JP7638481B2

JP7638481B2 - 生体由来物質の濃縮方法

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Publication number: JP7638481B2
Application number: JP2023119156A
Authority: JP
Inventors: 純子大室; 泰彦田畑
Original assignee: Yamato Scientific Co Ltd
Current assignee: Yamato Scientific Co Ltd
Priority date: 2023-07-21
Filing date: 2023-07-21
Publication date: 2025-03-04
Anticipated expiration: 2043-07-21
Also published as: JP2025016103A

Description

本発明は、細胞外小胞（ＥＶ、例えば、エクソソーム）などの生体由来物質を簡便に濃縮するための生体由来物質の濃縮方法に関する。

従来、温度やｐＨ、有機溶剤の存在などといった、環境因子の影響を受けやすい生体由来物質（例えば、タンパク質やウイルス、ＥＶなど）を、生物活性を維持したまま、液体試料中から回収／濃縮する技術が提案されている。

即ち、生体由来物質を回収／濃縮する技術としては、超遠心分離法、限外ろ過法、サイズ排除クロマトグラフィ法、および、アフィニティを利用した精製法などがよく知られており、試料の特性や後処理、操作時間やコストなどに応じて適した手法が用いられる。また、特殊な装置を必要とせず、低コストで実施可能な回収／濃縮方法として、排除体積効果を利用したポリマー沈殿法や水性二相系（ＡＴＰＳ）を利用した分配法もある。

なお、ＥＶに関して言及すると、Total Exosome Isolation Reagent （Invitrogen）やExoQuickシリーズ（System Biosciences）など、ポリマー沈殿法を用いた回収／濃縮キットが市販されている。

特許第６９３２５２９号公報韓国登録特許第１０－１７６１６８０号韓国登録特許第１０－１７４５４５５号特表２０２２－５０８１２２号公報国際公開第２０１９／１６０５１９号特許第５２７１３５４号公報

H. Shin et al., "High-yield isolation of extracellular vesicles using aqueous two-phase system", (2015) Scientific Reports, 5: 13103 J. Kim et al., "Isolation of High-Purity Extracellular Vesicles by Extracting Proteins Using Aqueous Two-Phase System", (2015) PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0129760. A. Torres-Bautista et al., "Characterization and optimization of polymer-polymer aqueous two-phase systems for the isolation and purification of CaCo2 cell-derived exosomes", (2022) PLoS ONE 17(9): e0273243. Y. Weng et al., "Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling", (2016) Analyst, 141: 4640-4646 T. Nezu & H. Maeda., "Phase Separation Coupled with Gelation in Polyethylene Glycol-Gelatin-Aqueous Buffer System", (1991) Bulll Chem. Soc. Jpn, 64: 1618-1622 M. Yanagisawa, et al., "Phase separation in binary polymer solution: Gelatin/Poly(ethylene glycol) system", (2014) Journal of Molecular Liquids 200: 2-6

従来の、生体由来物質を回収／濃縮するための、排除体積効果を利用したポリマー沈殿法や水性二相系を利用した分配法の場合、いずれも特殊な装置を必要とせずにスケールアップ／ダウンが比較的容易で、かつ、低コストという利点を有する。

しかしながら、前者は、操作が非常に簡便ではあるものの、目的物質の回収効率向上のためには、目的物質を排除体積効果によって遠心沈降可能なサイズにまで凝集させるインキュベーション工程や、小型の凝集物まで沈殿させる遠心分離工程に長い時間を要する。

後者は、速やかな二相形成を利用するため（数十秒間程度）、短時間で目的物質を二相（層）分配できるものの、ある程度の修練が必要であった。即ち、水と有機溶媒との二相系とは異なり、二相とも水相であるために相間の界面張力が小さく、界面を乱さずに目的物質を優先的に含む相のみを分け取る操作は非常に困難を要する。

また、後者において、目的物質の回収効率向上のためには、分散するドロップレット（微小液滴）を残さず集めて各相を二層へと分離させることが重要となる。相間界面張力の増加や二層分離の促進にはポリマー濃度の増加が有効ではあるが、ポリマー濃度の増加は同時に水溶液の粘性を増加させることになるため、回収効率と操作性とを共に向上させることが難しいという課題があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、液体試料から生体由来物質を迅速、かつ、簡便に、高効率で回収／濃縮することが可能な生体由来物質の濃縮方法を提供することにある。

上記課題を達成するため、本発明の第１の態様は、生体由来物質の濃縮方法であって、前記生体由来物質を含む液体試料に、高分子クラウダーと可逆的なゾル／ゲル変換特性を有するゲル形成ポリマーとを添加し、撹拌する工程と、遠心分離によって、前記液体試料を高分子クラウダー相からなる高分子クラウダー層およびゲル形成ポリマー相からなるゲル形成ポリマー層を含む、多層に分離する工程と、前記ゲル形成ポリマー層のゲル化を誘導する工程と、ゲル化された前記ゲル形成ポリマー層を分け取る工程と、を備え、前記生体由来物質は、細胞外小胞であり、前記高分子クラウダーは、分子クラウディング効果を有するポリマーであって、平均分子量が８，０００～３５，０００で、終濃度が５～１５％のＰＥＧであり、前記ゲル形成ポリマー相は、繰返しゾル／ゲル転換可能なポリマーであって、平均分子量が１０，０００～１００，０００で、終濃度が０．１～０．５％のゼラチンであることを特徴とする。

また、本発明の第２の態様は、生体由来物質の濃縮方法であって、前記生体由来物質を含む液体試料に、高分子クラウダーと可逆的なゾル／ゲル変換特性を有するゲル形成ポリマー相とを添加し、撹拌する工程と、前記ゲル形成ポリマー相のドロップレットのゲル化を誘導する工程と、遠心分離によって、前記液体試料を高分子クラウダー相からなる高分子クラウダー層およびゲル化されたゲル形成ポリマー層を含む、多層に分離する工程と、ゲル化された前記ゲル形成ポリマー層を分け取る工程と、を備え、前記生体由来物質は、細胞外小胞であり、前記高分子クラウダーは、分子クラウディング効果を有するポリマーであって、平均分子量が８，０００～３５，０００で、終濃度が５～１５％のＰＥＧであり、前記ゲル形成ポリマー相は、繰返しゾル／ゲル転換可能なポリマーであって、平均分子量が１０，０００～１００，０００で、終濃度が０．１～０．５％のゼラチンであることを特徴とする。

