JP7650480B2 - ヒト条件的不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法 - Google Patents

Description

特許法第３０条第２項適用 （１）▲１▼発行日：令和１年（２０１９年）６月２０日 ▲２▼刊行物：１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（開催場所：米国、フロリダ州マイアミ、Ｍａｒｒｉｏｔｔ Ｍｉａｍｉ Ｂｉｓｃａｙｎｅ Ｂａｙ ｈｏｔｅｌ、開催日時：令和１年６月２５日）の要旨集で公開

特許法第３０条第２項適用 （２）▲１▼開催日：令和１年（２０１９年）６月２５日 ▲２▼集会名、開催場所：１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、米国、フロリダ州マイアミ、Ｍａｒｒｉｏｔｔ Ｍｉａｍｉ Ｂｉｓｃａｙｎｅ Ｂａｙ ｈｏｔｅｌで公開

特許法第３０条第２項適用 （３）▲１▼発行日：令和１年（２０１９年）１０月１５日 ▲２▼刊行物：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１９ Ｎｏｖ ４；１６（１１）：４４６１－４４７１で公開

特許法第３０条第２項適用 （４）▲１▼発行日：令和１年（２０１９年）１１月２６日 ▲２▼刊行物：日本薬物動態学会第３４回年会（開催場所：茨城県つくば市、つくば国際会議場、開催日時：令和１年１２月１０日）の要旨集で公開

特許法第３０条第２項適用 （５）▲１▼開催日：令和１年（２０１９年）１２月１０日 ▲２▼集会名、開催場所：日本薬物動態学会 第３４回年会、茨城県つくば市、つくば国際会議場で公開

本発明は、ヒト条件的不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法に関する。

血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）は、脳微小血管内皮細胞（Ｂｒａｉｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ；ＢＭＥＣ）と、その周囲に存在するアストロサイトやペリサイトなどの支持細胞によって形成される（非特許文献１、非特許文献２）。ＢＭＥＣは、ＢＢＢの主要な構成要素であるが、ＢＢＢ特異的な性質を獲得するには、アストロサイトとペリサイトの双方が必要であり、またこれらは共にＢＢＢの制御および維持に重要な役割を果たす（非特許文献３）。

ＢＢＢは、末梢と中枢神経系（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ；ＣＮＳ）との間の重要な境界面を提供し、独立した生理学的恒常性を維持し、かつ、薬剤などの潜在的に有害な化学物質が脳に入るのを防ぐ（非特許文献４、非特許文献５）。ＢＢＢを構成する２つの主な分子実体は、（１）薬剤の脳内への傍細胞流入を厳密に制限する細胞間ジャンクション（タイトジャンクションおよび接着ジャンクション）；および（２）ＢＭＥＣの頂端膜側で種々の薬剤を積極的に運び出す複数の排出トランスポーター（Ｐ糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）および乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）を含む）である（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。

このような特殊な機能のため、優れたＢＢＢ透過性を持つ薬物候補の特定は、ＣＮＳ薬の開発における大きな課題であった。このような状況の下、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＢＢＢモデルは、ＢＢＢ透過性を有するＣＮＳ薬の特定プロセスを促進するための貴重なツールを提供することが期待される。

ＢＭＥＣの単一培養システムはｉｎ ｖｉｖｏのＢＢＢを正確に模倣しないため、アストロサイトおよび／またはペリサイトとの共培養が、高度かつ特殊な機能を有するＢＢＢモデルの開発に有用な方法であると考えられている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。これを達成するために、さまざまな動物種から得られたＢＢＢ細胞が広く使用されているが、動物とヒトのＢＢＢ機能には、ＢＢＢトランスポーターの発現レベルが異なることによって示されるように、いくつかの相違点があることが明らかになっている（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。したがって、ＣＮＳ薬の開発には、ヒト由来のＢＢＢモデルが必要である。

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本発明は、ヒト条件的不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法を提供することを目的とする。

先述のような背景の下、本発明者らは、２つ不死化遺伝子、すなわち、（１）テロメア長を伸長し、成長停止、および細胞分割に伴うテロメア短縮によって生ずるゲノム損傷に対抗するヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子；（２）温度感受性シミアンウイルス４０大腫瘍抗原（ｔｓＳＶ４０Ｔ）遺伝子をヒトの初代ＢＢＢ細胞へと導入することによって、ＢＭＥＣ、アストロサイトおよび脳ペリサイトに由来する、ヒト不死化細胞を樹立した（参考文献２４、参考文献２５、参考文献２６）。

ｔｓＳＶ４０Ｔは、条件付き不死化特性を細胞へ付与する。具体的には、３３℃の培養温度で安定であり、細胞周期を促進するが、３７℃以上の温度において、急速に分解される。それによって、不死化シグナルが消失すると同時に細胞は再分化する（参考文献２４、参考文献２５、参考文献２６、参考文献３０、参考文献３１）。上記２つの遺伝子の機能に基づき、ヒト不死化ＢＢＢ細胞は、継続的な増殖プロファイルを示す重要な細胞特性を保持する。この点は、多様な適用可能性に鑑みて、薬剤開発における、従来の細胞種に対する明らかな利点である。

これらのヒト不死化ＢＢＢ細胞は、薬剤透過性研究におけるヒトＢＢＢモデルの開発に貢献することが期待される。本発明者らは、これまでに本発明者らが樹立したヒト不死化アストロサイト細胞株（ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５）、ヒト不死化脳ペリサイト細胞株（ＨＢＰＣ／ｃｉ３７）およびヒト不死化脳微小血管内皮細胞株（ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８）を用いて、ヒト不死化細胞に基づく多細胞ＢＢＢモデルを開発し、当該ＢＢＢモデルの特性決定を行った。

すなわち、本発明は：
［１］（ｉ）ヒト条件的不死化ペリサイトを第１の培地に播種して培養するペリサイト培養工程と、
（ｉｉ）前記培養したヒト条件的不死化ペリサイトを第２の培地において分化させるペリサイト分化工程と、
（ｉｉｉ）ヒト条件的不死化アストロサイトを第３の培地に播種して培養するアストロサイト培養工程と、
（ｉｖ）前記培養したヒト条件的不死化アストロサイトを第４の培地において分化させるアストロサイト分化工程と、
（ｖ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を第５の培地に播種して、前記播種したヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培養する脳微小血管内皮細胞培養工程と
を含み、
前記ペリサイト培養工程（ｉ）および／または前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が形成され、
前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）および／または前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）において、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物が形成され、
前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化が、前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養温度とは異なる温度で行われ、
前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が、前記アストロサイト培養工程における培養温度とは異なる温度で行われ、
前記工程（ｉｉ）および前記工程（ｉｖ）の後で、前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）が行われ、
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が形成され、
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養が、第６の培地中における前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養と共に行われ、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが相互作用することが可能なように配置されている、多細胞血液脳関門モデルの製造方法；
［２］前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）における、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養が、前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化および／または前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とは異なる温度で行われる、［１］に記載の製造方法；
［３］前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養が３２～３４℃の温度範囲で行われ、前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化が３５～３９℃の温度範囲で行われ、および／または
前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養が３２～３４℃の温度範囲で行われ、前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が３５～３９℃の温度範囲で行われる、［１］または［２］に記載の製造方法；
［４］前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）における、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養が、３２～３４℃の温度範囲で行われる、［１］～［３］のいずれか１項に記載の製造方法；
［５］前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養および前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養が、それぞれ独立して、播種後１２～７２時間行われる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の製造方法；
［６］前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化および前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が、それぞれ独立して、１２～７２時間行われる、［１］～［５］のいずれか１項に記載の製造方法；
［７］前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）が、播種後１２～２４０時間行われる、［１］～［６］のいずれか１項に記載の製造方法；
［８］前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養と前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養とが、同時に行われる、［１］～［７］のいずれか１項に記載の製造方法；
［９］前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化と前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とが、同時に行われる、［１］～［８］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１０］前記ペリサイト培養工程（ｉ）および／または前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）において形成されるヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が層であり、および／または、
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において形成されるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が層である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１１］前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において形成されるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が単層である、［１］～［１０］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１２］前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の一方の側に、前記ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物が位置し、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の他方の側に、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が位置する、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１３］前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが、多孔性基材のそれぞれの面に形成されていることによって、前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが相互作用することが可能なように配置されている、［１］～［１２］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１４］前記多孔性基材が、細胞外マトリックスを構成する分子によって被覆されている、［１３］に記載の製造方法；
［１５］前記第３の培地と前記第４の培地とは、前記第３の培地に含まれる血清が前記第４の培地には含まれない点において相違する、［１］～［１４］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１６］前記第５の培地は、成長因子を含まない培地である、［１］～［１５］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１７］前記第６の培地が、第１の培地、第２の培地、第３の培地、第４の培地および第５の培地のいずれとも異なる、［１］～［１６］のいずれか１項に記載の製造方法；
［１８］［１］～［１７］のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、多細胞血液脳関門モデル；
［１９］（Ａ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物と、
（Ｂ）ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、
（Ｃ）ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物と、
（Ｄ）前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞のための培地と、
（Ｅ）前記ヒト条件的不死化ペリサイトおよび前記ヒト条件的不死化アストロサイトのための培地と
を含む多細胞血液脳関門モデルであって、
前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）と前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）とが相互作用することが可能なように配置されており、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）の一方の側に、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が位置し、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）の他方の側に、前記ヒト条件的不死化アストロサイト（Ｃ）を含む培養物が位置する、多細胞血液脳関門モデル；
［２０］前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が層であり、および／または、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）が層である、［１９］に記載の多細胞血液脳関門モデル；
［２１］前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が単層である、［１９］または［２０］に記載の多細胞血液脳関門モデル。
［２２］多孔性基材をさらに含み、
前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が多孔性基材の一方の面を被覆し、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）が多孔性基材の他方の面を被覆すする、［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の多細胞血液脳関門モデル；
［２３］前記培地（Ｄ）が、成長因子を含まない培地であり、
前記培地（Ｅ）が、神経細胞用培地である、［１９］～［２２］のいずれか１項に記載の多細胞血液脳関門モデル
に関する。

