JP7637060B2 - Ａｋｔ経路を標的とする神経保護遺伝子療法 - Google Patents

Description

網膜色素変性症（ＲＰ）は、世界中で推定３０００～７０００人のうち１人の個人が罹患する遺伝性網膜ジストロフィーの集合体である。臨床的発症は、桿体光受容体の機能不全およびその後の死と同時に起こる暗所（夜間）視力の障害を特徴とする。このプロセスは、拡大するにつれて、周辺視野を破壊し、中心網膜の錐体光受容体の変性に起因して、全盲に達する。多くの場合、この表現型は、桿体光伝達、構造または恒常性に不可欠な遺伝子内のヌル変異から生じ、この光受容体サブタイプの喪失についての直接的な説明を提供する。しかしながら、これらの変異は、典型的には、後期疾患における錐体の徐々に起こる悪化を説明しない。

必要とされるのは、それを必要とする対象におけるＲＰおよび他の眼障害関連網膜変性の治療である。

本発明は、ＡＫＴの発現のためのベクターの送達が、光受容体の数、構造、および視覚機能の劇的な保存を促進することを示す以下の例によって例示される。

一態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、ヒトタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）コード配列と、宿主細胞におけるＡＫＴの発現を指示する発現制御配列とを含むベクターゲノムがＡＡＶカプシドの中に封入されたＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶベクター。一実施形態では、ＡＫＴコード配列は、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、またはＡＫＴ３コード配列を含む。一実施形態では、コード配列は、配列番号９である。

別の態様では、薬学的に許容される担体と、少なくとも本明細書に記載されるＡＫＴ配列を含むＡＡＶベクターとを含む、医薬組成物が提供される。

別の態様では、網膜変性を治療するための方法が提供される。本方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載されるＡＡＶベクターを投与することを含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、網膜下または硝子体内に投与される。

別の態様では、ＡＡＶベクターを産生するためのプラスミドが提供される。特定の実施形態では、配列番号１のｎｔ１２５３～５０７０もしくは配列番号３のｎｔ１２５３～３８６８、またはそれらと少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む、プラスミド。

さらに別の態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を生成する方法が提供される。本方法は、感染性ＡＡＶエンベロープまたはカプシドへの遺伝子発現カセットウイルスゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下、配列番号１のｎｔ１２５３～５０７０または配列番号３のｎｔ１２５３～３８６８を含むパッケージング細胞を培養することを含む。

別の態様では、配列番号１のｎｔ１２５３～５０７０または配列番号３のｎｔ１２５３～３８６８を含むベクターゲノムを含む、ウイルスベクターが提供される。

別の態様では、ウイルスベクターは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＫＴコーディング、ｂＧＨポリＡ、および３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含む。

別の態様では、ウイルスベクターは、５’ＩＴＲ、ＧＲＫ１プロモーター、ＳＶ４０イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＫＴコード配列、ｂＧＨポリＡ、および３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含む。

別の態様では、組成物は、網膜変性を治療するための方法で使用するために提供され、本組成物は、本明細書で提供されるＡＡＶベクターを含んでいた。

本発明のさらに他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。

ＡＡＶ７ｍ８ベクターの設計および特徴付けを示す。（図１Ａ）ベクター発現カセットの概要。（図１Ｂ）未治療の対照と比較した、８４－３１細胞の形質導入後のＲｈｅｂ ｍＲＮＡの定量化および（図１Ｃ）ＡＫＴ３ ｍＲＮＡ発現の定量化。データは、平均±ＳＤ（Ｎ＝３）として表される。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図１Ｄ）ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（２×１０^９ｖｇ）の網膜下送達後のマウス網膜の代表的な眼底画像。（図１Ｅ）網膜下注射後のＡＡＶ７ｍ８の網膜トロピズム。（図１Ｆ）未治療、ならびに（図１Ｇ～図１Ｈ）ＡＡＶ．ＡＫＴ３（１×１０^９ｖｇ）およびＡＡＶ．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）とともに注射された、ＡＫＴに対して指向する抗体で染色されたＰＮ４５^ｒｄ１０網膜フラットマウント。 ｃａＲｈｅｂ増強が、光受容体変性を軽減することができないことを示す。（図２Ａ）ＰＮ１３－１４でのＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ（加えてＡＡＶ．ｅＧＦＰ）を網膜下注射した後のＰＮ４５でのＰｄｅ６ｂｒｄ１０網膜断面。（図２Ｂ）ＡＡＶ．ｅＧＦＰ、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰで治療されたか、または未治療のＰｄｅ６ｂｒｄ１０網膜の総ＯＮＬ厚さの定量化。（図２Ｃ）ＡＡＶ．ｅＧＦＰ単独（２×１０^９ｖｇ）で治療されたか、またはＡＡＶ．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）およびＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ（１×１０^９ｖｇ）を同時注射された眼からの２００μｍ当たりのＧＦＰ＋ＯＮＬ細胞の定量化。（図２Ｄ）視力を評価するための視運動反射（ＯＫＲ）の右／左比。異なる治療についての（図２Ｅ）混合桿体－錐体Ａ波振幅、（図２Ｆ）混合桿体－錐体Ｂ波振幅、および（図２Ｇ）錐体Ｂ７０７波振幅の網膜電位図（ＥＲＧ）測定。データを、平均値±ＳＥＭで表す。指数は、データバー内に数値として示された。 ＡＫＴ３遺伝子導入が、光受容体の生存および構造保存を促進することを示す。（図３Ａ）ＰＮ３０での未治療Ｒｄ１０マウス網膜および（図３Ｂ）ロドプシン（ＲＨＯ）に対して指向される抗体で染色されたＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰで治療されたものの代表的な画像。（図３Ｃ）ｅＧＦＰとの共局在化。（図３Ｄ）ＰＮ３０での未治療Ｒｄ１０マウス網膜および（図３Ｅ）錐体アレスチン（ＣＡＲ）に対して指向される抗体で染色されたＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰで治療されたものの代表的な画像。（図３Ｆ）ｅＧＦＰとの共局在化。（図３Ｇ）ＰＮ４５での網膜および網膜下ブレブの未治療部分の間の移行領域の代表的な画像。（図３Ｈ）ＰＮ３０およびＰＮ４５での治療群間のＯＮＬ厚さの定量化。データを、平均値±ＳＥＭで表した。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．（有意ではない）。 ＡＫＴ３遺伝子導入が、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜における網膜および視覚機能に及ぼす効果を示す。（図４Ａ）未治療、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療した網膜、およびＡＡＶ．ＡＫＴ３治療した網膜の間の混合桿体－錐体ａ波振幅の評価。（図４Ｂ）治療間の混合桿体錐体ｂ波振幅の評価。（図４Ｃ）治療群間の明所（錐体）ｂ波振幅。（図４Ｄ）視運動性反応（ＯＫＲ）によって試験される、視力の右眼／左眼比。右眼を、ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ単独（２×１０^９ｖｇ）で、またはＡＡＶ．ＡＫＴ３と組み合わせて治療し、一方、左眼は未治療であった。データを、平均値±ＳＥＭで表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。指数は、バー内に数値によって示された。 ＡＫＴ３誘導性神経保護が、ｍＴＯＲ活性化に関連していることを示す。（図５Ａ）ＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰで治療され、ｍＴＯＲＣ２活性化マーカーであるホスホ－ＡＫＴＳｅｒに対して指向される抗体で染色されたＲｄ１０網膜の代表的な画像。（図５Ｂ）網膜下送達領域をマーキングするｅＧＦＰとの共局在化。（図５Ｃ）ｍＴＯＲＣ２マーカーで染色された、より高倍率のＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰ形質導入切片。（図５Ｄ）ＡＡＶ．ｅＧＦＰ単独で治療され、ｍＴＯＲＣ２マーカーで染色された、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜。（図５Ｅ）ＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰで治療され、カノニカルｍＴＯＲＣ１活性化マーカーであるホスホ－Ｓ６Ｓｅｒ２４０／２４４について染色された、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜の代表的な画像。（図５Ｆ）ｅＧＦＰとの共局在化。（図５Ｇ）ｍＴＯＲＣ１マーカーで染色された、より高倍率のＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰ形質導入切片。（図５Ｈ）ＡＡＶ．ｅＧＦＰ単独で治療され、ｍＴＯＲＣ１マーカーで染色された、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜。 ＡＫＴ３過剰発現が、光受容体の静止を破らないが、ミュラー細胞を活性化することを示す。（図６Ａ～図６Ｃ）未治療、（図６Ｄ～図６Ｆ）ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ単独（２×１０^９ｖｇ）で治療された、または（図６Ｇ～図６Ｉ）ＡＡＶ７ｍ８．ＡＫＴ３（１×１０^９ｖｇ）およびＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）を共注射された、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜断片の代表的な画像。切片を、ＧＦＡＰ（ミュラー細胞マーカー）およびＫｉ６７（細胞増殖マーカー）に対して指向される抗体で染色する。 長期間のＡＫＴ３遺伝子導入が、野生型網膜における慢性ミュラー細胞グリオーシスを刺激することを示す。（図７Ａ～図７Ｃ）未治療、（図７Ｄ～図７Ｆ）ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（２×１０^９ｖｇ）で治療された、ならびに（図７Ｇ～図７Ｉ）ＰＮ１２５でＡＡＶ７ｍ８．ＡＫＴ３（１×１０^９ｖｇ）およびＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）を共注射された、野生型網膜の代表的な画像。切片を、Ｋｉ６７およびＧＦＡＰに対して指向される抗体で染色した。（図７Ｊ）未治療網膜切片とＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療された網膜切片との間の移行帯。（図７Ｋ）未治療領域とＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療領域との間の移行帯。 ＡＫＴ３の光受容体特異的発現が、Ｐｄｅ６ｂ^ｒｄ１０網膜における神経保護を媒介することを示す。（図８Ａ）ベクター発現カセットの描写。ＡＫＴ３導入遺伝子は、光受容体特異的ＧＲＫ１プロモーターによって調節される。治療群間の（図８Ｂ）混合ａ波、（図８Ｃ）混合ｂ波、および（図８Ｄ）錐体ｂ波のＥＲＧ応答の定量化。（図８Ｅ）ＡＡＶ７ｍ８．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３（１×１０^９ｖｇ）で治療されたＰＮ４５ Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０の代表的な断面。ＡＫＴ抗体で標識したＡＫＴ３の光受容体特異的発現。（図８Ｆ）治療群間のＰＮ４５でのＯＮＬ厚さの定量化。データを、平均値±ＳＥＭで表した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３が、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜における反応性グリオーシスを刺激しないことを示す。（図９Ａ～図９Ｃ）ミュラー細胞のためのカノニカルマーカー（ＧＦＡＰ）および細胞増殖のためのカノニカルマーカー（Ｋｉ６７）で染色された、ＰＮ４５での未治療マウス網膜の代表的な画像。（図９Ｄ～図９Ｆ）ＡＡＶ７ｍ８．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３（１×１０^９ｖｇ）およびＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）で共治療されたＰＮ４５ Ｐｄｅ６ｂｒ^ｄ１０網膜の代表的な顕微鏡写真。（図９Ｇ）Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜の未治療部分と注射部分との間の移行領域、および（図９Ｈ）ｅＧＦＰトレーサーとの共局在化。 ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂが、インビトロでｍＴＯＲＣ１を刺激するが、光受容体においては刺激しないことを示す。（図１０Ａ）未治療の８４－３１細胞またはＡＡＶ．ｅＧＦＰもしくはＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂで治療されたものからのｐＳ６^{Ｓｅｒ２４０／２４４}、Ｓ６、およびＧＡＰＤＨ（ローディング対照）の発現を評価するウエスタンブロット。数値は、各治療条件についての生物学的複製を示す。（図１０Ｂ）ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ単独（２×１０^９ｖｇ）を注射され（上側パネル）、またはＡＡＶ７ｍ８．ｃａＲｈｅｂ（１×１０^９ｖｇ）およびＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）を共注射され（下側パネル）、ｐＳ６^{Ｓｅｒ２４０／２４４}に対して指向される抗体で染色された網膜切片の代表的な顕微鏡写真。 長期間のＡＫＴ３遺伝子導入が、野生型動物における網膜組織の乱れにつながることを示す。Ｃ５７Ｂｌ／６（野生型）マウスは、ＰＮ１３で網膜下注射を受けた。（図１１Ａ～図１１Ｂ）ＰＮ１２５での網膜組織学は、ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ単独（２×１０^９ｖｇ）で治療された動物における正常な光受容体構造を明らかにする。（図１１Ｃ～図１１Ｄ）ＡＡＶ７ｍ８．ＡＫＴ３（１×１０^９ｖｇ）と組み合わせてＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ（１×１０^９ｖｇ）を共注射された動物は、網膜層の広範囲にわたる組織の乱れと、光受容体の数および構造の喪失を示す。 ｐＡＡＶ．ＣＡＧ．Ｍｙｒ．ＨＡ．ｈＡＫＴ３（ｐ１１１６）（配列番号１）のベクターマップを示す。 ｐＡＡＶ．ＧＲＫ１．Ｍｙｒ．ＨＡ．ｈＡＫＴ３（ｐ１２９４）（配列番号３）のベクターマップを示す。 ｐ６１８．Ｈｏｐｔ．ＡＫＴ３（配列番号５）のベクターマップを示す。 図１５Ａおよび図１５ＢはｈＡＫＴ３天然（配列番号７）およびｈＡＫＴｏｐｔ（配列番号１３）配列の整列を示し、図１５Ｃは、整列のためのパーセント同一性マトリックスを示す。

