JP7629401B2 - がんの治療又は予防に使用するための貪食可能な粒子 - Google Patents

Description

本発明は、がんの治療又は予防に使用するためのコアに強固に会合した新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子に関する。本発明はまた、がんの治療又は予防に使用するための注射可能な医薬組成物に関する。

がんを治療するために対象の免疫系を調節するための様々なアプローチが存在しており、そのようなアプローチは、しばしば「免疫療法」と呼ばれる。免疫療法の例としては、免疫チェックポイント阻害剤、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法、及びがんワクチンが挙げられる。

免疫活性化のチェックポイントに重要な結合相互作用を標的とするモノクローナル抗体の使用など、がんを治療するために免疫チェックポイント阻害剤を使用することについては多くの成功例がある。免疫チェックポイント阻害剤は、様々ながんの治療に使用されており、例えば、黒色腫、肺がん、膀胱がん及び胃腸がんの治療に使用されている。

養子細胞移入（ＡＣＴ）もある程度成功を収めている。例えば、進行結腸がんを有する患者を養子免疫療法プロトコルを用いて治療した研究がＫａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．、２０１０、１７（７）：１７４７～５７によって報告された。この治療は、腫瘍を自然に排出する最初のリンパ節（センチネル節）から手術中に単離された自己腫瘍反応性リンパ球の単離及びインビトロ増殖に基づくものであった。センチネル節獲得リンパ球を収集し、活性化し、自己腫瘍抽出物に対して増殖させ、輸血として患者に戻した。毒性副作用又は他の有害な作用は観察されなかった。疾患の完全な又は顕著な退縮が、肝臓転移及び肺転移を有する４人の患者において生じ、１２人の患者が、部分的な退縮又は病状の安定を示した。

ＡＣＴにおける大きな制約は、対象へ投与するために、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの抗がんＴ細胞を十分な量調製する必要があるということである。例えば、現在の方法では、抗がんＴ細胞を得るために、対象のがん又はがん細胞を除去する侵襲的外科手術を用いることがしばしば必要となる。さらに、その得られた細胞は、数が少なく、がん由来の免疫抑制機序のために、不応答性（反応不顕性）のことがよくある。これにより、インビトロ増殖が遅くなる可能性があり、このことは、治療に使用する十分な量の抗がんＴ細胞を得るのに長い時間がかかる可能性があることを意味する。

遺伝子操作されたＴ細胞は、ＡＣＴに関する制約のいくつかを克服するために開発された。遺伝子操作されたＴ細胞は、抗原受容体の導入によりＴ細胞の特異性を患者のがんに向けて遺伝子的にその方向を変えること、又は、「キメラ抗原受容体」と呼ばれる合成された認識構造体をＴ細胞に導入することによって得ることができる。遺伝子操作されたＴ細胞は血液がんの治療に成功しているが、固形がんの治療に関しては、遺伝子操作されたＴ細胞の安全性及び選択性は依然として改善を要する。

免疫チェックポイント阻害剤及びＡＣＴの代替アプローチは、抗がん免疫応答を誘発するために対象へがん抗原を投与することである。抗がん免疫応答を誘発する組成物は、しばしば「がんワクチン」と呼ばれる。がんワクチンは、典型的には、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）のようながん抗原を含む。ＴＡＡはがん細胞によって異常に発現され、例えば、ＴＡＡは、正常細胞とがん細胞の双方によって発現され得るが、がん細胞によって有意により高いレベルで発現されるタンパク質又はペプチドである。
ＴＳＡは、正常細胞によっては発現されず、がん細胞によって発現される抗原である。腫瘍特異的抗原の注目すべき例は新生抗原である。新生抗原は、正常細胞ではなくがん細胞によって発現される変異タンパク質又はペプチドであり、抗体又はＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの免疫系の分子に結合され得る。１以上のがん特異的なアミノ酸の変異を含み、免疫系の分子に直接結合されることが知られているか若しくは疑われる新生抗原の領域は、しばしばネオエピトープと呼ばれる。ネオアンチゲンなどのＴＳＡを標的とする治療薬又はワクチンは、より効果的で安全ながん治療を提供することが期待されている。

がん治療のための免疫療法に関心が寄せられているにもかかわらず、現在までのところ、それらの成功は限られている。これは、免疫療法の安全性及び選択性に関連する課題と並んで、抗がん免疫応答の調節又は誘導に効果がないことがその原因である。

したがって、がんの治療に使用するための改善された免疫療法であって、堅牢で標的化された抗がん性免疫応答を誘発し、臨床現場での使用にも適した免疫療法が依然として必要とされている。

本発明は、対象におけるがんの治療又は予防に使用するための貪食可能な粒子であって、当該貪食可能な粒子が、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含み、当該新生抗原性構築物が、対象におけるがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、当該タンパク質又はペプチドの一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、貪食可能な粒子を提供する。

本発明はまた、がんを治療又は予防する方法であって、貪食可能な粒子を対象に投与する工程を含み、当該貪食可能な粒子が、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性の構築物とを含み、当該新生抗原性構築物が、対象のがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、当該タンパク質又はペプチドの一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、方法を提供する。

本発明はまた、がんを治療又は予防するための医薬品を製造するための貪食可能な粒子の使用であって、当該貪食可能な粒子が、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含み、当該新生抗原性構築物が、対象のがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、当該タンパク質又はペプチドの一部が少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、使用を提供する。

本発明はまた、貪食可能な粒子を含む注射可能な医薬組成物であって、当該貪食可能な粒子が、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含み、当該新生抗原性構築物が、対象のがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、当該タンパク質又はペプチドの一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、注射可能な医薬組成物を提供する。

本発明はさらに、対象におけるがんの治療若しくは予防に使用するための本発明の貪食可能な粒子を提供し、又は、対象におけるがんの治療若しくは予防に使用するための本発明の注射可能な医薬組成物を提供し、又は、本発明の対象におけるがんの治療若しくは予防のための方法であって、当該がんの治療又は予防が、
１以上の後続の用量の貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物を対象に投与すること
を含み、当該対象が、当該対象においてがん細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分な用量の貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物を以前に投与された者である、方法を提供する。

本発明はさらに、対象におけるがんの治療若しくは予防に使用するための本発明の貪食可能な粒子を提供し、又は、対象におけるがんの治療若しくは予防に使用するための本発明の注射可能な医薬組成物を提供し、又は、本発明の対象におけるがんの治療若しくは予防のための方法であって、当該がんの治療又は予防が、
（ａ）貪食可能な粒子を上記対象に投与した後に、対象からＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を採取する工程と、
（ｂ）対象から採取した抗がんＴ細胞を増殖させる工程と、
（ｃ）治療用量の増殖した抗がんＴ細胞を対象に投与する工程とを含む、方法を提供する。

本発明者らは、対象へ投与した後に、本明細書に記載の貪食可能な粒子が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれることを見出した。次いで、関連する新生抗原性構築物がＡＰＣの表面に提示され、対象において抗がんＴ細胞の活性化及び増殖をもたらす。貪食可能な粒子を使用すると、驚くほど多くの新生抗原性構築物が取り込まれ、それに続いてＡＰＣ表面上の多種多様なネオエピトープが提示される。本発明者らは、マウスモデルにおいて、２種類の新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子を注射又は皮下によって鼠径リンパ節に投与すると、マウスから採取した血清試料中の抗ネオエピトープ抗体が用量依存的に増加することを示した。続いて、同じマウスに黒色腫がん細胞（Ｂ１６Ｆ１０）を注射した。有利なことに、本発明者らは、がん細胞の注射前に貪食可能な粒子をマウスに投与すると、マウスの腫瘍成長に対して用量依存的な予防効果が生じることを見出した。したがって、本発明者らは、本明細書に記載の貪食可能な粒子を対象に投与することによって、堅牢な抗がん免疫応答を対象に誘発することができ、本発明の貪食可能な粒子をがんの予防的ワクチン接種として使用してがんの増殖を減少させることができることを見出した。

さらに、本発明者らはまた、結腸直腸がんのマウス異種移植モデルにおいて、結腸がん細胞（ＭＣ－３８細胞株）の移植の前後に、６種類の新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子組成物を投与すると、マウスにおいて腫瘍成長を阻害する堅牢な抗がん免疫応答が生じることを示した。上述したように、本発明者らは、がんの２つのマウスモデルにおいて、本発明の貪食可能な粒子の治療的及び予防的可能性を示した。

本発明者らはまた、本明細書に記載の貪食可能な粒子のコア（例えば、ポリマー粒子）が、新生抗原性構築物にとって非常に有効な担体として機能することを見出した。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、コア及び強固に会合した新生抗原構築物を含む貪食可能な粒子全体が、ＡＰＣの食作用によってファゴソームに取り込まれるがゆえに、本明細書で定義される貪食可能な粒子は特に効果的であると考えられる。次いで、新生抗原性構築物は、粒子のコアから切断され、ファゴソーム中で処理される。次いで、新生抗原性構築物の断片は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ経路を介してＡＰＣの表面に提示され、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって細胞表面に提示される。これは、ネオエピトープがＡＰＣの表面に提示されるための排他的なプロセスではなく、新生抗原性構築物の一部の断片は、また、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ経路を介してＡＰＣの表面に提示される場合もあり、交差提示として知られるプロセスでＭＨＣクラスＩ分子によって細胞表面に提示される場合もあると考えられる。したがって、新生抗原性構築物の断片は主にＭＨＣクラスＩＩ経路を介してＡＰＣ上に提示されると予想されるが、一部はＭＨＣクラスＩ経路を介して提示されると予想されるため、本発明は双方の経路を多かれ少なかれ利用する。

抗原がＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されると、それらは通常ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる）を活性化し、これは主にサイトカインの分泌によって免疫応答を指揮し、Ｂ細胞のクラススイッチングを誘導してＢ細胞が抗体を作製するのを支援し、他のＴ細胞型、特に細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びメモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞）の活性化及び増殖を刺激する。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、他の細胞型（Ｂｏｒｓｔ他、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１８、１８（１０）、６３５～６４７）を直接死滅させることができる。これは、本明細書で定義される貪食可能な粒子を対象に投与することによって、複数の種類の免疫細胞を活性化することが可能であり、これにより、ゆっくりと開始する（したがって、副作用がほとんどない）抗がん免疫応答がもたらされ、長期持続効果を有し、（腫瘍細胞を直接攻撃することだけができるＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するだけはなく）全免疫系を利用することによって多くの異なる方法でがんを標的化することができることを意味する。これは、抗原（例えば、新生抗原）が遊離ペプチド又はペプチドを発現するヌクレオチド構築物として提供される場合に起こると予想されるものとは対照的である。かかる抗原はＡＰＣの細胞質ゾルに取り込まれると予想され、その結果、新生抗原がＭＨＣクラスＩ分子によってＭＨＣクラスＩ経路のみを介して細胞表面に提示される。これにより、主にＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化する。さらに、抗がん免疫応答を誘導した後、抗がんＴヘルパー細胞に由来するメモリーＴ細胞は血液循環の中に留まり、ネオエピトープを発現するがん細胞が体内に留まる間、又は同じがんが再発する場合に、迅速かつ効果的な二次免疫応答を開始することができる。

本発明者らはまた、本明細書に記載の貪食可能な粒子を効率的に精製及び滅菌することができ、例えば、対象への投与前に、病原体（例えば、細菌、真菌及びウイルス）、エンドトキシン及び他の抗原性汚染物質などの汚染物質を貪食可能な粒子から除去することができることを見出した。このことは、本明細書に記載の貪食可能な粒子から汚染物質を除去することにより、投与後の対象における非特異的免疫応答が低下し、その結果、貪食可能な粒子の安全性及び有効性が改善されるため、特に有利である。

本発明者らはまた、一部には、コアの不活性特性及び貪食可能な粒子の高い無菌性のために、投与後の対象において、貪食可能な粒子が十分に許容されることを理解している。

図１は、Ｔ細胞活性化における貪食性粒径の影響を示す。増殖アッセイ（チミジン取込みによる）を使用して、オボアルブミン感作マウスから得られた脾細胞の数を評価した。５．６μｍ、１μｍ及び０．２μｍの直径を有する異なるサイズの貪食可能な粒子に結合したオボアルブミンの比較を示す。Ｐ値はスチューデントのＴ検定を用いて決定し、ｐ＜０．０５の場合はその旨を記した。ステープルはＳＤを示す。 図２は、ネオエピトープＮＡ１～９の刺激によるＴ細胞の増殖を示す。図２Ａは、培養物中の経時的な細胞数を示す。図２Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞／全Ｔ細胞の％を示す。図２Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ－ｂｅｔ発現を示す。図２Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を示す。 図２－２は図２のつづきである。図２Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ－ｂｅｔ発現を示す。図２Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を示す。 図３は、新生抗原性構築物の刺激によるＴ細胞の増殖を示す。Ｔ細胞（小さい四角）及びＣＤ４＋Ｔ細胞の総数（大きい四角）、並びに増殖ＣＤ４＋細胞（丸）のパーセントを示す。 図４は、新生抗原性構築物の刺激による抗がんＴ細胞の増殖を示す。図４Ａは、ＰＢＭＣ培養物中の経時的（日）な細胞数を示す。ＰＢＭＣ培養物は、ＡＰＣ及びＴ細胞を含む様々な細胞型を含む。図４Ａの一番上の線（Ｐａｔ２ 個別化ＮＡ）は、ポリスチレンコア（ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））及びコアに強固に会合した個別化新生抗原性構築物（配列番号３）を含む貪食可能な粒子とのインキュベーション後のＰＢＭＣ培養物中の細胞の数を示す。図４Ａの下部の２本の線（Ｐａｔ２ ＮＡ １＋３及びＰａｔ２ ＮＡ ４＋５）は、ポリスチレンコア（ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））とコアに強固に会合した予測新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子と共にインキュベートした後の２つの別個のＰＢＭＣ培養物中の細胞数を示す。図４Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞／総Ｔ細胞の％を示す。 図４－２は図４のつづきである。図４Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞についてＢａｒｎｅｓ－Ｈｕｔ 確率的近傍埋め込み法（ＢＨ－ＳＮＥ）アルゴリズムを用いて行われた分析を可視化するものであり、試料中の全ての細胞は、選択されたマーカー（ＣＤ２８、ＣＤ５７、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、パーフォリン、グランザイムＢ（ＧＺＢ）、Ｋｉ－６７、ＰＤ－１）のセットによる発現強度の類似性に従って２次元マップ上でクラスター化されている。 図５Ａは、細胞内に貪食された粒子を有するＰＢＭＣの共焦点顕微鏡画像を示す。貪食された粒子と共にＰＢＭＣを３７℃で１８時間インキュベートした後に、３つのサイズの貪食可能な粒子が示されている（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）。 図５Ｂは、手動計数によって評価した、ＰＢＭＣと共に３７℃で１８時間インキュベートした後の２つのサイズ（４．５μｍ又は２．８μｍ）の貪食可能な粒子の細胞取込みを示す。 図５Ｃは、体積計算（＊ｐ＜０，０５ ＊＊ｐ＜０，０１ ＊＊＊ｐ＜０，００１、スチューデントのＴ検定を用いて計算）によって評価した、ＰＢＭＣ中で３７℃で１８時間インキュベートした後の３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の貪食可能な粒子の細胞取込み示す。 図６Ａは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価した場合の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の貪食可能な粒子で刺激されたＣＭＶ感受性健常ドナー（ｎ＝２）由来のＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ産生レベルの非刺激細胞と比較した相対的増加を示す。 図６Ｂは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価した場合の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の貪食可能な粒子で刺激されたＣＭＶ感受性健常ドナー（ｎ＝１）由来のＰＢＭＣにおけるＩＬ２２産生レベルの非刺激細胞と比較した相対的増加を示す。 図６Ｃは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価した場合の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の貪食可能な粒子で刺激したＣＭＶ感受性健常ドナー（ｎ＝１）由来のＰＢＭＣにおけるＩＬ１７産生レベルの非刺激細胞と比較した相対的増加を示す。 図６－２は図６のつづきである。図６Ｄは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価した場合の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の貪食可能な粒子で刺激されたＣＭＶ感受性健常ドナー（ｎ＝１）由来のＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ及びＩＬ－１７の二重サイトカイン産生の非刺激細胞と比較した相対的増加を示す。 図６Ｅは、実施例３ａ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価した場合の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の貪食可能な粒子で刺激されたＣＭＶ感受性健常ドナー（ｎ＝１）由来のＰＢＭＣにおけるＩＬ２２及びＩＬ１７の二重サイトカイン産生の非刺激細胞と比較した相対的増加を示す。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ及び図７Ｄは、低用量又は高用量の２種類の貪食可能な粒子を鼠径リンパ節内又は皮下に投与した後にマウスから採取した血清試料中の抗ネオエピトープ抗体の割合を示す（各用量及び投与経路についてｎ＝３）。２種類の貪食可能な粒子は、１）新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）に強固に会合したポリスチレン粒子、及び、２）新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）に強固に会合したポリスチレン粒子であった。図７Ａ及び図７Ｂは、貪食可能な粒子を最初に投与して２２日後のマウスから採取した血清中の、新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ａ）、又は新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ｂ）を示す。また、図７Ｃ及び図７Ｄは、１回目の貪食可能な粒子の投与のおよそ１ヶ月後に２回目の貪食可能な粒子を投与して２３日後のマウスから採取した血清中の新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ｃ）、又は新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ｄ）を示す。コントロールとして、ナイーブマウス（ｎ＝３、貪食可能な粒子の投与なし）から採取した血清試料を併せて分析した。高用量の貪食可能な粒子を１用量又は２用量受けた（鼠径リンパ節内又は皮下に投与された）マウスは、同じ経路を介して低用量の貪食可能な粒子を１用量又は２用量受けたマウスと比較して、また、貪食可能な粒子を１用量も受けなかったマウス（すなわち、ナイーブマウス）と比較して、血清試料中の抗ネオエピトープ抗体の割合が高かった。 図７Ｂは、貪食可能な粒子を最初に投与して２２日後のマウスから採取した血清中の新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ｂ）を示す。 図７Ｃは、１回目の貪食可能な粒子の投与のおよそ１ヶ月後に２回目の貪食可能な粒子を投与して２３日後のマウスから採取した血清中の新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ｃ）を示す。コントロールとして、ナイーブマウス（ｎ＝３、貪食可能な粒子の投与なし）から採取した血清試料を併せて分析した。 図７Ｄは、１回目の貪食可能な粒子の投与のおよそ１ヶ月後に２回目の貪食可能な粒子を投与して２３日後のマウスから採取した血清中の新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）に対する抗ネオエピトープ抗体の割合（図７Ｄ）を示す。コントロールとして、ナイーブマウス（ｎ＝３、貪食可能な粒子の投与なし）から採取した血清試料を併せて分析した。 図８は、予め２用量の貪食可能な粒子（Ｍ２７２１２０に強固に会合したポリスチレン粒子、及びＭ３０４７４８に強固に会合したポリスチレン粒子）を投与されたマウスにメラノーマがん細胞株Ｂ１６Ｆ１０を注射した後の腫瘍体積の経時的変化（日数、Ｄ）を示す。以下の用量の貪食可能な粒子を事前に投与したマウス（ｎ＝３）に関する腫瘍体積の経時的変化を示す（低用量の貪食可能な粒子を鼠径リンパ節に２用量投与（四角■）、高用量の貪食可能な粒子を鼠径リンパ節に２用量注入（三角▼）、低用量の貪食可能な粒子を２用量皮下注入（三角▲）、高用量の貪食可能な粒子を２用量皮下注射（菱形◆））。貪食可能な粒子の投与は、腫瘍体積に対する用量依存的な予防効果を示す。 図９は、６つの異なるグループの貪食可能な粒子を含む貪食可能な粒子組成物を１回及び２回投与した後のマウス（ｎ＝５）の腫瘍体積を示し、各グループは、異なるＭＣ３８新生抗原構築物（配列番号１３～１８）に結合したコアを含む。１回目の用量を－５日目に投与し（時点Ａ）、２回目の用量を１３日目に投与した（時点Ｃ）。０日目（時点Ｂ）にマウスにＭＣ３８腫瘍細胞を移植した。腫瘍進行を非ワクチン接種群（陰性対照、ｎ＝５）と比較した。実験終了時の腫瘍体積の差をスチューデントのｔ検定を用いて計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１。

