JP7638095B2 - Method for detecting or quantifying target biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles - Google Patents
Method for detecting or quantifying target biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles Download PDFInfo
- Publication number
- JP7638095B2 JP7638095B2 JP2021000617A JP2021000617A JP7638095B2 JP 7638095 B2 JP7638095 B2 JP 7638095B2 JP 2021000617 A JP2021000617 A JP 2021000617A JP 2021000617 A JP2021000617 A JP 2021000617A JP 7638095 B2 JP7638095 B2 JP 7638095B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- transparent
- temperature
- responsive
- hot plate
- biomolecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 55
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 82
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 63
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 43
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 43
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 31
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 26
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 25
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 32
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 17
- -1 inorganic base salts Chemical class 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 10
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 8
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 7
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 3
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- PWEBUXCTKOWPCW-UHFFFAOYSA-N squaric acid Chemical class OC1=C(O)C(=O)C1=O PWEBUXCTKOWPCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 description 2
- LJARBVLDSOWRJT-PSXMRANNSA-N 1,2-di-O-pentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCC LJARBVLDSOWRJT-PSXMRANNSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- RTWAYAIMWLNAJW-RRHRGVEJSA-N PC(17:0/17:0) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCC RTWAYAIMWLNAJW-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 125000002525 phosphocholine group Chemical group OP(=O)(OCC[N+](C)(C)C)O* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006903 response to temperature Effects 0.000 description 2
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N (2-nonanoyloxy-3-octadeca-9,12-dienoyloxypropoxy)-[2-(trimethylazaniumyl)ethyl]phosphinate Chemical class CCCCCCCCC(=O)OC(COP([O-])(=O)CC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 2-(trimethylazaniumyl)ethyl hydrogen phosphate Chemical class C[N+](C)(C)CCOP(O)([O-])=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSKHPKMHTQYZBB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC=N1 BSKHPKMHTQYZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 150000002211 flavins Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099578 hydrogenated soybean lecithin Drugs 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229940042880 natural phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 229910001120 nichrome Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M toluene-4-sulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
本発明は、温度応答性蛍光粒子を利用した標的生体分子の検出方法又は定量方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting or quantifying a target biomolecule using temperature-responsive fluorescent particles.
近年、生体分子（バイオマーカー）の検出及び定量にはＥＬＩＳＡ法が多用されている。ＥＬＩＳＡ法は、抗原－抗体反応を利用するため、高い特異性が得られる一方、試薬の洗浄や酵素反応などの操作が煩雑で時間が掛かかる上、生体分子の検出濃度は１ｐＭ程度が限界であった。 In recent years, the ELISA method has come to be widely used for the detection and quantification of biomolecules (biomarkers). The ELISA method uses an antigen-antibody reaction, which allows for high specificity, but the procedures for washing the reagent and enzyme reactions are cumbersome and time-consuming, and the detection concentration of biomolecules is limited to around 1 pM.
すなわち、ＥＬＩＳＡ法においては、固相化されずに浮遊する光標識物質がバックグラウンドノイズとなるため、検出感度が悪くなるといった本質的な問題がある。光標識物質としては、周囲環境に関係なく常時蛍光特性を示す蛍光物質が用いられていたため、固相化された光標識物質だけを選択的に蛍光発光させることはできなかった。 In other words, the ELISA method has an essential problem of poor detection sensitivity because the floating optically labeled substances that are not solidified become background noise. Because fluorescent substances that constantly exhibit fluorescent properties regardless of the surrounding environment were used as optically labeled substances, it was not possible to selectively cause only the solidified optically labeled substances to emit fluorescence.
このような事情から、洗浄プロセスによってバックグラウンドノイズとなる浮遊する光標識物質を除去することがなされているが、今度は検査工程が複雑になるという問題がある。 For these reasons, a cleaning process is used to remove floating photolabeled substances that become background noise, but this then creates the problem of complicating the testing process.
また、ＥＬＩＳＡ法に用いられてきた光標識物質としては、蛍光発光が弱く、高感度での測定が難しいという問題もある。 In addition, the photolabeling substances used in ELISA have a problem in that they emit weak fluorescence, making it difficult to measure with high sensitivity.
そこで、ＥＬＩＳＡ法をさらに進展させた生体分子の検出法も開発されている。例えば、デジタルＥＬＩＳＡ法と呼ばれる方法では、反応デバイスを工夫して微小液滴（フェムトリットル）中で酵素反応を行うことで高感度化を実現している（非特許文献１、２）。しかし、これらの方法の測定原理はＥＬＩＳＡ法と同じであり、従来のＥＬＩＳＡ法より操作が煩雑になり時間がかかる問題がある。 Therefore, biomolecule detection methods that are further developments of the ELISA method have also been developed. For example, in a method called digital ELISA, high sensitivity is achieved by performing an enzyme reaction in a microdroplet (femtoliter) using a modified reaction device (Non-Patent Documents 1 and 2). However, the measurement principle of these methods is the same as that of the ELISA method, and there is a problem that the operations are more complicated and time-consuming than those of the conventional ELISA method.
Single Molecule Counting (SMCTM) Immunoassay Technologyが、分子検出技術として開発されている（非特許文献３）。この技術もＥＬＩＳＡ法を原理としているが、検出器の光学系を工夫することで、検出領域を微小化して検出感度を向上させている。しかし、専用の高価な検出器が必要で、微小領域を繰り返しスキャンして測定するため測定に時間がかかる問題がある。 Single Molecule Counting (SMCTM) Immunoassay Technology has been developed as a molecular detection technology (Non-Patent Document 3). This technology is also based on the principle of ELISA, but the detection area is miniaturized by improving the detector's optical system, improving detection sensitivity. However, it requires a dedicated, expensive detector, and the measurement takes a long time because the measurement requires repeatedly scanning a small area.
また、イムノクロマト法が使用されているが（非特許文献４）、感度が低いため疾病や感染の早期発見には使えない、目視判定による判定者の視認感度差などがあり、偽陰性率（２０～３０％）も高いとの欠点を有する。 Although immunochromatography is also used (Non-Patent Document 4), it has the disadvantages of being unable to use it for early detection of disease or infection due to its low sensitivity, differences in visual sensitivity between examiners when visually assessing, and a high false negative rate (20-30%).
バイオマーカーによる疫病や感染の早期診断には１ｐＭ以下の検出感度が必要であるため、より高感度で、簡便で、短時間で実施可能な検出法の開発が待たれている。 Early diagnosis of epidemics and infections using biomarkers requires a detection sensitivity of 1 pM or less, so there is a need to develop a detection method that is more sensitive, simpler, and can be performed in a shorter time.
更に、最近、検出感度の高い温度応答性蛍光粒子について報告されているが（特許文献１）、これを利用して最適に検出又は定量する方法については、具体的に開示されていない。 Furthermore, although temperature-responsive fluorescent particles with high detection sensitivity have been reported recently (Patent Document 1), no specific method for optimal detection or quantification using these particles has been disclosed.
そこで発明者らは、鋭意検討の結果、温度応答性蛍光粒子の表面を修飾した温度応答性プローブ粒子を作製し、これを用いた改良ＥＬＩＳＡ法である検出方法等を発明した。温度応答性プローブ粒子は、ある特定の温度以上になると蛍光特性を示すものであり、蛍光発光も強いという性質を有する。この特性を利用して、励起光や蛍光を透過させる透明検査容器、透明ホットプレートを用いて、透明検査容器内の底面に固定化された温度応答性プローブ粒子が先に温められて相転移温度を超えて蛍光発光したタイミングを、透明ホットプレートの下側に配置されている検出部において測定する。 As a result of intensive research, the inventors have created temperature-responsive probe particles in which the surface of temperature-responsive fluorescent particles is modified, and have invented a detection method, etc., which is an improved ELISA method using the same. Temperature-responsive probe particles exhibit fluorescent properties when the temperature exceeds a certain temperature, and have the property of emitting strong fluorescence. Taking advantage of this property, a transparent inspection vessel that transmits excitation light and fluorescence and a transparent hot plate are used, and the timing at which the temperature-responsive probe particles fixed to the bottom surface of the transparent inspection vessel are first heated and exceed the phase transition temperature to emit fluorescence is measured in a detection unit located below the transparent hot plate.
本発明の一態様は、温度応答性蛍光粒子の表面を修飾した温度応答性プローブ粒子と、生体試料と、捕獲用生体分子認識素子と、を接触させた後に蛍光発光強度を測定することによって前記生体試料中に含まれる標的生体分子の検出又は定量を行う方法であって、（１）捕獲用生体分子認識素子が底面内側に固定化された透明検査容器を準備するステップ、（２）温度応答性プローブ粒子と、生体試料と、捕獲用生体分子認識素子と、を接触させて透明検査容器内に測定対象を得るステップ、（３）温度応答性プローブ粒子と、生体試料と、捕獲用生体分子認識素子と、を接触させて透明検査容器内に測定対象を得るステップ、（４）透明検査容器の底面を透明ホットプレートの上に配置するステップ、（５）透明ホットプレートを加熱するステップ、（６）透明ホットプレートの下側から前記透明検査容器内の底面近傍の蛍光発光強度を測定するステップ、を含むことを特徴とする方法である。 One aspect of the present invention is a method for detecting or quantifying a target biomolecule contained in a biological sample by contacting a biological sample and a capture biomolecule recognition element with temperature-responsive probe particles having a surface modified with temperature-responsive fluorescent particles, and then measuring the fluorescence emission intensity, the method comprising the steps of: (1) preparing a transparent test vessel with a capture biomolecule recognition element fixed to the inside of the bottom surface; (2) contacting the temperature-responsive probe particles, the biological sample, and the capture biomolecule recognition element to obtain a measurement target in the transparent test vessel; (3) contacting the temperature-responsive probe particles, the biological sample, and the capture biomolecule recognition element to obtain a measurement target in the transparent test vessel; (4) placing the bottom surface of the transparent test vessel on a transparent hot plate; (5) heating the transparent hot plate; and (6) measuring the fluorescence emission intensity near the bottom surface of the transparent test vessel from below the transparent hot plate.
本発明によれば、簡便かつ短時間で低濃度の標的生体分子を検出又は定量できる方法及び装置を提供することが出来る。 The present invention provides a method and device that can detect or quantify low concentrations of target biomolecules easily and quickly.