本発明によれば、ヒト不死化細胞を用いた血液脳関門モデルを提供することができる。

図１Ａは、顕微鏡で観察された、条件的不死化ヒト脳微小血管内皮細胞株ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８の細胞形態を示す。 図１Ｂは、免疫細胞化学により検出した、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞における内皮細胞マーカー（ｖＷＦおよびＣＤ３１）のタンパク質発現を示す。核の対比染色には４’，６－Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を用いた（青色）。試験は３回繰り返し、代表的な画像を示した。 図１Ｃは、免疫細胞化学により検出した、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞における不死化遺伝子（ｔｓＳＶ４０ＴおよびｈＴＥＲＴ）のタンパク質発現を示す。試験は３回繰り返し、代表的な画像を示した。 図１Ｄは、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞の増殖能力を示す。３３℃または３７℃で培養したＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞の増殖能力を、播種から３、５および９日後に細胞数を直接計測することによって調べた。各値は、３つの独立した試験から得られた値の平均±ＳＤであり、各計測は２回行った。 図１Ｅは、ｑＰＣＲによって評価した各種ｍＲＮＡ発現量の比較解析結果を示す。ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞およびヒト肝類洞内皮細胞株（ＨＬＳＥＣ/ｃｉＪ、非脳血管内皮細胞の例として使用）におけるＢＢＢに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。標的は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）、多剤耐性関連タンパク質４（ＭＲＰ４）、グルコーストランスポーター１（ＧＬＵＴ１）、ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＭＦＳＤ）２Ａ、Ｐ－グライコプロテイン（Ｐ－ｇｐ）、モノカルボン酸トランスポーター８（ＭＣＴ８）およびトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。値は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡレベルに対して標準化し、結果は、３つの独立した試験から得られた値の平均±ＳＤであり、各試験におけるｑＰＣＲは２回行った。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。 図２Ａは、ヒト不死化細胞に基づくＢＢＢモデルの作製手順の概要を示す。共培養の開始の２日前（Ｄａｙ－２）に、ヒトアストロサイト（ＨＡＳＴＲ）／ｃｉ３５細胞およびヒト脳ペリサイト（ＨＢＰＣ）／ｃｉ３７をそれぞれ、アストロサイト成長培地（ＡＧＭ）およびペリサイト培地（ＰＭ）を用いて、タイプＩＶコラーゲン／フィブロネクチン被覆培地インサートまたはプレートに播種した。次いで、Ｄａｙ－１に、培養温度を３３℃から３７℃へと変更し、アストロサイト成長培地（ＡＧＭ）をアストロサイト分化培地（ＡＤＭ）に変更した（図中の「Ｓｔｅｐ２：３５／３７ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」）。Ｄａｙ０で、ＶＥＧＦおよびｈＥＧＦを含まないＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖａｓ－Ｖ／Ｅ不含培地）を用いて、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞を培養インサート（頂端膜側）へ播種する一方で、脳実質培地（ＢＰＭ）を培養ウェル（基底側）に用いた。共培養開始から各試験が行われるまで細胞は３３℃に維持した（図中、「Ｓｔｅｐ ３：１８／３５／３７ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ」）。 図２Ｂは、異なる細胞配置パターンで作製した６種類のＢＢＢモデルを示す。図中、「Ｅ」、「Ａ」、「Ｐ」および「０」はそれぞれ、「ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞」、「ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞」、「ＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞」および「細胞なし」を意味する。アルファベットの順序は、各細胞種の培養位置を意味し、インサートの内側、インサートの外側およびウェルの底部の順である。Ｅ００モデルは、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞の単独培養モデルである。ＥＰ０およびＥＡ０モデルは、インサート内側のＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８とインサート外側のＨＢＰＣ／ｃｉ１３７細胞またはＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞とを共培養したものである。Ｅ０Ａモデルは、インサート内側のＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞と、ウェル底部のＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞とを共培養したものである。ＥＰＡモデルは、インサート内側にＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８、インサート外側にＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞、ウェル底部にＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞を播種したものである。ＥＡＰモデルは、インサート内側にＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８、インサート外側にＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞、ウェル底部にＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞をプレートの底部に播種したものである。 図３Ａは、図２に関して述べた方法に従って２４ウェルトランスウェル培養システム中で作製した６つのＢＢＢモデルについて、共培養開始後のＤａｙ１に測定した経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の値を示すものである。結果は、Ｅ００モデルから得られた値に対する倍率差で示される。値は、３つの独立した試験の平均（ＳＤ）として表され、抵抗値の測定は各回２回行った。図中、「Ｅ」は、「ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞」、「Ａ」は、「ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞」、「Ｐ」は「ＨＢＰＣ／ｃｉ３７」を示す。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１ ｖｓ Ｅ００、##, ｐ ＜ ０．０１； ###, ｐ ＜ ０．００１ ｖｓ Ｅ０Ａ。 図３Ｂは、共培養１日後に測定したＥ００およびＥＰＡモデル（１２ウェル）のＴＥＥＲ値を示す。結果は、３つの独立した試験から得られた値の平均±ＳＤであり、各試験は２回行った。*ｐ＜０．００１。 図４Ａは、ヒト不死化細胞によるＢＢＢモデルにおける細胞間ジャンクション関連遺伝子の発現プロファイルを示す。Ｅ００およびＥＰＡモデル（１２ウェル）における、細胞間ジャンクション関連遺伝子（ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ １ ［ＺＯ－１］、血管内皮［ＶＥ］－カドヘリンおよびβ－カテニン）の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲで試験した。値は、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルを用いて標準化し、Ｅ００モデルの値に対する倍率で表される。データは、３回の独立した実験から得られた値の平均（およびＳＤ）である。各ｑＰＣＲは各々、二重の複製サンプル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を用いて行った（*Ｐ＜０．０５）。 図４Ｂは、Ｅ００モデル（１２ウェル）およびＥＰＡモデル（１２ウェル）におけるＺＯ－１、Ｅ－カドヘリンおよびβ－カテニンのタンパク質発現および局在を免疫細胞染色（ＩＣＣ）によって試験した結果である。核対比染色（青色）には、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いた。すべての実験は３回独立して繰り返しており、図には代表的な写真を示している。 図５は、ヒト不死化細胞によるＢＢＢモデルにおける排出トランスポーターの機能を試験した結果であり、具体的には、Ｅ００モデル（１２ウェル）およびＥＰＡモデル（１２ウェル）における、ローダミン１２３（Ｒ１２３；Ｐ糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の基質）の双方向輸送アッセイの結果である。Ｒ１２３（５μＭ）を、インサートチャンバーまたはウェルの底に添加し、２０、４０または６０分、静置した。反対側から培地を回収し、Ｒ１２３濃度を測定した。測定した濃度に基づき、頂端膜側から基底側への透過係数ＰｅＡＢおよび基底側から頂端膜側への透過係数ＰｅＢＡの値を計算した。排出率（ＥＲ）はＥＲ ＝ ＰｅＢＡ／ＰｅＡＢに従って計算した。データは、３回の独立した実験から得られた値の平均（およびＳＤ）である。各実験は各々、二重の複製サンプル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を用いて行われた（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）。 図６Ａは、Ｅ００モデル（１２ウェル）およびＥＰＡモデル（１２ウェル）におけるＰ－ｇｐおよびＢＣＲＰのｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲによって試験した結果を示す。値は、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルを用いて標準化し、Ｅ００モデルの値に対する倍率差として表している。データは、３回の独立した実験から得られた平均（およびＳＤ）として示している。各ｑＰＣＲは各々、二重の複製サンプル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を用いて行った（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）。 図６Ｂは、Ｅ００モデル（１２ウェル）およびＥＰＡモデル（１２ウェル）におけるＰ－ｇｐおよびＢＣＲＰのタンパク質発現と細胞内局在をＩＣＣによって試験した結果を示す。比較のために、β－カテニンについても試験した。ＥＰＡモデルについては、ｘ－ｙ面画像を各図の中央に、ｙ－ｚ面画像およびｘ－ｚ面画像（ｘおよびｙ位置をそれぞれ、水平の白線および垂直の白線によって示す）を上および右に示した。核対比染色（青色）には、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いた。すべての実験は３回独立して繰り返しており、図には代表的な写真を示している。 図７は、Ｅ００モデル（１２ウェル）およびＥＰＡモデル（１２ウェル）におけるルシファーイエロー（ＢＢＢ不透過性マーカー）の透過性アッセイの結果を示す。頂端膜側にルシファーイエロー（１０μＭ）を添加した後、３０分、６０分または９０分静置した。ウェルから培地を回収し、ルシファーイエローの濃度を決定した。この濃度に基づき、透過係数（Ｐｅ）値を計算した。データは、３回の独立した実験から得られた平均（およびＳＤ）として示している。各実験は各々、二重の複製サンプル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を用いて行われた（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１ｖｓＥ００）。 図８は、基底側に種々の培地を用いて作製したＥＰＡモデルについて、共培養開始後のＤａｙ１に測定した経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の値の結果を示すものである。比較としてＥ００モデルとＥＰ０モデルを用いた。得られたＴＥＥＲ値から、基底側の培地にＢＰＭ（第６の培地）を用いることで、アストロサイトおよびペリサイトとの共培養効果が認められた。試験は２回行った。

