JP7639447B2

JP7639447B2 - ピーク分離方法及び装置

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Publication number: JP7639447B2
Application number: JP2021052470A
Authority: JP
Inventors: 原一植松
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2025-03-05
Anticipated expiration: 2041-03-25
Also published as: JP2022150055A

Description

本発明は、複数のピークが重畳するシグナルを非線形関数およびベースライン関数による各ピークおよびベースラインに分離し、精度よく各ピークの定量計算する方法及び装置に関するものである。

クロマトグラフィは有機物、無機物等の混合物の分離に使用される手法である。移動相を流した状態で、様々な官能基を有したゲル（分離材）を充填したカラムに試料を導入し、相互作用の差により混合物を分離し、様々な検出器により出力をモニターする。分離されたピークの溶出時間から定性、検出器の出力の度合いから定量分析する手法である。理想的には、混合物を完全に分離することで正確な定性、定量分析が可能であるが、分離性能には制限や限界もあり、完全に分離することができないケースが多々ある（図１参照）。各成分の分離が不十分の場合、一般的には図１ｂのように縦切り処理、図１ｃのようにベース処理、図１ｄのようにスキミング処理をして、各成分の面積等を算出し、定量に供する。

しかしながら、分離性能が極端に悪い場合や、各成分の量的関係に大きな差異がある場合などは、いずれの処理法であっても、正確に面積等を算出することは厳しくなる。このような場合にはピーク分離（ピークフィッティング）の手法を用いられることもある。分離が不十分なクログラムの一部の領域に対して、数学的な処理により各々のピークに分割する手法である（図２参照）。これは、クロマトグラムで得られるピークの形状が、理論的には正規分布であることを前提とし、正規分布係数の係数を変化させて、その総和と元のクロマトグラムの差異が最小となるように繰り返し計算、つまり最小二乗法により係数を確定するものである。この、最小二乗法に繰り返し計算は、不分離ピークに対して有効な定量の手段である一方、正確に定量できないケースも多々ある。

まず第一に、前述の手法は、ピークが正規分布であることを前提としていることである。実際のクロマトグラムのピークは、試料とゲルとの非特異的吸着や、試料負荷量が適切でない場合などは、テーリング状態や、リーディング状態となることがしばしばある。つまり、ピーク形状は左右対称でなくなり、正規分布ではないため、正確なフィッティング計算ができないことがある（図３参照）。

また、クロマトグラフィでは、ベースラインができるだけ安定した状態で測定するこが望ましく、不安定な状態では正しく定量計算ができなくなる。実際には、環境の変化や使用している溶離液の組成変化など、様々な要因でベースラインが一定方向に傾いたり（ドリフト）（図４ａ）、一定周期でうねりが生じたりする（図４ｂ）。ピークの強度が強い場合は、ベースラインがわずかに変動しても、定量には大きな影響はしないが、ピーク強度が弱い場合は正確に定量できない。このことは、ピーク分離（ピークフィッティング）にて定量する場合も同様である。ましてや、ピーク形状が左右対称の正規分布様でなく、ベース変動が生じている場合は、ピーク分離（ピークフィッティング）により正確な定量を行うことが困難となる（図５参照）。

また、最小二乗法によるピーク分離を実施する場合、ピーク関数の初期値が重要となる。適切ではない初期値を用いた場合、計算結果が収束しないこともある。また、ピークが溶出する領域のベースラインが水平でない場合も、計算に大きな誤差を生じることとなる。

このような課題を解決するため、前者に対しては、正規分布関数以外の非対称のピーク形状が得られる分布関数を使用することもある。また後者に対しては、最小二乗法によるピーク分離を実施する前に、ベースラインをオフセット処理して、計算区間のベースライン変動をゼロに近づける方策を取り入れることもされている。このような対処を実施しても、正確なピーク分離ができず、定量結果の信頼性が得られないケースが多々存在するのが現状である。

本発明の目的は、前述課題を解決するためになされた不分離のクロマトグラムをピーク分離する方法であり、ピーク分離の初期値を適切に設定し、また、ベースラインの変動がある場合でも正確なピーク分離ができる方法および前記ピーク分離方法を搭載した液体クロマトグラフィ装置を提供するものである。