以下、本発明を実施するための実施形態について詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。また、各図において図面の寸法比と実際の寸法比は必ずしも一致しない。 The following describes in detail the embodiments for carrying out the present invention. However, the present invention is not limited to the following embodiments. Also, the dimensional ratios in the drawings do not necessarily match the actual dimensional ratios in each figure.
（本発明の検出装置の概要）
図１を用いて、本発明の検出装置の概要を説明する。検出装置１００は、検出の際に外部からノイズ光が入らないように全体が筐体９で遮光されている。検出装置１００内部の上部には、透明ホットプレート２が設置されている。透明ホットプレート２の下側には、光源部３、検出部４が配置されている。なお、検出部４から発光された蛍光を測定しやすくするために、フィルタ５が配置されていてもよい。
(Overview of the detection device of the present invention)
An overview of the detection device of the present invention will be described with reference to Fig. 1. The detection device 100 is entirely light-shielded by a housing 9 to prevent noise light from entering from the outside during detection. A transparent hot plate 2 is installed at the top inside the detection device 100. A light source unit 3 and a detection unit 4 are arranged below the transparent hot plate 2. A filter 5 may be arranged to make it easier to measure the fluorescence emitted from the detection unit 4.
光源部３は、ここから発光された光が透明ホットプレート２及びその上部に配置されることになる透明検査容器１に届くように配置されている。検出部４は、透明ホットプレート２越しに透明検査容器１内の底面近傍の蛍光発光強度を測定することから、透明ホットプレート２の略重力方向下側に設置される。光源部３は、検出部４の測定の際に障害とならない位置に配置される必要がある。 The light source unit 3 is positioned so that the light emitted from it reaches the transparent hot plate 2 and the transparent inspection container 1 that will be placed above it. The detection unit 4 is installed approximately below the transparent hot plate 2 in the direction of gravity, as it measures the fluorescent emission intensity near the bottom surface inside the transparent inspection container 1 through the transparent hot plate 2. The light source unit 3 needs to be positioned in a position that does not interfere with the measurement by the detection unit 4.
（本発明の検出方法の概要）
測定は、測定対象が入っている透明検査容器１を透明ホットプレート２上に置いて透明検査容器１を底面から加熱すると共に、光源部３から励起光を発光して、検出部４によって透明検査容器内の底面近傍の蛍光発光強度を測定することによって行う。
(Outline of the detection method of the present invention)
The measurement is performed by placing a transparent inspection container 1 containing the object to be measured on a transparent hot plate 2, heating the transparent inspection container 1 from the bottom, emitting excitation light from a light source unit 3, and measuring the fluorescent emission intensity near the bottom inside the transparent inspection container by a detection unit 4.
（透明検査容器）
本発明で用いられる透明検査容器１の素材としては、透明プラスチック製、ガラス製など、光源部３の発する励起光及び測定対象が発する蛍光を遮断又は吸収しない素材が好ましい。透明検査容器１の形状としては、例えば、上部が開口した円筒形の容器があるが、これに限定されない。
(Transparent inspection container)
The material of the transparent test container 1 used in the present invention is preferably a material such as transparent plastic or glass that does not block or absorb the excitation light emitted by the light source unit 3 and the fluorescence emitted by the measurement target. The shape of the transparent test container 1 is, for example, a cylindrical container with an open top, but is not limited to this.
（検査容器ホルダ）
透明検査容器１は、直接透明ホットプレート２上に置いてもよいが、図１、２のように、検査容器ホルダ１０に固定することもできる。これにより、同時に多くの透明検査容器１を測定に用いることが可能となる。なお、検査容器ホルダ１０は、本発明の検出方法の妨げにならないように、図３（ａ）のように、透明検査容器１の底面を覆わない構造になっているか、図３（ｂ）のように、底面が透明素材でできていることが好ましい。また、検査容器ホルダ１０を構成する基本部材は、光の反射によって蛍光発光強度測定の妨げにならない様、黒色であることが好ましい。
(Test vessel holder)
The transparent test vessel 1 may be placed directly on the transparent hot plate 2, but may also be fixed to a test vessel holder 10 as shown in Figures 1 and 2. This allows many transparent test vessels 1 to be used for measurement at the same time. In order not to interfere with the detection method of the present invention, it is preferable that the test vessel holder 10 is structured so as not to cover the bottom of the transparent test vessel 1 as shown in Figure 3(a), or that the bottom is made of a transparent material as shown in Figure 3(b). In addition, it is preferable that the basic members constituting the test vessel holder 10 are black so as not to interfere with the measurement of the fluorescence emission intensity due to light reflection.
前者の例としては、透明検査容器１の上部に隆起部を設けて検査容器ホルダ１０の穴部に引っかけて固定することが考えられる。検査容器ホルダ１０を透明ホットプレート２上に置いたときに、透明検査容器１が透明ホットプレート２に接するように設計してもよいし、数ミリ程度浮くように設計してもよい。
後者の例としては、底面が、透明プラスチック製、ガラス製など、光源部３の発する励起光及び測定対象が発する蛍光を遮断又は吸収しない透明底１１で作られている場合が挙げられる。
As an example of the former, it is possible to provide a protuberance on the upper part of the transparent cuvette 1 and to fix it by hooking it into a hole in the cuvette holder 10. When the cuvette holder 10 is placed on the transparent hot plate 2, the transparent cuvette 1 may be designed to contact the transparent hot plate 2, or may be designed to float by about several millimeters.
An example of the latter is a transparent bottom 11 made of transparent plastic, glass, or the like that does not block or absorb the excitation light emitted by the light source unit 3 or the fluorescence emitted by the measurement target.
（透明ホットプレート）
透明ホットプレート２の素材としては、透明プラスチック製、ガラス製など、光源部３の発する励起光及び測定対象が発する蛍光を遮断又は吸収しない素材が好ましい。温度が迅速かつ均一に伝わりやすいという観点から、ガラス製が特に好ましい。
(Transparent hot plate)
The transparent hot plate 2 is preferably made of a material that does not block or absorb the excitation light emitted by the light source unit 3 or the fluorescence emitted by the measurement target, such as transparent plastic or glass. Glass is particularly preferable from the viewpoint of rapid and uniform temperature transfer.
図４に、透明ホットプレート２の構造の一例を挙げる。透明ホットシート２０は、全体として透明であるが、電気を通すことによって発熱するシートである。透明ホットプレート２の構造の一例は、この透明ホットシート２０をガラスプレート２１が挟み込む３層構造を採っている。 Figure 4 shows an example of the structure of the transparent hot plate 2. The transparent hot sheet 20 is a sheet that is transparent overall, but generates heat by conducting electricity. One example of the structure of the transparent hot plate 2 is a three-layer structure in which the transparent hot sheet 20 is sandwiched between glass plates 21.
図５は、透明ホットシート２０の平面図である。透明ホットシート２０は、基板となる透明フィルム２４に細い電熱線２２を複数本配置して、この電熱線２２を電極２３に接続することで構成される。透明フィルム２４は、光源部３の発する励起光及び測定対象が発する蛍光を遮断又は吸収しない素材であれば何でもよい。電熱線２２は、ニクロム線などの発熱素子からなる細い線であり、透明フィルム２４に組み込まれているか又は貼り付けられている。電極２３に通電することにより、この電熱線２２が発熱することになる。電熱線２２は、透明フィルム２４に複数本配置されているが、細い線であるので、測定の妨げになることはない。 Figure 5 is a plan view of the transparent hot sheet 20. The transparent hot sheet 20 is constructed by arranging multiple thin heating wires 22 on a transparent film 24 that serves as a substrate, and connecting the heating wires 22 to electrodes 23. The transparent film 24 may be made of any material that does not block or absorb the excitation light emitted by the light source unit 3 or the fluorescence emitted by the measurement target. The heating wires 22 are thin wires made of heating elements such as nichrome wires, and are embedded in or attached to the transparent film 24. The heating wires 22 generate heat when electricity is applied to the electrodes 23. Although multiple heating wires 22 are arranged on the transparent film 24, they are thin wires and do not interfere with the measurement.
透明ホットプレート２としては、上記以外にも、ガラスやプラスチックの板を単独で用いて、端部から加熱することで伝熱によって全体を加熱させるものであってもよい。その他、透明ホットプレート２の構成に限定はない。 In addition to the above, the transparent hot plate 2 may be a glass or plastic plate that is heated from the edge and the entire plate is heated by heat transfer. There are no other limitations on the configuration of the transparent hot plate 2.
（光源部）
光源部３としては、光標識物質の励起波長を出力することのできる光源であれば足りる。例えば、発光ダイオードのように特定の波長を出力できるものや、予め広範囲な波長を出力できるレーザー光源のレーザー光路途中に特定の波長のみが通過できるフィルタを設置することなどが考えられる。
(Light source section)
Any light source capable of outputting the excitation wavelength of the photolabeling substance can be used as the light source unit 3. For example, a light emitting diode capable of outputting a specific wavelength, or a laser light source capable of outputting a wide range of wavelengths, with a filter that allows only a specific wavelength to pass, installed in the middle of the laser light path, can be considered.
（検出部）
検出部４としては、一般的な市販の蛍光光度計の他、汎用のデジタルカメラ、スマートフォンやタブレットの内蔵カメラなどが用いられる。本発明の検査方法によれば、温度応答性蛍光粒子の蛍光が強いため、条件次第では、スマートフォン、タブレットなどの汎用機器でも実用的に検出できる。
(Detection unit)
In addition to a typical commercially available fluorometer, a general-purpose digital camera, a built-in camera of a smartphone or tablet, etc. can be used as the detection unit 4. According to the inspection method of the present invention, since the fluorescence of the temperature-responsive fluorescent particles is strong, it can be practically detected even by general-purpose devices such as smartphones and tablets, depending on the conditions.
（フィルタ）
本発明においては、検出部４に入る光を制限するために、検出部４の上部などにフィルタ５を設けてもよい。フィルタ５は、励起光など蛍光発光以外のノイズとなる光をカットするフィルムである。
(filter)
In the present invention, in order to limit the light entering the detection unit 4, a filter 5 may be provided above the detection unit 4. The filter 5 is a film that cuts out light that becomes noise other than fluorescent emission, such as excitation light.