本発明によれば、液体試料から生体由来物質を迅速、簡便、かつ、高効率で回収／濃縮することが可能な生体由来物質の濃縮方法を提供できる。

本発明の実施形態に係る生体由来物質の濃縮方法をドロップレット分離する場合を例に示す図（実施例１）である。本発明の実施形態に係る生体由来物質の濃縮方法をマイクロゲル分離する場合を例に示す図（実施例２）である。検証１の結果を示すグラフであって、実施例２に係るゼラチン－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ＡＴＰＳを例に、ゼラチン相をマイクロゲル化することで二層分離可能なポリマー濃度域がポリマー低濃度域へ拡張されることを示すもので、図（ａ）は、ゼラチン１００ｋとＰＥＧ３５ｋとからなるＡＴＰＳの場合であり、図（ｂ）は、ゼラチン１００ｋとＰＥＧ８ｋとからなるＡＴＰＳの場合であり、図（ｃ）は、ゼラチン２０ｋとＰＥＧ８ｋとからなるＡＴＰＳの場合である。検証２の結果を示すグラフであって、実施例２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを例に、マイクロゲル化後に遠心分離することで、より高比率のゼラチンが下層（沈殿物）として分離されることを示すもので、図（ａ）は、ゼラチン１００ｋとＰＥＧ３５ｋとからなるＡＴＰＳの場合であり、図（ｂ）は、ゼラチン１００ｋとＰＥＧ８ｋとからなるＡＴＰＳの場合であり、図（ｃ）は、ゼラチン６０ｋとＰＥＧ８ｋとからなるＡＴＰＳの場合であり、図（ｄ）は、ゼラチン２０ｋとＰＥＧ８ｋとからなるＡＴＰＳの場合であり、図（ｅ）は、ゼラチン１０ｋとＰＥＧ８ｋとからなるＡＴＰＳの場合である。検証３の結果を示すものであって、実施例１，２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを対象に、ゼラチン相をマイクロゲル化することでＥＶ回収率が増加することを、従来と対比して示すグラフである。検証４の結果を示すものであって、実施例２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを対象に、ゼラチン相をマイクロゲル化することでＥＶ回収率の増加と併せてウシ血清タンパク質のコンタミ率の低減がもたらされることを、従来と対比して示すグラフである。検証５の結果を示すものであって、実施例２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを用いた濃縮法でのＥＶ回収率を、他の濃縮方法によるＥＶ回収率と対比して示すグラフである。

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態に係る生体由来物質の濃縮方法について説明する。なお、実施の形態（態様）において、図面は、発明の概要を模式的に示すものであって、実際のものとは異なるものであることに留意すべきである。

用語の説明
まず、実施形態に係る生体由来物質の濃縮方法の説明を行う前に、本明細書の記載において使用される用語について説明する。本明細書中の記載において、特に断りがない限り、用語は、この項の記載に基づいて解釈される。

生体由来物質とは、生体から回収された物質の総称であり、生体を構成する細胞や生体から分泌された小胞、および、生体内で合成・分解された（高分子）化合物などを含む。具体的には、細胞、血球、ウイルス、細胞小器官、細胞外小胞、細胞外膜小胞、および、タンパク質などを含む。

液体試料とは、培養細胞や生物（個体）から採取される液体成分の試料である。具体的には、細胞培養系においては馴化培地や細胞溶解液といった液体成分であり、動物個体から採取される液体成分としては、血清、血漿、リンパ液、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、および、間質液などを含み、植物個体から採取される液体成分としては、果汁、間質液、導管液、および、師管液などを含む。

高分子クラウディング（高分子混みあい）とは、近年、材料科学やバイオ関連分野において注目を集めている生物物理学的現象であり、排除体積効果によって分子が占有できる体積を制限することで、分子の会合や折り畳みが促進される。

ここで、分子クラウディング効果を有するポリマー、即ち高分子クラウダーは、通常、分子量が約５，０００以上、濃度が約５％以上で、高分子のクラウディング状態を作り出す。高分子クラウダーとしては、例えば、ポリエチンレングリコールやポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、デキストラン（ＤＥＸ）、および、フィコールが挙げられる。

本実施形態で使用される高分子クラウダーとしては、好ましくは、ＰＥＧやＰＶＡである。詳細については後述するが、本発明の目的を達するために、望ましいＰＥＧの平均分子量は３，０００～５０，０００であり、さらに好ましくは８，０００～３５，０００である。

可逆的ゲル形成ポリマーは、一定の条件下で、ポリマー間／内に部分的に架橋を形成し、内部に多くの水分子を保持したメッシュワーク構造（ゲル）を構築できるポリマーのうち、繰返しゾル／ゲル転換可能なポリマーである。繰返しゾル／ゲル転換可能なポリマーとしては、例えば、ゼラチンやアルギン酸塩、アガロースなどが挙げられる。

本実施形態で使用されるゲル形成ポリマーとして、好ましくは、ゼラチンやアルギン酸塩である。ゼラチンやアルギン酸塩は、生体内での分解が可能で、安全性が高く、食用・工業用のみならず、医療分野においても幅広く利用されている生体適合性ポリマーである。

ゼラチンのゾル／ゲル変換特性は、原材料となる生物種や分子量などにも影響されるが、本実施形態で使用されるゼラチンは４℃～３７℃の間に凝固点と融点とを有すれば、原材料や分子量、等電点はいずれでも良い（ウシやブタ由来のゼラチンの凝固点は２３－３０℃、融点は３０－３５℃程度）。詳細については後述するが、本発明の目的を達するために、好ましいゼラチンの分子量は１０，０００～１００，０００である。