ＡＡＶカプシドを有する組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、およびヒトタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）をコードする核酸配列の送達のためにそれらを含む組成物が、本明細書に記載される。眼障害の治療のためのこれらの組成物の使用も提供される。

以下に記載されるように、従来の遺伝子増強戦略を使用したｍＴＯＲシグナル伝達経路の刺激は、遺伝性視力喪失の前臨床モデルにおいて光受容体の死を遅らせ、視覚機能を保持する。プロテインキナーゼＢは、ＡＫＴ１またはＲＡＣ－αセリン／スレオニン－タンパク質キナーゼとも呼ばれ、ｐ５３、ＦｏｘＯ／ＦＨ転写因子、およびＣＲＥＢを含む多様なタンパク質標的のリン酸化を介した細胞生存および生合成応答を担う。ＡＫＴは、代謝、増殖、生存、成長、および血管新生を含む多くの細胞プロセスを調節するＡＫＴキナーゼと呼ばれる３つの密接に関連するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３）で構成される。

本明細書で使用される場合、「ＡＫＴ」という用語は、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、またはＡＫＴ３を指す。「ｈＡＫＴ」という用語は、ヒトＡＫＴのコード配列を指す。特定の実施形態では、ＡＫＴは、ＡＫＴ１を指す。特定の実施形態では、ＡＫＴは、ＡＫＴ２を指す。特定の実施形態では、ＡＫＴは、ＡＫＴ３を指す。さらに、ＡＫＴという用語は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸を指すために本明細書で使用される。ｈＡＫＴ１核酸配列は、配列番号９に見出すことができる。ｈＡＫＴ１のアミノ酸配列は、配列番号１０に見出すことができる。ｈＡＫＴ２核酸配列は、配列番号１１に見出すことができる。ｈＡＫＴ２のアミノ酸配列は、配列番号１２に見出すことができる。ｈＡＫＴ３核酸配列は、配列番号７に見出すことができる。ｈＡＫＴ３のアミノ酸配列は、配列番号８に見出すことができる。特定の実施形態では、ｈＡＫＴコード配列は、配列番号１３に見出されるｈＡＫＴ３コード配列（「ｈＡＫＴｏｐｔ」と称されることもある）などの操作された配列である。

ｈＡＫＴをコードする核酸配列が、本明細書に提供される。一実施形態では、配列番号
１０に見出されるｈＡＫＴ１アミノ酸配列をコードする核酸が提供される。別の実施形態では、配列番号１２に見出されるアミノ酸配列をコードする核酸が提供される。さらに別の実施形態では、配列番号８に見出されるｈＡＫＴ３アミノ酸配列をコードする核酸配列が提供される。ＡＫＴの他のアイソフォームは、当該技術分野において既知であり、本明細書において有用である。

眼障害、およびそれに関連する網膜変性の治療のために哺乳動物対象にヒトタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）をコードする核酸を送達するための組成物および方法が本明細書に記載される。特定の実施形態では、そのような組成物は、配列番号１３に提供されるもの等の操作されたＡＫＴコード配列を含む。導入遺伝子カセットのこの最適化は、天然配列を使用して生成され得るレベルと比較して、実験タンパク質の産生レベルを最大化することが予想される。しかしながら、本明細書には、それぞれ、配列番号９、配列番号１１、および配列番号７に提供される、天然のＡＫＴ１、ＡＫＴ２、またはＡＫＴ３コード配列を含む組成物も包含される。ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、およびＡＫＴ３のいずれかについて実施形態が記載される場合、同様の実施形態が他のものについて列挙されることを意図されることを理解されたい。

本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に含まれる定義は、本明細書の成分および組成物を説明する際の明確さのために提供され、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳動物を意味し、ヒト、獣医学用動物または農業用動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに臨床研究に通常使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。さらに他の好適な対象としては、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類等が挙げられる。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、「患者」と互換的に使用される。

一実施形態では、対象は、子供、すなわち、１８歳未満である。別の実施形態では、対象は、幼児、すなわち、８歳以下である。別の実施形態では、対象は、よちよち歩きの幼児、すなわち、３歳以下である。さらに別の実施形態では、対象は、乳児、すなわち、１歳以下である。さらに別の実施形態では、対象は、新生児（ｎｅｗｂｏｒｎまたはｎｅｏｎａｔｅ）、すなわち、生後１ヶ月以下である。別の実施形態では、対象は、成人、すなわち、年齢またはそれ以上である。さらに別の実施形態では、対象は、より高齢の成人、すなわち、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５歳、またはそれ以上である。

本発明の特定の実施形態では、対象は、「眼障害」を有し、本発明の成分、組成物、および方法が、それを治療するように設計される。特定の実施形態では、対象は、網膜変性を有するか、または網膜変性のリスクがあり、これが眼障害と関連していてもよく、または関連していなくてもよい。本明細書で使用される場合、「眼障害」は、錐体桿体ジストロフィーおよび網膜疾患を含み、限定されないが、シュタルガルト病（常染色体優性または常染色体劣性）、網膜色素変性症、およびパターンジストロフィーを含む。一実施形態では、対象は、網膜色素変性症を有する。一実施形態では、対象は、色覚異常を有する。別の実施形態では、対象は、コロイデレミアまたはＸ連鎖遺伝性網膜変性を有する。別の実施形態では、対象は、眼障害に関連する網膜変性を有する。別の実施形態では、対象は、眼障害に関連しない網膜変性を有する。そのような眼疾患の臨床徴候としては、限定されないが、周辺視野の低下、中心（読み取り）視力の低下、夜間視力の低下、色覚の喪失
、視力の低下、光受容体機能の低下、色素の変化、および最終的に失明が挙げられる。

網膜変性は、その細胞の進行性の死によって引き起こされる網膜の劣化からなる網膜症である。網膜変性には、動脈または静脈の閉塞、糖尿病性網膜症、Ｒ．Ｌ．Ｆ．／Ｒ．Ｏ．Ｐ．（後水晶体線維形成症／未熟児網膜症）、または疾患（通常は遺伝性）を含むいくつかの理由がある。網膜変性の徴候および症状には、限定されないが、視力障害、夜盲症、網膜剥離、光過敏症、視野狭窄、および周辺視野の喪失から全視力喪失までが含まれる。網膜変性およびリモデリングは、網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜疾患、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの遺伝性の環境疾患、ならびに外傷および網膜剥離を含む眼／網膜に対する他の侵襲によって開始される、分子レベル、細胞レベル、および組織レベルでの一群の病理を包含する。これらの網膜変化および見かけの可塑性は、遺伝子発現における変化、デノボ神経発生、および新規シナプスの形成を含む神経の再編およびリプログラミング事象を引き起こし、樹状突起の変化および過剰な軸索成長を介して双極細胞内に破損回路を生成する。加えて、神経細胞移動は、変化した代謝シグナルを示すミュラー細胞の支柱に沿って網膜の垂直軸全体で起こり、網膜色素上皮（ＲＰＥ）が網膜に侵入し、ＲＰ疾患の古典的な臨床観察であった骨小体様色素沈着を形成する（例えば、Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ
ｂｙ Ｂｒｙａｎ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊｏｎｅｓ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｍａｒｃ ａｎｄ Ｒｅｂｅｃｃａ Ｌ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒを参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、対象に利益を与えるために使用される任意の方法を指し、すなわち、眼疾患、障害、または状態のうちの１つ以上の症状または態様を緩和し、発症を遅らせ、重症度もしくは発症率を下げることができるか、または予防をもたらすことができる。本発明の目的のために、治療は、症状の発症前、発症中、および／または発症後に投与することができる。特定の実施形態では、治療は、対象が従来の療法を受けた後に行われる。本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、状態の進行を無効化すること、実質的に阻害すること、遅らせること、または逆転させること、状態の臨床的もしくは美的症状を実質的に改善すること、または状態の臨床的もしくは美的症状の出現を実質的に予防すること、あるいは眼疾患、障害、もしくは状態から生じる１つ以上の症状の重症度および／または頻度を減らすことを含む。

核酸またはアミノ酸配列またはタンパク質に言及する場合に本明細書で使用される「外因性」という用語は、その核酸またはアミノ酸配列またはタンパク質が、染色体または宿主細胞に存在する位置では天然に存在しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象に由来し、それらに挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下）で存在する配列を指す。

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。プラスミド、発現カセット、もしくはベクターのタンパク質もしくは核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、そのタンパク質または核酸が、問題のタンパク質または核酸が天然には同じ関係で見出されないタンパク質または核酸とは別の配列もしくはサブ配列とともに存在することを示す。

核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ＡＫＴコード配列の全長、または少なくとも約１００～１５０ヌクレオチドの断片、または望ましいものであり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの
、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。多重配列整列プログラムもまた、核酸配列に対して利用可能である。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。一般的に利用可能な配列解析ソフトウェア、より具体的には、公開データベースによって提供されるＢＬＡＳＴまたは解析ツールも使用され得る。同様に、「パーセント配列同一性」などは、タンパク質の全長にわたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約４５０アミノ酸長であり得る。

「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、その後、天然系の同時に存在する物質の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然系にその後に再導入されたとしても、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではないという点で、依然として単離されている。

「操作された」とは、組み立てられ、任意の適切な遺伝子エレメント（例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなど）に配置される、本明細書に記載のＡＫＴタンパク質をコードする核酸配列を意味し、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、またはパッケージング宿主細胞内でウイルスベクターを生成するために、および／または対象において宿主細胞に送達するために、それらに含まれるＡＫＴ配列を宿主細胞に導入する。一実施形態では、遺伝子エレメントは、プラスミドである。かかる操作された構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、組換えプラスミドまたは産生プラスミド、ベクター、または宿主細胞におけるプロモーターまたは発現制御配列の制御下にある、外因性または操作されたタンパク質コード核酸配列を指す。特定の実施形態では、導入遺伝子は、機能的Ａｋｔタンパク質をコードするヒトタンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）配列である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号８に示されるＡＫＴアミノ酸配列をコードする核酸である。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号７に記載の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１０に示されるＡＫＴアミノ酸配列をコードする核酸である。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号９に記載の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１２に示されるＡＫＴアミノ酸配列をコードする核酸である。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１１に記載の配列によってコードされる。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１３に記載の配列によってコードされる。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番
号７、９、１１、または１３と少なくとも７０％の同一性を共有する配列である、操作されたＡＫＴコード配列である。例えば、配列番号１３は、配列番号７と約７５％の同一性を共有する（図１５Ａ～図１５Ｃに提供されるアラインメントおよびパーセント同一性マトリックスを参照されたい）。天然配列のさらなる修飾は、本明細書に記載されるように、本発明によって企図される。

