JP7629906B2 - 細胞標的化のための多重特異性抗原結合分子およびそれらの使用 - Google Patents

Description

配列表の参照
本出願は、２０２０年８月７日に作成され、６４，５７０バイトを含むファイル１０６０６ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照によって組み込む。

技術分野
本発明は、多価抗原結合タンパク質の代替フォーマット、およびそれらの使用の方法に関する。二重特異性および多重特異性分子を含む、多価抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合するＮ末端およびＣ末端抗原結合ドメインの両方を有する第１のポリペプチド鎖と、標的抗原（例えば、腫瘍細胞抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、を含む。

二重特異性および多重特異性抗体ならびに抗原結合分子は、当該技術分野で知られている（例えば、非特許文献１を参照されたい）。そのような既知のフォーマットの中には、ＦｃＦｃ＊（図１Ａ構造）があり、抗体のいずれかのアーム上にＦａｂ抗原結合ドメイン、およびプロテインＡ結合親和性を変化させてホモ二量体不純物からのヘテロ二量体の単離を可能にする修飾ＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を有する従来の二重特異性抗体である（同上ｐ．１８４、図２、パネル７、最後の構造）。この従来の二重特異性抗体フォーマットは、抗体の１つのアームが腫瘍細胞抗原を標的とし、第２のアームがＣＤ３などのＴ細胞抗原を標的とする二重特異性抗体を作製するために使用された。別の従来のフォーマットは、ＩｇＧ－ＨＣ－ｓｃＦｖ（図１Ｂ構造）であり、２つのＮ末端Ｆａｂドメインが第１の抗原に結合し、Ｆｃ領域のＣ末端に連結した２つのｓｃＦｖドメインが第２の抗原に結合する、二重特異性抗体である（同上ｐ．１８４、図２、パネル１０、最初の構造）。当該技術分野では、所望の機能性を改善する二重特異性または多重特異性抗原結合分子のための新しく有用なフォーマットの必要性がある。Ｂｒｉｎｋｍａｎｎらは、一般に、ホモ二量体またはヘテロ二量体抗原結合分子の生成のための「ビルディングブロック」を参照するが（ｐ．１８３、図１）、可能性は実質的に無限であり、伝えられるところによると図２（ｐ．１８４）に示されるそれらの分子のみが調製された。さらに、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎは、特異的な抗原結合ドメイン、特に、多重特異性分子の一部を形成する単一のポリペプチド鎖のＮ末端およびＣ末端の両方にＴ細胞抗原結合ドメインを含む分子を企図しない。

Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡＢＳ，９（２）：１８２－２１２，２０１７

一般に、本発明は、Ｔ細胞抗原（ＴＣＡ）（例えば、ＣＤ３）および標的抗原（ＴＡ）（例えば、腫瘍関連抗原、ウイルスまたは細菌抗原）の両方に結合し、Ｔ細胞抗原結合に関して多価（例えば、二価）である単一のポリペプチド鎖を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。

一態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第１の多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）第２の多量体化ドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の多量体化ドメインが、互いに会合して、分子を形成する、多重特異性抗原結合分子を提供する。

いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、第２の多量体化ドメインのＣ末端に第４の抗原結合ドメインをさらに含む。場合によっては、第４の抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合する。場合によっては、第３の抗原結合ドメインおよび第４の抗原結合ドメインは、異なる標的抗原に特異的に結合する。場合によっては、異なる標的抗原は、同じ細胞の表面上に発現（または存在）する。場合によっては、異なる標的抗原は、異なる細胞の表面上に発現（または存在）する。本明細書における、細胞の表面上に発現する（または存在する）標的抗原への参照は、細胞の膜に埋め込まれるか、または細胞の膜に広がる細胞によって発現されるタンパク質、および細胞による主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質の溝の文脈において提示されるペプチドの両方を含む。場合によっては、第３の抗原結合ドメインおよび第４の抗原結合ドメインは、同じ標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第４の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞抗原に特異的に結合する。場合によっては、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じＴ細胞抗原に特異的に結合する。場合によっては、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、異なるＴ細胞抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、共刺激分子である第１のＴ細胞抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは、チェックポイント阻害剤である第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する。場合によっては、共刺激分子は、ＣＤ２８であり、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１である。場合によっては、第１、第２、および第４の抗原結合ドメインは、同じＴ細胞抗原に特異的に結合する。場合によっては、第１、第２、および第４の抗原結合ドメインは、異なるＴ細胞抗原に結合する。場合によっては、第１および第４の抗原結合ドメインは、同じＴ細胞抗原に特異的に結合する。場合によっては、第２および第４の抗原結合ドメインは、同じＴ細胞抗原に特異的に結合する。

様々な実施形態では、抗原結合ドメインのうちの１つ以上は、Ｆａｂである。様々な実施形態では、抗原結合ドメインのうちの１つ以上は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、ＦａｂおよびｓｃＦｖ抗原結合ドメインの両方を含有する。場合によっては、第１の抗原結合ドメインおよび第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。場合によっては、第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。場合によっては、第４の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。場合によっては、第１および第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインであり、第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４の抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。場合によっては、第１、第２、第３、および第４の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインである。場合によっては、第１および第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインであり、第２および第４の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。場合によっては、第１、第２、第３、および第４の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインである。場合によっては、第１および第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインであり、第２および第４の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。場合によっては、第１、第２、第３、および第４の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインである。

抗原結合ドメインがｓｃＦｖドメインである任意の実施形態では、ｓｃＦｖドメインは、残基４４にシステイン変異を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および残基１００（Ｋａｂａｔ番号付け）にシステイン変異を含む軽鎖可変領域を含み得る。場合によっては、ｓｃＦｖは、１０～３０アミノ酸のポリペプチドリンカー、任意に（Ｇ４Ｓ）_４リンカーを介して一緒に結合したＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、５～２５アミノ酸のリンカー、任意に（Ｇ４Ｓ）_３リンカーを介して第１および／または第２の多量体化ドメインのＣ末端に接続している。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞受容体複合体抗原（すなわち、Ｔ細胞受容体複合体を構成するタンパク質サブユニットのいずれか）である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞上の共刺激分子またはチェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＰＤ－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＰＤ－１からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、真菌抗原または寄生虫抗原である。

いくつかの実施形態では、第１および第２の多量体化ドメインは、免疫グロブリンＦｃドメインである。場合によっては、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）の免疫グロブリンヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１ポリペプチドのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ４ポリペプチドのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の多量体化ドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合する。

いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインまたは第２の多量体化ドメインは、同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較してプロテインＡ結合についての親和性を低減するアミノ酸置換を含む。場合によっては、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ修飾、またはＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾（ＥＵ番号付け）を含む。場合によっては、第１の多量体化ドメインは、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾を含む。場合によっては、第２の多量体化ドメインは、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１および第２のポリペプチドの両方は、同じアイソタイプの野生型ヒンジドメインと比較して^Ｆｃγ受容体についての結合親和性を低減する修飾ヒンジドメインを含む。

別の態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインが、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する、多重特異性抗原結合分子を提供する。

いくつかの実施形態では、第２のＦａｂおよび第２のｓｃＦｖは、異なる標的抗原に特異的に結合する。場合によっては、異なる標的抗原は、同じ細胞の表面上に発現する。いくつかの実施形態では、第２のＦａｂおよび第２のｓｃＦｖは、同じ標的抗原に特異的に結合する。

別の態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインが、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する、多重特異性抗原結合分子を提供する。

いくつかの実施形態では、第３のＦａｂおよび第４のＦａｂは、異なる標的抗原に特異的に結合する。場合によっては、異なる標的抗原は、同じ細胞の表面上に発現する。いくつかの実施形態では、第３のＦａｂおよび第４のＦａｂは、同じ標的抗原に特異的に結合する。

別の態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインが、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する、多重特異性抗原結合分子を提供する。

別の態様では、本発明は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、および（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインが、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する、多重特異性抗原結合分子を提供する。

上記または本明細書で言及されるもののいずれかなどの、様々な実施形態では、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞受容体複合体抗原（すなわち、Ｔ細胞受容体複合体を構成するタンパク質サブユニットのいずれか）である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞上の共刺激分子またはチェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＰＤ－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＰＤ－１からなる群から選択される。

上記または本明細書で言及されるもののいずれかなどの、様々な実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、真菌抗原または寄生虫抗原である。

上記または本明細書で言及されるもののいずれかなどの、いくつかの実施形態では、第１および第２の多量体化ドメインは、免疫グロブリンＦｃドメインである。場合によっては、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧポリペプチド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）の免疫グロブリンヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１ポリペプチドのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ４ポリペプチドのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の多量体化ドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合する。

上記または本明細書で言及されるもののいずれかなどの、いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインまたは第２の多量体化ドメインは、同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較してプロテインＡ結合についての親和性を低減するアミノ酸置換を含む。場合によっては、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ修飾、またはＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾（ＥＵ番号付け）を含む。場合によっては、第１の多量体化ドメインは、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾を含む。場合によっては、第２の多量体化ドメインは、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１および第２のポリペプチドの両方は、同じアイソタイプの野生型ヒンジドメインと比較して^Ｆｃγ受容体についての結合親和性を低減する修飾ヒンジドメインを含む。

別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられる多重特異性分子のうちのいずれか１つと、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする対象に上記または本明細書で論じられる多重特異性分子のうちのいずれか１つを投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、感染症の治療を必要とする対象に上記または本明細書で論じられる多重特異性分子のうちのいずれか１つを投与することを含む、感染症を治療する方法を提供する。場合によっては、感染症は、細菌感染症である。場合によっては、感染症は、ウイルス感染症である。場合によっては、感染症は、真菌感染症である。場合によっては、感染症は、寄生虫感染症である。

様々な実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり１０～１０，０００，０００コピーの密度で存在する。様々な実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり１００～１０，０００，０００コピーの密度で存在する。様々な実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり１００～１，０００，０００コピーの密度で存在する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、５０～１０，０００の密度で存在する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、１００～５０００の密度で存在する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、１００～２０，０００の密度で存在する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり５００～１，０００，０００コピーの密度で存在する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり１０００～２０，０００コピーの密度で存在する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり２０，０００コピー超の密度で存在する。様々な実施形態では、標的抗原は、標的細胞当たり約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約５０，０００、約７５，０００、約１００，０００、約２００，０００、約３００，０００、約４００，０００、約５００，０００、約６００，０００、約７００，０００、約８００，０００、約９００，０００、約１，０００，０００、約２，０００，０００、約３，０００，０００、約４，０００，０００、または約５，０００，０００コピーの密度で存在する。本明細書で使用される場合、「低密度抗原」は、標的細胞上に５０００コピー以下の抗原が見出される抗原である。低密度抗原への参照は、細胞が、４０００コピー以下、３０００コピー以下、２０００コピー以下、１０００コピー以下、９００コピー以下、８００コピー以下、７００コピー以下、６００コピー以下、５００コピー以下、４００コピー以下、３００コピー以下、２００コピー以下、１００コピー以下、または５０コピー以下の標的抗原を有する場合を含む。

様々な実施形態では、多重特異性分子は、疾患または障害を治療するために第２の治療剤と組み合わされて投与される。場合によっては、第２の治療剤は、標的抗原（ＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメインおよびＴ細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含む。場合によっては、標的抗原は、腫瘍細胞抗原である。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、二重特異性抗ＴＡ×抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、二重特異性抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、Ｔ細胞上のチェックポイント阻害剤に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体を含む。場合によっては、多重特異性分子は、２つ以上の第２の治療剤と組み合わされて投与される。

別の態様では、本発明は、疾患または障害（例えば、がん、または感染症）の治療を必要とする対象における疾患または障害（例えば、がん、または感染症）を治療するための医薬品の製造における、上記または本明細書で論じられる多重特異性分子のうちのいずれか１つの使用を提供する。

別の態様では、本発明は、上記もしくは本明細書で論じられる多重特異性分子のうちのいずれか１つの医学における使用、または疾患もしくは障害（例えば、がん、もしくは感染症）を治療することを提供する。

別の態様では、本発明は、医学における使用のための、または疾患もしくは障害（例えば、がん、もしくは感染症）を治療するための、上記または本明細書で論じられる、多重特異性分子を提供する。