エマルジョン状態とは、水性二相系を懸濁することによって、液量の多い相の中に液量の少ない相がドロップレット（または、マイクロゲル）として分散した状態であり、ドロップレット（または、マイクロゲル）が光を散乱することで白濁して見えることがある。

二相の比重の違いによって、系に分散したドロップレットを一つのまとまり（多くの場合、層）として分離させることを、二層分離と呼ぶ。ドロップレットが分散したままでは、ドロップレットのみを選択的に回収するのは困難である。そのため、効率的な二層分離の工程（操作）が大切となる。

後述する本実施形態に係る生体由来物質の濃縮方法においては、排除体積効果の高い高分子クラウダーと可逆的ゲル形成ポリマーとを組み合わせた水性二相系を用いた生体由来物質の濃縮と、ゾル／ゲル変換特性を利用した生体由来物質の分離・回収と、を特徴とする。

ここで、生体由来物質を濃縮するとは、液体試料よりも高濃度の生体由来物質を含む液体を調製することを意味する。

本実施形態による生体由来物質の濃縮方法は、複数段階精製の初期段階目の精製として用いられ得る。具体的には、生体由来物質を含む液体試料とゲル形成ポリマーおよび高分子クラウダーとを混ぜ、撹拌することで、エマルジョン化した水性二相系を調製する工程を含む。

撹拌方法は特に限定されず、エマルジョンの形成が可能であれば、ボルテックスミキサーによる撹拌であっても、ピペッティングによる撹拌であっても、転倒混和であっても良い。

系としては、少なくともゲル形成ポリマー相（ゲル形成ポリマー層）および高分子クラウダー相（高分子クラウダー層）を含む。高分子クラウダー相は、主として高分子クラウダーを含む液相であり、微量のゲル形成ポリマーを含み得るが、その濃度は、本発明の目的を達するために、ゲル形成濃度未満でなくてはならない。

ゲル形成ポリマー相は、主としてゲル形成ポリマーを含む液相であり、好ましくは、実際は高分子クラウダーを含まない。ここでの「実際は高分子クラウダーを含まない」とは、本発明の作用・効果を失わない程度の微量の高分子クラウダーを含み得ることを意味する。

本発明の目的を達するためには、高分子クラウダー相中にゲル形成ポリマー相のドロップレットが分散した方が好ましい。

特に、ゲル形成ポリマー相および高分子クラウダー相の二相が形成されるまでは、ゲル形成ポリマーとしては、一相のままでのゲル化を起こさずに、ゾル状態を維持させる必要がある。即ち、ゲル形成ポリマーは、ゲル形成可能な濃度よりも低く、かつ、二相形成により初めてゲル形成ポリマー相中のゲル形成ポリマー濃度がゲル形成可能な濃度まで濃縮されるように、系の終濃度を設定する必要がある。

加えて、高分子クラウダー相は、生体由来物質とゲル形成ポリマーとを高分子クラウダー相から排斥し、かつ、ゲル形成ポリマー相のゲル形成ポリマー濃度をゲル化可能な濃度まで濃縮させるように、系の終濃度を設定する必要がある。

そこで、望ましくは、高分子クラウダー相よりもゲル形成ポリマー相の方が比重は高く、遠心分離工程後には、ゲル形成ポリマー相が沈降するように、系のゲル形成ポリマーの終濃度が設定される。例えば、ゲル形成ポリマーがゼラチンの場合、ゼラチンの終濃度は、０．０５％～５．０％の範囲内であることが好ましい。さらに好ましくは、０．１～０．５％である。これに対し、高分子クラウダーがＰＥＧの場合、ＰＥＧの終濃度は、１～２０％の範囲内であることが好ましい。さらに好ましくは、５～１５％である。

なお、液体試料と混合されるゲル形成ポリマーおよび高分子クラウダーは、固体であっても良いし、液体であっても良い。また、ゲル形成ポリマーまたは高分子クラウダーを溶媒に溶解してから、液体試料と混合するようにしても良い。

溶媒としては、水、生理食塩水、細胞培養培地、および、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））などから、濃縮する生体由来物質に適した溶媒を選択する。

本実施形態においては、エマルジョン化した水性二相系を調製する工程の後に、ゲル形成ポリマー相をゲル化させる工程を含む。ゲル化工程は、ゲル形成ポリマーのゾル／ゲル変換特性にしたがい、例えば、ゼラチンであれば冷却（ゲル化温度以下、０℃以上）、アルギン酸塩であればカルシウムイオン濃度の増加などが挙げられる。

本発明の目的を達するためには、生体由来物質を優先的に含む相を分け取るまでは、ゲル化状態を維持する（ゲル化条件を保つ）必要がある。

本実施形態においては、ゲル形成ポリマー相をゲル化させた後の工程として、ゲル形成ポリマー相を回収する工程を含む。ゲル形成ポリマー相の回収は、ゲル形成ポリマー相の全部または一部を高分子クラウダー相から分けて取得できる限り、その方法に制限されない。即ち、回収方法としては、例えば、ゲル形成ポリマー相と高分子クラウダー相とを二層分離させた後、高分子クラウダー相を吸引やデカントで除去し、ゲル形成ポリマー相だけを残すことを含む。

なお、本実施形態においては、系の二層分離を促進するために、遠心分離させる工程を含んでも良い。例えば、ゲル形成ポリマー相をドロップレットのまま分離する場合には、エマルジョン化の工程とゲル形成ポリマー相のゲル化の工程との間に、また、ゲル形成ポリマー相をマイクロゲル化して回収する場合には、マイクロゲル化の工程と回収の工程との間に、それぞれ遠心分離の工程が入り得る。

遠心処理の条件としては、系のサイズにも依存するが、遠心加速度の範囲は１，０００～１０，０００ｘｇ、時間は１～１０分間であれば良い。また、温度は、ゼラチンのようにゲル化条件が温度である場合にはゲル化温度に制約されるが、特に制約がない場合には、好ましくは４℃である。

