度θは、測定試料ごとに決定してもよいが、あらかじめ設定し、すべての測定試料に同じ回転角度を適用してもよい。回転角度θをあらかじめ設定する場合には、１０．２°から１０．５°程度とすることができる。回転方向は、回転角度θが正の値である場合には、反時計回り方向へ回転することを意図し、回転角度θが負の値である場合には、時計回り方向へ回転することを意図する。

このような変換を行うことにより、図２（Ａ）において白血球カウント領域と重なっていた脂質粒子ドットを、図２（Ｂ）に示す変換後の二次元座標（ｘ’，ｙ’）の二次元ドットプロット上にｘ’軸における境界線Ａを引くことにより、境界線Ａに対してｘ’軸高値側に位置する白血球カウント領域と、境界線Ａに対してｘ’軸低値側（原点側）に位置する脂質粒子ドットの領域とを分離することができることを本発明者らが見出した。

第２ステップとして、変換後の二次元ドットプロットを第１主成分方向に投影する。第１主成分方向に投影することは、変換後の二次元座標（ｘ’，ｙ’）において、すべてのドットのｙ’を「０」とすることを意図する。このようにすることで、図２（Ｃ）に示すヒストグラムが得られる。図２（Ｃ）のヒストグラムに境界線Ａを引くことにより、ｘ’軸高値側に位置する白血球カウント領域と境界線Ａに対してｘ’軸低値側に位置する脂質粒子ドットの領域とを分離することができ、図２（Ｂ）に示した二次元ドットプロットの場合よりも明瞭に見分けることができる。なお、図２（Ｂ）に示した境界線Ａと図２（Ｃ）に示した境界線Ａは、白血球カウント領域と脂質粒子ドットの領域の境界線として共通の破線で示している。

第３ステップとして、第２ステップで得られたヒストグラムを使って脂質粒子群が存在するか否かの判定を行う。図３を用いて第３ステップの例を説明する。図３（Ａ）は脂質粒子を含む測定試料から得られたヒストグラムの例であり、図３（Ｂ）は脂質粒子を含まない測定試料から得られたヒストグラムの例である。

例えば、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）のヒストグラムの右端側において、第２ステップで得られたヒストグラムに対してピーク（ａ）の解析を行う。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示す▼は、ピーク解析により取得されたピーク位置を示す。

次に、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）のヒストグラムの左端（チャンネル０）に示す（ｂ）において、検出されたピークのピーク位置の中で、最も高いピーク位置を特定する。最も高いピーク位置は、本来の目的とする細胞群に由来するピークである。続いて、ヒストグラムの左端（チャンネル０）から、最も高いピーク位置までの間に別のピークＱがあるか否かを探索する。図３（Ａ）では、チャンネル０から最も高いピーク位置のチャンネルまでの間に別のピークＱがあるため、脂質粒子群があると判定することができる。また、図３（Ｂ）では、チャンネル０から最も高いピーク位置のチャンネルまでの間に別のピークＱがないため、脂質粒子群がないと判定できる。

さらに、図３（Ａ）及び（Ｂ）のヒストグラムの左端（チャンネル０）に示す（ｂ）において、脂質粒子群があると判定された場合、図３（Ａ）のヒストグラムの左端（チャンネル０）と右端の間に示す（ｃ）において、細胞群と脂質粒子群を分画するための、ボトム（極小値）を探索する。ボトム（極小値）の探索は、好ましくは、最も高いピーク位置のチャンネルと図３（Ａ）のヒストグラムの左端（チャンネル０）に示す（ｂ）の探索で検出された別のピークＱの位置のチャンネルとの間で行われる。ボトム（極小値）を分画位置とすることにより、変換前の二次元ドットプロットから脂質粒子ドット群を抽出することができる。

第４ステップでは、第３ステップにおいて抽出された脂質粒子ドット群について、脂質粒子に関する情報を生成する。図４に、側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）の二次元ドットプロットにおいて、抽出された脂質粒子ドット群の濃淡を変更して表示した例を示す。白血球数カウント領域に重なった脂質粒子ドット群が濃い色で示され識別できている。この識別された脂質粒子ドットをカウントすることにより、脂質粒子に関する情報を生成する。脂質粒子に関する情報は、測定した粒子群における脂肪粒子の有無、または含有量等に関する定性的、半定量的、または定量的な情報を含む。好ましくは、脂質粒子に関する情報は、測定した粒子群における脂質粒子の存在比率、または脂質粒子の数である。

