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JP7651787B2 - Nucleic acid molecules for use in producing recombinant AAV virions - Google Patents
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JP7651787B2 - Nucleic acid molecules for use in producing recombinant AAV virions - Google Patents

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Description

本発明は，その一実施形態において，遺伝子治療に用いることのできる組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの分野に関し，詳しくは，rAAVビリオンを製造するために用い得る核酸分子及び当該核酸分子を用いたrAAVビリオンの製造方法に関する。 In one embodiment, the present invention relates to the field of recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions that can be used in gene therapy, and more particularly to a nucleic acid molecule that can be used to produce rAAV virions and a method for producing rAAV virions using the nucleic acid molecule.

アデノ随伴ウイルス（AAV: adeno-associated virus）は，自然界に存在するウイルスの中で最も小さい部類の直鎖一本鎖DNAウイルスであるパルボウイルス科に属し，そのウイルスゲノムは約4.7 kbである。AAVはエンベロープを持たず，直径約22 nmの正二十面体粒子を形成する。AAVはまた，単独感染では増殖することのできない欠損ウイルスであるディペンドウイルス属に分類され，動物細胞内で効率的に複製が行われるためには，AAVの複製を補助するヘルパーウイルスとの同時感染が必要である。AAVの複製を補助するヘルパーウイルスには，例えばアデノウイルス，又はヘルペスウイルスがある。ヘルパーウイルスの非存在下では，AAVの複製は認められず，AAVゲノムは宿主ゲノムに組込まれる。 The adeno-associated virus (AAV) belongs to the Parvoviridae family, which is a linear single-stranded DNA virus that is one of the smallest viruses found in nature, and its viral genome is approximately 4.7 kb. AAV is non-enveloped and forms icosahedral particles with a diameter of approximately 22 nm. AAV is also classified as a defective virus that cannot grow by infection alone, and requires co-infection with a helper virus that supports AAV replication in order to replicate efficiently in animal cells. Examples of helper viruses that support AAV replication include adenoviruses and herpes viruses. In the absence of a helper virus, AAV replication is not observed and the AAV genome is integrated into the host genome.

野生型のAAVが宿主細胞のヒト細胞に単独で感染すると，ウイルスゲノムは，ウイルスゲノムの両端に存在する逆方向末端反復（ITR）を介して，第１９番染色体に部位特異的に組み込まれる。宿主細胞のゲノム中に取り込まれたウイルスゲノムの遺伝子はほとんど発現しないが，細胞がヘルパーウイルスに感染するとAAVは宿主ゲノムから切り出され，感染性ウイルスの複製が開始される。ヘルパーウイルスがアデノウイルスの場合，ヘルパー作用を担う遺伝子はE1A，E1B，E2A，VA1，及びE4である。ここで，宿主細胞が，アデノウイルスのE1A，E1Bでトランスフォームしたヒト胎児腎組織由来細胞であるHEK293細胞の場合にあっては，E1A及びE1B遺伝子は，宿主細胞において元々発現している。 When wild-type AAV infects a human host cell alone, the viral genome is integrated site-specifically into chromosome 19 via the inverted terminal repeats (ITRs) present at both ends of the viral genome. The genes of the viral genome integrated into the genome of the host cell are hardly expressed, but when the cell is infected with a helper virus, AAV is excised from the host genome and replication of the infectious virus begins. When the helper virus is an adenovirus, the genes responsible for the helper function are E1A, E1B, E2A, VA1, and E4. Here, when the host cell is a HEK293 cell, which is a cell derived from human fetal kidney tissue transformed with adenovirus E1A and E1B, the E1A and E1B genes are originally expressed in the host cell.

また，AAVゲノムは2つの遺伝子rep及びcapを含む。rep遺伝子から産生されるrep蛋白質（rep78，rep68，rep52及びrep40）は，カプシド形成に必須であるとともに，ウイルスゲノムの染色体への組み込みに介在する。cap遺伝子は3つのカプシド蛋白質（VP1，VP2及びVP3）の産生を担う。 The AAV genome also contains two genes, rep and cap. The rep proteins (rep78, rep68, rep52, and rep40) produced by the rep gene are essential for capsid formation and mediate the integration of the viral genome into chromosomes. The cap gene is responsible for the production of three capsid proteins (VP1, VP2, and VP3).

野生型AAVのゲノムでは，両端にITRが存在し，ITRの間にrep遺伝子及びcap遺伝子が存在する。組換AAVビリオン（rAAVビリオン）は，rep遺伝子及びcap遺伝子を含む領域を，外来の蛋白質をコードする遺伝子で置換したものが，カプシドに内包されたものである。 In the wild-type AAV genome, there are ITRs at both ends, and the rep gene and cap gene are located between the ITRs. A recombinant AAV virion (rAAV virion) is a virion in which the region containing the rep gene and cap gene has been replaced with a gene encoding a foreign protein, and this virion is encapsulated in a capsid.

rAAVビリオンは，遺伝子治療において外因性の遺伝子を細胞に送達するためのベクターとして用いられ，これまで治癒することのできなかった疾患に治療選択肢を与える能力がある。 rAAV virions are used as vectors to deliver exogenous genes to cells in gene therapy, potentially providing treatment options for previously incurable diseases.

rAAVビリオンを生産するためには，一般に3種類のプラスミドが用いられる。すなわち，ITRに挟まれた外来の蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミド（特許文献１），Rep蛋白質をコードする遺伝子とCap蛋白質をコードする遺伝子を含むプラスミド（特許文献２），及びアデノウイルス由来E2A，E4，及びVA1 RNAをコードする遺伝子を含むプラスミド（特許文献３），である。遺伝子導入した細胞内で目的遺伝子を内包したrAAVビリオンを生産させるためには，これら3種類のプラスミドをHEK293細胞等の宿主細胞に導入する必要がある。rAAVビリオンは3種類のプラスミドが導入された宿主細胞内で合成される。このとき，宿主細胞内ではrAAVビリオンに加えて，DNAを内包しない空の粒子が発生する。プラスミドDNAの一過性発現系では80%近くがDNAを内包しない空の粒子であるとの報告もある。(非特許文献１) Three types of plasmids are generally used to produce rAAV virions. These are a plasmid containing a gene encoding a foreign protein flanked by ITRs (Patent Document 1), a plasmid containing a gene encoding a Rep protein and a gene encoding a Cap protein (Patent Document 2), and a plasmid containing genes encoding adenovirus-derived E2A, E4, and VA1 RNA (Patent Document 3). In order to produce rAAV virions containing a target gene in a gene-transfected cell, these three types of plasmids must be introduced into a host cell such as HEK293 cells. rAAV virions are synthesized in a host cell into which the three types of plasmids have been introduced. At this time, in addition to rAAV virions, empty particles that do not contain DNA are generated in the host cell. It has also been reported that in a transient expression system of plasmid DNA, nearly 80% are empty particles that do not contain DNA. (Non-Patent Document 1)

国際公開第９５／３４６７０号WO 95/34670 国際公開第９７／０６２７２号International Publication No. WO 97/06272 国際公開第９７／１７４５８号International Publication No. WO 97/17458

Maria S. et al., HUMAN GENE THERAPY METHODS, 28, 101-108 (2017)Maria S. et al., HUMAN GENE THERAPY METHODS, 28, 101-108 (2017)

本発明の目的は，その一実施形態において，遺伝子治療等に使用できる，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸配列がAAVのカプシドにパッケージされたrAAVビリオンを効率よく生産するために用いられる核酸分子及び，かかるrAAVビリオンの製造方法に関する。 The object of the present invention, in one embodiment, is to provide a nucleic acid molecule that can be used for efficient production of rAAV virions in which a nucleic acid sequence including a base sequence encoding a foreign protein is packaged in an AAV capsid, and to provide a method for producing such rAAV virions.

上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質をコードする塩基配列，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質をコードする塩基配列，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，アデノウイルスのＥ２Ａ領域を含む塩基配列，アデノウイルスのＥ４領域を含む塩基配列，及びアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域を含む塩基配列，及び，核酸分子の第一と第二のITRとの間に外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸分子を，宿主細胞に導入することにより，rAAVビリオンを効率よく製造できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．少なくとも以下の塩基配列を含む核酸分子；
（ａ）アデノ随伴ウイルスのＲｅｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，
（ｂ）アデノ随伴ウイルスのＣａｐ蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，
（ｃ）第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，
（ｄ）第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）又はその機能的等価物を含む塩基配列，
（ｅ）第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，
（ｆ）アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，
（ｇ）アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物を含む塩基配列，及び
（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物を含む塩基配列。
２．該Ｒｅｐ蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，
該Ｃａｐ蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び
該外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，を更に含むものである上記１の核酸分子。
３．薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，上記１又は２の核酸分子。
４．該第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，該Ｒｅｐ蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に該第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び更に下流に該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列，を含むものである，上記２又は３の核酸分子。
５．該第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列の下流に，該第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に該外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び該外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，を含むものである，上記２～４の何れかの核酸分子。
６．該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物の塩基配列の下流に，該アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物の塩基配列，更に下流に該アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物の塩基配列，を含むものである，上記２～５の何れかの核酸分子。
７．該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流に，該第一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，更に下流に該第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，更に下流に該外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び該外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列，を含むものである，上記４の核酸分子。
８．該第二の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む塩基配列の下流に，該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物の塩基配列，更に下流に該アデノウイルスのＥ４領域又はその機能的等価物の塩基配列，更に下流に該アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物の塩基配列，を含むものである，上記７の核酸分子。
９．薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，上記１～８の何れかの核酸分子。
１０．薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を，該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流であって，該第一のＩＴＲを含む塩基配列の上流に含むものである，上記９の核酸分子。
１１．該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流に，Ｒｅｐ蛋白質及びＣａｐ蛋白質の発現量を高めるエンハンサー機能を有する塩基配列を含むものである，上記１～１０の何れかの核酸分子。
１２．該Ｒｅｐ蛋白質が，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１のアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されるものである，上記１～１１の何れかの核酸分子。
１３．該Ｒｅｐ蛋白質が，Ｒｅｐ６８又は／及びＲｅｐ７８を含むものである，上記１２の核酸分子。
１４．該Ｃａｐ蛋白質が，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１のアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されるものである，上記１～１３の何れかの核酸分子。
１５．該Ｃａｐ蛋白質が，ＶＰ１を含むものである，上記１４の核酸分子。
１６．該第１の遺伝子発現制御部位が，該アデノウイルスのＥ２Ａ領域又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～１５の何れかの核酸分子。
１７．該第１の遺伝子発現制御部位が，アデノ随伴ウイルスのｐ５プロモーターである，上記１６の核酸分子。
１８．該第２の遺伝子発現制御部位が，アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～１７の何れかの核酸分子。
１９．該第２の遺伝子発現制御部位が，アデノ随伴ウイルスのｐ４０プロモーターである，上記１８の核酸分子。
２０．該第一及び第二のＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１からなる群から選択されるものである，上記１～１９の何れかの核酸分子。
２１．該ＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が２である，上記１～１９の何れかの核酸分子。
２２．該外来の蛋白質をコードするための塩基配列が，マルチクローニングサイトを含むものである，上記１～２１の何れかの核酸分子。
２３．該アデノウイルスの血清型が，２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，及びブタＡｄ３型からなる群から選択されるものである，上記１～２２の何れかの核酸分子。
２４．該アデノウイルスのＥ２Ａ領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病ウイルスからなる群から選択される何れかに由来するものである，上記１～２３の何れかの核酸分子。
２５．該アデノウイルスのＥ４領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病からなる群から選択される何れかに由来するものである，上記１～２４の何れかの核酸分子。
２６．該アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域の機能的等価物が，単純ヘルペスウイルス，ワクシニアウイルス，サイトメガロウイルス，及び仮性狂犬病ウイルスからなる群から選択される何れかに由来するものである，上記１～２５の何れかの核酸分子。
２７．該アデノウイルスのＥ２Ａ領域が，該アデノウイルスのＥ１Ｂ又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～２６の何れかの核酸分子。
２８．該アデノウイルスのＥ４領域が，該アデノウイルスのＥ１Ｂ又はその機能的等価物によって制御されるものである，上記２～２７の何れかの核酸分子。
２９．該薬剤耐性遺伝子が，該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤への耐性を，原核細胞に付与するものである，上記９～２８の何れかの核酸分子。
３０．該第３の遺伝子発現制御部位が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，及びβ-アクチンプロモーター，配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーター，配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーターの下流に配列番号３９で示される塩基配列を含むもの，からなる群から選択されるものである，上記２～２９の何れかの核酸分子。
３１．該エンハンサー機能を有する塩基配列が，アデノ随伴ウイルスのｐ５プロモーター又はその機能的等価物である，上記１１～３０の何れかの核酸分子。
３２．該外来の蛋白質がヒトのものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
３３．該外来の蛋白質が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
３４．該外来の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びＧＬＰ－１受容体アゴニストからなる群から選択されるものである，上記１～３２の何れかの核酸分子。
３５．該外来の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，上記１～３２の何れかの核酸分子。
３６．該外来の蛋白質が，抗ＩＬ－６抗体，抗ベータアミロイド抗体，抗ＢＡＣＥ抗体，抗ＥＧＦＲ抗体，抗ＰＤ－１抗体，抗ＰＤ－Ｌ１抗体，抗ＨＥＲ２抗体，抗ＰＣＳＫ９抗体，抗ＴＮＦ-α抗体，及び血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有する抗体からなる群から選択されるものである，上記１～３３の何れかの核酸分子。
３７．該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，上記３６の核酸分子。
３８．該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び，該他の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），及びベータアミロイドを分解する活性を有する酵素からなる群から選択されるものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
３９．該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び他の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，上記１～３１の何れかの核酸分子。
４０．該他の蛋白質が，ヒトのものである，上記３８又は３９の核酸分子。
４１．該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有するものである，上記３８～４０の何れかの核酸分子。
４２．該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，上記４１の核酸分子。
４３．環状プラスミドである，上記１～４２の何れかの核酸分子。
４４．上記１～４３の何れかの核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む，組換えＡＡＶビリオンの製造方法。
４５．該宿主細胞のゲノムが，アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域を含む塩基配列を含むものである，上記４４の製造法。
４６．該宿主細胞が，ＨＥＫ２９３細胞である，上記４５の製造法。 In the research for the above object, the present inventors conducted intensive studies and found that rAAV virions can be efficiently produced by introducing into a host cell a nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding the Rep protein of an adeno-associated virus, a base sequence encoding the Cap protein of an adeno-associated virus, a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a first adeno-associated virus, a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a second adeno-associated virus, a base sequence including an E2A region of an adenovirus, a base sequence including an E4 region of an adenovirus, and a base sequence including a VA1 RNA region of an adenovirus, and a base sequence encoding a foreign protein between the first and second ITRs of the nucleic acid molecule, and thus completed the present invention. That is, the present invention includes the following.
1. A nucleic acid molecule comprising at least the following base sequence:
(a) a nucleotide sequence encoding the Rep protein of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof,
(b) a nucleotide sequence encoding the Cap protein of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof,
(c) a nucleotide sequence comprising the inverted terminal repeat (ITR) of a first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof;
(d) a nucleotide sequence comprising the inverted terminal repeat (ITR) of a second adeno-associated virus or a functional equivalent thereof,
(e) a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein, located between the first ITR and the second ITR, and/or a base sequence encoding a foreign protein;
(f) a nucleotide sequence containing the adenovirus E2A region or a functional equivalent thereof,
(g) a nucleotide sequence comprising the E4 region of an adenovirus or a functional equivalent thereof; and (h) a nucleotide sequence comprising the VA1 RNA region of an adenovirus or a functional equivalent thereof.
2. A base sequence comprising a first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein,
The nucleic acid molecule of claim 1, further comprising a base sequence including a second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein, and a base sequence including a third gene expression control site that controls the expression of the foreign protein.
3. The nucleic acid molecule according to 1 or 2 above, further comprising a base sequence containing a drug resistance gene.
4. The nucleic acid molecule according to 2 or 3 above, which comprises, downstream of the base sequence comprising the first gene expression control site, a base sequence encoding the Rep protein, further downstream a base sequence comprising the second gene expression control site, and further downstream a base sequence encoding the Cap protein.
5. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 4 above, which comprises, downstream of the base sequence containing the first inverted terminal repeat (ITR), a base sequence containing the third gene expression control site, and further downstream, a base sequence for inserting a base sequence encoding the foreign protein and/or a base sequence encoding the foreign protein, and further downstream, a base sequence containing the second inverted terminal repeat (ITR).
6. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 5 above, which comprises a base sequence of the adenovirus E4 region or a functional equivalent thereof downstream of the base sequence of the adenovirus E2A region or a functional equivalent thereof, and further comprises a base sequence of the adenovirus VA1 RNA region or a functional equivalent thereof downstream.
7. The nucleic acid molecule according to 4 above, which comprises, downstream of the base sequence encoding the Cap protein, a base sequence comprising the first inverted terminal repeat (ITR), further downstream a base sequence comprising the third gene expression control site, further downstream a base sequence for inserting a base sequence encoding the foreign protein, or/and a base sequence encoding the foreign protein, further downstream a base sequence comprising the second inverted terminal repeat (ITR).
8. The nucleic acid molecule according to 7 above, which comprises, downstream of the base sequence comprising the second inverted terminal repeat (ITR), a base sequence of the adenovirus E2A region or a functional equivalent thereof, further downstream, a base sequence of the adenovirus E4 region or a functional equivalent thereof, and further downstream, a base sequence of the adenovirus VA1 RNA region or a functional equivalent thereof.
9. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 8 above, further comprising a base sequence containing a drug resistance gene.
10. The nucleic acid molecule according to 9 above, which comprises a base sequence containing a drug resistance gene downstream of the base sequence encoding the Cap protein and upstream of the base sequence containing the first ITR.
11. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 10 above, which comprises, downstream of the base sequence encoding the Cap protein, a base sequence having an enhancer function for increasing the expression levels of the Rep protein and the Cap protein.
12. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 11 above, wherein the Rep protein is selected from the group consisting of adeno-associated viruses of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11.
13. The nucleic acid molecule according to claim 12, wherein the Rep protein comprises Rep68 and/or Rep78.
14. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 13 above, wherein the Cap protein is selected from the group consisting of adeno-associated viruses of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11.
15. The nucleic acid molecule according to claim 14, wherein the Cap protein comprises VP1.
16. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 15 above, wherein the first gene expression control site is controlled by the E2A region of the adenovirus or a functional equivalent thereof.
17. The nucleic acid molecule of claim 16, wherein the first gene expression control site is the p5 promoter of an adeno-associated virus.
18. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 17 above, wherein the second gene expression control site is controlled by adenovirus VA1 RNA or a functional equivalent thereof.
19. The nucleic acid molecule of claim 18, wherein the second gene expression control site is the p40 promoter of an adeno-associated virus.
20. The nucleic acid molecule of any one of 1 to 19 above, wherein the adeno-associated virus serotype of the first and second ITRs is selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11.
21. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 19 above, wherein the ITR is of adeno-associated virus serotype 2.
22. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 21 above, wherein the base sequence for encoding the foreign protein contains a multicloning site.
23. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 22 above, wherein the adenovirus serotype is selected from the group consisting of 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24 to 30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, bovine Ad type 3, canine Ad type 2, ovine Ad, and porcine Ad type 3.
24. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 23 above, wherein the functional equivalent of the adenovirus E2A region is derived from any one selected from the group consisting of herpes simplex virus, vaccinia virus, cytomegalovirus, and pseudorabies virus.
25. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 24 above, wherein the functional equivalent of the adenovirus E4 region is derived from any one selected from the group consisting of herpes simplex virus, vaccinia virus, cytomegalovirus, and pseudorabies virus.
26. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 25 above, wherein the functional equivalent of the VA1 RNA region of the adenovirus is derived from any one selected from the group consisting of herpes simplex virus, vaccinia virus, cytomegalovirus, and pseudorabies virus.
27. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 26 above, wherein the E2A region of the adenovirus is controlled by E1B of the adenovirus or a functional equivalent thereof.
28. The nucleic acid molecule according to any one of 2 to 27 above, wherein the E4 region of the adenovirus is controlled by E1B of the adenovirus or a functional equivalent thereof.
29. The nucleic acid molecule according to any one of 9 to 28 above, wherein the drug resistance gene confers resistance to a drug corresponding to the drug resistance gene to a prokaryotic cell.
30. The nucleic acid molecule of any of 2 to 29 above, wherein the third gene expression control site is selected from the group consisting of a promoter derived from a cytomegalovirus, an SV40 early promoter, a human elongation factor-1 alpha (EF-1α) promoter, a human ubiquitin C promoter, and a β-actin promoter, a promoter comprising the base sequence shown in SEQ ID NO:47, and a promoter comprising the base sequence shown in SEQ ID NO:39 downstream of a promoter comprising the base sequence shown in SEQ ID NO:47.
31. The nucleic acid molecule according to any one of 11 to 30 above, wherein the base sequence having an enhancer function is the p5 promoter of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof.
32. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 31 above, wherein the foreign protein is human.
33. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 31 above, wherein the foreign protein is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody.
34. The foreign protein is growth hormone, lysosomal enzyme, somatomedin, insulin, glucagon, lysosomal enzyme, cytokine, lymphokine, blood coagulation factor, antibody, fusion protein of antibody and other protein, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle stimulating hormone (FSH), gonadotropin releasing hormone (GnRH), gonadotropin, DNase, thyroid stimulating hormone (TSH), nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell lineage stimulating factor ... 33. The nucleic acid molecule of any of 1 to 32 above, which is selected from the group consisting of neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon α, interferon β, interferon γ, interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor α receptor (TNF-α receptor), an enzyme having an activity of degrading beta-amyloid, etanercept, pegvisomant, metreleptin, abatacept, asfotase, and GLP-1 receptor agonist.
35. The foreign protein is a lysosomal enzyme, and the lysosomal enzyme is selected from the group consisting of α-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, GM2 activator protein, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, α-mannosidase, β-mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyelinase, and α-galactosidase. 33. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 32 above, wherein the nucleic acid molecule is selected from the group consisting of A, β-glucuronidase, heparan N-sulfatase, α-N-acetylglucosaminidase, acetyl-CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, acid ceramidase, amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1 and CLN2.
36. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 33 above, wherein the foreign protein is selected from the group consisting of an anti-IL-6 antibody, an anti-beta amyloid antibody, an anti-BACE antibody, an anti-EGFR antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-HER2 antibody, an anti-PCSK9 antibody, an anti-TNF-α antibody, and an antibody having affinity for a protein present on the surface of a vascular endothelial cell.
37. The nucleic acid molecule according to claim 36, wherein the protein present on the surface of a vascular endothelial cell is selected from the group consisting of transferrin receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transporter 1, organic anion transporter, monocarboxylate transporter, low-density lipoprotein receptor-related protein 1, low-density lipoprotein receptor-related protein 8, and a membrane-bound precursor of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor.
38. The foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein, the antibody is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody, and the other protein is a growth hormone, a lysosomal enzyme, a cytokine, a lymphokine, a blood coagulation factor, an antibody, a fusion protein of an antibody and another protein, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF), macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoietin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle-stimulating hormone, DNase, thyroid-stimulating hormone (TSH), or the like. 32. The nucleic acid molecule of any one of 1 to 31 above, which is selected from the group consisting of: neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon α, interferon β, interferon γ, interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor α receptor (TNF-α receptor), and an enzyme having an activity of degrading beta-amyloid.
39. The foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein, the antibody is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody, and the other protein is a lysosomal enzyme, the lysosomal enzyme being α-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, GM2 activator protein, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, α-mannosidase, β-mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyelinase, α-galactosidase 32. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 31 above, wherein the nucleic acid molecule is selected from the group consisting of A, β-glucuronidase, heparan N-sulfatase, α-N-acetylglucosaminidase, acetyl-CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, acid ceramidase, amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1 and CLN2.
40. The nucleic acid molecule according to claim 38 or 39, wherein the other protein is human.
41. The nucleic acid molecule according to any one of 38 to 40 above, wherein the antibody has affinity for a protein present on the surface of a vascular endothelial cell.
42. The nucleic acid molecule according to claim 41, wherein the protein present on the surface of a vascular endothelial cell is selected from the group consisting of transferrin receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transporter 1, organic anion transporter, monocarboxylate transporter, low-density lipoprotein receptor-related protein 1, low-density lipoprotein receptor-related protein 8, and a membrane-bound precursor of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor.
43. The nucleic acid molecule according to any one of 1 to 42 above, which is a circular plasmid.
44. A method for producing a recombinant AAV virion, comprising the step of introducing any one of the nucleic acid molecules according to 1 to 43 above into a host cell.
45. The method according to claim 44, wherein the genome of the host cell contains a base sequence including the E1A and E1B regions of adenovirus.
46. The method according to claim 45, wherein the host cell is a HEK293 cell.