新生抗原性構築物及びネオエピトープペプチド
本発明で使用するための貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した新生抗原性構築物を含む。本発明の新生抗原性構築物は、ネオエピトープペプチドを含む。

本発明で使用するためのネオエピトープペプチドは、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ
酸配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドであり、当該タンパク質又はペプチドの一部は、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する。ネオエピトープペプチドの「体細胞変異アミノ酸」は、タンパク質又はペプチドの上記一部が非がん性細胞（例えば、体細胞）によって発現されるときの、ネオエピトープペプチドアミノ酸配列に対応するタンパク質又はペプチドの上記一部とは異なるか又はその部分に存在しないアミノ酸である。例えば、ネオエピトープペプチドの「体細胞変異アミノ酸」は、欠失（すなわち、欠失されたアミノ酸）、付加（すなわち、付加されたアミノ酸）、又は置換（すなわち、異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸）であり得る。そのような体細胞変異アミノ酸は、体細胞変異アミノ酸ががん細胞に存在するが正常細胞（例えば、体細胞）には存在しないことから、「がん特異的体細胞変異アミノ酸」とも呼ばれ得る。好ましくは、ネオエピトープペプチドの体細胞変異アミノ酸は、置換である（すなわち、１個以上のアミノ酸が異なるアミノ酸に置換されている）。

細胞によって発現されるタンパク質又はペプチド中の変異体アミノ酸は、細胞のＤＮＡへのヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を引き起こす各細胞分裂で生じるＤＮＡ複製の不忠実性の結果として起こり得る。ヌクレオチド置換により、体細胞非変異核酸配列によってコードされるアミノ酸とは異なるアミノ酸がコードされ、その結果、タンパク質／ペプチド中に、正常な非がん性細胞（例えば、体細胞）のタンパク質／ペプチドとは異なるアミノ酸が生じ得る。ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失は、リーディングフレームエラー（すなわち、「フレームシフト突然変異」）をもたらし、その結果として、タンパク質レベルで新しいアミノ酸配列をもたらす可能性がある（すなわち、ヌクレオチドの挿入又は欠失がＤＮＡのリーディングフレームを変化させ、その結果、変異後に、正常細胞（例えば、体細胞）と比較して、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸の大部分又はすべてを変化させる）。追加的又は代替的に、挿入及び／又は欠失は、終止コドンの導入をもたらし、その結果として、タンパク質レベルで短縮型タンパク質をもたらす可能性がある。ヌクレオチド置換は、コドンを個々に変更し、タンパク質レベルでアミノ酸の置換及び／又は終止コドンの導入をもたらし、その結果として、タンパク質レベルで短縮型タンパク質をもたらす可能性がある。

本発明で使用するためのネオエピトープペプチドは、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドであり、当該タンパク質又はペプチドの一部は、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸（例えば、１、２、３、４又は５個、又はそれ以上の体細胞変異アミノ酸）を有する。

対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われる変異タンパク質又はペプチドは、「がん特異的変異タンパク質又はペプチド」と呼ばれる場合もある。これは、変異したタンパク質又はペプチドが、正常細胞（例えば、体細胞）ではなく、がん細胞において発現されることが知られているか若しくは疑われるからである。

がん特異的変異タンパク質又はペプチド、及びネオエピトープペプチドのアミノ酸配列に対応し得るそのアミノ酸配列は、様々な技術を用いて同定することができる。例えば、がん特異的変異タンパク質又はペプチド、及びそのがん特異的体細胞変異アミノ酸を含むそのアミノ酸配列は、ＣＯＳＭＩＣデータベース（Ｆｏｒｂｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４５（Ｄ１）、Ｄ７７７～Ｄ７８３、このデータベースはｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ）でアクセス可能である）などの公的に利用可能なタンパク質データベースから同定することができる。ＣＯＳＭＩＣデータベース又は同様のデータベースから同定された体細胞変異アミノ酸配列は、本明細書では「予測ネオエピトープペプチド」と呼ぶ。１個以上の「予測ネオエピトープペプチド」からなる新生抗原性構築物は、本明細書では「予測新生抗原性構築物」と呼ぶ。

がん特異的変異タンパク質又はペプチドを同定するための代替又は追加のアプローチでは、そのアミノ酸配列、すなわち、ネオエピトープペプチドアミノ酸配列が対象のがんから得られたがん細胞のゲノム、エクソームトランスクリプトーム及び／又はプロテオームに対応することができ、その結果、がん細胞における変異が推定される。これは、例えば、プロテオーム、ゲノム、エクソーム又はトランスクリプトーム由来データと参照ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との比較によって行うことができる。適切な参照配列は、対象から得られた非がん性細胞（例えば、体細胞）のゲノム、エクソーム若しくはトランスクリプトームから、又は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）及びＥＢＩ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｈｏｍｅ）などの公的に利用可能なヌクレオチド若しくはタンパク質データベースから得ることができ、これらは組織及びがん細胞株で発現されるタンパク質及びペプチドに関する情報を提供する。代替又は追加のアプローチでは、がん特異的変異タンパク質又はペプチド、及びネオエピトープペプチドのアミノ酸配列が対応し得るそのアミノ酸配列は、対象の腫瘍のゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム及び／又はプロテオームの分析によって事前に同定されたものであってもよい。がん細胞又は正常細胞のゲノム、エクソーム又はトランスクリプトームの塩基配列を決定するのに好適な技術は当技術分野で既知であり、例えば、サンガー配列決定法や次世代配列決定法が挙げられる。プロテオームデータを得るのに好適な技術としては、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析が挙げられる。対象から得られたゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム又はプロテオームデータから同定された体細胞変異アミノ酸配列は、本明細書では「個別化ネオエピトープペプチド」と呼ぶ。１個以上の「個別化ネオエピトープペプチド」からなる新生抗原性構築物は、本明細書では「個別化新生抗原性構築物」と呼ぶ。

本発明で使用するためのネオエピトープペプチドは、１個以上の体細胞変異アミノ酸を有する。例えば、それは、１個の体細胞変異アミノ酸を有していてもよく、又は２個以上の体細胞変異アミノ酸を有していてもよく、すなわちタンパク質又はペプチドの一部において、２個乃至すべてのアミノ酸が変異していてもよい。例えば、本発明のネオエピトープペプチドは、１から１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の体細胞変異アミノ酸を有していてもよく、より好ましくは１から８個（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８個）の変異アミノ酸を有していてもよい。又は、例えば、１から６個（例えば、１、２、３、４、５又は６個）の変異アミノ酸を有していてもよく、又は、例えば、１から５個（例えば、１、２、３、４又は５個）の体細胞変異アミノ酸を有していてもよく、又は、例えば、１から４個（例えば、１、２、３又は４個）の体細胞変異アミノ酸を有していてもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、１、２又は３個の体細胞変異アミノ酸を有する。好ましい一実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、１又は２個の体細胞変異アミノ酸を有する。さらにより好ましくは、本発明のネオエピトープペプチドは、１個の体細胞変異アミノ酸を有する。

好ましい一実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、そのほとんど又は全体において体細胞変異アミノ酸を有する。さらにより好ましくは、本発明のネオエピトープペプチドは、その全体において体細胞変異アミノ酸を有する。そのほとんど又は全体において体細胞変異アミノ酸を有するそのようなネオエピトープペプチドは、細胞のＤＮＡにおけるフレームシフト型変異によって生じるタンパク質又はペプチドの一部に対応し得る。

本発明で使用するためのネオエピトープペプチドの１個以上のアミノ酸変異は、ネオエピトープペプチドのアミノ酸配列内の任意のアミノ酸位置に位置し得る。好ましい一実施
形態では、体細胞変異アミノ酸の少なくとも１個（又はネオエピトープペプチド中に１個の体細胞変異アミノ酸のみが存在する実施形態では１個の体細胞変異アミノ酸）は、ネオエピトープペプチドの中央部分に位置する。例えば、ネオエピトープペプチドアミノ酸配列が少なくとも３アミノ酸長（例えば、少なくとも５アミノ酸長又は少なくとも７アミノ酸長）である場合、ネオエピトープペプチドの中心部は、ネオエピトープペプチドがその配列中に奇数個のアミノ酸を有する場合には、配列の中央にある１個のアミノ酸であり、また、ネオエピトープペプチドがその配列中に偶数個のアミノ酸を有する場合には、中央にある２個のアミノ酸である。例えば、ネオエピトープペプチドアミノ酸配列が少なくとも９アミノ酸長である場合、ネオエピトープペプチドの中心部は、ネオエピトープペプチドがその配列中に奇数個のアミノ酸を有する場合には、配列の中央にある３個のアミノ酸（及び、好ましくは１個の中央にあるアミノ酸）であり、また、ネオエピトープペプチドがその配列中に偶数個のアミノ酸を有する場合には、中央にある４個のアミノ酸（及び、好ましくは２個の中央にあるアミノ酸）である。例えば、ネオエピトープペプチドアミノ酸配列が少なくとも１１アミノ酸長である場合、ネオエピトープペプチドの中心部は、ネオエピトープペプチドがその配列中に奇数個のアミノ酸を有する場合には、配列の中央にある５個のアミノ酸（及び、好ましくは１個の中央にあるアミノ酸）であり、また、ネオエピトープペプチドがその配列中に偶数個のアミノ酸を有する場合には、中央にある６個のアミノ酸である。より好ましくは、ネオエピトープペプチドアミノ酸配列が少なくとも１１アミノ酸長である場合、ネオエピトープペプチドの中心部は、ネオエピトープペプチドがその配列中に奇数個のアミノ酸を有する場合には、配列の中央にある３個のアミノ酸（及び、好ましくは１個の中央にあるアミノ酸）であり、また、ネオエピトープペプチドがその配列中に偶数個のアミノ酸を有する場合には、中央にある４個のアミノ酸（及び、好ましくは２個の中央にあるアミノ酸）である。

好ましい一実施形態では、ネオエピトープペプチドの体細胞変異アミノ酸の少なくとも１個（又は、ネオエピトープペプチド中に１個の体細胞変異アミノ酸のみが存在する実施形態では１個の体細胞変異アミノ酸）は、ネオエピトープペプチドがその配列中に奇数のアミノ酸を有する場合には、ネオエピトープペプチドの中央位置に位置し、また、ネオエピトープペプチドがその配列中に偶数個のアミノ酸を有する場合には、アミノ酸配列の最も中央にある２つの位置のいずれか一方に位置する。

本発明のある実施形態では、ネオエピトープペプチドのアミノ酸のほとんど又はすべてが体細胞変異アミノ酸である。そのような実施形態では、がん細胞によって発現されるタンパク質又はペプチド中の体細胞変異アミノ酸は、コードＤＮＡのリーディングフレームのエラーに起因して（すなわち、フレームシフト突然変異に起因して）生じた可能性があり、その結果、タンパク質又はペプチドの部分中のアミノ酸の全部又は大部分が、正常な非がん性細胞で発現されるタンパク質又はペプチドの部分とは異なる。

本発明のネオエピトープペプチドは、３から２００アミノ酸長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５又は２００アミノ酸長）のアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、本発明のネオエピトープペプチドは、３から５０アミノ酸長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長）、より好ましくは３から３０アミノ酸長（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸長）、より好ましくは３から２５アミノ酸（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ア
ミノ酸長）、より好ましくは５から２５アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５アミノ酸長）、より好ましくは８から２５アミノ酸（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５アミノ酸長）、さらにより好ましくは１１から２５アミノ酸長（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５アミノ酸長）のアミノ酸配列を有し得る。好ましい一実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から２５アミノ酸長、５から２５アミノ酸長、１０から２５アミノ酸長、１１から２５アミノ酸長、１２から２５アミノ酸長、１３から２５アミノ酸長、１５から２５アミノ酸長、１７から２５アミノ酸長、１９から２５アミノ酸長、２０から２５アミノ酸長、又は２１から２５アミノ酸長を有する。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から２３個のアミノ酸長、５から２３個のアミノ酸長、１０から２３個のアミノ酸長、１１から２３個のアミノ酸長、１２から２３個のアミノ酸長、１３から２３個のアミノ酸長、１５から２３個のアミノ酸長、１７から２３個のアミノ酸長、１９から２３個のアミノ酸長、２０から２３個のアミノ酸長、又は２１から２３個のアミノ酸長を有する。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から２１アミノ酸長、５から２１アミノ酸長、１０から２１アミノ酸長、１１から２１アミノ酸長、１２から２１アミノ酸長、１３から２１アミノ酸長、１５から２１アミノ酸長、１７から２１アミノ酸長、又は１９から２１アミノ酸長である。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から１９アミノ酸長、５から１９アミノ酸長、１０から１９アミノ酸長、１１から１９アミノ酸長、１２から２１アミノ酸長、１３から２１アミノ酸長、１５から２１アミノ酸長、又は１７から１９アミノ酸長である。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から１７アミノ酸長、５から１７アミノ酸長、１０から１７アミノ酸長、１１から１７アミノ酸長、１２から１７アミノ酸長、１３から１７アミノ酸長又は１５から１７アミノ酸長を有する。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から１５アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、１０から１５アミノ酸長、１１から１５アミノ酸長、１２から１５アミノ酸長又は１３から１５アミノ酸長を有する。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から１９アミノ酸長、５から１７アミノ酸長、５から１５アミノ酸長、５から１３アミノ酸長、又は５から１０アミノ酸長である。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から１９アミノ酸長、５から１７アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、３から１０アミノ酸長、又は５から１０アミノ酸長である。別の好ましい実施形態では、本発明のネオエピトープペプチドは、３から１９アミノ酸長、３から１７アミノ酸長、３から１３アミノ酸長、３から１０アミノ酸長、又は３から７アミノ酸長である。

本発明の好ましい実施形態では、ネオエピトープペプチドは、１０から２５個のアミノ酸、１０から２３個のアミノ酸、１０から２１個のアミノ酸、１０から１９個のアミノ酸、１０から１７個のアミノ酸、１０から１５個のアミノ酸であり、１、２、３、４若しくは５個、又は全ての体細胞変異アミノ酸を含む。好ましくは、ネオエピトープペプチドは、１０から２５アミノ酸長、１０から２３アミノ酸長、１０から２１アミノ酸長、１０から１９アミノ酸長、１０から１７アミノ酸長、１０から１５アミノ酸長であり、１、２又は３個の体細胞性アミノ酸又は全ての変異アミノ酸を含む。より好ましくは、ネオエピトープペプチドは、１０から２５アミノ酸長、１０から２３アミノ酸長、１０から２１アミノ酸長、１０から１９アミノ酸長、１０から１７アミノ酸長、１０から１５アミノ酸長であり、ネオエピトープは、１又は２個の体細胞変異アミノ酸又は全ての変異アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、ネオエピトープペプチドは、１０から２５アミノ酸長、１０から２３アミノ酸長、１０から２１アミノ酸長、１０から１９アミノ酸長、１０から１７アミノ酸長、１０から１５アミノ酸長であり、一個の体細胞変異アミノ酸又は全ての変異アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、ネオエピトープペプチドは、１０から２５アミ
ノ酸長、１０から２３アミノ酸長、１０から２１アミノ酸長、１０から１９アミノ酸長、１０から１７アミノ酸長、１０から１５アミノ酸長であり、一個の体細胞変異アミノ酸を含む。

本発明の別の好ましい実施形態では、ネオエピトープペプチドは、３から２５アミノ酸長、３から１７アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、３から１０アミノ酸長、又は５から１０アミノ酸長であり、１、２、３、４個、若しくは５個、又は全ての体細胞変異アミノ酸を含む。好ましくは、ネオエピトープペプチドは、３から２５アミノ酸長、３から１７アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、３から１０アミノ酸長又は５から１０アミノ酸長であり、１、２又は３個又は全ての体細胞変異アミノ酸を含む。より好ましくは、ネオエピトープペプチドは、３から２５アミノ酸長、３から１７アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、３から１０アミノ酸長又は５から１０アミノ酸長であり、１又は２個又は全ての体細胞変異アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、ネオエピトープペプチドは、３から２５アミノ酸長、３から１７アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、３から１０アミノ酸長又は５から１０アミノ酸長であり、１個又は全ての体細胞変異アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、ネオエピトープペプチドは、３から２５アミノ酸長、３から１７アミノ酸長、３から１５アミノ酸長、３から１０アミノ酸長又は５から１０アミノ酸長であり、１個又はすべての体細胞変異アミノ酸を含む。

本発明者らは、有利なことに、本発明のネオエピトープ、特に、３から２５アミノ酸長であるがん特異的タンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、１個以上の体細胞変異アミノ酸を含むネオエピトープが、対象において抗がん免疫応答を誘発するのに特に有効であるが、対象において自己免疫又は非がん特異的免疫応答を誘発しないことを見出した。

新生抗原性構築物は、１個のネオエピトープペプチドを含み得るか、又は２個以上のネオエピトープペプチドを含み得る。例えば、新生抗原性構築物は、１から５０個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のネオエピトープペプチド）を含み得る。好ましくは、新生抗原性構築物は、１から２０個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のネオエピトープペプチド）を含み、より好ましくは、１から１５個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のネオエピトープペプチド）を含み、より好ましくは、１から１０個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）を含み、より好ましくは、１から８個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８個）を含み、より好ましくは、１から６個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、５又は６個）を含み、さらにより好ましくは、１から５個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３、４、又は５個）を含む。新生抗原性構築物は、１から５個のネオエピトープペプチド（例えば、１、２、３又は４個）、さらにより好ましくは３から５個のネオエピトープペプチド、例えば３、４又は５個のネオエピトープペプチドを含むことが特に好ましい。

本発明の一実施形態では、新生抗原性構築物は、２個以上のネオエピトープペプチドを含む。例えば、新生抗原性構築物は、２から５０個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２３、２４、２５、２６、２７、２
８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のネオエピトープペプチド）を含み得る。好ましくは、新生抗原性構築物は、２から２０個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のネオエピトープペプチド）を含み得、より好ましくは、新生抗原性構築物は、２から１５個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のネオエピトープペプチド）を含み得、より好ましくは、２から１０個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）を含み得、より好ましくは、２から８個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７又は８個）を含み得、より好ましくは、２から６個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４、５又は６個）を含み得、さらにより好ましくは、２から５個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４又は５個）を含み得る。新生抗原性構築物は、２から５個のネオエピトープペプチド（例えば、２、３、４又は５個）を含み、さらにより好ましくは、３から５個のネオエピトープペプチド、例えば３、４又は５個のネオエピトープペプチドを含むことが特に好ましい。