さらに、本実施形態においては、ゲル形成ポリマー相のゲル／マイクロゲルを回収した後に、ゲルを再融解するゾル化誘導の工程を含んでも良い。ゾル化誘導の工程は、ゲル形成ポリマーのゾル／ゲル変換特性にしたがい、例えば、ゼラチンであれば加温（ゾル化温度以上、望ましくは３７℃以下）、アルギン酸塩であればカルシウムイオンキレータ（ＥＤＴＡなど）の添加によるカルシウムイオン濃度の低下などが挙げられる。ゲル形成ポリマー相の再ゲル化を妨げるために、適宜、溶媒で希釈するようにしても良い。

実施形態
以下に、ポリマー沈殿のメカニズムの一つである排除体積効果による粒子の排斥と、水性二相系の速やかな二相形成、そしてゲル形成ポリマーの可逆的なゾル／ゲル変換特性を組み合わせることで、簡便、かつ、効率的な生体由来物質の回収／濃縮の方法について説明する。

実施例１
図１は、本実施形態に係る生体由来物質の濃縮方法について、ドロップレット分離する場合を例に説明するための図である。

まずは、例えば図１に示すように、生体由来物質を含む液体試料に、高分子クラウダーと可逆的なゾル／ゲル変換特性を有するゲル形成ポリマーとを添加し、撹拌する（１）。これにより、高分子クラウダー相の中にゲル形成ポリマー相のドロップレット（ゾル）が分散したエマルジョン状態（二相形成）を得る。高分子クラウダー相は、以降の工程間において、常に液相の状態を維持する。

次いで、遠心分離によって、高分子クラウダー相とゲル形成ポリマー相とを上層／下層の二層へと分離する（２－ａ）。

そして、ゲル形成ポリマーのゲル化を誘導し、下層のゲル形成ポリマー相のみをゲル化する（３－ａ）。

この後、下層のゲル形成ポリマー相（ゲル相）と上層の高分子クラウダー相（液相）とを分け取り、ゲル形成ポリマー相を回収（下層回収）する（４－ａ）。

最後に、必要に応じて、回収したゲル形成ポリマー相のゲルを再びゾル化／融解させ、濃縮された生体由来物質の液体試料（サンプル）を得る（５）。このサンプルは、適宜、緩衝液（ＰＢＳなど）で希釈し、ゲル形成ポリマーの濃度を下げても良い。

本実施例１によれば、液体試料から生体由来物質を迅速に、かつ、高効率で濃縮することができる。

実施例２
図２は、本実施形態に係る生体由来物質の濃縮方法について、マイクロゲル分離する場合を例に説明するための図である。

まずは、例えば図２に示すように、生体由来物質を含む液体試料に、高分子クラウダーと可逆的なゾル／ゲル変換特性を有するゲル形成ポリマーとを添加し、撹拌する（１）。これにより、高分子クラウダー相の中にゲル形成ポリマー相のドロップレット（ゾル）が分散したエマルジョン状態（二相形成）を得る。高分子クラウダー相は、以降の工程間において、常に液相の状態を維持する。

次いで、ドロップレットのゲル化を誘導し、ゲル形成ポリマー相のマイクロゲルを調製する（２－ｂ）。

そして、ゲル形成ポリマー相をマイクロゲル化した後、遠心分離によって、高分子クラウダー相からマイクロゲルを沈殿（二層分離）させる（３－ｂ）。

この後、下層のゲル形成ポリマー相のマイクロゲル（沈殿物）と上層の高分子クラウダー相（上清）とを分け取り、マイクロゲルを回収（沈殿回収）する（４－ｂ）。

最後に、必要に応じて、回収したゲル形成ポリマー相のマイクロゲルを再びゾル化／融解させ、濃縮された生体由来物質の液体試料（サンプル）を得る（５）。このサンプルは、適宜、緩衝液（ＰＢＳなど）で希釈し、ゲル形成ポリマーの濃度を下げても良い。

本実施例２によれば、液体試料から生体由来物質を迅速に、かつ、高効率で濃縮することができる。

上記したように、高い排除体積効果を有する高分子クラウダーによって排斥された生体由来物質が、それのみで沈殿可能なサイズにまで凝集するには時間を要するが、高分子クラウダーと組み合わせることにより二相形成が可能なゲル形成ポリマーをさらに加えることで、液体試料から生体由来物質を迅速に、かつ、高効率で濃縮することができる。

即ち、実施例１，２においては、ゲル形成ポリマーとの親和性が高い生体由来物質が、ゲル形成ポリマー相内へと排斥（分配）される際に、生体由来物質を含んだゲル形成ポリマー相のドロップレットが速やかに形成される（水性二相系の迅速性）。

しかも、ドロップレッドがゲル形成ポリマー相内に取り込まれない場合でも、ゲル形成ポリマー相のドロップレットが形成されることで、高分子クラウダーと生体由来物質との占有可能な空間が制約され（有効濃度が上昇し）、さらに、排除体積効果による生体由来物質の凝集場となる界面（ドロップレットの表面）が多量に形成されるとともに、ドロップレット同士の自発的な融合の繰り返しによって界面上の生体由来物質の凝集が加速することから、速やか、かつ、効率的に排除体積効果による物質の凝集が促進される。

さらに、相間の界面張力が小さいために二相の分け取りが困難であるという水性二相系の弱点も、ゲル形成ポリマーの性質（可逆的なゾル／ゲル変換特性）を利用して、一相をゲル相に変換することで克服される（操作性の向上）。

ゲル化誘導の工程を挿入し得るタイミングは二通りの可能性があり、一方は二層分離の工程と相の分取の工程との間（実施例１）、他方はエマルジョン化の工程と二層分離の工程との間（実施例２）であり、いずれも後に続く回収相のみの分取操作が容易になる。