本発明の一実施形態によれば，遺伝子治療等に使用できる，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸配列がパッケージされたrAAVビリオンを効率よく生産することができるので，rAAVビリオンが安価に供給できるようになり，遺伝子治療に必要な医療費を削減できる。 According to one embodiment of the present invention, rAAV virions packaged with a nucleic acid sequence including a base sequence encoding a foreign protein that can be used in gene therapy, etc., can be efficiently produced, making it possible to supply rAAV virions at low cost and reducing the medical costs required for gene therapy.

pHelper(mod)ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper(mod) vector. pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pAAV-CMV-GFP(mod) vector. pR2(mod)C6ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pR2(mod)C6 vector. pR2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pR2(mod)C9 vector. pHelper-ITR/CMV/GFPベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper-ITR/CMV/GFP vector. pHelper-R2(mod)C6ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper-R2(mod)C6 vector. pHelper-R2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper-R2(mod)C9 vector. pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector. pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector. pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector. pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector. 図１２は，実施例１６で得られた，培養上清中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定の結果を表す図である。縦軸はrAAVゲノム量（x1011）又は総カプシド量（x1011）を示す。黒棒はrAAVゲノム量，白棒は総カプシド量を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについての測定結果を示す。測定結果はrAAV9についてのみ示す。12 is a diagram showing the results of measuring the amount of rAAV genome and the amount of total capsid contained in the culture supernatant obtained in Example 16. The vertical axis indicates the amount of rAAV genome (x10 11 ) or the amount of total capsid (x10 11 ). The black bars indicate the amount of rAAV genome, and the white bars indicate the amount of total capsid. From the left, (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, were introduced, (2): when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, were introduced, (3): when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, (4): when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector, and (5): when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced. Measurement results are shown for rAAV9 only. 図１３は，実施例１８で得られた精製した細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定の結果を表す図である。縦軸はrAAVゲノム量（x1011）又は総カプシド量（x1011）を示す。黒棒はrAAVゲノム量，白棒は総カプシド量を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについての測定結果を示す。測定結果はrAAV9についてのみ示す。13 is a diagram showing the results of measuring the amount of rAAV genome and the amount of total capsid contained in the purified cell lysate solution obtained in Example 18. The vertical axis indicates the amount of rAAV genome (x10 11 ) or the amount of total capsid (x10 11 ). The black bars indicate the amount of rAAV genome, and the white bars indicate the amount of total capsid. From the left, (1): The results of transfection with two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2): The results of transfection with two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, (3): The results of transfection with two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, (4): The results of transfection with pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector, and (5): The results of transfection with three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, are shown. Measurement results are shown only for rAAV9. 図１４は，実施例１９で得られたrAAVビリオンの総カプシド中における存在比率の算出の結果を表す図である。縦軸は存在比率（％）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについての値を示す。測定結果はrAAV9についてのみ示す。14 is a diagram showing the results of calculating the abundance ratio in the total capsid of rAAV virions obtained in Example 19. The vertical axis shows the abundance ratio (%). From the left, the values are shown for (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, were introduced; (2): when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, were introduced; (3): when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced; (4): when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector, was introduced; and (5): when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced. The measurement results are shown only for rAAV9. 図１５は，実施例２０で得られた細胞溶解物溶液から精製したrAAV6ビリオンの感染能測定の結果を表す図である。縦軸はGFP陽性細胞の割合すなわちrAAV6ビリオンの感染効率（％）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，黒棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が2x108 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x108個）の場合，白棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が2x109 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x109個）の場合を示す。15 is a diagram showing the results of measuring the infectivity of rAAV6 virions purified from the cell lysate solution obtained in Example 20. The vertical axis shows the percentage of GFP-positive cells, i.e., the infection efficiency (%) of rAAV6 virions. From the left, (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pRC6 vector, were introduced; (2): when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector, were introduced; (3): when two types of plasmids, pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced; (4): when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector was introduced; and (5): when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector, were introduced. For each well, black bars indicate the amount of rAAV genome infected per well was 2 x 108 vg (i.e., the amount of rAAV virions was 2 x 108 ), and white bars indicate the amount of rAAV genome infected per well was 2 x 109 vg (i.e., the amount of rAAV virions was 2 x 109 ). 図１６は，実施例２１で得られた細胞溶解物溶液から精製したrAAV9ビリオンの感染能測定の結果を表す図である。縦軸はGFP陽性細胞の割合すなわちrAAV9ビリオンの感染効率（％）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）:統合rAAVプラスミド（pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクター）を導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，黒棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が2x109 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x109個）の場合，白棒は1 wellあたりに感染させたrAAVゲノム量が1x1010 vg（すなわちrAAVビリオン量が2x1010個）の場合を示す。16 is a diagram showing the results of measuring the infectivity of rAAV9 virions purified from the cell lysate solution obtained in Example 21. The vertical axis shows the percentage of GFP-positive cells, i.e., the infection efficiency (%) of rAAV9 virions. From the left, (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, were introduced; (2): when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, were introduced; (3): when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced; (4): when an integrated rAAV plasmid (pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector) was introduced; and (5): when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced. For each, the black bars represent the amount of rAAV genome infected per well at 2x109 vg (i.e., 2x109 rAAV virions), and the white bars represent the amount of rAAV genome infected per well at 1x1010 vg (i.e., the amount of rAAV virions was 2 x 10 図１７は，実施例２２で得られたrAAV6ビリオンのTransducing Unitの算出の結果を表す図である。縦軸はTransducing Unitの値（x105）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: 統合rAAVプラスミド（pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター）を導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，Transducing Unitの値を示す。17 is a diagram showing the results of calculation of the Transducing Unit of the rAAV6 virion obtained in Example 22. The vertical axis shows the Transducing Unit value (x10 5 ). From the left, the Transducing Unit values are shown for (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pRC6 vector, were introduced, (2): when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector, were introduced, (3): when two types of plasmids, pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, (4): when integrated rAAV plasmid (pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector) was introduced, and (5): when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector, were introduced. 図１８は，実施例２２で得られたrAAV9ビリオンのTransducing Unitの算出の結果を表す図である。縦軸はTransducing Unitの値（x105）を示す。左から順に，（1）: pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（2）: pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（3）: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類のプラスミドを導入した場合，（4）: 統合rAAVプラスミド（pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクター）を導入した場合，及び（5）: pHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合のそれぞれについて，Transducing Unitの値を示す。18 is a diagram showing the results of calculation of the Transducing Unit of the rAAV9 virion obtained in Example 22. The vertical axis shows the Transducing Unit value (x10 5 ). From the left, the Transducing Unit values are shown for (1): when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, were introduced, (2): when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, were introduced, (3): when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, (4): when integrated rAAV plasmid (pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector) was introduced, and (5): when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced. pAAV-CBA(BAM)-I2Sベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pAAV-CBA(BAM)-I2S vector. pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターの構造を示す模式図。Schematic diagram showing the structure of the pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9 vector.

外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いられる組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの生産には，通常，（１）AAV等のウイルスに由来する第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，及びこれら2つのITRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む構造を有するプラスミド（プラスミド１），（２）前記ITR配列に挟まれた領域（ITR配列を含む）の塩基配列を宿主細胞のゲノム中に組み込むために必要な機能を有するAAV Rep遺伝子と，AAVのカプシド蛋白質をコードする遺伝子とを含むプラスミド（プラスミド２），及び（３）アデノウイルスのE2A領域，E4領域，及びＶＡ１ ＲＮＡ領域を含むプラスミド（プラスミド３）の3種類のプラスミドが用いられる。 To produce recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions used to introduce foreign genes into cells, tissues, or living organisms, three types of plasmids are usually used: (1) a plasmid (plasmid 1) having a structure containing a base sequence containing a first inverted terminal repeat (ITR) and a base sequence containing a second inverted terminal repeat (ITR) derived from a virus such as AAV, and a gene encoding a desired protein arranged between these two ITRs; (2) a plasmid (plasmid 2) containing an AAV Rep gene having the function required to integrate the base sequence of the region (including the ITR sequence) sandwiched between the ITR sequences into the genome of a host cell, and a gene encoding the capsid protein of AAV; and (3) a plasmid (plasmid 3) containing the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region of adenovirus.

一般に，組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの生産には，まず，これら3種類のプラスミドが，アデノウイルスのE1a遺伝子とE1b遺伝子がゲノム中に組み込まれたHEK293細胞等の宿主細胞に導入される。そうすると第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列と第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，及びこれら2つのITRの間に配置された所望の蛋白質をコードする遺伝子を含む領域が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。この領域から1本鎖DNAが複製され，AAVのカプシド蛋白質にパッケージングされて，組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンが形成される。この組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンは，感染力を有するので，外来の遺伝子を細胞，組織，又は生体内に導入するために用いることができる。 In general, to produce recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions, these three types of plasmids are first introduced into host cells, such as HEK293 cells, in which the adenovirus E1a and E1b genes have been incorporated into the genome. Then, a region containing a base sequence containing the first inverted terminal repeat (ITR), a base sequence containing the second inverted terminal repeat (ITR), and a gene encoding a desired protein located between these two ITRs is incorporated into the genome of the host cell. Single-stranded DNA is replicated from this region and packaged into the capsid protein of AAV to form recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions. These recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions are infectious and can be used to introduce foreign genes into cells, tissues, or living organisms.

本発明は，その一実施形態において，組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンの生産に必要な，上記のプラスミド１～３の３種類のプラスミドの構成要素，すなわち（ａ）アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｂ）アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｃ）第一の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，（ｄ）第二の逆方向末端反復（ITR）を含む塩基配列，（ｅ）第一のITRと第二のITRとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，（ｆ）アデノウイルスのE2A蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，（ｇ）アデノウイルスのE4蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，及び（ｈ）アデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ又はその機能的等価物をコードする塩基配列を含む核酸分子に関する。 In one embodiment, the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising the components of the above three types of plasmids, plasmids 1 to 3, necessary for the production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions, namely (a) a base sequence encoding an adeno-associated virus Rep protein or a functional equivalent thereof, (b) a base sequence encoding an adeno-associated virus Cap protein or a functional equivalent thereof, (c) a base sequence including a first inverted terminal repeat (ITR), (d) a base sequence including a second inverted terminal repeat (ITR), (e) a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein located between the first and second ITRs and/or a base sequence encoding a foreign protein, (f) a base sequence encoding an adenovirus E2A protein or a functional equivalent thereof, (g) a base sequence encoding an adenovirus E4 protein or a functional equivalent thereof, and (h) a base sequence encoding an adenovirus VA1 RNA or a functional equivalent thereof.

本発明の一実施形態において，統合rAAVプラスミドというときは，上記（ａ）～（ｈ）の構成要素を含むプラスミドのことをいう。統合rAAVプラスミドは直鎖状であってもよく，環状であってもよい。 In one embodiment of the present invention, the term "integrated rAAV plasmid" refers to a plasmid containing the components (a) to (h) above. The integrated rAAV plasmid may be linear or circular.

更に，本発明は，その一実施形態において，該Rep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，該Cap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，及び，該外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列を含む塩基配列を更に含む核酸分子に関する。 Furthermore, in one embodiment, the present invention relates to a nucleic acid molecule further comprising a base sequence including a first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein, a base sequence including a second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein, and a base sequence including a third gene expression control site that controls the expression of the foreign protein.

アデノ随伴ウイルス（AAV）のRep蛋白質は，AAVのrep遺伝子にコードされる。Rep蛋白質は，例えばAAVゲノムを，当該ゲノム中に存在するITRを介して，宿主細胞のゲノム中に組み込むために必要な機能を有する。Rep蛋白質は複数のサブタイプが存在するが，AAVゲノムの宿主細胞のゲノムへの組み込みには，Rep68とRep78の2種類が必要とされる。Rep68とRep78は，同一の遺伝子から選択的スプライシングにより転写される2種類のmRNAの翻訳産物である。本発明においてAAVのRep蛋白質というときは，少なくともRep68とRep78の2種類の蛋白質を含むものである。 The Rep protein of adeno-associated virus (AAV) is encoded by the AAV rep gene. The Rep protein has the necessary function of integrating, for example, the AAV genome into the genome of a host cell via the ITRs present in the genome. There are multiple subtypes of Rep proteins, but two types, Rep68 and Rep78, are required for the integration of the AAV genome into the genome of a host cell. Rep68 and Rep78 are the translation products of two types of mRNA transcribed by alternative splicing from the same gene. In the present invention, the AAV Rep protein includes at least the two types of proteins, Rep68 and Rep78.

本発明の一実施形態において，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質をコードする塩基配列というときは，少なくともRep68とRep78をコードする塩基配列，又はこれに変異を加えた塩基配列のことをいう。Rep蛋白質は，好ましくは血清型2のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。野生型の血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列は配列番号１で示される塩基配列を有する。野生型の血清型2のAAVのRep68及びRep78は，それぞれ配列番号２及び配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する。 In one embodiment of the present invention, the base sequence encoding the Rep protein of an adeno-associated virus refers to a base sequence encoding at least Rep68 and Rep78, or a base sequence with a mutation therein. The Rep protein is preferably that of an AAV of serotype 2, but is not limited thereto, and may be any of serotypes 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11. The base sequence encoding the Rep protein of a wild-type AAV of serotype 2 has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Rep68 and Rep78 of a wild-type AAV of serotype 2 have the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.