（本発明の蛍光発光強度測定の概要）
図６は、本発明の方法のうち、蛍光発光強度測定の概要を説明する図である。光源部３が透明ホットプレート２の略重力方向下側から温度応答性蛍光粒子に対応する励起光を照射し、励起光は透明ホットプレート２及び透明検査容器１の底面を透過して測定対象に照射される。
(Outline of the Fluorescence Emission Intensity Measurement of the Present Invention)
6 is a diagram for explaining an outline of the fluorescence emission intensity measurement in the method of the present invention. The light source unit 3 irradiates the transparent hot plate 2 with excitation light corresponding to the temperature-responsive fluorescent particles from below the transparent hot plate 2 in the direction of gravity, and the excitation light passes through the transparent hot plate 2 and the bottom surface of the transparent testing container 1 to be irradiated to the measurement target.
この際、図７で示すように、透明ホットプレート２が透明検査容器１の底面から徐々に加熱していることから、透明検査容器１の液体には温度分布が生じ、底面に近いほど温かいという状況が生まれる。底面に固定化された温度応答性蛍光粒子が後述する相転移温度を超えた場合、温度応答性蛍光粒子が蛍光特性を示し、蛍光発光することになる（図８）。すなわち、温度分布を調整することにより、底面に固定化されている温度応答性蛍光粒子が蛍光特性を示し、浮遊する温度応答性蛍光粒子は蛍光特性を示さないというタイミングを作り出すことができる。
図６に戻って、検出部４は、このときに発光された蛍光の強度を測定する。上記タイミングにおいては、底面に固定化されている温度応答性蛍光粒子が発光する蛍光のみを検出することができる。
At this time, as shown in Fig. 7, the transparent hot plate 2 gradually heats the transparent inspection container 1 from its bottom, so that a temperature distribution occurs in the liquid in the transparent inspection container 1, and the liquid is warmer closer to the bottom. When the temperature-responsive fluorescent particles fixed to the bottom exceed a phase transition temperature described later, the temperature-responsive fluorescent particles exhibit fluorescent properties and emit fluorescence (Fig. 8). That is, by adjusting the temperature distribution, it is possible to create a timing at which the temperature-responsive fluorescent particles fixed to the bottom exhibit fluorescent properties and the floating temperature-responsive fluorescent particles do not exhibit fluorescent properties.
6, the detection unit 4 measures the intensity of the fluorescence emitted at this time. At the above timing, only the fluorescence emitted by the temperature-responsive fluorescent particles immobilized on the bottom surface can be detected.
（温度応答性蛍光粒子）
温度応答性蛍光粒子は、少なくとも一種の両親媒性分子を含み構成される分子集合体中に、少なくとも一種の蛍光分子を含む。即ち、本発明の温度応答性蛍光粒子は、相転移（即ち、固相から液相への転移、あるいはゲル相から液晶相への転移）に伴って蛍光分子の凝集による消光状態が解離して発光状態になるとの現象を利用したものである（図８）。
(Temperature-responsive fluorescent particles)
The temperature-responsive fluorescent particles contain at least one type of fluorescent molecule in a molecular assembly that contains at least one type of amphipathic molecule. That is, the temperature-responsive fluorescent particles of the present invention utilize the phenomenon that the quenched state caused by the aggregation of fluorescent molecules is dissociated and becomes a luminous state with a phase transition (i.e., a transition from a solid phase to a liquid phase, or a transition from a gel phase to a liquid crystal phase) (FIG. 8).
よって、本発明で用いる温度応答性蛍光粒子は、分子集合体形態を保ったまま、固相状態から液相状態に相転移が起こるものであれば特に制限なく用いることができる。前記分子集合体は、好ましくは、単分子膜又は二分子膜を有する、より好ましくは、前記分子集合体は、脂質二分子膜（脂質二重層とも言う。）を有する。 Therefore, the temperature-responsive fluorescent particles used in the present invention can be used without any particular restrictions as long as they undergo a phase transition from a solid state to a liquid state while maintaining the molecular assembly form. The molecular assembly preferably has a monolayer or bilayer membrane, and more preferably has a lipid bilayer membrane (also called a lipid bilayer).
前記両親媒性分子（例：脂質分子）は、生体由来の脂質に限定されるものではなく、半合成、合成により製造されるリン脂質などの低分子やその誘導体、高分子、ペプチド、アミノ酸、カルボン酸などを原料として合成により製造できる両親媒性分子を含む。 The amphipathic molecules (e.g., lipid molecules) are not limited to lipids derived from living organisms, but include amphipathic molecules that can be synthesized using raw materials such as semi-synthetic or synthetically produced low molecules such as phospholipids and their derivatives, polymers, peptides, amino acids, and carboxylic acids.
前記温度応答性蛍光粒子は、温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が液相のときに前記蛍光分子が解離して蛍光発光し、固相のときに凝集して消光し、これにより、温度に応答して蛍光分子の蛍光発光と、消光とを可逆的に変換することができる（図８）。 The temperature-responsive fluorescent particles undergo a solid-liquid phase transition in response to temperature, in which the fluorescent molecules dissociate and emit fluorescence when the molecular aggregate is in the liquid phase, and aggregate and quench when the molecular aggregate is in the solid phase, thereby enabling the fluorescent molecules to reversibly switch between fluorescence emission and quenching in response to temperature (Figure 8).
すなわち、前記分子集合体は、温度に応答する固相－液相転移を示し、液相のときに解離した蛍光分子を有し蛍光発光し、固相のときに凝集した蛍光分子を有し凝集起因消光（aggregation-caused quenching）により消光する。前記分子集合体が脂質二重層を有する分子集合体である場合には、前記固相はゲル相であり、また前記液相は液晶相である。 That is, the molecular assembly exhibits a solid-liquid phase transition that responds to temperature, has dissociated fluorescent molecules in the liquid phase and emits fluorescence, and has aggregated fluorescent molecules in the solid phase and quenches the fluorescence due to aggregation-caused quenching. When the molecular assembly is a molecular assembly having a lipid bilayer, the solid phase is a gel phase and the liquid phase is a liquid crystal phase.
前記蛍光分子は、水相中で分子集合状態となって構築される疎水性の領域、例えば、単分子膜で囲まれた領域、あるいは脂質二分子膜などの二分子膜中、に配置されるため、両親媒性ないし脂溶性の蛍光分子が好適である。通常、蛍光分子は凝集により消光する性質を有しているので、固相－液相転移（例えば、脂質二分子膜のゲル－液晶相転移）に応答して凝集と解離を示す蛍光分子であれば、消光と発光を変換できる。 Since the fluorescent molecules are arranged in hydrophobic regions that are constructed in a molecular aggregate state in the aqueous phase, for example, in regions surrounded by a monolayer or in bilayer membranes such as lipid bilayer membranes, amphiphilic or lipophilic fluorescent molecules are suitable. Since fluorescent molecules usually have the property of quenching by aggregation, fluorescent molecules that show aggregation and dissociation in response to a solid-liquid phase transition (for example, the gel-liquid crystal phase transition of a lipid bilayer membrane) can convert quenching and emission.
該蛍光分子の例として、下記一般式（A）で表される化合物を挙げることができる。 An example of such a fluorescent molecule is a compound represented by the following general formula (A):
生体分子には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビン類、タンパク質、アミノ酸など、600 nm以下の波長の光を吸収して600 nm以下の波長の蛍光（自家蛍光）を発光するものがある。このため、生体分子の検出に最大吸収波長と最大蛍光発光波長が600 nm以下の蛍光プローブを使うと、蛍光測定において夾雑分子の自家蛍光による干渉が問題となる場合がある。よって、本発明の一般式（A）で表される化合物は、最大吸収波長と最大蛍光発光波長が600 nm以上にある蛍光分子であることが望ましく、さらに980 nm以上の波長の光を水に照射すると水の吸収による発熱が温度応答性粒子に作用することを考慮すると、最大吸収波長と最大蛍光発光波長が600～900 nm の範囲にある蛍光分子であることがより望ましい。 Some biomolecules, such as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, flavins, proteins, and amino acids, absorb light with a wavelength of 600 nm or less and emit fluorescence (autofluorescence) with a wavelength of 600 nm or less. For this reason, if a fluorescent probe with a maximum absorption wavelength and maximum fluorescence emission wavelength of 600 nm or less is used to detect a biomolecule, interference due to the autofluorescence of contaminating molecules may become a problem in the fluorescence measurement. Therefore, the compound represented by the general formula (A) of the present invention is preferably a fluorescent molecule with a maximum absorption wavelength and maximum fluorescence emission wavelength of 600 nm or more, and furthermore, considering that when light with a wavelength of 980 nm or more is irradiated onto water, heat generated by absorption by water acts on the temperature-responsive particles, it is more preferable that the compound is a fluorescent molecule with a maximum absorption wavelength and maximum fluorescence emission wavelength in the range of 600 to 900 nm.
前記蛍光分子の前記式（A）の化合物のより具体的な例としては、スクアリン酸誘導体を挙げることができる。 A more specific example of the compound of formula (A) of the fluorescent molecule is a squaric acid derivative.
前記スクアリン酸誘導体の例としては、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を挙げることができる。 An example of the squaric acid derivative is a compound represented by the following general formula (I):
ただし、Ｒ1及びＲ2は、各々独立し、同一であってもよく又は異なってもよい、疎水性基を表す。 Here, R 1 and R 2 each independently represent a hydrophobic group, which may be the same or different.
一般式（A）又は一般式（Ｉ）で表される化合物は、フリー体だけでなく、その塩も包含されるものとする。係る塩は化合物の種類によって異なるが、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基塩などの塩基付加塩、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩が挙げられる。 The compounds represented by general formula (A) or general formula (I) include not only the free form but also their salts. The salts vary depending on the type of compound, but examples include inorganic base salts such as alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salts (calcium salt, magnesium salt, etc.), aluminum salts, and ammonium salts, as well as base addition salts such as organic base salts such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, and N,N'-dibenzylethylenediamine, and acid addition salts such as inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, and phosphate, and organic acid salts such as citrate, oxalate, acetate, formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, and paratoluenesulfonate.
前記スクアリン酸誘導体において、Ｒ1及びＲ2は、直鎖炭化水素であってもよく、分岐鎖炭化水素であってもよく、また、飽和炭化水素であってもよく、不飽和炭化水素であってもよい。好ましくは、直鎖飽和炭化水素を挙げることができるが、前記分子集合体の液晶相で前記蛍光分子が解離し、ゲル相で凝集する限りこれに限定されない。 In the squaric acid derivative, R1 and R2 may be straight-chain hydrocarbons, branched-chain hydrocarbons, saturated hydrocarbons, or unsaturated hydrocarbons. A straight-chain saturated hydrocarbon is preferable, but is not limited thereto as long as the fluorescent molecules dissociate in the liquid crystal phase of the molecular aggregate and aggregate in the gel phase.
