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JP7640466B2 - Ｃｄ４０活性化特性を有する組換えタンパク質 - Google Patents
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Description

本開示は、CD40活性化タンパク質の分野に関する。より具体的には、本明細書には、CD40リガンド(CD40L)と融合又は結合したCD40アゴニスト抗体の抗原結合断片を有するCD40アゴニスト抗体に基づく組換えタンパク質が開示される。また、このようなCD40活性化タンパク質の有利な使用、特にウイルス又はがん抗原等の送達された抗原に対する免疫応答を誘導するための使用が開示される。
CD40は、抗原提示細胞(APC)及びB細胞上に発現される強力な活性化腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーである。樹状細胞(DC)は、抗原を取り込み、病原体関連分子パターン(PAMP)を活性化することによって感染に応答し、したがって、その主要組織適合性複合体(MHC)分子上に抗原特異的T細胞に対して外来抗原を提示し、活性化T細胞上に発現されたCD40リガンド(CD40L)を介してDC成熟のサイクルを開始させ、次に、その病原体に対する細胞性及び体液性抗原特異的T細胞及びB細胞応答を誘導する[Elguetaら、2009]。アゴニスト性抗CD40抗体は、内因性抗原、例えば、腫瘍関連抗原(TAA)に対する免疫応答を刺激するためにAPCを直接活性化するという概念に基づいて、又はワクチンのアジュバントとして臨床開発中である[Dahanら、2016、Thompsonら、2015、Vonderheide及びGlennie、2017によって概説される]。化学コンジュゲーション[Barら、2003]、非共有結合アセンブリ[Flamarら、2013]、又は直接融合[Flamarら、2014]によって、抗CD40抗体に抗原を直接結合させると、インビトロ及びインビボの様々な設定において非常に低い抗原量で強力な抗原特異的細胞性及び体液性免疫が誘発される[Flamarら、2013、Flamarら、2014、Yinら、2016、Yinら、2017]。特に、CD40に対する抗原標的化は、他のDC受容体を標的とすることによって特徴付けられる後期エンドソームへの急速な抗原侵入とは異なり、初期エンドソームコンパートメント内に蓄積することによって、他の受容体を標的とするよりも優れた細胞性T細胞応答を誘発する。[Yinら、2016、Chattergeeら、2012]。
最も強力なアゴニスト活性を有するCD40反応性モノクローナル抗体を同定するための一次スクリーニングに加えて、例えば、ヒトDC上のサイトカイン分泌又はCD86表面発現を誘導し、臨床候補抗CD40抗体のアゴニスト有効性及び有用性を最大化することは、典型的には、H及びL鎖結合領域の親和性成熟[Mangsboら、2014]、並びに定常領域のFcRとの架橋の増強を含む[Dahanら、2016]。スクリーニングはまた、Fc相互作用を必要とせずに強力なアゴニストを同定することができ[Heら、2016]、これは、FcγRIIA相互作用が維持される場合、ヒト血小板活性化に問題となる可能性がある[Dahanら、2016]。アゴニスト性抗CD40抗体は、CD40L相互作用領域に重複する部位に結合することができ、又はそのリガンド結合領域とは異なる部位と相互作用することができるが[Gladueら、2011、Dahanら、2016、Heら、2016]、この区別が臨床的意義を有するかどうかは不明である。
CD40の強力な活性化は、インビトロでのCD40標的化を介した抗原の効果的なクラスI及びクラスII提示には必要でないが[Chattergeeら、2012、Flamarら、2014]、インビボでの有効性は、ポリIC等のToll様受容体(TLR)活性化剤の同時投与を要する[Zurawskiら、2017、Chengら、2017]。しかしながら、これらのインビトロ及びインビボ研究は、抗CD40抗体-抗原複合体又は完全なCD40アゴニスト活性を有する融合物を利用しておらず、非ヒト霊長類におけるペプチドベースのワクチン接種のためにポリICと組み合わせたアゴニスト性抗CD40抗体の明らかな利点[Thompsonら、2015]は、完全にアゴニスト性の抗CD40標的化ビヒクルによって抗原のCD40標的化が更に改善され得ることを示唆する。更に、アゴニストCD40標的化ビヒクルとして高い効力を有する単一分子を提供する必要がある。本明細書に開示されるのは、抗CD40抗体と抗CD40抗体-抗原融合タンパク質の両方のCD40活性化有効性を増強するための、ある種のアゴニスト性抗CD40ビヒクルとの可溶性CD40L協力の性質である。抗CD40抗体とCD40Lアゴニスト断片の両方を単一の実体に組み合わせる方法は、同時投与される2つの別々の薬剤で観察されるものと少なくとも同様の、又は更に優れた効力を与えることが、本明細書において更に開示される。このようなCD40活性化タンパク質は、処置及び投与された抗原に対するアジュバント免疫応答において非常に価値があり得る。
米国特許出願公開第20160031988A1号 米国特許出願公開第20120039916A1号 国際公開第2010/104747号 米国特許第5,223,409号 米国特許第5,403,484号 米国特許第5,571,698号 米国特許第5,427,908号 米国特許第5,580,717号 米国特許第5,969,108号 米国特許第6,172,197号 米国特許第5,885,793号 米国特許第6,521,404号 米国特許第6,544,731号 米国特許第6,555,313号 米国特許第6,582,915号 米国特許第6,593,081号 国際出願公開第02/43478号 米国特許第4,816,567号 米国特許第5,225,539号 米国特許第5,530,101号 米国特許第5,585,089号 米国特許第5,693,762号 米国特許第6,180,370号 国際公開第2010/009346号 国際公開第2010/104747号 国際公開第2010/104749号 米国特許第7,338,660号 米国特許出願公開第20120301488A1号 米国特許出願公開第20170342159号 米国特許第4,399,216号 米国特許第4,634,665号 米国特許第5,179,017号 米国特許第3,791,932号 米国特許第4,174,384号 米国特許第3,949,064号
Wardら、1989 Nature、341:544～546頁 Birdら、1988 Science、242:423～426頁 Hustonら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci.、85:5879～5883頁 Baudinoら、J. Immunol.181 (2008): 6664～69頁 Strohl, CO、Biotechnology 20 (2009): 685～91頁 Limら、Biotechnology Bioeng、2013、110、57～67頁 Nelsonら、2010 Nature Reviews Drug discovery、「Development trends for human monoclonal antibody therapeutics」(Advance Online Publication) Hoogenboomら、Method in Molecular Biology、178:1～37頁 O’Brienら、編、Human Press、Totowa、N.J.、2001 Lonbergら、1994 Nature 368(6474): 856～859頁 Kohler及びMilstein、1975 Nature 256: 495頁 Francisco J Aら、Cancer Res、60: 3225～31頁、2000 「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035～1038頁及び1570～1580頁 Parslowら、2018、J Vis Exp、2018;(138):57164頁
本開示は、少なくとも以下のタンパク質ドメイン:
(i)CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片(αCD40);及び、
(ii)CD40LのCD40結合ドメイン(CD40L)
を含むCD40活性化タンパク質に関する。
特定の実施形態では、上記CD40アゴニスト抗体は、ヒトCD40に特異的に結合し、以下の特性のうちの少なくとも1つ以上を有する:
(i)フローサイトメトリー分析又はCFSE標識細胞の複製希釈の分析によりインビトロで測定した場合、B細胞の増殖を誘導する;又は、
(ii)樹状細胞活性化アッセイによりインビトロで測定した場合、IL-6、IL-12及び/又はIL-15サイトカイン等のサイトカインの分泌を誘導する。
特定の実施態様では、CD40Lの上記CD40結合ドメインは、配列番号14を含むCD40Lの断片である。
特定の実施形態では、CD40Lの上記CD40結合ドメインは、上記CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は重鎖のC末端に融合されている。
特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、CD40アゴニストIgG抗体の重鎖及び軽鎖、好ましくはFc-ヌル及びジ-スルフィド安定化IgG4又は突然変異したサイレントIgG抗体を含む。
特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、CD40Lと、上記CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は重鎖との間のペプチドリンカー、好ましくは配列番号15の可撓性リンカーFlexV1を更に含む。
特定の実施態様では、上記CD40アゴニスト抗体は、以下の抗体から選択される:
(i)配列番号27のHCDR1、配列番号28のHCDR2、配列番号29のHCDR3、配列番号30のLCDR1、配列番号31のLCDR2、及び配列番号32のLCDR3を含むヒト化抗体;
(ii)配列番号21及び配列番号22のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体;
(iii)(i)又は(ii)で同定した抗体の少なくとも1つと、CD40発現細胞への結合について競合する抗体;又は、
(iv)(i)又は(ii)で同定した抗体の1つと同じエピトープに結合する抗体。
特定の実施形態では、1つ又は複数の抗原が、上記CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の重鎖又は軽鎖に融合されている。
典型的には、上記1つ又は複数の抗原は、CD40アゴニスト抗体の重鎖又は軽鎖に(ペプチド結合を介して直接的に、又は、例えばドッケリン-コヒーシン技術を介して非共役的に)融合されたウイルス、細菌、又はがん抗原である。
特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質は、式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖、及び式αCD40Heavy-(PL-Ag)xの重鎖を含み、
・αCD40Lightは、上記CD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40Heavyは、上記CD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・Agはウイルス又はがん抗原であり、同一又は異なり;
・xは1から20までの整数であり、例えば、3、4、又は5であり;
・CD40Lは、CD40のリガンドの結合ドメイン、例えば、配列番号14を含むCD40LのCD40結合ドメインであり;
・-は結合である。
特定の実施形態では、上記ウイルス抗原は、HIVペプチド抗原、好ましくはHIV-1抗原、例えば、配列番号48のGNG又は配列番号57のHIV5pepから選択される。
本開示はまた、上記で定義されるCD40活性化タンパク質及び1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本開示は更に、ワクチンとして使用するためのCD40活性化タンパク質に関する。特に、上記CD40活性化タンパク質は、対象におけるT細胞特異的応答、特に、ウイルス抗原に対するCD8+T細胞特異的応答を増強するのに使用することができる。
上記CD40活性化タンパク質はまた、対象においてB細胞増殖の誘発、及び/又は樹状細胞のサイトカイン増殖の誘導に使用され得る。
抗CD40 11B6-ヒトCD40 IgG4に例示される抗受容体抗体-リガンド融合概念を示す模式図である。関連するドメインを示す:VLは軽鎖可変領域であり;VHは重鎖可変領域であり;CHはH鎖定常領域1～3であり;CLは軽鎖定常領域であり;リンカー配列及び重要なジスルフィド結合は灰色の線で示す。本発明は、H鎖C末端に融合されたリガンド、及び多様な抗体形態及びアイソタイプを含む、代替の融合形態を予想した。 一定の低用量の可溶性ヒトCD40Lとともに及び伴わずにインキュベートされた、ある用量範囲の抗CD40抗体に対するヒトB細胞の増殖応答を示す図である。ヒトPBMCをヒトIL-4、ヒトIL-21とともにインキュベートし、種々のヒトIgG4アイソタイプ適合抗体のある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1、0.01nMと示される)を、CFSE希釈のフローサイトメトリー分析により6日後に決定した。黒塗りの丸印が付された曲線は抗体用量に対する応答であり、灰色塗りの四角印が付された曲線は100ng/ml(6nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下での抗体用量に対する応答である。データは、抗体若しくはsCD40L(6±4%の範囲)を伴わないか、又は抗体を伴わないがsCD40L(11±7%)を伴う、最大増殖(80±22%)対ベースライン複製について正規化された異なるドナーについての平均7(11B6、12B4、CP、IgG4)又は3(12E12、24A3)の独立した実験を表す。 一定の低用量の可溶性CD40Lとともに及び伴わずにインキュベートされた、ある用量範囲の抗CD40IgG4抗体に対するヒトMDDCのサイトカイン分泌応答を示す図である。ヒトMCDCを、各抗CD40 mAbのある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1、0.01、0.001nMと示される)で培養し、サイトカイン分泌の程度を2日後に決定した。最大応答を100%に設定した。黒い丸印が付された曲線は抗体のみに対する応答であり、灰色の四角印が付された曲線は1μg/mlの可溶性ヒトCD40L(60nM)の存在下での抗体に対する応答である。データは、試験された各サイトカインの最大分泌に対して正規化された単一の実験を表す(パネルA、IL-12 p40、561ng/ml;パネルB、IL-15、62ng/ml)。IL-6分泌についても同様の用量応答傾向が認められた(最大446pg/ml、sCD40Lに対する30pg/mlの応答)。 CD40L結合の抗CD40抗体阻害を示す図である。抗ヒトCD40マウス(左パネル)又はヒトIgG4(右パネル)mAbの滴定シリーズを、一定量(2μg/ml)のヒトCD40エクトドメインヒトFc(左パネル)又はマウスFc(右パネル)融合タンパク質に2μg/mlで添加し、混合物を氷上で1時間インキュベートし、次に、等量の200KヒトCD40Lで安定にトランスフェクトされたL細胞に添加し、氷上で1時間インキュベートし、洗浄し、ヤギ抗マウス(上パネル)又は抗ヒト(下パネル)IgG-PE試薬とともにインキュベートし、再度、洗浄し、FACSアレイ装置で分析した。結合の喪失は、試験mAbが、細胞表面CD40Lへの結合を妨げる様式で可溶性CD40に結合することを示す。 一定の低用量の可溶性CD40Lとともに及び伴わずにインキュベートされた、ある用量範囲の抗CD40 HIV5pep抗原融合タンパク質に対するヒトB細胞の増殖応答を示す図である。ヒトPBMCをヒトIL-4、ヒトIL-21、及びある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1nMと示される)のmAb又は融合タンパク質とともにインキュベートし、次に、増殖の程度を、CFSE希釈のフローサイトメトリー分析により6日後に決定した。灰色一色の四角印が付された曲線は、100ng/ml(6nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下での親hIgG4抗体用量に対する応答であり、中抜けの円印が付された曲線は、抗体-HIV5pep融合タンパク質用量に対する応答であり、灰色塗りの丸印が付された曲線は、100ng/ml(6nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下での抗体-HIV5pep融合タンパク質の用量に対する応答である。データは、抗体若しくはsCD40L(6%の範囲)を伴わないか、又は抗体を含まないがsCD40L(12.5%)を伴う、最大増殖(58%)対ベースライン複製について正規化された単一の実験を表す。参考のために、融合抗原を伴わないこれらの抗体、及びsCD40Lを添加して及び添加せずにこれらの抗体によって誘発された増殖性B細胞応答を図2に複製して示す。 融合HIV5pep抗原とともに及び伴わずに、及び一定の低用量の可溶性CD40Lとともに及び伴わずにインキュベートされた、ある用量範囲の抗CD40 IgG4抗体に対するヒトMDDCの細胞表面活性化マーカー応答を示す図である。100ng/ml(6nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下又は非存在下における、ある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1nMで示される)の各抗CD40 mAb及び抗CD40.HIV5pep融合タンパク質抗体を伴うヒトMDDC、並びにフローサイトメトリーによって決定されたCD86及びDRの高発現を伴う細胞のパーセンテージ。黒塗りの丸印が付された曲線は抗体のみに対する応答であり、灰色塗りの四角印が付された曲線は可溶性ヒトCD40Lの存在下での抗体に対する応答であり、中抜けの円印が付された曲線はHIV5pepのみに対する抗体に対する応答であり、灰色塗りの丸印が付された曲線は可溶性ヒトCD40Lの存在下でHIV5pepに融合された抗体に対する応答である。データは単一の代表的な実験から得られたものである。 sCD40とともに及び伴わずにインキュベートされたHIV-1感染ドナーPBMC培養物中のHIV-1特異的T細胞のCD40標的化HIV5pepによる拡大を示す図である。HIV-1+ドナーPBMCを、低用量のsCD40L(100ng/ml;6nM)及びIL-2とともに及び伴わずに、ある用量範囲の抗CD40.HIV5pep融合タンパク質(左から右へ1、0.1、0.01nM)とともに9日間培養し、続いて5つのHIV-1Gag、Nef、及びPolの長いペプチドのプールでBFAとともに6時間刺激し、次に、ICSにより分析した。データは、ペプチド刺激に対する、IFNγを産生する抗原特異的CD8+及びCD4+T細胞の培養終了時のパーセンテージを示す。Y軸は、IFNγ+ CD3+ CD4+又はCD3+ CD8+細胞のパーセンテージを示す。 直接融合したCD40Lとともに及び伴わずに、又は一定の低用量の可溶性CD40Lとともにインキュベートされた、ある用量範囲の抗CD40hIgG4 mAbに対するヒトB細胞の増殖応答を示す図である。ヒトPBMCをヒトIL-4、ヒトIL-21、及びある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1、0.01nMと示される)のmAb又は融合タンパク質とともにインキュベートし、次に、増殖の程度を、CFSE希釈のフローサイトメトリー分析により6日後に決定した。黒塗りの丸印が付された曲線は、hIgG4抗体用量に対する応答であり、灰色塗りの四角印が付された曲線は、100ng/ml(6nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下でのhIgG4抗体用量に対する応答であり、黒塗りの四角印が付された曲線は、直接融合CD40Lを有するhIgG4抗体の用量に対する応答である。データは、抗体及びsCD40L(10%)を伴わない、又は抗体を伴わないが、sCD40L(44.5%)を用いた、ベースラインの複製に対して最大増殖(95%)について正規化された単一の実験を表す。図2及び図5は、Ab及びAb+sCD40Lについての複製データを含有する。 直接融合したヒトCD40Lとともに並びに伴わずに、及び一定の低用量の可溶性CD40Lとともに及び伴わずにインキュベートされた、ある用量範囲の抗CD40IgG4抗体に対する、ヒトMDDCのサイトカイン分泌応答を示す図である。ヒトMCDCを、各抗CD40 mAb又は対照mAbのある用量範囲(左から右へ:100、10、1、0.1、0.01、0.001nMと示される)とともに培養し、2日後にサイトカイン分泌の程度を決定した。黒塗りの丸印が付された曲線は抗体のみに対する応答であり、灰色の四角印が付された曲線は1μg/ml(6nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下での抗体に対する応答であり、黒塗りの四角印が付された曲線はヒトCD40Lに直接融合した抗体に対する応答である。データは、試験された各サイトカインの最大分泌に対して正規化された単一の実験を表す。左側のパネルでは、最大値はIL-6、469ng/ml;IL-12p40、561ng/ml;IL-15、62ng/ml)であった。右側のパネルでは、最大値はIL-6、6192ng/ml;IL-12p40、5776ng/ml;IL-15、194ng/ml)であった。AbとAb+sCD40Lのデータは図3に示したものと同一であることに留意されたい。 H鎖C末端でHIV5pep抗原に融合した、及び/又はL鎖C末端に融合したヒトCD40Lと融合した抗CD4011B6 mAbのある用量範囲に対するヒトB細胞及びMDDCの応答を示す図である。ヒトPBMC又はMDDCを、各IgG4 mAbのある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1nMと示される)でインキュベートし、B細胞増殖の程度(左パネル)又はMDDCサイトカイン分泌の程度(右パネル)を決定した。これらは、B細胞増殖の最大範囲が4%ベースラインで31%であった単一の実験の結果であり、一方、サイトカイン産生データは、実験内でのIL-6(610pg/ml)、IL-15(2,250pg/ml)、TNFα(27,500pg/ml)、IL-12 p40(9,900pg/ml)及びIL-12 p70(3,300pg/ml)について最大産生パーセンテージの平均である。 抗体又は抗体融合タンパク質の用量範囲に対するヒトB細胞の増殖応答を示す図である。ヒトPBMCをヒトIL-4、ヒトIL-21とともにインキュベートし、ある用量範囲(左から右へ、10、1、0.1、0.01nM)で、増殖の程度をCFSE希釈のフローサイトメトリー分析により6日後に決定した。曲線は抗体量に対する応答である。データは、最大増殖についてそれぞれ正規化された2人のドナーの平均値を表す(最大シグナルに応答して複製されたB細胞の31%及び28%、一方、ベースライン細胞のみの値は3.5%及び3.6%であった)。11B6-HIV5pep+sCD40L滴定シリーズは、1μg/ml(60nM)可溶性CD40Lの一定用量を補充した11B6-HIV5pepであった。 H鎖C末端に融合したHIV5pep抗原とともに及び伴わずに、Mega sCD40L及び抗CD40 11B6-CD40L mAbのある用量範囲に対するヒトMDDCの応答を示す図である。ヒトMDDCを、各IgG4 mAb又はMega sCD40Lのある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1、0.01nMと示される)でインキュベートし、サイトカイン分泌の程度を24時間で決定した。提示された結果は、サイトカイン産生の最大範囲が最大シグナルに正規化され、次にIL-12 p40、TNFα、及びIL-15分泌について平均化された、2人の異なるドナーを用いた3つの実験にわたる平均されたデータである。最大産生量の平均値は、IL-12 p40(14,236pg/ml)、TNFα(37,145pg/ml)、IL-15(295pg/ml)であった。誤差バーは平均値の標準偏差である。11B6-CD40L-HIV5pepは、以前に記載されているように(Flamarら、2013)、IgG4H鎖末端上の5つの連結されたHIV-1抗原領域を担持し、一方、11B6-CD40L-HIV5pepkは、ノブインホール技術(Flamarら、2018; Ridgwayら、1996)を用いて、1つのH鎖上に5つの抗原領域のうちの2つ及び他方のH鎖上に3つを有する。 L鎖C末端に融合させたヒトCD40Lとともに及び伴わずに、H鎖C末端で融合された、HIV-1 Gag p24、Nef、及びGag p17、又はHPV16 E6/E7抗原に融合されたある用量範囲の抗CD40若しくは対照抗体に対するヒトB細胞の、又はある低用量の可溶性CD40Lと共培養されたヒトB細胞の増殖応答を示す図である。ヒトPBMCをヒトIL-4、ヒトIL-21とともにインキュベートし、ある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1、0.01nMと示される)を示し、増殖の程度を、CFSE希釈のフローサイトメトリー分析により6日後に決定した。