特に、後者の場合には、ゲル化誘導によって、高分子クラウダー相中に分散したまま分離／回収できずに残留していたゲル形成ポリマーやゲル形成ポリマー相のドロップレットが分離／沈殿されやすくなる（二相形成並びに二層分離の効率向上）。これにより、従来の水性二相系において利用可能な至適ポリマー濃度域を下げることが可能となり、系の粘度低下も操作性の向上に繋がる。

具体例
以下において、ゲル形成ポリマーとしてゼラチンを、高分子クラウダーとしてＰＥＧを、それぞれ用いて、生体由来物質としてＥＶを濃縮する方法について、具体的に説明する。なお、本実施形態の態様は、この具体例のみに限定されるものではない。

上述したように、ゼラチンは、ＰＥＧやＰＶＡなどの高分子クラウダーと組み合わせることで、水性二相系を構築することができる。両ポリマーの種類や分子量、系全体の終濃度を調整することで、系の中にゼラチン相がドロップレットとして分散する状態を作り出す。

例えば、平均分子量が１０，０００、２０，０００、６０，０００、および、１００，０００のゼラチン（新田ゼラチン社製で、いずれも等電点は５）を、それぞれＰＢＳで膨潤させ、３７℃で、１時間、加温しながら撹拌する。そして、５％（ｗ／ｗ）のゼラチン１０ｋ溶液と、５％（ｗ／ｗ）のゼラチン２０ｋ溶液と、５％（ｗ／ｗ）のゼラチン６０ｋ溶液と、５％（ｗ／ｗ）のゼラチン１００ｋ溶液と、を調製した。

同様に、例えば、平均分子量が８，０００のＰＥＧ（MP Biomedicals）と、平均分子量が３５，０００のＰＥＧ（Sigma-Aldrich）と、平均分子量が５０，０００のＤＥＸ（MP Biomedicals）と、をそれぞれＰＢＳで膨潤させ、室温でしっかり撹拌する。そして、２０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ８ｋ溶液と、２０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ３５ｋ溶液と、１０％（ｗ／ｗ）のＤＥＸ５０ｋ溶液と、を調製した。

これに対し、ヒト脂肪由来の間葉系幹細胞ｈＡＤＳＣの馴化培地（ＭＥＭ－α；GIBCO）／培養上清から２段階の低速の遠心分離（それぞれの条件は、４℃、２，０００ｘｇ、２０分間、および、４℃、１０，０００ｘｇ、３０分間）により、混在した死細胞や細胞断片を取り除いた。そして、０．２２-μｍフィルターでろ過した後、超遠心分離（４℃、２００，０００ｘｇ、１時間）によってＥＶを沈殿させ、夾雑する馴化培地由来のタンパク質を除くためにＰＢＳで再懸濁後、さらに超遠心分離（４℃、２００，０００ｘｇ、１時間）を行うことで、精製ＥＶを回収した。

ＰＢＳにより懸濁したＥＶに、標識試薬 ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red（同仁化学研究所；以下では、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒと記載；キットマニュアルにしたがって調製）を混和し、３７℃で、３０分間、反応させることで標識した。

標識後、サイズ排除クロマトグラフィカラム（ＰＤ－１０；Cytiva、バッファとしてＰＢＳを使用）により未反応の標識を取り除くことで、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識ＥＶサンプルを得た（蛍光測定に使用した励起／蛍光波長は６４０／６８０ｎｍ)。

以降、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識ＥＶサンプルは、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識ＥＶサンプル量とＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識の蛍光量とが直線関係になる濃度範囲内で使用した。

検証１
ここでは、予備実験を行って、ドロップレットのマイクロゲル化による水性二相系での二層分離能の向上とポリマー濃度域の拡大とについて検証した。

本検証１においては、まず、１．５ｍＬのマイクロチューブ内でＰＥＧ溶液およびゼラチン溶液とＰＢＳとを合わせて任意のポリマー濃度の系（１ｍＬ）を調製し、ボルテックスミキサーでしっかりと撹拌した。

次いで、３７℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間遠心し、チューブの底にゼラチン相の層（ゾル）が分離しているかを目視で確認した。

ゼラチン相（層）の分離が確認できなかった場合には、再びボルテックスミキサーでしっかりと撹拌した系を、３７℃で、１０分間静置した後、氷上で１０分間、チューブごと冷却した。

その後、４℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間遠心し、チューブの底にゼラチン相のマイクロゲルが沈殿しているかを目視で確認した。

図３は、系のＰＥＧ終濃度とゼラチン終濃度とを２軸とした状態を示すもので、図（ａ）は、ゼラチンとＰＥＧとからなる水性二相系の組み合わせを、ゼラチン１００ｋ－ＰＥＧ３５ｋとした場合の結果である。同様に、図（ｂ）は、ゼラチン１００ｋ－ＰＥＧ８ｋとした場合の結果であり、図（ｃ）は、ゼラチン２０ｋ－ＰＥＧ８ｋとした場合の結果である。

図３（ａ）～図３（ｃ）において、高濃度範囲（右上領域）では、ゼラチン相はドロップレットのままでも遠心操作による二層分離が確認できた（図中の〇印）。

しかしながら、ポリマー濃度を下げていく（左下領域へと移動していく）と、エマルジョン化により系が白濁した（二相形成された）としても、二層分離が認められない濃度範囲が現れた。

ところが、そのような濃度範囲であっても、冷却によりゼラチン相をマイクロゲル化することによって、ゼラチン相をＰＥＧ相から沈殿させることができた（図中の■印）。

なお、図中の×印は、マイクロゲル化しても一相のままで分離しなかった濃度範囲のものである。

上記の結果から、マイクロゲル化が二層分離に与える影響は、ポリマー分子量が小さいほど顕著であることが分かった。

即ち、マイクロゲル化工程を導入することで、これまで水性二相系を構築しにくかった低分子量のポリマーを組み合わせても、また、より低濃度のポリマーの組み合わせでも、水性二相系を用いた物質の濃縮が可能になり、併せて、ポリマーの使用に伴う系の粘性の課題も緩和される。

