JP7635934B2

JP7635934B2 - 評価用器具及び評価方法

Info

Publication number: JP7635934B2
Application number: JP2021033251A
Authority: JP
Inventors: 昌治竹内; 悠杉本; 香苗酒井
Original assignee: Toyota Boshoku Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Toyota Boshoku Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2025-02-26
Anticipated expiration: 2041-03-03
Also published as: US20220282193A1; CN115011662A; CN115011662B; JP2022134243A

Description

本開示は、評価用器具及び評価方法に関する。

細胞が備えている有用化合物の生産能力を評価するために、例えば、ＰＤＭＳ製のマイクロチャンバーが用いられている（特許文献１参照）。詳細には、まず、表面に複数のウェルを有する板状のマイクロチャンバーを用いて、ウェル内で細胞を培養する。そして、被検菌が塗布された培地に、マイクロチャンバーを裏返した状態で載せて、細胞が生産した抗菌成分等を培地に転写する。次に、抗菌成分等が転写された培地における被検菌の生育の抑制度合いを観察して、細胞の抗菌物質生産能力等を評価する。

特開２０２０－２０２７７７号公報

しかし、この方法では、被検菌が塗布された培地に、マイクロチャンバーを裏返して載せる際に、抗菌成分等を生産する細胞も一緒に転写されてしまうため、評価の精度が低いおそれがあった。
本開示は、上記実情に鑑みてなされたものであり、評価の精度を向上することを目的とする。本開示は、以下の形態として実現することが可能である。

〔１〕細胞によって生産された化合物の評価用器具であって、
前記細胞を含有する懸濁液を保持する保持空間が備えられ、
前記保持空間の底には、貫通孔が形成され、
前記貫通孔は、前記細胞を透過せず、かつ前記化合物を移動可能な物質で塞がれる、評価用器具。

本開示の評価用器具によれば、貫通孔に配された物質によって、細胞により生産された化合物が培地に移動し、細胞自体は培地には移動しないから、評価の精度を向上できる。

図１は、評価用器具の一例を示す斜視図である。図２は、評価用器具の一例を示す平面図である。図３は、図１の部分拡大図である。図４は、評価用器具の一例を示す断面図である。図５は、蓋付きの評価用器具の一例を示す斜視図である。図６は、導入口から懸濁液を注入した評価用器具を示す模式図である。図７は、導入口から空気を注入した評価用器具を示す模式図である。図８は、評価方法の一例を示す模式図（断面図）である。図９は、評価方法の一例を示す模式図（断面図）である。図１０は、評価方法の一例を示す模式図（断面図）である。図１１は、評価方法の一例を示す模式図（断面図）である。他の実施形態の評価用器具の一例を示す斜視図である。

ここで、本開示の望ましい例を示す。
〔２〕前記保持空間は複数存在している、評価用器具。
ｎ数を増やして評価精度を高めることができる。
〔３〕前記貫通孔は、各前記保持空間毎に独立して形成されている、評価用器具。
各保持空間で生産された各化合物の独立性が担保される。
〔４〕複数の前記保持空間は、互いに連結されている、評価用器具。
複数の保持空間に懸濁液を充填することが簡単に行える。
〔５〕前記保持空間に前記懸濁液を導入するための導入部が形成され、前記導入部から延びる流路に前記保持空間が連結されている、評価用器具。
複数の保持空間に懸濁液を充填することが簡単に行える。
〔６〕前記流路は線状に延び、前記流路の両側に前記保持空間が連結されている、評価用器具。
複数の保持空間に懸濁液を略均等に充填できる。
〔７〕培地に、評価用器具を載せて、前記貫通孔を塞いでいる前記物質と前記培地とを接触させて、
前記細胞によって生産された前記化合物を、前記物質を介し前記培地に移動させて、前記化合物を前記培地で評価する評価方法。
貫通孔に配された物質によって、細胞により生産された化合物が培地に移動し、細胞自体は培地には移動しないから、評価方法の精度が向上する。
〔８〕菌が塗布された培地に、評価用器具を載せて、前記貫通孔を塞いでいる前記物質と前記培地とを接触させて、
前記細胞によって生産された前記化合物を、前記物質を介し前記培地に移動させて、前記培地に形成された白濁領域と透明領域の状態を観察することで、前記化合物を評価する評価方法。
貫通孔に配された物質によって、細胞により生産された化合物が培地に移動し、細胞自体は培地には移動しないから、評価の精度が向上する。