上記または本明細書で論じられる実施形態のいずれかでは、標的抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質の溝の文脈におけるペプチドであり得る。
様々な実施形態では、上記または本明細書で論じられる実施形態の特徴または構成要素のうちのいずれかは組み合わせられ得、そのような組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で論じられるいずれの特定の値も、上記または本明細書で論じられる別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲は本開示の範囲内に包含される。

他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。

図１Ａおよび１Ｂは、既知の二重特異性抗体および抗原結合分子フォーマットを示す。図１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｎ、１Ｏ、１Ｐ、１Ｑ、１Ｒ、および１Ｓは、本発明の実施形態による二重特異性または多重特異性抗原結合分子フォーマットを示す。これらのフォーマットの各々では、第１のポリペプチド鎖は、Ｔ細胞抗原（ＴＣＡ）（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合するＮ末端およびＣ末端抗原結合ドメイン（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）の両方を含み、第２のポリペプチド鎖は、標的抗原（ＴＡ）（例えば、腫瘍細胞抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。図１Ｄは、Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインが異なるポリペプチド鎖（１つのポリペプチド鎖上のＮ末端、および第２のポリペプチド鎖上のＣ末端）に位置するフォーマットを示す。 Ｔ細胞のみの対照（ゼロ）および陽性対照と比較した、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示されるフォーマットの各々を有する分子によって誘導されるＴ細胞活性化を示す。標的細胞の不在下では、分子のいずれもＴ細胞を活性化しなかった。 最大の細胞殺滅を誘導する陽性対照と比較した、ヒトＰＢＭＣおよび標的細胞（Ａ３７５）の存在下、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示されるフォーマットの各々を有する分子の細胞毒性活性を示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｃの構造を有する分子は、図１Ａおよび１Ｂの構造を有する分子よりも著しく強力であった。 図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、最大細胞殺滅を誘導する陽性対照と比較した、抗ＰＤ－１抗体（図４Ａ）、共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体（図４Ｂ）、または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体（図４Ｃ）の両方と組み合わされた、ヒトＰＢＭＣおよび標的細胞（Ａ３７５）の存在下で、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示されるフォーマットの各々を有する分子の細胞毒性活性を示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｃの構造を有する分子は、図１Ａおよび１Ｂの構造を有する分子よりも、これらの追加の抗体と組み合わされて著しく強力であった。 同上。 同上。 図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに示される最大抗体濃度の点で図１Ａ（左パネル）の構造を有する分子と比較した、図１Ｃ（右パネル）の構造を有する分子の測定されたサイトカインレベルを示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｃの構造を有する分子は、著しくより大きな細胞毒性活性にもかかわらず、より大きなレベルのサイトカイン放出を示さない。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、図１Ｃの構造を有する分子およびこの分子の修飾バージョン（不活性ドメインを有する－凡例ではＸによって示される）の、ＭＡＧＥＡ４ペプチドを過剰発現するＲａｊｉ細胞（図６Ａ）もしくはＡ３７５細胞（図６Ｃ）、またはＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（図６Ｂおよび６Ｄ）への結合を示す。図６Ａおよび６Ｂに示される分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図６Ｃおよび６Ｄに示される分子のＣＤ３結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄに示されるように、２つの活性抗原結合ドメインの存在は、標的抗原への結合を改善し、抗ＣＤ３結合ドメインの供給源に関係なく、同様の結合が観察された。これらの図に示されるように、結合は、Ｎ末端Ｆａｂドメインが除去されたときに最も影響を受けた。 同上。 同上。 同上。 図７Ａおよび７Ｂは、図６Ａおよび６Ｂ（図７Ａ）、ならびに図６Ｃおよび６Ｄ（図７Ｂ）に示される同じ分子の細胞毒性活性を示す。図１Ｃの構造を有する分子は、最大の細胞毒性効力を示し、２つの活性Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）結合ドメインを有する分子が続いた。抗ＣＤ３結合ドメインの供給源に関係なく、同様の細胞毒性のパターンが観察された。 同上。 図８Ａおよび８Ｂは、図１Ｃの構造を有する分子およびこの分子の修飾バージョン（Ｃ末端Ｆａｂドメインまたは不活性ドメインを有する－凡例ではＸによって示される）の、ＭＡＧＥＡ４ペプチドを過剰発現するＲａｊｉ細胞（図８Ａ）またはＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（図８Ｂ）への結合を示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図８Ａおよび８Ｂに示されるように、Ｃ末端ｓｃＦｖドメインは、Ｃ末端Ｆａｂドメインと比較して標的抗原への優れた結合を提供した。 同上。 図８Ａおよび図８Ｂに示される同じ分子の細胞毒性活性を示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｃの構造を有する分子は、最大の細胞毒性効力を示し、図１Ｅの構造を有する分子が続いた。 図１０Ａおよび１０Ｂは、図１Ｃおよび１Ｄの構造を有する分子の、ＭＡＧＥＡ４ペプチドを過剰発現するＡ３７５細胞（図１０Ａ）、またはＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１０Ｂ）への結合を示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。２つの分子は、互いに比較して両方の細胞型への同様の結合を示した。 同上。 図１１Ａおよび１１Ｂは、２つの異なるドナー供給源からのＡ３７５細胞に対する図１０Ａおよび１０Ｂに示される同じ分子の細胞毒性活性を示す。分子のＣＤ３結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｃの構造を有する分子は、図１Ｄの構造を有する分子よりも強力であった。 同上。 図１２Ａおよび１２Ｂは、図１Ａの構造を有する分子と比較した、それぞれ、図１Ｃおよび図１Ｆの構造を有する分子の相対的な細胞毒性活性および効力を示す。分子は、実施例７で論じられるように、個別に、ならびに共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体および抗ＰＤ－１抗体と組み合わされて試験された。分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｆの構造を有する分子は、２つのＴＡ抗原結合ドメインを有する同じ標的抗原の２つの異なるエピトープを標的とするが、図１Ｃの構造を有する分子は、２つのＴＡ抗原結合ドメインを有する標的抗原の同じエピトープを標的とする。図１Ｆの構造を有する分子は、図１Ｃの構造を有する分子よりも強力であり、両方の分子は、図１Ａの構造を有する分子よりも強力であった。いずれの場合も、これらの分子の共刺激二重特異性抗体および抗ＰＤ－１抗体との組み合わせは、図４Ａ～４Ｃに示される結果と同様に、さらに大きな細胞毒性効力をもたらした。 同上。 ＣＤ３結合ドメインがＣＤ３に対して強い、中程度の、または弱い結合親和性を有する抗ＣＤ３抗体に由来する、図１Ｆの構造を有する分子についての相対的な結合親和性を示す。「強」結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体に由来する。「中」結合ドメインは、７２２１Ｇ抗ＣＤ３抗体に由来する。「弱」結合ドメインは、７２２１Ｇ２０抗ＣＤ３抗体に由来する。例えば、「強／強」への参照は、それぞれ、Ｆａｂ抗ＣＤ３結合ドメインおよびｓｃＦｃ抗ＣＤ３結合ドメインを指す。予想どおり、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合は、分子における抗ＣＤ３結合ドメインの親和性の強度と相関する。 図１４Ａおよび１４Ｂは、ＭＡＧＥＡ４陽性Ａ３７５細胞における図１３に示される分子の相対的な細胞毒性活性および効力を示す。分子は、実施例８で論じられるように、個別に（図１４Ａ）、ならびに共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体および抗ＰＤ－１抗体（図１４Ｂ）と組み合わされて試験された。抗ＣＤ３結合ドメインの強度と分子の効力との間には明確な相関がある。「対照」は、他の分子と比較するための最大の細胞毒性を提供するために、すべてのＨＬＡ分子の足場を標的とする陽性対照である。 同上。 図１５Ａおよび１５Ｂは、ＭＡＧＥＡ４陽性ＳｃａＢＥＲ細胞における図１３に示される分子の相対的な細胞毒性活性および効力を示す。分子は、実施例８で論じられるように、個別に（図１５Ａ）、ならびに共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体および抗ＰＤ－１抗体（図１５Ｂ）と組み合わされて試験された。抗ＣＤ３結合ドメインの強度と分子の効力との間には明確な相関がある。「対照」は、他の分子と比較するための最大の細胞毒性を提供するために、すべてのＨＬＡ分子の足場を標的とする陽性対照である。 同上。 図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、図１Ａ（分子Ｃ）、１Ｃ（分子Ｂ）、およびＩＦ（分子ＡおよびＤ）の構造を有する分子についてのＮＹＥＳＯ－１陽性細胞（図１６Ａ）、ＭＡＧＥＡ４（ペプチド１）陽性細胞（図１６Ｂ）、およびＭＡＧＥＡ４（ペプチド２）陽性細胞（図１６Ｃ）に対する相対的結合親和性を示す。予想どおり、ＮＹＥＳＯ－１結合ドメインを有しない、分子Ｄは、ＮＹＥＳＯ－１発現細胞に結合せず（図１６Ａ）に、関連するＭＡＧＥＡ４結合ドメインを欠く分子は、図１６Ｂおよび１６Ｃに示されるように、ＭＡＧＥＡ４発現細胞に結合しない。分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。「ＨＬＡ標的化二重特異性」陽性対照は、ＨＬＡ分子およびＣＤ３を結合する。「アイソタイプ対照多重特異性」は、無関係な標的抗原への結合ドメインを有する図１Ｃの構造を有する分子である。 同上。 同上。 図１７Ａおよび１７Ｂは、ＨＬＡ分子およびＣＤ３を結合する、図１Ａの構造を有する陽性対照と比較した、それぞれ、図１Ｃおよび図１Ｆの構造を有する分子の相対的な細胞毒性活性および効力を示す。アイソタイプ対照には、無関係な標的抗原への結合ドメインを有する図１Ｃの構造を有する分子、ならびにＣＤ３および無関係な標的抗原への結合ドメインを有する図１Ａの構造を有する分子が含まれた。分子は、実施例９で論じられるように、個別に、ならびに共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体および抗ＰＤ－１抗体と組み合わされて試験された。分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１Ｆの構造を有する分子は、２つのＴＡ抗原結合ドメインを有する２つの異なる抗原（ＮＹＥＳＯ－１およびＭＡＧＥＡ４）を標的とするが、図１Ｃの構造を有する分子は、２つのＴＡ抗原結合ドメインの両方を有する単一の抗原を標的とする。図１Ｆの構造を有し、２つの異なる抗原を標的とする分子は、図１Ｃの構造を有する分子よりも強力であった。いずれの場合も、これらの分子と共刺激二重特異性抗体および抗ＰＤ－１抗体との組み合わせは、図４Ａ～４Ｃに示される結果と同様に、分子単独と比較して、さらに大きな細胞毒性効力をもたらした。 同上。 図１７Ｃおよび１７Ｄは、図１７Ａおよび１７Ｂに関連して論じられる分子の相対的なＴ細胞活性化を示したものである。 同上。 図１８Ａおよび１８Ｂは、図１Ａの構造を有する分子と比較した、それぞれ、図１Ｃおよび図１Ｆの構造を有する分子の相対的な細胞毒性活性および効力を示す。陽性対照は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子およびＣＤ３を結合する図１Ａの構造を有する分子である。アイソタイプ対照には、無関係な標的抗原への結合ドメインを有する図１Ｃの構造を有する分子、ならびにＣＤ３および無関係な標的抗原への結合ドメインを有する図１Ａの構造を有する分子が含まれた。分子は、実施例９で論じられるように、個別に、ならびに共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体および抗ＰＤ－１抗体と組み合わされて試験された。分子のＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む。図１８Ａに示されるように、図１Ｆの構造を有する（２つの異なるＭＡＧＥＡ４のエピトープを標的とする）分子は、図１Ｃの構造を有する（両方のＴＡ結合ドメインを有する単一のエピトープを標的とする）分子よりも強力であり、両方の分子は、図１Ａの構造を有する分子よりも強力である。同様に、図１８Ｂに示されるように、図１Ｆの構造を有する（２つの異なる抗原を標的とする）分子は、図１Ｃの構造を有する（両方のＴＡ結合ドメインを有する単一の抗原を標的とする）分子よりも強力であり、両方の分子は、図１Ａの構造を有する分子よりも強力である。いずれの場合も、これらの分子と共刺激二重特異性抗体および抗ＰＤ－１抗体との組み合わせは、図４Ａ～４Ｃに示される結果と同様に、分子単独と比較して、さらに大きな細胞毒性効力をもたらした。 同上。 図１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅ、および１８Ｆは、図１８Ａおよび１８Ｂに関連して論じられる分子の相対的なＴ細胞活性化を示す。 同上。 同上。 同上。 図１９Ａおよび１９Ｂは、図１Ａの構造を有する２つの分子の組み合わせと比較した、図１Ｆの構造を有する分子の、それぞれ、細胞毒性活性および効力、ならびにＴ細胞活性化を示し、２つの分子の組み合わせは、図１Ｆの構造を有する分子と同じ標的抗原の対に結合する。図１９Ａおよび１９Ｂに示されるように、図１Ｆの構造を有する分子は、図１Ａの構造を有する２つの分子の組み合わせよりも、腫瘍細胞をより強力に殺滅し、Ｔ細胞活性化を増加させる。 同上。