Ｒ1及びＲ2のより具体的な例としては、例えば、炭素数２～１０の炭化水素基が挙げられ、より具体的には、n-ブチル基、n-ペンチル基又はn-ヘキシル基から選択することができるが、前記分子集合体の液晶相で解離し、ゲル相で凝集する限りこれに限定されない。 More specific examples of R1 and R2 include, for example, a hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms, and more specifically, can be selected from an n-butyl group, an n-pentyl group, or an n-hexyl group, but are not limited thereto as long as they dissociate in the liquid crystal phase of the molecular assembly and aggregate in the gel phase.
前記両親媒性分子の例としては、リン脂質を挙げることができる。 An example of the amphipathic molecule is a phospholipid.
リン脂質の種類に特に限定はないが、グリセロリン脂質（ジアシル型リン脂質とも言う。）が好ましく、特に相転移を示す安定な脂質二分子膜を形成するには、親水部にホスホコリン基を有するジアシル型リン脂質が好ましい。ジアシル型リン脂質のアシル鎖長は同じであっても異なっていても良い。ホスホコリン基を有するジアシル型リン脂質には、飽和リン脂質および不飽和リン脂質が含まれ、本発明ではいずれのものでも使用でき、また、これらを組み合わせて用いてもよい。飽和ホスホコリンは、合成、半合成、例えば100％に近い水添率の水添卵黄レシチン、水添大豆レシチンなどの天然系リン脂質及びその誘導体、また、ジミリストイルホスホコリン、ジペンタデカノイルホスホコリン、ジパルミトイルホスホコリン、ジヘプタデカノイルホスホコリン、ジステアロイルホスホコリン等を用いることができる。 The type of phospholipid is not particularly limited, but glycerophospholipids (also called diacyl phospholipids) are preferred, and in particular, to form a stable lipid bilayer membrane that exhibits phase transition, diacyl phospholipids having a phosphocholine group in the hydrophilic part are preferred. The acyl chain length of the diacyl phospholipids may be the same or different. Diacyl phospholipids having a phosphocholine group include saturated phospholipids and unsaturated phospholipids, and any of these can be used in the present invention, or these may be used in combination. As the saturated phosphocholine, synthetic or semi-synthetic phospholipids, such as hydrogenated egg yolk lecithin and hydrogenated soybean lecithin with a hydrogenation rate close to 100%, natural phospholipids and derivatives thereof, as well as dimyristoylphosphocholine, dipentadecanoylphosphocholine, dipalmitoylphosphocholine, diheptadecanoylphosphocholine, distearoylphosphocholine, etc. can be used.
そして、前記分子集合体の例として、単分子膜（単層とも言う。）で囲まれた疎水性コアを有するエマルジョンや脂質ナノ粒子、球殻状に閉じた膜構造を有する小胞であるベシクルを挙げることができる。かかるベシクルとしては、脂質二分子膜ベシクル（リポソームとも言う。）を挙げることができるが、これに限定されない。本発明の温度応答性蛍光粒子として使用できる、すなわち、前記分子集合体として使用可能な粒子は、特定の温度で固相－液相転移又はゲル－液晶相転移する分子集合体である限り、多重層若しくは単層、又は、粒子径等によって限定されない。 Examples of the molecular assembly include emulsions and lipid nanoparticles having a hydrophobic core surrounded by a monolayer (also called a single layer), and vesicles, which are small vesicles having a membrane structure closed like a spherical shell. Examples of such vesicles include, but are not limited to, lipid bilayer vesicles (also called liposomes). Particles that can be used as the temperature-responsive fluorescent particles of the present invention, that is, particles that can be used as the molecular assembly, are not limited by whether they are multilayer or single layer, particle size, etc., as long as they are molecular assemblies that undergo a solid-liquid phase transition or a gel-liquid crystal phase transition at a specific temperature.
脂質ベシクルなどの分子集合体の凝集や融合を防止するため、親水部に荷電残基や高分子鎖をもつ両親媒性分子を構成成分に含ませることができる。こうして得られる脂質ベシクルなどの分子集合体は、電荷による静電反発や高分子鎖による立体排除効果により高い分散安定性を有している。 To prevent aggregation and fusion of molecular aggregates such as lipid vesicles, amphiphilic molecules with charged residues or polymer chains in the hydrophilic part can be included in the constituents. Molecular aggregates such as lipid vesicles obtained in this way have high dispersion stability due to electrostatic repulsion caused by the charge and steric exclusion effect of the polymer chains.
荷電残基をもつ両親媒性分子の例として、該分子が脂質分子の場合には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸を親水部に有するアニオン性リン脂質やL-glutamic acid, N-(3-carboxy-1-oxo propyl)-, 1,5-dihexadecyl ester（SA）などのカルボン酸型脂質、アミノ酸を親水基に有するアミノ酸型脂質が挙げられる。 Examples of amphipathic molecules with charged residues, when the molecule is a lipid molecule, include anionic phospholipids with phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, and phosphatidic acid in the hydrophilic portion, carboxylic acid lipids such as L-glutamic acid, N-(3-carboxy-1-oxopropyl)-, 1,5-dihexadecyl ester (SA), and amino acid lipids with amino acids in the hydrophilic group.
また、高分子鎖をもつ両親媒性分子の例として、該分子が脂質分子の場合には、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-monomethoxy poly(ethylene glycol)が挙げられる。Poly(ethylene glycol)の分子量に制限はないが、脂質ベシクルの凝集を防止するには1000～5000の分子量が好ましい。 An example of an amphiphilic molecule with a polymer chain is 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-monomethoxy poly(ethylene glycol) when the molecule is a lipid molecule. There is no limit to the molecular weight of poly(ethylene glycol), but a molecular weight of 1000 to 5000 is preferable to prevent aggregation of lipid vesicles.
また、両親媒性分子として、該分子が脂質分子の場合には、1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC14）、1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC15）（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-diheptade canoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC17)（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC18）、1,2-dipalmitoy l-sn-glycero-3-phosphocholine（PC16（DPPCとも言う。））、1,2-Dioleoyl- sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)、1,5-dihexadecyl-N-succiny-L-gluta mate（DHSG）、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DSPE） などを用いることもできる。 In addition, when the amphipathic molecule is a lipid molecule, the following may be used: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC14), 1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC15) (manufactured by Avanti Polar Lipids Inc.), 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC17) (manufactured by Avanti Polar Lipids Inc.), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC18), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC16 (also called DPPC)), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,5-dihexadecyl-N-succiny-L-gluta mate (DHSG), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), etc. can also be used.
前記脂質ベシクルなどの分子集合体における蛍光分子の凝集起因消光は、該分子集合体中の濃度に依存し、蛍光分子の濃度の低下に伴って、凝集起因消光も低下する。そこで、本発明の温度応答性蛍光粒子は、前記一般式(Ｉ)で表される化合物を0.3mol％以上、好ましくは0.7mol％以上、より好ましくは1.0mol％以上の濃度で含有する。 The aggregation-induced quenching of fluorescent molecules in molecular assemblies such as lipid vesicles depends on the concentration in the molecular assembly, and the aggregation-induced quenching decreases as the concentration of the fluorescent molecules decreases. Therefore, the temperature-responsive fluorescent particles of the present invention contain the compound represented by the general formula (I) at a concentration of 0.3 mol % or more, preferably 0.7 mol % or more, and more preferably 1.0 mol % or more.
係る温度応答性蛍光粒子の製造は、前記分子集合体の製造の際に前記式(Ｉ)の化合物を共存させることによって取得することができる。分子集合体の製造の例としては、公知の脂質ベシクルの製造方法に従って製造することができる（Sheng Dong et al, ACS Appl. Nano Mater. 2018, 1, 1009-1013）。 Such temperature-responsive fluorescent particles can be produced by allowing the compound of formula (I) to coexist during the production of the molecular assembly. As an example of the production of molecular assemblies, they can be produced according to a known method for producing lipid vesicles (Sheng Dong et al., ACS Appl. Nano Mater. 2018, 1, 1009-1013).
本発明の温度応答性蛍光粒子は、下記の温度応答性プローブ粒子の製造に利用できる。 The temperature-responsive fluorescent particles of the present invention can be used to manufacture the following temperature-responsive probe particles:
（温度応答性プローブ粒子）
温度応答性プローブ粒子は、温度応答性蛍光粒子の表面を生体分子認識素子で修飾することにより取得できる。本明細書において、「素子」とは、特定の機能、例えば、生体分子認識機能など、を発揮する分子を意味し、「素子」と「分子」との用語は互換的に用いることができる。また、本明細書において、「認識」とは、標的の分子を認識し、該分子に結合すること意味する。さらに、「生体分子認識素子」は、それ自体が直接生体分子を認識するものだけでなく、他の分子や分子複合体（例：ストレプトアビジンと、生体分子を認識するビオチン化抗体との複合体等）との結合を介して、間接的に生体分子を認識するものも包含されるものとする。
(Temperature-responsive probe particles)
The temperature-responsive probe particle can be obtained by modifying the surface of the temperature-responsive fluorescent particle with a biomolecule recognition element. In this specification, the term "element" means a molecule that exerts a specific function, such as a biomolecule recognition function, and the terms "element" and "molecule" can be used interchangeably. In this specification, "recognition" means recognizing a target molecule and binding to the molecule. Furthermore, the "biomolecular recognition element" includes not only those that directly recognize a biomolecule by themselves, but also those that indirectly recognize a biomolecule through binding with other molecules or molecular complexes (e.g., a complex of streptavidin and a biotinylated antibody that recognizes a biomolecule, etc.).
前記生体分子認識素子の例として、抗体又は該抗体の可変領域若しくは該抗体のfab断片（以下、「抗体等」と記載）を挙げることができる。本明細書において、係る素子、例えば抗体等は、下記で説明するように「検出用生体分子認識素子」と言い、素子が抗体等の場合には、「検出抗体」とも言う。 An example of the biomolecule recognition element is an antibody, or the variable region of the antibody, or a fab fragment of the antibody (hereinafter referred to as "antibody, etc."). In this specification, such an element, for example, an antibody, etc., is referred to as a "biomolecular recognition element for detection" as explained below, and when the element is an antibody, etc., it is also referred to as a "detection antibody."
