JP7641968B2 - Ｉｌ－１３およびｔｓｌｐを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド - Google Patents

Description

説明
１ 本技術の分野
本技術は、ＩＬ－１３およびＴＳＬＰを標的化するポリペプチドに関する。本技術はまた、ポリペプチドをコードする核酸分子および核酸を含むベクター、ならびにポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物にも関する。本技術はさらに、炎症性疾患に罹っている対象を処置する方法における使用のためのこれらの製品に関する。さらに、本技術は、これらの製品を生産する方法に関する。

２ 技術背景
抑制されていない免疫応答は、宿主の防御に必要な一方で、喘息、アトピー性皮膚炎およびリウマチ様関節炎などの様々な炎症性疾患を引き起こす可能性がある。免疫系の自然および適応アームによって媒介される免疫応答のカスケード（例えば、抗原認識、抗原プロセシング、抗原提示、サイトカイン生産、抗体生産、標的細胞死滅）は、様々な免疫疾患の始まりと蔓延を促進する。炎症性疾患は慢性であることが多く、生命を脅かす可能性さえある。アレルギー性およびアトピー性疾患、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎は、２型免疫応答によって優勢に促進され、高いＩｇＥ生産および好酸球増加症のような２型免疫性の顕著な特色によって特徴付けられる。

胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）およびインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）は、間質および／または免疫細胞によって生産される可溶性サイトカイン標的である（非特許文献１、非特許文献２）。ヒトＴＳＬＰおよびＩＬ－１３は、２型免疫性、２型炎症性疾患、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎、加えて様々な免疫疾患の別個のオーバーラップする相乗的な態様を促進する。

ＴＳＬＰのシグナル伝達は、胸腺間質性リンパ球新生因子受容体（ＴＳＬＰＲ）およびＩＬ－７Ｒアルファ鎖（ＩＬ－７Ｒα）で構成されるヘテロ二量体の受容体複合体を介して始まる。同様に、ＩＬ－１３シグナル伝達は、アルファＩＬ－４受容体（ＩＬ－４Ｒα）およびアルファインターロイキン－１３受容体（ＩＬ－１３Ｒ１α）からなるヘテロ二量体の受容体複合体に結合することによって始まる。ＩＬ－１３のＩＬ－１３Ｒ１への高い親和性は、それらの複合体形成をもたらし、これがさらに、ＩＬ－４Ｒαへのヘテロ二量体形成の可能性を増加させる。

ＴＳＬＰは、樹状細胞の成熟、肥満細胞の発達および増殖を促進させ、加えて好塩基球や自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ２）などの他の免疫細胞を活性化する。同様に、ＩＬ－１３は、上皮バリアの崩壊、粘膜から上皮表面による粘液生産、気道リモデリングなどの様々な免疫病理、加えてエオタキシンなどのケモカインを補充する好酸球の誘導を起こす。これらのメカニズムは、２型炎症性応答の始まりと蔓延の中核をなし、アトピー性皮膚炎および喘息などの疾患における様々な免疫病理の発症の中核をなす。

現在、軽度／重度の喘息を有する患者は、特に低い好酸球性表現型を有する喘息患者において、抗ＩＬ４Ｒαモノクローナル抗体であるデュピクセント（Ｄｕｐｉｘｅｎｔ）（デュピルマブ；市販）、抗ＩＬ５（市販）、抗ＩｇＥモノクローナル抗体であるゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）（オマリズマブ；市販）のような生物製剤などの現在利用可能な標準的治療処置に対して不適切に応答する。ＴＳＬＰ（テゼペルマブ）およびＩＬ－１３（レブリキズマブ）に対するアンタゴニストモノクローナル抗体は現在臨床治験中であるが、ＴＳＬＰとＩＬ－１３の両方を標的化する活発な臨床開発プログラムはない。単一の薬剤を用いたＴＳＬＰとＩＬ－１３の二重標的化は、低２型および高２型喘息に加えてアトピー性皮膚炎の両方において効能を付与する可能性を有し、この可能性とは、単回の単一特異性薬剤療法がそれほど有効ではないこれらの徴候の範囲内の部分集団において効能を付与することである。したがって、より有効であることに加えて患者にうまく適用することもできる喘息およびアトピー性皮膚炎などの２型炎症性疾患の処置への、それでもなお未だ満たされていない医学的な必要性がある。

このような療法は、複数の疾患因子、例えばＩＬ－１３およびＴＳＬＰを標的化することを含んでいてもよい。

複数の疾患因子を標的化することは、例えば、異なる治療標的に結合する２つの別々の生物学的製剤、例えば抗体の共投与またはコンビナトリアルな使用によって達成することができる。しかしながら、別々の生物学的製剤の共投与またはコンビナトリアルな使用は、実用面と商業面両方の視点から問題がある可能性がある。例えば、別々の製品の２回の注射は、患者にとってより不便でより苦痛を伴う処置レジメンをもたらし、これは、コンプライアンスに負の影響を与える可能性がある。２つの別々の製品の単回注射に関して、必要な濃度での許容できる粘度と両方の製品の好適な安定性を可能にする配合物を提供することは、難しいかまたは不可能であり得る。加えて、共投与および共配合物は、２つの別々の薬物の生産を必要とすることから、全体コストを増加させる可能性がある。

別々の生物製剤、例えば抗体の共投与またはコンビナトリアルな使用に関連するこのような制限に対処するための１つの戦略として、２つの異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体が示唆されてきた。

二重特異性抗体構築物が複数の様式で提唱されている。例えば、二重特異性抗体様式は、２つの抗体の化学的コンジュゲーションまたはそれらの断片を含んでいてもよい（非特許文献３；非特許文献４）。

ＺｉｅｇｌｅｒおよびＡｒｔｉｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）１１：２８９ Ｇｉｅｓｅｃｋ ＩＩＩら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１８）１８：６２ Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５．２２９（４７０８）：８１～８３頁 Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８７．１３９（７）：２３６７～２３７５頁

しかしながら、このような二重特異性抗体様式の不利益は、高濃度での高い粘性を含み、それにより例えば皮下投与は難しくなり、特異的および高親和性結合のために、各結合単位が２つの可変ドメインの相互作用を必要とするという点で、ポリペプチドの安定性および生産効率への影響を含む。このような二重特異性抗体様式はまた、軽鎖の誤対合または重鎖の誤対合に関する化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）の問題を引き起こす可能性が潜在的にある。

３ 本技術の要約
一部の実施形態において、本技術は、同時にＩＬ－１３およびＴＳＬＰを特異的に標的化して、インビトロにおいて、単一特異性抗ＩＬ－１３または抗ＴＳＬＰポリペプチドと比較して、２型炎症性応答をモジュレートする効率の増加をもたらすポリペプチドに関する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、効率的に生産される（例えば微生物宿主で）。さらに、一部の実施形態において、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、既存の抗体（すなわち、抗体構築物での第１の処置の前に対象に存在する抗体）には限定的な反応性しかない。他の実施形態において、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、連続する処置間にうまく間隔をあけることができるように十分長い半減期を呈示する。

一実施形態において、本技術は、ＩＬ－１３に特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。さらなる実施形態において、本技術のポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、２つのＩＳＶＤは、場合により、ペプチド性リンカーを介して連結されている。一実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤは、別個のＩＳＶＤである。さらに、一実施形態において、ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、（ヒト）血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり得る。

別の態様において、本技術のポリペプチドは、ＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態において、本技術のポリペプチドは、ＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、２つのＩＳＶＤは、場合により、ペプチド性リンカーを介して連結されている。一実施形態において、ＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤは、別個のＩＳＶＤである。さらに、一実施形態において、ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、（ヒト）血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり得る。

別の実施形態において、本技術のポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＩＬ－１３に特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＴＳＬＰに特異的に結合する。一実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、ＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合する。一実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、別個のＩＳＶＤであり、ＴＳＬＰに結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、別個のＩＳＶＤである。別の実施形態において、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する。例えば、結合単位は、（ヒト）血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤであり得る。

本技術のポリペプチドを発現することが可能な核酸分子、核酸または核酸を含むベクター、およびポリペプチド、核酸またはベクターを含む組成物も提供される。一実施形態において、組成物は、医薬組成物である。

本技術によるポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む宿主または宿主細胞も提供される。

さらに、本技術によるポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ．好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、本技術のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ．本技術によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法が提供される。

さらに、本技術は、医薬としての使用のための、ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もしくはベクターを含む組成物を提供する。一実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、２型炎症性疾患のような炎症性疾患の処置における使用のためである。一実施形態において、２型炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎および喘息から選択される。

加えて、２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の本技術によるポリペプチドまたは組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。一実施形態において、２型炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎および喘息から選択される。一実施形態において、本方法は、１種またはそれ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。

さらに、２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置するための医薬組成物の調製における本技術のポリペプチドまたは組成物の使用が提供される。一実施形態において、２型炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎および喘息から選択される。

特に、本技術は以下の実施形態を提供する：

実施形態１．医薬としての使用のための、ポリペプチド、該ポリペプチドを含む組成物、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物であって、該ポリペプチドは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、該少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１９のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号２１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、前記ポリペプチドまたは組成物。

実施形態２．少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態１に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態３．少なくとも１つのＩＳＶＤのアミノ酸配列は：
ａ）配列番号２と９０％を超える配列同一性、
ｂ）配列番号３と９０％を超える配列同一性、
ｃ）配列番号４と９０％を超える配列同一性、または
ｄ）配列番号６と９０％を超える配列同一性
を含む、実施形態１または２のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態４．前記少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列、または
ｄ）配列番号６のアミノ酸配列
を含む、実施形態１～３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態５．ポリペプチドは、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、該少なくとも２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、または
ｆ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、実施形態１に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態６．ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｆ）第１のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態５に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態７．ａ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み、
ｆ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態５または６のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態８．ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または
ｆ）第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態５～７のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態９．ポリペプチドは：
ａ）配列番号１４８のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１４９のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１５０のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１５１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１５２のアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１５３のアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１５４のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１５５のアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列、
ｊ）配列番号１５７のアミノ酸配列、
ｋ）配列番号１５８のアミノ酸配列、または
ｌ）配列番号１５９のアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、実施形態５～８のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態１０．ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、該少なくとも４つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｄ）第４のＩＳＶＤは、
ｘ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、実施形態１または５のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１１．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の使用のための組成物。

実施形態１２．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態１０または１１に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１３．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態１０～１２のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１４．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１０～１３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１５．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態１～１４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１６．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態１５に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１７．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態１５～１６のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１８．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態１７に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態１９．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態１８に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２０．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態１８～１９のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２１．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態１８～２０のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２２．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態１８～２１のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２３．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態１０～２２のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２４．ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態１０～２３のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２５．２型炎症性疾患のような炎症性疾患の処置における使用のための、実施形態１～２４のいずれかに記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２６．２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎から選択される、実施形態２５に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

実施形態２７．少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み；少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１２のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１７のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１８のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１４のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号１９のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
配列番号１６のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
配列番号２１のアミノ酸配列であるかもしくは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、前記ポリペプチド。

実施形態２８．少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、
ｃ）配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態２７に記載のポリペプチド。

実施形態２９．少なくとも１つのＩＳＶＤのアミノ酸配列は：
ａ）配列番号２と９０％を超える配列同一性、
ｂ）配列番号３と９０％を超える配列同一性、
ｃ）配列番号４と９０％を超える配列同一性、または
ｄ）配列番号６と９０％を超える配列同一性
を含む、実施形態２７または２８のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３０．前記少なくとも１つのＩＳＶＤは：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列、または
ｄ）配列番号６のアミノ酸配列
を含む、実施形態２７～２９のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３１．ポリペプチドは、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、該少なくとも２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、または
ｆ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、実施形態１または２７に記載のポリペプチド。

実施形態３２．ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｆ）第１のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態３１に記載のポリペプチド。

実施形態３３．ａ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み、
ｆ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態３１または３２のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３４．ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
ｅ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または
ｆ）第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態３１～３３のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３５．ａ）配列番号１４８のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１４９のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１５０のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１５１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１５２のアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１５３のアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１５４のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１５５のアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列、
ｊ）配列番号１５７のアミノ酸配列、
ｋ）配列番号１５８のアミノ酸配列、または
ｌ）配列番号１５９のアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、実施形態３１～３４のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３６．ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、該少なくとも４つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、
ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｖｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、
ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｖｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｘ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み；
ｄ）第４のＩＳＶＤは、
ｘ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｘｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｘｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含み、
ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、実施形態２７または３１のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３７．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態３６に記載のポリペプチド。

実施形態３８．ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態３６または３７のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態３９．ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態３６～３８のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態４０．前記ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、実施形態２７～３９のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態４１．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、実施形態４０に記載のポリペプチド。

実施形態４２．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、実施形態４０～４１のいずれか１つに記載のポリペプチド。

実施形態４３．増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、実施形態４２に記載のポリペプチド。

実施形態４４．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
ｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含む、実施形態４３に記載のポリペプチド。

実施形態４５．ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、実施形態４３～４４のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態４６．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態４３～４５のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態４７．前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態４３～４６のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態４８．ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を含む、実施形態３６～４７のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態４９．配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、実施形態３６～４８のいずれかに記載のポリペプチド。

実施形態５０．実施形態２７～４９のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３６～４９によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

実施形態５１．実施形態５０による核酸を含む宿主または宿主細胞。

実施形態５２．実施形態２７～４９のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３６～４９によるポリペプチドを生産するための方法であって、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、実施形態５０による核酸を発現させる工程；場合により、それに続いて：
ｂ）実施形態２７～４９のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３６～４９によるポリペプチドを単離および／または精製する工程
を含む、前記方法。

実施形態５３．少なくとも１つの実施形態２７～４９のいずれかによるポリペプチド、または少なくとも１つの実施形態３６～４９によるポリペプチド、または実施形態５０による核酸を含む組成物。

実施形態５４．少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含み、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬組成物である、実施形態５３に記載の組成物。

実施形態５５．２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置する方法であって、医薬的に活性な量の、実施形態２７～４９のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３６～４９によるポリペプチド、または実施形態５３～５４のいずれかによる組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。

実施形態５６．２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎から選択される実施形態５５に記載の方法。

実施形態５７．２型炎症性疾患のような炎症性疾患を処置するための医薬組成物の調製における、実施形態２７～４９のいずれかによるポリペプチド、または実施形態３６～４９によるポリペプチド、または実施形態５３～５４のいずれかによる組成物の使用。

実施形態５８．２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎から選択される、実施形態５７に記載のポリペプチドまたは組成物の使用。

ＴＳＬＰを介して捕獲されたＦ０２７４００１６１へのＩＬ１３およびＨＳＡの同時の結合を示すセンサーグラムである。 Ｖ_ＨＨ Ｆ０２７４００１６１ならびに参照化合物抗ｈＩＬ－１３ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３ｍＡｂ２によるエオタキシン放出アッセイにおけるヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ１３の阻害を示す図である。 Ｆ０２７４００１６１ならびに参照化合物抗ｈＩＬ－１３ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３ｍＡｂ２によるＳＥＡＰレポーターアッセイにおけるヒトおよびカニクイザルＩＬ１３の阻害を示す図である。 ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰの阻害は、Ｆ０２７４００１６１および参照化合物抗ｈＴＳＬＰ ｍＡｂ１によってＢａＦ３増殖を誘導したことを示す図である。ＩＲＲ０００９６は、陰性対照Ｎｂである。 対照Ｆ０２７３０１１８６と比較した、９６種のヒト血清サンプルに存在する既存の抗体の、Ｆ０２７４００１６１、１６３および１６４への結合を示す箱ひげ図である。 ヒトＤＣにおけるＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７応答に対するＦ－２７４００１６１（Ｆ０２７４００１６１とも称される）およびコンパレーター抗体である抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の用量応答阻害プロファイルである。濃縮されたヒトＤＣを４ｎｇ／ｍＬのＴＳＬＰで処置し、８種の濃度のＩＳＶＤ構築物および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１と共に３６時間インキュベートした。新たに収集された上清中のＣＣＬ１７濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＣ_５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０で、非線形回帰（ｌｏｇ阻害剤対応答－可変勾配の４パラメーターの最小二乗フィッティング）によって制約なしで計算した。データは、８回の個々の実験から組み合わされた全８人のドナーの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。 ヒトＰＢＭＣにおけるＣＣＬ１７の０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３およびＴＳＬＰによって誘導された相乗的な生産に対する、Ｆ－２７４００１６１（Ｆ０２７４００１６１とも称される）およびコンパレーター抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の用量阻害応答を示す図である。健康なドナーＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ－１３＋ＴＳＬＰで刺激し、１０用量のＩＳＶＤ構築物（Ｎｂ）およびコンパレーターと共に２０時間インキュベートした。細胞培養上清中のＣＣＬ１７濃度をＭＳＤ Ｖ－Ｐｌｅｘキットによって測定した。ＩＣ_５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０で、非線形回帰（ｌｏｇ阻害剤対応答－可変勾配の４パラメーターの最小二乗フィッティング）によって制約なしで計算した。データは、８回の個々の実験から組み合わせた全てのドナーの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。 ヒトＰＢＭＣにおけるＣＣＬ１７の５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３およびＴＳＬＰによって誘導された相乗的な生産に対するＦ－２７４００１６１（Ｆ０２７４００１６１とも称される）ならびにコンパレーター抗体である抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の用量阻害応答を示す図である。健康なドナーＰＢＭＣを、５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ－１３＋ＴＳＬＰで刺激し、１０用量のＩＳＶＤ構築物（Ｎｂ）およびコンパレーター抗体と共に２０時間インキュベートした。新たに収集された上清中のＣＣＬ１７濃度をＭＳＤ Ｖ－Ｐｌｅｘキットによって測定した。ＩＣ_５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０で、非線形回帰（ｌｏｇ阻害剤対応答－可変勾配の４パラメーターの最小二乗フィッティング）によって制約なしで計算した。データは、８回の個々の実験から組み合わせた全てのドナーの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。 ３つの培養物のアッセイにおける、ヒトＰＢＭＣによるアレルゲンＤｅｒ Ｐによって誘導されたＩＬ－５、ＣＣＬ１７、およびＣＣＬ２６生産に対する、Ｆ－２７４００１６１（Ｆ０２７４００１６１とも称される）ならびにコンパレーター抗体である抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の阻害プロファイルを示す図である。ＭＲＣ５線維芽細胞およびＡ５４９上皮細胞と共に培養された正常ドナーＰＢＭＣを、３７℃の細胞培養インキュベーター中で、３ｍｇ／ｍＬのＤｅｒ Ｐで刺激し、１１．１ｎＭのＩＳＶＤ、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１、または抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１と共に２４ウェルプレート中で６日間インキュベートした。新たに収集された上清中のＩＬ－５、ＣＣＬ１７、およびＣＣＬ２６濃度をヒト磁気Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ａｓｓａｙ）によって測定した。ＩＳＶＤポリペプチドまたは抗体のどちらも受けなかった刺激されていない（最小）および刺激した（最大）対照サンプルに対する阻害のパーセンテージを計算した。全ての計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を使用して実行した。データは、３つの独立した実験から組み合わされた全てのドナーの平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表される。 Ｆ０２７４００１６１は、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＴＳＬＰの検出可能なレベルを有意に低下させた。ビヒクルで処置したマウス（３７６．１６６ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒト血漿ＴＳＬＰレベルが、０．１ｍｇ／ｋｇのＦ０２７４００１６１用量（４５．７７２ｐｇ／ｍｌ）および１０ｍｇ／ｋｇのＦ０２７４００１６１用量（０．０７２ｐｇ／ｍｌ）で低下したことから、Ｆ０２７４００１６１のＴＳＬＰアームは、ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＴＳＬＰに結合できることが実証される。 Ｆ０２７４００１６１は、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＩＬ－１３の検出可能なレベルを有意に低下させた。ビヒクルで処置したマウス（２７４．０５２ｐｇ／ｍｌ）と比較したところ、ヒトＩＬ－１３レベルが、０．０１ｍｇ／ｋｇのＦ０２７４００１６１用量（２０１．２８６ｐｇ／ｍｌ）、０．０５ｍｇ／ｋｇのＦ０２７４００１６１用量（２２．０２８ｐｇ／ｍｌ）、０．１ｍｇ／ｋｇのＦ０２７４００１６１用量（４０．７４０ｐｇ／ｍｌ）、および１０ｍｇ／ｋｇのＦ０２７４００１６１用量（１．７７７ｐｇ／ｍｌ）で低下したことから、Ｆ２７４００１６１のＩＬ－１３アームは、ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＩＬ－１３に結合できることが実証される。 Ｆ０２７４００１６１は、ｈＴＳＬＰおよびｈＩＬ－４の流体力学的な送達を受けたＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの肺におけるマウスＲｅｔｎｌａおよびＣｌｃａ１転写発現を有意に低下させた。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおけるヒトＴＳＬＰおよびＩＬ－４の過剰発現は、前駆体ＣＤ３４^＋由来のヒト免疫細胞からのｈＩＬ－１３の生産を誘導する。Ｆ０２７４００１６１によるヒトＩＬ－１３の中和は、１０ｍｇ／Ｋｇの用量でマウスＲｅｔｎｌａおよびＣｌｃａ１マーカー遺伝子の阻害をもたらした。 Ｆ０２７４００１６１は、ｈＴＳＬＰおよびｈＩＬ－４の流体力学的な送達を受けたＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの肺におけるマウスＲｅｔｎｌａおよびＣｌｃａ１転写発現を有意に低下させた。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおけるヒトＴＳＬＰおよびＩＬ－４の過剰発現は、前駆体ＣＤ３４^＋由来のヒト免疫細胞からのｈＩＬ－１３の生産を誘導する。Ｆ０２７４００１６１によるヒトＩＬ－１３の中和は、１０ｍｇ／Ｋｇの用量でマウスＲｅｔｎｌａおよびＣｌｃａ１マーカー遺伝子の阻害をもたらした。 ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１の概略的な提示であり、Ｎ末端からＣ末端へ１価ビルディングブロック／ＩＳＶＤ ４Ｂ０２、４Ｂ０６、５０１Ａ０２、５２９Ｆ１０、加えてアルブミンバインダーＡＬＢ２３００２を示す。それに対して４Ｂ０２および４Ｂ０６は、３５ＧＳリンカーを介して接続され、残りのビルディングブロックは、９ＧＳリンカーを介して連結される。