本発明がさらに詳細に記載される前に、記載される特定の方法および実験条件が異なり得るため、本発明がそのような方法および条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するようには意図されていないことも、理解されたい。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書において言及されるすべての特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。

定義
「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋細胞（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８＋細胞（細胞毒性Ｔ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、および腫瘍浸潤リンパ球を含む、ＣＤ３を発現する免疫細胞を指す。

「Ｔ細胞抗原」という表現は、Ｔ細胞上に存在する細胞表面に発現されるタンパク質を指し、「共刺激分子」を含む。「共刺激分子」とは、同族のリガンドまたは受容体（例えば、抗原提示細胞上）に結合して刺激シグナルを提供するＴ細胞によって発現されるタンパク質を指し、これは、Ｔ細胞のＴＣＲのペプチド／ＭＨＣとの関与によって提供される一次シグナルと組み合わされて、Ｔ細胞の活性を刺激する。Ｔ細胞の刺激は、Ｔ細胞の活性化、増殖、および／または生存を含むことができる。

本明細書で使用される場合、「細胞表面発現」または「細胞表面分子」という表現は、インビトロまたはインビボで細胞の表面上に発現される１つ以上のタンパク質を意味し、タンパク質の少なくとも一部分は、細胞膜の細胞外側面に露出され、抗体の抗原結合部分または本明細書で論じられる多重特異性抗原結合分子の抗原結合ドメインに接近可能である。

「ＣＤ３」という表現は、本明細書で使用される場合、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞上に発現され、４つの受容体鎖すなわちＣＤ３－イプシロン、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ３－ガンマのうち２つの会合から形成されるホモ二量体またはヘテロ二量体からなる抗原を指す。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントへのすべての参照は、非ヒト種由来であると明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すよう意図されている。したがって、「ＣＤ３」という表現は、非ヒト種、例えば、「マウスＣＤ３」、「サルＣＤ３」など由来であると特定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ３に結合する抗体」または「抗ＣＤ３抗体」は、単一のＣＤ３サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマ、またはゼータ）を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに２つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、およびゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗原結合ドメインは、可溶性ＣＤ３および／または細胞表面発現ＣＤ３に結合し得る。可溶性ＣＤ３には、天然ＣＤ３タンパク質、ならびに膜貫通ドメインを欠くか、または細胞膜と会合していない組換えＣＤ３タンパク質バリアント、例えば、単量体および二量体ＣＤ３構築物などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「細胞表面発現ＣＤ３」という表現は、インビトロまたはインビボで細胞表面上に発現される１つ以上のＣＤ３タンパク質を意味し、ＣＤ３タンパク質の少なくとも一部は細胞膜の細胞外側面に露出され、抗体の抗原結合部分に接近可能である。「細胞表面発現ＣＤ３」としては、細胞膜内の機能的Ｔ細胞受容体の中に含まれるＣＤ３タンパク質が挙げられる。「細胞表面発現ＣＤ３」という表現は、細胞の表面上のホモ二量体またはヘテロ二量体の一部として発現されるＣＤ３タンパク質（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、およびゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を含む。「細胞表面発現ＣＤ３」という表現はまた、他のＣＤ３鎖型なしで、細胞の表面上にそれ自体で発現するＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ３－デルタ、またはＣＤ３－ガンマ）も含む。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ３」は、通常ＣＤ３タンパク質を発現する細胞の表面上に発現されるＣＤ３タンパク質を含むかまたはそれからなることができる。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ３」は、通常その表面にヒトＣＤ３を発現しないがその表面にＣＤ３を発現するように人工的に操作されている細胞の表面上に発現されるＣＤ３タンパク質を含むかまたはそれからなることができる。

「抗原結合ドメイン」という用語は、所定の抗原（例えば、ＣＤ３または腫瘍関連抗原）に特異的に結合する多重特異性分子または対応する抗体のその部分を指す。「対応する抗体」への参照は、多重特異性分子で使用されるＣＤＲまたは可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）が由来する抗体を指す。例えば、例で論じられる図１Ｃ構造の分子は、特異的な抗ＣＤ３抗体および抗ＭＡＧＥＡ４抗体に由来する可変領域を有するＦａｂおよびｓｃＦｖを含む。これらの抗体は、それぞれの多重特異性分子に「対応する抗体」である。

「多重特異性抗原結合分子」という用語は、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）の異なるエピトープまたは抗原に結合する分子を含む。場合によっては、多重特異性抗原結合分子は、二重特異性である。場合によっては、多重特異性抗原結合分子は、三重特異性である。場合によっては、多重特異性抗原結合分子は、四重特異性である。

「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＣＤ３または標的抗原（ＴＡ））に特異的に結合するか、またはそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子も含む。重鎖は各々、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され得る。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態では、抗ＴＡ抗体または抗ＣＤ３抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメインおよび任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技法を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成され得る。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技法を使用することによって配列決定および操作されて、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などすることができる。

抗体結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。

抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、またはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_ＨドメインがＶ_Ｌドメインに会合した抗原結合フラグメントでは、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられてもよい。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、またはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインを含んでもよい。

特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な立体配置には、（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３、（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ、（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２、（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが挙げられる。上に列記される例示的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの立体配置でも、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されているか、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されているかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可動性または半可動性連結をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０、またはそれ以上の）アミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いとのおよび／または１つ以上の単量体Ｖ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有結合において、上に列記される可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。

本発明の特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によるか、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。

本明細書で論じられる抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、もしくは単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離される抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される際の、インビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に由来しそれらに関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。

本明細書で参照される抗体は、単離された抗体であり得る。「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するか、もしくは天然に産生される組織もしくは細胞から、分離または除去された抗体は、「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内でインサイチュの抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに供された抗体である。単離された抗体は、他の細胞性材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。

本明細書で参照される抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって産生されたものである。特定の状況では、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。

「多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）ドメイン」または「多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｉｎｇ）ドメイン」は、同じまたは類似の構造または構成の第２の高分子と（共有的にまたは非共有的に）会合する能力を有する任意の高分子である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化ドメインの非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。特定の実施形態では、多量体化ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含有する長さが１～約２００アミノ酸のＦｃフラグメントまたはアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むか、またはそれからなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＦｃドメインであり、本発明の多重特異性抗原結合分子は、従来の抗体におけるように、鎖間ジスルフィド結合を介した２つのそのようなＦｃドメインの会合によって形成される。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されるフラグメントなどの、ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー型）、またはそれらの両方の組み合わせである単量体からなり得る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾は、例えば、１つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換を含み、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に類似した構造と置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような連結の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製、もしくは単離されるすべての分子、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される多重特異性分子（例えば、二重特異性分子）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される多重特異性分子（例えば、二重特異性分子）（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、またはヒト免疫グロブリンおよび／もしくはＭＨＣ遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離される分子を含むことを意図する。そのような組換え多重特異性分子は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗原結合ドメインを含むことができる。

「対象」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界のすべてのメンバーを含む。一実施形態では、患者は、疾患または障害、例えば、感染症またはがんを有するヒトである。

「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に論じられるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。

ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。同様の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例には、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸塩－アスパラギン酸塩、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用され得るＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである既定パラメータまたは推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）（上記参照））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用したコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。

「ベクター」および「発現ベクター」という用語は、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成、もしくは合成核酸からなり得る線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ベクターは、自律複製（エピソームベクター）および／またはそれらが連結されている核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしかおよびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスを含む。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、およびレンチウイルスが挙げられる。

多重特異性抗原結合分子
本発明の多重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性または三重特異性または四重特異性）は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第１の多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）第２の多量体化ドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の多量体化ドメインは、（例えば、鎖間ジスルフィド結合を介して）互いに会合して、分子を形成する。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性または三重特異性または四重特異性）は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第１の多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第２の多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第４の抗原結合ドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の多量体化ドメインは、（例えば、鎖間ジスルフィド結合を介して）互いに会合して、分子を形成する。

上記および本明細書で参照される抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、Ｆａｂドメイン、および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対合される重鎖ＣＨ１ドメイン、およびＣＬドメインであり得る。上記および本明細書で参照される抗原結合ドメインはまた、例えば、約１０～約２５アミノ酸の、短いペプチドリンカーによって一緒に接続されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインであり得る。特定のリンカーには、（Ｇ４Ｓ）_ｎリンカーが含まれ、ｎ＝１～１０であるか、またはｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０である。場合によっては、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲとＬＣＶＲとの間のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）_４である。別段に定義されない限り、本発明の多重特異性分子の抗原結合ドメインは、すべてのＦａｂドメイン、すべてのｓｃＦｖドメイン、またはＦａｂドメインおよびｓｃＦｖドメインの組み合わせであり得る。場合によっては、抗原結合ドメインのうちの１つ以上は、Ｆａｂドメインである。場合によっては、抗原結合ドメインのうちの１つ以上は、ｓｃＦｖドメインである。場合によっては、第１の抗原結合ドメインおよび第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインである。場合によっては、第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。場合によっては、第４の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。場合によっては、第１および第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインであり、第２および第４の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。場合によっては、第１、第２、および第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインである。場合によっては、第１、第２、第３、および第４の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメインである。

様々な実施形態では、ｓｃＦｖドメインは、リンカーペプチドを介してそれぞれの多量体化ドメインのＣ末端に接続している。場合によっては、リンカーは、１～１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～２０アミノ酸長である。これに関して、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であり得る。本明細書で論じられる数を含む範囲は、本開示内にも包含され、例えば、リンカー１０～３０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、可動性リンカーである。好適なリンカーは、容易に選択され得、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸などの様々な長さの好適なもののうちのいずれかであり得、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であり得る。例示的な可動性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（ＧＳ）_ｎ、（ｎは、少なくとも１（例えば、１～２０）の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当該技術分野で既知の他の可動性リンカーが挙げられる。特定のリンカーには、（Ｇ４Ｓ）_ｎリンカーが含まれ、ｎ＝１～１０であるか、またはｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０である。場合によっては、各ｓｃＦｖドメインとそれぞれの多量体化ドメインのＣ末端との間のリンカーは、（Ｇ４Ｓ）_３である。

１つ以上の抗原結合ドメインがｓｃＦｖであるそれらの実施形態では、ｓｃＦｖは、安定化ｓｃＦｖであり得、１つ以上の修飾は、ｓｃＦｖの適切な立体配座をもたらし、維持するために、ＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲ配列に対して行われる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、可変領域間のジスルフィド間結合を生成するために、ＨＣＶＲの残基４４およびＬＣＶＲの残基１００（Ｋａｂａｔ番号付け）にシステイン変異を含む（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ，１２：１－１１，２０１１、およびＷｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（７）：３２１－３２９，２０１２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、グルタミン残基をグルタミン酸またはリジン残基に修飾して、立体配座異性化を阻害するために、ＨＣＶＲの残基３９およびＬＣＶＲの残基３８（Ｋａｂａｔ番号付け）に変異を含む（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２３（８）：６６７－６７７，２０１０を参照されたい）。

