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JP7638309B2 - 低減した増幅バイアスによるハイスループット単一細胞シークエンシング - Google Patents
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JP7638309B2 - 低減した増幅バイアスによるハイスループット単一細胞シークエンシング - Google Patents

低減した増幅バイアスによるハイスループット単一細胞シークエンシング Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
この出願は２０１８年５月１７日に出願の米国特許仮出願第６２／６７３，０２３号および２０１９年３月２１日に出願の米国特許仮出願第６２／８２１，８６４号の権益を主張し、その各々は参照により完全に本明細書に組み込まれる。
政府資金提供
この発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成金番号ＤＰ１ ＨＧ００７８１１の下の政府援助によって作成された。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
本開示の実施形態は、核酸の配列決定に関する。詳細には、本明細書で提供される方法および組成物の実施形態は、インデックス付きの単一細胞シークエンシングライブラリーを生成すること、ならびに交差および染色体誤分離事象を含む稀な事象を特徴付けるために配列データをそこから得ることに関する。一部の実施形態では、本方法は、単細胞レベルでがん不均一性を明らかにすることに関する。
背景技術
現代の単一細胞ゲノムシークエンシング技術は、２つの主要な限界を有する。第１に、ほとんどの方法は個々の細胞を区分することを必要とし、それはスループットを制限する可能性がある。第２に、ほとんどの増幅方法はＰＣＲベースであり、したがって、指数関数的増幅バイアスを被る。第１の問題を解決するために、我々および同僚は、単一細胞の核酸内容を特異的にタグ付けし、それによって各連続した回のインデクシングによりスループットにおける指数関数的増加を可能にするために、数回のスプリット－プール分子バーコード化を実行する、単一細胞コンビナトリアルインデクシング（「ｓｃｉ－」）を開発した。ｓｃｉ－方法は、多数の単一細胞において、クロマチンアクセス性（ｓｃｉ－ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、トランスクリプトーム（ｓｃｉ－ＲＮＡ－ｓｅｑ）、ゲノム（ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑ）、メチローム（ｓｃｉ－ＭＥＴ）、染色体高次構造（ｓｃｉ－Ｈｉ－Ｃ）をプロファイリングするように首尾よく開発されている（Cao et al., 2017, Science 357:661-667；Cusanovich et al., 2015, Science, 348:910-914；Mulqueen et al., 2018, Nat. Biotechnol. 36:428-431；Ramani et al., 2017, Nat. Methods 14:263-266；Vitak et al., 2017, Nat. Methods 14:302-308）。第２の問題を解決するために、Ｔ７ベースの転写による線形増幅は、単一細胞アッセイとの関係で以前に利用された潜在的解法を提供する（Eberwine et al., 1992; Proceedings of the National Academy of Sciences 89:3010-3014；Hashimshony et al., 2012, Cell Rep. 2:666-673；Sos et al., 2016, Genome Biolol., 17:20）。例えば、最近、Chen et al.は、ゲノムを断片化し、インビトロ転写（ＩＶＴ）のためにＴ７ ＲＮＡプロモーターを同時に挿入するためにＴｎ５トランスポゾンを使用するトランスポゾン挿入による線形増幅を開発した（「ＬＩＡＮＴＩ」）。ＤＮＡ鋳型から生成されるＲＮＡコピーは、さらなる増幅のために鋳型の役割をすることができない。したがって、全てのコピーは、元のＤＮＡ鋳型に直接的に由来する。指数関数的増幅を回避することによって、ＬＩＡＮＴＩは均一性を維持し、配列のエラーを最小にする。しかし、この方法は各単一細胞からの連続的ライブラリー調製を必要とするので、ロースループットである（Chen et al., 2017, Science 356:189-194）。
スループットの指数関数的増加を可能にすると同時に増幅バイアスを最小にするために、単一細胞コンビナトリアルインデクシングおよび線形増幅を組み入れた方法が本明細書に記載される。複数回の分子バーコード化によって、本方法は、線形増幅の利点を保持しつつ、１回の実験につき少なくとも数千のおよび潜在的に数百万の細胞までスループットを向上させる。発明者は、単一細胞全ゲノムシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ」）、標的化ゲノムシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑ」）ならびにゲノムおよびトランスクリプトームの共アッセイ（「ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ」）の概念実証を通した方法の一般化の可能性を実証する。さらなる実証として、不妊の種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１雄マウスならびに妊性の種内（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１雄マウスからの未熟のおよび成熟した雄生殖細胞における、先例のない数の減数分裂の交差および稀な染色体誤分離事象をマッピングするために、単一細胞全ゲノムシークエンシングが適用される。
定義
本明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、関連する分野におけるそれらの通常の意味をとることが理解される。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味は、本明細書に示される。
本明細書で用いるように、用語「生物体」、「対象」は互換的に使用され、微生物（例えば、原核生物または真核生物）、動物および植物を指す。動物の例は、ヒトなどの哺乳動物である。
本明細書で用いるように、用語「細胞型」は、形態、表現型、発生起源または他の公知であるか認識できる特徴的な細胞特性に基づいて細胞を同定することを意図する。単一の生物体から（または、同種の生物体から）から様々な異なる細胞型を得ることができる。例示的な細胞型には、限定されずに、生殖体（雌生殖体、例えば、卵子または卵細胞、および雄生殖体、例えば精子）、上皮卵巣、卵巣線維芽細胞、精巣、尿膀胱、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、がん細胞、真核細胞、幹細胞、血液細胞、筋細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、神経細胞、骨細胞、膵臓細胞、内皮細胞、膵臓上皮、膵臓アルファ、膵臓ベータ、膵臓内皮、骨髄リンパ芽球、骨髄Ｂリンパ芽球、骨髄マクロファージ、骨髄赤芽球、骨髄樹状、骨髄脂肪細胞、骨髄骨細胞、骨髄軟骨細胞、前骨髄芽球、骨髄巨核芽球、膀胱、脳Ｂリンパ球、脳神経膠、ニューロン、脳星状神経膠細胞、神経外胚葉、脳マクロファージ、脳ミクログリア、脳上皮、皮質ニューロン、脳線維芽細胞、乳房上皮、結腸上皮、結腸Ｂリンパ球、乳房上皮、乳房筋上皮、乳房線維芽細胞、結腸腸細胞、子宮頸管上皮、乳房管上皮、舌上皮、扁桃樹状、扁桃Ｂリンパ球、末梢血リンパ芽球、末梢血Ｔリンパ芽球、末梢血皮膚Ｔリンパ球、末梢血ナチュラルキラー、末梢血Ｂリンパ芽球、末梢血単球、末梢血骨髄芽球、末梢血単芽球、末梢血前骨髄芽球、末梢血マクロファージ、末梢血好塩基球、肝臓内皮、肝臓マスト、肝臓上皮、肝臓Ｂリンパ球、脾臓内皮、脾臓上皮、脾臓Ｂリンパ球、肝細胞、肝臓、線維芽細胞、肺上皮、気管支上皮、肺線維芽細胞、肺Ｂリンパ球、肺シュワン、肺扁平上皮、肺マクロファージ、肺骨芽細胞、神経内分泌、肺胞、胃上皮および胃線維芽細胞が含まれる。
本明細書で用いるように、用語「組織」は、生物体において一緒に作用して１つまたは複数の特定の機能を実行する細胞の集合または凝集を意味するものである。細胞は、形態学的に類似してもよい。例示的な組織には、限定されずに、精巣上体、目、筋肉、皮膚、腱、静脈、動脈、血液、心臓、脾臓、リンパ節、骨、骨髄、肺、気管支、気管、腸、小腸、大腸、結腸、直腸、唾液腺、舌、胆嚢、虫垂、肝臓、膵臓、脳、胃、皮膚、腎臓、尿管、膀胱、尿道、性腺、精巣、卵巣、子宮、卵管、胸腺、脳下垂体、甲状腺、副腎または副甲状腺が含まれる。組織は、ヒトまたは他の生物体の様々な器官のいずれかに由来することができる。組織は、健全な組織または不健全な組織であってよい。不健全な組織の例には、限定されずに、生殖組織、肺、乳房、結直腸、前立腺、鼻咽頭、胃、精巣、皮膚、神経系、骨、卵巣、肝臓、血液組織、膵臓、子宮、腎臓、リンパ系組織等における悪性腫瘍が含まれる。悪性腫瘍は、様々な組織学的サブタイプ、例えば、癌腫、腺癌、肉腫、線維腺癌、神経内分泌または未分化のものであってよい。
本明細書で用いるように、用語「ヌクレオソーム」は、クロマチンの基礎反復単位を指す。ヒトゲノムは、約１０μｍの平均直径を有する、細胞の核の中に詰められている数メートルのＤＮＡからなる。真核生物の核では、ＤＮＡはクロマチンとして知られる核タンパク質複合体の中にパッケージされる。ヌクレオソーム（クロマチンの基礎反復単位）は、コアヒストン八量体の周囲に概ね１．７回巻かれる約１４６塩基対のＤＮＡを一般的に含む。ヒストン八量体は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の各々の２コピーからなる。ヌクレオソームは、ストリング上のビーズの様式でＤＮＡに沿って規則的に間隔を置いて配置される。
本明細書で用いるように、用語「コンパートメント」は、ある物を他の物から分離または隔離する領域または容量を意味するものである。例示的なコンパートメントには、限定されずに、バイアル、チューブ、ウェル、液滴、ボーラス、ビーズ、容器、表面特性、または物理的力、例えば液流、磁気、電流などによって分離される領域もしくは容量が含まれる。一実施形態では、コンパートメントは、マルチウェルプレート、例えば９６－または３８４－ウェルプレートのウェルである。本明細書で用いるように、液滴はヒドロゲルビーズを含むことができ、それは１つまたは複数の核または細胞を封入するためのビーズであり、ヒドロゲル組成物または液滴ベースのマイクロフルーイディックスを含む。一部の実施形態では、液滴はヒドロゲル材料の均一な液滴であるか、またはポリマーヒドロゲルシェルを有する中空の液滴である。均一であれまたは中空であれ、液滴は、１つまたは複数の核または細胞を封入することが可能であってよい。
本明細書で用いるように、「トランスポソーム複合体」は、組入れ認識部位を含む組入れ酵素および核酸を指す。「トランスポソーム複合体」は、トランスポジション反応を触媒することが可能であるトランスポザーゼおよびトランスポザーゼ認識部位によって形成される機能的複合体である（例えば、Gunderson et al.、ＷＯ２０１６／１３０７０４を参照する）。組入れ酵素の例には、限定されずに、インテグラーゼまたはトランスポザーゼが含まれる。組入れ認識部位の例には、限定されずに、トランスポザーゼ認識部位が含まれる。
本明細書で用いるように、用語「核酸」は、当分野でのその使用と一貫しているものであって、天然に存在する核酸またはその機能的類似体を含む。特に有益な機能的類似体は配列特異的に核酸にハイブリダイズすることが可能であるか、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することが可能である。天然に存在する核酸は、ホスホジエステル結合を含有する主鎖を一般的に有する。類似体構造体は、当技術分野で公知である様々なもののいずれかを含む交互の主鎖連結を有することができる。天然に存在する核酸は、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出される）またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見出される）を一般的に有する。核酸は、当技術分野で公知であるこれらの糖部分の様々な類似体のいずれも含有することができる。核酸は、天然または非天然の塩基を含むことができる。この点に関しては、天然のデオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有することができ、リボ核酸は、アデニン、ウラシル、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有することができる。核酸に含まれてもよい有益な非天然の塩基は、当技術分野で公知である。非天然の塩基の例には、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）および偽相補的塩基（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。ＬＮＡおよびＢＮＡ塩基は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み込むことができ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの強度および特異性を増加させることができる。ＬＮＡおよびＢＮＡ塩基およびそのような塩基の使用は、当業者に公知であり、ルーチンである。
本明細書で用いるように、用語「標的」は、核酸に関して使用するとき、本明細書に示される方法または組成物との関連で核酸のための意味論的な識別子であるものであり、さもなければ明示的に示されるものを越えて核酸の構造または機能を必ずしも制限するというわけではない。標的核酸は、既知のまたは未知の配列の事実上いかなる核酸であってもよい。それは、例えば、ゲノムＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）、染色体外ＤＮＡ、例えばプラスミド、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡまたは非コードＲＮＡ）、タンパク質（例えば、細胞内または細胞表面タンパク質）またはｃＤＮＡの断片であってよい。シークエンシングは、標的分子の全体または一部の配列の決定をもたらすことができる。標的は、核などの一次核酸試料に由来することができる。一実施形態では、標的は、各標的断片の片方または両方の末端への遍在（ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ））配列の設置によって、増幅に適する鋳型に加工することができる。標的は、ｃＤＮＡへの逆転写によって最初のＲＮＡ試料から得ることもできる。一実施形態では、標的は、細胞の中に存在するＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のサブセットに関して使用される。標的化シークエンシングは、一般的にＰＣＲ増幅（例えば、領域特異的プライマー）またはハイブリダイゼーションベースの捕捉方法（例えば、捕捉プローブの使用）または抗体による、目的の遺伝子または領域またはタンパク質の選択および単離を使用する。標的化富化は、本方法の様々な段階で起こすことができる。例えば、標的化ＲＮＡ表示は、より複雑なライブラリーからのサブセットの逆転写工程またはハイブリダイゼーションベースの富化において標的特異的プライマーを使用して得ることができる。例は、エクソームシークエンシングまたはＬ１０００アッセイ（Subramanian et al., 2017, Cell, 171;1437-1452）である。標的化シークエンシングは、当業者に公知である富化プロセスのいずれも含むことができる。
本明細書で用いるように、用語「遍在性」は、ヌクレオチド配列を記載するために使用するとき、２つ以上の核酸分子に共通する配列の領域を指し、ここで、分子は互いと異なる配列の領域も有する。分子の集合の異なるメンバーに存在する遍在配列は、遍在捕捉核酸、例えば、遍在配列、例えば遍在捕捉配列の一部に相補的である捕捉オリゴヌクレオチドの集団を使用して複数の異なる核酸の捕捉を可能にすることができる。遍在捕捉配列の非限定的な例には、Ｐ５およびＰ７プライマーに同一であるかまたは相補的である配列が含まれる。同様に、分子の集合の異なるメンバーに存在する遍在配列は、遍在配列、例えば遍在アンカー配列の一部に相補的である遍在プライマーの集団を使用して複数の異なる核酸の複製（シークエンシング）または増幅を可能にすることができる。遍在アンカー配列の非限定的な例には、スペーサー配列、例えばｓｐ１およびｓｐ２に同一であるかまたは相補的である配列が含まれる。一実施形態では、遍在アンカー配列は、遍在プライマー（例えば、読み取り１（リード（ｒｅａｄ）１）または読み取り２のためのシークエンシングプライマー）がシークエンシングのためにアニールする部位として使用される。したがって、捕捉オリゴヌクレオチドまたは遍在プライマーは、遍在配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を含む。
用語「Ｐ５」および「Ｐ７」は、遍在性の捕捉配列または捕捉オリゴヌクレオチドに言及するときに使用することができる。用語「Ｐ５’」（Ｐ５プライム）および「Ｐ７’」（Ｐ７プライム）は、Ｐ５およびＰ７の相補体をそれぞれ指す。本明細書で提示される方法において、任意の適する遍在性の捕捉配列または捕捉オリゴヌクレオチドを使用することができ、Ｐ５およびＰ７の使用は例示的な実施形態だけであることが理解されよう。Ｐ５およびＰ７などの捕捉オリゴヌクレオチドまたはフローセル上のそれらの相補体の使用は、ＷＯ２００７／０１０２５１、ＷＯ２００６／０６４１９９、ＷＯ２００５／０６５８１４、ＷＯ２０１５／１０６９４１、ＷＯ１９９８／０４４１５１およびＷＯ２０００／０１８９５７の開示によって例示されるように、当技術分野で公知である。例えば、相補的な配列とのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のために、本明細書で提示される方法において、固定化されようが溶液状態であるにせよ、任意の適するフォワード増幅プライマーが有益である可能性がある。同様に、相補的な配列とのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のために、本明細書で提示される方法において、固定化されようが溶液状態であるにせよ、任意の適するリバース増幅プライマーが有益である可能性がある。当業者は、本明細書で提示されるような核酸の捕捉および／または増幅のために適するプライマー配列をどのように設計および使用するかを理解する。
本明細書で用いるように、用語「プライマー」およびその派生語は、目的の標的配列にハイブリダイズすることができる任意の核酸を一般的に指す。一般的に、プライマーは、その上にヌクレオチドをポリメラーゼによって重合させることができるかまたはインデックスなどのヌクレオチド配列をそれにライゲーションすることができる基質として機能する。しかし、一部の実施形態では、プライマーは合成された核酸鎖に組み込むことができ、および、合成された核酸分子に相補的な新しい鎖の合成を刺激するために、別のプライマーがハイブリダイズすることができる部位を提供することができる。プライマーは、ヌクレオチドまたはその類似体の任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、プライマーは一本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は本明細書では互換的に使用されて任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体またはそれらの混合物を含むことができる。本用語は、同等物として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡの類似体またはヌクレオチド類似体から作製される抗体－オリゴコンジュゲートを含むと、ならびに一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖のポリヌクレオチドに適用可能であると理解されるべきである。本明細書で使用される本用語は、例えば逆転写酵素の作用によってＲＮＡ鋳型から生成される、相補的なまたはコピーのＤＮＡであるｃＤＮＡも包含する。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、本用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。
本明細書で用いるように、用語「アダプター」およびその誘導体、例えば遍在アダプターは、本開示の核酸分子にライゲーションすることができる任意の線状オリゴヌクレオチドを一般的に指す。一部の実施形態では、アダプターは、試料中に存在するいかなる標的配列の３’末端にも５’末端にも実質的に非相補的である。一部の実施形態では、適するアダプター長は、約１０～１００ヌクレオチド、約１２～６０ヌクレオチドまたは約１５～５０ヌクレオチドの範囲内の長さである。一般的に、アダプターは、ヌクレオチドおよび／または核酸の任意の組合せを含むことができる。一部の態様では、アダプターは、１つまたは複数の位置に１つまたは複数の切断可能な基を含むことができる。別の態様では、アダプターは、プライマー、例えば遍在プライマーの少なくとも一部に実質的に同一であるかまたは実質的に相補的である配列を含むことができる。一部の実施形態では、下流のエラー補正、同定またはシークエンシングを支援するために、アダプターは、バーコード（本明細書において、タグまたはインデックスとも呼ばれる）を含むことができる。用語「アダプター」および「アダプター」は、互換的に使用される。
本明細書で用いるように、用語「各々」は、アイテムの集合に関して使用するとき、文脈が明らかに別途指図しない限り、集合の中の個々のアイテムを識別するものであるが、集合の中のあらゆるアイテムを必ずしも指すとは限らない。
本明細書で使用されるように、用語「運搬」は、流体を通しての分子の移動を指す。この用語は、それらの濃度勾配に沿った分子の移動（例えば、受動拡散）などの受動運搬を含むことができる。この用語は、分子がそれらの濃度勾配に沿って、またはそれらの濃度勾配の反対に移動することができる、能動運搬を含むこともできる。したがって、運搬は、所望の方向にまたは増幅部位などの所望の位置に１つまたは複数の分子を移動させるためにエネルギーを加えることを含むことができる。
本明細書で使用されるように、「増幅する」、「増幅すること」または「増幅反応」およびそれらの派生語は、核酸分子の少なくとも一部が少なくとも１つのさらなる核酸分子の中に複製またはコピーされる、任意の作用またはプロセスを一般的に指す。さらなる核酸分子は、鋳型核酸分子の少なくとも一部の部分に実質的に同一であるかまたは実質的に相補的である配列を含んでもよい。鋳型核酸分子は一本鎖でも二本鎖であってもよく、さらなる核酸分子は独立して一本鎖でも二本鎖であってもよい。増幅は、核酸分子の線形または指数関数的複製を含んでもよい。一部の実施形態では、そのような増幅は、等温条件を使用して実行することができる。他の実施形態では、そのような増幅は、サーモサイクリングを含むことができる。一部の実施形態では、増幅は、単一の増幅反応における複数の標的配列の同時増幅を含む多重増幅である。一部の実施形態では、「増幅」は、単独のまたは組合せた、ＤＮＡおよびＲＮＡベースの核酸の少なくとも一部の部分の増幅を含む。増幅反応は、当業者に公知である増幅プロセスのいずれかを含むことができる。一部の実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
本明細書で使用されるように、「増幅条件」およびその派生語は、１つまたは複数の核酸配列を増幅するのに適する条件を一般的に指す。そのような増幅は、線形であっても指数関数的であってもよい。一部の実施形態では、増幅条件は等温条件を含むことができるか、あるいは、サーモサイクリング条件または等温性およびサーモサイクリング条件の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列を増幅するのに適する条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を含む。一般的に、増幅条件は、遍在配列が隣接している１つまたは複数の標的配列などの核酸を増幅するか、または１つまたは複数のアダプターにライゲーションしている増幅された標的配列を増幅するのに十分である反応混合物を指す。一般的に、増幅条件は、増幅または核酸合成のための触媒、例えばポリメラーゼ；増幅させる核酸に多少の相補性を有するプライマー；およびヌクレオチド、例えば核酸にハイブリダイズしたプライマーの伸長を促進するデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。増幅条件は、核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションまたはアニーリング、プライマーの伸長、および伸長したプライマーが増幅中の核酸配列から分離される変性工程を必要とする可能性がある。一般的に、しかしそうとは限らないが、増幅条件はサーモサイクリングを含むことができ、一部の実施形態では、増幅条件は、アニーリング、伸長および分離の工程が反復される複数のサイクルを含む。一般的に、増幅条件は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋などのカチオンを含み、イオン性の強度の様々な調節剤を含むこともできる。
本明細書で使用されるように、「再増幅」およびそれらの派生語は、増幅される核酸分子の少なくとも一部が任意の適する増幅プロセス（一部の実施形態では「二次」増幅と呼ばれる）を通してさらに増幅され、それによって再増幅された核酸分子を生成する、任意のプロセスを一般的に指す。二次増幅は、増幅された核酸分子を生成した元の増幅プロセスと同一である必要がなく；再増幅された核酸分子が増幅された核酸分子と完全に同一である必要も完全に相補的である必要もなく；必要とされることの全ては、再増幅された核酸分子が増幅された核酸分子またはその相補体の少なくとも一部を含むということである。例えば、再増幅は、一次増幅と異なる標的特異的プライマーを含む、異なる増幅条件および／または異なるプライマーの使用を含むことができる。
本明細書で使用されるように、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングも精製もなしでゲノムＤＮＡの混合物中の目的のポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号の方法を指す。目的のポリヌクレオチドを増幅するためのこのプロセスは、所望の目的のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ混合物に大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入すること、および続くＤＮＡポリメラーゼの存在下での一連の熱サイクルからなる。２つのプライマーは、目的の二本鎖ポリヌクレオチドのそれらのそれぞれの鎖に相補的である。混合物は先ずより高い温度で変性させ、目的のポリヌクレオチド分子の中の相補的配列にプライマーを次にアニールさせる。アニーリングの後、プライマーをポリメラーゼで伸長させ、相補鎖の新しい対を形成する。所望の目的のポリヌクレオチドの高濃度の増幅されたセグメントを得るために、変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を多数回繰り返すことができる（サーモサイクリングと呼ばれる）。所望の目的のポリヌクレオチドの増幅されたセグメント（アンプリコン）の長さは、お互いに対するプライマーの相対的な位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。このプロセスを繰り返すことから、本方法はＰＣＲと呼ばれる。目的のポリヌクレオチドの所望の増幅されたセグメントが混合物中の支配的な核酸配列（濃度に関して）になるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言われる。上記の方法の改変形では、標的核酸分子は、複数の異なるプライマーを使用して、一部の場合には、目的の標的核酸１分子につき１つまたは複数のプライマー対を使用してＰＣＲ増幅することができ、それによって多重ＰＣＲ反応を形成する。
本明細書で定義される通り、「多重増幅」は、少なくとも１つの標的特異的プライマーを使用した、試料中の２つ以上の標的配列の選択的な非ランダム増幅を指す。一部の実施形態では、多重増幅は、標的配列の一部または全部が単一の反応容器の中で増幅されるように実行される。所与の多重増幅の「プレキシ」または「プレックス」は、その単一の多重増幅の間に増幅される異なる標的特異的配列の数を一般的に指す。一部の実施形態では、プレキシは、約１２プレックス、２４プレックス、４８プレックス、９６プレックス、１９２プレックス、３８４プレックス、７６８プレックス、１５３６プレックス、３０７２プレックス、６１４４プレックスまたはそれより多くてもよい。増幅された標的配列を、いくつかの異なる方法によって検出することも可能である（例えば、ゲル電気泳動および続くデンシトメトリー、バイオアナライザーまたは定量的ＰＣＲによる定量化、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組込みおよび続くアビジン－酵素コンジュゲート検出；増幅された標的配列への３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の組込み）。
本明細書で使用されるように、「増幅された標的配列」およびその派生語は、本明細書で提供される標的特異的プライマーおよび方法を使用して標的配列を増幅することによって生成された核酸配列を一般的に指す。増幅された標的配列は、標的配列に対して同じセンス（すなわち、正の鎖）またはアンチセンス（すなわち、負の鎖）のいずれであってもよい。
本明細書で使用されるように、用語「ライゲーションする」、「ライゲーション」およびそれらの派生語は、２つ以上の分子を共有結合するための、例えば２つ以上の核酸分子をお互いと共有結合させるためのプロセスを一般的に指す。一部の実施形態では、ライゲーションは、核酸の隣接したヌクレオチドの間のニックの連結を含む。一部の実施形態では、ライゲーションは、第１の核酸分子の末端と第２の核酸分子の末端の間で共有結合を形成することを含む。一部の実施形態では、ライゲーションは、１つの核酸の５’リン酸基と第２の核酸の３’ヒドロキシル基の間で共有結合を形成し、それによってライゲーションされた核酸分子を形成することを含むことができる。一般的に、本開示の目的のために、増幅された標的配列をアダプターにライゲーションし、アダプターにライゲーションされた、増幅された標的配列を生成することができる。
本明細書で使用されるように、「リガーゼ」およびその派生語は、２つの基質分子のライゲーションを触媒することが可能な任意の薬剤を一般的に指す。一部の実施形態では、リガーゼは、核酸の隣接したヌクレオチドの間のニックの連結を触媒することが可能な酵素を含む。一部の実施形態では、リガーゼは、１つの核酸分子の５’リン酸と別の核酸分子の３’ヒドロキシルの間での共有結合の形成を触媒し、それによってライゲーションされた核酸分子を形成することが可能である酵素を含む。適するリガーゼは、限定されずに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびＥ．コリ（E. coli）ＤＮＡリガーゼを含むことができる。
本明細書で使用されるように、「ライゲーション条件」およびその派生語は、２つの分子をお互いとライゲーションするのに適する条件を一般的に指す。一部の実施形態では、ライゲーション条件は、核酸間のニックまたはギャップを密封するのに適する。本明細書で使用されるように、用語ニックまたはギャップは、当技術分野での用語の使用と一貫している。一般的に、ニックまたはギャップは、適当な温度およびｐＨにおいてリガーゼなどの酵素の存在下でライゲーションすることができる。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約７０～７２℃の温度で核酸の間のニックを連結することができる。
本明細書で使用されるように用語「フローセル」は、１つまたは複数の液体試薬を流すことができる固体表面を含むチャンバーを指す。本開示の方法において直ちに使用することができるフローセルおよび関連した液体システムおよび検出プラットホームの例が、例えば、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、国際公開第０４／０１８４９７号；米国特許第７，０５７，０２６号；国際公開第９１／０６６７８号；国際公開第０７／１２３７４４号；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，４０５，２８１号および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載される。
本明細書で使用されるように、核酸に関して使用されるとき、用語「アンプリコン」は、核酸のコピー産物を意味し、ここで、産物は核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同じであるかまたはそれに相補的であるヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、例えば、ポリメラーゼ伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ライゲーション伸長またはライゲーション連鎖反応を含む、核酸またはそのアンプリコンを鋳型として使用する様々な増幅方法のいずれかによって生成することができる。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列（例えばＰＣＲ産物）の単一コピーまたはヌクレオチド配列（例えば、ＲＣＡのコンカテマー産物）の複数のコピーを有する核酸分子であってよい。標的核酸の第１のアンプリコンは、一般的に相補的なコピーである。以降のアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成の後に標的核酸から、または第１のアンプリコンから作製されるコピーである。以降のアンプリコンは、標的核酸に実質的に相補的であるか、標的核酸と実質的に同一である配列を有することができる。
本明細書で使用されるように、用語「増幅部位」は、１つまたは複数のアンプリコンを生成することができる、アレイの中のまたはその上の部位を指す。増幅部位は、その部位で生成される少なくとも１つのアンプリコンを含有するか、保持するか、付着させるようにさらに構成することができる。
本明細書で使用されるように、用語「アレイ」は、相対的な位置によってお互いから区別することができる部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイの中の部位の位置によってお互いから区別することができる。アレイの個々の部位は、特定のタイプの１つまたは複数の分子を含むことができる。例えば、部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含むことができるか、または、部位は、同じ配列（および／またはその相補的な配列）を有するいくつかの核酸分子を含むことができる。アレイの部位は、同じ基質の上に位置する異なるフィーチャーであってよい。例示的なフィーチャーには、限定されずに、基質の中のウェル、基質の中かその上のビーズ（または、他の粒子）、基質からの突起、基質の上の隆起または基質の中のチャネルが含まれる。アレイの部位は、異なる分子を各々有する別個の基質であってよい。別個の基質に付着している異なる分子は、基質が関連付けられている表面の基質の位置によって、または液体もしくはゲルの中の基質の位置によって同定することができる。別個の基質が表面に位置する例示的なアレイには、限定されずに、ウェルの中のビーズを有するものが含まれる。
本明細書で使用されるように、用語「容量」は、部位および核酸材料に関して使用されるとき、部位を占有することができる核酸材料の最大量を意味する。例えば、本用語は、特定の条件において部位を占有することができる核酸分子の総数を指すことができる。例えば、特定の条件において部位を占有することができる核酸材料の総質量または特定のヌクレオチド配列のコピー総数を含む、他の尺度を使用することもできる。一般的に、標的核酸のための部位の容量は、標的核酸のアンプリコンのための部位の容量と実質的に同等である。
本明細書で使用されるように、用語「捕捉薬剤」は、標的分子（例えば、標的核酸）に付着するか、保持するか、結合することが可能である材料、化学物質、分子またはその部分を指す。例示的な捕捉薬剤には、限定されずに、標的核酸の少なくとも一部に相補的である捕捉核酸（本明細書において捕捉オリゴヌクレオチドとも呼ばれる）、標的核酸（または、それに付着している連結部分）に結合することが可能である受容体－リガンド結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体等）、または標的核酸（または、それに付着している連結部分）と共有結合を形成することが可能な化学薬剤が含まれる。
本明細書で使用されるように、用語「レポーター部分」は、調査される分析物の組成、同一性および／または供給源を決定することを可能にする、任意の識別可能なタグ、標識、インデックス、バーコードまたは基を指すことができる。一部の実施形態では、レポーター部分は、タンパク質に特異的に結合する抗体を含むことができる。一部の実施形態では、抗体は、検出可能な標識を含むことができる。一部の実施形態では、レポーターは、核酸タグで標識した抗体または親和性試薬を含むことができる。核酸タグは、例えば近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）または近接伸長アッセイ（ＰＥＡ）またはシークエンシングベースの読み出し（Shahi et al. Scientific Reports volume 7, Article number: 44447, 2017）、またはＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Stoeckius et al. Nature Methods 14:865-868, 2017）を通して検出可能であってよい。
本明細書で使用されるように、用語「クローン集団」は、特定のヌクレオチド配列に関して均一である核酸の集団を指す。均一な配列は、長さが一般的に少なくとも１０ヌクレオチドであるが、例えば少なくとも５０、１００、２５０、５００または１０００ヌクレオチドの長さを含めてさらにより長くてもよい。クローン集団は、単一の標的核酸または鋳型核酸から導くことができる。一般的に、クローン集団の中の核酸の全ては、同じヌクレオチド配列を有する。クローン性を逸脱しない範囲で、少数の突然変異（例えば増幅アーチファクトによる）がクローン集団の中で起こることができることが理解されよう。
本明細書で使用されるように、用語「特異な分子識別子」または「ＵＭＩ」は、ランダムであれ非ランダムであれまたはセミランダムであれ、核酸分子に付着することができる分子タグを指す。核酸分子に組み込まれるとき、ＵＭＩは、増幅の後に配列決定される特異な分子識別子（ＵＭＩ）を直接的に数えることによって、以降の増幅バイアスを補正するために使用することができる。
本明細書で使用されるように、組成物、物品、核酸または核との関連で「提供する」とは、組成物、物品、核酸または核を作製することか、組成物、物品、核酸または核を購入することか、さもなければ化合物、組成物、物品または核を得ることを意味する。
用語「および／または」は、掲載されるエレメントの１つもしくは全て、または掲載されるエレメントの任意の２つ以上の組合せを意味する。
単語「好ましい」および「好ましくは」は、ある特定の状況の下である特定の利益を与えることができる本開示の実施形態を指す。しかし、同じまたは他の状況の下で、他の実施形態が好ましいこともある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有益でないことを暗示せず、本開示の範囲から他の実施形態を排除するものでない。
用語「含む」およびその変形形態は、これらの用語が明細書および請求項に出現する場合、制限する意味を有しない。
実施形態が「含む」、「含む」または「含んでいる」などの言葉と一緒に本明細書に記載される場合はいつでも、「からなる」および／または「から事実上なる」の観点から記載されるさもなければ類似した実施形態も提供されることが理解される。
特に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「少なくとも１つ」は互換的に使用され、１つまたは複数を意味する。
さらに本明細書では、エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲の中に包含される全ての数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
個別の工程を含む本明細書に開示されるいずれの方法についても、工程は任意の実行可能な順序で実行することができる。さらに、２つ以上の工程の任意の組合せを適宜、同時に実行することができる。
この明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「ある特定の実施形態」または「一部の実施形態」等への言及は、その実施形態に関連して記載される特定のフィーチャー、構成、組成または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書全体の様々な場所におけるそのような語句の出現は、本開示の同じ実施形態を必ずしも指しているとは限らない。さらに、特定のフィーチャー、構成、組成または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適する方法で組み合わせることができる。
本開示の例示的実施形態の以下の詳細な記載は、以下の図と一緒に読むときに最も良く理解することができる。