検証２
ここでは、予備実験を行って、ドロップレットのマイクロゲル化による水性二相系での二層分離能の向上とゼラチン分布の変化とについて検証した。

本検証２においては、まず、１．５ｍＬのマイクロチューブ内でＰＥＧ溶液およびゼラチン溶液とＰＢＳとを合わせて、終濃度が０．４％のゼラチン（４ｍｇ）と任意の終濃度のＰＥＧとからなる一対の系（各１ｍＬ）を調製し、ボルテックスミキサーでしっかりと撹拌した。

一方の系は、３７℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間遠心した後、氷上で冷却して下層であるゼラチン相をゲル化させ、さらに、上層であるＰＥＧ相を別チューブに移動させることで、２層を分け取った。

他方の系は、３７℃で、１０分間静置した後、氷上で１０分間、チューブごと冷却した。そして、４℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間遠心した後、上清（ＰＥＧ相）を別チューブに移動させることで、チューブの底に沈殿したゼラチン相のマイクロゲル沈殿物とＰＥＧ相とを分け取った。

その後、回収したゼラチン相のゲル／マイクロゲル沈殿物は、３７℃でインキュベートすることにより、ゾル化させた。

図４は、ＰＥＧ終濃度とゼラチン相へのゼラチンの分布の割合（ゼラチン相ゼラチン分布）とを２軸とした状態を示すもので、図（ａ）は、ゼラチンとＰＥＧとからなる水性二相系の組み合わせを、ゼラチン１００ｋ－ＰＥＧ３５ｋとした場合の結果である。同様に、図（ｂ）は、ゼラチン１００ｋ－ＰＥＧ８ｋとした場合の結果であり、図（ｃ）は、ゼラチン６０ｋ－ＰＥＧ８ｋとした場合の結果であり、図（ｄ）は、ゼラチン２０ｋ－ＰＥＧ８ｋとした場合の結果であり、図（ｅ）は、ゼラチン１０ｋ－ＰＥＧ８ｋとした場合の結果である。

ここでは、ゼラチン相とＰＥＧ相中のタンパク質濃度とを、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）により定量化し、系に添加したゼラチン（４ｍｇ）のうち、ゼラチンゲルもしくはマイクロゲル沈殿物として回収されたゼラチンの割合をゼラチン相ゼラチン分布として求めた。

図４（ａ）～図４（ｅ）からも明らかなように、二層分離後のゼラチン相へのゼラチンの分布はポリマー分子量に影響され、組み合わせるゼラチン分子量が大きいほど、また、ＰＥＧ分子量が大きいほど、ゼラチン相の分離が促進された。

また、同じポリマー濃度であっても、ドロップレットのまま二層分離（図中の〇)させるよりも、マイクロゲル化してから沈降（図中の■）させた方が、より効率的にＰＥＧ相からゼラチン（相）を分離できることが分かった。

上記の結果から、ドロップレットのマイクロゲル化により、系全体に分散するドロップレットが効率よく他相から分離されて二層分離が促進されること、また実現の難しかった低濃度・低分子量ポリマーの組み合わせによる水性二相系の構築が可能となり、粘度の低下による操作性の向上がもたらされる。

検証３
ここでは、ゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを用いた濃縮方法におけるＥＶ回収率の向上に対するドロップレットのマイクロゲル化の効果について検証を行った。

本検証３においては、まず、１．５ｍＬのマイクロチューブ内で、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識ＥＶサンプルと、ゼラチン溶液と、ＰＥＧ溶液と、ＤＥＸ溶液と、ＰＢＳと、を適宜組み合わせて、図５に示すようなポリマー終濃度の系（１ｍＬ）１～８を調製した。

系１～６は、０．４％のゼラチン（ゼラチン分子量が１００ｋ、６０ｋ、２０ｋ）－７％のＰＥＧ８ｋのゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳとした。系７は、７％のＰＥＧ８ｋのＰＥＧ沈殿系とし、系８は、７％のＰＥＧ８ｋ－１％のＤＥＸ５０ｋのＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳとした。

系１，３，５は、ドロップレット分離により調製されたゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳであって、後掲する下記表１に示すように、ボルテックスミキサー（Vortex）でしっかりと撹拌される。そして、ゼラチン相がドロップレットのまま遠心分離（３７℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間）された後、氷上でゲル化させた下層がＰＥＧ相から回収されることによってサンプル化される。

系２，４，６は、マイクロゲル分離により調製されたゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳであって、後掲する下記表１に示すように、ボルテックスミキサーでしっかりと撹拌され、３７℃下での１０分間のインキュベーションの後、氷上で１０分間冷却される(マイクロゲル化)。遠心操作（４℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間）により二層分離された後、沈殿させたマイクロゲルがＰＥＧ相から回収されることによってサンプル化される。

系７は、系１～６における二相形成の効果を示すために、ゼラチン添加を省いた系、つまりＰＥＧ沈殿法に相当する系であって、後掲する下記表１に示すように、ボルテックスミキサーによる撹拌の後に遠心分離（３７℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間）が行われて、沈殿物が回収されることによってサンプル化される。本発明の操作と条件を合わせたことで、一般的なPEG沈殿法の系と比べ、インキュベーション工程が省かれ、遠心時間も短縮されていることに留意すべきである。

系８は、従来の水性二相系により調製されたＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳであって、後掲する下記表１に示すように、ボルテックスミキサーによる撹拌の後、４℃に設定した卓上遠心機により、１０，０００ｘｇで、１０分間遠心され、下層が回収されることによってサンプル化される。

なお、回収したサンプルがゲル化されている系１～６では、加温（３７℃）により融解後、再ゲル化を妨げるために、適宜ＰＢＳにより希釈される。

図５に示すように、回収したサンプルの蛍光量（励起波長を６４０ｎｍ、蛍光波長を６８０ｎｍ）からＥＶ回収率（系に加えたＥＶ量のうち、濃縮回収されたＥＶ量の割合）を見積もったところ、同じ組成の系であっても、ゼラチン相をドロップレット状態のまま遠心分離する系１，３，５よりも、マイクロゲル化して遠心分離する系２，４，６の方が、ＥＶ回収率が向上することが分かった。このマイクロゲル化による回収率向上の効果は、二相形成／二層分離が起こりにくい低分子量のポリマーを組み合わせた系５，６間において、特に顕著となった。