黒塗りの丸印が付された曲線は、指示された抗体又は抗体-抗原融合タンパク質の用量に対する応答であり、灰色塗りの四角印が付された曲線は、1μg/ml(60nM)可溶性ヒトCD40Lの存在下における指示された抗体又は抗体-抗原融合タンパク質の用量に対する応答であり、三角印の緑色の曲線は、抗体-CD40L又は抗体-CD40L抗原融合タンパク質の用量に対する応答である。データは、正規化された最大増殖(95%)対抗体を含まないベースライン増殖(10%)の単一の実験を表す。 直接融合したヒトCD40Lとともに及び伴わずに、抗CD40又は抗CD40-GNG融合抗体のある用量範囲に対するヒトMDDCのサイトカイン分泌応答を示す図である。ヒトMCDCを、各mAbのある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1nMと示される)で培養し、サイトカイン分泌の程度を2日後に決定した。中抜けの丸印が付された曲線は抗体又は抗体-抗原融合タンパク質に対する用量応答、黒塗りの四角印が付された曲線は抗体又はヒトCD40Lに直接融合した抗体-抗原融合タンパク質に対する用量応答である。データは、試験された各サイトカインの最大分泌に対して正規化された単一の実験を表す。最大値は、IL-10、30ng/ml;IL-12p40、359ng/ml;IL-15、36ng/ml、TNFα、6134ng/mlであった)。 HIV-1感染ドナーPBMC培養物におけるHIV-1特異的T細胞の、可溶性CD40とともに及び伴わずにCD40標的化Gag p17-Nef-Gag p24又は融合CD40Lの拡大を示す図である。HIV-1+ドナーPBMCを、可溶性CD40L(0.1nM)又は直接連結されたCD40Lとともに及び伴わずに、IL-2及び抗CD40-GNG及び対照IgG4-GNG融合タンパク質(0.1nM)で9日間培養し、続いてGag及びNef重複ペプチドで6時間BFAで刺激し、ICSで分析した。上段パネルは、ドナーA17のデータ、下段はドナーA15のデータを示す。 融合CD40Lを有するCD40標的化HIV5pep抗原は、HIV-1感染ドナーPBMC培養物においてHIV-1特異的CD8+T細胞応答を優先的に拡大する。HIV-1+ドナーPBMCを、IL-2及び抗CD40 HIV5ペプチド融合タンパク質(1nM;KIHタンパク質について2nM)とともに9日間培養し、続いて、5つのHIV-1 gag、nef、及びpol領域のそれぞれに特異的な長いペプチドで6時間刺激し、次に、ICSにより分析した。これは、4人のドナーに試験した4つの示されたタンパク質のそれぞれを用いた実験からのデータを統合したものである。A.各点は、αCD40 11B6-CD40L.HIV5pep KIH Gen 2及びαCD40 11B6-CD40L.HIV5pep Gen 1(X軸)とαCD40 12E12.HIV5pep KIH Gen 2(X軸)及びαCD40 E1212.HIV5pep Gen 2(Y軸)とを比較した、各ドナーにおいて誘発されたそれぞれの長いペプチドに特異的な各応答についてのIFNγ+TNFα+ HIV5pep特異的CD8+(四角)又はCD4+(菱形)T細胞についての値%を表す。1人のドナーにおけるnef66応答の高値は示されない(58、44対35、44)。B. HIV5pep KIH構築物対非KIH構築物の比較は、HIV5pep特異的CD4+又はCD8+T細胞応答において有意差を示さなかった。 HIV-1感染ドナーPBMC培養物中でのHIV-1特異的T細胞のインビトロ拡大を介して、融合CD40Lとともに及び伴わずに、CD40標的化HIV5pep抗原を試験した図である。HIV-1+ドナー患者1のPBMCを、IL-2及び抗CD40 HIV5pep融合タンパク質(1nM)で9日間培養し、続いて、5つのHIV-1 gag、nef、及びpol領域のそれぞれに特異的な長いペプチドで6時間BFAで刺激し、次に、細胞内サイトカイン染色(ICS)により分析した。これは、図14に示した1人のドナーで試験した4種類のタンパク質のうち2種類を用いた実験から得られたICSデータである。PSApep及びsolは、それぞれ、非関連ペプチド及び溶媒陰性対照を示し、PMAは、フォルボール12-ミリステート13-アセテート及びイオノマイシンによるポリクローナル刺激を表す。各ICSパネルについて、Y軸はINFγ染色強度を示し、X軸はTNFα染色強度を示す。 CD40標的化HIV-1 gp140抗原は、融合CD40Lとともに及び伴わずに、ヒトCD40トランスジェニックマウスにおいてgp140特異的血清IgG応答を誘発する。Taconic CD40ホモ接合トランスジェニックマウス(系統12692)に、(グループ1、G1) HIV-1 gp140に直接融合させた抗CD40 11B6-CD40L、(グループ2、G2)コヒーシンgp140と複合体化した抗CD4011B6-CD40L-dockerin、(グループ3、G3)コヒーシンgp140と複合体化した抗CD4011B6-dockerin、又は(グループ4、G4)コヒーシンgp140を腹腔内注射によりワクチン接種した。用量は、非標的化対照グループ3(2μg又は約3モル当量)を除き、グループ2ワクチン1μgのモル当量となるように正規化した。ワクチン接種は1日目、14日目、21日目に行い、13日目(D13)、27日目(D27)、34日目(D34)に採血した。グラフは、抗マウスIG-HRP試薬が検出試薬であることを除き、Zurawskiら、2016に記載されているように、ELISAにより抗gp140 IgG反応性について分析された血清の系列希釈を示す。グループの大きさはG1、n=3及びG2-4、n=4であった。方向誤差バーは平均値のS.E.である。 ヒトCD40トランスジェニックマウスのB細胞における抗CD40 CP及び抗CD40 11B6-CD40Lの効果を示す図である。CP-870,893hIgG4(CP)及び抗CD40 11B6-CD40L(11B6-CD40L)をマウスに投与した。野生型(WT、白バー)、又は野生型(hCD40 Taconic株、黒バー)又はCD40 KO(ImmuRx hCD40株、灰色バー)C57BL/6バックグラウンドのいずれかのヒトCD40 BACトランスジェニックマウスに、CP-870,893hIgG4(CP、10μg≒0.5mg/Kg)又は抗CD40 11B6-CD40L(11B6-CD40L)のモル当量を注射(腹腔内)し、24時間後に屠殺した。PBMC調製のために血液を採取し、皮膚流出リンパ節及び脾臓から細胞を調製し、次にフローサイトメトリーにより細胞を分析した。B細胞活性化は、活性化マーカーCD69の分析によって特徴付けられた。データは、6群の各2匹の平均値である。 CD40Lを抗CD40 11B6に融合させると、FAS膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合されたCD40エクトドメインによって誘導される細胞殺傷の有効性と効力の両方が増大する。ヒトCD40-FAS融合構築物で安定にトランスフェクトされたCHO細胞を、希釈シリーズの抗CD40 IgG4抗体とともに48時間インキュベートした。次に、細胞をMTTとともにインキュベートして、細胞生存率の指標であるミトコンドリア還元活性の比色検出を行った。トランスフェクトされていないCHO細胞は、これらの試験された薬剤のいずれによっても影響を受けない(図示せず)。 CD40エクトドメイン融合タンパク質を発現するCHO細胞への抗CD40 mAb結合の分析を示す図である。FAS膜貫通膜に融合されたヒトCD40又はCD40エクトドメインを発現する発現プラスミドで安定にトランスフェクトされたCHO細胞(250K)及び細胞内残基を、1点あたり250K(特定の細胞型を有する)で、0.1μM最終(11ウェルにわたる3倍希釈)で開始する抗CD40抗体の希釈シリーズとともにインキュベートした。結合は、氷上で1時間、続いて1×PBS、2% FCS、2mM EDTA(同様に結合緩衝液)で2×洗浄し、次に、1:500の希釈でヤギ抗ヒトIgG PE(Prozyme: Phycolink anti-hIgG-RPE)でプローブし、続いて上記緩衝液で2回洗浄した。試料をFACSアレイ(BD Biosciences)上で分析した:計算したP1%は、PE(親)ヒストグラムのみで上記のバックグラウンド細胞に設定されたゲートを使用した。P1ゲート内の試料/特定のイベントからのすべてのイベントは、指定されたP1%値を与える。WT CD40-FAS CHOは、FASに融合された野生型(非突然変異型)CD40エクトドメインを発現する細胞である。CD40 R27A及びE28A FASは、突然変異したCD40エクトドメインを有する細胞である。 可撓性リンカー領域とともに及び伴わずに、H鎖又はL鎖のC末端に融合した、直接融合ヒトCD40Lを有する抗CD40 11B6 IgG4抗体の用量範囲に対するヒト骨髄由来樹状細胞(MDDC)のサイトカイン分泌応答を示す図である。ヒトMDDCを、各抗CD40 11B6-CD40Lアイソフォームのある用量範囲(左から右へ:10、1、0.1、0.01nMと示される)で培養し、24時間後にサイトカイン分泌の程度を決定した。データは、試験した各サイトカインの値を実験内で最高値まで正規化し、2人の異なるドナーでの反復した応答について平均化した値の合計を表す。誤差バーは平均値の標準誤差である。各滴定シリーズの下に示された模式図は、L鎖又はH鎖CD40L融合アイソフォームを示し、FはFlex V1リンカーの存在を示す。 抗CD40 11B6に融合されたCD40Lのスーパーアゴニスト活性は、FAS膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合されたCD40エクトドメインによって指示される細胞殺傷の有効性及び効力によって定義されるように、CD40L位置決めとは無関係である。FAS膜貫通及び細胞内残基に融合したヒトCD40エクトドメインを発現するための構築物(Mam-cetHS-puro[hCD40--Ecto hFas-TM-IC]、配列番号151)で安定にトランスフェクトされたCHO細胞を、抗CD40IgG4抗体の希釈シリーズとともに48時間インキュベートした。次に、ミトコンドリア還元活性の比色検出のために、細胞をMTTとともにインキュベートした。グラフでは、hはヒト化11B6 mAbを示し、mは元のマウスV領域を示す。 軽鎖又は重鎖のC末端、及び/又は可撓性リンカーの存在のいずれかで抗原を有する、各融合タンパク質の構造を表す模式図である。 抗CD40 11B6-CD40Lは、CD40クラスター形成を増強する。ヒトCD40-mCherrry CHO細胞を、単独で(上パネル)、カバースライド上で37℃において10nM抗CD40 12E12(中央パネル)又は10nM抗CD40 11B6-CD40L(下パネル)とともに、培養培地中で1時間インキュベートした。次に、細胞を1%PFAで固定し、洗浄し、DAPIを用いたProLong Gold antifade試薬とともに超凍結スライド上に載せた。画像はUTSWで撮影した画像であり、FIJIソフトウェア(ImageJからのオープンソース)を用いて分析し、ビーム面積あたりのクラスターの定量化を行った。各群あたり平均5個の細胞を、空間画像相関分光法を用いて分析し、各細胞あたり3個の32×32正方形を分析した。使用されるプロトコールは、自己相関及びFIJIソフトウェアの画像数学的機能を利用して、標識された受容体の蛍光強度を共焦点顕微鏡のビーム面積の関数として定量化し、細胞表面上の標的分子凝集(クラスター化)の状態の定量的測定を提供する(Parslowら、2018、J Vis Exp 2018;(138):57164頁。)。MDDCを、カバースライド上で37℃において100nM抗CD40 11B6-CD40L-Dock_Coh-eGFP又は100nM抗CD40 23E12-Dock_Coh-eGFPとともに培養培地中で6時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、固定し、浸透処理し、抗EEA1又は抗Lamp1について染色し、洗浄し、DAPIを用いたProLong Goldアンチフェード試薬とともに超凍結スライド上に載せた。画像は、前述のように、ビーム面積あたりのクラスターの定量化のために、FIJIソフトウェアを用いて撮影され、分析された。1画像あたり4つの32×32正方形を用いた抗CD40 11B6-CD40L処置のための8つの画像、及び1画像あたり4つ又は5つの32×32正方形を用いた抗CD40 12E12処置のための7つの画像を分析に用いた(右)。左右の目盛の差は、写真間の蛍光強度の差、異なる瞬間に撮影された蛍光強度の差、及び異なる細胞型(比較できない)によるものである。しかしながら、使用した異なる細胞型では、処置間の統計的有意性は同じである(p値<0.0001)。 抗CD40 11B6-CD40LはCD40を介した内在化を増強する。ヒトCD40-CHO細胞を、100nM mCherry標識された抗CD40 12E12(A)、抗CD40 11B6-CD40L(B)又は抗CD40 11B6(C)とともに37℃又は0℃のいずれかで培地中で様々な時間、インキュベートした後、細胞をPBSで洗浄するか又は等張酸除去緩衝液(pH2.5)で1分間処理し、中和し、次にPBSで洗浄した。次に、全標識又は酸耐性(即ち、取り込まれた)標識を蛍光により測定した。30～270分の時点からの全結合のシグナルを平均し、3つの独立した複製実験間のデータを正規化するために100%に設定した。細胞単独又は抗CD40 mAbとコンジュゲートしていない100nM mCherrryによるバックグラウンド蛍光値は2±1%であった。ゼロ時点での検出可能な結合は、最初の約6分間の遠心分離及び洗浄工程の間に起こる結合を反映する。 Ala突然変異原性研究に由来するデータを示す図である。下線はCD40の4つのCDR構造相同領域である。いくつかの突然変異の残存数を示す。灰色のハイライトは変化した残基を示す。PはPfizer CP mAbであり; Eは12E12であり; Bは11B6であり; Lは11B6-CD40Lであり; -は試験したいずれのmAbにも影響がないことを意味し;配列の下の小文字は結合の減少を示し; CAPSの文字は結合がないことを意味する。 HIV-1感染ドナーPBMC培養におけるHIV-1特異的T細胞のCD40標的化GNG抗原による拡大を示す図である。HIV-1+ドナーPBMCを、低用量のsCD40L(100ng/ml;6nM)及びIL-2の存在下及び非存在下で、ある用量範囲の抗CD40-GNG融合タンパク質(左から右へ、1、0.1、0.01nM)で9日間培養し、続いてプールHIV-1 Gag p17、Nef、及びGag p24ペプチドで6時間刺激し、次にISCによって分析した。データは、抗原特異的(A)CD4+及び(B)CD8+T細胞の培養終了時のペプチド刺激に対するIFNγ+TNFα産生の割合を示す。 HIV-1感染ドナーPBMC培養におけるHIV-1特異的T細胞のCD40標的化GNG抗原による拡大を示す図である。HIV-1+ドナーPBMCを、低用量のsCD40L(100ng/ml;6nM)及びIL-2の存在下及び非存在下で、ある用量範囲の抗CD40-GNG融合タンパク質(左から右へ、1、0.1、0.01nM)で9日間培養し、続いてプールHIV-1 Gag p17、Nef、及びGag p24ペプチドで6時間刺激し、次にICSによって分析した。データは、抗原特異的(A)CD4+及び(B)CD8+T細胞の培養終了時のペプチド刺激に対するIFNγ+TNFα産生のパーセンテージを示す。パネルC及びDは、それぞれ、3人の患者からの3つの最高用量までの抗原特異的CD4+及びCD8+T細胞の照合反応を、試験した全3つのペプチド領域にわたって添加し、各患者について最高反応に正規化し、次に、平均化したことを示す。指示された有意差は、Welch補正を用いた対合していない試験に基づいていた。 抗CD40-CD40L標的化HIV5pep抗原は、HIV-1感染ドナーPBMC培養において、多くのHIV-1特異的CD8+T細胞応答を優先的に拡大する。HIV-1+ドナーPBMCを、IL-2及び抗CD40 HIV5ペプチド融合タンパク質(1nM;KIHタンパク質について2nM)とともに9日間培養し、続いて、5つのHIV-1 gag、nef、及びpol領域のそれぞれに特異的な長いペプチドで、BFAとともに6時間刺激し、次に、ICSにより分析した。これは、4人のドナーで試験された指示された各タンパク質対を用いた実験からのデータと照合される。各点は、抗CD40 11B6-CD40L-HIV5pep KIH Gen 2及び抗CD40 11B6-CD40L-HIV5pep Gen 1(Y軸)を抗CD40 12E12-HIV5pep KIH Gen 2及び抗CD40 12E12-HIV5pep Gen 2(X軸)と比較した、各ドナーにおいて誘発された各長いペプチドに特異的な各応答についての、IFNγ++TNFα+ HIV5pep-特異的CD8+(パネルA、黒色の四角)又はCD4(パネルB、白丸)についての値%を表す。パネルAは、拡大培養の20%以下の応答を強調し、nef66ペプチドに対する強力な患者2の応答(抗CD40 11B6-CD40L-HIV5pepワクチンによって誘発される38±7%対抗CD40-HIV5pepワクチンによって誘発される48±10%)を除外する。パネルBは、全データセットを示す。
定義
本開示をより容易に理解し得るために、特定の用語を最初に定義する。詳細な説明を通して、更なる定義を記載する。
本明細書で使用される場合、用語「CD40」は、当該技術分野において一般的な意味を有し、配列番号13のCD40を含むヒトCD40ポリペプチド受容体を指す。特定の実施形態では、CD40は、UniProtKB-P25942(ヒトTNR5とも呼ばれる)により報告されたヒト標準配列のアイソフォームである。ある種の抗CD40抗体によって認識されるCD40のエクトドメインは、典型的には、配列番号13の21位と193位の残基の間に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、用語「CD40L」は、当該技術分野において一般的な意味を有し、例えば、配列番号14のCD40結合ドメインを含む、UniProtKB-P25942により報告されたヒトCD40Lポリペプチドを指す。CD40Lは可溶性ポリペプチドとして発現することができ、CD40受容体の天然リガンドである。
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」は、1つ又は複数の直鎖状鎖(「ポリペプチド鎖」とも呼ばれる)に配置され、球状形態に折り畳まれたアミノ酸からなる任意の有機化合物を指す。このようなポリペプチド鎖中のアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって一緒に連結される。用語「タンパク質」は、更に、限定されないが、ペプチド、一本鎖ポリペプチド、又は主としてアミノ酸の2つ以上の鎖からなる任意の複合タンパク質を含む。それは更に、限定されないが、糖タンパク質又は他の公知の翻訳後修飾を含む。更に、天然タンパク質の公知の天然又は人工的な化学修飾、例えば、糖鎖工学、ペグ化、ヘシル化等、非天然アミノ酸の取り込み、化学コンジュゲーション又は他の分子のためのアミノ酸修飾等を含む。
本明細書で使用される場合、「複合タンパク質」とは、より具体的には、少なくとも2つのポリペプチド鎖からなるタンパク質を指し、上記少なくとも2つのポリペプチド鎖は、適切な条件下で、非共有結合又は共有結合のいずれか、例えば、ジスルフィド架橋又はペプチド結合を介して一緒に結合される。
「ヘテロ二量体タンパク質」は、少なくとも2つのポリペプチド鎖からなるタンパク質であって、複合タンパク質を形成し、2つのポリペプチド鎖が異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」には、糖タンパク質、並びに非糖タンパク質が明示的に含まれる。特定の実施形態では、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、遺伝子によりコードされ、細胞発現システム及びDNA組換え手段、例えば、哺乳動物宿主細胞発現システムを用いて翻訳され得る任意のポリペプチド又はタンパク質を指す。
用語「組換えタンパク質」は、本明細書で使用される場合、組換え手段、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又はトランスクロモソームである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、又はそれらから調製されたハイブリドーマ(以下に更に説明する)、(b)対応するタンパク質、例えば、トランスフェクトーマ等を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された融合タンパク質等によって調製されるタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、遺伝的融合によって、例えば、別個のタンパク質の別々の機能ドメインをコードする少なくとも2つの遺伝子断片の遺伝的融合によって得られるか又は得ることができる、少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む組換えタンパク質を指す。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。
げっ歯類及び霊長類の天然抗体では、2本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに結合しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に結合している。軽鎖には、ラムダ(l)とカッパ(k)の2種がある。抗体分子の機能活性を決定する5つの主要な重鎖クラス(又はアイソタイプ):IgM、IgD、IgG、IgA、IgEがある。各鎖は異なる配列ドメインを含有する。典型的なIgG抗体では、軽鎖は2つのドメイン、可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む。重鎖は、4つのドメイン、可変ドメイン(VH)及び3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3、まとめてCHと呼ばれる)を含む。軽鎖(VL)と重鎖(VH)の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖(CL)及び重鎖(CH)の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、胎盤移動性、補体結合、及びFc受容体(FcR)への結合等の重要な生物学的特性を付与する。
Fv断片は、免疫グロブリンのFab断片のN末端部分であり、1つの軽鎖及び1つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変又は相補性決定領域(CDR)からの残基で構成される。場合により、非超可変領域又はフレームワーク領域(FR)由来の残基が抗体結合部位に関与するか、又は全体的等メイン構造、ひいては結合部位に影響を与えることがある。相補性決定領域又はCDRは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のFv領域の結合親和性及び特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、それぞれL-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、及びH-CDR1、H-CDR2、H-CDR3と命名された3つのCDRを有する。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖及び軽鎖V領域の各々からのCDRセットを含む6つのCDRを含む。フレームワーク領域(FR)は、CDR間に介在するアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖及び重鎖の可変領域は、典型的には、以下の配列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の4つのフレームワーク領域及び3つのCDRを含む。
抗体可変ドメイン中の残基は、従来、Kabatらによって考案されたシステムにしたがって番号付けされる。このシステムは、Kabatら、1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Department of Health and Human Services,、NIH、USA (Kabatら、1992、以下「Kabatら」)に記載される。Kabat残基の指定は、必ずしも配列番号による配列中のアミノ酸残基の直鎖状の番号付けと直接一致するとは限らない。実際の直鎖状のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造の構造成分であるフレームワーク又は相補性決定領域(CDR)の短縮又は挿入に対応する厳密なKabat番号付けに比べて、より少ない又は更なるアミノ酸を含み得る。残基の正しいKabat番号付けは、抗体の配列中の相同性の残基を「標準」Kabat番号付き配列とアラインメントすることによって、所定の抗体について決定することができる。重鎖可変ドメインのCDRは、Kabat番号付けシステムにしたがって、残基31～35(H-CDR1)、残基50～65(H-CDR2)及び残基95～102(H-CDR3)に位置する。軽鎖可変ドメインのCDRは、Kabat番号付けシステムにしたがって、残基24～34(L-CDR1)、残基50～56(L-CDR2)及び残基89～97(L-CDR3)に位置する。以下に記載されるアゴニスト抗体については、CDRは、www.bioinf.org.ukからのCDR発見アルゴリズムを用いて決定された-抗体ページ内の「配列を見てCDRを同定する方法」と題されるセクションを参照されたい。いくつかのアゴニスト抗体、例えば11B6、12E2、12B4、CP(Pfizer社からのCP-870,893)又は24A3の予測されるCDRは、以下の実施例に記載される。
