JP7630132B2

JP7630132B2 - 巨核球前駆細胞および巨核球細胞の製造方法並びに得られた巨核球前駆細胞および巨核球細胞

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Publication number: JP7630132B2
Application number: JP2021549042A
Authority: JP
Inventors: 啓光中内; 聡山崎; 清純越智; 素生渡部
Original assignee: University of Tokyo NUC; Megakaryon Corp
Current assignee: University of Tokyo NUC; Megakaryon Corp
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2025-02-17
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: WO2021060467A1; JPWO2021060467A1

Description

本発明は、ＣＤ３４陽性細胞から不死化した巨核球前駆細胞および血小板を製造する方法に関する。

血小板製剤は、手術、傷害等の出血時、その他血小板の減少を伴う患者に対して投与される。血小板製剤は、献血で得られた血液から現在製造されている。しかしながら、人口構成の変化から、献血量が低減し、血小板製剤が不足することが懸念されている。
また、献血の提供者が細菌等の感染症に罹患している場合、血液が細菌汚染されている可能性があるため、細菌汚染された血小板製剤の投与による感染症のリスクがある。このため、ｉｎｖｉｔｒｏで血小板を製造する方法が開発されている（非特許文献１）。

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から巨核球細胞を生産すること、すなわち、ｉｎｖｉｔｒｏにて多能性幹細胞から血液幹細胞に、さらに巨核球前駆細胞への分化を介して、成熟した巨核球細胞（多核化巨核球細胞）を生産することは可能となっている（特許文献１）。しかしながら、これらの方法において、多能性幹細胞から巨核球前駆細胞までに分化誘導するためには、多能性幹細胞の選別や多種の増殖因子等を必要とするため、大きなコストが必要となる。また、分化誘導後初期には巨核球系以外の血液系細胞も含まれているため、選別に多くの培養期間・培養量を必要とする。

ＷＯ２０１２／１５７５８６

ＴａｋａｙａｍａＮｅｔ．ａｌ， "ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｌａｔｅｌｅｔｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏｖｉａＥＳ－ｓａｃｓ，ＶＥＧＦ－ｐｒｏｍｏｔｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｔｈａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．"，２００８，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．１１１，Ｎｏ．１１，ｐａｇｅｓ５２９８－５３０６

本発明は、成熟巨核球細胞を効率よく安定的に生産することができる巨核球前駆細胞株の製造方法、並びに該製造方法によって得られる巨核球前駆細胞株から巨核球細胞及び血小板を製造する方法を提供する。

本発明者らは、ヒト骨髄由来造血幹細胞にヒトパピローマウィルスのＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を発現させて培養することにより、巨核球前駆細胞および巨核球並びにこれらの不死化細胞株を樹立することに成功した。

次に、得られた細胞の成熟した巨核球細胞への分化誘導を試みた。その結果、得られた巨核球細胞には多核化巨核球細胞が含有されており、さらには巨核球細胞は、血小板前駆体を形成していることを見出した。本願はこれらの知見に基づくものである。

すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を含む、巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
（２）前記Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方をゲノム上に有する、上記（１）に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
（３）単核である、上記（１）または（２）に記載の巨核球前駆細胞。
（４）上記（１）に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞であって、株化された巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
（５）上記（３）に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞であって、株化された巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
（６）上記（４）に記載の巨核球前駆細胞若しくは巨核球細胞または上記（５）に記載の巨核球前駆細胞若しくは巨核球細胞の凍結物。
（７）巨核球前駆細胞または巨核球細胞の製造方法であって、
巨核球系列の細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞またはＣＤ３４陽性細胞）にＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を発現させることと、
得られた細胞をトロンボポイエチン（ＴＰＯ）の存在下で培養することと
を含む、方法。
（７Ａ）巨核球前駆細胞または巨核球細胞の製造方法であって、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を有する巨核球系列の細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞またはＣＤ３４陽性細胞）を巨核球分化に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
（８）培養が、ＴＰＯ、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）存在下で行われる、上記（７）または（７Ａ）に記載の方法。
（９）血小板製剤の製造方法であって、
巨核球系列の細胞（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）にＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を発現させることと、
得られた細胞をトロンボポイエチン（ＴＰＯ）の存在下で培養して巨核球細胞を得て、巨核球細胞の培養物から血小板を回収することと、
を含む、方法。
（９Ａ）血小板製剤の製造方法であって、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を有する巨核球細胞の培養物を用意することと、当該培養物から血小板を回収することとを含む、
方法。
（１０）巨核球細胞が、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の遺伝子発現が抑制された細胞である、上記（９）または（９Ａ）に記載の方法。