以下、本発明についてより詳細に説明する。

本発明の第１の側面は、ヒト条件的不死化細胞を用いた多細胞血液脳関門モデルの製造方法を提供する。具体的には、本製造方法によって提供される多細胞血液脳関門モデルは、ヒトのインビトロの血液脳関門モデルである。本製造方法は、以下に説明する工程を含むものである。

すなわち、本発明にかかる多細胞血液脳関門モデルの製造方法は、下記：
（ｉ）ヒト条件的不死化ペリサイトを第１の培地に播種して培養するペリサイト培養工程と、
（ｉｉ）前記培養したヒト条件的不死化ペリサイトを第２の培地において分化させるペリサイト分化工程と、
（ｉｉｉ）ヒト条件的不死化アストロサイトを第３の培地に播種して培養するアストロサイト培養工程と、
（ｉｖ）前記培養したヒト条件的不死化アストロサイトを第４の培地において分化させるアストロサイト分化工程と、
（ｖ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を第５の培地に播種して、前記播種したヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培養する脳微小血管内皮細胞培養工程と
を含む。以下、各工程について詳述する。

＜ペリサイト培養工程（工程（ｉ））＞
本工程では、ヒト条件的不死化ペリサイトを培地に播種して培養する。本工程で培養されたヒト条件的不死化ペリサイトは、後続のペリサイト分化工程において、分化に供される。本工程におけるヒト条件的不死化ペリサイトの培養は、例えば３１～３５℃の範囲内、好ましくは３２～３４℃の範囲内、より好ましくは３３℃で行われる。より低い温度やより高い温度で培養すると、細胞の増殖速度が低下する可能性がある。

ペリサイト培養工程（ｉ）における培養は、例えば播種後１２～７２時間、好ましくは１８～６０時間、より好ましくは２０～４８時間、さらに好ましくは２２～３６時間行われる。一態様において、ペリサイト培養工程（ｉ）における培養は、播種後２４時間行われる。より短い時間培養を行うと、十分に細胞が接着・進展・増殖しない可能性があり、より長い時間培養を行うと過増殖が懸念され、また、モデル作製に時間がかかり、効率的ではない。

ヒト条件的不死化ペリサイトは例えば、図２Ｂに示すような、平坦な面を有する基材に播種されることが好ましいが、培養物を形成する限り、これに限定されない。平坦な面を有する基材に播種される場合は、後述するように、当該平坦な面の反対側に、脳微小血管内皮細胞培養工程において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が層状に形成される。

本工程では、ペリサイトの培養に通常用いられる当該分野で既知の培地を使用することができ、例えば、市販品としては、ペリサイト培地（Ｓｃｉｅｎ Ｃｅｌｌ社製）が挙げられる。

＜ペリサイト分化工程（工程（ｉｉ））＞
本工程では、ペリサイト培養工程において培養したヒト条件的不死化ペリサイトを分化させる。本工程におけるヒト条件的不死化ペリサイトの分化は、前記ペリサイト培養工程における培養温度とは異なる温度で行われる。ヒト条件的不死化ペリサイトの分化は、前記ペリサイト培養工程における培養温度よりも高い温度で行われ、例えば１℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは３℃以上、特に好ましくは４℃以上高い温度で行われる。より具体的には、ヒト条件的不死化ペリサイトの分化は、前記ペリサイト培養工程における培養温度よりも、例えば１～７℃高い温度、好ましくは２～６℃高い温度、より好ましくは３～５℃高い温度、さらに好ましくは３．５～４．５℃高い温度、最も好ましくは４℃高い温度で行われる。

本工程における、ヒト条件的不死化ペリサイトの分化は具体的には、例えば３４～４０℃、好ましくは３５～３９℃、より好ましくは３６～３８℃の温度範囲内で行われる。一態様において、当該分化は３６．５～３７．５℃の温度範囲内で行われる。別の一態様において、当該分化は３７℃で行われる。

実施例において後述するように、本発明者らは、具体的な実験においては、３７℃という、増殖は抑えつつも分化を促進する温度条件で分化を行うことにより、好適な血液脳関門モデルを得ることに成功した。これまで、３９℃において細胞の不死化シグナルが完全に解除されることが報告されていたが、本発明者らは、３７℃でも不死化シグナルの働きを弱めて分化を促進できることを示した。本発明にかかる製造方法は、より低い温度で分化を促進できるという点で汎用性がより高まった方法である。

ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化は、例えば１２～７２時間、好ましくは１８～６０時間、より好ましくは２０～４８時間、さらに好ましくは２２～３６時間行われる。一態様において、ペリサイト分化工程（ｉｉｉ）における分化は、２４時間行われる。

本工程では、ペリサイトの分化に通常用いられる当該分野で既知の培地を使用することができ、例えば、ペリサイト用培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ）が挙げられるが、これに限定されない。当該培地にはさらに、血清、成長因子、抗生剤などを添加してもよい。血清としてはＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｗａｌｔｍａｎ, ＣＡ）など、成長因子としては、Ｐｅｒｉｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）など、抗生剤としては、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔ、Ｗａｋｏ, Ｏｓａｋａ）、ブラストサイジンＳ（ｎａｃａｌｉ ｔｅｓｑｕｅ, Ｋｙｏｔｏ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい一態様において、ペリサイト分化工程で用いられる培地（第２の培地）は、ペリサイト培養工程で用いられる培地（第１の培地）と同一であるか、または、第１の培地と第２の培地とは、第１の培地に含まれる血清が第２の培地には含まれない点において相違する。第２の培地が血清を含有しない場合、含有する場合と比較して、ペリサイトの分化が促進される。一態様では、ペリサイト分化工程で用いられる培地（第２の培地）は、ペリサイト培養工程で用いられる培地（第１の培地）と同一である。

ペリサイト培養工程（ｉ）および／またはペリサイト分化工程（ｉｉ）において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が形成される。ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の形状は、層または塊であってよい。一態様において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物は、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む層である。当該ヒト条件的不死化ペリサイトを含む層は、単層および複数層であってよく、好ましくは単層である。ヒト条件的不死化ペリサイトを含む層が単層であれば、内皮において形成されるバリア機能の過大評価を回避することができる。

本明細書において「層」の語が、ヒト条件的不死化ペリサイト、ヒト条件的不死化アストロサイトおよびヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞に関して使用される場合、「層」の語には、細胞同士が一部重なる部分を有する層や、細胞が存在しない隙間部分を有する層も包含されるものとする。すなわち、本明細書において「層」の語には、完全で均一な構造を有する層以外にも、層様の構造およびシート状の構造が包含される。