抗体の用語「抗原結合断片」(又は単に「抗体断片」)は、本明細書で使用される場合、抗原(例えば、CD40のエクトドメイン)に特異的に結合する能力を保持する抗体の全長又は1つ又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行うことができることが示されている。抗体の用語「抗原結合断片」に包含される結合断片の例としては、Fab断片、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価断片;F(ab)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片;VH及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFv断片;VHドメインからなるdAb断片(Wardら、1989 Nature 341:544～546頁)、又はこのような抗原結合断片を含む任意の融合タンパク質が挙げられる。
更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、VL及びVH領域が対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質として作成することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて接続することができる(一本鎖Fv(scFv)として公知である;例えば、Birdら、1988 Science 242:423～426頁;及びHustonら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879～5883頁を参照されたい)。このような一本鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合断片」内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、断片は、無傷の抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される場合、用語「IgG Fc領域」は、天然配列Fc領域及びバリアントFc領域を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。ヒトIgG重鎖Fc領域は、一般的に、IgG抗体のC226位又はP230位からカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むものとして定義される。Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。Fc領域のC末端リシン(残基K447)は、例えば、抗体の産生又は精製の間に除去され得る。したがって、本発明の抗体の組成物は、全てのK447残基を除去した抗体集団、K447残基を除去しなかった抗体集団、及びK447残基を有する抗体及び有さない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。
用語「Kassoc」又は「Ka」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対して、用語「Kdis」又は「Kd」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。
用語「KD」は、本明細書で使用される場合、KdのKaに対する比(即ち、Kd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される解離定数を指すことを意図する。抗体のKD値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。タンパク質又は抗体のKDを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を用いることにより、例えば、Biacore(登録商標)システム等のバイオセンサシステムを用いることによる。
本明細書で使用される場合、用語「結合特異性」は、例えば実施例で決定されるように、表面プラズモン共鳴(SPR)測定によって測定した場合、KDが100nM以下、10nM以下、5nM以下で、組換えCD40ポリペプチド等の抗原組換えポリペプチドに検出可能に結合する抗体の能力を指す。
「特定の抗原と交差反応しない」抗体は、KDが100nM以上、又はKDが1mM以上、又はKDが10mM以上の、その抗原に結合する抗体を指すことを意図しており、上記親和性は、実施例に開示されるように、例えば、同様の表面プラズモン共鳴(SPR)測定を用いて測定される。ある種の実施形態では、抗原と交差反応しないこのような抗体は、標準結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
本開示による単離されたCD40活性化タンパク質は、CD40に対する結合特異性及びCD40受容体に対する活性化又はアゴニスト特性を有するタンパク質である。CD40活性化タンパク質は、他の種由来の関連CD40分子等の他の抗原に対して交差反応性を有することがある。更に、特定の実施形態では、単離されたCD40活性化タンパク質は、他の細胞材料及び/又は化学物質を実質的に含まないことができる。
語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に対する特異性を有する抗体」は、本明細書において、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
特異性は、更に、例えば、約10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10.000:1以上の、他の無関係な分子への非特異的結合に対する特異的抗原への結合における親和性/アビディティの比(この場合、特異的抗原はCD40ポリペプチドである)によって示され得る。用語「親和性」は、本明細書で使用される場合、エピトープに対する抗体の結合の強度を意味する。
本開示は、CD40Lと特定のCD40アゴニスト抗体(例えば、国際公開第2010/104748号に記載されているように、アゴニストmAb 11B6又は12B4に由来する)との融合タンパク質が、対応するアゴニスト抗体単独又はこのようなアゴニスト抗体と可溶性CD40L(sCD40L)との組み合わせ投与と比較して優れたCD40活性化特性を示すという予期せぬ発見に関する。
「ヒト化抗体」は、本明細書で使用される場合、広くは、可変領域及び定常領域を有する非ヒト細胞によって作製され、ヒト細胞によって作製される抗体に非常に類似するように改変された抗体を含む。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を改変して、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列中に見出されるアミノ酸を取り込むことによる。ヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)、例えば、CDRに含み得る。本明細書で使用される抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異)を含み得る。特に、用語「ヒト化抗体」は、Fc IgG領域のサイレントバリアントを含む抗体を含む。
特定の実施形態では、用語「ヒト化抗体」は、マウス抗体の6つのCDRを有する抗体を含むが、ヒト化されたフレームワーク及び定常領域を含む。
より具体的には、用語「ヒト化抗体」は、本明細書で使用される場合、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含み得る。
本明細書で使用される場合、「CD40アゴニスト」抗体は、B細胞増殖アッセイ等の細胞ベースのアッセイにおいて、CD40Lの非存在下でCD40媒介性シグナル伝達活性を増加させる抗体を指すことを意図する。このようなアッセイは、以下の実施例においてより詳細に記載される。
本明細書で使用される場合、用語「サイレント」抗体は、ADCC活性を示さないか又は低い抗体を指す。本明細書で使用される場合、用語「ADCC」又は「抗体依存性細胞傷害性」活性は、細胞枯渇活性を指す。ADCC活性は、文献に記載されるADCCアッセイによって測定することができる。
サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のFc領域における突然変異によって得ることができ、Art: Strohl 2009 (LALA & N297A); Baudino 2008、 D265A (Baudinoら、J. Immunol.181 (2008): 6664～69頁、Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685～91頁)に記載されている。サイレントFc IgG1抗体の例は、IgG1 Fcアミノ酸配列におけるL234A及びL235A突然変異を含む。
本明細書で使用される場合、「CD40活性化」特性を有するタンパク質又は抗体は、CD40媒介性シグナル伝達活性を増加させることができるタンパク質又は抗体を指す。特に、本明細書で使用される場合、CD40活性化特性を有するタンパク質は、以下の特性のうちの少なくとも1つ以上を有する:
(i)例えば、下記の実施例に記載のB細胞増殖アッセイ、例えば、CFSE標識された細胞の複製希釈の分析によって測定した場合、フローサイトメトリー分析によってインビトロで測定した場合、B細胞の増殖を誘導する;
(ii)下記の実施例に記載の樹状細胞活性化アッセイを用いてインビトロで測定した場合、IL-6、IL-12、又はIL-15のようなサイトカインの分泌を誘導する。
特定の実施形態では、本開示の上記CD40活性化タンパク質は、CD40受容体の天然リガンドであるCD40Lの可溶性バージョンと少なくとも同じ活性化特性を有する。
特定の実施態様では、上記CD40活性化タンパク質は、三量体形態ではないCD40LのCD40結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、本開示の上記CD40活性化タンパク質は、CD40結合に関して四価である。
特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、二価抗体の各アームに、好ましくは各アームの軽鎖又は重鎖のいずれかの二価抗体の各アームのC末端部分を介して、共有結合又は非共有結合で結合したCD40Lの1つの単量体CD40結合ドメインを有する二価CD40アゴニスト抗体を含む。
他の特定の実施形態では、本開示の上記CD40活性化タンパク質は、以下のCD40アゴニスト(部分アゴニストを含む)抗体:11B6、12B4、CP-870、893又は24A3、典型的には11B6抗体又はヒト化バージョンの中から典型的に選択される参照CD40アゴニスト抗体と少なくとも同様の活性化特性を有する。
他の特定の実施形態では、本開示の上記CD40活性化タンパク質は、少なくとも同様の活性化特性を有し、下記の実施例に記載されるように、樹状細胞活性化アッセイにおいて測定した場合、サイトカインの分泌を誘発するために、可溶性CD40Lの公知の三量体バージョンであるMega sCD40Lよりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、又は少なくとも100倍活性であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「Mega sCD40L」は、MEGA CD40L(登録商標)として販売され、Kornbluthら、2012に記載もされている、アディポネクチン/ACRP30/AdipoQのコラーゲンドメインを介して連結された三量体CD40リガンド分子を指す。
他の特定の実施形態では、本開示の上記CD40活性化タンパク質は、上記CD40活性化タンパク質中に存在するのと同じCD40アゴニスト抗体(又はその抗原結合断片)を有する可溶性CD40Lの組み合わされた組成物と少なくとも同じ活性化特性を有する。
本明細書で使用される場合、用語「最適化された」は、産生細胞又は生物体、一般的に真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)又はヒト細胞において好ましいコドンを使用するヌクレオチド配列が改変されてアミノ酸配列をコードすることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発ヌクレオチド配列によって元々コードされたアミノ酸配列を完全に又は可能な限り保持するように操作される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列はまた、最適化されたものと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数(即ち、同一性%=同一の位置の数/位置の総数×100)である。配列の比較及び2つの配列間の同一性パーセントの決定は、以下に記載されるように、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
Needleman及びWunschアルゴリズム(NEEDLEMAN及びWunsch)を用いて、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定することができる。
2つのヌクレオチド間又はアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、例えば、EMBOSSニードル(ペアワイズアラインメント;www.ebi.ac.ukで入手可能である)等のアルゴリズムを用いて決定することができる。例えば、EMBOSSニードルは、BLOSUM62マトリックス、10の「ギャップオープンペナルティ」、0.5の「ギャップ延長ペナルティ」、0.5の偽「エンドギャップペナルティ」、10の「エンドギャップオープンペナルティ」、及び0.5の「エンドギャップ延長ペナルティ」を用いて使用され得る。一般的に、「同一性パーセント」は、一致する位置の数を、比較された位置の数で割り、100を掛けた関数である。例えば、10個の配列位置のうち6個がアラインメント後に比較された2つの配列間で同一である場合、同一性は60%である。同一性%は、典型的には、分析が行われるクエリー配列の全長にわたって決定される。同じ一次アミノ酸配列又は核酸配列を有する2つの分子は、いかなる化学的及び/又は生物学的修飾にかかわらず同一である。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。
本明細書で使用される場合、「樹状細胞」(DC)は、リンパ組織又は非リンパ組織において見出される形態学的に類似した細胞型の多様な集団の任意のメンバーを指す。これらの細胞は、それらの特徴的な形態及び高レベルの表面MHC-クラスII発現によって特徴付けられる。これらの細胞は、下記の実施例に記載されるように、多数の組織源から、都合良くは末梢血から単離することができる。
本開示のCD40活性化タンパク質
本開示は、少なくとも以下のタンパク質ドメイン。
(i)CD40アゴニスト抗体(αCD40)又はその抗原結合断片;及び
(ii)典型的には配列番号14のCD40L(CD40L)のCD40結合ドメイン、又は配列番号14と少なくとも90%、95%若しくは100%の同一性を有するその機能性断片
を含むCD40活性化タンパク質に関する。
ある種の実施形態では、CD40LのCD40結合ドメイン(好ましくは単量体形態)は、場合により、ペプチド又は化学リンカー等のリンカーを介して、上記CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は重鎖のC末端に共有結合又は非共有結合で結合される。一実施形態では、CD40LのCD40結合ドメインは、CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の軽鎖のC末端に非共有結合で結合される。
ある種の実施形態では、CD40LのCD40結合ドメインは、場合によりリンカー、例えばペプチドリンカーを介して、上記CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は重鎖のC末端に融合されている。典型的には、CD40LのCD40結合ドメインは、場合によりリンカー、例えばペプチドリンカーを介して、CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の軽鎖のC末端に融合されている。
他の特定の実施形態では、CD40Lの上記CD40結合ドメインは、化学的カップリングを用いて、CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされる。抗体のそのコンジュゲート部分への結合又はコンジュゲーションのためのいくつかの方法が、当該技術分野において公知である。部分を抗体に結合させるために使用されたリンカータイプの例としては、限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びペプチド含有リンカー、例えば、バリン-シトルリンリンカーが挙げられる。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント内の低pHによる切断に感受性であるか、又はカテプシン(例えば、カテプシンB、C、D)等の腫瘍組織中で優先的に発現されるプロテアーゼ等のプロテアーゼによる切断に感受性であるように選択することができる。治療剤を抗体にコンジュゲートさせるためのリンカーのタイプ及び方法の更なる検討については、抗体薬物コンジュゲートに関するレビューについて、Panowskiら、2013も参照されたい。
ある種の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖及び式αCD40Heavyの重鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・CD40Lは、例えば、配列番号14を含むCD40リガンドのCD40結合ドメイン、又は配列番号14と少なくとも90%、95%若しくは100%の同一性を有するその機能性断片である。
より特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖及び式αCD40Heavy-PL-BP1の重鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・BP1は、結合対BP1/BP2の第1のメンバーであり、上記結合対BP1/BP2の第2のメンバーBP2との非共有結合カップリングを可能にする。
別の特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Heavy-PL-CD40Lの重鎖及び式αCD40Light-PL-BP1の軽鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・BP1は、結合対BP1/BP2の第1のメンバーであり、上記結合対BP1/BP2の第2のメンバーBP2との非共有結合カップリングを可能にする。
当該技術分野において公知である任意の結合対、典型的にはポリペプチドドメインの結合対をDC40活性化タンパク質の上記実施形態のために使用することができる。上記結合対BP1/BP2の例には、以下に記載するように、限定されないが、ドッカリングドメイン/コヒーシンドメイン、又はmSA2/ビオチンが含まれる。
より特定の実施形態では、本明細書に開示されている上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖及び式αCD40Heavy-PL-Docの重鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・Docは、例えば、配列番号111を含む米国特許出願公開第20160031988A1号及び米国特許出願公開第20120039916A1号に記載される、コヒーシン融合タンパク質、又はその任意の機能的変異体への非共有結合カップリングを可能にするドッカリンドメイン又は複数のドメインである。
他の特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖及び式αCD40Heavy-PL-mSA2の重鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・mSA2は、Limら(Biotechnology Bioeng 2013、110、57～67頁)に記載されるように、例えば配列番号168を含むビオチン標識又は融合タンパク質、又はそれらの任意の機能性バリアントとの非共有結合カップリングを可能にするためのモノマーストレプトアビジン2ドメインである。
他の特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Heavy-PL-CD40Lの重鎖及び式αCD40Lightの軽鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・CD40Lは、例えば、配列番号14を含むCD40リガンドのCD40結合ドメイン、又は配列番号14と少なくとも90%、95%若しくは100%の同一性を有するその機能性断片である。
別のより特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Heavy-PL-CD40Lの重鎖及び式αCD40Light-PL-Docの軽鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・Docは、例えば、配列番号111を含む米国特許出願公開第20160031988A1号及び米国特許出願公開第20120039916A1号に記載されるような、コヒーシン融合タンパク質、又はその任意の機能的変異体への非共有結合カップリングを可能にするドッカリンドメイン又は複数のドメインである。
他の特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Heavy-PL-CD40Lの重鎖及び式αCD40Light-PL-mSA2の軽鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・mSA2は、Limら(Biotechnology Bioeng 2013、110、57～67頁)に記載されるように、例えば、配列番号168を含むビオチン標識又は融合タンパク質、又はそれらの任意の機能性バリアントとの非共有結合カップリングを可能にするためのモノマーストレプトアビジン2ドメインである。
αCD40Light、αCD40Heavy、及びCD40Lの好ましい実施形態は、次のセクションに更に記載される。
ある種の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、更に、上記CD40アゴニスト抗体又はその抗原結合断片の対応する重鎖又は軽鎖のいずれかに非共有結合カップリングで融合又はコンジュゲート又はカップリングされた、1つ又は複数の抗原「Ag」を含む。上記抗原は、CD40活性化タンパク質のポリペプチド鎖、例えば、CD40活性化タンパク質のポリペプチド鎖のC末端、及び場合により、以下に記載されるFlexV1、f1、f2、f3、又はf4等のペプチドリンカーを介して、直接コンジュゲートされ得る。それらはまた、ドッケリンドメインとカップリングするためのコヒーシン融合タンパク質、及び/又はモノマーストレプトアビジン2ドメインとカップリングするためのビオチン融合タンパク質に含まれる、非共有結合カップリングによってカップリングされ得る。
本明細書で使用される場合、用語「抗原」又は「Ag」は、微生物全体又はその一部を含むか否かを問わず、ワクチンにおいて使用され得る任意の抗原及び種々のタイプ(例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、糖脂質、リポペプチド等)を指す。したがって、用語「抗原」は、抗原のレシピエントにおいて体液性及び/又は細胞性免疫応答を開始することができる分子を指す。抗原は、通常、ワクチン接種が有利な処置である疾患を引き起こす病原体によってコードされる重要な分子である。
特定の実施形態では、Agはペプチドコンカテマーである。Agはまた、ポリヌクレオチドを含み得、その配列は、DNA免疫化と呼ばれる免疫化技術の場合に、ポリヌクレオチドが投与される個体によってその発現が所望される抗原をコードするように選択される。
典型的には、本明細書で使用される場合、Agは、ウイルス又は他の感染性疾患抗原、又はがん抗原から選択される。
ある種の実施形態では、Agは、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌抗原から選択される感染性疾患抗原から選択される。典型的には、Agは少なくとも1つのウイルス抗原である。例えば、少なくとも1つのウイルス抗原は、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビンウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、ロトウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドを含む。別の態様では、少なくとも1つのウイルス抗原は、HIV、CMV、A型、B型及びC型肝炎、インフルエンザ;麻疹、ポリオ、天然痘、風疹、呼吸器合胞体、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹、エプスタイン-バー、日本脳炎、狂犬病、インフルエンザ、又は風邪ウイルスのうちの少なくとも1つからのペプチドを含む。