以下、本開示を詳しく説明する。なお、本明細書において、数値範囲について「～」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０～２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０～２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。

１．評価用器具１
本開示の評価用器具１は、細胞によって生産された化合物３の評価に用いる。
評価用器具１には、図１～図４に示されるように、細胞を含有する懸濁液５を保持する保持空間７が備えられている。保持空間７の底９には、貫通孔１１が形成されている。貫通孔１１は、細胞を透過せず、かつ化合物３を移動可能な物質１３で塞がれる。図１，２，３，５では、貫通孔１１が物質１３で塞がれる前の状態が示され、図４では、貫通孔１１が物質１３で塞がれた状態が示されている。評価用器具１は、使用に際して貫通孔１１が物質１３で塞がれた状態とされる。

保持空間７の個数は、特に限定されない。保持空間７は、ｎ数を増やして評価精度を高める観点から、複数存在していることが好ましい。
保持空間７の形状は、特に限定されない。保持空間７の形状は、懸濁液５をスムーズに充填する観点から、略円柱状が好ましい。保持空間７が略円柱状の場合には、径φ１及び高さｈ１は特に限定されない。評価するために十分な量の化合物３を細胞に生産させる観点から、径φ１は０．８ｍｍ～１．２ｍｍ、高さｈ１は０．３ｍｍ～０．７ｍｍが好ましい。
貫通孔１１は、図３に示されるように、保持空間７毎に独立して形成されていることが好ましい。各保持空間で生産された各化合物３の独立性を担保するためである。貫通孔１１の形状は、特に限定されない。貫通孔１１の形状は、図４に示されるように、下方に向かうにつれて径が小さくなる形状、例えば円錐台形状であることが好ましい。この形状であると、貫通孔１１から物質１３が抜けて脱落することが抑制される。貫通孔１１の形状は、特に限定されない。貫通孔１１が円錐台形状の場合には、物質１３の脱落を抑制しつつ、物質１３における化合物３の移動量を十分に確保する観点から、上端部の径φ２は、０．２５ｍｍ～０．３５ｍｍが好ましく、下端部の径φ３は、径φ２よりも小さいことが好ましく、高さｈ２は０．３ｍｍ～０．７ｍｍが好ましい。

保持空間７が複数存在する場合には、図２，３に例示されるように、複数の保持空間７は、互いに連結されていることが好ましい。図２，３の例では、複数の保持空間７は、流路１７及び連結流路２１にて、液体が流通可能に連結されている。

評価用器具１では、保持空間７に懸濁液５を導入するための導入部１９が形成されている。導入部１９から延びる流路１７に連結流路２１を介して保持空間７が連結されている。この構成では、導入部１９に懸濁液５を注入することで、複数の保持空間７に懸濁液５を容易に充填できる（図６参照）。
流路１７は線状（例えば、直線状）に延び、流路１７の両側に保持空間７が連結されていることが好ましい。流路１７と保持空間７とは、連結流路２１によって連結されている。図３では、流路１７及び連結流路２１が、保持空間７の底９と同一の高さとされているが、図１２に示すように、流路１７及び連結流路２１は、保持空間７の底９と異なる高さであってもよい。図１２では、流路１７及び連結流路２１よりも、保持空間７の底９の方が低くなっている。
流路１７の両側への複数の保持空間７の配置は特に限定されない。図２に示すように、流路１７の一方側に位置する保持空間７Ａと、流路１７の他方側に位置する保持空間７Ｂとは、導入部１９から排出部２５の方向に沿って、互い違いに配置されている。この構造によって、導入部１９から懸濁液５を導入すると、流路１７の一方側に位置する保持空間７Ａと、流路１７の他方側に位置する保持空間７Ｂとに、交互に懸濁液５が充填されるから、各保持空間７に、略均等に懸濁液５を流し込むことができる。
流路１７の幅Ｗは、特に限定されない。流路１７の幅Ｗは、流路１７へスムーズに懸濁液５を流す観点から、例えば、０．１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下とされる。