一方、標的生体分子を測定容器底面等に固着する目的で、標的生体分子の別のエピトープに対する素子、例えば抗体等を使用する場合がある。本明細書において、かかる素子を、「捕獲用生体分子認識素子」と言い、素子が抗体等の場合には、「捕獲抗体」とも言う。 On the other hand, an element for another epitope of the target biomolecule, such as an antibody, may be used to fix the target biomolecule to the bottom surface of the measurement container, etc. In this specification, such an element is referred to as a "capture biomolecule recognition element", and when the element is an antibody, it is also referred to as a "capture antibody".
前記生体分子認識素子は、検出又は測定対象とする標的生体分子と結合することにより、標的生体分子と前記温度応答性蛍光粒子との複合体を形成することができる。 The biomolecular recognition element can bind to a target biomolecule to be detected or measured, thereby forming a complex between the target biomolecule and the temperature-responsive fluorescent particle.
従来技術であるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で使用されるように、前記生体分子認識素子として抗体を使用する場合、同一抗原の異なるエピトープに対して結合する検出抗体と捕獲抗体の２種類の抗体を使用する。検出抗体は、該抗体を介して抗原と温度応答性蛍光粒子とを結合させる。捕獲抗体はウェル等の測定容器の底面等に固定することにより被験対象である標的生体分子を測定容器の底面等に捕獲し、固着させる役割を有する。 When an antibody is used as the biomolecule recognition element, as in the conventional sandwich ELISA method, two types of antibodies are used: a detection antibody and a capture antibody, which bind to different epitopes of the same antigen. The detection antibody binds the antigen to the temperature-responsive fluorescent particles via the antibody. The capture antibody has the role of capturing and fixing the target biomolecule to be tested on the bottom surface of a measurement container such as a well by fixing the antibody to the bottom surface of the measurement container.
サンドイッチＥＬＩＳＡ法と同様に、本発明の温度応答性プローブ粒子において、検出抗体を前記温度応答性蛍光粒子に結合させるための抗体として、また、捕獲抗体をウェル等の測定容器の底面等に標的生体分子を固着させるための抗体として使用する。 As in the sandwich ELISA method, in the temperature-responsive probe particles of the present invention, the detection antibody is used as an antibody for binding to the temperature-responsive fluorescent particles, and the capture antibody is used as an antibody for fixing the target biomolecule to the bottom surface of a measurement container such as a well.
すなわち、前記生体分子認識素子が抗体のとき、（ａ）前記温度応答性蛍光粒子と検出抗体とで構成される温度応答性プローブ粒子、（ｂ） 検出抗体と捕獲抗体の抗原である標的生体分子、（ｃ）ウェル等の測定容器の底面に固定された捕獲抗体とが、温度応答性プローブ粒子（検出抗体が膜表面に修飾された温度応答性蛍光粒子）－標的生体分子（抗原）－捕獲抗体－測定容器の複合体を形成するときに、温度応答性プローブ粒子は測定容器底面に固着された状態となる。この状態で、測定容器底面を加温すると、測定容器底面からの熱伝導により前記複合体の温度は速やかに上昇する（図１１（ｂ））。このとき複合体中の温度応答性プローブ粒子が固相から液相に相転移することにより、固相では凝集し消光していた温度応答性蛍光粒子中の蛍光分子が解離し、蛍光発光する。一方、被験試料中に標的生体分子、すなわち抗原が存在しないとき、前記複合体は形成されない。そこで、温度応答性プローブ粒子は測定容器底面に固着することはできず、測定容器底面を加熱しても、溶媒を介した熱伝達による緩徐な昇温に留まるため、固相の状態をより長時間維持し、消光状態を維持する（図１２（ｂ））。 That is, when the biomolecule recognition element is an antibody, (a) a temperature-responsive probe particle composed of the temperature-responsive fluorescent particle and a detection antibody, (b) a target biomolecule that is an antigen of the detection antibody and the capture antibody, and (c) a capture antibody fixed to the bottom of a measurement container such as a well form a complex of the temperature-responsive probe particle (temperature-responsive fluorescent particle with a detection antibody modified on the membrane surface)-target biomolecule (antigen)-capture antibody-measurement container, and the temperature-responsive probe particle is fixed to the bottom of the measurement container. In this state, when the bottom of the measurement container is heated, the temperature of the complex rises quickly due to heat conduction from the bottom of the measurement container (Figure 11 (b)). At this time, the temperature-responsive probe particle in the complex undergoes a phase transition from solid to liquid phase, causing the fluorescent molecules in the temperature-responsive fluorescent particle that were aggregated and quenched in the solid phase to dissociate and emit fluorescence. On the other hand, when the target biomolecule, i.e., the antigen, is not present in the test sample, the complex is not formed. Therefore, the temperature-responsive probe particles cannot adhere to the bottom of the measurement container, and even if the bottom of the measurement container is heated, the temperature rise is only slow due to heat transfer through the solvent, so the solid phase state is maintained for a longer period of time, and the quenched state is maintained (Figure 12 (b)).
本発明の温度応答性プローブ粒子、すなわち、上記の表面が生体分子認識素子で修飾された温度応答性蛍光粒子は、公知の方法に従って、検出抗体で修飾された脂質ベシクルを製造し、取得することができる（国際公開パンフレットWO2020/241830、WO2000/064413、特開2003-73258号公報、特開昭58-134032号公報、Manjappa S. A., et al, J. Controlled Release 2011, 150, 2-22、Li T., et al, Nanomed.: Nanotechnol. Biol. Medicine, 2017, 13, 1219-1227）。 The temperature-responsive probe particle of the present invention, i.e., the temperature-responsive fluorescent particle whose surface is modified with a biomolecular recognition element, can be obtained by producing a lipid vesicle modified with a detection antibody according to a known method (International Publication WO2020/241830, WO2000/064413, JP2003-73258A, JP58-134032A, Manjappa S. A., et al, J. Controlled Release 2011, 150, 2-22, Li T., et al, Nanomed.: Nanotechnol. Biol. Medicine, 2017, 13, 1219-1227).
その他、本発明の温度応答性蛍光粒子、温度応答性プローブ粒子の製法は、公知の方法（Scientific Reports volume 10, Article number: 18086 (2020)など）を参照することができる。 For the production method of the temperature-responsive fluorescent particles and temperature-responsive probe particles of the present invention, refer to known methods (e.g., Scientific Reports volume 10, Article number: 18086 (2020)).
従来技術であるＥＬＩＳＡ法の測定操作では、標的生体分子に結合した抗体－酵素コンジュゲートと、標的生体分子に結合しなかった抗体－酵素コンジュゲートとを分離する操作、及び／又は、標的生体分子に結合しなかった抗体－ 酵素コンジュゲートとを洗浄する操作を必要とする。一方、本発明は、標的生体分子のエピトープに対する抗原－抗体反応を利用して熱源近傍に固着した温度応答性プローブ粒子への熱伝導による速やかな昇温と、標的生体分子に結合していない温度応答性蛍光粒子に対した溶媒を介した熱伝達による緩徐な温度変化の差を利用するため、ＥＬＩＳＡ法で必要な分離操作や洗浄操作を行うことなく、蛍光発光強度を測定することで、簡便、短時間かつ高感度で標的生体分子を検出できる。 The measurement procedure of the conventional ELISA method requires an operation to separate the antibody-enzyme conjugate bound to the target biomolecule from the antibody-enzyme conjugate that has not bound to the target biomolecule, and/or an operation to wash away the antibody-enzyme conjugate that has not bound to the target biomolecule. On the other hand, the present invention utilizes the difference between the rapid temperature rise caused by heat conduction to the temperature-responsive probe particles fixed near the heat source by utilizing the antigen-antibody reaction to the epitope of the target biomolecule, and the slow temperature change caused by heat conduction via the solvent to the temperature-responsive fluorescent particles that have not bound to the target biomolecule, and therefore the target biomolecule can be detected simply, quickly, and with high sensitivity by measuring the fluorescence emission intensity without performing the separation and washing procedures required for the ELISA method.
一方、サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、すでに各種生体分子に対する測定キットが商業的に利用されている。すなわち、測定容器としてのウェルの底面等に捕獲抗体が固定された測定用マイクロウェルプレートや検出抗体がキットに含まれる。そこで、例えば、このような商業的に利用可能なサンドイッチＥＬＩＳＡ 測定キットを利用することができる。本発明の温度応答性プローブ粒子を作製し、このようなキットに含まれる検出抗体や、捕獲抗体がウェル底面等に固定されたマイクロウェルプレート等を入手すれば、本発明を実施することができる。 Meanwhile, for the sandwich ELISA method, measurement kits for various biomolecules are already commercially available. That is, the kit includes a measurement microwell plate in which a capture antibody is fixed to the bottom of the well as a measurement container, and a detection antibody. Therefore, for example, such a commercially available sandwich ELISA measurement kit can be used. The present invention can be implemented by producing the temperature-responsive probe particles of the present invention and obtaining the detection antibody included in such a kit, or a microwell plate in which a capture antibody is fixed to the bottom of the well.