２以上の成分ピークからなる不分離状態のピーク群に対して、ピーク分離を行い、前記各々のピークの定量を行うピーク分離の方法であって、
ピーク分離を行う開始時間、終了時間、および、仮想時間の少なくとも３つの時間を指定し、それに対応するクロマトグラムの出力値を取得し、前記３組の時間、出力群から２次以上の多項式を算出し、前記多項式の各係数を算出し、仮想のベースラインを取得する第一の工程と、
前記ピーク分離に用いるピーク関数が非正規分布関数であり、
各々のピークに対する、前記非正規分布関数の各係数のうち、ピークトップ時間に関する係数の初期値を、前記不分離状態のピーク群から取得し、
各々のピークに対する、前記非正規分布関数の各係数のうち、ピーク幅に関する係数の初期値を、前記ピークトップ時間と事前に設定されたカラムの段数から算出した値を基に適用する第二の工程と、
前記第一の工程で得られた仮想のベースラインの各係数と、前記第二の工程で得られた各ピークごとの非正規分布関数の係数とを変化させ、
各ピークの非正規分布関数の和とベースライン関数の総和と、処理を行うデータとの差が最小になるように最小二乗法にて、処理を行い、ベースライン関数および各ピーク関数を特定し、定量することを特徴とするピーク分離方法、および前記ピーク分離方法を搭載した液体クロマトグラフィ装置を提供するものである。

不分離のクロマトグラムをピーク分離する方法であり、ピーク分離の初期値を適切に設定し、また、ベースラインの変動がある場合でも正確なピーク分離ができる方法および前記ピーク分離方法を搭載した液体クロマトグラフィ装置を提供することが可能となる。

以下に、本発明の処理の詳細を説明する。
図６は本発明の処理の流れを示したフローチャートである。図７は不分離状態のクロマトグラムを模式的に示した図である。図中の太実線はクロマトグラムを示している。まず第一の工程として、ピーク分離を行う開始時間ＴＳ（●）、終了時間ＴＥ（▲）、および、仮想時間ＴＣ（〇）の少なくとも３つの時間を指定し、それに対応するクロマトグラムの出力値（ＹＳ、ＹＥ、ＹＣ）を取得する。次に、前記３組の時間、出力群から２次以上の多項式の各係数を算出し、仮想のベースラインを取得する。ここでは、仮想点を１点とし、２次式で近似することを例として説明する。仮想点は開始時間と終了時間の間の時間でも、開始時間より前の時間、終了時間の後の時間でも良く、ピークが存在しないと推定される時間を指定することが望ましい。２次式の場合、数学的に、下記数１により、係数を算出できる。

仮想点が２点以上の場合は、係数ａ、ｂ、ｃは最小二乗法により算出することができる。ここでは、開始点ＴＳを４．０００分、仮想点ＴＣを６．０００分、終了点ＴＥを１４．０００とし、表１のように２次式の係数を算出する。

第二の工程として、分離に用いたカラムの段数Ｎ、分離を行うピーク数ｎ、および、各ピークの頂点時間Ｔを指定し、それに対応する出力値ｙを取得する。時間の指定は、クロマトグラムを見ながら手動で設定しても、微分曲線の変曲点から自動で取得してもよく、指定方法を限定するものではない。

次に、段数Ｎとピークトップの時間ｔから、理論上のピーク幅ｗを算出する。段数の算出式は、規格により異なるが、ピーク幅はピークフィッティングを行う関数のピーク幅に関する係数の初期値として使用するため、どの規格の算出式を使用して良い。ここでは、一般的に使用される数２を使用して計算する。

ここでは、表２の通り、Ｐｅａｋ＿１：７．５００分（出力１０４．２４９）、Ｐｅａｋ＿２：９．７００分（出力８５．４５４）、Ｐｅａｋ＿３：１０．６００分（出力６８．３８１）、Ｐｅａｋ＿４：１１．９００分（出力２８．４７３）の４つのピークを指定した。また、段数＿Ｎは４０００段として計算した。ピーク幅は、以下の数３のように計算される。