第５ステップでは、脂質粒子に関する情報に基づいて、脂質粒子が存在するか否かの判定結果に基づく情報、または白血球数カウントから脂質粒子ドット群のカウントを除いた白血球数カウントの補正値を生成する。

脂質粒子が存在するか否かの判定結果に基づく情報は、白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報である。白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報は、白血球数の測定値に脂質粒子のカウントが含まれているか否かを示すラベルである。また、白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報は、計数された白血球に含まれる脂質粒子の量を半定量的、または定量的に示すラベルであってもよい。半定量的とは、例えば、脂質粒子含有量が「多い」または「少ない」等で表すことができる。あるいは、白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報は、脂質粒子に関する情報に応じた、白血球数の測定値に対する信頼度であってもよい。例えば、脂質粒子が検出されなかった場合や少ない場合には「信頼度が高い」ことを示すラベルを示すことができる。また、脂質粒子が中程度から高い場合には「信頼度が低い」ことを示すラベルを示すことができる。

白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報は、あらかじめ設定した所定の値、例えば前記脂質粒子の存在比率が検出された全粒子の３％以上であるとき、または前記脂質粒子の数が、白血球数に対して所定の割合、例えば３％以上であるときに出力する。好ましくは、白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報は、脂質粒子の数が５０以上であって、かつ前記脂質粒子の存在比率が全粒子数の３％以上であるとき、または前記脂質粒子の数が、白血球数の３％以上であるときに出力する。

（２）変形例
上記第３ステップに示す脂質粒子群の検出を行うと、図５（Ａ）及び図５（Ｂ）に示すように、測定試料に含まれる有核細胞数が多い場合、特にリンパ球数が多い場合、リンパ球カウント領域のピークと脂質粒子のピークの区別がつきにくいことがある（図５（Ｃ）参照）。この場合、脂質粒子のピークを探索する際あらかじめ設定された範囲に探索範囲を限定し、脂質粒子に関する情報を生成することが好ましい。脂質粒子のピークは、リンパ球のピークが現れる領域よりもＰＣＡ１軸低値側に出現することが多いため、脂質粒子のピークの探索範囲を、リンパ球の極大値出現領域の低値側に限定して探索してもよい。

さらに、前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）の二次元ドットプロットにおいて、脂質粒子ドットが出現する領域にマラリア原虫に感染した赤血球が出現することがある。マラリア原虫に感染した赤血球は、側方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）の二次元ドットプロットにおいては、他の粒子と鑑別が可能であり、カウントが可能であるため、脂質粒子のカウントからマラリア原虫に感染した赤血球のカウントを差し引いて、脂質粒子に関する情報を取得することができる。

２．測定システム
２－１．測定システムの構成
本発明のある実施形態は、血球を含む測定試料中の細胞数を測定する測定システム１００（以下、単に「測定システム１００」とする）に関する。本実施形態の測定システム１００の外観を図６に示す。測定システム１００は、測定装置２００と、タッチパネル式のディスプレイ３００と、を備えている。測定システム１００のハードウエア構成を図７に示す。測定システム１００は、入力部３１１及び出力部３１２を含むディスプレイ３００に接続されている。

（２）測定装置２００のハードウエア構成
測定装置２００において、検体吸引部２１０と、試料調製部２２０と、ＦＣＭ検出部２３０と、処理部２０１と、記憶部２０２と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２０７は、バス２０９によって互いに通信可能に接続されている。記憶部２０２は、前記測定値や回転行列の回転角度θ、回転角度θを算出するためのアルゴリズム、ピーク解析プログラムを含む測定プログラム２０２ｂを記憶する。