図１Ａ～Ｂは、本開示による単細胞コンビナトリアルインデクシングのための一般的な例示的方法の一般的なブロック図を示す。 図２は、本開示による単細胞コンビナトリアルインデクシングのための一般的な例示的方法の一般的なブロック図を示す。 図３Ａ～Ｆは、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳがハイスループットの単細胞線形全ゲノム増幅を可能にすることを示す。（Ａ）３レベルのインデクシングによるｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳワークフローの模式図。（Ｂ）上：様々なライブラリー調製方法に適合する、結果として生じる増幅されたＤＮＡ二重鎖のバーコード構造。ｂｃ、バーコード；ｓｐ、スペーサー；ｇＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ。中央：ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのためのライブラリー構造の例。Ｐ５およびＰ７シークエンシングアダプターが、Ａ－テーリングおよびライゲーションによって加えられる。ライゲーションの左右対称のためにＵＭＩ末端にＰ７を、ｇＤＮＡ末端にＰ５を有することが等しく可能であることに留意する。下：ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑ．のためのライブラリー構造の例。ゲノムの中のスペーサー２（ｓｐ２）および目的の標的化遺伝子座からの初回刺激によってＰ５およびＰ７シークエンシングアダプターがそれぞれ加えられる。ＷＧＳライブラリーの中の各ｂｃ３に対応する新しい３回目のバーコードｂｃ３’もＰＣＲによって加えられ、新しいＵＭＩ’がｂｃ３’の外側に加えられることに留意する。（Ｃ）低いシークエンシング深度でのヒトおよびマウス細胞からの特異なＴｎ５挿入部位の数の散布図、２４ｂｃ１×６４ｂｃ２×６ｂｃ３ ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ、１ウェルにつき１００～３００細胞をソーティングした。青色、推測されたマウス細胞数（マウス読取りの百分率＞９５％、中央値９８．７％、ｎ＝３１５）；赤色、推測されたヒト細胞数（ヒト読取りの百分率＞９５％、中央値９９．８％、ｎ＝７１９）；灰色、推測された衝突（ｎ＝４８，４％）。（Ｄ）１細胞あたり平均２．４Ｍの生の読み取りおよび１．７８×深度における１細胞あたりの特異なＴｎ５挿入部位の数を示すボックス図。深度は、特異なＩＶＴ転写物の数と特異なＴｎ５挿入部位の数の間の比と規定される。太い水平線、中央値；ボックスの上および下のエッジ、それぞれ第１および第３四分位値；ひげ、四分位間の範囲の１．５倍；丸、外れ値）。プロトコールの改良版で作製されたライブラリーの特徴付けについては、図５および実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計」のセクションも参照する。（Ｅ）個々の細胞のための染色体ＣＮＶ図の例。上、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２．６Ｍの生の読み取り、２．４Ｍの特異分子、ＭＡＰＱ＞１の１．３Ｍの特異なＴｎ５挿入部位。下、３Ｔ３細胞、２．７Ｍの生の読み取り、２．４Ｍの特異分子、ＭＡＰＱ＞１の１．２Ｍの特異なＴｎ５挿入部位。（Ｆ）８２２個の２９３Ｔ細胞または１，４５３個のＨＡＰ１細胞にわたるコピー数変動のためのボックス図。分節コピーの増加も減少もない正倍数性の染色体が１の値を有するのが予想されるように、Ｙ軸は、染色体長によって正規化された１染色体あたりの読み取り割合を示す。 図４Ａ～Ｆは、各工程におけるｓｃｉ－ＬＩＡＮＴＩの分子構造を示す。破線：ＲＮＡ、実線：ＤＮＡ。（Ａ）Ｔｎ５アダプターは両方の５’末端がリン酸化され、１つは挿入のために必要とされ、他はライゲーションのために必要とされる。アニールされたトランスポゾンのオーバーハングは、ライゲーションのために１回目のバーコード（「ｂｃ１」）およびスペーサー（「ｓｐ１」）を含有する。（Ｂ）ライゲーション分子はヘアピンループとしてプレアニールされ、それは分子間ライゲーションを３分子から２分子に低減する；ヘアピン構造は、下流工程におけるＲＴ効率の向上も助ける。ヘアピンは、１）ライゲーションのために「ｓｐ１」にアニールするオーバーハング、２）下流工程においてＳＳＳのためのステムの中の初回刺激部位の役目をする２回目のバーコード（「ｂｃ２」）およびスペーサー（「ｓｐ２」）、ならびに３）ＩＶＴのためのループの中のＴ７プロモーターを含有する。（Ｃ）ギャップ伸長は、ループ状のＴ７プロモーターを二重鎖に変換する。ライゲーションが両末端で成功する場合は、Ｔ７プロモーターが両側に存在することに留意する；しかし、ライゲーションが１つの末端で成功する場合は、ボックス部分は欠落している。それにもかかわらず、両方とも異なるＲＴプライマーによって下流工程において逆転写することができる。（Ｄ）ＩＶＴは、Ｔ７プロモーターの下流に一本鎖ＲＮＡアンプリコンを生成する。（Ｅ）ライゲーションが両末端で成功した場合は、ＲＴは自己ループ化ＲＴプライマーによって好ましくは初回刺激され、それらはループ化ライゲーション分子から受け継がれる；ライゲーションが１つの末端だけで成功した場合は、ＲＴは過剰に加えられる追加のＲＮＡ ＲＴプライマーによって初回刺激される。次に、以降のＳＳＳ反応への干渉を回避するために、過剰なＲＮＡプライマーはＳＳＳの前に除去される。（Ｆ）３回目のバーコードおよびＵＭＩタグを各転写物に同時に加えるために、「ｓｐ２」を脱初回刺激するＳＳＳによって二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。より詳細な説明は、実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計」のセクションで提供される。 ５Ａ～Ｇは、異なるｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験における読み取り数を異なるＴｎ５トランスポソーム濃度と示す。示した深度での１細胞あたりの特異なＴｎ５挿入部位の数を示すボックス図。深度は、特異なＩＶＴ転写物の数と特異なＴｎ５挿入部位の数の間の比と規定される。太い水平線、中央値；ボックスの上および下のエッジ、それぞれ第１および第３四分位値；ひげ、四分位間の範囲の１．５倍；丸、外れ値）。濃縮されたＴｎ５トランスポソーム：０．２μＭ、希釈されたＴｎ５トランスポソーム：０．１μＭ。（Ａ）濃縮されたＴｎ５によるｙｉ１２８（深度中央値：１．１９×）のヒト対マウスの特異読み取り（ヒト特異読み取り中央値：２１５ｋ、ｎ＝１１５細胞；マウス特異読み取り中央値：１６９ｋ、ｎ＝４４）；濃縮されたＴｎ５（特異読み取り中央値：２１５ｋ）対希釈されたＴｎ５（特異読み取り中央値：４６ｋ）によるヒト特異読み取り。（Ｂ）ｙｉ１２９（深度中央値：１．７８×）の濃縮されたＴｎ５（特異読み取り中央値：６３５ｋ）対希釈されたＴｎ５（特異読み取り中央値：１８３ｋ）によるヒト特異読み取り。マウス特異読み取りは、図３Ｄに提供する。（Ｃ）濃縮されたＴｎ５によるｙｉ１４０およびｙｉ１４１（深度中央値：１．３７×；ヒト特異読み取り中央値：６６０ｋ）。表２および実施例２も参照する。（Ｄ）濃縮されたＴｎ５によるｙｉ１４４およびｙｉ１４５（深度中央値：１．０５×；ヒト特異読み取り中央値：９７．３ｋ）。表２も参照する。ｙｉ１４０、ｙｉ１４１、ｙｉ１４４およびｙｉ１４５は、実施例２で議論される最適化プロトコールによるライブラリーであることに留意する。（Ｅ）濃縮されたＴｎ５によるｙｉ１７４（深度中央値：１．０６×）のヒト／マウスの特異読み取り（ヒト特異読み取り中央値：１００ｋ、ｎ＝１０３；マウス特異読み取り中央値：２３ｋ、ｎ＝３５）；濃縮されたＴｎ５（特異読み取り中央値：１００ｋ）および希釈されたＴｎ５（特異読み取り中央値：５４ｋ）によるヒト特異読み取り。（Ｆ）マウス胚芽細胞のライブラリー：ｙｉ１８６、ｙｉ１８７、ｙｉ１８８は、希釈されたＴｎ５で調製され；ｙｉ１９０、ｙｉ１９２、ｙｉ１９３は濃縮されたＴｎ５で調製される。（Ｇ）シークエンシング深度の関数としての特異Ｔｎ５挿入部位の数。青色および赤色の線は、ＲＮＡ ＲＴプライマーありに対するそれらがないｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳをそれぞれ示す（実施例２）。ｙｉ１２９（パネルＢの場合のように、深度中央値：１．７８×）の濃縮によるヒト特異挿入（特異挿入中央値：６３５ｋ）。５×および１０×深度で推定したとき、予想される特異挿入数はそれぞれ１．９Ｍおよび２．６Ｍである。ｙｉ１４０およびｙｉ１４１を合わせたものは深度中央値が１．３７×であり、特異挿入中央値は６６０ｋである。１．７８×、５×および１０×深度で推定したとき、予想される特異挿入数はそれぞれ１．５Ｍ、４．２Ｍおよび６．０Ｍである。 図６Ａ～Ｅは、Ｓｃｉ－Ｌ３ベースのＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイが、同じ単細胞からのゲノムおよびトランスクリプトームのためのハイスループット線形増幅を共同で可能にすることを示す。（Ａ）３レベルのインデクシングによるｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイワークフローの模式図。Ｔｎ５トランスポゾンおよびｃＤＮＡ合成プライマーの両方が、１回目のバーコードの外側の５’オーバーハングに同じリン酸化ライゲーションランディングパッド（ピンク色）を含有することに留意する。（Ｂ）様々なライブラリー調製方法に適合するゲノムおよびトランスクリプトーム（それぞれ左および右）に対応する、結果として生じる増幅された二重鎖のバーコード構造。ｂｃ、バーコード；ｓｐ、スペーサー；ｇＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ。（Ｃ）一緒にプロットした低いおよび高いシークエンシング深度でのヒトおよびマウス細胞からの特異なＴｎ５挿入部位の数の散布図、２４ｂｃ１×６４ｂｃ２×６ｂｃ３ ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイ、１ウェルにつき１００～３００細胞をソーティングした。青色、推測されたマウス細胞数（マウス読取りの百分率＞９５％、中央値９９．５％、ｎ＝２００２）；赤色、推測されたヒト細胞数（ヒト読取りの百分率＞９５％、中央値９９．８％、ｎ＝２４１９）；灰色、推測された衝突（ｎ＝１４９、低いおよび高い深度を合わせて６．６％；５／２７０、高い深度で３．７％）。（Ｄ）ＲＮＡについては（Ｃ）の場合と同じ。青色、推測されたマウス細胞（９５．１％のマウス読み取りの純度中央値）；赤色、推測されたヒト細胞（９１．５％のヒト読み取りの純度中央値）；灰色、推測された衝突（ｎ＝２７２、低いおよび高い深度を合わせて１２％；７／２７０、高い深度で５．２％）。（Ｅ）ＲＮＡ－ｓｅｑシグナルを有するＳｅｕｒａｔは、ＢＪ－５ｔａヒト皮膚線維芽細胞（雄）およびＨＥＫ２９３Ｔ（雌）細胞に対応する明瞭なクラスターを示す。Ｙ染色体の存在の有無に基づいて、９８８／１０２４個の細胞（９６．５％）が正しく割り当てられる。 図７Ａ～Ｅは、交差の有る無しの有糸分裂／均等および減数分裂／還元染色体分離を示す。各縦のセグメントは、１つの染色分体（ＤＮＡ鎖は示さない）を表す。黒色および青色は、相同体を表す。卵形は、動原体を表す。マウス染色体が端部動原体型であることに留意するべきである。灰色の交差は、４Ｃ期のＤＮＡ複製の後の交差部位を示す。赤色ボックスはヘテロ接合である有糸分裂の娘細胞を示し、黒色および青色ボックスは、動原体近位領域でそれぞれの系統バックグラウンドについてホモ接合である減数分裂Ｉ（ｍｅｉｏｓｉｓ Ｉ）（ＭＩ）の娘細胞を示す。娘細胞のＬＯＨ領域は、巻き毛のブラケットが特徴的である。（Ａ）交差のない有糸分裂／均等分離。両方の娘細胞は、ヘテロ接合性を保持する。（Ｂ）相同体間の交差を有する有糸分裂／均等分離。組み換えられた染色分体は分離し、交差に対し動原体遠位のＬＯＨをもたらす。（Ｃ）相同体間の交差を有する有糸分裂／均等分離。両方の娘細胞はヘテロ接合性を保持するが１つの娘細胞は連鎖スイッチを有するように、組み換えられた染色分体は一緒に分離する。（Ｄ）（Ｂ）と違って交差に対し動原体近位のＬＯＨをもたらす、交差を有する減数分裂／還元分離。（Ｅ）娘細胞において相互の単為生殖二染色体性（ＵＰＤ）をもたらす、交差のない減数分裂／還元分離。均等染色体分離を有するＭＩは、（Ｂ）および（Ｃ）に似ていることに留意する。本文では、我々の研究は主にＭＩに重点を置いているので、我々は、姉妹染色分体が一緒に分離するＭＩの間の予想される減数分裂／還元分離を「還元分離」と呼び、姉妹染色分体が別々に分離するＭＩの間の予想外の有糸分裂様／均等分離を「均等分離」と呼ぶ。 図８Ａ～Ｇは、精子および精子前駆体およびＦＡＣＳによるそれらの倍数性を示す。（Ａ）Ｂ６精子の可視化。（Ｂ）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１精子の可視化。未知の倍数性の小数の丸い生殖細胞、および極めて少ない形態学的に成熟した精子（矢印）が観察される。（Ｃ）精巣上体から分離された（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１精子および精子前駆体は、大きな割合の２Ｃ細胞を予想外に含む。３７５のＤＡＰＩ電圧。（Ｄ）ＨＥＫ２９３／Ｐａｔｓｋｉミックス、３５０のＤＡＰＩ電圧。Ｐａｔｓｋｉピーク（２Ｃ）は、より低いＤＡＰＩ電圧のために（Ｃ）における２Ｃピークに対してわずかに左にシフトしている。（Ｅ）精巣上体から分離された（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１精子は、１Ｃ細胞からほとんど完全になる。３７５のＤＡＰＩ電圧。（Ｆ）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１精子前駆体、解離した精巣からの２Ｃ細胞のためのプレソーティング；多数の１Ｃ細胞がなお存在する。３７５のＤＡＰＩ電圧。（Ｇ）ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの間の（２回のバーコード化の後）ＦＡＣＳ工程時の（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１精子および精子前駆体、なお１Ｃ細胞から大部分なる。（Ｆ）からのプレソーティングされた２Ｃ核の中の混入した１Ｃ核の割合に基づいて、２Ｃであるタグメントされた核の割合は１８％と推定され、ホモジナイズされた精巣中の２Ｃ核の２．５％から７．２倍の富化である。我々は２Ｃ集団からソーティングした（全細胞の約１５．４％、タグメンテーション工程で推定された１８％に類似する）。３７５のＤＡＰＩ電圧。 図９Ａ～Ｆは、種間雑種マウス雄生殖系列のｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳが、ＭＩにおける非独立均等分離の多数の例を明らかにすることを示す。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）では、赤色線は、ＨＭＭによるフィットさせた交差転位を示す。動原体は、各染色体の写真の最も左に位置する。（Ａ）１Ｃ細胞のための交差図の例。灰色のドットは、Ｓｐｒｅｔ対立遺伝子のために１の値を、およびＢ６対立遺伝子のために０の値を有する。（Ｂ）および（Ｃ）では、灰色のドットは、平均４０ＳＮＰ部位のＳｐｒｅｔの対立遺伝子頻度を示す。（Ｂ）還元分離を有するＭ２細胞のためのＬＯＨ図の例（図７Ｄも参照する）。ＬＯＨは、交差部位の動原体近位領域に存在する。（Ｃ）均等分離を有するＭ２細胞のためのＬＯＨ図の例（図７Ｂも参照する）。ＬＯＨは、（Ｂ）と異なり交差部位の動原体遠位領域に存在する。（Ｄ～Ｆ）Ｍ２細胞の各々のための還元的に（赤色、ピンク色、黒色）および均等に（青色、緑色）分離された染色体の数。各カラムは、１つの単一のＭ２細胞を表す（１細胞あたり１９染色体、色で示す通りに分布される）。（Ｄ）二項分布に基づいた、および還元分離の確率ｐが観察データからのＭＬＥ０．７６に等しいと仮定した、還元対均等分離の予想される分布。（Ｅ）Ｍ２細胞における観察データ。稀な場合（２７／５，５４８染色体）では、まばらなＳＮＰカバレージ（パネル最上部の空白）のために、還元対均等分離を区別することができなかった。黒色バーは、染色分体の０または４コピーが観察されたＭＩ不分離（ＮＤＪ、合計４０染色体）を示す。姉妹染色分体が一緒に分離するので、ＮＤＪは還元分離であると考えられることに留意すべきである。（Ｆ）（Ｅ）と同じであるが、交差（「ＣＯ」と略される）の有る無しの染色体の数によってさらに細分化される。細胞は、先ず均等分離染色体の数（薄緑色および青色、降順）によって、次に交差のない観察された均等分離染色体の数（青色、降順）によってソーティングされる。 図１０Ａ～Ｇは、染色体スケールでの減数分裂の交差および単為生殖染色体分布を示す。（Ａ）染色体サイズについて正規化した後、各染色体の上の少なくとも１つの交差を有する一倍体細胞の数は、染色体サイズと負に相関する（ｒ＝－０．８７、ｐ＝２ｅ－６）。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑が示される。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ｃを参照する。（Ｂ）Ｍ２細胞については（Ａ）と同じ（ｒ＝－０．９１、ｐ＝８ｅ－８）。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ｄを参照する。（Ｃ）一倍体細胞あたりの染色体あたりの交差（ＣＯ）数の分布（（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）については平均＝０．６２、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）については平均＝０．５８）。（Ｄ）Ｍ２細胞については（Ｃ）と同じ（（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）については平均＝０．９２、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）については平均＝１．０３）。（Ｅ）少なくとも２つの交差を有する染色体のための、全染色体についての交差距離。予想される数の分布は、１染色体につき２つの交差をランダムに置くことによって生成される。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑が示される。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ｅを参照する。（Ｆ）Ｐａｔｓｋｉ細胞におけるＵＰＤおよびＬＯＨ事象の数（上）および染色体分布（下）。（Ｇ）大多数の染色体を還元的に対均等に分離したＭ２細胞について細分化されたミトコンドリアのコピー数（正規化）。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑。 図１１Ａ～Ｅは、種間雑種マウス雄生殖系列のｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳが、非独立均等分離の多数の例も明らかにすることを示す。（Ａ～Ｂ）２つのランダムな１Ｃ細胞のダブレットに由来するバーコード第１群からの人工「２Ｃ」細胞のための、還元的（赤色）および均等（青色）に分離した染色体の数。各カラムは、１つの単一の２Ｃ細胞を表す（１細胞あたり１９染色体、色で示す通りに分布する）。（Ａ）二項分布に基づいた、および均等分離の確率ｐが０．５に等しいと仮定した、還元対均等分離の予想される分布。（Ｂ）（Ａ）に示す予想分布に一致する、２Ｃ細胞における観察データ。（Ｃ～Ｅ）２つのランダムな１Ｃ核の人工ダブレットおよび実際の２Ｃ二次精母細胞の両方の混合物である、バーコード第２群からの非１Ｃ細胞のための還元的に（赤色、ピンク色、黒色）および均等に（青色、緑色）分離された染色体の数。各カラムは、１つの単一の非１Ｃ細胞を表す（１細胞あたり１９染色体、色で示す通りに分布する）。（Ｃ）バーコード第２群からの全ての非１Ｃ細胞。（Ｄ）バイアスされた染色体分離だけを有する、すなわち、均等または還元分離する少なくとも１５染色体を有する非１Ｃ細胞。黒色バーは、染色分体の０または４コピーが観察された減数分裂Ｉ不分離（ＮＤＪ、合計２，１８５染色体のうち２つ）を示す。（Ｅ）（Ｄ）と同じであるが、交差（「ＣＯ」と略される）の有る無しの染色体の数によってさらに細分化される。細胞は、先ず均等分離染色体の数（薄緑色および青色、降順）によって、次に交差のない観察された均等分離染色体の数（青色、降順）によってソーティングされる。 図１２Ａ～Ｃは、マウス雄生殖系列のｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳからの観察データ（下）と比較した３つの二項分布によるフィットさせた有限混合モデル（上）を示す。混合モデル化の詳細については、実施例２を参照する。（Ａ）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）ハイブリッドにおけるバーコード第１群からの非１Ｃ細胞の混合モデル化。（Ｂ）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）ハイブリッドにおけるバーコード第２群からの非１Ｃ細胞の混合モデル化。（Ｃ）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑からの２Ｃ細胞の混合モデル化。 図１３Ａ～Ｉは、染色体スケールでの減数分裂の交差および単為生殖染色体分布を示す。（Ａ）染色体サイズによって正規化した交差（ｃＭ／Ｍｂ）の数は、一倍体細胞における染色体サイズと負に相関する（ｒ＝－０．６６、ｐ＝０．００２）。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑を示す。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ａを参照する。（Ｂ）Ｍ２細胞については（Ａ）と同じ（ｒ＝－０．８３、ｐ＝１ｅ－５）。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交差を示す。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交差については、図１４Ｂを参照する。（Ｃ）一倍体細胞あたりの染色体あたりの交差（ＣＯ）頻度の分布。数の分布については、図１０Ｃを参照する。（Ｄ）Ｍ２細胞については（Ｃ）と同じ。数の分布については、図１０Ｄを参照する。（Ｅ）少なくとも２つの交差を有する染色体については、第１、第２、第１２および第１３染色体の交差の間の距離（Ｍｂ）。全ての染色体については図１０Ｅを参照する。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑を示す。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ｅを参照する。予想される数の分布は、１染色体につき２つの交差をランダムに置くことによって生成される。ボックス図は、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑が（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑より強力な交差干渉を有することを示す（ｐ＝５ｅ－９１）。（Ｆ）一倍体（中央値＝８、平均＝８．１）、Ｍ２細胞（中央値＝１、平均＝１．１）または他の二倍体／４Ｃ（中央値＝０、平均＝０．４）細胞あたりの単為生殖染色体数のヒストグラム。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑を示す。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ｆを参照する。（Ｇ）一倍体（ｒ＝－０．８７、ｐ＝２ｅ－６）、Ｍ２細胞（ｒ＝－０．７５、ｐ＝２ｅ－４）および他の二倍体／４Ｃ（ｒ＝－０．６８、ｐ＝０．００１）細胞のための単為生殖染色体分布。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑を示す。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、図１４Ｇを参照する。（Ｈ）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）（左）および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）（右）交雑における逆分離事象の染色体分布。（Ｉ）一倍体、Ｍ２細胞および他の二倍体／４Ｃ二倍体細胞のための、読み取り深度によって正規化した１細胞あたりのミトコンドリア読み取りの数。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑。 図１４Ａ～Ｇは、減数分裂の交差およびＵＰＤのための染色体分布を示す（Ｂ６×Ｃａｓｔ）。（Ａ）染色体サイズによって正規化した交差（ｃＭ／Ｍｂ）の数は、一倍体細胞における染色体サイズと負に相関する（ｒ＝－０．６５、ｐ＝０．００３）。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｂ）Ｍ２細胞については（Ａ）と同じ（ｒ＝－０．９、ｐ＝２ｅ－７）。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｃ）染色体サイズについて正規化した後、各染色体の上の少なくとも１つの交差を有する一倍体細胞の数は、染色体サイズと負に相関する（ｒ＝－０．８５、ｐ＝５ｅ－６）。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｄ）Ｍ２細胞については（Ｃ）と同じ（ｒ＝－０．９４、ｐ＝３ｅ－９）。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｅ）少なくとも２つの交差を有する染色体のための、全染色体についての交差距離。予想される数の分布は、１染色体につき２つの交差をランダムに置くことによって生成される。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｆ）一倍体（中央値＝８、平均＝８．９）およびＭ２細胞（中央値＝０、平均＝０．５４）細胞あたりの単為生殖染色体数。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｇ）単為生殖染色体分布（括弧に示す染色体サイズとの相関）、一倍体（ｒ＝－０．８、ｐ＝４ｅ－５）およびＭ２細胞（ｒ＝－０．４５、ｐ＝０．０５）。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。 図１５Ａ～Ｃは、交差ブレークポイントパイルアッププロファイルを示す。（Ａ）上から下へ：Ｂ６のためのＳＳＤＳマップによる減数分裂のＤＳＢホットスポット、Ｃａｓｔおよび（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１ハイブリッド、この研究で作成された（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）における交差マップ。一倍体対Ｍ２細胞の内訳ならびにＳｐｏｌ１－オリゴマップについては、（Ｂ）および（Ｃ）を参照する。（Ｂ）上から下へ：１）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１ハイブリッドのためのＳＳＤＳによる減数分裂ＤＳＢホットスポットマップ、２）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）の一倍体交差マップ、および３）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）のＭ２細胞交差マップ。（Ｃ）上から下へ：１）「対称形の」ホットスポットを有するＳｐｏ１１－オリゴマップによる減数分裂ＤＳＢホットスポット、２）全ホットスポットを有するＳｐｏ１１－オリゴマップによる減数分裂ＤＳＢホットスポット：ＰＲＤＭ９モチーフは考慮されない。３）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）における一倍体交差マップ、および４）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）におけるＭ２細胞交差マップ。 図１６Ａ～Ｆは、減数分裂交差ホットニスおよび説明的なゲノムフィーチャーを示す。（Ａ）ＢＭＡによる交差ホットニスに関連したフィーチャーのための境界線上の包含確率。ｘ軸は、事後確率によってモデルをランク付けし、ここで、灰色のボックスは各モデルに含まれないフィーチャーを示し（縦線、上位２０モデルを示す）、オレンジ色のスケールはモデルの事後確率を示す。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑からの統合データセットをここに示す。別々に分析した２つの交雑については、図１５を参照する。（Ｂ）ブレークポイント分解能のためのサイズの分布（ｌｏｇ正規分布）。左：（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）、中央値１５０ｋｂ。右：（Ｂ６×Ｃａｓｔ）、中央値２５０ｋｂ。（Ｃ～Ｄ）各染色体の右端交差の位置。染色体の長さは、赤色線の範囲よりも右端のＳＮＰ（黒色バー）によって示される。（Ｃ）Ｍ２細胞。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）（左）交雑における交差は、染色体の動原体遠位末端を好むが、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑（右）における交差は各染色体の腕の中央領域を好む。染色体間の変動性について考慮した後に、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑における交差は動原体に平均して５．５Ｍｂより近位であると推定する。１Ｃ細胞以外類似している、図２０Ａを参照する。（Ｄ）１ＣおよびＭ２細胞を比較する、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑。染色体間の変動性について考慮した後に、Ｍ２細胞（右）における交差は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑における１Ｃ（左）より動原体に平均して９．４Ｍｂ近位であると推定する。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑において、より低い程度の同じ傾向が観察される（図２０Ｂを参照する）。（Ｅ）０．７３のＡＵＣは、マウスゲノムから描かれる領域がＢ６×Ｓｐｒｅｔ交差地帯かまたは同数のランダムにサンプリングした地帯から来るか予測することにおける、予想される精度を定量化する。左：全部で７６フィーチャー。右：ＭＩＰ＞０．５のＢＭＡからの２５フィーチャーのサブセット。（Ｆ）０．８５のＡＵＣは、マウスゲノムから描かれる領域がＢ６×Ｃａｓｔ交差地帯かまたは同数のランダムにサンプリングした地帯から来るか予測することにおける、予想される精度を定量化する。左：全部で６９フィーチャー。右：ＭＩＰ＞０．５のＢＭＡからの２５フィーチャーのサブセット。 図１７Ａ～Ｂは、ＢＭＡによる交差ホットニスに関連したフィーチャーのための境界線上の包含確率を示す。ｘ軸は、事後確率によってモデルをランク付けする。（Ａ）（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。（Ｂ）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑。 図１８は、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑における交差事象およびゲノムフィーチャーの両方のための相関マトリックスを示す。ここでは、１００ｋｂウィンドウで計算した、様々な交差パイルアップトラックとゲノムフィーチャーの間の全ての可能なペアワイズ相関を示す。交差パイルアップトラックは、最初の５つのカラムまたは列（「事象」接頭辞；赤色テキスト表示）であり、残りはモデル化で使用した同じゲノムフィーチャーである（青色テキスト表示）。接尾辞「ｈｐ＿ｍ２」、「ｈｐ」、「ｍ２」、「ｍｔ」および「ｍｅ」が付いた交差パイルアップトラックは、それぞれ、一倍体およびＭ２細胞、一倍体、Ｍ２細胞、バイアスされた均等分離を有するＭ２細胞ならびにバイアスされた還元分離を有するＭ２細胞に由来する。青色の四角は正の相関を示し、赤色の四角は負の相関を示す。フィーチャーは、階層的クラスタリングによって順序付けられる。オープンな楕円形はフィーチャー「テロメア」および「分位数＿７５＿１００」を強調表示し、それは本文に記載の通りに２つの交雑における異なる傾向を示す。 図１９は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑における交差事象およびゲノムフィーチャーの両方のための相関マトリックスを示す。図１８凡例に記載のものと同じフォーマット。 図２０Ａ～Ｅは、各染色体の上の右端の交差の位置を示す。（Ａ）一倍体細胞。両方の交雑において、交差は、染色体の動原体遠位末端を好む。（Ｂ）一倍体およびＭ２細胞を比較する（Ｂ６×Ｃａｓｔ交雑）。染色体間の変動性について考慮した後に、Ｍ２細胞における交差は、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑における一倍体より動原体に平均して５．２Ｍｂ近位であると推定する。（Ｃ）バイアスされた染色体分離を有するＭ２細胞を比較する。染色体間の変動性について考慮した後に、バイアスされた均等分離を有するＭ２細胞における交差は、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑におけるバイアスされた還元分離を有するＭ２細胞のものより動原体に平均して１３．７Ｍｂ遠位であると推定する。（Ｄ）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑の（Ｃ）と同じ。交差は、動原体に平均して８．７Ｍｂより遠位である。（Ｅ）適切な染色体分離に及ぼす交差位置の影響のモデル。動原体により近い（最後の四分位ではなく中央の２つの四分位の）交差は、より強力な腕粘着を有することによって還元分離を促進することができる；しかし、染色体腕の末端の近くの交差は、より強力なＣＥＮ粘着を有することによってＭＩＩ分離を促進することができる。 図２１は、Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ交雑における交差ホットスポットを区別するフィーチャーの主成分分析を示す。「ｃｈｒ３＿ｂｐ（ブレークポイント）」および「ｃｈｒ１＿ｕｐｃ（単為生殖染色体）」は、全ての染色体のために含まれたフィーチャーの代表であることに留意する。１１５個の全フィーチャーのうちの４４個を示す。省略した３６個の他の染色体ブレークポイントおよびＵＰＣフィーチャー以外の３５個の他のフィーチャーは、明らかな傾向の欠如のために示されない。 図２２は、Ｂ６×Ｃａｓｔ交雑の交差ホットスポットを区別するフィーチャーの主成分分析を示す。「ｃｈｒ３＿ｂｐ（ブレークポイント）」および「ｃｈｒ１＿ｕｐｃ（単為生殖染色体）」は、全ての染色体のために含まれたフィーチャーの代表であることに留意する。１０８個の全フィーチャーのうちの１９個を示す。省略した３６個の他の染色体ブレークポイントおよびＵＰＣフィーチャー以外の５３個の他のフィーチャーは、明らかな傾向の欠如のために示されない。 図２３は、減数分裂の交差と染色体誤分離の間の関係のモデルを示す。「ＭＩ」：減数分裂Ｉ、「ＣＥＮ」：動原体（楕円形または丸い円）、「ＩＨ」：相同体間。本開示の例示的実施形態の以下の詳細な記載は、以下の図と一緒に読むときに最も良く理解することができる。
略図は、スケール通りとは限らない。図において使用される類似の番号は、類似の構成成分、工程などを指す。しかし、所与の図における構成成分を指す番号の使用は、同じ番号で表示される別の図の構成成分を限定することを意図していないことが理解されよう。さらに、構成成分を指す異なる番号の使用は、異なる番号の付いた構成成分が他の番号の付いた構成成分と同じでも類似するはずでもないことを示すことを意図していない。
本開示は例えば以下を提供する。
［項１］
複数の単一の核または細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、
第１の複数のコンパートメントに複数の単離された核または細胞を提供する工程であって、
各コンパートメントは単離された核または細胞のサブセットを含み、
核または細胞は核酸断片を含む、工程と；
線形増幅媒介物を前記細胞または核に導入する工程と；
線形増幅によって前記核酸断片を増幅する工程と；
核または細胞の各サブセットを処理してインデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、
前記処理は単離された前記核または細胞に存在する核酸断片に第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加えて単離された核または細胞に存在するインデックス付きの核酸をもたらすことを含み、
前記処理は、ライゲーション、プライマー伸長、ハイブリダイゼーション、増幅または転位を含む工程と；
インデックス付きの前記核または細胞を合わせてプールされたインデックス付きの核または細胞を生成し、それによって複数の前記核または細胞からシークエンシングライブラリーを生成する工程と
を含む方法。
［項２］
前記増幅が前記処理の前に起こる、項１に記載の方法。
［項３］
前記処理が前記増幅の前に起こる、項１に記載の方法。
［項４］
複数の単一の核または細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、
複数の単離された核または細胞を提供する工程であって、
核または細胞は核酸断片を含む、工程と；
線形増幅媒介物を単離された前記核または細胞に導入する工程と；
単離された前記核または細胞を第１の複数のコンパートメントに分配する工程であって、
各コンパートメントは単離された核または細胞のサブセットを含む工程と；
線形増幅によって前記核酸断片を増幅する工程と；
単離された核または細胞の各サブセットを処理してインデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、
前記処理は単離された前記核または細胞に存在する核酸断片に第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加えて単離された核または細胞に存在するインデックス付きの核酸をもたらすことを含み、
前記処理は、ライゲーション、プライマー伸長、増幅または転位を含む工程と；
インデックス付きの前記核を合わせてプールされたインデックス付きの核または細胞を生成し、それによって複数の前記核または細胞からシークエンシングライブラリーを生成する工程と
を含む方法。
［項５］
複数の単一の核または細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、
複数の単離された核または細胞を第１の複数のコンパートメントに提供する工程であって、
各コンパートメントは単離された核または細胞のサブセットを含み、
核または細胞は核酸断片を含む、工程と；
核または細胞の各サブセットを処理してインデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、
前記処理は、単離された前記核または細胞に存在する核酸断片に、（ｉ）第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加えて単離された核または細胞に存在するインデックス付きの核酸をもたらすこと、および（ｉｉ）線形増幅媒介物によって認識されるヌクレオチド配列を加えることを含み、
前記処理は、ライゲーション、プライマー伸長、ハイブリダイゼーション、増幅または転位を含む工程と；
線形増幅媒介物を前記細胞または核に導入する工程と；
線形増幅によって前記核酸断片を増幅する工程と；
インデックス付きの前記核または細胞を合わせてプールされたインデックス付きの核または細胞を生成し、それによって複数の前記核または細胞からシークエンシングライブラリーを生成する工程と
を含む方法。
［項６］
前記線形増幅媒介物がファージＲＮＡポリメラーゼまたは線形増幅プライマーを含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
前記核酸断片がＴ７プロモーターを含み、前記ファージＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む、項６に記載の方法。
［項８］
前記線形増幅媒介物を導入することが、前記線形増幅媒介物を単離された前記核または細胞に存在する核酸断片に加えることを含む、項６に記載の方法。
［項９］
各コンパートメントの複数の単離された前記核または細胞を所定の条件に曝露させることをさらに含む、項１または５に記載の方法。
［項１０］
前記曝露の後に複数の前記細胞から核を単離することをさらに含む、項９に記載の方法。
［項１１］
複数の単離された前記核または細胞を所定の条件に曝露させることをさらに含む、項４に記載の方法。
［項１２］
単離された前記核の完全性を維持しつつヌクレオソームが枯渇された核を生成する条件に単離された前記核を付すことをさらに含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項１３］
前記処理が、
各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、
各コンパートメントの中の前記トランスポソーム複合体は、他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列を含む工程と；
前記サブセットの中の核酸を複数の核酸に断片化し、前記第１のインデックス配列を前記核酸の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの前記核酸を含むインデックス付きの前記核または細胞を生成する工程と
を含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項１４］
前記処理が、
各サブセットを逆転写酵素および単離された前記核の中のＲＮＡ分子にアニールするプライマーと接触させる工程であって、各コンパートメントの中の前記プライマーは、他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列を含み、インデックス付きの前記核酸を含むインデックス付きの前記核または細胞を生成する工程
を含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
前記接触させることが特異的ヌクレオチド配列にアニールする標的特異的プライマーをさらに含む、項１４に記載の方法。
［項１６］
前記第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加える前記処理が、遍在配列を含むヌクレオチド配列を前記核酸断片に加え、次に前記第１のコンパートメント特異的インデックス配列を前記核酸断片に加える２工程法を含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項１７］
前記加えることが前記遍在配列を含むトランスポソーム複合体を含む、項１６に記載の方法。
［項１８］
前記処理が、第１のインデックスを単離された前記核または細胞に存在するＤＮＡ核酸に加えること、第１のインデックスを単離された前記核または細胞に存在するＲＮＡ核酸に加えること、またはその組合せを含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項１９］
前記の第１のインデックス配列をＲＮＡ核酸に加えることが、
各サブセットを逆転写酵素および単離された前記核または細胞の中のＲＮＡ分子にアニールするプライマーと接触させる工程であって、
各コンパートメントの中の前記プライマーは、前記第１のコンパートメント特異的インデックス配列を含み、インデックス付きの前記核酸を含むインデックス付きの前記核または細胞を生成する工程
を含む、項１８に記載の方法。
［項２０］
前記の第１のインデックス配列をＤＮＡ核酸に加えることが、
各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、
各コンパートメントの中の前記トランスポソーム複合体は前記第１のコンパートメント特異的インデックス配列を含む工程と；
前記サブセットの中の核酸を複数の核酸に断片化し、前記第１のコンパートメント特異的インデックス配列を前記核酸の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの前記核酸を含むインデックス付きの前記核または細胞を生成する工程と
を含む、項１８に記載の方法。
［項２１］
各コンパートメントにおいてＤＮＡ核酸に加えられる前記第１のインデックス配列およびＲＮＡ核酸に加えられる前記第１のインデックス配列が同一である、項１９に記載の方法。
［項２２］
各コンパートメントにおいてＤＮＡ核酸に加えられる前記第１のインデックス配列およびＲＮＡ核酸に加えられる前記第１のインデックス配列が同一でない、項１９に記載の方法。
［項２３］
前記核酸断片の指数関数的増幅をさらに含み、前記指数関数的増幅は特異的ヌクレオチド配列にアニールする標的特異的プライマーを含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項２４］
前記合わせることの後に、
プールされたインデックス付きの前記核または細胞のサブセットを第２の複数のコンパートメントに分配する工程と；
第２のコンパートメント特異的インデックス配列をインデックス付きの核酸に導入して二重インデックス付きの核酸を含む二重インデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、
前記導入することは、ライゲーション、プライマー伸長、増幅または転位を含む工程と
をさらに含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項２５］
二重インデックス付きの前記核を合わせてプールされた二重インデックス付きの核または細胞を生成する工程と、
プールされた二重インデックス付きの前記核または細胞のサブセットを第３の複数のコンパートメントに分配する工程と；
第３のコンパートメント特異的インデックス配列をインデックス付きの核酸に導入して三重インデックス付きの核酸を含む三重インデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、