一実施形態では、ＡＫＴをコードする核酸配列は、それに共有結合したタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。タグポリペプチドは、限定されないが、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、Ｍｙｃ－ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタグポリペプチド、フラグタグポリペプチド、ｍｙｒ（ミリストイル化）ポリペプチド、およびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドを含む既知の「エピトープタグ」から選択され得る。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１または配列番号３に見出されるＭＹＲタグを含む。

本明細書で使用される「ベクター」は、その中に外因性もしくは異種もしくは操作された核酸導入遺伝子が挿入されていてもよく、次いで、適切な宿主細胞に導入され得る核酸分子である。ベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞が、ベクターを有しない細胞から選択され得る簡便な手段を有し、例えば、それらが薬物耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および（主に酵母および細菌における）「人工染色体」を含む。特定のプラスミドは、本明細書に記載されている。

「ウイルスベクター」は、外因性または異種ＡＫＴ核酸導入遺伝子を含む複製欠損ウイルスとして定義される。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、宿主細胞への送達および／またはウイルスベクターの産生のために使用されるプラスミド上で操作され得る。好適なウイルスベクターは、好ましくは複製欠損であり、眼細胞を標的とするものの中から選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、パルボウイルスなどを含むが、これらに限定されない、遺伝子療法に好適な任意のウイルスを含み得る。しかしながら、理解しやすいように、アデノ随伴ウイルスが、本明細書において、例示的なウイルスベクターとして言及される。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされ、そのウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列が複製欠損である（すなわち、後代ビリオンを生成することはできないが、標的細胞を感染させる能力は保持している）、合成または組換えウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作され得る）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

さらに別の実施形態では、発現カセット（本明細書に記載されるもののいずれかを含む）が使用され、組換えＡＡＶゲノムを生成する。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、組換えＡＡＶが産生プラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語
は、導入遺伝子の発現が望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合）によって細胞に導入された外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを含む原核細胞または真核細胞を指す。本明細書の特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載される組成物のインビトロ評価のための様々な哺乳動物種の眼細胞の培養物を指す。さらに他の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、眼疾患のためにインビボで治療される対象の眼細胞を指すことが意図される。

本明細書で使用される場合、「眼細胞」という用語は、眼内の任意の細胞、または眼の機能に関連する任意の細胞を指す。この用語は、桿体光受容体、錐体光受容体および感光性神経節細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、脈絡叢細胞、双極細胞、水平細胞、および無軸索細胞を含む、光受容体細胞のいずれか１つを指し得る。一実施形態では、眼細胞は、光受容体細胞である。別の実施形態では、眼細胞は、ＲＰＥ細胞である。

「プラスミド」は、一般に、当業者によく知られている標準的な命名規則に従って、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字によって、本明細書で命名される。本発明に従って使用することができる多くのプラスミド、および他のクローニングおよび発現ベクターは、当業者に周知であり、容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明における使用に好適な任意の数の他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明におけるかかるプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構造、および使用は、本開示の当業者には容易に明らかとなるであろう。

本明細書で使用される場合、「転写制御配列」または「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列などのＤＮＡ配列を指し、それらが作動可能に連結しているタンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、またはその他の方法で制御する。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」または「作動可能に会合する」という用語は、転写およびその発現を制御するためにトランスで、もしくは所定距離でＡＫＴをコードする核酸配列および／または発現制御配列に連続している両方の発現制御配列を指す。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」または「ＡＡＶ血清型」という用語は、数十種の天然に存在し、かつ利用可能なアデノ随伴ウイルス、ならびに人工ＡＡＶを指す。ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、または操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織および動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、および他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８およびＡＡＶＡｎｃ８０、既知のもしくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、または未だ発見されていないＡＡＶもしくはそのバリアント、またはそれらの混合物を含む任意のＡＡＶから容易に選択され得る。例えば、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、双極細胞を優先的に標的とする、ＡＡＶ８ｂｐカプシドである。例えば、ＷＯ２０１４／０２４２８２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、外側網膜への優先的な送達を示したＡＡＶ７ｍ８カプシドである。Ｄ
ａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎ Ｖｉｖｏ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｕｔｅｒ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｒｏｍ
ｔｈｅ Ｖｉｔｒｅｏｕｓ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８９ｒａ７６（２０１３）を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。別の実施形態では、ＡＡＶカプシド ＡＡＶ９カプシド。別の実施形態では、ＡＡＶカプシド ＡＡＶ５カプシド。別の実施形態では、ＡＡＶカプシド ＡＡＶ２カプシド。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して言及する場合、「バリアント」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列にわたって少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはさらに大きな配列同一性を共有するものを含め、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載または既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／または当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ得る。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８ ｖｐ３と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２カプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、自己相補的ＡＡＶが使用される。

ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離または操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、または公的資源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、または入手することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献またはデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなど）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性および粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することが可能になる。

本明細書で使用される場合、「人工ＡＡＶ」は、限定されないが、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、擬似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得るが、これらに限定されない。１つのＡＡＶのカプシドタンパク質が異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／７ｍ８は、例示的な擬似型ベクターである。

「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染時には、第２の鎖の細胞介在合成を待つのではなく、ｓｃＡ
ＡＶの２つの相補的片割れが会合して、即時の複製および転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，「Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ
１６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、および同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。

「投与」または「投与経路」は、選択された組成物の送達に好適であり、眼疾患を特徴とする選択された標的細胞に有効量を送達することができる任意の既知の投与経路を含む。本発明の方法で有用な投与経路には、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、舌下、眼内注射、網膜下注射、硝子体内注射、デポー製剤またはデバイス経由、点眼剤経由、吸入によるものの１つ以上が含まれる。特定の実施形態では、本方法は、網膜下注射によって組成物をＲＰＥ、光受容体細胞、および／または他の眼細胞に送達することを伴う。特定の実施形態では、眼細胞への硝子体内注射を用いる。さらに他の実施形態では、眼細胞への眼瞼静脈を介した注射が用いられる。さらに他の投与方法は、本開示を考慮して、所与の当業者によって選択され得る。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、周期的に繰り返される。本明細書に記載の医薬組成物は、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。本明細書に記載の核酸分子および／またはベクターは、単一の組成物または複数の組成物で送達されてもよい。任意選択で、２つ以上の異なるＡＡＶが送達されるか、または複数のウイルスが送達されてもよい［例えば、ＷＯ２０ ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。別の実施形態では、複数のウイルスは、単独で、またはタンパク質と組み合わせて、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有し得る。

本明細書に記載の特定の組成物は、ヒトＡＫＴをコードする配列を提供する、単離された、または合成もしくは組換え操作された核酸配列である。一実施形態では、ヒトＡＫＴをコードする単離または操作された核酸配列が提供される。特定の実施形態では、配列は、エピトープタグなどのマーカーの追加を可能にする１つ以上の追加の制限部位を含む。天然核酸配列と整列させた場合、ＡＫＴをコードする操作された配列は、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％（それらの範囲のいずれかの間の任意の整数を含む）のパーセント同一性を有し得る。一実施形態では、ＡＫＴをコードする操作された配列は、少なくとも５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の天然配列とのパーセント同一性を有する。

ＡＫＴタンパク質の発現のために配列番号７を使用する様々な発現カセットが提供される。一実施形態では、そのような発現カセットを含有するプラスミドの一例を、配列番号１に示す。一実施形態では、そのような発現カセットを含有するプラスミドの一例を、配列番号３に示す。別の実施形態では、発現カセットは、Ｍｙｒタグを含まない。ＡＫＴタンパク質の発現に配列番号１３を用いた発現カセットを配列番号５に示す。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、ＡＫＴタンパク質についてのコード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含んでいても
よく、カセットは、遺伝子エレメントまたはプラスミド内で操作されてもよく、および／またはウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）内にパッケージングされてもよい。一実施形態では、発現カセットは、ＡＫＴをコードする操作された核酸配列を含む。一実施形態では、発現カセットは、宿主細胞におけるＡＫＴコード配列および／または遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列と作動可能に連結されたＡＫＴコード配列を含む。

「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、およびＡＡＶカプシド内にパッケージされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」または「複製欠損ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子および調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’および３’最末端に位置する。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の実施例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、または完全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能またはトランス相補ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。さらに、他のＩＴＲが使用され得る。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する制御配列を含む。

様々なプラスミドは、ｒＡＡＶベクターを産生するために使用するための当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される組成物および方法に有用である。産生プラスミドは、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞内で培養される。宿主細胞では、各ｒＡＡＶゲノムがレスキューされ、カプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質内にパッケージングされ、感染性ウイルス粒子を形成する。一実施形態では、産生プラスミドは、本明細書に記載されているもの、またはＷＯ２０１２／１５８７５７（参照により本明細書に援用される）に記載されている通りである。

産生プラスミドの１つの種類は、配列番号１および図１２に示されるものであり、ｐＡＡＶ．ＣＡＧ．ｍｙｒ．ｈＡＫＴ３と称される。別の産生プラスミドを、配列番号２および図１３に示す。さらに別の産生プラスミドを、配列番号３および図１４に示す。かかるプラスミドは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列と、選択されたプロモーターと、ポリＡ配列と、３’ＩＴＲとを含有するものである。ＡＫＴをコードする核酸配列は、選択されたプロモーターとポリＡ配列との間に挿入される。特定の実施形態では、産生プラスミドは、ベクタープラスミド産生効率を最適化するように修飾される。かかる修飾は、本明細書において企図される。他の実施形態では、ターミネーターおよび他の配列は、プラスミドに含まれる。

なおさらなる実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本明細書に記載のＡＫＴ構築物および配列の送達のために提供される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む核酸配列と、ヒトタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）をコードする核酸配列と、宿主細胞におけるＡＫＴの発現を指示する発現制御配列とを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中に、標的細胞に送
達するための核酸配列がパッケージングされている。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３からなり、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上に特定されたＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、ＡＡＶが選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターで使用するためのＡＡＶカプシドは、前述のＡＡＶカプシドまたはそのコード核酸のうちの１つの突然変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換による）によって生成され得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、前述のＡＡＶカプシドタンパク質のうちの２つまたは３つまたは４つまたはさらに多くのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ由来のｖｐｌ、ｖｐ２、およびｖｐ３モノマーのモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、前述のカプシドタンパク質のうちの１つより多くを含む。

発現カセットまたはｒＡＡＶゲノムまたは産生プラスミドをビリオン内にパッケージングするために、ＩＴＲは、導入遺伝子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。一実施形態では、複製（ｒｅｐ）および／またはカプシド（ｃａｐ）のコード配列は、ＡＡＶゲノムから除去され、トランスで供給されるか、またはＡＡＶベクターを生成するためにパッケージング細胞株によって供給される。例えば、上述のように、擬似型ＡＡＶは、ＡＡＶカプシドの供給源とは異なる供給源からのＩＴＲを含有し得る。これに加えて、または代替的に、キメラＡＡＶカプシドが利用される。さらに他のＡＡＶ成分が選択され得る。かかるＡＡＶ配列の供給源は、本明細書に記載されており、単離または操作されてもよく、学術的、商業的、または公的な供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手されてもよい。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献またはデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）など）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して入手されてもよい。