検体吸引部２１０は、検体を収容した検体容器からノズルを介して検体を吸引し、試料調製部２２０が備える反応槽に分注する。試料調製部２２０は、反応槽に試薬を供給し、検体と試薬を混合することで測定試料を調製する。試料調製部２２０が使用する試薬は、測定モードによって異なる。試料調製部２２０は、ＣＢＣ測定モードにおいて白血球を計数するための測定試料を調製するために、試薬として希釈液と溶血剤を検体と混合する。試料調製部２２０は、ＤＩＦＦ測定モードにおいて白血球を分類計数するための測定試料を調製するために、試薬として希釈液と溶血剤と蛍光色素を検体と混合する。ＣＢＣ測定モードにおいて調製される測定試料は、蛍光色素を含まない。

処理部２０１は、測定装置２００のＣＰＵである。処理部２０１は、ＧＰＵと協働してもよい。処理部２０１が、記憶部２０２に記憶されているオペレーションシステム（ＯＳ）２０２ａと協働して測定プログラム２０２ｂを実行し、取得されるデータの処理を行う。

記憶部２０２は、ハードディスクで構成されている。記憶部２０２には、処理部２０１により実行される測定プログラム２０２ｂ及びこれに用いるデータが記録されている。ＲＯＭは、測定装置２００の起動時に、処理部２０１によって実行されるブートプログラムや測定装置２００のハードウエアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。

入力Ｉ／Ｆ２０６は、シリアルインタフェース、パラレルインタフェース、及びアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ２０６は、入力部３１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、記憶部２０２に記憶される。

入力部３１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、測定装置２００に文字入力または音声入力を行う。入力部３１１は、測定装置２００の外部から接続されても、測定装置２００と一体となっていてもよい。

出力Ｉ／Ｆ２０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ２０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ２０７は、処理部２０１が生成した情報を出力部３１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ２０７は、処理部２０１が生成し、記憶部２０２に記憶した情報を、出力部３１２に出力する。

出力部３１２は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、ＦＣＭ検出部２３０から送信される検出結果及び測定装置２００における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。

記憶部２０２には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。本実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、測定装置２００は、パーソナルコンピュータ等であり得る。

測定システム１００を構成する測定装置２００のＦＣＭ検出部２３０が別所に配置され、これらがネットワークで接続されていてもよい。

（３）ＦＣＭ検出部
図８は、ＦＣＭ検出部２３０のハードウエア構成を示す。ＦＣＭ検出部２３０は、本明細書において、フローサイトメータ２３０と称することがある。
ＦＣＭ検出部２３０は、図８に示すように、フローセル２３０ｊと、検出部２３０ａと、照射光学系２３０ｅと、受光光学系２３０ｋと、信号処理回路２３０ｐと、を備えている。

フローセル２３０ｊは、試料調製部２２０により調製された測定試料を流す。レーザダイオード２３０ｉから出射されたレーザ光は、フローセル２３０ｊを流れる測定試料に照射される。測定試料にレーザ光が照射されると、測定試料中の粒子から光が生じる。検出部２３０ａの光検出器２３０ｂ～２３０ｄは、それぞれ、測定試料中の粒子から生じた前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）及び側方蛍光（ＳＦＬ）を受光することにより、レーザ光が照射された測定試料中の粒子から光学情報を取得する。

照射光学系２３０ｅは、コリメータレンズ２３０ｆと集光レンズ２３０ｇを備える。コリメータレンズ２３０ｆは、レーザダイオード２３０ｉから出射されたレーザ光を平行光に変換する。集光レンズ２３０ｇは、平行光に変換されたレーザ光を集光してフローセル２３０ｊに照射する。このように、照射光学系２３０ｅは、レーザダイオード２３０ｉから出射されたレーザ光を、フローセル２３０ｊを流れる測定試料に照射する。測定試料にレーザ光が照射されると、測定試料中の粒子から、前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）が生じる。

受光光学系２３０ｋは、ビームストッパ２３０ｌと、集光レンズ２３０ｍと、ダイクロイックミラー２３０ｎと、分光フィルタ２３０ｏと、を備える。ビームストッパ２３０ｌは、フローセル２３０ｊに照射されたレーザ光のうち、粒子に照射されずにフローセル２３０ｊを透過したレーザ光を遮断する。光検出器２３０ｂは、フォトダイオードである。光検出器２３０ｂは、前方散乱光（ＦＳＣ）を受光し、前方散乱光（ＦＳＣ）の強度に応じた電気信号を出力する。