＜アストロサイト培養工程（工程（ｉｉｉ））＞
本工程では、ヒト条件的不死化アストロサイトを培地に播種して培養する。本工程で培養されたヒト条件的不死化アストロサイトは、後続のアストロサイト分化工程において、分化に供される。本工程におけるヒト条件的不死化アストロサイトの培養は、例えば３１～３５℃の範囲内、好ましくは３２～３４℃の範囲内、より好ましくは３３℃で行われる。

アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養は、例えば播種後１２～７２時間、好ましくは１８～６０時間、より好ましくは２０～４８時間、さらに好ましくは２２～３６時間行われる。培養をより長い時間行うと、細胞の機能が低下する可能性がある。一態様において、アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養は、播種後２４時間行われる。

ヒト条件的不死化アストロサイトは例えば、図２Ｂに示すような、内側に更なる容器を挿入可能な容器内に播種されることが好ましい。一態様において、当該容器は、平坦な底面を有する。

本工程でアストロサイトを播種する第３の培地としては、アストロサイトの培養に通常用いられる当該分野で既知の培地を使用することができ、例えば、市販品としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＬＯＮＺＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなど）が挙げられるが、これらに限定されない。第３の培地には、適宜、抗生剤、血清、Ｎ２サプリメント（Ｗａｋｏ）などが添加されてよい。

＜アストロサイト分化工程（工程（ｉｖ））＞
本工程では、アストロサイト培養工程において培養したヒト条件的不死化アストロサイトを分化させる。本工程におけるヒト条件的不死化アストロサイトの分化は、前記アストロサイト培養工程における培養温度とは異なる温度で行われる。ヒト条件的不死化アストロサイトの分化は、前記アストロサイト培養工程における培養温度よりも高い温度で行われ、例えば１℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは３℃以上、特に好ましくは４℃以上高い温度で行われる。より具体的には、ヒト条件的不死化アストロサイトの分化は、前記アストロサイト培養工程における培養温度よりも、例えば１～７℃高い温度、好ましくは２～６℃高い温度、より好ましくは３～５℃高い温度、さらに好ましくは３．５～４．５℃高い温度、最も好ましくは４℃高い温度で行われる。

本工程における、ヒト条件的不死化アストロサイトの分化は具体的には、例えば３４～４０℃、好ましくは３５～３９℃、より好ましくは３６～３８℃の温度範囲内で行われる。一態様において、当該分化は３６．５～３７．５℃の温度範囲内で行われる。別の一態様において、当該分化は３７℃で行われる。

実施例の項において後述するように、本発明者らは、具体的な実験においては、３７℃という、増殖は抑えつつも分化を促進する温度条件で分化を行うことにより、好適な血液脳関門モデルを得ることに成功した。これまで、３９℃において細胞の不死化シグナルが完全に解除されることが報告されていたが、本発明者らは、３７℃でも不死化シグナルの働きを弱めて分化を促進できることを示した。本発明にかかる製造方法は、より低い温度で分化を促進できるという点で汎用性がより高まった方法である。

アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化は、例えば１２～７２時間、好ましくは１８～６０時間、より好ましくは２０～４８時間、さらに好ましくは２２～３６時間行われる。より長い時間、分化を行うと、細胞の機能が低下する可能性がある。一態様において、アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化は、２４時間行われる。

本工程でアストロサイトを分化させる第４の培地としては、アストロサイトの分化に通常用いられる当該分野で既知の分化用培地を使用することができ、例えば、市販品としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＬＯＮＺＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい一態様において、アストロサイト分化工程で用いられる培地（第４の培地）は、アストロサイト培養工程で用いられる培地（第３の培地）とは、第３の培地に含まれる血清を含まない点において相違する。

ここで、血清としては例えば、ＦＢＳなどが挙げられるがこれらに限定されない。第３の培地が血清を含むことにより、アストロサイトの細胞増殖が促進され、第４の培地が血清を含まないことにより、アストロサイトの分化が抑制されることを防ぐ。

別の一態様において、アストロサイト分化工程で用いられる培地（第４の培地）は、アストロサイト分化促進剤を含んでもよい。アストロサイト分化促進剤としては、例えば、ｃＡＭＰおよびそのアナログ（ｄＢｃＡＭＰなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

一態様において、第４の培地は、適宜、抗生剤を含んでもよい。別の一態様において、第３の培地が抗生剤を含む場合、第４の培地は、第３の培地に含まれる抗生剤を含まなくてもよい。抗生剤としては例えば、ブラストサイジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）および／またはアストロサイト分化工程（ｉｖ）において、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物が形成される。ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物の形状は、層または塊であってよい。一態様において、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物は、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む層である。当該ヒト条件的不死化アストロサイトを含む層は、単層および複数層であってよい。また、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物は、細胞塊や複雑な立体形状をとってもよい。

ペリサイト培養工程（ｉ）における培養とアストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養とは、例えば、上記の時間範囲内で、それぞれ独立して行われる。好ましい一態様において、ペリサイト培養工程（ｉ）における培養とアストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養とは、上記の時間範囲内で、同時に行われる。これらの培養を同時に行うことで、モデル作製に要する時間を短縮することができる。

また、ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化とアストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とは、例えば、上記の時間範囲内で、それぞれ独立して行われる。好ましい一態様において、ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化とアストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とは、上記の時間範囲内で、同時に行われる。これらの分化を同時に行うことで、モデル作製に要する時間を短縮することが可能である。

＜脳微小血管内皮細胞培養工程（工程（ｖ））＞
本工程は、ペリサイト分化工程（工程（ｉｉ））およびアストロサイト分化工程（工程（ｉｖ））の後で行われる。本工程では、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培地に播種して、播種したヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培養する。

本工程において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が形成される。ここで、好ましくは、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物は層である。一態様において、脳微小血管内皮細胞を含む培養物は単層である。ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む層が単層であれば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血液脳関門の構造をより忠実に模すことができる。

本工程において、播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養は、第６の培地におけるヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養およびヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養と共に行われる。このように共培養することにより、生体内の脳環境により近い状態を再現することができ、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞における血液脳関門機能を向上させることができる。

脳微小血管内皮細胞培養工程において、播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養およびヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養は、ペリサイト分化工程（工程（ｉｉ））における分化および／またはアストロサイト分化工程（工程（ｉｖ））における分化とは、異なる温度で行われることが好ましい。分化工程（ｉｉ）および／または分化工程（ｉｖ）における分化温度よりも低い温度、例えば１℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは３℃以上、特に好ましくは４℃以上低い温度で行われる。より具体的には、例えば１～７℃低い温度、好ましくは２～６℃低い温度、より好ましくは３～５℃低い温度、さらに好ましくは３．５～４．５℃低い温度、最も好ましくは４℃低い温度で行われる。

一態様において、本工程におけるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、ヒト条件的不死化ペリサイトおよびヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養は、例えば３１～３５℃の範囲内、好ましくは３２～３４℃の範囲内、より好ましくは３３℃で行われる。

本工程におけるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、ヒト条件的不死化ペリサイトおよびヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養は、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の播種後、例えば１２時間以上、好ましくは１２～２４０時間、より好ましくは１２～１５０時間、さらに好ましくは１８～１２０時間、特に好ましくは、２４～１２０時間行われる。培養時間が上記範囲よりも長いと、脳微小血管内皮細胞の機能が保たれない可能性があることに加え、モデルの作製に時間がかかりすぎ、効率的ではない。一方、培養時間が上記範囲よりも短いと、脳微小血管内皮細胞が十分に増殖しないか、または層を形成できない可能性がある。一態様において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養ならびにヒト条件的不死化ペリサイトおよびヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養は、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の播種後２４時間行われる。

ここで、形成されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物は、生体内の血液脳関門（ＢＢＢ）構造の頂端膜側を模すものであり、先の工程において形成された、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物とヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物とは、ＢＢＢ構造の基底側を模すものである。

本工程におけるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養では、第５の培地として、当該分野で既知の培地を使用することができ、例えば、市販品としてはＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ （ＫＵＲＡＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）が挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養における第５の培地は、成長因子を含まない培地である。一態様では、第５の培地として、ＶＥＧＦおよびｈＥＧＦやブラストサイジンＳを含まないＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖａｓ－Ｖ／Ｅ不含培地）を使用することができる。第５の培地は、適宜、抗生剤を含んでよい。ここで成長因子としては、ＶＥＧＦ、ｈＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦなどが挙げられるがこれらに限定されない。また、抗生剤としては、ブラストサイジン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどが挙げられるがこれらに限定されない。