対象に送達するのに適したＡＡＶウイルスベクターを生成し、単離するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ ２００３／０４２３９７、ＷＯ ２００５／０３３３２１、ＷＯ
２００６／１１０６８９、およびＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。１つの系では、プロデューサー細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物と、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする構築物によって一過性にトランスフェクトされる。第２の系では、ｒｅｐおよびｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物によって一過性にトランスフェクトされる。これらの系の各々において、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ｒＡＡＶを汚染ウイルスから分離することを必要とする。より最近では、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスによる感染を必要としない系が開発されており、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、およびＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、トランスで系によって供給される。これらのより新しい系では、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性にトランスフェクションすることによって供給することができ、またはヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むように細胞を操作することができ、その発現が、転写レベルまたは転写後レベルで制御することができる。

さらに別の系では、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルス由来のベクターによる感染によって、昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関する概説については、一般的に、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉ
ｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９（その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。これらおよび他のＡＡＶ生産系の製造方法および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。

本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本発明を限定しない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

本明細書に提供されるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドと、上述のようなＡＫＴをコードする配列を有するＡＡＶ発現カセットとを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセットは、ＡＡＶ逆方向末端反復配列と、ＡＫＴをコードする核酸配列と、宿主細胞におけるコードされたタンパク質の発現を指示する発現制御配列とを含む。ｒＡＡＶ発現カセットは、他の実施形態では、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ、および転写後調節エレメントのうちの１つ以上をさらに含む。眼への送達のための医薬組成物で使用するためのそのようなｒＡＡＶベクターは、本明細書に記載されるものを含む多くの既知のＡＡＶのうちのいずれかに由来するカプシドを用いてもよい。

本明細書に提供される発現カセットおよびベクターの他の従来の成分は、特定の種に対して、例えば、本明細書に記載されるようなコドン最適化を含む当該技術分野で既知の技術を使用して最適化することができる。本明細書に記載されるカセット、ベクター、プラスミド、ウイルス、または他の組成物の成分は、発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含む。別の実施形態では、プロモーターは、細胞特異的である。「細胞特異的」という用語は、組換えベクターに対して選択される特定のプロモーターが、特定の眼細胞の１種類以上においてＡＫＴ導入遺伝子の発現を指示することができることを意味する。一実施形態では、プロモーターは、光受容体細胞における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、桿体および錐体における発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、桿体における発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、錐体における発現に特異的である。一実施形態では、光受容体特異的プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼプロモーターである。ロドプシンキナーゼプロモーターは、桿体および錐体の両方で活性であることが示されている。例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ Ｂｏｔｈ Ｒｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｅｓ Ｒｅｓｃｕｅｓ Ｒｅｔｉｎａｌ
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＡＩＰＬ１ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎｕａｒｙ；１７（１）：１１７－１３１を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、プロモーターは、クローニングを容易にするために、１つ以上の制限部位を添加するように修飾される。

さらに他の実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、クローニングのために末端に制限を含むように修飾される。例えば、Ｎａｔｈａｎｓ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，ＰＮＡＳ，８１：４８５１－５（Ａｕｇｕｓｔ １９８４）を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に援用される）。別の実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターの一部または断片である。別の実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターのバリアントである。

他の例示的なプロモーターとしては、ヒトＧタンパク質共役受容体プロテインキナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３２７５８０）が挙げられる。別の実施形態では、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターの２９２ｎｔ断片（１７９３～２０８７位）である（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０ １７：１１６２－７４を参照されたい）。一実施形態では、プロモーターは、配列番号３のｎｔ１４２７～１７９０のＧＲＫ１プロモーターである。別の好ましい実施形態では、プロモーターは、ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質近位（ＩＲＢＰ）プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ｈＩＲＢＰプロモーターの２３５ｎｔ断片である。一実施形態では、プロモーターは、ＲＰＧＲ近位プロモーターである（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ，ＩＯＶＳ，Ｍａｙ ２１０２、その全体が参照により援用される）。本発明において有用な他のプロモーターとしては、限定されないが、桿体オプシンプロモーター、赤緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－β－ホスホジエステラーゼプロモーター（Ｑｇｕｅｔａ
ｅｔ ａｌ，ＩＯＶＳ，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０００ Ｄｅｃ；４１（１３）：４０５９－６３）、マウスオプシンプロモーター（上に引用されたＢｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ ２０１０）、ロドプシンプロモーター（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，Ｊｕｌｙ ２０１１，１８（７）：６３７－４５）、錐体トランスデューシンのアルファ－サブユニット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｄｅｖ，Ｂｉｏｌ，Ｊａｎ ２０１１，１１：３）、ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Ｎｉｃｏｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，Ｄｅｃ ２００７，９（１２）：１０１５－２３）、ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Ｌａｍｂａｒｄ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，Ｏｃｔ．２０１０，５（１０）：ｅ１３０２５）、ＲＰＥ６５プロモーター、網膜変性遅型／ペリフェリン２（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１０ Ａｕｇ；９１（２）：１８６－９４）、およびＶＭＤ２プロモーター（Ｋａｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９（２０：３１－９））が挙げられる。これらの文書の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。別の実施形態では、プロモーターは、ヒトヒトＥＦ１αプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼ、光受容体間結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、錐体オプシンプロモーター（赤緑、青）、赤緑錐体遺伝子座制御領域を含む錐体オプシン上流配列、錐体トランスデューシング、ならびに転写因子プロモーター（神経網膜ロイシンジッパー（Ｎｒｌ）および光受容体特異的核内受容体Ｎｒ２ｅ３、ｂＺＩＰ）から選択される。

他の実施形態では、プロモーターは、偏在性または構成的プロモーターである。好適なプロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを有するハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。別の実施形態では、ＣＭＶエンハンサー配列を有するニワトリベータアクチンプロモーターは、配列番号１のｎｔ１４４３～３１０４である。さらに別の実施形態では、ＣＭＶエンハンサー配列を有するニワトリベータアクチンプロモーターは、配列番号５のｎｔ１４９３～２０７５である。別の実施形態では、プロモーターは、ＣＢ７プロモーターである。他の好適なプロモーターとしては、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子－１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。例えば、Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ，（Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ
ＯＮＥ ９（８）：ｅ１０６４７２を参照されたい。さらに他の好適なプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーターが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）。あるいは、生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載される発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド、およびウイルスに利用され得る。一実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶベクターのサイズ制限に起因して、１０００ｂｐ未満の小さなサイズのプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、４００ｂｐ未満である。他のプロモーターは、当業者により選択され得る。一実施形態では、ＡＫＴ構築物は、ＣＭＶエンハンサーエレメントを有するＣＢＡプロモーターを含む。別の実施形態では、ＡＫＴ構築物は、ＧＲＫ１プロモーターを含む。一実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターは、配列番号３のｎｔ１４２７～１７９０に示されるものである。

特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、ラパマイシン／ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）プロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、およびテトラサイクリン応答性プロモーター、またはヘテロ二量体リプレッサースイッチを含む既知のプロモーターから選択され得る。例えば、Ｓｏｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎ Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｏｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５ Ｎｏｖ ２４；５：１７１０５およびＤａｂｅｒ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ Ｍ．，Ａ
ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ａｕｇ ２８；３９１（４）：６６１－７０，Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２１を参照されたい（両方とも、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。

他の実施形態では、本明細書に記載のカセット、ベクター、プラスミド、およびウイルス構築物は、他の好適な転写開始配列、終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、ＴＡＴＡ配列、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、イントロン、タンパク質の安定性を増強させる配列を含み、所望な場合、コードされた産物の分泌を増強させる配列を含み得る。発現カセットまたはベクターは、本明細書に記載されるエレメントを含まなくてもよく、いずれか１つ以上を含んでいてもよい。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡ、およびＴＫポリＡが含まれる。好適なエンハンサーの例には、例えば、特に、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファ１－マイクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が含まれる。一実施形態では、正しい開始コドンからの翻訳を増強するために、導入遺伝子コード配列の上流にＫ
ｏｚａｋ配列が含まれる。別の実施形態では、ＣＢＡエクソン１およびイントロンは、発現カセットに含まれる。一実施形態では、導入遺伝子は、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下に置かれる。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター、およびイントロン１配列に隣接するＣＢＡエクソン１からなる。

特定の実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１、ｎｔ３１２１～３１２９）である。

特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲと、ＣＢＡプロモーターと、ＣＭＶエンハンサーと、ヒトＡＫＴ３コード配列（配列番号７）と、ｂＧＨポリＡと、３’ＩＴＲとを含む。

特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲと、ｈＧＲＫ１プロモーターと、ヒトＡＫＴ３配列（配列番号７）と、ｂＧＨポリＡと、３’ＩＴＲとを含む。

特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲと、ＣＢＡプロモーターと、ＣＭＶエンハンサーと、操作されたヒトＡＫＴ３配列（配列番号１３）と、ｂＧＨポリＡと、３’ＩＴＲとを含む。

特定の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲと、ｈＧＲＫ１プロモーターと、操作されたヒトＡＫＴ３配列（配列番号１３）と、ｂＧＨポリＡと、３’ＩＴＲとを含む。

特定の実施形態では、これらの核酸配列、ベクター、発現カセット、またはｒＡＡＶウイルスベクターは、本明細書に記載されており、医薬組成物において有用であり、薬学的に許容される担体、緩衝液、希釈剤、および／またはアジュバントなども含む。かかる医薬組成物は、例えば、組換え操作されたＡＡＶまたは人工ＡＡＶによる送達を通じて、眼細胞においてＡＫＴを発現させるために使用される。

核酸配列、ベクター、発現カセットおよびｒＡＡＶウイルスベクターを含有するこれらの医薬組成物を調製するために、配列またはベクターまたはウイルスベクターを、好ましくは、従来の方法による汚染について評価し、次いで、眼への投与に好適な医薬組成物に製剤化する。そのような製剤は、適切な生理学的レベルでｐＨを維持するために、薬学的および／または生理学的に許容されるビヒクルまたは担体、特に、緩衝生理食塩水または他の緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳなどの眼への投与に好適なビヒクルまたは担体、ならびに任意選択で、他の医薬薬剤、薬剤、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈剤などの使用を伴う。注射に関して、担体は、典型的には液体である。例示的な生理学的に許容される担体としては、滅菌された発熱性物質除去水および滅菌され、発熱性物質除去され、リン酸緩衝化された生理食塩水が挙げられる。様々なかかる既知の担体が、参照により本明細書に援用される米国特許公開第７，６２９，３２２号に提供される。一実施形態では、担体は、等張性塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は、平衡塩溶液である。一実施形態では、担体は、ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存する場合は、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結させ得る。

１つの例示的な特定の実施形態では、担体または賦形剤の組成物は、０．０００１％～０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＦ６８）を含む１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．３を含有する。緩衝液の生理食塩水成分の正確な組成は、１６０ｍＭ～１８０ｍＭのＮａＣｌの範囲である。任意選択で、具体的に記載される緩衝液の代わりに、異なるｐＨ緩衝液（潜在的には、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム、ＴＲＩＳ）を使用する。さらに代替的に、０．９％ＮａＣｌを含有する緩衝液が有用である。

任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび／またはバリアントおよび担体に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含有する。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）、ベクターゲノム（「ＶＧ」）、またはウイルス粒子の定量化は、製剤または懸濁液に含まれる用量の尺度として使用され得る。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶのＧＣ数滴定を行うための１つの方法は、以下の通りである。精製されたＡＡＶベクター試料は、まずＤＮａｓｅで処理され、非カプシド化ＡＡＶゲノムＤＮＡまたは産生プロセスからの汚染プラスミドＤＮＡを排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理して、カプシドからゲノムを放出させる。次に、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを使用したリアルタイムＰＣＲによって、放出されたゲノムを定量化する。別の方法では、ＡＫＴ導入遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効用量は、Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８８
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（参照によりその全体が援用される）に記載されるように測定される。