様々な実施形態では、抗原結合ドメインのいずれかのＬＣＶＲ（および任意にＣＬ）は、ＨＣＶＲに対応する同族のＬＣＶＲであり得るか、またはＬＣＶＲは、複数の抗原結合ドメインに共通の汎用的ＬＣＶＲ（および任意にＣＬ）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインの軽鎖は、共通の軽鎖である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインの軽鎖は、標的抗原結合ドメインに対応する同族の軽鎖であり、軽鎖は、両方のＦａｂドメインに共通である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖドメインのＬＣＶＲは、同族のＬＣＶＲである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂドメインの軽鎖は、共通の軽鎖であり、ｓｃＦｖドメインのＬＣＶＲは、同族のＬＣＶＲである。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｃに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｅに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第１の標的抗原とは異なる第２の標的抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｆに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第１の標的抗原とは異なる第２の標的抗原に特異的に結合する第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｇに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｈに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｉに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、および（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｊに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、および（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｋに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｌに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｍに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第１の標的抗原とは異なる第２の標的抗原に特異的に結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｎに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第１の標的抗原とは異なる第２の標的抗原に特異的に結合する第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｏに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞に特異的に結合する（任意に第１のＴ細胞抗原、第２のＴ細胞抗原、または第３のＴ細胞抗原に結合し得る）第２のｓｃＦｖを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｐに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞に特異的に結合する（任意に第１のＴ細胞抗原、第２のＴ細胞抗原、または第３のＴ細胞抗原に結合し得る）第４のＦａｂを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｑに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第２のＦａｂ、および（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｒに示される。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）第１のＴ細胞抗原に特異的に結合する第１のＦａｂ、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンＦｃドメイン、および（ｉｉｉ）第２のＴ細胞抗原に特異的に結合する第２のＦａｂを含む、第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ、および（ｉｉ）第２の免疫グロブリンＦｃドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、第１および第２の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、分子を形成する。そのような分子の例示的な構造は、図１Ｓに示される。

別段に定義されない限り、かつ存在する場合、第４の抗原結合ドメインは、標的抗原またはＴ細胞抗原に特異的に結合することができる。場合によっては、第３の抗原結合ドメインおよび第４の抗原結合ドメインは、異なる標的抗原（同じタンパク質、または異なるタンパク質上の異なるエピトープ）に特異的に結合する。場合によっては、異なる標的抗原は、同じ標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上に発現する。場合によっては、第３の抗原結合ドメインおよび第４の抗原結合ドメインは、同じ標的抗原（同じタンパク質上の同じエピトープ）に特異的に結合する。様々な実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメイン、ならびに第４の抗原結合ドメイン（存在し、Ｔ細胞抗原に向けられる場合）は、図に示されるように、同じまたは異なるＴ細胞抗原に結合することができる。場合によっては、第１、第２、および第４の抗原結合ドメインは、異なるＴ細胞抗原（同じタンパク質、または異なるタンパク質上の異なるエピトープ）に特異的に結合する。場合によっては、第１、第２、および第４の抗原結合ドメインは、同じＴ細胞抗原（同じタンパク質上の同じエピトープ）に特異的に結合する。場合によっては、異なるＴ細胞抗原は、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）およびチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１）である。そのような実施形態では、本発明の多重特異性分子は、Ｔ細胞に共刺激シグナルを提供するだけでなく、チェックポイント阻害を防止することができる。本明細書で使用される場合、「同じ」標的抗原またはＴ細胞抗原への参照は、必ずしも抗原結合ドメインが同じ表面分子に結合していることを意味しないが、むしろ抗原結合ドメインが同じ特異性を有する（例えば、それらは各々がＣＤ３またはＴＡを結合する）ことを意味する。同様に、「異なる」標的抗原またはＴ細胞抗原への参照は、それが別の標的抗原（例えば、ＭＡＧＥＡ４対ＥＧＦＲ）もしくは別のＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ２８対ＰＤ－１）とは異なるか、または同じタンパク質上の別のエピトープであることを意味する。

上記または本明細書で論じられる実施形態のいずれかでは、標的抗原は、腫瘍関連抗原または感染症関連抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫によって発現される抗原）であり得る。場合によっては、標的抗原は、腫瘍関連抗原である。場合によっては、標的抗原は、感染症関連抗原である。場合によっては、標的抗原は、ウイルス抗原である。場合によっては、標的抗原は、細菌抗原である。場合によっては、標的抗原は、真菌抗原である。場合によっては、標的抗原は、寄生虫によって発現される抗原である。

場合によっては、標的抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質の溝（ＰｉＧ）の文脈におけるペプチドである。いくつかの実施形態では、ＰｉＧは、約５～約４０アミノ酸残基、約６～約３０アミノ酸残基、約８～約２０アミノ酸残基、または約９、１０、もしくは１１アミノ酸残基からなるペプチドである。場合によっては、ＰｉＧは、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原のフラグメントである。様々な実施形態では、標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、またはＨＬＡ－ＤＰのいずれかを含む、ヒト白血球抗原の任意のクラス、サブタイプ、または対立遺伝子の溝の文脈におけるペプチドである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチド／ＭＨＣ複合体である。場合によっては、ペプチド／ＭＨＣ複合体中のペプチドは、腫瘍関連抗原のフラグメント、細菌抗原のフラグメント、ウイルス抗原のフラグメント、真菌抗原のフラグメント、または寄生虫抗原のフラグメントである。

場合によっては、抗原は、腫瘍関連抗原または腫瘍細胞によって発現される抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ－８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えば、ＧＡＧＥ－１、－２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１０、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えば、ＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６、および－１２）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン、ＭＬ－ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、トンプソン－ヌーベル抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、およびウロプラキン－３からなる群から選択される。

場合によっては、抗原は、ウイルス抗原または細菌抗原である。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、アデノウイルス、アストロウイルス、チクングニア、サイトメガロ、デング、エボラ、ＥＢＶ、ハンタウイルス、ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス、ＨＩＶ、ＨＰＩＶ、ＨＴＬＶ、インフルエンザ、日本脳炎ウイルス、ラッサ、はしか、メタニューモウイルス、ムンプス、ノロウイルス、オロプーシェ、ＨＰＶ、パルボウイルス、ロタウイルス、ＲＳＶ、風疹、ＳＡＲＳ、ＴＢＥＶ、ウスツ、ワクシニア、水痘、ウエストナイル、黄熱、およびジカからなる群から選択されるウイルスに関連するか、もしくはそれによって発現され、または細菌抗原は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、カルバペネム耐性Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、薬物耐性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、多剤耐性Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、薬物耐性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、フルコナゾール耐性Ｃａｎｄｉｄａ、基質特異性拡張型β－ラクタマーゼ産生菌、バンコマイシン耐性ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、多剤耐性ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、薬物耐性非チフス性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、薬物耐性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｔｙｐｈｉ、薬物耐性Ｓｈｉｇｅｌｌａ、薬物耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、薬物耐性ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ、エリスロマイシン耐性ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびクリンダマイシン耐性ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される細菌に由来する。

上記または本明細書で論じられる実施形態のいずれかでは、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞の表面で発現される抗原、Ｔ細胞受容体複合体抗原、Ｔ細胞上の共刺激分子もしくはチェックポイント阻害剤、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、またはＰＤ－１であり得る。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞受容体複合体抗原である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、Ｔ細胞上の共刺激分子またはチェックポイント阻害剤である。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＰＤ－１からなる群から選択される。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＰＤ－１からなる群から選択される。場合によっては、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、０Ｘ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、２Ｂ４、ＣＤ２２６、ＴＩＭ１、およびＴＩＭ２からなる群から選択される。

Ｔ細胞抗原がＣＤ３である特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に結合し、ヒトＴ細胞活性化を誘導する。特定の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に弱く結合し、ヒトＴ細胞活性化を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に弱く結合し、腫瘍関連抗原発現細胞殺滅を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトおよびカニクイザル（サル）ＣＤ３と弱く結合または会合するが、結合相互作用は、当該技術分野で既知のインビトロアッセイによって検出可能ではない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に弱い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に（例えば、２５℃で）、表面プラズモン共鳴（例えば、ｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）または実質的に同様のアッセイによって測定される約１５ｎＭ未満のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、ｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）または実質的に同様のアッセイで測定される場合に、約１５ｎＭ超、約２０ｎＭ超、約３０ｎＭ超、約４０ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約６０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約２００ｎＭ超、または約３００ｎＭ超のＫ_Ｄ値で結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ３に、例えば、本明細書において実施例３で定義されるアッセイフォーマット、または実質的に同様のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定される場合に、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１８０ｐＭ未満、約１６０ｐＭ未満、約１４０ｐＭ未満、約１２０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、または約１０ｐＭ未満のＫ_Ｄで結合する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、インビトロフローサイトメトリー結合アッセイで測定される場合に、約５０ｎＭ未満未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、または５００ｐＭ未満のＥＣ_５０値を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、インビトロフローサイトメトリー結合アッセイで測定される場合に、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、または１μＭ以上のＥＣ_５０値を示す。

実施形態のいずれかでは、ＣＤ３結合ドメインは、７１９５Ｐ、７２２１Ｇ、７２２１Ｇ５、および７２２１Ｇ２０として同定される抗体を含む、ＷＯ２０１４／０４７２３１（９２５０－ＷＯ）またはＷＯ２０１７／０５３８５６（１０１５１ＷＯ０１）に開示される抗ＣＤ３抗体のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列の対内に含有される６つのＣＤＲ）アミノ酸配列のいずれかを含むことができる。様々な実施形態では、「強い結合剤」として同定された抗ＣＤ３抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、Ｔ２００ ＢＩＡＣＯＲＥ装置で行われる測定での抗原捕捉フォーマットで２５℃）で測定される場合に、一桁のナノモル範囲（例えば、１～９ｎＭ）のヒトＣＤ３についての親和性を有する。様々な実施形態では、「中程度の結合剤」として同定された抗ＣＤ３抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される場合に、２桁のナノモル範囲（例えば、１０～９９ｎＭ、任意に１０～５０ｎＭ、または１０～２５ｎＭ）のヒトＣＤ３についての親和性を有する。様々な実施形態では、「弱い結合剤」として同定された抗ＣＤ３抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される場合に、３桁のナノモル範囲（例えば、１００～９９９ｎＭ、任意に１００～５００ｎＭ、または５００ｎＭ～１μＭ）のヒトＣＤ３についての親和性を有する。様々な実施形態では、「非常に弱い結合剤」として同定された抗ＣＤ３抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される場合に、１０μＭを超えるか、または検出不能であるヒトＣＤ３についての親和性を有する。

実施形態のいずれかでは、ＣＤ３結合ドメインは、以下の表に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ（例えば、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列の対内に含有される６つのＣＤＲ）アミノ酸配列のいずれかを含むことができる（「Ｇ」バージョンは、ＷＯ ２０１７／０５３８５６から取られている）。いくつかの実施形態では、（例えば、図１Ｃまたは１Ｆの構造を有する分子のＦａｂアームにおける）ＣＤ３結合ドメインは、標的抗原結合ドメインに対応する同族の軽鎖を含む。言い換えれば、標的抗原結合ドメインの同族の軽鎖は、標的抗原結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインの両方に（例えば、図１Ｃまたは１Ｆの構造のＮ末端Ｆａｂドメインにおいて）共通である。

表１に記載される抗体の各々は、表３に記載されるアミノ酸配列を含む共通の軽鎖可変領域を含む。「Ｇ」指定抗体の各々はまた、本明細書において「７２２１」接頭辞、例えば、７２２１Ｇ、７２２１Ｇ５、７２２１Ｇ２０などで呼ばれ得る。抗原結合ドメインのｓｃＦｖバージョンでは、重鎖可変領域の４４位のアミノ酸残基は、例えば、配列番号１６９（７１９５Ｐに対応する修飾された重鎖）または配列番号１７０（７２２１Ｇに対応する修飾された重鎖）に示されるように、システイン残基で置き換えられ得る。