また，Rep68は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のRep68のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明において，これら変異を加えたRep68も，Rep68に含まれる。 In addition, Rep68 may be modified by substitution, deletion, addition, or other such changes to the amino acid sequence of wild-type Rep68 of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, so long as it exerts its function. In the present invention, Rep68 with these mutations is also included in Rep68.

野生型のRep68のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型のRep68のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたRep68も，Rep68である。アミノ酸を付加する場合，野生型のRep68のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたRep68も，Rep68に含まれる。変異を加えたRep68のアミノ酸配列は，野生型のRep68のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When amino acids in the amino acid sequence of wild-type Rep68 are replaced with other amino acids, the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. When amino acids in the amino acid sequence of wild-type Rep68 are deleted, the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. Rep68 with mutations that combine these amino acid substitutions and deletions is also Rep68. When amino acids are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added in the amino acid sequence or to the N-terminus or C-terminus of wild-type Rep68. Rep68 with mutations that combine these amino acid additions, substitutions, and deletions is also included in Rep68. The amino acid sequence of the mutated Rep68 preferably exhibits 85% or more homology with the amino acid sequence of wild-type Rep68, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

また，Rep78は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のRep78のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明において，これら変異を加えたRep78も，Rep78に含まれる。 In addition, Rep78 may be modified by substitution, deletion, addition, or other such changes to the amino acid sequence of wild-type Rep78 of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, so long as it exerts its function. In the present invention, Rep78 with these mutations is also included in Rep78.

野生型のRep78のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型のRep78のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたRep78も，Rep78である。アミノ酸を付加する場合，野生型のRep78のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたRep78も，Rep78に含まれる。変異を加えたRep78のアミノ酸配列は，野生型のRep78のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When amino acids in the amino acid sequence of wild-type Rep78 are replaced with other amino acids, the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. When amino acids in the amino acid sequence of wild-type Rep78 are deleted, the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. Rep78 with mutations that combine these amino acid substitutions and deletions is also Rep78. When amino acids are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence or the N-terminus or C-terminus of wild-type Rep78. Rep78 with mutations that combine these amino acid additions, substitutions, and deletions is also included in Rep78. The amino acid sequence of the mutated Rep78 preferably exhibits 85% or more homology with the amino acid sequence of wild-type Rep78, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

AAVのRep蛋白質の機能的等価物とは，Rep68にあっては，機能的にRep68に代えて用いることができるものをいい，Rep78にあっては，機能的にRep78に代えて用いることができるものをいう。 A functional equivalent of the AAV Rep protein refers to a substance that can be used functionally in place of Rep68, and a substance that can be used functionally in place of Rep78.

配列番号１で示される塩基配列は，機能的なRep68及びRep78をコードするものである限り，置換，欠失，付加等の改変を加えることができる。配列番号１で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep蛋白質をコードする塩基配列として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep蛋白質をコードする核酸分子として使用できる。変異を加えた塩基配列は，配列番号１で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。但し，これら変異を加える場合において，Rep蛋白質のRep68とRep78とをコードする遺伝子の開始コドンをACGとすることが好ましい。 The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be modified by substitution, deletion, addition, etc., so long as it encodes functional Rep68 and Rep78. When a base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with another base, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When a base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as a base sequence encoding a Rep protein. When a base is added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or to the 5' end or 3' end. A mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as a nucleic acid molecule encoding a Rep protein. The mutated base sequence preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology. However, when adding these mutations, it is preferable that the start codons of the genes encoding the Rep proteins Rep68 and Rep78 are ACG.

本発明の好ましい一実施形態における，Rep蛋白質をコードする核酸分子として，配列番号４で示される塩基配列を含むものが挙げられる。この核酸分子は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するRep蛋白質のRep68と，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するRep蛋白質のRep78とをコードする。また，この核酸分子において，Rep蛋白質のRep68とRep78とをコードする遺伝子の開始コドンはACGである。この塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Rep蛋白質をコードするものである限り，Rep蛋白質をコードする核酸分子である。 In a preferred embodiment of the present invention, a nucleic acid molecule encoding a Rep protein includes a nucleic acid molecule containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. This nucleic acid molecule encodes the Rep protein Rep68 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the Rep protein Rep78 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. In this nucleic acid molecule, the initiation codon of the genes encoding the Rep proteins Rep68 and Rep78 is ACG. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to this base sequence are also nucleic acid molecules encoding Rep proteins, so long as they still encode Rep proteins.

本発明の一実施形態においてアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質をコードする塩基配列というときは，少なくともAAVのカプシドを構成する蛋白質の一種であるVP1をコードする塩基配列，又はこれに変異を加えた塩基配列を含む塩基配列のことをいう。VP1は，好ましくは血清型9のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，１０又は１１の何れのものであってもよい。野生型の血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列は配列番号５で示される塩基配列を有する。野生型の血清型6のAAVのVP1は，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する。野生型の血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列は配列番号７で示される塩基配列を有する。野生型の血清型9のAAVのVP1は，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する。 In one embodiment of the present invention, the base sequence encoding the Cap protein of an adeno-associated virus refers to a base sequence encoding at least VP1, which is one of the proteins that constitute the capsid of AAV, or a base sequence containing a mutated base sequence thereof. VP1 is preferably that of AAV serotype 9, but is not limited thereto, and may be any of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, or 11. The base sequence encoding VP1 of wild-type AAV serotype 6 has the base sequence shown in SEQ ID NO:5. VP1 of wild-type AAV serotype 6 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6. The base sequence encoding VP1 of wild-type AAV serotype 9 has the base sequence shown in SEQ ID NO:7. VP1 of wild-type AAV serotype 9 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8.

また，VP1は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のVP1のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたVP1も，VP1に含まれる。 In addition, VP1 may be modified by substitution, deletion, addition, or other alteration to the amino acid sequence of wild-type VP1 of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, so long as it exerts its function. In one embodiment of the present invention, VP1 with these mutations is also included in VP1.

野生型のVP1のアミノ酸配列中，例えば配列番号６で示される野生型の血清型6のAAVのVP1のアミノ酸配列又は配列番号９で示される野生型の血清型9のAAVのVP1のアミノ酸配列，のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型のVP1のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたVP1も，VP1である。アミノ酸を付加する場合，野生型のVP1のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたVP1も，VP1に含まれる。変異を加えたVP1のアミノ酸配列は，野生型のVP1のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 In the amino acid sequence of wild-type VP1, for example, the amino acid sequence of wild-type serotype 6 AAV VP1 shown in SEQ ID NO: 6 or the amino acid sequence of wild-type serotype 9 AAV VP1 shown in SEQ ID NO: 9, when replacing amino acids with other amino acids, the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. In the amino acid sequence of wild-type VP1, when deleting amino acids, the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. In addition, VP1 with mutations that combine these amino acid substitutions and deletions is also VP1. When adding amino acids, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added in the amino acid sequence of wild-type VP1 or to the N-terminus or C-terminus. VP1 with mutations that combine these amino acid additions, substitutions, and deletions is also included in VP1. The amino acid sequence of the mutated VP1 preferably exhibits 85% or more homology with the amino acid sequence of wild-type VP1, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

AAVのVP1の機能的等価物とは，機能的にVP1に代えて用いることができるものをいう。 A functional equivalent of AAV VP1 refers to something that can be used functionally in place of VP1.

本発明の好ましい一実施形態におけるCap蛋白質をコードする核酸分子として，配列番号５又は７で示される塩基配列を含むものが挙げられる。これらの核酸分子は，それぞれ，野生型の血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列と野生型の血清型9型のAAVのVP1をコードする塩基配列である。これら塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，機能的なVP1をコードするものである限り，Cap蛋白質をコードする核酸分子である。 In a preferred embodiment of the present invention, a nucleic acid molecule encoding a Cap protein includes a nucleic acid molecule containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7. These nucleic acid molecules are the base sequence encoding VP1 of wild-type AAV serotype 6 and the base sequence encoding VP1 of wild-type AAV serotype 9, respectively. Any nucleic acid molecule that has been modified by substitution, deletion, addition, or other such modification is also a nucleic acid molecule encoding a Cap protein, so long as it encodes a functional VP1.

配列番号５又は７で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号５又は７で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap蛋白質をコードする塩基配列として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号５又は７で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap蛋白質をコードする核酸分子として使用できる。変異を加えた塩基配列は，配列番号５又は７で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Furthermore, a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as a base sequence encoding a Cap protein. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 or to the 5' end or 3' end. A mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as a nucleic acid molecule encoding a Cap protein. The mutated base sequence preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

本発明の一実施形態において，アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）というときは，宿主細胞のゲノム配列中に非相同組換えによりアデノ随伴ウイルスの遺伝子が組み込まれるために必須の塩基配列のことをいう。本発明の一実施形態において，核酸分子中には，アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）が２つ存在し，それぞれ第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR），第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）という。ここで，２つのITRの間に，外来の蛋白質をコードする遺伝子を配置したときに，5’側に位置するITRを第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）といい，3’側に位置するITRを第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）という。 In one embodiment of the present invention, the inverted terminal repeat (ITR) of the adeno-associated virus refers to a base sequence essential for the incorporation of an adeno-associated virus gene into the genome sequence of a host cell by non-homologous recombination. In one embodiment of the present invention, there are two adeno-associated virus inverted terminal repeats (ITR) in a nucleic acid molecule, which are called the first adeno-associated virus inverted terminal repeat (ITR) and the second adeno-associated virus inverted terminal repeat (ITR). Here, when a gene encoding a foreign protein is placed between the two ITRs, the ITR located on the 5' side is called the first adeno-associated virus inverted terminal repeat (ITR), and the ITR located on the 3' side is called the second adeno-associated virus inverted terminal repeat (ITR).

逆方向末端反復（ITR）は，好ましくは血清型2のAAVのものであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。血清型2のAAVの逆方向末端反復（ITR）は，第一のITRが配列番号９で示される塩基配列を含み，第二のITRが配列番号１０で示される塩基配列を含む。 The inverted terminal repeats (ITRs) are preferably those of AAV of serotype 2, but are not limited thereto and may be any of serotypes 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11. The inverted terminal repeats (ITRs) of AAV of serotype 2 include a first ITR containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a second ITR containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.

また，逆方向末端反復（ITR）は，その機能を発揮する限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のITRの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。これら変異を加えたITRも，ITRに含まれる。 In addition, the inverted terminal repeat (ITR) may be modified by substitution, deletion, addition, or other such changes to the base sequence of the wild-type ITR of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, so long as it still exhibits its function. ITRs with such mutations are also included in the ITR.

野生型のITRの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。ITRの塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，ITRである。塩基を付加する場合，野生型のITRの塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，ITRに含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，野生型のITRの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the wild-type ITR are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the ITR are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. In addition, an ITR with a mutation that combines the substitution and deletion of these bases is also an ITR. When bases are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence or the 5' end or 3' end of the wild-type ITR. ITRs with a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases are also included in ITRs. The base sequence of the mutated ITR preferably shows 85% or more homology with the base sequence of the wild-type ITR, more preferably shows 90% or more homology, even more preferably shows 95% or more homology, and even more preferably shows 98% or more homology.

AAVのITRの機能的等価物とは，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものをいう。また，AAVのITRに基づいて人工的に構築されたITRも，AAVのITRを代替することができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物である。 A functional equivalent of an AAV ITR is one that can be used functionally in place of an AAV ITR. In addition, an artificially constructed ITR based on an AAV ITR is also a functional equivalent of an AAV ITR as long as it can replace an AAV ITR.

かかる人工的に構築された第１の逆方向末端反復（第一のITR）として，配列番号１１で示される塩基配列を有するものが挙げられる。この配列番号１１で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物に含まれる。配列番号１１で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第一のITRである。配列番号１１で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第一のITRに含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，配列番号１１で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 An example of such an artificially constructed first inverted terminal repeat (first ITR) is one having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11. This base sequence shown in SEQ ID NO: 11 with substitutions, deletions, or mutations is also included in the functional equivalent of the AAV ITR, so long as it can be used functionally in place of the AAV ITR. When a base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is replaced with another base, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. When a base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. An ITR with a mutation that combines the substitution and deletion of these bases is also the first ITR. When a base is added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence or to the 5' end or 3' end. The first ITR also includes ITRs with mutations that combine the addition, substitution, and deletion of these bases. The base sequence of the mutated ITR preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO:11, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

また，かかる人工的に構築された第２の逆方向末端反復（第二のITR）として，配列番号１２で示される塩基配列を有するものが挙げられる。この配列番号１２で示される塩基配列に，置換，欠失，変異を加えたものも，機能的にAAVのITRに代えて用いることができるものである限り，AAVのITRの機能的等価物に含まれる。配列番号１２で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１２で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第二のITRである。配列番号１２で示される塩基配列に塩基を付加する場合，当該塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたITRも，第二のITRに含まれる。変異を加えたITRの塩基配列は，配列番号１２で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 An example of such an artificially constructed second inverted terminal repeat (second ITR) is one having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12. A base sequence shown in SEQ ID NO: 12 to which substitutions, deletions, or mutations have been added is also included in the functional equivalent of the ITR of AAV, so long as it can be used functionally in place of the ITR of AAV. When a base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is replaced with another base, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. When a base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. An ITR to which a mutation has been added by combining the substitution and deletion of these bases is also a second ITR. When a base is added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added in the base sequence or to the 5' end or 3' end. The second ITR also includes ITRs that have been mutated by combining the addition, substitution, and deletion of these bases. The base sequence of the mutated ITR preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

本発明の一実施形態において，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）と，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）との間には，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列が存在する。 In one embodiment of the present invention, between the inverted terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus and the inverted terminal repeat (ITR) of the second adeno-associated virus, there is a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein and/or a base sequence encoding a foreign protein.

本発明の一実施形態において，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列というときは，制限酵素で特異的に切断することのできる塩基配列を含む塩基配列のことをいう。いわゆるマルチクローニングサイトもこれに含まれる。この塩基配列を制限酵素で切断し，この切断箇所に所望の外来の蛋白質をコードする核酸分子を挿入することができる。 In one embodiment of the present invention, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein refers to a base sequence that contains a base sequence that can be specifically cleaved with a restriction enzyme. This also includes so-called multicloning sites. This base sequence can be cleaved with a restriction enzyme, and a nucleic acid molecule encoding a desired foreign protein can be inserted at the cleavage site.

本発明の一実施形態において，核酸分子中にコードされることのできる外来の蛋白質に特に制限はない。外来の蛋白質が特定の生物種に由来するものである場合，その生物種に特に制限はなく，原核細胞，真核細胞のゲノムにコードされる蛋白質の何れであってもよい。ここで真核細胞は，例えば，真菌類，酵母，昆虫，原虫，両生類，爬虫類，鳥類，哺乳動物，植物である。また，生物種が哺乳動物である場合，例えば，ヒト，ヒト以外の霊長類，ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ等の家畜，ネコ，イヌ等の愛玩動物である。また，外来の蛋白質は，特定の生物種に由来する野生型の蛋白質のアミノ酸配列に，置換，欠失，付加等の変異を加えたものであってもよい。また，外来の蛋白質は，天然には存在しないアミノ酸配列を含む，人工的な蛋白質であってもよい。 In one embodiment of the present invention, there is no particular limitation on the foreign protein that can be encoded in the nucleic acid molecule. When the foreign protein is derived from a specific biological species, there is no particular limitation on the biological species, and the foreign protein may be any protein encoded in the genome of a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. Here, eukaryotic cells are, for example, fungi, yeast, insects, protozoa, amphibians, reptiles, birds, mammals, and plants. When the biological species is mammalian, the examples include humans, non-human primates, livestock such as cows, horses, pigs, and sheep, and pets such as cats and dogs. Furthermore, the foreign protein may be a protein obtained by adding a mutation such as substitution, deletion, or addition to the amino acid sequence of a wild-type protein derived from a specific biological species. Furthermore, the foreign protein may be an artificial protein that includes an amino acid sequence that does not exist in nature.

外来の蛋白質が，野生型の蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。野生型の蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加する場合，野生型の蛋白質のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異が加えられた蛋白質のアミノ酸配列は，対応する野生型の蛋白質のアミノ酸配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When a foreign protein replaces an amino acid in the amino acid sequence of a wild-type protein with another amino acid, the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. When an amino acid in the amino acid sequence of a wild-type protein is deleted, the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. Mutations combining the substitution and deletion of these amino acids can also be added. When adding amino acids, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added in the amino acid sequence or to the N-terminus or C-terminus of the wild-type protein. Mutations combining the addition, substitution, and deletion of these amino acids can also be added. The amino acid sequence of the mutated protein preferably exhibits 85% or more homology with the amino acid sequence of the corresponding wild-type protein, more preferably exhibits 90% or more homology, more preferably exhibits 95% or more homology, and even more preferably exhibits 98% or more homology.

本発明の一実施形態において，外来の蛋白質に特に制限はないが，例えば，遺伝子疾患において一部又は全部が機能的に欠損している蛋白質が挙げられる。かかる遺伝子疾患としては，ライソソーム病，嚢胞性繊維症，血友病が例示できる。その他，外来の蛋白質として，成長ホルモン，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びＧＬＰ－１受容体アゴニストが例示できる。 In one embodiment of the present invention, the foreign protein is not particularly limited, but examples thereof include proteins that are partially or completely functionally deficient in genetic diseases. Examples of such genetic diseases include lysosomal diseases, cystic fibrosis, and hemophilia. Other foreign proteins include growth hormone, somatomedin, insulin, glucagon, lysosomal enzymes, cytokines, lymphokines, blood coagulation factors, antibodies, fusion proteins of antibodies and other proteins, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle-stimulating hormone (FSH), gonadotropin-releasing hormone (GnRH), gonadotropin, DNase, thyroid-stimulating hormone (TSH), nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNF), and the like. NTF), glial cell line neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon α, interferon β, interferon γ, interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor α receptor (TNF-α receptor), enzymes with beta-amyloid degrading activity, etanercept, pegvisomant, metreleptin, abatacept, asfotase, and GLP-1 receptor agonists are examples.

また，外来の蛋白質として，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体が例示できる。更に，外来の蛋白質として，抗ＩＬ－６抗体，抗ベータアミロイド抗体，抗ＢＡＣＥ抗体，抗ＥＧＦＲ抗体，抗ＰＤ－１抗体，抗ＰＤ－Ｌ１抗体，抗ＨＥＲ２抗体，抗ＰＣＳＫ９抗体，及び抗ＴＮＦ-α抗体が例示できる。 Furthermore, examples of foreign proteins include mouse antibodies, humanized antibodies, human-mouse chimeric antibodies, and human antibodies.Furthermore, examples of foreign proteins include anti-IL-6 antibodies, anti-beta amyloid antibodies, anti-BACE antibodies, anti-EGFR antibodies, anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, anti-HER2 antibodies, anti-PCSK9 antibodies, and anti-TNF-α antibodies.