特定の実施形態では、上記ウイルス抗原は、HIV-1 Gag p24(配列番号45)、Nef(配列番号46)、及びGag p17(配列番号47)(GNGと呼ばれる3つの抗原の組み合わせを含み、下記のアミノ酸配列の詳細を参照されたい)又はHVP16 E6及びHPV16 E7抗原(HPV16 E6/E7)(HPVとも呼ばれ、下記の詳細なアミノ酸配列も参照されたい)の組み合わせの1つ又は複数の以下の抗原ドメインから選択される。
GNG配列は、以下の式で表される:(C末端からN末端へ)
FlexV1-LE-gag17-VDf3-VD-nef-EF-f4-QF p24-6xHis](可撓性リンカー配列)
式中、
FlexV1は、配列番号15のペプチドリンカーであり;
LEは、Leu-Gluのジペプチドであり;
Gag17は、以下のアミノ酸配列:
MGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGNKQYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKS(配列番号47)
のHIV-1ウイルス抗原であり;
VDは、バリン及びアスパラギン酸のジペプチドリンカーであり;
f3は、以下のアミノ酸配列:
TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(配列番号53)
のペプチドリンカーであり;
nefは、以下のアミノ酸配列:
MGGKWSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC(配列番号46)
のHIV-1ウイルス抗原であり;
EFは、グルタミン酸とフェニルアラルニンのジペプチドリンカーであり;
f4は、可撓性リンカー TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(配列番号54)であり;
QFは、グルタミンとフェニルアラニンのジペチジンリンカーであり;
P24は、以下のアミノ酸配列:
AQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVG(配列番号45)
のHIV-1ウイルス抗原であり;
6-Hisは、HHHHHHのC末端ヘキサヒスチジンタグである。
GNGの完全なアミノ酸配列は、配列番号48からなる。
代替のGNG配列は、例えば、同じHIV-1ペプチド配列を有するが、他のペプチドリンカーを有するGNG配列を用いて使用することができる。
HPVは、以下の式:Flex-v1-HPV16E6-HPV16E7-f1
(式中、FlexV1は上記の通りであり、
HPV16E6-HVP16E7は、以下のアミノ酸配列:
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVGDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEASMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK (配列番号55)
を有し;
f1は、以下のアミノ酸配列:
ASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPAS(配列番号56)
の可撓性リンカーである)である。
HPVの完全なアミノ酸配列は、配列番号57からなる。
他の特定の実施形態では、上記ウイルス抗原は、以下のHIV抗原性ドメイン:配列番号16のGag p17(17-35)、配列番号17のGag p17-p24(253-284)、及び配列番号18のNef(116-145)、配列番号19のPol 325-344(RT158-188)、及び配列番号20のNef(66-97)のうちの1つ又は複数から選択される。
好ましい実施形態では、上記ウイルス抗原は、以下の5つのHIV抗原性ドメインの組み合わせ:配列番号16のGag p17(17-35)、配列番号17のGag p17-p24(253-284)、及び配列番号18のNef(116-145)、配列番号19のPol 325-344(RT158-88)、及び配列番号20のNef(66-97)から選択され、また、以下の式:
FlexV1-gag p17(17-35)-f1-gag p17-p24(253-284)-f2-nef(116-145)-f3-nef(66-97)-f4-Pol 325-344(RT158-188)
(式中、FlexV1、f1、f2、f3、f4は、上述される)
のHIV5pep配列に含まれるものである。
HIV5pepアミノ酸配列の特定の実施形態は、配列番号112に記載される。
他の特定の実施形態では、Agは、CEA、前立腺特異的抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6及び12、MUC関連タンパク質(ムチン)(MUC-1、MUC-2等)、GM2及びGD2ガングリオシド、ras、myc、チロシナーゼ、MART(メラノーマ抗原)、MARCO-MART、サイクリンB1、サイクリンD1、Pmel 17(gp100)、GnT-VイントロンV配列(N-アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼVイントロンV配列)、前立腺Ca psm、前立腺血清抗原(PSA)、PRAME(メラノーマ抗原)、β-カテニン、MUM-I-B(メラノーマユビキタス突然変異遺伝子産物)、GAGE(メラノーマ抗原)1、BAGE(メラノーマ抗原)2-10、C-ERB2(Her2/neu)、EBNA(エプスタイン-バーウイルス核抗原)1-6、gp75、ヒトパピローマウイルス(HPV)E6及びE7、p53、肺抵抗性タンパク質(LRP)、Bcl-2、及びKi-67から選択される腫瘍関連抗原から選択される。別の態様では、Agは、白血病及びリンパ腫、星状細胞腫又は神経膠芽腫等の神経腫瘍、黒色腫、乳がん、肺がん、頭頸部がん胃腸腫瘍、胃がん、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、例えば、子宮頸部、子宮、卵巣がん、膣がん、精巣がん、前立腺がん又は陰茎がん等の泌尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆道樹、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分、甲状腺、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病のがん由来の抗原を含む腫瘍関連抗原から選択される。このような腫瘍関連抗原には、公知又は潜在的なT細胞エピトープを含む患者特異的な腫瘍突然変異タンパク質が含まれる。
特定の実施形態では、本開示のCD40活性化タンパク質は、2つのヘテロ二量体を含む複合タンパク質を指し、各ヘテロ二量体は、例えば、1つ又は複数のジスルフィド結合を介して、安定に一緒に会合したアミノ酸の1つの重鎖及び1つの軽鎖からなる。典型的には、重鎖は、少なくともVH領域、好ましくはCD40アゴニスト抗体の少なくともCH1-VH領域を含み、軽鎖は、少なくともVL領域、好ましくは、上記CD40アゴニスト抗体の少なくともCL-VL領域を含む。少なくとも、上記重鎖又は軽鎖は、場合によりリンカー、例えばペプチドリンカーを介して、CD40Lの少なくともCD40結合ドメインに融合又はコンジュゲートされる。
特定の実施形態では、本開示の上記CD40活性化タンパク質は、アイソタイプ定常領域又はIgG Fc領域、好ましくはIgG4又は突然変異したサイレントIgG Fcを含む、CD40アゴニストIgG抗体の重鎖及び軽鎖を含む。
より特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖及び式αCD40Heavy-(PL-Ag)xの重鎖を含む抗体様タンパク質である。
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・Agはウイルス又はがん抗原であり、同一であるか又は異なり;
・xは1から20までの整数であり、例えば、3、4、又は5であり;
・CD40Lは、配列番号14を含むCD40のリガンドの結合ドメイン、又は配列番号14と少なくとも90%、95%若しくは100%の同一性を有するその機能性断片であり;
・-は共有結合である。
別のより特定の実施形態では、本明細書に開示される上記CD40活性化タンパク質は、式αCD40Heavy-PL-CD40Lの重鎖及び式αCD40Light-(PL-Ag)xの軽鎖を含む抗体様タンパク質であり、
・αCD40LightはCD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
・αCD40HeavyはCD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
・PLは、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり、好ましくは配列番号15のFlexV1であり;
・Agはウイルス又はがん抗原であり、同一であるか又は異なり;
・xは1から20までの整数であり、例えば、3、4、又は5であり;
・CD40Lは、配列番号14を含むCD40のリガンドの結合ドメイン、又は配列番号14と少なくとも90%、95%若しくは100%の同一性を有するその機能性断片であり;
・-は共有結合である。
特定の実施形態では、PLは、好ましくは、細胞産生における最適な活性化特性及び収率を確実にするペプチドリンカーである。
特定の実施形態では、-(PL-Ag)xは、上記CD40活性化抗体様タンパク質の重鎖のカルボキシ末端に位置する。
典型的には、上記CD40活性化タンパク質の実施形態の概略図を図1に示す。αCD40Light、αCD40Heavy、及びCD40Lの好ましい実施形態は、次のセクションに更に記載される。
ある種の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリコシル化部位を組み込むことができるか、又は二次構造を導入することができる。更に、これらのリンカーは、融合タンパク質の発現又は安定性の効率を増加させ、その結果、樹状細胞への抗原提示の効率を増加させ得る。このようなリンカーは、flexV1、f1、f2、f3及び/又はf4リンカーを含み得る。これらの例及び他のものは、国際公開第2010/104747号に記載され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。特に、flexV1は配列番号15のポリペプチドである。
より特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号1及び配列番号2からなるPAB3405 CD40アゴニスト抗体を含む。
別の特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号3及び配列番号4からなるPAB3408 CD40アゴニスト抗体を含む。
別の特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号5を含む重鎖ポリペプチド及び配列番号6を含む軽鎖からなる。
別の特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号5を含む重鎖ポリペプチド及び配列番号8を含む軽鎖からなる。
別の特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号9を含む重鎖ポリペプチド及び配列番号10を含む軽鎖からなる。
別の特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号11を含む重鎖ポリペプチド及び配列番号12を含む軽鎖からなる。
別の特定の実施形態では、上記CD40活性化タンパク質は、配列番号109の軽鎖ポリペプチド及び配列番号110の重鎖ポリペプチドからなる。
上記定義されたアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90%、例えば、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD40活性化タンパク質もまた本開示の一部である。
本開示の融合タンパク質の調製に使用するためのCD40アゴニスト抗体
当業者は、当該技術分野において既に公知であるCD40アゴニスト抗体を使用するか、又は抗体スクリーニング技術を使用して新たに新規なCD40活性化抗体を生成することができる。
より具体的には、本開示のCD40活性化タンパク質において使用するための上記CD40アゴニスト抗体(又はその抗原結合断片)は、1つ又は複数の以下の有利な特性を有する:
(i)例えば、下記の実施例に記載されるように、SPR結合アッセイによって測定した場合、500nM以下、例えば50以下～500nMの間のKDを有するCD40エクトドメインに結合する;
(ii)例えば、下記の実施例に記載のB細胞増殖アッセイで測定した場合、フローサイトメトリー分析によってインビトロで測定した場合、B細胞の増殖を誘導する;及び/又は
(iii)下記の実施例に記載の樹状細胞活性化アッセイを用いてインビトロで測定した場合、IL-6、IL-12、又はIL-15等のサイトカインの分泌を誘導する。
特定の実施形態では、上記CD40アゴニスト抗体は、1つ又は複数の以下の特性を有する:
(i)例えば下記の実施例に記載されるように、SPRによって測定した場合、500nM以下、例えば50～500nMの間のKDを有するCD40エクトドメインに結合する;
(ii)上記アゴニスト抗体を用いたB細胞増殖アッセイで測定した場合、B細胞の増殖は、可溶性CD40Lの最適以下の用量の存在下で、例えば、下記の実施例に記載のアッセイを用いて、更に、典型的には少なくとも10倍、又は少なくとも100倍増加させることができる;及び/又は、
(iii)IL-6、IL-12、又はIL-15等のサイトカインの分泌は、例えば、下記の実施例に記載のアッセイを用いて、樹状細胞活性化アッセイでインビトロで測定した場合、可溶性CD40Lの最適以下の用量の存在下で、典型的には少なくとも10倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも1000倍増強することができる。
特定の実施形態では、CD40アゴニスト抗体は、同じ細胞ベースのアッセイで測定した場合に、参照CD40アゴニスト抗体のCD40媒介性シグナル伝達活性と少なくとも類似する、細胞ベースのアッセイにおいて、CD40Lの非存在下で、CD40媒介性シグナル伝達活性を有する抗体であり、上記参照CD40アゴニスト抗体は、典型的には、下記のように、CD40アゴニスト抗体:mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5及びmAb6の中から選択される。
特定の実施態様では、上記CD40アゴニスト抗体は、CD40への結合に関してsCD40Lと競合しない。
特定の実施形態では、一定の最適以下量(6nM)の可溶性ヒトCD40Lの存在下で、CD40アゴニスト抗体は、CD40アゴニスト抗体mAb5(CP-870,893)について測定されたEC50の1～200倍の間、好ましくは1～150倍の間、又は1～100倍の間であるEC50(実施例に記載のB細胞増殖アッセイで測定される)を有する。
他の特定の実施形態では、一定の最適以下量(6nM)の可溶性ヒトCD40Lの存在下で、CD40アゴニスト抗体は、mAb1(11B6)抗体のEC50と等しいか又はそれ未満であるEC50(実施例に記載のB細胞増殖アッセイで測定される)を有する。
B細胞増殖アッセイで測定される相対的EC50値は、実施例に更に記載されている(図2及び図3のための表(表4及び5)を参照されたい)。
新規なCD40アゴニスト抗体を選択するために、抗体をスクリーニングする種々の方法が当該技術分野において説明されている。このような方法は、抗原免疫付与時に十分にヒト抗体を産生することができるトランスジェニックマウス等のインビボシステムと、抗体DNAコードライブラリーを生成し、抗体産生のための適切なシステムでDNAライブラリーを発現し、親和性選択基準で標的に結合する抗体候補を発現するクローンを選択し、選択されたクローンの対応するコード配列を回収することからなるインビトロシステムとに分けることができる。
これらのインビトロ技術はディスプレイ技術として公知であり、限定されないが、ファージディスプレイ、RNA又はDNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母又は哺乳動物細胞ディスプレイを含む。それらは、当該技術分野において十分に説明されている(概要について、例えば、Nelsonら、2010 Nature Reviews Drug discovery、「Development trends for human monoclonal antibody therapeutics」(Advance Online Publication)及びHoogenboomら、Method in Molecular Biology 178:1～37頁、O'Brienら、編、Human Press、Totowa、N.J.、2001を参照されたい)。1つの特定の実施形態では、ヒト組換えCD40アゴニスト抗体は、CD40結合及びアゴニスト特性を有するヒト組換え抗体ライブラリーのスクリーニングのためのファージディスプレイ法を用いて単離される。
VH及びVL遺伝子又は関連CDR領域のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングするか、又はDNA合成装置によって合成し、ファージライブラリー中でランダムに組み換えることができ、次に、抗原結合クローンについてスクリーニングすることができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立されているか又は下記の実施例に記載される。例えば、Ladnerらによる米国特許第5,223,409号;同第5,403,484号;及び同第5,571,698号;Dowerらによる米国特許第5,427,908号及び同第5,580,717号;McCaffertyらによる米国特許第5,969,108号及び同第6,172,197号;Griffithsらによる米国特許第5,885,793号;同第6,521,404号;同第6,544,731号;同第6,555,313号;同第6,582,915号及び同第6,593,081号を参照されたい。
ある種の実施形態では、CD40に対するヒト抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニック又はトランスクロモソームマウスを用いて同定することができる。これらのトランスジェニック及びトランスクロモソームマウスは、それぞれ、本明細書ではHuMAbマウス及びKMマウスと称されるマウスを含み、本明細書ではまとめて「ヒトIgマウス」と称される。
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex, Inc.社)は、非再構成ヒト重鎖(μ及びγ)及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座、並びに内因性μ鎖及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異を含む(例えば、Lonbergら、1994 Nature 368(6474):856～859頁を参照されたい)。
別の実施形態では、ヒトCD40アゴニスト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランスクロモソームを担持するマウス等の導入遺伝子及びトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて作製することができる。このようなマウスは、本明細書では「KMマウス」と呼ばれ、IshidaらによるPCT出願国際公開第02/43478号に詳細に記載される。
モノクローナル抗体(mAb)はまた、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler及びMilstein、1975 Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術により産生することができる。モノクローナル抗体を産生するための多くの技術、例えば、Bリンパ球のウイルス又は発がん性形質転換を用いることができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、十分に確立された手順である。免疫化プロトコール及び融合のための免疫化された脾細胞の単離のための技術は、当該技術分野において公知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)及び融合手順もまた公知である。
キメラ抗体又はヒト化抗体は、上記のように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、目的のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学的技術を用いて、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域は、当該技術分野において公知である方法(例えば、Cabillyらによる米国特許第4,816,567号を参照されたい)を用いて、ヒト定常領域に連結することができる。ヒト化抗体を作製するために、マウスCDR領域を、当該技術分野において公知である方法を用いてヒトフレームワークに挿入することができる。例えば、Winterによる米国特許第5,225,539号、並びにQueenらによる米国特許第5,530,101号;同第5,585,089号;同第5,693,762号及び同第6,180,370号を参照されたい。
番号を参照されたい。
更に、モノクローナル抗体は、上記で定義したように、それらのCD40アゴニスト特性について更にスクリーニングされるか又は最適化され得ることが企図される。特に、モノクローナル抗体は、本明細書に提供されるモノクローナル抗体又はヒト化抗体の1、2、3、4、5、又は6個のCDRのアミノ酸配列における1、2、3、4、5、6又はそれ以上の改変を有することができることが企図される。抗体の軽鎖若しくは重鎖可変領域のVJ又はVDJ領域のCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、又はCDR6の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10におけるアミノ酸は、保存されているか又は保存されていないアミノ酸による挿入、欠失、又は置換を有し得ることが企図される。置換され得るか又は置換を構成し得るこのようなアミノ酸は、上記に開示されている。
本開示のCD40活性化タンパク質の調製に使用するための当該技術分野において公知であるCD40アゴニスト抗体には、組換えCD40アゴニスト抗体mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5及びmAb6が含まれ、これらは、以下のTable 1(表1)及びTable 2(表2)に記載されるように、それらの可変重鎖及び軽鎖アミノ酸及びヌクレオチド配列によって構造的に特徴付けられる。
使用され得る他のCD40アゴニスト抗体は、上記に定義されるmAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5若しくはmAb6の6つのCDRを含む任意のキメラ又はヒト化抗体を含む。
本開示によるいくつかのCD40アゴニスト抗体のVH CDR1(HCDR1とも呼ばれる)、VH CDR2(HCDR2とも呼ばれる)、VH CDR3(HCDR1とも呼ばれる)、VL CDR1(LCDR1とも呼ばれる)、VL CDR2(LCDR2とも呼ばれる)、VL CDR3(HCDR3とも呼ばれる)のアミノ酸配列の例をTable 3(表3)に示す。
Table 3(表3)において、本開示の抗体のCDR領域は、Kabat番号付け(Kabatら、1992、以下「Kabatら」)を用いて描写される。
特定の実施形態では、CD40アゴニスト抗体は、以下の抗体から選択される:
(i)mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5又はmAb6の6つのCDRを含むヒト化抗体;
(ii)それぞれ配列番号21及び配列番号22のVH及びVLドメインを含むヒト化抗体;
(iii)(i)又は(ii)において同定した抗体の少なくとも1つと、CD40発現細胞への結合について競合する抗体;
(iv)(i)又は(ii)において同定した抗体の1つと同じエピトープに結合する抗体。
特に、特定の実施形態では、CD40アゴニスト抗体は、配列番号13(CD40のCDR1領域)のアミノ酸残基36～59を含むか又はそれからなるエピトープ領域に結合する。より具体的には、それは、CD40のアミノ酸残基50～58を含むか又はそれからなるエピトープ領域に結合する。ある種の実施形態では、CD40アゴニスト抗体は、少なくとも以下のアミノ酸残基:E56及びE58に直接接触する。他の実施形態では、CD40アゴニスト抗体は、少なくとも以下のアミノ酸残基:D50及びE58に直接接触する。