次に、ピーク分離に用いるピーク関数を指定する。クロマトグラフィにおいては、理論的には、ピークは左右対称の正規分布の形態をとるとされるが、実際には非特異的な吸着や、試料の過負荷等、様々な要因で、リーディング状態やテーリング状態となり、左右対称の正規分布とはならない。正確なピーク分離を行うため、ピーク関数として非正規関数を指定する。ここではピーク関数として、非正規分布関数の１つである非対称シグモイド関数を適用した（数４参照）。

この関数においては、ｘ：時間、ｙ０：出力のオフセットに関する係数、Ａ：強度に関する係数、ｘｃ：ピーク頂点時間に関する係数、ｗ１：ピーク幅（全体）に関する係数、ｗ２：ピーク幅（前方）に関する係数、ｗ３：ピーク幅（後方）に関する係数である。ピーク幅に関する係数は、本関数式ではｗ１からｗ３の３つ存在するが、前記の段数から算出されたピーク幅をｗ１の初期値に設定する。ｗ２、ｗ３に関しては、ｗ１の１／２の値を初期値として設定する。以上のようにして算出された値を表２および図７ａに示す。ここから分かるように、各ピーク関数から得られるピーク曲線と生クロマトグラムの出力に差異が残る。そこで、各ピーク関数から得られるピーク曲線の高さと生クロマトグラムの出力が同じなるように、各ピーク関数の係数Ａを調整する（図７ｂ、表２Ａ修正）。

各ピークのピーク関数の係数Ｘｃ、Ａ、ｗ１、ｗ２、ｗ３、およびベースライン関数のａ、ｂ、ｃを順次変化させ、その総和と生クロマトグラムの差異が最小になるよう繰り返し計算を実施し、最もフィッティングする係数を導き出す。図８、９は、繰り返し計算の過程でのフィッティングの度合いを示した図である。図８左図はクロマトグラムとピーク関数とおよびベースライン関数の総和、図８右図は誤差を示している。図９は計算回数と誤差の関係を示している。また、表３は繰り返し計算の過程でのベースライン関数の係数ａ、ｂ、ｃの変化を示している。このように、誤差が最小になるようする計算の過程で、ピーク関数およびベースライン関数の係数も変化していくことが分かる。

分離不十分な状態でのピーク検出法を模式的に示した図である。分離不十分な状態でのピーク群に対する、一般的なピーク分離（ピークフィッティング）を模式的に示した図である。クロマトグラフィにおけるピーク形状を模式的に示した図である。クロマトグラフィにおけるベースラインの変動を模式的に示した図である。ベースラインの変動がある場合のピーク形状を模式的に示した図である。本発明のピーク分離（ピークフィッティング）の処理の流れを示したフローチャートである。本発明のピーク分離（ピークフィッティング）での初期値を示した図である。本発明のピーク分離（ピークフィッティング）での計算の過程を示した図である。本発明のピーク分離（ピークフィッティング）での計算の過程を示した図である。本発明の効果を示すために使用したシステム構成である。実施例で検証に使用した試料（高分子）の構造示した図である。実施例での処理の流れを示したフローチャートである。ベースライン関数として２次式を適用し、仮想点を１点とした場合である。実施例１で検証に用いたクロマトグラム（試料：ポリスチレン）である。実施例１でのピーク分離を行った区間および、ピークの位置を示した図である（ピーク点６点）。実施例１での解析方法１（従来法）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例１での解析方法２（従来法）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例１での解析方法３（従来法）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例１での解析方法４（本発明）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例１での解析方法４（本発明）による波形分離／ピークフィッティングの過程を示した図である。実施例１でのピークフィッティングの最終結果のうち、ベースライン関数を示した図である。実施例１でのピーク分離を行った区間および、ピークの位置を示した図である（ピーク点８点）。実施例１での解析方法４（本発明）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例２で検証に用いたクロマトグラム（試料：エポキシ樹脂）である。実施例２での解析方法５（従来法）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例２での解析方法６（本発明）による波形分離／ピークフィッティングの結果を示した図である。実施例２での解析方法６（本発明）による波形分離／ピークフィッティングの過程を示した図である。従来法（解析方法５）と本発明（解析方法６）を比較した図である、横軸がピーク、縦軸は最終的に得られた各ピーク関数の面積を示している。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。検証には、分子排除クロマトグラフである東ソー（株）製、高速ＧＰＣ装置ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣで取得したクロマトグラムを用いた。図１０は本検証で使用したシステム構成である。