前記導入することは、ライゲーション、プライマー伸長、増幅または転位を含む工程と
をさらに含む、項２４に記載の方法。
［項２６］
メチル化分析のためにインデックス付きの前記核または細胞を処理してメチル化分析のために適する核酸断片を生成することをさらに含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項２７］
インデックス付きの前記核または細胞を近接性ライゲーションに付してクロマチン高次構造の分析のために適する核酸断片を生成することをさらに含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項２８］
前記シークエンシングライブラリーの前記核酸断片を増幅してＤＮＡナノボールを生成することをさらに含む、項１、４または５のいずれか一項に記載の方法。
［項２９］
前記コンパートメントがウェルまたは液滴を含む、項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
［項３０］
前記第１の複数のコンパートメントの各コンパートメントが５０から１００，０００，０００個の核または細胞を含む、項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
［項３１］
前記第２の複数のコンパートメントの各コンパートメントが５０から１００，０００，０００個の核または細胞を含む、項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
［項３２］
複数の増幅部位を含む表面を提供する工程であって、
前記増幅部位が遊離の３’末端を有する付着した一本鎖の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団を含む工程と、
複数の増幅部位を生成するのに適する条件の下で増幅部位を含む前記表面をインデックス付きの前記断片と接触させ、各々は複数のインデックスを含む個々の断片からのアンプリコンのクローン集団を含む工程と
をさらに含む、項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
［項３３］
複数の単一細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の細胞からの単離された核を提供する工程と；
（ｂ）単離された前記核の完全性を維持しつつヌクレオソームが枯渇された核を生成する化学処理に単離された前記核を付す工程と；
（ｃ）ヌクレオソームが枯渇された前記核のサブセットを第１の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、各コンパートメントの中の前記トランスポソーム複合体がトランスポザーゼおよび他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列を含む工程と；
（ｄ）ヌクレオソームが枯渇された核の前記サブセットの中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第１のインデックス配列を前記核酸断片の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの核酸断片を含むインデックス付きの核を生成する工程であって、インデックス付きの前記核酸断片は前記トランスポザーゼに付着したままである工程と；
（ｄ）インデックス付きの前記核を合わせてプールされたインデックス付きの核を生成する工程と；
（ｅ）プールされたインデックス付きの前記核のサブセットを第２の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをヘアピンライゲーション二重鎖と、インデックス付きの核酸断片の片方または両方の末端への前記ヘアピンライゲーション二重鎖のライゲーションに適する条件の下で接触させて二重インデックス付きの核酸断片をもたらす工程であって、前記ヘアピンライゲーション二重鎖が他のコンパートメントの中の第２のインデックス配列と異なる第２のインデックス配列を含む工程と；
（ｆ）二重インデックス付きの前記核を合わせてプールされたインデックス付きの核を生成する工程と；
（ｇ）プールされた二重インデックス付きの前記核のサブセットを第３の複数のコンパートメントに分配する工程と；
（ｈ）二重インデックス付きの前記核を溶解させる工程と；
（ｉ）他のコンパートメントの中の第３のインデックス配列と異なる第３のインデックス配列を含むように二重インデックス付きの前記核断片を処理する工程と；
（ｊ）前記三重インデックス断片を合わせ、それによって複数の前記単一細胞からの全ゲノム核酸を含むシークエンシングライブラリーを生成する工程と
を含む方法。
本明細書で提供される方法は、例えば、全ゲノム（ｓｃｉ－ＷＧＳ）、トランスクリプトーム（ｓｃｉ－ＲＮＡ）、ゲノムおよびトランスクリプトーム（ｓｃｉ－ＤＮＡ／ＲＮＡ）および／またはメチローム（ｓｃｉ－ＭＥＴ）の共アッセイを含む、複数の単細胞または核の単細胞コンビナトリアルインデクシング（ｓｃｉ）シークエンシングライブラリーを生成するために使用することができる。一実施形態では、本方法は、目的の１つまたは複数の特異的領域の標的化シークエンシングのために使用することができる。例えば、標的化配列のために選択的に富化するために、特異的領域（例えば、コード領域、非コード領域等）にハイブリダイズするプライマー、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡによって挿入されるヌクレオチド配列を使用することができる。一実施形態では、個々の遺伝子編集、ＤＮＡ編集もしくは編集のためのマーカー、細胞または核からの遺伝子サイン、摂動および／または機能的読み取り（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質または組合せ）のための情報を収集し、分析することができる（Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ）。他の実施形態では、本方法は、クロマチンアクセス性（ｓｃｉ－ＡＴＡＣ）、クロマチン高次構造（Ｈｉ－Ｃ）および他の単細胞コンビナトリアルインデクシング方法を評価するために使用することができる。
本方法は、単離した核または細胞を提供すること、核または細胞のサブセットをコンパートメントに分配すること、それらが核酸断片を含むように核または細胞を処理すること、コンパートメント特異的インデックスを核酸断片に加えること、および線形増幅によって核酸断片を増幅することを含む。これらの工程は異なる順序で起こることができ、異なる方法で組み合わせることができる。３つの実施形態を、図１Ａおよび１Ｂに示す。一実施形態では、本方法は、核酸断片を含有する単離した核または細胞の分配されたサブセットを提供することを含む（図１Ａ、ブロック１、および図１Ｂ、ブロック１）。図１ＡＢに示すように、線形増幅による核酸断片の増幅（図１Ａ、ブロック２）に続いて、増幅された核酸断片にインデックスが加えられる（図１Ａ、ブロック３）。図１Ｂに示すように、分配された核または細胞の中の核酸断片はインデックスを含み、核酸断片は線形増幅によって増幅される（図１Ｂ、ブロック２）。単離した核または細胞を提供する工程、単離した核または細胞のサブセットを分配する工程、核酸断片を含むように単離した核または細胞を処理する工程、コンパートメント特異的インデックスを加える工程、および線形増幅によって核酸断片を増幅する工程が本明細書に記載される。
単離した核または細胞を提供する
本明細書で提供される方法は、細胞または複数の細胞から単離した核を提供することを含む。細胞および核は、任意の試料、例えば、任意の生物体（複数可）に、および生物体（複数可）の任意の細胞型または任意の組織に由来することができる。一実施形態では、細胞は、生殖細胞、例えば精子細胞または卵細胞であってよい。一実施形態では、組織は、生殖組織、例えば精巣上体であってよい。一実施形態では、細胞または核は、がんまたは病的な組織に由来することができる。本方法は、細胞を解離させることおよび／または核を単離することをさらに含むことができる。核を細胞から単離するための方法は当業者に公知であり、ルーチンである。核または細胞の数は、少なくとも２つであってよい。上限は、本明細書に記載される方法の他の工程で使用される装置（例えば、マルチウェルプレート）の実際の限界に依存する。使用することができる核または細胞の数は限定するものではなく、数１０億を数えることができる。例えば、一実施形態では、核または細胞の数は、１００，０００，０００以下、１０，０００，０００以下、１，０００，０００，０００以下、１００，０００，０００以下、１０，０００，０００以下、１，０００，０００以下、１００，０００以下、１０，０００以下、１，０００以下、５００以下、または５０以下であってよい。１つまたは複数の試料を提供することができる。例えば、試料は、１生物体からの１つの細胞型または組織であってよい。試料を同定し、次に組み合わせるために、本明細書に記載されるインデクシング方法を使用して、複数の試料、例えば、１生物体からの異なる細胞型、２つ以上の生物体からの１つの細胞型もしくは組織、または２つ以上の生物体からの異なる細胞型もしくは組織を第１のインデックスで別々にインデックス付けすることができる。当業者は、一部の実施形態では、各核の中の核酸分子は、生物体の全体の遺伝子相補体（生物体の全ゲノムとも呼ばれる）を表し、イントロンおよびエクソン配列の両方、ならびにプロモーターおよびエンハンサー配列などの非コード調節配列を含むゲノムＤＮＡ分子であることを認める。
核の単離は、少なくとも１～２０分、例えば５、１０または１５分の間細胞溶解緩衝液の中で細胞をインキュベートすることによって達成することができる。適宜、ピペットによる移動などの、溶解を助ける外部の力に細胞を曝露させることができる。細胞溶解緩衝液の例には、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０および１％ＳＵＰＥＲａｓｅ Ｉｎ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒが含まれる。当業者は、核を単離する細胞溶解緩衝液の有用性を低減することなく、構成成分のこれらのレベルを若干変更することができることを認める。当業者は、ＲＮアーゼ阻害剤、ＢＳＡおよび／または界面活性剤が核の単離のために使用される緩衝液において有益である可能性があること、および他の下流の単細胞コンビナトリアルインデクシング用のために他の添加剤を緩衝液に加えることができることを認める。
一実施形態では、接着性であるかまたは懸濁状である個々の細胞から核が単離される。個々の細胞から核を単離する方法は、当業者に公知である。一実施形態では、組織の中に存在する細胞から核が単離される。単離された核を得る方法は、組織を調製すること、および調製した組織から核を単離することを一般的に含む。一実施形態では、全ての工程は、氷の上で実行される。
組織の調製は、液体窒素の中で組織を急冷凍すること、次に組織のサイズを１ｍｍ以下の直径の断片に低減するために組織を細かく切り刻むかまたは鈍い力を加えることを含むことができる。適宜、冷たいプロテアーゼおよび／または細胞間連絡を破壊するための他の酵素を使用することができる。細かく切り刻むことは、組織を小片に切るための刃で達成することができる。鈍い力を加えることは、ハンマーまたは類似の物体によって組織を粉砕することによって達成することができ、粉砕された組織の生じる組成物は粉末と呼ばれる。
従来の組織核抽出技術は、通常、組織を組織特異的酵素（例えば、トリプシン）と一緒に高温（例えば、３７℃）で３０分間から数時間インキュベートし、その後、核抽出のために細胞溶解緩衝液で細胞を溶解させる。本明細書におよび米国特許仮出願第６２／６８０，２５９号に記載される核単離方法は、いくつかの利点を有する：（１）人工酵素は導入されず、全ての工程は氷の上で実行される。これは、細胞状態（例えば、トランスクリプトーム状態、クロマチン状態またはメチル化状態）への潜在的摂動を低減する。（２）脳、肺、腎臓、脾臓、心臓、小脳、および腫瘍組織などの疾患試料を含むほとんどの組織型にわたってこれは検証されている。異なる組織型のために異なる酵素を使用する伝統的な組織核抽出技術と比較して、新しい技術は、異なる組織からの細胞状態を比較するときバイアスを潜在的に低減することができる。（３）本方法は、酵素処理工程を取り除くことによって、費用も低減し、効率も増加させる。（４）他の核抽出技術（例えば、Ｄｏｕｎｃｅ組織グラインダー）と比較して、本技術は異なる組織型のためにより頑強であり（例えば、Ｄｏｕｎｃｅ法は異なる組織のためにＤｏｕｎｃｅサイクルを最適化することを必要とする）、大きな試料片をハイスループットで処理することを可能にする（例えば、Ｄｏｕｎｃｅ法はグラインダーのサイズに制限される）。
単離した核または細胞はヌクレオソームを含むことができるか、ヌクレオソーム無しであってよいか、または核のヌクレオソームを枯渇させる条件に付し、ヌクレオソームが枯渇された核を生成することができる。ヌクレオソームが枯渇された核は、細胞の全ゲノムまたはその分画のＤＮＡ配列を決定するための方法において有益である。
一実施形態では、ヌクレオソーム枯渇のために使用する条件は、単離した核の完全性を維持する。一般的に、ヌクレオソーム枯渇方法は単細胞のペレットまたは懸濁液で使用され、したがって、接着性の細胞培養または組織が細胞の供給源として使用される実施形態では、供給源は単細胞のペレットまたは懸濁液を得るために処理される。
ヌクレオソーム枯渇のための方法は公知でルーチンであり、限定されずに、酵素処理および化学的処理を含む。一実施形態では、ヌクレオソーム枯渇のための条件には、核酸－タンパク相互作用を破壊することが可能なカオトロピック剤による化学的処理が含まれる。有益なカオトロピック剤の例には、３，５－リチウムジヨードサリチル酸が限定されずに含まれる。３，５－リチウムジヨードサリチル酸を使用するための条件には、それを細胞のペレットに加え、氷の上でインキュベートすることが含まれる。
好ましい実施形態では、条件には、核酸－タンパク相互作用を破壊することが可能な洗浄剤による化学的処理が含まれる。有益な洗浄剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が限定されずに含まれる。ＳＤＳを使用するための条件には、それを細胞のペレットに加えて４２℃などの高温でインキュベートすること、次にＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００などの非イオン性洗浄剤を加えて４２℃などの高温でインキュベートすることが含まれる。
一部の実施形態では、ＳＤＳなどの洗浄剤を使用するとき、核はヌクレオソーム枯渇の前に架橋剤に曝露させられる（ＷＯ２０１８／０１８００８）。一実施形態では、核は細胞の中にある間に架橋剤に曝露させられ、別の実施形態では、単離された核が架橋剤に曝露させられる。架橋剤の有益な例には、ホルムアルデヒドが限定されずに含まれる（Hoffman et al., 2015, J. Biol. Chem., 290:26404-26411）。ホルムアルデヒドによる細胞の処理は、ホルムアルデヒドを細胞懸濁液に加えて、室温でインキュベートすることを含むことができる。一実施形態では、ホルムアルデヒド処理の後、核をグリシンおよびＩｇｅｐａｌ（登録商標）などの非イオン性の非変性洗浄剤に曝露させることができる。
単離される核の中のヌクレオソームを枯渇させるプロセスの間、単離される核の完全性は維持される。ヌクレオソームを枯渇させるための条件への曝露の後に核がインタクトなままかどうかは、位相差画像化などのルーチンの方法によって核の状態を可視化することによって決定することができる。一実施形態では、ヌクレオソーム枯渇の後にインタクトな核の数は、１～１，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１００，０００、１００，０００～１，０００，０００、１，０００，０００～１０，０００，０００または１０，０００，０００～１００，０００，０００であってよい。
本明細書に記載される提供する工程、プールする工程および分配する工程を含む核または細胞の人為操作は、核緩衝液の使用を含むことができる。核緩衝液の例には、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＳＵＰＥＲａｓｅ Ｉｎ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ／μＬ、Ａｍｂｉｏｎ）および１％ＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ、ＮＥＢ）が含まれる。当業者は、核を懸濁させる核緩衝液の有用性を低減することなく、構成成分のこれらのレベルを若干変更することができることを認める。当業者は、核を懸濁させる核緩衝液の有用性を低減することなく、様々な構成成分を置換することができることも認める。
一実施形態では、細胞（核が単離される細胞を含む）は、異なる所定の条件に曝露させられている。例えば、細胞のサブセットは、異なる所定の条件に曝露させることができる。異なる条件は、例えば、異なる培養条件（例えば、異なる培地、異なる環境条件）、薬剤の異なる用量、異なる薬剤または薬剤の組合せを含むことができる。薬剤は、本明細書に記載される。細胞および／または１つまたは複数の試料の各サブセットの核または細胞は、１つまたは複数のインデックス配列でインデックスが付けられ、プールされ、大規模に多重の単一核または単細胞シークエンシング方法によって分析される。単一核トランスクリプトームシークエンシング（米国特許仮出願第６２／６８０，２５９号およびＧｕｎｄｅｒｓｏｎら（ＷＯ２０１６／１３０７０４））、単一核の全ゲノムシークエンシング（米国特許出願公開第２０１８／００２３１１９号）、またはトランスポゾンアクセス可能クロマチンの単一核シークエンシング（米国特許第１０，０５９，９８９号）、ｓｃｉ－ＨｉＣ（Ramani et al., Nature Methods, 2017, 14:263-266）、ＤＲＵＧ－ｓｅｑ（Ye et al., Nature Commun., 9, article number 4307）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ（Dixit et al., Cell, 2016, 167(7):1853-1866.e17）、またはＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質からの分析物の任意の組合せ、例えばｓｃｉ－ＣＡＲ（Cao et al., Science, 2018, 361(6409):1380-1385）を限定されずに含む、事実上いかなる単一核または単細胞シークエンシング方法も使用することができる。試料インデックスとしてインデックスの使用を含む、初期スプリット－アンド－プールインデクシング（例には１０Ｘゲノム研究Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標）システムまたはＢｉｏｒａｄ ｄｄｓｅｑシステムが含まれる）の後、液滴ベースの単細胞分析を適用することもできる。異なる条件から個々の細胞または核を非多重化および同定するために、核ハッシングが使用される。
一実施形態では、細胞の各サブセットが、薬剤または摂動に曝露させられる。薬剤は、細胞に変化を引き起こす事実上いかなるものであってもよい。例えば、薬剤は、細胞のトランスクリプトームを変更することができるか、細胞のクロマチン構造を変更することができるか、細胞中のタンパク質の活性を変更することができるか、細胞のＤＮＡを変更することができるか、細胞のＤＮＡ編集を変更することができるか、または他の変化を引き起こすことができる。薬剤の例には、限定されずに、化合物、例えばタンパク質（抗体を含む）、非リボソームタンパク質、ポリケチド、有機分子（９００ダルトン以下の有機分子を含む）、無機分子、ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子、炭水化物、糖タンパク質、核酸またはその組合せが含まれる。一実施形態では、薬剤は、遺伝子の摂動、例えばＤＮＡ編集タンパク質および／またはガイドＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲまたはＴａｌｅｎを引き起こす。一実施形態では、薬剤は治療薬である。一実施形態では、細胞は野生型の細胞であってよく、別の実施形態では、遺伝子の摂動、例えば遺伝子ノックインまたは遺伝子ノックアウトを含むように細胞を遺伝子改変することができる（Szlachta et al., Nat Commun., 2018, 9:4275）。細胞のサブセットを同じ薬剤に曝露させることができるが、マルチウェル装置のコンパートメントにわたって異なる変数を変更することができ、単一の実験で複数の変数を試験することを可能にする。例えば、異なる投薬量、異なる曝露時間および異なる細胞型を単一のプレートで試験することができる。一実施形態では、細胞は、既知の活性を有するタンパク質を発現することができ、活性に及ぼす薬剤の影響を異なる条件で評価することができる。核酸断片を標識するインデックス配列の使用は、核または細胞の特異的サブセット、例えばマルチウェルプレートの１つのウェルに由来する核酸の後の同定を可能にする。
サブセットを分配する
本明細書で提供される方法は、核、例えばヌクレオソームが枯渇された核または細胞のサブセットを、複数のコンパートメントに分配することを含む。本方法は、単離した核または細胞の集団（本明細書ではプールとも呼ばれる）がサブセットに分割される、複数の分配工程を含むことができる。一般的に、単離した核または細胞のサブセットのプールから複数のコンパートメントへの分配は、単離した核または細胞のサブセットに存在する核酸断片へのインデックスの付加の前に起こる。したがって、本方法は、プールされた単離した核または細胞をとってそれらを分配する少なくとも１つの「スプリットアンドプール」工程を含み、ここで、「スプリットアンドプール」工程の数は、核酸断片に加えられる異なるインデックスの数に依存することができる。インデックスを付けた後、十分な数のインデックスが核酸断片に加えられるまで、必要に応じてサブセットをプールし、サブセットに分割し、インデックスを付け、再びプールすることができる。
サブセットに、したがって各コンパートメントに存在する核または細胞の数は、少なくとも１つであってよい。一実施形態では、サブセットに存在する核または細胞の数は、１００，０００，０００以下、１０，０００，０００以下、１，０００，０００以下、１００，０００以下、１０，０００以下、４，０００以下、３，０００以下、２，０００以下、または１，０００以下、５００以下または５０以下である。一実施形態では、サブセットに存在する核または細胞の数は、１～１，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１００，０００、１００，０００～１，０００，０００、１，０００，０００～１０，０００，０００または１０，０００，０００～１００，０００，０００であってよい。一実施形態では、各サブセットに存在する核または細胞の数は、概ね等しい。サブセットに、したがって各コンパートメントに存在する核の数は、インデックスの衝突を低減する要求に一部基づき、それは、本方法のこの工程の同じコンパートメントに存在する同じトランスポザーゼインデックスを有する２つの核の存在のことである。核または細胞をサブセットに分配するための方法は、当業者に公知であり、ルーチンである。例には、限定されずに、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）サイトメトリーおよび単純希釈が含まれる。適宜、異なる倍数性の核を染色、例えばＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色によってゲーティングし、富化することができる。
分配工程（およびインデックスの以降の付加）におけるコンパートメントの数は、使用するフォーマットに依存することができる。例えば、コンパートメントの数は、２から９６コンパートメント（９６ウェルプレートが使用されるとき）、２から３８４コンパートメント（３８４ウェルプレートが使用されるとき）、または２から１５３６コンパートメント（１５３６ウェルプレートが使用されるとき）であってよい。一実施形態では、各コンパートメントは、液滴であってよい。使用するコンパートメントのタイプが２つ以上の核または細胞を含有する液滴であるとき、任意の数の液滴、例えば少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００または少なくとも１０，０００，０００の液滴を使用することができる。一実施形態では、コンパートメントの数は、２４である。
核酸断片を生成する処理
一実施形態では、単離した核または細胞の中のＤＮＡ核酸、例えば染色体および／またはプラスミドを核酸断片に断片化するために、単離した核または細胞の処理を使用することができる。配列決定をする標的核酸が核または細胞に存在するＤＮＡに由来するとき、処理が一般的に必要である。しかし、一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は断片化する必要がしばしばないので、配列決定をする標的核酸が核または細胞に存在するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよび／または非コードＲＮＡ）に由来するとき、処理は適宜である。核または細胞の中の核酸を処理することは、ヌクレオチド配列を処理によって生成される核酸断片の片方または両方の末端に一般的に加え、ヌクレオチド配列は１つまたは複数の遍在配列を含むことができ、および一般的に含む。遍在配列は、例えば、ライゲーション、プライマー伸長または増幅の以降の工程による核酸断片へのインデックスなどの別のヌクレオチド配列の付加のためのプライマーとして使用することができるヌクレオチド配列をアニールする以降の工程における「ランディングパッド」として使用することができる。そのようなプライマーのヌクレオチド配列は、インデックス配列を含んでもよい。核または細胞の中の核酸を処理することは、処理によって生成される核酸断片の片方または両方の末端に１つまたは複数の特異な分子識別子を加えることができる。
核酸断片への核酸の処理が起こることができるいくつかの時点が本方法の中にある。例えば、一実施形態では、単離された核または細胞は、単離した核または細胞のサブセットを分配する前に処理することができる。このような実施形態では、全ての単離した核または細胞が組み合わされたときコンパートメント特異的インデックスを加えることはいかなる目的にも一般的に役立たないので、処理は、コンパートメント特異的インデックスでなく、遍在配列および／または遍在分子識別子の核酸断片への付加を一般的に含む。別の実施形態では、単離した核または細胞は、異なるコンパートメントへのサブセットの分配の後に処理することができる（例えば、図１Ａおよび図１Ｂを参照）。この実施形態の１つの態様では、処理はインデックスを加えず（図１Ａ、ブロック１）、この実施形態の別の態様では、処理はコンパートメント特異的インデックスの付加を含むことができる（図１Ｂ、ブロック１）。本方法におけるいかなる時点での処理も、核酸断片の片方または両方の末端への遍在配列および／または遍在分子識別子の付加を含むことができる。
核または細胞の中の核酸の核酸断片への処理のための様々な方法が、公知である。例には、ＣＲＩＳＰＲおよびＴａｌｅｎ様酵素、ならびにＤＮＡ断片がハイブリダイズして伸長または増幅を開始することができる一本鎖の領域を作製することができるＤＮＡを巻き戻す酵素（例えば、ヘリカーゼ）が含まれる。例えば、ヘリカーゼベースの増幅を使用することができる（Vincent et al., 2004, EMBO Rep., 5(8):795-800）。一実施形態では、伸長または増幅は、ランダムプライマーで開始される。一実施形態では、トランスポソーム複合体が使用される。トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ認識部位に結合しているトランスポザーゼであり、時には「タグメンテーション」と呼ばれる方法で核の中の標的核酸にトランスポザーゼ認識部位を挿入することができる。一部のそのような挿入事象では、トランスポザーゼ認識部位の１本の鎖は、標的核酸に移転させることができる。そのような鎖は、「移転鎖」と呼ばれる。一実施形態では、トランスポソーム複合体は、２つのサブユニットを有する二量体のトランスポザーゼおよび２つの不連続のトランスポゾン配列を含む。別の実施形態では、トランスポザーゼは、２つのサブユニットを有する二量体のトランスポザーゼおよび連続したトランスポゾン配列を含む。一実施形態では、トランスポザーゼ認識部位の片方または両方の鎖の５’末端は、リン酸化することができる。
一部の実施形態は、機能亢進性のＴｎ５トランスポザーゼおよびＴｎ５型のトランスポザーゼ認識部位（Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)）、または、ＭｕＡトランスポザーゼならびにＲ１およびＲ２末端配列を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位（Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983；Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995）の使用を含むことができる。当業者によって最適化されるような、Ｔｎ５ Ｍｏｓａｉｃ Ｅｎｄ（ＭＥ）配列を使用することもできる。
本明細書で提供される組成物および方法のある特定の実施形態で使用することができるトランスポジションシステムのより多くの例には、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）Ｔｎ５５２（Colegio et al., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001; Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002）、Ｔｙ１（Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994および国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Craig, N L, Science. 271: 1512, 1996；Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996）、Ｔｎ／ＯおよびＩＳ１０（Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996）、Ｔｃ１（Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996）、Ｐエレメント（Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004）、Ｔｎ３（Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990）、細菌性挿入配列（Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996）、レトロウイルス（Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989）、および酵母のレトロトランスポゾン（Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989）が含まれる。より多くの例には、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１およびトランスポザーゼファミリー酵素の工学操作バージョンが含まれる（Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub 2009 Oct 16；Wilson C. et al (2007) J. Microbiol. Methods 71:332-5）。
本明細書で提供される方法および組成物で使用することができるインテグラーゼの他の例には、レトロウイルスインテグラーゼ、およびＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＰＦＶ－１、ＲＳＶからのインテグラーゼなどのそのようなレトロウイルスインテグラーゼのためのインテグラーゼ認識配列が含まれる。
本明細書に記載される方法および組成物で有益なトランスポゾン配列は、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号および国際出願番号ＷＯ２０１２／０６１８３２に提供される。一部の実施形態では、トランスポゾン配列は、第１のトランスポザーゼ認識部位および第２のトランスポザーゼ認識部位を含む。トランスポソーム複合体がインデックス配列を導入するために使用される実施形態では、インデックス配列は、トランスポザーゼ認識部位の間に、またはトランスポゾンの中に存在することができる。
本明細書で有益な一部のトランスポソーム複合体は、２つのトランスポゾン配列を有するトランスポザーゼを含む。一部のそのような実施形態では、２つのトランスポゾン配列はお互いに連結されておらず、言い換えると、トランスポゾン配列はお互いと連続していない。そのようなトランスポソームの例は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号を参照する）。
一部の実施形態では、トランスポソーム複合体は、２つのトランスポザーゼサブユニットに結合して「ループ状の複合体」または「ループ状のトランスポソーム」を形成する、トランスポゾン配列核酸を含む。一例では、トランスポソームは、二量体のトランスポザーゼおよびトランスポゾン配列を含む。ループ状の複合体は、元の標的ＤＮＡの命令情報を維持しつつ、および標的ＤＮＡを断片化することなしに、トランスポゾンが標的ＤＮＡに挿入されることを確実にすることができる。理解されるように、ループ状の構造は、標的核酸の物理的連続性を維持しつつ、インデックスなどの所望の核酸配列を標的核酸に挿入することができる。一部の実施形態では、ループ状のトランスポソーム複合体のトランスポゾン配列は、トランスポゾン配列を断片化して２つのトランスポゾン配列を含むトランスポソーム複合体を作製することができるように、断片化部位を含むことができる。そのようなトランスポソーム複合体は、トランスポゾンが挿入される近隣の標的ＤＮＡ断片が、アッセイの後の段階で明白にアセンブルすることができるコード組合せを受けることを確実にするのに有益である。
一実施形態では、核酸を断片化することは、核酸に存在する断片化部位を使用して達成される。一般的に、断片化部位は、トランスポソーム複合体を使用して標的核酸に導入される。一実施形態では、核酸が断片化された後、トランスポザーゼは核酸断片に付着したままであり、そのため、同じゲノムＤＮＡ分子に由来する核酸断片は物理的に連結されたままである（Adey et al., 2014, Genome Res., 24:2041-2049）。例えば、ループ状のトランスポソーム複合体は、断片化部位を含むことができる。断片化部位は、標的核酸に挿入されたインデックス配列の間の情報の関連でなく物理的関連を切断するために使用することができる。切断は、生化学的であるか、化学的であるかまたは他の手段によることができる。一部の実施形態では、断片化部位は、様々な手段によって断片化することができるヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含むことができる。断片化部位の例には、限定されずに、制限エンドヌクレアーゼ部位、ＲＮアーゼで切断可能な少なくとも１つのリボヌクレオチド、ある特定の化学薬剤の存在下で切断可能なヌクレオチド類似体、過ヨウ素酸塩による処理によって切断可能なジオール結合、化学還元剤で切断可能なジスルフィド基、光化学的切断を受けさせることができる切断可能な部分、およびペプチダーゼ酵素または他の適する手段によって切断可能なペプチドが含まれる（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７２４号およびＷＯ２０１２／０６１８３２を参照する）。
トランスポソーム複合体は少なくとも１つのインデックス配列を含んでもよく、トランスポザーゼインデックスと呼ぶことができる。インデックス配列は、トランスポゾン配列の一部として存在する。一実施形態では、インデックス配列は、移動させた鎖、標的核酸に移動させたトランスポザーゼ認識部位の鎖に存在することができる。
トランスポソーム複合体は、線形増幅媒介物が使用することができる少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでもよい。そのようなヌクレオチド配列の例には、限定されずに、核酸断片がファージプロモーターを含むときのＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７プロモーター用としてのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、および線形増幅プライマーが含まれる。線形増幅プライマーの例には、ＰＣＲタイプの増幅で使用するための単一のプライマーまたは線形増幅媒介物が含まれる。線形増幅媒介物が使用することができるヌクレオチド配列の他の実施形態は、鎖置換ポリメラーゼによって認識される配列である。媒介物は、複製を開始するためのニッキング部位を含有することができる。一部の場合には、ニッキング部位は、さらなる増幅のために再生される。
コンパートメント特異的インデックスを加える
タグまたはバーコードとも呼ばれるインデックス配列は、特定の核酸が存在したコンパートメントに特徴的なマーカーとして有益である。したがって、インデックスは、特定のコンパートメントに存在する標的核酸の各々に付着している核酸配列タグであり、その存在は、単離した核または細胞の集団が本方法の特定の段階に存在したコンパートメントを示すか、またはそれを同定するのに使用される。インデックスの核酸断片への付加は、異なるコンパートメントに分配される単離した核または細胞のサブセットで達成される。
インデックス配列は、長さが任意の適する数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くのヌクレオチドであってよい。４ヌクレオチドタグは、同じアレイの上で２５６個の試料を多重化する可能性を与え、６塩基タグは同じアレイの上で４０９６個の試料を処理することを可能にする。
一実施形態では、インデックスの付加は、核酸断片への核酸の処理の間に達成される。例えば、インデックスを含むトランスポソーム複合体を使用することができる。他の実施形態では、片方または両方の末端にヌクレオチド配列を含有する核酸断片が処理によって生成された後に、インデックスは加えられる。インデックスを加える方法には、限定されずに、ライゲーション、伸長（逆転写酵素を使用した伸長を含む）、ハイブリダイゼーション、吸着、プライマーの特異的もしくは非特異的相互作用または増幅が含まれる。核酸断片の片方または両方の末端に加えられるヌクレオチド配列は、１つまたは複数の遍在配列および／または特異な分子識別子を含むこともできる。遍在配列は、例えば、核酸断片への別のインデックスおよび／または別の遍在配列などの別のヌクレオチド配列の付加のためのプライマーとして使用することができるヌクレオチド配列をアニールする以降の工程における「ランディングパッド」として使用することができる。
例えば、ｍＲＮＡに由来する核酸断片の使用を含む実施形態では、１工程または２工程でインデックスをｍＲＮＡに加えるために、様々な方法を使用することができる。例えば、ｃＤＮＡを生成するために使用されるタイプの方法を使用して、インデックスを加えることができる。逆転写酵素を使用して、３’末端のポリＴ配列を有するプライマーをｍＲＮＡ分子にアニールさせ、伸長させることができる。単離した核または細胞を逆転写に適する条件の下でこれらの構成成分に曝露させることは、インデックス付きの核または細胞の集団をもたらす、インデックスの１工程付加をもたらし、ここで、各核または細胞は、インデックス付きの核酸断片を含有する。あるいは、ポリＴ配列を有するプライマーはインデックスの代わりに遍在配列を含み、インデックスは、ライゲーション、プライマー伸長、増幅の以降の工程によって加えられる。インデックス付きの核酸断片は、合成された鎖の上に特定のコンパートメントを示すインデックス配列を含むことができ、また一般的に含む。
非コードＲＮＡに由来する核酸断片の使用を含む実施形態では、１工程または２工程でインデックスを非コードＲＮＡに加えるために、様々な方法を使用することができる。例えば、ランダム配列を含む第１のプライマーおよび鋳型スイッチプライマーを使用してインデックスを加えることができ、ここで、いずれのプライマーもインデックスを含むことができる。合成された鎖の３’末端への非鋳型ヌクレオチドの付加をもたらす末端転移酵素活性を有する逆転写酵素を使用することができ、鋳型スイッチプライマーは、逆転写酵素によって加えられる非鋳型ヌクレオチドとアニールするヌクレオチドを含む。有益な逆転写酵素の一例は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素である。特定の実施形態では、非コードＲＮＡ、および所望によりｍＲＮＡにインデックスを加えるための鋳型スイッチングの使用のために、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．から入手可能なＳＭＡＲＴｅｒ（商標）試薬（カタログ番号６３４９２６）が使用される。あるいは、第１のプライマーおよび／または鋳型スイッチプライマーはインデックスの代わりに遍在配列を含むことができ、インデックスは、ライゲーション、プライマー伸長または増幅の以降の工程によって加えられる。インデックス付きの核酸断片は、合成された鎖の上に特定のコンパートメントを示すインデックス配列を含むことができ、また一般的に含む。他の実施形態は、ＲＮＡの５’もしくは３’プロファイリングまたは完全長ＲＮＡプロファイリングを含む。
インデックスの核酸断片への付加のために他の方法を使用することができ、インデックスがどのように加えられるかは制限するものでない。例えば、一実施形態では、インデックス配列の組込みは、核酸断片の片方または両方の末端にプライマーをライゲーションすることを含む。ライゲーションプライマーのライゲーションは、核酸断片の末端の遍在配列の存在によって支援することができる。プライマーの非限定的な例は、ヘアピンライゲーション二重鎖である。ライゲーション二重鎖は、核酸断片の１つの末端または好ましくは両末端にライゲーションすることができる。一実施形態では、ヘアピンライゲーション二重鎖などのプライマーは、線形増幅媒介物によって認識されるヌクレオチド配列を含有することができる。そのようなヌクレオチドを含有するヘアピンアダプターの例は、実施例１、図２に記載される。その分子の増幅産物を生成するためにバーコード化分子の２つの末端のうちの１つでのライゲーションの成功を必要とするだけである増幅媒介物を導入する、実施例１に記載されるものなどのアッセイスキームが望ましく、その理由は、それが鋳型変換の効率が増加する利点を有するからである。例えば、単一のライゲーション事象が５０％の効率を有する場合、この改変は分子を増幅するライゲーション工程で２５％の代わりに７５％の成功率を与える（実施例１、図２）。
別の実施形態では、インデックス配列の組込みは、一本鎖の核酸断片の使用および第２のＤＮＡ鎖の合成を含む。一実施形態では、第２のＤＮＡ鎖は、一本鎖の核酸断片の末端に存在するヌクレオチドに相補的な配列を含むプライマーを使用して生成される。
別の実施形態では、インデックスの組込みは、一重、二重、三重または多重にインデックスが付いた単一細胞ライブラリーをもたらす、１、２、３またはより多くの回数のスプリットおよびプールバーコード化において起こる。
別の実施形態では、増幅媒介物が使用することができるインデックスおよびヌクレオチド配列の組込みは一方向で設計され、標的化単一細胞シークエンシングライブラリーの調製を可能にする（実施例１、図３ｂを参照する）。
核酸断片の線形増幅
本明細書で提供される方法は、核酸断片の線形増幅を含む。ほとんどの増幅方法はＰＣＲベースであり、したがって、指数関数的増幅バイアスを被る。本明細書で使用される線形増幅は指数関数的増幅バイアスを低減または排除することができ、それによってより良い均一性および低減された配列エラーにつながる。全ゲノム増幅を利用する全ての単一細胞ゲノム研究方法では、増幅産物はコンパートメント（例えばウェルまたは液滴）に入れられ、バーコードが直接的または間接的に増幅産物に付着している。このように、１コンパートメントにつき単一の細胞だけが存在し、スループットが制限され、費用が増加する。本発明の特異な態様は、単一のコンパートメントの中で指数関数的増幅バイアスなしで複数の単一細胞ライブラリーを増幅することができることである。単一細胞からのライブラリーは、特異な単一細胞ごとの特異な１つまたは複数のバーコードに基づいて割り当てることができる。