評価用器具１は、蓋２７を備えていることが好ましい。蓋２７には、各保持空間７の上方位置に通気孔２９が形成されている。蓋２７には、導入部１９の上方位置に導入口３１が形成され、排出部２５の上方位置に排出口３３が形成されている。

評価用器具１の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂を主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。なお、蓋２７も、評価用器具１と同様の材質を好適に採用できる。

細胞によって生産される化合物３は、特に限定されない。化合物３は、例えば、抗菌物質（抗生物質）等の有用物質である。化合物３を生産する細胞は、生産細胞とも呼ばれている。

物質１３は、細胞を透過せず、かつ化合物３を移動可能である。物質１３には、寒天（寒天ゲル）を好適に採用できる。

本開示の評価用器具１によれば、貫通孔１１に配された物質１３によって、細胞により生産された化合物３が培地３５に移動し、細胞自体は培地３５には移動しないから、評価の精度が向上する。すなわち、本開示の評価用器具１によれば、次の効果が期待できる。評価用器具１によれば、生産細胞は培地３５に移動しないから、培地３５において、生産細胞と検出菌（被検菌）とが混じり合うおそれが少ない。よって、評価用器具１によれば、培地３５における検出菌（被検菌）の生育障害等の評価を適正に行える。

２．評価方法
本開示の評価方法は、培地３５に、評価用器具１を載せて、貫通孔１１を塞いでいる物質１３と培地３５とを接触させて、細胞によって生産された化合物３を、物質１３を介し培地３５に移動させて、化合物３を培地３５で評価する（図８～図１１参照）。
培地３５として、例えば、寒天培地が好適に採用される。寒天培地は、取り扱い性の観点から固形培地であることが好ましく、平板培地がより好ましい。寒天培地には、菌が塗布されていることが好ましい。この菌は、検出菌（被検菌）とも呼ばれ、病原菌等が好適に採用される。
評価手法は、特に限定されない。評価手法としては、例えば、図１１に示すように、培地３５上に形成された白濁領域３５Ａと透明領域３５Ｂの状態を観察することで、化合物３が評価される。
本開示の評価方法では、貫通孔１１に配された物質１３によって、細胞により生産された化合物３が培地３５に移動し、細胞自体は培地３５には移動しないから、評価の精度が向上する。すなわち、本開示の評価方法によれば、次の効果が期待できる。この評価方法によれば、生産細胞は培地３５に移動しないから、培地３５において、生産細胞と検出菌（被検菌）とが混じり合うおそれが少ない。よって、この評価方法によれば、培地３５における検出菌（被検菌）の生育障害等の評価を適正に行える。

ここで、好適な評価方法をより詳細に説明する。
蓋２７で上面を塞いだ評価用器具１を用いる。図６，７では、蓋２７は説明を分かりやすくするために省略されている。導入口３１から懸濁液５を注入すると、図６に示されるように、導入部１９から、点描で模式的に示された懸濁液５が導入されていく。懸濁液５は、直線状の流路１７をスムーズに流れる。導入部１９に近い保持空間７から順に懸濁液５で満たされる。
次に、導入口３１から空気を注入すると、図７に示されるように、導入部１９から空気が注入されていく。すると、空気が略直進して、直線状の流路１７に止まっていた懸濁液５が排出部２５にスムーズに押し出され、各保持空間７に充填された懸濁液５は非連結状態となる。すなわち、各保持空間７に充填された懸濁液５は、相互に独立した状態となる。この状態の断面図が図８である。そして、この状態で、懸濁液５中の細胞を培養すると、図９で示すように、懸濁液５中に化合物３が生成する。図９の懸濁液５の点描における点の密度は、図８の懸濁液５の点描における点の密度よりも多くして、図９の懸濁液５に化合物３が生成したことを模式的に示している。
別途、菌（図示せず）を塗布した培地３５を用意する。図１０に示されるように、培地３５に評価用器具１を載せて、物質１３の下面と培地３５の上面とを接触させる。細胞によって生産された化合物３は、図１０中の破線矢印で示すように、物質１３を介し培地３５に移動する（拡散する）。