本発明の別の実施形態では、新生抗原性構築物は、３個以上のネオエピトープペプチドを含む。例えば、新生抗原性構築物は、３から５０個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のネオエピトープペプチド）を含み得る。好ましくは、新生抗原性構築物は、３から２０個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のネオエピトープペプチド）を含み得、より好ましくは、新生抗原性構築物は、３から１５個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のネオエピトープペプチド）を含み得、より好ましくは、３から１０個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０）を含み得、より好ましくは３から８個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４、５、６、７又は８）を含み得、より好ましくは、３から６個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４、５又は６個）を含み得、さらにより好ましくは、３から５個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４又は５個）を含み得る。新生抗原性構築物は、３から５個のネオエピトープペプチド（例えば、３、４又は５個）、さらにより好ましくは、５個のネオエピトープペプチドを含むことが特に好ましい。

本発明のさらなる実施形態では、新生抗原性構築物は、４個以上のネオエピトープペプチド（例えば、４個のネオエピトープペプチド）、５個以上のネオエピトープペプチド（例えば、５個のネオエピトープペプチド）、又は６個以上のネオエピトープペプチド（例えば、６個のネオエピトープペプチド）を含む。

誤解を避けるために記すと、新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、１個以上のネオエピトープペプチド、２個以上のネオエピトープペプチド、又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含み得る実施形態では、各ネオエピトープペプチドは、本発明で使用するための本明細書に記載のネオエピトープペプチドである（すなわち、新生抗原性構築物の各ネオエピトープペプチドは、対象のがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、当該タンパク質又はペプチドの一部は、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する）。そのような実施形態では、各ネオエピトープペプチドは、本明細書に記載のネオエピトープペプチドの任意の特性及び／又は特徴を独立して有
し得る。

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、１個以上のネオエピトープペプチド、２個以上のネオエピトープペプチド、又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含み得る実施形態では、各ネオエピトープペプチドは同じアミノ酸配列を有し得るか、又はネオエピトープペプチドは異なるアミノ酸配列を有し得る（すなわち、新生抗原性構築物の一部のネオエピトープペプチドが異なるアミノ酸配列を有し得るか、又は新生抗原性構築物のネオエピトープペプチドのすべてが異なるアミノ酸配列を有し得る）。

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチドを含み得るある好ましい実施形態では、ネオエピトープペプチドの一部又は全部が異なるアミノ酸配列を有し、より好ましくは、ネオエピトープペプチドの全部が異なるアミノ酸配列を有する。新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチドを含む別の実施形態では、各ネオエピトープペプチドは同じアミノ酸配列を有する。

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、１個以上のネオエピトープペプチド、２個以上のネオエピトープペプチド、又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含み得、ネオエピトープペプチドの一部が異なるアミノ酸配列を有するか、又はネオエピトープペプチドのすべてが異なるアミノ酸配列を有する実施形態では、アミノ酸配列は、以下の理由で異なる可能性がある。すなわち、
対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドが異なる。あるいは、
対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドは同じであるが、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドのネオエピトープペプチドのアミノ酸配列が対応する部分が異なる。

対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドは同じであるが、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドのネオエピトープペプチドのアミノ酸配列が対応する部分が異なる場合、これらの部分は、以下の１以上の理由で異なる可能性がある。すなわち、
少なくとも１個の同じ体細胞変異アミノ酸を有する部分がより長い、
少なくとも１個の同じ体細胞変異アミノ酸を有する部分がより短い、及び／又は、
その部分が少なくとも１個の同じ体細胞変異アミノ酸を有するが、変異アミノ酸の位置がＣ末端及びＮ末端に関して異なる、
同じタンパク質又はペプチドの一部が少なくとも１個の異なる体細胞変異アミノ酸を有して異なる（例えば、タンパク質又はペプチドがフレームシフト突然変異を有し、異なる部分がタンパク質又はペプチドのフレームシフト突然変異配列の異なる部分である）。

ある好ましい実施形態では、各ネオエピトープペプチドに関して、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドが異なるため、そのアミノ酸配列が異なる。

ある好ましい実施形態では、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドが同じであるため、アミノ酸配列が異なるが、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドのネオエピトープペプチドのアミノ酸配列が対応する部分は、それぞれがタンパク質又はペプチドのフレームシフト変異配列の異なる部分であるため、異
なる。

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、２個以上のネオエピトープペプチド又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含む本発明の実施形態では、ネオエピトープペプチドは、直接連結されてもよく、又はスペーサー部分を介して連結されてもよい。

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、１個以上のネオエピトープペプチド、２個以上のネオエピトープペプチド、又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含むある好ましい実施形態では、ネオエピトープペプチドは共有結合している。

２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、２個以上のネオエピトープペプチド、又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含む本発明の新生抗原性構築物は、直接連結されたネオエピトープペプチド及び／又はスペーサー部分を介して連結されたネオエピトープを含み得る。２以上のスペーサー部分が新生抗原性構築物中に存在する場合、新生抗原性構築物のスペーサー部分は全て同じであってもよく、又は異なっていてもよい。

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチド（例えば、１個以上のネオエピトープペプチド、２個以上のネオエピトープペプチド、又は３個以上のネオエピトープペプチド）を含むある好ましい実施形態では、ネオエピトープペプチドはそれぞれ、スペーサー部分を介して連結される。

スペーサー部分は、アミノ酸の短い配列、例えば１から１５個のアミノ酸、好ましくは１から１０個のアミノ酸、より好ましくは１から５個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４又は５個のアミノ酸）であり得る。スペーサー部分は、アミノ酸のランダムな組み合わせを含み得、又は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグリシン、ポリアラニン若しくはポリヒスチジンアミノ酸配列のような合成アミノ酸配列を含み得る。好ましくは、スペーサー部分は、モチーフＶＶＲ及び／又はＧＧＳを含む。

２個の連結したネオエピトープペプチドを含む新生抗原性構築物の構造は、以下の通りであり得る。
－［第１のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第２のネオエピトープペプチド］

３個の連結されたネオエピトープを含む新生抗原性構築物の構造は、以下の通りであり得る。
－［第１のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第２のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第３のネオエピトープペプチド］

４個の連結されたネオエピトープを含む新生抗原性構築物の構造は、以下の通りであり得る。
－［第１のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第２のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第３のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第４のネオエピトープペプチド］

５個の連結されたネオエピトープを含む新生抗原性構築物の構造は、以下の通りであり得る。
－［第１のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第２のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第３のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分
］－［第４のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第５のネオエピトープペプチド］

ｎ個の連結したネオエピトープペプチドを含む新生抗原性構築物の構造は、以下の通りであり得る。
－［第１のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第２のネオエピトープペプチド］－［スペーサー部分］－［第３のネオエピトープペプチド］．．．．．－［スペーサー部分］－［第ｎのネオエピトープペプチド］

新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチドを含む場合、新生抗原性構築物は、ネオエピトープペプチドと、任意選択的に任意のスペーサー部分とからなり得る。あるいは、新生抗原性構築物が２個以上のネオエピトープペプチドを含む場合、新生抗原性構築物は、ネオエピトープペプチドと、任意選択で、任意のスペーサー部分及び追加的なアミノ酸配列とを含み得る。そのような追加的なアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸のランダムな組み合わせ（特に、高い割合のヒスチジン及び／又はシステイン残基を有するランダムな配列）、又は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリヒスチジン若しくはポリシステインアミノ酸配列（及び、好ましくは、ポリヒスチジン若しくはポリシステイン）などの合成アミノ酸配列であり得る。そのような追加的なアミノ酸配列は、例えば、貪食可能な粒子のコアと、それに強固に会合した新生抗原性構築物のネオエピトープペプチドとの間のリンカー及び／又はスペーサーとして使用され得、又は、新生抗原性構築物を貪食可能な粒子に強固に会合するために使用され得る。例えば、金属キレートは、ヒスチジン又はシステインを含有するタンパク質及びペプチドに大きな強度で結合することができる。したがって、金属キレートを有するコアは、ポリヒスチジン合成アミノ酸配列若しくはポリシステイン合成アミノ酸配列、並びに／又は、高い割合のヒスチジン残基及び／若しくはシステイン残基を有するアミノ酸のランダムな組み合わせを追加的なアミノ酸配列として含む新生抗原性構築物に非共有結合することができる。本明細書に記載の新生抗原構築物はまた、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含み得る。

本発明の実施形態では、新生抗原性構築物が１個のネオエピトープペプチドを含む場合、新生抗原性構築物はネオエピトープペプチドからなり得る。あるいは、新生抗原性構築物が１個のネオエピトープペプチドを含む場合、新生抗原性構築物は、ネオエピトープペプチド及び追加的なアミノ酸配列を含み得る。そのような追加的なアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸のランダムな組み合わせ（特に、高い割合のヒスチジン及び／又はシステイン残基を有するランダムな配列）、又は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリヒスチジン若しくはポリシステインアミノ酸配列（及び、好ましくは、ポリヒスチジン若しくはポリシステイン）などの合成アミノ酸配列であり得る。そのような追加的なアミノ酸配列は、例えば、貪食可能な粒子のコアと、それに強固に会合した新生抗原性構築物のネオエピトープペプチドとの間のリンカー及び／又はスペーサーとして使用され得、又は、新生抗原性構築物を貪食可能な粒子に強固に会合するために使用され得る。例えば、金属キレートは、ヒスチジン又はシステインを含有するタンパク質及びペプチドに大きな強度で結合することができる。したがって、金属キレートを有するコアは、ポリヒスチジン合成アミノ酸配列若しくはポリシステイン合成アミノ酸配列、並びに／又は、高い割合のヒスチジン残基及び／若しくはシステイン残基を有するアミノ酸のランダムな組み合わせを追加的なアミノ酸配列として含む新生抗原性構築物に非共有結合することができる。

本発明で使用するための新生抗原性構築物の長さは、例えば、新生抗原性構築物中のネオエピトープペプチドの数及び新生抗原性構築物中の各ネオエピトープペプチドの長さに依存し、並びに、２個以上のネオエピトープペプチドが存在する場合に存在し得る任意の
スペーサー部分の長さ及び存在し得る任意の追加的なアミノ酸配列の長さに依存する。ある好ましい実施形態では、本発明の新生抗原性構築物は、３から３００アミノ酸長、好ましくは１０から２５０アミノ酸長、より好ましくは１０から２００アミノ酸長、より好ましくは１０から１８０アミノ酸長であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、本発明の新生抗原性構築物は、１１から１５０アミノ酸長、１１から１４０アミノ酸長、３３から１２０アミノ酸長、４２から１４０アミノ酸長、１１から１１２アミノ酸長、３３から１１２アミノ酸長、２，４２から１１２アミノ酸長、１１から１００アミノ酸長、３３から１００アミノ酸長、４２から１００アミノ酸長、１１から８４アミノ酸長、３３から８４アミノ酸長、４２から８４アミノ酸長、１１から６０アミノ酸長、３３から６０アミノ酸長、又は４２から６０アミノ酸長、１１から５０アミノ酸長、３３から５０アミノ酸長、又は４２から５０アミノ酸長を含み得る。

本発明で使用するための新生抗原性構築物は、組換えにより（例えば、大腸菌、哺乳動物細胞又は昆虫細胞において）、合成的に（例えば、溶液又は固相ペプチド合成などの標準的な有機化学技術を使用して）調製することができ、又は、動物源（例えば、ヒト源）に由来する天然タンパク質若しくはペプチドから単離されたポリペプチドから調製することができる。好ましくは、本発明で使用するための新生抗原性構築物は、組換えにより調製される（例えば、大腸菌、哺乳動物細胞又は昆虫細胞において）。より好ましくは、本発明で使用するための新生抗原性構築物は、大腸菌で組換えにより調製される。

貪食可能な粒子及び貪食可能な粒子のコア
本発明の貪食可能な粒子は、免疫系の細胞によって貪食され得る粒子である。しかしながら、本発明の貪食可能な粒子は、異なる経路（例えば、飲作用、クラスリン媒介エンドサイトーシス及び非クラスリン媒介エンドサイトーシス）を介して免疫系の細胞によって取り込まれ得ることを理解されたい。好ましくは、貪食可能な粒子は、ＡＰＣ、例えば、単球、樹状細胞、Ｂ細胞若しくはマクロファージ、又は、抗原などの細胞外分子を貪食するか取り込んでＭＨＣクラスＩＩ及び／若しくはＭＨＣクラスＩ分子上の抗原由来ペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する他の細胞によって貪食可能である。

貪食経路によってＡＰＣに取り込まれる抗原は不均一に分解され、その後、ＡＰＣがより多様な抗原由来ペプチドを提示する。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明で使用するための貪食可能な粒子は、新生抗原性構築物がＡＰＣによって貪食されることで、抗がんＴ細胞の活性化及び増殖をさらに改善すると考えられており、その結果、より多様な新生抗原性構築物由来ペプチドがＡＰＣによって提示され、それゆえに、抗がんＴ細胞のさらなる活性化及び増殖をもたらす。

ＡＰＣなどの免疫系の細胞によって貪食される粒子の場合、粒子は、貪食を可能にするのに適したサイズの範囲内である必要がある。例えば、小さすぎる粒子は、特定のＡＰＣによる食作用を誘発しない場合があり、また、大きすぎる粒子は、特定のＡＰＣによる食作用が可能でない場合がある。完全な食作用は、ＡＰＣによる良好な抗原分解及びその後のＭＨＣクラスＩＩ経路を介したＴ細胞への良好な提示をもたらす。最適なサイズは、本発明者らによって研究されている（実施例３ａ及び３ｂ、並びに図１、図５Ａ～Ｃ及び図６Ａ～Ｅを参照されたい）。

本発明の貪食可能な粒子は、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含む。したがって、コアのサイズは、コアが新生抗原性構築物に強固に会合している場合に、コアとその強固に会合した新生抗原性構築物が免疫系の細胞、特にＡＰＣによって貪食可能であるような範囲内である必要がある。コアのサイズは、コアが新生抗原性構築物と強固に会合している場合に、コアとその強固に会合した新生抗原性構築物が、２個以上の貪
食可能な粒子が食作用によって同じＡＰＣに入ることができるほどに十分に小さくなるような範囲内であることが好ましい。ＡＰＣ中に２個以上の貪食された粒子を有することは、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介した細胞表面上のネオエピトープの提示を最大化する。さらに、このことは、異なる新生抗原性構築物（特に、異なるネオエピトープペプチドを含む新生抗原性構築物）を有する粒子がＡＰＣに入ることを可能にし、これは、ＡＰＣが、異なるファゴソームにおいて、いくつかの粒子からの異なるネオエピトープを同時に提示し得ることを意味する。

したがって、好ましい一実施形態では、コアは、６μｍ未満、５．６μｍ未満、４μｍ未満、３μｍ未満、２．５μｍ未満、２μｍ未満又は１．５μｍ未満の最大寸法を有する。より好ましくは、コアは、１．５μｍ未満の最大寸法を有する。別の好ましい実施形態では、コアは、０．００１μｍ超、０．００５μｍ超、０．０１μｍ超、０．０５μｍ超、０．１μｍ超、０．２μｍ超、又は０．５μｍ超の最大寸法を有してもよい。より好ましくは、コアは、０．５μｍを超える最大寸法を有する。

特に好ましい一実施形態では、コアは、０．１から６μｍ、例えば０．１から５．６μｍ、０．２から５．６μｍ、０．５から５．６μｍ、０．１から４μｍ、又は０．５から４μｍの範囲の最大寸法を有する。より好ましくは、コアは、０．１から３μｍ、例えば０．５から３μｍ、０．２から２．５μｍ、０．５から２．５μｍ、０．２から２μｍ、０．５から２μｍ又は１から２μｍの範囲内の最大寸法を有する。さらにより好ましくは、コアは、約１μｍ、約１．５μｍ又は約２μｍの最大寸法を有する。本発明の非常に好ましい実施形態では、コアは、約１μｍである。

本発明の貪食可能な粒子のコアは、任意の三次元形状、例えば、任意の規則的又は不規則な三次元形状の形態をとる。好ましくは、貪食可能な粒子は実質的に球形であり、この場合、貪食可能な粒子の寸法は直径を指す。

貪食可能な粒子のコアは、ポリマー、ガラス、セラミック材料を含み得る（例えば、コアは、ポリマー粒子、ガラス粒子又はセラミック粒子であってもよい）。コアの材料は、生分解性及び／又は生体適合性材料であってもよい（例えば、粒子は、生分解性及び／又は生体適合性粒子であってもよい）。

好ましくは、コアは、ポリマーを含む（例えば、コアはポリマー粒子である）。コアがポリマーを含む場合、それは、合成芳香族ポリマー（ポリスチレンなど、例えば、コアはポリスチレン粒子である）、合成非芳香族ポリマー（ポリエチレン、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）及びポリカプロラクトンなど、例えば、コアはポリエチレン粒子、ポリ乳酸粒子、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）粒子又はポリカプロラクトン粒子である）、天然ポリマー（コラーゲン、ゼラチン、タンパク質など（例えば、ウイルス様粒子）、脂質又はアルブミンなど、例えば、コアはコラーゲン粒子、ゼラチン粒子又はアルブミン粒子である）、ポリマー炭水化物分子（多糖など、例えば、アガロース、アルギネート、キトサン又はザイモサンなど、例えば、コアはアガロース粒子、アルギネート粒子、キトサン粒子又はザイモサン粒子である）からなる群から選択され得る。

好ましい一実施形態では、コアは、ポリスチレン又はポリエチレンを含み、より好ましくはポリスチレンを含む（例えば、コアは、ポリスチレン粒子である）。このようなポリマーは、生体適合性である。

本発明者らは、ポリスチレン粒子が非毒性であり、様々なサイズ及び様々な官能化可能な形態で広く市販されていることから、ポリスチレン粒子が本発明の貪食可能な粒子の特に有用なコアであることを見出した。さらに、本発明者らは、ポリスチレン粒子などのポ
リスチレンコアを含む貪食可能な粒子が、対象へ投与する粒子を調製するための厳格な滅菌手順に耐えることができることを見出した。そのような滅菌手順は、酸又はアルカリ溶液による繰り返しの洗浄及び／又は高温への曝露を含み得る。

本発明の非常に好ましい一実施形態では、コアは、６μｍ未満、好ましくは約１μｍから約３μｍ、より好ましくは約１μｍの最大寸法を有するポリスチレン粒子である。約１μｍから約３μｍ、特に約１μｍの寸法を有するポリスチレン粒子コアを含む貪食可能な粒子は、ＡＰＣによって効率的に貪食され、コア又は新生抗原性構築物に会合し得る、病原体（例えば、細菌、真菌及びウイルス）並びに発熱物質（例えば、エンドトキシン）などの抗原性汚染物質を除去するための厳格な滅菌手順に耐えることもできる。