一実施形態では、線形増幅は、ファージプロモーターを核酸断片の片方または両方の末端に加えることによって達成される。核酸断片の上流に置かれるとき、ファージプロモーターは、一本鎖のＲＮＡを生成するインビトロ（in vitro）転写による対応するファージＲＮＡポリメラーゼを使用した転写を促進するために使用することができる。ＤＮＡ鋳型から生成されるＲＮＡコピーは、さらなる増幅のための鋳型の役割をすることができない。したがって、全てのコピーは、元のＤＮＡ鋳型に直接的に由来し、指数関数的増幅が回避される。一実施形態では、以降の工程は、一本鎖ＤＮＡを得るためのＲＮＡコピーの逆転写、および一本鎖のＤＮＡコピーを二本鎖分子に変換するための第２の鎖合成を次に含むことができる。第２の鎖合成はプライマーの使用を一般的に必要とし、このプライマーは、インデックス、遍在配列および／または遍在分子識別子の１つまたは複数を導入するために使用することができる。
線形増幅の他の方法を使用することができる。例えば、ＰＣＲ増幅は１つのプライマーで、または２つのプライマーで使用することができ、１つは余分である。一部の実施形態では、トランスポゾン挿入部位に隣接している隣接配列の増幅のために、線形ＰＣＲを使用することができる（Xianbo et al. AMB Express, 2017, 7:195）。連結線形増幅（Reyes et al., Clin. Chem., 2001, 47(1):31-40）、線形伸長および線形伸長とライゲーション、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Walker et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20(7): 1691-1696）ならびにローリングサークル増幅（Ali et al., Chem. Soc. Rev., 2014, 43:3324-3341）を一部の実施形態で使用することもできる。一部の実施形態では、インデックス、遍在配列および／または特異な分子識別子は、線形増幅の間に核酸断片に加えることができる。
一般的に、線形増幅は、単離した核または細胞に線形増幅媒介物を導入することを含む。線形増幅媒介物の例には、核酸断片がファージプロモーターを含むときのＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７プロモーター用としてのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および線形増幅プライマーが含まれる。線形増幅プライマーの例には、ＰＣＲタイプの増幅で使用するための単一のプライマーまたは線形増幅媒介物が含まれる。増幅媒介物の他の実施形態は、ヌクレオチド配列を認識する鎖置換ポリメラーゼである。媒介物は、複製を開始するためのニッキング部位を含有することができる。一部の場合には、ニッキング部位は、さらなる増幅のために再生される。媒介物は、増幅または増幅産物の標識化の間にバーコードの複製を可能にする、特異なバーコードまたはプライマーを含有することができる。
固定化のための遍在配列の付加
一実施形態では、処理および／またはインデクシング工程の間のヌクレオチドの付加は、断片の固定化およびシークエンシングにおいて有益である遍在配列を加える。別の実施形態では、インデックス付きの核酸断片は、核酸断片の固定化およびシークエンシングにおいて有益な遍在配列を加えるために、さらに処理することができる。当業者は、コンパートメントが液滴である実施形態において、核酸断片を固定化するための配列は適宜であることを認める。一実施形態では、断片の固定化およびシークエンシングにおいて有益な遍在配列の組込みは、同一の遍在アダプター（「ミスマッチアダプター」とも呼ばれ、その一般的フィーチャーは、Ｇｏｒｍｌｅｙら、米国特許第７，７４１，４６３号、およびＢｉｇｎｅｌｌら、米国特許第８，０５３，１９２号に記載される）をインデックス付きの核酸断片の５’および３’末端にライゲーションすることを含む。一実施形態では、遍在アダプターは、アレイの上にインデックス付きの核酸断片を固定化するための配列を含む、シークエンシングに必要な全ての配列を含む。
一実施形態では、平滑末端ライゲーションを使用することができる。別の実施形態では、核酸断片は、例えば、単一のデオキシヌクレオチド、例えばデオキシアデノシン（Ａ）をインデックス付きの核酸断片の３’末端に加える非鋳型依存性末端転移酵素活性を有する、ある特定のタイプのＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼまたはクレノウエキソマイナスポリメラーゼの活性によって、単一の突出ヌクレオチドで調製される。一部の場合には、突出ヌクレオチドは、複数塩基である。そのような酵素は、単一のヌクレオチド「Ａ」を核酸断片の各鎖の平滑末端３’末端に加えるために使用することができる。したがって、Ｔａｑまたはクレノウエキソマイナスポリメラーゼとの反応によって「Ａ」を二本鎖標的断片の各鎖の３’末端に加えることができ、核酸断片の各末端に加えられるさらなる配列は、加えられる二本鎖核酸の各領域の３’末端の上に存在する、適合する「Ｔ」突出を含むことができる。この末端改変は核酸のセルフライゲーションも阻止し、そのため、この実施形態で加えられる配列が隣接するインデックス付きの核酸断片の形成の方へのバイアスがある。
別の実施形態では、インデックス付きの核酸断片にライゲーションされる遍在アダプターがシークエンシングのために必要な全ての配列を含むとは限らない場合、固定化およびシークエンシングの前に各インデックス付きの核酸断片に存在する遍在アダプターをさらに改変するために、ＰＣＲなどの増幅工程を使用することができる。例えば、初期プライマー伸長反応は、インデックス付きの核酸断片に存在する遍在配列に相補的である遍在アンカー配列を使用して実行することができ、ここで、各個々のインデックス付きの核酸断片の両方の鎖に相補的な伸長産物が形成される。一般的に、ＰＣＲは、遍在捕捉配列などのさらなる遍在配列を加える。
シークエンシングのために必要な全ての配列を含む遍在アダプターをライゲーションする単一工程方法によって、または遍在アダプターをライゲーションし、次に増幅させて遍在アダプターをさらに改変する二工程方法によって遍在アダプターが加えられた後、最終インデックス断片は、遍在捕捉配列およびアンカー配列を含む。各末端に遍在アダプターを加えることの結果は、複数のインデックス付きの核酸断片またはそのライブラリーである。
生じるインデックス付きの核酸断片は、固定化して次に配列決定することができる核酸のライブラリーを集団で提供する。本明細書でシークエンシングライブラリーとも呼ばれる用語ライブラリーは、それらの３’および５’末端に公知の遍在配列を含有する単一の核または細胞からの核酸断片の集合を指す。
インデックス付きの核酸断片は、所定のサイズ範囲、例えば１５０から４００ヌクレオチドの長さ、例えば１５０から３００ヌクレオチドを選択する条件に付すことができる。生じるインデックス付きの核酸断片をプールし、組み込まれていない遍在アダプターまたはプライマーの少なくとも一部を取り除くことによってＤＮＡ分子への純度を強化するためのクリーンアッププロセスに付してもよい。任意の適するクリーンアッププロセス、例えば電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーなどを使用することができる。一部の実施形態では、所望のＤＮＡ分子を付着していない遍在アダプターまたはプライマーから分離し、サイズに基づいて核酸を選択するために、固相可逆的固定化常磁性ビーズを用いることができる。固相可逆的固定化常磁性ビーズは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（ＭａｇＪｅｔ）、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｋ（Ｍａｇ－Ｂｉｎｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅａｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｋａｐａ Ｐｕｒｅ Ｂｅａｄｓ）から市販されている。
本開示の非限定的な例示的実施形態は図２に示し、実施例１に記載する。この実施形態では、本方法は、複数の細胞から単離した核を提供することを含む（図２、ブロック２２）。単離した核はヌクレオソーム無しであってよいか、または核のヌクレオソームを枯渇させる条件に付し、ヌクレオソームが枯渇された核を生成することができる（図２、ブロック２３）。
この実施形態では、本方法は、ヌクレオソームが枯渇された核のサブセットを第１の複数のコンパートメントに分配することを含む（図２、ブロック２４）。第１の分配工程（図２、ブロック２４）におけるコンパートメントの数は、使用するフォーマットに依存することができる。一実施形態では、コンパートメントの数は、２４である。
各コンパートメントは、トランスポソーム複合体を含む。トランスポソーム複合体は、核のサブセットがコンパートメントに加えられる前、後またはそれと同時に各コンパートメントに加えることができる。トランスポソーム複合体は、少なくとも１つのインデックス配列および少なくとも１つの遍在配列を含む。トランスポソーム複合体の一部として存在する遍在配列は、スペーサー配列と呼ぶことができる。スペーサー配列は、トランスポゾン配列の一部として存在する。一実施形態では、スペーサー配列は、移動させた鎖、標的核酸に移動させたトランスポザーゼ認識部位の鎖に存在することができる。スペーサー配列は、相補的な配列とアニーリングするための部位として有益である。例えば、スペーサー配列は、遍在プライマーまたは遍在プライマーの相補体であってよい。トランスポソーム複合体のスペーサー配列は、各コンパートメントで同じであってよい。一実施形態では、インデックス（「ｂｃ１」）およびスペーサー（「ｓｐ１」）は、実施例１の図４Ａに示す配向で配置され、突出部に存在している。
本方法は、インデックス付きの核を生成することを含む（図２、ブロック２５）。一実施形態では、インデックス付きの核を生成することは、ヌクレオソームが枯渇された核（例えば、各コンパートメントに存在する核酸）のサブセットに存在する核酸を処理して複数の核酸断片にすることを含む。一実施形態では、核酸が断片化された後、トランスポザーゼは核酸断片に付着したままであり、そのため、同じゲノムＤＮＡ分子に由来する核酸断片は物理的に連結されたままである（Adey et al., 2014, Genome Res., 24:2041-2049）。断片化の結果はインデックス付きの核の集団であり、ここで、各核はインデックス付きの核酸断片を含有する。トランスポソーム複合体のインデックス配列は各コンパートメントで異なり、したがって、インデックス付きの核酸断片は、少なくとも１つの鎖の上に特定のコンパートメントを示すインデックス配列を含むことができ、また一般的に含む。インデックス付きの核酸断片の例は、実施例１の図４Ａのボックス部分に示す。
複数のコンパートメントからのインデックス付きの核は、組み合わせることができる（図２、ブロック２６）。これらの組み合わせたインデックス付きの核のサブセットは、第２の複数のコンパートメントに次に分配される。サブセットに、したがって各コンパートメントに存在する核の数は、インデックスの衝突を低減する要求に一部基づき、それは、本方法のこの工程の同じコンパートメントに存在する同じトランスポザーゼインデックスを有する２つの核の存在のことである。一実施形態では、各サブセットに存在する核の数は、概ね等しい。
サブセットへの核の分配の後に、二重インデックス断片を生成するための、各コンパートメントの中のインデックス付きの核酸断片への第２のインデックス配列の組み込みが続く。これは、インデックス付きの核酸断片のさらなるインデクシングをもたらす（図２、ブロック２７）。細胞が架橋剤によって架橋される実施形態では、インデックス付きの核酸断片に付着したトランスポザーゼはインデックス付きの核酸断片から解離させることができる。トランスポザーゼを解離させるために洗浄剤を使用することができ、一実施形態では、洗浄剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
一実施形態では、第２のインデックス配列の組込みは、各コンパートメントの中のインデックス付きの核酸断片にヘアピンライゲーション二重鎖をライゲーションすることを含む。ライゲーション二重鎖は、二重のインデックス付きの核酸断片の１つの末端または好ましくは両末端にライゲーションすることができる。一実施形態では、ライゲーション二重鎖は、５つのエレメントを含む：１）第１のスペーサー配列の逆相補体（例えば、実施例１の図４Ｂの中の「ｓｐ１」）、これは本明細書に記載されるライゲーション工程における「ランディングパッド」の役目をする；２）２回目のバーコードの逆相補体；３）第２の鎖の合成（ＳＳＳ）プライマーの逆相補体；４）Ｔ７プロモーター、これは好ましくはヘアピンのループ領域である；５）Ｔ７転写を強化するためのＧＧＧから開始する第２の鎖の合成（ＳＳＳ）プライマー領域（実施例１の図４Ｂの中の第２のスペーサー配列、「ｓｐ２」）；および６）２回目のバーコード、第２のインデックス配列、（実施例１の図４Ｂの中の「ｂｃ２」）。第２のインデックス配列は各コンパートメントで特異であり、ここでは、分配されるインデックス付きの核は第１のインデックスがタグメンテーションによって加えられた後に置かれた（図２、ブロック２７）。
複数のコンパートメントからのインデックス付きの核は、組み合わせることができる（図２、ブロック２８）。これらの組み合わせたインデックス付きの核のサブセットは、第３の複数のコンパートメントに次に分配される。サブセットに、したがって各コンパートメントに存在する核の数は、インデックスの衝突を低減する要求に一部基づき、それは、本方法のこの工程の同じコンパートメントに存在する同じトランスポザーゼインデックスを有する２つの核の存在のことである。一実施形態では、１００～３００細胞が各ウェルに分配される。一実施形態では、最高３００細胞が各ウェルに分配される。一実施形態では、各サブセットに存在する核の数は、概ね等しい。
サブセットへの二重インデックス付きの核の分配の後に、溶解およびさらなる人為操作が続く（図２、ブロック２９）。核の溶解のための方法は、当業者に公知であり、ルーチンである。さらなる人為操作には、限定されずに、ギャップ伸長、インビトロ転写（ＩＶＴ）および逆転写が含まれる。
ギャップ伸長は、ヘアピンＴ７プロモーター構造を二重鎖に変換する（実施例１の図４Ｃ）。ギャップ伸長のために、鎖置換活性を有するポリメラーゼが一般的に使用される。この活性を有するポリメラーゼ、例えばＢｓｔポリメラーゼが利用可能である。
ＩＶＴは、Ｔ７プロモーターの下流に線形増幅一本鎖ＲＮＡ分子を生成する（実施例１の図４Ｄ）。ＩＶＴのための方法は公知であり、ルーチンである。
逆転写は、２つの経路のうちの１つによって起こることができる（実施例１の図４Ｅ）。本明細書に記載されるライゲーション反応は、２種類の核酸断片をもたらす：両末端にライゲーション二重鎖を有する核酸断片および１つの末端にライゲーション二重鎖を有する核酸断片。ライゲーションが両末端で成功した場合は、逆転写は自己ループ化逆転写プライマーによって初回刺激することができ、それらはループ化ライゲーション二重鎖から受け継がれる。ライゲーションが１つの末端だけで成功した場合は、逆転写は過剰に加えられる追加のＲＮＡ逆転写プライマーによって初回刺激される。
核の溶解および核酸断片の処理の後に、三重インデックス付き断片を生成するための、各コンパートメントの中の二重インデックス付きの核酸断片への第３のインデックス配列の組み込みが続き、ここで、各コンパートメントの中の第３のインデックス配列は他のコンパートメントの中の第１および第２のインデックス配列と異なり、各コンパートメントの中の第３のインデックス配列は他のコンパートメントの中の第３のインデックス配列と異なる。これは、固定化およびシークエンシングの前にインデックス付きの核酸断片のさらなるインデクシングをもたらす（図２、ブロック３０；実施例１の図４Ｆ）。第３のインデックスは、第２のＤＮＡ鎖の合成によって組み込むことができる。一実施形態では、第２のＤＮＡ鎖は、二重インデックス付きの核酸断片の末端に存在するヌクレオチドに相補的な配列を含むプライマーを使用して生成される。例えば、プライマーは、第２のスペーサー配列の逆相補体とアニールする第２のスペーサー配列（ｓｐ２）を含むことができる（実施例１の図４Ｆ）。プライマーは、第３のインデックス（実施例１の図４Ｆの中の「ｂｃ３」）および他の特異な分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。生じる二本鎖ＤＮＡは、ルーチンの方法を使用して精製することができる。
シークエンシングのために、複数の三重インデックス付きの断片を調製することができる。三重インデックス付きの断片をプールした後、それらは、シークエンシングの前に一般的に固定化および／または増幅によって富化される（図２、ブロック３１）。
シークエンシングのための固定化試料の調製
シークエンシングのために、複数のインデックス付きの断片を調製することができる。例えば、三重インデックス付きの断片のライブラリーが生成される実施形態では、三重インデックス付きの断片は、シークエンシングの前に一般的に固定化および／または増幅によって富化される（図２、ブロック２１）。１つまたは複数の供給源からのインデックス付きの断片を基質に付着させるための方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、インデックス付きの断片は、そのインデックス付きの断片に特異性を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用して富化され、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体基質の表面に固定化することができる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは遍在の結合性の対の第１のメンバーを含むことができ、ここで、結合性の対の第２のメンバーは固体基質の表面に固定化される。同様に、固定化された二重インデックス付きの断片を増幅する方法には、限定されずに、架橋増幅および動態学的排除が含まれる。シークエンシングの前に固定化および増幅する方法は、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌら（米国特許第８，０５３，１９２号）、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら（ＷＯ２０１６／１３０７０４）、Ｓｈｅｎら（米国特許第８，８９５，２４９号）およびＰｉｐｅｎｂｕｒｇら（米国特許第９，３０９，５０２号）に記載される。
プールされた試料は、シークエンシングの準備のために固定化することができる。シークエンシングは単一分子のアレイとして実行することができるか、またはシークエンシングの前に増幅することができる。増幅は、１つまたは複数の固定化プライマーを使用して実行することができる。固定化プライマー（複数可）は、例えば、平らな表面の上、またはビーズのプールの上のローンであってよい。ビーズのプールは、乳濁液の各「コンパートメント」の中に単一のビーズが含まれる乳濁液の中に単離することができる。１「コンパートメント」につき１つの鋳型だけの濃度では、単一の鋳型だけが各ビーズの上で増幅される。
本明細書で使用される用語「固相増幅」は、固体支持体の上でまたはそれと共同して実行され、そのため、それらが形成されるにつれて増幅産物の全てまたは一部が固体支持体の上に固定化される、任意の核酸増幅反応を指す。詳細には、本用語は、固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）および固相等温増幅を包含し、それらは、フォワードおよびリバース増幅プライマーの片方または両方が固体支持体の上に固定化されることを除いて、標準の溶液相増幅に類似した反応である。固相ＰＣＲは、１つのプライマーがビーズにアンカーされ、他は自由溶液中にある乳濁液、および、１つのプライマーが表面にアンカーされ、１つは自由溶液中にある固相ゲルマトリックスの中でのコロニー形成などのシステムを包含する。
一部の実施形態では、固体支持体はパターン化表面を含む。「パターン化表面」は、固体支持体の露出層の中またはその上での異なる領域の配置を指す。例えば、領域の１つまたは複数は、１つまたは複数の増幅プライマーが存在するフィーチャーであってよい。フィーチャーは、増幅プライマーが存在しない中間領域によって分離することができる。一部の実施形態では、パターンは、行および列にあるフィーチャーのｘ－ｙフォーマットであってよい。一部の実施形態では、パターンは、フィーチャーおよび／または中間領域の反復配置であってよい。一部の実施形態では、パターンは、フィーチャーおよび／または中間領域のランダム配置であってよい。本明細書に示す方法および組成物において使用することができる例示的なパターン化表面は、米国特許第８，７７８，８４８号、第８，７７８，８４９号および第９，０７９，１４８号、および米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号に記載される。
一部の実施形態では、固体支持体はウェルのアレイまたは表面の陥没を含む。これは、一般的に当技術分野で公知であるように、写真平版、スタンピング技術、成形技術およびマイクロエッチング技術を限定されずに含む、様々な技術を使用して製作することができる。当業者が理解するように、使用する技術はアレイ基質の組成および形状に依存する。
パターン化表面のフィーチャーは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ、例えば、米国特許出願公開第２０１３／１８４７９６号、ＷＯ２０１６／０６６５８６およびＷＯ２０１５／００２８１３を参照する）などの、パターン化された共有結合しているゲルを有する、ガラス、シリコン、プラスチック、または他の適する固体支持体の上のウェル（例えば、マイクロウェルまたはナノウェル）のアレイの中のウェルであってよい。このプロセスは、多数のサイクルによるシークエンシングの実行にわたって安定することができるシークエンシングのために使用される、ゲルパッドを作製する。ウェルへのポリマーの共有結合は、様々な使用の間の構造化基質の寿命にわたって構造化フィーチャーにゲルを維持するのに有効である。しかし、多くの実施形態では、ゲルはウェルに共有結合する必要はない。例えば、一部の条件では、構造化基質のいずれの部分にも共有結合していないシランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ、例えば、米国特許第８，５６３，４７７号を参照する）を、ゲル材料として使用することができる。
特定の実施形態では、構造化基質は、固体支持材をウェル（例えば、マイクロウェルまたはナノウェル）によってパターン化し、パターン化支持体をゲル材料［例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡまたは化学改変されたその変異体、例えばＳＦＡのアジドール化バージョン（アジド－ＳＦＡ）］によってコーティングし、ゲルコーティングされた支持体を、例えば化学的または機械的研摩によって研摩し、それによって、ゲルをウェルの中に保持するが、ウェルの間の構造化基質の表面の中間領域からのゲルの実質的に全てを除去または不活性化することによって作製することができる。プライマー核酸は、ゲル材料に付着させることができる。個々のインデックス付きの断片がゲル材料に付着しているプライマーとの相互作用を通して個々のウェルに播種するように、インデックス付きの断片の溶液を研摩された基質と次に接触させることができる。しかし、ゲル材料の不在または不活性のために、標的核酸は中間領域を占有しない。中間領域におけるゲルの不在または不活性は成長する核酸コロニーの外側への移動を阻止するので、インデックス付きの断片の増幅はウェルに限定される。このプロセスは都合よく製作することができ、スケーラブルであり、従来のマイクロ－またはナノファブリケーション方法を利用する。
本開示は１つの増幅プライマーだけが固定化される（他のプライマーは通常自由溶液中に存在する）「固相」増幅方法を包含するが、一実施形態では、固体支持体が、固定化されるフォワードおよびリバースプライマーと提供されることが好ましい。実際、増幅プロセスは増幅を持続するために過剰のプライマーを必要とするので、固体支持体上に固定化される「複数」の同一のフォワードプライマーおよび／または「複数」の同一のリバースプライマーがある。本明細書においてフォワードおよびリバースプライマーへの言及は、文脈が別途示さない限り、「複数」のそのようなプライマーを包含するものとして解釈されるべきである。
熟練読者が理解するように、いかなる所与の増幅反応も、増幅される鋳型に特異的である少なくとも１つのタイプのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのタイプのリバースプライマーを必要とする。しかし、ある特定の実施形態では、フォワードおよびリバースプライマーは、同一の配列の鋳型特異的部分を含むことができ、完全に同一のヌクレオチド配列および構造（任意の非ヌクレオチド改変を含む）を有することができる。言い換えると、１つのタイプのプライマーだけを使用して固相増幅を実行することが可能であり、そのような単一プライマー方法は本開示の範囲内に包含される。他の実施形態は、同一の鋳型特異的配列を含有するが、一部の他の構造的なフィーチャーにおいて異なるフォワードおよびリバースプライマーを使用することができる。例えば、１つのタイプのプライマーは、他に存在しない非ヌクレオチド改変を含有することができる。
本開示の全ての実施形態では、固相増幅のためのプライマーは、プライマーの５’末端またはその近くにおける固体支持体への単一点共有結合性付着によって好ましくは固定化され、プライマーの鋳型特異的部分をそのコグネイト鋳型に自由にアニールさせ、３’ヒドロキシル基のプライマー伸長を自由にする。当技術分野で公知の任意の適する共有結合性付着手段を、この目的のために使用することができる。選択される付着化学は、固体支持体の性質、およびそれに適用される任意の誘導体化または官能基化に依存する。プライマーは、付着を促進するために、非ヌクレオチド化学的改変であってよい部分をそれ自体含むことができる。特定の実施形態では、プライマーは５’末端に含硫求核体、例えばホスホロチオエートまたはチオホスフェートを含むことができる。固体によって支持されるポリアクリルアミドヒドロゲルの場合、この求核体は、ヒドロゲルに存在するブロモアセトアミド基に結合する。プライマーおよび鋳型を固体支持体に付着させるより特定の手段は、国際公開第０５／０６５８１４号に記載の通りに、重合アクリルアミドおよびＮ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）で構成されるヒドロゲルへの５’ホスホロチオエート付着による。
本開示のある特定の実施形態は、例えばポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合性付着を可能にする反応性基を含む中間材料の層またはコーティングの適用によって「官能基化された」、不活性の基質またはマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズ等）を含む固体支持体を利用することができる。そのような支持体の例には、限定されずに、ガラスなどの不活性基質の上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲルが含まれる。そのような実施形態では、生体分子（例えばポリヌクレオチド）は中間材料（例えばヒドロゲル）に直接的に共有結合させることができるが、中間材料自体は基質またはマトリックス（例えばガラス基質）に非共有結合的に付着していてもよい。用語「固体支持体への共有結合性付着」は、このタイプの配置を包含するものと解釈するべきである。
各ビーズがフォワードおよびリバース増幅プライマーを含有するビーズの上で、プールされた試料を増幅することができる。特定の実施形態では、インデックス付きの断片のライブラリーは、固相増幅、より詳細には固相等温増幅による、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号、米国特許第７，１１５，４００号、国際公開第００／１８９５７号および国際公開第９８／４４１５１号に記載されるものに類似している、核酸コロニーのクラスター化アレイを調製するために使用される。用語「クラスター」および「コロニー」は、本明細書では複数の同一の固定化された核酸鎖および複数の同一の固定化された相補的な核酸鎖を含む、固体支持体の上の個別の部位を指すために互換的に使用される。用語「クラスター化アレイ」は、そのようなクラスターまたはコロニーから形成されるアレイを指す。この関係において、用語「アレイ」は、整然としたクラスター配置を必要とすると理解するべきでない。
用語「固相」または「表面」は、プライマーが平面に、例えばガラス、シリカまたはプラスチック製の顕微鏡スライドまたは類似のフローセル装置に付着している平らなアレイ；１つまたは２つのプライマーがビーズに付着し、ビーズが増幅されるビーズ；または、ビーズが増幅された後の表面のビーズのアレイを意味するために使用される。
クラスター化アレイは、国際公開第９８／４４１５１号に記載のサーモサイクリングのプロセス、または、温度が定数として維持され、伸長および変性のサイクルが試薬の変更によって実行されるプロセスを使用して調製することができる。そのような等温増幅方法は、特許出願番号国際公開第０２／４６４５６号および米国特許出願公開第２００８／０００９４２０号に記載される。等温プロセスにおいて有益なより低い温度のために、一部の実施形態ではこれは特に好ましい。
固定化されたＤＮＡフラグメントを増幅するために、本明細書に記載されるか当技術分野で一般に公知である増幅方法のいずれをも遍在または標的特異的であるプライマーと使用することができることが理解される。米国特許第８，００３，３５４号に記載の通りに、増幅のために適する方法には、限定されずに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。上記の増幅方法は、目的の１つまたは複数の核酸を増幅するために用いることができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲは、固定化されたＤＮＡフラグメントを増幅するために利用することができる。一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドに特異的に向けられるプライマーが、増幅反応に含まれる。
ポリヌクレオチドの増幅のための他の適する方法は、オリゴヌクレオチド伸長およびライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)）ならびにオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（米国特許第７，５８２，４２０号、第５，１８５，２４３号、第５，６７９，５２４号および第５，５７３，９０７号；欧州特許第０３２０３０８号；欧州特許第０３３６７３１号；欧州特許第０４３９１８２号；国際公開第９０／０１０６９号；国際公開第８９／１２６９６号；および国際公開第８９／０９８３５号を一般的に参照する）技術を含むことができる。これらの増幅方法は、固定化されたＤＮＡフラグメントを増幅するように設計することができることが理解される。例えば、一部の実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーを含有する、ライゲーションプローブ増幅またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含むことができる。一部の実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーを含有する、プライマー伸長－ライゲーション反応を含むことができる。目的の核酸を増幅するように特異的に設計することができるプライマー伸長およびライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、米国特許第７，５８２，４２０号および第７，６１１，８６９号に例示されるＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のために使用されるプライマーを含むことができる。
本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせて、ＤＮＡナノボールを使用することもできる。ゲノムシークエンシングのためにＤＮＡナノボールを作製して利用する方法は、例えば、米国特許および出願公開、第７，９１０，３５４号、第２００９／０２６４２９９号、第２００９／００１１９４３号、第２００９／０００５２５２号、第２００９／０１５５７８１号、第２００９／０１１８４８８号に、および、例えばDrmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81に記載の通りに見出すことができる。簡潔には、ゲノムライブラリーＤＮＡ断片化に続いて、アダプターが断片にライゲーションされ、アダプターにライゲーションされた断片は環リガーゼによるライゲーションによって環化され、ローリングサークル増幅が実行される（Lizardi et al., 1998. Nat. Genet. 19:225-232および米国特許出願公開第２００７／００９９２０８号に記載の通りに）。アンプリコンの伸長したコンカテマー構造はコイル化を促進し、それによってコンパクトなＤＮＡナノボールを作製する。各ナノボールの間の距離が維持され、それによって別個のＤＮＡナノボールのシークエンシングを可能にするように、好ましくは整然としているかまたはパターン化されたアレイを作製するために、ＤＮＡナノボールを基質の上で捕捉することができる。完全ゲノム研究（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）によって使用されるものなどの一部の実施形態では、連続回のアダプターライゲーション、増幅および消化が環状化の前に実行されて、アダプター配列によって分離されるいくつかのゲノムＤＮＡ断片を有するヘッド－トゥ－テールコンストラクトを生成する。
本開示の方法において使用することができる例示的な等温増幅方法には、限定されずに、例えばDean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)によって例示される多重置換増幅（ＭＤＡ）または例えば米国特許第６，２１４，５８７号に例示される等温鎖置換核酸増幅が含まれる。本開示において使用することができる他の非ＰＣＲベースの方法には、例えば、Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995；米国特許第５，４５５，１６６号および第５，１３０，２３８号、およびWalker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)に記載される鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または、例えばLage et al., Genome Res. 13:294-307 (2003)に記載される過分枝鎖置換増幅が含まれる。等温増幅方法は、例えば、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換ファイ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片、５’－＞３’エキソ－と使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い処理能力および鎖置換活性を利用する。高い処理能力は、ポリメラーゼが１０～２０ｋｂの長さである断片を生成することを可能にする。上に示されるように、クレノウポリメラーゼなどの低い処理能力および鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して等温条件でより小さい断片を生成することができる。増幅反応、条件および構成成分のさらなる記載は、米国特許第７，６７０，８１０号の開示の中で詳細に示される。
本開示において有益である別のポリヌクレオチド増幅方法は、例えば、Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)に記載される、定常５’領域および続くランダム３’領域を有する２ドメインプライマーの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の最初の数回は、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて熱変性ＤＮＡの上で多数の開始を可能にするために実行される。３’領域の性質のために、開始部位は、ゲノム全体にわたってランダムであると考えられる。その後、未結合のプライマーを除去することができ、定常５’領域に相補的であるプライマーを使用してさらなる複製を起こさせることができる。
一部の実施形態では、等温増幅は、排除増幅（ＥｘＡｍｐ）とも呼ばれる動態学的排除増幅（ＫＥＡ）を使用して実行することができる。本開示の核酸ライブラリーは、増幅試薬を反応させて、その部位に播種した個々の標的核酸からアンプリコンの実質的にクローンの集団を各々含む複数の増幅部位を生成する工程を含む方法を使用して作製することができる。一部の実施形態では、増幅反応は、それぞれの増幅部位の容量を満たすのに十分な数のアンプリコンが生成されるまで進行する。この方法により、既に播種された部位を容量まで満たすことは、標的核酸がその部位でランディングおよび増幅することを抑制し、それによってその部位でアンプリコンのクローン集団を生成する。一部の実施形態では、第２の標的核酸がその部位に到着する前に増幅部位が容量まで満たされないとしても、明らかなクローン性を達成することができる。一部の条件下では、第１の標的核酸の増幅は、その部位へ輸送される第２の標的核酸からのコピーの生成を効果的に凌ぐかまたは圧倒するために、十分な数のコピーが作製される時点まで進行することができる。例えば、直径５００ｎｍ未満の環状フィーチャーの上で架橋増幅プロセスを使用する一実施形態では、第１の標的核酸のための１４サイクルの指数関数的増幅の後、同じ部位での第２の標的核酸による汚染は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットホームでの合成によるシークエンシング分析に不利な影響を及ぼすには不十分な数の汚染性アンプリコンしか生成しないと決定された。
一部の実施形態では、アレイの中の増幅部位は、完全にクローンであってよいが、その必要はない。むしろ、一部の適用のために、個々の増幅部位は、第１のインデックス付きの断片からのアンプリコンで主に占められてよく、第２の標的核酸からの低レベルの汚染性アンプリコンを有することもできる。その汚染のレベルがアレイの以降の使用に許容できない影響を及ぼさない限り、アレイは、低レベルの汚染性アンプリコンを有する１つまたは複数の増幅部位を有することができる。例えば、アレイを検出適用において使用するとき、許容されるレベルの汚染は、検出技術の信号対雑音または分解能に許容できない方法で影響を及ぼさないレベルであろう。したがって、明らかなクローン性は、本明細書に示される方法によって作製されるアレイの特定の使用または適用に一般的に関連する。特定の適用のための個々の増幅部位で許容することができる汚染の例示的なレベルには、限定されずに、多くても０．１％、０．５％、１％、５％、１０％または２５％の汚染性アンプリコンが含まれる。アレイは、汚染性アンプリコンのこれらの例示的なレベルを有する１つまたは複数の増幅部位を含むことができる。例えば、アレイの中の増幅部位の最高５％、１０％、２５％、５０％、７５％またはさらに１００％は、多少の汚染性アンプリコンを有することができる。アレイまたは部位の他の集合において、部位の少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％またはそれより多くはクローンであってよいか明らかにクローンであってよいことが理解されよう。
一部の実施形態では、別の事象またはプロセスの発生を効果的に排除するために十分に迅速な速度でプロセスが起こるときに、動態学的排除が起こることができる。例えば、アレイの部位が溶液からの三重インデックス付きの断片でランダムに播種され、三重インデックス付きの断片のコピーが、播種された部位の各々を容量まで満たす増幅プロセスにおいて生成される、核酸アレイの作製をとりあげる。本開示の動態学的排除方法により、播種および増幅プロセスは、増幅速度が播種速度を超える条件の下で同時に進行することができる。このように、コピーが第１の標的核酸によって播種された部位で作製される比較的迅速な速度は、第２の核酸が増幅のためにその部位に播種することを効果的に排除する。動態学的排除増幅方法は、米国特許出願公開第２０１３／０３３８０４２号の開示に詳細に記載の通りに実行することができる。
動態学的排除は、三重インデックス付きの断片の以降のコピーを作製するための（または、インデックス付きの断片の第１のコピーの）比較的速い速度に対して、増幅を開始するために比較的遅い速度（例えば、インデックス付きの断片の第１のコピーを作製する遅い速度）を活用することができる。前の段落の例では、動態学的排除は、インデックス付きの断片の播種のコピーによって部位を満たすために増幅が起こる比較的速い速度に対して、インデックス付きの断片の播種の比較的遅い速度（例えば、比較的遅い拡散または運搬）のために起こる。別の例示的な実施形態では、動態学的排除は、以降のコピーが作製されてその部位を満たす比較的速い速度に対して、部位に播種されたインデックス付きの断片の第１のコピーの形成の遅れ（例えば、遅れたかまたは遅い活性化）により起こることができる。この例では、個々の部位がいくつかの異なるインデックス付きの断片で播種されていてもよい（例えば、いくつかのインデックス付きの断片が増幅の前に各部位に存在してもよい）。しかし、任意の所与のインデックス付きの断片のための第１のコピー形成は、以降のコピーが生成される速度と比較して第１のコピー形成の平均速度が比較的遅いように、ランダムに活性化することができる。この場合、個々の部位がいくつかの異なるインデックス付きの断片で播種されていてもよいが、動態学的排除は、インデックス付きの断片のうちの１つだけが増幅されることを可能にする。より具体的には、第１のインデックス付きの断片が増幅のために活性化されると、その部位はそのコピーによって迅速に容量まで満たされ、それによって、その部位で第２のインデックス付きの断片のコピーが作製されることを阻止する。
一実施形態では、この方法は、（ｉ）平均運搬速度でインデックス付きの断片を増幅部位に運搬するために、および（ｉｉ）増幅部位にあるインデックス付きの断片を平均増幅速度で同時に増幅するために実行され、ここで、平均増幅速度は平均運搬速度を超える（米国特許第９，１６９，５１３号）。したがって、動態学的排除は、比較的遅い速度の運搬を使用してそのような実施形態で達成することができる。例えば、所望の平均運搬速度を達成するために十分に低い濃度のインデックス付きの断片を選択することができ、より低い濃度は運搬のより遅い平均速度をもたらす。あるいは、またはさらに、運搬速度を低減するために、高粘度溶液および／または溶液中の分子密集試薬の存在を使用することができる。有益な分子密集試薬の例には、限定されずに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、デキストランまたはポリビニルアルコールが含まれる。例示的な分子密集試薬および製剤は米国特許第７，３９９，５９０号に示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。所望の運搬速度を達成するために調整することができる別の因子は、標的核酸の平均サイズである。