（実施例１）
試料として、検量線作成等に使用される標準ポリスチレンキット（ＰＳｔＱｕｉｃｋＭＰ－ＭＦ－８０，Ｆ－１０，Ａ－５０００，Ａ－５００東ソー（株）製）を使用した。表４に測定条件を示す。

図１３に、前記条件で取得したクロマトグラムを示す。本標準ポリスチレンキットを分離すると、６．２分（ＭＷ：３７９００）、７．９分（ＭＷ：５９７０）付近に単分散のピーク、９．５～１０．６分付近に不分離のピーク（ＭＷ：６８２～２６６）が見られる。ここでは、この不分離のピーク群に対して、以下の４つの解析方法（方法１～３は従来法、４は本発明の方法）でピーク分離を実施し、効果の検証を行った。処理の範囲は、開始点：８．７５０分、終了点：１１．０００分、仮想点：９．０００分、ピーク数：６点で実施した。

解析方法１（従来法）
処理の開始点をゼロとするオフセット処理を実施後、正規分布関数（数５）によりピークフィッティングさせた。変化させた係数は、正規関数の各係数。（開始点８．７５０分時の出力３０．０６３を処理領域の出力から差し引き処理）。

解析方法２（従来法）
処理の開始点をゼロとするオフセット処理を実施後、非正規分布関数（数４）によりピークフィティングさせた。変化させた係数は、非正規関数の各係数。（開始点８．７５０分時の出力３０．０６３を処理領域の出力から差し引き処理）。

解析方法３（従来法）
処理の開始点、終了点、仮想点の３点から算出された２次式をベースラインとし（表５参照）、非正規分布関数（数４）によりピークフィッティングさせた。変化させた係数は、非正規関数の各係数。

解析方法４（本発明）
処理の開始点、終了点、仮想点の３点から算出された２次式をベースライン関数の初期値とし（表６参照）、非正規分布関数（数４）と合わせてピークフィッティングさせた。変化させた係数は、２次式の係数ａ、ｂ、ｃおよび非正規関数の各係数。

フィッティングに使用される関数（正規／非正規）の係数の初期値は以下のように決定した（表７参照）。時間に関する係数は、処理対象クロマトグラムの各ピーク頂点時間、ピーク幅に関する係数は事前に設定したカラムの段数および前記ピーク時間から逆算した。

図１８は本発明の方法（解析方法４（本発明）ピーク数６）によるフィッティングの結果を示した図であり、図１９は、本発明の方法（解析方法４（本発明）ピーク数６）によるフィッティングの過程を示した図である。図１９ａは各ピーク関数（実線）とベースライン関数（破線）、図１９ｂは各ピーク関数とベースライン関数の総和（実線）と生クロマトグラム（破線）、図１９ｃは各ピーク関数とベースライン関数の総和と生クロマトグラムの差の総和（Σ△^２）を示している。図１９の左図は、初期値でのフィッティング状態で、右に行くにつれて繰り返し計算回数が増えた状態である。ここから分かるように、計算を繰り返すごとに、各ピーク関数も徐々に変化し、表８の通り、ベースライン関数の各係数も変化していき、その総和も元のクロマトグラムと類似していく。この場合、１４０回の繰り返し計算により、誤差が最小となった。

図２０は、生クロマトグラムとベースライン関数を示した図である。実線は生クロマトグラム、長破線は最終的に得られたベースライン関数、短破線はフィッティングの初期値（解析方法３の係数と同じ）のベースライン関数を示している。ここから分かるように、ピーク関数の各係数も変化するが、ベースライン関数も大きく変化していることが見てとれる（表８参照）。つまり、本発明のように、ベースラインは固定値を用いるのではなく、変数の１つとして取り扱うことで、より精度よくフィッティングができることを示唆している。