CD40アゴニスト抗体の他の例は、国際公開第2010/009346号、国際公開第2010/104747号及び国際公開第2010/104749号に記載されている。開発中の他の抗CD40アゴニスト抗体には、以下のものがある:
CP-870,893 - Pfizer社が開発した完全ヒトIgG2 CD40アゴニスト抗体。それは、3.48×10-10MのKDでCD40に結合するが、CD40Lの結合を遮断しない(例えば、米国特許第7,338,660号を参照されたい)。
SGN-40は、ヒト膀胱がん腫細胞株を免疫原として作製されたマウス抗体クローンS2C6からSeattle Genetics社が開発したヒト化IgG1抗体である。それは1.0×10-9MのKDでCD40に結合し、CD40とCD40Lの間の相互作用を増強することにより作用し、したがって部分的なアゴニスト効果を示す(Francisco J Aら、Cancer Res、60: 3225～31頁、2000)。
また、APEXIGEN社による米国特許出願公開第20120301488A1号は、別の抗CD40アゴニスト性mAbを記載する。AbbVie Biotherapeutics Inc.社の米国特許出願公開第20170342159号は、別のアゴニスト抗体を記載する。CDX-1140は、Celldex社によるアゴニストCD40抗体であり、別のアゴニスト抗体である。
任意の他の公知の抗体を、本出願において明らかにされた方法を用いて、それらの生物学的活性を増加させるために、結合CD40Lと潜在的に組み合わせることができる。
本開示のCD40活性化タンパク質をコードする核酸分子
本明細書には、本開示のCD40活性化タンパク質をコードする核酸分子も開示される。
核酸分子の例は、前のセクションで開示されたCD40活性化抗体様タンパク質の可変軽鎖及び重鎖アミノ酸配列をコードするものであり、遺伝子コードを使用し、場合により、宿主細胞種に依存するコドンバイアスを考慮する。
典型的には、本開示のCD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号1及び配列番号2からなるCD40アゴニスト抗体、例えば、それぞれ配列番号33及び配列番号34の核酸のコード配列を含む。
特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号3及び配列番号4からなるCD40アゴニスト抗体、例えば、それぞれ配列番号35及び配列番号36の核酸のコード配列を含む。
別の特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号5を含む重鎖ポリペプチドをコードする配列、及び配列番号6を含む軽鎖、例えば、それぞれ配列番号37及び配列番号38の核酸をコードする配列を含む。
別の特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号5を含む重鎖ポリペプチドのコード配列、及び配列番号8を含む軽鎖のコード配列、例えば、それぞれ配列番号39及び配列番号37の核酸を含む。
別の特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号9を含む重鎖ポリペプチドのコード配列、及び配列番号10を含む軽鎖のコード配列、例えば、それぞれ配列番号41及び配列番号42の核酸を含む。
別の特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号11を含む重鎖ポリペプチドのコード配列、及び配列番号12を含む軽鎖のコード配列、例えば、それぞれ配列番号43及び配列番号44の核酸を含む。
別の特定の実施形態では、CD40活性化タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号110を含む重鎖ポリペプチドのコード配列、及び配列番号109を含む軽鎖のコード配列、例えば、それぞれ配列番号114及び配列番号113の核酸を含む。
上記定義されたヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも90%、例えば、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する本開示のCD40活性化タンパク質をコードする核酸もまた、本開示の一部である。
本開示はまた、哺乳動物細胞、例えば、CHO又はHEK細胞株におけるタンパク質発現のために最適化された後者の配列に由来する核酸分子に関する。
核酸は、全細胞、細胞溶解物中に存在し得るか、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態の核酸であり得る。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知である他の技術(Ausubelら、1988)を含む標準的技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製される場合、「単離される」又は「実質的に純粋な状態になる」。本開示の核酸は、例えば、DNA若しくはRNAであり得るか、又はイントロン配列を含み得るか若しくは含み得ない。一実施形態では、核酸は、ファージディスプレイベクター等のベクター中、又は組換えプラスミドベクター中に存在し得る。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。例えば、VH及びVLセグメントをコードするDNA断片が得られると、これらのDNA断片は、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、又はscFv遺伝子に変換するために、通常の組換えDNA技術によって更に操作することができる。
CD40活性化タンパク質を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示のCD40活性化タンパク質は、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて、例えば、当該技術分野において周知である組換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて産生することができる(Morrison、1985)。
例えば、CD40活性化タンパク質を発現するために、上記CD40活性化タンパク質をコードするDNAは、標準的な分子生物学又は生化学技術(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いたDNA化学合成、PCR増幅又はcDNAクローニング)によって得ることができ、DNAは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入することができる。この文脈において、用語「作動可能に連結される」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、CD40活性化タンパク質の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、遺伝子がベクターに連結されることを意味することが意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性であるように選択される。CD40活性化タンパク質が別個のポリペプチドを含む場合、例えば、上記のセクションで開示されるCD40活性化抗体様タンパク質の重鎖をコードする1つの配列、及び上記CD40活性化抗体様タンパク質の軽鎖をコードする別の配列を含む場合、重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を別個のベクターに挿入することができ、又はより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。遺伝子は、標準的な方法(例えば、タンパク質遺伝子及びベクター上の相補的制限部位の連結、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端連結)によって発現ベクターに挿入される。
シグナルペプチドは、更に、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(即ち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)等、発現細胞からのポリペプチドの分泌のために使用され得る。
更に、本明細書に開示される組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるCD40活性化タンパク質の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、それぞれの遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に依存し得ることが当業者には理解される。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、及びポリオーマに由来するプロモーター及び/又はエンハンサーを含む。或いは、ユビキチンプロモーター又はP-グロビンプロモーター等の非ウイルス性調節配列を使用し得る。なお更に、SV40初期プロモーター及びヒトT細胞白血病ウイルス1型の長鎖末端反復を含むSRaプロモーター系等の異なる供給源由来の配列から構成される調節エレメントもある。
更に、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)及び選択マーカー遺伝子等の追加の配列を担持することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、全てAxelらによる米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号及び同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞上で、G418、ヒグロマイシン又はメトトレキサート等の薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅を伴うdhfr-宿主細胞における使用のため)及びneo遺伝子(G418選択のため)が挙げられる。
CD40活性化タンパク質の発現について、発現ベクターを標準的な技術により宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物又は真核生物宿主細胞への外因性DNAの導入、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム-リン酸沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクション等に一般的に使用される広範な技術を包含することが意図されている。理論的には、本開示の結合タンパク質を原核細胞又は真核細胞宿主細胞のいずれかで発現させることが可能である。真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、酵母又は糸状菌における組換えタンパク質の発現は、このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞よりも、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体をアセンブリ及び分泌する可能性が高いため検討される。
1つの特定の実施形態では、本開示によるクローニング又は発現ベクターは、前のセクションで説明したように、適切なプロモーター配列に機能的に連結された1つ又は複数の核酸を含む。
本開示の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、DHFR選択マーカーで使用されるdhfr-CHO細胞(Urlaub及びChasin、1980に記載される)、CHOK1 dhfr+細胞株、NSO骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞、例えば、GS CHO細胞株、並びにGS Xceed(商標)遺伝子発現系(Lonza社)又はHEK細胞等のチャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現のために十分な時間、宿主細胞を培養し、場合により、宿主細胞が増殖される培養培地中に抗体を分泌することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、例えば、分泌後に培養培地から回収及び精製することができる。
1つの特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、前のセクションで開示したように、CD40活性化タンパク質のコード配列を有する発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞である。
次に、後者の宿主細胞を、上記CD40活性化タンパク質の発現及び産生に適した条件下で更に培養することができる。
医薬組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化されたCD40活性化タンパク質を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
本明細書に開示される医薬組成物はまた、併用療法、即ち、他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも1つの抗ウイルス剤、抗炎症剤、ワクチンアジュバント及び/又は別の抗増殖剤と組み合わせた、本開示のCD40活性化タンパク質を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である任意の及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮への投与(例えば、注射又は注入)に適していなければならない。一実施形態では、担体は、皮下経路に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物、即ち、CD40活性化タンパク質は、化合物を不活性化し得る酸及び他の天然条件の作用から化合物を保護するために材料中に被覆され得る。
滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の好適な担体は当業者に周知である(Remington及びGennaro、1995)。製剤は、更に、1つ又は複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質損失を防止するためのアルブミン等を含み得る。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、処置される状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、及び性別等に自然に依存する。
本開示の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は眼内投与等のために製剤化することができる。
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤について薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張、滅菌、生理食塩水溶液(リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物)中にあるか、又は添加された場合、場合によっては、滅菌された水又は生理食塩水の添加によって、注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥、特に凍結乾燥された組成物であり得る。
投与のために使用される用量は、種々のパラメータの関数として、特に使用される投与モード、関連する病理学の関数として、又は所望の処置期間の関数として適合させることができる。
医薬組成物を調製するために、有効量のCD40活性化タンパク質を薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させることができる。
注射可能な使用に適した医薬形態は、滅菌水溶液又は分散液;ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤;及び滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末又は凍結乾燥物を含む。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、注射器が容易に存在する程度まで流体でなければならない。それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
製剤に用いることができる薬学的に許容される塩には、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される)を含み、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄、並びに有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から誘導することもできる。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの好適な混合物、及び野菜油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙した種々の他の成分とともに適切な溶媒中に取り込み、続いて、濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本分散媒及び上記のものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、活性成分の粉末と、その先に滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分とを生じる。
溶媒としてのDMSOの使用が、極めて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性剤を小さな腫瘍領域に送達すると考えられる場合には、直接注射のためのより多くの又は高濃度の溶液の調製も考えられる。
処方する場合、溶液は、投薬処方と適合する様式で、及び治療的に有効な量で投与される。製剤は、上述した注射可能な溶液のタイプのような種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用することができる。
水溶液中での非経口投与について、例えば、溶液は、必要であれば、好適に緩衝化され、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用可能である無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、1つの投与量を1mlの等張NaCl溶液に溶解し、1000mlの皮下注射液に添加するか、又は提案された注入部位に注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035～1038頁及び1570～1580頁を参照されたい)。投与量のいくらかの変動は、必然的に、処置される対象の状態に依存して生じる。投与責任者は、いずれにせよ、対象ごとに適切な用量を決定する。
CD40活性化タンパク質は、1回用量あたり約0.0001～1.0ミリグラム、又は約0.001～0.1ミリグラム、又は約0.1～1.0ミリグラム、又は1.0～約10ミリグラムを含むように治療用混合物内に製剤化することができる。また、複数回用量も投与することができる。
ワクチン組成物
本開示はまた、本開示のCD40活性化タンパク質及び薬学的に許容されるビヒクルを含むワクチンに関する。
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン」は、免疫応答を誘導するためにヒト又は動物に投与することができる組成物を意味することを意図し;この免疫応答は、抗体の産生、又は単にある細胞、特に抗原提示細胞、Tリンパ球及びBリンパ球の活性化をもたらすことができる。ある種の実施形態では、ワクチンは、ワクチンにおいて提供される抗原に関して、患者において中和抗体の産生をもたらす免疫応答を産生することができる。ワクチンは、予防目的又は治療目的のための組成物であり得るか又はその両方であり得る。
ワクチンは、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散された、本開示の有効量のCD40活性化タンパク質を含み得る。このような組成物は、接種材料とも呼ばれ得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性成分と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分を組成物中に組み込むこともできる。本開示のワクチン組成物は、古典的な医薬調製物を含み得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、及び油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
更に、所望であれば、ワクチンは、ワクチンの有効性を増強する湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、及び/又はアジュバント等の少量の補助物質を含有することができる。有効であり得るアジュバントの例としては、限定されないが、水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、MTP-PE及びRIBIが挙げられ、細菌から抽出された3つの成分、モノホスホリル脂質A、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格(MPL + TDM + CWS)が2%スクアレン/Tween80エマルジョンで含まれる。アジュバントの他の例としては、DDA(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)、フロイントの完全アジュバント及び不完全アジュバント、及びキルAが挙げられる。更に、リンホカイン(例えば、IFN-[ガンマ]、IL-2及びIL-12)等の免疫調節物質、又はポリI:C又はポリICLC(Hiltonol)等の合成IFN-[ガンマ]誘導物質を、本明細書に記載のアジュバントと組み合わせて用いることができる。
ある種の実施形態では、アジュバントは、ポリICLC、CpG、LPS、Immunoquid、PLA、GLA、又はIFNα等のサイトカインアジュバントの中から選択され得る。他の実施形態では、アジュバントは、Toll様受容体アゴニスト(TLR)であり得る。使用され得るTLRアゴニストの例は、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト又はTLR9アゴニストを含む。
活性免疫原性成分としてのCD40活性化タンパク質のワクチン調製物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製することができ;感染前の液体中の溶液又は懸濁液中の溶液に適した固形形態も調製することができる。調製物は、乳化され、リポソーム中にカプセル化され得る。活性な免疫原性成分は、しばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合性である担体と混合される。
本開示のCD40活性化タンパク質の使用方法
CD40活性化タンパク質に存在する抗原に対する免疫応答を誘発することにより、本開示のCD40活性化タンパク質は、薬物、特にがん又は感染性障害を処置又は予防するために有用であり得る。
一部の実施形態では、CD40活性化タンパク質は、本開示のCD40活性化タンパク質を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染又はがん障害を処置又は予防する方法において使用され得る。
更に別の態様は、それを必要とする対象において、ウイルス又は腫瘍関連抗原に対するB細胞及び/又はT細胞応答を誘発及び/又は増強するための方法であって、それを必要とする対象に、本開示のCD40活性化タンパク質又はワクチンを投与することを含む方法に関する。
更なる態様は、本開示のCD40活性化タンパク質又は開示のワクチン組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における抗原に対するIgG結合抗体応答を誘導する方法に関する。
一部の実施形態では、本方法は、免疫刺激剤の投与を更に含む。一部の実施形態では、免疫刺激剤は、ワクチン又は治療組成物に逐次的に又は同時に投与される。
一部の実施形態では、免疫刺激剤は、対象へのワクチン組成物の注射に先立って、即座にワクチン組成物と混合される。
更に、本開示の方法はまた、1つ又は複数のアジュバントの投与を含み得る。アジュバントは、直接的又は間接的に、抗原又はCD40活性化タンパク質等のワクチン成分の1つ又は複数に結合又はコンジュゲートされ得る。他の実施形態では、アジュバントは、ワクチン組成物とは別個に提供又は投与することができる。ある種の実施形態では、アジュバントは、ポリICLC、CpG、LPS、Immunoquid、PLA、GLA、又はIFNα等のサイトカインアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは、Toll様受容体アゴニスト(TLR)であり得る。使用され得るTLRアゴニストの例は、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト又はTLR9アゴニストを含む。