本発明の一実施形態では、コアは、磁気特性を有する。例えば、コアは、常磁性又は超常磁性を有し得る。好ましくは、コアは超常磁性特性を有する。

本発明での使用に適した超常磁性コアの例は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、様々な官能化可能な形態、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０カルボン酸、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０アミン及びＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅカルボン酸で入手可能である。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、単サイズの超常磁性粒子であり、一様に分布した磁性材料を有する高度に架橋したポリスチレンから構成される。磁性材料は、酸化鉄であってもよい。磁性コア、特に超常磁性コアの他の例としては、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ Ｅｓｔａｐｏ（登録商標）ＳｕｐｅｒＰａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（メルク・シミーＳ．Ａ．Ｓ．）及びＳｅｒａ－Ｍａｇ ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（親水性）カルボキシレート修飾磁性粒子（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ）が挙げられる。Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）ＳｕｐｅｒＰａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓは、酸化鉄コアをカプセル化するコア－シェル構造で作られている。

本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した新生抗原性構築物を含む。新生抗原性構築物は、様々な手段を使用してコアに強固に会合することができる。例えば、新生抗原性構築物は、共有結合、例えば、新生抗原性構築物のアミン基又はカルボン酸基とコアの表面のカルボン酸基又はアミン基との間のアミド結合によってコアに結合され得る。あるいは、新生抗原性構築物は、金属キレートを介してコアに連結されてもよい。例えば、イミノ二酢酸などの金属キレート配位子で連結されたコアは、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋又はＦｅ^３＋などの金属イオンに結合することができる。次いで、これらの金属キレートは、例えば、ヒスチジン又はシステインを含むタンパク質及びペプチドに大きな強度で結合することができる。その結果、金属キレートを有するコアは、新生抗原性構築物に非共有結合的に結合することができる。好ましくは、新生抗原性構築物は、コアに共有結合的に付着している。新生抗原性構築物をコアに会合させる一例を実施例１に示す。

本発明の貪食可能な粒子は、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含む。本発明の貪食可能な粒子は、コアに会合した１個以上の新生抗原性構築物を含み得る。例えば、本発明の貪食可能な粒子は、１から３００万個の新生抗原性構築物、好ましくは１から２００万個の新生抗原性構築物、より好ましくは１から１００万個の新生抗原性構築物、例えば１から８００，０００個、１から５００，０００個、１から１００，０００個、１から１０，０００個、１から１０００個、１から１００個又は１から１０個の新生抗原性構築物を含み得、あるいは、例えば、１０から１００万個、１００から１００万個、１０００から１００万個、１０，０００から１００万個、１００，０００から１００万個、又は５００，０００から１００万個の新生抗原性構築物を含み得る。好ましくは、本
発明の貪食可能な粒子は、５００，０００から１００万個の新生抗原性構築物を含み得る。

好ましい実施形態では、ＡＰＣへの新生抗原性構築物の送達を最大化するために（その後、新生抗原性構築物は貪食可能な粒子から切断され、ＡＰＣによって処理され得、その結果、ＡＰＣの表面上に多種多様なネオエピトープ由来ペプチドを提示する）、本発明の貪食可能な粒子は、コアに会合する２個以上（すなわち、２個以上、例えば、２から３００万個）の新生抗原性構築物を含み得る。例えば、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した２から１００万個の新生抗原性構築物（例えば、コアに強固に会合した２から８００，０００個、２から５００，０００個、２から１００，０００個、２から１０，０００個、２から１０００個、２から１００個又は２から１０個の新生抗原性構築物）を含み得る。好ましくは、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１０から１００万個の新生抗原性構築物（例えば、コアに強固に会合した１０から８００，０００個、１０から５００，０００個、１０から１００，０００個、１０から１０，０００個、１０から１０００個、又は１０から１００個の新生抗原性構築物）など、コアに強固に会合した１０個以上の新生抗原性構築物を含む。より好ましくは、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１００から１００万個の新生抗原性構築物（例えば、コアに強固に会合した１００から８００，０００個、１００から５００，０００個、１００から１００，０００個、１００から１０，０００個、又は１００から１０００個の新生抗原性構築物）など、コアに強固に会合した１００個以上の新生抗原性構築物を含む。ある実施形態では、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１０００から１００万個の新生抗原性構築物（例えば、コアに密に会合した１０００から８００，０００個、１０００から５００，０００個、１０００から１００，０００個、又は１０００から１０，０００個の新生抗原性構築物）など、コアに強固に会合した１０００個以上の遺伝子構築物を含む。ある実施形態では、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１０，０００個から１００万個の新生抗原性構築物（例えば、コアに密に会合した１０，０００から８００，０００個、１０，０００から５００，０００個、又は１０，０００から１００，０００個の新生抗原性構築物）など、コアに強固に会合した１０，０００個以上の新生抗原性構築物を含む。ある実施形態では、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１００，０００から１００万個の新生抗原性構築物（例えば、コアに強固に会合した１００，０００から８００，０００個又は１００，０００から５００，０００個の新生抗原性構築物）など、コアに強固に会合した１００，０００個以上の新生抗原性構築物を含む。非常に好ましい一実施形態では、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した５００，０００から１００万個の新生抗原性構築物、又はコアに強固に会合した５００，０００から２００万個の新生抗原性構築物、又はコアに強固に会合した５００，０００から３００万個の新生抗原性構築物など、コアに強固に会合した５００，０００個以上の新生抗原性構築物を含む。別の実施形態では、本発明の貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１００万個を超える新生抗原性構築物、例えば、コアに強固に会合した１００万から３００万個又は１００万から２００万個の新生抗原性構築物を含み得る。

本発明の実施形態では、本発明の貪食可能な粒子が、コアに会合した２個以上の新生抗原性構築物（例えば、コアに会合した２個以上、１０個以上、１００個以上、１０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上又は５００，０００個以上の新生抗原性構築物）を含み得る場合、コアに会合した新生抗原性構築物は同じであってもよく、又は異なっていてもよい（すなわち、コアに会合した新生抗原性構築物の一部又は全部が異なっていてもよい）。それらは、異なるネオエピトープペプチド配列を含むことによって異なり得、又はネオエピトープペプチドの異なる組み合わせを含むことによって異なり得る。代替的又は追加的に、それらは、１個以上の異なるスペーサー部分又は追加的なアミノ酸配列を含むことによって異なり得る（そのような部分及び配列が存在する場合には）。異なる新生抗原性構築物は、「異なるタイプ」の新生抗原性構築物と呼ばれることがあ
る。同一の新生抗原性構築物は、「同じタイプ」の新生抗原性構築物と呼ばれることがある。がん細胞は、しばしば、がん細胞によって発現される複数のタンパク質又はペプチドにおいて複数のアミノ酸変異を誘導する。本発明者らは、２個以上の異なるタイプの新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子が、多種多様なネオエピトープをＡＰＣに送達し、その結果、ＡＰＣによって提示されるネオエピトープ由来ペプチドの多様性を増加し得ることを見出した。本発明者らは、このことが、がん細胞を標的化することができる抗がんＴ細胞の活性化及び増殖を有意に改善することを見出した。

本発明のコアに会合した２個以上の新生抗原性構築物（例えば、コアに会合した２個以上、１０個以上、１００個以上、１０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上又は５００，０００個以上の新生抗原性構築物）を含む貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１種類の新生抗原性構築物を含むことができる（すなわち、コアに強固に会合したすべての新生抗原性構築物は同じである）。本発明の一実施形態では、貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１００，０００から１００万個の新生抗原性構築物を含み、１００，０００から１００万個の新生抗原性構築物は同じ種類の新生抗原性構築物である。

本発明の代替的な実施形態では、コアに会合した２個以上の新生抗原性構築物（例えば、コアに会合した２個以上、１０個以上、１００個以上、１０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上又は５００，０００個以上の新生抗原性構築物）を含む貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した２つの異なる新生抗原性構築物のタイプを含み得る。本発明の別の実施形態では、コアに会合した１１個以上の新生抗原性構築物（例えば、コアに会合した１００個以上、１０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上又は５００，０００個以上の新生抗原性構築物）を含む貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した２種類以上の異なる新生抗原性構築物のタイプを含み得る。例えば、そのような貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した２から１０種類（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種類）の異なる新生抗原性構築物のタイプを含み得る。好ましくは、そのような貪食可能な粒子は、２から６種類の異なる新生抗原性構築物のタイプ（例えば、２、３、４、５又は６種類）を含み得る。本発明の一実施形態では、貪食可能な粒子は、コアに強固に会合した１００，０００から１００万個の新生抗原性構築物を含み、１００，０００から１００万個の新生抗原性構築物は、２種類以上の異なる新生抗原性構築物タイプを含む。例えば、２から６種類の異なる新生抗原性構築物のタイプ（例えば、２、３、４、５又は６種類）。

本発明の一実施形態では、貪食可能な粒子は、コアに強固に会合したアジュバントをさらに含む。本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する任意の物質として理解されるものである。アジュバントの特定の例としては、ポリイノシン：ポリシチジル酸などのｄｓＲＮＡ類似体、不完全フロイントアジュバント、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７及びＩＬ－１５）、ＣＤ４０、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、サポニン、コロイドミョウバン、及びリポ多糖の脂質Ａの類似体が挙げられる。アジュバントは、本明細書に記載された新生抗原性構築物をコアに強固に会合させるための方法と同じ方法でコアに強固に会合し得る。

貪食可能な粒子の滅菌
本発明者らは、有利なことに、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含む貪食可能な粒子が、対象への投与前に効率的に洗浄及び滅菌され得ることを見出した。これは、洗浄及び滅菌された 貪食可能な粒子が含む病原体（例えば、細菌、真菌及びウイルス）並びにエンドトキシン（例えば、リポ多糖）及びその他の抗原性汚染物質など汚染物質がより低いレベルであることから、特に有利である。そのような汚染物質は、対象
において非特異的免疫応答を誘発する可能性がある。したがって、投与前の本発明の貪食可能な粒子の洗浄及び滅菌は、その安全性及び有効性を改善する。

本発明の一実施形態では、貪食可能な粒子は、磁性コアを含み、例えば常磁性コア又は超常磁性コアを含む。磁性コアを含む貪食可能な粒子は、磁石によって収集することができ、及び／又は、定位置に保持することができる。他の手段によって、例えば、貪食可能な粒子（常磁性であろうとなかろうと）をカラムに保持することによって、又は、重力若しくは遠心分離により粒子を沈降させることによって洗浄を行うことも可能である。

洗浄の特定の方法は、本発明の文脈において重要ではない。例えば、洗浄は、貪食可能な粒子を高ｐＨ、低ｐＨ、高温、滅菌／変性剤、又はそれらの組み合わせにさらすことを含み得る。

洗浄は、貪食可能な粒子をアルカリ、好ましくは強アルカリ、例えば、少なくとも０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍのアルカリにさらすことを含み得る。好ましくは、洗浄は、貪食可能な粒子を少なくとも１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、例えば、少なくとも２ＭのＮａＯＨにさらすことを含み得る。好ましくは、洗浄は、貪食可能な粒子を少なくとも１３．０、より好ましくは少なくとも１４．０、最も好ましくは少なくとも１４．３の高ｐＨにさらすことを含む。使用し得る他のアルカリとしては、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）_２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）_２）、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）_２）、及び水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）_２）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、洗浄は、貪食可能な粒子を少なくとも１３．０、より好ましくは少なくとも１４．０、最も好ましくは少なくとも１４．３の高ｐＨにさらすことを含む。

洗浄はまた、貪食可能な粒子を酸、好ましくは強酸、例えば、少なくとも０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍの酸にさらすことを含み得る。好ましくは、洗浄は、貪食可能な粒子を少なくとも１Ｍの塩酸（ＨＣｌ）、例えば、少なくとも２ＭのＨＣｌにさらすことを含み得る。使用し得る他の酸としては、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、過塩素酸（ＨＣｌＯ_４）、硝酸（ＨＮＯ_３）及び硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）が挙げられるが、これらに限定されない。

洗浄はまた、貪食可能な粒子をさらに尿素及び／又はグアニジン－ＨＣｌなどの滅菌／変性剤にさらすことを含み得る。

好ましくは、洗浄により、貪食可能な粒子が無菌及び／又は滅菌される。より好ましくは、洗浄により、貪食可能な粒子が滅菌される。本明細書で定義される無菌は、疾患を引き起こす微生物及びウイルスを含まない。滅菌は、本明細書において、すべての生物学的汚染物質を含まないと定義される。

好ましくは、洗浄はまた、貪食可能な粒子から発熱物質（例えばエンドトキシン）などの抗原性汚染物質を除去する。好ましくは、洗浄は、１００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満のエンドトキシン汚染物質を有する貪食可能な粒子をもたらす。

したがって、本発明の好ましい実施形態では、貪食可能な粒子は滅菌され、１００ｐｇ／ｍｌ未満のエンドトキシン汚染物質を有する。

洗浄の注目すべき利点は、貪食可能な粒子が単一工程で滅菌及び変性されるように条件
を選択できることである。特に、高ｐＨ洗浄（例えば、ｐＨ＞１４）は、貪食可能な粒子を簡便に、同時にかつ迅速に滅菌し、十分な量のエンドトキシン及び他の抗原性汚染物質を除去することができる。

洗浄は、１回の洗浄又は数回の反復洗浄、例えば、２、３、４又は５回の洗浄を含み得る。加えて、又は代替的に、貪食可能な粒子は、高温、例えば、少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９２℃、より好ましくは少なくとも９５℃、例えば、少なくとも１００℃又は少なくとも１１０℃にさらしてもよい。

本発明者らは、有利なことに、新生抗原性構築物が共有結合によってコアに会合している場合には、貪食可能な粒子は、新生抗原性構築物又はコアに結合し得る発熱物質（例えば、エンドトキシン）などの抗原性汚染物質の量を減少させる厳格な滅菌及び洗浄手順に耐え得ることを見出した。これは、本明細書に記載の貪食可能な粒子ががんの治療又は予防における使用に特に適していることを意味する。

注射用組成物
本発明は、本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を提供する。

本明細書に記載の貪食可能な粒子を含む本発明の注射用組成物は、１個以上の貪食可能な粒子を含み得る。好ましくは、それは２個以上の粒子を含む。そのような実施形態では、それらの貪食可能な粒子は同じであってもよく、又は異なっていてもよい。貪食可能な粒子は、コアによって異なっていてもよく、及び／又はコアに強固に会合した異なる種類の新生抗原性構築物を含むことによって異なっていてもよい。好ましくは、本発明の貪食可能な粒子を含む組成物であって、中の貪食可能な粒子が異なる組成物では、それらの貪食可能な粒子は、同じコアを有し、当該粒子がコアに強固に会合した異なる種類の新生抗原性構築物を含むために異なる。

異なるコア（例えば、異なるサイズを有する、及び／又は本明細書に記載の異なる材料／ポリマーを含むコア）を有する貪食可能な粒子は、本明細書では 「異なるセット」 の貪食可能な粒子と呼ぶ。同じコア（例えば、同じサイズを有し、同じ材料／ポリマーを含むコア）を有する貪食可能な粒子は、本明細書では「同じセット」の貪食可能な粒子と呼ぶ。

同じコアを有する貪食可能な粒子である（すなわち、それらは同じ貪食可能な粒子セットである）が、コアに強固に会合した異なる種類の新生抗原性構築物を有するために異なる貪食可能な粒子は、本明細書では「異なる群」の貪食可能な粒子と呼ぶ。同じコアと、そのコアに強固に会合した同じ種類の新生抗原性構築物とを有する貪食可能な粒子は、本明細書では「同じ群」の貪食可能な粒子と呼ぶ。

一実施形態では、本発明の注射用組成物は、１つの貪食可能な粒子群（すなわち、組成物中の貪食可能な粒子のすべてが同じである）からなる１つの貪食可能な粒子セットを含む。あるいは、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０又は５０、又はそれ以上の貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。一実施形態では、本発明の注射用組成物は、２から５０の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、４０又は５０の貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。一実施形態では、本発明の注射用組成物は、２から３０の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５又は３０の貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。別の実施形態では、本発明の注
射用組成物は、２から２０個の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８又は２０個の貪食可能な粒子群）を含む１個の貪食可能な粒子セットを含み得る。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２から１５の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２又は１５の貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２から１０の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２から８の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７又は８の貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２から６の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５又は６つの貪食可能な粒子群）を含む１つの貪食可能な粒子セットを含み得る。

一実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セットを含む（すなわち、各セットは異なるコアを有し、例えば、各セットは異なるサイズのコアを有し、及び／又は本明細書に記載の異なる材料を含む）ことができ、各セットは１つの貪食可能な粒子群からなることができる。例えば、本発明の注射用組成物は、２、３、４又は５の貪食可能な粒子セットを含むことができ、各セットは、１つの貪食可能な粒子群からなることができる。好ましくは、本発明の注射用組成物は、２又は３の貪食可能な粒子セットを含むことができ、各セットは１つの貪食可能な粒子群からなる。

別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２以上の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５又は３０の貪食可能な粒子群）を含むことができる。一実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２から３０の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５又は３０の貪食可能な粒子群）を含むことができる。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２から２０の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８又は２０の貪食可能な粒子群）を含むことができる。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２から１５の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２又は１５の貪食可能な粒子群）を含むことができる。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２から１０の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の貪食可能な粒子群）を含むことができる。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２から８の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５、６、７又は８の貪食可能な粒子群）を含むことができる。別の実施形態では、本発明の注射用組成物は、２以上の異なる貪食可能な粒子セット（例えば、２、３又は４の貪食可能な粒子セット）を含むことができ、各セットは、２から６の異なる貪食可能な粒子群（例えば、２、３、４、５又は６の貪食可能な粒子群）を含むことができる。

誤解を避けるために記すと、貪食可能な粒子の２以上のグループ及び貪食可能な粒子の２以上のセットを有する実施形態では、貪食可能な粒子セットの各グループは、別の貪食可能な粒子セットの各グループから独立している。したがって、ある貪食可能な粒子セッ
トからの群は、別の貪食可能な粒子セットからの群と同じ新生抗原性構築物タイプを有することができる。あるいは、１つの貪食可能な粒子セットからの群は、別の貪食可能な粒子セットからの群のものとは異なるタイプの新生抗原性構築物を有することができる。

がん細胞は、しばしば、がん細胞によって発現される複数のタンパク質又はペプチドにおいて複数のアミノ酸変異を誘導する。２以上の貪食可能な粒子群を含む注射用組成物の投与は、多種多様なネオエピトープをＡＰＣに送達することを可能にし、その結果、ＡＰＣによって提示されるネオエピトープ由来ペプチドの多様性を増加させる。ＡＰＣによって提示されるネオエピトープ由来ペプチドの多様性の増加は、抗がんＴ細胞の活性化及び増殖を有意に改善することができる。

本発明による有用な薬学的に許容され得る注射用製剤としては、非経口投与（皮下、皮内、筋肉内、静脈内（ボーラス又は注入）、関節内、及びリンパ内を含む）に適したものが挙げられる。最も適切な経路は、例えば、レシピエントの状態及び疾患に依存し得る。好ましくは、医薬組成物は、静脈内及び／又はリンパ内投与に適している。このように、本発明は、本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を提供する。

好ましくは、本発明の注射可能な組成物は、注射可能な医薬組成物である。本発明の注射用組成物は、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与（ボーラス又は注入）、腫瘍内投与、関節内投与及びリンパ内投与に適した組成物を含むが、最も適した経路は、例えば、対象に存在するがん又は腫瘍の種類に依存し得る。好ましくは、注射用組成物は、静脈内投与及び／又はリンパ内投与に適している。