また、サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、マイクロウェルプレートのウェルの底面に固定させた捕獲抗体と、抗原（標的生体分子）と、ビオチン化された検出抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジンとの複合体を形成させることにより抗原を測定する測定キットが商業的に利用できる（図９（ａ）参照）。そこで、本発明の温度応答性プローブ粒子として、表面をビオチンで標識した温度応答性蛍光粒子を製造し、マイクロプレートのウェルの底面に固定させた捕獲抗体と、抗原（標的生体分子）と、ビオチン化された検出抗体と、ストレプトアビジンと、該表面をビオチンで標識した温度応答性蛍光粒子とを混合し，これらの複合体を形成させ、マイクロプレートのウェル底面を熱源で加熱し、温度応答性蛍光粒子を速やかに相転移させて蛍光発光させることにより、被験試料中の抗原（標的生体分子）を測定することができる（図９（ｂ）参照）。すなわち、この場合の生体認識素子としては、検出抗体単独ではなく、温度応答性蛍光粒子の表面を修飾したビオチン－ストレプトアビジン－ビオチン化検出抗体の複合体といえる。あるいは、マレイミド末端ポリエチレングリコール型脂質を導入することにより脂質ベシクルの表面をマレイミド基にて修飾し、検出抗体をペプシン処理後還元して得られた断片化抗体であるFab’のチオール基を反応させることによって作製された複合体も、温度応答性蛍光脂質ベシクル－断片化検出抗体の複合体といえる。このように、生体認識素子として、抗体単独に限定されることはなく、また、ビオチン－ストレプトアビジンに限定されることもなく、分子認識等により強い結合性を有する複合体を形成する各種の分子を利用することによって、本発明の温度応答性プローブ粒子を製造し、使用することができる。 In addition, in the sandwich ELISA method, a measurement kit is commercially available that measures antigens by forming a complex between a capture antibody immobilized on the bottom surface of a well of a microwell plate, an antigen (target biomolecule), a biotinylated detection antibody, and horseradish peroxidase (HRP)-labeled streptavidin (see FIG. 9(a)). Therefore, as the temperature-responsive probe particle of the present invention, a temperature-responsive fluorescent particle with a biotin-labeled surface is manufactured, and a capture antibody immobilized on the bottom surface of a well of a microplate, an antigen (target biomolecule), a biotinylated detection antibody, streptavidin, and a temperature-responsive fluorescent particle with a biotin-labeled surface are mixed to form a complex, and the bottom surface of the well of the microplate is heated with a heat source to rapidly cause a phase transition of the temperature-responsive fluorescent particles to emit fluorescence, thereby measuring the antigen (target biomolecule) in the test sample (see FIG. 9(b)). That is, in this case, the biorecognition element is not the detection antibody alone, but a complex of biotin-streptavidin-biotinylated detection antibody that modifies the surface of the temperature-responsive fluorescent particle. Alternatively, a complex produced by modifying the surface of a lipid vesicle with a maleimide group by introducing a maleimide-terminated polyethylene glycol type lipid, and reacting the thiol group of Fab', which is a fragmented antibody obtained by treating the detection antibody with pepsin and reducing it, can also be said to be a complex of temperature-responsive fluorescent lipid vesicle-fragmented detection antibody. In this way, the biorecognition element is not limited to an antibody alone, nor is it limited to biotin-streptavidin, and the temperature-responsive probe particle of the present invention can be produced and used by using various molecules that form a complex with strong binding properties through molecular recognition, etc.
分子認識による複合体形成に利用できる分子種として、例えば、糖鎖とレクチンの組み合わせ、核酸の相補的塩基配列、受容体とリガンド分子の組み合わせ、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーを挙げることができるが、これらに限定されない。 Examples of molecular species that can be used to form complexes through molecular recognition include, but are not limited to, combinations of glycans and lectins, complementary base sequences of nucleic acids, combinations of receptors and ligand molecules, nucleic acid aptamers, and peptide aptamers.
（標的生体分子の検出又は定量法）
本発明の標的生体分子の検出又は定量法は、従来の検出法、例えばエンドサイトーシスや膜融合により、蛍光プローブ粒子や、該粒子に含まれる蛍光分子を細胞膜へと輸送し、細胞を検出する方法や、蛍光分子が蛍光プローブ粒子から放出されることにより生じる蛍光を検出する方法など、とは全く異なる。
(Method for detecting or quantifying target biomolecules)
The method for detecting or quantifying a target biomolecule of the present invention is completely different from conventional detection methods, such as a method in which fluorescent probe particles or the fluorescent molecules contained in the particles are transported to a cell membrane by endocytosis or membrane fusion to detect a cell, or a method in which fluorescence generated by the release of fluorescent molecules from the fluorescent probe particles is detected.
上記で説明のとおり、上記温度応答性プローブ粒子及び温度応答性蛍光粒子は、分離操作や洗浄操作を行うことなく、蛍光発光強度を測定することで、短時間、簡便かつ高感度で標的生体分子を検出又は測定できる。あるいは、加熱ではなく洗浄操作により、生体分子を検出又は定量することもできる。また、被験試料を微小液滴化することにより、標的生体試料の分子検出法としても利用できる。 As explained above, the temperature-responsive probe particles and temperature-responsive fluorescent particles can detect or measure target biomolecules quickly, easily, and with high sensitivity by measuring the fluorescence emission intensity without separation or washing operations. Alternatively, biomolecules can be detected or quantified by washing operations rather than heating. In addition, by forming the test sample into microdroplets, it can also be used as a molecular detection method for target biological samples.
（本発明の検出方法のステップ（１））
本発明の検出方法のステップ（１）は、捕獲用生体分子認識素子が底面内側に固定化された透明検査容器を準備するステップである。捕獲用生体分子認識素子を固定化する方法は、公知の方法による。なお、当該ステップ（１）として、捕獲用生体分子認識素子が底面内側に固定化された透明検査容器の市販品を利用することもできる。
(Step (1) of the detection method of the present invention)
Step (1) of the detection method of the present invention is a step of preparing a transparent test vessel with a capture biomolecule recognition element immobilized on the inside of the bottom surface. The method of immobilizing the capture biomolecule recognition element is a known method. In addition, for step (1), a commercially available transparent test vessel with a capture biomolecule recognition element immobilized on the inside of the bottom surface can also be used.
（本発明の検出方法のステップ（２））
本発明の検出方法のステップ（２）は、前記温度応答性プローブ粒子と、前記生体試料と、前記捕獲用生体分子認識素子と、を接触させて前記透明検査容器内に測定対象を得るステップである。
(Step (2) of the detection method of the present invention)
Step (2) of the detection method of the present invention is a step of contacting the temperature-responsive probe particle, the biological sample, and the capture biomolecule recognition element to obtain a measurement target in the transparent test container.
本発明の生体分子の検出又は定量法に用いる温度応答性プローブ粒子の濃度は、特に限定されないが、捕獲用生体分子認識素子の接触時において、温度応答性プローブ粒子が、溶液中に1.0μg/ml以上、より好ましくは2.0μg/ml以上、さらに好ましくは5.0μg/ml以上の濃度で含まれていることが好ましい。 The concentration of the temperature-responsive probe particles used in the method for detecting or quantifying biomolecules of the present invention is not particularly limited, but it is preferable that the temperature-responsive probe particles are contained in the solution at a concentration of 1.0 μg/ml or more, more preferably 2.0 μg/ml or more, and even more preferably 5.0 μg/ml or more when contacting the capture biomolecule recognition element.
上記本発明の生体分子の検出又は定量法に用いる生体試料としては、例えば、動物又は細胞から採取した試料が挙げられる。また、前記試料は、標的の生体分子を含むことが既知の試料であってもよいし、標的の生体分子が含まれるか不明な試料であってもよい。かかる動物又は細胞としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物又は該動物に由来する細胞が挙げられる。動物由来の試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液などが挙げられ、好ましくは血液、血清又は血漿である。これらの試料は、自体公知の方法により得ることができ、例えば、血清や血漿は、常法に従って被検動物から採血し、液性成分を分離することにより調製することができ、脳脊髄液は、脊椎穿刺等の公知の手段により採取することができる。 Examples of biological samples used in the detection or quantification method of the biomolecule of the present invention include samples collected from animals or cells. The sample may be a sample known to contain a target biomolecule, or may be a sample whose presence or absence of a target biomolecule is unknown. Examples of such animals or cells include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, monkeys, orangutans, chimpanzees, and humans, or cells derived from such animals. Examples of samples derived from animals include blood, serum, plasma, saliva, urine, tears, sweat, milk, nasal secretions, semen, pleural fluid, gastrointestinal secretions, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, and lymphatic fluid, and are preferably blood, serum, or plasma. These samples can be obtained by methods known per se. For example, serum and plasma can be prepared by collecting blood from a test animal and separating the liquid components according to a conventional method, and cerebrospinal fluid can be collected by known means such as spinal puncture.
温度応答性プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させる方法は特に限定されない。例えば、生体試料を含む溶液と、温度応答性プローブ粒子とを、この順に基板上に添加することにより行うことができるが、この方法に限定されない。あるいは、あらかじめ生体試料と温度応答性プローブ粒子とを混合して作製した溶液を、基板上に添加してもよい（即ち、生体試料と温度応答性プローブ粒子とを同時に基板に接触させてもよい）。上記接触の際の条件としては、特に制限されないが、通常０～４５℃の温度下で接触させ、好ましくは０～４０℃の温度下で接触させ、より好ましくは４～３７℃の温度下で、さらに好ましくは２５℃～３７℃の温度下で接触させる。また、接触させる時間としても特に制限はないが、典型的には６時間以下であり、好ましくは２時間以下、より好ましくは１時間以下である。また、接触時間の下限も特に制限されないが、典型的には1 ０秒以上、好ましくは１分以上、より好ましくは１０分以上である。 The method of contacting the temperature-responsive probe particles and the biological sample with the capture biomolecule recognition element fixed to the substrate is not particularly limited. For example, the method is not limited to the method of contacting the temperature-responsive probe particles and the biological sample by adding the solution containing the biological sample and the temperature-responsive probe particles in this order to the substrate. Alternatively, a solution prepared by mixing the biological sample and the temperature-responsive probe particles in advance may be added to the substrate (i.e., the biological sample and the temperature-responsive probe particles may be contacted with the substrate at the same time). The conditions for the contact are not particularly limited, but the contact is usually performed at a temperature of 0 to 45°C, preferably at a temperature of 0 to 40°C, more preferably at a temperature of 4 to 37°C, and even more preferably at a temperature of 25 to 37°C. The contact time is also not particularly limited, but is typically 6 hours or less, preferably 2 hours or less, and more preferably 1 hour or less. The lower limit of the contact time is also not particularly limited, but is typically 10 seconds or more, preferably 1 minute or more, and more preferably 10 minutes or more.