一部の実施形態では、投与は、皮内、筋肉内、又は皮下投与を含む。
一部の実施形態では、ウイルスワクチン、例えば、ウイルス抗原を含むCD40活性化タンパク質は、本明細書に記載されるウイルスワクチンを患者に投与することを含む、少なくとも1つのウイルスエピトープに対する免疫応答を増強する方法において使用される。
一部の実施形態では、このようなウイルスワクチンは、本開示のこのようなウイルスワクチンを、例えば、上記ウイルスに感染していない健康な対象に投与することを含む、上記ウイルスに感染される健康な対象を予防するために使用される(予防的処置)。他の実施形態では、本開示のウイルスワクチンは、ウイルス感染の初期段階の患者を処置する方法において使用され、上記ウイルスワクチンを患者に投与することを含む。
少なくとも1つのウイルス抗原は、宿主、好ましくはヒト患者又は霊長類において、体液性及び/又は細胞性免疫応答の少なくとも1つを誘発することが企図される。
本開示によるワクチン又は医薬組成物の投与は、最大(又は場合によっては最小)免疫応答のための部位への抗原の送達を最大化するために、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介して行われる。ワクチンの投与は、一般的に、同所性、皮内、粘膜、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射によって行われる。他の送達領域には、経口、鼻腔、口腔、直腸、膣又は局所がある。本開示のワクチンは、好ましくは、非経口的に、注射によって、例えば、皮下又は筋肉内のいずれかで投与される。
本開示のワクチン又は医薬組成物は、投薬処方と適合する方法で、並びに予防的及び/又は治療的に有効な量で投与することができる。投与される量は、例えば、対象の免疫系が抗体を合成する能力、及び所望の保護又は処置の程度を含む、処置される対象に依存する。好適な投与量範囲は、約0.1mg～1000mgの範囲、例えば、約1mg～300mgの範囲、又は約10mg～50mgの範囲で、ワクチン接種あたり数百マイクログラムの活性成分である。
投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各対象に特有であり得る。本開示のCD40活性化タンパク質の処置有効量は、特に、投与スケジュール、投与される抗原の単位投与量、CD40活性化タンパク質が他の処置剤と組み合わせて投与されるかどうか、レシピエントの免疫状態及び健康、及び特定のCD40活性化タンパク質の処置活性に依存することが当業者には明らかである。
ワクチンは、典型的には、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールで投与され得る。複数回投与スケジュールは、ワクチン接種の初回コースとして、例えば、1～10回の別々の投与、続いて、免疫応答を維持又は強化するために必要なその後の時間間隔で、例えば、1～4ヵ月の2回目の投与、及び必要であれば、数ヵ月後の2回目の投与を含めることができるものである。望ましいレベルの防御免疫を維持するためには、通常3年間、1～5年間の間隔で定期的に追加免疫を行うことが望ましい。免疫化の経過に続いて、抗原と共培養された末梢血リンパ球(PBL)のインビトロ増殖アッセイ、及びプライミングされたリンパ球から放出されたIFN-[ガンマ]のレベルを測定することによって、免疫化を行うことができる。アッセイは、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光標識等の従来の標識を用いて行うことができる。これらの技術は当業者に公知であり、米国特許第3,791,932号、同第4,174,384号、及び同第3,949,064号に見出すことができる。
ワクチンは、1つ又は複数の「単位投与量」で提供され得る。単位投与量は、その投与に関連して所望の反応を生じるように計算された所定量のワクチン、即ち、適切な経路及び処置レジメンを含むものとして定義される。投与される量、及び特定の経路及び製剤は、臨床分野の当業者の技術の範囲内である。処置される対象もまた、特に、対象の免疫系の状態及び所望の防御を評価することができる。単位投与量は、単回注射として投与する必要はないが、設定された期間にわたる持続注入を含み得る。送達されるワクチンの量は、約0.001～約0.05mg/kg体重、例えば、対象あたり0.1～5mgの間で変動し得る。
更なる態様は、本開示のCD40活性化タンパク質、本開示の核酸、本開示の発現ベクター、又は本開示の宿主細胞を含むキット;及び任意に、本キットの使用のための指示を含むキットに関する。キットは、本明細書に記載される方法を行うために使用され得る。一部の実施形態では、キットは、対象においてT細胞応答及び/又はB細胞応答を誘発するためであり、キットは、本開示のCD40活性化タンパク質又は本開示のワクチンを含む。
本開示は、以下の実施例によって更に例示される。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
1.方法
MDDC作製方法-プロトコール
1Mヒト血液単球/mLを、RPMI培地+10%FBS+10ng/mLヒトIL-4+100ng/mLヒトGM-CSF中の6ウェルプレート(2mL/ウェル)中で培養した。培地の半分を2日目及び4日目に交換し、同濃度のIL-4及びGM-CSFを維持した。細胞を5日目に、擦り取ることなく、穏やかに洗浄して採取し、96ウェルv底部プレート中にウェルあたり100,000個の細胞で200μLで播種した。典型的には、1M DCは2M単球から誘導された。異なる濃度の抗CD40 mAb又は抗CD40 IgG4融合タンパク質及び10ng/mL IL-4及び100ng/mL GM-CSFを添加し、24時間又は48時間後に、上清を分泌されたサイトカインについて試験し、細胞を細胞表面活性化マーカーについて染色した。
表面プラズモン共鳴(SPR)結合アッセイ-プロトコール
表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイ結合測定をSensiQ Pioneer装置(SensiQ Technologies, Inc.社, Oklahoma City, OK, USA)で行った。プロテインA又はプロテインG(10mM NaAc pH4.5中100μg/mL)を、製造業者の推奨プロトコールに従って、25℃でCOOH2又はCOOH5センサチップ上のアミンカップリング化学を用いて固定化した。泳動緩衝液は、10mM HEPES、3.4mM EDTA、0.005% Tween20、8.8g/L NaCl、pH7.5であった。続いて、チャンネル1を用いて125nMの濃度の抗CD40 mAbを注入し(注入高速、10μL/分で4分間):チャンネル1-2を用いて、コヒーシン-ヒトCD40エクトドメインタンパク質(P3398)の希釈シリーズ(25、12.5、6.25、3.125、1.6、0.8nM、25μL/分で2分間)を注入し;最後に、表面を20mM NaOHで1分間(25μl)の注入により再生した。結合データをQdatソフトウェア(SensiQ Technologies, Inc.社)で分析した。
T細胞拡大-プロトコール
解凍し、洗浄した後、2M PBMCを、24ウェル平底プレート中の1mL cRPMI+10%AB血清中のO2の存在下、37℃で培養した。細胞を、異なる濃度(1nM、0.1nM及び0.01nM)のaCD40 abs又は対照で処理した。培養終了時に十分なT細胞を得るために、条件を3重にして行った。2日目に、1mLのcRPMI+100U/mLの最終濃度の10%AB血清及びIL-2を各ウェルに添加した。培地の半分は、濃度を2倍にすることなく、4日目及び6日目に新鮮なIL-2を添加して交換した。細胞を10日目まで休ませ、その時点で採取し、2mM EDTAでPBS中で2回洗浄した。次に、細胞を、必要とされる条件間で細胞の等しい分布を可能にする容量のcRPMI+10%AB血清中に再懸濁し、条件あたり200μLの最終容量で、計数し、50mLチューブ中のO2の存在下、37℃でO/Nを休ませた。
11日目に、細胞を96ウェルプレートV底部に播種し、O2の存在下、37℃で1時間、2μMペプチド又は対照で再刺激した。1時間後、0.175μLのゴルジストップ及び0.45μLのブレフェルジンを50μLのcRPMI+10%AB血清の容量で各ウェルに添加し、細胞を更に4時間インキュベートした。その後、細胞をスピンダウンし、以下の抗体:αCD3 BV711、αCD4 Pe-Cy7、αCD8 Pacific Blue、αCD56 Pe-Cy5、αCD16 APC-H7、αCD45 Pacific Orange、αNKG2C Alexa Fluor 700、αNKG2D PECF594、αCD69 FITC、αTNF-α APC、αINF-γ PEを用いてICS染色を行った。Aquaを生存染料として使用した。染色後、細胞をBD固定液に再懸濁し、BD LSR IIフローサイトメーターで分析した。
Bセル細胞増殖アッセイ-プロトコール
ヒトPBMCを、RPMI培地(5mL中1μL)中のベンゾナイド1:10を用いて解凍し、細胞をPBS中で2×洗浄し、PBS中でCf10M/mLを有するように再懸濁し、次に暗所で7分間RTにてCSFE Cf 1.25μM(Ci=5mM)で染色した。10mLのFBSを加え、細胞を冷所に5分間放置し、次にPBS中で2×洗浄し、10%FBSを含むRPMI培地中に再懸濁して、1M細胞/mLをウェルあたり分配した。ヒトIL-4(10ng/mL)及びヒトIL-21(5ng/mL)を、6日間、種々の量の抗CD40 mAb又は抗CD40 IgG4融合タンパク質とともに細胞に添加した。CD19 APC:1μl;CD27 APC-H7:1μl;CD38 PE-Cy7:0.5μl;生/死Aqua:1μl。
樹状細胞活性化アッセイ-プロトコール
1Mヒト血液単球/mLを、RPMI培地+10%FBS+10ng/mLヒトIL-4+100ng/mLヒトGM-CSF中の6ウェルプレート(ウェルあたり2mL)中で培養した。培地の半分を2日目及び4日目に交換し、同じ濃度のIL-4及びGM-CSFを維持した。細胞を5日目に、擦り取ることなく、穏やかに洗浄して採取し、96ウェルv底部プレート中に200μL、100,000細胞/ウェルで播種した。典型的には、1M DCは2M単球から誘導された。異なる濃度の抗CD40 mAb又は抗CD40 IgG4融合タンパク質及び10ng/mL IL-4及び100ng/mL GM-CSFを添加し、24時間又は48時間後に、上清を分泌されたサイトカインについて試験し、細胞を細胞表面活性化マーカーについて染色した。
HIV5長いペプチドを用いるT細胞増殖アッセイ:ICS-プロトコール
すべての培養は、cRPMI中の10%AB(濾過しない)で行われる:
cRPMI
Hepes (1M)[500mlあたり12.5ml]
NEAA (10X)[500mlあたり5ml]
2ME (1000X)[500mlあたり450μl;50uM最終]
ピルビン酸ナトリウム(10 X)[500mlあたり5ml]
Pen Strep (10,000U/10,000U)[500mlあたり5ml]
NaOHでpHを7.4にする
細胞を10%AB cRPMIで解凍する(細胞の最初の希釈において50Uベンゾナーゼを用いる)
1×PBS、2mM EDTAで2×洗浄する。10%AB cRPMI中で、2×10e6/mlの濃度で、50mlのルーズキャップ付きチューブ中で細胞を再懸濁し、細胞を37℃ C02 5%で一晩静止させる。
翌日(0日目):生存率/密度に基づいて、2×10e6/ml(ウェルあたり)*に再計数し、調整する。
0日目:24ウェルプレートに細胞を播種する:
試験分子の条件ごとに約6ウェルの標的(したがって、T細胞増殖の終わりに十分な細胞が存在する。再刺激のための対照として、試験分子を含まない「細胞のみ」のセットも必要である)
・(典型的には、4種類の異なる試験分子及び陰性細胞のみの対照を試験する場合、これには6×10e7ドナーPBMCが必要である)
10%AB cRPMI中の2×10e6/ウェル(セットアップ時に1ml)*で24ウェルプレートに細胞を播種する
1nMの「最終」**で試験分子を加える
・これは50μl体積で行い、1mlの細胞に加えることができる。
・又は、細胞及び試験分子(500μl+500μl)*の「等量」添加のために細胞体積を調整する。
・**試験分子の範囲を30nMから0.1nMの間で試験した:本発明者らの比較ワクチン評価のために、1nMを最終的に使用している。
・濃縮されたストックから新鮮なものを作り、低濃度のタンパク質を貯蔵しない。
2日目:培養セットアップ及びタンパク質刺激後、IL2含有10%AB cRPMI 1mlを加える(ウェル中の最終IL-2濃度が100U/mlになるようにする)。
4日目:1mlを取り除き、10%AB cRPMI中の100U/ml IL2 1mlを加える。
6日目:1mlを取り除き、10%AB cRPMI中の100U/ml IL2 1mlを加える。
8日目:試験分子の条件(試験分子、細胞数、及びタイプ/形態により異なる)ごとにすべてのプールを採取する。IL2を洗い流す(1×PBS、2mM EDTAで2×洗浄する)。10%AB cRPMI中で、2×10e6/mlの濃度で、50mlのルーズキャップ付きチューブ中で細胞を再懸濁し、細胞を37℃でCO2 5%で一晩静止させる。
9日目:フィルター(CD40L構築物で凝集した細胞)を濾過し、ペプチドによる再刺激を可能にするために、同量の細胞(ドナーあたりに蓄積した全細胞あたり)を計数し、分注する。(細胞数/生存率はPBMCドナーごとに異なる;ペプチド条件は同じままである)典型的には、細胞はドナーに依存して、試験時点あたり約100万～500万個である。細胞を100μl体積で播種する。
ペプチド刺激を96ウェル-V底プレートにセットアップする:
V底96ウェルプレート中の100μlの細胞(100μlあたり約1～5×10e6)+100μlのペプチド(又は溶媒/対照SEB):(各ドナー間で7条件に分割する)
溶媒(使用されるペプチドの最高量の最高体積)、10μMのペプチド(2μM～10μMで使用可能)、2μg/mlのSEB。1時間、37℃、CO2 5%。
37℃、CO2 5%で1時間刺激した後、0.175μlのゴルジストップ/0.45μlのブレフェルジンA:(BDゴルジストップ、Cat 51-2092KZ; ブレフェルジンA、Cat 420601)を含有する50μlの10%AB cRPMI培地を加える。
37℃、CO2 5%で4時間後、細胞内染色に進む。
細胞内染色プロトコール:
・96ウェルV底プレートに続き、ペプチド再刺激後、ゴルジ/BFAブロック:
・細胞(1×w/200μl 1×PBS)を洗浄する:(Cfg 1600 RPM 10分間;洗浄液を除去するためにプレートを動かす)
・4℃で20分間、50μLのAqua*(必要とされる試料あたり1μl Aqua/50μlの1X×PBS)で細胞を再懸濁する。
・細胞を洗浄する(FACS緩衝液で200μl中1×):(Cfg 1600 RPM 10分間;洗浄液を除去するためにプレートを動かす)
・細胞表面マーカーのカクテル(αCD3 Per-CP 3μL、αCD4 PE-Cy7 0.5μL及びαCD8 Pacific Blue 1μL)中で細胞を、FACS緩衝液の総体積50μL/試料中で氷中30分間染色する。
・細胞を洗浄する(FACS緩衝液で2×):(Cfg 1600 RPM 10分間;洗浄液を除去するためにプレートを動かす)
・細胞を200μLのCytofix/Cytoperm**溶液に4℃で20分間懸濁する。
・その後、細胞をスピンし、次に、1×濾過された(0.45μm)Perm/Wash**溶液中で細胞を2×洗浄する。
・抗サイトカインのカクテル(αTNFα APC 1μL及びαINFγ PE 2μL)中で細胞を、総体積50μL Perm/Wash**/試料中で染色する。
・RTで30分間インキュベートする
・細胞を洗浄する(Perm/Wash*緩衝液で2×):(Cfg 1600 RPM 10分間、洗浄液を除去するためにプレートを動かす)
・BD固定液(1試料あたり約200μl)に再懸濁する。
**BD固定/透過キットカタログ#554714
FACS緩衝液:PBS+2%FCS又はBSA+2mM EDTA
BD固定安定化固定剤3×濃縮液:水中1:3 カタログ#338036
*Aqua生/死Invitrogen L34966(チューブあたり50μl DMSOを再構成し、1μl/試料を使用する)
CD40受容体クラスター形成アッセイ-プロトコール
ヒトCD40-eGFP又はヒトCD40-mCherrry融合タンパク質を安定に発現するExpiCHO-S細胞(Thermo Fisher社)を、CD40クラスター形成を研究するためのモデルとして使用した。細胞をCD CHO/M5培地(Gibco社)中で1E6細胞/mLの濃度で、直径25mmの丸いカバースライド(Electron Microscopy Science社)を有する6ウェルプレート中で、10nM抗CD40抗体の存在下で37℃にてインキュベートした。1時間後、カバースライドをPBSで2回穏やかに洗浄し、次に室温で10分間、1%PFA(Thermo Fisher社)に再懸濁した。PBS中で更に2回洗浄し、最後に、DAPI(Invitrogen社)を用いたProLong Gold antifade試薬を用いて、超凍結顕微鏡スライド(Fisherbrand社)上にカバースライドを載せた。スライドは、暗所で室温に一晩放置した。翌日、スライドをLeica TCS SP5共焦点顕微鏡で画像化し、続いてImageJソフトウェアで分析した。
抗CD40 mAb内在化アッセイプロトコール
ヒトCD40cDNA挿入物(NM_001250.6残基31～864、C928)を担持するCET 1019 HS-puro-SceIベクター(Millipore Sigma社)で安定にトランスフェクトされたCHO細胞を、ピューロマイシン選択とともにCD CHO/M5培地(Gibco社)中で増殖させ、バルクを安定にトランスフェクトした。細胞は、V底部96ウェルプレート中の1%BSA(250K/50μl)と、そのH鎖C末端で、コヒーシン-mCherry融合タンパク質と非共有結合的に会合したフレックスV1 Doc Var1モジュール(Flamarら、2012)に融合した100nmの各試験mAb(C3808、セルローソーム足場タンパク質A[Hungateiclostridium thermocellum]由来のコヒーシンドメインに融合したLDITH6残基、f1可撓性リンカーを有するWP_065674352.1残基1044～1213、mCherryに対するAVY25163.1残基580～608、MLをコードするコドンの後であり、コードされた分泌型タンパク質をCタグ親和性マトリックスCaptureSelect(商標)(Thermo Fisher社、191307005)精製用に使用されたKEPEA配列の前のANF29837.1残基330～562)とを含む細胞培地中に分散された。試験した抗体は、これらの細胞上のCD40結合部位を100nMで飽和する(データは示さない)。30分間隔で、標識された抗体複合体を、細胞培養インキュベーター内で37℃に保った細胞に添加し、最後の(ゼロ)時点で、等量の氷冷PBSを、動かすことによる液体除去で1600rpmで6分間の遠心分離でにより全ての時間点に添加した。次に、110μlの冷PBSを1回の時間経過列(全結合分析のため)に添加し、100μlの氷冷0.1Mグリシン、0.1M NaCl pH2.5を、並列時間経過列(即ち、細胞表面結合mAbを選択的に除去するための酸ストリッピング処理)に添加した。1分後、10μlの1M Tris HCl pH9を酸を中和するために酸処理行に添加し、更に100μlの冷PBSを全列に添加し、続いて動かすことによる液体除去で1600rpmで6分間遠心分離した。この期間の酸処理ではmCherry蛍光が損なわれないことに留意されたい(データは示さない)。PBS中での最終洗浄の後、細胞を100μlのPBS中に再懸濁し、SpectraMax Paradigm装置(Molecular Devices社)中でEx 570_Em 625nMで蛍光を読み取るために、75μlをBlack Fluor Micro2プレート(Thermo Fisher社)中に分注した。
例示される配列命名規約:
11B6-5
PAB3405
・rAB-pIRES2[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-]
・rAB-IRES2-CI2[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
C3677 rAB-pIRES2[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]
配列番号1
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS-
+ C3862 rAB-IRES2-CI2
C3682 rAB-IRES2-CI2[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
配列番号2
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS-
PAB3408
11B6-8
・rAB-pIRES2[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
・rAB-IRES2-CI2[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
C3678 rAB-pIRES2[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
配列番号3
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
C3682 rAB-IRES2-CI2[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
配列番号4
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS
これらの2つから、CD40Lを付着させた2つのバリアントを誘導した:
PAB3470
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]
C3724rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]
配列番号5
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
+C3725 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]
配列番号6
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS-
PAB3471
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
C3724 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]
配列番号5
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
+C3726 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
配列番号8
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
本発明者らはHIV-5pepを付着させるためにPAB3470を選択した
PAB3499(CD40Lなし)
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
C3735 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]
配列番号9
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS
+C3739 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
配列番号10
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS
PAB3498
・rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]
・rAB-cetHS-puro[m抗体-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]
C3735 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]
配列番号11
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQAHGQGLEWIGRINPYNGATSYNQNFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREDYVYWGQGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS
+C3524 rAB-cetHS-puro[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]
配列番号12
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
配列番号13:CD40L
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