本発明の薬学的に許容され得る注射用製剤及び本発明の注射用組成物は、水性及び非水性滅菌注射溶液（例えば、ＰＢＳなどの生理食塩水）を含み得、抗酸化剤、緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＴＲＩＳ及びＴＥＡ）、静菌剤、界面活性剤（例えば、ポロキサマー、ポリソルベート、ＣＨＡＰＳ及びＴｉｔｏｎ Ｘ－１００）、及び当該組成物を対象となるレシピエントの血液と等張にする溶質、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含有し得る。組成物は、ユニットドーズ型容器又はマルチドーズ型容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルで提供されてもよく、また、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、生理食塩水又は注射用蒸留水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されてもよい。非経口投与のための即時注射溶液及び懸濁液としては、例えば、マンニトール、１，３－ブタンジオール、水、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液、又は、合成モノグリセリド若しくは合成ジグリセリドと、オレイン酸若しくはクレマフォールを含む脂肪酸とを含む他の適切な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁剤といった、適切な非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒を含有し得る注射可能な溶液又は懸濁液が挙げられる。

本発明の薬学的に許容され得る製剤及び本発明の注射用組成物は、アジュバントをさらに含み得る。本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する任意の物質として理解されるものである。本発明で使用するためのアジュバントの例としては、ポリイノシン：ポリシチジル酸などのｄｓＲＮＡ類似体、不完全フロイントアジュバント、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、ＣＤ４０、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、サポニン、コロイドミョウバン、及びリポ多糖の脂質Ａの類似体が挙げられる。したがって、本発明の注射用組成物は、ポリイノシン：ポリシチジル酸などのｄｓＲＮＡ類似体、不完全フロイントアジュバント、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７及びＩＬ－１５）、ＣＤ４０、キーホールリンペットヘモシアニン、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、サポニン、コロイドミョウバン、及びリポ多糖の脂質Ａの類似体を含み得る。

本発明の薬学的に許容され得る製剤及び本発明の注射用組成物の好ましい単位投与量は、貪食可能な粒子についての、治療用量（すなわち、がんに対する一次免疫応答を誘発するのに適した用量）、若しくはブースター用量（すなわち、がんに対する二次免疫応答を誘導するのに適した用量）、又はそれらの適切な分画を含むものである。貪食可能な粒子の単位投与量は、１μｇから４０００μｇ、１０μｇから３０００μｇ、又は１０μｇから２０００μｇであり得る。例えば、単位投与量は、１０μｇから１０００μｇ、１０μｇから７５０μｇ、１０μｇから５００μｇ、２０から４００μｇ、２５μｇから３００μｇ、又は３０μｇから２００μｇ、５０μｇから１０００μｇ、５０μｇから７５０μｇ、５０μｇから５００μｇ、５０μｇから４００μｇ、５０μｇから３００μｇ、５０μｇから２００μｇ、１００μｇから１０００μｇ、１００μｇから７５０μｇ、１００μｇから５００μｇ、１００μｇから４００ μｇ、１００μｇから３００μｇ又は１００μｇから２００μｇ、２００μｇから１０００μｇ、２００μｇから７５０μｇ、２００μｇから５００μｇ、２００μｇから４００μｇ、２００μｇから３００μｇ、４００μｇから１０００μｇ、４００μｇから７５０μｇ、４００μｇから５００μｇ、５００μｇから１０００μｇ、５００μｇから７５０μｇ、又は７５０μｇから１０００μｇであり得る。例えば、貪食可能な粒子の単位投与量は、１、１０、５０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００又は４０００μｇであり得る。好ましくは、上記単位投与量は、１００から７５０μｇ、より好ましくは２００から７５０μｇ、より好ましくは３００から７５０μｇ、より好ましくは４００から７５０μｇ、より好ましくは５００から７５０μｇ、より好ましくは６００から７５０μｇ、さらに好ましくは６５０から７５０μｇである。例えば、貪食可能な粒子の単位投与量は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００又は７５０μｇであり得る。

上記で特に言及した成分に加えて、本発明の薬学的に許容され得る製剤及び本発明の注射用組成物は、問題の組成物の種類を考慮して当技術分野で慣用的な他の薬剤を含み得ることを理解されたい。

本発明の様々な実施形態で使用するための本発明の貪食可能な粒子は、唯一の活性成分として使用することができるが、貪食可能な粒子をさらに１種以上の活性剤と組み合わせて使用することも可能である。上述したように、本発明はまた、対象のがんの治療若しくは予防に使用するための、又は対象のがんの治療若しくは予防の方法に使用するための貪食可能な粒子を、本発明に従って、同時に、逐次的に若しくは別々に投与するための追加的な活性薬剤と併せて提供する。かかる追加的な活性剤は、がんの治療に有用な薬剤又は他の医薬活性材料であり得るが、好ましくは、がんの治療用として既知の薬剤である。かかる薬剤は、当技術分野で既知である。追加的な活性剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、免疫調節薬、微小管相互作用薬、プロテインキナーゼ阻害剤、ステロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤及び血管新生阻害剤が挙げられる。

したがって、対象のがんの治療若しくは予防に使用するための、又は本発明の対象のがんの治療若しくは予防の方法に使用するための本発明の貪食可能な粒子は、がんの治療若しくは予防用として既知の１種以上の化合物、例えば、１種以上のアルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、免疫調節薬、微小管相互作用薬、プロテインキナーゼ阻害剤、ステロイド、トポイソメラーゼ阻害剤細胞周期阻害剤、又は血管新生阻害剤と一緒に投与され得る。

組み合わせで使用される場合、追加的な活性薬剤の正確な投与量は、投与スケジュール、選択された特定の薬剤の経口効力、対象（典型的には哺乳動物又はヒト）の年齢、体格
、性別及び症状、がんの性質及び重症度、並びに他の関連する医学的及び物理的要因によって異なる。したがって、正確な治療用量又はブースター用量を事前に特定することはできず、介護者又は臨床医によって容易に決定することができる。適切な量は、動物モデル及びヒトの臨床研究からの所定の実験によって決定することができる。ヒトの場合、治療用量又はブースター用量は既知であるか、そうでなければ当業者によって決定される。

かかる組合せの個々の成分は、治療過程の異なる時間において別々に投与することができ、又は分割された若しくは単一の組合せ形態で同時に投与することができる。したがって、本発明は、同時処置又は交互処置のすべてのそのようなレジームを包含するものとして理解されるべきである。

上記の追加的な活性剤は、本発明において有用な化合物と組み合わせて使用される場合、例えば、医師用添付文書集（ＰＤＲ）に示される量で、又はそうでなければ当業者によって決定される量で使用され得る。

処置
本発明は、対象におけるがんの治療又は予防に使用するための貪食可能な粒子であって、当該貪食可能な粒子が、コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含み、当該新生抗原性構築物が、対象におけるがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、当該タンパク質又はペプチドの一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、貪食可能な粒子を提供する。本発明はまた、本発明の貪食可能な粒子を対象に投与する工程を含む、対象のがんを治療又は予防する方法を提供する。本発明はまた、がんを治療又は予防するための医薬品を製造するための本発明の貪食可能な粒子の使用を提供する。

本発明者らは、本発明で使用される貪食可能な粒子が、驚くべきことに、対象においてがん細胞に対する堅牢な抗がん免疫応答を誘発するのに有効であることを見出した。一般的なレベルでは、免疫応答は、自然免疫応答又は適応免疫応答のいずれかに分類することができる。自然免疫応答は、抗原との事前の接触によって本質的に影響を受けない免疫応答である。かかる応答は、しばしば、ナイーブＴ細胞及びＢ細胞の活性化及び増殖を特徴とする。対照的に、適応免疫応答は、抗原との事前の接触を必要とする免疫応答である。適応免疫応答は、一般に、自然免疫応答の直後に続き、最終的に抗原に対する免疫記憶をもたらす。免疫系が抗原と初めて接触するときに誘発される免疫応答（自然応答及び適応応答）は、しばしば「一次免疫応答」と呼ばれる。同じ抗原によるメモリーＴ細胞及びＢ細胞の後の活性化は、抗原に対する迅速かつ特異的な免疫応答をもたらし、抗原に対するこの迅速かつ特異的な免疫応答は、しばしば「二次免疫応答」と呼ばれる。

本投資家は、驚くべきことに、本発明の貪食可能な粒子が、対象において自然免疫応答及び適応免疫応答の双方を活性化することによって堅牢な抗がん免疫応答を誘発することを見出した。

本発明で使用される貪食可能な粒子によって誘導される免疫応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による貪食可能な粒子の食作用を含み得る。ＡＰＣは、典型的には樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞若しくはマクロファージ、又は、細胞外生物若しくはタンパク質（すなわち抗原）を貪食又は取り込む細胞であり、処理後にＭＨＣクラスＩＩ及び／又はＭＨＣクラスＩ上の抗原由来ペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する。血液において、最も豊富なＡＰＣは単球であり、例えば、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞である。

本発明で使用される貪食可能な粒子によって誘導される免疫応答はまた、ナイーブＴ細胞又はメモリーＴ細胞の活性化及び増殖を誘導し得る。例えば、本発明の貪食可能な粒子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（又はＴヘルパー細胞又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞（又は細胞傷害性Ｔ細胞）の活性化及び増殖を誘導し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカイン分泌を介して免疫応答を指揮する細胞である。それらは、Ｂ細胞の抗体クラススイッチングを刺激する、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及び増殖を刺激する、又は食細胞を増強するなど、他の免疫細胞を抑制又は増強することができる。それらは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩを介した抗原提示によって活性化され、特定の抗原内の約１５アミノ酸のストレッチ（いわゆるＴ細胞エピトープ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＣＤ８＋Ｔ細胞（又は細胞傷害性Ｔ細胞）は、腫瘍細胞、感染細胞又は他の方法で損傷を受けた細胞を死滅させる細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なり、それらは活性化のためにＡＰＣを必要としない。それらのＴ細胞受容体は、すべての有核細胞上に発現されるタンパク質であるＭＨＣクラスＩによって提示される抗原由来ペプチド（約７～１０、例えば、８アミノ酸長）を認識する。

本発明の処置は、任意の形態のがん、例えば固形がん、転移性固形がん又は血液悪性腫瘍を治療又は予防するために使用され得る。

本明細書における「固形がん」は、例えば、臓器に由来する組織の異常な塊である。固形がんは悪性であり得る。様々なタイプの固形がんが、それらを形成する細胞のタイプについて命名されている。固形がんの種類には、肉腫、がん腫及びリンパ腫が含まれる。固形がんの例としては、副腎がん、肛門がん、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、胆管がん、膀胱がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、腫瘍のｅｗｉｎｇファミリー、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺がんカルチノイド腫瘍リンパ様肉芽腫症、悪性中皮腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、原発性体液性リンパ腫、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（基底及び扁平細胞、メラノーマ及びメルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が挙げられる。本発明の処置は、固形がんの処置において特に有効である。したがって、本発明の対象は、固形がんであり得る。本発明の処置は、肛門がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺がんカルチノイド腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、胃がん、精巣がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がんからなる群から選択される固形がんの処置において特に有効であり、さらにより具体的には、乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺がんカルチノイド腫瘍、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、及び膀胱がんの処置に特に有効である。

本発明の処置はまた、転移性固形がんの処置において特に有効である。転移性がんは、原発部位から身体の１以上の異なる領域に広がっているがんである。

あるいは、がんは、任意の形態の血液悪性腫瘍であり得る。血液悪性腫瘍は、骨髄又はリンパ系などの血液形成組織の細胞で始まるがんの一形態である。多くの血液悪性腫瘍において、正常な血球発生プロセスは、異常なタイプの血球の無制御な成長によって妨害される。血液がんの例としては、白血病、リンパ腫、骨髄腫及び骨髄異形成症候群が挙げられる（リンパ腫は、固形がん及び血液悪性腫瘍の双方として分類され得る）。血液悪性腫瘍の例としては、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性赤血球性白血病、急
性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟型急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄樹状細胞白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、攻撃的ＮＫ細胞白血病、未分化大細胞リンパ腫、及び形質細胞腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、慢性特発性骨髄線維症、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性好中球性白血病、髄外白血病、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、カーラー病、リンパ腫様肉芽腫症、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、筋膜、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、形質細胞性白血病、原発性滲出液リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。

投与及び投与レジメン
本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物の治療用量は、対象においてがんに対する免疫応答を誘発するのに十分な用量である。例えば、一次免疫応答及び／又は二次免疫応答である。

本発明のある実施形態では、がんの治療又は予防のための本明細書に記載の貪食可能な粒子の使用は、治療用量の貪食可能な粒子を対象に投与することを含む。本発明のある実施形態では、本発明のがんを治療又は予防する方法が、治療用量の貪食可能な粒子を対象に投与することを含む。本発明のある実施形態では、本発明の貪食可能な粒子又は本発明の治療方法の使用は、治療用量の本発明の注射用組成物を対象に投与することを含む。

対象のがんを治療又は予防するために必要とされる本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物の治療用量は、注射経路及び治療中の対象の特徴、例えば、種、年齢、体重、性別、病状、特定のがん及びその重症度、並びに他の関連する医学的及び物理的要因によって異なる。通常の熟練した医師であれば、がんの処置又は予防に必要な貪食可能な粒子の有効量を容易に決定し投与することができる。

貪食可能な粒子の治療用量は、１μｇから４０００μｇ、１０μｇから３０００μｇ、又は１０μｇから２０００μｇであり得る。例えば、用量は、１０μｇから１０００μｇ、１０μｇから７５０μｇ、１０μｇから５００μｇ、２０から４００μｇ、２５μｇから３００μｇ、３０μｇから２００μｇ、５０μｇから１０００μｇ、５０μｇから７５０μｇ、５０μｇから５００μｇ、５０μｇから４００μｇ、５０μｇから３００μｇ、５０μｇから２００μｇ、１００μｇから１０００μｇ、１００μｇから７５０μｇ、１００μｇから５００μｇ、１００μｇから４００μｇ、１００μｇから３００μｇ又は１００μｇから２００μｇ、２００μｇから１０００μｇ、２００μｇから７５０μｇ、２００μｇから５００μｇ、２００μｇから４００μｇ、２００μｇから３００μｇ、４００μｇから１０００μｇ、４００μｇから７５０μｇ、４００μｇから５００μｇ、５００μｇから１０００μｇ、５００μｇから７５０μｇ、又は７５０μｇから１０００μｇであり得る。例えば、貪食可能な粒子の用量は、１、１０、５０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、又は４０００μｇであり得る。好ましくは、上記用量は、１００から７５０μｇ、より好ましくは２００から７５０μｇ、より好ましくは３００から７５０μｇ、より好ましくは４００から７５０μｇ、より好ましくは５００から７５０μｇ、より好ましくは６００から７５０μｇ、さらに好ましくは６５０から７５０μｇである。例えば、貪食可能な粒子の用量は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は７５０μｇであり得る。

別法として、貪食可能な粒子の治療用量は、貪食可能な粒子の数に基づいて決定することができる。例えば、用量は、約１０^４から１０^１０、１０^５から１０^９、１０^５から１
０^８、１０^５から１０^７、又は１０^５から１０^６個の貪食可能な粒子（例えば、１０４、５^５、１０^５、５^６、１０^６、５^７、１０^７、５^８、１０^８、５^９、１０^９、５^１０、又は１０^１０個の貪食可能な粒子）であり得る。好ましくは、用量は、およそ１０^５から１０^８，１０^５から１０^７、又は１０^５から１０^６個の貪食可能な粒子、例えば、およそ１０^５から１０^９、５ｘ１０^５から１０^８、５ｘ１０^５から７．５ｘ１０^７、５ｘ１０^５から５ｘ１０^７、５ｘ１０^５から２．５ｘ１０^７、又は５ｘ１０^５から１０^７個である。より好ましくは、用量は、約１０^７から１０^９個、例えば、約５×１０^７から１０^９、７．５×１０^７から１０^９、７．５×１０^７から７．５×１０^８、７．５×１０^７から５×１０^８、又は７．５×１０^７から２．５×１０^８個の貪食可能な粒子である。より好ましくは、用量は、およそ７．５×１０^７から５×１０^８個の貪食可能な粒子、例えば、およそ７５００万、１億、１億５０００万、２億又は２億５０００万個の貪食可能な粒子である。

別法として、貪食可能な粒子の治療用量は、コアに会合する新生抗原性構築物の量に基づいて決定することができる。例えば、用量は、１μｇから４０００μｇ、１０μｇから３０００μｇ、又は１０μｇから２０００μｇの新生抗原性構築物であり得る。例えば、１μｇから４０００μｇ、１０μｇから３０００μｇ、又は１０μｇから２０００μｇである。例えば、新生抗原性構築物の用量は、１０μｇから１０００μｇ、１０μｇから７５０μｇ、１０μｇから５００μｇ、１０μｇから４００μｇ、１０μｇから３００μｇ、１０μｇから２００μｇ、１０μｇから１００μｇ又は１０から５０μｇ、１０から２５、２０μｇから４００μｇ、２５μｇから３００μｇ、３０μｇから２００μｇ、５０μｇから１０００μｇ、５０μｇから７５０μｇ、５０μｇから５００μｇ、５０μｇから４００μｇ、５０μｇから３００μｇ又は５０μｇから２００μｇ、１００μｇから１０００μｇ、１００μｇから７５０μｇ、１００μｇから５００μｇ、１００μｇから４００μｇ、１００μｇから３００μｇ又は１００μｇから２００μｇ、２００μｇから１０００μｇ、２００μｇから７５０μｇ、２００μｇから５００μｇ、２００μｇから４００μｇ、２００μｇから３００μｇ、４００μｇから１０００μｇ、４００μｇから７５０μｇ、４００μｇから５００μｇ、５００μｇから１０００μｇ、５００μｇから７５０μｇ、又は７５０μｇから１０００μｇである。例えば、新生抗原性構築物の用量は、１、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、又は４０００μｇであり得る。好ましくは、用量は、１０μｇから１０００μｇ、１０μｇから７５０μｇ、１０μｇから５００μｇ、１０μｇから４００μｇ、１０μｇから３００μｇ、１０μｇから２００μｇ、１０μｇから１００μｇ、又は１０から５０μｇの新生抗原性構築物であり得る。好ましくは、用量は、１０μｇから１００μｇの新生抗原性構築物、例えば１０μｇから７５μｇ、１０μｇから５０μｇ、１０μｇから２５μｇ、２５μｇから５０μｇ、又は５０μｇから７５μｇの新生抗原性構築物である。例えば、貪食可能な粒子の用量は、１、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００μｇの新生抗原性構築物であり得る。好ましくは、用量は、１０から５０μｇの新生抗原性構築物である。

治療用量は、治療用量の貪食可能な粒子を含む単回単位用量として、又は単位用量が治療用量の分画を含む場合は複数単位用量として投与され得る。好ましくは、本発明の貪食可能な粒子の治療用量は、単回用量として対象に投与される。

治療用量の貪食可能な粒子、又は治療用量の本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物は、対象に１回投与され得る。