集光レンズ２３０ｍは、側方散乱光（ＳＳＣ）を集光する。ダイクロイックミラー２３０ｎは、側方散乱光（ＳＳＣ）を反射する。光検出器２３０ｃは、フォトダイオードである。光検出器２３０ｃは、側方散乱光（ＳＳＣ）を受光し、側方散乱光（ＳＳＣ）の強度に応じた電気信号を出力する。光検出器２３０ｄは、アバランシェフォトダイオードである。このように、受光光学系２３０ｋは、測定試料から生じた光を検出部２３０ａの光検出器２３０ｂ～２３０ｄに導く。ここで、光検出器２３０ｂ～２３０ｄは、光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ）としてもよい。

信号処理回路２３０ｐは、光検出器２３０ｂ～２３０ｄから出力された電気信号に対して所定の信号処理を施すことにより、それぞれ、前方散乱光（ＦＳＣ）信号及び側方散乱光（ＳＳＣ）信号に対応する特徴値、すなわちパルスピーク及びパルス幅を取得する。具体的には、信号処理回路２３０ｐは、光検出器２３０ｂから経時的に出力された前方散乱光信号をＡ／Ｄ変換することで、第一軸に受光強度をとり、第二軸に時間経過をとったデジタル値の信号波形を生成し、生成されたデジタル信号波形から個々の粒子に対応するパルス波形を切り出す。信号処理回路２３０ｐは、切り出したパルス波形のピーク高さを前方散乱光ＦＳＣ）信号のパルスピーク値、パルス波形のうち閾値を超える部分の幅を前方散乱光（ＦＳＣ）信号のパルス幅として、それぞれ出力する。同様に、信号処理回路２３０ｐは、光検出器２３０ｃから経時的に出力された側方散乱光（ＳＳＣ）信号に基づいて個々の粒子の側方散乱光（ＳＳＣ）のパルスピーク値を出力する。

３．測定プログラム
本発明のある実施形態は、血球を含む測定試料中の細胞数を測定するための測定プログラム２０２ｂに関する。図９～図１１を用いて、測定プログラム２０２ｂの処理の流れを説明する。

図９に示すステップＳ１において、図７に示す測定装置２００の処理部２０１は、検体と蛍光色素を含まない試薬を混合することで測定試料を調製するように試料調製部２２０（図７参照）を制御する。次に、図９に示すステップＳ２において、処理部２０１は、フローセル２３０ｊ（図８参照）を流れる測定試料にレーザ光を照射するようにＦＣＭ検出部２３０（図７参照）を制御する。そして、ステップＳ３において、処理部２０１は、レーザ光が照射された測定試料中の粒子から取得した光学情報に基づいて解析処理を行う。

図１０を用いてステップＳ３の処理をより詳細に説明する。
ステップＳ１０において、処理部２０１はＦＣＭ検出部２３０から散乱光に関する複数のパラメータの測定値を粒子ごとに取得する。この処理は、オペレータが処置開始要求を入力部３１１から入力し、この入力を処理部２０１が受け付けることにより開始される。

ステップＳ１１において、処理部２０１は、ステップＳ１０で取得した粒子ごとの光散乱に関する特徴値を記憶部２０２に記憶する。

ステップＳ１２において、処理部２０１は、ステップＳ１１において生成した特徴値に基づいて、スキャッタグラムを生成する。

ステップＳ１３において、スキャッタグラムから、白血球数カウント領域とその他の領域を分画し、白血球数カウント領域内に存在する粒子数を計数する。

ステップＳ１４において、処理部２０１は、脂質領域を設定し、脂質粒子ドットの抽出を行う。

図１１を用いてステップＳ１４の処理をより詳細に説明する。
ステップＳ１４１において、処理部２０１は、スキャッタグラムから解析対象となる領域に含まれる粒子のドット群を抽出する。

ステップＳ１４２において、処理部２０１は、抽出されたドット群に対して、回転行列を適用しスキャッタグラム上の座標を変換し、さらに第１主成分に対応する軸方向に各ドットの座標を投影する。この処理は、上記１．において説明した第１ステップ及び第２ステップに対応する。