増幅試薬は、アンプリコン形成を促進する、および一部の場合にはアンプリコン形成の速度を増加させる、さらなる構成成分を含むことができる。例は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼは、反復侵入／伸長を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。より具体的には、リコンビナーゼは、アンプリコン形成のための鋳型としてインデックス付きの断片を使用して、ポリメラーゼによるインデックス付きの断片の侵入およびポリメラーゼによるプライマーの伸長を促進することができる。このプロセスは、各ラウンドの侵入／伸長から生成されるアンプリコンが以降のラウンドにおいて鋳型の役割をする、連鎖反応として繰り返すことができる。変性サイクル（例えば、加熱または化学的変性を通した）が必要とされないので、このプロセスは標準のＰＣＲより迅速に起こることができる。このように、リコンビナーゼによって促進される増幅は、等温で実行することができる。増幅を促進するために、リコンビナーゼで促進される増幅試薬にＡＴＰまたは他のヌクレオチド（または、一部の場合には加水分解抵抗性であるその類似体）が含まれることが一般的に望ましい。ＳＳＢは増幅をさらに促進することができるので、リコンビナーゼおよび一本鎖の結合性（ＳＳＢ）タンパク質の混合物が特に有益である。リコンビナーゼで促進される増幅のための例示的な製剤には、ＴｗｉｓｔＤｘ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によりＴｗｉｓｔＡｍｐキットとして市販されるものが含まれる。リコンビナーゼで促進される増幅試薬の有益な構成成分および反応条件は、米国特許第５，２２３，４１４号および米国特許第７，３９９，５９０号に示される。
アンプリコン形成を促進する、および一部の場合にはアンプリコン形成の速度を増加させる増幅試薬に含めることができる構成成分の別の例は、ヘリカーゼである。ヘリカーゼは、アンプリコン形成の連鎖反応を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。変性サイクル（例えば、加熱または化学的変性を通した）が必要とされないので、このプロセスは標準のＰＣＲより迅速に起こることができる。このように、ヘリカーゼによって促進される増幅は、等温で実行することができる。ＳＳＢは増幅をさらに促進することができるので、ヘリカーゼおよび一本鎖の結合性（ＳＳＢ）タンパク質の混合物が特に有益である。ヘリカーゼで促進される増幅のための例示的な製剤には、Ｂｉｏｈｅｌｉｘ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からＩｓｏＡｍｐキットとして市販されるものが含まれる。さらに、ヘリカーゼタンパク質を含む有益な製剤の例は、米国特許第７，３９９，５９０号および米国特許第７，８２９，２８４号に記載される。
アンプリコン形成を促進する、および一部の場合にはアンプリコン形成の速度を増加させる増幅試薬に含めることができる構成成分のさらに別の例は、起点結合性タンパク質である。
シークエンシング／シークエンシングの方法における使用
表面へのインデックス付きの断片の付着の後、固定化され、増幅されたインデックス付きの断片の配列が決定される。シークエンシングは、任意の適するシークエンシング技術を使用して実行することができ、鎖再合成を含む、固定化および増幅されたインデックス付きの断片の配列を決定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌら（米国特許第８，０５３，１９２号）、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら（ＷＯ２０１６／１３０７０４）、Ｓｈｅｎら（米国特許第８，８９５，２４９号）およびＰｉｐｅｎｂｕｒｇら（米国特許第９，３０９，５０２号）に記載される。
本明細書に記載される方法は、様々な核酸シークエンシング技術と共に使用することができる。特に適用可能な技術は、それらの相対位置が変化しないようにアレイの固定位置に核酸が付着し、アレイが繰り返し画像化されるものである。画像が、例えば、１つのヌクレオチド塩基タイプを別のものと区別するために使用される異なる標識に一致する異なるカラーチャネルで得られる実施形態が、特に適用可能である。一部の実施形態では、インデックス付きの断片のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであってよい。好ましい実施形態は、合成によるシークエンシング（「ＳＢＳ」）技術を含む。
ＳＢＳ技術は、鋳型鎖に対するヌクレオチドの反復付加を通した、発生期の核酸鎖の酵素的伸長を一般的に含む。ＳＢＳの伝統的な方法では、各デリバリーにおいて単一のヌクレオチド単量体をポリメラーゼの存在下で標的ヌクレオチドに提供することができる。しかし、本明細書に記載される方法では、デリバリーにおいて複数のタイプのヌクレオチド単量体をポリメラーゼの存在下で標的核酸に提供することができる。
一実施形態では、ヌクレオチド単量体は、ロック核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）を含む。ヌクレオチド単量体におけるＬＮＡまたはＢＮＡの使用は、固定化されたインデックス付きの断片の上に存在するヌクレオチド単量体とシークエンシングプライマー配列の間のハイブリダイゼーション強度を増加させる。
ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体またはいかなるターミネーター部分も欠いているものを使用することができる。本明細書にさらに詳細に示されるように、ターミネーターを欠いているヌクレオチド単量体を使用する方法には、例えば、ピロシークエンシングおよびγ－リン酸標識ヌクレオチドを使用するシークエンシングが含まれる。ターミネーターを欠いているヌクレオチド単量体を使用した方法では、各サイクルにおいて加えられるヌクレオチドの数は一般的に可変であり、鋳型配列およびヌクレオチドデリバリー様式に依存する。ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体を利用するＳＢＳ技術については、ジデオキシヌクレオチドを利用する伝統的なサンガーシークエンシングの場合のように、使用されるシークエンシング条件下でターミネーターは効果的に不可逆的であってよいか、または、Ｓｏｌｅｘａ（現、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によって開発されたシークエンシング方法の場合のように、ターミネーターは可逆的であってよい。
ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチド単量体または標識部分を欠いているものを使用することができる。したがって、組込み事象は、標識の蛍光などの標識の特性；分子量または電荷などのヌクレオチド単量体の特性；ピロリン酸の放出などのヌクレオチドの組込みの副産物；などに基づいて検出することができる。２つ以上の異なるヌクレオチドがシークエンシング試薬に存在する実施形態では、異なるヌクレオチドはお互いから識別可能であるか、あるいは、２つ以上の異なる標識は、使用する検出技術の下で区別できなくてもよい。例えば、シークエンシング試薬に存在する異なるヌクレオチドは異なる標識を有することができ、それらは、Ｓｏｌｅｘａ（現、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によって開発されたシークエンシング方法によって例示されるような適当な光学を使用して区別することができる。
好ましい実施形態には、ピロシークエンシング技術が含まれる。特定のヌクレオチドが発生期の鎖に組み込まれるので、ピロシークエンシングは無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1), 84-9；Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11；Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363；米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，５６８号および第６，２７４，３２０号）。ピロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることによって検出することができ、生成されるＡＴＰのレベルはルシフェラーゼによって生成される光子を通して検出される。配列決定をする核酸はアレイの中のフィーチャーに付着させることができ、アレイは、アレイのフィーチャーにおけるヌクレオチドの組込みによって生成される化学発光シグナルを捕捉するために、画像化することができる。アレイを特定のヌクレオチドタイプ（例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）で処理した後に、画像を得ることができる。各ヌクレオチドタイプの付加後に得られる画像は、アレイの中のどのフィーチャーが検出されるかについて異なる。画像におけるこれらの差は、アレイでのフィーチャーの異なる配列含有量を反映する。しかし、各フィーチャーの相対位置は、画像の中では不変のままである。画像は、本明細書に示される方法を使用して保存し、処理し、分析することができる。例えば、各異なるヌクレオチドタイプによるアレイの処理後に得られる画像は、可逆的ターミネーターベースのシークエンシング方法のための異なる検出チャネルから得られる画像のために本明細書に例示されるのと同じ方法で扱うことができる。
ＳＢＳの別の例示的なタイプでは、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号および米国特許第７，０５７，０２６号などに記載される切断可能であるかまたは光漂白可能である色素標識を含有する、可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的付加によってサイクルシークエンシングが達成される。このアプローチはＳｏｌｅｘａ（現、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）によって商品化されており、国際公開第９１／０６６７８号および国際公開第０７／１２３７４４号に記載されてもいる。終止を逆転することおよび蛍光標識を切断することの両方が可能である蛍光標識ターミネーターの利用可能性は、効率的な周期的可逆的終止（ＣＲＴ）シークエンシングを促進する。これらの改変されたヌクレオチドを効率的に組み込み、伸長させるために、ポリメラーゼを同時に工学操作することもできる。
一部の可逆的ターミネーターベースのシークエンシング実施形態では、ＳＢＳ反応条件の下で標識は伸長を実質的に抑制しない。しかし、検出標識は、例えば、切断または分解によって除去可能であってよい。配列された核酸フィーチャーへの標識の組込みの後、画像を捕捉することができる。特定の実施形態では、各サイクルはアレイへの４つの異なるヌクレオチドタイプの同時デリバリーを含み、各ヌクレオチドタイプはスペクトルで識別可能な標識を有する。４つの異なる標識のうちの１つに選択的である検出チャネルを各々使用して、４つの画像を次に得ることができる。あるいは、異なるヌクレオチドタイプは逐次的に加えることができ、アレイの画像は各付加工程の間で得ることができる。そのような実施形態では、各画像は、特定のタイプのヌクレオチドを組み込んだ核酸フィーチャーを示す。各フィーチャーの異なる配列含有量のために、異なる画像に異なるフィーチャーが存在するかまたは不在である。しかし、フィーチャーの相対位置は、画像の中では不変のままである。本明細書に示される通り、そのような可逆的ターミネーター－ＳＢＳ方法から得られる画像は、保存し、処理し、分析することができる。画像捕捉工程の後、標識は除去することができ、ヌクレオチド付加および検出の以降のサイクルのために可逆的ターミネーター部分を除去することができる。それらが特定のサイクルにおいて検出された後の、および以降のサイクルの前の標識の除去は、サイクルの間のバックグラウンドシグナルおよびクロストークを低減する利点を提供することができる。有益な標識および除去方法の例は、本明細書に示される。
特定の実施形態では、ヌクレオチド単量体の一部または全ては、可逆的ターミネーターを含むことができる。そのような実施形態では、可逆的ターミネーター／切断可能な蛍光団は、３’エステル連結を通してリボース部分に連結される蛍光団を含むことができる（Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005)）。他のアプローチは、ターミネーター化学を蛍光標識の切断から分離した（Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)）。Ｒｕｐａｒｅｌらは、伸長をブロックするために小さい３’アリル基を使用しているが、パラジウム触媒による短い処理によって容易に非ブロック化することができる、可逆的ターミネーターの開発を記載した。長波長ＵＶ光への３０秒の曝露によって容易に切断することができる光切断性リンカーを通して、蛍光団をベースに付着させた。したがって、ジスルフィド還元または光切断を切断可能リンカーとして使用することができる。可逆的終止への別のアプローチは、ｄＮＴＰの上へのバルキーな色素の設置の後に起こる自然な終止の使用である。ｄＮＴＰの上の荷電したバルキーな色素の存在は、立体的および／または静電的障害を通して有効なターミネーターとして作用することができる。色素が除去されない限り、１回の組込み事象の存在はさらなる組込みを阻止する。色素の切断は蛍光団を除去し、終止を効果的に逆転させる。改変されたヌクレオチドの例は、米国特許第７，４２７，６７３号および第７，０５７，０２６号にも記載される。
本明細書に記載される方法およびシステムで利用することができるさらなる例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、第２００６／０１８８９０１号、第２００６／０２４０４３９号、第２００６／０２８１１０９号、第２０１２／０２７０３０５号および第２０１３／０２６０３７２号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号、国際公開第０６／０６４１９９号および国際公開第０７／０１０２５１号に記載される。
一部の実施形態は、４つ未満の異なる標識を使用した４つの異なるヌクレオチドの検出を使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号の組み込まれた資料に記載される方法およびシステムを使用して、ＳＢＳを実行することができる。第１の例として、一組のヌクレオチドタイプを同じ波長で検出することができるが、他と比較した組の１メンバーの強度における差に基づいて、または、組の他のメンバーについて検出されるシグナルと比較して明らかなシグナルを出現または消滅させる、組の１メンバーへの変化（例えば、化学的改変、光化学的改変または物理的改変を通した）に基づいて区別することができる。第２の例として、４つの異なるヌクレオチドタイプのうちの３つは特定の条件下で検出することができるが、第４のヌクレオチドタイプは、それらの条件下で検出可能である標識を欠くか、またはそれらの条件下で最小限に検出される（例えば、バックグラウンド蛍光による最小限の検出等）。核酸への最初の３つのヌクレオチドタイプの組込みは、それらのそれぞれのシグナルの存在に基づいて決定することができ、核酸への第４のヌクレオチドタイプの組込みは、任意のシグナルの不在または最小限の検出に基づいて決定することができる。第３の例として、１つのヌクレオチドタイプは、２つの異なるチャネルにおいて検出される標識（複数可）を含むことができるが、他のヌクレオチドタイプは、チャネルの１つだけで検出される。前記の３つの例示的な構成は、相互に排他的であると考えられておらず、様々な組合せで使用することができる。全ての３つの例を組み合わせる例示的な実施形態は、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチドタイプ（例えば、第１の励起波長によって励起したときに第１のチャネルで検出される標識を有するｄＡＴＰ）、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチドタイプ（例えば、第２の励起波長によって励起したときに第２のチャネルで検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１および第２のチャネルで検出される第３のヌクレオチドタイプ（例えば、第１および／または第２の励起波長によって励起したときに両方のチャネルで検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ）、ならびにいずれのチャネルでも検出されないかまたは最小限に検出される標識を欠いている第４のヌクレオチドタイプ（例えば、標識を有していないｄＧＴＰ）を使用する蛍光ベースのＳＢＳ方法である。
さらに、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号の組み込まれた資料に記載される通り、単一のチャネルを使用してシークエンシングデータを得ることができる。そのようないわゆる１色素シークエンシングアプローチでは、第１のヌクレオチドタイプは標識されるが、その標識は第１の画像が生成された後に除去され、第２のヌクレオチドタイプは第１の画像が生成された後にだけ標識される。第３のヌクレオチドタイプは第１と第２の両画像においてその標識を保持し、第４のヌクレオチドタイプは両画像において非標識のままである。
一部の実施形態は、ライゲーション技術によるシークエンシングを使用することができる。そのような技術は、オリゴヌクレオチドを組み込み、そのようなオリゴヌクレオチドの組込みを同定するために、ＤＮＡリガーゼを使用する。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列の中の特定のヌクレオチドのアイデンティティと相関する異なる標識を一般的に有する。他のＳＢＳ方法と同様に、標識されたシークエンシング試薬による核酸フィーチャーのアレイの処理の後に画像を得ることができる。各画像は、特定のタイプの標識を組み込んだ核酸フィーチャーを示す。各フィーチャーの異なる配列含有量のために、異なる画像に異なるフィーチャーが存在するかまたは不在であるが、フィーチャーの相対位置は、画像の中では不変のままである。本明細書に示される通り、ライゲーションベースのシークエンシング方法から得られる画像は、保存し、処理し、分析することができる。本明細書に記載される方法およびシステムで利用することができる例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許第６，９６９，４８８号、第６，１７２，２１８号および第６，３０６，５９７号に記載される。
一部の実施形態は、ナノポアシークエンシングを使用することができる（Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)；Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis", Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)；Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2:611-615 (2003)）。そのような実施形態では、インデックス付きの断片は、ナノポアを通過する。ナノポアは、α－ヘモリシンなどの合成孔または生体膜タンパク質であってよい。インデックス付きの断片がナノポアを通過するにつれて、孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって、各塩基対を同定することができる。（米国特許第７，００１，７９２号；Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)；Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007)；Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)）。本明細書に示される通り、ナノポアシークエンシングから得られるデータは、保存し、処理し、分析することができる。詳細には、データは、光学式画像および本明細書に示される他の画像の例示的な処理により画像として処理することができる。
一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を使用することができる。ヌクレオチドの組込みは、例えば米国特許第７，３２９，４９２号および第７，２１１，４１４号に記載される通り、蛍光団含有ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）相互作用を通して検出することができるか、または、ヌクレオチドの組込みは、例えば米国特許第７，３１５，０１９号に記載されるゼロモード導波管で、ならびに、例えば米国特許第７，４０５，２８１号および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載の通り蛍光性ヌクレオチド類似体および工学操作ポリメラーゼを使用して検出することができる。蛍光標識ヌクレオチドの組込みを低いバックグラウンドで観察することができるように、照度は表面連結ポリメラーゼの周囲のゼプトリットルスケールの容量に制限することができる（Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003)；Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)；Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)）。本明細書に示される通り、そのような方法から得られる画像は、保存し、処理し、分析することができる。
一部のＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組込みの後に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシークエンシングは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器および関連する技術、または米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号、第２００９／０１２７５８９号、第２０１０／０１３７１４３号および第２０１０／０２８２６１７号に記載されるシークエンシング方法およびシステムを使用することができる。動態学的排除を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に示される方法は、プロトンの検出のために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に示される方法は、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成するために使用することができる。
複数の異なるインデックス付きの断片を同時に操作するように、上記のＳＢＳ方法を多重フォーマットで都合よく実行することができる。特定の実施形態では、異なるインデックス付きの断片は、一般的な反応容器の中で、または特定の基質の表面で処理することができる。これは、シークエンシング試薬の便利なデリバリー、未反応試薬の除去および組込み事象の多重検出を可能にする。表面結合標的核酸を使用した実施形態では、インデックス付きの断片は、アレイフォーマットの形態であってもよい。アレイフォーマットでは、インデックス付きの断片は、空間的に識別可能な様式で表面に一般的に結合することができる。インデックス付きの断片は、直接的な共有結合性付着、ビーズもしくは他の粒子への付着、または表面に付着しているポリメラーゼもしくは他の分子への結合によって結合することができる。アレイは各部位（フィーチャーとも呼ばれる）にインデックス付きの断片の単一コピーを含むことができるか、または、同じ配列を有する複数のコピーが各部位もしくはフィーチャーに存在することができる。本明細書にさらに詳細に記載される通り、架橋増幅または乳濁液ＰＣＲなどの増幅方法によって、複数のコピーを生成することができる。
本明細書に示される方法は、例えば、少なくとも約１０フィーチャー／ｃｍ２、１００フィーチャー／ｃｍ２、５００フィーチャー／ｃｍ２、１，０００フィーチャー／ｃｍ２、５，０００フィーチャー／ｃｍ２、１０，０００フィーチャー／ｃｍ２、５０，０００フィーチャー／ｃｍ２、１００，０００フィーチャー／ｃｍ２、１，０００，０００フィーチャー／ｃｍ２、５，０００，０００フィーチャー／ｃｍ２またはそれより高いものを含む、様々な密度のいずれかのフィーチャーを有するアレイを使用することができる。
本明細書に示される方法の利点は、それらが複数のｃｍ２の迅速で効率的な検出を並行して提供することである。したがって、本開示は、本明細書に例示されるものなどの当技術分野で公知である技術を使用して、核酸を調製および検出することが可能な統合化システムを提供する。したがって、本開示の統合化システムは、１つまたは複数の固定化されたインデックス付きの断片に増幅試薬および／またはシークエンシング試薬を送達することが可能な流体構成成分を含むことができ、システムは、ポンプ、バルブ、レザバー、流体系などの構成成分を含む。フローセルは、標的核酸の検出のために、統合化システムに構成することおよび／またはその中で使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号および米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載される。フローセルについて例示される通り、統合化システムの流体構成成分の１つまたは複数は、増幅方法および検出方法のために使用することができる。一例として核酸シークエンシング実施形態をとると、統合化システムの流体構成成分の１つまたは複数は、本明細書に示される増幅方法のために、および上で例示されるものなどのシークエンシング方法におけるシークエンシング試薬のデリバリーのために使用することができる。あるいは、統合化システムは、増幅方法を実行するためにおよび検出方法を実行するために、別個の流体システムを含むことができる。増幅された核酸を作製すること、および核酸の配列を決定することも可能である統合化シークエンシングシステムの例には、限定されずに、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載される装置が含まれる。
組成物も、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法の実施の間、様々な組成物をもたらすことができる。例えば、三重インデックス付きの核酸断片を含む組成物をもたらすことができる。マルチウェルプレートも提供され、ここで、マルチウェルプレートのウェルは三重インデックス付きの核酸断片を含む。
本明細書で、キットも提供される。一実施形態では、キットは、シークエンシングライブラリーを調製するためのものである。キットは、適する包装材料の中に、本明細書に記載されるトランスポソームおよび／または線形増幅媒介物を少なくとも１つのアッセイまたは使用に十分な量で含む。適宜、プライマー、インデックス、遍在配列またはその組合せを含む１つまたは複数の核酸などの、他の構成成分が含まれてもよい。含まれてもよい他の構成成分は、緩衝剤などの試薬および溶液である。包装された構成成分の使用説明書も、一般的に含まれる。本明細書で使用されるように、フレーズ「包装材料」は、キットの内容を収納するために使用される１つまたは複数の物理的構造物を指す。包装材料は、無菌の無汚染物環境を一般的に提供するためにルーチンの方法によって構築される。包装材料は、シークエンシングライブラリーを生成する構成成分を使用することができることを示す標識を有することができる。さらに、包装材料は、キットの中の材料がどのように用いられるかを示す説明書を含有する。本明細書で使用されるように、用語「パッケージ」は、キットの構成成分を固定された限度の範囲内で保持することが可能である、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの容器を指す。「使用説明書」は、試薬濃度、または混合される試薬および試料の相対量、試薬／試料混合物のための維持時間、温度、緩衝条件などの、少なくとも１つのアッセイ方法パラメータを記載する具体的な表現を一般的に含む。
例示的な実施形態
実施形態１。複数の単一の核または細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって：第１の複数のコンパートメントに複数の単離された核または細胞を提供する工程であって、各コンパートメントは単離された核または細胞のサブセットを含み、核または細胞は核酸断片を含む工程；
線形増幅媒介物を細胞または核に導入する工程；
線形増幅によって核酸断片を増幅する工程；
核または細胞の各サブセットを処理してインデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、処理は、単離された核または細胞に存在する核酸断片に第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加えて単離された核または細胞に存在するインデックス付きの核酸をもたらすことを含み、処理は、ライゲーション、プライマー伸長、ハイブリダイゼーション、増幅または転位を含む工程；および
インデックス付きの核または細胞を合わせてプールされたインデックス付きの核または細胞を生成し、それによって複数の核または細胞からシークエンシングライブラリーを生成する工程を含む方法。
実施形態２。増幅が処理の前に起こる、実施形態１の方法。
実施形態３。処理が増幅の前に起こる、実施形態１の方法。
実施形態４。複数の単一の核または細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって：
核酸断片を含む複数の単離された核または細胞を提供する工程；
線形増幅媒介物を単離された核または細胞に導入する工程；
第１の複数のコンパートメントに単離された核または細胞を分配する工程であって、各コンパートメントは単離された核または細胞のサブセットを含む工程；
線形増幅によって核酸断片を増幅する工程；
単離された核または細胞の各サブセットを処理してインデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、処理は、単離された核または細胞に存在する核酸断片に第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加えて単離された核または細胞に存在するインデックス付きの核酸をもたらすことを含み、処理は、ライゲーション、プライマー伸長、増幅または転位を含む工程；
インデックス付きの核を合わせてプールされたインデックス付きの核または細胞を生成し、それによって複数の核または細胞からシークエンシングライブラリーを生成する工程を含む方法。
実施形態５。複数の単一の核または細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって：
第１の複数のコンパートメントに複数の単離された核または細胞を提供する工程であって、各コンパートメントは単離された核または細胞のサブセットを含み、核または細胞は核酸断片を含む工程；
核または細胞の各サブセットを処理してインデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、処理は、単離された核または細胞に存在する核酸断片に、（ｉ）第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加えて単離された核または細胞に存在するインデックス付きの核酸をもたらすこと、および（ｉｉ）線形増幅媒介物によって認識されるヌクレオチド配列を加えることを含み、処理は、ライゲーション、プライマー伸長、ハイブリダイゼーション、増幅または転位を含む工程；
線形増幅媒介物を細胞または核に導入する工程；
線形増幅によって核酸断片を増幅する工程；および
インデックス付きの核または細胞を合わせてプールされたインデックス付きの核または細胞を生成し、それによって複数の核または細胞からシークエンシングライブラリーを生成する工程を含む方法。
実施形態６。線形増幅媒介物がファージＲＮＡポリメラーゼまたは線形増幅プライマーを含む、実施形態１～５のいずれか１つの方法。
実施形態７。核酸断片がＴ７プロモーターを含み、ファージＲＮＡポリメラーゼがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
実施形態８。線形増幅媒介物を導入することが、線形増幅媒介物を単離された核または細胞に存在する核酸断片に加えることを含む、実施形態１～７のいずれか１つの方法。
実施形態９。各コンパートメントの複数の単離された核または細胞を所定の条件に曝露させることをさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つの方法。
実施形態１０。曝露させた後に複数の細胞から核を単離することをさらに含む、実施形態１～９のいずれか１つの方法。
実施形態１１。複数の単離された核または細胞を所定の条件に曝露させることをさらに含む、実施形態１～１０のいずれか１つの方法。
実施形態１２。単離された核の完全性を維持しつつヌクレオソームが枯渇された核を生成する条件に単離された核を付すことをさらに含む、実施形態１～１１のいずれか１つの方法。
実施形態１３。処理が、
各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、各コンパートメントの中のトランスポソーム複合体は、他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列を含む工程；および
サブセットの中の核酸を複数の核酸に断片化し、第１のインデックス配列をその核酸の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの核酸を含むインデックス付きの核または細胞を生成する工程を含む、実施形態１～１２のいずれか１つの方法。
実施形態１４。処理が、各サブセットを逆転写酵素および単離された核の中のＲＮＡ分子にアニールするプライマーと接触させる工程であって、各コンパートメントの中のプライマーは、他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列を含み、インデックス付きの核酸を含むインデックス付きの核または細胞を生成する工程を含む、実施形態１～１３のいずれか１つの方法。
実施形態１５。接触させることが特異的ヌクレオチド配列にアニールする標的特異的プライマーをさらに含む、実施形態１～１４のいずれか１つの方法。
実施形態１６。第１のコンパートメント特異的インデックス配列を加える処理が、遍在配列を含むヌクレオチド配列を核酸断片に加え、次に第１コンパートメント特異的インデックス配列を核酸断片に加える２工程法を含む、実施形態１～１５のいずれか１つの方法。
実施形態１７。加えることが遍在配列を含むトランスポソーム複合体を含む、実施形態１～１６のいずれか１つの方法。
実施形態１８。処理が、第１のインデックスを単離された核または細胞に存在するＤＮＡ核酸に加えること、第１のインデックスを単離された核または細胞に存在するＲＮＡ核酸に加えること、またはその組合せを含む、実施形態１～１７のいずれか１つの方法。
実施形態１９。第１のインデックス配列をＲＮＡ核酸に加えることが、各サブセットを逆転写酵素および単離された核または細胞の中のＲＮＡ分子にアニールするプライマーと接触させる工程であって、各コンパートメントの中のプライマーは、第１のコンパートメント特異的インデックス配列を含み、インデックス付きの核酸を含むインデックス付きの核または細胞を生成する工程を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。
実施形態２０。第１のインデックス配列をＤＮＡ核酸に加えることが、
各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、各コンパートメントの中のトランスポソーム複合体は、第１のコンパートメント特異的インデックス配列を含む工程；および
サブセットの中の核酸を複数の核酸に断片化し、第１のコンパートメント特異的インデックス配列をその核酸の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの核酸を含むインデックス付きの核または細胞を生成する工程を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法。
実施形態２１。各コンパートメントにおいてＤＮＡ核酸に加えられる第１のインデックス配列およびＲＮＡ核酸に加えられる第１のインデックス配列が同一である、実施形態１～２０のいずれか１つの方法。
実施形態２２。各コンパートメントにおいてＤＮＡ核酸に加えられる第１のインデックス配列およびＲＮＡ核酸に加えられる第１のインデックス配列が同一でない、実施形態１～２１のいずれか１つの方法。
実施形態２３。核酸断片の指数関数的増幅をさらに含み、指数関数的増幅は、特異的ヌクレオチド配列にアニールする標的特異的プライマーを含む、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
実施形態２４。合わせた後に、
プールされたインデックス付きの核または細胞のサブセットを、第２の複数のコンパートメントに分配する工程；および
第２のコンパートメント特異的インデックス配列をインデックス付きの核酸に導入して二重インデックス付きの核酸を含む二重インデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、導入することは、ライゲーション、プライマー伸長、増幅または転位を含む工程をさらに含む、実施形態１～２３のいずれか１つの方法。
実施形態２５。二重インデックス付きの核を合わせてプールされた二重インデックス付きの核または細胞を生成する工程、
プールされた二重インデックス付きの核または細胞のサブセットを第３の複数のコンパートメントに分配する工程；および
第３のコンパートメント特異的インデックス配列をインデックス付きの核酸に導入して三重インデックス付きの核酸を含む三重インデックス付きの核または細胞を生成する工程であって、導入することは、ライゲーション、プライマー伸長、増幅または転位を含む工程をさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つの方法。
実施形態２６。メチル化分析のためにインデックス付きの核または細胞を処理してメチル化分析のために適する核酸断片を生成することをさらに含む、実施形態１～２５のいずれか１つの方法。
実施形態２７。インデックス付きの核または細胞を近接性ライゲーションに付してクロマチン高次構造の分析のために適する核酸断片を生成することをさらに含む、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
実施形態２８。シークエンシングライブラリーの核酸断片を増幅してＤＮＡナノボールを生成することをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか１つの方法。
実施形態２９。コンパートメントがウェルまたは液滴を含む、実施形態１～２８のいずれか１つの方法。
実施形態３０。第１の複数のコンパートメントの各コンパートメントが５０から１００，０００，０００個の核または細胞を含む、実施形態１～２９のいずれか１つの方法。
実施形態３１。第２の複数のコンパートメントの各コンパートメントが５０から１００，０００，０００個の核または細胞を含む、実施形態１～２９のいずれか１つの方法。
実施形態３２。複数の増幅部位を含む表面を提供する工程であって、増幅部位が遊離の３’末端を有する付着した一本鎖の捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団を含む工程、および
複数の増幅部位を生成するのに適する条件の下で増幅部位を含む表面をインデックス付きの断片と接触させ、各々は複数のインデックスを含む個々の断片からのアンプリコンのクローン集団を含む工程をさらに含む、実施形態１～３１のいずれか１つの方法。
実施形態３３。複数の単一の細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、
（ａ）複数の細胞からの単離された核を提供する工程；
（ｂ）単離された核の完全性を維持しつつヌクレオソームが枯渇された核を生成する化学処理に単離された核を付す工程；
（ｃ）ヌクレオソームが枯渇された核のサブセットを第１の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、各コンパートメントの中のトランスポソーム複合体がトランスポザーゼおよび他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列を含む工程；
（ｄ）ヌクレオソームが枯渇された核のサブセットの中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、第１のインデックス配列を核酸断片の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの核酸断片を含むインデックス付きの核を生成する工程であって、インデックス付きの核酸断片はトランスポザーゼに付着したままである工程；
（ｄ）インデックス付きの核を合わせてプールされたインデックス付きの核を生成する工程；
（ｅ）プールされたインデックス付きの核のサブセットを第２の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをヘアピンライゲーション二重鎖と、インデックス付きの核酸断片の片方または両方の末端へのヘアピンライゲーション二重鎖のライゲーションに適する条件の下で接触させて二重インデックス付きの核酸断片をもたらす工程であって、ヘアピンライゲーション二重鎖が他のコンパートメントの中の第２のインデックス配列と異なる第２のインデックス配列を含む工程；
（ｆ）二重インデックス付きの核を合わせてプールされたインデックス付きの核を生成する工程；
（ｇ）プールされた二重インデックス付きの核のサブセットを第３の複数のコンパートメントに分配する工程；
（ｈ）二重インデックス付きの核を溶解させる工程；
（ｉ）他のコンパートメントの中の第３のインデックス配列と異なる第３のインデックス配列を含むように二重インデックス付きの核断片を処理する工程；および
（ｊ）三重インデックス断片を合わせ、それによって複数の単一の細胞からの全ゲノム核酸を含むシークエンシングライブラリーを生成する工程
を含む方法。
本開示は、以下の実施例によって例示される。特定の例、材料、量および手順は本明細書に示される開示の範囲および精神にしたがって広義に解釈されるべきであることを理解すべきである。
線形増幅によるハイスループット単一細胞シークエンシング
単一細胞ゲノムシークエンシングのための従来の方法は、均一性およびスループットに関して制限される。ここでは、「ｓｃｉ－Ｌ３」、単一細胞コンビナトリアルインデクシング（「ｓｃｉ」）および線形（「Ｌ」）増幅を組み合わせたハイスループットの高カバレージ単一細胞シークエンシング方法を記載する。ｓｃｉ－Ｌ３方法は、スループットの指数関数的増加を可能にしつつ増幅バイアスを最小にする、一方向性３レベル（「３」）インデクシングスキームを採択する。我々は、単一細胞全ゲノムシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ」）、標的化ゲノムシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑ」）ならびにゲノムおよびトランスクリプトームの共アッセイ（「ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ」）の概念実証を通したｓｃｉ－Ｌ３フレームワークの一般化の可能性を実証する。Ｆ１ハイブリッド雄マウスからの＞１０，０００個の精子および精子前駆体のゲノムをプロファイリングし、８６，７８６個の交差をマッピングし、雄減数分裂における全ゲノム均等染色体分離の事例を含む稀な染色体誤分離事象を特徴付けるために、我々はｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳを適用する。ＣＲＩＳＰＲ摂動およびゲノム安定性の測定を連結するために、組換え状況を完全に特徴付けるために、およびハイスループットの高カバレージ単一細胞ゲノムシークエンシングを必要とする他の目標に、ｓｃｉ－Ｌ３アッセイを適用することができることが期待される。
序論