ある好ましい実施形態では、対象に、治療用量の貪食可能な粒子又は治療用量の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を投与し、そして、少なくとも１回の追加的な（又は「後続
の」）治療用量の本発明の貪食可能な粒子又は治療用量の本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を投与する。貪食可能な粒子の追加的な（又は「後続の」）治療用量は、毎日、２日毎若しくは３日毎、毎週、２週間毎、３週間毎若しくは４週間毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎若しくは４ヶ月毎、６ヶ月毎、又は毎年投与され得る。本発明の貪食可能な粒子又は本発明の貪食可能な粒子の治療用量を含む注射用組成物の追加的な治療用量の数及び頻度は、対象、並びに治療されるがんの形態及び重症度に依存する。

一実施形態では、がんの治療又は予防のための貪食可能な粒子の使用は、１回以上の後続の治療用量の本発明の貪食可能な粒子又は治療用量の本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を対象に投与することを含み、当該対象は、治療用量の本発明の貪食可能な粒子又は治療用量の本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を以前に投与されたことがある。１回以上の後続の治療用量は、それぞれが対象においてがん細胞に対する免疫応答（すなわち、一次免疫応答及び／又は二次免疫応答）を誘発するのに十分な用量である。

１回以上の後続の治療用量の本発明の貪食可能な粒子又は治療用量の本発明の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を対象に投与することを含む本発明の実施形態では、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はｎ回の 後続の治療用量の貪食可能な粒子又は注射用組成物が対象に投与される。ここで、「ｎ」は、１０回より多い任意の投与回数（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０回の投与）である。好ましくは、対象に投与される後続の治療用量の数及び頻度は、対象のがんを治療又は予防するのに十分である。

本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物の治療用量は、独立して、本明細書に記載の貪食可能な粒子又は注射用組成物の治療用量の特性及び／又は特徴のいずれをも有し得る。本発明の好ましい実施形態では、後続の治療用量として対象に投与される貪食可能な粒子は、治療用量として対象に以前に投与された貪食可能な粒子と同じタイプの新生抗原性構築物を含む。後続の治療用量として投与される貪食可能な粒子のコアは、治療用量として対象に以前に投与された貪食可能な粒子のコアと同じであっても異なっていてもよい（例えば、コアは、異なるサイズを有していてもよく、及び／又は本明細書に記載の異なる材料／ポリマーを含んでいてもよい）。好ましくは、後続の治療用量として投与される貪食可能な粒子は、治療用量として対象に以前に投与された貪食可能な粒子と同じタイプの新生抗原性構築物及び同じコアを含み得る（すなわち、貪食可能な粒子は、同じセットであり、治療用量として対象に以前に投与された各群と同じである）。

１回以上の後続の治療用量の貪食可能な粒子又は治療用量の貪食可能な粒子を含む注射用組成物を対象に投与することを含む本発明の実施形態では、好ましくは、１回以上の後続の治療用量は、数日、数週間又は数ヶ月の間隔で対象に投与される。例えば、１回以上の後続の治療用量が、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎に対象に投与される。代替的又は追加的に、１回以上の後続の治療用量が、例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は４週間に１回、対象に投与される。代替的又は追加的に、１回以上の後続の治療用量が、例えば、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回又は６ヶ月に１回、対象に投与される。代替的又は追加的に、１回以上の後続の治療用量が、例えば、１年に１回、対象に投与される。

本発明の一実施形態において、１回以上の後続の治療用量は、対象に、毎年１回、毎年２回、又は毎年３回投与される。例えば、１回以上の後続の治療用量は、１から１０年、１から２０年、１から３０年、１から４０年、又は１から６０年（例えば、１から１０年、１０から２０年、２０から３０年、３０から４０年又は５０から６０年の期間）の期間にわたって、毎年１回、毎年２回、又は毎年３回、対象に投与され得る。

本発明者らは、１回以上の後続の治療用量を長期間にわたって（すなわち、１年以上にわたって）対象に投与することによって、対象に存在する抗がん性メモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞の数を増加させることが可能であることを見出した。対象における抗がん記憶Ｂ細胞及び記憶Ｔ細胞の数を増加させることにより、対象における抗がん免疫記憶が維持され、それにより、がんの成長（例えば、腫瘍を形成すること）又は再発が防止されることが予想される。

本発明のある実施形態では、ブースター用量は、がんが（本明細書に記載の１個又は複数の治療用量で）首尾よく治療された対象に投与され、がんの再発を予防する。

本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物のブースター用量は、独立して、本明細書に記載の貪食可能な粒子又は注射用組成物の治療用量の特性及び／又は特徴のいずれかを有し得る。本発明の好ましい実施形態では、ブースター用量として対象に投与される貪食可能な粒子は、治療用量として対象に投与される貪食可能な粒子と同じタイプの新生抗原性構築物を含む。貪食可能な粒子のコアは、治療用量として対象に投与される貪食可能な粒子のコアと同じであっても異なっていてもよい（例えば、コアは、異なるサイズを有していてもよく、及び／又は本明細書に記載の異なる材料／ポリマーを含んでもよい）。好ましくは、ブースター用量は、治療用量として対象に投与される貪食可能な粒子と同じタイプの新生抗原性構築物及び同じコアを有する貪食可能な粒子を含む（すなわち、貪食可能な粒子は、同じセットであり、治療用量として対象に以前に投与された各群と同じである）。

本発明の一実施形態では、１回以上のブースター用量が、例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は４週間に１回、対象に投与される。代替的又は追加的に、１回以上のブースター用量が、例えば、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回、対象に投与される。代替的又は追加的に、１回以上のブースター用量が、例えば、年に１回、対象に投与される。

本発明の別の実施形態では、１回以上のブースター用量が、毎年１回、毎年２回、又は毎年３回、対象に投与される。例えば、１回以上のブースター用量は、１から１０年、１０から２０年、２０から３０年、３０から４０年、又は５０から６０年の期間にわたって、毎年１回、毎年２回、又は毎年３回、対象に投与され得る。

１回以上のブースター用量を投与することによって対象における抗がんメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞の数を増加させることにより、対象における抗がん免疫記憶が維持され、それにより、がんが成長又は再発することが防止されることが予想される。

抗がんＴ細胞のエクスビボ活性化及び増殖
本発明はまた、ａ）ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を対象から採取すること、ｂ）対象から採取した抗がんＴ細胞を増殖させること、及び、ｃ）治療用量の増殖した抗がんＴ細胞を対象に投与することも追加の工程として含む本発明の治療を提供する。

本発明はまた、対象においてがんを処置又は予防する方法であって、ａ）ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を対象から採取すること、ｂ）対象から採取した抗がんＴ細胞を増殖させること、及び、ｃ）治療用量の増殖した抗がんＴ細胞を対象に投与することも追加の工程として含む方法を提供する。
工程ａ）対象への貪食可能な粒子の投与後に、対象からＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を採取する工程

本発明の一実施形態では、工程ａ）において、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を、本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物の用量（好ましくは治療用量）を対象に投与した後に対象から採取する。代替的又は追加的に、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を、同時に、かつ／又は、用量（好ましくは、治療用量）の本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物を対象に投与する前に、対象から採取してもよい。好ましくは、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を、本発明の貪食可能な粒子又は注射用組成物の用量（好ましくは治療用量）を対象に投与した後、対象から採取する。

ＡＰＣは、抗がんＴ細胞が反応し得る抗原特異的状況（ＭＨＣ拘束性）で抗がんＴ細胞に抗原を提示することができるように、抗がんＴ細胞と適合するものでなければならない。ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞は、好ましくは、同じ種から得られ、ＭＨＣ受容体に関してドナー適合される。しかしながら、異なる種由来の遺伝子操作されたＡＰＣの使用も想定される。より好ましくは、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞は、同じ対象から得られる。ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞が同じ対象に由来する場合、ＡＰＣと抗がんＴ細胞との間のミスマッチの可能性は回避される。

対象から採取されたＡＰＣは、食細胞、単球及び／又は樹状細胞を含み得る。抗がんＴ細胞は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。

ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞は、対象に由来する血液試料から採取され得る。好ましくは、血液試料は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である。ＰＢＭＣは、全血の密度勾配遠心分離によって調製されたヒト血液の分画である。ＰＢＭＣは、主にリンパ球（７０～９０％）及び単球（１０～３０％）からなり、赤血球、顆粒球及び血漿は除去されている。単球は、場合によっては、ＰＢＭＣ試料中の細胞数の１０から２０％、例えば１０から１５％を構成し得る。

ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞はまた、対象の腫瘍、例えば腫瘍内のリンパ管又は腫瘍排出リンパ節（すなわち、センチネル節）に由来する試料に由来し得る。好ましくは、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を、対象に由来する同じ試料及び／又は対象の同じ腫瘍から採取する。代替的又は追加的に、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞は、対象に由来する異なる試料から採取し得る。例えば、ＡＰＣは血液試料から採取することができ、抗がんＴ細胞は腫瘍から採取することができる。

好ましくは、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞をＰＢＭＣ試料から採取する。例えば、ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を同じＰＢＭＣ試料又は異なるＰＢＭＣ試料から採取する。末梢血試料からＰＢＭＣを得ることは、ありふれたプロトコルであり、ＡＰＣ及びＴ細胞の双方のための便利な供給源を同時にかつ同じ対象から提供する。ＰＢＭＣ試料は、採取したてを使用してもよく、又は使用前に保存のために凍結してもよい。
工程ｂ）対象から採取した抗がんＴ細胞を増殖させる工程
ステップａ）で対象から採取されたＡＰＣ及び抗がんＴ細胞は、対象におけるがんの治療又は予防に使用するのに適した抗がんＴ細胞の調製に使用することができる。対象への投与に適した抗がんＴ細胞は、対象から採取された抗がんＴ細胞のインビトロ活性化及び増殖によって調製される。インビトロ活性化及び増殖方法は、
ｉ）コアと、当該コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含む貪食可能な粒子貪食可能な粒子を提供する工程であって、上記新生抗原性構築物が、対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、上記タンパク質又はペプチドの一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、工程と、
ｉｉ）ＡＰＣを提供する工程と、
ｉｉｉ）ｉｉｉ）貪食可能な粒子を、ＡＰＣによる貪食可能な粒子の食作用を可能にする条件下で、ＡＰＣとインビトロで接触させる工程と、
ｉｖ）対象から採取された抗がんＴ細胞を提供する工程と、
ｖ）インビトロで、ＡＰＣによって提示されるネオエピトープに応答して抗がんＴ細胞の特異的活性化及び増殖を可能にする条件下で、抗がんＴ細胞を工程ｉｉｉ）からのＡＰＣと接触させる工程と、を含む。

インビトロ増殖方法は、ＡＰＣを１００から１×１０^９個の貪食可能な粒子、例えば１００から１×１０^８個、例えば１００から１×１０^７個の貪食可能な粒子と接触させることを含み得、所与の増殖の実行では、例えば１０００から１×１０^７個の貪食可能な粒子を使用する。例えば、貪食可能な粒子とＡＰＣの比は、１０００：１から１：１０の範囲内である。上記比は、貪食可能な粒子のサイズに応じて最適化することができる。例えば、約１μｍの最大直径を有する貪食可能な粒子の場合、上記比は５０：１から２：１、例えば２５：１から５：１、１５：１から７：１、及び１０：１の範囲内であり得る。

誤解を避けるために記すと、ＡＰＣとの接触に適した貪食可能な粒子は、独立して、対象に治療用量又はブースター用量として投与される貪食可能な粒子の特性及び／又は特徴のいずれかを有し得る。

本発明のある実施形態では、ＡＰＣを、治療用量として対象に投与される貪食可能な粒子と同じタイプの新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子と接触させる。貪食可能な粒子のコアは、治療用量として対象に投与される貪食可能な粒子のコアと同じであっても異なっていてもよい（例えば、コアは、異なるサイズを有してもよく、及び／又は本明細書に記載の異なる材料／ポリマーを含んでもよい）。本発明の好ましい実施形態では、ＡＰＣを、治療用量で対象に投与された貪食可能な粒子と同じタイプの新生抗原性構築物及び同じコアを含む貪食可能な粒子と接触させる。

本発明の一実施形態では、抗がんＴ細胞を増殖させる方法は、抗がんＴ細胞試料に低用量のＩＬ－２、例えば１．２５Ｕ／ｍｌ超（例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ超、２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超）のＩＬ－２、好ましくは２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超のＩＬ－２を添加することを含む。抗原特異的Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ－２が同時に存在する場合、抗原提示細胞の存在下で起こる。ＩＬ－２は、抗がんＴ細胞のエフェクター抗がんＴ細胞及びメモリー抗がんＴ細胞への分化を促進する。抗がんＴ細胞の増殖後、ＡＰＣは、例えば磁気分離によって、増殖したＴ細胞集団から除去され得る。

本発明の別の実施形態では、抗がんＴ細胞を増殖させる方法が、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－７及び／又はＩＬ－１５を抗がんＴ細胞試料に添加すること、例えば、低用量のＩＬ－２を抗がんＴ細胞試料に添加すること、例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ超（例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ超、２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超）、好ましくは２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超のＩＬ－２を添加すること、並びに、ＩＬ－７及び／又はＩＬ－１５を任意に添加することを含む。例えば、抗がん性Ｔ細胞試料に対する低用量のＩＬ－７は、例えば１．２５Ｕ／ｍｌ超（例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ超、２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超）、好ましくは２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超のＩＬ－７であり、及び／又は、例えば、抗がんＴ細胞試料に対する低用量のＩＬ－１５は、例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ超（例えば、１．２５Ｕ／ｍｌ超、２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ）、好ましくは２．５Ｕ／ｍｌ超、５Ｕ／ｍｌ超、又は５０Ｕ／ｍｌ超のＩＬ－１５である。

本発明の好ましい実施形態では、インビトロで抗がんＴ細胞を活性化及び増殖させる方
法は、抗がんＴ細胞から本発明の貪食可能な粒子を取り込んだＡＰＣを除去する工程を含む。本発明の貪食可能な粒子が磁性コアを含む本発明の実施形態では、ＡＰＣは、磁気分離を使用することによって抗がんＴ細胞から除去される。

抗がんＴ細胞と、本発明の貪食可能な粒子を取り込んだＡＰＣとの接触後、抗がんＴ細胞活性化の程度は、例えば、抗がんＴ細胞活性化の程度を関連する参照と比較することによって決定され得る。抗がんＴ細胞活性化の程度の決定は、当技術分野で既知のＴ細胞活性化アッセイ、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ、フローサイトメトリーを用いたサイトカインの細胞内染色、ＦＡＳＣＩＡ（活性化全血中の特異的細胞媒介性免疫応答のためのフローサイトメトリーアッセイ）、増殖アッセイ（例えば、チミジン取込み、ＣＦＳＥ又はＢｒｄＵ染色）、ＭＨＣ－Ｉ又はＩＩ四量体を用いた特異的ＴＣＲ－検出、及び、分泌サイトカインのＥＬＩＳポアッセイのＥＬＩＳＡ－又はＬｕｍｉｎｅｘ分析を使用して行うことができる。この方法は、抗がんＴ細胞活性化の程度を関連する参照と比較する工程を含み得る。適切な参考文献としては、例えば、抗がんＴ細胞を含まないＴ細胞試料、又は貪食可能な粒子を取り込んだＡＰＣと接触していない抗がんＴ細胞試料が挙げられる。
ｃ）拡大された抗がんＴ細胞の治療用量を対象に投与する工程

増殖した抗がんＴ細胞の治療用量を対象に投与することができる。したがって、本発明はまた、対象のがんを治療又は予防するのに使用するための抗がんＴ細胞を提供する。増殖した抗がんＴ細胞は、対象に静脈内、動脈内、髄腔内又は腹腔内に投与することができる。

増殖した抗がんＴ細胞の正確な投与量は、投与スケジュール、対象（典型的には哺乳動物又はヒト）の年齢、体格、性別及び病状、病状の性質及び重症度、並びに他の関連する医学的及び物理的要因によって異なる。したがって、正確な治療有効量は、臨床医によって容易に決定することができる。適切な量は、動物モデル及びヒトの臨床研究からの所定の実験によって決定することができる。ヒトの場合、有効用量は既知であるか、そうでなければ当業者により決定され得る。

実施例１：新生抗原性構築物又はモデルペプチド／タンパク質を磁気コアにカップリングするための一般プロトコル

新生抗原性構築物又はモデルペプチド／タンパク質のコアへのカップリング
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（直径１μｍの球）をコアとして使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸粒子は、酸化鉄を含み、粒子の表面が遊離カルボン酸基で官能化された常磁性ポリスチレン粒子である。カップリング手順は、メーカーのプロトコル（ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ（エチルカルボジイミド）を用いた２段階手順）に従って実施した。

工程１）：ＭＥＳ－Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ ６）で２回洗浄する。次いで、ＭＥＳ緩衝液中、５０ ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及び５０ ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド）をポリスチレン粒子に添加することによってカルボン酸基を活性化し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。磁石を用いてポリスチレン粒子を回収し、上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液で２回洗浄した。

工程２）：新生抗原性構築物又はモデルペプチド／タンパク質試料を、ＭＥＳ緩衝液で
１ｍｇ／ｍｌ、合計１００μｇの濃度に希釈して、ポリスチレン粒子に加え、室温で１時間インキュベートした。ポリスチレン粒子を磁石で収集し、上清を除去し、ペプチド濃度測定のために保存した。未反応の活性化カルボン酸基を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４で１５分間クエンチした。次いで、ポリスチレン粒子をＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、次いで－８０^℃で保存した。

メーカーのプロトコルに従ってＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ポリスチレン粒子にカップリングされたペプチド性物質の量を測定し、カップリング前の新生抗原性構築物試料のペプチド性物質濃度及びカップリング後の上清のペプチド性物質濃度を測定した。

いくつかのポリペプチドを試験し、１ｍｇのポリスチレン粒子あたり推定平均４８．７μｇ（平均：４８．７、ＳＤ：２０．５、Ｎ＝１０）の新生抗原性構築物をカップリングさせた。メーカーの指示によれば、１ｍｇの粒子あたり５０μｇのポリペプチドをカップリングさせることができ、これは達成されたカップリングの効率が高いことを示している。

実施例２：洗浄
実施例１に記載の方法に従って、ポリスチレン粒子を大腸菌で産生された組換え新生抗原性構築物に結合させた。カップリング後、ポリスチレン粒子を３つの異なる洗浄緩衝液（２Ｍ ＮａＯＨ ｐＨ１４．３、８Ｍ 尿素、又は６Ｍグアニジン（グアニジン－ＨＣｌ）、すべて室温の滅菌水中）のうちの１つを用いて洗浄するか、又はポリスチレン粒子を９５^℃のＰＢＳ中でインキュベートした。ポリスチレン粒子を緩衝液に懸濁し、４分間振盪し、磁石で回収し、上清を除去した。これを３回繰り返した。熱処理したポリスチレン粒子をＰＢＳ ｐＨ７．４に入れ、９５^℃の加熱ブロックに５分間入れた後、磁石で回収し、上清を除去した。これを３回繰り返した。次いで、粒子を滅菌ＰＢＳで３回洗浄して、残っている洗浄緩衝液を除去した。

４つの異なる洗浄条件、（ａ）高ｐＨ（２Ｍ ＮａＯＨ ｐＨ１４．３）、（ｂ）高温（９５℃）及び滅菌／変性剤（（ｃ）８Ｍ尿素、及び（ｄ）６Ｍグアニジン塩酸塩）、を試験した。いずれの場合も、ポリスチレン粒子と会合した新生抗原性構築物は、ポリスチレン粒子と会合した状態を維持した。