なお、同じ濃度・同じ分子量の高分子クラウダーを用いても、二相が形成されない系７では、系１～６と比して、極僅かしかＥＶを回収できなかった。このことから、本発明の濃縮技術におけるドロップレット／マイクロゲル形成の有用性が示される。

系７を水性二相系同様の時短工程で処理したＰＥＧ沈殿系とみなせば、その回収率の低さから、水性二相系を用いた濃縮方法のタイムパフォーマンスの高さが示唆される（後述する検証５（図７）における、充分な時間のインキュベーションと遠心処理工程を経たＰＥＧ沈殿系でのＥＶ回収率との違いに留意すべき）。

ドロップレット分離およびマイクロゲル分離のいずれであっても、ゼラチン相のゲル化を伴うゼラチン－ＰＥＧ系１～６は、上下層とも液相である従来の一般的なＰＥＧ－ＤＥＸ系８よりも、作業性（操作性）が大幅に向上する。

加えて、特に、マイクロゲル分離を行う系２，４，６では系８よりもＥＶ回収率の増加がみとめられ、従来のＡＴＰＳを用いた濃縮法よりも、本発明の濃縮法の方が操作性と回収効率とにおいて、優位性が認められる。

検証４
ここでは、ゼラチン相のマイクロゲル化工程を含むゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを用いた濃縮方法と、従来のＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳを用いた濃縮方法と、の比較を行った。

本検証４においては、まず、１．５ｍＬのマイクロチューブ内で、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識ＥＶサンプル、もしくは、０．２２μｍフィルターでろ過した仔ウシ血清（ＦＣＳ）サンプルへ、ゼラチン２０ｋ溶液と、ゼラチン１００ｋ溶液と、ＰＥＧ８ｋ溶液と、ＤＥＸ５０ｋ溶液と、ＰＢＳと、を適宜組み合わせて、ＡＴＰＳ（１ｍＬ）を調製した。

ゼラチン終濃度は０．４％、ＤＥＸ終濃度は１％とし、ＰＥＧ終濃度は７％もしくは１５％とした。さらに、ＦＣＳタンパク質定量のために、標識ＥＶサンプルもＦＣＳサンプルも加えないバックグラウンド（ＢＫＧ）の系も調製した。

ゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳにおいては、実施例２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳ（０．４％ゼラチン１００ｋ－ＰＥＧ８ｋ）を用いた濃縮方法において、ボルテックスミキサーにより撹拌した系を、３７℃と氷上とでそれぞれ１０分間インキュベーションした後、遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ、１０分間)した。

そして、上清（ＰＥＧ相）を分け取り、得られたゼラチン相のマイクロゲル沈殿物を３７℃で融解し、ＰＢＳを添加して１００μＬに調製した。

一方、ＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳ（ＰＥＧ８ｋ－１％ＤＥＸ５０ｋ）を用いた濃縮方法においては、ボルテックスミキサーにより撹拌した系を遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ、１０分間）し、上層（ＰＥＧ相）を分け取って、下層（ＤＥＸ相）を得た。

ＥＶ回収率に関しては、ＥＶに標識したＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ蛍光量に基づいて測定した。ＦＣＳタンパク質コンタミ量に関しては、ＦＣＳサンプルを添加した系とＢＫＧ系の上下層のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）により定量化し、ＦＣＳサンプル系のタンパク質濃度からＢＫＧ系のタンパク質濃度を減算することで、ＦＣＳタンパク質の濃度を補正した。

ＦＣＳタンパク質コンタミ率は、系に添加したＦＣＳタンパク質のうち、下層に取り込まれたＦＣＳタンパク質の割合として見積もられた。

図６は、本発明（実施例２）の濃縮方法と従来のＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳを用いた濃縮方法でのＥＶ回収率(縦軸）とＦＣＳタンパク質コンタミ率(横軸）を２軸としたプロットである。

従来のＰＥＧ－ＤＥＸ系ではＰＥＧ相とＤＥＸ相との界面張力を増加させ相分離を促進するためにＰＥＧ濃度を増加させると、系の粘度が増加するため相（層）の分け取り操作が困難となるだけでなく、ＰＥＧ－ＤＥＸ系のプロット（図６中の△）の横方向への広がりから、濃縮されたＥＶサンプル中に共に取り込まれるＦＣＳタンパク質コンタミ率がＰＥＧ濃度の上昇に伴い増加することが示される。

それに対し、本発明では、ゼラチン分子量に関わらず、プロット（図６中の●■〇□）がＰＥＧ－ＤＥＸ系のプロット域とは独立して左上領域に集中することから、ＥＶサンプル中のＦＣＳタンパク質コンタミ率はＰＥＧ－ＤＥＸ系よりも低レベルに抑えられ、かつ、ＥＶ回収率は高レベルに向上したことが示された。

上記の結果から、従来のＡＴＰＳを用いた濃縮法よりも、本発明の濃縮法、特にドロップレットのマイクロゲル化を含む実施例２の濃縮法の方が、ＥＶ濃縮において、ＥＶ回収率に加え、馴化培地等に含まれるＦＣＳタンパク質の除去能が高い利点が認められる。

また、細胞培養後の馴化培地（培養液）／培養上清に、直接、高分子クラウダーと可逆的ゲル形成ポリマーなどを添加し、多相形成することでも、濃縮を達成し得る。

検証５
ここでは、ゼラチン相のマイクロゲル化工程を含むゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳを用いた濃縮方法でのＥＶ回収率と、他の濃縮方法によるＥＶ回収率との比較を行った。

図７は、検証５の結果として、実施例２で示した濃縮方法により回収／濃縮されたＥＶ回収率を、従来の一般的な方法により回収／濃縮されたＥＶ回収率と、対比して示すものである。