外来の蛋白質がリソソーム酵素である場合にあっては，外来の蛋白質の遺伝子として，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２が例示できる。 When the foreign protein is a lysosomal enzyme, the gene for the foreign protein may be α-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, GM2 activator protein, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, α-mannosidase, β-mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyelinase, α-galactosidase Examples include A, β-glucuronidase, heparan N-sulfatase, α-N-acetylglucosaminidase, acetyl CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, acid ceramidase, amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1, and CLN2.

外来の蛋白質は，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であってもよい。かかる融合蛋白質としては，抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体の何れかであり，そして他の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），及びベータアミロイドを分解する活性を有する酵素の何れかであるものが例示できる。 The foreign protein may be a fusion protein of an antibody and another protein. In such a fusion protein, the antibody is any one of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody, and the other protein is a growth hormone, a lysosomal enzyme, a cytokine, a lymphokine, a blood coagulation factor, an antibody, a fusion protein of an antibody and another protein, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoietin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle-stimulating hormone, DNase, thyroid-stimulating hormone (TSH), neurotransmitter, etc. Examples include growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon α, interferon β, interferon γ, interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor α receptor (TNF-α receptor), and enzymes that have the activity of degrading beta amyloid.

外来の蛋白質は，抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質であってもよい。かかる融合蛋白質としては，抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体の何れかであり，そしてリソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２の何れかであるものが例示できる。 The foreign protein may be a fusion protein of an antibody and a lysosomal enzyme. In such a fusion protein, the antibody is any one of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody, and the lysosomal enzyme is any one of α-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, GM2 activator protein, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, α-mannosidase, β-mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyelinase, and α-galactosidase. Examples include enzymes selected from the group consisting of A, β-glucuronidase, heparan N-sulfatase, α-N-acetylglucosaminidase, acetyl CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, acid ceramidase, amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1, and CLN2.

外来の蛋白質が抗体と他の蛋白質との融合蛋白質又は抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質である場合の抗体は，例えば，血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して特異的な親和性を有する抗体である。かかる蛋白質としては，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体が例示できる。更に，有機アニオントランスポーターとしてはＯＡＴＰ－Ｆが，モノカルボン酸トランスポーターとしてはＭＣＴ－８が例示できる。 When the foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein or an antibody and a lysosomal enzyme, the antibody is, for example, an antibody that has a specific affinity for a protein present on the surface of vascular endothelial cells. Examples of such proteins include transferrin receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transporter 1, organic anion transporter, monocarboxylate transporter, low-density lipoprotein receptor-related protein 1, low-density lipoprotein receptor-related protein 8, and the membrane-bound precursor of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor. Furthermore, an example of an organic anion transporter is OATP-F, and an example of a monocarboxylate transporter is MCT-8.

第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，及び第一のITRと第二のITRとの間に位置する，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域をトランスファー領域という。 The region that contains the base sequence containing the inverted terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, the base sequence containing the inverted terminal repeat (ITR) of the second adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, and the base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein and/or the base sequence encoding a foreign protein, located between the first ITR and the second ITR, is called the transfer region.

アデノウイルスは，宿主細胞中でAAVのゲノムが複製されてカプシドにパッケージングされてウイルスビリオンを形成するために必要な機能を提供する。この機能は，アデノウイルスゲノムのＥ１領域，E2A領域，E4領域，及びＶＡ１ ＲＮＡ領域により発揮される。 Adenoviruses provide the functions necessary for the AAV genome to replicate in host cells, be packaged into capsids, and form viral virions. This function is exerted by the E1, E2A, E4, and VA1 RNA regions of the adenovirus genome.

本発明の一実施形態において，組換えAAVビリオン（rAAVビリオン）というときは，AAVのカプシド蛋白質（その機能的等価物を含む）に，野生型のAAVのゲノムに改変が加えられた核酸分子，例えばrAAVゲノムがパッケージングされたものをいう。ここで，rAAVゲノム（組換えAAVゲノム）というときは，野生型のAAVのゲノムに改変が加えられた核酸分子のことをいう。rAAVビリオンにパッケージングされるrAAVゲノムは１本鎖DNAである。かかる核酸分子としては，５’末端から側から，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域，及び第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む１本鎖DNAがある。但し，rAAVビリオンにパッケージングされていない当該核酸分子も，rAAVゲノムということができる。従って，rAAVゲノムは一本鎖DNAであっても二本鎖DNAであってもよい。 In one embodiment of the present invention, a recombinant AAV virion (rAAV virion) refers to a nucleic acid molecule in which a wild-type AAV genome has been modified, such as a rAAV genome, packaged in an AAV capsid protein (including its functional equivalent). Here, a rAAV genome (recombinant AAV genome) refers to a nucleic acid molecule in which a wild-type AAV genome has been modified. The rAAV genome packaged in the rAAV virion is single-stranded DNA. Such a nucleic acid molecule includes single-stranded DNA that includes, from the 5' end, a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, a region including a base sequence encoding a foreign protein, and an inverted terminal repeat (ITR) of a second adeno-associated virus. However, the nucleic acid molecule that is not packaged in the rAAV virion can also be referred to as an rAAV genome. Therefore, the rAAV genome may be single-stranded DNA or double-stranded DNA.

本発明の一実施形態において，rAAVゲノム量とは，rAAVゲノムの個数のことを意味し，その単位はvgである。 In one embodiment of the present invention, the amount of rAAV genome means the number of rAAV genomes, and its unit is vg.

本発明の一実施形態において，空カプシドとは，rAAVゲノムがパッケージングされていないカプシド蛋白質で構成されている粒子のことをいう。また，総カプシドとは空カプシドとrAAVビリオンの総称であり，総カプシド量とは空カプシドとrAAVビリオンの個数を足しあわせた個数のことである。 In one embodiment of the present invention, an empty capsid refers to a particle composed of capsid protein in which the rAAV genome is not packaged. In addition, total capsid is a general term for empty capsids and rAAV virions, and the total capsid amount refers to the total number of empty capsids and rAAV virions.

また，組換えAAVビリオンにおいて，そのカプシド蛋白質が血清型6のAAVに由来するものであるときは組み換えAAV6ビリオン（rAAV6ビリオン）ということができ，カプシド蛋白質が血清型9のAAVに由来するときは組み換えAAV9ビリオン（rAAV9ビリオン）ということができるものとする。その他の血清型のAAVについても同様とする。 In addition, a recombinant AAV virion whose capsid protein is derived from AAV serotype 6 can be called a recombinant AAV6 virion (rAAV6 virion), and whose capsid protein is derived from AAV serotype 9 can be called a recombinant AAV9 virion (rAAV9 virion). The same applies to AAV of other serotypes.

更に，かかる核酸分子としては，５’末端から側から第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，該外来の蛋白質の発現を制御する遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域，及び第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む１本鎖DNAがある。 Furthermore, such nucleic acid molecules include a single-stranded DNA that includes, from the 5' end, a base sequence that includes the inverted terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, a base sequence that includes a gene expression control site that controls the expression of the foreign protein, a region that includes a base sequence that codes for the foreign protein, and the inverted terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus.

更に，かかる核酸分子としては，５’末端から側から第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，該外来の蛋白質の発現を制御する遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，イントロン配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む領域，ポリＡ配列，及び第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）を含む１本鎖DNAがある。ここで，イントロン配列として用い得る塩基配列に，特に制限はないが，ヒトβグロビン遺伝子に変異を導入した合成ヒトβグロビンイントロン，例えば，配列番号２５で示される塩基配列を含むイントロンが好適に使用し得る。また，ポリアデニレーションシグナル配列（ポリＡ配列）として用い得る塩基配列に，特に制限はないが，配列番号２６で示される塩基配列を含む合成ポリアデニレーションシグナル配列（合成ポリＡ配列）の塩基配列がある。 Furthermore, such a nucleic acid molecule includes a single-stranded DNA including, from the 5' end, a base sequence including the inverted terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, a base sequence including a gene expression control site that controls the expression of the foreign protein, an intron sequence, a region including a base sequence that codes for a foreign protein, a polyA sequence, and the inverted terminal repeat (ITR) of the first adeno-associated virus. Here, there is no particular limitation on the base sequence that can be used as the intron sequence, but a synthetic human β-globin intron obtained by introducing a mutation into the human β-globin gene, for example, an intron including the base sequence shown in SEQ ID NO: 25, can be preferably used. In addition, there is no particular limitation on the base sequence that can be used as the polyadenylation signal sequence (polyA sequence), but there is a base sequence of a synthetic polyadenylation signal sequence (synthetic polyA sequence) including the base sequence shown in SEQ ID NO: 26.

宿主細胞中で，組換えAAVビリオンが形成されるためには，アデノウイルスのＥ１領域が有する機能が必要とされる。一般に，組換えAAVビリオンの作製は，E1領域の全部又はその一部を有する宿主細胞が用いられる。かかる細胞として，HEK293細胞が知られている。HEK293細胞のゲノム中には，E1A及びE1Bのコーディング領域が少なくとも含まれている。 The function of the E1 region of adenovirus is required for the formation of recombinant AAV virions in host cells. Generally, host cells that contain all or part of the E1 region are used to produce recombinant AAV virions. HEK293 cells are known as such cells. The genome of HEK293 cells contains at least the coding regions of E1A and E1B.

Ｅ１領域の全部又はその一部を有する宿主細胞を用いる場合に，AAVのゲノムが複製されてカプシドにパッケージングされてウイルスビリオンを形成するために必要なアデノウイルスゲノムの領域は，E2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域である。これらの領域は，AAV複製のために必要とされる蛋白質及びRNAをコードしている。E4領域によって提供される機能に関しては，E4領域のオープンリーディングフレーム６(ORF6)によってコードされるE4 34kD蛋白質がAAVの複製に必要とされる。 When using a host cell having all or part of the E1 region, the regions of the adenovirus genome necessary for the AAV genome to be replicated and packaged into capsids to form viral virions are the E2A region, the E4 region, and the VA1 RNA region. These regions code for proteins and RNA required for AAV replication. With regard to the functions provided by the E4 region, the E4 34 kD protein encoded by the open reading frame 6 (ORF6) of the E4 region is required for AAV replication.

本発明の一実施形態における，E2A領域は，AAV複製のために必要とされる本来の機能を発揮するものである限り，血清型が２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，又はブタＡｄ３型の何れのアデノウイルスのものであってもよい。血清型２であるアデノウイルスのE2A領域は，本発明において好適なものの一つである。血清型２であるアデノウイルスのE2A領域は配列番号１３で示される塩基配列を含む。 In one embodiment of the present invention, the E2A region may be that of any of the adenoviruses whose serotypes are 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, bovine Ad3, canine Ad2, ovine Ad, or porcine Ad3, as long as it exerts the original functions required for AAV replication. The E2A region of serotype 2 adenovirus is one of the preferred regions in the present invention. The E2A region of serotype 2 adenovirus contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.

また，E2A領域として，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，野生型のアデノウイルスのE2A領域に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものを使用することもできる。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたE2A領域も，E2A領域に含まれる。 In addition, the E2A region may be a wild-type adenovirus E2A region that has been modified by substitution, deletion, addition, or other means, so long as the region still exhibits its inherent function. In one embodiment of the present invention, the E2A region includes E2A regions that have been modified in this way.

野生型のE2A領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。E2A領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたE2A領域も，E2A領域である。塩基を付加する場合，野生型のE2A領域の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたE2A領域も，E2A領域に含まれる。変異を加えたE2A領域の塩基配列は，野生型のE2Aの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the wild-type E2A region are replaced with other bases, the number of bases replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the E2A region are deleted, the number of bases deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Furthermore, E2A regions with mutations that combine these base substitutions and deletions are also included in the E2A region. When bases are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence or the 5' end or 3' end of the wild-type E2A region. E2A regions with mutations that combine these base additions, substitutions, and deletions are also included in the E2A region. The base sequence of the mutated E2A region preferably exhibits 85% or more homology with the wild-type E2A base sequence, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

本発明の一実施形態における，E4領域は，AAV複製のために必要とされる本来の機能を発揮するものである限り，血清型が２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，又はブタＡｄ３型の何れのアデノウイルスのものであってもよい。血清型２であるアデノウイルスのE4領域は，本発明において好適なものの一つである。血清型２であるアデノウイルスのE4領域は配列番号１４で示される塩基配列を含む。 In one embodiment of the present invention, the E4 region may be that of any of the adenoviruses whose serotypes are 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, bovine Ad3, canine Ad2, ovine Ad, or porcine Ad3, as long as it exerts the original functions required for AAV replication. The E4 region of serotype 2 adenovirus is one of the preferred regions in the present invention. The E4 region of serotype 2 adenovirus contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.

また，E4領域として，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，野生型のアデノウイルスのE4領域に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものを使用することもできる。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたE4領域も，E4領域に含まれる。 In addition, the E4 region may be a wild-type adenovirus E4 region that has been modified by substitution, deletion, addition, or other means, so long as the E4 region exerts its inherent function. In one embodiment of the present invention, the E4 region includes E4 regions that have been modified in this way.

野生型のE4領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。E4領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたE4領域も，E4領域である。塩基を付加する場合，野生型のE4の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたE4も，E4に含まれる。変異を加えたE4の塩基配列は，野生型のE4の塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the wild-type E4 region are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the E4 region are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Furthermore, an E4 region in which a mutation has been added by combining the substitution and deletion of these bases is also an E4 region. When bases are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added in the base sequence of the wild-type E4 or to the 5' end or 3' end. E4 in which a mutation has been added by combining the addition, substitution, and deletion of these bases is also included in E4. The base sequence of the mutated E4 preferably shows 85% or more homology with the base sequence of the wild-type E4, more preferably shows 90% or more homology, even more preferably shows 95% or more homology, and even more preferably shows 98% or more homology.

E4領域の好適な一例として，配列番号１５で示される塩基配列を含むものがある。この配列番号１５で示される塩基配列に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，E4領域として使用できる。 A suitable example of an E4 region is one that contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 15. Modifications to this base sequence shown in SEQ ID NO: 15, such as substitutions, deletions, and additions, can also be used as the E4 region, so long as the region exerts its original function.

配列番号１５で示される塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。E4領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。塩基を付加する場合，配列番号１５で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた塩基配列は，配列番号１５で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。これらの変異を加えたものも，E4領域である。 When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the E4 region are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Mutations combining these base substitutions and deletions can also be added. When bases are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or to the 5' end or 3' end. Mutations combining these base additions, substitutions, and deletions can also be added. The base sequence with the mutations preferably shows 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 15, more preferably shows 90% or more homology, even more preferably shows 95% or more homology, and even more preferably shows 98% or more homology. The region with these mutations is also the E4 region.

本発明の一実施形態における，VA1 RNA領域は，AAV複製のために必要とされる本来の機能を発揮するものである限り，血清型が２，１，５，６，１９，３，１１，７，１４，１６，２１，１２，１８，３１，８，９，１０，１３，１５，１７，１９，２０，２２，２３，２４～３０，３７，４０，４１，ＡｄＨｕ２，ＡｄＨｕ３，ＡｄＨｕ４，ＡｄＨｕ２４，ＡｄＨｕ２６，ＡｄＨｕ３４，ＡｄＨｕ３５，ＡｄＨｕ３６，ＡｄＨｕ３７，ＡｄＨｕ４１，ＡｄＨｕ４８，ＡｄＨｕ４９，ＡｄＨｕ５０，ＡｄＣ６，ＡｄＣ７，ＡｄＣ６９，ウシＡｄ３型，イヌＡｄ２型，ヒツジＡｄ，又はブタＡｄ３型の何れのアデノウイルスのものであってもよい。血清型２であるアデノウイルスのVA1 RNA領域は，本発明において好適なものの一つである。血清型２であるアデノウイルスのVA1 RNA領域は配列番号１６で示される塩基配列を含む。 In one embodiment of the present invention, the VA1 RNA region may be from any of the adenoviruses whose serotypes are 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, bovine Ad3, canine Ad2, ovine Ad, or porcine Ad3, as long as it exerts the original functions required for AAV replication. The VA1 RNA region of serotype 2 adenovirus is one of the preferred regions in the present invention. The VA1 RNA region of serotype 2 adenovirus contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.

また，VA1 RNA領域として，当該領域が本来有する機能を発揮するものである限り，野生型のアデノウイルスのVA1 RNA領域に，置換，欠失，付加等の改変がなされたものを使用することもできる。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたVA1 RNA領域も，VA1 RNA領域に含まれる。 In addition, the VA1 RNA region may be a wild-type adenovirus VA1 RNA region that has been modified by substitution, deletion, addition, or other means, so long as the region still exhibits its inherent function. In one embodiment of the present invention, the VA1 RNA region includes the VA1 RNA region that has been modified in this way.

野生型のVA1 RNA領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。VA1 RNA領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたVA1 RNA領域も，VA1 RNA領域である。塩基を付加する場合，野生型のVA1 RNA領域の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたVA1 RNA領域も，VA1 RNA領域に含まれる。変異を加えたVA1 RNA領域の塩基配列は，野生型のVA1 RNA領域の塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the wild-type VA1 RNA region are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the VA1 RNA region are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a VA1 RNA region in which a mutation that combines the substitution and deletion of these bases has been added is also a VA1 RNA region. When bases are added, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence or the 5' end or 3' end of the wild-type VA1 RNA region. A VA1 RNA region in which a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases has been added is also included in the VA1 RNA region. The base sequence of the mutated VA1 RNA region preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence of the wild-type VA1 RNA region, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

本発明の好ましい一実施形態において，E2A領域とE4領域とVA1 RNA領域は如何なる順で位置してもよい。E2A領域，E4領域及びVA1 RNA領域を含む塩基配列をヘルパー領域という。 In a preferred embodiment of the present invention, the E2A region, the E4 region, and the VA1 RNA region may be located in any order. A base sequence including the E2A region, the E4 region, and the VA1 RNA region is called a helper region.

ヘルパー領域の好ましい一実施形態として，E2A領域の下流にE4領域，更に下流にVA1 RNA領域が位置する，配列番号１７で示される塩基配列を含むものが挙げられる。この塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，E2A領域，E4領域及びVA1 RNA領域のそれぞれの領域が本来の機能を発揮するものである限り，ヘルパー領域として使用できる。 A preferred embodiment of the helper region is one that contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 17, in which the E4 region is located downstream of the E2A region and the VA1 RNA region is located further downstream. Modifications to this base sequence, such as substitutions, deletions, and additions, can also be used as helper regions, so long as the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region each exert their original functions.