本発明の優位性を検証するために、従来法である解析方法１、解析方法２、解析方法３でも同様にフィッティングを実施した。図１５に解析方法１（従来法）：処理の開始点をゼロとするオフセット処理を実施後、正規分布関数によりピークフィッティングさせた結果、図１６に解析方法２（従来法）：処理の開始点をゼロとするオフセット処理を実施後、非正規分布関数によりピークフィティングさせた結果、図１７に解析方法３（従来法）：処理の開始点、終了点、仮想点の３点から算出された２次式をベースラインとし、非正規分布関数によりピークフィッティングさせた結果をそれぞれ示す。図１７ａは各ピーク関数（実線）とベースライン関数（破線）、図１７ｂは各ピーク関数とベースライン関数の総和（実線）と生クロマトグラム（破線）を示している。

また、表９に各解析方法および本発明でのフィッティングの最終結果を一覧で示す。検証に使用した試料は図１１ａの通り、スチレン基が重合したポリマーである。分子排除クロマトグラフィでは、低分子域では重合度（ｎ）毎に分離されるが、ｎが増えると分離が悪くなる。

図１５から分かるように、正規分布関数を使用したピークフィッティング法（解析方法１）では、低分子域はそれなりのフィッティングがなされているが、分子量が高い領域では正確なフィッティングがされず、結果的に、最終的な誤差が大きくなっている。これは、実際のピーク形状が左右対称でないことが主原因であり、また、ベースラインが完全に水平でないことに由来している。

解析方法２は、ベースラインを直線として、解析方法３および４は、ベースラインを２次式としてフィッティングしているが、両者を比較すると、解析方法３および４の方が、最終誤差が１／３程度と極端に小さくなる。このことから、ベースラインは２次式を使用した方が望ましいことが分かる。また、本発明では、ベースラインとして２次式を用いるが、更に２次式の係数もフィッティング関数の１つとして、繰り返し計算を実施することで、更なる精度向上が実現できることが分かる。表９は各解析方法の条件および最終的に収束した際の誤差を一覧で示した表である。

また、本発明の優位性を検証するために、ピーク数を８とした場合のフィッティングも実施した（高分子側に２つのピークを追加）。図２１に開始点、終了点、仮想点、各ピーク点を示す。初期パラメータは、前述と同じ手法で決定して実施した（表１０参照）。

図２２にフィッティングの結果を示す。図２２ａは各ピーク関数（実線）とベースライン関数（破線）、図２２ｂは各ピーク関数とベースライン関数の総和（実線）と生クロマトグラム（破線）、図２２ｃは各ピーク関数とベースライン関数の総和と生クロマトグラムの差の総和（Σ△^２）を示している。最終的な誤差は０．３８１８となり、ピーク数を６とした場合の１／１０まで小さくなっており、本発明のフィッティング法の精度が高いことが、ここからも分かる（表９最右列）。

（実施例２）
試料として、エポキシ樹脂であるＥ１００１を（三菱化学社製）使用した。表１１に測定条件を示す。

図２３に、前記条件で取得したクロマトグラムを示す。エポキシ樹脂（Ｅ１００１）を分離すると、８分から１４分にかけて重合度（ｎ）の違いで分離される。１２．５分以降はほぼ完全に分離されているが、それより前（高分子側）は分離が不十分な状態となっている。このような複雑な不分離ピークに対してピーク分離を実施し、効果の検証を行った。処理の範囲は、開始点：７．５分、終了点：１４．２分、仮想点：１２．４９分、ピーク数：１５点で実施した。また、比較のために、従来法（実施例１の解析方法１に相当）でもフィッティングした
解析方法５（従来法）（実施例１の解析方法１に相当）
処理の開始点をゼロとするオフセット処理を実施後、正規分布関数によりピークフィッティングさせた。変化させた係数は、正規関数の各係数。（開始点７．５０分時の出力３０．０３２を処理領域の出力から差し引き処理）。

解析方法６（本発明）（実施例１の解析方法４に相当）
処理の開始点、終了点、仮想点の３点から算出された２次式を初期値とし、非正規分布関数と合わせてピークフィッティングさせた。変化させた係数は、２次式の係数ａ、ｂ、ｃおよび非正規関数の各係数。

ピーク関数としては、実施例１と同様に、解析方法５には正規分布関数として数５を、解析方法６には非線形関数として数４の非対称シグモイド関数を使用した。またフィッティングに使用される関数（正規／非正規）の係数の初期値は次のように決定した。時間に関する係数は処理対象クロマトグラムの各ピーク頂点時間、ピーク幅に関する係数は事前に設定したカラムの段数および前記ピーク時間から逆算した。