５ 本技術の詳細な説明
本技術は、アトピー性皮膚炎および喘息などの炎症性疾患を処置するための新規のタイプの薬物を提供することを目的とする。

一部の実施形態において、本技術は、インビトロおよび／またはインビボにおいて、同時にＩＬ－１３およびＴＳＬＰを標的化して、単一特異性抗ＩＬ－１３または抗ＴＳＬＰポリペプチドと比較して、２型炎症性応答をモジュレートする効率の増加をもたらすポリペプチドに関する。一部の実施形態において、ポリペプチドは、効率的に生産される（例えば微生物宿主で）。さらに、一部の実施形態において、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象における既存の抗体（すなわち抗体構築物での第１の処置の前に対象に存在する抗体）に対して限定的な反応性しかないことを示すことができた。他の実施形態において、このようなポリペプチドは、処置しようとする対象において、連続する処置間にうまく間隔をあけることができるように十分長い半減期を呈示する。

５．１ 本技術のポリペプチド
単一特異性１価ポリペプチド
一実施形態において、本技術のポリペプチドは、単一特異性であり、１価である。

用語「単一特異性」は、１種の（特異的な）タイプの標的分子に結合することを指す。したがって、本技術の単一特異性のポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する。他方の本技術の単一特異性のポリペプチドは、ＴＳＬＰに特異的に結合する。

用語「１価」は、分子、例えばＩＳＶＤを（特異的に）標的化する結合単位／ビルディングブロックが１つのみ存在することを示す。

したがって、一態様において、本技術は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含むＩＬ－１３に特異的に結合する１つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性１価ポリペプチドを提供する。ＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３；または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤから選択することができる。

本技術のこの態様の一実施形態において、ＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合する。

さらなる実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤは：
ａ）配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３；または
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤから選択される。

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤは：
ａ）配列番号２と９０％を超える配列同一性；または
ｂ）配列番号３と９０％を超える配列同一性
を含むＩＳＶＤから選択される。

一実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列；または配列番号３のアミノ酸配列を含むＩＳＶＤから選択される。

別の態様において、本技術は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含む、ＴＳＬＰに特異的に結合する１つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性１価ポリペプチドを提供する。ＩＳＶＤは：
ａ）配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３；または
ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤから選択することができる。

本技術のこの態様の一実施形態において、ＩＳＶＤは、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合する。

さらなる実施形態において、ＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤは：
ａ）配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３；または
ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤから選択される。

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、ＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤは：
ａ）配列番号４と９０％を超える配列同一性；または
ｂ）配列番号６と９０％を超える配列同一性
を含むＩＳＶＤから選択される。

一実施形態において、ＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列；または配列番号６のアミノ酸配列を含むＩＳＶＤから選択される。

単一特異性多価ポリペプチド
別の態様において、本技術のポリペプチドは、単一特異性であり、少なくとも２価であるが、例えば、３価、４価、５価、６価などであってもよい。

用語「２価」、「３価」、「４価」、「５価」、または「６価」は全て用語「多価」に該当し、それぞれ２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤの存在を示す。

したがって、一態様において、本技術は、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性２価ポリペプチドであって、２つのＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、
単一特異性２価ポリペプチドを提供する。

本技術のこの態様の一実施形態において、ＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている。一実施形態において、２つのＩＳＶＤは、ヒトＩＬ１３に特異的に結合する。

さらなる実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；
ｃ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；または
ｄ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含む。

一実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ）第１および第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み：
ｃ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；または
ｄ）第１のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本技術は、ＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる単一特異性２価ポリペプチドであって、２つのＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、２つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｂ）第１のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
第２のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む、単一特異性２価ポリペプチドを提供する。

本技術のこの態様の一実施形態において、ＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている。一実施形態において、２つのＩＳＶＤは、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合する。

さらなる実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含むか、または
ｂ）第１のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

本技術のこの態様のさらなる実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含むか、または
ｂ）第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む。

一実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは、ＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり：
ａ）第１のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；または
ｂ）第１のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、第２のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

これに関して、用語「第１のＩＳＶＤ」および「第２のＩＳＶＤ」は、ＩＬ－１３／ＴＳＬＰに結合する具体的に列挙されたＩＳＶＤの互いの相対的な位置のみを示し、番号付けは、本技術のポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近い。それに応じて、「第２のＩＳＶＤ」はしたがって、「第１のＩＳＶＤ」よりＣ末端により近い。したがって番号付けは、絶対ではなく、２つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すに過ぎないため、それぞれＩＬ－１３およびＴＳＬＰに結合する追加の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得る可能性を排除しない。さらにそれは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその間に配置され得る可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、セクション「多重特異性多価ポリペプチド」および５．４「（インビボでの）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、別のヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含んでいてもよく、これも「第１のＩＳＶＤ」と「第２のＩＳＶＤ」の間に配置されていてもよい（そのためこのような構築物は、後続のセクションで説明されるように多重特異性と称される）。

一実施形態において、単一特異性多価ポリペプチドの、特に上述した単一特異性２価ポリペプチドの（少なくとも２つの）ＩＳＶＤは、ペプチド性リンカーを介して連結されている。２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのペプチド性リンカーの使用は当業界において周知である。単一特異性多価ポリペプチドと共に、特に上述した単一特異性２価ポリペプチドと共に使用できる例示的なペプチド性リンカーは、表Ａ－５に示される。使用されることが多いペプチド性リンカーのクラスの一つは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号７３）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはそれより多くであり得る）などのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む。このようなＧＳリンカーの一部の使用されることが多い例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号７６）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）：３２５～３３０が参照される。本技術の一実施形態において、単一特異性多価ポリペプチドの、特に、本技術の単一特異性２価ポリペプチドのＩＳＶＤは、表Ａ－５に記載のリンカーを介して連結されている。一実施形態において、（少なくとも）２つのＩＳＶＤは、３５ＧＳリンカーを介して連結されている。

したがって、一実施形態において、単一特異性２価ポリペプチドは：
ａ）配列番号１４８のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１４９のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１５０のアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１５１のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１５２のアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１５３のアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１５４のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１５５のアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列、
ｊ）配列番号１５７のアミノ酸配列、
ｋ）配列番号１５８のアミノ酸配列、または
ｌ）配列番号１５９のアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる。

多重特異性多価ポリペプチド
さらなる態様において、本技術のポリペプチドは、少なくとも二重特異性であるが、例えば、三重特異性、四重特異性、五重特異性などであってもよい。さらに、ポリペプチドは、少なくとも２価であるが、例えば、３価、４価、５価、６価などであってもよい。

用語「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」、「五重特異性」などは全て用語「多重特異性を有する」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、５種などの異なる標的分子に結合することを指す。

用語「２価」、「３価」、「４価」、「５価」、「６価」などは全て用語「多価」に該当し、それぞれ２種、３種、４種、５種、６種などの結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤの存在を示す。

例えば、ポリペプチドは、二重特異性４価、例えば少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＩＬ－１３に特異的に結合し、少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＴＳＬＰに特異的に結合する。一実施形態において、ＩＬ－１３およびＴＳＬＰは、ヒトＩＬ－１３およびヒトＴＳＬＰである。別の例において、ポリペプチドは、三重特異性５価、例えば５つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであってもよく、この場合、２つのＩＳＶＤは、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、２つのＩＳＶＤは、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合し、１つのＩＳＶＤは、ヒト血清アルブミンに結合する。このようなポリペプチドは、例えば２つのＩＳＶＤがヒトＩＬ－１３またはヒトＴＳＬＰ上の２つの異なるエピトープと結合する場合、同時にバイパラトピックであり得る。用語「バイパラトピック」は、同じ標的分子の２つの異なる部分（例えば、エピトープ）に結合することを指す。一実施形態において、本技術の三重特異性５価ポリペプチドは、例えば、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１であり、これは、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤ、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤ、１つのヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含み、ＩＬ－１３およびＴＳＬＰの両方に結合することに関してバイパラトピックである。

一実施形態において、多重特異性多価ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなり、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、少なくとも４つのＩＳＶＤは、場合により、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されており：
ａ）第１のＩＳＶＤは、ＩＬ－１３と特異的に結合し、配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、ＩＬ－１３と特異的に結合し、配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、ＴＳＬＰと特異的に結合し、配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み、
ｄ）第４のＩＳＶＤは、ＴＳＬＰと特異的に結合し、配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２、および配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

一実施形態において、前記ポリペプチドによって結合されるＩＬ－１３およびＴＳＬＰは、それぞれヒトＩＬ－１３およびヒトＴＳＬＰである。

多重特異性多価ポリペプチドのさらなる実施形態において：
ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

多重特異性多価ポリペプチドのさらなる態様において：
ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み；
ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；
ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み；
ｄ）前記第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む。

多重特異性多価ポリペプチドの一実施形態において：
ａ）第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ｂ）第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ｃ）第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
ｄ）第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

これに関して、用語「第１のＩＳＶＤ」、「第２のＩＳＶＤ」、「第３のＩＳＶＤ」などは、ＩＳＶＤの互いの相対的な位置のみを示し、番号付けは、本技術のポリペプチドのＮ末端から開始される。したがって「第１のＩＳＶＤ」は、「第２のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近く、それに対して「第２のＩＳＶＤ」は、「第３のＩＳＶＤ」よりＮ末端に近い。したがって、Ｃ末端から考える場合、ＩＳＶＤの配置は逆である。番号付けは絶対ではなく、少なくとも４つのＩＳＶＤの相対的な位置を示すに過ぎないため、ＩＬ－１３またはＴＳＬＰに結合する他の結合単位／ビルディングブロック、例えば追加のＩＳＶＤ、または別の標的に結合するＩＳＶＤがポリペプチド中に存在し得ることは排除されない。さらに、番号付けは、他の結合単位／ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその間に配置され得る可能性を排除しない。例えば、下記でさらに記載されるように（特に、下記のセクション５．４「（インビボでの）半減期の延長」を参照）、ポリペプチドは、別のヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤをさらに含んでいてもよく、これも例えば「第３のＩＳＶＤ」と「第４のＩＳＶＤ」との間に配置されていてもよい。

別の態様において、本技術は、上記（セクション５．１；「単一特異性１価ポリペプチド」）で単一特異性１価ポリペプチドに関して詳細に説明されるＩＬ－１３またはＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤ、および下記（セクション５．４；「（インビボにおける）半減期の延長」）で詳細に説明されるヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む二重特異性２価ポリペプチドを提供する。

別の態様において、本技術は、上記の単一特異性２価ポリペプチド（セクション５．１；「単一特異性２価ポリペプチド」）および下記（セクション５．４；「（インビボにおける）半減期の延長」）で詳細に説明されるヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む二重特異性３価ポリペプチドを提供する。

前記多重特異性多価ポリペプチドの構成要素、例えばＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上の好適なリンカー、例えばペプチド性リンカーによって互いに連結されていてもよい。

２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は当業界において周知である。例示的なペプチド性リンカーは、表Ａ－５に示される。使用されることが多いペプチド性リンカーのクラスの一つは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」または「ＧＳ」リンカーとして公知である。これらは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、通常、ＧＧＧＧＳ（配列番号７３）モチーフ（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎを含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７またはそれより多くであり得る）などのペプチドモチーフの１つまたはそれ以上の反復を含む。このようなＧＳリンカーの一部の使用されることが多い例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号７６）１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）（配列番号７８）および３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）（配列番号８３）である。Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９；およびＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４）２７（１０）：３２５～３３０が参照される。本技術のポリペプチドにおいて、ポリペプチドの構成要素を互いに連結するために、９ＧＳ（配列番号７６）および３５ＧＳ（配列番号８３）リンカーが使用される。

本技術の多重特異性多価ポリペプチドの一態様において、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤ、およびＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む。本技術のこの態様において、ＩＬ－１３に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、３５ＧＳリンカーを介して連結され、それに対してＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、９ＧＳリンカーを介して連結されている。一実施形態において、ＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤは、アルブミンに結合するＩＳＶＤによって分離されている（９ＧＳ－Ａｌｂ－９ＧＳ）（下記のセクション５．４「（インビボにおける）半減期の延長」に記載される通り）。発明者らは、驚くべきことに、このような立体配置はポリペプチドの生産収率を増加させることができることを見出した。

したがって、一実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下：ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、ＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、ＴＳＬＰに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、本明細書で定義される増加した半減期を有するポリペプチドを提供する任意選択の結合単位、およびＴＳＬＰに特異的に結合する第２のＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる。一実施形態において、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する結合単位は、ＩＳＶＤである。

さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端から開始する順番で、以下：ＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤ、リンカー、ＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、リンカー、ＴＳＬＰに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、リンカー、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、リンカー、およびＴＳＬＰに特異的に結合する第２のＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる。具体的な一実施形態において、ＩＬ－１３に結合する２つのＩＳＶＤ間のリンカーが３５ＧＳリンカーであり、それに対して、他方のリンカーは９ＧＳリンカーである。

ポリペプチドのこのような立体配置は、生産収率の増加、優れたＣＭＣ特徴、例えば十分な溶解性および生物物理的安定性、２型免疫応答のモジュレーションに関する強い効力、加えて、既存の抗体への少ない結合をもたらすことができる。

一実施形態において、本技術の多重特異性多価ポリペプチドは、ヒト血清中の既存の抗体による結合の低減を呈示する。この目的を達成するために、一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、１～５個の（天然に存在する）アミノ酸の伸長を含み、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）の伸長を含む。ＩＳＶＤのＣ末端は、通常、ＶＴＶＳＳ（配列番号１３８）である。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を含む。別の実施形態において、ＩＳＶＤは、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１２位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を含む。これらの実施形態において、単一のアラニンを付加した後、ポリペプチドのＣ末端が、例えば、配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１４１）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１４２）、ＶＱＶＳＳＡ（配列番号１４３）、ＶＴＶＫＳＡ（配列番号１７２）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号１７３）、ＶＫＶＫＳＡ（配列番号１７４）、ＶＫＶＱＳＡ（配列番号１７５）、ＶＱＶＫＳＡ（配列番号１７６）、またはＶＱＶＱＳＡ（配列番号１７７）を含むように、ＩＳＶＤのＣ末端は、ＶＫＶＳＳ（配列番号１３９）、ＶＱＶＳＳ（配列番号１４０）、ＶＴＶＫＳ（配列番号１６６）、ＶＴＶＱＳ（配列番号１６７）、ＶＫＶＫＳ（配列番号１６８）、ＶＫＶＱＳ（配列番号１６９）、ＶＱＶＫＳ（配列番号１７０）、またはＶＱＶＱＳ（配列番号１７１）である。一実施形態において、Ｃ末端は、ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１４１）を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、各ＩＳＶＤ中に、アミノ酸１１位におけるバリン（Ｖ）およびアミノ酸８９位におけるロイシン（Ｌ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を含み、場合により、少なくとも１つのＩＳＶＤ中に、１１０位におけるリシン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を含み、１～５個の（天然に存在する）アミノ酸の伸長を含み、例えばＩＳＶＤのＣ末端における単一のアラニン（Ａ）の伸長を含む（ポリペプチドのＣ末端が、例えば配列ＶＴＶＳＳＡ（配列番号１４１）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号１４２）またはＶＱＶＳＳＡ（配列番号１４３）、例えばＶＴＶＳＳＡ（配列番号１４１）を有するように）。これに関するさらなる情報については、例えばＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５を参照されたい。

一実施形態において、本技術の多重特異性多価ポリペプチドは、配列番号１と、９０％を超える配列同一性、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、５つのＩＳＶＤのＣＤＲは、それぞれ下記のセクション「５．２ 免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「５．４（インビボにおける）半減期の延長」に記載の項目Ａ～Ｅ（またはＫａｂａｔの定義を使用する場合、Ａ’～Ｅ’）で定義された通りであり、特に：
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ＴＳＬＰに特異的に結合する第３のＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ＴＳＬＰに特異的に結合する第４のＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有するか、
または代替としてＫａｂａｔの定義を使用する場合、：
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第１のＩＳＶＤは、配列番号３７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ＩＬ－１３に特異的に結合する第２のＩＳＶＤは、配列番号３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ＴＳＬＰに特異的に結合する第３のＩＳＶＤは、配列番号３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ＴＳＬＰに特異的に結合する第４のＩＳＶＤは、配列番号４１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有し；
・ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号４０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を有する。

別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

一実施形態において、本技術のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較した場合、ヒトＩＬ－１３およびヒトＴＳＬＰの少なくとも半分の結合親和性、またはそれと少なくとも同じ結合親和性を有し、この場合、結合親和性は、同じ方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定される。

５．２ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）は、「単一可変ドメイン」と同義的に使用され、これは、免疫グロブリン分子であって、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、それにより形成されるものを定義する。これは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）またはその断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ）とは別にＩＳＶＤを設定している。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）とが相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与することになり、すなわち合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に関与することになる。

上記の定義を考慮すれば、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子；当業界において公知）の、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、例えばジスルフィドで連結されたＦｖまたはｓｃＦｖ断片、もしくはこのような従来の４鎖抗体由来のダイアボディ（全て当業界において公知）の抗原－結合ドメインは通常、ＩＳＶＤとみなされないが、これは、これらの場合では、抗原のそれぞれのエピトープに結合することは通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインによって起こるのではなく、一対の（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインによって、すなわち連帯してそれぞれの抗原のエピトープに結合する免疫グロブリンドメインのＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ対によって起こるためである。

対照的に、ＩＳＶＤは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合せずに抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。ＩＳＶＤの結合部位は、単一のＶ_Ｈ、単一のＶ_ＨＨまたは単一のＶ_Ｌドメインによって形成される。

したがって、単一の抗原結合単位（すなわち、機能的な抗原結合単位を形成するのに、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位）を形成することが可能である限りは、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｌ－配列）もしくはその好適な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｈ－配列またはＶ_ＨＨ配列）もしくはその好適な断片であり得る。

ＩＳＶＤは、例えば重鎖ＩＳＶＤであってもよく、例えばＶ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、例えばラクダ化Ｖ_Ｈまたはヒト化されたＶ_ＨＨなどであってもよい。一実施形態において、ＩＳＶＤは、Ｖ_ＨＨであり、例えばラクダ化Ｖ_Ｈまたはヒト化Ｖ_ＨＨなどである。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体または重鎖抗体由来であってもよい。

例えば、ＩＳＶＤは、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体として使用するのに好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ（またはｄＡｂとして使用するのに好適なアミノ酸配列）、もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書で定義される通りであり、その例としては、これに限定されないが、Ｖ_ＨＨが挙げられる）；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれか１つのあらゆる好適な断片であり得る。

特に、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（例えばＶ_ＨＨ、例えばヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ化Ｖ_Ｈなど）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である。

「Ｖ_ＨＨドメイン」は、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_ＨＨ抗体断片、およびＶ_ＨＨ抗体としても公知であり、これは元々、「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠失した抗体」の；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６～４４８、１９９３）免疫グロブリンの可変ドメインと結合する抗原として説明されていた。用語「Ｖ_ＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体（本明細書では「Ｖ_Ｈドメイン」と称される）に存在する重鎖可変ドメインおよび従来の４鎖抗体（本明細書では「Ｖ_Ｌドメイン」と称される）に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために選択された。Ｖ_ＨＨのさらなる説明のために、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総論（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２、２００１）が参照される。

典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物の免疫化、免疫グロブリンを生産する細胞を融合してハイブリドーマを作り出すこと、および望ましい特異性に関してスクリーニングすることを含む。代替として、免疫グロブリンは、ナイーブまたは合成ライブラリーを、例えばファージディスプレイによってスクリーニングすることによって生成してもよい。

免疫グロブリン配列、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の生成は、様々な出版物で広範囲に説明されおり、そのなかでも、ＷＯ９４／０４６７８、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１を例示することができる。これらの方法において、前記標的抗原に対する免疫応答を誘導するために、ラクダ科動物が標的抗原で免疫化される。前記免疫化から得られたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのレパートリーはさらに、標的抗原と結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓに関してスクリーニングされる。

これらの例において、抗体の生成は、免疫化および／またはスクリーニングのために精製した抗原を必要とする。抗原は、天然源から精製してもよいし、または組換え体生産の過程で精製してもよい。

免疫グロブリン配列の免疫化および／またはスクリーニングは、このような抗原のペプチド断片を使用して実行することができる。

本技術は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ免疫グロブリン配列を含む異なる起源の免疫グロブリン配列を使用することができる。本技術はまた、完全ヒト、ヒト化またはキメラ配列も含む。例えば、本技術は、ラクダ免疫グロブリン配列およびヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、またはラクダ化ドメイン抗体、例えば、Ｗａｒｄら（例えばＷＯ９４／０４６７８およびＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４および１９９６）を参照）によって記載されるようなラクダ化ｄＡｂを含む。さらに、本技術はまた、融合した免疫グロブリン配列、例えば、多価および／または多重特異性構築物（１つまたはそれ以上のＶ_ＨＨドメインを含有する多価および多重特異性ポリペプチドならびにそれらの調製のため、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、１０．７３４６～７３５０、２００１、加えて例えばＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１が参照される）、ならびにタグまたは他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射化学物質などを含む免疫グロブリン配列を形成する融合した免疫グロブリン配列も使用し、これらは本技術の免疫グロブリン配列から誘導可能である。

「ヒト化Ｖ_ＨＨ」は、天然に存在するＶ_ＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されている、すなわち、前記天然に存在するＶ_ＨＨ配列のアミノ酸配列中の（特にフレームワーク配列中の）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の４鎖抗体（例えば上記で示された）からのＶ_Ｈドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってヒト化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書や先行技術（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に記載のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。ここでも注目すべきことに、このようなヒト化Ｖ_ＨＨは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。

「ラクダ化Ｖ_Ｈ」は、天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち、従来の４鎖抗体からの天然に存在するＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶ_ＨＨドメインにおける対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたはそれ以上によって置き換えることによってラクダ化されているアミノ酸配列を含む。これは、例えば本明細書や先行技術（例えばＷＯ２００８／０２００７９）に記載のさらなる説明に基づき、当業者には明らかであるそれ自体公知の方式で実行することができる。このような「ラクダ化」置換は通常、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌの境界を形成する、および／またはそこに存在するアミノ酸位置に、および／または本明細書で定義されるようないわゆるラクダの特徴的な残基に挿入される（例えばＷＯ９４／０４６７８ならびにＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４および１９９６）、上記を参照）。一実施形態において、ラクダ化Ｖ_Ｈを生成または設計するための出発材料または開始点として使用されるＶ_Ｈ配列は、哺乳動物からのＶ_Ｈ配列、またはヒトのＶ_Ｈ配列、例えばＶ_Ｈ３配列である。しかしながら、注目すべきことに、このようなラクダ化Ｖ_Ｈは、それ自体公知のあらゆる好適な方式で得ることができ、したがって、厳密には、出発材料として天然に存在するＶ_Ｈドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。

ＩＳＶＤ配列の構造は、４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）で構成されるとみなすことができ、これらは、当業界および本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；および「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）として言及され；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）が途中に存在し、これらは、当業界および本明細書ではそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；および「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）として言及される。

ＷＯ０８／０２００７９の５８頁および５９頁段落ｑ）でさらに記載されるように、ＩＳＶＤのアミノ酸残基は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２０００（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１～２）：１８５～１９５；例えばこの出版物の図２を参照）の論文に記載のラクダ科動物からのＶ_ＨＨドメインに適用された通り、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって付与されるＶ_Ｈドメインの一般的な番号付けに従って番号付けすることができる。注目すべきことに、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインに関して当業界において周知の通り、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変化することがあり、Ｋａｂａｔの番号付けによって示されたアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる１つまたはそれ以上の位置が実際の配列において占有されていなくてもよいし、または実際の配列がＫａｂａｔの番号付けによって許容される数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）。これは、一般的に、Ｋａｂａｔによる番号付けは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号付けに対応していてもよいし、または対応していなくてもよいことを意味する。Ｖ_ＨドメインおよびＶ_ＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常、１１０～１２０の範囲となり、１１２～１１５となることが多い。しかしながら、注目すべきことに、それより短い配列およびそれより長い配列も、本明細書に記載される目的にとって好適であり得る。

本出願において、別段の指定がない限り、ＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２０１０年編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、第３章、３３～５１頁）に記載されたように、ＡｂＭの定義に従って決定された。この方法によれば、ＦＲ１は、１～２５位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、２６～３５位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、３６～４９位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ２は、５０～５８位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、５９～９４位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、９５～１０２位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は、１０３～１１３位にアミノ酸残基を含む。

ＣＤＲ領域の決定は、異なる方法に従って行ってもよい。ＫａｂａｔによるＣＤＲ決定において、ＩＳＶＤのＦＲ１は、１～３０位にアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＣＤＲ１は、３１～３５位にアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＦＲ２は、３６～４９位にアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＣＤＲ２は、５０～６５位にアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＦＲ３は、６６～９４位にアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＣＤＲ３は、９５～１０２位にアミノ酸残基を含み、ＩＳＶＤのＦＲ４は、１０３～１１３位にアミノ酸残基を含む。

このような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は、あらゆる好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的な教本、および本明細書で述べられたさらなる開示および先行技術に基づき当業者には明らかであろう。

フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列または免疫グロブリンフレームワーク配列から得られた（例えば、ヒト化またはラクダ化によって）フレームワーク配列の好適な組合せである。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶ_Ｌ配列）および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶ_Ｈ配列またはＶ_ＨＨ配列）から得られたフレームワーク配列であり得る。一態様において、フレームワーク配列は、Ｖ_ＨＨ配列から得られたフレームワーク配列（それにおいて、前記フレームワーク配列が、場合により、部分的または完全にヒト化されていてもよい）であるか、または従来のラクダ化Ｖ_Ｈ配列（本明細書で定義される通り）であるかのいずれかである。

特に、本技術で使用されるＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、ＩＳＶＤ配列が、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、例えばヒト化Ｖ_ＨＨまたはラクダ化Ｖ_Ｈを含むＶ_ＨＨになるように、特徴的な残基（本明細書で定義される通り）の１つまたはそれ以上を含有していてもよい。このようなフレームワーク配列の一部の非限定的な例（その好適な組合せ）は、本明細書に記載のさらなる開示から明確になるであろう。

ここでも、本明細書において免疫グロブリン配列に関して一般的に記載される通り、また、前述のもののいずれかの好適な断片（または断片の組合せ）、例えば、好適には１つまたはそれ以上のフレームワーク配列が隣接する、および／またはそれを介して連結された１つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を含有する断片（例えば、これらのＣＤＲおよびフレームワーク配列は、断片がそれから得られた完全サイズの免疫グロブリン配列において生じ得る同じ順番で）を使用することも考えられる。

しかしながら、注目すべきことに、本技術は、ＩＳＶＤ配列（またはそれを発現させるのに使用されるヌクレオチド配列）の起源にも、ＩＳＶＤ配列またはヌクレオチド配列が生成される（または生成された）または得られる方法にも限定されない。したがって、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）であってもよいし、または合成もしくは半合成の配列であってもよい。具体的な、ただし非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は、天然に存在する配列（あらゆる好適な種からの）または合成もしくは半合成の配列であり、その例としては、これらに限定されないが、「ヒト化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列（例えば部分的または完全にヒト化されたマウスまたはウサギ免疫グロブリン配列、特に、部分的または完全にヒト化されたＶ_ＨＨ配列）、「ラクダ化」（本明細書で定義される通り）免疫グロブリン配列、加えて、親和性成熟（例えば、合成、ランダムまたは天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフティング、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列から得られた断片を組み合わせること、オーバーラップするプライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似の技術；または前述のもののいずれかのあらゆる好適な組合せなどの技術により得られた免疫グロブリン配列が挙げられる。

同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列または合成もしくは半合成の配列であってもよく、例えば、好適な天然に存在するテンプレートからＰＣＲによって単離される配列（例えば細胞から単離したＤＮＡまたはＲＮＡ）、ライブラリー（特に、発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、天然に存在するヌクレオチド配列に突然変異を導入すること（それ自体公知のあらゆる好適な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）によって調製されるヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを使用するＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体公知のＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。

上述したように、ＩＳＶＤは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの一般的な説明のために、以下のさらなる説明、加えて本明細書において引用された先行技術が参照される。しかしながら、この点において、この説明および先行技術は、主として、いわゆる「Ｖ_Ｈ３クラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（すなわち、ＤＰ－４７、ＤＰ－５１またはＤＰ－２９などのＶ_Ｈ３クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）を説明したものであることに留意すべきである。しかしながら、本技術は、その最も広い意味で、一般的にあらゆるタイプのＮａｎｏｂｏｄｙを使用することができ、例えば、例えばＷＯ２００７／１１８６７０に記載されたように、いわゆる「Ｖ_Ｈ４クラス」に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（すなわち、ＤＰ－７８などのＶ_Ｈ４クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）も使用することに留意すべきである。

一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（特にＶ_ＨＨ配列、例えば（部分的に）ヒト化Ｖ_ＨＨ配列およびラクダ化Ｖ_Ｈ配列など）は、フレームワーク配列（ここでも本明細書にさらに記載される通り）の１つまたはそれ以上における１つまたはそれ以上の「特徴的な残基」（本明細書に記載される通り）の存在によって特徴付けることができる。したがって、一般的に、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列と定義することができ、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、特徴的な残基の１つまたはそれ以上は、さらに本明細書で定義される通りである。

詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し、フレームワーク配列は、さらに本明細書で定義される通りである。

より詳細には、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であってもよく、式中、ＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１～３を指し：
Ｋａｂａｔの番号付けに従って１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８位におけるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が、以下の表Ａ－０に記載した特徴的な残基から選択される。

本技術はとりわけ、ＩＬ－１３またはＴＳＬＰに結合することができるＩＳＶＤを使用する。本技術に関して、特定の標的分子「に結合すること」は、抗体およびそのそれぞれの抗原に関して理解される通り当業界における通常の意味を有する。

本技術の多重特異性多価ポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤ、およびＴＳＬＰに特異的に結合する２つまたはそれ以上のＩＳＶＤを含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合する２つのＩＳＶＤ、およびＴＳＬＰに特異的に結合する２つのＩＳＶＤを含んでいてもよい。

一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＳＶＤは、その標的分子を機能的にブロックすることができる。例えば、標的化部分は、ＩＬ－１３とＩＬ－１３Ｒα１（インターロイキン１３受容体、アルファ１）との相互作用、および／またはＩＬ－１３／ＩＬ－１３Ｒα１複合体とＩＬ－４Ｒα（アルファインターロイキン－４受容体）との相互作用をブロックすることができ、またはＴＳＬＰとＴＳＬＰＲ（ＴＳＬＰ受容体）との相互作用、および／またはＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲ複合体とＩＬ－７Ｒα（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）との相互作用をブロックすることができる。したがって、一実施形態において、本技術のポリペプチドは、ＩＬ－１３に特異的に結合し、それとＩＬ－１３Ｒα１との相互作用および／またはＩＬ－１３／ＩＬ－１３Ｒα１複合体とＩＬ－４Ｒαとの相互作用を機能的にブロックする少なくとも２つのＩＳＶＤ、ならびにＴＳＬＰに特異的に結合し、それとＴＳＬＰＲとの相互作用、および／またはＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲ複合体とＩＬ－７Ｒαとの相互作用を機能的にブロックする２つのＩＳＶＤを含む。

本技術で使用されるＩＳＶＤは、ポリペプチドがＩＬ－１３およびＴＳＬＰに特異的に結合することができるように、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなる本技術のポリペプチドの一部を形成する。

したがって、本技術のポリペプチドで使用される少なくとも４つのＩＳＶＤの標的分子は、ＩＬ－１３およびＴＳＬＰである。その例は、哺乳類のＩＬ－１３およびＴＳＬＰである。ヒトＩＬ－１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５２２５）およびヒトＴＳＬＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６９Ｄ９）の他にも、他の種からのバージョンも本技術に適しており、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル（本明細書では「ｃｙｎｏ」としても言及される）、またはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカからのＩＬ－１３およびＴＳＬＰが挙げられる。

本技術で使用できるＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、以下の項目ＡおよびＢに記載される通りである：
Ａ．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

Ｂ．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

このようなヒトＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤの例は、それぞれ表Ａ－２に記載の構築物４Ｂ０２または４Ｂ０６に関して示されるように、１つまたはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有する（それぞれ前述の項目ＡおよびＢで定義されたＣＤＲに加えて）。一実施形態において、これは、構築物４Ｂ０２または構築物４Ｂ０６（それぞれ配列番号２および３；表Ａ－１およびＡ－２を参照）の全長アミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＳＶＤである。

別の実施形態において、ヒトＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２または３と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、ＣＤＲは、それぞれ前述の項目ＡまたはＢで定義された通りである。一実施形態において、ＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２または３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

このようなＩＬ－１３に結合するＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目ＡまたはＢ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲにおいて２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、それぞれ配列番号２または３に記載の構築物４Ｂ０２または４Ｂ０６のように、ヒトＩＬ－１３の少なくとも半分の結合親和性、またはそれと少なくとも同じ結合親和性を有し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

本技術で使用できるＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、以下の項目ＣおよびＤに記載される通りである：
Ｃ．ヒトＴＳＬＰに特異的に結合し、
ｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

Ｄ．ヒトＴＳＬＰに特異的に結合し、
ｉ．配列番号１１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

このようなヒトＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤの例は、それぞれ表Ａ－２に記載の構築物５０１Ａ０２および５２９Ｆ１０に関して示されるように、１つまたはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有する（前述の項目ＣおよびＤで定義されたＣＤＲに加えて）。一実施形態において、これは、構築物５０１Ａ０２または５２９Ｆ１０（配列番号４または６、表Ａ－１およびＡ－２を参照）の全長アミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＳＶＤである。

別の実施形態において、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４または６と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、ＣＤＲは、前述の項目ＣまたはＤで定義された通りである。一実施形態において、ヒトＴＳＬＰに結合するＩＳＶＤは、配列番号４または６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

このようなヒトＴＳＬＰに結合するＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目ＣまたはＤ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、それぞれ配列番号４および６に記載の構築物５０１Ａ０２または５２９Ｆ１０のように、ヒトＴＳＬＰの少なくとも半分の結合親和性、またはそれと少なくとも同じ結合親和性を有し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

一実施形態において、上記の項目Ａ～Ｄで定義されるＩＳＶＤのそれぞれは、本技術のポリペプチドに含まれる。

このような上記の項目Ａ～Ｄで定義されるＩＳＶＤのそれぞれを含む本技術のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドのように、ヒトＩＬ－１３およびヒトＴＳＬＰの少なくとも半分の結合親和性、またはそれと少なくとも同じ結合親和性を有し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

上記の項目Ａ～Ｄおよび下記の項目Ｅで言及される配列番号（セクション５．４「（インビボにおける）半減期の延長」を参照）は、ＡｂＭの定義によるＣＤＲの定義（表Ａ－２を参照）に基づく。Ｋａｂａｔ定義により同じＣＤＲを定義する配列番号（表Ａ－２．１を参照）は、同様に、上記の項目Ａ～Ｄおよび下記の項目Ｅで使用することができることに留意する（セクション５．４「（インビボにおける）半減期の延長」を参照）。

したがって、本技術で使用できるＩＬ－１３またはＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤの具体的な例は、ＡｂＭの定義を使用して上述した通りであり、下記の項目Ａ’～Ｄ’に記載の通りＫａｂａｔ定義を使用して記載することもできる：
Ａ’．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４２のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４２と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１７と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号３７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

Ｂ’．ヒトＩＬ－１３に特異的に結合し、
ｉ．配列番号３８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４３のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４３と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１８と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号３８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

このようなヒトＩＬ－１３に特異的に結合するＩＳＶＤの例は、それぞれ表Ａ－２－１に記載の構築物４Ｂ０２または４Ｂ０６に関して示されるように、１つまたはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有する（それぞれ前述の項目Ａ’およびＢ’で定義されたＣＤＲに加えて）。一実施形態において、これは、構築物４Ｂ０２または構築物４Ｂ０６（それぞれ配列番号２および３；表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）の全長アミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＳＶＤである。

Ｃ’．ヒトＴＳＬＰに特異的に結合し、
ｉ．配列番号３９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号３９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４４のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４４と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号１９のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１９と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

Ｄ’．ヒトＴＳＬＰに特異的に結合し、
ｉ．配列番号４１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４６のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４６と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２１と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号４１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

このようなヒトＴＳＬＰに特異的に結合するＩＳＶＤの例は、それぞれ表Ａ－２－１に記載の構築物５０１Ａ０２および５２９Ｆ１０に関して示されるように、１つまたはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有する（前述の項目Ｃ’およびＤ’で定義されたＣＤＲに加えて）。一実施形態において、これは、構築物５０１Ａ０２または５２９Ｆ１０（配列番号４または６、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）の全長アミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＳＶＤである。

第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一な、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることによって計算することができ、この場合、第１のアミノ酸配列と比較した場合の第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加のそれぞれは、単一のアミノ酸残基（すなわち単一の位置）における差としてみなされる。

通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１の」アミノ酸配列として取り扱われることになり、その他のアミノ酸配列が「第２の」アミノ酸配列として取り扱われることになる。

「アミノ酸の差異」は、本明細書で使用される場合、参照配列に相対する単一のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を指す。一実施形態において、「アミノ酸の差異」は、置換である。

一実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。このような保存的置換は、以下のグループ（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（ａ）小さい脂肪族の、非極性の、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負電荷を有する残基およびその（非荷電性）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族の、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。

一実施形態において、保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙへの、またはＳｅｒへの；ＡｒｇからＬｙｓへの；ＡｓｎからＧｌｎへの、またはＨｉｓへの；ＡｓｐからＧｌｕへの；ＣｙｓからＳｅｒへの；ＧｌｎからＡｓｎへの；ＧｌｕからＡｓｐへの；ＧｌｙからＡｌａへの、またはＰｒｏへの；ＨｉｓからＡｓｎへの、またはＧｌｎへの；ＩｌｅからＬｅｕへの、またはＶａｌへの；ＬｅｕからＩｌｅへの、またはＶａｌへの；ＬｙｓからＡｒｇへの、Ｇｌｎへの、またはＧｌｕへの；ＭｅｔからＬｅｕへの、Ｔｙｒへの、またはＩｌｅへの；ＰｈｅからＭｅｔへの、Ｌｅｕへの、またはＴｙｒへの；ＳｅｒからＴｈｒへの；ＴｈｒからＳｅｒへの；ＴｒｐからＴｙｒへの；ＴｙｒからＴｒｐへの；および／またはＰｈｅからＶａｌへの、Ｉｌｅへの、またはＬｅｕへの置換。

５．３ 特異性
用語「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、特定の結合単位、例えばＩＳＶＤが十分に高い親和性で結合することができる、同じ生物からの抗原などの異なる標的分子の数を指す（下記を参照）。「特異性」、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、本明細書において、「選択性」、「選択的に結合する」または「選択的な結合」と同義的に使用される。結合単位、例えばＩＳＶＤは、その指定された標的に特異的に結合する。

結合単位の特異性／選択性は、親和性に基づいて決定することができる。親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般的に、モル／リットル（またはＭ）の単位を有するＫＤ、または解離定数によって示される。親和性はまた、１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）^－１（またはＭ^－１）の単位を有する会合定数、ＫＡとして表すこともできる。

親和性は、部分と標的分子上の結合部位との間の結合強度の尺度であり：ＫＤ値が低いほど、標的分子と標的化部分との間の結合強度はより強くなる。

典型的には、本技術で使用される結合単位（例えばＩＳＶＤ）は、その標的に、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満、または１０^－７～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満、または１０^－８～１０^－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０^５～１０^１２リットル／モルまたはそれより多く、または１０^７～１０^１２リットル／モルまたはそれより多く、または１０^８～１０^１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）結合する。

一般的に、１０^－４モル／リットルより大きいあらゆるＫＤ値（または１０^４リットル／ｍｏｌより低いあらゆるＫＡ値）が、非特異的な結合を示すとみなされる。

生物学的な相互作用のＫＤ、例えば、特異的とみなされる免疫グロブリン配列の抗原への結合のＫＤは、典型的には、１０^－５モル／リットル（１００００ｎＭまたは１０μＭ）～１０^－１２モル／リットル（０．００１ｎＭまたは１ｐＭ）またはそれ未満の範囲内である。

したがって、特異的／選択的な結合は、同じ測定方法、例えばＳＰＲを使用した場合、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）は、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で、ＩＬ１３および／またはＴＳＬＰに結合し、関連するサイトカインに１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合することを意味する場合がある。ＩＬ１３に関連する標的の例は、ヒトＩＬ４である。ＴＳＬＰに関連するサイトカインの例は、ヒトＩＬ７である。したがって、本技術の一実施形態において、ポリペプチド中に含まれる少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＩＬ１３に、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のＩＬ４に、１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合し、ポリペプチド中に含まれる少なくとも２つのＩＳＶＤは、ＴＳＬＰに、１０^－５～１０^－１２モル／リットルまたはそれ未満のＫＤ値で結合し、同じ種のヒトＩＬ７に、１０^－４モル／リットルより大きいＫＤ値で結合する。

したがって、本技術のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドと比較した場合、ヒトＩＬ１３およびヒトＴＳＬＰの少なくとも半分の結合親和性、またはそれと少なくとも同じ結合親和性を有し、この場合、結合親和性は、同じ方法、例えばＳＰＲを使用して測定される。

特定の種からの特定の標的への特異的な結合は、結合単位が、異なる種からの類似した標的にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。例えば、ヒトＩＬ１３への特異的な結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザルからのＩＬ１３にも特異的に結合する可能性があることを排除しない。同様に、例えば、ヒトＴＳＬＰへの特異的な結合は、結合単位（またはそれを含むポリペプチド）が、カニクイザル（「ｃｙｎｏ」）からのＴＳＬＰにも特異的に結合する可能性があることを排除しない。

結合単位の、その指定された標的への特異的な結合は、それ自体公知のあらゆる好適な方式、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびにそれ自体当業界において公知のそれらの様々な改変法；加えて本明細書で述べられる他の技術で決定することができる。

解離定数は、当業者には明らかであろうが、実際の解離定数であってもよいし、または見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであり、その例としては、下記で述べられる技術が挙げられる。この点において、１０^－４モル／リットルまたは１０^－３モル／リットルより大きい（例えば１０^－２モル／リットルの）解離定数を測定できない可能性があることも明らかであろう。場合により、当業者には明らかであろうが、（実際の、または見かけの）解離定数は、［ＫＤ＝１／ＫＡ］という関係によって、（実際の、または見かけの）会合定数（ＫＡ）に基づき計算することができる。

２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術を介して測定することができる（例えばＯｂｅｒら、２００１、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：１５５１～１５５９を参照）。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用される場合、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、この場合、一方の分子がバイオセンサーチップに固定され、他方の分子が流動条件下で固定された分子上を通過することで、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ測定値、したがってＫ_Ｄ（またはＫ_Ａ）値が得られる。これは、例えば、周知のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して実行することができる。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９～２６）、Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０～６２７）、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５～１３１）、およびＪｏｈｎｎｓｏｎら（１９９１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８～２７７）を参照されたい。

生体分子の相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えばＡｂｄｉｃｈｅら、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９～２１７を参照）。用語「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」は、本明細書で使用される場合、２つの表面：内部参照層（参照ビーム）およびバイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質の層（シグナルビーム）から反射した光の干渉縞を分析する、標識なしの光学技術を指す。バイオセンサーのチップに結合した分子の数の変化は、波長シフト（ｎｍ）として報告される干渉縞におけるシフトを引き起こし、その規模が、バイオセンサーチップ表面に結合した分子の数の直接の尺度である。相互作用はリアルタイムで測定できるため、会合および解離速度ならびに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＵＳＡの一部門）を使用して実行することができる。

代替として、親和性は、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）プラットフォーム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｂｏｉｓｅ、ＵＳＡ）を使用する反応速度論除外アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ）（例えばＤｒａｋｅら、２００４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２８：３５～４３を参照）で測定することができる。用語「ＫｉｎＥｘＡ」は、本明細書で使用される場合、改変されていない分子の真の平衡結合親和性および速度論を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化溶液を、抗原（または抗体）でプレコーティングされたビーズを有するカラム上に通過させることで、遊離の抗体（または抗原）をコーティングされた分子に結合させることができる。このようにして捕獲された抗体（または抗原）の検出は、抗体（または抗原）と結合する蛍光標識したタンパク質を用いて達成される。

ＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化された生物学的な分析および迅速なサンプルの回転のためのプラットフォームを提供する（Ｆｒａｌｅｙら、２０１３、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ５：１７６５～７４）。

５．４ （インビボにおける）半減期の延長
ポリペプチドは、場合により１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結された、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含んでいてもよく、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した（インビボにおける）半減期を有するポリペプチドを提供する。インビボにおける半減期の延長は、例えば、ポリペプチドが、投与された後、哺乳動物、例えばヒト対象において増加した半減期を有することを意味する。半減期は、例えばｔ１／２ベータとして表することができる。

基、残基、部分または結合単位のタイプは、一般的に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群から選択することができる。

より具体的には、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、または血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧに結合することができる結合単位からなる群から選択することができる。一実施形態において、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができる結合単位である。一実施形態において、結合単位は、ＩＳＶＤである。

例えば、ＷＯ０４／０４１８６５は、血清アルブミンに結合する（特にヒト血清アルブミンに対する）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）であって、前記タンパク質の半減期を増加させるために他のタンパク質（例えば望ましい標的に結合する１種またはそれ以上の他のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）に連結されていてもよいものを記載している。

国際出願ＷＯ０６／１２２７８７は、（ヒト）血清アルブミンに対する多数のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を記載している。これらのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）としては、Ａｌｂ－１（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号５２）およびそれらのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ－８（ＷＯ０６／１２２７８７では配列番号６２）と称されるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）が挙げられる。これらもまた、治療用タンパク質およびポリペプチドならびに他の治療的な実体または部分の半減期を延長するのに使用することができる。

さらに、ＷＯ２０１２／１７５４００は、Ａｌｂ－２３と称されるＡｌｂ－１のさらに改善されたバージョンを記載している。

一実施形態において、ポリペプチドは、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－３、Ａｌｂ－４、Ａｌｂ－５、Ａｌｂ－６、Ａｌｂ－７、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－９、Ａｌｂ－１０およびＡｌｂ－２３から選択される血清アルブミン結合部分を含む。一実施形態において、血清アルブミン結合部分は、ＷＯ２０１２／１７５４００の７～９頁で示されるようなＡｌｂ－８もしくはＡｌｂ－２３またはそのバリアント、およびＷＯ２０１２／１７５７４１、ＷＯ２０１５／１７３３２５、ＷＯ２０１７／０８０８５０、ＷＯ２０１７／０８５１７２、ＷＯ２０１８／１０４４４４、ＷＯ２０１８／１３４２３５、ＷＯ２０１８／１３４２３４に記載されるアルブミンバインダーである。一部の血清アルブミンバインダーは、表Ａ－４にも示される。一実施形態において、本技術のポリペプチドのさらなる構成要素は、項目Ｅに記載される通りである：
Ｅ．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号１５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤの例は、表Ａ－２に記載の構築物ＡＬＢ２３００２に関して示されるように、１つまたはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有する（前述の項目Ｅで定義されたＣＤＲに加えて）。一実施形態において、これは、構築物ＡＬＢ２３００２（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２を参照）の全長アミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＳＶＤである。

項目Ｅはまた、Ｋａｂａｔ定義を使用して以下のように記載することもできる：
Ｅ’．ヒト血清アルブミンに結合し、
ｉ．配列番号４０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４５のアミノ酸配列であるかまたは配列番号４５と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
ｉｉｉ．配列番号２０のアミノ酸配列であるかまたは配列番号２０と２もしくは１つのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ３
を含むＩＳＶＤ。

一実施形態において、ＩＳＶＤは、配列番号４０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２および配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３を含む。

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤの例は、表Ａ－２－１に記載の構築物ＡＬＢ２３００２に関して示されるように、１つまたはそれ以上の、または全てのフレームワーク領域を有する（前述の項目Ｅ’で定義されたＣＤＲに加えて）。一実施形態において、これは、構築物ＡＬＢ２３００２（配列番号５、表Ａ－１およびＡ－２－１を参照）の全長アミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＩＳＶＤである。

さらなる実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と、９０％を超える、例えば９５％を超える、または９９％を超える配列同一性を有していてもよく、ＣＤＲは、前述の項目ＥまたはＥ’で定義された通りである。一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。

このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、対応する参照ＣＤＲ配列（上記の項目Ｅ）と比べて少なくとも１つのＣＤＲ中に２または１つのアミノ酸の差異を有する場合、ＩＳＶＤは、配列番号５に記載の構築物ＡＬＢ２３００２のように、ヒト血清アルブミンの少なくとも半分の結合親和性、またはそれと少なくとも同じ結合親和性を有し、この場合、結合親和性は、ＳＰＲなどの同じ方法を使用して測定される。

一実施形態において、このようなヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端の位置を有する場合、Ｃ末端アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）の伸長を呈示する。一実施形態において、このようなＩＳＶＤは、配列番号５９、６０、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９および７１から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、Ｃ末端の位置とは別の位置にある（すなわち、本技術のポリペプチドのＣ末端のＩＳＶＤではない）。一実施形態において、このようなＩＳＶＤは、配列番号５、５７、５８、６１、および６３から選択される（下記の表Ａ－４を参照）。

５．５ 核酸分子
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。

「核酸分子」（「核酸」と同義的に使用される）は、ヌクレオチド配列を形成するためにリン酸主鎖を介して互いに連結されたヌクレオチド単量体の鎖である。核酸は、例えばポリペプチドの発現および／または生産のために、宿主細胞または宿主生物を形質転換／トランスフェクトするのに使用することができる。生産目的のための好適な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。本技術のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主または宿主細胞も、本技術に包含される。

核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであってもよいし、ＰＮＡのような（例えば化学的に）修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。核酸は、一本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよい。一実施形態において、核酸は、二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本技術のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡであってもよい。

本技術の核酸は、それ自体公知の方式で調製するかまたは得てもよいし、および／または好適な天然源から単離してもよい。天然に存在する（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供されるように、部位特異的変異誘発に供してもよい。また当業者には明らかであろうが、核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば標的化部分をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば１つまたはそれ以上のリンカーをコードする核酸も、好適な方式で一緒に連結されていてもよい。

核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、その例としては、これらに限定されないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つまたはそれ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（または２つまたはそれ以上のそれらの一部）を組み合わせること、短縮化された発現産物の発現をもたらす突然変異の導入；１つまたはそれ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して容易に消化および／またはライゲートすることができるカセットおよび／または領域を作り出すため）、ならびに／または１つまたはそれ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入を挙げることができる。

５．６ ベクター
本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を細胞に運ぶのに好適な媒体である。ベクターとしては、裸の核酸、例えばプラスミドまたはｍＲＮＡ、またはより大きい構造に埋め込まれた核酸、例えばリポソームもしくはウイルスベクターが挙げられる。

ベクターは、一般的に、場合により、１つまたはそれ以上の調節エレメント、例えば１つまたはそれ以上の好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに連結された少なくとも１つの核酸を含む。一実施形態において、ベクターは、発現ベクターであり、すなわち、好適な条件下で、例えばベクターが（例えばヒト）細胞に導入されたときに、コードされたポリペプチドまたは構築物を発現させるのに好適なベクターである。ＤＮＡベースのベクターの場合、これは通常、転写のためのエレメントの存在（例えばプロモーターおよびポリＡシグナル）および翻訳のためのエレメントの存在（例えばコザック配列）を含む。

一実施形態において、ベクター中において、前記少なくとも１つの核酸および前記調節エレメントは、互いに「作動可能に連結」しており、これは、一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターがコード配列の転写および／または発現を開始させるかまたはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することができる場合、コード配列に「作動可能に連結している」とみなされる（ここで前記コード配列は、前記プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結している場合、それらは同じ方向となり、また通常は同じリーディングフレーム内にある。それらはまた通常は本質的に連続しているが、これもまたそうである必要はない場合もある。

一実施形態において、ベクターのいずれの調節エレメントも、それらが意図した宿主細胞または宿主生物においてそれらの意図した生物学的機能を提供できるようなものである。

例えば、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターは、意図した宿主細胞または宿主生物において「作動可能である」はずであり、これは、例えば前記プロモーターが、ヌクレオチド配列、例えばそれに作動可能に連結したコード配列の転写および／または発現を開始させること、またはそれ以外の方法でそれらを制御／調節することが可能であるはずであることを意味する。

５．７ 組成物
本技術はまた、少なくとも１つの本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、またはこのような核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む組成物も提供する。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含んでいてもよく、場合により、１種またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む。

５．８ 宿主生物
本技術はまた、本技術のポリペプチド、本技術のポリペプチドをコードする核酸、および／または本技術のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞または宿主生物にも関する。

好適な宿主細胞または宿主生物は当業者に明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物である。具体的には例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。一実施形態において、宿主は、ピチア・パストリスである。

５．９ ポリペプチドの方法および使用
本技術はまた、本技術のポリペプチドを生産するための方法も提供する。本方法は、宿主細胞または宿主生物を、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換／トランスフェクトすること、宿主中でポリペプチドを発現させること、場合により、それに続いて、１つまたはそれ以上の単離および／または精製工程を含んでいてもよい。
具体的には、本方法は、：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物中で、または別の好適な発現系中で、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；場合により、それに続いて：
ｂ）ポリペプチドを単離および／または精製すること
を含んでいてもよい。

生産目的のための好適な宿主細胞または宿主生物は当業者には明らかであり、例えば、あらゆる好適な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株、またはあらゆる好適な真菌、原核もしくは真核生物であり得る。具体的な例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌またはピチア・パストリスが挙げられる。一実施形態において、宿主は、ピチア・パストリスである。

記載される本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は、医薬として有用である。

したがって、本技術は、医薬としての使用のための、記載される本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を提供する。

また、炎症性疾患の（予防的または治療的な）処置における使用のための、記載される本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物も提供される。

さらに、炎症性疾患を処置する（予防的および／または治療的な）方法であって、医薬的に活性な量の、記載される本技術のポリペプチド、核酸分子またはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法が提供される。

さらに、医薬組成物の調製における、本技術のポリペプチド、記載される核酸分子もしくはベクター、または本技術のポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物の使用が提供される。一実施形態において、調製された医薬組成物は、炎症性疾患を処置するためのものである。

炎症性疾患は、２型炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎および喘息である。

「対象」は、本技術に関して言及される場合、あらゆる動物であってもよく、より具体的には哺乳動物であってもよい。哺乳動物のなかでも、ヒトと非ヒト哺乳動物との区別がなされる場合がある。非ヒト動物は、例えばコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ）、家畜（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、またはブタ動物）、または一般的に調査目的および／または抗体生産のために使用される動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、またはラクダ科動物、例えばラマまたはアルパカ）であり得る。

予防および／または治療目的に関して、対象は、あらゆる動物であってもよく、より具体的には、あらゆる哺乳動物であってもよい。一実施形態において、対象は、ヒト対象である。

物質（例えばポリペプチド、核酸分子およびベクターなど）または組成物は、あらゆる好適な投与経路によって、例えば経腸（例えば経口または直腸）または非経口（例えば皮膚上、舌下、頬側、経鼻、関節内、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、真皮下、または経粘膜）投与によって対象に投与することができる。一実施形態において、物質は、非経口投与、例えば筋肉内、皮下または皮内投与によって投与される。一実施形態において、皮下投与が使用される。

有効量の記載されるポリペプチド、核酸分子もしくはベクター、またはポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含む組成物は、意図した処置結果を提供するために、対象に投与することができる。

１つまたはそれ以上の用量が投与されてもよい。１つより多くの用量が投与される場合、用量は、ポリペプチド、組成物、核酸分子またはベクターの作用を最大化するために、好適な間隔で投与されてもよい。

６ 実施例
６．１ それぞれＩＬ－１３およびＴＳＬＰに特異的に結合する１価ＩＳＶＤの生成
６．１．１ 実施例１：免疫化
重鎖抗体依存性体液性免疫応答を誘発させる目的で、３匹のラマを標準的なプロトコールに従って組換えヒトＩＬ－１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－１３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）で免疫化した。加えてこれらのラマを別の源からのヒト／カニクイザルＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣおよび１１０５７－ＣＮＡＨ、哺乳類細胞由来）でブーストした。

別の３匹のラマを、組換えｈＴＳＬＰ－Ｆｃで免疫化した。加えてこれらのラマをカニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃでブーストした。２匹の追加のラマを、ｈＴＳＬＰで、カニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃと交互に免疫化した。

免疫血液（ＰＢＬ）サンプルを定期的に採取し、全ＲＮＡを単離したＢ細胞から調製した。免疫化プロセス中に、免疫化開始前に収集されたサンプルと、複数回の抗原投与後に通常通り収集された血清サンプルとの抗原特異的な血清力価を比較することによって、体液性免疫応答をモニターした。簡単に言えば、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ヒトＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣ）またはヒトＴＳＬＰでコーティングした。組換えヒトＴＳＬＰは、商業的に入手可能であり、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号１３９８－ＴＳ）から入手可能である。ブロッキングし、希釈した血清サンプルを添加した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）結合ヤギ抗ラマ免疫グロブリン（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）および後続の基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）の存在下での酵素反応を使用することによって、抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤの存在が実証された。

６．１．２ 実施例２：ライブラリー構築およびファージディスプレイ選択
末梢血単核細胞を、血液サンプルから、フィコール－ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ）を製造元の説明書に従って使用して調製した。これらの細胞およびリンパ節から抽出した全ＲＮＡを、ＩＳＶＤをコードする遺伝子断片を増幅するためのＲＴ－ＰＣＲの出発材料として使用した。これらの断片をファージミドベクターｐＡＸ２１２にクローニングした。ファージを、標準的なプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（第１版、２００２、Ｏ’ＢｒｉａｎおよびＡｉｔｋｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に従って調製し、４℃での濾過滅菌の後、さらなる使用まで貯蔵した。ＩＬ１３のための５つのファージライブラリーを構築し、ライブラリーサイズは６．１×１０^８～１．３×１０^９であり、挿入物のパーセンテージは８７～９６％の範囲であった。ＴＳＬＰのための５つのファージライブラリーを構築し、ライブラリーサイズは４．２×１０^８～９．８×１０^８であり、挿入物のパーセンテージは９１～１００％の範囲であった。

ヒトおよびカニクイザルＩＬ－１３を認識するＩＳＶＤを同定するために、ファージライブラリーを、ヒト血清からのＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ４５０６）の存在下で、５０ｎＭの可溶性ビオチン化ｈＩＬ１３－Ｆｃと共にインキュベートした。ｈＩＬ－１３－Ｆｃおよびファージの複合体を、溶液からストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ上に捕獲した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、結合したファージをトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の添加によって溶出させた。これらのラウンド１の選択のアウトプットを、０．０５、０．５または５ｎＭの可溶性ビオチン化ｈＩＬ－１３－ＦｃまたはカニクイザルＩＬ－１３－Ｆｃと共にインキュベートした。ラウンド３で、ラウンド２の選択からの濃縮されていないアウトプットをさらに０．００５、０．０５、０．５または５ｎＭの可溶性ビオチン化ヒトまたはカニクイザルＩＬ－１３－Ｆｃと共にインキュベートした。濃縮されたラウンド２およびラウンド３の選択からの個々のクローンを選別した。

ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰを認識するＩＳＶＤを同定するために、ファージライブラリーを、ヒト血清からのＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ４５０６）の存在下で、５０ｎＭの可溶性ビオチン化ｈＴＳＬＰ－Ｆｃと共に、または５００ｎＭのビオチン化ｈＴＳＬＰと共に、または５００ｎＭのビオチン化カニクイザルＴＳＬＰと共にインキュベートした。ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰ配列は公知である（それぞれＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６９Ｄ９およびＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５５７５５５．１）。組換えタンパク質を使用して、アッセイを実行した。ＴＳＬＰおよびファージの複合体を、溶液からストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ上に捕獲した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄した後、結合したファージをトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の添加によって溶出させた。これらのラウンド１の選択のアウトプットを、５ｎＭの可溶性ビオチン化ｈＩＬＴＳＬＰ－ＦｃまたはカニクイザルＴＬＳＰ－Ｆｃまたは０．５ｎＭビオチン化ｈＴＳＬＰと共にインキュベートした。ラウンド２の選択からのアウトプットを、０．０５、０．５または５ｎＭの可溶性ビオチン化ヒトＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ－ＦｃまたはカニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃと共にインキュベートした。各ラウンドにつき、濃縮されたアウトプットからの個々のクローンを選別した。

全ての個々のクローンを９６ディープウェルプレート（１ｍｌ体積）中で増殖させた。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによって、ＩＳＶＤ発現を誘導した。細胞ペレットを凍結し、１００μｌのＰＢＳ中でそれを溶解させることによって、ペリプラズム抽出物を調製した。死細胞片を遠心分離によって除去した。

対照として、選択されたペリプラズム抽出物を、ＥＬＩＳＡで、それぞれヒトおよびカニクイザルＩＬ１３－Ｆｃ、ＴＳＬＰ－Ｆｃへの結合に関してスクリーニングした。Ｓｐｅｃｔｒａｐｌａｔｅ ３８４－ＨＢ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、２５μｌの様式で評価を行った。抗原を、４℃で、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌで一晩コーティングした。ウェルをカゼイン溶液（１％）でブロックした。ペリプラズム抽出物の５倍希釈物の添加後、ＩＳＶＤ結合を、マウス抗Ｆｌａｇ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）および後続の基質ｅｓＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）の存在下での酵素反応を使用して検出した。

６．１．３ 実施例３：ヒトＩＬ１３およびヒトＴＳＬＰを使用するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイによってペリプラズム抽出物中のＩＳＶＤをブロックすることに関してスクリーニングすること
ＩＳＶＤのブロック能力を決定するために、粗製ペリプラズム抽出物を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ）を使用する異なるタンパク質ベースの競合アッセイでスクリーニングした。蛍光を、６８０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を使用するＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。

ｈＩＬ－１３：ｈＩＬ－１３Ｒα１二元複合体ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎにおいて、ＩＳＶＤがｈＩＬ－１３とｈＩＬ－１３Ｒα１細胞外ドメインとの相互作用をブロックできるかどうかを調査した。この目的を達成するために、ペリプラズム抽出物の希釈物を、ビオチン化ｈＩＬ－１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－１３）と共にプレインキュベートした。この混合物に、ｈＩＬ－１３Ｒα１－ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号１４６－ＩＲ）および抗ｈＦｃ結合アクセプタービーズを添加し、さらに室温で１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン結合ドナービーズを添加し、追加の１時間インキュベートした。二元複合体が形成されたら、アクセプターおよびドナービーズを近接させ、レーザー励起させると、検出可能なシグナルが生成する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルの減少は、ビオチン化ｈＩＬ－１３のｈＩＬ－１３Ｒα１への結合がペリプラズム抽出物中のＩＳＶＤによってブロックされていることを示す。類似の設定で、ＩＳＶＤが、ｈＴＳＬＰ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０－８４９９）とｈＴＳＬＰＲ細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号９８１－ＴＲ）との相互作用をブロックできるかどうかを調査した。

ｈＩＬ－１３：ｈＩＬ－１３Ｒα１：ｈＩＬ４Ｒα三元複合体であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎにおいて、ＩＳＶＤがｈＩＬ４ＲαのｈＩＬ１３：ｈＩＬ１３Ｒα１二元複合体への補充をブロックできるかどうかをスクリーニングした。ｈＩＬ－１３は、ｈＩＬ－１３Ｒα１に結合し、この二元複合体はｈＩＬ４Ｒαを補充し、結果として三元複合体ｈＩＬ－１３：ｈＩＬ－１３Ｒα１：ｈＩＬ４Ｒαの形成をもたらす。ペリプラズム抽出物の希釈物を、ｈＩＬ－１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－１３）およびビオチン化ｈｕＩＬ４Ｒα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２３０－４Ｒ／ＣＦ）と共にプレインキュベートした。この混合物に、ｈＩＬ－１３Ｒα１－ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号１４６－ＩＲ）および抗ｈＦｃ結合アクセプタービーズを添加し、さらに室温で１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン結合ドナービーズを添加し、追加の１時間インキュベートした。三元複合体が形成されたら、アクセプターおよびドナービーズを近接させ、レーザー励起させると、検出可能なシグナルが生成する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルの減少は、三元複合体の形成がペリプラズム抽出物中のＩＳＶＤによってブロックされていることを示す。同様に、ＩＳＶＤが、ｈＴＳＬＰ：ｈＴＳＬＰＲ：ｈＩＬ７Ｒα複合体（ｈＩＬ７Ｒα源＝Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１０９５－Ｈ０８Ｈ）の形成をブロックできるかどうかを調査した。

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ分析（表３および表４）に基づいて、多数のブロックするＩＳＶＤを選択し、シーケンシングした（表１および表２）。

６．１．４ 実施例４：ＩＬ１３およびＴＳＬＰにおけるペリプラズム抽出物の表面プラズモン共鳴分析
抗ＩＬ１３または抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤを含有するペリプラズム抽出物のオフレートを、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０が補充されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４をランニング緩衝液として使用し、実験を２５℃で実行した。

ｈＩＬ１３－Ｆｃ、カニクイザルＩＬ１３－Ｆｃ、ｈＴＳＬＰ－ＦｃおよびカニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃを、活性化のために、３０μｌ／分の流速でＥＤＣおよびＮＨＳを使用するアミンカップリングによってＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップ上に固定した。ＩＬ１３タンパク質を、ｐＨ５．０で、ＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中の１０μｇ／ｍｌで注入した。ＴＳＬＰタンパク質を、ｐＨ５．５で、ＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中の５μｇ／ｍＬで注入した。固定した後、表面をエタノールアミンで不活性化した。

ＩＳＶＤ候補のペリプラズム抽出物をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）で１０倍希釈し、２分にわたり４５μｌ／分で注入し、９００秒間解離させた。異なるサンプル間で、ＩＬ１３の場合、４５μｌ／分でのリン酸（０．４２５％）の２分の注入により、またはＴＳＬＰの場合、４５μＬ／分でのグリシンｐＨ３．０（５ｍＭ）／ＳＤＳ（０．２５％）の１分の注入により、表面を再生した。異なるペリプラズム抽出物について得られたセンサーグラムからオフレートを計算した。

ｈＩＬ－１３－ＦｃおよびカニクイザルＩＬ－１３－Ｆｃにおけるオフレート分析は、表３に示される。

ｈＴＳＬＰ－ＦｃおよびカニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃにおけるオフレート分析は、表４に示される。

６．１．５ 実施例５：抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤの発現および精製
抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤおよび抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤを、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイおよびオフレート値におけるそれらのブロック能力に基づいて、発現および精製のために選択した。配列は、表１および２に示される。

ＩＳＶＤを大腸菌ＴＧ１細胞でｃ－ｍｙｃ、Ｈｉｓ６でタグ付けされたタンパク質として発現させた。１ｍＭのＩＰＴＧの添加により発現を誘導し、そのまま３７℃で３時間継続した。細胞培養物をスピンさせた後、ペリプラズム抽出物を、ペレットを凍結融解しｄＰＢＳに再懸濁することによって調製した。これらの抽出物を、ニッケルセファロースＴＭ６ ＦＦカラム（Ａｔｏｌｌ）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための出発材料として使用した。ＩＳＶＤを、２５０ｍＭイミダゾールでカラムから溶出させ、その後、ｄＰＢＳに対して脱塩した。後述される細胞ベースのアッセイのために、内毒素を、５０ｍＭのオクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ、Ｓｉｇｍａ）の存在下でのゲル濾過によって除去した。内毒素レベルを、標準的なＬＡＬ－アッセイを使用して決定した。

６．１．６ 実施例６：ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイにおける精製した抗ＩＬ１３および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤのブロック能力
二元および三元複合体ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを、実施例３に記載した通りに使用して、抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤのＩＣ５０値を決定し、実施例５に記載した通りに精製した。ペリプラズム抽出物の希釈物の代わりに、精製したＩＳＶＤそれぞれの５００ｎＭから開始して１．８ｐＭまでの一連の希釈物を、ＩＬ－１３またはＴＳＬＰと共にプレインキュベートした。

試験した抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤは、表５に示した通りのＩＣ５０値で、三元複合体の形成を阻害し、二元複合体を部分的にブロックした。

試験した抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤは、表６に示した通りのＩＣ５０値で、三元複合体の形成を完全に阻害し、二元複合体の形成も阻害した。

６．１．７ 実施例７：細胞ベースのアッセイにおける精製した抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤのブロック能力
抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤの阻害効力を、ＴＦ－１細胞のＩＬ－１３によって媒介される増殖をモニターする細胞ベースのアッセイで決定した。この目的を達成するために、ＴＦ－１細胞を、１／５のＨＥＰＥＳ、１／５００のＮａ－ピルビン酸塩、１／５００のＧｌｕｔａｍａｘおよび２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＴＦ－１細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ非含有の増殖培地中ウェル当たり細胞４０，０００個で植え付けた。精製した抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤの一連の希釈物または参照化合物を添加した。３７℃で１５分のインキュベーションの後、２００ｐＭのＩＬ－１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－１３）を添加した。９６時間後、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上のＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ３５８０）で、ＴＦ－１細胞の増殖を決定した。

表７に示されるＩＳＶＤは、ＩＬ－１３によって誘導されたＴＦ１増殖を阻害する。

抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤのブロック効力を、ｈＴＳＬＰＲおよびｈＩＬ７ＲａをコードするプラスミドでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞のＴＳＬＰによって媒介される増殖をモニターする細胞ベースのアッセイで決定した。細胞培養処理した白色の９６ウェルプレートにおいて、細胞をＲＰＭＩ１６４０増殖培地中細胞２０，０００個／ウェルの密度で植え付けた。抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤの一連の希釈物を添加し、続いて細胞の刺激のために５０ｐＭのｈＴＬＳＰ－Ｆｃまたは５０ｐＭのカニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃを添加した。ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰ配列は公知である（それぞれＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６９Ｄ９およびＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５５７５５５．１）。組換えタンパク質を使用して、アッセイを実行した。

７２時間のインキュベーション後、細胞密度および生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７１／Ｇ７５７２／Ｇ７５７３）を使用してモニターし、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み出した。結果は、表８に示される。

６．１．８ 実施例８：精製した抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤの、ヒトおよびカニクイザルＩＬ－１３およびＴＳＬＰへの結合親和性
ＳＰＲによる完全結合反応速度論研究を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行した。

ＩＬ－１３の場合、約２０００ＲＵのｈＩＬ１３－Ｆｃまたは４０００ＲＵのカニクイザルＩＬ１３－ＦｃをＣＭ５センサーチップ上に直接固定した。次いでＩＳＶＤを異なる濃度（３μＭ～１２ｎＭ）で１２０秒に間わたり注入し、９００秒間解離させた。ｈＩＬ－１３－ＦｃおよびカニクイザルＩＬ－１３－Ｆｃ表面の再生を、０．８５％Ｈ_３ＰＯ_４：ＭｉｌｌｉＱ（１：１）の４７秒の注入を使用して実行した。

ＴＳＬＰの場合、約８０００ＲＵの抗ｈｕＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５センサーチップ上に直接固定した。ｈＴＳＬＰ－Ｆｃ（１μｇ／ｍＬで）またはカニクイザルＴＳＬＰ－Ｆｃ（０．７５μｇ／ｍＬで）を浮遊させ、１２０秒間にわたりチップ上に捕獲した。次いでＩＳＶＤを異なる濃度（０．４ｎＭ～３０００ｎＭ）で１２０秒間にわたり注入し、９００秒間解離させた。

結合曲線の評価を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアＶ２．０．３を使用して行った。動態分析を、１：１の相互作用モデル（ラングミュア結合）（Ｒｍａｘ＝グローバル；ＲＩ＝定数＝０、オフセット＝０）をフィッティングすることによって実行した。１：１の相互作用モデルの承認基準を満たさない可能性がある相互作用は、ヘテロジニアスリガンドフィッティングモデル（ＲＩ＝定数＝０、オフセット＝０）を使用してフィッティングした。

動態データは、ＩＬ－１３ ＩＳＶＤに関して表９に、ＴＳＬＰ ＩＳＶＤに関して表１０に示される。

６．２ それぞれＩＬ－１３およびＴＳＬＰに結合する単一特異性多価ポリペプチドの生成
６．２．１ 実施例１０：野生型抗ＩＬ－１３の２価またはバイパラトピックＩＳＶＤ構築物の生成およびインビトロでの特徴付け
選択された抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤ（Ｆ０１０７００４Ｂ０２およびＦ０１０７００４Ｂ０６）を、バイパラトピックおよび２価ＩＳＶＤ構築物にフォーマット化した。構築物中のビルディングブロックは、フレキシブルな３５ＧＳ（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーによって遺伝学的に連結される。ＩＳＶＤを、ピチア・パストリス中でＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６でタグ付けされたタンパク質として発現させた（アミノ酸配列は、表１４に示される）。ＩＳＶＤ構築物発現の誘導は、メタノールの段階的な添加によって起こった。分泌されたＩＳＶＤ構築物を含む透明化した培地を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための出発材料として使用し、続いて脱塩を行い、結果としてＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価したところ９０％純度を得た。

バイパラトピックおよび２価ＩＬ－１３構築物を、二元および三元複合体をブロックするＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（実施例６に記載される通り）、加えてＴＦ－１増殖アッセイ（実施例７に記載される通り）で特徴付けた。二成分および三成分ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイおよびＴＦ－１増殖アッセイにおける生成した構築物およびそれらのブロック効力の概要は、表１１に示される。バイパラトピック構築物は、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１の効力と同様の、ｈＩＬ－１３およびｃｙＩＬ－１３に対して優れた効力を示した。２価構築物も効力を改善したが、ＴＦ１増殖アッセイにおいてバイパラトピック構築物Ｆ０１０７０００２９と同じ程度ではなかった。加えて、２価構築物は、ＩＬ１３－ＩＬ１３Ｒα１のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎにおいて完全阻害に到達しない。

最も有力な抗ＩＬ－１３バイパラトピックＩＳＶＤ構築物を、ＩＬ－１３によって誘導されたＡ５４９エオタキシン放出アッセイで試験した。この目的を達成するために、Ａ５４９懸濁細胞を、１０％ＦＣＳが補充されたＨａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋ培地中で培養した。細胞を、細胞２００，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに植え付けた。次の日、２００ｐＭのｈＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣ）またはカニクイザルＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１１０５７－ＣＮＡＨ）、続いてＩＳＶＤ構築物の一連の希釈物を添加した。２４時間後、エオタキシン－３を、ＭＳＤ ＥＬＩＳＡ（ヒトエオタキシン－３組織培養キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ、Ｋ１５１ＡＢＢ－１））を使用して、上清中で決定した。結果は、表１２に示される。

競合ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＩＬ－１３ １価およびバイパラトピックＩＳＶＤ構築物が、ｈＩＬ－１３のＩＬ１３Ｒα２への結合を阻害するかどうかを試験した。ＩＬ１３Ｒα２（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１０３５０－Ｈ０８Ｈ）を、３８４ウェルのＳｐｅｃｔｒａｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上にコーティングした。ｈＩＬ１３－Ｆｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０３６９－Ｈ０１Ｈ）を、ＩＳＶＤ構築物の連続希釈物または陽性対照化合物ＩＬ－１３Ｒα２と混合し、１時間インキュベートした。洗浄およびブロッキングの後、コーティングされた受容体をＩＬ１３－Ｆｃ ＩＳＶＤ／対照ミックスと共にインキュベートし、１時間インキュベートした。洗浄の後、結合したＩＬ－１３－Ｆｃの存在を、抗ヒトＩｇＧ－ペルオキシダーゼ抗体を使用して検出し、続いて基質ｅｓＴＭＢの存在下で酵素反応を行った。ＩＳＶＤがＩＬ－１３－ＩＬ－１３Ｒα２相互作用を阻害する場合、ＩＬ－１３－Ｆｃの検出は用量依存的に消失する。結果は、表１３に示される。

６．２．２ 実施例１１：野生型バイパラトピック抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤ構築物の生成および特徴付け
選択されたＴＳＬＰＲブロッカー（Ｆ０１０７５０１Ａ０２およびＦ０１０７５２９Ｆ１０）を、バイパラトピックＩＳＶＤ構築物に組み合わせた。構築物を、ピチア・パストリス中でＦＬＡＧ３－ＨＩＳ６でタグ付けされたタンパク質として発現させた（アミノ酸配列は、表１６に示される）。ＩＳＶＤ構築物発現の誘導は、メタノールの段階的な添加によって起こった。分泌されたＩＳＶＤ構築物を含む透明化した培地を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための出発材料として使用し、続いて脱塩を行い、結果としてＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価したところ９０％純度を得た。

ＢａＦ３増殖アッセイ（実施例７に記載される通り）において、バイパラトピック構築物を、精製したタンパク質として、５０または５ｐＭのｈＴＳＬＰおよび５０または５ｐＭのカニクイザルＴＳＬＰに対して滴定し、異なる抗ＴＳＬＰ参照化合物（抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ２および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１）と比較した。データは、表１５に要約される（ｈＴＳＬＰおよびカニクイザルＴＳＬＰ）。バイパラトピック構築物は明らかに、参照ｍＡｂより性能が優れている。Ｎ末端にＦ０１０７５０１Ａ０２を有するバイパラトピック構築物は、Ｃ末端にＦ０１０７５０１Ａ０２を有する構築物と比較して、改善されたカニクイザルＴＳＬＰに対する反応性を示す。

６．３ 抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ １価ＩＳＶＤの配列最適化
６．３．１ 実施例１２：抗ＩＬ－１３および抗ＴＳＬＰ １価ＩＳＶＤの配列最適化
抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤ Ｆ０１０７００４Ｂ０２およびＦ０１０７００４Ｂ０６および抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５０１Ａ０２およびＦ０１０７５２９Ｆ１０をさらに配列最適化した。

配列最適化は、ＩＳＶＤの１つまたはそれ以上の（望ましい）特性を改善するために、配列中の１つまたはそれ以上の特異的なアミノ酸残基を置き換えることを含む。

このような配列最適化の一部の例は、本明細書に記載のさらなる説明で述べられており、その例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
１）ヒトＶＨ３－ＪＨ生殖細胞系コンセンサス配列とより同一なＩＳＶＤ配列を得るための、親野生型ＩＳＶＤ配列における置換であり、これは、ヒト化と称されるプロセスである。この目的を達成するために、いわゆる特徴的な残基を除き、ＩＳＶＤとヒトＶＨ３－ＪＨ生殖細胞系コンセンサスとの間で異なるＦＲ中の特定のアミノ酸が、タンパク質構造、活性および安定性が無傷のまま維持されるような方法でヒト対応物に変更される。

２）ＩＳＶＤの安定性を増加させるための、ラマ生殖細胞系に対する置換であり、これは、ラクダ化と定義される。この目的を達成するために、親野生型ＩＳＶＤアミノ酸配列を、ＩＳＶＤのラマＩＧＨＶ生殖細胞系アミノ酸配列に対してアライメントする（ラマＩＧＨＶ生殖細胞系に対するＩＳＶＤのＢｌａｓｔＰ分析から上位のヒットとして同定された）。

３）ここでも望ましい宿主細胞または宿主生物に応じて、貯蔵下での長期の安定性または特性を改善する置換、望ましい宿主細胞または宿主生物における発現レベルを増加させる置換、および／または（望ましくない）翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）を除去または低減する置換。Ｎ末端のピログルタメート形成を回避するために、標準的に、Ｅ１Ｄ突然変異が、効力または安定性に影響を与えることなく、多価ＮｂのＮ末端ビルディングブロック中に導入される。したがって、ビルディングブロックの配列最適化の間、Ｅ１Ｄ突然変異は、一貫して導入されない。

４）１１位におけるＶａｌに対する突然変異および８９位におけるＬｅｕに対する突然変異は、あらゆる天然に存在する既存の抗体活性の結合を最小化する。

Ｆ０１０７００４Ｂ０２およびＦ０１０７００４Ｂ０６
抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤ Ｆ０１０７００４Ｂ０２の配列最適化は、親ＩＳＶＤ Ｆ１０７００４Ｂ０２と比較して８つのアミノ酸置換（すなわちＥ１Ｄ、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｎ６４Ｋ、Ｓ６５Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｉ８９Ｌ）を含む最終的な配列最適化されたバリアントＦ０２７１０００１９をもたらした。抗ＩＬ－１３ ＩＳＶＤ Ｆ０１０７００４Ｂ０６の配列最適化は、親ＩＳＶＤ Ｆ１０７００４Ｂ０６と比較して４つのアミノ酸置換（すなわちＬ１１Ｖ、Ｒ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含む最終的な配列最適化されたバリアントＦ０２７１００１８３をもたらした。

配列最適化されたバリアントを、ＰＣＲオーバーラップ伸長方法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てた。バリアントを大腸菌で発現させ、ＩＭＡＣおよび脱塩によって精製した。Ｆ０２７１０００１９およびＦ０２７１００１８３を、ＰｅｐｒｏｔｅｃｈからのｈＩＬ－１３（カタログ番号２００－１３）を使用する表面プラズモン共鳴によって、それらのｈＩＬ－１３結合能力に関して評価した。加えて、Ｆ０２７１０００１９を、エオタキシン放出アッセイにおけるその中和活性に関して試験した。両方のバリアントの単量体の挙動をサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によってモニターした。バリアントの熱安定性を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用するサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）で試験した。このアッセイにおいて、親ＩＳＶＤおよびそのバリアントは、異なるｐＨで、サイプロオレンジの存在下でインキュベートされ、温度勾配が適用される。ＩＳＶＤが変性を開始させたら、サイプロオレンジが結合し、測定された蛍光が突然増加することから、融解温度は、特定のｐＨにつき決定することができる。結果は、表１７および表１８に要約される。

Ｆ０２７１０００１９は、エオタキシン放出アッセイにおいて優れた効力を呈示し、そのｈＩＬ－１３に対する親和性は、ＳＰＲにおいて３４ｎＭと決定された。Ｆ０２７１０００１９のＴｍは、親ＩＳＶＤ Ｆ０１０７００４Ｂ２の場合より３℃高い。Ｆ０２７１０００１９のフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭの定義に基づいて８５％であり（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）による、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、２０１０を参照）、Ｋａｂａｔの定義に基づいて８６％である。

Ｆ０２７１００１８３の親和性は、ＷＴ配列と比較して類似しており、バリアントは、６１℃のＴｍを有する。バリアントは、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて１００％の単量体ピークとして溶出する。Ｆ０２７１００１８３のフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭの定義に基づいて９４．４％であり、Ｋａｂａｔの定義に基づいて９３．１％である。

Ｆ０１０７５２９Ｆ１０
抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５２９Ｆ１０の配列最適化は、親ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５２９Ｆ１０と比較して８つのアミノ酸置換（すなわち、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｔ６０Ａ、Ｓ７１Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７９Ｙ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含む最終的な配列最適化されたバリアントＦ０２７４０００２１をもたらした。抗ＴＳＬＰ ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５０１Ａ０２の配列最適化は、親ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５０１Ａ０２と比較して６つのアミノ酸置換（すなわち、Ｌ１１Ｖ、Ａ１４Ｐ、Ｅ１６Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒ、Ｖ８９Ｌ）を含む最終的な配列最適化されたバリアントＦ０２７４００１６０をもたらした。

配列最適化されたバリアントを、ＰＣＲオーバーラップ伸長方法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てた。構築物を大腸菌で発現させ、ＩＭＡＣおよび脱塩によって精製した。バリアントを、表面プラズモン共鳴によってヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰへのその結合能力に関して評価した。全てのバリアントの単量体の挙動をサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によってモニターし、熱安定性をサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）でモニターした。加えて、Ｆ０１０７５０１Ａ０２のバリアントを、三元複合体Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎで、ｈＴＳＬＰに対するそのブロック活性に関して試験した。結果は、表１９および表２０に要約される。

突然変異Ａ１４Ｐ、Ｔ６０Ａ、Ｓ７１Ｒ、Ａ７４Ｓ、Ｓ７９Ｙ、Ｋ８３Ｒを有する中間体バリアントＦ０１０７０４０９９は、親ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５２９Ｆ１０と比較して、ｈＴＳＬＰに対して類似の親和性を示し、カニクイザルＴＳＬＰに対して２分の１の親和性を示した。Ｔｍは、親ＩＳＶＤと比較して１１．４℃の全体的な増加を示した。２つの追加の突然変異、すなわちＬ１１ＶおよびＶ８９ＬをバリアントＦ０１０７０４０９９に導入して、既存の抗体結合を最小化し、最終的なバリアントＦ０２７４０００２１を得た。Ｆ０２７４０００２１のフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭの定義に基づいて８９．９％であり、Ｋａｂａｔの定義に基づいて８８．５％である。

突然変異Ａ１４Ｐ、Ｅ１６Ｇ、Ａ７４Ｓ、Ｋ８３Ｒを有する中間体バリアントＦ０１０７０４０７６は、親ＩＳＶＤ Ｆ０１０７５０１Ａ０２と比較して、ｈＴＳＬＰおよびカニクイザルＴＳＬＰに対して類似のオフレートを示し、三元複合体Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎにおいて類似の効力を示した。Ｔｍは、親ＩＳＶＤと比較して１２．３℃の全体的な増加を示した。２つの追加の突然変異、すなわちＬ１１ＶおよびＶ８９ＬをバリアントＦ０１０７０４０７６に導入して、既存の抗体結合を最小化し、最終的なバリアントＦ０２７４００１６０を得た。

Ｆ０２７４００１６０のフレームワーク領域におけるフレームワーク同一性％は、ＡｂＭの定義に基づいて８３．１％であり、Ｋａｂａｔの定義に基づいて８０．５％である。

６．４ 多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１
上記で同定された最適化されたＩＳＶＤ Ｆ０２７１０００１９（Ｆ０１０７００４Ｂ０２の最適化されたバリアント）、Ｆ０２７１００１８３（Ｆ０１０７００４Ｂ０６の最適化されたバリアント）、Ｆ０２７４０００２１（Ｆ０１０７５２９Ｆ１０の最適化されたバリアント）、およびＦ０２７４００１６０（Ｆ０１０７５０１Ａ０２の最適化されたバージョン）を、多重特異性ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１の生成のために使用した。Ｆ０２７４００１６１で使用された最適化された１価ビルディングブロックは、以下において、それらのＩＳＶＤ起源に従って、それぞれ０４Ｂ０２、０４Ｂ０６、５２９Ｆ１０、および５０１Ａ０２として略記される形態で名付けられる。

６．４．１ 実施例１５：多重特異性ＩＳＶＤ構築物の生成
ＩＬ－１３およびＴＳＬＰに結合するＩＳＶＤを含有するポリペプチドＦ０２７４００１６１（配列番号１）の同定は、数種の抗ＴＬＳＰビルディングブロック、数種の抗ＩＬ１３ビルディングブロックおよび抗ＨＳＡビルディングブロックＡＬＢ２３００２が含まれるデータ駆動型の二重特異性操作およびフォーマット化戦略によって達成された。ビルディングブロックの異なる位置／方向および異なるリンカー長さ（９ＧＳ対３５ＧＳ）が適用され、異なるパラメーター（効力、交差反応性、発現収量など）にとって重要であることを証明した。

異なるＩＳＶＤ構築物の大きいパネルを、小さいスケールの生産のために、ピチア・パストリスで形質転換した。ＩＳＶＤ発現の誘導は、メタノールの段階的な添加によって起こった。分泌されたＩＳＶＤを含む透明化した培地を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介した精製とそれに続く脱塩のための出発材料として使用した。精製したサンプルを、機能的な特徴付けおよび発現評価のために使用した。

一部の構築物は、リンカー長さおよびＩＳＶＤビルディングブロックの相対的な位置に応じて損なわれた効力を示した。例えば：抗ＴＳＬＰのバイパラトピックな組合せである５０１Ａ０２－５２９Ｆ１０のカニクイザルＴＳＬＰの効力は、短い９ＧＳリンカーで連結された場合、強く損なわれる。一部の構築物は、ビルディングブロックの組合せおよび順番に応じて低い発現レベルを示した。４Ｂ０２－４Ｂ０６を含む二重特異性の場合、発現は、５０１Ａ０２－５２９Ｆ１０と組み合わせると最も良好であった。

表２３は、同じビルディングブロックを含むが異なるように並べられ、異なるリンカー長さで接続された６つの構築物で低い力価から高い力価の範囲の異なる収量を得たことを例示する。最も高い発現力価は、３５ＧＳリンカーを介して連結されたＩＬ－１３ ＩＳＶＤ ４Ｂ０２および４Ｂ０６を含む構築物（Ｆ０２７４００１６１およびＦ０２７４００１６３）で得られる。加えて、Ｆ０２７４００１６１およびＦ０２７４００１６３の溶解性は、ビルディングブロックが４つの９ＧＳリンカーで連結され、ＡＬＢがＣ末端に位置するそれらそれぞれの対応物Ｆ０２７４００２９６および２９８より一層高かった。

その後、大きい二重特異性パネルを、予備的な収量の推測に基づいて、両方の標的（ヒトおよびカニクイザル）に対して有力であることが証明され、高い発現レベルの可能性を有するＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１およびＦ０２７４００１６３からなる２つの二重特異性構築物のパネルに縮小した。

発現収量決定と生物物理学的特性および既存の抗体反応性の評価のために、ピチア・パストリスにおけるより大きいスケールの２Ｌおよび５Ｌ生産を行った。

表２４および実施例２２は、既存の抗体反応性が、ビルディングブロックの方向とリンカー長さによって促進されることを実証する。

最終的に、効力、既存の抗体への結合の低減、ならびに優れた発現レベルおよびＣＭＣ特徴に基づいて、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１を選択した。

６．４．２ 実施例１６：ＴＳＬＰ、ＩＬ１３および血清アルブミンに対する多重特異性ＩＳＶＤ構築物の結合親和性
ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰに対するＦ０２７４００１６１の、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される親和性（ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰ配列は公知である（それぞれＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６９Ｄ９およびＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５５７５５５．１）。組換えタンパク質を使用してアッセイを実行し、ヒトＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣ）、カニクイザルＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１１０５７－ＣＮＡＨ）およびアカゲザルＩＬ－１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２６７４－ＲＭ）、ならびにヒト（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８７６３）、カニクイザルおよびマウス（Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号Ｎ１２０４Ｈ１ＣＭ）血清アルブミンを、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰワークステーション（Ｇｙｒｏｓ）で、溶液中の親和性測定によって定量化した。

Ｋ_Ｄによって制御される測定で、ＴＳＬＰまたはＩＬ－１３（１μＭ～０．２５ｆＭの範囲）または血清アルブミン（１００μＭ～３２０ｐＭの範囲）の連続希釈物、および固定した量のＦ０２７４００１６１（ＴＳＬＰおよびＩＬ１３の場合、５ｐＭまたは１０ｐＭ、および血清アルブミンの場合、２０ｎＭ）を混合して相互作用させ、４８時間または７２時間のいずれか（ＴＳＬＰおよびＩＬ１３の場合）または２時間（血清アルブミンの場合）にわたりインキュベートして、平衡に到達させた。

受容体によって制御される測定で、ＴＳＬＰまたはＩＬ－１３（１μＭ～０．２５ｆＭの範囲）または血清アルブミン（１００μＭ～３２０ｐＭの範囲）の連続希釈物、および固定した量のＦ０２７４００１６１（ＴＳＬＰの場合、２５０ｐＭ、ＩＬ－１３の場合、１０ｎＭ、および血清アルブミンの場合、１μＭ）を混合して相互作用させ、４８または７２時間いずれか（ＴＳＬＰおよびＩＬ－１３の場合）または２時間（血清アルブミンの場合）にわたりインキュベートして、平衡に到達させた。

ビオチン化ヒトＴＳＬＰ／ＩＬ－１３／血清アルブミンを、ビーズのカラムを含有し、平衡化した溶液から遊離のＦ０２７４００１６１を捕獲するための分子プローブとして使用されるＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ＣＤの微細構造に捕獲した。ＴＬＳＰ／ＩＬ－１３／血清アルブミンおよびＦ０２７４００１６１の混合物（遊離のＴＬＳＰ／ＩＬ－１３／血清アルブミン、遊離のＦ０２７４００１６１およびＴＬＳＰ／ＩＬ－１３／血清アルブミン－Ｆ０２７４００１６１複合体を含有する）を、ビーズを通って流動させ、遊離のＩＳＶＤ濃度に比例する小さいパーセンテージの遊離のＦ０２７４００１６１を捕獲した。次いで蛍光標識した抗Ｖ_ＨＨ抗体、ＡＢＨ００８６－Ａｌｅｘａ６４７を注入して全ての捕獲されたＦ０２７４００１６１を標識し、過量の蛍光プローブを濯ぎ落とした後、蛍光の変化を決定した。一連の希釈物のフィッティングを、Ｇｙｒｏｌａｂ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して行い、Ｋ_Ｄおよび受容体によれば制御される曲線を分析して、ＫＤ値を決定した。

結果（表２５）は、多重特異性ＩＳＶＤ構築物が、高親和性でヒト／カニクイザルＴＳＬＰおよびヒト／カニクイザル／アカゲザルＩＬ１３と結合することを実証する。

６．４．３ 実施例１７：多重特異性ＩＳＶＤ構築物はＴＳＬＰおよびＩＬ１３と選択的に結合する
ＩＬ１３およびＴＳＬＰ関連サイトカインとしてＩＬ－４およびＩＬ－７に結合するＦ０２７４００１６１の非存在を、それぞれＳＰＲ（Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６）によって評価した。

活性化のためにＥＤＣ／ＮＨＳを８０秒間注入し、非活性化のために１ＭのエタノールアミンＨＣｌを１５０秒間注入するアミンカップリング（ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット。カタログ番号１７６－２４１０）を使用して、サイトカインをｐｒｏｔｅｏｎ ＧＬＣセンサーチップ上に２５μｇ／ｍＬで、６００秒間にわたり固定した。活性化および非活性化中の流速を３０μｌ／分に設定し、リガンド注入中の流速を２５μｌ／分に設定した。１０ｍＭの酢酸固定緩衝液のｐＨは、ＩＬ１３およびＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０７）のためには６．０であり、ＴＳＬＰおよびＩＬ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２０４－ＩＬ／ＣＦ）のためには５．５であった。

次に、１μＭのＦ０２７４００１６１を２分にわたり注入し、４５μＬ／分の流速で６００秒間解離させた。ランニング緩衝液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。陽性対照として、１００ｎＭのα－ｈＩＬ４ Ａｂおよび１００ｎＭのα－ＩＬ７ Ａｂを注入した。Ｆ０２７４００１６１および陽性対照と固定した標的との相互作用を、結合するとチップ上の質量変化の結果として生じる免疫性指標における増加の検出によって測定した。

全ての陽性対照は、それらそれぞれの標的に結合しなかった。Ｆ０２７４００１６１のヒトＩＬ４およびＩＬ７への結合は検出されなかった。

加えて、Ｆ０２７４００１６１がＴＳＬＰの短い形態に結合できるかどうかを調査した。この目的を達成するために、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰの短い形態（Ｆｏｒｎａｓａ、２０１５に記載される通り）を、それぞれ上述したようにアミンカップリングを５μｇ／ｍｌで１５０秒間使用して、１０μｇ／ｍＬでｐｒｏｔｅｏｎ ＧＬＣセンサーチップ上に固定した。１０ｍＭの酢酸固定緩衝液のｐＨは、ＴＳＬＰのためには５．５であり、ＴＳＬＰの短い形態のためには４．０であった。

次に、５００ｎＭのＦ０２７４００１６１を２分にわたり注入し、４５μＬ／分の流速で６００秒間解離させた。ランニング緩衝液として、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。参照化合物として、５００ｎＭの抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１を注入し、陽性対照として、５００ｎＭのα－ｈＴＳＬＰ ｐＡｂ（Ａｂｃａｍ ａｂ４７９４３）を注入した。

それに対して陽性対照は、ＴＳＬＰの長い（正常な）形態と短い形態の両方に結合せず、Ｆ０２７４００１６１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１のＴＳＬＰの短い形態への結合は検出されなかった。

６．４．４ 実施例１８：多重特異性ＩＳＶＤ構築物のＩＬ１３、ＴＳＬＰおよびＨＳＡへの同時の結合
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、Ｆ０２７４００１６１が、ｈＴＳＬＰとｈＩＬ１３に同時に結合できるかどうかを決定した。この目的を達成するために、ｈＴＳＬＰ（組換えヒトＴＳＬＰは、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから商業的に入手可能である（カタログ番号１３９８－ＴＳ）を、アミンカップリングを介してＣＭ５センサーチップ上に固定した。ＴＳＬＰビルディングブロック５０１Ａ０２－５２９Ｆ１０を介してＩＳＶＤ構築物を捕獲するために、１００ｎＭのＦ０２７４００１６１を、ＴＳＬＰ表面上に１０μΙ／分で２分にわたり注入した。その後、１００ｎＭのｈＩＬ１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－１３）、ＨＳＡまたはｈＯＸ４０Ｌまたは１０００ｎＭのＨＳＡのいずれかを注入するか、または１００ｎＭのＩＬ１３＋１００ｎＭのＨＳＡ、１００ｎＭのＩＬ１３＋１０００ｎＭのＨＳＡ、１００ｎＭのＯＸ４０Ｌ＋１００ｎＭのＨＳＡ、１００ｎＭのＯＸ４０Ｌ＋１０００ｎＭのＨＳＡまたは１００ｎＭのＩＬ１３＋１００ｎＭのＯＸ４０Ｌの混合物を１０μｌ／分の流速で２分間注入し、それに続き、後続の３００秒の解離工程を行った。ＴＳＬＰ表面を、４５μｌ／分での０．５％ＳＤＳ＋１０ｍＭのグリシンｐＨ３の１分の注入で再生した。センサーグラム（図１）は、Ｆ０２７４００１６１が、ＴＳＬＰでの捕獲後の反応単位の増加によって示された通りヒトＩＬ１３、ヒトＴＳＬＰおよびＨＳＡと同時に結合することができ：ＩＬ１３のみで約１３０ＲＵの増加、１００ｎＭのＨＳＡで約６０ＲＵの増加、ならびに１０００ｎＭのＨＳＡのみで約３５０ＲＵ、ＩＬ１３と１００ｎＭのＨＳＡ混合物で約１８０ＲＵの増加、およびＩＬ１３と１０００ｎＭのＨＳＡ混合物で約５００ＲＵであることを実証する。ＨＳＡの場合、Ｆ０２７４００１６１の親和性がより低いため、ある程度のＲＵ増加レベルを見るためにはより高い濃度のＨＳＡが必要であった（実施例１６を参照）。

実施例１９：インビトロにおけるＩＬ１３によって誘導されたエオタキシン放出の多重特異性ＩＳＶＤ構築物阻害
目的の異なる種（ヒト、アカゲザルおよびカニクイザル）からの可溶性ＩＬ１３の機能的な活性およびＦ０２７４００１６１によるそれらの阻害を、Ａ５４９ヒト肺癌腫細胞によってエオタキシン放出を調査する細胞ベースのアッセイを使用して研究した。

この目的を達成するために、Ａ５４９懸濁液細胞を、１０％ＦＣＳが補充されたＨａｍ’ｓ Ｆ１２Ｋ培地中で培養し、９６ウェルプレートに細胞４００，０００個／ウェルで植え付けた。２４時間のインキュベーションの後、Ｆ０２７１００１６１の一連の希釈物または参照化合物（抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ２）を添加した。２０分のインキュベーションの後、ヒトＩＬ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣ）、カニクイザルＩＬ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１１０５７－ＣＮＡＨ）またはアカゲザルＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２６７４－ＲＭ－０２５）を、１６０ｐＭの最終濃度まで添加した。３０μＭのＨＳＡの存在下でのさらなる２４時間のインキュベーションの後、ヘパリンを５０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、エオタキシン発現を強化した。追加の４時間のインキュベーションの後、細胞上清中に分泌されたエオタキシン－３を、ヒトＣＣＬ２６／エオタキシン－３ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ３４６）の使用によって定量化した。

Ｆ０２７４００１６１は、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ１３によって誘導されたエオタキシン－３放出を濃度依存性の方式で阻害し、ＩＣ５０は、１９４ｐＭ（ヒトＩＬ１３の場合）、１０４０ｐＭ（カニクイザルＩＬ１３の場合）および７１３ｐＭ（アカゲザルＩＬ１３の場合）であり、これは参照化合物抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１に匹敵しており、参照化合物抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ２より優れていた（表２６、図２）。

６．４．５ 実施例２０：ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ４／ＩＬ１３細胞におけるＩＬ１３によって誘導されたＳＴＡＴ－６活性化の多重特異性ＩＳＶＤ構築物阻害
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を、ヒトＳＴＡＴ６遺伝子およびＳＴＡＴ６誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子でのＨＥＫ２９３細胞の安定なトランスフェクションによって生成した。ＩＬ－４およびＩＬ－１３で刺激すると、細胞は、上清中に分泌されたＳＴＡＴ６によって誘導されたＳＥＡＰを生産し、これをＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）によって定量化した。

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中で培養し、９６ウェルプレートに細胞５０，０００個／ウェルで植え付けた。Ｆ０２７１００１６１の一連の希釈物または参照化合物（抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ２）を、１０ｐＭのｈＩＬ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１０３６９－ＨＮＡＣ）またはカニクイザルＩＬ－１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１１０５７－ＣＮＡＨ）と共に室温で１時間プレインキュベートし、細胞に添加した。３０μＭのＨＳＡの存在下での２２～２４時間のインキュベーションの後、４０μｌの細胞上清を、１６０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）と混合した。分泌されたＳＥＡＰを、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ機器で６２０ｎｍにおける吸収を測定することによって定量化した。

Ｆ０２７４００１６１は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ－１３によって誘導されたＳＥＡＰ分泌を濃度依存性の方式で阻害し、ＩＣ５０は、３２．８ｐＭ（ヒトＩＬ－１３の場合）および５３．４ｐＭ（カニクイザルＩＬ－１３の場合）であり、参照化合物抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ２より優れていた（表２７、図３）。

６．４．６ 実施例２１：インビトロにおけるＴＳＬＰによって誘導されたＢａ／Ｆ３細胞増殖の多重特異性ＩＳＶＤ構築物阻害
目的の異なる種（ヒト、アカゲザルおよびカニクイザル）からの可溶性ＴＳＬＰの機能的な活性およびＦ０２７４００１６１によるそれらの阻害を、ｈＴＳＬＰＲおよびｈＩＬ７ＲａをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＢａＦ３細胞の増殖を調査する細胞ベースのアッセイを使用して研究した。

細胞を、細胞培養処理した白色の９６ウェルプレートにおいて、ＲＰＭＩ１６４０増殖培地中細胞１５０００個／ウェルの密度で植え付けた。Ｆ０２７１００１６１の一連の希釈物または参照化合物（抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１）を添加し、続いて細胞の刺激のために５ｐＭのヒトまたはカニクイザルＴＬＳＰを添加した。ヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰ配列は、公知である（それぞれＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６９Ｄ９およびＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５５７５５５．１）。組換えタンパク質を使用して、アッセイを実行した。３０μＭのＨＳＡの存在下で４８時間のインキュベーションの後、細胞密度および生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７１／Ｇ７５７２／Ｇ７５７３）を使用してモニターし、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み出した。

Ｆ０２７４００１６１は、Ｂａ／Ｆ３細胞のヒトおよびカニクイザルＴＳＬＰ依存性の増殖を濃度依存性の方式で阻害し、ＩＣ５０は、７．８ｐＭ（ヒトＴＳＰの場合）および２４ｐＭ（カニクイザルＴＳＬＰの場合）であり、したがって、参照化合物抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１より一層優れた性能を示した（表２８、図４）。

６．４．７ 実施例２２：既存の抗体に結合する多重特異性ＩＳＶＤ構築物
ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１の既存の抗体反応性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、正常ヒト血清（ｎ＝９６）中で評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として使用し、実験を２５℃で実行した。

ＩＳＶＤを、チップ上に固定されたＨＳＡへの、ＡＬＢ２３００２ビルディングブロックの結合を介してチップ上に捕獲した。ＨＳＡを固定するために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流速３０μΙ／分）で活性化し、ＨＳＡを、ｐＨ４．５のＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中の１００μｌ／ｍｌで注入して、およそ２９００ＲＵの固定レベルにした。固定した後、表面をエタノールアミンＨＣｌ（流速３０μΙ／分）で不活性化した。

その後、ＩＳＶＤ構築物を、ＨＳＡ表面上に４５μｌ／分で２分にわたり注入して、ＩＳＶＤ捕獲レベルをおよそ８００ＲＵにした。既存の抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）で１：１０希釈し、その後、４５μｌ／分で２分にわたり注入し、それに続き、後続の４００秒の解離工程を行った。各サイクルの後（すなわち新しいＩＳＶＤ捕獲および血液サンプル注入工程の前に）、ＨＳＡ表面を、ＨＣｌ（１００ｍＭ）の４５μｌ／分で２分の注入で再生した。１）ＩＳＶＤ－ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンへの非特異的な結合を引くことによる二重の参照の後、既存の抗体結合を示すセンサーグラムを得た。１２５秒（会合終了から５秒後）に報告ポイントを設定することによって、既存の抗体の結合レベルを決定した。参照ＩＳＶＤの１２５秒での結合レベルに対する既存の抗体結合におけるパーセンテージの低減を計算した。

５価のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１は、各ビルディングブロックにおける突然変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９ＬならびにＣ末端アラニンの導入によって既存の抗体結合の低減のために最適化されたことから、既存の抗体への結合は、対照の最適化されていない５価のＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７３０１１８６と比較してより実質的に少ないことが示される（表２４および図５）。

既存の抗体結合は、多重特異性構築物に存在するビルディングブロックの方向およびリンカー長さに依存する。表２４および図５は、構築物Ｆ０２７４００１６１が、その特定の方向のために構築物Ｆ０２７４００１６３より低い既存の抗体反応性を示すこと、ただしＦ０２７４００１６４は、全体的に短いリンカーのためにＦ０２７４００１６１より低い反応性を示すことを実証する。

６．４．８ 実施例２３：インビトロにおいてＦ０２７４００１６１はヒト樹状細胞においてＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７をブロックする
２型炎症カスケードは、環境依存的に上皮細胞、樹状細胞、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）、肥満細胞および自然リンパ球系細胞の協調した動作によって開始し伝播する。サイトカイン胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）は、樹状細胞（ＤＣ）を活性化するその能力を介してアレルギー性炎症の開始および進行に関与することが示されてきた。ＴＳＬＰによって活性化されると、ヒトＤＣは、ＣＣＬ１７、Ｔｈ２関連ケモカインを生産し、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＴｈ２細胞分化を促進する。Ｆ０２７４００１６１は、ＴＳＬＰとＩＬ－１３の両方を標的化し、ＴＳＬＰとＤＣとの相互作用をブロックすることができ、それによってＣＣＬ－１７生産を低減し、２型炎症性疾患などにおいて効能を付与すると予想される。

８人の個々の健康なドナーから単離したヒトＤＣにおけるＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７生産を阻害するＦ０２７４００１６１の能力を、参照単一特異性抗体、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１と比較して評価した。ヒトＤＣ（ＣＤ３^－ＣＤ１４^－ＣＤ１１ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^ｈｉｇｈ）を単離し、軟膜（ヒト白血球パック）サンプル中の健康なヒトＰＢＭＣから濃縮した。合計０．５～０．８×１０^６個のＤＣ／ウェルを、３７℃の細胞培養インキュベーターにおける４ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＳＬＰでの３６時間の刺激の前に、８つの３倍で連続希釈した濃度のＦ０２７４００１６１（４００ｎｇ／ｍＬまたは５．７１４ｎＭのトップ濃度）または８つの４倍で連続希釈した濃度の抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１（４０００ｎｇ／ｍＬまたは２７ｎＭのトップ濃度）と共にインキュベートした。組換えヒトＴＳＬＰは、商業的に入手可能であり、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である（カタログ番号１３９８－ＴＳ）。新たに収集された細胞培養上清におけるＣＣＬ１７生産をＥＬＩＳＡによって測定し、ＩＳＶＤ構築物および基準抗体のＩＣ_５０値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍで計算した。

ヒトＤＣにおけるＦ０２７４００１６１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の用量阻害応答の集合的な結果は、図６に示される。参照単一特異性抗体である抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１は、ＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７生産を７９３．４ｐＭの平均ＩＣ_５０濃度で阻害したが、Ｆ０２７４００１６１は、ＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７生産を５３．２６ｐＭの平均ＩＣ_５０で阻害した。

結論として、これらの結果は、ＩＳＶＤ構築物Ｆ０２７４００１６１は、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１と比較して、ヒトＤＣにおけるＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７応答を阻害することにおいてより有効であることを実証する。

６．４．９ 実施例２４：インビトロにおいて、Ｆ０２７４００１６１は、ヒトＰＢＭＣにおいて０．５ｎｇ／ｍＬの［ＩＬ－１３＋ＴＳＬＰ］によって誘導された相乗的なＣＣＬ１７をブロックする
２型サイトカイン、例えば胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）およびインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）は、独特な、相加的および相乗的な応答を働かせ、喘息およびアトピー性皮膚炎（ＡＤ）の病態生理を促進する。２型免疫カスケードの上皮細胞由来の開始剤としてのＴＳＬＰおよび下流エフェクターサイトカインとしてのＩＬ－１３の役割が広範囲にわたり検証されてきた。Ｆ０２７４００１６１は、ＴＳＬＰとＩＬ－１３の両方を標的化し、それによって２型媒介炎症性疾患などにおいて効能を付与すると予想される。

ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）の０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３およびＴＳＬＰによって誘導された相乗的な生産を阻害するＦ０２７４００１６１の能力を、８人の個々の健康なドナーからのヒトＰＢＭＣにおいて評価した。単一特異性生物製剤、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１に対するＩＳＶＤ構築物の非劣性を評価するように研究を設計した。ウェル当たり細胞１００万個のヒトＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＳＬＰ（組換えヒトＴＳＬＰは商業的に入手可能であり、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である（カタログ番号１３９８－ＴＳ）、加えて、ＩＬ－１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１３－ＩＬＢ－００５／ＣＦ）で刺激し、３７℃の細胞培養インキュベーター中で、１０の３倍で連続希釈した濃度のＩＳＶＤ構築物（１０ｎＭのトップ濃度）、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１（１０ｎＭのトップ濃度）および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１（１００ｎＭのトップ濃度）と共に９６ウェルプレート中で２０時間インキュベートした。アッセイを、Ｆ０２７４００１６１に関する各ドナーにつき技術的な３連で実行した。使用されたサイトカインの濃度は、正常なヒト、喘息患者およびアトピー性皮膚炎患者の血清、ＢＡＬ流体、痰および皮膚からの報告された文献値の標準誤差の２倍以内であった（Ｂｅｒｒａｉｅｓ Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔｅｒ １７８：８５～９１、２０１６；Ｂｅｌｌｉｎｉ Ａら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（２）：１４０～９、２０１２；Ｄａｖｏｏｄｉ Ｐら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ６０（２）：４３１～７、２０１２；Ｓｚｅｇｅｄｉ Ｋら、Ｊ Ｅｕｒ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ ２９（１１）：２１３６～４４、２０１５）。新たに収集された細胞培養上清におけるＣＣＬ１７生産を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）Ｖ－ＰＬＥＸヒトＴＡＲＣキットによって測定した。

Ｆ０２７４００１６１ならびに基準抗体、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の用量阻害応答の集合的な結果は、図７に示される。Ｆ０２７４００１６１は、０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３＋ＴＳＬＰによって誘導された相乗的なＣＣＬ１７生産の１００％阻害を０．００６１ｎＭの平均ＩＣ_５０で実証した。参照抗体である抗ｈＩＬ－１３ｍＡｂ１は、０．００２８ｎＭのより低い平均ＩＣ_５０を有するにもかかわらず、Ｆ０２７４００１６１の等しいモル用量で相乗的なＣＣＬ１７応答を完全にブロックすることができず、およそ８０％阻害でプラトー状態になった。一方で、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１は、２．９３２ｎＭの平均ＩＣ_５０でＣＣＬ１７生産のおよそ５０％だけブロックすることができた。

結論として、これらの結果は、Ｆ０２７４００１６１は、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１より有効であり、ヒトＰＢＭＣにおける病態生理学的な重要な濃度のＩＬ－１３およびＴＳＬＰによって誘導された相乗的な応答をブロックすることに関して抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１と比較して優れていることを実証し、２型炎症性疾患、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎の処置のためのその治療上の可能性が強調される。

６．４．１０ 実施例２５：インビトロにおいて、Ｆ０２７４００１６１は、ヒトＰＢＭＣにおいて５ｎｇ／ｍＬの［ＩＬ－１３＋ＴＳＬＰ］によって誘導された相乗的なＣＣＬ１７をブロックする
５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３＋ＴＳＬＰによって誘導されたＣＣＬ１７生産を阻害するＦ０２７４００１６１の能力を、８人の健康な個々のドナーからのヒトＰＢＭＣにおいて評価した。単一特異性生物製剤、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１および抗ＩＬ－１３参照ｍＡｂ１に対するＩＳＶＤ構築物の非劣性を評価するように研究を設計した。使用されたサイトカインの濃度は、一時的な炎症状態中の仮定の濃度として正常なヒト、喘息患者およびアトピー性皮膚炎患者における文献で報告されたＴＳＬＰおよびＩＬ－１３の病態生理学的な範囲の上限値の約１０倍であった（Ｂｅｒｒａｉｅｓ Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔｅｒ １７８：８５～９１、２０１６；Ｂｅｌｌｉｎｉ Ａら、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（２）：１４０～９、２０１２；Ｄａｖｏｏｄｉ Ｐら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ６０（２）：４３１～７、２０１２；Ｓｚｅｇｅｄｉ Ｋら、Ｊ Ｅｕｒ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ ２９（１１）：２１３６～４４、２０１５）。ウェル当たり細胞１００万個のヒトＰＢＭＣを、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＳＬＰ、加えてＩＬ－１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１３－ＩＬＢ－００５／ＣＦ）で刺激し、３７℃の細胞培養インキュベーター中で、１０の３倍で連続希釈した濃度のＦ－２７４００１６１（１０ｎＭのトップ濃度）、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１（１０ｎＭのトップ濃度）および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１（１００ｎＭのトップ用量）と共に９６ウェルプレート中で２０時間インキュベートした。アッセイを、Ｆ０２７４００１６１に関する各ドナーにつき技術的な３連で実行した。新たに収集された細胞培養上清におけるＣＣＬ１７生産を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）Ｖ－ＰＬＥＸヒトＴＡＲＣキットによって測定した。