本明細書で使用される場合、「投薬量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投薬量、あるいは単一の単位（または複数の単位もしくは分割投薬量）投与で送達される量を指し得る。医薬ウイルス組成物は、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内（その範囲内のすべての整数または分数量を含む）である、本明細書に記載されるＡＫＴをコードする核酸配列を保有する複製欠損ウイルスの量を含むように投薬量単位で製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、または９ｘ１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１１、２ｘ１０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、または９ｘ１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、または９ｘ１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、または９ｘ１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、または９ｘ１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、または９ｘ１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり１×１０^１０～
約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。すべての投薬量は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ
ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１（それらは参照により本明細書に援用される）に記載されるように、ｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるものを含む、任意の既知の方法によって測定されてもよい。

これらの上述の用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の（範囲内のすべての数を含む）様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。

特定の実施形態では、ウイルス構築物は、マウスなどの小動物対象について、約１μＬ～約３μＬの容量で、約１×１０^９～約１×１０^１１ＧＣの用量で送達される。ヒトの眼とほぼ同じサイズの眼を有する、より大きな獣医学的対象の場合、上述のより大きなヒト投薬量および容量が有用である。種々の獣医学的動物への物質の投与に関する良好な慣行の議論については、例えば、Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５－２３（２００１）を参照されたい。本文書は、参照により本明細書に援用される。

ウイルスまたは他の送達ビヒクルの最低有効濃度を、毒性、網膜異形成、および剥離などの望ましくない影響のリスクを減らすために利用することが望ましい。これらの範囲におけるさらに他の投薬量は、治療される対象（好ましくはヒト）の身体状態、対象の年齢、特定の眼障害、および進行性である場合、障害が発症した程度を考慮して、主治医によって選択され得る。

特定の態様では、眼障害を有するか、または眼障害を発症するリスクがある哺乳動物対象における失明を治療し、失明の進行を遅らせ、または停止させるための方法が本明細書に記載される。一実施形態では、対象は、網膜変性を有する。特定の実施形態では、好ましくは生理学的に適合する担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントに懸濁されたＡＫＴ配列を保有するｒＡＡＶは、所望の対象（例えば、ヒト対象）に投与される。本方法は、それを必要とする対象に、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクター、もしくはｒＡＡＶベクター、またはこれらを含有する組成物のいずれかを投与することを含む。特定の実施形態では、組成物は、網膜下に送達される。別の実施形態では、組成物は、硝子体内に送達される。さらに別の実施形態では、組成物は、眼疾患の処置に好適な投与経路の組み合わせを使用して送達され、これには、眼底静脈を介した
投与、または他の静脈内投与もしくは従来の投与経路が含まれるが、これらに限定されない。

これらの方法での使用のために、各投薬量の容量およびウイルス力価は、本明細書にさらに記載されるように、個々に決定され、同じ眼または反対側の眼で実施される他の治療と同じであってもよく、または異なっていてもよい。投薬量、投与、およびレジメンは、本明細書の教示を考慮して、主治医によって決定され得る。特定の実施形態では、組成物は、上に列挙されるものから選択される単回用量で投与され、単一の罹患した眼に投与される。他の実施形態では、組成物は、上に列挙されるものから選択される単一の用量として、両方の罹患した眼に、同時に、または逐次投与される。逐次投与は、数分間、数時間、数日間、数週間、または数ヶ月間の間隔からの時間ギャップの片方の眼から別の眼への投与を意味し得る。他の実施形態では、本方法は、組成物を２つ以上の投薬量（例えば、分割投薬量）で眼に投与することを伴う。別の実施形態では、複数回の注射は、同じ眼の異なる部分で行われる。別の実施形態では、選択された発現カセット（例えば、ＡＫＴ含有カセット）を含むｒＡＡＶの第２の投与は、後の時間点で実行される。そのような時間点は、第１の投与の数週間後、数ヶ月後、または数年後であり得る。かかる第２の投与は、一実施形態では、第１の投与からのｒＡＡＶとは異なるカプシドを有するｒＡＡＶで実施される。別の実施形態では、第１および第２の投与のためのｒＡＡＶは、同じカプシドを有する。

さらに他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、単一の組成物または複数の組成物で送達される。任意選択で、２つ以上の異なるＡＡＶが送達されるか、または複数のウイルスが送達される［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。別の実施形態では、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶおよびアデノウイルス）を含有する。

特定の実施形態では、治療の標的となる眼の領域（例えば、桿体および錐体光受容体）を特定するために、非侵襲的網膜撮像および機能的研究を行うことが望ましい。これらの実施形態では、臨床診断試験を用いて、１つ以上の網膜下注射の正確な位置を決定する。これらの試験には、治療される対象の種、身体状態、および投薬量に応じて、例えば、網膜電図写真（ＥＲＧ）、網膜の層の周辺のトポグラフィックマッピング、ならびに共焦点レーザー走査眼底検査（ｃＳＬＯ）および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によるその層の厚さの測定、補償光学（ＡＯ）による錐体密度のトポグラフィックマッピング、機能的眼検査などが含まれる。実施される撮像および機能的研究を鑑みると、特定の実施形態では、罹患した眼の異なる領域を標的とするために、１つ以上の注射が同じ眼で実施される。各注射の容量およびウイルス力価は、本明細書にさらに記載されるように、個々に決定され、同じ眼または反対側の眼で実施される他の注射と同じであってもよく、または異なっていてもよい。別の実施形態では、単一の、より大きな容量の注射は、眼全体を治療するために行われる。一実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の容量および濃度は、損傷を受けた眼細胞の領域のみに影響を与えるように選択される。別の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の容量および／または濃度は、損傷を受けていない光受容体を含め、眼のより大きな部分に到達するように、より多くの量である。

本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物の単回の眼内送達、例えば、ＡＫＴ発現カセットのＡＡＶ送達は、眼障害または網膜変性を発症するリスクがある対象における視力喪失および失明の予防に有用である。

特定の実施形態では、組成物は、疾患発症の前に投与される。他の実施形態では、組成物は、視力障害または視力喪失の開始前に投与される。他の実施形態では、組成物は、視力障害または喪失の開始後に投与される。さらに他の実施形態では、組成物は、疾患のな
い眼（例えば、反対側の眼）と比較して、桿体および／または錐体または光受容体の９０％未満が機能しているか、または残っているときに投与される。

特定の実施形態では、本方法は、追加の研究、例えば、機能的研究および撮像研究を実施して、治療の有効性を決定することを含む。動物の場合、そのような試験には、桿体および錐体光受容体機能を見る網膜電位図（ＥＲＧ）による網膜および視覚機能の評価、視覚運動性眼振、瞳孔測定、水迷路試験、明暗嗜好、光干渉断層撮影（網膜の様々な層の厚さを測定するため）、組織学（網膜の厚さ、外側核層の核の列、導入遺伝子発現を記録するための免疫蛍光、錐体光受容体カウント、錐体光受容体の鞘部分を特定するピーナッツアグルチニンによる網膜切片の染色）が含まれる。

具体的には、ヒト対象について、本明細書に記載の組成物の投薬量の投与後、対象は、網膜電位図（ＥＲＧ）を使用して治療の有効性について試験され、桿体および錐体光受容体機能、瞳孔測定による視力評価、コントラスト感度色覚試験、視野試験（ハンフリー視野／ゴールドマン視野）、視野移動試験（障害物コース）、および／または読み取り速度試験を行う。本明細書に記載の医薬組成物による治療後に対象が受ける他の有用な治療後有効性試験としては、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、全視野光過敏性試験、光干渉断層撮影を含む網膜構造試験、眼底撮影、眼底自発蛍光（ＦＡＦ）、補償光学レーザー操作眼底検査、移動性試験、読み取り速度および精度の試験、マイクロペリメトリーおよび／または眼底検査が挙げられる。これらおよび他の有効性試験は、米国特許第８，１４７，８２３号および同時係属中の国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０１１２１０またはＷＯ２０１４／１２４２８２に記載されており、参照により本明細書に援用される）。

さらに他の実施形態では、上述の方法のいずれかは、別の療法、または二次療法と組み合わせて実施される。さらに他の実施形態では、これらの眼疾患の治療方法は、抗生物質治療、疼痛に対する緩和治療などの別の治療と組み合わせて、本明細書に詳細に記載される組成物で対象を治療することを伴う。追加の療法は、これらの変異もしくは欠陥、またはそれらの関連する影響のいずれかを予防し、阻止し、または改善するのに役立つ任意の既知の療法、または未だ知られていない療法であり得る。二次療法は、上に記載の組成物の投与の前、投与と同時、または投与の後に投与することができる。特定の実施形態では、二次療法は、神経栄養因子、抗酸化剤、抗アポトーシス剤の投与など、網膜細胞の健康を維持するための非特異的アプローチを含む。非特異的アプローチは、タンパク質、組換えＤＮＡ、組換えウイルスベクター、幹細胞、胎児組織、または遺伝子組換え細胞の注射によって達成される。後者は、カプセル化された遺伝子組換え細胞を含むことができる。

特定の実施形態では、組換えｒＡＡＶを生成する方法は、上述のＡＡＶ発現カセットを含むプラスミドを得ることと、ＡＡＶウイルスゲノムを感染性ＡＡＶエンベロープまたはカプシド内にパッケージングすることを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下で、プラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することとを含む。ｒＡＡＶベクター生成の特定の方法は、上に記載されており、上記および以下の実施例で記載される発現カセットまたはベクターゲノムを送達することができるｒＡＡＶベクターを生成する際に使用される。

さらに他の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットのいずれかを含むベクターが提供される。上述のように、そのようなベクターは、様々な起源のプラスミドであってもよく、本明細書にさらに記載されるような組換え複製欠損ウイルスの生成のために特定の実施形態で有用である。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少な
くとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％の変動性を意味する。本明細書で使用される「調節」またはその変形形態という用語は、生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する組成物の能力を指す。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

２５０を超える既知の遺伝子内の変異は、遺伝性網膜変性に関連する。ＲＰＥ６５変異に起因する先天性失明の遺伝子置換療法後の臨床的成功は、他の形態の遺伝性眼疾患を標的とする下流治療の開発のためのプラットフォームを確立する。残念ながら、複雑な疾患病理学に関連するいくつかの課題および現在の遺伝子導入技術の制限は、遺伝性網膜変性の各特定の形態に関する関連戦略の開発を妨げる。ここでは、光受容体の生存および構造維持に必要な嫌気性代謝の特徴を刺激することにより、網膜変性を遅らせる遺伝子増強戦略について説明する。本願発明者らは、網膜色素変性症のマウスモデルにおけるＡＡＶ媒介性遺伝子増強を伴うカノニカルインスリン／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路における２つの重要な調節点を標的とした。セリン／スレオニンキナーゼであるＡＫＴ３を発現するＡＡＶベクターは、光受容体の数、構造、および部分的な視覚機能の劇的な保存を促進する。この保護効果は、細胞成長および生存に関連する経路に対する光受容体代謝のリプログラミングの成功と関連していた。まとめると、これらの所見は、光受容体の生存および維持における嫌気性代謝に関連するＡＫＴ活性および下流経路の重要性を強く主張する。

実施例１：材料および方法：
動物
Ｃ５７Ｂｌ／６およびＰｄｅ６ｂｒｄ１０マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、１２時間の明暗サイクルで育てた。動物は、実験動物のケアおよび使用に関するＡＲＶＯガイドライン、ならびに施設および連邦規制に準拠して、ペンシルベニア大学に収容された。