リーダー又はシグナル配列1～20;
エクトドメイン残基21～193;
膜貫通配列194～215;
細胞質配列216～277。
これは、UniProtKB-P25942(TNR5_HUMAN)によって報告されているように、「標準的」配列として選択されたアイソフォームであり、配列バリアントも記載している。
他のCD40抗体:HC及びKCの可変ドメイン配列
H鎖のV領域の末端のアミノ酸は通常リジンであるが、より典型的にはセリンで置き換えられる(CP配列のように、これは活性に影響しない)。
12B4 HC [m抗-CD40_12B4.2C10_H-LV-hIgG4H-C]
Figure 0007640466000004
12B4 KC [m抗-CD40_12B4.2C10_K-LV-hIgGK-C]
Figure 0007640466000005
12E12 HC [m抗-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C]
Figure 0007640466000006
12E12 KC [m抗-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C]
Figure 0007640466000007
12E12 H2ヒト化HC [h抗-CD40VH2-LV-hIgG4H-C]
Figure 0007640466000008
12E12 H3ヒト化HC [h抗-CD40VH3-LV-hIgG4H-C]
Figure 0007640466000009
12E12 K2ヒト化KC [h抗-CD40VK2-LV-hIgGK-C]
Figure 0007640466000010
Pfizer HC[m抗-hCD40_CP870893H-LV-hIgG4H-C]
Figure 0007640466000011
Pfizer KC [m抗-hCD40_CP870893K-LV-hIgGK-C]
Figure 0007640466000012
24A3 HC [m抗-hCD40_24A3.3F1_H-LV-hIgG4H-C]
Figure 0007640466000013
24A3 KC [m抗-hCD40_24A3.3F1_K-LV-hIgGK-C]
Figure 0007640466000014
ドッカリンドメインに融合された11B6 hCD406ヒト化HC-これは11B6 hCD40Lヒト化KCと対合した場合[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド]、任意のコヒーシン-抗原融合と非共有結合的なカップリングのためにヒト化11B6-CD40L-ドッケリンを作製する。
完全配列(C3724) FlexV1(下線) hCD40L(マーカー)
11B6 hCD40Lヒト化HC [m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-ChermoDockerin] (C3737) (ChermoDockerin)(マーカー)
可撓性リンカーアミノ酸配列:
QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP(flexV1、配列番号15)
ASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSPAS(f1、配列番号56)
PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(f2、配列番号130)
TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(f3、配列番号53)
TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(f4、配列番号:54)
2. 結果
部分アゴニスト抗CD40抗体を含むいくつかのアゴニストはCD40活性化のために可溶性CD40Lと相乗作用することができる。
抗原活性化CD4+ヘルパーT細胞上に発現されたCD40Lが、サイトカインであるインターロイキン-4及びインターロイキン-21を分泌するCD40Lと関与した場合、B細胞の増殖が駆動され、これは、典型的にはリンパ器官の胚中心に限定される事象である。本発明者らは、IL-4及びIL-21の存在下でヒト末梢B細胞の増殖を駆動する効果について、ヒトIgG4及びヒトκ軽鎖としてフォーマットされた抗ヒトCD40抗体の適合したパネルを試験した(図2)。これらの抗体は、順位CP>12E12≧12B4>11B6>24A3(CPはCP-870,893であり、様々な臨床試験で試験されたPfizer Inc.社の抗体である(Vonderheideら、2013))でアゴニスト効果の>100倍の範囲をカバーした。
可溶性CD40L(sCD40L)の固定された最適以下の濃度の存在下でこのアッセイを繰り返すと、12B4及び12E12抗体の用量反応に影響はなく、CP抗体の効力はわずかに増加したが、11B6及び24A3抗体との相乗作用(100倍以上)により、それらの効力が大幅に増加した(図2)。これら2つの弱いCD40アゴニストシグナルの相乗的な協力は、これらの特異的mAbとCD40との相互作用がCD40Lの生産的相互作用を増強するか、又はその逆を示唆している。単一細胞上の異なる受容体を活性化する物質間の相乗作用は周知の現象であり、例えば、アゴニスト抗CD40 mAbとFcRII(Dahanら、2016)との間に協調作用が観察され得るが、この場合、本発明者らの2つの活性化剤は同じ受容体型に作用している。
センチネル樹状細胞(DC)は、外来抗原及び病原体由来の危険シグナルに曝露された場合、同族抗原特異的T細胞に主要組織適合性分子(MHC)中の抗原ペプチドを処理し、提示する(Hivrozら、2012)。樹状細胞上に発現されたCD40は、隣接する抗原活性化T細胞上に発現されたCD40Lと相互作用し、この事象は、部分的には、細胞表面DC活性化分子(例えば、CD68及びHLA)の発現の増加、及びDCによる炎症性サイトカインの分泌(Ma及びClark、2009)を誘発することを介して、免疫を開始するために重要である。したがって、本発明者らは、成熟ヒト単球由来DC(MDDC)上でサイトカイン分泌を開始するそれらの能力について、抗CD40ヒトIgG4 mAbのパネルをアッセイした。B細胞増殖アッセイと同様に、これらの抗体は、同様の>1000倍の有効性範囲にわたってサイトカイン産生を誘発し、同様の順位CP>12B4≧12E12>11B6>24A3であった(図3)。sCD40Lの最適用量以下でアッセイした場合、12B4及び12E12抗体の用量反応に影響はなかった。しかしながら、低用量sCD40LはCP抗体の効力を約100倍に増加させ、一方、sCD40Lと11B6及び24A3抗体との間では、DC活性化に対する強い相乗作用(100倍以上)が再び観察された(図3)。抗体単独とsCD40Lを有する抗体との間の有効性の差は、B細胞増殖アッセイで観察されたよりも大きく、MDDC上のこれら2つのアゴニストタイプ間の協力の可能性がより大きいことを示した。
本発明者らが研究した抗ヒトCD40 mAbsのパネルはすべて、表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した場合、CD40に対して比較的高い親和性で結合し、オン速度について11B6>12B4>12E12>24A3>CPの順位であり、オフ速度について12B4>11B6>24A3>12E12>CPの順位であった(Table 1(表1))。アゴニスト抗CD40抗体を用いたこれまでの研究では、これらの動態パラメータと活性化能との間に明らかな相関は示されておらず(Hagarら、2003)、本研究内のmAbについてSPRデータはこの結論と一致している。
sCD40LとCD40の抗CD40mAb活性化との間の相乗作用の1つの可能なメカニズムは、CD40エクトドメイン上の別々の部位へのそれらのアクセスを介するものであり得る。アゴニスト抗CD40L mAb CDX-1140は、CD40Lとは異なる部位でCD40と相互作用し、sCD40LとこのmAbとの間に同様の相乗作用が観察されることが公知である(Heら、2016)。
このように、本発明者らは、本発明者らの抗ヒトCD40 IgG4抗体のパネルについて、L細胞の表面に発現するCD40LへのCD40の結合を阻害する能力について試験した。化学量論的量の12B4及び12E12抗体は、CD40の細胞表面CD40Lへの結合を妨げ、一方、CD40Lへの結合を部分的にさえ遮断するためには、>20倍高いレベルのCP抗体が必要であった。一方、11B6及び24A3抗体は、最高のmAb用量においてさえも、CD40Lへの結合において最小の影響を及ぼした(図4)。
これらのデータは、元のマウス抗体として、又はhIgG4として再フォーマットされたこれらのmAbについて一貫していた。それらの親和性定数(Table 4(表6))に基づいて、これらの抗体はすべて、12E12及び12B4 mAbがCD40L結合を完全に遮断する、1μg/mlの重要な判別濃度において、完全にCD40結合部位を占めていた。これらのデータは、12B4及び12E12 mAbがCD40-CD40L相互作用に絶対的に必要とされるCD40上の部位に結合し、一方、CP、11B6及び24A3 mAbはCD40-CD40L相互作用に最小の干渉でCD40部位に結合することを示している。
このように、B細胞及びDC活性化に対するsCD40Lと抗CD40 mAbとの間の相乗作用は、CD40Lの異なる部分へのこれらの両方のアゴニストの同時アクセスと関連している。
アゴニスト抗CD40 mAbに融合した抗原は、CD40の活性化効果を鈍化させることができるが、いくつかの抗CD40 mAb-抗原融合体は、sCD40Lと相乗的に作用し、CD40の活性化能力を回復させる
キメラ又はヒト化アゴニスト抗体のC末端への抗原の融合は、親抗体のアゴニスト特性を鈍化させ得るか又は排除し得る[Flamarら、2013]。H及び/又はL鎖C末端に移植されたGag、Nef、及びPol遺伝子領域由来のHIV-1長いT細胞エピトープに富むペプチドの連結されたストリングの有無にかかわらず、ヒトIgG4アイソタイプに適合する抗CD40抗体のパネル[Flamaerら、2013]を、ヒトB細胞増殖及びヒト樹状細胞活性化の誘発においてそれらの相対的有効性について試験した。
アゴニスト11B6、12B4、12E12、及びCP IgG4 mAbは、グリコシル化された可撓性リンカーが散在する連結された5つのHIV-1長いペプチド領域をそれらのH鎖C末端に移植した場合、B細胞増殖を誘導するための非常に弱いアゴニストとなった(図5)。11B6-HIV5pep及びCP-515pepのB細胞増殖能力をsCD40Lの最適以下のレベルに加えて、sCD40Lとともにインキュベートした類似の「裸の」抗CD40 11B6及びCP mAbのレベルに特徴的なレベルまで回復させたが、12B4-HIV5pep又は12E12-HIV5pep mAbには有意な効果を示さなかった(図5)。
これらの同じ4つの抗CD40-HIV5pep融合タンパク質はまた、MDDC上の活性化マーカーの上方制御に対して非常に低い効力を有し、sCD40Lの最適以下のレベルは、11B6-HIV5pep及びCP-HIV5pepの活性を増強したが、12B4-HIV5pep又は12E12-HIV5pep融合タンパク質には影響を及ぼさなかった(図6)。しかしながら、sCD40L増強の程度は、11B6及びCP「裸の」mAbで観察されたものよりも約5～10倍低かった(図6)。
sCD40Lは、抗CD40.HIV5pepと協働して、HIV-1感染個体由来のPBMC中の抗原特異的記憶CD8+T細胞を拡大する
PBMC及びDC-T細胞の共培養系は、DC標的化プロトタイプワクチン構築物を検証するため、特に、例えば、細胞性T細胞応答を標的とするための最良の受容体を選択するため(Yinら、2016)、並びに選択された融合抗原の、CD4+とCD8+T細胞応答の両方に対する広範なT細胞ペプチド特異性を誘発するための有効性を確認するため(Flamarら、2013)のインビトロアッセイに有用である。このような試験に基づくと、CD40標的化は特に魅力的であるが、しかしながら、初期エンドソームDCコンパートメントへの特徴的な抗原内在化に伴うCD40の活性化の潜在的寄与については取り上げられていない(Chattergeeら、2012; Yinら、2016)。
本発明者らは、低用量のsCD40Lとともに及び伴わずに、HIV-1+ドナーPBMC培養物において、HIV-1抗原特異的T細胞拡大に対するHIV5pepに融合した抗CD40 mAbの有効性を試験した。抗原特異的CTL拡大の顕著な増大は、抗CD40 11B6及びCP HIV5pepワクチンとの最適以下のレベルのsCD40Lの同時投与によって観察されたが、抗CD40 12E12及び12B4 HIV5pepワクチンとの同時投与では観察されなかった(図7)。
アゴニスト抗CD40抗体に融合したCD40Lは、CD40の活性化を最大限にすることができる
sCD40Lとアゴニスト抗CD40 mAbの相乗的協力は、例えば、活性化T細胞上のCD40Lを、mAbによってすでに占有されているDC上のCD40にアクセスさせることを介して、インビボでの価値あるな特性であり得る。或いは、アゴニスト抗CD40 mAb及びsCD40Lを、インビボで同時に送達して、インビトロで観察された増強されたCD40活性化を介して、可能性のある治療上の利益を得ることができる。
三量体sCD40Lは、前臨床研究(Stoneら、2009)において有効性が示されており、sCD40LとアゴニストmAbの相乗作用を有するmAbとの組み合わせの実際の臨床検証のために、将来的に利用可能となる可能性がある。
ここでは、本発明者らは、sCD40LをアゴニストmAbと物理的に結合させるという新規な概念を、単剤の高活性アゴニストを確立することの明らかな潜在的利点と直接融合させることによって探索した。この目的のために、ヒトCD40Lの全エクトドメインを、グリコシル化に富む可撓性リンカー配列(flex V1と呼ばれる、又はASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS(配列番号15);Flamarら、2013)を介して、抗CD40mAbのL鎖C末端に融合させた。これらの「二価の」抗CD40-CD40L mAbは、均一な分泌産物として293及びCHO細胞において効率的に発現された(データを示さず)。
CD40Lに融合した抗CD40 IgG4 mAb 11B6及び12B4を、B細胞増殖の誘発におけるそれらの有効性について、非融合mAbと比較して試験した。これらのCD40L融合mAbの両方は、このアッセイにおいて非常に強力であり、最適以下のsCD40Lと同時投与された非常に強力なCPmAbの有効性に一致した(図2を参照されたい)。いずれの場合も、CD40L付加物は親mAbの効力を大きく増加させ(11B6では>1,000倍、12B4では>100倍)、11B6 mAbの増加はsCD40Lとの同時投与の場合よりも10倍以上強力であった(図8)。対照IgG4 mAbに融合したCD40Lはまた、B細胞増殖の誘導に活性であったが、11B6及び12B4-CD40L融合タンパク質よりも約10倍低く(図8)、CD40Lと抗CD40抗体結合との直接結合を介した組み合わせの利点を強調した。
CD40Lに融合された抗CD40 IgG4 mAbの全パネルを、DC活性化の誘発におけるそれらの有効性について、非融合mAbと比較して試験した。注目すべきことに、12E12を除くすべてのmAbにCD40Lを直接連結させると、11B6、CP、及び24A3 mAbに、連結していないsCD40Lを添加することにより観察された相乗作用と比較して、それらの効果(即ち、最大応答)が劇的に増加した(図9)。更に、CD40占有に関してCD40Lと直接競合するB細胞増殖アッセイmAb 12B4と一致して、CD40L融合からも大きな恩恵を受けた(図9)。対照(非DC結合)IgG4に直接融合されたhCD40LはMDDCに対して最小限の活性しかもたず、CD40L-抗CD40mAb融合アプローチがDC活性化に対して優先的に有効であることを示唆していることに留意されたい。
アゴニスト抗CD40 mAb 11B6にCD40Lを直接連結させると、親和性及び活性化効果が増加する
本発明者らは、SPR分析を用いて、L鎖C末端に融合したCD40の抗CD40 11B6及び抗CD40 12E12 mAbのCD40結合動力学への影響を裏付けるために、それらをプロテインA/G表面上に固定化し、液相中でそれらの上に可溶性ヒトCD40エクトドメインを流動させた。抗CD40 12E12 mAb上のCD40L付加物は、親の抗CD40 12E12 mAbと比較して、抗体のオン又はオフ速度を有意に変化させなかった(データを示さず)。これは、抗CD40 12E12 mAbがCD40上のCD40L結合部位に対して競合し、L鎖と同様に融合されたCD40Lを有するヒトIgG4対照mAbが、このフォーマットでCD40に対して検出可能な結合を示さなかったことから予想された(データを示さず)。対照的に、抗CD40 11B6 mAb上のCD40L付加物は、親の抗CD40 11b6 mAbと比較して、抗体オフ速度を有意に変化させた(データを示さず)。具体的には、オン速度はわずかに影響を受けたが、オフ速度は約15倍減少し、これはCD40への結合における抗CD40 mAbとCD40Lとの間の協同性を示した。
抗原融合により鈍化した抗CD40 mAbのアゴニスト特性は、それらの軽鎖C末端にCD40Lを直接融合させることにより回復させることができる
抗CD40 mAbのアゴニスト特性は、いくつかの抗原への融合を介して減少又は排除され得る。例えば、H鎖C末端に融合されたHIV5pep抗原は、11B6、12B4、又は12E12 mAbビヒクルによって担持された場合、アゴニスト特性を大幅に低下させるが、同時投与されたsCD40Lは、抗CD40 11B6 HIV5pep融合タンパク質の活性を増強する(図5及び図6)。同様に、CD40Lの抗CD40 11B6-HIV5pepタンパク質のL鎖への融合もまた、B細胞増殖及びMDDCサイトカイン産生の活性を増強する(図10A)。図10Bは、H鎖C末端にHIV5pep抗原を担持する抗CD40 11B6(図L2中の11B6-HIV5pep)が、B細胞増殖アッセイによって決定した場合、CD40活性化に対して最小の有効性を有することを示す。しかしながら、低用量のsCD40L(11B6-HIV5pep+sCD40L)の添加又はL鎖C末端へのヒトCD40Lの融合(11B6-CD40L-HIV5pep)は、CP-970,893 IgG4抗体によって達成され得るより大きな程度まで、高度に強力なCD40活性化をもたらす。
CD40Lに直接融合した抗CD40 11B6 mAbは可溶性CD40Lの高度に活性な二量体-三量体形態と比較して優れたアゴニストである
MEGACD40L(登録商標)(Mega sCD40L)は広く使用されている(Kornbluthら、2012)高活性タンパク質であり、2つの三量体CD40リガンド分子がアディポネクチン/ACRP30/AdipoQのコラーゲンドメインを介して人工的に連結されている(Miconnet and Pantaleo、Vaccine 2008を参照されたい)。図10Cは、H鎖C末端に融合したHIV5pep抗原の有無に関わらず、ある用量範囲のMega sCD40L及び抗CD40 11B6-CD40L mAbに対するヒトMDDCの応答を示す。抗CD40 11B6-CD40Lは、このアッセイにおいてサイトカイン分泌を誘発するためにMega sCD40Lよりも約100倍活性であり、10nM抗CD40 11B6とともに投与されたMega sCD40Lよりも約100倍活性であり、これは、抗CD40 11B40とCD40Lとの物理的連結がこの非常に高い活性に必須であることを示した。重要なことに、H鎖C末端を介してHIV5pep抗原に連結した抗CD40 11B6-CD40Lはまた、Mega sCD40Lより約10倍活性であった。
アゴニスト抗CD40 mAb L鎖C末端へのCD40L融合体が、他の抗原と融合した状態でそれらのアゴニストの効力を増加させることができるかどうかを試験するために、本発明者らは、H鎖C末端で融合した場合のアゴニスト活性を、L鎖に直接融合したCD40Lの有無にかかわらず、連結されたHIV-1 Gag p24 Nef Gag p17(GNGと呼ばれる)又はHPV 16 E6/E7(HPVと呼ばれる)抗原と比較した。これらの2つの抗原は、親の11B6 mAbのB細胞CD40活性化の低効力を有意に鈍らせなかったが、CD40L鎖融合は、同時投与されたsCD40と等しいレベルまで活性化を増強した(図11)。H鎖C末端でGNGに、及びL鎖C末端でCD40Lに融合した11B6 mAbは、融合抗原のない11B6-CD40L mAbと比較してMDDC活性化に対して等価であり、11B6と11B8-GNGの両方はsCD40Lと強く相乗効果を示したが、一方、11B6-CD40L-GNGは11B6-GNG+sCD40と同等の効力を示した(図11)。これらのデータは、L鎖に融合したCD40Lが11B6-HPV+sCD40で見られる完全アゴニスト活性を回復させるという点で、HPV抗原と融合した11B6について同様であった(図11)。これらの11B6-CD40L抗原融合体は、CD mAb+sCD40Lと同様に、12B4-CD40L mAbで観察される強いアゴニスト活性に等価であった。興味深いことに、12E12-HPV mAbはsCD40L作用を妨げるが、抗CD40 12E12-CD40L-HPV mAbフォーマットは強いアゴニスト活性を回復させた(図11)。
抗CD40 11B6-CD40L-GNGタンパク質を用いてB細胞増殖において観察された十分に「高い」アゴニスト活性は、11B6-GNGの非常に弱いアゴニスト活性とは対照的に、11B6-CD40L-GNGに対するMDDCの高いサイトカイン分泌反応によって再現された(図12)。11B6-CD40L分子の有効性は、標準的な完全アゴニスト抗CD40 CP IgG4抗体よりも顕著に高いことに留意されたい。
CD40Lに直接的に連結した抗CD40.Gag-17-Nef-Gag p24ワクチンは、インビトロで特異的な記憶CD8+T細胞応答を増加させる
CD40Lと連結した抗CD40 11B6-GNG mAbの改善されたアゴニスト特性がHIV-1特異的T細胞増殖の効力に影響を及ぼすかどうかを直接試験するために、HIV-1感染ドナーPBMCを、低用量の抗CD40 11B6-GNG-CD40L及び種々の対照GNG融合mAbとともに9日間、IL-2供給とともにインキュベートし、続いてGag p17、Gag p24及びNef由来のペプチドプールで刺激した。両方のドナーにおいて、直接的に連結したCD40L又は同時投与されたsCD40Lを有する11B6-GNG mAbは、顕著に優れたNef特異的CD8+T細胞応答を誘発した(図13)。
連結されたCD40Lを有する抗CD40 11B6-HIV5pep mAbの改善されたアゴニスト特性がHIV-1特異的T細胞増殖の効力に影響を及ぼすかどうかを直接試験するために、HIV-1感染ドナーPBMCを、低用量の抗CD40 11B6-GNG-CD40L及び種々の対照GNG融合mAbとともに9日間、IL-2供給とともにインキュベートし、続いてHIV5pepの5つのGag p17、Gag p24、Nef及びPolエピトープ成分に対応する個々の長いペプチドで刺激した。HIV-1ペプチド特異的T細胞応答が誘発される一般的な傾向は、CD40Lと直接的に連結した11B6-HIV5pep mAbが、優れたHIV-1特異的CD8+ T細胞応答及びより少ないHIV-1特異的CD4+ T細胞応答を誘発することであった(図14)。
抗CD40 DC標的化ワクチンとsCD40Lを組み合わせたインビトロ培養系は、細胞治療用途のための、例えば、エクスビボで拡大されたCTLの収率を高める潜在的価値を有する。しかしながら、インビボでのワクチン戦略としては、複雑な投与/薬物動態、GMP産生、及びライセンスの問題に関連する2種類の異なるタンパク質薬剤を同時に投与する必要性があるため、これは制約を受ける。CD40Lを抗CD40 DC標的化mAbに直接結合させる新規な二価抗体フォーマットは、この問題を解決する。
HIV-1感染ドナーPBMC培養におけるHIV-1特異的T細胞のCD40標的GNG抗原による拡大
HIV-1+ドナーPBMCを、低用量のsCD40L(100ng/ml;6nM)及びIL-2の有無にかかわらずに、ある用量範囲の抗CD40-GNG融合タンパク質(左から右へ、1、0.1、0.01nM)で9日間培養し、続いてプールHIV-1 Gag p17、Nef、及びGag p24ペプチドで6時間刺激し、次にICSにより分析した。データは、ペプチド刺激に反応して、IFNγ+TNFαを産生する抗原特異的(A)CD4+及び(B)CD8+T細胞の培養終了時のパーセンテージを示す(図26を参照されたい)。同様のデータが、2人の他のドナーからのPBMCを用いて観察された(図27)。
抗CD40-CD40L標的化HIV5pep抗原はHIV-1感染ドナーPBMC培養において多くのHIV-1特異的CD8+T細胞応答を優先的に拡大する
HIV-1+ドナーPBMCを、IL-2及び抗CD40 HIV5prep融合タンパク質(1nM;KIHタンパク質について2nM)とともに9日間培養し、続いて、5つのHIV-1gag、nef、及びpol領域のそれぞれに特異的な長いペプチドで6時間刺激し、次にICSにより分析した。図28は、4人のドナーで試験した指示された各タンパク質対を用いた実験から照合したデータを示す。各点は、抗CD40 11B6-CD40L-HIV5pep KIH Gen 2及び抗CD40 11B6-CD40L-HIV5pep Gen 1(Y軸)を抗CD40 12E12-HIV5pep KIH Gen 2及び抗CD40 E1212-HIV5pep Gen 2(X軸)と比較した、各ドナーにおいて誘発された各長いペプチドに特異的な各応答についての、IFNγ++TNFα+ HIV5pep-特異的CD8+(パネルA、黒色の四角)又はCD4(パネルB、中抜けの灰色の丸)についての値%を表す。パネルAは、拡大培養の20%以下であった反応を強調し、nef66ペプチドに対する強力な患者2の反応(抗CD40-11B6-CD40L-HIV5pepワクチンによって誘発された38±7%対抗CD40-HIV5pepワクチンによって誘発された48±10%)を除外する。パネルBはデータセット全体を示す。