ＥＶ回収率の算出には、ＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識ＥＶサンプルを、以下の方法によって回収／濃縮したものを用いた（超遠心分離では、１０－ｍＬの遠心チューブを用いた１０ｍＬの系、水性二相系およびポリマー沈殿を用いた方法では、１．５－ｍＬのマイクロチューブを用いた１ｍＬの系）。

即ち、実施例２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳ（０．４％のゼラチン１００ｋ－７％のＰＥＧ８ｋ）を用いた濃縮方法においては、ボルテックスミキサーにより撹拌した系を、３７℃と氷上とでそれぞれ１０分間インキュベーションした後、遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ、１０分間)した。そして、上清（ＰＥＧ相）を分け取り、得られたゼラチン相のマイクロゲル沈殿物を３７℃で融解し、ＰＢＳを添加して１００μＬに調製した。

一方、ＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳ（７％のＰＥＧ８ｋ－１％のＤＥＸ５０ｋ）を用いた濃縮方法においては、ボルテックスミキサーにより撹拌した系を遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ、１０分間）し、上層（ＰＥＧ相）を分け取って、下層（ＤＥＸ相）を得た。

また、ポリマー沈殿－ＴＥＩ（Total Exosome Isolation Reagent、Invitrogen）を用いた濃縮方法においては、マニュアルにしたがって系を調製し、４℃で、overnightのインキュベートを行った後、遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ、６０分間）して沈殿物を得た。

また、ＰＥＧ沈殿法（７％のＰＥＧ８ｋ）においては、調製した系を、４℃で、overnightのインキュベートを行った後、遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ、６０分間）して沈殿物を得た。

また、超遠心分離法においては、ＰＢＳで液量を１０ｍＬに調整後、超遠心分離（４℃、２００，０００ｘｇ、６０分間）して沈殿物を得た。

これに対し、サイズ排除クロマトグラフィ法においては、ＰＢＳで液量を０．５ｍＬに調整後、マニュアルにしたがってカラムｑＥＶ original GEN 2（IZON）上にロードし、ＰＢＳで溶出し、２．２－３．４ｍＬ画分をサンプルとして回収した。

図７からも明らかなように、それぞれに得られたサンプルのＥｘｏＳｐａｒｋｌｅｒ標識の蛍光量からＥＶ回収率を求めたところ、実施例２に係るゼラチン－ＰＥＧＡＴＰＳは、一般的なＰＥＧ－ＤＥＸＡＴＰＳを用いた濃縮方法やポリマー沈殿法などと比べ、操作性の向上または操作時間の短縮に加え、高いＥＶ回収率を示した。

上記したように、本実施形態によれば、ポリマー沈殿のメカニズムの一つである排除体積効果による粒子の排斥と、水性二相系の速やかな二相形成、そしてゲル形成ポリマーの可逆的なゾル／ゲル変換特性を組み合わせることで、簡便、かつ、効率的な生体由来物質の回収／濃縮が可能となる。

即ち、液体試料に対して、高分子クラウダーと、該高分子クラウダーとの組み合わせにより二相形成可能なゲル形成ポリマーと、を加えることにより、液体試料から生体由来物質を迅速、かつ、簡便に、高効率で濃縮することが可能となる。

なお、本明細書中では、１種の高分子クラウダーと１種の可逆的ゲル形成ポリマーとを含む水性二相系に限定して記述したが、さらに１種以上の高分子クラウダーや１種以上のゲル形成ポリマーなどを追加した水性多相系（多層）としても、本発明の目的達成を阻害しない限り、差し支えない。

以上、実施の形態を例示して本発明の態様について説明したが、一例であり、特許請求の範囲に記載される発明の範囲は、発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々変更できるものである。

Claims

生体由来物質の濃縮方法であって、
前記生体由来物質を含む液体試料に、高分子クラウダーと可逆的なゾル／ゲル変換特性を有するゲル形成ポリマーとを添加し、撹拌する工程と、
遠心分離によって、前記液体試料を高分子クラウダー相からなる高分子クラウダー層およびゲル形成ポリマー相からなるゲル形成ポリマー層を含む、多層に分離する工程と、
前記ゲル形成ポリマー層のゲル化を誘導する工程と、
ゲル化された前記ゲル形成ポリマー層を分け取る工程と、
を備え、
前記生体由来物質は、細胞外小胞であり、
前記高分子クラウダーは、分子クラウディング効果を有するポリマーであって、平均分子量が８，０００～３５，０００で、終濃度が５～１５％のＰＥＧであり、
前記ゲル形成ポリマー相は、繰返しゾル／ゲル転換可能なポリマーであって、平均分子量が１０，０００～１００，０００で、終濃度が０．１～０．５％のゼラチンである
ことを特徴とする生体由来物質の濃縮方法。
生体由来物質の濃縮方法であって、
前記生体由来物質を含む液体試料に、高分子クラウダーと可逆的なゾル／ゲル変換特性を有するゲル形成ポリマー相とを添加し、撹拌する工程と、
前記ゲル形成ポリマー相のドロップレットのゲル化を誘導する工程と、
遠心分離によって、前記液体試料を高分子クラウダー相からなる高分子クラウダー層およびゲル化されたゲル形成ポリマー層を含む、多層に分離する工程と、
ゲル化された前記ゲル形成ポリマー層を分け取る工程と、
を備え、
前記生体由来物質は、細胞外小胞であり、
前記高分子クラウダーは、分子クラウディング効果を有するポリマーであって、平均分子量が８，０００～３５，０００で、終濃度が５～１５％のＰＥＧであり、
前記ゲル形成ポリマー相は、繰返しゾル／ゲル転換可能なポリマーであって、平均分子量が１０，０００～１００，０００で、終濃度が０．１～０．５％のゼラチンである
ことを特徴とする生体由来物質の濃縮方法。
分け取った前記ゲル形成ポリマー層のゾル化を誘導し、融解させる工程を、さらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の生体由来物質の濃縮方法。