その後、培地３５を、培地３５に塗布された検出菌の培養（増殖）に適した温度、例えば、２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃に保温する。
そして、培地３５を観察する。例えば、培地３５に形成された白濁領域３５Ａと透明領域３５Ｂ（ハロ）の状態を観察する。
化合物３が検出菌に対して有効な抗生物質であれば、培地３５のうち、物質１３と接触した領域周辺が透明領域３５Ｂとなり、その他の領域は白濁領域３５Ａ（不透明領域）となる。この場合、透明領域３５Ｂの存在は、抗生物質により菌（検出菌）の生育が阻害されていることを意味している。つまり、このような透明領域３５Ｂと白濁領域３５Ａが観察されることは、抗生物質の存在により菌が死滅し、抗生物質の不存在により菌が増殖することを確認できることになり、結局のところ、細胞によって生産された抗生物質の抗菌活性が評価可能となる。

前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本開示を限定するものと解釈されるものではない。本開示を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本開示の記述及び図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的及び例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本開示の範囲又は本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本開示の詳述に特定の構造、材料及び実施例を参照したが、本開示をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本開示は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。

本開示は上記で詳述した実施形態に限定されず、本開示の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。

本開示の評価用器具は、細胞により生産される化合物の評価に使用できる。

１ …評価用器具
３ …化合物
５ …懸濁液
７ …保持空間
７Ａ …保持空間
７Ｂ …保持空間
９ …底
１１ …貫通孔
１３ …物質
１７ …流路
１９ …導入部
２１ …連結流路
２５ …排出部
２７ …蓋
２９ …通気孔
３１ …導入口
３３ …排出口
３５ …培地
３５Ａ…白濁領域
３５Ｂ…透明領域
ｈ１ …高さ
ｈ２ …高さ
φ１ …径
φ２ …径
φ３ …径

Claims

細胞によって生産された化合物の評価用器具であって、
前記細胞を含有する懸濁液を保持する保持空間が備えられ、
前記保持空間の底には、貫通孔が形成され、
前記貫通孔は、前記細胞を透過せず、かつ前記化合物を移動可能な物質で塞がれる、前記評価用器具を、菌が塗布された培地に載せて、前記貫通孔を塞いでいる前記物質と前記培地とを接触させて、
前記細胞によって生産された前記化合物を、前記物質を介し前記培地に移動させて、前記培地に形成された白濁領域と透明領域の状態を観察することで、前記化合物を評価する評価方法。
前記保持空間は複数存在している、請求項１に記載の評価方法。
前記貫通孔は、各前記保持空間毎に独立して形成されている、請求項２に記載の評価方法。
複数の前記保持空間は、互いに連結されている、請求項２又は請求項３に記載の評価方法。
前記保持空間に前記懸濁液を導入するための導入部が形成され、前記導入部から延びる流路に前記保持空間が連結されている、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の評価方法。
前記流路は線状に延び、前記流路の両側に前記保持空間が連結されている、請求項５に記載の評価方法。
細胞によって生産された化合物の評価用器具であって、
前記細胞を含有する懸濁液を保持する保持空間が備えられ、
前記保持空間の底には、貫通孔が形成され、
前記貫通孔は、寒天で塞がれており、
前記保持空間は複数存在し、
前記貫通孔は、各前記保持空間毎に独立して形成され、
各前記貫通孔を塞いでいる各前記寒天は、互いに接触せずに独立状態が保たれている、評価用器具。
前記貫通孔は、前記保持空間の前記底から遠ざかるにつれて径が小さくなる形状である、請求項７に記載の評価用器具。
前記保持空間に前記懸濁液を導入するための導入部が形成され、前記導入部から延びる流路に前記保持空間が連結されている、請求項７又は請求項８に記載の評価用器具。
前記流路は線状に延び、前記流路の両側に前記保持空間が連結されている、請求項９に記載の評価用器具。