図２６は、本発明の方法（解析方法６）によるフィッティングの過程を示した図である。図２６ａは各ピーク関数（実線）とベースライン関数（破線）、図２６ｂは各ピーク関数とベースライン関数の総和（実線）と生クロマトグラム（破線）、図２６ｃは各ピーク関数とベースライン関数の総和と生クロマトグラムの差の総和（Σ△^２）を示している。

左図は、初期値でのフィッティング状態で、右に行くにつれて繰り返し計算回数が増えた状態である。ここから分かるように、計算を繰り返すごとに、各ピーク関数も徐々に変化し、表１４の通り、ベースライン関数の各係数も変化していき、その総和も元のクロマトグラムと類似していく。この場合、４６３回の繰り返し計算により、誤差が最小となった。

本発明の優位性を検証するために、従来法である解析方法５（実施例１の解析方法１に相当）でもピークフィッティングを行った。図２４に解析方法５（従来法）：処理の開始点をゼロとするオフセット処理を実施後、正規分布関数によりピークフィッティングさせた結果を示す。図２４ａは各ピーク関数（実線）とベースライン関数（破線）、図２４ｂは各ピーク関数とベースライン関数の総和（実線）と生クロマトグラム（破線）を示している。また、表１５に各解析方法および本発明でのフィッティングの最終結果を一覧で示す。

検証に使用した試料は図１１ｂの通り、エポキシ樹脂は末端に反応性のエポキシ基を持つ熱硬化型の合成樹脂で、ビスフェノールＡとエピクロルヒドリンとの縮合反応により合成される。分子排除クロマトグラフィでは、低分子域では重合度（ｎ）毎に分離されるが、ｎが増えると分離が悪くなる。

図２４から分かるように、正規分布関数を使用したピークフィッティング法（解析方法５：従来法）では、最終的な誤差が本発明の３倍と大きく、また、分離が不十分ながらピークの頂点が確認できる１１．０～１２．５分の領域で、計算誤差が大きくなっている。更に、１２．７分に存在する極小のピーク（Ｐｅａｋ＿１３）に対しては、ピークとしては認識できていない。一方、本発明の場合、１２．７分に存在する極小のピーク（Ｐｅａｋ＿１３）もピークとして認識され、正確なピークフィッティングが行えている。これは、本来のベースラインが直線ではなく、うねりを伴っていることが原因である。本発明ではベースラインもフィット関数として取り扱うため、ベースラインの変動にも対応でき、正確なピークフィッティングが可能となり、定量分析をより正確に行えることとなる。

１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．送液ポンプ（リファレンス側）
５．試料注入機構
６．分析カラム
７．リファレンスカラム
８．恒温槽
９．屈折計

Claims

２以上の成分ピークからなる不分離状態のピーク群に対して、ピーク分離を行い、前記各々のピークの定量を行う、ピーク分離の方法であって、
ピーク分離を行う開始時間、終了時間、および、仮想時間の少なくとも３つの時間を指定し、それに対応するクロマトグラムの出力値を取得し、前記３組の時間、出力群から２次以上の多項式を算出し、前記多項式の各係数を算出し、仮想のベースラインを取得する第一の工程と、
前記ピーク分離に用いるピーク関数が非正規分布関数であり、
各々のピークに対する、前記非正規分布関数の各係数のうち、ピークトップ時間に関する係数の初期値を、前記不分離状態のピーク群から取得し、
各々のピークに対する、前記非正規分布関数の各係数のうち、ピーク幅に関する係数の初期値を、前記ピークトップ時間と事前に設定されたカラムの段数から算出した値を基に適用する第二の工程と、
前記第一の工程で得られた仮想のベースラインの各係数と、前記第二の工程で得られた各ピークごとの非正規分布関数の係数とを変化させ、
各ピークの非正規分布関数の和とベースライン関数の総和と、処理を行うデータとの差が最小になるように最小二乗法にて、処理を行い、ベースライン関数および各ピーク関数を特定し、定量することを特徴とするクロマトグラフィ用のピーク分離方法。
請求項１に記載のピーク分離方法を搭載した、液体クロマトグラフィ装置。