本工程における、ヒト条件的不死化ペリサイトおよびヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養では、第６の培地として、当該分野で既知の培地を使用することができる。好ましくは、第６の培地は、第１の培地、第２の培地、第３の培地、第４の培地および第５の培地のいずれとも異なるものである。第６の培地としては、例えば、市販品を用いてもよい。第６の培地として、神経基底培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられるがこれに限定されない。当該培地には、適宜、抗生剤、Ｎ２サプリメント等を添加してもよい。一態様において、第６の培地としては、神経基底培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することができ、当該培地にｐｅｎ／ｓｔ、アポトランスフェリンを含んだＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｌ－グルタミンを添加してもよい（このようにして作製された培地は、脳実質培地（ＢＰＭ）とも称する。）。

上述のようにして製造された多細胞血液脳関門モデルにおいて、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の一方の側に、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む層が位置し、かつ、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の他方の側に、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が位置する。

また、一態様において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物とヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とは、相互作用を行うことが可能なように連通している。ここで、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物とヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物との相互作用とは、少なくとも液性因子を介した相互作用であるが、ペリサイトと脳微小血管内皮細胞とが多孔性膜の孔を通じて直接接触していてもよい。別の一態様において、培養物が層である場合、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の層とヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物の層とが、相互作用を行うことが可能なように連通している。

一態様において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物とヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とは、多孔性基材のそれぞれの面に形成されていることによって、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが相互作用を行うことが可能なように連通している。多孔性基材は、例えば多孔性膜である。多孔性基材の材質は、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物とヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物との直接的な相互作用を妨げない範囲で適宜選択され、例えばポリエチレンテレフタレート等、当該分野で用いられる多孔性膜に一般的なものが挙げられるが、これらに限定されない。

多孔性基材の孔のサイズは、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物とヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物との相互作用を妨げない範囲や、細胞の培養物（例えば層や塊）の形成を妨げない範囲で適宜選択されてよい。多孔性基材の市販品の例としては、ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ, ０．４ μｍ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｏｒｅｓ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ, Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ, ＮＪ）が挙げられる。

多孔性基材は、細胞の接着を促進するために、細胞外マトリックスを構成する分子によって被覆されていることが好ましい。多孔性基材は例えば、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンからなる群より選択される少なくとも１つで被覆されている。このような物質で被覆することにより、細胞の接着と分化形質が向上する。一態様において、多孔性基材は、コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンによって被覆されている。

本発明にかかる製造方法において、播種されるヒト条件的不死化ペリサイトの数、ヒト条件的不死化アストロサイトの数、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の数や、これらの数の比は、適宜調整されてよい。

＜その他の工程＞
前記製造方法は、さらに、作製された多細胞血液脳関門モデルを凍結する凍結工程、作製された当該モデルの形状、性能等を維持する工程、当該モデルを必要とされる場所に輸送する輸送工程を含んでもよい。

本発明の第２の側面は、先述の製造方法によって製造される、多細胞血液脳関門モデルに関する。

本発明の第３の側面は、下記：
（Ａ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物と、
（Ｂ）ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、
（Ｃ）ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物と、
（Ｄ）前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞のための培地と、
（Ｅ）前記ヒト条件的不死化ペリサイトおよび前記ヒト条件的不死化アストロサイトのための培地と
を含む多細胞血液脳関門モデルに関する。

本モデルにおいて、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）とヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）とは相互作用することが可能なように配置されている。一態様において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）とヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）との間には多孔性基材が存在してもよく、この場合、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が多孔性基材の一方の面を被覆し、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）が多孔性基材の他方の面を被覆している。

ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）の一方の側には、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が位置し、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）の他方の側には、ヒト条件的不死化アストロサイト（Ｃ）を含む培養物が位置する。

好ましい一態様において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が層であり、および／または、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）が層である。別の好ましい一態様において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）は単層であり、および／または、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）は単層である。

培地（Ｄ）は、先述の第５の培地に対応し、成長因子を含まない培地である。培地（Ｄ）はさらに、抗生剤を含まなくてもよい。培地（Ｅ）は先述の第６の培地に対応し、神経細胞用培地である。

一態様において、本発明にかかる多細胞血液脳関門モデルは、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物（Ｃ）を内部に保持する第１の容器と、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）およびヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）を担持した第２の容器とを含む。例えば、第１の容器は、内部に第２の容器を設置することができる構造を有していてよく、例えば、一定の深さを有するウェルの構造を有してよい。この場合、第２の容器は、第１の容器の内部に配置されるインサートであってもよい。

第２の容器は、一方の側（例えば、第２の容器の内側）にヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）を、他方の側（例えば、第２の容器の外側）にヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）を担持している。このように培養物（Ａ）および培養物（Ｂ）を担持することによって、第１の容器と第２の容器とを組み合わせた場合に、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物層（Ｂ）の一方の側には、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物層（Ａ）が位置し、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物層（Ｂ）の他方の側には、ヒト条件的不死化アストロサイト（Ｃ）を含む培養物層が位置する構成となり、生体内での構造を模倣したＢＢＢモデルを再現できる（例えば、図２Ｂ、図３Ａおよび図８）。第１の容器および第２の容器は好ましくは、平坦な底面を有する。

ここで、培養物（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の配置や、第１の容器および第２の容器の配置は、上記のものに限定されず、生体内でのＢＢＢの構造ないし機能を模倣できる範囲で、適宜変更されてもよい。また、第１の容器および第２の容器の形状も、生体内でのＢＢＢの構造ないし機能を模倣できる範囲で、適宜変更されてよい。

先に述べたとおり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門（ＢＢＢ）モデルは、脳標的薬の開発とＢＢＢの生理学的および病態生理学的機能の理解のための重要な研究ツールである。本発明によれば、ヒト条件的不死化細胞を用いた多細胞血液脳関門モデルを提供することができる。当該モデルは、基本的なヒトのＢＢＢ特性を保持すると共に、不死化細胞の無限の増殖能力に基づき、様々なＢＢＢ研究を加速するための有用で適用性の高い実験プラットフォームを提供することが期待される。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

＜１＞試料および試験方法
［細胞のメンテナンス］
ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８（以下で説明）およびヒト肝類洞内皮細胞株（ＨＬＳＥＣ/ｃｉＪ（参考文献３２）にはＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ （Ｖａｓ－ｃｏｍｐ）を、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５にはアストロサイト増殖培地（ＡＧＭ）を、ＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞にはペリサイト培地（ＰＭ）を使用して培養を行った。使用した培地の組成を、表１に示す。

Ｖａｓ－ｃｏｍｐは、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ （ＫＵＲＡＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に、５ｎｇ／ｍＬ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂａｓｉｃ（ｈＦＧＦ－ｂ）、５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸、１μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（ＨＣ）、１５ｎｇ／ｍＬ ヒトインスリン様成長因子－１（ｈＩＧＦ－１）、５ｎｇ／ｍＬ ヒト表皮成長因子（ｈＥＧＦ）、５ｎｇ／ｍＬ 血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、０．７５ｕｎｉｔ／ｍＬ ヘパリン、１０ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｗａｋｏ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（グルタミン以外のすべてはＫＵＲＡＢＯから購入した）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｗａｌｔｈａｍ, ＭＡ）および４μｇ／ｍＬ ブラストサイジンＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ）を添加したものである。

ＡＧＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコースＧｌｕｔａＭＡＸピルベート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎを含む１％ （ｖ/ｖ） Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ ｐｅｎ／ｓｔおよび４μｇ／ｍＬ ブラストサイジンＳを添加したものである。

ペリサイト培地（ＰＭ）は、ペリサイト基本培地に、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ペリサイト成長因子および１％ ｐｅｎ／ｓｔ（すべてＳｃｉｅｎＣｅｌｌ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡから購入した）を添加したものである。

不死化細胞はすべて、タイプＩコラーゲン被覆ディッシュ中で、３３℃、５％ＣＯ_２／９５％ａｉｒの条件で培養した。細胞はすべて、０．２５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて、３日ごとに継代培養した。

［条件的不死化ヒトＢＭＥＣクローン１８（ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８）の単離］
ＨＢＭＥＣ／ｃｉクローン１８（ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８、図１）は、Ｖａｓ－ｃｏｍｐを使用したこと以外は参考文献２４に記載のとおり、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ親細胞より連続希釈法に基づいて単離した。

［細胞増殖解析］
ＨＡＳＴＲ／ｃｉ１８を、５．０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播種し（Ｄａｙ０）、３３℃または３７℃のいずれかで培養した。Ｄａｙ３、Ｄａｙ５およびＤａｙ９で、サイトメーターを用いて細胞数をカウントした。

［Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）］
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出、ゲノムＤＮＡコンタミネーションチェック、およびｃＤＮＡ合成は、参考文献２４、２６、３３に記載の方法に従って行った。ｑＰＣＲは、表２に示すプライマーを用いてＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８のｃＤＮＡを鋳型として行った。標的ｍＲＮＡについては、図の説明および本明細書の対応箇所に記載した。各ｑＰＣＲの増幅効率が１に近いことを確認した。各細胞種におけるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡのレベルを標準化コントロールとして決定した。これらの値についてデルタ－デルタＣＴ法を用いて、相対発現レベルを決定した。

［免疫細胞化学（ＩＣＣ）］
ＩＣＣは、参考文献２５、２６、３３、３４に記載の方法に従って行った。使用した一次抗体および二次抗体を表３に示す。抗体はすべて、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ （ＴＯＹＯＢＯ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）によって適切な濃度に希釈された。核対比染色には、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｄｏｊｉｎｄｏ, Ｋｕｍａｍｏｔｏ, Ｊａｐａｎ）を用いた。細胞を、ａｎｔｉｆａｄｅ（０．１％ 「ｗ/ｖ」 ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅおよび６８．８％ 「ｖ／ｖ」 ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ８．０）によって封入し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ, Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光を検出した。

［インビトロＢＢＢモデルの開発］
図２に示すように、ヒト不死化ＢＢＢ細胞を、トランスウェル培養システム（１２または２４ウェル）内で組み合わせてＢＢＢモデルを開発した。セルカルチャーインサートの膜（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ, ０．４ μｍ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｏｒｅｓ, ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ, Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ, ＮＪ）を、１００μｇ／ｍＬ ｔｙｐｅ－ＩＶ コラーゲン（Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）、１００μｇ／ｍＬ フィブロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液によって３７℃で１時間インキュベートした（細胞外マトリックスコーティング）。インサートは空気によって乾燥し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で二度洗浄した。

共培養モデルについては、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５（２．５×１０^４細胞／ｃｍ^２）およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７（３．０×１０^４細胞／ｃｍ^２）をインサートの膜の外側（２４ウェルについては０．３３ｃｍ^２、１２ウェルについては０．９ｃｍ^２）またはプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）の底部に（２４ウェルについては２．０ｃｍ^２または１２ウェルについては４．０ｃｍ^２）播種した。

ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞（Ｄａｙ２）を播種する前の２日間（図２、Ｓｔｅｐ１）、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５はＡＧＭ、ＨＢＰＣ／ｃｉ３７はＰＭを用いて培養した。播種後、３３℃で１日培養し、その後（Ｄａｙ１）、培養温度を３３℃から３７℃にシフトさせ、かつ、ＡＧＭをアストロサイト分化培地（ＡＤＭ）に換えることにより、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７の細胞分化を行った。

ここで、ＡＤＭは、
（ｉ）ＦＢＳおよびブラストサイジンＳを含まないこと
（ｉｉ）１ｍＭ ジブチリル環状アデノシン一リン酸（ｄＢｃＡＭＰ, Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ, Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ, ＣＡ）を含むこと
以外はＡＧＭと同じ組成である（図２Ａ、Ｓｔｅｐ２参照）。

Ｄａｙ０では、共培養を始めるため（図２Ａ、Ｓｔｅｐ３参照）、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞（１．３ｘ１０^５細胞／ｃｍ^２）を、前記のＨＢＰＣ／ｃｉ３７（またはＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５）細胞を培養しているインサートの内側に播種した直後、２つの細胞種を保持するインサートを、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５（またはＨＢＰＣ／ｃｉ３７）の細胞を培養しているウェルに移動した。ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞の単独培養には、他の細胞がいないインサートの内側に細胞を播種した（図２Ｂ参照）。

ＢＢＢモデルのすべてのタイプ（図２Ｂ参照）において、
・頂端膜側（インサート）には、ＶＥＧＦおよびｈＥＧＦを含まないＶａｓｃｕＬｉｆｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖａｓ－Ｖ／Ｅ不含培地）を、
・基底側（ウェル）には、脳実質培地（ＢＰＭ）を
使用した。

Ｖａｓ－Ｖ／Ｅ不含培地は、ＶＥＧＦ、ｈＥＧＦおよびブラストサイジンＳを含まないこと以外はＶａｓｃｏｍｐと同一の組成である（表１－１参照）。

ＢＰＭは、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン－１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１％（ｖ／ｖ）アポトランスフェリンを含んだ１％（ｖ／ｖ）Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加した神経基底培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から構成される（表１－４参照）。

Ｓｔｅｐ３において、細胞の培養は３３℃で行った。Ｄａｙ１でＲＮＡ抽出、ＩＣＣおよび透過率アッセイを行い、Ｄａｙ１、Ｄａｙ２およびＤａｙ５で経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）分析を行った。

［経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定］
ＳＴＸ０１電極（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えたＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳ－２ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ, Ｄａｒｍｓｔａｄｔ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴＥＥＲの測定を行った。培養インサートの面積を用いて、ＴＥＥＲ値（Ω ｘ ｃｍ^２）を算出した。

［Ｐ－ｇｐの機能アッセイ］
排出トランスポーター機能（Ｐ－ｇｐ）は、ローダミン１２３（Ｒ１２３、Ｐ－ｇｐの基質）を用いた双方向輸送実験によって決定した。

具体的には、Ｒ１２３（５μＭ、Ｗａｋｏ）を頂端膜側（Ａ）に添加した。２０分間、４０分間または６０分間のインキュベーションの後、頂端膜側（Ａ）および基底側（Ｂ）のそれぞれから培地を回収し、Ｐｅ値（頂端膜側－基底側方向にはＰｅＡＢ、基底側－頂端膜側方向にはＰｅＢＡ）を算出して、排出率（ＥＲ）（ＰｅＢＡ／ＰｅＡＢ）を決定した。

Ｐｅ値を決定するために、以下の式を用いて、ｃｌｅａｒｅｄ ｖｏｌｕｍｅを算出した。

上記式では、頂端膜（Ｃ_{ａｐｉｃａｌ}）側および基底（Ｃ_{ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ}）側における化合物濃度、ならびに、頂端膜側の体積（Ｖ_{ａｐｉｃａｌ}＝７５０μＬ）および基底側の体積（Ｖ_{ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ}＝２２５０μＬ）を用いた。Ｃｌｅａｒｅｄ ｖｏｌｕｍｅを時間軸に対してプロットし、ＢＢＢモデル（ＰＳ_{ｔｏｔａｌ}）および細胞不含インサート（ＰＳ_{ｉｎｓｅｒｔ}）についてクリアランス直線のスロープを得た。内皮単層（ＰＳ_ｅ）については、下記式を用いて透過性×面積の値を決定した。

最終的に、以下に示すように、ＰＳ_ｅ値を表面積Ａで除してＰｅ値を得た（１２ウェルのインサートについてはＡ：０．９ｃｍ^２）。

［インビトロＢＢＢ透過性試験］
ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞の単独培養物（Ｅ００）、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞および ＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞との共培養物（ＥＰＡ）を用いてルシファーイエローの透過性アッセイを行った。インサートをＰＢＳ（＋）で一度洗った後、培地を、カルシウムおよびマグネシウムを含有するハンクス緩衝塩類溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で置き換えた後、３３℃で１０分間、プレインキュベーションを行った。その後、ルシファーイエロー（ＬＹ，１０μＭ、Ｗａｋｏ）を頂端膜側に添加した。

３７℃で３０、６０または９０分間インキュベーションした後、培地を基底ウェルから回収した。ＬＹの定量のため、各培地の蛍光強度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ （Ｔｅｃａｎ, Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した（波長は４２８／５３６（ｎｍ／ｎｍ））。

［統計的解析］
統計的解析は、Ｅｘｃｅｌを用いて、ｙｓｔａｔ２００６ （Ｉｇａｋｕｔｏｓｈｏ Ｓｈｕｐｐａｎ Ｌｔｄ., Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）によって行った。複数の値間の比較を、１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った後、ボンフェローニ補正を行った。２つの値は、独立スチューデントｔ－試験によって比較した。

［培地の最適化］
３種類の細胞の共培養における基底側の培地（すなわち、ペリサイトおよびアストロサイトの培養のための培地）として、以下の培地について検討を行った。各培地の組成は、以下の通りである。
・Ｖａｓ－ｃｏｍｐ（表１－１）
・Ｖａｓ－Ｖ／Ｅ不含培地（表１－１）
・ＡＤＭ（表１－２）
・ＰＭ（表１－３、ただしここでは血清不含）
・ＢＰＭ（表１－４）

＜２＞結果
［条件的不死化ヒト脳微小血管内皮細胞株の新規クローンＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８の単離および特性決定］
本発明者らは、これまでにヒト脳微小血管内皮細胞／条件的不死化クローンβ、ＨＢＭＥＣ／ｃｉβ（参考文献２４）を単離したが、より優れたＢＢＢ特性を有するクローンを作製するために、親細胞から再度クローニングを行った。本発明者らは、ここから得られたクローンより、クローン１８を選択し、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８とした（図１Ａ）。

ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞は、典型的な伸長錘型の細胞形態を示し（図１Ａ）、代表的な内皮マーカータンパク質であるフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）とＣＤ３１を発現していた（図１Ｂ）。さらに、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞は、不死化タンパク質であるｔｓＳＶ４０ＴとｈＴＥＲＴを発現していた（図１Ｃ）。また、本細胞は優れた増殖能を示した（図１Ｄ）。

次いで、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞が、脳血管内皮細胞特異的な遺伝子発現の特徴を示すかどうかを調べるため、ＢＢＢに特徴的なｍＲＮＡ発現レベルを試験し、条件的不死化ヒト肝類洞壁内皮細胞株（ＨＬＳＥＣ／ｃｉＪ、非脳血管由来細胞株）の発現レベルと比較した。その結果、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞は、ＢＭＥＣに特徴的なｍＲＮＡ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、インスリン受容体、多剤耐性関連タンパク質４、グルコーストランスポーター１（ＧＬＵＴ１）、ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＭＦＳＤ）２Ａ、Ｐ－ｇｐ、モノカルボン酸トランスポーター８およびトランスフェリン受容体）を、ＨＬＳＥＣ／ｃｉＪよりも高いレベルで発現していた（図１Ｅ）。

まとめると、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞は、基本的なＢＭＥＣの特性を有していると考えられた。そこで、以降、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８を用いて、インビトロＢＢＢ培養モデルの開発を行った。

［ヒト不死化細胞に基づくインビトロＢＢＢモデルの開発］
アストロサイトおよびペリサイトは、ＢＭＥＣにおけるＢＢＢ特性の誘発に重要な役割を果たすことが知られている（参考文献４および５）。いくつかのインビトロ研究によって、アストロサイトおよび／またはペリサイトと共培養したＢＭＥＣのＢＢＢ機能は、単独培養したＢＭＥＣよりも高いことが報告されている（参考文献１２～１４）。したがって、本発明者らはＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞と、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞とを組み合わせることによって、共培養ＢＢＢモデルを開発することとした（図２）。

これを達成するため、本発明者らは、新たな培養法の開発に取り組んだ。例えば、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５およびＨＢＰＣ／ｃｉ３細胞の成熟を促進するため、無血清培地および３７℃の培養温度を利用した（Ｓｔｅｐ２）。また、血管内皮細胞の機能を高めるために、ＢＢＢ形成に対して抑制的に作用するＶＥＧＦおよびｈＥＧＦ（参考文献３５、３６）非添加の内皮培地を用いた。

これらの条件下、図２Ｂに示す６つのＢＢＢモデルタイプを作製した。６つのモデルタイプの詳細は以下の通りである。
（１）Ｅ００：ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞のみ培養したもの
（２）ＥＰ０：ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞をＨＢＰＣ／ｃｉ３７と共培養したもの
（３）ＥＡ０：ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞をＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５と共培養したもの（ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５は、インサート外側）
（４）Ｅ０Ａ：ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞をＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５と共培養したもの（ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５は、ウェル底面側）
（５）ＥＰＡ：３種類の細胞すべてを共培養したもの（ＨＢＰＣ／ｃｉ３７がインサート外側、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５がウェル底面側）
（６）ＥＡＰ：３種類の細胞すべてを共培養したもの（ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５がインサート外側、ＨＢＰＣ／ｃｉ３７がウェル底面側）

図３Ａに示すＴＥＥＲ分析の結果から、共培養モデルのＴＥＥＲ値は、単独培養のＥ００モデルのＴＥＥＲ値（６０．３±４．１ Ω×ｃｍ^２）と比較して、より高いことが示された。また、共培養モデルの中でも、ＥＰＡモデルが最も高いＴＥＥＲ値（９３．０±３．４Ω×ｃｍ^２）を有していた。したがって、図３Ｂに示すように、これらのＴＥＥＲレベルは、少なくともＤａｙ５まで維持された。したがって、ＥＰＡモデルが、ＢＢＢモデルの開発のための最も好ましい構成である。

これらのデータに基づき、本発明者らは、ＢＢＢモデルのさらなる特性解析においてはＥＰＡモデルを用い、比較にはＥ００モデルを用いた。

［ヒト不死化細胞ＢＢＢモデルにおける細胞ジャンクションの機能的発現］
ＥＰＡモデルのＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞において、細胞間ジャンクションが形成され機能しているか明らかにするため、本発明者らは、接着結合関連遺伝子（ＶＥカドヘリンおよびβカテニン）および密着結合関連遺伝子（ＺＯ－１、 クローディン－５およびオクルディン）の発現レベルおよび局在化について、ｑＰＣＲおよび免疫組織化学によって調べた。図４Ａに示すとおり、ＥＰＡモデルでは、これらすべてのｍＲＮＡレベルがＥ００モデルよりも高かった。この結果と一致して、ＶＥカドヘリンおよびβ－カテニンタンパク質の発現レベルも、Ｅ００モデルよりもＥＰＡモデルにおいて高かった（図４Ｂ）。

これらの結果より、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞は、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞における細胞間ジャンクション形成（主にＡＪ）を促進し、より強い細胞間バリアの形成に関与すると考えられる。

［ヒト不死化細胞ＢＢＢモデルにおける排出トランスポーターの機能解析］
ＥＰＡおよびＥ００モデルにおけるＰ－ｇｐ活性を、Ｒ１２３（Ｐ－ｇｐの基質）の双方向性輸送解析により調べた。Ｒ１２３の排出率（ＥＲ）は、Ｅ００モデルよりもＥＰＡモデルの方が高いことが示された（Ｒ１２３：１．７２ｖｓ１．３１）（図５）。

続いて、ＥＰＡおよびＥ００モデルにおけるＰ－ｇｐの発現レベルをｑＰＣＲおよび免疫細胞化学によって比較した。その結果、ＥＰＡモデルにおけるＰ－ｇｐおよびＢＣＲＰのｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルは、Ｅ００モデルにおけるレベルよりも有意に高かった（図６Ａおよび図６Ｂ）。

さらに、ＥＰＡモデルにおけるＰ－ｇｐおよびＢＣＲＰの細胞内局在を垂直断面（Ｚ軸面）の画像から解析したところ、Ｐ－ｇｐおよびＢＣＲＰは、頂端膜に主に局在していることが明らかとなった。これらの局在性は、上記の双方向輸送分析の結果とよく一致していた。一方、接着結合タンパク質であるβ－カテニンタンパク質は、Ｐ－ｇｐやＢＣＲＰと異なり、細胞－細胞の境界に局在していた（図６Ｂ）。

まとめると、ＥＰＡモデルは、Ｅ００モデルと比較して、より良好な排出トランスポーター機能を有しており、このことは、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞との共培養によって、ＥＰＡモデルのＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞におけるＰ－ｇｐおよびＢＣＲＰの発現や機能が誘導されたことを示唆する。

［ヒト不死化細胞ＢＢＢモデルを用いた化合物透過性評価］
ヒト不死化細胞によるＢＢＢモデルが化合物透過性試験に用いることが可能か、代表的な透過性マーカーであるルシファーイエローを用いて検討した。Ｅ００モデルおよびＥＰＡモデルを用いた透過性試験の結果から、ルシファーイエローの透過性はいずれのモデルでも低く、さらにその値はＥ００よりもＥＰＡモデルで低いことが示された。したがって、ヒト不死化細胞によるＢＢＢモデルは、化合物透過性試験に用いることが可能であり、さらに、Ｅ００モデルよりもＥＰＡモデルの方が、より優れた機能を有することが明らかとなった。

［培地の評価］
図８に示す結果から、ＥＰＡモデルにおける基底側の培地にＢＰＭを用いた場合にＴＥＥＲ値が最も高いことが示され、ＢＰＭがアストロサイトまたは／およびペリサイトの共培養効果を増強することが確認された。なお、三種共培養の効果は、いずれのモデルにおいてもＤａｙ１がピークであった。

＜３＞考察
上記のとおり、３つの条件的不死化ヒトＢＢＢ細胞株を共培養することによって、インビトロのヒトＢＢＢモデルを樹立した。このヒト不死化細胞に基づいたＢＢＢモデルを、以下、「ｈｉＢＢＢ９０モデル」と称する。ｈｉＢＢＢ９０モデルは、ＣＮＳ薬剤候補のＢＢＢ透過性スクリーニングのためのユニークな利点を有する。