本発明の多重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性または三重特異性または四重特異性）は、２つのポリペプチド鎖を含み、その各々は、（例えば、鎖間ジスルフィド結合を介した）２つのポリペプチド鎖の会合を促進して、単一の多重特異性抗原結合分子を形成する多量体化ドメインを含む。上記または本明細書で論じられる実施形態のいずれかでは、第１および第２の多量体化ドメインは、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧアイソタイプ）であり得る。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ジスルフィド結合を介して互いに会合する。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。場合によっては、第１および第２の多量体化ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインまたは第２の多量体化ドメインは、同じアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４）の野生型Ｆｃドメインと比較してプロテインＡ結合についての親和性を低減するアミノ酸置換を含む。場合によっては、アミノ酸置換は、Ｈ４３５Ｒ修飾、またはＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾（ＥＵ番号付け）を含む。場合によっては、第１の多量体化ドメインは、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾を含む。場合によっては、第２の多量体化ドメインは、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾を含む。

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１および第２のポリペプチドの両方は、同じアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４）の野生型ヒンジドメインと比較して^Ｆｃγ受容体についての結合親和性を低減する修飾ヒンジドメインを含む。

多量体化ドメインがヒンジドメインを含む重鎖定常領域を含む様々な実施形態では、定常領域は、複数の免疫グロブリンアイソタイプに由来する配列を組み合わせる、キメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ Ｃ_Ｈ２領域に由来するＣ_Ｈ２配列の一部または全部、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４に由来するＣ_Ｈ３配列の一部または全部を含み得る。キメラＦｃドメインは、キメラヒンジ領域も含み得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせられた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含み得る。本明細書に記載の抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの具体的な例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ４ Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ ＣＨ３］を含む。本明細書に記載の抗原結合分子のうちのいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ ＣＨ２］－［ＩｇＧ１ ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれらおよび他の例は、ＷＯ２０１４／１２１０８７（８５５０－ＷＯ）に記載される。これらの一般的な構造配置を有するキメラＦｃドメインおよびそのバリアントは、改変されたＦｃ受容体結合を有し得、次いで、Ｆｃエフェクター機能に影響を及ぼす。

多量体化ドメインがヒンジドメインを含む重鎖定常領域を含む様々な実施形態では、ヒンジドメイン内の２３３～２３６位は、Ｇ、Ｇ、Ｇ、および空き；Ｇ、Ｇ、空き、および空き；Ｇ、空き、空き、および空き；またはすべて空きであり、位置は、ＥＵ番号付けによって番号付けられる。任意に、重鎖定常領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。任意に、重鎖定常領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。任意に、存在する場合、ＣＨ１領域、存在する場合、ヒンジ領域の残部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、同じヒトアイソタイプである。任意に、存在する場合、ＣＨ１領域、存在する場合、ヒンジ領域の残部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ１である。任意に、存在する場合、ＣＨ１領域、存在する場合、ヒンジ領域の残部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ２である。任意に、存在する場合、ＣＨ１領域、存在する場合、ヒンジ領域の残部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ４である。任意に、定常領域は、プロテインＡへの結合を低減するように修飾されたＣＨ３ドメインを有する。本発明の抗原結合分子のいずれかに含めることができる多量体化重鎖定常領域のこれらおよび他の例は、ＷＯ２０１６／１６１０１０（１０１４０ＷＯ０１）に記載される。

本発明の実施形態では、１つの多量体化ドメインの別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促進し、それによって二重特異性抗原結合分子を形成する。多量体化ドメインは、同じまたは類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸であり得る。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体化成分の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含む）、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプである。

いくつかの実施形態では、第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプであり得る。あるいは、第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプのものであり得る。

特定の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメントまたは少なくとも１つのシステイン残基を含む１～約２００アミノ酸長のアミノ酸配列である。他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインには、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むか、またはそれからなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。

多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメイン（ヒンジありまたはなし）は、野生型、Ｆｃドメインの天然に存在するバージョンと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失、または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の修飾された結合相互作用（例えば、強化または減少）を有する修飾Ｆｃドメインをもたらす、Ｆｃドメイン中の１つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、Ｃ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域に修飾を含み、この修飾により、酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５～約６．０のエンドソーム内）においてＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性が増加する。かかるＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾、または２５０位および／もしくは４２８位での修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位での修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。

本発明はまた、第１のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインおよび第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインを含む多重特異性抗原結合分子を含み、第１および第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減する。一実施形態では、第１のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによるもの、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含む。第２のＣ_Ｈ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。第２のＣ_Ｈ３内に見られ得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。

抗原結合ドメインの調製および二重特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当該技術分野で既知の任意の抗体産生技術によって調製することができる。得られると、２つ以上の異なる抗原（例えば、ＣＤ３および標的抗原）に特異的な、異なる抗原結合ドメインは、互いに適切に配置して、常法を使用して本発明の多重特異性抗原結合分子の構造を産生することができる。特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子の個々の成分（例えば、重鎖および軽鎖またはその部分）のうちの１つ以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、本発明の多重特異性抗原結合分子の重鎖および／または軽鎖のうちの１つ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、特定の抗原（例えば、ＣＤ３または標的抗原）に対する高親和性キメラ抗体がまず単離される。抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む、望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。マウス定常領域は、所望のヒト定常領域で置き換えられて、本発明の多重特異性抗原結合分子に組み込まれ得る完全ヒト重鎖および／または軽鎖を生成する。

遺伝子操作された動物は、ヒト多重特異性抗原結合分子を作製するために使用され得る。例えば、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再編成および発現することができない、遺伝子修飾マウスを使用することができ、マウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座のマウスカッパ定常遺伝子に作動可能に連結されているヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。そのような遺伝子修飾マウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト多重特異性抗原結合分子を産生することができる。（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい）。完全ヒトとは、抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫グロブリンドメインの各ポリペプチドの全長にわたるヒト配列に由来するＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫グロブリンドメインを指す。いくつかの例において、完全ヒト配列は、ヒトの内在性タンパク質に由来する。他の例において、完全ヒトタンパク質またはタンパク質配列は、各成分配列がヒト配列に由来するキメラ配列を含む。いずれの理論にも縛られないが、キメラタンパク質またはキメラ配列は、一般に、例えば任意の野生型ヒト免疫グロブリン領域またはドメインと比較して、成分配列の接合部における免疫原性エピトープの作製を最小にするように設計される。

様々な実施形態では、上記で論じられる方法および技法は、Ｔ細胞抗原および標的抗原に対する抗体を生成するために使用され、これらの抗体の抗原結合ドメイン（例えば、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、またはＣＤＲ）は、本明細書で論じられる、または、例えば、図１Ｃおよび１Ｅ～１Ｓに示される構造を有する多重特異性抗原結合分子を産生するために使用される。

抗原結合ドメインの結合特性
本明細書で使用される場合、抗体（例えば、対応する抗体）、免疫グロブリン、抗原結合ドメイン、または多重特異性抗原結合分子の、例えば、細胞表面タンパク質またはそのフラグメントなどの所定の抗原への結合の文脈における「結合」という用語は、典型的には、最低２つの実体または分子構造間の相互作用または会合、例えば、抗原結合ドメイン／抗原相互作用を指す。

例えば、結合親和性は、リガンドとして抗原を、分析物（または抗リガンド）として抗体、Ｉｇ、抗体結合ドメイン、または多重特異性抗原結合分子を使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、典型的には、約１０^－７Ｍ以下、例えば、約１０^－８Ｍ以下、例えば、約１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄ値に対応する。フローサイトメトリーアッセイも日常的に使用される。

したがって、本発明の抗体（例えば、対応する抗体）、抗原結合ドメイン、または多重特異性抗原結合分子は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性よりも少なくとも１０倍低いＫ_Ｄ値に対応する親和性を有する所定の抗原または細胞表面分子に結合する。本発明によると、非特異的抗原よりも１０倍以下低いＫ_Ｄ値に対応する抗体（例えば、対応する抗体）、抗原結合ドメイン、または多重特異性抗原結合分子の親和性は、検出不能な結合とみなされ得るが、そのような抗体は、本発明の二重特異性抗体の産生のための第２の抗原結合アームと対合され得る。

「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体（もしくは抗原結合ドメイン）－抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に結合する抗体（もしくは抗原結合ドメイン）もしくは抗体結合フラグメントの解離平衡定数を指す。Ｋ_Ｄと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、Ｋ_Ｄ値が小さいほど、親和性は高い、すなわちより強い。したがって、「より高い親和性」または「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、つまりより小さいＫ_Ｄ値に関し、逆に「より低い親和性」または「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、つまりより大きなＫ_Ｄ値に関する。状況によっては、別の相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｙ）に対する分子（例えば、抗体または抗原結合ドメイン）の結合親和性と比較して、その相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｘ）に対する特定の分子（例えば、抗体または抗原結合ドメイン）のより高い結合親和性（またはＫ_Ｄ）は、より大きなＫ_Ｄ値（より低い、またはより弱い、親和性）をより小さなＫ_Ｄ（より高い、またはより強い、親和性）で割ることによって決定される結合比として表され、例えば、場合によって５倍または１０倍大きな結合親和性として表され得る。

「ｋ_ｄ」（秒－１または１／ｓ）という用語は、特定の抗体（もしくは抗原結合ドメイン）－抗原相互作用の解離速度定数、または抗体もしくは抗体結合ドメインの解離速度定数を指す。その値はｋ_ｏｆｆ値とも呼ばれる。

「ｋ_ａ」（Ｍ－１×秒－１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体（もしくは抗原結合ドメイン）－抗原相互作用の会合速度定数、または抗体もしくは抗体結合ドメインの会合速度定数を指す。

「Ｋ_Ａ」（Ｍ－１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗体（もしくは抗原結合ドメイン）－抗原相互作用の会合平衡定数、または抗体もしくは抗体結合ドメインの会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋ_ａをｋ_ｄで割ることによって得られる。

「ＥＣ５０」または「ＥＣ_５０」という用語は、最大半量の有効濃度を指し、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導する抗体（または抗原結合ドメインもしくは多重特異性分子）の濃度を含む。ＥＣ_５０は、その最大効果の５０％が観察される抗体（または抗原結合ドメインまたは多重特異性分子）の濃度を本質的に表す。特定の実施形態では、ＥＣ_５０値は、例えば、フローサイトメトリー結合アッセイによって決定されるように、ＣＤ３または標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）を発現する細胞に最大半量の結合を与える本発明の多重特異性分子の濃度に等しい。したがって、低減したまたは弱い結合は、ＥＣ_５０の増加、または最大半量の有効濃度で観察される。

一実施形態では、低下した結合は、最大半量の標的細胞への結合を可能にする増加したＥＣ_５０分子濃度として定義することができる。
別の実施形態では、ＥＣ_５０値は、Ｔ細胞の細胞毒性活性による標的細胞の最大半量枯渇を誘発する本発明の分子の濃度を表す。したがって、細胞毒性活性の増加（例えば、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅）は、ＥＣ_５０または最大半量の有効濃度値の低下で観察される。

ｐＨ依存的結合
本発明は、ｐＨ依存的結合特性を有する抗原結合ドメインおよび二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の分子は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＴ細胞抗原または標的抗原への低減した結合を示し得る。あるいは、本発明の分子は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＴ細胞抗原または標的抗原への増強された結合を示し得る。「酸性ｐＨ」という表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５、９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０以下のｐＨ値を含む。本明細書で使用される場合、「中性ｐＨ」という表現は、約７．０～約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」という表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。

場合によっては、「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで．．．低減した結合」は、中性ｐＨでその抗原に結合する分子（または抗原結合ドメイン）のＫ_Ｄ値に対する酸性ｐＨでその抗原に結合する分子（または抗原結合ドメイン）のＫ_Ｄ値（またはその逆）の比に関して表される。例えば、分子または抗原結合ドメインが約３．０以上の酸性／中性Ｋ_Ｄ比を示す場合、本発明の目的のために、分子または抗原結合ドメインは、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＴ細胞抗原または標的抗原への低減した結合」を示すとみなされ得る。特定の例示的な実施形態では、本発明の分子または抗原結合ドメインの酸性／中性Ｋ_Ｄ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０以上であり得る。

ｐＨ依存的結合特性を有する多重特異性抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでの特定の抗原への低減した（増強した）結合について対応する抗体の集団をスクリーニングすることによって得られ得る。加えて、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特性を有する分子を産生し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することによって、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで低減した抗原結合を有する分子が得られ得る。