現代の単一細胞ゲノムシークエンシング技術は、２つの主要な限界を有する。第１に、ほとんどの方法は個々の細胞を区分することを必要とし、それはスループットを制限する。第２に、ほとんどの増幅方法はＰＣＲベースであり、したがって、指数関数的増幅バイアスを被る。第１の問題を解決するために、我々および同僚は、単一細胞コンビナトリアルインデクシング（「ｓｃｉ－」）を開発し、ここでは、単一細胞の核酸内容を特異的にタグ付けするために数回のスプリット－プール分子バーコード化を実行し、それによって各連続した回のインデクシングによりスループットの指数関数的増加を可能にする。ｓｃｉ－方法は、多数の単一細胞において、クロマチンアクセス性（ｓｃｉ－ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、トランスクリプトーム（ｓｃｉ－ＲＮＡ－ｓｅｑ）、ゲノム（ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑ）、メチローム（ｓｃｉ－ＭＥＴ）、染色体高次構造（ｓｃｉ－Ｈｉ－Ｃ）をプロファイリングするように首尾よく開発されている（Cao et al., 2017；Cusanovich et al., 2015；Mulqueen et al., 2018；Ramani et al., 2017；Vitak et al., 2017）。第２の問題を解決するために、Ｔ７ベースの転写による線形増幅は、単一細胞アッセイとの関係で以前に利用された潜在的解法を提供する（Eberwine et al., 1992；Hashimshony et al., 2012；Sos et al., 2016）。例えば、最近、Ｃｈｅｎらは、ゲノムを断片化し、インビトロ転写（ＩＶＴ）のためにＴ７ ＲＮＡプロモーターを同時に挿入するためにＴｎ５トランスポゾンを使用する、トランスポゾン挿入による線形増幅を開発した（「ＬＩＡＮＴＩ」）。ＤＮＡ鋳型から生成されるＲＮＡコピーは、さらなる増幅のために鋳型の役割をすることができない。したがって、全てのコピーは、元のＤＮＡ鋳型に直接的に由来する。指数関数的増幅を回避することによって、ＬＩＡＮＴＩは均一性を維持し、配列のエラーを最小にする。しかし、この方法は、各単一細胞からの連続的ライブラリー調製を必要とするので、ロースループットである（Chen et al., 2017）。
スループットの指数関数的増加を可能にすると同時に増幅バイアスを最小にするために、単一細胞コンビナトリアルインデクシングおよび線形増幅を組み入れたｓｃｉ－Ｌ３を開発した。３回の分子バーコード化によって、ｓｃｉ－Ｌ３は、線形増幅の利点を保持しつつ、１回の実験につき少なくとも数千のおよび潜在的に数百万の細胞までＬＩＡＮＴＩのスループットを向上させる。我々は、単一細胞全ゲノムシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ」）、標的化ゲノムシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑ」）ならびにゲノムおよびトランスクリプトームの共アッセイ（「ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ」）の概念実証を通したｓｃｉ－Ｌ３フレームワークの一般化の可能性を実証する。さらなる実証として、不妊の種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１雄マウスならびに妊性の種内（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１雄マウスからの未熟のおよび成熟した雄生殖細胞における、先例のない数の減数分裂の交差および稀な染色体誤分離事象をマッピングするために、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳを適用する。
設計
スループットを増加させつつ増幅バイアスを最小にする潜在的技術的経路は、「ｓｃｉ」および「ＬＩＡＮＴＩ」方法を単に組み合わせることであろう。しかし、Ｔ７プロモーターがＴｎ５トランスポゾンを通して挿入されるＬＩＡＮＴＩの分子構造は、わずか２回だけの細胞バーコード化の機会を与え、それは、スループットを１実験につき数千の単一細胞に制限するだろう。それは、ゲノムＤＮＡのプロファイリングにさらに制限される（Chen et al., 2017；Sos et al., 2016）。ｓｃｉ－Ｌ３の開発では、単一細胞コンビナトリアルインデクシング、線形増幅およびライゲーションによりＴ７プロモーターを導入することによる３回の細胞バーコード化（「３レベル」）を統合した（図３Ａ）。「ｓｃｉ」および「ＬＩＡＮＴＩ」を単に組み合わせることと比べて、ｓｃｉ－Ｌ３アプローチはいくつかの主要な利点を有する。第１に、潜在的スループットは、３レベルインデクシングによってかなり低減された費用で１実験につき１，０００，０００個を超える細胞に指数関数的に増加する（Cao et al., 2019）。第２には、単一細胞バーコード化の一方向性の性質は、ＣＲＩＳＰＲ摂動および生じるゲノム不安定性を連結すること、ならびに多数の単一細胞にわたって特異的ゲノム遺伝子座を配列決定することが望ましい他の適用を可能にする全ゲノムシークエンシング（「ＷＧＳ」）に加えて、標的化シークエンシング（「標的－ｓｅｑ」）にｓｃｉ－Ｌ３を容易に変換することを可能にする。第３に、一般化可能である線形増幅およびハイスループット細胞バーコード化スキームとして、ｓｃｉ－Ｌ３は、ｓｃｉ－Ｌ３ベースの単一細胞ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイの我々の概念実証によってここで実証される通り、プロトコールの小さい改変によって他の単一細胞アッセイおよび共アッセイに適応させる柔軟性を提供する。
結果
ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの概念実証
ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの３レベルコンビナトリアルインデクシングおよび増幅スキームは、図３Ａに示す：（ｉ）細胞をホルムアルデヒドで固定し、ヌクレオソームはＳＤＳによって枯渇させる（Vitak et al., 2017）。結果として生じる核は、次に２４個のウェルに均一に分配する。（ｉｉ）インデックス付きのＴｎ５の挿入（「タグメンテーション）」）により１回目のバーコードを２４ウェルの各々の中に加える。Ｔｎ５トランスポゾンがバーコードなしのＴ７プロモーターを含有するＬＩＡＮＴＩと異なって、スペーサー配列がバーコードの５’側に含まれ、それは以降のライゲーション工程のための「ランディングパッド」の役目をする（Ｔｎ５トランスポゾン設計の詳細については、図４および実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計」のセクションを参照する）。（ｉｉｉ）核の全てをプールし、６４個の新しいウェルに均一に再分配する；２回目のバーコードをライゲーションによって加え、それは両方のバーコードの外側に配置されるＴ７プロモーター配列を含む。（ｉｖ）核の全てを再度一緒にプールし、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）サイトメトリーによって選別し、１ウェルにつき最高３００細胞で最終回のウェルに分配する。異なる倍数性の核をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色によってゲーティングし、富化することができることに留意する。さらに、単純な希釈は、損失率を低減することができる、ＦＡＣＳの代替手段である。（ｖ）選別された核を溶解し、ｉｎ ｓｉｔｕギャップ伸長に付して二重鎖Ｔ７プロモーターを形成する。これの後に、ＩＶＴ、逆転写（ＲＴ）および第２鎖合成（ＳＳＳ）が続き、ゲノムを線形増幅する。３回目のバーコードを特異な分子識別子（ＵＭＩ）と一緒にＳＳＳ工程の間に加えて、個々のＩＶＴ転写物をタグ付けする。（ｖｉ）それらの起源細胞を規定する３つのバーコードを各々含有する二重鎖ＤＮＡ分子（図３Ｂ、上）は、目標が単一細胞ＷＧＳ（例えば、ライゲーション（図３Ｂ、中央）またはタグメンテーションによって配列アダプターを付け加える）である場合は従来のライブラリー構築方法に、または、目標が単一細胞標的化ＤＮＡ－ｓｅｑ（例えば、プライマーの１つが標的特異的であるＰＣＲ工程を加える（図３Ｂ、下））である場合はわずかに改変された方法に適合する。
初期の概念実証として、マウスおよびヒトの細胞を混合してｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳを実行した。結果として生じる単一細胞ゲノムの９５％超について、大多数の読み取りはマウスまたはヒトゲノムにマッピングした。２つ以上の細胞によるバーコードの同じ組合せの偶然の使用から時折の「衝突」が生じる（図３Ｃ）。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの成績をＬＩＡＮＴＩならびに我々の以前のＰＣＲベースのｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑ方法と表１に比較する。我々は、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのいくつかの利点を強調する：１）ＰＣＲベースのｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑによる６０％の回収と比較して、選別された細胞の９０％が一般的に回収される（Vitak et al., 2017）；２）４０％より少い生の読み取りデータ（ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳによる３２９Ｍ対ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑによる５４９Ｍ）で、ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑ（＞３倍改善）による約３０，０００個の特異な挿入と比較して、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳは、１細胞につき約９７，０００個の特異なＴｎ５挿入の配列カバレージをもたらした。より少ない数の細胞をより高い深度まで配列決定をして、ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑより高いライブラリー複雑性を維持しつつ、１細胞につき約６６０，０００個の特異なＴｎ５挿入が観察され、＞２０倍のさらなる改善を示唆している；３）マッピング可能な読み取りデータの率は、ＬＩＡＮＴＩによる６１％からｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳによる８６％まで向上する。これは、ＬＩＡＮＴＩが完全にイン－チューブであり、したがって、人為現象的な配列（例えば、Ｔｎ５の自己挿入に続発性の）を除去することが困難であるが、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳでは、過剰な遊離ＤＮＡを除去するために核は数回ペレットにされることが原因でありそうである；４）２反復の読み取りがＳＮＰコーリングのための情報を提供しないＰＣＲベースの増幅と異なって、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの「２反復」読み取りは元の鋳型から重合させた独立したＩＶＴ転写物からたいていもたらされ、したがって、新規のＳＮＶの発見のために、または公知のＳＮＰの遺伝子タイピングのために有益である。
表１。ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑ対ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ対ＬＩＡＮＴＩの成績比較。（Vitak et al., 2017）のｘＳＤＳ方法からのｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑデータ。（Chen et al., 2017）のイン－チューブ方法からのＬＩＡＮＴＩ。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳについては、ライブラリーｙｉ１４０およびｙｉ１４１（高い深度のシークエンシング）ならびにｙｉ１４４およびｙｉ１４５（低い深度のシークエンシング）の結果を示す。これらの４つのライブラリーは、濃縮したＴｎ５トランスポソーム（０．２μＭ）および改善されたＲＴ反応をさらなるＲＮＡプライマーと使用した、最適化されたプロトコールを使用する（詳細については、図５および実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計」のセクションを参照する）。同じ色は、目的の比較を示す。緑色：選別からの回収された単一細胞の百分率は、ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑと比較してｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳで１．９倍改善される；ピンク色：生の読み取りデータのマッピング率は、ＬＩＡＮＴＩと比較してｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳで１．４倍改善される；黄色：様々なシークエンシング深度での特異挿入部位；行１および２は類似した数の生の読み取りデータで比較され、ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑと比較してｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳで４０％より少い生の読み取りデータで３．３倍改善され、行１および３は類似したライブラリー複雑性で比較され、ＬＩＡＮＴＩと比較してｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳで２０％より良いＴｎ５挿入複雑性で２２．４倍改善された；青色：ＬＩＡＮＴＩおよびｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの両方を含む方法が最小限のＰＣＲ２反復を有することを示す中間ライブラリー複雑性；オレンジ色：回収された５０ｋを超える特異読み取りデータの細胞数は、ＬＩＡＮＴＩと比較してｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳで１．８倍改善される；
ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳで、Ｔｎ５挿入はヒトゲノムの平均０．５～１．５ｋｂごとであり、ＩＶＴは約１，０００転写物を与える。これは２，０００，０００～６，０００，０００個の特異Ｔｎ５挿入に、したがって、単一細胞につき２，０００，０００，０００～６，０００，０００，０００個の特異ゲノム由来のＩＶＴ転写物に対応する。結果として生じるライブラリーを特異なＩＶＴ転写物の数に関して飽和まで配列決定をすることは、現在明らかに実際的でない。ここでは、各ライブラリーのための「シークエンシングの深度」を、配列決定をした特異な転写物の数とマッピングした特異なＴｎ５挿入部位の数の間の比と規定する。この研究では、大部分のライブラリーは１．１×から２×の深度で配列決定され、各細胞のゲノムの０．５％～５％のカバレージをもたらす。ヒト／マウス概念実証実験における細胞あたりの特異Ｔｎ５挿入部位の分配は図３Ｄに示し、他の実験については図５に示す。代表的単一細胞のための推定された相対的染色体コピー数は図３Ｅに示し、全ての細胞にわたるそれらの分配は図３Ｆに示す。より高いシークエンシング深度での単一細胞あたりの予想されるゲノムカバレージを外挿するために、特異挿入部位の数をシークエンシング深度の関数としてあてはめる（図５Ｇ）。個々の細胞のゲノムの１６％および２２％のカバレージに対応する、それぞれ５×および１０×のシークエンシング深度で１細胞あたり４．２Ｍおよび６．０Ｍの特異な挿入が観察されると予想される。
上記のように、ｓｃｉ－Ｌ３（図３Ｂ、上）によって生成される二本鎖アンプリコンは、単一細胞ＷＧＳ（ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ；図３Ｂ、中央）だけでなく、単一細胞標的化ＤＮＡシークエンシング（「ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑ」）にも適合する。具体的には、標的化シークエンシングのために、第２の鎖合成の後にＰＣＲによってシークエンシングアダプターを加えることができ、１つのプライマーは第３の細胞バーコードを有しているが、他のプライマーはゲノムの特異的領域を標的にする（図３Ｂ、下）。ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑによる回収の効率を定量化するために、レンチウイルスＣＲＩＳＰＲライブラリーを低いＭＯＩで組み入れ（詳細については、実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計」のセクションを参照する）、ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑによりｓｇＲＮＡスペーサーに対応するＤＮＡ配列を回収した。１００３個の単一細胞のうちの９７個のために、単一の統合されたｓｇＲＮＡを首尾よく回収することができる。１ハプロタイプあたりのこの１０％の効率は、シークエンシング深度を見積もることによって上で推定された２２％のゲノムカバレージと広く一貫する（図５Ｇ）。
分子レベルで、「ｓｃｉ」および「ＬＩＡＮＴＩ」方法をいくつかの方法で改変したことに留意する。要約すると：１）ライゲーションに適合するようにＴｎ５トランスポゾンの設計を変更し、このように、２回を超える「ｓｃｉ」を可能にした、他の単一細胞アッセイに潜在的に一般化するアプローチ、２）分子内ライゲーションを促進するためにＴ７プロモーターのループ構造を加えた、および３）１回目のバーコード化分子の２つの末端のうちの１つでの良好なライゲーションだけを必要とするようにＲＴスキームを変更した。単一のライゲーション事象が５０％の効率を有すると仮定すると、この改変はライゲーション工程で２５％の代わりに７５％の成功率を与える（比較を図５に示す）。各バーコード化工程の後の分子の構造を図４に示し、これらの設計の理論的根拠を実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計」のセクションで検討する。スケーラビリティおよび費用も、実施例２および表２において議論される。１００、１０００、１０，０００および、１，０００，０００個の単一細胞のライブラリーについて、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの費用はＬＩＡＮＴＩによる同数の細胞の処理の１４％、１．５％、０．２６％および０．０１４％であると推定する。スループットを増加させるために（例えば、３レベルｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳにより５％衝突率での１，０００，０００個の細胞のためにライブラリーを構築する費用は約８，０００ドルである）、または、衝突率を低減するために（例えば、３－レベルｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳにより１％衝突率での１０，０００個の細胞のためにライブラリーを構築する費用は約１，５００ドルである）、２つではなく３つのレベルのコンビナトリアルインデクシングの使用でてこ入れすることができる。
表２。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの費用計算。現在の方法は３レベルのインデクシングを含み、それはスループットを増加させ、バーコード衝突を低減するだけでなく、ライブラリー調製の１細胞あたりの費用も有意に低減する。これは、２つの理由による：１）２レベルインデクシングでは、類似した数の細胞をプロファイリングするためにより多くのＴｎ５トランスポソーム複合体で開始する必要があり、それは費用を実質的に増加させる；２）２レベルインデクシングでは、ＩＶＴ、ＲＴおよびカラム精製の前に１ウェルあたりかなりより少ない数の核の選別に制限され、それも費用を実質的に増加させる。約１０ｋおよび約１Ｍの細胞の処理については、３レベルｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳは１細胞あたりＬＩＡＮＴＩよりほぼ４００倍および７，０００倍費用が安いと推定する。




単一細胞ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイのためにｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳをてこ入れさせる
プロトコールへの小さい改変によってｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳスキームを分子生物学の他の態様に潜在的に適合させることができると認識した。これを実証するために、ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイの概念実証実験を実行した。簡潔には、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳにおけるように１回目のＤＮＡバーコード化はＴｎ５挿入によって実行されるが、１回目のＲＮＡバーコード化を同時に実行し、逆転写を通してバーコードおよびＵＭＩ含有ポリＴプライマーによってｍＲＮＡをタグ付けする（図６Ａ）。Ｔｎ５挿入およびＲＴプライマーの両方は２回目のバーコードならびにＴ７プロモーターのライゲーションを媒介することができるオーバーハングを有し、３レベルインデクシングおよび以降のＩＶＴベースの線形増幅を、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳとほとんど同一の様式で効果的に可能にする（図６Ａ～６Ｂ、実施例２、「ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイの方法および分子設計」のセクション）。概念実証として、マウス細胞を２つのヒト細胞系からの細胞と一緒に混合し、ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイを実行した。大多数の細胞のために、ＲＮＡ（５．２％の衝突率）およびＤＮＡ（６．６％の衝突率）の両方について、読み取りデータはマウスまたはヒトゲノムにマッピングされた（図６Ｃ～６Ｄ）。さらに、良好な共アッセイと一貫して、細胞の１００％はそれらのＲＮＡおよびＤＮＡプロファイルによって同じ種標識を割り当てられた。さらなるチェックとして、それらのＲＮＡプロファイルに基づいてｔ－ＳＮＥ空間の中のヒト細胞に可視化した。予想通り、それらは２つのクラスターに分離した。Ｙ染色体の存在の有無に基づく個々の細胞の標識化は、９６．５％の精度でクラスターをＢＪ細胞（雄）またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞（雌）（図６Ｅ）に対応すると首尾一貫して同定した。
ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳによるマウス生殖細胞の単一細胞ＤＮＡプロファイリング
正常な有糸分裂細胞分裂では、二倍体染色体は複製を経て４コピーのＤＮＡを生成し、姉妹染色分体は相反的な娘細胞に分離する。娘細胞は各々母および父から引き継いだＤＮＡ配列の１コピーを受け取り、動原体近位の配列でほとんどいつでもヘテロ接合性を維持する（図７Ａ）。稀に、染色体は染色体相同体の間で有糸分裂交差を経るが、２つの組み換えられた染色分体が異なる娘細胞に分離する場合、それは交差に対し動原体遠位の配列でヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）の二倍体細胞を時にはもたらすことができる（図７Ｂ～Ｃ）。
減数分裂では、姉妹染色分体は同じ娘細胞に先ず同時分離し、相同体は減数分裂Ｉ（「ＭＩ」）期に「還元分離」としても知られる相反的娘細胞に分離し、動原体近位の配列でヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）の２Ｃ細胞（非複製二倍体細胞のＤＮＡ内容）をもたらす（図７Ｄ～Ｅ）。ＭＩにおける染色体の良好な還元分離のために（図７Ｄ）、Ｓｐｏ１１によって触媒される二重鎖切断（ＤＳＢ）によって開始される交差（Baudat et al., 2000；Keeney et al., 1997；Romanienko and Camerini-Otero, 2000）は、染色体相同体の間で連結および必要な緊張（Hong et al., 2013）を提供する。稀に、染色体はいかなる相同体間交差もなしで減数分裂式に分離し、単為生殖二染色体性（ＵＰＤ）をもたらす。ＭＩの後、これらの２Ｃ細胞は、減数分裂ＩＩ（ｍｅｉｏｓｉｓ ＩＩ）（「ＭＩＩ」）に「均等分離」とも呼ばれる有糸分裂様染色体分離を次に経、そのため、姉妹染色分体は分離して１Ｃ生殖体を形成する（図７Ｅ）。以下、我々の研究は主にＭＩに重点を置いているので、姉妹染色分体が一緒に分離するＭＩの間の減数分裂／還元分離を「還元分離」と呼び、姉妹染色分体が別々に分離するＭＩの間の有糸分裂様／均等分離を「均等分離」と呼ぶ。
これまで、交差位置と染色体分離の間の関係に関するほとんどの研究は画像化によって実行された（Wang et al., 2017a, 2017b）が、それは、減数分裂交差を起こしやすい根底のゲノム配列を完全に特徴付けることができない。いくつかのアッセイは減数分裂のＤＳＢホットスポットの詳細なマッピングを可能にする（Lange et al., 2016；Smagulova et al., 2011, 2016）が、これらのアッセイは減数分裂交差を直接的にマッピングしない。交差対非交差を微細スケールで解剖するアッセイは、２、３のホットスポットに制限される（Cole et al., 2014）。その結果として、減数分裂のＤＳＢホットスポットについて知るより、交差と染色体スケールのフィーチャー、例えば複製ドメインの間の関係についてかなり少ししか知らない（Baudat et al., 2013；Choi and Henderson, 2015；Yamada et al., 2017）。ゲノムワイドの減数分裂交差マップは、酵母（Mancera et al., 2008；Zhang et al., 2017）、単一のヒト精子および完全なヒト雌減数分裂（Hou et al., 2013；Lu et al., 2012；Ottolini et al., 2015；Wang et al., 2012）における四分染色体をマッピングすることによって生成された。全体で８７の完全な減数分裂を分析したヒト雌減数分裂の研究を除いて（Hou et al., 2013；Ottolini et al., 2015）、ほとんどの交差マップは少なくとも３つの観点で制限される：１）細胞が両方のラウンドの減数分裂を完了している成熟した１Ｃ生殖体が分析され、それは、ＭＩの間に染色体が還元対均等分離を経るかどうかおよびその頻度を評価する情報量のより多い中間２Ｃ細胞の直接的観察を阻止する（図７）；２）成熟した配偶子状態まで進行することができないため、異常な細胞が反対選択される；３）単一の精子または卵母細胞のシークエンシングによる分析は、スループットが制限され、また最高でも二、三百の細胞に制限され、このように稀な事象を見落とす可能性がある。妊性の交雑についても、合理的に生成し、遺伝子タイピングすることができる子孫の数はかなり制限される（Liu et al., 2014）。
これらの限界の全てに一度に対処するために、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳを種間交雑（雌Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ Ｃ５７ＢＬ／６（「Ｂ６」）×雄Ｍｕｓ ｓｐｒｅｔｕｓ ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ（後に「Ｓｐｒｅｔ」））の不妊性の子孫ならびに種内雑種（雌Ｂ６×雄Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃａｓｔａｎｅｏｕｓ ＣＡＳＴ／Ｅｉ（「Ｃａｓｔ」））の妊性の子孫に適用した。高度にスケーラブルな技術によって精子を配列決定することによって、哺乳動物系のために、妊性および不妊性の雑種における先例のない数の交差事象をマッピングすることができる。さらに、稀な２Ｃ二次精母細胞からプロファイルを回収するためにｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのスループットを活用することによって、同じ単一の細胞から交差および染色体誤分離を同時に調査することもできる。
その副睾丸が何百万もの成熟した精子を貯蔵する近交系雄ならびに（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１雄と異なり、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１雄の副睾丸は（Berletch et al., 2015）、極めてわずかな形態学的に成熟した精子および倍数性が未知である限定数の丸い生殖細胞を含有する（図８Ａ～Ｂ）。興味深いことに、ＦＡＣＳの間に、１Ｃ精子が支配する「正常な」精巣上体で予想されるだろうよりかなり高い割合の２Ｃ細胞を観察した（図８Ｃ～Ｄ）。回収された細胞の数およびそれらの推定された倍数性は、表３に掲載する。対照的に、および予想通りに、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１雄の副睾丸は、ほとんど完全に１Ｃ精子を含有した（図８Ｅ）。この交雑のために、したがって、解離した精巣から１Ｃおよび２Ｃ細胞を選別した（図８Ｆ）。×
表３。回収した細胞の数および細胞倍数性、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）副睾丸。選別された全ての細胞のためにシークエンシングライブラリーを作製したわけではなかったことに留意する；例えば、Ｅｘｐ１における２Ｃライブラリーは、細胞のサブセットを含有するだけである。我々は、１Ｃ細胞のためにも広くゲーティングし（ある特定のウェルでは最大５８個のＤＡＰＩシグナル）、この交雑における豊富な２Ｃ細胞のために、１Ｃ細胞については約５１～５５％に富化することができるだけである。



（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑の両方からのＦ１雄からの細胞のために、線形増幅、３回目のバーコードを加える第２の鎖の合成、ライブラリー調製およびシークエンシングを進めた（詳細は、実施例２、「（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑におけるｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験のセットアップ」のセクションにある）。重要な点は、１Ｃおよび２Ｃ細胞は情報科学的に区別することができるが、それらの相対的な存在度は我々の分析になお影響を与えることである。具体的には、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑では、１Ｃ細胞は稀であり、そのため、いかなる「ダブレット」（例えば、相互に固着している、または同じバーコードを偶発的に受け取る２つの１Ｃ細胞）も２Ｃ集団に実質的に寄与しない。対照的に、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑では、富化にもかかわらず大多数の細胞は１Ｃ（約８５％、図８Ｇ）であり、そのため、２Ｃ細胞を模倣する多くの１Ｃダブレットがある可能性がある。我々は、後のセクションにおいて本物の２Ｃ細胞から１Ｃダブレットを情報科学的に区別する方法を検討する。
Ｍ２細胞は、クラスター化された還元または均等染色体分離を示す
不妊性（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑からのＭ２細胞における染色体分離
上記の通りに得られた、不妊性（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１雄の副睾丸からの細胞における減数分裂を分析しようと先ず努めた。２つのｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験にわたって、２，６８９個（＞１０ｋの生の読み取りデータを有する２，９１９個の選別された細胞の９２％）および４，２３９個（＞３０ｋの生の読み取りデータを有する４，４９７個の選別された細胞の９４％）の単一細胞のゲノムをプロファイリングした。特異的マッピングの読み取りデータの数を、図５Ｆに示す。２つのライブラリーのための１．６×および１．４×のシークエンシング深度で（詳細は図５にある）、それぞれ０．７％および１．４％の中間ゲノムカバレージに対応する、１細胞あたり約７０ｋおよび約１４４ｋの特異なＴｎ５部位の中間値を得た。
交差ブレークポイントを同定するために、Ｂ６対Ｓｐｒｅｔに明らかに割り当てることができる高品質の読み取りデータに依存した隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を実行した（実施例２、「バイオインフォマティクスおよび統計分析の方法」のセクションを参照する）。我々は１，６６３個の１Ｃ細胞における交差を特徴付けし、その代表例を図９Ａに示す。さらに、交差事象のために約５，２００個の２Ｃ細胞を検索した。これらの５，２００個のほとんどは単に体細胞性細胞であるかもしれないが、驚いたことに、かなりの数の交差を有する２９２個の２Ｃ細胞が同定され、それを「Ｍ２細胞」と呼ぶ（図９Ｂおよび９Ｃ）。さらに驚くべきことに、これらの細胞のかなりの割合は、還元ではなく均等分離を示した。
２つの染色体相同体の間で交差が起こった後、染色体が還元様式で分離する場合、動原体と交差位置の間の領域はホモ接合になるが、交差の下流ではヘテロ接合性が維持される（図７Ｄ）。しかし、染色体が均等様式で分離する場合、組み換えられた染色分体が分離するならば、交差に対し動原体遠位にＬＯＨが観察される（図７Ｂ）。図９Ｂ（動原体と交差点の間の一貫したホモ接合性に留意する）においてその染色体が予想される還元分離を経るＭ２細胞の１つの例、および図９Ｃ（動原体と交差点の間の一貫したヘテロ接合性に留意する）においてその染色体が均等分離を予想外に経るＭ２細胞の１つの例を示す。合計で、２９２個のＭ２細胞にわたって、還元分離を経た染色体の４，１６２個の例を観察し、そのうち３，７４０個は交差を有し（９０％）、均等分離を経た染色体の１，３１０個の例を観察し、そのうち６３６個は交差を有する（４９％）。しかし、留意すべきことに、交差結果のサブセットを同定することができないので、均等に分離した染色体における交差事象の数はより高いかもしれない（図７Ｃ）。一方、還元分離した染色体の全ての交差を検出することができる。
一部の染色体が還元分離を示し、他の染色体が均等分離を示す細胞の多くの例が観察されるが、Ｍ２細胞の中の個々の染色体の分離パターンは独立しているようには見えない。各細胞における染色体が還元対均等分離を独立して選択するならば、還元および均等分離した染色体の、還元分離の確率ｐの最大尤度推定値（ＭＬＥ）を中心にした二項分布が予想され（データ、４１６２／５４７２からｐ＝０．７６）、染色体のだいたい３／４は還元分離し、１／４は均等分離する（図９Ｄ）。しかし、プロファイリングした２９２個のＭ２細胞の間で、還元様式で分離した少なくとも１５個の染色体を有する２０２個の細胞、および均等様式で分離した少なくとも１５個の染色体を有する３８個の細胞が観察される（図９Ｅ；これは、独立を仮定したときに予想されるそれぞれ１４８個および０個の細胞と対照的である；ｐ＝４ｅ－２３、フィッシャーの直接確率検定）。個々のＭ２細胞が還元または均等分離を圧倒的に経る方に偏ることは、細胞が減数分裂を続行するかまたは有糸分裂に戻るかどうか決めるための細胞自律的包括的感知機構の可能性を示唆する。
Ｍ２細胞の染色体が交差を有するかどうかによって、細胞をさらに分類することができる（図９Ｆ）。還元分離した染色体（図９Ｆのピンク色）は、均等分離した染色体（図９Ｆの緑色）より多くの交差を有するようである。しかし、全ての交差を動原体ＬＯＨとして検出することができる還元分離した染色体におけるのとは異なり、均等分離した染色体は、２つの組み換えられた染色分体が相反的娘細胞に分離する場合にＬＯＨを有するだけである（図７Ｂ）。代わりに組み換えられた染色分体が共分離する場合は、検出不能である連鎖スイッチにもかかわらず染色体全体でヘテロ接合性が維持される（図７Ｃ）。図９Ｆでは、均等分離した染色体における観察可能なＬＯＨを有する（緑色で示す）対有していない（青色で示す）の比は、だいたい１：１である。これは、それらの完全にヘテロ接合性の染色体（青色で示す）が連鎖スイッチを実際に有するならば、均等分離した染色体は組み換えられた染色分体を一緒に分離する５０％の可能性を有すること、あるいは、均等分離した染色体は組み換えられた染色分体を常に別々に分離し、交差頻度は還元分離した染色体と比較して半減することを意味する可能性がある。
断片のまたは全染色体のＬＯＨは、哺乳動物の有糸分裂細胞において稀であることが知られている。それにもかかわらず、そのような事象の有糸分裂起源を除外するために、雌（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１マウスに由来する自然発生的に不死化された細胞系であるＰａｔｓｋｉ細胞系においてそのような事象を調べた。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳによってＰａｔｓｋｉからの１，１０７個の単一細胞を分析し、その中で、１細胞につき平均０．３６のＵＰＤ染色体および０．０９８の断片ＬＯＨ事象を見出したが、Ｍ２細胞と比較してかなり低い率である。これらの事象は、必ずしも独立しているとは限らない点にも留意する。例えば、細胞系の継代の早期に出現するＵＰＤは、後代細胞の大部分で共有することができ、そのため、独立したＬＯＨ事象の率はおそらくさらにより低い。これらの事象の分配（Ｓｐｒｅｔｕｓ由来の染色体では比較的均一であり、Ｂ６由来の染色体では均一でない）は、図１０Ｆにプロットされる。
まとめると、両方とも同じ技術によって測定した、有糸分裂ＬＯＨの低い率（予想される）と均等分離を示す２Ｃ細胞の比較的高い率（予想外の）の間のコントラストは、後者が体細胞に対応する可能性が非常に低いことを確認する。次のセクションでは、妊性の（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑を分析することによって、１）ここで観察した全ゲノム均等分離事象が、２つの１Ｃ細胞のダブレットのアーチファクトでないこと、および２）そのような分離事象は、低い率であるが、妊性の種内雑種においても起こることをさらに示す。
妊性の（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑からのＭ２細胞における染色体分離
我々は、均等分離が種内（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１雄の妊性後代においてもＭＩの間に起こるかどうか疑問に思った。上に示す通り、この交雑からの副睾丸はほとんど完全に１Ｃ成熟精子からなる。したがって、全精巣から２Ｃ二次精母細胞のために富化した。次に、副睾丸および精巣の両方からの細胞で、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳを実行した。
回収およびバーコード衝突率を調査するために品質管理のために主に実行した、この交雑での最初のｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験では、１Ｃの円形精子を均一に分配し、２回のバーコード化の後に１Ｃ細胞のために選別しただけだった。それらが非１Ｃであるという事実によって同定されるダブレットは、バーコード衝突の率を定量化することを可能にする。２，４００個の選別された細胞（２００／ウェル）の中で、１細胞につき＞７，０００個の読み取りデータで２，１２７個（８９％）が回収された。これらのうちの２，００８個は減数分裂交差を有する１Ｃであり、５．５％のバーコード衝突率を示す。１．０６×のシークエンシング深度で、１細胞につき約６０ｋの特異なＴｎ５挿入の中間値を得、これは、約０．６％の中間ゲノムカバレージに対応した。
この交雑での第２のｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験では、精巣からの１Ｃ円形精子（「バーコード第１群」）、精巣からの２Ｃ細胞（「バーコード第２群」；図８Ｆに示す通り、多数の１Ｃ精子で汚染される）、および精巣上体からの１Ｃ成熟精子（「バーコード第３群」、実施例２、「（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑におけるｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験のセットアップ」のセクション）を、１回目のバーコード化の間に別個のウェルの中でタグメントした。さらなる富化として、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのＦＡＣＳ工程の間に、ウェルのサブセットのために、我々は２Ｃ細胞（全ての細胞の１５．５％、図８Ｇ）のために特異的にゲーティングした。１．０９×のシークエンシング深度で、１細胞につき約９４ｋの特異なＴｎ５挿入の中間値を得、これは、約０．９％の中間ゲノムカバレージに対応した。
合計で、この第２のｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験から、３，５３９個の１Ｃおよび１，４７７個の非１Ｃ細胞を回収した。興味深いことに、１Ｃ細胞の＞９７％はバーコード第３群（ｎ＝８８）ではなく第１群（ｎ＝１，８５３）および第２群（ｎ＝１，５９８）に由来し、精巣上体からの成熟精子がｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳによってよく回収されないことを示す。これは、上の（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑から回収される１Ｃ細胞もおそらく成熟精子からでなく、円形精子からであることを示唆し、図８Ｂの成熟形態を有する精子の少ない数と一貫している。
１，４７７個の非１Ｃ細胞は、バーコード第１群（ｎ＝１，１０４；おそらく１Ｃ円形精子のダブレットである）およびバーコード第２群（ｎ＝３７３；おそらく本物のＭ２細胞および１Ｃダブレットの混合物である）の両方に由来した。１Ｃダブレットのサインを同定するために、バーコード第１群（それは１Ｃ含有量について特異的に前選別されており、そのため、本物のＭ２細胞を含有する可能性が低い）からの非１Ｃ細胞のプロファイルを調べた。減数分裂の両方のラウンドを完了した１Ｃ細胞の動原体近位のＳＮＰは、Ｂ６またはＣａｓｔ由来であるはずである。１Ｃダブレットでは、これらの領域は、ヘテロ接合またはホモ接合として出現する等しい可能性を有する。したがって、任意の所与の１Ｃダブレットの中で、均等分離したようである染色体の数、ならびに還元分離したようであるものの数は、ｎ＝１９およびｐ＝０．５の二項分布に従うはずである。実際、これは、バーコード第１群からの１Ｃダブレットで観察されるものである（二項（１９、０．５）、カイ２乗検定から逸脱した均等分離染色体の割合の分布についてはｐ＝０．５３、図１１Ａ～Ｂ）。実際、均等であれ還元であれ、一貫した様式で分離するようである少なくとも１５個の染色体を有するわずか１１個の１Ｃダブレット細胞があるだけである。
対照的に、バーコード第２群からの非１Ｃ細胞は、非常に異なる分配を示す。そのような３７３個の細胞の中で、２５８個は、それらが均等または還元分離パターンに類似した数の染色体を有するという点で、バーコード第１群の１Ｃダブレットに類似する。残りの１１５個の細胞はバイアスされ、少なくとも１５個の染色体は均等であれ還元であれ一貫した様式で分離し（図１１Ｃ～Ｅ；バーコード第２群の１１５／３７３対バーコード第１群の１１／１，１０４；ｐ＝３ｅ－７０、カイ２乗検定）、多くは完全に均等の（ｎ＝６）または完全に還元の（ｎ＝９１）パターンを示す。
非１Ｃ細胞の３集団をあてはめるための有限混合物モデル