ＡＡＶベクター
Ｎ末端ミリストイル化（ＭＹＲ）およびＨＡタグを含有するヒトＡＫＴ３ ｃＤＮＡ配列をコードするプラスミドは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｅｌｌｅｒｓによって親切にも提供された（ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号９０１７）。ＭＹＲ－ＨＡ－ｈＡＫＴ３配列を増幅し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングシステム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用してＡＡＶプロウイルス発現プラスミドにクローニングした。ヒトＲｈｅｂ ｃＤＮＡクローンは、Ｏｒｉｇｅｎｅから入手した。逆ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、以下のプライマー
配列を有するＳ１６Ｈ変異を作成した。５’［ホスホ］ＣＡＣＧＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＡＣ ３’（Ｓ１６Ｈ Ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１４）および５’ ＣＣＧＧＴＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴ ３’（配列番号１５）。次いで、Ｓ１６Ｈ変異を含有するヒトＲｈｅｂ ｃＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングシステムを使用してＡＡＶプロウイルス発現プラスミドにクローニングした。ウイルスベクターの産生のために、ＡＡＶ７ｍ８ Ｃａｐを発現するヘルパープラスミドは、Ｊｏｈｎ Ｆｌａｎｎｅｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒによって親切にも提供された（ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６４８３９）。ＡＡＶ７ｍ８－ＡＫＴ３およびＡＡＶ７ｍ８－ｅＧＦＰベクターを、前述の方法４６を使用して生成し、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｏｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＣＡＲＯＴ）リサーチベクターコア（ペンシルベニア大学、ＰＡ，ＵＳＡ）によって、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離を用いて精製した。

細胞培養およびＡＡＶ形質導入
８４－３１細胞は、Ｊａｍｅｓ Ｗｉｌｓｏｎ博士（ペンシルベニア大学）によって親切にも提供され、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ－ＧｌｕｔａＭａｘ中で培養した。ＡＡＶ形質導入に関して、８４－３１細胞を、６ウェル皿に２．５×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。その後、細胞を、１×１０^６の多重感染（ＭＯＩ）で即座にＡＡＶ７ｍ８ベクターで形質導入した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。

ＲＮＡ単離および遺伝子発現分析
ＲＮＡを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキットを使用して単離した。製造業者のプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランド合成システムを用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔシステムを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。以下のプライマー配列を使用した。５’
ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣ ３’（ヒトＧＡＰＤＨ Ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号１６）、５’
ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡ ３’（ヒトＧＡＰＤＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ、配列番号１７）、５’
ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＧＡ ３’（ヒトＲｈｅｂ Ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号１８）、５’
ＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＡ ３’（ヒトＲｈｅｂ Ｒｅｖｅｒｓｅ、配列番号１９）、５’
ＡＧＧＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣＴＧＣＡＴＧＧ ３’（ヒトＡＫＴ３ Ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号２０）、および５’
ＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＧＴＡＧＧＡＡＡＡ ３’（ヒトＡＫＴ３ Ｒｅｖｅｒｓｅ、配列番号２１）。相対遺伝子発現をΔΔＣＴ法で定量化し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。

網膜下注射
網膜下注射を、前述のように実施した。各網膜に、１ｕＬのベクター調製物を与えた。ＡＡＶ．ｅＧＦＰベクターを単独で与えた眼に、２×１０^９個のベクターゲノムを投与した。ＡＡＶ．ｅＧＦＰとＡＡＶ．ＡＫＴ３またはＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの組み合わせを受けた眼に、ベクター当たり１×１０^９個のベクターゲノム（２×１０^９個の総ベクターゲノム）を投与した。

網膜電位図
マウスに麻酔をかけ、前述のように維持した。瞳孔を１％トロピカミド（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）で拡張させた。白金線が埋め込まれた透明なプラスチック製コンタクトレンズを使用して光応答を記録し、白金線ループを動物の口に入れて参照電極として機能させた。ＥＲＧをＥｓｐｉｏｎ Ｅ２システム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ、Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）で記録した。３つのＥＲＧ応答を、以下のパラメータで記録した。暗所応答（暗順応、０．０１ｓｃｏｔ ｃｄ ｓ ｍ^－２刺激）、最大混合桿体－錐体応答（暗順応、５００ｓｃｏｔ ｃｄ ｓ ｍ^－２刺激）、最大錐体応答。

視運動性反応
視力は、前述のように、ＯｐｔｏＭｏｔｒｙソフトウェアおよび装置（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ、メディシン・ハット、ＡＢ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、視運動性反応（ＯＫＲ）を測定することによって評価した。記録は、実験的治療に対してマスキングされた治験責任医師によって行われた。

免疫組織化学
眼を除去し、取り出し、前述のように凍結切片として調製した（Ｄｏｏｌｅｙ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｃａｎ ｒｅｐａｉｒ ＣＥＰ２９０ ｍＲＮＡ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：２９４－３０８）。切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０％正常ヤギ血清（ＣＳＴ）、および２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有するブロック緩衝液中で、室温で１時間インキュベートした。その後、切片を、前述の成分および以下の抗体の組み合わせを含有する加湿チャンバー中、一次抗体溶液中で一晩インキュベートした。ウサギ抗錐体アレスチン（１：４００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ａｂ１５２８２）、ウサギ抗ホスホ－Ｓ６－Ｓｅｒ２４０／２４４（１：１００、ＣＳＴ番号５３６４）、ウサギ抗ホスホ－ＡＫＴ－Ｓｅｒ２７３（１：１００、ＣＳＴ番号４０６０）、マウス抗ロドプシン（１：４００、Ａｂｃａｍ番号ａｂ５４１７）、ウサギ抗ＨＡ（１：１００、ＣＳＴ番号３７２４）、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：４００、Ａｂｃａｍ番号ａｂ１５５８０）、マウス抗ＰＣＮＡ（１：４００、Ａｂｃａｍ番号ａｂ２９）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（１：４００、Ａｂｃａｍ番号ａｂ４６７４）、ウサギ抗ＡＫＴ（１：１００、ＣＳＴ番号４６９１）。一次抗体インキュベーション後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、１０％正常ヤギ血清、２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および以下の二次抗体の組み合わせを含有する加湿チャンバー中、室温で２時間、二次抗体溶液中でインキュベートした。ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－５９４ヤギ抗ニワトリ（１：５００、Ａｂｃａｍ番号ａｂ１５０１７６）、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－５９４ヤギ抗マウス（１：５００、番号ａｂ１５０１１６）、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－５９４ヤギ抗ウサギ（１：５００、Ａｂｃａｍ番号ａｂ１５００８０）、Ｃｙ５コンジュゲートヤギ抗ウサギ（１：５００、ＫＰＬ番号０７２－０２－１５－１６）。切片を二次抗体インキュベーションから除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。リン酸化抗原の存在について染色した切片をインキュベートし、ＰＢＳの代わりにＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含有する溶液中で洗浄した。

ＯＮＬ測定
網膜切片全体を、ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ ２細胞撮像システムを使用して、４０倍の対物レンズを使用してタイリングした。各画像において、ＯＮＬ厚さは、７５～１００μｍ間隔の３つの等距離の点で測定された。これらの測定値は、切片の平均ＯＮＬ厚さを表すために、すべての画像間で平均化された。試料当たり３つの網膜切片を平均化した。ベクターで形質導入された網膜の特定の領域からのＯＮＬ数を、２００μｍの領域当たりのＧＦＰ＋ＯＮＬ細胞の数をカウントすることによって定量化した。再び、試料当たり３
つの網膜切片を平均化して、これらの測定値を取得した。

ウェスタンブロッティング
タンパク質試料を、ＮｕＰａｇｅ電気泳動システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で分離した。試料を７０℃で加熱し、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にロードした。次いで、分離されたタンパク質を、ＸＣｅｌｌ
ＩＩブロットモジュール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用い、ＰＶＤＦ膜に３５ボルトで１．５時間かけて移した。タンパク質移動後、膜を、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（ＢｉｏＲａｄ）（ＴＢＳＴ）および５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するトリス緩衝生理食塩水中で、室温で１時間インキュベートした。その後、ブロットを、以下の一次抗体：ウサギ抗４９８ホスホ－Ｓ６－Ｓｅｒ２４０／２４４（１：１０００、ＣＳＴ番号５３６４）、ウサギ抗Ｓ６（１：１０００、ＣＳＴ番号２２１７）、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ（１：１０００、ＣＳＴ番号５１７４）を含有する前述の溶液中でインキュベートした。一次抗体のインキュベーションを、４℃で一晩行った。一次抗体溶液からブロットを除去し、ＴＢＳＴ中で各々５分間、３回洗浄した。その後、ＴＢＳＴ、５％ＢＳＡ、およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＥＣＬ（１：１０，０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からなる二次抗体溶液中に、室温で１時間置いた。ＴＢＳＴで膜を３回洗浄し、その後、製造業者の指示に従って、ＥＣＬ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で５分間インキュベーションした。最後に、化学発光設定を有するＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、膜を撮像した。

統計
すべてのデータは、別段の指示がない限り、平均値±ＳＥＭとして表される。２つの治療群間の差を、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して比較した。３つ以上の実験群間の差を、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後のテューキーの正直な有意差検定を使用して比較した。統計的有意性の計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０を使用して決定した。差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなされた。

実施例２：眼疾患の治療のためのＡＫＴ３遺伝子療法
網膜色素変性症のＰｄｅ６ｂ^ｒｄ１０（ｒｄ１０）マウスモデルにおけるＡＫＴ３またはｃａＲｈｅｂの過剰発現の影響
ｒｄ１０マウスモデルにおける疾患は、桿体ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のβ－サブユニットをコードする遺伝子中の点変異から生じ、これにより、ＰＤＥ複合体が非機能性になり、桿体光伝達カスケードにおける遮断が生成する。さらに、ＰＤＥは、ｃＧＭＰからＧＭＰへのリサイクルにおいて重要な役割を果たし、それによって、電位依存性イオンチャネルの閉鎖を促進する。ＰＤＥ複合体活性の喪失は、Ｎａ＋およびＣａ２＋イオンの構成的流入、ならびに細胞死カスケードの活性化を促進する。Ｒｄ１０マウスは、出生後１８日目（ＰＮ１８）付近から始まる光受容体外核層（ＯＮＬ）の漸進的な薄化を示す。ＰＮ３０までに、網膜の中心領域および周辺領域に著しい光受容体の損失があり、典型的には、異常な錐体細胞体の１つの層が、ＰＮ４５で中心網膜に残っている。以下に記載される研究では、視覚機能、構造形態、および光受容体の保存に関するＡＫＴ３またはＲｈｅｂ送達の神経保護電位を評価した。本願発明者らは、ｍＴＯＲ活性化を示すマーカーの発現を調べることによって、神経保護効果の潜在的なメカニズムをさらに調査した。加えて、本願発明者らは、ＡＫＴ３またはＲｈｅｂの過剰発現が網膜神経の発がん性増殖に及ぼす可能性に関して、長期的な安全性を検討した。

ＡＡＶ７ｍ８ベクターの設計および特徴付け
ＡＡＶに由来する遺伝子導入ベクターは、神経組織を標的化するための最適な遺伝子送達プラットフォームとして出現してきた。ＡＡＶ７ｍ８は、インビボ選択を通じて生成さ
れたＡＡＶ２のバリアントであり、強化された網膜および細胞形質導入特性を示す。本願発明者らは、過剰活性態様のヒトＡＫＴ３（ＡＡＶ．ＡＫＴ３）、構成的に活性なＲｈｅｂ変異体（ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ）、および対照としての増強緑色蛍光タンパク質レポーター（ＡＡＶ．ｅＧＦＰ）をコードするＡＡＶ７ｍ８ベクターを生成した（図１Ａ）。ＡＫＴ３導入遺伝子は、Ｎ末端ミリストイル化（ＭＹＲ）配列を含有し、それによって、膜標的化および局在化を増強する。ｃａＲｈｅｂ導入遺伝子は、ＴＳＣ媒介ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）活性への耐性を付与するカノニカルＳ１６Ｈ変異を含む。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂまたはＡＡＶ．ＡＫＴ３ベクターで形質導入された８４－３１細胞は、未治療対照と比較して、標的遺伝子ｍＲＮＡの強固な発現を示す（図１Ｂ～図１Ｃ）。ＡＡＶ７ｍ８の網膜下送達によって、光受容体の強固なラベリング、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、およびマウス網膜におけるミュラー細胞が生じる（図１Ｄ～図１Ｅ）。実験ベクターとレポーターベクターとの共注射によって、網膜下送達領域への特異的な導入遺伝子発現の局在化が生じ（図１Ｇ～図１Ｈ）、治療された網膜領域の十分な特定が可能になる。