配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～６０個，より好ましくは１～３０個，更に好ましくは１～１０個である。配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～６０個，より好ましくは１～３０個，更に好ましくは１～１０個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，ヘルパー領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～６０個，より好ましくは１～３０個，更に好ましくは１～１０個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，ヘルパー領域として使用できる。変異を加えたヘルパー領域の塩基配列は，配列番号１７で示される塩基配列を含むヘルパー領域の塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the helper region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, and even more preferably 1 to 10. When bases in the base sequence of the helper region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, and even more preferably 1 to 10. In addition, a region in which a mutation that combines the substitution and deletion of these bases has been added can also be used as the helper region. When bases are added, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, and even more preferably 1 to 10 bases are added to the base sequence of the helper region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 or to the 5' end or 3' end. A region in which a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases has been added can also be used as the helper region. The base sequence of the mutated helper region preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence of the helper region containing the base sequence shown in SEQ ID NO:17, more preferably exhibits 90% or more homology, even more preferably exhibits 95% or more homology, and even more preferably exhibits 98% or more homology.

ヘルパー領域に含まれる，E2A領域，E4領域及びVA1 RNA領域のそれぞれにおける改変については，上記のルールが適用される。 The above rules apply to modifications in the E2A region, E4 region, and VA1 RNA region contained in the helper region.

本発明の一実施形態において，Rep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それがE2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域を含む領域にコードされる蛋白質及びＲＮＡによって制御されるものである限り，特に制限はないが，好ましくは，AAVのp5プロモーターである。第１の遺伝子発現制御部位がAAVのp5プロモーターである場合，血清型２であるAAVのp5プロモーターであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。血清型２のAAVのp5プロモーターは配列番号１８で示される塩基配列を含む。 In one embodiment of the present invention, the base sequence that can be used as the base sequence containing the first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein is not particularly limited as long as it is controlled by the protein and RNA encoded in the region containing the E2A region, the E4 region, and the VA1 RNA region, but is preferably the p5 promoter of AAV. When the first gene expression control site is the p5 promoter of AAV, it is preferably the p5 promoter of AAV of serotype 2, but is not limited thereto, and may be any of serotypes 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11. The p5 promoter of AAV of serotype 2 contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 18.

また，AAVのp5プロモーターは，その機能を発揮するものである限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたp5プロモーターも，p5プロモーターに含まれる。 In addition, the AAV p5 promoter may be one that has been modified by substitution, deletion, addition, or other such modification to the base sequence of the wild-type p5 promoter of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, so long as it exerts its function. In one embodiment of the present invention, p5 promoters with these mutations are also included in the p5 promoter.

配列番号１８で示される野生型のp5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１８で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたp5プロモーターも，p5プロモーターである。塩基を付加する場合，配列番号１８で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたp5プロモーターも，p5プロモーターに含まれる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，野生型のp5プロモーターの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the wild-type p5 promoter shown in SEQ ID NO: 18 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. A p5 promoter with a mutation that combines the substitution and deletion of these bases is also a p5 promoter. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 or to the 5' end or 3' end. A p5 promoter with a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases is also included in the p5 promoter. The base sequence of the mutated p5 promoter preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence of the wild-type p5 promoter, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

血清型２であるAAVのp5プロモーターを改変したp5プロモーターの例として配列番号１９で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，p5プロモーターの本来の機能を発揮するものである限り，p5プロモーター又はその機能的等価物たり得る。 An example of a p5 promoter modified from the p5 promoter of AAV serotype 2 is one containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 19. Modifications to the base sequence of this p5 promoter, such as substitutions, deletions, and additions, can also be considered p5 promoters or their functional equivalents, so long as they exhibit the original functions of the p5 promoter.

配列番号１９で示される塩基配列を含むp5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１９で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１９で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，配列番号１９で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the p5 promoter containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as the p5 promoter or its functional equivalent. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 or to the 5' end or 3' end. A mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as the p5 promoter or its functional equivalent. The base sequence of the mutated p5 promoter preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO:19, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

p5プロモーター又はその機能的等価物は，通常，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の上流に位置する。 The p5 promoter or its functional equivalent is usually located upstream of a nucleotide sequence encoding the adeno-associated virus Rep protein or its functional equivalent.

p5プロモーター又はその機能的等価物とアデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列とを含む領域を，Rep領域という。Rep領域の好ましい一実施形態として，配列番号２０で示される塩基配列を含むものが挙げられる。この配列番号２０で示される塩基配列は，配列番号１９で示される塩基配列の下流に，配列番号４で示される塩基配列を含むものである。すなわち，この配列番号２０で示される塩基配列は，配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する血清型2のAAVのRep68と，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する血清型2のAAVのRep78とをコードする。 A region containing the p5 promoter or a functional equivalent thereof and a base sequence encoding the Rep protein or a functional equivalent thereof of an adeno-associated virus is called a Rep region. A preferred embodiment of the Rep region includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 20. This base sequence shown in SEQ ID NO: 20 includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 downstream of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19. In other words, this base sequence shown in SEQ ID NO: 20 encodes Rep68 of serotype 2 AAV having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and Rep78 of serotype 2 AAV having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

配列番号２０で示される塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Ｒｅｐ領域の本来の機能を発揮するものである限り，Rep領域として使用できる。 The base sequence shown in SEQ ID NO:20 may be modified by substitution, deletion, addition, or other such modifications, and may also be used as the Rep region, so long as it exhibits the original function of the Rep region.

配列番号２０で示される塩基配列を含むRep領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２０で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２０で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep領域として使用できる。変異を加えたRep領域の塩基配列は，配列番号２０で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the Rep region including the base sequence shown in SEQ ID NO:20 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO:20 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as the Rep region. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO:20 or to the 5' end or 3' end. A mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as the Rep region. The base sequence of the mutated Rep region preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO:20, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

本発明の一実施形態において，Cap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それがE2A領域，E4領域，及びVA1 RNA領域を含む領域にコードされる蛋白質及びＲＮＡによって制御されるものである限り，特に制限はないが，好ましくは，AAVのp40プロモーターである。AAVのp40プロモーターである場合，血清型２であるAAVのp40プロモーターであることが好ましいが，これに限定されることはなく，血清型１，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのものであってもよい。 In one embodiment of the present invention, the base sequence that can be used as the base sequence containing the second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein is not particularly limited as long as it is controlled by the protein and RNA encoded in the region containing the E2A region, the E4 region, and the VA1 RNA region, but is preferably the AAV p40 promoter. In the case of the AAV p40 promoter, it is preferably the p40 promoter of AAV of serotype 2, but is not limited thereto, and may be any of serotypes 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11.

また，AAVのp40プロモーターは，その機能を発揮するものである限り，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のp40プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。本発明の一実施形態において，これら変異を加えたp40プロモーターも，p40プロモーターに含まれる。野生型のp40プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。野生型のp40プロモーターの塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたp40プロモーターも，p40プロモーターである。塩基を付加する場合，野生型のp40プロモーターの塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたp40プロモーターも，p40プロモーターに含まれる。変異を加えたp40プロモーターの塩基配列は，野生型のp40プロモーターの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 In addition, the AAV p40 promoter may be one that has been modified by substitution, deletion, addition, or the like in the base sequence of the wild-type p40 promoter of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, so long as it exerts its function. In one embodiment of the present invention, the p40 promoter to which these mutations have been added is also included in the p40 promoter. When bases in the base sequence of the wild-type p40 promoter are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the wild-type p40 promoter are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, the p40 promoter to which mutations that combine the substitution and deletion of these bases have been added is also a p40 promoter. When bases are added, preferably 1 to 20 bases, more preferably 1 to 10 bases, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence or the 5' or 3' end of the wild-type p40 promoter. Mutations of p40 promoters that combine the addition, substitution, and deletion of these bases are also included in the p40 promoter. The base sequence of the mutated p40 promoter preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence of the wild-type p40 promoter, more preferably exhibits 90% or more homology, even more preferably exhibits 95% or more homology, and even more preferably exhibits 98% or more homology.

p40プロモーター又はその機能的等価物は，通常，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の上流に位置する。 The p40 promoter or its functional equivalent is usually located upstream of the nucleotide sequence encoding the Cap protein or its functional equivalent of the adeno-associated virus.

p40プロモーター又はその機能的等価物とアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列とを含む領域を，Cap領域という。 The region containing the p40 promoter or its functional equivalent and the base sequence encoding the adeno-associated virus Cap protein or its functional equivalent is called the Cap region.

Cap領域の好ましい一実施形態として，配列番号２１で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このCap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列を含み，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする。このCap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列に代えて，配列番号５で示される塩基配列を有する血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列を含むものとすることもできる。これら塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Cap領域の本来の機能を発揮するものである限り，Cap領域として使用できる。 A preferred embodiment of the cap region includes a base sequence shown in SEQ ID NO:21. This cap region includes a base sequence encoding VP1 of serotype 9 AAV having the base sequence shown in SEQ ID NO:7, and encodes VP1 of serotype 9 AAV having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8. This cap region can also include a base sequence encoding VP1 of serotype 6 AAV having the base sequence shown in SEQ ID NO:5, instead of the base sequence encoding VP1 of serotype 9 AAV having the base sequence shown in SEQ ID NO:7. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to these base sequences can also be used as cap regions, so long as they exhibit the original function of the cap region.

Cap領域の塩基配列中の配列番号２１で示される塩基配列の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２１で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２１で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Cap領域として使用できる。変異を加えたCap領域の塩基配列は，配列番号２１で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。配列番号７で示される塩基配列を配列番号５で示される塩基配列に代えたものについても同様である。 When replacing bases in the base sequence shown in SEQ ID NO:21 in the base sequence of the Cap region with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When deleting bases in the base sequence shown in SEQ ID NO:21, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. Furthermore, a region that has been subjected to a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as the Cap region. When adding bases, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO:21 or to the 5' end or 3' end. A region that has been subjected to a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as the Cap region. The base sequence of the mutated Cap region preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 21, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology. The same applies to the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 replaced with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.

本発明の好ましい一実施形態において，Rep領域はCap領域の上流に位置してもよく，又下流に位置してもよい。Rep領域とCap領域を含む領域をRep-Cap領域という。 In a preferred embodiment of the present invention, the Rep region may be located upstream or downstream of the Cap region. A region including the Rep region and the Cap region is called a Rep-Cap region.

Rep-Cap領域の好ましい一実施形態として，Rep領域がCap領域の上流に位置する，配列番号２２で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このRep-Cap領域は，配列番号１９で示される塩基配列の下流に配列番号２０で示される塩基配列，更に下流に配列番号２１で示される塩基配列を含む。このRep-Cap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列を含み，配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する血清型9型のAAVのVP1をコードする。このRep-Cap領域は，配列番号７で示される塩基配列を有する血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列に代えて，配列番号５で示される塩基配列を有する血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列を含むものとすることもできる。これらの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Rep-Cap領域の本来の機能を発揮するものである限り，Rep-Cap領域として使用できる。 A preferred embodiment of the Rep-Cap region includes a Rep region located upstream of the Cap region and containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 22. This Rep-Cap region contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 downstream of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 further downstream. This Rep-Cap region contains a base sequence encoding VP1 of AAV of serotype 9 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and encodes VP1 of AAV of serotype 9 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. This Rep-Cap region can also contain a base sequence encoding VP1 of AAV of serotype 6 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, instead of the base sequence encoding VP1 of AAV of serotype 9 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to these base sequences can also be used as the Rep-Cap region, as long as they exhibit the original function of the Rep-Cap region.

配列番号２２で示される塩基配列を含むRep-Cap領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２２で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２２で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。変異を加えたRep-Cap領域の塩基配列は，配列番号２２で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the Rep-Cap region including the base sequence shown in SEQ ID NO:22 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO:22 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a region that has been added with a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as the Rep-Cap region. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO:22 or to the 5' end or 3' end. A region that has been added with a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as the Rep-Cap region. The base sequence of the mutated Rep-Cap region preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO:22, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

Rep-Cap領域の下流に，Rep蛋白質又は／及びCap蛋白質の発現量を高める機能を有するエンハンサー配列を配置することもできる。ここで，かかるエンハンサー配列に特に制限はないが，AAVのp5プロモーター又はその機能的等価物をエンハンサーとして使用することができる。ここで用いられるp5プロモーターのAAVの血清型に特に限定はなく，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れのAAVのp5プロモーターであってもよいが，好ましくは血清型2であるAAV p5プロモーターである。血清型2のAAVのp5プロモーターは配列番号１８で示される塩基配列を含む。 An enhancer sequence having the function of increasing the expression level of the Rep protein and/or Cap protein can also be placed downstream of the Rep-Cap region. There is no particular limitation on such enhancer sequence, but the AAV p5 promoter or a functional equivalent thereof can be used as the enhancer. There is no particular limitation on the AAV serotype of the p5 promoter used here, and it may be any of the AAV p5 promoters of serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11, but the AAV p5 promoter of serotype 2 is preferred. The AAV p5 promoter of serotype 2 contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 18.

また，Rep-Cap領域の下流に配置されるAAVのP5プロモーターは，血清型１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０又は１１の何れかのAAVの野生型のp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものであってもよい。これら変異を加えたp5プロモーターも，P5プロモーターに含まれる。 The AAV P5 promoter located downstream of the Rep-Cap region may be one that has been modified by substitution, deletion, addition, or other such modification to the base sequence of the wild-type p5 promoter of any of AAV serotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11. p5 promoters with these mutations are also included in the P5 promoter.

ここで，野生型のP5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。野生型のp5プロモーターの塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたp5プロモーターも，P5プロモーターである。塩基を付加する場合，野生型のP5プロモーターの塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたP5プロモーターも，P5プロモーターに含まれる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，野生型のP5プロモーターの塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 Here, when bases in the base sequence of the wild-type P5 promoter are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence of the wild-type p5 promoter are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. A p5 promoter that has been mutated by combining the substitution and deletion of these bases is also a P5 promoter. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence or the 5' end or 3' end of the wild-type P5 promoter. A P5 promoter that has been mutated by combining the addition, substitution, and deletion of these bases is also included in the P5 promoter. The base sequence of the mutated p5 promoter preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence of the wild-type P5 promoter, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

血清型2のAAVのp5プロモーターを改変したp5プロモーターの例として配列番号１９で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このp5プロモーターの塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，p5プロモーターに含まれる。 An example of a p5 promoter that is a modified version of the p5 promoter of serotype 2 AAV is one that contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 19. p5 promoters that have been modified by substitution, deletion, addition, or other such modifications to the base sequence of this p5 promoter are also included.

配列番号１９で示される塩基配列を含むp5プロモーターの塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号１９で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号１９で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，p5プロモーター又はその機能的等価物として使用できる。変異を加えたp5プロモーターの塩基配列は，配列番号１９で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the p5 promoter containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as the p5 promoter or its functional equivalent. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 or to the 5' end or 3' end. A mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as the p5 promoter or its functional equivalent. The base sequence of the mutated p5 promoter preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO:19, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

Rep-Cap領域の下流にAAVのp5プロモーター又はその機能的等価物の塩基配列が配置される場合，このAAVのp5プロモーター又はその機能的等価物の塩基配列を含めた領域を，Rep-Cap領域ということもできる。かかるRep-Cap領域の好ましい一実施形態として，配列番号２３で示される塩基配列を含むものが挙げられる。このRep-Cap領域は，配列番号１９で示される塩基配列の下流に配列番号２０で示される塩基配列，更に下流に配列番号２１で示される塩基配列，更に下流に配列番号１９で示される塩基配列を含む。この塩基配列に置換，欠失，付加等の改変がなされたものも，Rep-Cap領域の本来の機能を発揮するものである限り，Rep-Cap領域とすることができる。 When the base sequence of the AAV p5 promoter or its functional equivalent is located downstream of the Rep-Cap region, the region including the base sequence of the AAV p5 promoter or its functional equivalent can also be referred to as the Rep-Cap region. One preferred embodiment of such a Rep-Cap region includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 23. This Rep-Cap region includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 downstream of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19, the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 further downstream, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 further downstream. Modifications such as substitutions, deletions, and additions to this base sequence can also be considered as Rep-Cap regions as long as they exhibit the original function of the Rep-Cap region.

配列番号２３で示される塩基配列を含むRep-Cap領域の塩基配列中の塩基を他の塩基で置換する場合，置換する塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。配列番号２３で示される塩基配列中の塩基を欠失させる場合，欠失させる塩基の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個である。また，これら塩基の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。塩基を付加する場合，配列番号２３で示される塩基配列中若しくは５’末端又は３’末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～３個の塩基を付加する。これら塩基の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，Rep-Cap領域として使用できる。変異を加えたRep-Cap領域の塩基配列は，配列番号２３で示される塩基配列と，好ましくは８５％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。 When bases in the base sequence of the Rep-Cap region including the base sequence shown in SEQ ID NO:23 are replaced with other bases, the number of bases to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. When bases in the base sequence shown in SEQ ID NO:23 are deleted, the number of bases to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3. In addition, a region that has been added with a mutation that combines the substitution and deletion of these bases can also be used as the Rep-Cap region. When bases are added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 3 bases are added to the base sequence shown in SEQ ID NO:23 or to the 5' end or 3' end. A region that has been added with a mutation that combines the addition, substitution, and deletion of these bases can also be used as the Rep-Cap region. The base sequence of the mutated Rep-Cap region preferably exhibits 85% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO:23, more preferably 90% or more homology, even more preferably 95% or more homology, and even more preferably 98% or more homology.

本発明の一実施形態において，外来の蛋白質の発現を制御する第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列として用いることのできる塩基配列に，それがこの外来の蛋白質をコードする遺伝子が導入される先の細胞，組織又は生体内で，この外来の蛋白質を発現させることができるものである限り，特に制限はないが，サイトメガロウイルス由来のプロモーター（任意選択でエンハンサーを含む），ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター，ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター，β-アクチンプロモーター，ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターを含むものが好適である。β-アクチンプロモーターとしては配列番号３８で示される塩基配列を有するニワトリβ-アクチンプロモーターが好適である。この他，ヒトCMVエンハンサーの下流にニワトリβ-アクチンプロモーターが結合した配列番号４７で示される塩基配列を有するプロモーターが第３の遺伝子発現制御部位として好適に利用できる。 In one embodiment of the present invention, the base sequence that can be used as the base sequence containing the third gene expression control site that controls the expression of a foreign protein is not particularly limited as long as it can express the foreign protein in a cell, tissue, or living body into which a gene encoding the foreign protein is introduced. However, preferred base sequences include a cytomegalovirus-derived promoter (optionally including an enhancer), an SV40 early promoter, a human elongation factor-1α (EF-1α) promoter, a human ubiquitin C promoter, a retrovirus Rous sarcoma virus LTR promoter, a dihydrofolate reductase promoter, a β-actin promoter, and a phosphoglycerate kinase (PGK) promoter. A preferred β-actin promoter is a chicken β-actin promoter having the base sequence shown in SEQ ID NO: 38. In addition, a promoter having the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 in which a chicken β-actin promoter is linked downstream of a human CMV enhancer can be preferably used as the third gene expression control site.