これをより正式に考慮するために、各実験からのデータを３つの二項分布のベイズの有限混合物にあてはめた。詳細は、実施例２、「非１Ｃ細胞の３集団をあてはめるための有限混合物モデル」のセクションおよび図１２に提供され、重要な結論はここで要約される。１番目に、種内（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１雄の精巣（すなわち、バーコード第２群）からの非１Ｃ細胞は、還元（２８％）対均等（２％）分離する細胞サブセット、ならびにおそらく１Ｃダブレット（６９％）を含むと推定される（図１２Ｂ）。この割合は、種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１雄からのＭ２細胞では異なり、これらは、還元（６６％）対均等（１４％）分離する細胞サブセット、ならびにおそらく１Ｃダブレット（２０％）を含むと推定される（図１２Ｃ）。これらの分析は、不妊性（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）の交雑が、還元分離より均等分離にバイアスされる細胞のかなりより高い割合を有するという結論を裏付ける。
染色体レベルでの減数分裂交差の分配
次に、交差事象のゲノム相関を調査することを目指した。全体として、我々は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑からの１９，６０１個の交差ブレークポイントを有する１，６６３個の１Ｃ細胞および４，１８４個の交差ブレークポイントを有する２４０個のＭ２細胞、ならびに、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑からの６０，７５５個の交差ブレークポイントを有する５，５４７個の１Ｃ細胞および２，２４６個の交差ブレークポイントを有する１１５個のＭ２細胞を分析した。我々の知る限りでは、これは、哺乳動物の減数分裂に関連して同定された交差事象の数に関して先例のないデータセットである。
ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのハイスループットの性質は、多数の未熟な生殖細胞を分析して、ＭＩを完了したがＭＩＩを完了していない稀な細胞集団を同定すること、ならびに、このように同じ細胞で減数分裂の交差および染色体誤分離事象を観察することを可能にした。不妊性の種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）雑種を妊性の種内（Ｂ６×Ｃａｓｔ）雑種と染色体レベルで比較することにおいて、ＭＩに以下の欠点が観察される：１）全ての１９個の常染色体の上に少なくとも１つの交差を有するＭ２細胞の割合は、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）の約２／３から（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）の約１／２に低減する；２）Ｍ２細胞あたりの交差の平均数は（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）でより低いが、１Ｃ細胞あたりの交差の平均数はより高い；３）交差干渉は（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）でより弱く、隣接した交差の間の中間距離は９７Ｍｂから８２Ｍｂに低減する；４）（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｍ２細胞では、交差は、動原体に最も遠位の四分位を好む、両交雑の１Ｃならびに（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｍ２細胞と対照的に、各染色体腕の中央の半分で起こる傾向がある；５）バイアスされた均等または還元染色体分離を有するＭ２細胞の中で、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）は（Ｂ６×Ｃａｓｔ）（８／１１５）より有意に高い割合（３８／２４０）の全ゲノム均等分離を示す；６）ＭＩにおけるＭ２細胞の全ゲノム還元分離の中で、散発的な均等分離（逆分離とも呼ばれる（Ottolini et al., 2015））の平均数は、０．２から１．１に増加する。これらの知見は、交差の形成および配置における欠陥、１染色体につき少なくとも１つの交差を確実にするための機構の障害、ならびに散発性のおよび全ゲノムの均等分離の増加を含む、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１雄の不妊に寄与する根底にある因子に寄与するかまたはそれを反映することができる機構を示唆する。これらの分析の詳細は、図１０、図１３、および図１４および実施例２、「染色体レベルの減数分裂交差の分配」のセクションに提示する。
ゲノムの状況に関する減数分裂交差事象の分配
交差ホットニスを調節するゲノムフィーチャー
より微細なスケールで交差の分配を評価するために、各マウス染色体に沿って「ホットニスマップ」を生成するために、全ての交差事象を崩壊させた。これらのマップを、減数分裂のＤＳＢホットスポットを最も高い分解能で同定する、一本鎖ＤＮＡシークエンシング（ＳＳＤＳ）マップ（Brick et al., 2018；Smagulova et al., 2011, 2016）およびＳｐｏ１１オリゴヌクレオチド複合体マップ（Lange et al., 2016）と先ず比較した（図１５Ａ）。これらの２つのマッピング方法からのＢ６株におけるＤＳＢマップは、１００ｋｂウィンドウ（ロー＝０．８７、ｐ＜２ｅ－３０８）に沿ってお互いと強く相関する。我々の１ＣおよびＭ２細胞の交差パイルアップはお互いと相関するが（（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑ではロー＝０．６７、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑ではロー＝０．５５、両方でｐ＜２ｅ－３０８、図１５Ｂ～Ｃ）、両方ともＤＳＢマップから逸脱する。関連して、ホットスポット特異化のための主要プレーヤーであるＰＲＤＭ９遺伝子は、分かれたマウス系統の間で、さらにマウスの亜種の間でさえ、異なるモチーフに結合するように発展した（Davies et al., 2016；Gregorova et al., 2018）。我々は、実施例２、「交差ホットニスに及ぼすＰＲＤＭ９の影響」のセクションにおける２つの交雑の間の差に及ぼすその潜在的影響を検討する。
減数分裂特異的ＤＳＢのわずか１０％が、交差として修復される。次に、ベイズモデル平均化（ＢＭＡ）で線形モデルを構築することによって、Ｓｐｏ１１切断の他にどんな因子が交差形成に寄与するかについて調べた（Clyde et al., 2011）。ここで適用されるように、ＢＭＡは調査される１５，０００を超える可変選択モデルの加重平均をとり、各モデルの事後確率によってそれらを重み付けし、それはラッソ回帰のような一部の他の可変選択技術と異なって、モデル選択における不確実性を説明する。我々は、約８０個の潜在的説明変数のために、限界包含確率（ＭＩＰ）を定量化した。Ｓｐｏ１１切断部位、ＧＣ含有量等の減数分裂交差に関連することが知られているフィーチャーが、ほとんど全てのモデルに高い確率で含まれる（図１６Ａ、図１７）。例えば、ＧＣ含有量が高い領域は交差形成のためによりホットである。我々は、以前は減数分裂の交差に結びつけられなかった２、３のより多くのフィーチャー、例えば反復配列およびクロマチンマークの特異的ファミリー、特に初期の複製ドメインも見出した。交差ホットニスと全てのフィーチャーの間の相関マトリックスを、各交差について図１８～１９にプロットする。使用したフィーチャーならびに単純な線形モデルおよびＢＭＡの要約が含まれる。ブレークポイント分解能（（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）では中間値約１５０ｋｂおよび（Ｂ６×Ｃａｓｔ）では約２５０ｋｂ；図１６Ｂ）は、単一細胞シークエンシング（１５０～５００ｋｂ）によって減数分裂の交差をマッピングする以前の取り組みと同等である（Lu et al., 2012；Ottolini et al., 2015；Wang et al., 2012）。しかし、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳによって与えられたより大きなライブラリー複雑性は、我々がかなりより低いシークエンシング深度でこれを達成することを可能にした。
交差形成と相関するフィーチャーの多くは（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑の間で一貫しているが、一部は違う。例えば、交差形成の位置的バイアスは、異なるようである。両交雑の１Ｃ細胞ならびに（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑のＭ２細胞では、動原体から１０Ｍｂ以内では交差は過少に示され、右端の位置的「四分位」ではむしろテロメアの近くに起こる傾向がある（図１８）。しかし、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑のＭ２細胞では、動原体の近くでならびにテロメアの近くで交差は過少に示され、むしろ中央の四分位に起こる傾向がある（図１９）。この傾向は、我々が全ての他のフィーチャーからの寄与を説明する線形モデルにおいて有効である。
交差の位置は染色体相同体の間で執行される緊張の量に大いに影響することができ、それは次に適切な染色体分離を促進する。したがって、各細胞の中の各染色体のために右端の交差だけをとり、各交雑における染色体腕に沿ってその位置を調べることによって、我々はこれをさらに詳細に探究した（de Boer et al., 2015）。線形混合影響モデルによって染色体間変動性について考慮して、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑における右端の交差の位置が、１Ｃ細胞の（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑におけるそれらより平均して１．６Ｍｂ動原体により近位である（図２０Ａ、ｐ＝１ｅ－１３、Ｆ検定）が、Ｍ２細胞では５．５Ｍｂ動原体により近位であると推定する（図１６Ｃ、ｐ＝２．２ｅ－１５）。Ｍ２細胞における右端の交差は両交雑の１Ｃ細胞におけるそれらより動原体に近位であるが、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑（図２０Ｂ）におけるより（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑（図１６Ｄ）においてその程度はより大きい傾向があることに留意する。これらの差は、その交差が必要以上に動原体の近くで起こる（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑のＭ２細胞のサブセットが、おそらくＭＩＩ分離における欠陥により１Ｃ細胞に成熟することができない可能性を示唆する。同様に、事象の数は限定されているが、我々は、染色体分離がバイアスされているＭ２細胞における交差の位置も比較し、両交雑において、バイアスされた均等分離を有する細胞における交差が、バイアスされた還元分離を有する細胞におけるそれらより動原体に遠位であり、その差は（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑で１３．７Ｍｂ（ｐ＝４ｅ－１５）であり、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑で８．７Ｍｂ（ｐ＝６ｅ－１４）であることを見出した（図２０Ｃ～Ｄ）。これは、テロメアに必要以上に近い交差を有する細胞における、可能なＭＩ分離欠陥を示唆する。我々は、図２０Ｅにこの観察を説明するための仮のモデルを提案する。
交差ブレークポイントに関する細胞不均一性
１ＣおよびＭ２細胞は交差パイルアップにおいて広く類似しているように見えるが（図１５）、単一細胞のサブセットにおける交差分配に影響するフィーチャーに何らかの構造があるかどうかについて疑問に思った。これを探究するために、７８個のフィーチャーの各々のために各単一細胞について交差関連の情報を集めた（実施例２、「バイオインフォマティクスおよび統計分析の方法」のセクション）。次に、各行を１つの単一細胞とし、各列を１つの要約されたフィーチャー値としたマトリックスの上で、主成分分析（ＰＣＡ）を使用した。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑については、最初の２つの主成分（ＰＣ）は分散の２６％を捕捉し、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、ＰＣ１およびＰＣ３は分散の１７％を捕捉する。両交雑では、１ＣおよびＭ２細胞は、これらのＰＣによって２つのクラスターに分離される。図２１および図２２に、これらのＰＣに投影される各フィーチャーをプロットする。交差の染色体分配、単為生殖染色体および染色体四分位における交差の位置は、１ＣおよびＭ２細胞の分離を促進するようであるフィーチャーである。
ゲノムフィーチャーから交差地帯を予測する
最後に、我々は、交差位置の予測モデルを構築するために、ここで観察される多数の事象を活用することを目指した。具体的には、１は同じ地帯長分配からのゲノムから採取した交差地帯であり０はランダム地帯である、二元応答の線形モデルを構築した（詳細は、実施例２、「バイオインフォマティクスおよび統計分析の方法」のセクションにある）。ＢＭＡ分析におけるのと同じ７６個のフィーチャーを使用して、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑のために、０．７３の平均レシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）のヘルドアウトデータで、交差地帯を予測することができる。ＢＭＡによって同定される高い包含確率（ＭＩＰ＞０．５）の２５変数のサブセットで、０．７２の類似の平均ＡＵＣを達成する（図１６Ｅ）。同様に、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑については、全てのフィーチャーまたはＭＩＰ＞０．５の２５個のフィーチャーのサブセットを使用するとき、０．８５の平均ＡＵＣを達成する（図１６Ｆ）。
考察
ここでは、３レベルの単一細胞コンビナトリアルインデクシングおよび線形増幅を組み合わせたフレームワーク、ｓｃｉ－Ｌ３を記載する。我々は、ｓｃｉ－Ｌ３が単一細胞全ゲノムシークエンシング（ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ）、単一細胞標的化ＤＮＡシークエンシング（ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑ）ならびにゲノムおよびトランスクリプトームの単一細胞共アッセイ（ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ）に適用可能であることを実証する。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳにより、少なくとも数万および潜在的に数百万の単一細胞のゲノムを２日間の実験で、１０ｋの細胞では１細胞につき０．１４ドル、および１Ｍの細胞では１細胞につき０．００８ドルのライブラリー構築費用で処理することができる。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのスループットは、「イン－チューブ」ＬＩＡＮＴＩなどの線形増幅に基づく代替の単一細胞ＷＧＳ方法より数桁高い（Chen et al., 2017）。各単一細胞から回収される特異分子の数を、低い数千（Pellegrino et al., 2018）または低い数万（Vitak et al., 2017）から数十万にそれはさらに向上させる。
我々は雄マウス減数分裂を研究するためにｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳを適用して、Ｍ２細胞の予想外の集団を同定した。データの単一細胞の性質は、我々が減数分裂の交差および染色体誤分離を同時に特徴付けることも可能にした。逆分離事象はヒト雌減数分裂（Ottolini et al., 2015）の全分析において以前に観察されており、マウス雄減数分裂との関連で類似の事象がここで観察される（すなわち、１つまたはいくつかの染色体の均等分離）。我々が（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑から分析した２９２個のＭ２細胞の中で、個々の細胞は、均等または還元染色体分離の方へバイアスされ、細胞が減数分裂を続行するか、またはその染色体の有糸分裂分離に戻るかどうか決定する包括的感知機構を示唆している。さらに、我々の知る限り、哺乳動物の減数分裂で初めて、我々はＭＩの間の全ゲノム均等分離の複数の例を観察し、染色体自律様式よりはむしろ細胞自律様式の均等分離を示唆している。妊性の（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑ではより稀であるが、我々は両交雑においてそのような事象を同定した。
染色体自律機構、特に種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑で予想されるだろうもの（２－１９の率）と比較したときの全ゲノム逆分離の高い発生率は、答えられないほど多くの疑問を呈する。我々は図２３においてモデルを示し、いくつかの未解決の疑問を強調する。正常なＭＩでは、還元分離において動原体粘着は維持され、交差に対し動原体近位の姉妹染色分体がＭＩＩまで分割されない（図２３Ｄのパターン１）。ＭＩにおける均等分離は、未熟な動原体コヒーシン分離を示す（図２３Ｄのパターン２および／または３）。以前の研究は、ＰＲＤＭ９結合性部位の浸食によりこれらのＦ１交雑では相同体対形成に欠陥があるかもしれないことも示しており（Davies et al., 2016；Gregorova et al., 2018；Smagulova et al., 2016）、対形成の問題は、種間交雑においておそらくより重度である。実施例２、「逆分離の原因および結果に関する推測」のセクションでは、我々は以下について推測する：１）何が未熟な動原体コヒーシン分離を引き起こす可能性があるか、２）１つの交差が適切な還元分離に十分であるかどうかについて、および３）ＭＩにおける均等分離はどんな結果をもたらす可能性があるか。
向上したゲノムカバレージは、他の単一細胞シークエンシング方法と比較して交差ブレークポイントの高分解能マッピングを可能にし、合計約８７，０００個の交差のマッピングのためのスループットは、我々がパイルアップデータによって交差ホットニスに関連したゲノムおよびエピゲノムフィーチャーをより良好に特徴付けることを可能にした。交差ホットニスの連続帯が多くの因子によってどのように形成されるかについて、実施例２、「交差ホットニスおよび関連する（エピ）ゲノム因子」のセクションで議論する。
ｓｃｉ－Ｌ３の開発においてトランスポゾン挿入（ＬＩＡＮＴＩ）を通してハイスループット単一細胞コンビナトリアルインデクシング（「ｓｃｉ」）スキームを線形増幅と単に組み合わせることからの１つの重要な差は、ライゲーションによってＴ７プロモーターを導入したことであり、それは２回を超える細胞バーコード化を可能にし、さらにかなり低減された費用でスループットを増加させるだけでなく、この方法をプロトコールの小さい微調整によって他の単一細胞アッセイに一般化するための柔軟性も提供する。第１の例として、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳをｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑに容易に適合させることができることを実証する。単一細胞標的化シークエンシングは１０Ｘゲノム研究プラットホームによって報告されているが、我々の知る限りでは、それはＤＮＡ遺伝子座ではなくＲＮＡ転写物のものである。現在の１ハプロタイプにつき１０％の「回収率」は標的化シークエンシングに理想的でないかもしれないが、それは分析することができる多数の細胞によって緩和される。第２の例として、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳをｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイにも適合させることができることを実証する。クロマチンアクセス性、メチロームおよびクロマチン高次構造のそれぞれの単一細胞プロファイリングのために、ｓｃｉ－Ｌ３をＡＴＡＣ－ｓｅｑ、重亜硫酸－ｓｅｑおよびＨｉ－Ｃに適合させることがさらに可能であるかもしれないと我々は予期し、それは、スループットおよび増幅均一性に関してこれらの目標のための公開されたｓｃｉ－方法（Cusanovich et al., 2015；Mulqueen et al., 2018；Ramani et al., 2017）に対して利点を有する可能性がある。
要約すると、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ、ｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑおよびｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイは、単一細胞シークエンシングのためのツールセットを拡張する。この研究では、我々は、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳがどのように減数分裂性組換えの系統的で定量的な像を提供することができるかについてさらに示し、スループットの先例のない組合せによって稀な全ゲノム染色体誤分離事象を明るみに出す。ｓｃｉ－Ｌ３方法は、例えば、稀な相同体間有糸分裂交差を研究するために、およびがんの遺伝的異質性および発生を解剖するために、単一細胞ゲノムシークエンシングがトランスフォーマティブであることが証明される他の状況で高度に有益になると、我々は予想する。
参考文献
非１Ｃ細胞の３集団をあてはめるための有限混合物モデル
バーコード第２群からの（Ｂ６×Ｃａｓｔ）雑種から回収された非１Ｃ細胞は、１Ｃダブレット、均等分離の方へバイアスされているようである細胞、および還元分離の方へバイアスされているようである細胞を含む。それらの相対的な割合を定量化するために、０．０１、０．４８および０．９５の均等分離染色体の確率ならびに０．２８、０．６９および０．０２の混合割合で、３つの二項分布の混合物にデータをあてはめた（図１２Ａ）。対照的に、バーコード第１群からの非１Ｃ細胞を３つの二項分布の混合物に同様にあてはめようとするとき、我々は０．４６、０．５および０．５３（全て０．５に近い）の均等分離染色体の確率ならびに０．２４、０．４４および０．３１の混合割合を得る（図１２Ｂ）。
均等対還元分離の方へバイアスされるＭ２細胞の割合が妊性および不妊性の交雑の間で異なるかどうか尋ねることに向けて、我々は（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑からの染色体データを同様にあてはめることができ（図９Ｅ）、それは０．０５、０．３９および０．９１の均等分離染色体の確率ならびに０．６６、０．２および０．１４の混合割合を与える（図１２Ｃ）。これらの割合は、不妊性の（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑が、還元分離より均等分離にバイアスされる細胞のより高い割合を有することを示唆する。
染色体レベルの減数分裂交差の分配
（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑からの１９，６０１個の交差ブレークポイントを有する１，６６３個の１Ｃ細胞および４，１８４個の交差ブレークポイントを有する２４０個のＭ２細胞、ならびに（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑からの６０，７５５個の交差ブレークポイントを有する５，５４７個の１Ｃ細胞および２，２４６個の交差ブレークポイントを有する１１５個のＭ２細胞に基づき、我々は、染色体全域にわたって減数分裂交差の分配を先ず考慮した。交差密度は、１Ｍｂあたりの１回の分裂あたりの１細胞あたりの交差の平均数に２（１Ｃ細胞）または１（Ｍ２細胞）を掛け算したものとここで規定される。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑では、１Ｃ細胞における染色体サイズと交差密度の間で強力な負の相関が観察された（図１３Ａ、ｒ＝－０．６６、ｐ＝０．００２）。以前の知見（Lange et al., 2016）と一貫して、この相関はＳｐｏ１１オリゴヌクレオチド複合体密度（ｒ＝－０．４６、ｐ＜０．０５）によって部分的に説明されるだけであり、これは、より小さい染色体がより多くのＤＳＢを維持し、それらのＤＳＢは交差を生成する可能性がより高いことを示唆する。この負の相関は、Ｍ２細胞においてさらにより強力である（図１３Ｂ、ｒ＝－０．８３、ｐ＝１ｅ－５）。図１０Ａ～Ｂでは、我々は１細胞あたりの１染色体あたりの複数の交差の場合を単一の事象と考え、それは負の相関をさらに強化する（１Ｃ細胞ではｒ＝－０．８７、ｐ＝２ｅ－６；Ｍ２細胞ではｒ＝－０．９１、ｐ＝８ｅ－８）。これらの観察は、より小さい染色体が交差に対して、特に１回の細胞分裂につき少なくとも１つの交差を有することに対してよりホットであることを示唆する。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑において、同じ傾向が観察される（図１４Ａ～Ｄ）。１Ｃ細胞は種間および種内交雑について１細胞あたりの１染色体につき平均０．６２個および０．５８個の交差をそれぞれ有したが、Ｍ２細胞は１細胞あたりの１染色体につき平均０．９２個および１．０３個を有した（図１３Ｃ～Ｄ、１０Ｃ～Ｄ）。種間Ｍ２細胞における交差率は、２％の配列分散にもかかわらず、Ｂ６近交系マウスの４Ｃ精母細胞においてＭｌｈ１焦点によって測定した交差数（Froenicke et al., 2002）よりわずか９％低い。１Ｃ細胞における交差率は、単一のヒト精子シークエンシングにおいて観察されるより４５％低い（Lu et al., 2012；Wang et al., 2012）。後者の差は、マウス染色体の端部動原体の性質に大部分よるかもしれない。種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑は（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑と比較して１Ｃにおいて検出される交差のより高い平均数を有するが（ｐ＝７ｅ－２６、マン－ホイットニー検定法）、Ｍ２細胞における交差の平均数はより低い（ｐ＝２ｅ－１０）。あらゆる染色体に交差を有する１９個の常染色体の全てを還元分離させたＭ２細胞の割合は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑（４１／８０または５１％）より（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑（６０／９１または６６％）で高いことに注意し（ｐ＝０．０６、フィッシャーの直接確率検定）、それは後者の不妊に寄与する可能性がある。
交差干渉を調べるために、少なくとも２つの交差を有する染色体を取り上げ、隣接した交差の間の距離をプロットし、ランダムシミュレーションに基づいてこの分布を予想と比較した（図１３Ｅ、図１０Ｅ、図１４Ｅ）。交差の間の中間の観察された距離は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）で８２Ｍｂおよび（Ｂ６×Ｃａｓｔ）で９７Ｍｂであった。両方とも、３９および４２Ｍｂの予想よりかなり大きい（それぞれｐ＝１ｅ－２６７およびｐ＜２ｅ－３０８、マン－ホイットニー検定法）。これは、非常に近接した交差の反発と一貫している。交差干渉は（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑より（Ｂ６×Ｃａｓｔ）でより強力であり、隣接した交差の間の距離はより長い（ｐ＝５ｅ－９１）。
我々は、各単一の細胞における単為生殖染色体の（すなわち、交差は観察されない）（図１３Ｆ）、および（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑における各染色体（図１３Ｇ）のための分配も分析した（図１４Ｆ～Ｇに示すように、同じ傾向は（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑で有効である）。長さによって正規化したとき、より短い染色体は高い交差率を示すが、単為生殖染色体の率（細胞の全てのクラスにわたって崩壊させた）は染色体サイズとなお負に相関した（図１３Ｇ；ｒ＝－０．９１、ｐ＝４．６ｅ－８）。
Ｍ２細胞はそれらの染色体の均等または還元分離のいずれかの方に強くバイアスされることを示したが、還元分離を有する少なくとも１５個の染色体を有する細胞の間で、数百の散発性の均等分離事象も観察した。この現象は以前にも観察され、「逆分離」と命名された（Ottolini et al., 2015）。図１３Ｈでは、これらの逆分離事象の染色体分配を示す。逆分離の率は（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑（平均＝０．２、ｐ＝２ｅ－１４、マン－ホイットニー検定法）より（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑（平均＝１．１）において有意に高いが、第７および第１１染色体は両交雑において最も高い逆分離率を有することに留意する。
ミトコンドリアゲノムにマッピングされる細胞あたりの読み取りデータの正規化された割合を、次に調べた（図１３Ｉ、図１０Ｇ）。ミトコンドリアＤＮＡの「コピー数」に関して１Ｃ細胞は二峰性分布を示すが、この観察に関して我々は満足な説明を欠いている。ミトコンドリアの読み取りデータ割合と交差の数の間で、軽度の負の相関を観察した（ロー＝－０．１１、ｐ＝３ｅ－６）。興味深いことに、限定された数であるが、それらの染色体の少なくとも１５個を均等対還元分離したＭ２細胞は、ミトコンドリアの読み取りデータ割合の非常に異なる分布を有した（図１０Ｇ）。これと一貫して、ミトコンドリアの読み取りデータ割合は、Ｍ２細胞における還元分離した染色体の数と正に相関した（ｒ＝０．１８、ｐ＝０．００５）。配列決定した単一細胞の９０％超がミトコンドリアゲノムにマッピングされたいかなる読み取りデータも有していないので、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑においてこれを評価することができないことに留意すべきである。精巣からの核の前選別と相まって、精巣（Ｂ６×Ｃａｓｔ）対精巣上体（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）からの核単離のために使用した異なる方法が、バルク核からミトコンドリアを分別した可能性がある。
交差ホットニスに及ぼすＰＲＤＭ９の影響
ゲノム全体にわたって染色体に沿って交差ブレークポイントを積み上げることによる交差ホットニスマップに基づいて（図１５）、おそらくＣａｓｔ ＰＲＤＭ９対立遺伝子がＦ１雑種において半優性である結果として、種内（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑では、交差ホットニスがＢ６雄よりもＣａｓｔ雄においてマッピングされたＤＳＢホットドメインとよりよく相関する（それぞれ、ロー＝０．２８および０．１２、ｐ＜２ｅ－３０８およびｐ＝１ｅ－８３）ことを見出した。相関は、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）Ｆ１動物においてマッピングされたＤＳＢホットドメインでより強い（ロー＝０．３、ｐ＜２ｅ－３０８）。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑では、ＰＲＤＭ９コンセンサス結合性部位の浸食は、Ｓｐｏ１１オリゴヌクレオチド複合体マップによって規定される４種類のＤＳＢホットスポットをもたらす：Ｂ６とＳｐｒｅｔの間で保存される、「対称」ホットスポットと呼ばれるもの、Ｂ６またはＳｐｒｅｔにだけ存在する、「非対称」ホットスポットと呼ばれるもの、およびいずれの種においてもＰＲＤＭ９結合性部位を含有しないもの。４種類のＤＳＢホットドメインの全ては、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑からの交差と十分に相関しない（Ｂ６にマッピングされた全てのＳｐｏ１１ホットスポットを使用した場合ロー＝０．１３、ｐ＝４ｅ－８７；「対称ホットスポット」だけを使用する場合ロー＝０．１１、ｐ＝３ｅ－６３）。１つの可能性は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑におけるＤＳＢ部位がＳｐｒｅｔＰＲＤＭ９対立遺伝子によって強く支配され、そのため、Ｂ６系統バックグラウンドにマッピングされたＤＳＢホットスポットから交差部位が予測されないということである。
逆分離の原因および結果の推測
我々は逆分離の高い発生率を、特に種間（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑において観察した。我々は、以下について推測する：１）何が未熟な動原体コヒーシン分離を引き起こす可能性があるか、２）１つの交差が適切な還元分離に十分であるかどうかについて、および３）ＭＩにおける均等分離はどんな結果をもたらす可能性があるか。
１番目に、Ｂ６とＳｐｒｅｔ染色体の間の不十分な相同体対形成のために、減数分裂の間に相同体から正常に修復されるべきだったＤＳＢは、代わりに鋳型として姉妹染色分体を使用して頻繁に修復される可能性がある。これは、コヒーシンの破壊を引き起こす可能性（Storlazzi et al., 2008）、および未熟な動原体コヒーシン分離につながる可能性がある。
第２には、現在のモデルは、１つの相同体間交差および適切な姉妹染色分体粘着が、種間交雑における初期の不十分な相同体対形成にもかかわらずキアズマの形成に十分である（図２３）ことを示唆する。交差が首尾よく形成されると、染色体分離は損なわれないはずである。我々の研究では、個々の染色体レベルでは、動原体遠位ＬＯＨによって立証される通り、観察された多数の均等分離染色体は正常な交差を有し、そのことは、初期の相同体対形成における欠陥が最終結果に影響を与えることを示しているかもしれない。しかし、ゲノムレベルでは、バイアスされた均等分離を有する細胞がそれらの還元にバイアスされた対応物と類似した数の交差を有するかどうかについて確信して調査することができないが、その理由は、還元分離する染色体について全ての交差を検出することができるが、均等分離した染色体における交差は２つの組み換えられた染色分体が別々に分離するときに検出することができるだけであるからである（図５Ｂ～Ｃおよび図１６Ｄ、パターン２および３）。組み換えられた染色分体が等しく一緒にまたは別々に分離する可能性があると仮定すると、交差の数はそれらのゲノムレベルの均等分離の場合にはより小さくないが、未解消の組換え中間体のために分離が５０／５０から離れてバイアスされる可能性を排除することができない（図２３、パターン３）。
第３に、これらの均等分離した染色体の結果は何であるか？それらは有糸分裂に戻って広範なＬＯＨを有するのか、またはそれらはＭＩＩに進行するのか、もしそうならば、１Ｃ生殖体の形成に寄与するのか？酵母では、減数分裂プログラムを開始する細胞が適切な栄養の存在下で正常な有糸分裂に戻り、多数のＬＯＨ事象をもたらすことができる、「成長回帰」と呼ばれる現象が特徴付けられている（Dayani et al., 2011）。ヒト雌の減数分裂では、逆分離を有する染色体はＭＩＩに進行し、１つの正倍数性の卵母細胞および１つの正倍数性の極体２に導き、正常なＭＩＩ分離と一貫している。著者は、未解消の組換え中間体が、さもなければ無関係な相同体染色分体を連結することによって、ＭＩにおいて逆分離を引き起こし、適切なＭＩＩ分離を促進した可能性を示唆する（図２３、パターン３）（Ottolini et al., 2015）。Ｍｌｈ１は、減数分裂におけるミスマッチ修復（ＭＭＲ）とホリディ接合部中間体の解消の両方のために重要である。Ｂ６とＳｐｒｅｔ間の２％の配列分散を考慮すると、集中的ＭＭＲのためにＭｌｈ１が制限的である可能性があり、組換え中間体を解消するのに十分なＭｌｈ１がないかもしれない。しかし、組み換えられた相同体染色分体が共分離する場合、これはＬＯＨにつながらないだろうと、我々は強調する（図５Ｃ）。したがって、ＬＯＨおよび均等分離を有するＭ２細胞は、未解消の中間体の共分離によって説明することができない。
最後に、図２３では、パターンの１つ（パターン４）が、交差を有するが、組み換えられた染色分体を共分離する細胞（パターン３）から識別可能でないので、おそらく不十分な相同体対形成のために、いかなる相同体間交差もない染色体からの生殖体形成への可能な寄与を示す。しかし、交差のないこれらの細胞が１Ｃ細胞に有意に寄与する場合、１Ｃ細胞の間でより多くの交差のない染色体が観察されるはずである。両交雑で観察した１Ｃ細胞のうち、交差の有る無しの染色体の数はだいたい５０－５０であり、それらが図２３のパターン１～３の何らかの組合せに主に由来すること、および相同体間交差のない２Ｃ細胞（パターン４および５）は、ＭＩＩを首尾よく完了する１Ｃ細胞に実質的に寄与しないことを示す。
交差ホットニスおよび関連する（エピ）ゲノム因子
交差ホットニスは連続帯であり、多くの因子によって形づくられる。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑における交差は、２つの親系統のための個々のマップにおけるより、Ｆ１交雑にマッピングされる減数分裂のＤＳＢホットスポットと強く相関し、これは、新規の減数分裂ホットスポットがＦ１雑種において形成することができるという以前の知見に基づいて予想される（Smagulova et al., 2016）。（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑では、交差は、弱いがＳｐｏ１１切断と正に相関する。Ｓｐｏ１１マップは、Ｂ６対立遺伝子のＰＲＤＭ９タンパク質に結合したＰＲＤＭ９部位だけを説明することに留意すべきであり、ＰＲＤＭ９のＳｐｒｅｔコピーが異なる部位に結合して、我々の分析で説明されていない新しい減数分裂ＤＳＢホットスポットを形成する可能性がある。減数分裂交差と正に相関していることが観察されるゲノムフィーチャーには、ＧＣに富む領域（酵母減数分裂における場合も同様である（Petes, 2001；Petes and Merker, 2002））、系統（Lilue et al., 2018）、遺伝子体、偽遺伝子転写物、ＣＴＣＦ結合性部位、複製ドメイン（Marchal et al., 2018）、ＤＮＡトランスポゾン、サテライトＤＮＡならびにＨ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ３６ｍｅ３を含むヒストン改変のサブセット（Mu et al., 2017）の間のＣＮＶの増加が含まれる。興味深いことに、雄生殖細胞における有糸分裂から減数分裂への転換の調節に関与するＤｍｒｔ６の結合性部位（Zhang et al., 2014）は、減数分裂の交差ホットニスと強く相関している。注目すべきことに減数分裂交差と負に相関しているゲノムフィーチャーには、３’ＵＴＲ、ＬＩＮＥおよび低い複雑性のＤＮＡが含まれる。ｒＤＮＡが減数分裂交差に対して極めて冷めている（Petes and Botstein, 1977）酵母の場合と異なり、マウスｒＤＮＡは交差を抑制しないようである。これらのゲノムフィーチャーで、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）でそれぞれ０．７３および０．８５の精度によって、真の減数分裂交差開始部位をマウスゲノムの中のランダムに採取された地帯から区別することができ、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑における０．８５の予測精度は２５個のゲノムフィーチャーのサブセットに適用される。様々なフィーチャーがモデル化アプローチの間でほとんど一貫してふるまうが、さらなる実験なしでいかなる因果律も割り当てることができないことを我々は強調する。
方法
ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳおよびｓｃｉ－Ｌ３－標的－ｓｅｑの方法および分子設計
単一細胞の調製およびヌクレオソーム枯渇
細胞懸濁液は、シャーレからのトリプシン処理または組織からの均質化によって調製される。ワシントン大学ＩＡＣＵＣが承認したプロトコールに従って、雄Ｆ１マウスはＣＯ２および続く頚椎脱臼によって安楽死させた。雄生殖細胞の単離のために、１０％ＦＢＳを追加した１×ＰＢＳの１ｍｌの中で管をスライスし、室温で１５分間、組織をインキュベートすることによって精巣上体を解剖した。インキュベーションの後、ピペット操作によって細胞懸濁液を収集した。精巣上体から単離された細胞は、（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑の実験のために、および、（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑の成熟精子（「バーコード第３群」）の供給源としても使用した。（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑のための２Ｃ細胞のための富化方法としての全精巣からの核の単離のために、精巣細胞を先ず１％ホルムアルデヒドによって架橋させ、低張性緩衝液を使用して核を抽出した。次に、主にＤＡＰＩシグナルに基づくＤＮＡ含有量によって、１Ｃおよび２Ｃ核をＦＡＣＳ選別した。培養したヒトおよびマウス細胞を４℃で５分間、５５０ｇでペレット化し、雄生殖細胞は４℃で１０分間、２４００ｇでペレット化する。
ヌクレオソーム枯渇は、溶解緩衝液が下流のＬＩＡＮＴＩプロトコールに適合するように改変されること以外は（Chen et al., 2017）、ｓｃｉ－ＤＮＡ－ｓｅｑ（Vitak et al., 2017）におけるｘＳＤＳ方法にほとんど従う。細胞は、１０ｍＬのＤＭＥＭ完全培地の中で室温で１０分間（管を静かに反転させる）、４０６μＬの３７％ホルムアルデヒド（最終濃度１．５％）によって架橋させる。次に、８００μＬの２．５Ｍグリシンを加え、氷の上で５分間インキュベートする。細胞をペレット化し、１ｍＬの溶解緩衝液（６０ｍＭトリス－Ａｃ、ｐＨ８．３、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１５ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄する。０．１％ＩＧＥＰＡＬ（Ｉ８８９６、ＳＩＧＭＡ）を有する１ｍＬ溶解緩衝液にペレットを再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートする。核を次にペレット化し、１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１で洗浄し、ヌクレオソーム枯渇のために０．３％ＳＤＳを有する８００μＬの１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１に４２℃で再懸濁させる（５００ｒｐｍで３０分間激しく振盪させる）。次に、１８０μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを加え、４２℃で３０分間、激しく振盪させる（５００ｒｐｍ）。透過性にした核を次に１ｍＬの溶解緩衝液の中で２回洗浄し、１μＬにつき２０，０００個の核で溶解緩衝液に再懸濁させる。
トランスポソームの設計およびアセンブリー
トランスポゾンＤＮＡオリゴはリン酸化された２本の鎖の両方の５’で合成され、１つはＬＩＡＮＴＩおよびＮｅｘｔｅｒａにおけるのと同様にＴｎ５挿入のために必要とされ（５’／リン酸／ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ、ＩＤＴ、ＰＡＧＥ精製（配列番号１））、他は、ライゲーションのために必要とされる（５’／リン酸／ＧＴＣＴＴＧ ＸＸＸＸＸＸＸＸ［１回目のバーコード］ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ、ＩＤＴ、標準の脱塩（配列番号２））。アニール緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）の中での段階的な冷却（９５℃５分間、－０．１℃／サイクル、９秒間／サイクル、２５℃まで７００サイクル）による１：１のアニーリングの後に、５’オーバーハングを有するＴｎ５二重鎖を１．５μＭに希釈する。次に７．２μＬの保存緩衝液（５０％グリセロールを含む１ｘＴＥ）を１２μＬ～１μＭのＴｎ５トランスポザーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＴＮＰ９２１１０）に加え、０．７９μＬの希釈されたトランスポザーゼを室温で３０分間、０．４μＬの１．５μＭ Ｔｎ５二重鎖と一緒にインキュベートする。トランスポソームは、０．２μＭの最終濃度に二量体化する。トランスポソーム複合体は、最高１年の間、－２０℃で安定して保存することができる。１回目に２４ウェルのバーコード化のために２４個の反応を立ち上げたが、適用によってはより多くのウェルが望ましいかもしれない。新しい生物適用ごとに、検査実験のためにトランスポソームを先ず０．１μＭまでさらに希釈する。特異な読み取りデータの数およびライブラリー複雑性はより最適でないが（図５）、低分解能でのマッピングのために使用できる。