実施例３ａ：貪食可能な粒子に適した粒径の同定
チミジン取込みを測定する細胞増殖アッセイを使用して、抗原特異的Ｔ細胞活性化に対する貪食性粒径の効果を試験した。Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）免疫マウス由来の脾細胞を、異なるサイズのＯＶＡ結合ポリスチレン粒子で刺激して、抗原特異的増殖を測定した。

５．６μｍ、１μｍ、及び０．２μｍの直径を有するＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸粒子を、実施例１のプロトコルに従ってＯＶＡ（ＯＶＡ粒子）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ粒子）とカップリングさせた。

抗原特異的Ｔ細胞活性化を刺激するＯＶＡ粒子の有効性を試験するために、増殖アッセイ（^３Ｈチミジン取込みによる）を使用した。細胞濃度に対する粒子濃度は、５．６μｍ粒子では１：１、１μｍ粒子では１０：１、０．２μｍ粒子では５００：１であった。細胞とのインキュベーション中の総タンパク質濃度は、５．６μｍ、１μｍ、及び０．２μｍについて、それぞれ、１２５ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、及び１６０ｎｇ／ｍｌと計算された。増殖アッセイを以下のように実行した。

刺激剤として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸粒子に結合したオボアルブミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）及びＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用した（ＯＶＡ粒子又はＢＳＡ粒子）。マウスを、水酸化アルミニウムに吸着させた１００μｇのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を毎月注射することによってオボアルブミンに免疫化した。最初の注射の３ヶ月後、マウスを屠殺し、脾臓を採取した。脾細胞は、Ｔｈｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００９，Ａｌｌｅｒｇｙ ６４：９１９に記載されている標準的な手順によって調製した。

当該細胞を、ＯＶＡ粒子又はＢＳＡ粒子（１０粒子／細胞）と共にｃＲＰＭＩ中で５日間インキュベートした。全ての細胞を、３７℃、６％ ＣＯ_２の加湿雰囲気中で６日間インキュベートした。最後の１８時間のインキュベーションのために、１μＣｕ／ウェル ［^３Ｈ］ チミジンを細胞培養物に添加した。刺激した３連から得られた毎分の平均カウント（ｃｐｍ）を、刺激していない細胞からの平均ｃｐｍ値で除算し、刺激指数（ＳＩ）として表した。ＳＩ値≧２．０は、一般に陽性と見なされる。

図１に見られるように、直径０．２μｍのＯＶＡ粒子と共にインキュベートした細胞は、増殖の増加を示し、平均ＳＩは４．１（９５％ ＣＩ ２．４～５．８、Ｐ＝０．００７）であった。直径１μｍのＯＶＡ粒子と共にインキュベートした細胞は、増殖の増加を示し、平均ＳＩは８．４（９５％ ＣＩ ６．１～１０．６、Ｐ＜０．００５）であった。直径５．６μｍのＯＶＡ粒子と共にインキュベートした細胞は、増殖を刺激することができず、平均ＳＩは１．１（９５％ ＣＩ ０．４～２．７、Ｐ＝０．８７６）であった。

これらの結果は、異なるサイズの粒子に結合した抗原が細胞増殖を刺激し得ることを示す。約１μｍの直径を有する粒子は、細胞刺激に関して最も効率的であると思われるが、０．２μｍのサイズまでの粒子は依然として機能する。直径が５．６μｍに近づくと、粒子は細胞を完全に刺激することができないが、１μｍより大きいサイズの粒子も機能すると予測することは合理的である。１μｍが最適なサイズであると仮定することは、それが細菌のサイズに類似していることから合理的である。我々の免疫系は、このサイズの微生物／粒子を貪食して反応するように進化している。正常な抗原提示細胞は、１０～１５μｍの範囲のサイズを有する。

実施例３ｂ：異なる粒径の抗原結合粒子と、それらのＴ細胞の活性化及び増殖における有効性との比較
（ｉ）抗原結合貪食可能な粒子の調製
異なるサイズの３種類の常磁性ポリスチレン貪食可能な粒子を使用した。
－直径１μｍ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ カルボン酸、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）－直径２．８μｍ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ カルボン酸、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
－直径４．５μｍ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０ エポキシ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）

貪食可能な粒子を、メーカーの指示に従って、モデル抗原サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質ｐｐ６５構築物（配列番号１９）と結合させた。エンドトキシンを除去するために、貪食可能な粒子を０．７５Ｍ水酸化ナトリウム緩衝液で５回洗浄し、続いて滅菌ＰＢＳに再懸濁した。
（ｉｉ）抗原に結合した貪食可能な粒子のインキュベーション

標準的なフィコールに基づく密度勾配遠心分離によって単離されたＣＭＶ感受性健常ド
ナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＭＶ構築物に結合した貪食可能な粒子（以下、本明細書において「ＣＭＶ粒子」と呼ぶ）と共に４８ウェルプレート中、３７℃、５％ ＣＯ_２、５００，０００細胞／ウェルで１８時間、１，０００，０００細胞／ｍｌの濃度で培養した。ＣＭＶ粒子の濃度は、総表面積（ＣＭＶ粒子の表面に結合しているときのＣＭＶ量の代用マーカー）に基づいて平準化した。これは、試料中の全ＰＭＢＣの数に基づいて、１μｍサイズの粒子については１０個のＣＭＶ粒子／ＰＢＭＣ、２．８μｍサイズの粒子については１．４個のＣＭＶ粒子／ＰＢＭＣ、及び４．５μｍサイズの粒子については０．５個のＣＭＶ粒子／ＰＢＭＣに等しい。各粒子サイズの結果を以下の表１に示す。

（ｉｉｉ）取込みの評価
インキュベーション後、共焦点顕微鏡を使用して、貪食されたＣＭＶ粒子の数を手動で計数した。８個の細胞を計数して、平均値及び標準偏差値を得た。図５Ａには、細胞内に貪食されたＣＭＶ粒子を有する代表的な細胞の共焦点顕微鏡の画像が示されている。黒破線は細胞の輪郭を示す。白線は、細胞内のＣＭＶ粒子の全体の寸法を示す。

この方法は、１μｍのＣＭＶ粒子には、粒子が小さすぎて正確に計数することができなかったために適用できなかった。１μｍのＣＭＶ粒子の大きさを評価するために、貪食されたすべてのＣＭＶ粒子の総体積を測定し、充填密度を６０％と仮定して、総体積に基づいて個々のＣＭＶ粒子の大きさを逆算した。この方法は、２．８μｍのＣＭＶ粒子（手動で計数した９．１個のＣＭＶ粒子／細胞に対して推定された１１．９個のＣＭＶ粒子／細胞）及び４．５μｍのＣＭＶ粒子（手動でカウントされた３．１個のＣＭＶ粒子／細胞に対して推定された２．４個のＣＭＶ粒子／細胞）についてかなり正確であることが証明されたので、１μｍのＣＭＶ粒子の大きさも正確に推定すると仮定することができる。

ＣＭＶ粒子の取込みを図５Ｂ及び５Ｃに示す。図５Ｂは、手動計数によって評価した場合の各細胞によって取り込まれたＣＭＶ粒子の数を示す（ビーズの種類ごとに８個の細胞を計数）。手動計数法を使用して、４．５μｍのＣＭＶ粒子の細胞あたりの貪食粒子の数は３．１（±１．１）であることが分かった。２．８μｍのＣＭＶ粒子については、９．１（±２．２）であった。この方法を用いて１μｍのＣＭＶ粒子数を計数することはできなかった。

図５Ｃは、体積計算によって評価される各細胞によって取り込まれたＣＭＶ粒子の数を示す（ビーズの種類ごとに３個の細胞を測定）（＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１ ＊＊＊ ｐ＜０．００１、スチューデントＴ検定を用いて計算）。体積計算法を使用して、４．５μｍのＣＭＶ粒子の細胞あたりの貪食粒子の数は２．４（±１．１）であることが分かった。２．８μｍのＣＭＶ粒子については、１１．９（±３．２）であった。１μｍのＣＭＶ粒子については、２０３．７（±２１．９）であった。

体積計算法によって評価した各細胞によって取り込まれたＣＭＶ粒子の数に基づいて、貪食されたＣＭＶの総表面積、ひいてはＣＭＶの総量を計算した。取り込まれた表面積は、１μｍのＣＭＶ粒子については６３９．６（±６８．９）μｍ^２、２．８μｍのＣＭＶ粒子については２９３．１（±７９．３）μｍ^２、及び４．５μｍのＣＭＶ粒子については１５０．７（±６７．０）μｍ^２として計算された。これらのデータを以下の表２に示す。

（ｉｖ）Ｔ細胞刺激の評価
抗原結合粒子がＴ細胞を刺激することでその増殖を促進する能力を、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ＰＢＭＣからのＩＦＮγ、ＩＬ２２及びＩＬ１７Ａの放出を測定することによって評価した。ＣＭＶ感受性健常ドナー（ｎ＝２）由来のＰＢＭＣ（２５０，０００個／ウェル）を、３連でＣＭＶ粒子で刺激した。抗原結合粒子の濃度は、総表面積に基づいて前述のように平準化した（１０×１μｍ ＣＭＶ粒子／細胞、１．４×２．８μｍ ＣＭＶ粒子／ＰＢＭＣ、及び０．５×４．５μｍ ＣＭＶ粒子／細胞）。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイのウェルあたりのＰＢＭＣの数を、ウェルあたりの単球の推定数（ＰＢＭＣ試料の中身の２０％が単球であるという推定に基づく）と共に、各粒径について以下に示す（表３）。

ＰＢＭＣを３７℃、５％ ＣＯ_２で４４時間インキュベートした。プレートをメーカーの指示に従って現像し、自動ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔリーダーで読み取った。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔについて報告されたデータは、細胞をＣＭＶ粒子で刺激した場合のスポット数であり、ＣＭＶ粒子で刺激しなかった場合のスポット数よりも多い。

ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価したＩＦＮγ産生のレベルを図６Ａに示す。ＣＭＶ粒子間の差はほとんどないことが分かる。

ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価したＩＬ２２及びＩＬ１７産生のレベルを図６Ｂ及び６Ｃに示す。１μｍのＣＭＶ粒子は、より大きなＣＭＶ粒子よりも一方の個体において有意に高いＩＬ２２及びＩＬ１７産生を引き起こし、ＩＬ２２に関してもう一方の個体でも同様の傾向が見られることが分かる。

ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価したデュアルサイトカイン産生のレベルを図６Ｄ及び６Ｅに示す。１μｍのＣＭＶ粒子は、１μｍの抗原結合粒子で刺激した場合、一方の健常ドナーに対して、より大きなＣＭＶ粒子よりも有意に高いデュアルサイトカイン放出（ＩＦＮγ＋ＩＬ１７及びＩＬ２２γ＋ＩＬ１７）を引き起こしたことが分かる。

これらの実験におけるサイトカイン放出は、Ｔ細胞増殖の代わりになる。一般に、ＩＦＮγはＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ１サブクラス）及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生される。ＩＬ１７及びＩＬ２２は、主に炎症誘発性Ｔｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。かかる細胞は炎症促進性であり、腫瘍根絶を補助することが示されている。データは、１μｍビーズがＴｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を他のビーズと同程度に活性化して増殖させ、併せて、炎症誘発性Ｔｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞及びあまり顕著ではないがやはり炎症誘発性の二重サイトカイン産生Ｔ細胞も活性化して増殖させるというさらなる
利点を伴うことを示唆している。

実施例４：マウスがんモデルにおける貪食可能な粒子の予防効果
この実験では、２群の貪食可能な粒子、すなわち、１）ポリスチレン粒子コアを含み、コアに強固に会合した新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）を含む貪食可能な粒子、及び、２）ポリスチレン粒子コアと、コアに強固に会合した新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）とを含む貪食可能な粒子、を使用した。貪食可能な粒子を、実施例１及び２において本明細書に記載される方法を使用して調製した。すなわち、新生抗原性構築物を、実施例１及び２において概説されるプロトコルに従って１μｍの超常磁性ビーズ（Ｓｅｒａ－Ｍａｇ ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（親水性）カルボキシレート修飾磁性粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。新生抗原性構築物は、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍モデルを使用した以前に公開された研究（Ｋｒｅｉｔｅｒ他（２０１５）、Ｎａｔｕｒｅ、５２０：６９２及びＣａｓｔｌｅ他（２０１２）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２：１０８１）に基づいて設計した。作製後、２群の貪食可能な粒子を混合し（１：１の比）、次いで精製し、アジュバントとしてのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ １６６８、Ｅｎｚｏ）を含むＰＢＳに当該粒子を入れてストック溶液を作製した。ストック溶液は１０００万粒子／μｌの濃度を有していた。

健常マウス（Ｃ５７ ＢＬ／６マウス）に、低用量（９μｌのＰＢＳ中に１μｌの貪食可能な粒子）又は高用量（１０μｌの貪食可能な粒子）の貪食可能な粒子を、鼠径リンパ節又は皮下のいずれかに注射することによって投与した。各用量及び投与経路を３連で評価した（ｎ＝３）。低用量及び高用量を調製するために使用したストック貪食可能な粒子試料は、１０００万ビーズ／μｌを含有していた。したがって、低用量は約１０００万個の貪食可能な粒子を含有し、高用量は約１億個の貪食可能な粒子を含有していた。貪食可能な粒子の各用量は、２つの異なるグループの貪食可能な粒子、すなわち、１）ポリスチレン粒子コアを含み、コアに強固に会合した新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）とを含む貪食可能な粒子、及び、２）ポリスチレン粒子コアと、該コアに強固に会合した新生抗原性構築物Ｍ３０４７４８（配列番号２）とを含む貪食可能な粒子、を含んでいた。

マウスに、第１日目に第１の用量の貪食可能な粒子を投与し、次いで、約１ヶ月後（３３日後）に第２の用量を同じマウスに投与した。血液試料を、１回目の貪食可能な粒子の投与の約３週間後（２２日間）に、及び２回目の貪食可能な粒子の投与の約３週間後（２３日間）にマウスから採取した。

鼠径リンパ節注射によって２用量の貪食可能な粒子を受けたマウスの健康状態を併せて評価した。本発明者らは、鼠径リンパ節を介した貪食可能な粒子の２×１０μｌ注射が動物の健康状態（体重及び全体的な健康状態）に影響を及ぼさないことを見出した。鼠径リンパ節及びマウス脾臓も肉眼的異常を示さず、貪食可能な粒子がマウスによって十分に許容されたことを示唆した。

採取した血液試料を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて分析した。アッセイを９６ウェルプレートで行った。ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌの新生抗原性構築物を添加することによって、プレートを新生抗原性構築物Ｍ２７２１２０（配列番号１）又はＭ３０４７４８（配列番号２）でコーティングした。プレートを一晩インキュベートした後、洗浄した。次いで、被覆９６ウェルプレートを、１回目の用量又は２回目の用量の貪食可能な粒子の投与後にマウスから採取した１００μｌの希釈（１：１０００）マウス血清とインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、１：８０００希釈）とインキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、次いで、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
）で現像し、吸光度を３７０及び６５０ｎｍで測定した。各新生抗原性構築物に対する各マウス血清試料の吸光度を、図７Ａ（１回目の投与後にマウスから採取した血清、新生抗原性構築物＝Ｍ２７２１２０（配列番号１））、図Ｂ（１回目の投与後にマウスから採取した血清、新生抗原性構築物＝Ｍ３０４７４８（配列番号２））、図７Ｃ（２回目の投与後にマウスから採取した血清、新生抗原性構築物＝Ｍ２７２１２０（配列番号１））、及び図７Ｄ（２回目の投与後にマウスから採取した血清、新生抗原性構築物＝Ｍ３０４７４８（配列番号２））に示す。対照試料として、ナイーブマウス（ｎ＝３、投与された貪食可能な粒子の用量なし）から採取した血清試料を併せて分析した。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、及び図７Ｄによって示されるように、（リンパ節内又は皮下に投与された）高用量の貪食可能な粒子を受けたマウスは、同じ経路を介して低用量の貪食可能な粒子を受けたマウス及び貪食可能な粒子の投与を受けなかったマウス（すなわち、ナイーブマウス）から採取された血清試料と比較して、血清試料中の抗ネオエピトープ抗体の割合が高かった。

２回目の用量の貪食可能な粒子の投与のおよそ２ヶ月後（５４日後）に、マウスの皮下に、メラノーマがん細胞株Ｂ１６－Ｆ１０の５００，０００個の細胞を注射した。腫瘍の体積を毎日測定した。図８は、腫瘍体積の経時的な増加を示す（日数、Ｄ）。

実施例５：抗がんＴ細胞のエクスビボ増殖のために貪食可能な粒子を利用するパイロット試験
（ｉ）膀胱がんにおけるネオエピトープ標的の同定
尿膀胱がんは、高い突然変異率を示し、その結果、免疫系によって非自己として認識される可能性がある多数のネオエピトープを発現する。したがって、本発明者らは、免疫療法用にＴ細胞を増殖させるために使用され得る潜在的なネオエピトープの大量のリポジトリを含む変異データベースを検索することによって、ネオエピトープペプチド及びＴ細胞の標的としてふさわしい腫瘍多型を調査した。

ＣＯＳＭＩＣデータベースは、全エクソーム解析及びホットスポット解析の双方の４７５４個の移行細胞がんの変異データを含む。本発明者らは、膀胱がん（ＵＢＣ）に注目し、単一アミノ酸変異、特に置換変異をもたらす最も一般的な１５の変異を選択し、その結果、ネオエピトープとして適格とした。本発明者らはまた、キナーゼ、成長因子受容体及び細胞周期タンパク質などの腫瘍病理発生に関連することが知られている遺伝子の多型に注目した。選択された１５の変異だけで、ＣＯＳＭＩＣにおいて見出される膀胱がん変異の７３％をカバーする。ＣＯＳＭＩＣデータベースから同定されたネオエピトープペプチドを、本実施例では「予測ネオエピトープペプチド」と呼ぶ。

別法として、免疫療法のためのさらなる多型及び新しい標的を同定するために、ＵＢＣ患者由来の腫瘍の全ゲノム配列決定が行われる。腫瘍のＲＮＡ配列決定を実施して多型を有する転写物の存在を確認することができる。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析遷移を使用することで、タンパク質レベルで最も一般的なネオエピトープの発現について患者を迅速にスキャンし、個々の免疫療法に使用されるネオエピトープペプチドを調整することができる。この方法を用いて同定されたネオエピトープペプチドを、本実施例では「個別化ネオエピトープ」と呼ぶ。

新生抗原性構築物を、配列の 中央にある１個のアミノ酸の位置に体細胞変異アミノ酸を有する２１アミノ酸ペプチドとして設計した（すなわち、アミノ酸位置１１に体細胞変異アミノ酸を有する）。新生抗原性構築物を設計するために、３個のネオエピトープペプチドを２個のＶＶＲスペーサーと連結した。これは、ＶＶＲモチーフが、ヒト白血球抗原提示のステップとして、翻訳後にリソソーム中のカテプシンＳによって切断されるためである。
（ｉｉｉ）ネオエピトープによるＴ細胞の活性化及び増殖