また、温度応答性プローブ粒子が有する生体分子認識素子（例：ビオチン等）と同一のものを、検出用生体分子認識素子に付加することで、該生体分子認識素子を認識する素子（例：ストレプトアビジン等）を介して、温度応答性プローブ粒子と、検出用生体分子認識素子とを結合させてもよい。従って、一態様において、ステップ（２）が、温度応答性プローブ粒子と、生体分子認識素子を認識する素子と検出用生体分子認識素子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップであってもよい。接触方法については、上記で記載の方法と同様に行うことができる。例えば、生体試料を含む溶液と、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子及び温度応答性プローブ粒子を含む溶液とを、この順に基板上に添加することにより行うことができるが、この順番に限定されない。また、検出用生体分子認識素子と、生体分子認識素子を認識する素子と、温度応答性プローブ粒子を、別々に捕獲用生体分子認識素子と接触させてもよい。あるいは、あらかじめ生体試料、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子及び温度応答性プローブ粒子を混合して作製した溶液を、基板上に添加してもよい（即ち、生体試料、温度応答性蛍光プローブ生体分子認識素子を認識する素子及び検出用生体分子認識素子を同時に基板に接触させてもよい）。本方法の模式図を、図１０（ａ）～（ｃ）として示す。かかる方法により、図１０（ｃ）に示すように、１つの生体分子に対して複数の温度応答性プローブ粒子が結合することになり、検出感度を向上させることが可能となる。好ましい態様において、上記生体分子認識素子はビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子は、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。 In addition, the same biomolecule recognition element (e.g., biotin, etc.) as that possessed by the temperature-responsive probe particle may be added to the biomolecule recognition element for detection, so that the temperature-responsive probe particle and the biomolecule recognition element for detection may be bound via an element that recognizes the biomolecule recognition element (e.g., streptavidin, etc.). Therefore, in one embodiment, step (2) may be a step of contacting the temperature-responsive probe particle, the element that recognizes the biomolecule recognition element, the biomolecule recognition element for detection, and the biological sample with the capture biomolecule recognition element fixed to the substrate. The contact method may be the same as the method described above. For example, the contact may be performed by adding a solution containing a biological sample, a biomolecule recognition element for detection, an element that recognizes the biomolecule recognition element, and a solution containing the temperature-responsive probe particle in this order onto the substrate, but is not limited to this order. In addition, the biomolecule recognition element for detection, the element that recognizes the biomolecule recognition element, and the temperature-responsive probe particle may be contacted with the capture biomolecule recognition element separately. Alternatively, a solution prepared by mixing a biological sample, a detection biomolecule recognition element, an element that recognizes the biomolecule recognition element, and a temperature-responsive probe particle in advance may be added onto the substrate (i.e., a biological sample, an element that recognizes the temperature-responsive fluorescent probe biomolecule recognition element, and a detection biomolecule recognition element may be simultaneously brought into contact with the substrate). Schematic diagrams of this method are shown in Figures 10(a) to (c). With this method, as shown in Figure 10(c), multiple temperature-responsive probe particles are bound to one biological molecule, making it possible to improve detection sensitivity. In a preferred embodiment, the biomolecule recognition element is biotin, and the element that recognizes the biomolecule recognition element is streptavidin, avidin, or neutravidin.
（本発明の検出方法のステップ（３））
本発明の検出方法のステップ（３）は、透明検査容器の底面を透明ホットプレートの上に配置するステップである。この態様としては、透明検査容器１個又は複数個を直接透明ホットプレートの上に置いてもよいし、検査容器ホルダに入れた上で透明ホットプレートの上に置いてもよい。透明ホットプレートの熱が透明検査容器に伝わる態様であれば、限定はされず、透明検査容器が透明ホットプレートから浮いていたり、透明シートなどが挟まったりしても問題はない。ただし、光源部３の発する励起光及び測定対象が発する蛍光を遮断又は吸収しない態様である必要がある。
(Step (3) of the detection method of the present invention)
Step (3) of the detection method of the present invention is a step of placing the bottom surface of the transparent test vessel on the transparent hot plate. In this embodiment, one or more transparent test vessels may be placed directly on the transparent hot plate, or may be placed in a test vessel holder and then placed on the transparent hot plate. As long as the heat of the transparent hot plate is transferred to the transparent test vessel, there is no limitation, and there is no problem even if the transparent test vessel is floating above the transparent hot plate or a transparent sheet is sandwiched between the transparent test vessel and the transparent hot plate. However, it is necessary that the embodiment does not block or absorb the excitation light emitted by the light source unit 3 and the fluorescence emitted by the measurement target.
（本発明の検出方法のステップ（４））
本発明の検出方法のステップ（４）は、透明ホットプレートを加熱するステップである。加熱のタイミングは、透明検査容器の底面を透明ホットプレートの上に配置してから加熱しても、配置する前段階から加熱しておいてもよい。
(Step (4) of the detection method of the present invention)
Step (4) of the detection method of the present invention is a step of heating the transparent hot plate. The timing of heating may be after the bottom surface of the transparent test container is placed on the transparent hot plate, or may be before the bottom surface is placed on the transparent hot plate.
透明ホットプレートは、それ自身発熱するもの、電気や光の作用によって発熱するもの、他の熱源から熱伝導で熱を得るもの、などその方法は問わない。使用する温度応答性蛍光粒子が、相転移（即ち、固相から液相への転移、あるいはゲル相から液晶相への転移）する温度（相転移温度）を予め測定しておき、透明ホットプレートを相転移温度以上に加熱する必要がある。 The transparent hot plate can be one that generates heat by itself, one that generates heat through the action of electricity or light, or one that obtains heat through thermal conduction from another heat source; it does not matter how it is used. The temperature (phase transition temperature) at which the temperature-responsive fluorescent particles used undergo a phase transition (i.e., transition from solid phase to liquid phase, or transition from gel phase to liquid crystal phase) must be measured in advance, and the transparent hot plate must be heated to the phase transition temperature or higher.
その際、透明ホットプレートの設定温度と、相転移温度の差が大きい程、透明検査容器の底面が早く温まり、相転移も早く起きることになる。あまり差が大きすぎると、温度上昇が急激になり、透明検査容器全体が早く相転移温度を超えることになるため、透明検査容器の底面に補足されている測定対象の温度応答性プローブ粒子と、透明検査容器内の補足されずに浮遊している温度応答性プローブ粒子とが相転移温度を超えるまでの時間差が小さくなるために、蛍光発光強度測定がしにくくなるという問題が生じる。
他方で、あまり差が小さすぎると、透明検査容器の底面に補足されている測定対象の温度応答性プローブ粒子自体がなかなか温まらず、蛍光発光強度測定に時間がかかりすぎることになる。
このため、透明ホットプレートの設定温度は、蛍光発光強度測定が数秒から１分以内で完了するような温度にすることが好ましい。
In this case, the greater the difference between the set temperature of the transparent hot plate and the phase transition temperature, the faster the bottom of the transparent inspection vessel heats up and the faster the phase transition occurs. If the difference is too large, the temperature rises rapidly and the entire transparent inspection vessel exceeds the phase transition temperature quickly, so the time difference between the temperature-responsive probe particles to be measured that are captured on the bottom of the transparent inspection vessel and the temperature-responsive probe particles that are not captured and are floating in the transparent inspection vessel exceeds the phase transition temperature becomes small, resulting in a problem that it becomes difficult to measure the fluorescence emission intensity.
On the other hand, if the difference is too small, the temperature-responsive probe particles to be measured that are captured on the bottom surface of the transparent test container do not heat up easily, and it takes too long to measure the fluorescence emission intensity.
For this reason, it is preferable to set the transparent hot plate to a temperature at which the measurement of the fluorescence emission intensity can be completed within a few seconds to one minute.
（本発明の検出方法のステップ（５））
本発明の検出方法のステップ（５）は、透明ホットプレートの下側から透明検査容器内の底面近傍の蛍光発光強度を測定するステップである。
(Step (5) of the detection method of the present invention)
Step (5) of the detection method of the present invention is a step of measuring the fluorescence emission intensity in the vicinity of the bottom surface inside the transparent test container from below the transparent hot plate.
蛍光発光の検出又は測定方法に特に限定はないが、一般的な光ファイバ型蛍光検出器、マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、カメラ（例：CMOS素子搭載カメラ）を備えた検出器（例：ゲルイメージャー）などを用いれば検出又は測定できる。また、ＥＬＩＳＡ法での方法と同様に、標的生体分子の濃度が既知の試料（標準品）を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて、生体試料中の標的生体分子の濃度を定量することもできる。さらに、以下に記載の生体分子の定量法により定量することもできる。即ち、本発明の生体分子の検出法は、生体分子の定量法として応用できる。 There are no particular limitations on the method for detecting or measuring the fluorescence emission, but it can be detected or measured using a general optical fiber type fluorescence detector, a microplate reader, a fluorescence microscope, a detector equipped with a camera (e.g., a camera equipped with a CMOS element) (e.g., a gel imager), etc. In addition, as with the ELISA method, a calibration curve can be created using a sample (standard product) with a known concentration of the target biomolecule, and the concentration of the target biomolecule in a biological sample can be quantified using the calibration curve. Furthermore, it can also be quantified using the biomolecule quantification method described below. In other words, the biomolecule detection method of the present invention can be applied as a biomolecule quantification method.
検出の基本的な原理としては、透明ホットプレートの下側に配置された光源部から透明検査容器内に向けて励起光を当てることにより、相転移温度を超えて蛍光分子の凝集による消光状態が解離して発光状態になった温度応答性プローブ粒子を選択的に蛍光発光させ、検出部において、その強度を測定するというものである。 The basic principle of detection is that excitation light is directed into the transparent test vessel from a light source located below the transparent hot plate, causing the temperature-responsive probe particles to selectively emit fluorescence when the phase transition temperature is exceeded and the quenched state caused by the aggregation of fluorescent molecules is dissociated, resulting in a luminescent state, and the intensity of this emission is measured in the detection section.
その際、測定対象の温度応答性プローブ粒子は、透明検査容器の底面に補足されていることから、透明検査容器内の補足されずに浮遊している温度応答性プローブ粒子と比較して、透明ホットプレートによってより早いタイミングで相転移温度を超えることになる。 At this time, the temperature-responsive probe particles to be measured are captured on the bottom surface of the transparent testing container, and therefore exceed the phase transition temperature at an earlier time due to the transparent hot plate compared to temperature-responsive probe particles that are not captured and are floating in the transparent testing container.