本発明によれば、巨核球前駆細胞を効率よく安定的に生産することができる巨核球前駆細胞株の製造方法、並びに該製造方法によって得られる巨核球前駆細胞株から巨核球細胞および血小板を製造する方法を提供することが可能となる。

図１は、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質とを発現させた造血幹細胞のウイルス除去後２１日目の培養物の遺伝子発現解析の結果（パネルＡ）および上記培養開始後のＣＤ４１細胞数の変化（パネルＢ）を示す。以下、図中では、「Ｅ６－２Ａ－Ｅ７」を単に「Ｅ６－Ｅ７」と表記する。図２は、ウイルス除去後７０日目の培養物中のＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性細胞の割合を示す。図３は、Ｅ６遺伝子またはＥ７遺伝子を単独で発現させた造血幹細胞のウイルスの導入３週間後の培養物中のＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性細胞の割合（パネルＡ）およびＥ６タンパク質とＥ７タンパク質のいずれかまたは両方を発現させた造血幹細胞のウイルス除去後のＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性細胞の培養物中に占める割合（％）の変化（週）を示す。図４は、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を発現させた造血幹細胞の培養中の細胞数の推移を示す。図５は、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を発現させた造血幹細胞において生じるＰＩ陽性細胞の割合を示す。図６は、不死化した巨核球前駆細胞からの血小板前駆体の産生を示す。

発明の具体的な説明

本明細書では、「造血幹細胞」とは、血液系細胞への分化能を有する幹細胞を意味する。造血幹細胞は、通常は血液系以外の細胞への分化能を有しないことが知られている。また、ありとあらゆる血液系細胞への分化能を有することが知られている。「造血幹細胞」は、「血液幹細胞」とも称される。かかる「造血幹細胞」は、臍帯血、末梢血、骨髄、および胎児肝臓等の組織から、造血幹細胞の表面抗原（ＣＤ３４等）に特異的に結合する抗体を用いてフローサイトメトリー法等により分離回収した細胞集団中に豊富に含まれていることが知られている。また、本発明において「造血幹細胞」は、ヒト多能性幹細胞から分化誘導することにより調製することもできる。

本明細書では、「巨核球」とは、単核巨核球および血小板を産生する成熟巨核球を含む意味で用いられる。巨核球のうち、成熟巨核球は、４Ｎから１２８Ｎの染色体を有する。成熟巨核球は、造血幹細胞に由来し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞、造血前駆細胞、巨核芽球、および巨核球前駆細胞（巨核球系列の細胞）を経て、成熟巨核球となる。本明細書では、倍数体になる前の２Ｎの染色体を有する巨核球を単核巨核球という。巨核球の細胞株を作成する場合には、単核巨核球から作成することになる。成熟巨核球は、血小板の産生能力を有する。

本発明では、「巨核球前駆細胞」とは、成熟巨核球細胞（すなわち、多核化した巨核球細胞）への分化能を有する細胞を意味する。巨核球前駆細胞は、巨核球以外の血液系細胞への分化能を喪失している細胞であり得る。また、「巨核球前駆細胞株」とは、株化された巨核球前駆細胞を意味し、具体的には、不死化した巨核球前駆細胞のことを意味する。

本明細書では、「ヒトパピローマウイルス」（ＨＰＶ）とは、パピローマウイルス科に属するウイルスの一つであり、パピローマ（または乳頭腫）と呼ばれるイボを形成させるウイルスである。ＨＰＶは、初期遺伝子としてＥ１～Ｅ７を有し、後期遺伝子としてＬ１およびＬ２を有する。Ｅ６およびＥ７は、発がん（特に子宮頸がんの発がん）に関与するタンパク質として知られている。本明細書では、Ｅ６タンパク質は、ＨＰＶの１６型のＥ６タンパク質および当該タンパク質が有するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するＥ６タンパク質を意味する。本明細書では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶの１６型のＥ７タンパク質および当該タンパク質が有するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するＥ７タンパク質を意味する。

本明細書では、「細胞」は、哺乳動物の細胞であり、例えば、ヒト細胞であり得る。細胞は株化されると、無制限に細胞分裂を繰り返すようになることが知られている。

本明細書では、「あるアミノ酸配列に対応する」とは、当該アミノ酸配列のオーソログであって、当該アミノ酸配列を有するタンパク質と同質の機能性を有するタンパク質をいう。Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質としてはそれぞれ、例えば、上記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質が含まれ得る。配列同一性は、例えば、ＮＥＥＤＬＥｐｒｏｇｒａｍ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１９７０、Ｖｏｌ．４８、ｐ．４４３－４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味し得る。前記のパラメータは以下の通りであり得る。Ｇａｐｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、およびＭａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２。

＜巨核球前駆細胞および巨核球細胞＞
本発明では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６タンパク質をコードする遺伝子（Ｅ６遺伝子ともいう）およびＥ７タンパク質をコードする遺伝子（Ｅ７遺伝子ともいう）からなる群から選択される少なくとも１つを有する、細胞（例えば、巨核球系列の細胞、例えば、巨核球前駆細胞および巨核球細胞）が提供される。

ＨＰＶのＥ６遺伝子は、特に限定されないが、例えば、１６型ＨＰＶのＥ６遺伝子（「ＨＰＶ－Ｅ６遺伝子」ともいう）とすることができる。ＨＰＶのＥ７遺伝子は、特に限定されないが、例えば、１６型ＨＰＶのＥ７遺伝子（「ＨＰＶ－Ｅ７遺伝子」ともいう；１６型ＨＰＶのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子を併せて「ＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子」ともいう）とすることができる。

「ＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子」は、典型的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＰＶ－Ｅ６タンパク質）及び配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＨＰＶ－Ｅ７タンパク質、例えば、配列番号：３）をコードする核酸であり得る。

Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子は、別々の核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）に含まれていてもよいが、好ましくは１つの核酸に含まれていてもよい。Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子が１つの核酸に含まれている場合には、ポリシストロニックに核酸に含まれていてもよいし、モノシストロニックに核酸に含まれていてもよい。Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子を含む核酸は、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質（例えば、２Ａペプチドで連結した融合タンパク質）をコードする遺伝子を含んでいてもよい。２Ａペプチドは、ウイルス由来の２０アミノ酸前後の長さを有する配列を有し、細胞に内在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）によって認識されて、そのＣ末端から１残基の箇所で切断されることが知られている。２Ａペプチドとしては、例えば配列番号４に記載のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する２Ａペプチドが挙げられ、本発明で用いることができる。２Ａペプチドは、その前後にスペーサー（例えば、３アミノ酸長程度のアミノ酸配列）を介在させ、タンパク質と連結させることができる。

Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子は、哺乳動物用の遺伝子発現ベクターに含まれてていてもよいし、細胞のゲノム上に含まれていてもよい。遺伝子発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルス）およびプラスミドベクターが挙げられる。遺伝子発現ベクターは、細胞内では、ゲノムにインテグレートしていてもよいし、エピゾーマルに存在していてもよい。センダイウイルスなどのＲＮＡウイルスベクターの場合は、マイクロＲＮＡ標的配列をゲノムに導入し、当該ウイルスの感染細胞にマイクロＲＮＡを導入することによって除去することができる。

Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子は、哺乳動物細胞内でこれらの遺伝子を発現させることができる発現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結していてもよい。プロモーターとしては、構成的発現をもたらすプロモーターおよび誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、外部刺激に応答して転写を活性化させるプロモーターを用いることができ、例えば、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等）である場合には、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と最小プロモーターを含むプロモーターを用いることができる。テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と最小プロモーターを含むプロモーターは、テトラサイクリン調節性トランス活性化因子（ｔＴＡ）の存在下において、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等）が結合すると不活性化し、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等）が外れると活性化する。また、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）と最小プロモーターを含むプロモーターは、リバーズテトラサイクリン調節性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）の存在下において、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等）と結合すると活性化し、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ドキシサイクリン等）が外れると不活性化する。また、外的刺激がエクジステロイド（エクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ等）の存在である場合には、エクジステロイドと、エクジソン受容体－レチノイド受容体複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。さらに、外的刺激がＦＫＣｓＡの存在である場合には、ＦＫＣｓＡと、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン－シクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。

巨核球系列の細胞は、造血幹細胞に由来するＣＤ３４陽性造血幹細胞、造血前駆細胞、および巨核球前駆細胞、並びに巨核球が挙げられる。巨核球系列の細胞は、ＣＤ４１陽性細胞、フォンヴィレブランド因子（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ；ＶＭＦ）陽性の細胞、およびＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性の細胞からなる群から選択される細胞（例えば、巨核球前駆細胞、並びに巨核球）であり得る。

２Ｎの核型を有する細胞は、増殖に適している。したがって、２Ｎの核型を有する細胞は、好ましく株化され得る。株化は、細胞を不死化することによって行われ得る。不死化は、常法を用いて行うことができ、例えば、不死化因子（例えば、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原やテロメア逆転写タンパク質（ＴＥＲＴ）等）を細胞に導入することによって行われ得る。

本発明によれば、
Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を含む、巨核球前駆細胞または巨核球細胞の凍結物；および
Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方をゲノム上に有する、巨核球前駆細胞または巨核球細胞の凍結物が提供される。凍結物において、巨核球前駆細胞または巨核球細胞は単核であってもよい。単核の巨核球前駆細胞若しくは単核の巨核球細胞またはこれを含む組成物（例えば、凍結状態の組成物または凍結物）は、例えば、ワーキングセルバンクを調製することに用いることができ、すなわち、ワーキングセルバンクを調製するためのマスターセルバンクとして用いることができる。従って、本発明のある態様では、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を含む、巨核球前駆細胞または巨核球細胞の凍結物；および
Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方をゲノム上に有する、巨核球前駆細胞または巨核球細胞の凍結物
のマスターセルバンクとしての使用が提供される。また、本発明のある態様では、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を含む、巨核球前駆細胞または巨核球細胞の凍結物；および
Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方をゲノム上に有する、巨核球前駆細胞または巨核球細胞の凍結物
からなる群から選択される凍結物または当該凍結物を含む、血小板を製造することに用いるためのマスターセルバンクまたはワーキングセルバンクが提供される。

細胞が、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を有するかどうかは、常法（例えば、ＰＣＲ法、サザンブロット法、およびノーザンブロット法）によって検出することができる。

＜巨核球前駆細胞株の製造方法＞
本発明の巨核球前駆細胞株の製造方法においては、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を細胞（例えば、造血幹細胞から巨核球前駆細胞までのいずれかの分化段階にある細胞（例えば、造血幹細胞および造血前駆細胞）に導入することができる。従って、本発明によれば、造血幹細胞から巨核球前駆細胞までのいずれかの分化段階にある細胞（例えば、造血幹細胞および造血前駆細胞）であって、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む、細胞が提供され得る。本発明のある態様では、造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞であり得る。
細胞にＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を含むＤＮＡを導入する場合には、ＤＮＡは、発現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結させたＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を含み得る。
本発明のある態様では、誘導性プロモーターに作動可能に連結したヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を含む遺伝子発現ベクターを、細胞に導入する。誘導性プロモーターを作動させる外的刺激は、任意のタイミングで（例えば、ベクター導入前、導入中、または導入後若しくは導入直後に）、細胞に対して加えることができる。ある態様では、誘導性プロモーターを作動させる外的刺激は、ベクター導入前には添加されない。ある態様では、誘導性プロモーターを作動させる外的刺激は、ベクター導入後の一定期間は細胞に対して添加されるが、その後除去されてもよい。除去は、所望の細胞（例えば、巨核球前駆細胞または巨核球細胞）が生じる前または後で行うことができる。

ヒト造血幹細胞に導入される「外的刺激に応答して、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）１６型のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子（ＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子）の発現を誘導することが可能な発現カセット」は、誘導性プロモーター、例えば、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターと、該プロモーターによって発現が制御されるＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子と、必要に応じてターミネーターとを含む核酸構築物である。

発現カセットは、必要に応じて、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）、およびＳＶ４０複製起点からなる群から選択される因子を含んでいてもよい。また、当業者であれば、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子及びターミネーター等を、公知のものから適宜選択して組み合わせることにより、所望の発現レベルにてＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導することが可能な発現カセットを構築することができる。

また、必要に応じて、本発明にかかるヒト血液幹細胞には、外的刺激に応じてＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導する因子（例えば、テトラサイクリントランスアクチベーター、テトラサイクリンリプレッサー、エクジソン受容体－レチノイド受容体複合体、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン－シクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン複合体）を核内において恒常的に発現させることが可能な発現カセットも導入されていてもよい。

本発明において、前記発現カセットを造血幹細胞に導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記発現カセットを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法にて細胞に導入することができる。

このような発現ベクターとしては、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、増殖活性があまり高くない血液幹細胞のゲノムＤＮＡへの導入効率が極めて高いという観点から、レンチウイルスが好ましく用いられ得る。

本発明の巨核球前駆細胞株の製造方法においては、次に、前記発現カセットが導入されたヒト血液幹細胞を、前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養することができる。

なお、「ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されている巨核球前駆細胞株」とは、本発明にかかる発現カセットが細胞内に導入された結果、外的刺激の存在下においてＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子を安定的に発現し得る巨核球前駆細胞株のことであり、細胞株の樹立、さらには後述の巨核球細胞への分化段階にて、核と共に本発明にかかる発現カセットが除去できるという観点から、本発明にかかる発現カセットがゲノムＤＮＡに組み込まれている巨核球前駆細胞株が好ましい。

本発明において、「血液系増殖因子」は、血液幹細胞から巨核球前駆細胞への分化誘導又は巨核球前駆細胞の増殖に寄与する因子を意味する。このような「血液系増殖因子」としては、例えば、ＳＣＦ、およびＴＰＯが挙げられる。

後述の培養液における、ＳＣＦの好適な添加濃度としては、５０～１００ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯの好適な添加濃度としては、５０～１００ｎｇ／ｍｌである。

また、前記外的刺激に関しては、当業者であれば、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、後述の培地への添加量を適宜調整することができる。例えば、外的刺激がドキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在である場合には、ＤＯＸの好適な添加濃度としては、１～２μｇ／ｍｌである。

巨核球前駆細胞への分化誘導のために用いられ、前記外的刺激及び前記血液系増殖因子が添加される培養液としては、例えば、ＩＭＤＭ溶液、α－ＭＥＭ溶液又はＤＭＥＭ溶液が挙げられ、さらに、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトインシュリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノール、セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、アルファモノチオグリセロール、Ｌ－グルタミン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、または誘導性プロモーターを作動させる外部刺激（例えば、ＤＯＸ）等が含まれていてもよい。また、必要に応じて、無機塩類（硫酸第一鉄等）、または抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン等）等が添加してあってもよい。

前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて、培養液交換を行いながら巨核球前駆細胞の培養を継続し、不死化細胞株を樹立できたと考えられる培養期間としては、好ましくは３ヶ月間であり、より好ましくは６ヶ月以上培養できた時点で不死化細胞株と判断する。

さらに、前記発現カセットが前記血液幹細胞のゲノムＤＮＡに安定的に導入されるまでの期間を確保するという観点から、前記外的刺激及び血液系増殖因子の存在下にて培養する前に、前記発現カセットを前記血液幹細胞に導入してから、１～７日間は、前記外的刺激の非存在下及び血液系増殖因子の存在下にて培養してもよい。

本発明のある態様では、巨核球分化に適した培養条件とは、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦＬＴ３からなる群から選択される因子の存在下の条件であり得、例えば、ＴＰＯ存在下の条件であり得る。

＜成熟巨核球細胞の製造方法＞
後述の実施例において示す通り、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子の発現は、樹立した巨核球前駆細胞株の取得量の増加において重要である。一方、巨核球細胞の分化・成熟過程においては、巨核球前駆細胞から徐々に細胞分裂能が低下していることから、前述の方法にて製造されたヒト巨核球前駆細胞株を、誘導性プロモーターを作動させる外部刺激（例えば、ＤＯＸ）の非存在下にて培養してもよい。

すなわち、本発明の成熟巨核球細胞の製造方法は、成熟巨核球細胞への分化誘導のために用いられ、培地としては、例えば、ＩＭＤＭ溶液、α－ＭＥＭ溶液、ＤＭＥＭ溶液が挙げられ、培地には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトインシュリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノール、セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、アルファモノチオグリセロール、Ｌ－グルタミン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、またはＦＬＴ３等が含まれていてもよい。また、必要に応じて、無機塩類、または抗生物質が添加してあってもよい。

なお、かかる製造方法についても、当業者であれば、前述の本発明に関する説明及び実施例の具体的な説明を参照しつつ、本発明にかかる発現カセットの構成、該発現カセットの導入方法、各分化段階における培養条件（例えば、培地の組成、培養期間）等を適宜選択しつつ、必要に応じてこれらの方法に適宜、修飾ないし改変を加えることにより、実施することができる。

本発明のある態様では、ヒトパピローマウィルス１６型Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、外的刺激及び血液系増殖因子の存在下で増殖し、前記外的刺激の非存在下にて培養することにより巨核球細胞および血小板の産生能を有する、ヒト巨核球前駆細胞株が提供される。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において用いた細胞、培養液及び形質転換に用いたベクターは以下の通りである。

＜細胞＞
ヒト骨髄由来造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）は、Ｌｏｎｚａ社より購入した。

＜ベクター＞
巨核球前駆細胞株樹立の工程において、ヒトパピローマウィルス－Ｅ６／Ｅ７（ＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７）遺伝子及びテトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）をコードする遺伝子を導入するために、ＣＳＩＶ－ＴＲＥ－ＲｆＡ－ＵｂＣ－ＫＴレンチウイルスベクターを用いた。また、これらレンチウイルスベクターを用いたレンチウイルスの調製は、標準的な手技手法を採用して行った。

実施例１：造血幹細胞からのＣＤ４１陽性ＣＤ４２ｂ陽性の巨核球細胞への分化誘導
造血幹細胞は、ＴＰＯ存在下でＣＤ４１陽性細胞（巨核球前駆細胞）を経由してＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性細胞（巨核球細胞）へと分化する。本実施例では、造血幹細胞から巨核球細胞への誘導を試みた。

２×１０⁵細胞のヒト骨髄由来造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）（Ｌｏｎｚａ）を６ウェルプレートディッシュに播種して、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＴＳ（１０μｇ／ｍｌヒトインシュリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン酸ナトリウム；Ｓｉｇｍａ）、５０ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、ＰＳＱ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ－グルタミン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＰＯ、および１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＦＬＴ３を含むＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ）培養液で４８時間培養した。その後、上記ヒト骨髄由来造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）にパピローマウイルスのＥ６タンパク質とＥ７タンパク質とを２Ａペプチドを介して連結させた融合タンパク質をコードする遺伝子（Ｅ６－２Ａ－Ｅ７）を組み込んだ、ＣＳＩＶ－ＴＲＥ－ＲｆＡ－ＵｂＣ－ＫＴレンチウイルスベクター（ＴＡＫＡＲＡＢＩＯ）（ＣＳＩＶ－ＴＲＥ－ＨＰＶ１６－Ｔ２Ａ－Ｅ７－ＵｂＣ－ＫＴ）をＭＯＩ＝２０（ＭＯＩは２９３Ｔ細胞を用いて確認した）で１２時間毎に２回感染させた後、上記ＩＭＤＭ培養液に１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＰＯ、および１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＦＬＴ３および１ μｇ／ｍｌＤＯＸを加えてＥ６およびＥ７の発現誘導を行った。この系は、Ｅ６とＥ７の効果を検証するために誘導可能な系とした。具体的には、Ｅ６とＥ７遺伝子はドキシサイクリン（ＤＯＸ）存在下では発現を人為的に誘導することが可能であり、ＤＯＸ非存在下ではＥ６とＥ７遺伝子の発現を抑制することができる系とした。また、レンチウイルスには、細胞に感染するとＧＦＰを発現するようにＧＦＰを発現可能に組み込まれた。

１回目のレンチウイルス感染と同時にＤＯＸを添加し、２回目の感染後２４時間後と４８時間後に培地を新鮮な培地に交換した。この培地交換によって、培地中のレンチウイルスは除去された。

ウイルス除去後、培養液を交換しながら、経時的に細胞の増殖を観察した。培養２０日後に一部の培養細胞を回収して、ＣＤ４１の発現を抗ヒトＣＤ４１抗体を用いて蛍光染色し、フローサイトメーターで確認した。この際、レンチウイルスの感染が成立しているかを確認するため、フローサイトメトリーでＧＦＰの発現を同時に確認した。

フローサイトメトリー
モノクローナル抗体を用いて、氷上で細胞を３０分間、染色した。細胞数は、１００ μｌの染色液に１×１０⁶以下とした。染色後、抗体を含まない染色液で２回洗浄後、ＦＡＣＳａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ）を用いて、測定した。ヒト抗原に対する抗体は、フルオレッセンイソチオシアネイト（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ａｌｅｘａ４８８）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識した。ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂは、ＦＩＴＣで標識し、ＣＤ１１ｂは、Ａｌｅｘａ４８８で標識した。アイソタイプ・コントロールとして、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ｃ－ＫＩＴは、ＡＰＣで標識した。これらの標識抗体は、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。細胞生存率は、ヨウ化プロピジウム（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ；ＰＩ）染色により測定した。ＰＩ陽性細胞は、死細胞として除外し、ＰＩ陰性細胞について、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ分析ソフトウェアを用いて解析した。

結果は、図１に示される通りであった。図１のパネルＡに示されるように、上記の条件で培養された細胞は、ウイルス除去後の２０日間の培養を経ても、良好に細胞分裂を継続し、ＧＦＰ陽性細胞が存在し、かつ、ＧＦＰ陽性細胞の半数がＣＤ４１陽性を示した。また、培養をさらに数日継続すると、ＧＦＰ陽性細胞はほぼすべてＣＤ４１陽性細胞に変化した。細胞のＳＣＦ濃度依存性を確認すると、図１のパネルＢに示されるように、培地中のＳＣＦの濃度依存的に細胞増殖の効率が変化することから、上記で得られた細胞は、ＣＤ４１陽性の細胞であることが示唆された。巨核球細胞の発生分化において、ＣＤ４１陽性の細胞は、巨核球前駆細胞の表現型である。従って、本実施例では、ＣＤ４１陽性の巨核球前駆細胞が得られたことが示唆された。

また、ウイルス除去後７０日間培養した細胞を回収して、ＣＤ４１ａとＣＤ４２ｂの発現を抗ヒトＣＤ４１ａ抗体および抗ヒトＣＤ４２ｂ抗体を用いてフローサイトメトリーで確認した。結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、大半の細胞が、ＣＤ４１ａ陽性かつＣＤ４２ｂ陽性を示した。これにより、ＣＤ４１ａ陽性かつＣＤ４２ｂ陽性の巨核球前駆細胞が得られたことが明らかとなった。

Ｅ６とＥ７遺伝子を単独で骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞に遺伝子導入して長期間培養後における表面マーカーであるＣＤ４１とＣＤ４２ｂ陽性細胞の発現変化を検討した。
図３のパネルＡに示すように、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかの単独発現においても、遺伝子導入から３週間後には、ＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性細胞を確認できた。図３のパネルＢに示すように、ＣＤ４１とＣＤ４２ｂ陽性細胞が最もピークである時期は、遺伝子導入後４週間後（ＤＯＸ除去２週間後）であった。

次に、ＧＦＰのみ、ＧＦＰとＥ６、ＧＦＰとＥ７またはＧＦＰとＥ６－２Ａ－Ｅ７を含むレンチウイルスで感染したＣＤ３４陽性細胞の細胞数の変化を検討した。

ＧＦＰのみ（対照）、ＧＦＰとＥ６、ＧＦＰとＥ７またはＧＦＰとＥ６－２Ａ－Ｅ７を含むレンチウイルスで感染したＣＤ３４陽性細胞は、３日後、各群の細胞（１×１０⁴細胞）をＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で培養し、指定した日数の経過後に培養物に占める細胞の割合を測定した。結果は図３のパネルＢに示される通りであった。図３のパネルＢに示されるように、Ｅ６単独もしくはＥ７単独の遺伝子導入群およびＥ６とＥ７の共発現群において細胞数の増加が認められた。一方で、Ｅ６－２Ａ－Ｅ７遺伝子を発現させた群においては１０週間を過ぎてもＣＤ４２ｂとＣＤ４１の共陽性細胞が５０％近くを維持できた。

ＧＦＰ、Ｅ６、Ｅ７またはＥ６－２Ａ－Ｅ７を含むレンチウイルスで感染後、Ｄａｙ０でのＧＦＰ陽性細胞数を１０³個として細胞の培養を行い、細胞数をセルカウンターで測定した。結果は図４に示される通りであった。図４に示されるように、Ｅ６単独もしくはＥ７単独の遺伝子導入群においてはコントロール（ＧＦＰ）群と比較して長期の細胞数の増加は認められるが、細胞の増殖に３週間を超える時間を要した。一方で、Ｅ６－２Ａ－Ｅ７遺伝子を発現させた群においては全ての群と比べて非常に細胞数の増加までの期間が短かった。

ＧＦＰのみ、ＧＦＰとＥ６、ＧＦＰとＥ７またはＧＦＰとＥ６－２Ａ－Ｅ７を含むレンチウイルスで感染したＣＤ３４陽性細胞の死亡率をＰＩ陽性細胞数の割合とし、培養１４日後にフローサイトメーターを用いて測定した。Ｅ６単独もしくはＥ７単独の遺伝子導入群においてはコントロール（ＧＦＰ）群と比較して同様のＰＩ陽性細胞が確認できた。しかし、Ｅ６－２Ａ－Ｅ７遺伝子発現させた群においては全ての群と比べてＰＩ陽性細胞が減少していた。
これらのことからＥ６とＥ７の同時発現はアポトーシスを抑制することで細胞の増幅が他の群と比較して効率がよいことが示唆された。

実施例２：血小板前駆体（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）放出の分析
Ｅ６およびＥ７を発現したＣＤ４１陽性ＣＤ４２ｂ陽性の巨核球前駆細胞について継代培養を行い、継代培養を１ヶ月以上行うことにより、不死化したＣＤ４１陽性ＣＤ４２ｂ陽性の巨核球前駆細胞を得た。不死化した巨核球前駆細胞（５×１０⁶細胞）を２０日間培養し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、フィブロネクチン塗布した培養皿に移し３日間培養後、ＣＤ４１抗体で染色して顕微鏡下に測定した。

分化条件として、２０日間、ＤＯＸ非存在下に培養した不死化巨核球前駆細胞をフィブロネクチン塗布した培養皿に移し、３日間培養後にＣＤ４１抗体（赤色）の分布を顕微鏡下に観察した。その結果ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ状の構造が確認された。

配列表
配列番号１：ＨＰＶ１６型のＥ６タンパク質のアミノ酸配列の一例
ＭＦＱＤＴＥＥＫＰＲＴＬＨＤＬＣＱＡＬＥＴＴＩＨＮＩＥＬＱＣＶＥＣＫＫＰＬＱＲＳＥＶＹＤＦＡＦＡＤＬＴＶＶＹＲＥＧＮＰＦＧＩＣＫＬＣＬＲＦＬＳＫＩＳＥＹＲＨＹＮＹＳＶＹＧＮＴＬＥＱＴＶＫＫＰＬＮＥＩＬＩＲＣＩＩＣＱＲＰＬＣＰＱＥＫＫＲＨＶＤＬＮＫＲＦＨＮＩＳＧＲＷＡＧＲＣＡＡＣＷＲＳＲＲＲＥＴＡＬ

配列番号２：ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質のアミノ酸配列の一例
ＭＲＧＨＫＰＴＬＫＥＹＶＬＤＬＹＰＥＰＴＤＬＹＣＹＥＱＬＳＤＳＳＤＥＤＥＧＬＤＲＰＤＧＱＡＱＰＡＴＡＤＹＹＩＶＴＣＣＨＴＣＮＴＴＶＲＬＣＶＮＳＴＡＳＤＬＲＴＩＱＱＬＬＭＧＴＶＮＩＶＣＰＴＣＡＱＱ

配列番号３：ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質とＥ６タンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列の一例
ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＬＩＮＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ

配列番号４：２Ａペプチドのアミノ酸配列の一例
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ

Claims

Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方を発現する、巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
前記Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子のいずれかまたは両方をゲノム上に有する、請求項１に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
単核である、請求項１または２に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
請求項１に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞であって、株化された巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
請求項３に記載の巨核球前駆細胞または巨核球細胞であって、株化された巨核球前駆細胞または巨核球細胞。
請求項４に記載の巨核球前駆細胞若しくは巨核球細胞または請求項５に記載の巨核球前駆細胞若しくは巨核球細胞の凍結物。
巨核球前駆細胞または巨核球細胞の製造方法であって、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を発現する巨核球系列の細胞から巨核球前駆細胞を得ることを含む、方法。
培養が、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
血小板製剤の製造方法であって、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を発現する巨核球系列の細胞から巨核球前駆細胞を得ることと、得られた巨核球前駆細胞を巨核球細胞への分化に適した条件下で培養して血小板を含む成熟巨核球細胞の培養物を得ることと、当該培養物から血小板を回収することとを含む、方法。
成熟巨核球細胞が、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の遺伝子発現が抑制された細胞である、請求項９に記載の方法。