ｃａＲｈｅｂ遺伝子導入は、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０マウスにおける網膜変性を軽減することができない
本願発明者らは、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜におけるｃａＲｈｅｂ遺伝子増強の影響を検討した。動物は、桿体の死の発生前の時間点であるＰＮ１３～１４に、ｅＧＦＰ（網膜の注射部分を特定することができるように）を含有するＡＡＶとともに、実験導入遺伝子を保有するＡＡＶの片側網膜下注射を受けた。対照には、ｅＧＦＰ含有ＡＡＶの単独注射、またはＡＡＶの注射を行わないものが含まれていた。注射後、視覚機能を、網膜電位図（ＥＲＧ）および視運動性反応（ＯＫＲ）で測定した。網膜組織学をＰＮ４５で調べ、光受容体生存に対するＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの影響を決定した（図２Ａ～図２Ｃ）。網膜当たりの総ＯＮＬ厚さの定量化は、実験的治療対対照治療（未治療、またはＡＡＶ．ｅＧＦＰ単独で注射されたもの）における残存光受容体細胞体の数に有意差を示さなかった（図２Ｂ）。総ＯＮＬ厚さに加えて、本願発明者らは、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ単独で形質導入されたか、またはＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂで共形質導入された網膜内の領域の２００μｍ切片当たりのＧＦＰ＋ＯＮＬ細胞の数を測定した。ここでも再び、本願発明者らは、これらの群間のＯＮＬ細胞数の統計的に有意な変化を観察しなかった（図２Ｃ）。さらに、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、ＥＲＧ（図２Ｄ～図２Ｆ）およびＯＫＲ（図２Ｇ）でそれぞれ測定された場合、対照と比較して、網膜または視覚機能を保持しなかった。まとめると、これらのデータは、ｃａＲｈｅｂ遺伝子導入が、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０マウス網膜において光受容体神経保護を促進しないことを示唆している。

ＡＫＴ３遺伝子増強は、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜における光受容体生存および構造保存を促進する
本願発明者らは、ＡＫＴ３遺伝子増強が、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜における光受容体生存および構造完全性に及ぼす影響を検討した。ＰＮ１３～１４にＡＡＶ．ＡＫＴ３を注射した後のＰＮ３０およびＰＮ４５での網膜構造の組織学的分析は、ｅＧＦＰと共標識された網膜領域において特異的な光受容体に対する強力な神経保護効果（治療群間の免疫染色およびＯＮＬ測定によって反映されるような）を明らかにした（図３Ｃ）。いずれの時間点においても、未治療の眼と比較して、ＡＡＶ．ＧＦＰ注射された眼において組織学的レスキューの証拠はなかった。維持された特定の種類の光受容体をプローブするための免疫染色は、ＡＡＶ．ＡＫＴ３ベクターで形質導入された網膜領域において、錐体光受容体の保存（錐体アレスチンについての染色によって評価される）を明らかにした（図３Ｄ～図３Ｆ）。同様に、ロドプシンの免疫染色は、（網膜の非曝露領域、またはＡＡＶ．ｅＧＦＰもしくは未治療の対照網膜ではなく）ＡＡＶ．ＡＫＴ３形質導入領域における桿体光受容体の保存を明らかにした。

顕著なことに、ロドプシンの免疫染色はまた、対照と比較して、ＰＮ３０の収集点で桿
体外側セグメントの保存の増強を明らかにし、このことは、桿体光受容体の超構造の製造および維持を媒介する際のこの経路の重要性を示唆している（図３Ａ～図３Ｃ）。

ＡＫＴ３遺伝子導入が、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜における網膜および視覚機能に及ぼす効果
本願発明者らは、それぞれ網膜電位図（ＥＲＧ）および視運動性反応（ＯＫＲ）測定により、ＰＮ３０およびＰＮ４５時間点での網膜および視覚機能を評価した。
ＡＡＶ．ＡＫＴ３で治療された眼からの混合桿体－錐体応答の分析は、ＰＮ３０での未治療対照およびＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療対照の両方と比較して、改善されたａ波振幅を明らかにした（図４Ａ）。加えて、ＡＡＶ．ＡＫＴ３で治療された眼の刺激によっても、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療された眼と比較して、混合ｂ波応答の増加を誘発した（図４Ｂ）だけではなく、この時間点で未治療の眼と比較して、保存の増加の傾向があった。しかしながら、ＰＮ４５での治療群間のこれらの転帰尺度に有意差はなかった（図４Ａ～図４Ｂ）。本願発明者らはまた、錐体特異的なｂ波応答を測定したが、試験した任意の時間点で、治療群間で統計的な有意差は観察されなかった（図４Ｃ）。本願発明者らは、視運動性反応（ＯＫＲ）を測定することにより、遺伝子導入に応答した視力を検討した。データは、未治療の左眼が動物内対照として機能し、一方、右眼をＡＡＶ．ｅＧＦＰ単独またはＡＡＶ．ＡＫＴ３と組み合わせて治療した、これらの記録の右／左眼比を表す。ＡＡＶ．ＡＫＴ３／ＡＡＶ．ｅＧＦＰによる治療は、任意の時間点で、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ対照と比較して視力を維持しなかった（図４Ｄ）。まとめると、このデータは、ＡＫＴ３遺伝子導入が、初期から中期の疾患の間、細胞生存およびいくつかの機能を延長するが、長期間の維持には不十分である可能性があることを示している。

ＡＫＴ３遺伝子増強は、生合成および細胞生存経路を刺激する
本願発明者らは、ＡＫＴ３誘導性神経保護応答が、同化および細胞生存に関連する経路を活性化するという仮説を立てた。この可能性を評価するために、本願発明者らは、ｍＴＯＲ活性化を示すカノニカル下流マーカーに対して指向される抗体を用い、網膜切片を免疫染色した（図５Ａ～図５Ｈ）。ＡＡＶ．ＡＫＴ３で特異的に形質導入された網膜の領域は、非曝露網膜または未治療網膜と比較して、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）の発現の増強を示す（図５Ｅ～図５Ｈ）。興味深いことに、本願発明者らはまた、ＡＡＶ．ＡＫＴ３に特異的に曝露された領域内でｍＴＯＲＣ２マーカー（ｐＡＫＴ^Ｓ４７３）の発現の増加を観察し、このことは、細胞生存およびストレス耐性に関連する追加の機能の刺激を示唆している（図５Ａ～図５Ｄ）。未治療対照群およびＡＡＶ．ＧＦＰ対照群から得られた網膜切片は、これらのマーカーの発現の増強を示さず、このことは、ＡＫＴ３誘導性神経保護が、少なくとも、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２経路の両方によって部分的に引き起こされることを暗示している（図５Ｄおよび図５Ｈ）。

ＡＫＴ３過剰発現は、光受容体の静止を破らないが、ミュラー細胞活性化を刺激する
調節不全ＡＫＴシグナル伝達は、多くのヒトのがんに共通の特徴である。細胞増殖のカノニカルマーカーを用いた免疫染色により、網膜静止に対するＡＫＴ３遺伝子導入の効果を検討した。Ｋｉ６７の発現は、未治療およびＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療されたＰｄｅ６ｂｒｄ１０網膜において神経節細胞層を占有する細胞に限定された。

ＧＦＡＰに対して指向される抗体との共染色は、このＫｉ６７＋細胞集合体をミュラーグリアとして特定した。恒常性条件下では、これらの細胞は、神経栄養因子放出の媒介、細胞外イオンバランスの調節、および細胞片除去を通じて、他の網膜細胞型に対する構造的および代謝的な補助を提供する。重要なことに、ＯＮＬを占有する細胞は、Ｋｉ６７マーカーに対して陽性の免疫反応性を示さず、このことは、ＡＫＴ３誘発性保護応答が、光受容体静止のエスケープの副産物ではないことを示唆していた（図６Ｈおよび図６Ｉ）。興味深いことに、ＡＡＶ．ＡＫＴ３で特異的に形質導入された網膜の領域内のミュラー細
胞は、ＧＦＡＰ発現の上方制御および異なる網膜層全体にわたる神経プロセスの延長などのアストログリオーシスに代表される形態学的変化を示す。（図６Ｇ～図６Ｉ）。同様に、本願発明者らは、本願発明者らのベクターパネルを注射した野生型動物におけるこれらのマーカーの発現を検討した。野生型動物は、ＰＮ１３で網膜下注射を受け、ＰＮ１２５で組織学的分析のためにフォローアップされた。本願発明者らは、レポーターベクター単独の長期的な過剰発現を有する動物において、構造的または細胞的変化を観察しなかった（図１１Ａ～図１１Ｂ）。逆に、遍在性ＡＡＶ．ＡＫＴ３ベクターで治療された動物は、広範囲にわたる網膜組織の乱れおよび光受容体構造マーカーの喪失を示す（図１１～図１１Ｄ）。さらに、ＡＡＶ．ＡＫＴ３ベクターで特異的に形質導入された領域は、未治療網膜およびＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療網膜と比較して、ミュラー細胞の慢性的な活性化も示す（図７Ａ～図７Ｋ）。

ＡＫＴ３の光受容体によって制限される発現が、Ｐｄｅ６ｂ^ｒｄ１０網膜における神経保護効果を媒介する
本願発明者らは、前述のＧＲＫ１プロモーターによって引き起こされるＡＡＶベクターを生成することによって、光受容体内で特異的なＡＫＴ３媒介性神経保護の効果を検討した（図８Ａ）。Ｐｄｅ６ｂ^ｒｄ１０網膜内でのこれらのベクターの適用は、遍在性ＣＡＧプロモーターによって引き起こされる前述のベクターと同様の網膜機能への効果を発揮した（図８Ｂ～図８Ｄ）。具体的には、ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３による治療は、ＰＮ３０で混合ａ波およびｂ波振幅を保存したが、ＰＮ４５での進行期の変性では保存されなかった。以前の所見と同様に、これらのベクターは、対照治療と比較して、錐体特異的ｂ波振幅の保存を媒介しなかった。組織学のレベルでは、これらのベクターは、光受容体内で特異的導入遺伝子発現を示す（図８Ｅ）。さらに、ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３はまた、未治療対照眼およびＡＡＶ．ｅＧＦＰ治療対照眼と比較して、光受容体生存が向上した（図８Ｆ）。

光受容体特異的プロモーターによって調節されるＡＫＴ３ベクターは、Ｐｄｅ６ｂ^ｒｄ１０網膜における反応性グリオーシスを刺激しない
本願発明者らは、ＧＲＫ１によって引き起こされるベクターを用い、光受容体層にＡＫＴ３導入遺伝子発現を制限することは、偏在性ＣＡＧプロモーターによって調節されるＡＫＴ３ベクターを用いて以前に観察された慢性ミュラー細胞活性化を減少させるという仮説を立てた。再び、本願発明者らは、ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３と、ＧＦＡＰおよびＫｉ６７に対して指向される抗体を有するトレーサーベクターを共注射したＰＮ４５のＰｄｅ６ｂｒｄ１０マウス由来の網膜切片を免疫染色した（図９Ａ～図９Ｈ）。ＡＡＶ．ＧＲＫ１．ＡＫＴ３による治療は、未治療試料と比較して、Ｐｄｅ６ｂ^ｒｄ１０におけるミュラー細胞の異常な活性化および移動を明らかにしなかった（図９Ａ～図９Ｆ）。

さらに、未治療の網膜領域と網膜下注射部位との間の移行領域は、同様の組織学的所見を明らかにし、このことはさらに、光受容体によって制限されたＡＫＴ３遺伝子導入が、偏在性ベクター系を用いて以前に観察されたミュラー細胞の慢性活性化を軽減することを示唆している（図９Ｇおよび図９Ｈ）。これらの結果は、神経保護遺伝子導入戦略に関連する潜在的に有害なオフターゲット効果を回避するための細胞および組織特異的なプロモーターの重要性を強調する。