ステップＳ１４３において、処理部２０１は、ステップＳ１４２において得られたヒストグラムにおいて、複数のピークが存在するか否かを探索し、複数のピークが存在した場合には、脂質粒子群を抽出するための分画位置を決定する。この処理は、上記１．において説明した第３ステップの前段に対応する。

ステップＳ１４４において、処理部２０１は、ステップＳ１４３において決定された分画位置よりも左方の領域のピークに基づいて脂質粒子群を決定する。この処理は、上記１．において説明した第３ステップの後段に対応する。

図１０に戻り、測定プログラム２０２ｂの処理をさらに説明する。ステップＳ１５において、処理部２０１は、脂質粒子が白血球領域に干渉しているか否かを判定する。ステップＳ１４において、脂質粒子群が所定の範囲内で検出された場合には、脂肪粒子が白血球領域に干渉していると決定することができる。脂質粒子群が所定の範囲内で検出されたと判断するための条件は、上記１．において白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報を出力するときの条件と同様である。

ステップＳ１５において、判定結果が「ＮＯ」である場合、処理部２０１はステップＳ１９に進み、白血球数を出力部３１２に出力し、処理を終了する。

ステップＳ１５において、判定結果が「ＹＥＳ」である場合、処理部２０１はステップＳ１６に進み、脂質粒子が存在するか否かの判定結果に基づく情報である補助情報を出力部３１２に出力する。このステップは、上記１．において説明した第４ステップに対応する。

続いて、処理部２０１はステップＳ１７に進み、ステップＳ１４において脂質粒子と判定された粒子の数をカウントし、脂質粒子に関する情報を生成する。

さらに、処理部２０１は、ステップＳ１８に進み、処理部２０１は、白血球数カウントから脂質粒子ドット群のカウントを除いた白血球数カウントの補正値を生成する。このステップは、上記１．に示す第５ステップに対応する。
処理部２０１は、ステップＳ１９に進み、白血球数の補正値を出力部３１２から出力する。

４．コンピュータプログラムを記録した記億媒体
ステップＳ１０からステップＳ１９及びステップＳ１４１からステップＳ１４４の処理実行するコンピュータプログラムは、記憶媒体等のプログラム製品として提供されうる。前記コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶される。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記制御部が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。

図１２に、末梢血検体＃１、＃２、＃３、＃４、及び＃５に本実施形態の測定方法を適用した結果を示す。＃５は脂質粒子が含まれなかった検体であり、それ以外はすべて脂質粒子を含む検体である。図１２（Ａ）に各検体の最大極大値（白血球を示すピーク）、極大値（脂質粒子を示すピーク）、分画位置（最小極小値）を示す。最大極大値は、５検体すべてにおいて、チャンネル１４であった。また、極大値は、脂質粒子を含む４検体において、チャンネル１０または９であった。分画位置は、脂質粒子を含む４検体すべてにおいて、チャンネル１１であった。図１２（Ｂ）は、脂質粒子を含む４検体の対策前と対策後の側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示す。対策後では、白血球分画に重なっている脂質粒子ドットが識別されて表示された。

図１３（Ａ）は、各データ群における脂質粒子陽性検体の頻度を示す。図１３（Ｂ）は脂質粒子陽性検体の中で、脂質粒子の含有量が最も少なかった検体（＃６）と脂質粒子の含有量が最も多かった検体（＃７）の側方散乱光信号のパルスピーク（ＳＳＣ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムと、前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）－前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）のスキャッタグラムを示す。＃６の脂質粒子含有比率は１．４％であり、脂質粒子の数は５３であった。＃７の脂質粒子含有比率は１４．３％であり、脂質粒子の数は２２９５であった。このことから、脂質粒子の数は、少なくとも５０であれば、脂質粒子が存在するか否かの判定結果に基づく情報である補助情報を出力できると考えられた。また、白血球カウントの同時再現性が３％未満であることから、補助情報を出力する脂質含有量の閾値は３％として問題ないと考えられた。