図７で、各工程でのｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの分子構造を示す。市販のＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製では、以下のために配列決定可能なＤＮＡ材料の少なくとも半分を失う：１）Ｔｎ５挿入は断片化したゲノムＤＮＡの２つの末端に対称形のトランスポゾン配列を導入し、これは、変性したときにヘアピンループの形成をもたらすことができ、ＰＣＲ増幅を阻止する；および２）２つの末端が５０％の可能性でｉ５またはｉ７の両方でタグメントされる場合、分子は配列決定をすることができない。Ｎｅｘｔｅｒａベースのライブラリー調製に対するＬＩＡＮＴＩの１つの重要な利点は、ループ状のＴｎ５設計がトランスポソーム二量体によって導入される対称性を切断し、分子内ＲＴプライマーを使用して逆転写（ＲＴ）を促進することであり、これはループ状のトランスポゾンの特徴でもある。しかし、ループ状のトランスポゾンは２回を超えるバーコード化に適合せず、このことはスループットを制限し、ライブラリー費用を相当増加させる（比較については表２を参照する）。ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳに加えた変更では、ライゲーション工程の間、ループ状のＴｎ５によってもたらされる利点は維持される。
タグメンテーション（１回目のバーコード）およびライゲーション（２回目のバーコード）
次に、ｌｏ－ｂｉｎｄ９６ウェルプレートの各ウェルの中に１．５μＬの核を２０，０００／μＬ濃度で分配し、６．５μＬのＨ２Ｏおよび０．７μＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を加える（溶解緩衝液の中のＥＤＴＡは３．２４ｍＭの最終濃度である）。上で調製される１．２μＬのトランスポソームを各ウェルに加え、次にプレートを５５℃で２０分間インキュベートする（サーモミキサーが推奨されるが、要求されていない）。次に５μＬの停止液（４０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭスペルミジン）を加え、核をトラフにプールする。溶解緩衝液のさらなる１ｍＬを核懸濁液に加えてからペレット化する。上清を注意深く除去した後に、３１２μＬの再懸濁緩衝液（２４μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、４８μＬの１０×タグメンテーション緩衝液［５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ ８．０］、９６μＬのＨ２Ｏ、１４４μＬの溶解緩衝液）に核を再懸濁し、新しいｌｏ－ｂｉｎｄ９６ウェルプレートの各ウェルに４．７μＬの核ミックスを分配する。ヘアピンライゲーション二重鎖（１．ＣＡＡＧＡＣ２．Ｙ’Ｙ’Ｙ’Ｙ’Ｙ’Ｙ’Ｙ’［２回目のバーコードの逆相補体］３．ＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣ４．ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ５．ＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧ６．ＹＹＹＹＹＹＹ［２回目のバーコード］（配列番号３））は、Ｔｎ５トランスポゾン二重鎖と同様にプレアニールされ、１．５μＭまで希釈される。ライゲーション二重鎖は５つのエレメントを含有することに留意する：１）Ｔｎ５の上のライゲーションアダプターの逆相補体；２）２回目のバーコードの逆相補体；３）第２の鎖の合成（ＳＳＳ）プライマーの逆相補体；４）Ｔ７プロモーター、これはヘアピンのループ領域であることに留意する；５）Ｔ７転写を強化するためのＧＧＧから開始する第２の鎖の合成（ＳＳＳ）プライマー領域（図４Ｂの中の「ｓｐ２」）；６）２回目のバーコード（図４Ｂの中の「ｂｃ２」）。これらの二重鎖の０．８μＬを、核懸濁液を有する６４ウェルの各々に加え、１．１８μＬのライゲーションミックス（０．６μＬの１０×ＮＥＢ Ｔ４リガーゼ緩衝液、０．４８μＬのＰＥＧ－４０００、０．１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ［Ｔｈｅｒｍｏ ＥＬ００１１］）を各ウェルに加え、２０℃で３０分間インキュベートする。ライゲーションの後、ループ状の構造はＬＩＡＮＴＩのそれに類似し、ＲＴ工程（下で議論する）での効率を促進する点に、および、両ラウンドのバーコードがＴ７プロモーターの３’に存在し、したがって増幅された分子に含まれる点に留意する。ライゲーション反応は、４μＬの停止液を加えることによって中止される。細胞は、次に新しいトラフ（約６３０μＬ）にプールされ、５μｇ／ｍＬの最終濃度のＤＡＰＩで染色され、細胞選別の前に加えられる３μＬの溶解緩衝液によって各新しいウェルの中に１００～３００で選別される。ＦＡＣＳによる各選別事象がノズルのサイズによって約３～５ｎＬのＦＡＣＳ緩衝液に関連する点に留意する、我々は、塩濃度を低くしておくために各ウェルに加えられる液体の総量を＜１μＬに保つことを推奨する。
細胞溶解、ギャップ伸長およびインビトロ転写による線形増幅
次に、細胞溶解のために、７５℃で４５分間インキュベートし、４℃に冷却し、新たに希釈したＱｉａｇｅｎプロテアーゼ（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）によって５５℃で８時間処理することによって、各ウェルの中の合計３．５～４μＬの選別された核にとりかかる。７５℃で３０分間インキュベートすることによって、プロテアーゼを次に熱不活性化する。細胞溶解物は、－８０℃で保存することができる。以降の増幅工程がＲＮＡを含み、時間に敏感であるので、各実験のために３２個以下のウェルの試料（約９６００個の単一細胞）を処理することを推奨する。ギャップ伸長（図４Ｃ）のために、２μＬのＨ２Ｏ、０．７μＬの１０×タグメンテーション緩衝液、０．３５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰおよび鎖置換活性を有する０．３５μＬのＢｓｔ ＷａｒｍＳｔａｒｔ２．０ポリメラーゼの混合物を加えることによって、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用し、６８℃で５分間インキュベートする。ライゲーションが両末端で成功した場合、両側にＴ７プロモーターがあって二重鎖は対称的であるが、ライゲーションが一方の末端だけで成功した場合は、破線ボックスの中の領域は一方の側で欠落している点に留意する。分子間のライゲーションは、一般的に非効率的である。分子間のライゲーションの必要性を最小にするためにプレアニールされたヘアピンループを含めたが、２つの分子（ヘアピンループのない３つの代わりに）はなお互いを見出す必要がある。ライゲーション効率が５０％である場合、両末端にライゲーションを有する率は２５％であるが、いずれかの末端にライゲーションを有する率は７５％である。ＲＴ工程の後半では、ライゲーションの成功は一方の末端だけで必要とされることを我々は示す。ギャップ伸長の後、２μＬのＨ２Ｏ、２μＬのＴ７ Ｐｏｌミックスおよび１０μＬのｒＮＭＰミックス（ＮＥＢ、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット）を加えることによって、２０μＬのＴ７インビトロ転写システムをアセンブルする。混合物を３７℃で１０～１６時間インキュベートする。
ＲＮＡ精製、ＲＴおよびＳＳＳ（または、標的化シークエンシング）
２．２μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えることによって、転写を終了する。増幅されたＲＮＡ分子は、次にＲＣＣ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ１０１６）で精製し、１８μＬの０．１×ＴＥで溶出する。最初に０．６μＬのＲＮＡ ＲＴプライマー（ｒＡｒＧｒＡｒＵｒＧｒＵｒＧｒＵｒＡｒＵｒＡｒＡｒＧｒＡｒＧｒＡｒＣｒＡｒＧ、ＩＤＴ（配列番号４））、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰおよび０．５μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ＊Ｉｎ（商標）ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ／μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＡＭ２６９６）を加えることによって、３０μＬのＲＴシステムをアセンブルする。次に、変性および二次構造の除去のために７０℃で１分間および９０℃で２０秒間インキュベートし、氷上で急冷する。６μＬの５×ＲＴ緩衝液、１．５μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、１μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ＊Ｉｎ（商標）および１μＬのＳＳＩＶによるＲＴのために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ逆転写酵素（ＳＳＩＶ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ １８０９００５０）を使用する。ＲＴ反応は、５５℃で１５分間、６０℃で１０分間、６５℃で１２分間、７０℃で８分間、７５℃で５分間および８０℃で１０分間インキュベートする。反応を室温まで冷却させてから、０．５μＬのＲＮアーゼＨ（ＮＥＢ）および０．３μＬのＲＮアーゼＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ２２７０）を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。図４Ｅは、ＲＴ工程の間の２つのシナリオを示すことに留意する：１）両末端のライゲーションが成功した場合、ＬＩＡＮＴＩにおける通りＲＴは折り返しループによって初回刺激される可能性がある；２）一方の末端だけでライゲーションが成功した場合、変性工程の前に加えられるＲＮＡ ＲＴプライマーによってＲＴが初回刺激される可能性がある。過剰なＲＮＡプライマーおよびＲＮＡ転写物は、ｃＤＮＡ合成の後に分解される。最後に、２７μＬのＨ２Ｏ、２０μＬの５×Ｑ５緩衝液、２０μＬのＱ５ＧＣエンハンサー、１μＬのＱ５ポリメラーゼおよび１μＬのＳＳＳプライマー（ＮＮＮＮ［ＵＭＩ］ＺＺＺＺＺＺ［３回目のバーコード］ＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧ、ＩＤＴ、標準の脱塩（配列番号５）を加えることによって、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼによって第２の鎖を合成する。結果として生じる二本鎖ＤＮＡはＤＣＣ－５（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４０１４）で精製することができ、シークエンシングアダプターを加えるための最小限の３サイクルのＰＣＲによってＮＥＢＮｅｘｔウルトラＩＩなどのライブラリー調製キットで続行することができる。
Ｐ５末端を有する単一細胞バーコードプライマー（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣ ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ ＮＮＮＮＮＮＮ ＺＺＺＺＺＺ［３回目のバーコード］ＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号６））をゲノムの中の１つの領域のための標的化プライマーと一緒に使用して、標的化シークエンシングを可能にするように、ＳＳＳ工程を容易に改変することができることに留意する価値がある（図３Ｂ）。例えば、レンチウイルスベースのＣＲＩＳＰＲライブラリー（Shalem et al., 2014）を組み入れる適用では、各単一細胞の中のガイドＲＮＡ配列は、レンチウイルス組み入れＣＲＩＳＰＲライブラリープライマー、ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＧ［インデックス１］ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡ（配列番号７））を有するＰ７末端を使用して読み取ることができ、したがって、全ゲノムを配列決定して、特異的目的領域を富化する必要性を回避する。この場合、プライマー二量体を除去するために、ライブラリー調製工程を省略してゲルまたはビーズ精製で置き換えることができる。
ｓｃｉ－Ｌ３－ＲＮＡ／ＤＮＡ共アッセイの方法および分子設計
単一細胞調製およびヌクレオソーム枯渇
下に示す差以外はｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳにおけるのと同じプロトコールで、細胞懸濁液を調製する。ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＪ－５ｔａおよび３Ｔ３細胞をシャーレからトリプシン処理し、１Ｍ／ｍＬの細胞濃度で、室温で１０分間、１×ＰＢＳ中の２％ＰＦＡで固定した。以降のクエンチング（グリシンによる）、洗浄、核単離（０．１％ＩＧＥＰＡＬによる）、ヌクレオソーム枯渇（ｘＳＤＳ方法）工程は、１％Ｓｕｐｅｒａｓｅ－Ｉｎを全ての溶解緩衝液および１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１に加えること以外はｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳと同一である。核は、１μＬにつき２０，０００個の核で、１％Ｓｕｐｅｒａｓｅ－Ｉｎを含む溶解緩衝液に再懸濁させる。
トランスポソームおよび逆転写（ＲＴ）プライマー設計
単一細胞ゲノム増幅構成成分については、トランスポソームの設計およびアセンブリーは、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳと同一である。
単一細胞トランスクリプトームプロファイリング構成成分については、逆転写プライマーは、逆転写態様、すなわちオリゴのポリＴ初回刺激部分のために、（Cao et al., 2017；Cusanovich et al., 2015；Mulqueen et al., 2018；Ramani et al., 2017；Vitak et al., 2017）のｓｃｉ－ＲＮＡ－ｓｅｑに類似の構造を共有するが、以降のライゲーション工程のために異なるバーコード構造およびランディングパッドを含有する（／５Ｐｈｏｓ／ＧＴＣＴＴＧ［ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳの場合と同じランディングパッド配列］ＮＮＮＮＮＮ［特異転写物のタグ付けのためのＵＭＩ１］Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｘ’［トランスクリプトームのための１回目のバーコード、Ｔｎ５トランスポゾンバーコードから異なる配列］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ、ＩＤＴ、標準の脱塩（配列番号８））。
ＲＴおよびタグメンテーション（１回目のバーコード）、ライゲーション（２回目のバーコード）、ＦＡＣＳおよび細胞溶解
次に、ＲＴ工程の準備のために、ｌｏ－ｂｉｎｄ ９６ウェルプレートの各ウェルの中に１．５μＬの核を２０，０００／μＬ濃度で分配し、０．２μＬのＨ２Ｏ、０．３μＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（溶解緩衝液中のＥＤＴＡを中和するために）、０．２５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰおよび上記の１μＬの２５μＭ ＲＴプライマーを加える。次に、二次構造を除去し、氷上で速やかに失活させるために、核混合物を５５℃で５分間インキュベートする。次に、１μＬの５×ＲＴ緩衝液、０．０３μＬの１００ｍＭＤＴＴ（溶解緩衝液からのＤＴＴがある点に留意する、最終濃度５ｍＭ）、０．２５μＬのＳＳＩＶ、０．２５μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１０７７７０１９）を加え、ＲＴ反応のために２５℃で１分間、３７℃で１分間、４２℃で１分間、５０℃で１分間、５５℃で１５分間インキュベートする。次に、各ウェルに０．４μＬのＭｇＣｌ２および３．５２μＬのＨ２Ｏ、および上で調製した１．２μＬのトランスポソームを加える。細胞溶解後までの全ての以降の工程は、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳと同一である。
ギャップ伸長およびインビトロ転写による線形増幅
部分的ＮＥＢＮｅｘｔ読み取りデータ１プライマーを５’オーバーハングとした（ＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ ＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号９））ギャップ伸長のために、ランダム七量体を使用する。１μＬの２０μＭオリゴを加え、ＤＮＡを変性させるために９５℃で３分間インキュベートし、オリゴがアニールするために室温まで徐々に冷却する（約５分間）。次に、２μＬのＨ２Ｏ、０．８μＬの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２、０．４μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．４μＬクレノウ断片（３’→５’エキソ－、ＮＥＢ Ｍ０２１２Ｓ）を加え、３０℃で８分間および７５℃で１０分間インキュベートする。ギャップ伸長の後、２０μＬのＴ７インビトロ転写システムを同じｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳプロトコールによってアセンブルする。
ＲＮＡ精製、ＲＴおよびＳＳＳ
異なるオリゴ配列以外、全ての工程はｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳと同一である。ＩＶＴの後のＲＴ工程で、０．６μＬのＲＮＡ ＲＴプライマーを使用する代わりに、０．６μＬのＮＥＢＮｅｘｔ読み取りデータ１プライマー（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧ ＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ、ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのＰ５末端、ＩＤＴ（配列番号１０））を使用する。ＳＳＳプライマーのために、シークエンシングアダプターを加えるために、ＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ［Ｐ７末端］ＮＮＮＮ［ＵＭＩ２］Ｚ’Ｚ’Ｚ’Ｚ’Ｚ’Ｚ’［３回目のバーコード］ＣＧＴＣＴＣＴＡＣ ＧＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号１１）を使用する。結果として生じる二本鎖ＤＮＡは今やＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのためのＰ５およびＰ７の両末端を含有し、１．１×ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズで精製してシークエンシングに進行することができることに注意すべきである。シークエンシングアダプターを加えるためのライブラリー調製工程およびｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳにおける最小限の３サイクルのＰＣＲは、共アッセイのために不要である。
（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑および（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑におけるｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験のセットアップ
（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）交雑
２つの別個の実験において、それぞれ７０日齢および８８日齢の（Ｂ６×Ｓｐｒｅｔ）Ｆ１雄からの６つおよび３つの副睾丸から単離した細胞をプールし、１％ホルムアルデヒドで固定した。各実験で、ヌクレオソーム枯渇の後、１ウェルにつき３０，０００個の細胞を分配し、１回目のバーコードを加えるために２４ウェルにわたってｉｎ ｓｉｔｕのインデックス付きＴｎ５挿入を実行した。次に全ての細胞をプールし、ライゲーションによって２回目のバーコードおよびＴ７プロモーターを加えるために、これらを６４個のウェルに再分配した。全ての細胞を再びプールした後に、細胞混合物を１：６に分割し、大部分の細胞（６／７）をＦＡＣＳ選別し、残り（１／７）を希釈した。結果として生じたウェルは、１ウェルにつき１００～３６０個の細胞を含有し、概算４～１１％の衝突率であった。
（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑。
６つの精巣から、約１２Ｍ個の１Ｃ円形精子および約０．５Ｍ個の２Ｃ細胞を回収した。しかし、１Ｃ細胞の＞２０倍多い数のために、２Ｃ細胞のために選別した集団において多くの１Ｃ細胞がなお見出された（図８Ｆ）。２Ｃ細胞を富化しようと試みたｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ実験の１つでは、精巣上体から約１６０ｋ個の精子、約１６０ｋ個の１Ｃ円形精子および約７０ｋ個の２Ｃ細胞をタグメントしたと推定し、ｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳのＦＡＣＳ工程の間に２Ｃ細胞のためにさらに富化した（図８Ｇ）。しかし、２回の富化にもかかわらず、１Ｃ細胞はなお優勢であった。
表4. sci-L3のためのオリゴ。









バイオインフォマティクスおよび統計分析の方法
読み取りデータ処理、アラインメントおよびＳＮＶコーリング
ベースコールは、インデックスにおけるエラーのために１つのミスマッチを可能にしたｂｃｌ２ｆａｓｔｑによってｆａｓｔｑファイルに変換した。次に、非多重化するために、カスタマイズしたシェルスクリプト「ｓｃｉ＿ｌｉａｎｔｉ＿ｖ２．ｓｈ」（パイソンスクリプトおよびＲ Ｍａｒｋｄｏｗｎファイルは、「ｓｃｉ＿ｌｉａｎｔｉ＿ｉｎｓｔ．ｔａｒ．ｇｚ」として別々にアップロードされる；全ての主要なおよび補助的図面を生成するための中間データファイルを含有するＲパッケージは、以下のリンク：https://drive.google.com/file/d/19NFubouHrahZ8WoblL-tcDrrTlIZEpJh/view?usp=sharingを通してダウンロードし、インストールすることができる）を使用し、それは以下の工程のためにパイソンスクリプトまたはＮＧＳツールを呼び出す：１）全ての単一細胞コンビナトリアルバーコードが読み取りデータ１（Ｒ１）にあるように、読み取りデータ対を命じる；２）３回目の（ＳＳＳ、６ｎｔ、エラーは許されない）バーコードを非多重化し、転写物のためのバーコードおよびＵＭＩの両方を読み取りデータ名に付け、３回目のバーコードでライブラリーを分割する。１００～３００個の単一細胞を含有する個々のライブラリーの３回目のバーコードによる分割のために、全ての以降の工程は並行して実行されることに留意すべきである；３）Ｒ１における１回目（Ｔｎ５、８ｎｔ、１つのエラーが許される）および２回目（ライゲーション、７ｎｔ、１つのエラーが許される）のバーコードを分割するためにｃｕｔａｄａｐｔを使用し、エラーはＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ距離によって計算し、両ラウンドのバーコードを読み取りデータ名に付ける。この工程は対形成末端モードで実行される、すなわち、Ｒ１が正しいバーコードおよびスペーサー構造を有しない場合は、対形成読み取りデータ２（Ｒ２）は棄却される；４）ｃｕｔａｄａｐｔを使用してＲ２をクリーンアップする；５）対形成末端モードでｂｗａ ｍｅｍを有するｈｇ１９またはｍｍ１０ゲノムに整列させる（Li and Durbin, 2009）。バーコード衝突を調査する実験のために、ｈｇ１９およびｍｍ１０の連結された参照を使用し、特異的に整列させた読み取りデータを使用してヒトまたはマウスゲノムへの相対的なマッピング率を決定する；６）読み取りデータ名に付けられた１回目および２回目のバーコードを使用してｂａｍファイルを単一細胞ｂａｍファイルに分割する；７）ｂｅｄｔｏｏｌ（Quinlan and Hall, 2010）によってｂａｍファイルをｂｅｄファイルに変換し、Ｒ１またはＲ２が同じエンドポイントを共有する場合、特異な挿入部位を決定する。特異なＴｎ５挿入部位は、読み取りデータ対の両末端が異なる必要性がある断片と規定される；８）「ｌｉａｎｔｉ」パッケージ（https://github.com/lh3/lianti/blob/master/pileup.c）（Chen et al., 2017）の「パイルアップ」機能を使用して、対立遺伝子－ａｗａｒｅモードで変異体を呼び出す。この工程で、ＳＮＰコールが最終ｖｃｆファイルに含まれるために各ＳＮＰ位置の深度の閾値がバルクファイルにおいて超えられることだけが必要であり、したがって、変異体がバルクファイルの中でヘテロ接合のＳＮＰとして存在する限り、ＲＥＦおよびＡＬＴ対立遺伝子の生の数値が単一細胞カラムに含まれるように、各単一細胞ｂａｍファイルと合わせたバルクｂａｍファイル（全ての約６９００個の単一細胞のｓａｍｔｏｏｌ併合によって生成される（Chen et al., 2017；Li and Durbin, 2009）、３０×を超える）を含めることに留意する。これは、新規のＳＮＰコーリングクエスチョンを遺伝子タイピングクエスチョンに変換することによって、単一細胞における低深度シークエンシングによる高い偽陰性率の問題を回避する；９）Ｓｐｒｅｔのための参照ＳＮＰ ｖｃｆファイル（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＰｒｏｊｅｃｔからダウンロードされるＳＰＲＥＴ＿ＥｉＪ．ｍｇｐ．ｖ５．ｓｎｐｓ．ｄｂＳＮＰ１４２．ｖｃｆ．ｇｚ）によって各単一細胞においてＳＮＰ品質に関して呼び出されるＳＮＶを注釈する。注釈したＳＮＰファイルは、以降の交差ブレークポイント分析のための入力として次に使用する。
コーリングブレークポイントのためのＨＭＭ
所与のＳＮＰ部位の遺伝子型は、参照および代替の対立遺伝子を裏づける読み取りデータの数を比較することによって決定される。１Ｃ細胞では、交差位置は、３つの状態、参照、代替物およびヘテロ接合体の隠れマルコフモデルをあてはめることによって決定される。
遷移マトリックスは、表５に明記する。
表5.遷移マトリックス。
ＨＭＭがデータ中の明らかな構造をどのくらい良好に捕捉するか、および一次パラメータを２桁変更するときにその結果があまり変化しないという視覚的評価に基づいてパラメータを手動で選択した。任意の個々のＳＮＰ部位での状態遷移は非常に稀な事象であるはずであるという確信を反映するために、ｔｒａｎｓｐｒｏｂは非常に小さい数［１ｅ－１０／この場合（所与の染色体の上のＳＮＰの総数）］をとる。０．３および０．７の割合によるｔｒａｎｓｐｒｏｂのさらなる分解は、参照－代替物－参照または代替物－参照－代替物の形態の速い連続した遷移を抑制することを目指す。
放出マトリックスは、表６に明記する。
表6.放出マトリックス。
各個々のＳＮＰのために隠れた状態が呼び出された後、５０ｋｂより短い状態ブロックを除去することによって連続した長い状態ブロックが呼び出される。ブレークポイント地帯の出発位置が以前の状態ブロックの最後のＳＮＰ位置であり、地帯末端位置が続く状態ブロックの最初のＳＮＰ位置である異なる状態に、長い状態ブロックが切り替わる場所によって、交差位置が次に決定される。
Ｍ２細胞では、平均対立遺伝子頻度は、４０ＳＮＰのウィンドウの中の対立遺伝子にわたって平均することによって先ず得られる。仕分けられた対立遺伝子頻度は、単一のガウス曲線確率分布によって隠れマルコフモデルから根底にある染色体状態を推測するために次に使用される。
遷移マトリックスを、表７に明記する。
表7.遷移マトリックス。
放出マトリックスを、表８に明記する
表8.放出マトリックス。
５０ｋｂより短い状態ブロックを除去することによって連続した長い状態ブロックが呼び出され、次に、長い状態ブロックが異なる状態に切り替わる場所によって、およそのブレークポイント位置が決定される。およそのブレークポイント位置は、およそのブレークポイントの周囲の上流の２０個および下流の２０個のＳＮＰの中で可能性があるブレークポイントを見出すことを目的とした尤度比検定によって次に精密化される。各ＳＮＰについて、観察された遺伝子型を観察する確率は、表９に明記する。
表9.観察された遺伝子型を観察する確率。
エラー－ｐｒｏｂは、ＳＮＰが誤って呼び出される確率を反映する１ｅ－３と規定される。およそのブレークポイントの周囲の各ＳＮＰについて、それが実際のブレークポイントである尤度は、上の分配によって計算される。０．０１＊の最大尤度より大きな尤度を有する全てのＳＮＰは、ブレークポイントの範囲内にあると考えられる。ブレーク地帯の開始は、これらのＳＮＰの中の左端のＳＮＰとして決定され、ブレーク地帯の終わりは右端のＳＮＰとして決定される。１Ｃの場合のように、全てのＭ２細胞ブレークポイント地帯は、例えば２つの直に隣接したスイッチが５０ｋｂ以内に存在するアーチファクトを除去するためにさらに手動で調べられる。我々は、Ｐａｔｓｋｉ細胞を有糸分裂的に分けることにおいて、同じブレークポイントコーリングも実行した。Ｍ２細胞およびＰａｔｓｋｉ細胞については、まばらなゲノムカバレージを有する細胞のために１０および４０個のＳＮＰのビンサイズを比較することによってブレークポイント地帯を手動でさらに調べた。
この工程は、交差ブレークポイントを生成する。動原体領域、すなわち各染色体の開始領域がヘテロ接合（「ｍｔ」、有糸分裂分離）であるかまたはホモ接合（「ｍｅ」、減数分裂分離）であるかに基づいて染色体分離情報を加えるために、後処理をする。
単為生殖染色体の分析
この工程はＨＭＭ出力からｒｄｓファイルをとり、単為生殖染色体コールを生成する。
染色体レベルの減数分裂交差および染色体分離の分析
この工程は、図１０、１３および１４に示す減数分裂交差の染色体レベルの特徴を生成する。
（Ｂ６×Ｃａｓｔ）交雑のバーコード第２群の２Ｃ細胞に有限混合物モデルをあてはめる
均等分離する染色体のそれらの確率を表しているｐ１、ｐ２、ｐ３によってそれぞれパラメータ化される、３つの二項分布の混合物にデータをあてはめた。これらの３つの二項分布の相対寄与は、長さ３のベクターシータによって表される。Ｒパッケージｒｓｔａｎ（http://mc-stan.org/users/interfaces/rstan）をθのために先行する均一なＤｉｒｉｃｈｌｅｔ：θ～Ｄｉｒ（Ｋ＝３、α＝１）およびｐのために先行するベータ：ｐ～ベータ（ａ＝５、ｂ＝５）と使用して、それらの後方分布から試料を描画することによって、ｐ１、ｐ２、ｐ３ならびにθを推定する。モデル仕様に関するさらなる詳細については、Ｓｔａｎファイルｍｔ＿ｍｉｘｔｕｒｅ＿ｍｏｄｅｌ．ｓｔａｎを参照する。
交差ホットニスおよび細胞クラスタリングの線形モデルを構築するための他のゲノム研究からのデータセットの前処理。
我々は、様々なゲノムエレメントに関して、以前のゲノム研究からの、ならびにダウンロードされたｇｆｆ３フォーマットのマウスアノテーションファイルおよびＵＣＳＣゲノムブラウザーからのＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）からのデータセットを処理した。ｍｍ９に基づくデータセットを、ｍｍ１０に先ず上げる。これらのデータセットは、２つのカテゴリーにだいたい分類される：ｂｅｄフォーマットの数値データまたはｂｅｄＧｒａｐｈフォーマットの様々な遺伝子もしくは後成的マークのシグナル。細胞クラスタリングおよび予測モデル化では、交差地帯は異なる長さを有する。細胞クラスタリング分析のために各単一細胞における全ての交差から合計される配列の全量を分けることによって数値データを正規化し、および極めて短い地帯が過剰に重み付けされないように、各交差地帯またはランダム採取地帯のために地帯長プラス１ｋｂを分けることによって正規化する。１ｋｂを加えることが大いに余分の配列を含まないように、中間の地帯長は１５０ｋｂであることに留意すべきである。様々なマークの連続的シグナルを有するデータセットについては、交差またはランダム地帯を横切るマークの平均シグナルをとる。交差パイルアップデータセットについては、均一サイズの１００ｋｂのウィンドウを使用したので、数値データを使用するときに地帯長を正規化しなかった。
フィーチャーが交差の存在と統計的に有意な関連を有する、考察のセクションで指摘するデータセットに加えて、以下のデータセットも使用した：１）配列分散（Lilue et al., 2018）；２）精製されたパキテン期精母細胞からマッピングしたＡＴＡＣ－ｓｅｑおよびＨ３Ｋ２７ａｃ（Maezawa et al., 2018）；３）精原細胞からの重亜硫酸シークエンシング（Inoue et al., 2017）；４）精母細胞におけるＭＮａｓｅベースのヌクレオソーム位置決め（Barral et al., 2017）；５）精母細胞におけるＨ４Ｋ５およびＨ４Ｋ８のブチリル化およびアセチル化（Goudarzi et al., 2016）；６）精母細胞におけるＨ２Ａユビキチン化（Hasegawa et al., 2015）；７）ＣＴＣＦＬの結合性部位、ＣＴＣＦの結合性部位の精巣特異的パラログ（Sleutels et al., 2012）；８）パキテン期精母細胞における５－ｈｍＣマップ（Gan et al., 2013）；９）エトポシド処理の後の末端－ｓｅｑならびに活性化Ｂ細胞におけるＣＴＣＦおよびＲＡＤ２１ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、ＭＥＦにおけるＴＯＰ２ＡおよびＴＯＰ２ＢＣｈＩＰ－ｓｅｑ（Canela et al., 2017）；１０）Ｐａｔｓｋｉ対立遺伝子のＡＴＡＣ－ｓｅｑデータ（Bonora et al., 2018）。
細胞クラスタリングのためのＰＣＡ、交差ホットニスの線形モデルのためのＢＭＡ、ならびに交差およびランダム地帯の予測モデルのためのランダムフォレスト
それらのブレークポイントフィーチャーに基づいて１ＣおよびＭ２細胞の分離を２Ｄで可視化するために、主成分分析を使用する。各単一細胞について、３タイプに対応する合計７８個のフィーチャーの交差関連情報を集めた。最初のタイプとして、各細胞の各染色体のために交差または全染色体ＬＯＨ事象の数を単に計算した。第２のタイプとして、ＧＣ含有量、配列分散、クロマチンマークの強度等のフィーチャーのために、各細胞における交差ブレークポイントの中間値を計算した。第３のタイプとして、各細胞における、遺伝子体、末端反復配列（ＬＴＲ）、交差ブレークポイントと重なったＬＩＮＥエレメントなどのゲノムエレメントの正規化された数値を計算した。
交差ホットニスを予測する線形モデルを構築するために、「ｂａｓ」パッケージ（Ｃｌｙｄｅら、２０１１）を使用したベイズモデル平均化を使用し（デフォルト設定で機能ｂａｓ．ｌｍは２１４モデルから試料を採取する）、ホットニスの予測にとって重要な変数をそれらの境界線上の包含確率に基づいて同定する。ランダムフォレストは、「ヌル」分布に類似するゲノムからランダムに採取される地帯から真の交差地帯を区別するように訓練される。モデル精度は、外部５倍および各訓練セットの中で５倍の、完全にネスト状の５倍の交差検証によって決定される（Ｒコードおよびアノテーションについてはｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ－ｆｉｇｕｒｅｓ．Ｒｍｄの中の「モデル」と呼ばれるセクションを参照する）。
染色体に沿って右端の交差を位置決めすることに及ぼす系統（または、細胞型）の影響を推定するために、染色体間変動性を説明するために、系統（または、細胞型）への固定された作用および染色体へのランダム遮断を有する線形混合作用モデルを使用する（Ｒコードおよびアノテーションについてはｓｃｉ－Ｌ３－ＷＧＳ－ｆｉｇｕｒｅｓ．Ｒｍｄの中の「核型プロット」と呼ばれるセクションを参照する）。
参考文献
本明細書に引用される全ての特許、特許出願および公開、ならびに電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列提出物、ならびに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢのアミノ酸配列提出物、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑの注釈付きのコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、参照により完全に組み込まれる。刊行物に参照される補助資料（補足表、補足図面、補足材料および方法および／または補足実験データなど）は、同様に参照により完全に組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示（複数可）の間にいかなる不一致も存在する場合には、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な記載および実施例は、理解の透明性のためだけに与えられる。不必要な限定はそこから理解されるべきでない。当業者にとって明らかな変形形態は請求項によって規定される本開示の中に含まれるので、本開示は、示され、記載される正確な詳細に限定されない。
別途指示がない限り、本明細書および請求項で使用される、構成成分の量、分子量などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されることを理解するべきである。したがって、別途逆指示がない限り、本明細書および請求項で示される数字パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性によって異なってもよい近似値である。少なくとも、および同等物の原則を請求項の範囲に限定しようとするものではないが、各数字パラメータは、少なくとも報告される有効桁数に照らして、および通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。
本開示の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に示す数値はできるだけ正確に報告される。しかし、全ての数値は、それらのそれぞれの試験測定値で見出される標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を本来的に有する。
指定されない限り、全ての見出しは読者の便宜のためであり、見出しに続く本文の意味を限定するために使用するべきではない。

Claims (9)

  1. 複数の細胞からの核酸を含むシークエンシングライブラリーを調製するための方法であって、以下：
    （ａ）複数の細胞からの単離された核を提供する工程；
    （ｂ）第１の複数のコンパートメントに単離された前記核を分配する工程であって、ここで、各コンパートメントが単離された核のサブセットを含む、工程、および各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させる工程であって、ここで、各コンパートメントの中の前記トランスポソーム複合体が、トランスポザーゼ、他のコンパートメントの中の第１のインデックス配列と異なる第１のインデックス配列、および少なくとも１つの遍在配列を含む、工程；
    （ｃ）ヌクレオソームが枯渇された核の前記サブセットの中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第１のインデックス配列を前記核酸断片の少なくとも１つの鎖に組み込んでインデックス付きの核酸断片を含むインデックス付きの核を生成する工程；
    （ｄ）インデックス付きの前記核を合わせてプールされたインデックス付きの核を生成する工程；
    （ｅ）プールされたインデックス付きの前記核のサブセットを第２の複数のコンパートメントに分配する工程；
    （ｆ）各コンパートメントの中のインデックス付きの前記核酸断片に第２のインデックス配列を組み込んで二重インデックス付きの核酸断片を生成する工程であって、ここで、前記第２のインデックス配列が各コンパートメントに特異である、工程；
    （ｇ）二重インデックス付きの前記核を合わせて、プールされた二重インデックス付きの核を生成する工程；
    （ｈ）プールされた二重インデックス付きの前記核のサブセットを第３の複数のコンパートメントに分配し、二重インデックス付きの前記核を溶解して、線形増幅により二重インデックス付きの核酸断片を増幅する工程；
    （ｉ）各コンパートメントの中の二重インデックス付きの前記核酸断片に第３のインデックス配列を組み込んで三重インデックス付きの核酸断片を生成する工程であって、ここで各コンパートメントの中の前記第３のインデックス配列が、他のコンパートメントの中の第１および第２のインデックス配列と異なり、かつ各コンパートメントの中の前記第３のインデックス配列が、他のコンパートメントの中の第３のインデックス配列と異なる、工程；
    （ｊ）三重インデックス付きの前記核酸断片を合わせてプールされた三重インデックス付きの核酸断片を生成し、それにより複数の前記核からのシークエシングライブラリーを産生する工程、
    とを含む、方法。
  2. 単離された前記核が、ヌクレオソーム無しである、請求項１に記載の方法。
  3. 単離された前記核の完全性を維持しつつヌクレオソームが枯渇された核を生成する条件に、工程（ｂ）の前に、単離された前記核を付すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記遍在配列が、遍在プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 工程（ｃ）のインデックス付きの前記核酸断片が、前記トランスポザーゼに付着したままであり、そのため同じゲノムＤＮＡ分子に由来する核酸断片が物理的に連結されたままである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記トランスポザーゼをインデックス付きの前記核酸断片から解離させることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 工程（ｆ）が、インデックス付きの核酸断片の片方または両方の末端へのヘアピンライゲーション二重鎖のライゲーションに適する条件の下で各サブセットをヘアピンライゲーション二重鎖と接触させて、二重インデックス付きの核酸断片をもたらすことを含み、ここで、前記ヘアピンライゲーション二重鎖が、前記第２のインデックス配列を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 工程（ｈ）の後および工程（ｉ）の前に、二重インデックス付きの前記核酸断片の人為操作をさらに含み、ここで前記人為操作が、ギャップ伸長、インビトロ転写、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 工程（ｉ）の組み込むことが、第２の鎖の合成を含む、請求項１に記載の方法。
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