多重特異性抗原結合分子の生物学的特性
本発明は、ヒトＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）およびヒト標的抗原（複数可）（例えば、腫瘍関連抗原）に同時に結合することができる多重特異性抗原結合分子およびその抗原結合ドメインを含むことができる。

本発明は、ヒトＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に結合し、標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘導する多重特異性抗原結合分子を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に結合し、標的抗原（複数可）（例えば、腫瘍関連抗原）を発現する細胞の存在下でＴ細胞の細胞毒性活性を誘導する多重特異性抗原結合分子を含む。

本発明は、従来の構造の二重特異性抗ＣＤ３×抗ＴＡ抗体と比較して、サイトカイン産生を増加させることなく、ヒトＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に結合し、Ｔ細胞活性化を誘導する多重特異性抗原結合分子を含むことができる（例えば、図１Ａ）。

本発明は、細胞が標的抗原（複数可）を発現する細胞集団を枯渇または低減することができる多重特異性抗原結合分子を含むことができる。本発明の多重特異性抗原結合分子は、従来の二重特異性抗体フォーマットを有する分子よりも強力にＴ細胞媒介性細胞毒性を誘導することができる（例えば、図１Ａおよび１Ｂ）。

本発明は、ヒトＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）および２つの異なる標的抗原（例えば、図１Ｆの構造を有する分子）に結合し、２つの標的抗原を発現する細胞の存在下で細胞毒性活性および／またはＴ細胞活性化を誘導する多重特異性抗原結合分子を含むことができる。

多くのがんは、プロテオソームによって細胞内で処理される様々な細胞内抗原を発現し、関連するペプチドは、ＨＬＡ分子の文脈における細胞の表面で示される。異なるタンパク質からの標的化ペプチドは、本発明の多重特異性分子の特異性を増加させるために使用され得る。場合によっては、ＰｉＧ抗原または低密度がん抗原によって特徴付けられるがんは、腫瘍内の標的コピー数が低いことが多いため、従来のがん療法から逃れる。加えて、ＰｉＧまたは低密度がん抗原によって特徴付けられる固形腫瘍は、細胞表面抗原ではないが、がん関連ペプチド内の溝に存在するため、療法に対してより耐性があり、治療することがより困難であり得る。よって、２つの異なる抗原（例えば、低密度抗原）を標的とする本発明の多重特異性分子の使用は、がん、特に固形腫瘍によって特徴付けられるがんにおける療法の有効性を増加／増強するために、ＰｉＧおよび／または低密度がん抗原を効果的に標的とすることができる。

様々な実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、標的抗原の密度が細胞当たり約１００コピー～細胞当たり約１００万コピー以上の範囲である場合、細胞集団においてＴ細胞媒介性細胞毒性を誘導することができる。場合によっては、標的抗原は、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約２５０００、約３００００、約３５０００、約４００００、約４５０００、約５００００、約７５０００、約１０００００（すなわち、１００Ｋ）、約２００Ｋ、約３００Ｋ、約４００Ｋ、約５００Ｋ、約６００Ｋ、約７００Ｋ、約８００Ｋ、約９００Ｋ、約１００万、約２００万、約３００万、約４００万、約５００万、または約１０００万のコピー数／細胞で存在する。

理論によって拘束されることを意図することなく、本発明者らは、本発明の分子フォーマットの改善された細胞毒性効力が、分子の単鎖上の２つのＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）結合ドメインの存在の関数であると仮定する。特に、本発明の分子構造の形状は、刺激性シナプス形成を誘導することなく、低濃度で溶解性シナプス形成を選択的に誘導し、後者は、細胞毒性Ｔリンパ球からのサイトカイン産生に関与すると仮定される。

エピトープマッピングおよび関連技法
本発明の抗原結合分子が結合するＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）および／または標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）上のエピトープは、タンパク質の３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一連続配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、タンパク質の複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなってもよい。本発明の分子は、例えば、単一のＣＤ３鎖内に含まれるアミノ酸（例えば、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ３－デルタ、またはＣＤ３－ガンマ）と相互作用し得るか、または２つ以上の異なるＣＤ３鎖上のアミノ酸と相互作用し得る。「エピトープ」という用語は、本明細書で使用される場合、パラトープとして既知の抗原結合ドメインの可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有してもよい。よって、異なる抗原結合ドメインは、抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。

当業者に既知の様々な技法を使用して、分子の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されている日常的な交差ブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、およびペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。分子の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、分子を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／分子複合体を水に移して、分子によって保護されている残基（重水素標識されたままである）を除くすべての残基で水素－重水素交換を生じさせる。分子の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、分子が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。抗原／分子複合体のＸ線結晶解析もまた、エピトープマッピング目的に使用してもよい。

生物学的等価物
本発明は、本明細書に記載される例示的な多重特異性抗原結合分子のいずれかと生物学的に等価である多重特異性抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、生物学的等価物とみなされる。これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度におけるこのような差が意図的で、かつ標識に反映されており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、試験した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされるため、生物学的に等価とみなされ得る場合、いくつかの抗原結合タンパク質は、等価物または薬学的選択肢とみなされるであろう。

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物との間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。

生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定は、例えば、（ａ）抗原結合タンパク質またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清、または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、（ｂ）ヒトインビボ生物学的利用能データと相関しており、かつそれらを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗原結合タンパク質（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、および（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、有効性、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験を含む。

本明細書に記載される例示的な多重特異性抗原結合分子の生物学的に等価なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物学的活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈において、生物学的に等価な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む、本明細書に記載される例示的な多重特異性抗原結合分子のバリアントを含み得る。

種の選択性および種の交差反応性
本発明の特定の実施形態によると、ヒトＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に結合するが、他の種由来の同じ抗原に結合しない抗原結合分子が提供される。ヒト標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合するが、他の種からの同じ標的抗原に結合しない抗原結合分子も提供される。本発明はまた、ヒト抗原および１つ以上の非ヒト種からの対応する抗原に結合する抗原結合分子を含む。

本発明の特定の例示的な実施形態によると、ヒトＣＤ３および／またはヒト腫瘍抗原に結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、もしくはチンパンジーＣＤ３および／または腫瘍抗原のうちの１つ以上に結合してもよく、または結合しなくてもよい抗原結合分子が提供される。例えば、本発明の特定の例示的な実施形態では、ヒトＣＤ３およびカニクイザルＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ヒト腫瘍抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、多重特異性抗原結合分子が提供される。

免疫複合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤、または放射性同位元素などの治療部分（「免疫結合体」）に複合体化された抗原結合分子を包含する。細胞毒性薬剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。免疫複合体を形成するために好適な細胞毒性薬剤および化学療法剤の例は、当該技術分野で知られている（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照）。

治療製剤および投与
本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供する他の薬剤とともに製剤化される。多くの適切な製剤は、薬剤師全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。

患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢および大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変動し得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。本発明の多重特異性抗原結合分子が成人患者において治療目的に使用される場合、本発明の多重特異性抗原結合分子を通常約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で静脈内投与することが有利であり得る。病態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。多重特異性抗原結合分子を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に決定され得、例えば、患者の経過を定期的な評価によってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

様々な送達系は既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮または粘膜皮膚の内層（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。

本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際の適用を容易にする。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。貯蔵器から薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。

数多くの再利用可能なペンおよび自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の薬学的組成物の皮下送達での用途を有する使い捨てペン型送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３による総説で考察されている。

注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射に従来使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上記に記載される抗原結合分子またはその塩を溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。

有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。そのような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが含まれる。前述の含有される抗原結合分子の量は、概して、単位用量の剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述の抗原結合分子は、約５～約１００ｍｇ、他の剤形については約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。

抗原結合分子の治療的使用
本発明は、Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）および標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に特異的に結合する多重特異性抗原結合分子を含む治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示される多重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含むことができる。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、がんの１つ以上の症状または徴候を示すヒトまたは非ヒト動物、あるいはそうでなければ標的抗原活性の阻害もしくは低減または標的抗原陽性細胞（例えば、腫瘍細胞）の枯渇から利益を得るものを意味する。

本発明の多重特異性抗原結合分子（およびそれを含む治療組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化、および／または標的化が有益である任意の疾患または障害を治療するために有用である。特に、本発明の多重特異性抗原結合分子は、標的抗原発現もしくは活性または標的抗原陽性細胞の増殖に関連するか、またはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善に使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序は、Ｔ細胞の存在下で標的抗原を発現する細胞の殺滅を含む。

本発明の多重特異性抗原結合分子は、例えば、がんを含む標的抗原発現に関連する疾患または障害を治療するために使用され得る。腫瘍スキャニングなどのような、当該技術分野において既知の分析／診断方法は、患者が標的抗原について陽性である腫瘍細胞を保有するかを確かめるために使用され得る。場合によっては、がんは、固形腫瘍、頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、前立腺がん、急性骨髄性白血病、膵臓がん、結腸がん、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、胃がん、移植後リンパ増殖性障害、卵巣がん、肺がん、扁平上皮がん、非小細胞肺がん、食道がん、膀胱がん、鼻咽頭がん、子宮がん、肝臓がん、精巣がん、または乳がんから選択される。

本発明はまた、対象における残存がんを治療するための方法も含む。本明細書で使用される場合、「残存がん」という用語は、抗がん療法による治療後の対象における１つ以上のがん性細胞の存在または持続を意味する。

特定の態様によると、本発明は、対象が標的抗原陽性がんを有すると決定された後、本明細書の他所に記載の多重特異性抗原結合分子のうちの１つ以上を対象に投与することを含む、標的抗原発現に関連する疾患または障害（例えば、がん）を治療するための方法を提供する。例えば、本発明は、対象が他の免疫療法または化学療法を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、または４週間、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１年以上後に、多重特異性抗原結合分子を患者に投与することを含む、がんを治療するための方法を含む。

併用療法および製剤
本発明は、本明細書に記載の例示的な多重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合分子と組み合わされ得るか、または組み合わされて投与され得る例示的な追加の治療剤は、例えば、抗腫瘍剤（例えば、化学療法剤）を含む。特定の実施形態では、第２の治療剤は、モノクローナル抗体、抗体薬物複合体、抗腫瘍剤に複合体化した二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせであり得る。本発明の抗原結合分子と組み合わされて有益に投与され得る他の薬剤には、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、またはそれらのそれぞれの受容体に結合する小分子サイトカイン阻害剤および抗体を含む、サイトカイン阻害剤が含まれる。本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書に開示される多重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物）はまた、細胞表面上の異なる抗原と相互作用し得るモノクローナル抗体、腫瘍細胞表面上の抗原に結合する一方のアームおよびＴ細胞上の抗原に結合する他方のアームを有する二重特異性抗体、抗体薬物複合体、抗腫瘍剤に複合体化した二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１もしくはＣＴＬＡ－４を標的とするもの、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の治療組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与され得る。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、またはセミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）などのＰＤ－１阻害剤から選択され得る。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）などのＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択され得る。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）などのＣＴＬＡ－４阻害剤から選択され得る。本発明の抗体と併用して使用することができる他の組み合わせは、上に記載されている。

本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合分子のいずれか、およびＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ－１０、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－β、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキンのうちの１つ以上の阻害剤、または前述のサイトカインのいずれかを含む治療組み合わせを含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ、抗体、二重特異性抗体、または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および最小認識ユニットなどの他の操作された分子）である。本発明の抗原結合分子は、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイドおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与および／または同時処方することもできる。本発明の抗原結合分子はまた、放射線治療および／または従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与してもよい。

追加の治療活性成分は、本発明の抗原結合分子の投与の直前、同時に、または直後に投与してもよい。（本開示の目的のために、このような投与レジメンは、追加の治療活性成分と「組み合わせて」抗原結合分子を投与することとみなされる。

本発明には、本発明の抗原結合分子が、本明細書の他所に記載の追加の治療活性成分の１つ以上と同時処方された薬学的組成物が含まれる。
投与レジメン
本発明の特定の実施形態によれば、多重特異性抗原結合分子の複数回用量は、既定される時間経過にわたって対象に投与され得る。本発明のこの態様による方法は、本発明の抗原結合分子の複数回用量を対象へ連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、抗原結合分子の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗原結合分子の単回の初回用量と、それに続く抗原結合分子の１回以上の二次用量、次いで任意に抗原結合分子の１回以上の三次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。

「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の抗原結合分子の投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量はすべて、同じ量の抗原結合分子を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、特定の実施形態では、一次用量、二次用量、および／または三次用量に含有される抗原結合分子の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。

本発明のある例示的な実施形態では、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回投与において、抗原結合分子の用量を意味し、これは、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される。

本発明のこの態様による方法は、抗原結合分子の二次および／または三次用量の任意の回数を患者へ投与することを含んでよい。例えば、特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。

複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者へ投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。

フローサイトメトリーによって結合するための方法：以下の例では、以下のフローサイトメトリー方法を使用して、様々な分子についての結合を決定した。フローサイトメトリー分析を利用して、ＭＡＧＥＡ４×ＣＤ３多重特異性分子のＲＡＪＩ／ＨＬＡ－Ａ２／Ｂ２Ｍ／ＭＡＧＥＡ４（ペプチドａ）、Ａ３７５／ｈＨＬＡ－Ａ２／Ｂ２Ｍ／ＭＡＧＥＡ４（ペプチドｂ）、ＲＡＪＩ／ＨＬＡ－Ａ２／Ｂ２Ｍ／ＮＹ－ＥＳＯ－１、およびＪＵＲＫＡＴ細胞への結合を測定し、続いてＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。簡潔には、１×１０^５細胞／ウェルを、ＭＡＧＥＡ４×ＣＤ３多重特異性分子の段階希釈液またはアイソタイプ対照（ヒトＭＡＧＥＡ４またはＣＤ３との交差反応性なしにヒト抗原に結合するヒトＩｇＧ４ステルス抗体）と４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１％濾過ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ結合抗ヒト２次抗体を細胞に添加して、さらに３０分間インキュベートした。抗体なしまたは二次抗体のみを含有するウェルを対照として使用した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、１％濾過ＦＢＳを含有する２００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリーによって分析した。

細胞毒性アッセイのための方法：以下の例では、以下の細胞毒性アッセイを使用して様々な分子の細胞毒性を決定した。単剤としての、またはＥＧＦＲ×ＣＤ２８二重特異性抗体および／もしくはＰＤ－１抗体と組み合わされたＭＡＧＥＡ４×ＣＤ３の存在下でのＭＡＧＥＡ４＋細胞の殺滅をモニターするために、Ａ３７５細胞、ＳｃａＢＥＲ細胞、ＮＣＩ－Ｈ１７５５転移性（肝臓由来）細胞、およびＮＣＩ－Ｈ１７５５細胞を、１ｕＭの蛍光追跡色素Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒで標識した。標識後、細胞を３７℃で一晩播種した。別に、ヒトＰＢＭＣを１×１０^６細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地に播種し、付着マクロファージ、樹状細胞、およびいくつかの単球を枯渇させることによってリンパ球を濃縮するために３７℃で一晩インキュベートした。翌日、標的細胞を、付着細胞枯渇ナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞１０：１比）、ＭＡＧＥＡ４×ＣＤ３多重特異性分子の段階希釈液、ならびに固定濃度のＥＧＦＲ×ＣＤ２８および／または抗ＰＤ１抗体と３７℃で９６時間共インキュベートした。トリプシン－ＥＤＴＡ解離バッファーを使用して細胞を細胞培養プレートから取り出し、ＦＡＣＳ ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ－Ｘ２０でＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞をｄｅａｄ／ｌｉｖｅ Ｎｅａｒ ＩＲ Ｒｅａｃｔｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素で染色した。ＦＡＣＳ分析の直前に、５Ｅ０５計数ビーズを各ウェルに加えた。各試料について１Ｅ０５ビーズを収集した。殺滅の特異性を評価するために、細胞を生きたバイオレット標識集団にゲートした。生きた集団のパーセントを記録し、生存率の計算に使用した。

実施例１：Ｔ細胞活性化は標的細胞の存在に依存している
Ｔ細胞活性化を、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示される分子フォーマットの各々について評価した。Ｔ細胞の活性化およびＰＤ－１マーカーの上方調節を、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＰＤ－１に対して直接複合体化した抗体と細胞をインキュベートし、全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）のうちの後期活性化（ＣＤ２５＋／ＣＤ８＋）Ｔ細胞およびＰＤ－１＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を報告することによって評価した。

図２に示されるように、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）は、標的細胞の不在下でＴ細胞を活性化しなかった。「ゼロ」は、Ｔ細胞のみの対照を表す。
実施例２：従来のフォーマットと比較した多重特異性分子の細胞毒性
本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）の細胞毒性を上記で論じられるように測定し、同じ抗原結合ドメインを有する従来のフォーマットの分子（図１Ａおよび１Ｂ）の細胞毒性と比較した。この実施例で使用されるＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に対して中程度の結合親和性を有する。この実施例で使用される標的抗原結合ドメインは、ＭＡＧＥＡ４（黒色腫関連抗原Ａ４）ペプチドに結合する。「対照」は、他のフォーマットと比較するための最大の細胞毒性を提供するために、すべてのＨＬＡ分子の足場を標的とする陽性対照である。

図３に示されるように、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）は、従来の二重特異性フォーマットを有する分子（図１Ａ構造、および図１Ｂ構造）よりも強力に標的細胞を殺滅した。

実施例３：抗ＰＤ－１抗体、共刺激二重特異性抗体、または両方との組み合わせの従来のフォーマットと比較した多重特異性分子の細胞毒性
本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）の細胞毒性を、上記で論じられるように測定し、抗ＰＤ－１抗体、共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、または両方の抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体と組み合わせて同じ抗原結合ドメインを有する従来のフォーマットの分子（図１Ａおよび１Ｂ）の細胞毒性と比較した。陽性対照、ならびにＣＤ３および標的抗原結合ドメインは、実施例２において上記で論じられるとおりであった。

図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに示されるように、抗ＰＤ－１抗体、共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、または両方の添加は、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）の効力をさらに増強した。実線は、（図３に示されるように）単剤の細胞毒性を表し、破線は、それぞれの組み合わせの細胞毒性を表す。

細胞毒性に加えて、ヒトＰＢＭＣアッセイからのアッセイウェルの上清を、ＢＤサイトメトリービーズアレイヒトキットを使用し、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン放出について評価した。図５に示されるように、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）のより大きな細胞毒性は、従来の二重特異性抗体フォーマット（図１Ａ構造）と比較して、いかなるより大きなサイトカイン放出ももたらさなかった。

この一連の実験は、（ａ）細胞毒性アッセイにおける最大濃度で、図１Ｃの構造を有する分子は、同等レベルのサイトカイン放出を伴う図１Ａの構造を有する分子よりも大きな効力を示し、（ｂ）図１Ｃ（単剤）の構造を有する分子の細胞毒性のＥＣ５０は、図１Ａ（単剤）の構造を有する分子で観察されるものよりも低く、（ｃ）細胞毒性アッセイにおける最大濃度で、図１Ａの構造を有する分子は、同等レベルのサイトカイン放出を伴う図１Ａの構造を有する分子（抗ＰＤ－１組み合わせ）よりも抗ＰＤ－１抗体との組み合わせでより大きな効力を示し、（ｄ）抗ＰＤ－１抗体と組み合わされた図１Ｃの構造を有する分子の細胞毒性のＥＣ５０は、図１Ａの構造を有する分子（抗ＰＤ－１組み合わせ）で観察されるものよりも低く、（ｅ）細胞毒性アッセイにおける最大濃度で、図１Ａの構造を有する分子は、同等レベルのサイトカイン放出を伴う図１Ａの構造を有する分子（抗ＥＧＦＲ×ＣＤ２８組み合わせ）よりも抗ＥＧＦＲ×ＣＤ２８二重特異性抗体との組み合わせでより大きな効力を示し、（ｆ）抗ＥＧＦＲ×ＣＤ２８二重特異性抗体と組み合わされた図１Ｃの構造を有する分子の細胞毒性のＥＣ５０は、図１Ａの構造を有する分子（抗ＥＧＦＲ×ＣＤ２８組み合わせ）で観察されるものよりも低く、（ｇ）細胞毒性アッセイにおける最大濃度で、図１Ａの構造を有する分子は、抗ＰＤ－１抗体および抗ＥＧＦＲ×ＣＤ２８二重特異性抗体と組み合わされて、同等レベルのサイトカイン放出を伴う図１Ａの構造を有する分子（三重組み合わせ）よりも大きな効力を示し、（ｈ）抗ＰＤ－１抗体および抗ＥＧＦＲ×ＣＤ２８二重特異性抗体と組み合わされた図１Ｃの構造を有する分子の細胞毒性のＥＣ５０は、図１Ａの構造を有する分子（三重組み合わせ）で観察されるものよりも低かったことを確認する。

実施例４：多重特異性分子の効力は２つのエフェクター結合ドメインによって増強される
例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）の、ＭＡＧＥＡ４ペプチドを過剰発現する標的細胞およびＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合を、上記で論じられるように測定した。これらの細胞への結合を、抗原結合ドメインのうちの１つ以上が不活性化された図１Ｃ構造の修飾についても評価した。非活性ドメインは、図の凡例に「Ｘ」で示される。

実施例６Ａ～６Ｄに示されるように、結合データは、２つの抗原結合ドメイン（例えば、単一のＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ）の組み合わせが、単一のＦａｂドメインを有する分子または単一のｓｃＦｖドメインを有する分子よりも大きな親和性（低いＥＣ５０）で標的細胞に結合した。予想どおり、アイソタイプ対照分子は、結合を示さなかった。抗ＣＤ３結合ドメインの供給源に関係なく、結合パターンの区別が観察されなかった。

結合に加えて、これらの分子の細胞毒性も、上記で論じられる方法を使用して決定された。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）は、最大の細胞毒性効力を示し、２つのＴ細胞抗原（ＣＤ３）結合ドメインを含むが、単一の標的抗原（ＭＡＧＥＡ４）結合ドメイン（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）のみを含む２つの修飾された分子が続いた。同様に、抗ＣＤ３結合ドメインの供給源に関係なく、同じ細胞毒性パターンが観察された。陰性対照（図１Ａフォーマット）は、無関係な標的抗原結合ドメインを含んだ。

実施例５：Ｃ末端ｓｃＦｖドメインはＣ末端Ｆａｂドメインと比較して多重特異性分子の効力を増強する
例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）の、ＭＡＧＥＡ４ペプチドを過剰発現する標的細胞およびＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合を、上記で論じられるように測定した。これらの細胞への結合を、Ｃ末端ｓｃＦｖドメインをＦａｂドメインで置き換える図１Ｃ構造の修飾（図１Ｅ構造）、またはＮ末端Ｆａｂドメインが不活性化されたものについても評価した。非活性ドメインは、図の凡例に「Ｘ」で示される。

実施例４で論じられる結合と同様に、図８Ａおよび８Ｂに示されるように、結合データは、２つの抗原結合ドメイン（例えば、単一のＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ、または２つのＦａｂ）の組み合わせが、単一のＦａｂドメインを有する分子または単一のｓｃＦｖドメインを有する分子よりも大きな親和性（低いＥＣ５０）で標的細胞に結合した。図８Ａおよび８Ｂの表に示されるように、図１Ｃおよび図１Ｅの構造を有する分子は、同等の結合滴定で結合する。

結合に加えて、これらの分子の細胞毒性も、上記で論じられる方法を使用して決定された。図９に示されるように、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）は、最大の細胞毒性効力を示し、２つのｓｃＦｖドメインの代わりにＣ末端Ｆａｂドメインを含む修飾分子が続いた。

実施例６：Ｔ細胞抗原についての単鎖二価性は多鎖二価性と比較して多重特異性分子の効力を増強する
例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）の、ＭＡＧＥＡ４ペプチドを過剰発現する標的細胞およびＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合を、上記で論じられるように測定した。これらの細胞への結合を、ＭＡＧＥＡ４結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインが交換されて、２セットの抗原結合ドメインが２つの別々のポリペプチド鎖上に位置する、図１Ｄに示される構造を有する分子についても評価した。

図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、結合データは、２つの細胞型の各々への２つの分子構造の同様の結合を示した。
結合に加えて、これらの分子の細胞毒性も、上記で論じられる方法を使用して決定された。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃ構造）は、図１Ｄの構造を有する分子と比較してより大きな細胞毒性効力を示し、単一のポリペプチド鎖上の２つのＴ細胞抗原結合ドメインの存在が増強した細胞毒性効力を提供することを確認した。

実施例７：単独または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性抗体との組み合わせの従来のフォーマットと比較した１つまたは２つの抗原を標的とする多重特異性分子の相対的細胞毒性
本発明の２つの例示的な多重特異性分子（図１Ｃおよび１Ｆ構造）の細胞毒性を上記で論じられるように測定し、単独、または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体との組み合わせの、従来のフォーマットの分子（図１Ａ）の細胞毒性と比較した。この実施例は、前の実施例で使用されたものよりも大きな特異性を有する陽性対照を使用して、図１Ｃおよび１Ｆの構造を有する分子と、これらの分子の共刺激二重特異性抗体および抗ＰＤ－１抗体との組み合わせとの間のより大きな区別を示す。この実施例で使用されるＣＤ３抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３に対して強い結合親和性を有し、標的抗原結合ドメイン（ＭＡＧＥＡ４ａ）は、上記の実施例２に論じられるとおりであった。陰性対照（図１Ａフォーマット）は、無関係な標的抗原結合ドメインを含んだ。図１Ｆの構造を有する分子についてこの実施例で使用される第２の標的抗原結合ドメイン（ＭＡＧＥＡ４ｂ）は、第１の標的抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとは完全に異なるＭＡＧＥＡ４のエピトープに結合する。

図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、腫瘍細胞上の２つの異なる低密度抗原を標的とする多重特異性分子は、単一の腫瘍抗原のみを標的とする多重特異性分子と比較して増加した効力を示し、両方の分子は、図１Ａの構造を有する従来のフォーマットの分子よりも大きな効力を示す。抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体の添加は、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｃおよび１Ｆ構造）の効力をさらに増強した。

実施例８：多重特異性分子の相対的な細胞毒性はＴ細胞抗原結合ドメインの親和性と相関する
（図１３に示されるように）図１Ｆの構造を有する例示的な多重特異性分子は、様々な親和性の抗ＣＤ３結合ドメインで調製した。以下のパラメータに従って５つの分子を調製した：
ＣＤ３アーム７１９５Ｐ（強）ｆａｂおよび７１９５Ｐ（強）ｓｃｆｖを有する分子Ａ、
ＣＤ３アーム７２２１Ｇ（中）ｆａｂおよび７２２１Ｇ（中）ｓｃｆｖを有する分子Ｂ、
ＣＤ３アーム７２２１Ｇ２０（弱）ｆａｂおよび７２２１Ｇ２０（弱）ｓｃｆｖを有する分子Ｃ、
ＣＤ３アーム７２２１Ｇ２０（弱）ｆａｂおよび７２２１Ｇ（中）ｓｃｆｖを有する分子Ｄ、ならびに
ＣＤ３アーム７２２１Ｇ（中）ｆａｂおよび７１９５Ｐ（強）ｓｃｆｖを有する分子Ｅ。

これらの５つの分子からのＴ細胞への結合滴定の範囲は、フローサイトメトリーによって試験され、アイソタイプ対照と比較して図１３に示されるように、ＣＤ３結合ドメインの強度と相関する。

２つの異なるＭＡＧＥＡ４＋細胞株（Ａ３７５およびＳｃａＢＥＲ）を標的とする細胞毒性アッセイでは、図１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、および１５Ｂに示されるように、エフェクターアーム（例えば、抗ＣＤ３結合ドメイン）の強度が、単剤として、またはＥＧＦＲ×ＣＤ２８二重特異性抗体および抗ＰＤ１抗体と組み合わされて、低下する場合、分子の効力が低下することが示された。分子の各々は、（非重複ＭＡＧＥＡ４ペプチド１およびＭＡＧＥＡ４ペプチド２に対して）同じ標的抗原結合ドメインを含有した。

実施例９：単独または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性抗体との組み合わせの従来のフォーマットと比較した２つの抗原を標的とする多重特異性分子の相対的細胞毒性
本発明の３つの例示的な多重特異性分子（図１Ｃおよび１Ｆ構造）の細胞毒性を上記で論じられるように測定し、単独、または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体との組み合わせの、従来のフォーマットの分子（図１Ａ）の細胞毒性と比較した。この実施例は、ＣＤ３およびＨＬＡを結合する図１Ａの構造を有する陽性対照を使用する。この実施例で使用されるＣＤ３抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３（７１９５Ｐに由来）に対して強い結合親和性を有し、標的抗原結合ドメインは、１つもしくは２つの非重複ＭＡＧＥＡ４（黒色腫関連抗原Ａ４）ペプチド（ＭＡＧＥＡ４ＡａおよびＭＡＧＥＡ４ｂ）に対し、またはＮＹ－ＥＳＯ－１（ニューヨーク食道扁平上皮がん１）のペプチドに対する。無関係な標的抗原結合ドメインを含む２つのアイソタイプ陰性対照（図１Ａフォーマットおよび図１Ｃフォーマット）も含まれた。

図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃに示されるように、分子は、予想どおり、フローサイトメトリーによってＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ４ａ、またはＭＡＧＥＡ４ｂ発現細胞に結合した。

図１７Ａおよび１７Ｂに示されるように、２つの異なる抗原（分子Ａ）または単一抗原の２つの異なるエピトープ（分子Ｂ）を標的とする多重特異性分子は、両方の転移性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞（図１７Ａ）およびＮＳＣＬＣ（図１７Ｂ）の細胞毒性を強力に誘導し、２つの異なる抗原を標的とする多重特異性分子（分子Ａ）は、同じ抗原の２つの異なるエピトープを標的とする多重特異性分子（分子Ｂ）と比較して増加した効力を示した。抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体の添加は、本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｆ構造）の効力をさらに増強した。これらの分子のＴ細胞活性化の相対的誘導も評価され、図１７Ｃ（転移性ＮＳＣＬＣ細胞）および１７Ｄ（ＮＳＣＬＣ細胞）に示される。

１つまたは２つの抗原（異なるエピトープまたは異なる抗原）を標的とし、図１Ｃおよび１Ｆの構造を有する多重特異性分子の相対的な細胞毒性活性および効力を、単独、または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体との組み合わせの、従来のフォーマットの分子（図１Ａ）の細胞毒性と比較した。陽性対照およびアイソタイプ対照は、この実施例において上記で論じられるとおりであった。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、多重特異性分子は、従来のフォーマットの分子よりも強力であり、２つの異なるエピトープ（図１８Ａ）または２つの異なる抗原（図１８Ｂ）を標的とする多重特異性分子は、両方の標的抗原結合ドメインで同じ抗原を標的とする多重特異性分子よりも強力であった。これらの分子のＴ細胞活性化の相対的な誘導を図１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅ、および１８Ｆに示す。

実施例１０：同じ抗原を標的とする従来のフォーマットの分子の組み合わせと比較した、２つの抗原を標的とする多重特異性分子の相対的細胞毒性
２つの異なる抗原を標的とする本発明の例示的な多重特異性分子（図１Ｆ構造）の細胞毒性を上記で論じられるように測定し、単独、または抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体との組み合わせの、同じ２つの抗原を標的とする従来のフォーマットの分子（図１Ａ構造）の組み合わせの細胞毒性と比較した。

細胞毒性アッセイは、ＭＡＧＥＡ４発現ＳＣａＢＥＲ細胞（膀胱）を標的とし、ＭＡＧＥＡ４ａおよびＭＡＧＥＡ４ｂ（ＭＡＧＥＡ４の非重複ペプチド）の両方を標的とする多重特異性分子が、図１９Ａに示されるように、同じ２つのＭＡＧＥＡ４ペプチドを標的とする従来のフォーマットの二重特異性抗体の組み合わせよりも強力であることを示した。抗ＰＤ－１抗体および共刺激二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体の添加は、本発明の例示的な多重特異性分子の効力をさらに増強した（図１Ｆ構造）。これらの同じ分子によるＴ細胞活性化の相対的な誘導を図１９Ｂに示す。

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (25)

1. 多重特異性抗原結合分子であって、
   （ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインであって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および軽鎖ＣＬドメインと対合した重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および重鎖ＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリンＦａｂドメインを含む第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含む第１の多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインであって、ペプチドリンカーで接続されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、
   （ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）標的抗原に特異的に結合する第３の抗原結合ドメインであって、ＬＣＶＲおよび軽鎖ＣＬドメインと対合したＨＣＶＲおよび重鎖ＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリンＦａｂドメインを含む第３の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインを含む第２の多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合する第４の抗原結合ドメインであって、ペプチドリンカーで接続されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むｓｃＦｖドメインである第４の抗原結合ドメインを含む、第２のポリペプチドと、を含み、
   前記第１および前記第２の多量体化ドメインが、ジスルフィド結合を介して互いに会合して、前記分子を形成している、分子。
2. 前記ペプチドリンカーが１０～３０アミノ酸である、請求項１に記載の分子。
3. 前記ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ） _ｎ リンカーであり、ｎが１～１０である、請求項１に記載の分子。
4. 前記ｓｃＦｖドメインが、残基４４にシステイン変異を含むＨＣＶＲと、残基１００にシステイン変異を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子。
5. 前記ｓｃＦｖドメインが、５～２５アミノ酸のリンカーを介して前記第１および第２の多量体化ドメインのＣ末端にそれぞれ接続している、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
6. 前記ｓｃＦｖドメインが、（Ｇ４Ｓ） _ｎ リンカーを介して前記第１および第２の多量体化ドメインのＣ末端にそれぞれ接続しており、ｎが１～１０である、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
7. 前記第１の多量体化ドメインおよび前記第２の多量体化ドメインが、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインまたはヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。
8. 前記第１の多量体化ドメインまたは前記第２の多量体化ドメインの一方のみが、同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較してプロテインＡ結合についての親和性を低減するアミノ酸置換を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の分子。
9. 前記アミノ酸置換が、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ修飾（ＥＵ番号付け）を含む、請求項８に記載の分子。
10. 前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第１および第２のポリペプチドの両方は、同じアイソタイプの野生型ヒンジドメインと比較してＦｃγ受容体についての結合親和性を低減する修飾ヒンジドメインを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の分子。
11. 前記標的抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質と複合体化されたペプチドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の分子。
12. 前記第３の抗原結合ドメインおよび前記第４の抗原結合ドメインは、異なる標的抗原に結合する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の分子。
13. 前記異なる標的抗原は同じ細胞の表面上に発現する、請求項１２に記載の分子。
14. 前記第３の抗原結合ドメインが結合する標的抗原は、前記第４の抗原結合ドメインが結合する標的抗原と同じである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の分子。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
16. がんの治療用の請求項１５に記載の薬学的組成物であって、前記標的抗原は腫瘍細胞抗原である、薬学的組成物。
17. 感染症の治療用の請求項１５に記載の薬学的組成物であって、前記標的抗原は感染症関連抗原である、薬学的組成物。
18. （ａ）前記感染症はウイルス感染症であり、前記感染症関連抗原はウイルス抗原であるか、
    （ｂ）前記感染症は細菌感染症であり、前記感染症関連抗原は細菌抗原であるか、
    （ｃ）前記感染症は真菌感染症であり、前記感染症関連抗原は真菌抗原であるか、
    （ｄ）前記感染症は寄生虫感染症であり、前記感染症関連抗原は寄生虫によって発現される抗原である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
19. 前記薬学的組成物は第２の治療剤と組み合わされて使用されるものであり、前記第２の治療剤は、標的抗原（ＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメインおよびＴ細胞抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
20. 前記第２の治療剤は、二重特異性抗ＴＡ×抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
21. 前記第２の治療剤は、二重特異性抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
22. 前記第２の治療剤は、Ｔ細胞上のチェックポイント阻害剤に結合する抗体を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
23. 前記第２の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体を含む、請求項２２に記載の薬学的組成物。
24. 前記標的抗原が、標的細胞当たり１００～５０００コピーの密度で存在する、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
25. 前記標的抗原が、標的細胞当たり１０００～２０，０００コピーの密度で存在する、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

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