図１１は、生体試料中に標的生体分子が存在している場合の時間の経過と蛍光強度の関係を示したものである。（ａ）透明検査容器を透明ホットプレート上に置いた瞬間は、測定対象の温度応答性プローブ粒子の温度は相転移温度未満であるので、光源部から励起光を当てたとしても、蛍光発光しない。その後、（ｂ）透明検査容器が透明ホットプレートで温まってくると、先に透明検査容器内の底面に補足されている測定対象の温度応答性プローブ粒子が温められて相転移温度を超えることにより、蛍光発光することになる。ただ、この時点では、透明検査容器内の補足されずに浮遊している温度応答性プローブ粒子は相転移温度を超えていないので、蛍光発光しない。さらにその後、（ｃ）透明検査容器内の補足されずに浮遊している温度応答性プローブ粒子も温められて相転移温度を超えることにより、蛍光発光することになる。これを下側の検出部から測定すると、図１１下部のグラフのようになる。 Figure 11 shows the relationship between the passage of time and the fluorescence intensity when the target biomolecule is present in the biological sample. (a) At the moment when the transparent inspection vessel is placed on the transparent hot plate, the temperature of the temperature-responsive probe particles to be measured is below the phase transition temperature, so even if excitation light is applied from the light source, no fluorescence is emitted. After that, (b) when the transparent inspection vessel is heated by the transparent hot plate, the temperature-responsive probe particles to be measured that have been captured on the bottom surface of the transparent inspection vessel are heated and exceed the phase transition temperature, causing fluorescence emission. However, at this point, the temperature-responsive probe particles that are not captured and floating in the transparent inspection vessel have not yet exceeded the phase transition temperature, so they do not emit fluorescence. After that, (c) the temperature-responsive probe particles that are not captured and floating in the transparent inspection vessel are also heated and exceed the phase transition temperature, causing fluorescence emission. When this is measured from the lower detection section, it becomes like the graph at the bottom of Figure 11.
図１２は、生体試料中に標的生体分子が存在していない場合の時間の経過と蛍光強度の関係を示したものである。図１１と比較して、透明検査容器内の底面に補足されている測定対象の温度応答性プローブ粒子が存在しないことから、透明検査容器内の温度応答性プローブ粒子はほとんどが浮遊している状態であり、透明検査容器内の底面だけが温められた（ｂ）の状態であっても、蛍光発光強度は弱い。その後、透明検査容器内の補足されずに浮遊している温度応答性プローブ粒子も温められた場合には、蛍光発光強度は最大値になる（ｃ）。 Figure 12 shows the relationship between the passage of time and the fluorescence intensity when the target biomolecule is not present in the biological sample. Compared to Figure 11, since there are no temperature-responsive probe particles to be measured trapped on the bottom surface of the transparent inspection container, most of the temperature-responsive probe particles in the transparent inspection container are in a floating state, and even in the state where only the bottom surface of the transparent inspection container is heated (b), the fluorescence emission intensity is weak. If the temperature-responsive probe particles that are not trapped and are floating in the transparent inspection container are also heated thereafter, the fluorescence emission intensity reaches a maximum value (c).
図１３は、図１１、１２の下部のグラフを重ね合わせたものである。生体試料中に標的生体分子が存在している場合と存在していない場合とでは、透明検査容器内の補足されずに浮遊している温度応答性プローブ粒子も温められた場合の蛍光発光強度は同じである。ただ、生体試料中に標的生体分子が存在している場合には、透明検査容器内の底面に測定対象の温度応答性プローブ粒子が補足されて局在化しているために、存在していない場合と比較してより早いタイミングで蛍光発光強度が強くなることになる。この時間差を測定することにより、標的生体分子が存在するかどうかを判断することができる。
なお、標的生体分子が特定量存在することが分かっているサンプルを用いることによって検量することにより、標的生体分子が含まれる量を定量することもできる。
Figure 13 is a superposition of the graphs at the bottom of Figures 11 and 12. When the target biomolecule is present in the biological sample and when it is not present, the fluorescence emission intensity when the temperature-responsive probe particles floating in the transparent test vessel without being captured are also heated is the same. However, when the target biomolecule is present in the biological sample, the temperature-responsive probe particles to be measured are captured and localized on the bottom surface of the transparent test vessel, so the fluorescence emission intensity becomes stronger at an earlier timing than when it is not present. By measuring this time difference, it is possible to determine whether the target biomolecule is present.
Additionally, the amount of target biomolecule present can be quantified by calibration using samples known to contain a particular amount of the target biomolecule.
１ 透明検査容器
２ 透明ホットプレート
３ 光源部
４ 検出部
５ フィルタ
９ 筐体
１０ 検査容器ホルダ
４０ 抗原
４１ 捕捉抗体
４２ 光標識物質
Reference Signs List 1 Transparent test container 2 Transparent hot plate 3 Light source unit 4 Detection unit 5 Filter 9 Housing 10 Test container holder 40 Antigen 41 Capture antibody 42 Photolabeled substance
Claims (4)
前記捕獲用生体分子認識素子が底面内側に固定化された透明検査容器を準備するステップと、
前記温度応答性プローブ粒子と、前記生体試料と、前記捕獲用生体分子認識素子と、を接触させて前記透明検査容器内に測定対象を得るステップと、
前記透明検査容器の底面を透明ホットプレートの上に配置するステップと、
前記透明ホットプレートを加熱するステップと、
前記透明ホットプレートの下側から前記透明検査容器内の蛍光発光強度を測定するステップと、
を含み、
前記蛍光発光強度を測定するステップは、前記透明検査容器内の底面内側に固定化されている前記温度応答性プローブ粒子が、前記透明検査容器内で固定化されずに浮遊している前記温度応答性プローブ粒子よりも先に温められて相転移温度を超えて蛍光発光したタイミングで実施されることを特徴とする方法。 A method for detecting or quantifying a target biomolecule contained in a biological sample by contacting a temperature-responsive probe particle having a surface-modified temperature-responsive fluorescent particle with a biological sample and a capture biomolecule recognition element, and then measuring the fluorescence emission intensity, comprising:
preparing a transparent test vessel having the capture biomolecular recognition element immobilized on the inside of the bottom surface ;
a step of contacting the temperature-responsive probe particle, the biological sample, and the capture biomolecule recognition element to obtain a measurement target in the transparent test container;
placing a bottom surface of the transparent test vessel on a transparent hot plate ;
heating the transparent hot plate ;
measuring the fluorescent emission intensity in the transparent test container from below the transparent hot plate ;
Including,
The method is characterized in that the step of measuring the fluorescence emission intensity is performed at a time when the temperature-responsive probe particles immobilized on the inside of the bottom surface of the transparent inspection vessel are heated faster than the temperature-responsive probe particles that are not immobilized and are floating in the transparent inspection vessel, exceeding their phase transition temperature and emitting fluorescence .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021000617A JP7638095B2 (en) | 2021-01-05 | 2021-01-05 | Method for detecting or quantifying target biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021000617A JP7638095B2 (en) | 2021-01-05 | 2021-01-05 | Method for detecting or quantifying target biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022105961A JP2022105961A (en) | 2022-07-15 |
| JP7638095B2 true JP7638095B2 (en) | 2025-03-03 |
Family
ID=82365579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021000617A Active JP7638095B2 (en) | 2021-01-05 | 2021-01-05 | Method for detecting or quantifying target biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7638095B2 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014180255A (en) | 2013-03-21 | 2014-09-29 | Kinki Univ | Base plate for cell treatment |
| JP2019110903A (en) | 2017-12-22 | 2019-07-11 | クレド バイオメディカル ピーティーイー リミテッド | Convective pcr device |
| WO2019189753A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | 栄研化学株式会社 | Fully automatic genetic testing device |
| WO2020241830A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 学校法人早稲田大学 | Temperature-responsive fluorescent particles for detection of biomolecules |
-
2021
- 2021-01-05 JP JP2021000617A patent/JP7638095B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014180255A (en) | 2013-03-21 | 2014-09-29 | Kinki Univ | Base plate for cell treatment |
| JP2019110903A (en) | 2017-12-22 | 2019-07-11 | クレド バイオメディカル ピーティーイー リミテッド | Convective pcr device |
| WO2019189753A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | 栄研化学株式会社 | Fully automatic genetic testing device |
| WO2020241830A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 学校法人早稲田大学 | Temperature-responsive fluorescent particles for detection of biomolecules |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022105961A (en) | 2022-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10866234B2 (en) | Method for detecting analyte | |
| JP7284470B2 (en) | Temperature-responsive fluorescent particles for detection of biomolecules | |
| JP6417725B2 (en) | Analyte detection method | |
| JP7769743B2 (en) | Method for reducing noise in signal-generating digital assays - Patent Application 20070122997 | |
| JP2023521872A (en) | Methods and systems for enhancing the optical signal of extracellular vesicles | |
| KR101916608B1 (en) | Biochemical-immunological hybrid biosensor and sensor system including the same | |
| JP5006459B1 (en) | Composite particles for labeling | |
| US10866237B2 (en) | Ultrahigh-sensitivity two-dimensional chromatography-based biosensor | |
| JP2023501164A (en) | Lateral flow assay system and method for quantification of biological samples | |
| EP4083610B1 (en) | Biomolecular inspection chip for fluorescence detection | |
| JP2019007984A (en) | Detection method of analysis object and test strip for lateral flow | |
| JP2007024883A (en) | Method for improving the sensitivity of POCT devices utilizing gold and silver nanoparticles by means of a nanostructure interacting with labeled particles or a substrate comprising nanoparticles | |
| JP7638095B2 (en) | Method for detecting or quantifying target biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles | |
| JP5529112B2 (en) | Chemical substance detection method | |
| JPH06502720A (en) | Analysis method | |
| US20100285607A1 (en) | Method for detecting and quantifying analytes on a solid support with liposome-encapsulated fluorescent molecules | |
| JPWO2003081243A1 (en) | Fluorescence polarization method, kit used therefor, and biosensor | |
| WO2025047645A1 (en) | Method for simultaneous detection of biomolecules using temperature-responsive fluorescent particles | |
| US7541196B2 (en) | Planar optical waveguide based sandwich assay sensors and processes for the detection of biological targets including early detection of cancers | |
| WO2024209981A1 (en) | Nanoparticle bodies, electrochemiluminescence immunoassay method using nanoparticle bodies, electrochemiluminescence sensor using nanoparticle bodies, cell for mounting electrochemiluminescence sensor, and assay kit provided therewith | |
| Kwon et al. | An automated microfluidic assay for the detection of cancer biomarkers in serum using photonic crystal enhanced fluorescence | |
| JP2009257764A (en) | Liposome composite, liposome array and method for detecting substance to be inspected | |
| Gagni | DEVELOPMENT OF NOVEL HIGH PERFORMANCE PROTEIN MICROARRAYS FOR DIAGNOSTIC APPLICATIONS | |
| JP2015215188A (en) | Capillary for high-speed assay and high-speed assay method using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230911 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20230911 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240716 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240730 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240930 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20241126 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20250121 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20250218 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7638095 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |