JP7644764B2

JP7644764B2 - 目的タンパク質の回収方法及び製造方法

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Publication number: JP7644764B2
Application number: JP2022541740A
Authority: JP
Inventors: 憲一西田
Original assignee: Denka Co Ltd; Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2025-03-12
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: EP4194561A1; US12545902B2; CN116194461A; US20230265403A1; EP4194561A4; JPWO2022030600A1; WO2022030600A1

Description

本発明は、目的タンパク質の回収方法及び製造方法に関する。

遺伝子組換え技術等により植物体に目的タンパク質を発現させ、発現した目的タンパク質を回収する方法が開発されている。植物体を利用した従来の目的タンパク質の回収及び製造においては、例えば、非特許文献１のように、植物の葉を破砕することにより植物成分の大部分を抽出する方法がとられることが多かった。

しかしながら、植物体の破砕を伴う従来の方法では、植物体を破砕することにより得られた抽出液に、目的タンパク質の他に植物残渣等の植物由来の不溶性異物及び水溶性の不純物が含まれるため、それらを取り除くための精製工程が必要であった。非特許文献２に記載されているように、目的タンパク質の抽出量を多くしようとすると、不要な植物成分が増え、この精製工程の負荷が増大する。

Marillonnet et al. "In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.", Proc Natl Acad Sci U S A., 2004 Oct 26;101(43):15546 Dixon et al. "The Impact of Six Critical Impurities on Recombinant Protein Recovery and Purification from Plant Hosts", Molecular Pharming: Applications, Challenges, and Emerging Areas, 2018, 137-180

そこで、本発明は、植物体の破砕を必要としない、目的タンパク質を回収する方法及び目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入し、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出することで、植物体を破砕することなく、アポプラストにおいて発現する目的タンパク質を回収することが出来ることを見出した。本発明は、この新規な知見に基づくものである。

すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程
を含む、アポプラストにおいて発現する目的タンパク質の回収方法。
［２］
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含む、［１］に記載の方法。
［３］
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、［１］に記載の方法。
［５］
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体を浸漬することを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも高い塩濃度の緩衝液に植物体を浸漬することを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［２］又は［４］に記載の方法。
［８］
加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［３］又は［４］に記載の方法。
［９］
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体を準備する工程、
植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法。
［１０］
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含む、［９］に記載の方法。
［１１］
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、［９］に記載の方法。
［１３］
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体を浸漬することを含む、［９］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも高い塩濃度の緩衝液に植物体を浸漬することを含む、［９］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［１０］又は［１２］に記載の方法。
［１６］
加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１７］
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の葉の気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程
を含む、アポプラストにおいて発現する目的タンパク質の回収方法。
［１８］
気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含む、［１７］に記載の方法。
［１９］
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］
気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含み、
気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程及び気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、［１７］に記載の方法。
［２１］
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔又は水孔から葉内部に注入した緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体の葉を浸漬することを含む、［１７］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔又は水孔から葉内部に注入した緩衝液よりも高い塩濃度の緩衝液に植物体の葉を浸漬することを含む、［１７］～［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］
目的タンパク質が酵素である、［７］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］
加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［１８］又は［２０］に記載の方法。
［２５］
加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［１９］又は［２０］に記載の方法。
［２６］
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体を準備する工程、
植物体の葉の気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法。
［２７］
気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含む、［２６］に記載の方法。
［２８］
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、［２６］又は［２７］に記載の方法。
［２９］
気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含み、
気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する工程及び気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、［２６］に記載の方法。
［３０］
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔又は水孔から葉内部に注入した緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体の葉を浸漬することを含む、［２６］又は［２７］に記載の方法。
［３１］
気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔又は水孔から葉内部に注入した緩衝液よりも高い塩濃度の緩衝液に植物体の葉を浸漬することを含む、［２４］に記載の方法。
［３２］
目的タンパク質が酵素である、［２６］～［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］
加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［２７］又は［２９］に記載の方法。
［３４］
加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、［２８］又は［２９］に記載の方法。

本発明によれば、植物体の破砕を必要としない、目的タンパク質を回収する方法及び目的タンパク質の製造方法を提供することができる。

目的タンパク質を抽出する際の植物体由来の不要な成分の抽出量が減少すると、精製工程の負荷が低減する。本発明によれば、植物体の破砕を必要としないため、植物体を破砕した抽出液に含まれる不要な植物成分を除去する精製工程を省略することができる。本発明によれば、不要な植物成分を低減しつつ、従来の植物体を破砕する抽出方法と同等又はそれ以上の量の目的タンパク質を得ることができるため、効率よく目的タンパク質を抽出及び回収することができる。

破砕抽出液と加減圧抽出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ａ）及びウエスタンブロット解析（ｂ）の結果を示す。レーン１は加減圧抽出液、レーン２は破砕抽出液であり、矢印はホスホジエステラーゼのバンドの位置を示す。破砕抽出液と浸透圧抽出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ａ）およびウエスタンブロット解析（ｂ）の結果を図２に示す。レーン１は破砕抽出液、レーン２は浸透圧抽出液であり、矢印はホスホジエステラーゼのバンドの位置を示す。耐圧容器内で、気体、液体又はプレス機を使用した加圧又は減圧を例示する概略図である。緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内に、下矢印の方向に気体を加えることで加圧でき、上矢印の方向に気体を抜くことで減圧することができる（ａ）。緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内に、下矢印の方向に液体を加えることで加圧でき、上矢印の方向に液体を抜くことで減圧することができる（ｂ）。緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内において、下矢印の方向にプレスすることで緩衝液に浸漬させた植物が含まれる密閉空間を狭くすることで、気体及び／又は液体を圧縮して加圧でき、逆に上矢印の方向に当該密閉空間を広げたり、減圧弁を使用したりすることで減圧することができる（ｃ）。

〔目的タンパク質の回収方法〕
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の回収方法は、アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を含む。ここで、回収される目的タンパク質は、アポプラストにおいて発現する目的タンパク質である。

本明細書において「アポプラスト」とは、植物組織において細胞膜よりも外側の部分、すなわち細胞壁及び細胞間隙の総体を意味する。

目的タンパク質は、植物体のアポプラストにおいて発現が可能である限り制限されず、例えば、自然界に存在するタンパク質、自然界に存在するタンパク質に由来するタンパク質、又は人工的に設計したタンパク質であってもよい。目的タンパク質としては、例えば、酵素、抗体、抗原、エピトープ、成長因子、ホルモン、サイトカイン、転写因子、受容体又はそれらの部分ペプチド等が挙げられる。例えば、目的タンパク質は、酵素、抗原、及び抗体からなる群から選択されるものであってもよく、酵素であってもよい。目的タンパク質の由来も制限されず、例えば、動物（ヒト等の哺乳動物を含む）、植物、糸状菌、細菌又は酵母由来であってよい。

酵素としては、例えば、酸化酵素、還元酵素、リパーゼ（例えば、ホスホリパーゼ）、プロテアーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、セルラーゼ、ステロイド合成酵素、メチラーゼ、デメチラーゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼ及びキチナーゼが挙げられる。例えば、酵素は、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、及びオキシダーゼからなる群から選択されるものであってもよく、エステラーゼであってよく、ホスホジエステラーゼであってもよい。

抗体としては、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。

抗原及びエピトープとしては、例えば、糸状菌由来のタンパク質、細菌由来のタンパク質及びウイルス由来のタンパク質が挙げられる。ワクチンとして使用される抗原タンパク質又はエピトープである場合には、免疫原性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、病原性である糸状菌由来のタンパク質、病原性である細菌由来のタンパク質及び病原性であるウイルス由来のタンパク質が挙げられる。

成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。

ホルモンとしては、例えば、ペプチド・タンパク質系ホルモンが挙げられる。

サイトカインとしては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、造血因子（ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ）及びケモカイン（ＩＬ－８）が挙げられる。

転写因子としては、例えば、基本転写因子、上流転写因子及び誘導型転写因子が挙げられる。

受容体としては、例えば、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体及びサイトカイン受容体スーパーファミリーが挙げられる。

また、目的タンパク質は、２つ以上のタンパク質が結合した融合タンパク質であってもよい。２つ以上のタンパク質の融合タンパク質としては、２つ以上の異種タンパク質の融合タンパク質でもよいし、２つ以上の同種タンパク質の融合タンパク質でもよい。

目的タンパク質の分子量は、特に制限されないが、例えば、１ｋＤａ～１００ｋＤａ、１ｋＤａ～７５ｋＤａ、１ｋＤａ～５０ｋＤａ、又は１ｋＤａ～１０ｋＤａであってよい。また、目的タンパク質の分子量は、例えば、５００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、７５ｋＤａ以下、又は５０ｋＤａ以下であってもよい。

目的タンパク質は、モノマー、ダイマー、トリマー又はマルチマーであってもよい。

目的タンパク質には、目的タンパク質の検出及び／又は精製しやすくするためのタグが付加されていてもよい。

目的タンパク質を発現する植物体は、公知の方法により作製することができる。そのような方法としては、例えば、アグロインフィルトレーション法、植物ウイルスベクター法、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、及びパーティクルガン法が挙げられる。

アグロインフィルトレーション法を使用する場合、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入したＴ－ＤＮＡでアグロバクテリウムを形質転換し、そのアグロバクテリウムを植物体に感染させることで目的タンパク質を発現する植物体を得ることができる。

植物ウイルスベクター法を使用する場合、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡから得られたＲＮＡをベクターとして植物体に接種して感染させることで目的タンパク質を発現する植物体を得ることができる。このようなウイルスベクターとしては、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）ベクター、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ベクター、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）ベクター、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクター、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ベクター、及びズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）ベクター等が挙げられる。

ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムを使用する場合、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入したＴＭＶ又はＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ－ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムを植物体に感染させることで目的タンパク質を発現する植物体を得ることができる。

パーティクルガン法を使用する場合、目的タンパク質をコードする核酸で被覆した金属微粒子を高速で射出し、目的タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入することで目的タンパク質を発現する植物体を得ることができる。

形質転換に用いられる植物体としては特に制限されないが、例えば、ナス科（例えば、タバコ、ナス、トマト、ピーマン、トウガラシ）、バラ科（例えば、バラ、イチゴ）、アブラナ科（例えば、シロイヌナズナ、アブラナ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ）、キク科（例えば、キク、シュンギク、レタス）、アカザ科（例えば、ホウレンソウ、テンサイ）、イネ科（例えば、コムギ、イネ、オオムギ、トウモロコシ）及びマメ科（例えば、ダイズ、アズキ、インゲン、ソラマメ）等に属する植物が挙げられる。例えば、植物体は、ナス科又アブラナ科の植物であってよく、タバコ属又はシロイヌナズナ属の植物であってよく、ニコチアナ・ベンサミアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎ））、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）であってもよい。

目的タンパク質は公知の方法により、アポプラストにおいて発現させることができる。例えば、植物体において発現させた際に自然にアポプラストにおいて発現する目的タンパク質を用いてもよいし、アポプラスト（細胞壁及び／又は細胞間隙）において発現するように標的化した目的タンパク質を用いてもよい。アポプラストにおいて発現するタンパク質としては、例えば、アルブミン、抗体及び抗原が挙げられる。通常アポプラスト以外で発現する目的タンパク質を、アポプラストにおいて目的タンパク質を発現させる方法としては、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列に、細胞外への局在化を指向するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結することが挙げられる。細胞外への局在化を指向するシグナルペプチドとしては、例えば、イネアミラーゼシグナルペプチド（McCormick 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:703-708）、タバコ植物病因関連タンパク質（ＰＲＰ）及びカルレティキュリンタンパク質由来の分泌ターゲッティングシグナルが挙げられる。

（アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程）
植物体に存在する気孔、水孔又は断面から、植物体内部に向けて緩衝液を注入することで、植物体内部のアポプラスト内に緩衝液が注入される。気孔又は水孔は通常植物の葉の裏に存在する。または、植物体の切断した断面から植物体内部に向けて緩衝液を注入することで、植物体内部のアポプラスト内に緩衝液が注入される。アポプラスト内に緩衝液が注入されることで、アポプラストにおいて発現された目的タンパク質が注入された緩衝液に移行する。

植物体としては、例えば、葉、根、苗条、茎、花、果実、胚芽及び実生並びにこれらの組合せを用いることができるが、気孔又は水孔から緩衝液を注入する場合には、葉を含むことが好ましく、断面から緩衝液を注入する場合には、植物体が切断面を有することが好ましい。ここで、本実施形態に係る発明は、目的タンパク質を発現する植物体を破砕することを含まないため、切断後の植物体は形態の一部が維持される。植物体の切断は、例えば、植物体の１～３カ所を切断すること、又は、植物体又は葉を１／１０～１／２（体積）に切断することであってよく、植物体は切断した切片であってもよい。植物体は、例えば、カッター及びカミソリを用いて切断することができる。

植物体は、生の植物体（例えば、生葉）を使用してもよいし、本発明が実施できる限り、凍結、融解及び乾燥等の処理をした植物体を使用してもよい。

気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する方法としては、例えば、気孔、水孔又は断面から植物体内部に直接緩衝液を注入する方法、加圧又は減圧を利用して注入する方法、及び浸透圧を利用して注入する方法等が挙げられる。目的タンパク質の抽出効率向上の観点から、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する方法は、加圧又は減圧を利用して注入する方法であることが好ましい。また、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する方法は、葉の裏の気孔又は水孔から葉内部に緩衝液を注入する方法であってよく、目的タンパク質の抽出効率向上の観点から、気孔又は水孔から葉内部に直接緩衝液を注入する方法、又は加圧又は減圧を利用して注入する方法であることが好ましい。

気孔、水孔又は断面から植物体内部に直接緩衝液を注入する方法としては、例えば、緩衝液に収納したシリンジの先端を気孔若しくは水孔又は断面にあて、プランジャをシリンジの先端方向に移動させることで緩衝液を気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入する方法が挙げられる。この際、プランジャの移動は手動で行ってもよく、その他の機械的な外力を加えることにより行ってもよい。

加圧を利用して注入する方法としては、例えば、緩衝液に浸漬させた植物体を内部に収納した容器内を加圧することにより、緩衝液を気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入する方法が挙げられる。容器（例えば、耐圧容器）内の加圧は、例えば、容器に気体を注入することで行うことができ、容器内の気体を圧縮することで行うこともできる。容器がシリンジの場合には、例えば、シリンジの一方を封止し、他方からプランジャ（プランジャ内は密封状態）をシリンジの先端方向に移動させることで行ってもよく、他方から気体を注入することで行ってもよい。加圧された容器内の圧力は、大気圧よりも高く、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入できれば特に制限されないが、例えば、０．０１～５ＭＰａ、０．０１～１ＭＰａ、０．０１～０．５ＭＰａ又は０．０１～０．１ＭＰａであってよい。加圧時間は特に限定されず、例えば、０～５分間、０～１分間、０～０．５分間、１秒～５分間、１秒～１分間、又は１秒～０．５分間であってよい。

減圧を利用して注入する方法としては、例えば、緩衝液に浸漬させた植物体を内部に収納した容器（例えば、耐圧容器、デシケーター）内を減圧した後、復圧することで緩衝液を気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入する方法が挙げられる。容器内の減圧は、例えば、容器内の空気を抜くことで行うことができ、減圧を停止して空気を容器内に戻すことで復圧することができる。容器がシリンジの場合には、例えば、シリンジの一方を封止し、他方からプランジャをシリンジの先端と反対の方向に移動させることで行ってもよく、他方からプランジャ内の空気を抜くことで行ってもよい。減圧された容器内の圧力は、大気圧よりも低く、復圧することで気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入できれば特に制限されないが、例えば、－０．０１～－０．１ＭＰａ又は－０．０１～－０．０５ＭＰａであってよい。減圧時間は特に限定されず、例えば、０～５分間、０～１分間、０～０．５分間、１秒～５分間、１秒～１分間、又は１秒～０．５分間であってよい。復圧する時間も特に限定されず、例えば、０～５分間、０～１分間、０～０．５分間、１秒～５分間、１秒～１分間、又は１秒～０．５分間であってよい。

上記の加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することは、耐圧容器（例えば、耐圧槽）内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含んでいてもよい。気圧を使用する場合には、例えば、緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内に、気体を加えることで加圧でき、気体を抜くことで減圧することができる（図３（ａ））。液体を使用する場合には、例えば、緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内に、液体を加えることで加圧でき、液体を抜くことで減圧することができる（図３（ｂ））。プレス機を使用する場合には、例えば、緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内において、緩衝液に浸漬させた植物が含まれる密閉空間をプレス機で狭くすることで、気体及び／又は液体を圧縮して加圧でき、逆に当該密閉空間を広げたり、減圧弁を使用したりすることで減圧することができる（図３（ｃ））。

浸透圧を利用して注入する方法としては、例えば、植物体内部のアポプラストに含まれる液の濃度よりも浸透圧が低い緩衝液に植物体を浸漬させることが挙げられる。例えば、植物体内部のアポプラストに含まれる液の濃度よりも濃度が低い緩衝液に植物体を浸漬させることが挙げられる。緩衝液の濃度とは、例えば、塩濃度であってもよく、糖濃度であってもよい。

緩衝液としては、例えば、トリス系緩衝液、リン酸系緩衝液、及びクエン酸系緩衝液等の一般的な緩衝液が使用できる。本発明において緩衝液は、特に限定するものではないが、目的タンパク質に与え得る水和性や安定性、活性等、各タンパク特性への影響を考慮しつつ、当業者が適宜設定することができる。トリス系緩衝液の濃度は、例えば、１０～３００ｍＭであってよく、１０～１００ｍＭであってよい。リン酸系緩衝液の濃度は、例えば、１０～２００ｍＭであってよい。クエン酸系緩衝液の濃度は、例えば、１０～２００ｍＭであってよい。緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ３～１１、ｐＨ５～９又はｐＨ７～９であってよい。

緩衝液は塩を含むものであってもよい。緩衝液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及びリン酸ナトリウム等の一般的な塩が使用できる。無機塩類の種類や濃度は、目的タンパク質に与え得る水和性や安定性、活性等、各タンパク特性への影響を考慮しつつ、当業者が適宜設定することができる。緩衝液の塩濃度は、例えば、１～３０００ｍＭ又は１～１０００ｍＭであってよい。浸透圧を利用して気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する場合には、植物体を浸漬させる緩衝液の塩濃度は、植物体内部のアポプラストに含まれる液の塩濃度よりも低い塩濃度であることが好ましい。

緩衝液は糖を含むものであってもよい。緩衝液に含まれる糖としては、例えば、スクロース、トレハロース、及びマルトース等の一般的な糖が使用できる。糖の種類や濃度は、目的タンパク質に与え得る水和性や安定性、活性等、各タンパク特性への影響を考慮しつつ、当業者が適宜設定することができる。緩衝液の糖濃度は、例えば、０．１～５０％又は０．１～１０％であってよい。浸透圧を利用して気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する場合には、植物体を浸漬させる緩衝液の糖濃度は、植物体内部のアポプラストに含まれる液の糖濃度よりも低い糖濃度であることが好ましい。

緩衝液は添加剤を含むものであってもよい。添加剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ及びＤＴＰＡ等のキレート剤、α－メルカプトエタノール、アスコルビン酸塩、メタ重硫酸ナトリウム及びジチオトレイトール等の酸化防止剤、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、尿素、塩酸グアニジン等の変性剤、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、グリセロール、イソプロパノール等のアルコール、セルラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ等の酵素性タンパク質、エクスパンシン等の非酵素性タンパク質が挙げられる。

緩衝液は添加剤を含まないものであってもよい。キレート剤等の添加剤を添加することで、緩衝液を気孔、水孔又は断面から抽出した後に、カラム等によりその添加剤を除く工程が必要になる場合がある。本発明は、添加剤を含まない緩衝液を用いて目的タンパク質の抽出が可能であるため、添加剤を除く工程が不要であるという利点を有する。

本工程を実施する際の温度は、特に制限されないが、例えば、１～５０℃、１～３０℃、１～１５℃、又は４～５０℃であってよい。目的タンパク質の変性を防ぐ目的から、３０℃以下であることが好ましい。

なお、本工程で用いる緩衝液を第１の緩衝液、後述する「気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程」で用いる緩衝液を第２の緩衝液と表すこともできる。第１の緩衝液と第２の緩衝液は同じであってもよいし、異なっていても良い。第１の緩衝液にさらに塩等を追加することで第２の緩衝液としてもよい。

緩衝液に植物体を浸漬させた状態で気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入した場合には、そのまま緩衝液に植物体を浸漬させた状態で後述する「気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程」を行ってもよく、緩衝液から植物体を分離して後述する「気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程」を行ってもよい。

本工程においては、緩衝液を植物体内部に注入した後、例えば、容器から植物体を取り出すこと、植物体表面に付着した緩衝液を除くこと等をさらに含んでもよい。

（気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程）
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液に注入された緩衝液に、アポプラストにおいて発現された目的タンパク質が含まれる。したがって、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出することで、緩衝液に含まれる形で目的タンパク質を回収することができる。

気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する方法としては、例えば、気孔、水孔又は断面から直接緩衝液を抽出する方法、加圧又は減圧を利用して抽出する方法、浸透圧を利用して抽出する方法、及び遠心力を利用して抽出する方法等が挙げられる。目的タンパク質の抽出効率向上の観点から、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する方法は、加圧若しくは減圧を利用して抽出する方法、又は浸透圧を利用して抽出する方法であることが好ましい。また、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する方法は、気孔又は水孔から葉内部の緩衝液を抽出する方法であってもよく、目的タンパク質の抽出効率向上の観点から、加圧若しくは減圧を利用して抽出する方法、又は浸透圧を利用して抽出する方法であることが好ましい。気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程は、遠心力を利用して抽出することを除くものであってもよい。

気孔、水孔又は断面から直接緩衝液を抽出する方法としては、例えば、空のシリンジの先端を植物体の気孔、水孔又は断面にあて、プランジャをシリンジの先端と反対の方向に移動させることで植物体内部の緩衝液を気孔、水孔又は断面から抽出する方法が挙げられる。この際、プランジャの移動は手動で行ってもよく、その他の機械的な外力を加えることにより行ってもよい。

加圧を利用して抽出する方法としては、例えば、緩衝液が注入された植物体を内部に収納した容器内を加圧することにより、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する方法が挙げられる。容器内の加圧は、例えば、容器に気体を注入することで行うことができ、容器内の気体を圧縮することで行うこともできる。容器がシリンジの場合には、例えば、シリンジの一方を封止し、他方からプランジャをシリンジの先端方向に移動させることで行ってもよく、他方から気体を注入することで行ってもよい。加圧された容器内の圧力は、大気圧よりも高く、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出できれば特に制限されないが、例えば、０．０１～５ＭＰａ、０．０１～１ＭＰａ、０．０１～０．５ＭＰａ又は０．０１～０．１ＭＰａであってよい。加圧時間は特に限定されず、例えば、０～５分間、０～１分間、０～０．５分間、１秒～５分間、１秒～１分間、又は１秒～０．５分間であってよい。

減圧を利用して抽出する方法としては、例えば、緩衝液が注入された植物体を内部に収納した容器内を減圧することで、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する方法が挙げられる。減圧は、緩衝液が注入された植物体が緩衝液に浸漬した状態で行われてもよい。緩衝液が注入された植物体が緩衝液に浸漬した状態で容器内を減圧した場合には、植物体内部の緩衝液が気孔、水孔又は断面から抽出され、植物体が浸漬された緩衝液に含まれる。容器内の減圧は、例えば、容器内の空気を抜くことで行うことができる。容器がシリンジの場合には、例えば、シリンジの一方を封止し、他方からプランジャをシリンジの先端と反対の方向に移動させることで行ってもよく、他方からプランジャ内の空気を抜くことで行ってもよい。減圧された容器内の圧力は、大気圧よりも低く、植物体内部の緩衝液を気孔、水孔又は断面から抽出できれば特に制限されないが、例えば、例えば、－０．０１～－０．１ＭＰａ又は－０．０１～－０．０５ＭＰａであってよい。減圧時間は特に限定されず、例えば、０～５分間、０～１分間、０～０．５分間、１秒～５分間、１秒～１分間、又は１秒～０．５分間であってよい。

上記の加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することは、耐圧容器（例えば、耐圧槽）内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含んでいてもよい。気圧を使用する場合には、例えば、緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内に、気体を加えることで加圧でき、気体を抜くことで減圧することができる（図３（ａ））。液体を使用する場合には、例えば、緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内に、液体を加えることで加圧でき、液体を抜くことで減圧することができる（図３（ｂ））。プレス機を使用する場合には、例えば、緩衝液に浸漬させた植物を内部に収納した耐圧容器内において、緩衝液に浸漬させた植物が含まれる密閉空間をプレス機で狭くすることで、気体及び／又は液体を圧縮して加圧でき、逆に当該密閉空間を広げたり、減圧弁を使用したりすることで減圧することができる（図３（ｃ））。

浸透圧を利用して抽出する方法としては、例えば、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液（アポプラストに含まれる緩衝液）の浸透圧よりも浸透圧が高い緩衝液に植物体を浸漬させることが挙げられる。例えば、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液の濃度よりも濃度が高い緩衝液に植物体を浸漬させることが挙げられる。例えば、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液を第１の緩衝液、本工程で用いる第２の緩衝液とした場合に、第１の緩衝液よりも濃度の高い第２の緩衝液に植物体を浸漬させることで、植物体内部の緩衝液を抽出することができる。緩衝液の濃度とは、例えば、塩濃度であってもよく、糖濃度であってもよい。

第２の緩衝液に植物体を浸漬する時間は、例えば、１分～１２０分であってよく、５分～６０分であってよく、１０分～３０分であってよい。

緩衝液は、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液と同じものを使用してもよく、異なるものを使用してもよい。浸透圧を利用して植物体内部の緩衝液を抽出する場合には、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液と少なくとも浸透圧の異なる緩衝液を用いる。

緩衝液は塩を含むものであってもよい。緩衝液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及びリン酸ナトリウム等の一般的な塩が使用できる。無機塩類の種類や濃度は、目的タンパク質に与え得る水和性や安定性、活性等、各タンパク特性への影響を考慮しつつ、当業者が適宜設定することができる。緩衝液の塩濃度は、例えば、１～３０００ｍＭ又は１～１０００ｍＭであってよい。浸透圧を利用して気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する場合には、植物体を浸漬させる第２の緩衝液の塩濃度は、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した第１の緩衝液（アポプラストに含まれる緩衝液）の塩濃度よりも高い塩濃度であることが好ましく、例えば、１０～３０００ｍＭ又は１０～１０００ｍＭであってよい。また、例えば、第２の緩衝液の塩濃度は、第１の緩衝液の塩濃度の１倍以上、２倍以上、１倍～１０００倍、２倍～１００倍であってよい。植物体内部に注入した第１の緩衝液の塩濃度よりも高い塩濃度である第２の緩衝液に植物体を浸漬させることで、浸透圧により、目的タンパク質を含む第１の緩衝液が、第２の緩衝液中に抽出される。

緩衝液は糖を含むものであってもよい。緩衝液に含まれる糖としては、例えば、スクロース、トレハロース、及びマルトース等の一般的な糖が使用できる。糖の種類や濃度は、目的タンパク質に与え得る水和性や安定性、活性等、各タンパク特性への影響を考慮しつつ、当業者が適宜設定することができる。緩衝液の糖濃度は、例えば、０．１～５０％又は０．１～１０％であってよい。浸透圧を利用して気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する場合には、植物体を浸漬させる第２の緩衝液の糖濃度は、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した第１の緩衝液（アポプラストに含まれる緩衝液）の糖濃度よりも高い糖濃度であることが好ましく、例えば、０．１～５０％又は０．１～１０％であってよい。また、例えば、第２の緩衝液の糖濃度は、第１の緩衝液の糖濃度の１倍以上、２倍以上、１倍～１０００倍、２倍～１００倍であってよい。植物体内部に注入した第１の緩衝液の糖濃度よりも高い糖濃度である第２の緩衝液に植物体を浸漬させることで、浸透圧により、目的タンパク質を含む第１の緩衝液が、第２の緩衝液中に抽出される。

緩衝液は添加剤を含むものであってもよい。添加剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ等のキレート剤、α－メルカプトエタノール、アスコルビン酸塩、メタ重硫酸ナトリウム及びジチオトレイトール等の酸化防止剤、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ＣＨＡＰＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００等の界面活性剤、尿素、塩酸グアニジン等の変性剤、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、グリセロール、イソプロパノール等のアルコール、セルラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ等の酵素性タンパク質、エクスパンシン等の非酵素性タンパク質が挙げられる。

緩衝液は添加剤を含まないものであってもよい。キレート剤等の添加剤を添加することで、緩衝液を気孔、水孔又は断面から抽出後に、カラム等によりその添加剤を除く工程が必要になる場合がある。本発明は、添加剤を含まない緩衝液を用いて目的タンパク質の抽出が可能であるため、添加剤を除く工程が不要であるという利点を有する。

本工程を実施する際の温度は、特に制限されないが、例えば、例えば、１～５０℃、１～３０℃、１～１５℃、又は４～５０℃であってよい。目的タンパク質の変性を防ぐ目的から、３０℃以下であることが好ましい。気孔、水孔又は断面から植物体内部へ緩衝液を注入する工程の温度と同じであってもよく、異なっていてもよい。

遠心力を利用して抽出する方法としては、例えば、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入した植物体を容器に入れ、遠心分離機で遠心することが挙げられる。遠心力により、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液が容器内に放出される。遠心の条件は特に制限されないが、例えば、１００ｒｐｍ～２０，０００ｒｐｍで１０～３０分遠心することが挙げられる。

目的タンパク質を含む緩衝液を抽出することで、緩衝液に含まれた状態で目的タンパク質を回収することができる。目的タンパク質の用途に応じて、目的タンパク質を緩衝液から分離精製する工程をさらに含んでもよい。目的タンパク質を緩衝液から精製する工程は、当業者によく知られた方法に従って行うことができるが、例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、透析、フィルターろ過、水性二相分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の方法又はこれらの組み合わせにより行うことができる。

また、本実施形態に係る方法は、植物体の破砕を必要としないため、植物体を破砕した抽出液に含まれる不要な植物体成分を除去する精製工程を必要としないが、目的タンパク質の純度をさらに上げる目的から、気孔、水孔又は断面から抽出した緩衝液に含まれる不純物等を除去する精製工程をさらに含むことを妨げるものではない。

また、本実施形態に係る方法は、目的タンパク質の存在及び／又は発現量を確認する工程を含んでもよい。当該工程は、目的タンパク質を含む緩衝液を抽出した後に行ってもよいし、分離精製等を行った後に行ってもよい。目的タンパク質の存在及び／又は発現量を確認する方法としては、例えば、ウエスタンブロッティング、及びアミノ酸配列解析等、当業者によく知られた方法に従って行うことができる。

目的タンパク質の抽出効率向上の観点から、本実施形態に係る方法は、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含むことが好ましい。この場合、例えば、植物体を緩衝液に浸漬させたままの状態で、加圧又は減圧により緩衝液を植物体内部に注入すること及び加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することを行ってもよい。また、例えば、植物体を緩衝液に浸漬させたままの状態で、加圧により緩衝液を植物体内部に注入すること及び減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することを行ってもよい。また、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含んでもよい。上記セットを３セット以上、４セット以上、５セット以上繰り返してもよい。２セット以上繰り返すことで、目的タンパク質の回収効率がより向上する。上記セットを繰り返す上限は特に制限されないが、例えば、１００セット以下、５０セット以下又は２０セット以下であってもよい。すべてのセット繰り返される間、植物体は緩衝液に浸漬させたままの状態であることが好ましい。

また、目的タンパク質の抽出効率向上の観点から、本実施形態に係る方法は、気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、浸透圧を利用して抽出することを含むことが好ましい。

〔目的タンパク質の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体を準備する工程、植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程、を含む。

アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体を準備する工程における、当該植物体を準備する方法については、上述した目的タンパク質の回収方法に記載の方法により実施することができる。

植物体の葉の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程等を含む、本実施形態に係る方法における具体的な態様等は、上述した目的タンパク質の回収方法における具体的な態様等を制限なく適用できる。

［実施例１アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の製造］
ホスホジエステラーゼ（目的タンパク質）の遺伝子を、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター（ＩｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ社製）にクローニングし、アグロバクテリウムに導入して形質転換して培養した後、培養液の混合液をニコチアナ・ベンサミアーナの葉にインフィルトレーションし、１週間ほどで感染葉を収穫した。

［実施例２目的タンパク質の抽出及び回収］
以下の３種類の方法により、目的タンパク質の抽出及び回収を行った。なお、各抽出で用いた緩衝液組成のＭｇＣｌ_２は、本実施例で対象とする酵素の安定化に必須である為添加している。

（加圧・減圧による緩衝液の注入及び抽出）
収穫した感染葉を、２ｍＭＭｇＣｌ_２を添加した重量比５倍量の緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ））に漬け込み、密封した耐圧シリンジ内に格納して、ピストンにより数秒加圧（＜０．１ＭＰａ）して常圧に戻し、数秒間減圧（＞－０．１ＭＰａ）して常圧に戻した。この加圧減圧処理を５セット繰り返して緩衝液を回収した。以下、この回収した緩衝液を加減圧抽出液ともいう。

（減圧による緩衝液の注入及び高浸透圧緩衝液への浸漬による抽出）
収穫した感染葉を、２ｍＭＭｇＣｌ_２を添加した緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ）に漬け込み、耐圧デシケーター内に設置して、真空ポンプで減圧（～０．１ＭＰａ）し、常圧に戻した。感染葉を回収して液滴をふき取り、重量比５倍量の高塩濃度緩衝液（２０ｍＭＰＢｐＨ７．４、０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２）に常温で１０～３０分間浸漬させて緩衝液を回収した。以下、この回収した緩衝液を浸透圧抽出液ともいう。

（物理的破壊による抽出）
収穫した感染葉を液体窒素で凍結して乳鉢・乳棒で磨り潰し、２ｍＭＭｇＣｌ_２を添加した重量比４倍量の緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ）を添加して、室温で１０分間懸濁したのち、遠心分離（４℃、１０分間、１２，０００×ｇ）して上清を回収した。以下、この回収した上清を破砕抽出液ともいう。

［実施例３各抽出液の分析］
実施例２において回収した各抽出液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット解析、総タンパク質含量測定、ホスホジエステラーゼ含量測定及びホスホジエステラーゼ活性測定にて分析した。

（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析）
試料を非還元性変性試料ローディング緩衝液で処理し、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。ゲルをＣＢＢ染色液（バイオラッド社製）で染色した。また、ゲルをＨＲＰ標識した抗ホスホジエステラーゼウサギポリクローナル抗体でウエスタンブロット解析し、ホスホジエステラーゼのバンドを特定した。

（総タンパク質含量測定）
ウシ血清アルブミンを参照標準としたＴＣＡ－ＢＣＡ法（ＭｉｃｒｏＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で、総タンパク質含量を測定した。

（ホスホジエステラーゼ活性測定）
ＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔ（アブカム社製）でホスホジエステラーゼ活性を測定した。

（ホスホジエステラーゼ含量測定（ＥＬＩＳＡ））
９６ウェルマイクロプレートを抗ホスホジエステラーゼウサギポリクローナル抗体で、５℃、１５～１８時間コーティングした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する０．０１ＭＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．４））でプレートを３回洗浄し、ＰＢＳＴ中の２％ウシ血清アルブミンで、２５℃、１時間ブロッキングした。精製ホスホジエステラーゼを標品としてＰＢＳＴで希釈し、試料をＰＢＳＴで希釈した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、標品と試料を加え、２５℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ標識した抗ホスホジエステラーゼウサギポリクローナル抗体を加え、２５℃、１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、発色基質（１－ＳｔｅｐＭＬｔｒａＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を加えて２５℃、２０分間インキュベートし、０．３１３Ｍ硫酸を加えて反応を停止した。プレートリーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ、パーキンエルマー社製）で波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

［実施例４抽出効果の比較（１）］
一般的な物理的破砕による抽出液（実施例２の破砕抽出液）と加圧・減圧による抽出液（実施例２の加減圧抽出液）の抽出成分を比較した。

破砕抽出液と加減圧抽出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析の結果を図１に示す。破砕抽出液（図１のレーン２）と比較して、加減圧抽出液（図１のレーン１）はホスホジエステラーゼが同等以上抽出されている。また、加減圧抽出液において、ホスホジエステラーゼ以外の植物由来成分は検出されなかった。

総タンパク質含量測定、ホスホジエステラーゼ含量測定及びホスホジエステラーゼ活性測定、並びに各測定結果につき感染葉あたりの物理的破砕による抽出量を１００％としたときの加圧・減圧による抽出量を表１に示す。

破砕抽出液と比較して、加減圧抽出液の総タンパク質抽出量は８分の１に減少しているにもかかわらず、ホスホジエステラーゼの抽出量は２倍以上増加した。加圧・減圧による抽出は、不要な植物成分の抽出を大幅に抑制しつつ、発現タンパク質を高効率に抽出可能な方法であることが示された。

［実施例５抽出効果の比較（２）］
一般的な物理的破砕による抽出液（実施例２の破砕抽出液）と、高浸透圧緩衝液への浸漬による抽出液（実施例２の浸透圧抽出液）の抽出成分を比較した。

破砕抽出液と浸透圧抽出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析の結果を図２に示す。破砕抽出液（図２のレーン１）と比較して、浸透圧抽出液（図２のレーン２）はホスホジエステラーゼが同程度抽出されている。また、浸透圧抽出液において、ホスホジエステラーゼ以外の植物由来成分は検出されなかった。

総タンパク質含量測定、ホスホジエステラーゼ含量測定及びホスホジエステラーゼ活性測定、並びに各測定結果につき感染葉あたりの物理的破砕による抽出量を１００％としたときの高浸透圧緩衝液への浸漬による抽出量を表２に示す。

破砕抽出液と比較して、浸透圧抽出液の総タンパク質抽出量が８分の１に減少しているにもかかわらず、ホスホジエステラーゼの抽出量は同程度であった。高浸透圧緩衝液への浸漬による抽出は、不要な植物成分の抽出を大幅に抑制しつつ、発現タンパク質を効率的に抽出可能な方法であることが示唆された。

Claims

アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程
を含む、アポプラストにおいて発現する目的タンパク質の回収方法であって、
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧により緩衝液を注入することを含むか、又は気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧（但し、遠心分離による加圧を除く）又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、回収方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、請求項１に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体を浸漬することを含む、請求項１に記載の方法。
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程
を含む、アポプラストにおいて発現する目的タンパク質の回収方法であって、
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、アポプラストに含まれる緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体を浸漬することを含む、回収方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含む、請求項４に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、請求項４又は５に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、請求項４に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも高い塩濃度の緩衝液に植物体を浸漬することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、請求項１～３、５及び７のいずれか一項に記載の方法。
加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、請求項１～３、６及び７のいずれか一項に記載の方法。
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体を準備する工程、
植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法であって、
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧により緩衝液を注入することを含むか、又は気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧（但し、遠心分離による加圧を除く）又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、製造方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、請求項１１に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体を浸漬することを含む、請求項１１に記載の方法。
アポプラストにおいて目的タンパク質を発現する植物体を準備する工程、
植物体の気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程、及び
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法であって、
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、アポプラストに含まれる緩衝液よりも浸透圧の高い緩衝液に植物体を浸漬することを含む、製造方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含む、請求項１４に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含む、請求項１４に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を注入することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、加圧又は減圧により緩衝液を抽出することを含み、
気孔、水孔又は断面から植物体内部に緩衝液を注入する工程及び気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程を１セットとし、これを２セット以上繰り返すことを含む、請求項１４に記載の方法。
気孔、水孔又は断面から植物体内部の緩衝液を抽出する工程が、気孔、水孔又は断面から植物体内部に注入した緩衝液よりも高い塩濃度の緩衝液に植物体を浸漬することを含む、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
加圧又は減圧により植物体内部に緩衝液を注入することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、請求項１１～１３、１５及び１７のいずれか一項に記載の方法。
加圧又は減圧により植物体内部の緩衝液を抽出することが、耐圧容器内で、気体、液体、プレス機又はその組み合わせを使用して加圧又は減圧することを含む、請求項１１～１３、１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。