外来の蛋白質の発現量を増加させるため，第３の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列と外来の蛋白質をコードする塩基配列との間，又は外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流に，イントロン配列が存在してもよい。例えば，ヒトCMVエンハンサーの下流にニワトリβ-アクチンプロモーター，その下流に配列番号３９で示される塩基配列を有するニワトリβアクチン/MVMキメライントロンが結合したものは，第３の遺伝子発現制御部位として好適に利用できる。ここでMVMはMinute virus of miceの略号である。 In order to increase the expression level of a foreign protein, an intron sequence may be present between the base sequence containing the third gene expression control site and the base sequence encoding the foreign protein, or downstream of the base sequence encoding the foreign protein. For example, a chicken β-actin promoter downstream of a human CMV enhancer, and a chicken β-actin/MVM chimeric intron having the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 downstream of that promoter, can be suitably used as the third gene expression control site. Here, MVM is an abbreviation for Minute virus of mice.

外来の蛋白質の下流にはポリアデニレーション配列（polyA配列）が配置される。polyA配列として用いることのできる塩基配列に，それが外来の蛋白質をコードする遺伝子が導入される先の細胞，組織又は生体内で本来の機能を発揮できるものである限り，特に制限はないが，ヒト成長ホルモンpolyA配列，配列番号４０で示される塩基配列を有する成長ウシ成長ホルモンpolyA配列が好適に利用できる。 A polyadenylation sequence (polyA sequence) is placed downstream of the foreign protein. There are no particular limitations on the base sequence that can be used as the polyA sequence, so long as it can exert its original function in the cell, tissue, or living body into which the gene encoding the foreign protein is introduced. However, the human growth hormone polyA sequence and the bovine growth hormone polyA sequence having the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 are preferably used.

本発明の一実施形態である核酸分子は，環状のプラスミドとすることができる。 In one embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule can be a circular plasmid.

本発明の一実施形態において，核酸分子が環状のプラスミドであるとき，Rep-Cap領域，トランスファー領域，ヘルパー領域は，如何なる順で位置してもよい。 In one embodiment of the present invention, when the nucleic acid molecule is a circular plasmid, the Rep-Cap region, transfer region, and helper region may be located in any order.

本発明の好適な一実施形態において，Rep-Cap領域の下流にトランスファー領域，その下流にヘルパー領域が位置する。例えば，Rep領域の下流にCap領域，その下流にトランスファー領域，その下流にE2A領域，その下流にE4領域，その下流にVA1 RNA領域が位置する。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 In a preferred embodiment of the present invention, a transfer region is located downstream of the Rep-Cap region, and a helper region is located downstream of that. For example, a Cap region is located downstream of the Rep region, a transfer region is located downstream of that, an E2A region is located downstream of that, an E4 region is located downstream of that, and a VA1 RNA region is located downstream of that. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる一実施形態において，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，アデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，及びアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列は，如何なる順で位置してもよい。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 In a further embodiment of the present invention, the base sequence encoding the Rep protein or a functional equivalent thereof of the adeno-associated virus, the base sequence encoding the Cap protein or a functional equivalent thereof of the adeno-associated virus, the base sequence including the inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof of the first adeno-associated virus, the base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein or/and the base sequence encoding a foreign protein, the base sequence including the inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof of the second adeno-associated virus, the base sequence encoding the E2A region or a functional equivalent thereof of the adenovirus, the base sequence encoding the E4 region or a functional equivalent thereof of the adenovirus, and the base sequence encoding the VA1 RNA region or a functional equivalent thereof of the adenovirus may be located in any order. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid. A drug resistance gene can also be incorporated into any position of this nucleic acid molecule. In addition, a replication origin necessary for the plasmid to replicate in a host cell can also be incorporated into any position of this nucleic acid molecule. When the host cell is used, Coli E1 is preferably used as the origin of replication. There is usually a polyA sequence downstream of the base sequence that codes for the foreign protein. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

但し，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列は，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の５’側に位置することが好ましい。また，アデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物の塩基配列は，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物の塩基配列の５’側に位置することが好ましい。また更に，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物の塩基配列は，アデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物の塩基配列の５’側に位置することが好ましい。また更に，アデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物の塩基配列の３’側に，アデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物の塩基配列，更にその下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物の塩基配列が位置することが好ましい。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 However, the base sequence encoding the Rep protein or a functional equivalent thereof of the adeno-associated virus is preferably located on the 5' side of the base sequence encoding the Cap protein or a functional equivalent thereof of the adeno-associated virus. The base sequence of the E2A region of the adenovirus or a functional equivalent thereof is preferably located on the 5' side of the base sequence of the E4 region of the adenovirus or a functional equivalent thereof. Furthermore, the base sequence of the E4 region of the adenovirus or a functional equivalent thereof is preferably located on the 5' side of the base sequence of the VA1 RNA region of the adenovirus or a functional equivalent thereof. Furthermore, it is preferable that the base sequence of the E4 region of the adenovirus or a functional equivalent thereof is located on the 3' side of the base sequence of the E2A region of the adenovirus or a functional equivalent thereof, and further downstream of that, the base sequence of the VA1 RNA region of the adenovirus or a functional equivalent thereof is located. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid. A drug resistance gene can also be incorporated into any position of this nucleic acid molecule. In addition, an origin of replication necessary for the plasmid to replicate in a host cell can be incorporated at any position in the nucleic acid molecule. In the case of a host cell, Coli E1 is preferably used as the origin of replication. There is usually a polyA sequence downstream of the base sequence encoding the foreign protein. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列の下流に，アデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 As a further preferred embodiment of the present invention, a nucleic acid molecule in which a base sequence encoding a Cap protein or a functional equivalent thereof of an adeno-associated virus is located downstream of a base sequence encoding a Rep protein or a functional equivalent thereof of an adeno-associated virus, a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof further downstream, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein further downstream or/and a base sequence encoding a foreign protein further downstream, a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a second adeno-associated virus or a functional equivalent thereof further downstream, a base sequence encoding an E2A region of an adenovirus or a functional equivalent thereof further downstream, a base sequence encoding an E4 region of an adenovirus or a functional equivalent thereof further downstream, and a base sequence encoding a VA1 RNA region of an adenovirus or a functional equivalent thereof further downstream are located. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid. A drug resistance gene can also be incorporated into any position of this nucleic acid molecule. In addition, an origin of replication necessary for the plasmid to replicate in a host cell can be incorporated at any position in the nucleic acid molecule. In the case of a host cell, Coli E1 is preferably used as the origin of replication. There is usually a polyA sequence downstream of the base sequence encoding the foreign protein. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，Rep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。更に複製開始点を含んでもよく，付随的に薬剤耐性遺伝子を組み込んでもよい。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 As a further preferred embodiment of the present invention, downstream of a base sequence containing a first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein of the adeno-associated virus, a base sequence encoding a Rep protein or a functional equivalent thereof, downstream of which is a base sequence containing a second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein of the adeno-associated virus, downstream of which is a base sequence encoding a Cap protein of the adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence containing an inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof of a first adeno-associated virus, further downstream of which is a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein or/and a base sequence encoding a foreign protein, further downstream of which is a base sequence containing an inverted terminal repeat (ITR) or a functional equivalent thereof of a second adeno-associated virus, further downstream of which is a base sequence encoding an E2A region of the adenovirus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence encoding an E4 region of the adenovirus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence encoding a VA1 region of the adenovirus, Examples include nucleic acid molecules in which a base sequence encoding an RNA region or a functional equivalent thereof is located. It may further include an origin of replication, and may additionally incorporate a drug resistance gene. There is usually a polyA sequence downstream of the base sequence encoding the foreign protein. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，Rep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にAAVのp5プロモーター又はその等価物の塩基配列，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。この核酸分子の任意の位置に，更に，薬剤耐性遺伝子を組み込むこともできる。また，この核酸分子の任意の位置に，更に，宿主細胞中でプラスミドが複製するために必要な複製開始点を組み込むこともできる。宿主細胞である場合の複製開始点としては，Coli E1が好適に使用できる。外来の蛋白質をコードする塩基配列の下流には通常polyA配列がある。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 As a further preferred embodiment of the present invention, downstream of a base sequence including a first gene expression control site controlling the expression of the Rep protein of the adeno-associated virus, there is a base sequence encoding a Rep protein or a functional equivalent thereof, downstream of which is a base sequence including a second gene expression control site controlling the expression of the Cap protein of the adeno-associated virus, downstream of which is a base sequence encoding a Cap protein of the adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence of an AAV p5 promoter or an equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein or/and a base sequence encoding a foreign protein, further downstream of which is a base sequence including an inverted terminal repeat (ITR) of a second adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence encoding an E2A region of the adenovirus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence encoding an E4 region of the adenovirus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence encoding a VA1 region of the adenovirus, Examples include nucleic acid molecules in which a base sequence encoding an RNA region or a functional equivalent thereof is located. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid. A drug resistance gene can also be incorporated into any position of this nucleic acid molecule. Furthermore, an origin of replication necessary for the plasmid to replicate in a host cell can also be incorporated into any position of this nucleic acid molecule. When the host cell is used, Coli E1 is preferably used as the origin of replication. There is usually a polyA sequence downstream of the base sequence encoding the foreign protein. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる好ましい一実施形態として，アデノ随伴ウイルスのRep蛋白質の発現を制御する第１の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列の下流に，Rep蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質の発現を制御する第２の遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，その下流にアデノ随伴ウイルスのCap蛋白質又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にAAVのp5プロモーター又はその等価物の塩基配列，更に下流に複製開始点，更に下流に薬剤耐性遺伝子，更に下流に第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ITR）又はその機能的等価物を含む塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE2A領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのE4領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列，更に下流にアデノウイルスのVA1 RNA領域又はその機能的等価物をコードする塩基配列が位置する核酸分子が挙げられる。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 As a further preferred embodiment of the present invention, downstream of a base sequence containing a first gene expression control site that controls the expression of the Rep protein of the adeno-associated virus, a base sequence encoding a Rep protein or a functional equivalent thereof, downstream of which is a base sequence containing a second gene expression control site that controls the expression of the Cap protein of the adeno-associated virus, downstream of which is a base sequence encoding the Cap protein of the adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, further downstream of which is a base sequence of the AAV p5 promoter or an equivalent thereof, further downstream of which is a replication origin, further downstream of which is a drug resistance gene, and further downstream of which is a Examples of such nucleic acid molecules include a nucleic acid molecule having a base sequence downstream containing an inverted terminal repeat (ITR) of a first adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein further downstream or/and a base sequence encoding a foreign protein, a base sequence further downstream containing an inverted terminal repeat (ITR) of a second adeno-associated virus or a functional equivalent thereof, a base sequence further downstream encoding an E2A region of an adenovirus or a functional equivalent thereof, a base sequence further downstream encoding an E4 region of an adenovirus or a functional equivalent thereof, and a base sequence further downstream encoding a VA1 RNA region of an adenovirus or a functional equivalent thereof. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる好ましい一実施形態として，血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列を含むRep領域，その下流に血清型6又は9のAAVのCap蛋白質をコードする塩基配列を含むCap領域，更に下流にエンハンサーとしてp5プロモーター，更に下流に第一のITR，更に下流にサイトメガロウイルス由来のプロモーター，更に下流に合成ヒトβグロビンイントロン，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流に合成polyA配列，更に下流に第二のITR，更に下流にアデノウイルスのE2A領域，更に下流にアデノウイルスのE4領域，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域が位置する核酸分子が挙げられる。更に複製開始点を含んでもよく，その場合，複製開始点は好ましくはp5プロモーターの下流に位置する。付随的に薬剤耐性遺伝子を組み込んでもよく，その場合，薬剤耐性遺伝子は好ましくは第一のITRの上流に位置する。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 As a further preferred embodiment of the present invention, there is a nucleic acid molecule in which a Rep region containing a base sequence encoding the Rep protein of AAV of serotype 2, a Cap region containing a base sequence encoding the Cap protein of AAV of serotype 6 or 9 downstream thereof, a p5 promoter as an enhancer further downstream, a first ITR further downstream, a promoter derived from cytomegalovirus further downstream, a synthetic human β-globin intron further downstream, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein further downstream/and a base sequence encoding a foreign protein further downstream, a synthetic polyA sequence further downstream, a second ITR further downstream, an adenovirus E2A region further downstream, an adenovirus E4 region further downstream, and an adenovirus VA1 RNA region further downstream are located. It may further include an origin of replication, in which case the origin of replication is preferably located downstream of the p5 promoter. A drug resistance gene may be incorporated concomitantly, in which case the drug resistance gene is preferably located upstream of the first ITR. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の更なる好ましい一実施形態として，血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列を含むRep領域，その下流に血清型6又は9のAAVのCap蛋白質をコードする塩基配列を含むCap領域，更に下流にエンハンサーとしてp5プロモーター，更に下流に第一のITR，更に下流にヒトCMVエンハンサー，更に下流にニワトリβアクチンプロモーター，更に下流にニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列又は／及び外来の蛋白質をコードする塩基配列，更に下流にウシ又はヒト成長ホルモンpolyA配列，更に下流に第二のITR，更に下流にアデノウイルスのE2A領域，更に下流にアデノウイルスのE4領域，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域が位置する核酸分子が挙げられる。更に複製開始点を含んでもよく，その場合，複製開始点は好ましくはp5プロモーターの下流に位置する。付随的に薬剤耐性遺伝子を組み込んでもよく，その場合，薬剤耐性遺伝子は好ましくは第一のITRの上流に位置する。核酸分子が環状のプラスミドである場合も同様である。 As a further preferred embodiment of the present invention, there is mentioned a nucleic acid molecule in which a Rep region containing a base sequence encoding the Rep protein of AAV of serotype 2, a Cap region containing a base sequence encoding the Cap protein of AAV of serotype 6 or 9 downstream thereof, a p5 promoter as an enhancer further downstream, a first ITR further downstream, a human CMV enhancer further downstream, a chicken β-actin promoter further downstream, a chicken β-actin/MVM chimeric intron further downstream, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein further downstream or/and a base sequence encoding a foreign protein further downstream, a bovine or human growth hormone polyA sequence further downstream, a second ITR further downstream, an adenovirus E2A region further downstream, an adenovirus E4 region further downstream, and an adenovirus VA1 RNA region further downstream. It may further include an origin of replication, in which case the origin of replication is preferably located downstream of the p5 promoter. A drug resistance gene may be incorporated concomitantly, in which case the drug resistance gene is preferably located upstream of the first ITR. The same applies when the nucleic acid molecule is a circular plasmid.

本発明の一実施形態の核酸分子を用いた，組換えアデノ随伴ウイルスビリオンの製造法について，配列番号２４で示される塩基配列を含む核酸分子を例にとって以下に説明する。 The method for producing recombinant adeno-associated virus virions using a nucleic acid molecule according to one embodiment of the present invention will be described below using a nucleic acid molecule containing the base sequence shown in SEQ ID NO:24 as an example.

配列番号２４で示される核酸分子は，血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列を含むRep領域，その下流に血清型9のAAVのCap蛋白質をコードする塩基配列を含むCap領域，更に下流にエンハンサーとしてp5プロモーター，更に下流に複製開始点，更に下流にアンピシリン耐性遺伝子，更に下流に第一のITR，更に下流にサイトメガロウイルス由来のプロモーター，更に下流に合成ヒトβグロビンイントロン，更に下流に外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列，更に下流に合成polyA配列，更に下流に第二のITR，更に下流にアデノウイルスのE2A領域，更に下流にアデノウイルスのE4領域，更に下流にアデノウイルスのＶＡ１ ＲＮＡ領域が位置する核酸分子である。配列番号２４には示されていないが，外来の蛋白質をコードする塩基配列を挿入するための塩基配列（配列番号２４で示される塩基配列中の8116bp～8147bpに存在する制限酵素サイトの何れか）には，所望の蛋白質をコードする塩基配列が導入されているものとする。この配列番号２４で示される核酸分子は，組換えAAVビリオンを作製するために用い得る核酸分子の好適な一例である。配列番号２４で示される核酸分子は，図１１で示されるpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターから，GFP遺伝子を除いたものに相当する構造を有する。 The nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO:24 is a nucleic acid molecule in which a Rep region containing a base sequence encoding the Rep protein of AAV of serotype 2, a Cap region containing a base sequence encoding the Cap protein of AAV of serotype 9, a p5 promoter as an enhancer further downstream, a replication origin further downstream, an ampicillin resistance gene further downstream, a first ITR further downstream, a promoter derived from cytomegalovirus further downstream, a synthetic human β-globin intron further downstream, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein further downstream, a synthetic polyA sequence further downstream, a second ITR further downstream, an adenovirus E2A region further downstream, an adenovirus E4 region further downstream, and an adenovirus VA1 RNA region further downstream are located. Although not shown in SEQ ID NO:24, a base sequence for inserting a base sequence encoding a foreign protein (any of the restriction enzyme sites present at 8116bp to 8147bp in the base sequence shown in SEQ ID NO:24) is assumed to have a base sequence encoding a desired protein introduced therein. The nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO:24 is a suitable example of a nucleic acid molecule that can be used to produce a recombinant AAV virion. The nucleic acid molecule shown in SEQ ID NO:24 has a structure corresponding to the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector shown in FIG. 11 with the GFP gene removed.

配列番号２４で示される塩基配列を有する核酸分子は，環状プラスミドとして一般的な遺伝子工学的手法を用いて合成することができる。この環状プラスミドには，薬剤耐性遺伝子がコードされている。また，大腸菌で複製されるための複製開始点を有する。従って，この環状プラスミドは大腸菌に導入することによって増幅させることができ，容易に大量に調製することができる。 The nucleic acid molecule having the base sequence shown in SEQ ID NO:24 can be synthesized as a circular plasmid using common genetic engineering techniques. This circular plasmid encodes a drug resistance gene. It also has an origin of replication for replication in E. coli. Therefore, this circular plasmid can be amplified by introducing it into E. coli, and can be easily prepared in large quantities.

調製した環状プラスミドは，アデノウイルスのE1A領域及びE1B領域がゲノムに組み込まれた宿主細胞に導入される。かかる宿主細胞として，アデノウイルスのE1A遺伝子，及びE1B遺伝子でトランスフォームしたヒト胎児腎組織由来細胞であるHEK293細胞が好適に使用できる。 The prepared circular plasmid is introduced into a host cell in which the adenovirus E1A and E1B regions have been integrated into the genome. As such a host cell, HEK293 cells, which are cells derived from human fetal kidney tissue and transformed with the adenovirus E1A and E1B genes, can be suitably used.