図１４に、末梢血検体＃１、＃２、＃３、及び＃４について蛍光染色を行うＤＩＦＦモードで測定した白血球数（ＷＢＣ－Ｄ）、通常のＣＢＣモードで測定した白血球数（ＷＢＣ－Ｃ補正前）、本実施形態の測定方法で補正した後の白血球数（ＷＢＣ－Ｃ補正後）を示す。＃１以外の検体では、ＷＢＣ－Ｃ補正前の値は参照値であるＷＢＣ－Ｄの値と大きく乖離していたが、ＷＢＣ－Ｃ補正後の値はＷＢＣ－Ｄの値に近似した。ＷＢＣ－Ｃ補正後の値の増加率は、ＷＢＣ－Ｄの値の０．３％から２．５％であり、ＷＢＣの同時再現性の上限値が３％であることを考慮すると充分に許容できる範囲であると考えられた。

以上より、本実施形態によれば蛍光色素を用いずに白血球と脂質粒子を分画できる。これにより、蛍光色素を用いるＤＩＦＦ測定モードによらずに、蛍光色素を用いないＣＢＣ測定モードのみで、脂質粒子が含まれる患者検体の白血球数を正確に計数し、あるいは、検体に脂質粒子が含まれている旨の通知を測定結果に付加でき、検査コストを抑えながら、脂質粒子を含む検体について正確な検査結果を提供することができる。

本明細書において、測定方法は、制限されない。例えば、図１（Ｂ）に示した前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）により示したスキャッタグラムを用いて測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得してもよい。この場合、図１（Ｂ）において破線内の脂質粒子ドットが点線で示される領域をゲーティングし、ゲート内に出現する粒子を計数することによって、脂質粒子に関する情報が取得できる。

他の例としては、図２（Ａ）に示した前方散乱光信号のパルス幅（ＦＳＣＷ）と前方散乱光信号のパルスピーク（ＦＳＣ）とのスキャッタグラムを回転行列により変換した二次元座標の二次元ドットプロットから測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得してもよい。この場合、二次元座標（ｘ’，ｙ’）の二次元ドットプロットである図２（Ｂ）に境界線Ａを引くことにより、境界線Ａに対してｘ’軸高値側に位置する白血球カウント領域と境界線Ａに対してｘ’軸低値側に位置する脂質粒子ドットの領域とを分離することができる。

本明細書において、ＣＢＣ測定モードとＤＩＦＦ測定モードとを含む複数の測定モードから、ユーザによって選択された一又は複数の測定モードによって検体に含まれる血球を計数する例に制限されない。例えば、ＣＢＣ測定モードのみによって検体に含まれる血球を計数してもよい。

本明細書において、回転角度θは、制限されない。例えば、８°から１２°程度、好ましくは９°から１１°程度、より好ましくは９．５°から１０．８°程度、さらに好ましくは１０．０°から１０．６°程度してもよい。

本明細書において、測定試料は、制限されない。例えば、血液（末梢血、動脈血、静脈血等）、及び体液（骨髄液、脳脊髄液、関節液等）の検体の原液、または前記検体の希釈液を含みうる。血液は、抗凝固剤の存在下で採取されることが好ましい。

本明細書において、粒子は、制限されない。例えば、粒子には、細胞と非細胞性粒子が含まれ得る。細胞は、測定試料を採取した被検者に由来する細胞を意図する。細胞は、赤血球、白血球、血小板、幼若赤血球、幼若白血球、幼若リンパ球、ミクロメガカリオサイト、腫瘍細胞（例えば、白血病細胞、悪性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫等）、マラリア感染赤血球等を含み得る。非細胞性粒子には、脂質粒子、細菌、真菌（例えば、酵母）等を含み得る。

本明細書において、光散乱に関する複数の特徴値の「複数」は、制限されない。例えば、「複数」とは、２以上である限り制限されない。

本明細書において、測定プログラム２０２ｂを実行する処理部２０１が、測定装置２００に搭載されている例を示して実施形態を説明した。しかし、測定プログラム２０２ｂは、フローサイトメータ２３０を搭載していない別のコンピュータにおいて実行されてもよい。例えば、クラウド等のネットワークを介して、別のコンピュータがフローサイトメータ２３０から散乱光に関する複数のパラメータの測定値を粒子ごとに取得し、別のコンピュータの処理部が、測定プログラム２０２ｂを実行してもよい。