CD40Lを抗CD40 11B6に融合させると、インビボでのマウスモデルにおいてアジュバント不含抗体反応が増大する
抗CD40L融合体と抗CD40 11B6抗体とを組み合わせてワクチン効果を増大させる可能性を試験するために、ヒトCD40トランスジェニックマウスに、CD40L軽鎖融合の有無にかかわらず、HIV-1 Engv gp140にカップリングされた抗CD40 11B6送達媒体でワクチン接種した。gp140に直接融合した抗CD40 11B6-CD40Lを用いたワクチン接種を、コヒーシン-gp140融合タンパク質、コヒーシン-gp140融合タンパク質に非共有結合的に結合した抗CD40 11B6-CD40L、及び非CD40標的化コヒーシン-gp140と非共有結合的にカップリングした抗CD40 11B6-CD40Lを用いたワクチン接種と比較した。コヒーシン-gp140融合体タンパク質へ非共有結合的にカップリングした抗体CD40 11B6-CD40Lと、gp140に直接融合した抗CD40 11B6-CD40Lの両方は、単回ワクチン接種後1週間と同程度に早く検出された抗gp140 IgG力価を誘発し、両ワクチンはその後の2回のワクチン接種後、同様の範囲で応答を増加する(図16)。コヒーシン-gp140に非共有結合的に連結した抗CD40 11B6によるワクチン接種は、2回目のワクチン接種後にのみ検出された血清抗gp140 IgG力価を誘発し、3回目のワクチン接種後に応答は更に増加したが、力価は2種類の抗CD40 11B6-CD40Lベースワクチンと比較して有意に低下した。非標的化コヒーシン-gp140は、CD40標的化ワクチンと比較して3倍モル過剰のgp140を用いた3回のワクチン接種後でさえも、検出可能な抗gp140 IgG応答を誘発しなかった。これらの結果は、抗CD40 E12-gp140ワクチン接種が、アジュバントポリICと同時投与された同じワクチンと比較して、わずかな抗gp140 IgG応答しか誘発しなかった、非ヒト霊長類モデルにおける結果との関連において考慮されるべきである(Zurawskiら、2016)。マウスのデータは、抗CD40 11B6-gp140構築物に連結したCD40Lが、このタンパク質ワクチンに「アジュバント様」特性を付与する可能性を示唆する。
抗CD40 11B6-CD40Lは、インビボでのマウスモデルにおいてCD40の強力な活性化を誘発する
化学療法を受けているがん患者におけるCP-870,893の注入は、血漿炎症性サイトカインの増加(即ち、サイトカイン放出症候群)、補助刺激分子のB細胞発現の増加、及びB細胞の一過性の枯渇によって検出される免疫活性化を誘発する(Beattyら、2013)。これらの患者では、用量制限毒性は0.2mg/kgと決定されたが、0.3mg/kgはこの抗CD40アゴニスト単独を受けた患者において決定された限度であった(Vonderheideら、2016)。インビボにおける抗CD40 11B6-CD40Lの生物学的活性を評価するために、本発明者らは、10μg(約0.5mg/Kg)の用量でCP-870,893 hIgG4及び抗CD40 11B6-CD40Lの短期(24時間)効果を試験した。野生型(タコニック株)又はCD40 KO(ImmuRx株)C57BL/6バックグラウンド上の野生型又はヒトCD40 BACトランスジェニックマウスに、CP-870,893 hIgG4又は抗CD40 11B6-CD40Lのそのモル当量を注射(腹腔内)し、24時間後に屠殺した。サイトカイン(Luminex(登録商標)による血清)のアッセイのために血液を収集し、PBMC、皮膚流出リンパ節及び脾臓からの細胞をフローサイトメトリーにより分析した。B細胞は、活性化マーカーCD69、MHC-II、OX40L及びCD86の分析によって特徴付けられた。結果を図17に示し、CP-870,893 hIgG4がこれらの試験において最小限の活性を有するか又は全く活性を有さないが、抗CD40 11B6-CD40Lは、血中で検出されるように、活性化に関連する強力なB細胞枯渇、並びにサイトカイン分泌を誘発することを示す。これらのデータは、例えば、がん療法における補助剤として臨床的に使用される場合、CP-870,893と比較して非常に低用量の抗CD40 11B6-CD40Lが必要であることを予測する。
CD40Lを抗CD40 11B6に融合させると、FAS膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合されたCD40エクトドメインによって指示される細胞殺傷の有効性と効力の両方が増加する
FAS(CD95)は腫瘍壊死因子受容体(TNF-R)ファミリーに属し、細胞内の「デスドメイン」を含み、その生理学的リガンドであるFASLに応答してアポトーシスを引き起こすことができる(Strasserら、2009)。本発明者らは、ヒトFAS残基187～350に融合したヒトCD40エクトドメイン残基21～193を発現する融合タンパク質を構築し、FAS膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに連結したCD40エクトドメインを発現する安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を樹立した。CD40アゴニストは、テトラゾリウム塩MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(Mossman、1983)のミトコンドリア還元の喪失によって決定されるように、これらの細胞の殺傷を誘発する。このアッセイでは、抗CD40 11B6 IgG4及び抗CD40 12E12 IgG4は、同様の有効性(MTT減少の最大の低下により決定される)及び同様の効力(EC50がそれぞれ約2.5nM及び1nMである)を示すが、抗CD40 11B6-CD40L IgG4は、効力(即ち、MTT減少のより大きな最大の低下)が増加し、効力が有意に増加する(EC50は約2.5pMである)(図18)。このデータは、B細胞及びDCアッセイにおいて見られる抗CD4011B6-CD40L効力の優越性の試験から、結論を再確認するものである。
抗CD40 11B6-CD40LはCD40を介したクラスター形成及び内在化を増強する
本発明者らは、抗CD40 11B6-CD40L対抗CD40 12E12のCD40を介した内在化の速度及び程度を比較した。これら2つの抗体は、SPR分析に基づいてCD40とのそれらの結合によく適合しているが(それぞれ12及び28nMのKD、図24)、CD40活性化の効力は劇的に異なっている(図9、図18)。リガンド関与は、細胞膜上に架橋されたCD40脂質ラフト(クラスター)の形成を導くため、事象は、CD40の内部移行及び下流シグナル伝達に続き(Wangら、2015)、本発明者らは、抗CD40 11B6-CD40L対抗CD40 12E12の細胞表面CD40をクラスター化し、内在化する能力を比較した。
最初に、本発明者らは、これら2つの抗CD40抗体が細胞膜上に架橋されたCD40脂質ラフト(クラスター)の形成を誘導する能力を比較した。本発明者らは、共焦点顕微鏡によるクラスター形成を可視化するモデルとして、ヒトCD40-eGFP融合タンパク質又はヒトCD40-mCherry融合体を発現するCHO細胞を用いた。細胞を1時間、37℃で、10nM抗CD4011B6-CD40Lで処理すると、抗CD40 12E12での同じ処理と比較して、より強いCD40クラスター形成が誘導された(図23)。このデータは、CD40クラスター化がCD40活性化の最初のトリガーである可能性が高いことから、抗CD40 11B6-CD40L抗体のシグナル伝達能力の増加と一致する。
次に、本発明者らは、モデルとしてヒトCD40を発現するCHO細胞を用い、非共有結合的に結合したmCherryモジュールの抗CD40媒介結合及び内在化をアッセイした。両抗体の結合は迅速であり、37℃及び0℃で約30分以内に飽和に達した(図24A及び図24B)。細胞を低温等張酸緩衝液(pH2.5)中で1分間処理すると、結合が0℃で行われた場合、細胞関連抗CD40 12E12標識の約75%が除去された(図24A)。結合が37℃で行われた場合、37℃での標識保持が上昇する傾向があり(残存標識29±3%対26±3%、n.s.)、これはおそらくわずかな内在化を反映していると考えられる。対照的に、抗CD40 11B6-CD40L結合が0℃で行われた場合、酸ストリッピングは抗CD40 E12 mAbで観察された26±3%に対して、細胞結合標識の約60%しか除去されず、2つのmAbのこの差は有意であり(p<0.0001、図24 B)、これは、抗CD40 11B6-CD40Lの内在化が0℃でさえも容易に検出可能であることを示している。の時間経過で50～90%増加した(図24B)。したがって、抗CD40 11B6-CD40Lは、抗CD40 12E12よりもはるかに多く内在化され、0℃でさえも有意な内在化が検出された。CD40Lに融合しない抗CD4011B6 mAbの結合及び内在化特性は、抗CD40 12E12 mAbと非常に類似していたため、この特性はCD40L付加物の唯一の結果である(図24C)。
抗CD40 11B6は、抗CD40 12E12及び抗CD40 CPとは異なるCD40上のエピトープを認識する。
Yuら(2018)は、アゴニスト抗CD40 mAbと、CD40との相互作用部位との間の関係に関する知見をまとめた。例えば、抗CD40 CPは、CD40 CRD1領域内で結合し(即ち、除去された場合、結合しない)、また、残基23～37が欠失されるか、又は残基27～28のREがAAで置換された場合、結合も失われる。また、Singhら(1998)は、CD40中の負に荷電した残基Glu74、Asp84、及びGlu117の個々の置換がCD40L結合を破壊することを報告した。このマッピングは、CD40L対CP抗体についてのCD40における相互作用の異なる部位を示す。Wanら、2012の方法を用いて、残基R27及びE28を個々にAで置換し、突然変異型CD40エクトドメインを、抗CD40 CP、抗CD40 12E12、及び抗CD40 11B6(±CD40L)への結合について試験した。予想されるように、R27A及びE28A突然変異は、抗CD40 CP mAbへの結合を停止又は大幅に減少させた(図19)。しかしながら、これらの突然変異は抗CD40 11B6又は12E12 mAbの結合に影響を及ぼさなかった。データは、抗CD40 CP mAbのCD40上の結合部位を、抗CD40 11B6又は12E12 mAbと明確に区別する。
抗CD40アゴニスト抗体12E12及び11B6のエピトープマッピング
2つのアプローチを用いて、2つの請求された抗体(12E12及び11B6)との相互作用/結合に重要であるCD40残基を定義し、それらを他のアゴニスト抗体CP-870,893(本明細書ではCPと呼ばれる)と鑑別した。第1のアプローチは、PepScan(オランダを拠点とする会社)「Precision Epitope Mapping」プラットフォームに基づくものである。第2のアプローチは、抗体結合分析にカップリングされたヒトCD40エクトドメインの選択された親水性残基のAlaスキャニング突然変異誘発を実施することによって、PepScanデータに基づいて構築された。
これらのアプローチを用いて、これら3つの抗体に特異的なCD40上のエピトープの相違を同定することを目的とした。
6つの12E12結合ペプチド領域をPepscan分析から同定し、Ala突然変異誘発はこれらのペプチドのうちの1つを除くすべての(高度に荷電した残基を持たない)荷電残基をカバーした。
9つの11B6結合ペプチド領域が強調され、Ala突然変異誘発は、これら9つのペプチドのうちの8つ(高度に荷電した残基を持たないものを除く)の荷電残基をカバーした。
Ala突然変異誘発試験から得られたデータを図25に要約する。下線はCD40の4つのCDR構造相同領域である。いくつかの突然変異の残存数を示す。灰色の協調は、変化した残基を示す。PはPfizer CP mAbであり; Eは12E12であり; Bは11B6であり; Lは11B6-CD40Lであり; -は試験したいずれのmAbにも影響も及ぼさず; 配列下の小文字は結合の減少を示し; CAPSの文字は結合がないことを意味する。
突然変異誘発は、たとえ3つのmAbのすべてがCDR1領域に明確なエピトープ成分を有していたとしても、CP、11B6、及び12E12結合のためのエピトープを高い信頼性で識別する結果をもたらした。このCP相互作用は、残基R27及びE28の変化(公開された情報の検証)によって破壊された;11B6相互作用は、残基K29、並びにE56及びE58との相互作用を伴った;組み合わされた11B6-CD40L結合は、K46A変化によって特異的に抑制された;12E12相互作用は、D50及びE58に依存した。このように、このデータは、これら3つのmAbのエピトープのいくつかの重複を示しているが、重要な接触部位には明らかな違いがあることを示している。
本開示の融合タンパク質の他の例
以下の代替の融合タンパク質A1～A5を調製した。図22は、軽鎖又は重鎖のC末端で、及び/又は可撓性リンカーの存在のいずれかに抗原を有する、各融合タンパク質の構造を表す模式図を示す。
例A1:L鎖C末端にCD40Lを有する抗CD40 11B6
PAB3588 C3334(配列番号131)×C3792(配列番号133)
[m抗-CD40_11B6.1C3_H-LV-hIgG4H-C-Nhe-Not][m抗-CD40_11B6.1C3_Syn_K-LV-hIgGK-C-hCD40リガンド]
例A2:H鎖C末端にFlex-CD40Lを有する抗CD40ヒト化11B6
PAB3618 C3823(配列番号135)×C3739(配列番号137)
[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-IgG4H-C-Flex-v1-hCD40リガンド][m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
例A3:L鎖C末端にFlex-CD40Lを有する抗CD40ヒト化11B6
PAB3475 C3724(配列番号139)×C3726(配列番号141)
[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-IgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド][m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v3-LV-hIgG4H-C]
例A4:H鎖C末端にCD40Lを有する抗CD40ヒト化11B6
PAB3615 C3821(配列番号143)×C3739(配列番号137)
[m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C-hCD40リガンド][m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-hIgGK-C]
例A5:L鎖C末端にFlex-CD40Lを有する抗CD40ヒト化11B6
PAB3470 C3724(配列番号139)×C3725(配列番号145)
[m抗-CD40-11B6.1C3-Vκ-v2-LV-IgGK-C-Flex-v1-hCD40リガンド][m抗-CD40-11B6.1C3-VH-v2-LV-hIgG4H-C]
スーパーアゴニスト特性は、L鎖のC末端又はH鎖のC末端のいずれかのCD40Lの位置、及び可撓性リンカー接続配列の有無にかかわらず観察される
ヒトMDDCを、ある用量範囲(図20において左から右に示される:10、1、0.1、0.01nM)の各抗CD40 11B6-CD40Lアイソフォームとともに培養し、サイトカイン分泌の程度を24時間後に決定した。図20のデータは、実験内で最高値に正規化され、2人の異なるドナーでの反復した応答について平均化された、試験した各サイトカインの値の合計を表す。誤差バーは平均値の標準誤差である。各滴定シリーズの下に示された模式図は、L鎖又はH鎖CD40L融合アイソフォームを示し、FはFlex V1リンカーの存在を示す。この結果から、このシリーズの各用量の値間に有意差は認められなかったことを示す。
抗CD40抗体に融合されたCD40Lのスーパーアゴニスト活性は、FAS膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合されたCD40エクトドメインによって誘導される細胞殺傷の有効性及び効力によって定義されるように、CD40L位置決めとは無関係である
FAS(CD95)は腫瘍壊死因子受容体(TNF-R)ファミリーに属し、細胞内「のデスドメイン」を含み、その生理学的リガンドであるFASLに応答してアポトーシスを引き起こすことができる(Strasserら、2009)。本発明者らは、ヒトFAS残基187～350に融合したヒトCD40エクトドメイン残基21～193を発現する融合タンパク質を構築し、FAS膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに連結したCD40エクトドメインを発現する安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を樹立した。CD40アゴニストは、テトラゾリウム塩MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(Mossman、1983)のミトコンドリア還元の喪失によって決定されるように、これらの細胞の殺傷を誘発するFAS及びCD40は同一のTNF-Rファミリーに属し、受容体活性化の機序(細胞外)は類似しているが、細胞内シグナル伝達経路、即ち、アポトーシス及び選択されたサイトカイン及び細胞表面マーカー活性化は異なる。この融合構築物は、トランスフェクトされたCHO細胞に基づくCD40活性化の分析のための便利な代理アッセイフォーマットを提供する。このアッセイでは、抗CD40 11B6 IgG4及び抗CD40 12E12 IgG4は、同様の有効性(MTT減少の最大の低下により決定される)及び同様の効力(それぞれEC50≒2.5nM及び1nMである)を示すが、抗CD40 11B6-CD40L IgG4は、効力(即ち、MTT減少のより最大の低下)が増加し、効力(EC50≒2.5pM)が有意に増加する(EC50は約2.5pMであり)(図21)。したがって、部分アゴニスト抗CD40 11B6 mAbへのCD40L融合は、3つの異なるCD40担持細胞型に対する効力及び有効性を大幅に増加させることができる。
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（参考文献）
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Claims (15)

  1. 少なくとも以下のタンパク質ドメイン
    (i)CD40アゴニスト抗体(αCD40);及び
    (ii)CD40LのCD40結合ドメイン
    を含むCD40活性化タンパク質であって、
    CD40を活性化することにより、B細胞の増殖、及び／又は樹状細胞のサイトカイン分泌を誘導し、
    前記CD40アゴニスト抗体が、以下の抗体:
    a.配列番号27のHCDR1、配列番号28のHCDR2、配列番号29のHCDR3、配列番号30のLCDR1、配列番号31のLCDR2、及び配列番号32のLCDR3を含むヒト化抗体；
    b.配列番号74のHCDR1、配列番号75のHCDR2、配列番号76のHCDR3、配列番号77のLCDR1、配列番号78のLCDR2、及び配列番号79のLCDR3を含むヒト化抗体；
    c.配列番号80のHCDR1、配列番号81のHCDR2、配列番号82のHCDR3、配列番号83のLCDR1、配列番号84のLCDR2、及び配列番号85のLCDR3を含むヒト化抗体；
    d.配列番号86のHCDR1、配列番号87のHCDR2、配列番号88のHCDR3、配列番号89のLCDR1、配列番号90のLCDR2、及び配列番号91のLCDR3を含むヒト化抗体；
    e.配列番号92のHCDR1、配列番号93のHCDR2、配列番号94のHCDR3、配列番号95のLCDR1、配列番号96のLCDR2、及び配列番号97のLCDR3を含むヒト化抗体
    から選択され、
    前記CD40LのCD40結合ドメインが、配列番号14を含むCD40Lの単量体断片であり、
    前記CD40LのCD40結合ドメインが、前記CD40アゴニスト抗体の軽鎖又は重鎖のC末端に、直接共有結合で結合される、又はリンカーを介して結合される、CD40活性化タンパク質。
  2. 前記CD40アゴニスト抗体がヒトCD40に特異的に結合し、以下の特性:
    (i)フローサイトメトリー分析によりインビトロで測定した場合、B細胞の増殖を誘導する;又は、
    (ii)樹状細胞活性化アッセイによりインビトロで測定した場合、サイトカインの分泌を誘導する
    のうちの少なくとも1つ以上を有する、請求項1に記載のCD40活性化タンパク質。
  3. 前記CD40LのCD40結合ドメインが、配列番号14からなるCD40Lの断片である、請求項1又は2に記載のCD40活性化タンパク質。
  4. 前記CD40LのCD40結合ドメインが、前記CD40アゴニスト抗体の軽鎖又は重鎖のC末端に融合されている、請求項1から3のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質。
  5. CD40アゴニストIgG抗体の重鎖及び軽鎖を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質。
  6. CD40Lと前記CD40アゴニスト抗体の軽鎖又は重鎖との間にペプチドリンカーを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質。
  7. CD40Lと前記CD40アゴニスト抗体の軽鎖又は重鎖との間のペプチドリンカーが、配列番号15の可撓性リンカーFlexV1である、請求項6に記載のCD40活性化タンパク質。
  8. 前記CD40アゴニスト抗体が、以下の抗体:
    a.配列番号21及び配列番号22のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体;
    b.配列番号23及び配列番号22のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体;
    c.配列番号58及び配列番号59のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体;
    d.配列番号60及び配列番号61のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体;
    e.配列番号62及び配列番号63のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体;
    f.配列番号64及び配列番号65のVH及びVLドメインをそれぞれ含むヒト化抗体
    から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質。
  9. 1つ又は複数の抗原が、前記CD40アゴニスト抗体の重鎖又は軽鎖に融合されている、請求項1から8のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質。
  10. 1つ又は複数の感染性疾患抗原又はがん抗原が、CD40アゴニスト抗体の重鎖又は軽鎖に融合されている、請求項9に記載のCD40活性化タンパク質。
  11. 式αCD40Light-PL-CD40Lの軽鎖及び式αCD40Heavy-(PL-Ag)xの重鎖を含み、
    αCD40Lightが前記CD40アゴニスト抗体の軽鎖であり;
    αCD40Heavyが前記CD40アゴニスト抗体の重鎖であり;
    PLが、結合又はペプチドリンカーであり、同一であるか又は異なり;
    Agがウイルス抗原又はがん抗原であり、同一であるか又は異なり;
    xが1から20までの整数であり;
    CD40Lが、配列番号14を含むCD40のリガンドの結合ドメインであり;
    -が結合である、請求項1から10のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質。
  12. ペプチドリンカーが、配列番号15のFlexV1である、請求項11に記載のCD40活性化タンパク質。
  13. 前記ウイルス抗原が、HIVペプチド抗原、パピローマウイルス抗原、及びコロナウイルス抗原から選択される、請求項11又は12に記載のCD40活性化タンパク質。
  14. 請求項1から13のいずれか一項に記載のCD40活性化タンパク質、及び1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  15. ａ）ワクチンとして使用するための、
    ｂ）対象におけるT細胞特異的応答の増強に使用するための、あるいは
    ｃ）対象においてB細胞増殖の誘発、及び/又は樹状細胞のサイトカイン増殖の誘導に使用するための、
    請求項14に記載の医薬組成物。
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