宿主細胞に環状プラスミドが導入されると，第一のITRから第二のITRに至る領域が宿主細胞に非相同組換えによって組み込まれる。ついで，この宿主細胞に組み込まれた領域から，１本鎖DNAが複製されて，これがカプシドにパッケージングされて組換えAAVビリオンが形成される。組換えAAVビリオンは，培養液中に放出されるか，又は宿主細胞内に蓄積する。従って，宿主細胞の培養上清を回収することにより，又は宿主細胞を回収しこれを破壊することにより，組換えAAVビリオンを回収することができる。 When the circular plasmid is introduced into a host cell, the region from the first ITR to the second ITR is integrated into the host cell by non-homologous recombination. Then, single-stranded DNA is replicated from the region integrated into the host cell and packaged into a capsid to form a recombinant AAV virion. The recombinant AAV virion is released into the culture medium or accumulates within the host cell. Therefore, the recombinant AAV virion can be recovered by recovering the culture supernatant of the host cell or by recovering and destroying the host cell.

通常，組換えAAVビリオンを製造するためには，ITRに挟まれた所望の蛋白質をコードする塩基配列を含むプラスミド，Rep蛋白質をコードする塩基配列及びCap蛋白質をコードする塩基配列を含むプラスミド，及びアデノウイルス由来E2A，E4，及びVA1 RNA配列を含むプラスミドの３種類のプラスミドを同時に宿主細胞に導入する必要がある。宿主細胞の中で，３種類のプラスミドが導入される細胞の比率は低く，これにより組換えAAVビリオンの製造効率は低下する。また，３種類のプラスミドの中で，ITRに挟まれた所望の蛋白質をコードする塩基配列を含むプラスミドが導入されず，他の２種のプラスミドのみが導入された宿主細胞では，rAAVゲノムを含まない空のウイルス粒子（空カプシド）が産生されることになるので，更に製造効率は低下する。 Normally, to produce recombinant AAV virions, three types of plasmids must be simultaneously introduced into host cells: a plasmid containing a base sequence encoding the desired protein flanked by ITRs, a plasmid containing a base sequence encoding the Rep protein and a base sequence encoding the Cap protein, and a plasmid containing the adenovirus-derived E2A, E4, and VA1 RNA sequences. The ratio of host cells to which the three types of plasmids are introduced is low, which reduces the production efficiency of recombinant AAV virions. In addition, in host cells to which the plasmid containing the base sequence encoding the desired protein flanked by ITRs is not introduced and only the other two types of plasmids are introduced, empty virus particles (empty capsids) that do not contain the rAAV genome are produced, further reducing the production efficiency.

本発明の好適な実施例の一つである配列番号２４で示される塩基配列を有する環状プラスミドは，これら３種類のプラスミドの機能を全て有する。従って，この環状プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換することにより，rAAVビリオンの細胞中での産生に必要なすべての要素が細胞に同時に導入されることになるので，rAAVビリオンの生産量が上昇させることができるのみならず，空カプシドの発生を抑制することもできる。総カプシドに占める空カプシドの比率が高いほど，rAAVビリオンの品質は低下することになるので，この環状プラスミドを用いることにより，空カプシドの比率の低い高品質のrAAVビリオンを効率よく製造できる。これに限らず，統合rAAVプラスミドを用いて宿主細胞を形質転換することにより，空カプシドの比率の低い高品質のrAAVビリオンを効率よく製造できる。 The circular plasmid having the base sequence shown in SEQ ID NO:24, which is one of the preferred embodiments of the present invention, has all the functions of these three types of plasmids. Therefore, by transforming a host cell with this circular plasmid, all elements necessary for the production of rAAV virions in the cell are introduced into the cell at the same time, so not only can the production amount of rAAV virions be increased, but also the occurrence of empty capsids can be suppressed. Since the higher the ratio of empty capsids to the total capsids, the lower the quality of the rAAV virions, by using this circular plasmid, high-quality rAAV virions with a low ratio of empty capsids can be efficiently produced. Not only this, but by transforming a host cell with an integrated rAAV plasmid, high-quality rAAV virions with a low ratio of empty capsids can be efficiently produced.

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but it is not intended that the present invention be limited to these examples.

〔実施例１〕pHelper(mod)ベクターの構築
5’側より，SalIサイト，RsrIIサイト，複製開始点（ColE1 ori），アンピシリン耐性遺伝子，BsiWIサイト，BstZ17Iサイト，及びBsrGIサイトを含む配列番号２７で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をSalIとBsrGIで消化した。pHelperベクター（タカラバイオ社）をSalIとBsrGIで消化し，これに，上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpHelper(mod)ベクターとした（図１）。 [Example 1] Construction of pHelper(mod) vector
A DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO:27, including the SalI site, RsrII site, replication origin (ColE1 ori), ampicillin resistance gene, BsiWI site, BstZ17I site, and BsrGI site from the 5' side, was synthesized. This DNA fragment was digested with SalI and BsrGI. The pHelper vector (Takara Bio) was digested with SalI and BsrGI, and the above restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted into it. The resulting plasmid was designated pHelper(mod) vector (Figure 1).

〔実施例２〕pAAV-CMV-GFPベクター及びpAAV-CMV-GFP(mod) ベクターの構築
5’側より，EcoRIサイト，MluIサイト，GFP遺伝子（緑色蛍光蛋白質遺伝子），NotIサイト，及びBamHIサイトを含む配列番号２８で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をEcoRIとBamHIで消化した。pAAV-CMVベクター（タカラバイオ社）をEcoRIとBamHIで消化し，これに上記の制限酵素処理したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-CMV-GFPベクターとした。pAAV-CMV-GFPベクターのPciIサイトに，配列番号２９で示される塩基配列を有する，BsiWIサイトとAvrIIサイトを含むマルチクローニングサイト１を挿入し，更に，SfoIサイト，配列番号３０で示される塩基配列を有する，BsrGIサイト，AgeIサイト，及びBstZ17Iサイトを含むマルチクローニングサイト２を挿入した。得られたプラスミドをpAAV-CMV-GFP(mod)ベクターとした（図２）。 Example 2: Construction of pAAV-CMV-GFP vector and pAAV-CMV-GFP(mod) vector
A DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO:28, including an EcoRI site, an MluI site, a GFP gene (green fluorescent protein gene), a NotI site, and a BamHI site from the 5' side, was synthesized. This DNA fragment was digested with EcoRI and BamHI. A pAAV-CMV vector (Takara Bio) was digested with EcoRI and BamHI, and the above-mentioned restriction enzyme-treated DNA fragment was inserted thereinto. The resulting plasmid was designated as a pAAV-CMV-GFP vector. A multicloning site 1 containing a BsiWI site and an AvrII site and having a base sequence shown in SEQ ID NO:29 was inserted into the PciI site of the pAAV-CMV-GFP vector, and further a multicloning site 2 containing an SfoI site, a BsrGI site, an AgeI site, and a BstZ17I site and having a base sequence shown in SEQ ID NO:30 was inserted. The resulting plasmid was designated as a pAAV-CMV-GFP(mod) vector (Figure 2).

〔実施例３〕pR2(mod)C6ベクターの構築
5’側より，AfeIサイト，RsrIIサイト，BsrGIサイト，AvrIIサイト，アンピシリン耐性遺伝子サイト，複製開始点（ColE1 ori），RsrIIサイト，AAV2 Rep領域の5’部分（p5プロモーターを含む），及びSacIIサイトを含む配列番号３１で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をAfeIとSacIIで消化した。pRC6ベクター（タカラバイオ社）をAfeIとSacIIで消化し，これに上記の制限処理した合成遺伝子を挿入した。得られたプラスミドをpR2(mod)C6ベクターとした（図３）。 [Example 3] Construction of pR2(mod)C6 vector
A DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO:31, including the AfeI site, RsrII site, BsrGI site, AvrII site, ampicillin resistance gene site, replication origin (ColE1 ori), RsrII site, 5' portion of AAV2 Rep region (including p5 promoter), and SacII site from the 5' side, was synthesized. This DNA fragment was digested with AfeI and SacII. pRC6 vector (Takara Bio) was digested with AfeI and SacII, and the above-mentioned restricted synthetic gene was inserted into it. The resulting plasmid was named pR2(mod)C6 vector (Figure 3).

〔実施例４〕pR2(mod)C9ベクターの構築
5’側より，HindIIIサイト，AAV2 Rep領域の3’部分，AAV9 Cap領域，p5プロモーター，RsrIIサイト，及びBsrGIサイトを含む配列番号３２で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片をHindIIIとBsrGIで消化した。pR2(mod)C6ベクターをHindIIIとBsrGIで消化し，これに上記の制限酵素処理した合成遺伝子を挿入した。得られたプラスミドをpR2(mod)C9ベクターとした（図４）。 Example 4: Construction of pR2(mod)C9 vector
A DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO:32, including a HindIII site, the 3' portion of the AAV2 Rep region, an AAV9 Cap region, a p5 promoter, an RsrII site, and a BsrGI site from the 5' side, was synthesized. This DNA fragment was digested with HindIII and BsrGI. The pR2(mod)C6 vector was digested with HindIII and BsrGI, and the synthetic gene treated with the above restriction enzymes was inserted into it. The resulting plasmid was named pR2(mod)C9 vector (Figure 4).

〔実施例５〕pHelper-ITR/CMV/GFPベクターの構築
pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターをBsiWIとBstZ17Iで消化し，ITR-CMVプロモーター，ヒトβグロビンイントロン，GFP遺伝子，合成ポリA配列，及びITRを含むDNA断片を切り出した。pHelper(mod)ベクターをBsiWIとBstZ17Iで消化し，これに切り出したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとした（図５）。 [Example 5] Construction of pHelper-ITR/CMV/GFP vector
The pAAV-CMV-GFP(mod) vector was digested with BsiWI and BstZ17I to excise a DNA fragment containing the ITR-CMV promoter, human β-globin intron, GFP gene, synthetic polyA sequence, and ITR. The pHelper(mod) vector was digested with BsiWI and BstZ17I, and the excised DNA fragment was inserted into it. The resulting plasmid was designated the pHelper-ITR/CMV/GFP vector (Figure 5).

〔実施例６〕pHelper-R2(mod)C6ベクターの構築
pR2(mod)C6ベクターをRsrIIで消化し，AAV2 Rep領域（p5プロモーターを含む），AAV6 Cap領域-p5プロモーターを含む配列を切り出した。別にpHelper(mod)ベクターをRsrIIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pHelper-R2(mod)C6ベクターとした（図６）。 [Example 6] Construction of pHelper-R2(mod)C6 vector
The pR2(mod)C6 vector was digested with RsrII to excise the AAV2 Rep region (including the p5 promoter) and the AAV6 Cap region-p5 promoter sequence. Separately, the pHelper(mod) vector was digested with RsrII. The excised DNA fragment was inserted into this vector to create the pHelper-R2(mod)C6 vector (Figure 6).

〔実施例７〕pHelper-R2(mod)C9ベクターの構築
pR2(mod)C9ベクターをRsrIIで消化し，p5 promoter-Rep2-AAV9 VP1-p5 promoterを含む配列を切り出した。pHelper(mod)ベクターをRsrIIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pHelper-R2(mod)C9ベクターとした（図７）。 [Example 7] Construction of pHelper-R2(mod)C9 vector
The pR2(mod)C9 vector was digested with RsrII to excise the sequence containing the p5 promoter-Rep2-AAV9 VP1-p5 promoter. The pHelper(mod) vector was digested with RsrII. The excised DNA fragment was inserted into this vector to create the pHelper-R2(mod)C9 vector (Figure 7).

〔実施例８〕pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターの構築
pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターをAvrIIとBsrGIで消化し，ITR- CMVプロモーター-ヒトβグロビンイントロン-GFP-合成ポリA配列-ITRを含む配列を切り出した。pR2(mod)C6ベクターをAvrIIとBsrGIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとした（図８）。 [Example 8] Construction of pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector
The pAAV-CMV-GFP(mod) vector was digested with AvrII and BsrGI to excise the sequence containing ITR-CMV promoter-human β-globin intron-GFP-synthetic polyA sequence-ITR. The pR2(mod)C6 vector was digested with AvrII and BsrGI. The excised DNA fragment was inserted into this vector to create the pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector (Figure 8).

〔実施例９〕pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターの構築
pAAV-CMV-GFP(mod)ベクターをAvrIIとBsrGIで消化し，ITR-CMVプロモーター-ヒトβグロビンイントロン-GFP-合成ポリA配列-ITRを含むDNA断片を切り出した。別に，pR2(mod)C9ベクターをAvrIIとBsrGIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとした（図９）。 [Example 9] Construction of pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector
The pAAV-CMV-GFP(mod) vector was digested with AvrII and BsrGI to excise a DNA fragment containing ITR-CMV promoter-human β-globin intron-GFP-synthetic polyA sequence-ITR. Separately, the pR2(mod)C9 vector was digested with AvrII and BsrGI. The excised DNA fragment was inserted into this vector to create the pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector (Figure 9).

〔実施例１０〕pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターの構築
pR2(mod)C6ベクターをRsrIIで消化してAAV2 Rep領域（p5プロモーターを含む），AAV6 Cap領域，及びエンハンサーとして機能するp5プロモーターを含む配列を切り出した。別に，pHelper-ITR/CMV/GFPベクターをRsrIIで消化した。これに上記で切り出した配列を挿入し，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターとした。（図１０） Example 10: Construction of pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector
The pR2(mod)C6 vector was digested with RsrII to excise the AAV2 Rep region (including the p5 promoter), the AAV6 Cap region, and a sequence including the p5 promoter that functions as an enhancer. Separately, the pHelper-ITR/CMV/GFP vector was digested with RsrII. The sequence excised above was inserted into this vector to create the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector (Figure 10).

〔実施例１１〕pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターの構築
pR2(mod)C9ベクターをRsrIIで消化してAAV2 Rep領域（p5プロモーターを含む），AAV9 Cap領域，及びエンハンサーとして機能するp5プロモーターを含むDNA断片を切り出した。別にpHelper-ITR/CMV/GFPベクターをRsrIIで消化した。これに切り出したDNA断片を挿入し，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターとした（図１１）。 Example 11: Construction of pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector
The pR2(mod)C9 vector was digested with RsrII to excise a DNA fragment containing the AAV2 Rep region (including the p5 promoter), the AAV9 Cap region, and the p5 promoter that functions as an enhancer. Separately, the pHelper-ITR/CMV/GFP vector was digested with RsrII. The excised DNA fragment was inserted into this vector to create the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector (Figure 11).

〔実施例１２〕3種類のプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生
SV40ウイルスのlarge T抗原遺伝子を発現させたヒト胎児腎臓細胞由来の細胞株である，HEK293T細胞を宿主細胞として用いた。HEK293T細胞を，1.65×107個/ディッシュの濃度で15cmディッシュに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地（Thermo Fisher Scientific社）で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNAとして，下記の（１）～（２）の組み合わせのプラスミドを含む溶液を作製した；
（１）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpAAV-CMV-GFPベクターとpRC6ベクター（タカラバイオ社），
（２）pHelperベクター（タカラバイオ社）とpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター。
それぞれの溶液は，3種類のプラスミドが等モル濃度で含まれる，DNA濃度が4 μg/mLである溶液となるように調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンとFBSを，濃度がそれぞれ12 μg/mLと1.3% (v/v)となるように添加し，更にDMEM/High Glucose培地を加えて液量を30 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。15cmディッシュに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，30 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞中で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。実施例１３及び１４においても同様である。 [Example 12] Production of rAAV virions by transient expression of three types of plasmids
HEK293T cells, a cell line derived from human embryonic kidney cells expressing the SV40 virus large T antigen gene, were used as host cells. HEK293T cells were seeded on 15 cm dishes at a density of 1.65 x 107 cells/dish and cultured in 10% FBS-containing DMEM/High Glucose medium (Thermo Fisher Scientific) at 37°C in the presence of 5% CO2 for 16 hours. As DNA for transfection, a solution containing the following combination of plasmids (1) to (2) was prepared;
(1) pHelper vector (Takara Bio), pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector (Takara Bio),
(2) pHelper vector (Takara Bio), pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector.
Each solution was prepared so that the DNA concentration was 4 μg/mL, containing the three types of plasmids at equimolar concentrations. Polyethylenimine and FBS were added to this solution to make the concentrations 12 μg/mL and 1.3% (v/v), respectively, and DMEM/High Glucose medium was added to adjust the liquid volume to 30 mL to prepare a transfection solution. After removing all the culture supernatant from the cells seeded in a 15 cm dish, the entire amount of 30 mL of the transfection solution was added, and the cells were cultured at 37°C and 5% CO2 for 3 days to produce rAAV virions. Some of the rAAV virions produced in the host cells were released into the culture supernatant, and some remained in the host cells. The same applies to Examples 13 and 14.

〔実施例１３〕2種類のプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生
HEK293T細胞を1.65×107個/ディッシュの濃度で15cmディッシュに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，下記の（１）～（６）の組み合わせのプラスミドを含む溶液を作製した；
（１）pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター（タカラバイオ社），
（２）pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，
（３）pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，
（４）pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，
（５）pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクター（タカラバイオ社），
（６）pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelper（タカラバイオ社）ベクター。
それぞれの溶液は，2種類のプラスミドが等モル濃度で含まれる，DNA濃度が3.5～3.6 μg/mLである溶液となるように調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンとFBSを，濃度がそれぞれ12 μg/mLと1.3% (v/v)となるように添加し，更にDMEM/High Glucose培地を加えて液量を30 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。15 cmディッシュに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，30 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。 [Example 13] Production of rAAV virions by transient expression of two types of plasmids
HEK293T cells were seeded in 15 cm dishes at a density of 1.65 × 107 cells/dish and cultured in 10% FBS-containing DMEM/High Glucose medium at 37°C in the presence of 5% CO2 for 16 hours. As DNA solutions for transfection, solutions containing the following combinations of plasmids (1) to (6) were prepared:
(1) pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pRC6 vector (Takara Bio Inc.),
(2) pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector,
(3) pHelper-R2(mod)C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector,
(4) pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector,
(5) pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector (Takara Bio Inc.),
(6) pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper (Takara Bio) vector.
Each solution was prepared so that the DNA concentration was 3.5-3.6 μg/mL, containing the two plasmids at equimolar concentrations. Polyethylenimine and FBS were added to these solutions to make the concentrations 12 μg/mL and 1.3% (v/v), respectively, and DMEM/High Glucose medium was added to adjust the volume to 30 mL to prepare the transfection solution. After removing all the culture supernatant from the cells seeded in a 15 cm dish, the entire volume of the transfection solution (30 mL) was added and the cells were cultured at 37°C in the presence of 5% CO2 for 3 days to produce rAAV virions.