２０１ 処理部
２０２ 記憶部
２３０ｊ フローセル
３１１ 入力部
３１２ 出力部
２３０ａ 検出部
２３０ｂ～２３０ｄ 検出器
２３０ｅ 照射光学系
２３０ｋ 受光光学系
２３０ｐ 信号処理回路
２２０ 試料調製部
２３０ ＦＣＭ検出部（フローサイトメータ）
１００ 測定システム
２００ 測定装置
３００ ディスプレイ

Claims (14)

1. 蛍光色素を使用せずに調製した測定試料中の粒子数を測定する測定方法であって、
   前記測定試料に含まれる個々の粒子からフローサイトメータによって取得した、各粒子における光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得すること、を含み、
   前記光散乱に関する複数の特徴値は、各粒子に対応する前方散乱光信号のパルス波形の幅と前方散乱光信号のパルス波形のピーク高さとをそれぞれ異なる座標軸方向に示した値である、測定方法。
2. 前記個々の粒子に光を照射して生じる散乱光に基づいて、前記測定試料中の有核細胞数を計数する、請求項１に記載の測定方法。
3. 前記脂質粒子に関する情報に基づいて、粒子数の測定値に対する脂質粒子の影響の有無を判定し、判定結果に基づく情報を出力することをさらに含む、請求項１または２に記載の測定方法。
4. 前記脂質粒子に関する情報は、白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報である、請求項１から３のいずれか一項に記載の測定方法。
5. 前記脂質粒子に関する情報に基づいて、粒子数の測定値を補正し、補正後の値を白血球数の測定値として出力する、請求項１から４のいずれか一項に記載の測定方法。
6. 前記脂質粒子に関する情報は、前記個々の粒子から取得した、前記前方散乱光信号のパルス波形の幅と前方散乱光信号のパルス波形のピーク高さによって示される座標を、回転行列によって変換した変換後の座標から、脂質粒子を示す座標を抽出することによって生成される、請求項１に記載の測定方法。
7. 前記脂質粒子に関する情報は、前記回転行列により変換した変換後の座標における第１主成分に対応する軸方向に投影したヒストグラムのピーク解析により生成される、請求項６に記載の測定方法。
8. 前記ヒストグラムのピーク解析においてピーク値を補正し、前記脂質粒子に関する情報を生成する、請求項７に記載の測定方法。
9. 前記ヒストグラムのピーク解析においてピークの探索範囲を限定し、前記脂質粒子に関する情報を生成する、請求項７または８に記載の測定方法。
10. 前記脂質粒子に関する情報が、粒子群における脂質粒子の存在比率、または脂質粒子の数である、請求項１から９のいずれか一項に記載の測定方法。
11. 前記脂質粒子の存在比率があらかじめ設定された所定の値以上であるとき、または
    前記脂質粒子の数が、粒子数の測定値に対して所定の値以上であるとき、
    前記白血球数の測定値に対する信頼性に関する情報を出力する、請求項４に記載の測定方法。
12. 前記脂質粒子を示す座標から、マラリア感染細胞に対応する粒子の座標を除外し、前記脂質粒子に関する情報を取得する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の測定方法。
13. 蛍光色素を使用せずに調製した測定試料中の細胞数を測定する測定装置であって、
    前記測定装置は、フローサイトメータと処理部とを備え、
    前記処理部は、
    前記測定試料に含まれる個々の粒子から前記フローサイトメータによって取得した、各粒子における光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得し、
    前記光散乱に関する複数の特徴値は、各粒子に対応する前方散乱光信号のパルス波形の幅と前方散乱光信号のパルス波形のピーク高さとをそれぞれ異なる座標軸方向に示した値である、
    測定装置。
14. コンピュータに実行させたときに、
    蛍光色素を使用せずに調製した測定試料に含まれる個々の粒子からフローサイトメータによって取得した、各粒子における光散乱に関する複数の特徴値に基づいて、前記測定試料に含まれる脂質粒子に関する情報を取得するステップを実行することを含み、
    前記光散乱に関する複数の特徴値は、各粒子に対応する前方散乱光信号のパルス波形の幅と前方散乱光信号のパルス波形のピーク高さとをそれぞれ異なる軸方向に示した値である、
    前記測定試料中の細胞数を測定する測定プログラム。

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