上記のように、９つのネオエピトープをバイオインフォマティックに同定した。予測ネオエピトープペプチドは、ＦＧＦＲ３及びｐ５３などの報告された膀胱がん関連変異を持つ遺伝子に基づいていた。３個のネオエピトープペプチドを含む新生抗原性構築物を使用するパイロット試験において、本発明者らは、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによって膀胱がんを有する患者の血液からＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を同定することができ、ネオエピトープペプチドアプローチの妥当性を実証した。

膀胱がんを有する同じ患者について、Ｔ細胞の活性化を、予測ネオエピトープペプチドＮＡ１－９（配列番号４～１２、以下の表４参照）を用いて行った。ＮＡ１、３、５、７及び８に応答して増殖が見られた（配列番号４、６、８、１０及び１１）。図２Ａは、ポリスチレン粒子に結合した予測ネオエピトープペプチド（ＮＡ１～９）を含む貪食可能な粒子と接触させたＡＰＣとのインキュベーション後のＰＢＭＣ培養物中の細胞の数を経時的に示す（ＰＢ＝末梢血）。図２Ａの矢印は、再刺激の時間（すなわち、ＡＰＣによって提示されたネオエピトープに応答した抗がんＴ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、Ｔ細胞試料を、予測ネオエピトープペプチド（ＮＡ１～９）を含む貪食可能な粒子と接触させたＡＰＣの第２のバッチと接触させた時間）を示す。図２Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞／全Ｔ細胞の％を示す。図２ＣはＣＤ ４におけるＴ－ｂｅｔ発現を示し、図２Ｄ及びＥはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を示す。

増殖したＴ細胞は、転写因子Ｔ－ｂｅｔ及び高レベルのエフェクター分子パーフォリン及びグランザイムＢ（ＧＺＢ）を発現する。

本発明の方法はまた、配列決定された腫瘍データが得られた播種性結腸がんを有する患者由来の細胞にも使用されている。患者はｐ５３に２つの多型を示し、そのうち１つは既知であり、もう１つは新規であった。患者はまた、ＰＩＫ３ＣＡに変異を示した。３個のネオエピトープペプチドを含み、配列番号３によるアミノ酸配列を有する３個の新生抗原性構築物を含む個別化新生抗原性構築物を、患者の腫瘍データにおける特異的変異に基づいて設計、発現及び精製し、これにより個別化ネオエピトープの同定が可能になった。実施例１及び２に概説されているプロトコルに従って新生抗原性構築物をポリスチレン粒子にカップリングすることによって、貪食可能な粒子を調製した。個別化新生抗原性構築物（配列番号３）を含む貪食可能な粒子を、細胞を増殖させるために使用した結果、ネオエピトープ特異的応答が起こった。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を培養に使用した。図３は、ポリスチレン粒子コア及びコアに強固に会合した個別化新生抗原性構築物を含む貪食可能な粒子を用いた増殖前及び増殖中のＴ試料において増殖するＣＤ４＋細胞（丸）を示すと同時に、Ｔ細胞のパーセント（小さい四角）及びＣＤ４＋Ｔ細胞の総数（大きい四角）を示す。

図４Ａは、ＰＢＭＣ培養物中の経時的な細胞数（日）を示す。一番上の線（Ｐａｔ２ 個別化ＮＡ）は、個別化新生抗原性構築物（配列番号３）を含む貪食可能な粒子と接触させた、インキュベーション後のＰＢＭＣ培養物中の細胞の数を示す。図の下の２本の線（Ｐａｔ２ ＮＡ１＋３及びＰａｔ２ ＮＡ４＋５）は、ＮＡ１及びＮＡ３の貪食可能な粒子又はＮＡ４及びＮＡ５の貪食可能な粒子と接触させた並行ＰＢＭＣ培養物中の細胞の数を示す。図４Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞／総Ｔ細胞の％を示す。１４日以降の時点における図４Ｂの一番上の線は、Ｐａｔ２の個別化ＮＡの実験に関するものである。図４Ａ及び図４Ｂの矢印は、再刺激の時間（すなわち、ＡＰＣによって提示されるネオエピトープに応答して抗がんＴ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、Ｔ細胞試料を、貪食可能な粒子と接触させたＡＰＣの第２のバッチと接触させた時間）を示す。図４Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞についてＢａｒｎｅｓ－Ｈｕｔ 確率的近傍埋め込み法（ＢＨ－ＳＮＥ）アルゴリズムを用いて行われた分析を可視化しており、ここで、試料中のすべての細胞は、選択された
マーカー、ここではＣＤ２８、ＣＤ５７、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、パーフォリン、グランザイムＢ（ＧＺＢ）、Ｋｉ－６７及びＰＤ－１のセットによる発現強度の類似性に従って２次元マップ上でクラスター化されている。

増殖マーカーＫｉ６７の発現及びＴ細胞の数は増殖において増加し、Ｔ－ｂｅｔ、パーフォリン及びグランザイムＢなどの抗腫瘍活性に関する重要なマーカーの発現は、１４日間の培養期間にわたってＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の双方で増加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージはＣＤ４＋Ｔ細胞の約１０％に減少したが、ＣＤ８＋細胞の総数は増加した。

配列データを受け取ってから増殖細胞の分析までの全プロセスは、４～５週間で完了することができる。

これらの結果は、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答があったことを示す。上述したように、本発明者らは、Ｔ細胞の活性化及び増殖のために、予測ネオエピトープペプチド及び個別化ネオエピトープペプチドを設計し、使用することができることを実証した。

本実施例のＴ細胞を増殖させる方法、及び本実施例の増殖方法を用いて増殖させたＴ細胞は、本明細書に記載のがんの治療及び予防のための使用及び方法において実用性が見出される。

実施例６：ＭＣ３８結腸直腸腫瘍特異的新生抗原に結合した貪食可能な粒子によるワクチン接種後の腫瘍成長を評価する腫瘍マウスモデル

材料及び方法
６個の異なる貪食可能な粒子群を含む貪食可能な粒子組成物をこの試験で使用した（本明細書では「ＭＣ３８粒子組成物」と呼ぶ）。各粒子群は、以下のタイプ、すなわち、１）配列番号１３、２）配列番号１４、３）配列番号１５、４）配列番号１６、５）配列番号１７、６）配列番号１８（表５参照）、のＭＣ３８新生抗原構築物のうちの１つに結合したポリスチレン粒子コア（Ｓｅｒａ－Ｍａｇ ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（親水性）カルボキシレート修飾磁性粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含んでいた。

各ＭＣ３８新生抗原性構築物は、ＭＣ３８結腸がん細胞株に由来する６つの異なる２０～２３アミノ酸の新生抗原ペプチド配列を含む。ＭＣ３８新生抗原性構築物を、大腸菌を使用して組換え発現させ、カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。

ＭＣ３８粒子は、実施例１で概説したプロトコルに従って調製した。作製後、貪食可能な粒子の６つの群を混合し、次いで、実施例２に記載のプロトコルを用いて滅菌した。ＰＢＳ中１０００万粒子／μｌの濃度でＭＣ３８粒子組成物のストック溶液を調製した。

試験マウス（ｎ＝５）に、ＭＣ３８粒子組成物の第１及び第２の用量を投与した。各用量の総体積は１０μｌであった（ＭＣ３８粒子組成物原液９．５μｌ、アジュバントとして０．０５ｎｍｏｌ ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ １６６８、Ｅｎｚｏ）０．５μｌ）。対照マウスは処置をしなかった（ｎ＝５、非ワクチン接種群）。

最初の用量の貪食可能な粒子（ＭＣ３８粒子組成物）を、ＭＣ３８腫瘍細胞を移植する５日前に注射した（図９の時点Ａ）。ＭＣ３８腫瘍細胞を０日目に移植した（図９の時点Ｂ）。１０^６個のＭＣ３８腫瘍細胞を各マウスに注射することによって移植を実現した。移植の１３日後、マウスに、１回目の用量と同じタイプの貪食可能な粒子（すなわちＭＣ３８粒子）の２回目の用量（図９の時点Ｃ）を注射した。各マウスの腫瘍体積を試験の経過にわたって測定した（図９参照）。

結果
結果を図９に示す。図９から分かるように、腫瘍成長は、ワクチン接種していないマウス（「陰性対照」マウス）と比較して、ＭＣ３８粒子を投与したマウス（「ワクチン接種」マウス）で顕著に減少した。これらの結果は、ＭＣ３８粒子が、ＭＣ３８結腸直腸腫瘍
マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する抗がん免疫応答を誘導するのに有効であることを示している。

実施例７：毒性及び生体内分布試験
貪食可能な粒子の最大許容量を評価するために、ラットモデルを使用して、貪食可能な粒子のコアの毒性及び生体内分布プロファイルを評価する。

材料及び方法
試験に使用した粒子は、Ｓｅｒａ－Ｍａｇ ＳｐｅｅｄＢｅａｄカルボキシレート修飾磁性粒子（親水性）である。これらの粒子は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（粒子ロット／バッチ番号 ＧＥ：１６８０７６７５、濃度：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中２．３％固形分（ｇ／１００ ｇ）（１０ｍｇ Ｆｅ／ｍＬに相当）、ｐＨ７．１）によって供給される。粒子は、使用前に２～８℃で保存する。

動物は、詳細には、ウィスター系ラットである。試験場に到着した時点で、ラットの体重をおよそ２５０ ｇとする。ラットを試験開始前に最低５日間馴化させる。ラットを、個別に換気したケージ（ＩＶＣ ４型）の中、＋２２℃±３℃、湿度５０％±２０％、１２時間明／１２時間暗のサイクルで飼育する。食物及び水は自由に摂取可能とする。ケージあたり３匹のラットとする。

試験１）
５匹の雌ウィスター系ラットをパイロット試験に使用する。ラット＃１に、実行可能な最大濃度（鉄５０ｍｇ／ｋｇに相当する濃度５ｍＬ／ｋｇ）の粒子を静脈内（ＩＶ）注射し、その後、画像を取得するためにラットをコンピュータ断層撮影（ＣＴ）カメラに入れる。静脈内注射は可能な限りゆっくりと行う。毒性応答が明らかな場合、粒子を２０分間にわたってゆっくり注入することで残りのラットに送達する（最大２０ ｍＬ／ｋｇ）。ラットに送達する粒子濃度を、最大許容量が特定されるまで滴定する。粒子の用量を受けていないラットを陰性対照としてバックグラウンドＣＴスキャンを取得するために使用する。

粒子のＩＶ注射／注入後、ラットをイソフルランで麻酔し、眼軟膏を眼に入れて脱水を防ぐ。次いで、ラットをＣＴ装置の加熱床に置き、吸入麻酔を維持する。呼吸センサ及び直腸温度計を使用して、実験の過程においてバイタルパラメータ（脈拍及び呼吸）をモニターする。ラットをＣＴカメラに入れ、約２０分間にわたって写真を取得する。粒子のＩＶ注射後の健康状態を記録して、起こり得る毒性反応を評価し、全身ＣＴ画像を使用して粒子の視認性を評価し、注射後の粒子の位置を特定する。ＣＴ画像の取得後、ラットを安楽死させる。

試験２）
１２匹のラットを用いてさらなる試験を行って、粒子除去速度を同定する。全てのラットは、パイロット試験で特定した用量で粒子のＩＶ注射を受ける。粒子の投与直後に、ラットをＣＴカメラに入れる。その後、ラットを、投与から２４時間後、３日後、７日後、１４日後及び１ヶ月後にＣＴカメラでモニターする。各時点で、組織病理学的分析のために器官を切除するべく２匹のラットを安楽死させる。ラットを、投与から２４時間後、３日後及び７日後、そして、その後は週に１回、健康状態及び体重の変化についてモニターする。

実施例７：バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用した貪食可能な粒子滅菌プロトコルの例示
本実験は、層流空気流（ＬＡＦ）安全キャビネット内で滅菌条件下で実施した。新生抗
原構築物に結合したコア（Ｓｅｒａ－Ｍａｇ ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓカルボキシレート修飾磁性粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む貪食可能な粒子を、高濃度アルカリ溶液（２Ｍから５Ｍ ＮａＯＨ）で４回洗浄した。最初の洗浄後、貪食可能な粒子を新しい滅菌チューブに移し、上清を除去し、２度目の量のアルカリ溶液を添加した。貪食可能な粒子を超音波処理浴中で１０分間超音波処理し、次いで、同じアルカリ溶液中でくるくると回転させながら３０分間インキュベートした。このプロセスをさらに２回繰り返した後、滅菌ダルベッコ修飾ＰＢＳで４回洗浄した。

貪食可能な粒子（新生抗原が付着していないＳｅｒａ－Ｍａｇ ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓカルボキシレート修飾磁性粒子）に高負荷量（＞１．２ ＣＦＵ）のｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｓｐｉｚｉｚｅｎｉｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）Ｅｐｏｗｅｒ １０６ ＣＦＵ）を加え、その後に続く上記のＮａＯＨ処理プロトコルでＮａＯＨ処理プロトコルの有効性を評価した。ＮａＯＨ処理後、未処理の試料（陽性対照）との対比で５Ｍ又は２Ｍ ＮａＯＨ処理の試料からの完全ビーズ懸濁液及び上清の双方を、抗生物質のない栄養寒天に播種し、３７℃で一晩（＞１６時間）インキュベートした。

結果
洗浄処理がないとｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｓｐｉｚｉｚｅｎｉｉのコロニーが多量に増殖したのに対して、５Ｍ及び２Ｍ ＮａＯＨ処理のいずれも細菌の増殖を効果的に無効にした。結論として、２Ｍ及び５Ｍ ＮａＯＨ処理のいずれも、貪食可能な粒子から人為的に高くしたバイオバーデンを除去するのに非常に有効であった。

Claims (27)

1. 対象のがんの治療又は予防に使用するための貪食可能な粒子であって、
   コアと、前記コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含み、前記貪食可能な粒子は０．５から２．５μｍの最大寸法を有し、前記コアはポリマーを含み、
   前記新生抗原性構築物が、前記対象のがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、前記タンパク質又はペプチドの前記一部が少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有し；
   前記対象のがんの治療又は予防は、前記貪食可能な粒子を前記対象に投与する工程を含む、貪食可能な粒子。
2. 前記新生抗原性構築物が、２個以上の共有結合したネオエピトープペプチドを含む、請求項１に記載の使用のための貪食可能な粒子。
3. 前記新生抗原性構築物が、３個以上の共有結合したネオエピトープペプチドを含む、請求項２に記載の使用のための貪食可能な粒子。
4. 前記新生抗原性構築物が、３個、４個又は５個の共有結合したネオエピトープペプチドを含む、請求項２又は３に記載の貪食可能な粒子。
5. 前記共有結合したネオエピトープペプチドが、スペーサー部分を介して共有結合している、請求項２から４のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
6. 前記スペーサー部分が、１から１５個のアミノ酸の配列である、請求項５に記載の使用のための貪食可能な粒子。
7. 前記スペーサー部分が、アミノ酸配列ＶＶＲ及び／又はアミノ酸配列ＧＧＳを含む、請求項５又は６に記載の使用のための貪食可能な粒子。
8. 前記共有結合したネオエピトープペプチドのそれぞれが、３から２５アミノ酸長である、請求項２から７のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
9. 前記新生抗原性構築物が前記コアに共有結合的に付着している、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
10. 前記貪食可能な粒子が、前記コアに強固に会合した２個以上の異なる新生抗原性構築物を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
11. 前記貪食可能な粒子が、前記コアに強固に会合した２個、３個、４個又は５個の異なる新生抗原性構築物を含む、請求項１０に記載の使用のための貪食可能な粒子。
12. 前記異なる新生抗原構築物のそれぞれが、異なるネオエピトープペプチド配列又はネオエピトープペプチドの異なる組み合わせを含む、請求項１０又は１１に記載の使用のための貪食可能な粒子。
13. 前記貪食可能な粒子が、０．５から２μｍの最大寸法、又は約１μｍの最大寸法を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
14. 前記コアが常磁性又は超常磁性である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
15. 前記コアがポリスチレンを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
16. 前記貪食可能な粒子が、アジュバントと共に投与されるか、又は前記コアに強固に会合したアジュバントを含む、
    請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子。
17. 前記アジュバントが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７及びＩＬ－４からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用のための貪食可能な粒子。
18. コアと、前記コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含む貪食可能な粒子を含む注射可能な医薬組成物であって、前記貪食可能な粒子は０．５から２．５μｍの最大寸法を有し、前記コアはポリマーを含み、及び前記新生抗原性構築物が、前記対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、前記タンパク質又はペプチドの前記一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、注射可能な医薬組成物。
19. 前記貪食可能な粒子が、請求項２から１７のいずれか一項に定義される、請求項１８に記載の注射可能な医薬組成物。
20. 対象のがんの治療又は予防に使用するための、請求項１８又は１９に記載の注射可能な医薬組成物。
21. 前記がんが、固形がんである、
    請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子又は
    請求項２０に記載の使用のための注射可能な医薬組成物。
22. 前記固形がんが、乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺カルチノイド腫瘍、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん及び膀胱がんから選択されるがんである、請求項２１に記載の使用のための貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物。
23. がんの前記治療又は予防が、さらに、
    前記貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物の１以上の後続の用量を前記対象に投与することを含み、前記対象は、前記対象においてがん細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分な用量の前記貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物を以前に投与された者である、
    請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子、又は
    請求項２０、２１又は２２に記載の使用のための注射可能な医薬組成物。
24. 前記対象における前記がんの前記治療又は予防が、さらに、
    ａ）前記貪食可能な粒子を前記対象に投与した後に、前記対象からＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を採取する工程と、
    ｂ）前記対象から採取した抗がんＴ細胞を増殖させる工程と、
    ｃ）治療用量の前記増殖した抗がんＴ細胞を前記対象に投与する工程とを含む、
    請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用のための貪食可能な粒子、又は
    請求項２０に記載の使用のための注射可能な医薬組成物、又は
    請求項２１から２３に記載の使用のための貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物。
25. 前記ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を前記対象に由来するＰＢＭＣ試料から採取する、請求項２４に記載の使用のための貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物。
26. 前記ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を同じＰＢＭＣ試料から採取するか、又は前記ＡＰＣ及び抗がんＴ細胞を異なるＰＢＭＣ試料から採取する、請求項２５に記載の使用のための貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物。
27. 前記抗がんＴ細胞の活性化及び増殖工程ｂ）が、
    ｉ．コアと、前記コアに強固に会合した新生抗原性構築物とを含む貪食可能な粒子を提供する工程であって、
    前記新生抗原性構築物が、前記対象においてがん細胞によって発現されることが知られているか若しくは疑われるタンパク質又はペプチドの一部のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを含み、前記タンパク質又はペプチドの前記一部が、少なくとも１個の体細胞変異アミノ酸を有する、工程と、
    ｉｉ．ＡＰＣを提供する工程と、
    ｉｉｉ．前記ＡＰＣによる前記貪食可能な粒子の食作用を可能にする条件下で、前記貪食可能な粒子を前記ＡＰＣとインビトロで接触させる工程と、
    ｉｖ．前記対象から採取された抗がんＴ細胞を提供する工程と、
    ｖ．前記ＡＰＣによって提示されたネオエピトープに応答して抗がんＴ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記抗がんＴ細胞を工程ｉｉｉ）からのＡＰＣとインビトロで接触させる工程とを含む、
    請求項２４、２５又は２６に記載の使用のための貪食可能な粒子又は注射可能な医薬組成物。