Ｆ０２７４００１６１ならびに基準抗体、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の用量阻害応答の集合的な結果は、図８に示される。Ｆ０２７４００１６１は、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１３＋ＴＳＬＰによって誘導された相乗的なＣＣＬ１７生産の１００％阻害を０．０３８７ｎＭの平均ＩＣ_５０で実証した。等モル用量のコンパレーター抗体である抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１で処理したＰＢＭＣは０．０１３３９ｎＭのより低い平均ＩＣ_５０を示したが、阻害応答は１００％に決して達せず、およそ９０％阻害でプラトー状態になった。一方で、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１は、ＣＣＬ１７生産のおよそ４０％しか１９ｎＭの平均ＩＣ_５０で部分的にブロックしなかった。

結論として、これらの結果は、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－１３およびＴＳＬＰによって誘導された相乗的なＣＣＬ１７応答を、サイトカインの病態生理学的な範囲の１０倍の［ＴＳＬＰ＋ＩＬ－１３］濃度でブロックすることにおいて、Ｆ０２７４００１６１が、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１と抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１の両方より優れていることを実証し、急性または炎症期間中における喘息およびアトピー性皮膚炎の処置のためのその治療上の可能性が強調される。

６．４．１１ 実験２７：Ｔ０２７４００１６１は、３つの培養物のアッセイシステムにおいてＩＬ－５、ＣＣＬ１７、およびＣＣＬ２６のアレルゲンＤｅｒ Ｐによって誘導された生産をブロックする
ＴＳＬＰは、ＣＣＬ１７、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３生産を誘導することによって２型免疫応答を促進させる。その後、ＩＬ－１３は、局所的な上皮細胞によってＣＣＬ２６生産を開始させ、２型免疫応答によって媒介される炎症性疾患などの副次的問題を引き起こす。

ＴＳＬＰによって誘導されたＩＬ－５およびＣＣＬ１７、ならびにＩＬ－１３によって誘導されたＣＣＬ２６の生産を阻害するＦ０２７４００１６１の能力を、６人の個々の正常ドナーからのＤｅｒ Ｐ刺激ヒトＰＢＭＣと共に６日間培養したＭＲＣ５線維芽細胞およびＡ５４９上皮細胞を使用する３つの培養物のアッセイシステムで評価した。単一特異性生物製剤、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１に対するＩＳＶＤの非劣性を評価するように研究を設計した。Ｄｅｒ Ｐおよび内因性ＴＳＬＰ刺激と共にＰＢＭＣによって生産されたＩＬ－１３に応答して、ＭＲＣ５線維芽細胞は、約１００ｐｇ／ｍＬの内因性ＴＳＬＰを構成的に生産し、Ａ５４９上皮細胞は、ＣＣＬ２６を生産した。ヒトＰＢＭＣとの共培養の１日前に、ウェル当たり７万５０００個のＭＲＣ５線維芽細胞およびＡ５４９上皮細胞を平板培養した。平板培養したＭＲＣ５線維芽細胞およびＡ５４９上皮細胞に、ウェル当たり細胞１００万個のヒトＰＢＭＣを添加し、３μｇ／ｍＬのＤｅｒ Ｐで刺激し、３７℃の細胞培養インキュベーター中で、１１．１ｎＭのＩＳＶＤ、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１、または抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１と共に２４ウェルプレート中で６日間インキュベートした。アッセイを、Ｆ０２７４００１６１に関する各ドナーにつき技術的な３連で実行した。新たに収集された細胞培養上清におけるＩＬ－５、ＣＣＬ１７、およびＣＣＬ２６の生産を、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍからのヒト磁気Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。

Ｆ０２７４００１６１ならびに基準抗体、抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１および抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１の阻害応答の集合的な結果は、図９に示される。Ｆ０２７４００１６１は、ＣＣＬ１７生産の６０％阻害、ＩＬ－５生産の５０％阻害、およびＣＣＬ２６生産の９５％阻害を実証した。参照抗体である抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１は、ＣＣＬ１７生産の５０％阻害、ＩＬ－５生産の５０％阻害、およびＣＣＬ２６生産のおよそ５５％阻害を示した。抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１は、匹敵するＣＣＬ２６生産の９５％阻害を実証するが、この参照抗体は、ＣＣＬ１７生産のおよそ３５％およびＩＬ－５生産の１０％未満しかブロックできなかった（図９）。これらの試験した分子による完全なＩＬ－５およびＣＣＬ１７の阻害の欠如は、Ｄｅｒ Ｐ刺激が、ＰＢＭＣによってＩＬ－５およびＣＣＬ１７の生産を促進するためにＴＳＬＰおよびＩＬ－１３以外の経路の惹起を開始させることを示唆する可能性がある。

結論として、これらの結果は、組織構造的な細胞と共に培養されたヒトＰＢＭＣを含む複雑なアッセイシステムにおいて３つのサイトカインおよびケモカイン（ＣＣＬ１７、ＩＬ－５およびＣＣＬ２６）をブロックするその能力によって、抗ＴＳＬＰ／ＩＬ－１３ ＩＳＶＤ Ｆ０２７４００１６１が、抗ｈＴＳＬＰ参照ｍＡｂ１および抗ｈＩＬ－１３参照ｍＡｂ１より優れていることを実証し、２型炎症性疾患、例えば喘息およびアトピー性皮膚炎、加えて広範な免疫疾患の徴候の処置のためのその治療上の可能性が強調される。

６．４．１２ 実施例２６：インビボにおけるＦ０２７４００１６１によって媒介される標的の占有および薬力学を評価するためのＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスモデル
Ｆ０２７４００１６１は、ヒトＴＳＬＰとＩＬ－１３の両方を標的化し、マウスオーソログと反応しない。したがって、Ｆ０２７４００１６１の生物学的活性を評価するために、異種移植されたヒト化モデル系を使用した。雌ＮＳＧ－ＳＧＭ３（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－ＩＬ２Ｒγ－／－、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒγｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡから得た。これらのマウスは、ヒト造血サイトカイン：幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインターロイキン－３（ＩＬ－３）を発現し、全てヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列によって促進される。三重トランスジェニックマウスは、上記のサイトカインを構成的に生産し、細胞増殖および生存シグナルを提供し、ＣＤ３３＋骨髄系統、および数種のタイプのリンパ系細胞の安定な生着を維持する。簡単に言えば、生着のために行われるプロトコールは以下の通りである：
研究の０日目に、マウスに、１５０センチグレイで、１２０ラド／分の速度で１分および１５秒間放射線を照射した。マウスに、２００μｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中の１×１０^５個の臍帯血ＣＤ３４＋幹／前駆細胞を、静脈内（ＩＶ）経路によって、植え付け後およそ６時間植え付けた。マウスの１つのグループに同じ方式で放射線を照射し、ただし植え付けは行わなかった。これらのマウスは、照射ナイーブマウスとみなした。生着後８８日目に、マウスは、生理食塩水（植え付けられた対照マウス）または５０μｇのＩＬ－４ミニサークルＤＮＡと５０μｇのＴＳＬＰミニサークルＤＮＡの組合せのいずれかの流体力学的な（ＨＤＤ）ｉ．ｖ．注射を受けた。９１日目に、下顎下の採血を実行し、１００～１５０μｌの血液を各マウスから収集し、リチウムヘパリンチューブに入れた。生着チェックをフローサイトメトリーによって実行し、ＩＬ－４およびＴＳＬＰの血漿濃度を評価した。生着チェックおよび／またはサイトカイン決定からの情報を使用して、研究からマウスを選択した（組み入れた、または除外した）。２５％未満のヒトＣＤ４５＋細胞を有する植え付けられた対照グループからのマウスを研究から除外した。同様に、ミニサークルＤＮＡを受け、平均未満の１標準偏差の血漿ＴＳＬＰレベルを示した植え付けられたマウスも研究から除外した。ＨＤＤｉ．ｖ．注射によってミニサークルＤＮＡを受けたマウスは、９５、９７、９９、および１０１日目に、ビヒクル（２０ｍＭのホスフェート、１２５ｍＭのＬ－アルギニンＨＣＬ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．０）またはＦ０２７４００１６１（０．０１、０．０５、０．１、または１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの皮下投与を受けた。１０３日目に、イソフルラン麻酔によってマウスを麻酔した。イソフルラン麻酔下の間に、後眼窩での採血によって血液を収集した。血液収集の後、それでもなおイソフルラン麻酔下で、マウスを頸部脱臼によって致死させた。肺の一部を回収し、遺伝子発現評価のためにＲＮＡ ｌａｔｅｒに入れた。１０３日目の血漿サンプルからのヒトＴＳＬＰの血漿濃度を、ＭＳＤキット評価（カタログ番号Ｋ１５０６７－Ｌ－２、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）によって決定した。１０３日目の血漿サンプルからのヒトＩＬ－１３の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡ（カタログ番号８８－７４３９－－８８Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１３ＥＬＩＳＡキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって決定した。内部アッセイ検証実験は、ヒトＴＳＬＰおよびＩＬ－１３の両方の検出キットが、ｈＴＳＬＰおよびｈＩＬ－１３に結合したＦ０２７４００１６１を検出することができなかったことを実証した。

図１０および図１１で示されるこれらの実験の集合的な結果は、Ｆ０２７４００１６１が、ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの血漿中のヒトＴＳＬＰおよびＩＬ－１３の検出可能なレベルを有意に阻害できることを実証し、これは、ヒトＴＳＬＰおよびヒトＩＬ－１３の両方についての標的の占有を実証する。

ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスモデルにおいて、ＴＳＬＰおよびＩＬ－４のｃＤＮＡの流体力学的な送達は、ヒトＩＬ－１３の発現を作動させる（図１１）。マウスＩＬ－１３受容体を介してシグナル伝達するヒトＩＬ－１３の能力を利用することによって、ＮＳＧ－ＳＧＭ３研究から得られたサンプルを使用してＦ０２７４００１６１の薬力学的作用を研究した（Ｈｅｒｓｈｅｙ ＧＫ．２００３、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１１１（４）：６７７～９０）。これらの研究において、ヒトＩＬ－１３によって調節されたマウス遺伝子転写物に対するＦ０２７４００１６１処理の影響を研究した。上記の研究からのマウス肺組織をこの分析に使用した。

処置した、および対照ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスからの肺を回収し、添付されたプロトコールで詳述された通りに処理してＲＮＡを作製した。ＴａｑＭａｎによる定量化のためにＲＮＡを処理し、データをプロトコールに記載した通りに分析した。簡単に言えば、マウスから回収した肺をＲＮＡＬａｔｅｒに貯蔵し、標準的なプロトコールに従って処理し、精製して、高品質のＲＮＡを生成した。次いで精製した肺ＲＮＡを、Ｑｕａｎｔａ Ｑ－Ｓｃｒｉｐｔ ５Ｘマスターミックスを製造元のプロトコールに従って使用してｃＤＮＡに逆転写した。得られた肺ｃＤＮＡを使用して、ＴａｑＭａｎアッセイを製造元のプロトコールに従って使用して、ヒトＩＬ－１３応答性マウス標的遺伝子（マウスＲｅｔｎｌａおよびマウスＣｌｃａ１）および内因性対照（Ｒｐｌ３７ａ）の転写発現レベルを定量した。データ分析を、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ６＆７フレックスソフトウェアで実行した。各プローブにつき、Ｃ_Ｔ値およびデルタＣ_Ｔ値（Ｒｐｌ３７ａに対して）をエクセルにエクスポートし、各遺伝子の相対発現値を、以下の式を使用して計算した：
正規化した相対発現＝（パワー（２，－（デルタＣＴ）））×１０００。

評価された２種のヒトＩＬ－１３調節マウス遺伝子は、肺血管リモデリングにおいて役割を果たすＲｅｔｎｌａ（レジスチン様アルファ）およびＣｌｃａ１（塩素チャネルアクセサリー１）（Ｌｅｗｉｓ ＣＣ、２００９、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１２３（４）：７９５～８０４）であった。

図１２および１３で示されるようなこれらの実験の集合的な結果は、Ｆ０２７４００１６１は、マウスＲｅｔｎｌａおよびマウスＣｌｃａ１転写発現を有意に阻害できたことを実証し、これは、インビボにおけるヒトＩＬ－１３によって駆動するマウス転写応答に対するＦ０２７４００１６１の薬力学的作用を実証する。

方法：
サンプルホモジネートの調製：
肺をマウスから回収し、ＲＮＡ ｌａｔｅｒに貯蔵した。次いで肺葉を乾燥させ、１ｍＬのＲＬＴ＋２－ＭＥを含有するｆａｓｔｐｒｅｐ溶解マトリックスＡチューブ（肺をホモジナイズするための）に移した。サンプルを、ＭＰ－Ｂｉｏホモジナイザーでプログラム１（サンプルの加熱を回避するために５分間を挟んで２回の４０秒サイクル）を使用してホモジナイズした。次いでサンプルを１０，０００ｇで３分間スピンした。３５０ｕｌの溶解物［ＲＬＴ＋２ＭＥ中（１％ｖ／ｖ）］を収集した。マルチチャネルを使用して複数回（約２０回）ピペッティングし、細胞を溶解させた。

ＲＮＡ調製：
ＲＮＡ精製のために、３５０ｕｌのホモジネートを使用した。１×体積（３５０ｕｌ）の７０％エタノールを添加し、ホモジネートを徹底的に混合し、溶出プレート中に置いた９６ウェルのＲＮｅａｓｙスピンプレートに移し、以下の改変を施したＱｉａｇｅｎ ＲＮＡミニ組織ＲＮＡ抽出プロトコールを使用して、ＲＮＡを調製した。９６ウェルプレートをシール可能なアルミニウム箔で覆い、４０００×ｇで２分間遠心分離した。カラムを洗浄するために、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに４００μｌの緩衝液ＲＷＴを添加し、スピンカラムプレートを、４０００×ｇで、室温で２分間遠心分離した。８０ｕｌの１×ＤＮアーゼＩミックスを添加し、室温で１５分インキュベートすることによって、ＤＮアーゼＩ消化を行った。４００ｕｌの緩衝液ＲＷＴを添加し、プレートを４０００×ｇで２分間スピンさせることによって、ＤＮアーゼＩを洗い落とした。これに続いて、それぞれ５００ｕｌの緩衝液ＲＰＥおよび８０％エタノールでスピンプレートを洗浄した。これに続いて、４０００×ｇで４分間スピンさせることによってカラム膜を乾燥させた。次いでＲＮＡを、４０μｌのトリスＨＣｌ（１０ｍＭ；ｐＨ８．０）中で溶出させた。ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐを使用して定量化し、５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡ調製のために使用した。

第１の鎖の合成：
Ｑｕａｎｔａ Ｑ－Ｓｃｒｉｐｔ ５Ｘマスターミックスを使用し、製造元のプロトコールを使用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの最終濃度は２５ｎｇ／ｕｌであった。ＴａｑＭａｎアッセイを実行するまでｃＤＮＡを－２０℃で貯蔵した。

ＴａｑＭａｎアッセイ：
１．５ｍｌのマイクロ遠沈管中で構成要素を以下の順番で添加することによって、ＴａｑＭａｎマルチプレックスマスターミックスを調製した。３つの別々のマスターミックスを、内部Ｒｐｌ３７ａ対照と共に各プローブセットにつき作製した。各マルチプレックスｑＰＣＲ反応を１０μｌの反応体積で実行した。

３８４ウェルの光学プレートの適切なウェルに、各サンプルにつき合計８．８ｕｌのマスターミックスを添加した。各ウェルに３０ｎｇ（１．２ｕｌ）のｃＤＮＡサンプルを添加した。ＴａｑＭａｎアッセイをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｋ上で構成した。サーモサイクラーにおける条件は、以下の通りであった：９５℃で３分間の予備変性、４０サイクルの９５℃で２秒間の変性、ならびに６０℃で５秒間のアニーリングおよび伸長。伸長工程中に蛍光測定を行った。

データ分析：
データ分析を、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ６＆７フレックスソフトウェアで実行した。

各プローブにつき、ＣＴ値およびデルタＣＴ値（Ｒｐｌ３７ａに対する）をエクセルにエクスポートし、各遺伝子の相対発現値を、以下の式を使用して計算した：
正規化した相対発現＝（パワー（２，－（デルタＣＴ）））×１０００

参考文献：
Liu, Y.J. 2006, J Exp Med.;203(2):269-73. Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation.
Hershey GK. 2003, J Allergy Clin Immunol.;111(4):677-90. IL-13 receptors and signaling pathways: an evolving web.
Lewis CC, Aronow B, Hutton J, Santeliz J, Dienger K, Herman N, Finkelman FD, Wills-Karp M. 2009, J Allergy Clin Immunol.;123(4):795-804. Unique and overlapping gene expression patterns driven by IL-4 and IL-13 in the mouse lung.

７ 産業上の利用可能性
本明細書に記載されるポリペプチド、それをコードする核酸分子、核酸を含むベクターおよび組成物は、例えば炎症性疾患に罹っている対象の処置において使用することができる。

Claims (19)

1. 少なくとも４つのＩＳＶＤを含むかまたはそれからなるポリペプチドであって、前記ＩＳＶＤのそれぞれは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、：
   ａ）第１のＩＳＶＤは、ＩＬ－１３に特異的に結合し、
   ｉ．配列番号７のアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
   ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
   ｉｉｉ．配列番号１７のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
   を含み；
   ｂ）第２のＩＳＶＤは、ＩＬ－１３に特異的に結合し、
   ｉｖ．配列番号８のアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
   ｖ．配列番号１３のアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
   ｖｉ．配列番号１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
   を含み；
   ｃ）第３のＩＳＶＤは、ＴＳＬＰに特異的に結合し、
   ｖｉｉ．配列番号９のアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
   ｖｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
   ｉｘ．配列番号１９のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
   を含み；
   ｄ）第４のＩＳＶＤは、ＴＳＬＰに特異的に結合し、
   ｘ．配列番号１１のアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
   ｘｉ．配列番号１６のアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
   ｘｉｉ．配列番号２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
   を含み、
   ＩＳＶＤの順番は、前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で考えられるそれらの互いに対する相対的な位置を示す、前記ポリペプチド。
2. 請求項１に記載のポリペプチドであって、該少なくとも４つのＩＳＶＤは、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている、前記ポリペプチド。
3. ａ）前記第１のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号２と９０％を超える配列同一性を含み；
   ｂ）前記第２のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号３と９０％を超える配列同一性を含み；
   ｃ）前記第３のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号４と９０％を超える配列同一性を含み；
   ｄ）前記第４のＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号６と９０％を超える配列同一性を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. ａ）前記第１のＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
   ｂ）前記第２のＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
   ｃ）前記第３のＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
   ｄ）前記第４のＩＳＶＤは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位を有さない対応するポリペプチドと比較して、増加した半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
6. 前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、１つまたはそれ以上のペプチド性リンカーを介して連結される、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそれらの断片、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる低分子量タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、請求項５または６に記載のポリペプチド。
8. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記１つまたはそれ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンのような）または血清免疫グロブリン（ＩｇＧのような）に結合することができる結合単位からなる群から選択される、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
9. 増加した半減期を有するポリペプチドを提供する前記結合単位は、ヒト血清アルブミンに結合することができるＩＳＶＤである、請求項８に記載のポリペプチド。
10. ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、
    ｉ．配列番号１０のアミノ酸配列であるＣＤＲ１；
    ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ２；および
    ｉｉｉ．配列番号２０のアミノ酸配列であるＣＤＲ３
    を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤのアミノ酸配列は、配列番号５と９０％を超える配列同一性を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
12. 前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と９０％を超える配列同一性を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
14. 配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
16. 少なくとも１つの請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１５に記載の核酸を含む組成物であって、該組成物は、少なくとも１種の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および／もしくはアジュバントをさらに含む医薬組成物である、前記組成物。
17. 前記組成物は、１またはそれ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、請求項１６に記載の組成物。
18. ２型炎症性疾患のような炎症性疾患の処置に使用するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１６または１７に記載の組成物。
19. 前記２型炎症性疾患は、喘息およびアトピー性皮膚炎から選択される、請求項１８に記載の使用のためのポリペプチドまたは組成物。

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