実施例３：ＡＡＶ媒介遺伝子導入によるｍＴＯＲ経路の刺激
上の実施例２に記載される研究は、ＡＡＶ媒介遺伝子導入によるｍＴＯＲ経路の刺激後のＲＰ動物モデルにおける細胞代謝のリプログラミングの治療的可能性を実証する。神経変性疾患の文脈におけるｍＴＯＲシグナル伝達の実際の役割は、依然として議論の対象である。カノニカルｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンによる治療を介したｍＴＯＲ活性の下方制御は、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病を含むいくつか
の神経変性モデルにおける病理学的メカニズムを軽減することができる。逆に、他の検討では、インスリン／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ軸の刺激が、関連する神経変性疾患モデルにおいて有益な転帰を媒介することができることが示唆されている。上述の研究において、２つの別個の調節点でｍＴＯＲ経路を標的化することは、光受容体の生存、構造的完全性、および網膜機能に対する異なった効果をもたらした。

いくつかの以前の研究は、神経変性疾患モデルの文脈で治療転帰を改善するために、Ｒｈｅｂ活性化を標的化する保護の可能性を強調した。しかしながら、ｃａＲｈｅｂ遺伝子導入による調節のこの下流点におけるｍＴＯＲ経路の刺激は、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１０網膜における保護効果を媒介しなかった。興味深いことに、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂベクターは、インビトロでｍＴＯＲＣ１活性の強力な刺激を示し、このことは、カノニカルｍＴＯＲＣ１活性化マーカーｐＳ６の発現の増強を示している。この活性は、ｃａＲｈｅｂ導入遺伝子を過剰発現する網膜切片中のｐＳ６についての陰性免疫染色によって示される場合、インビボで応用されなかった。このことは、光受容体内でｍＴＯＲＣ１を刺激するｃａＲｈｅｂの能力を阻害する固有のメカニズムの存在を示唆している（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。これらの観察は、ｃａＲｈｅｂ遺伝子導入が種々の神経集合体内でｍＴＯＲＣ１活性を刺激し、パーキンソン病、ハンチントン病、および視神経外傷のモデルにおいてストレス耐性を与えた以前の研究において報告されたものとは異なっている。他の系統の証拠は、Ｒｈｅｂが、異なる形態の細胞ストレスに応答して、細胞死シグナル伝達プログラムを促進する際に競合する役割を果たす可能性があることを示唆している。ＵＶまたはＴＮＦαによって誘発される細胞ストレスを、Ｒｈｅｂ過剰発現と組み合わせると、インビトロでのアポトーシスシグナル伝達を増強したが、一方、ラパマイシンによるＲｈｅｂノックダウンまたは治療は、これらの細胞傷害性薬剤からの部分的な保護を提供した。網膜変性の文脈では、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の光によって誘発される損傷は、変性前のアポトーシスのマーカーの増加と関連するＲｈｅｂ発現の上方制御を引き起こした。まとめると、Ｒｈｅｂの保護機能またはアポトーシス促進機能は、問題となる特定の病理を通じて誘発されるメカニズムによって決定される可能性が高い。さらに、遺伝子導入によるＲｈｅｂ活性の増幅は、特定の疾患の文脈に依存して、細胞生物学に対する多様な効果を調節する可能性が高い。

さらに、ＡＡＶ媒介性ＡＫＴ３遺伝子導入は、光受容体の生存および形態保存に対する強力な神経保存効果を刺激した。この保護効果は、ＡＡＶ．ＡＫＴ３ベクターで特異的に形質導入された網膜の領域におけるｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の刺激と関連があった。本願発明者らの所見は、光受容体の神経保護に関連するｍＴＯＲＣ２シグナル伝達活性の上方制御を最初に報告したものである。このデータは、ｍＴＯＲＣ２活性が、Ｐｔｅｎのトランスジェニックアブレーション後に低下し、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１マウス網膜において錐体生存が増強したというＶｅｎｋａｔｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１５）による以前の観察から逸脱したものである。

ＡＫＴ３遺伝子導入によって媒介される劇的な細胞保護にもかかわらず、本願発明者らは、網膜電位図およびＯＫＲによる評価後に機能保護の際の異なる効果を観察した。本願発明者らは、ＰＮ３０測定でＣＡＧもしくはＧＲＫ１プロモーターによって引き起こされるＡＫＴ３ベクターで治療された眼において混合桿体－錐体ａ波、および場合によってはｂ波応答の統計的に有意な保存を観察したが、より後期の変性中には観察されなかった。ＡＫＴ３導入遺伝子発現による錐体構造の形態学的保存にもかかわらず、本願発明者らは、試験したいずれの時間点での対照と比較しても、錐体特異的光応答の改善は観察されなかった。この所見は、同様の疾患モデルにおける錐体光受容体の神経保護の戦略を検討した以前の検討から逸脱したものである。これらの違いは、導入遺伝子カセットだけではなく、ベクター用量、注射経路、モデル系に関連する変性の動態、およびベクター送達のタイミングに関する研究設計の変動によって説明され得る。本研究では、ベクターを、光受
容体の死の発症の直前の時間点で注射したが、一方、以前の検討では、出生直後、および網膜成熟前、および疾患メカニズムの発症前に、実験的介入を行った。実験設計におけるこれらの違いは、網膜の被覆率、ベクター動員の動態、および神経変性メカニズムの発症に関連する発現、ならびに最終的には治療の転帰尺度に関連する重要な下流の推測を有する可能性が高い。

細胞代謝をリプログラミングするための戦略に基づく遺伝子療法の進歩は、臨床への応用の前に、非常に厳格な安全基準を満たさなければならない。本願発明者らは、腫瘍形成の証拠を観察しなかったが、野生型動物における偏在性プロモーターによって調節されたＡＫＴ３の長期的な過剰発現は、広範囲にわたる網膜組織の乱れを引き起こし、最終的には光受容体の喪失を引き起こした。この表現型は、野生型動物およびＰｄｅ６ｂ^ｒｄ１０動物において観察された偏在性ベクターによって特異的に形質導入された網膜領域におけるミュラー細胞の慢性的な活性化に対応していた。反応性グリオーシスは、典型的には組織損傷に関連する応答であり、これらの細胞が活性化し、増殖して、組織リモデリング、神経栄養因子放出、細胞片の除去を含む様々な機能を媒介する。この応答は、さらなる網膜損傷を抑制することを意図しているが、慢性的な活性化は、隣接細胞にとって有害であり、網膜の恒常性を破壊する可能性がある。例えば、活性化されたミュラー細胞は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ－１）を含む様々な炎症促進性分子の発現および分泌を上方制御することが観察されている。

さらに、それらの細胞は、隣接細胞に損傷を与え得る遊離ラジカルを生成する過剰量の一酸化窒素（ＮＯ）を分泌することが知られている^４１。この所見は、細胞が、それらの正確な生理学的要求に対応するためにこれらの代謝成分において絶妙なバランスを必要とし、このような経路の過剰な刺激が、細胞生存能に対して有害な影響を示す可能性が高いため、驚くべきことではなかった。遺伝子増強またはサイレンシング戦略でこのバランスを決定し、達成することは、これらのアプローチを臨床に応用する際の大きな課題となるであろう。

追加の調節エレメント、例えば、細胞特異的プロモーター（ここで示したように）、ストレス応答性プロモーターまたは誘導性系は、強力な代謝経路を刺激する神経保護性の遺伝子導入戦略の臨床開発において重要な役割を果たす可能性が高い。

まとめると、この検討は、遺伝性網膜変性のモデルにおける遺伝子増強後の光受容体の生存能および構造に対する広範な保護効果を実証する。これらの所見は、光受容体の生存および維持における嫌気性代謝に関連するＡＫＴ活性および下流経路の重要性を強く主張する。さらに、この結果は、細胞代謝のリプログラミングの複雑で繊細な性質、ならびに複雑な神経変性疾患の進行を「一般的な」遺伝子療法戦略で阻止する際の重要な安全性の懸念を強調する。

本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に援用される。２０１９年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／８１３，５８７号、２０１９年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／８２１，７０５号は、それらの配列表とともに、それらの全体が参照により本明細書に援用される。「１８－８３８０ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称で本明細書とともに提出された配列表、ならびに参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まることが意図される。

Claims (32)

1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、ヒトタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）３コード配列と、宿主細胞におけるＡＫＴの発現を指示する発現制御配列とを含むベクターゲノムがＡＡＶカプシドの中に封入されたＡＡＶカプシドを含み、
   前記ＡＫＴ３コード配列が、配列番号８のアミノ酸配列をコードする、配列番号１３と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列、を含む、
   ＡＡＶベクター。
2. 前記ＡＫＴ３コード配列が、配列番号１３を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
3. 前記発現制御配列が、ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーターを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
4. 前記ＣＭＶエンハンサー配列を有するニワトリベータアクチンプロモーターが、配列番号１のヌクレオチド１４４３～３１０４または配列番号５のヌクレオチド１４９３～２０７５である、請求項３に記載のＡＡＶベクター。
5. 前記発現制御配列が、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
6. 前記発現制御配列が、ＧＲＫ１プロモーターを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
7. 前記ＧＲＫ１プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド１４２７～１７９０を含む、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
8. 前記発現制御配列が、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターまたはｈＣＡＲプロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
9. 前記発現制御配列が、眼細胞特異的プロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
10. 前記発現制御配列が、ヒトＥＦ１αプロモーター、代謝型グルタミン酸受容体６（ｍＧｌｕＲ６）プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、および転写因子プロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
11. 前記発現制御配列が、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
12. 前記プロモーターが、ラパマイシン／ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）プロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、およびヘテロ二量体リプレッサースイッチから選択される誘導性プロモーターである、請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
13. 前記発現制御配列が、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ配列、および転写後調節エレメントのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
14. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ若しくはＡＡＶ７ｍ８またはそれらのバリアントである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
15. 前記カプシドが、ＡＡＶ７ｍ８カプシドである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
16. 前記ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
17. 薬学的に許容される担体と、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターとを含む、医薬組成物。
18. それを必要とする対象における網膜変性を治療するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターまたは請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記ＡＡＶベクターまたは医薬組成物が、網膜下または硝子体内に投与される、請求項１８に記載のＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
20. 前記対象が、哺乳動物である、請求項１８または１９に記載のＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
21. 前記対象が、ヒトである、請求項２０に記載のＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
22. 前記ＡＡＶベクターが、別の療法と組み合わせて投与される、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
23. 前記ＡＡＶベクターが、１０⁷～１０¹³のベクターゲノム（ＶＧ）の投薬量で投与される、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
24. 前記ＡＡＶベクターが、１００μＬ～５００μＬの容量で投与される、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
25. 前記ＡＡＶベクターが、１回より多く投与される、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
26. ＡＡＶベクターを製造するためのプラスミドであって、配列番号８のアミノ酸配列をコードする、配列番号１３と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列、を含むＡＫＴ３コード配列を含む、プラスミド。
27. ＡＡＶベクターを産生するためのプラスミドであって、配列番号３のヌクレオチド１２５３～３８６８を含む、プラスミド。
28. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスを生成する方法であって、感染性ＡＡＶエンベロープまたはカプシドへの遺伝子発現カセットのパッケージングを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下、請求項２６または２７に記載のプラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することを含む、方法。
29. 網膜変性を治療するための方法で使用するための組成物であって、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターまたは請求項１７に記載の医薬組成物を含む、組成物。
30. 色覚異常の治療のための医薬品の製造における、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターの使用。
31. 網膜変性を治療するための方法で使用するための組成物であって、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、組成物。
32. 網膜変性の治療のための医薬品の製造における、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターの使用。

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