細胞ジャンクション（バリア）機能に関し、ｈｉＢＢＢ９０モデルがＴＥＥＲ値９０（Ω × ｃｍ^２）を有することは、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞が、機能的なバリア機能を有することを示す。なお、インビボにおいて観察される値（１０００超）（参考文献２１、２２）やラットの初代細胞に基づいたＢＢＢモデルにおいて観察される値（約３５０）（参考文献１４）には至らないが、ｈｉＢＢＢ９０モデルのＴＥＥＲ値は、ヒト初代細胞ＢＢＢモデルの値（１４０～２６０）に近いものである（参考文献１２、３７）。ＢＢＢモデルとして最低限必要なＴＥＥＲレベルは未だ定まっていないが、これまでに、１５０～４００（Ω × ｃｍ^２）を超えるＴＥＥＲ値を示すＢＢＢモデルにおいて、蛍光化合物のＰｅ値は一定に達することが報告されており（参考文献３８、３９）、これらの値が、現時点でのＢＢＢモデルにおけるベンチマークＴＥＥＲと考えることができる。また、本モデルは、ＢＢＢ非透過性マーカーであるＬＹに対しても低い透過性を示しており、この点からも機能的なバリアを形成していることが伺える。

さらに、ｈｉＢＢＢ９０モデルは、排出トランスポーター機能を有しており、このことは、Ｐ－ｇｐ／ＢＣＲＰの免疫細胞化学検出およびＲ１２３のＥＲ（それぞれ、１．７２）の結果により支持される。

また、培地を最適化することで、本モデルの機能をより高めることができた。その最も特徴的な点は、まず、脳側の環境を再現するための神経用培地の使用である。これにより、従来モデルと比較して、より脳環境を再現出来たことが、本モデルの確立における重要な要因であると考えられる。

上記のＢＢＢ機能に加え、その優れたスケーラビリティもｈｉＢＢＢ９０モデルのユニークな利点である。３つの不死化細胞株は、長期間の培養または繰り返しの凍結／融解が可能で、かつ、これらに伴うフェノタイプ異常も認められなかった。さらに、本研究では簡便なスフェロイド構築法を開発し、この点も研究遂行上大きなメリットである。

以上より、ｈｉＢＢＢ９０モデルはＢＢＢの機能性と実用性をともに有しており、薬物のＢＢＢ透過性スクリーニングをはじめ様々な中枢薬開発研究に応用できると期待される。

本研究におけるｈｉＢＢＢ９０モデルの開発の要点は、培地組成と共培養条件の変更である。特に、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞を分化させる点は、このモデルに固有のものである。これまでに、発明者らは３７℃の培養温度によりＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５細胞およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞の分化形質が大幅に促進することを報告している（参考文献２６、３３）。この分化形質の向上により、ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８細胞に対する共培養効果が大きくなり、ＢＢＢモデルとしての機能も向上したものと推察される。共培養効果の分子メカニズムは不明であるが、参考文献２、３、５、１４などを参考にすると、例えば、グリア由来神経栄養因子、ソニックヘッジホッグ、およびアストロサイトから分泌されるＷｎｔタンパク質、または周皮細胞から分泌されるａｎｇｉｏｐｅｐ－１などが考えられる。したがって、ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５およびＨＢＰＣ／ｃｉ３７細胞におけるこれらの栄養因子の発現レベルが分化に伴い増加する可能性がある。

最後に、ＣＮＳ医薬品開発におけるｈｉＢＢＢ９０モデルのさらなる活用について簡単に言及する。一般に、脳内の薬物の薬理作用は、その血漿濃度と明確に関連づけることはできず、むしろ脳内薬物濃度と関連している。そのため、ラットではあるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏＢＢＢモデルデータからのインビボ定常状態Ｋ_{ｐ，ｕｕ，ｂｒａｉｎ}を予測する方法が最近提案されている（参考文献４０）。したがって、ｈｉＢＢＢ９０モデルを用いることで、ヒトのｉｎ ｖｉｔｒｏのデータから薬物のヒトｉｎ ｖｉｖｏにおける脳濃度－時間プロファイルを予測することが可能となるかもしれない（参考文献４１）。

本研究で発明したｈｉＢＢＢ９０モデルは、基本的なＢＢＢ特性を保持すると同時に、優れたスケーラビリティと取り扱いの簡便さを備えている。本モデルは、新しいＣＮＳ薬の脳移行性評価や、ＢＢＢ生物学の分子メカニズムを解明する研究に幅広く活用できる可能性がある。したがって、本発明によるｈｉＢＢＢ９０モデルは、ＣＮＳ医薬品開発を含む様々なヒトＢＢＢ研究を加速するための新たなツールとなることが期待される。

参考文献

Claims (21)

1. （ｉ）ヒト条件的不死化ペリサイトを第１の培地に播種して培養するペリサイト培養工程と、
   （ｉｉ）前記培養したヒト条件的不死化ペリサイトを第２の培地において分化させるペリサイト分化工程と、
   （ｉｉｉ）ヒト条件的不死化アストロサイトを第３の培地に播種して培養するアストロサイト培養工程と、
   （ｉｖ）前記培養したヒト条件的不死化アストロサイトを第４の培地において分化させるアストロサイト分化工程と、
   （ｖ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を第５の培地に播種して、前記播種したヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培養する脳微小血管内皮細胞培養工程と
   （ｖｉ）ヒト条件的不死化ペリサイトおよびヒト条件的不死化アストロサイトを第６の培地中において更に培養する更なる培養工程と
   を含み、
   前記ペリサイト培養工程（ｉ）および／または前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が形成され、
   前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）および／または前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）において、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物が形成され、
   前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化が、前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養温度とは異なる温度で行われ、
   前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が、前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養温度とは異なる温度で行われ、
   前記工程（ｉｉ）および前記工程（ｉｖ）の後で、前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）が行われ、
   前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が形成され、
   前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）と前記更なる培養工程（ｖｉ）とが共に行われ、
   前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが相互作用することが可能なように配置されており、
   前記第６の培地が、第１の培地、第２の培地、第３の培地、第４の培地および第５の培地のいずれとも異なり、神経細胞用培地である、多細胞血液脳関門モデルの製造方法。
2. 前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）における、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養が、前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化および／または前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とは異なる温度で行われる、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養が３２～３４℃の温度範囲で行われ、前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化が３５～３９℃の温度範囲で行われ、および／または
   前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養が３２～３４℃の温度範囲で行われ、前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が３５～３９℃の温度範囲で行われる、請求項１または２に記載の製造方法。
4. 前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）における、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養が、３２～３４℃の温度範囲で行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養および前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養が、それぞれ独立して、播種後１２～７２時間行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化および前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が、それぞれ独立して、１２～７２時間行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）が、播種後１２～２４０時間行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養と前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養とが、同時に行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化と前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とが、同時に行われる、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 前記ペリサイト培養工程（ｉ）および／または前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）において形成されるヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が層であり、および／または、
    前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において形成されるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が層である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
11. 前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において形成されるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が単層である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
12. 前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の一方の側に、前記ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物が位置し、
    前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物の他方の側に、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が位置する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
13. 前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが、多孔性基材のそれぞれの面に形成されていることによって、前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが相互作用することが可能なように配置されている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
14. 前記多孔性基材が、細胞外マトリックスを構成する分子によって被覆されている、請求項１３に記載の製造方法。
15. 前記第３の培地と前記第４の培地とは、前記第３の培地に含まれる血清が前記第４の培地には含まれない点において相違する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
16. 前記第５の培地は、成長因子を含まない培地である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、多細胞血液脳関門モデル。
18. （Ａ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物と、
    （Ｂ）ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と、
    （Ｃ）ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物と、
    （Ｄ）前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞のための培地と、
    （Ｅ）前記ヒト条件的不死化ペリサイトおよび前記ヒト条件的不死化アストロサイトのための培地と
    を含む多細胞血液脳関門モデルであって、
    前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）と前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）とが相互作用することが可能なように配置されており、
    前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）の一方の側に、前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が位置し、
    前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）の他方の側に、前記ヒト条件的不死化アストロサイト（Ｃ）を含む培養物が位置し、
    前記培地（Ｄ）が、成長因子を含まない培地であり、
    前記培地（Ｅ）が、神経細胞用培地である、多細胞血液脳関門モデル。
19. 前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が層であり、および／または、
    前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）が層である、請求項１８に記載の多細胞血液脳関門モデル。
20. 前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が単層である、請求項１８または１９に記載の多細胞血液脳関門モデル。
21. 多孔性基材をさらに含み、
    前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物（Ａ）が多孔性基材の一方の面を被覆し、
    前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物（Ｂ）が多孔性基材の他方の面を被覆する、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の多細胞血液脳関門モデル。

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