〔実施例１４〕統合rAAVプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生
HEK293T細胞を1.65×107個/ディッシュの濃度で15cmディッシュに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNA溶液として，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター又はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターが3.2 μg/mLの濃度で含まれる溶液を調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンとFBSを，濃度がそれぞれ12 μg/mLと1.3% (v/v)となるように添加し，更にDMEM/High Glucose培地を加えて液量を30 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。15cmディッシュに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，30 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で3日間培養して，rAAV6ビリオンとrAAV9ビリオンとをそれぞれ産生させた。 Example 14: Production of rAAV virions by transient expression of integrated rAAV plasmids
HEK293T cells were seeded in a 15 cm dish at a density of 1.65 × 107 cells/dish and cultured in 10% FBS-containing DMEM/High Glucose medium at 37℃ in the presence of 5% CO2 for 16 hours. A solution containing pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector or pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector at a concentration of 3.2 μg/mL was prepared as a DNA solution for transfection. Polyethylenimine and FBS were added to this solution to make the concentrations 12 μg/mL and 1.3% (v/v), respectively, and the volume was adjusted to 30 mL by adding DMEM/High Glucose medium to prepare the transfection solution. After removing all of the culture supernatant from the cells seeded in a 15 cm dish, the entire volume of 30 mL of transfection solution was added and cultured at 37°C in the presence of 5% CO2 for 3 days to produce rAAV6 virions and rAAV9 virions, respectively.

〔実施例１５〕培養上清の回収
実施例１２～１４の培養終了後，細胞培養液を50 mL遠心チューブに移し，3000×gで10分間遠心して，培養上清を回収した。また，遠心して沈殿させた細胞は，実施例１７の細胞溶解物溶液の調製に用いた。 [Example 15] Recovery of culture supernatant After the completion of the culture in Examples 12 to 14, the cell culture solution was transferred to a 50 mL centrifuge tube and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes to recover the culture supernatant. The cells precipitated by centrifugation were used to prepare a cell lysate solution in Example 17.

〔実施例１６〕培養上清中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定
培養上清中のウイルスゲノム含有量はAAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (タカラバイオ社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。実施例１５で回収した2 μLの培養上清に，2 μLの10×DNaseI Buffer，1 μLのDNaseI，及び15 μLの純水を添加して混合し，37℃で1時間インキュベートした。95℃で10分間熱処理してDNaseIを失活させ，次いで20 μLのLysis Bufferを添加して70℃で10分間熱処理を行った。熱処理後の溶液をEASY Dilution （タカラバイオ社）で100倍希釈し，リアルタイムPCR用サンプル溶液とした。 [Example 16] Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in culture supernatant The viral genome content in the culture supernatant was measured using AAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (Takara Bio Inc.) according to the protocol attached to the kit, generally by the following method. 2 μL of 10×DNaseI Buffer, 1 μL of DNaseI, and 15 μL of pure water were added to 2 μL of the culture supernatant recovered in Example 15, mixed, and incubated at 37°C for 1 hour. DNaseI was inactivated by heat treatment at 95°C for 10 minutes, and then 20 μL of Lysis Buffer was added and heat treatment was performed at 70°C for 10 minutes. The solution after heat treatment was diluted 100 times with EASY Dilution (Takara Bio Inc.) to prepare a sample solution for real-time PCR.

リアルタイムPCR用サンプル溶液と検量線用スタンダードプラスミド溶液（pAAV-CMV-GFPベクターを直鎖化したもの）のそれぞれ5 μLに，12.5 μLのTB Green Premix Ex TaqII，0.6 μLの10 μM 順方向プライマー (プライマー１，配列番号３３)，0.6 μLの10 μM 逆方向プライマー(プライマー２，配列番号３４)，0.08 μLのROX Reference Dye II，及び6.5 μLの水を加えた。リアルタイムPCR反応は変性条件（95℃，2分）の後35サイクルの2ステップPCR（95℃，5秒→60℃，30秒）を行った。得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるrAAVゲノム量（個数）を求めた。このPCRにおいて複製される領域は，ITRの内部領域である。 12.5 μL of TB Green Premix Ex TaqII, 0.6 μL of 10 μM forward primer (primer 1, sequence number 33), 0.6 μL of 10 μM reverse primer (primer 2, sequence number 34), 0.08 μL of ROX Reference Dye II, and 6.5 μL of water were added to 5 μL each of the sample solution for real-time PCR and the standard plasmid solution for the standard curve (linearized pAAV-CMV-GFP vector). The real-time PCR reaction was performed under denaturing conditions (95°C, 2 minutes) followed by 35 cycles of two-step PCR (95°C, 5 seconds → 60°C, 30 seconds). The measured values of the sample were interpolated into the obtained standard curve to determine the amount (number) of rAAV genomes contained in the sample. The region replicated in this PCR is the internal region of the ITR.

培養上清中の総カプシド量はAAV Titration ELISA Kit (PROGEN社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。マウス抗AAV9モノクローナル抗体が固定化されたプレートに1×Assay Bufferで希釈した実施例１５で回収した培養上清（検体サンプル）を100 μLずつ添加し，37℃で1時間静置した。1.3×109～1.0×107 カプシド数/mLの濃度に1×Assay Bufferで希釈したKit Controlを標準溶液として検体サンプルと同様にプレートに加えて静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，ビオチン標識されたマウス抗AAV9抗体又はマウス抗AAV6抗体を加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP標識ストレプトアビジンを加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP基質を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれる総カプシド量（個数）を求めた。 The total amount of capsids in the culture supernatant was measured using an AAV Titration ELISA Kit (PROGEN) according to the protocol attached to the kit, generally by the following method. 100 μL of the culture supernatant (specimen sample) collected in Example 15 diluted with 1× Assay Buffer was added to a plate on which mouse anti-AAV9 monoclonal antibody was immobilized, and the plate was left to stand at 37°C for 1 hour. Kit Control diluted with 1× Assay Buffer to a concentration of 1.3×10 9 to 1.0×10 7 capsids/mL was added as a standard solution to the plate in the same manner as the specimen sample and left to stand. After washing the plate three times with 1× Assay Buffer, biotin-labeled mouse anti-AAV9 antibody or mouse anti-AAV6 antibody was added and left to stand at 37°C for 1 hour. After washing the plate three times with 1× Assay Buffer, HRP-labeled streptavidin was added and left to stand at 37°C for 1 hour. After washing the plate three times with 1x Assay Buffer, HRP substrate was added and left to stand at room temperature for 15 minutes, after which sulfuric acid was added to stop the reaction. The measured values of the samples were interpolated into the calibration curve obtained from the absorbance measurements of the standard solutions to determine the total amount (number) of capsids contained in the samples.

〔実施例１７〕細胞溶解物溶液の調製
実施例１５で細胞培養液を遠心して沈殿させた細胞に，1% TritonX-100，4 mM MgCl2，50U/mL Turbonuclease（Accelagen社），及び4×Protease Inhibitor Cocktail（シグマ社）を含有するクエン酸緩衝液（32 mM クエン酸ナトリウム）を加え，37℃で1.5時間静置した。4 mM MgCl2含有クエン酸緩衝液（68 mM クエン酸）を添加して中和後，6000×g，4℃で10分間遠心した。これに0.25% TritonX-100，4 mM MgCl2，12.5U/mL Turbonuclease（Accelagen社），及び1×Protease Inhibitor Cocktail（シグマ社）を含有する25 mMクエン酸緩衝液（pH 3.6，8 mM クエン酸ナトリウム＋17 mM クエン酸）を2倍量添加して細胞溶解物とした。 Example 17: Preparation of cell lysate solution To the cells precipitated by centrifugation of the cell culture medium in Example 15, citrate buffer (32 mM sodium citrate) containing 1% TritonX-100, 4 mM MgCl2, 50 U/mL Turbonuclease (Accelagen), and 4x Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) was added and left to stand for 1.5 hours at 37°C. After neutralization by adding citrate buffer (68 mM citric acid) containing 4 mM MgCl2, the mixture was centrifuged at 6000xg and 4°C for 10 minutes. A two-fold volume of 25 mM citrate buffer (pH 3.6, 8 mM sodium citrate + 17 mM citric acid) containing 0.25% TritonX-100, 4 mM MgCl2, 12.5 U/mL Turbonuclease (Accelagen), and 1x Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) was added to obtain a cell lysate.

SP-Sepharose 1 mLカラム（GEヘルスケア社）を，4 mM MgCl2を含有する25 mM クエン酸緩衝液（pH 3.6，8 mM クエン酸ナトリウム＋17 mM クエン酸）で平衡化し，これに細胞溶解物を供した。4 mM MgCl2，500 mM NaClを含有する50 mM クエン酸緩衝液（pH 5.18，40.2 mM クエン酸ナトリウム＋9.8 mM クエン酸）で溶出後，最終濃度が50 mMとなるように1M Tris緩衝液を添加して溶出液を中和した。中和サンプルをVivaspin-500 100K MWCO（Vivaproducts社）に入れ，3000×g，4℃で10分間遠心後，180 mM NaCl，0.001% F68含有PBSを入れてさらに3000×g，4℃で10分間遠心して緩衝液を置換した。得られた溶液を細胞溶解物溶液とした。 A 1 mL SP-Sepharose column (GE Healthcare) was equilibrated with 25 mM citrate buffer (pH 3.6, 8 mM sodium citrate + 17 mM citric acid) containing 4 mM MgCl2 , and the cell lysate was applied to the column. After elution with 50 mM citrate buffer (pH 5.18, 40.2 mM sodium citrate + 9.8 mM citric acid) containing 4 mM MgCl2 and 500 mM NaCl, 1 M Tris buffer was added to the column to a final concentration of 50 mM to neutralize the eluate. The neutralized sample was placed in a Vivaspin-500 100K MWCO (Vivaproducts) and centrifuged at 3000 x g for 10 minutes at 4°C, after which PBS containing 180 mM NaCl and 0.001% F68 was added and centrifuged at 3000 x g for 10 minutes at 4°C to replace the buffer. The resulting solution was used as the cell lysate solution.

〔実施例１８〕細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定
精製した細胞溶解物溶液中のウイルスゲノム含有量はAAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (タカラバイオ社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。実施例１７で調製した2 μLの細胞溶解物溶液サンプルに，2 μLの10×DNaseI Buffer，1 μLのDNaseI，及び15 μLの純水を添加して混合し，37℃で1時間インキュベートした。95℃で10分間熱処理してDNaseIを失活させ，次いで20 μLのLysis Bufferを添加して70℃で10分間熱処理を行った。熱処理後の溶液をEASY Dilution（タカラバイオ社）で100倍希釈したものをリアルタイムPCR用のサンプル溶液とした。 Example 18: Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in cell lysate solution The viral genome content in the purified cell lysate solution was measured using the AAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (Takara Bio Inc.) in accordance with the protocol attached to the kit, generally by the following method. 2 μL of 10×DNaseI Buffer, 1 μL of DNaseI, and 15 μL of pure water were added to 2 μL of the cell lysate solution sample prepared in Example 17, mixed, and incubated at 37°C for 1 hour. DNaseI was inactivated by heat treatment at 95°C for 10 minutes, and then 20 μL of Lysis Buffer was added and heat treatment was performed at 70°C for 10 minutes. The solution after heat treatment was diluted 100 times with EASY Dilution (Takara Bio Inc.) to prepare a sample solution for real-time PCR.

リアルタイムPCR用サンプル溶液と検量線用スタンダードプラスミド溶液（pAAV-CMV-GFPベクターを直鎖化したもの）のそれぞれ5 μLに，12.5 μLのTB Green Premix Ex TaqII，0.6 μLの10 μM順方向プライマー (プライマー１，配列番号３３)，0.6 μLの10 μM 逆方向プライマー (プライマー２，配列番号３４)，0.08 μLのROX Reference Dye II，及び6.5 μLの水を加えた。リアルタイムPCR反応は変性条件（95℃, 2分）の後35サイクルの2ステップPCR（95℃, 5秒→60℃, 30秒）を行った。得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるAAVウイルスゲノム量（vg）を求めた。ここでvgはAAVウイルスゲノムの個数を示す単位である。このPCRにおいて複製される領域は，ITRの内部領域である。 12.5 μL of TB Green Premix Ex TaqII, 0.6 μL of 10 μM forward primer (primer 1, sequence number 33), 0.6 μL of 10 μM reverse primer (primer 2, sequence number 34), 0.08 μL of ROX Reference Dye II, and 6.5 μL of water were added to 5 μL each of the sample solution for real-time PCR and the standard plasmid solution for the standard curve (linearized pAAV-CMV-GFP vector). The real-time PCR reaction was performed under denaturing conditions (95°C, 2 minutes) followed by 35 cycles of two-step PCR (95°C, 5 seconds → 60°C, 30 seconds). The measured values of the sample were interpolated into the obtained standard curve to determine the amount of AAV viral genome (vg) contained in the sample. Here, vg is a unit that indicates the number of AAV viral genomes. The region replicated in this PCR is the internal region of the ITR.

細胞溶解物溶液中の総カプシド量はAAV Titration ELISA Kit (PROGEN社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記方法で測定した。マウス抗AAV9モノクローナル抗体が固定化されたプレートに1×Assay Bufferで希釈した実施例１７で調製した細胞溶解物溶液（検体サンプル）を100 μLずつ添加し，37℃で1時間静置した。1.3×109～1.0×107 カプシド数/mLの濃度に1×Assay Bufferで希釈したKit Controlを標準溶液として検体サンプルと同様にプレートに加えて静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，ビオチン標識されたマウス抗AAV9抗体又はマウス抗AAV6抗体を加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP標識ストレプトアビジンを加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP基質を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれる総カプシド量（個数）を求めた。 The total amount of capsids in the cell lysate solution was measured using an AAV Titration ELISA Kit (PROGEN) according to the protocol attached to the kit, generally by the following method. 100 μL of the cell lysate solution (specimen sample) prepared in Example 17 diluted with 1× Assay Buffer was added to a plate on which mouse anti-AAV9 monoclonal antibody was immobilized, and the plate was left to stand at 37°C for 1 hour. Kit Control diluted with 1× Assay Buffer to a concentration of 1.3×10 9 to 1.0×10 7 capsids/mL was added as a standard solution to the plate in the same manner as the specimen sample and left to stand. After washing the plate three times with 1× Assay Buffer, biotin-labeled mouse anti-AAV9 antibody or mouse anti-AAV6 antibody was added and left to stand at 37°C for 1 hour. After washing the plate three times with 1× Assay Buffer, HRP-labeled streptavidin was added and left to stand at 37°C for 1 hour. After washing the plate three times with 1x Assay Buffer, HRP substrate was added and left to stand at room temperature for 15 minutes, after which sulfuric acid was added to stop the reaction. The measured values of the samples were interpolated into the calibration curve obtained from the absorbance measurements of the standard solutions to determine the total amount (number) of capsids contained in the samples.

〔実施例１９〕rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率の算出
実施例１８で測定した細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果と総カプシド量の測定結果からrAAVゲノムを含む組換えAAVビリオン（rAAVビリオン）と空カプシドの量を，それぞれ算出した。rAAVビリオンの量は，rAAVゲノムが全てカプシドにパッケージングされてビリオンを形成したものとみなして，rAAVゲノム量（vg）をrAAVビリオンの量（個数）とした。（rAAVビリオンの量／総カプシド量）X100%を，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率として算出した。なお，総カプシド量（個数）の測定値からrAAVビリオンの量（個数）を減ずると空カプシド量（個数）が算出される。 [Example 19] Calculation of the abundance ratio of rAAV virions in total capsids From the measurement results of the amount of rAAV genome contained in the cell lysate solution measured in Example 18 and the measurement results of the amount of total capsids, the amount of recombinant AAV virions containing the rAAV genome (rAAV virions) and the amount of empty capsids were calculated. The amount of rAAV virions was calculated by assuming that all of the rAAV genome was packaged in capsids to form virions, and the amount of rAAV genome (vg) was the amount (number) of rAAV virions. The abundance ratio of rAAV virions in total capsids was calculated as (amount of rAAV virions/total amount of capsids) x 100%. The amount (number) of empty capsids was calculated by subtracting the amount (number) of rAAV virions from the measurement value of the amount (number) of total capsids.

〔実施例２０〕細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定
HEK293T細胞を1×105個/ウェルの濃度で24ウェルプレートに播種し，10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，8% CO2存在下で16時間培養した。実施例１８で調製したrAAV6ビリオンを含む細胞溶解物溶液を，2% FBSを含む1 mLのDMEM/High Glucose培地に添加し，トランスダクション用溶液を調製した。トランスダクション用溶液は，rAAV6ビリオンが，2x108 個と2x109個含まれるものをそれぞれ調製した。24ウェルプレートの培養上清を全て除いた後，トランスダクション用溶液を添加し，37℃，8% CO2存在下で3日間培養した。 [Example 20] Measurement of infectivity of rAAV6 virions contained in cell lysate solution
HEK293T cells were seeded in a 24-well plate at a concentration of 1x105 cells/well and cultured in 10% FBS-containing DMEM/High Glucose medium at 37°C and 8% CO2 for 16 hours. The cell lysate solution containing rAAV6 virions prepared in Example 18 was added to 1 mL of DMEM/High Glucose medium containing 2% FBS to prepare a transduction solution. Transduction solutions containing 2x108 and 2x109 rAAV6 virions were prepared. After removing all the culture supernatant from the 24-well plate, the transduction solution was added and cultured at 37°C and 8% CO2 for 3 days.

3日後に24ウェルプレートの培養上清を全て除き，PBSで洗浄後20 μLのTrypLETM（トリプシン様活性を有する酵素溶液：Thermo Fisher Scientific社）を添加して37℃で2分間静置した。その後，1 mLのPBSで再び懸濁し，このうち65 μLを用いてMOXI-GO II（ORFLO社）でGFP陽性細胞の割合を測定した。 After 3 days, all the culture supernatant was removed from the 24-well plate, and the wells were washed with PBS. Then, 20 μL of TrypLE ™ (an enzyme solution with trypsin-like activity: Thermo Fisher Scientific) was added and left to stand for 2 minutes at 37°C. The wells were then resuspended in 1 mL of PBS, and 65 μL of the suspension was used to measure the percentage of GFP-positive cells using MOXI-GO II (ORFLO).

〔実施例２１〕細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定
HEK293T細胞を1×105個/ウェルの濃度で24ウェルプレートに播種し， 10% FBS含有DMEM/High Glucose培地で37℃，8% CO2存在下で16時間培養した。実施例１８で調製したrAAV9ビリオンを含む細胞溶解物溶液を，2% FBSを含む1 mLのDMEM/High Glucose培地に添加し，トランスダクション用溶液を調製した。トランスダクション用溶液は，rAAV6ビリオンが，2x108個と2x109個含まれるものをそれぞれ調製した。24ウェルプレートの培養上清を全て除いた後，トランスダクション用溶液を添加し，37℃，8% CO2存在下で3日間培養した。 [Example 21] Measurement of infectivity of rAAV9 virions contained in cell lysate solution
HEK293T cells were seeded in a 24-well plate at a concentration of 1x105 cells/well and cultured in 10% FBS-containing DMEM/High Glucose medium at 37°C and 8% CO2 for 16 hours. The cell lysate solution containing rAAV9 virions prepared in Example 18 was added to 1 mL of DMEM/High Glucose medium containing 2% FBS to prepare a transduction solution. Transduction solutions containing 2x108 and 2x109 rAAV6 virions were prepared. After removing all the culture supernatant from the 24-well plate, the transduction solution was added and cultured at 37°C and 8% CO2 for 3 days.

3日後に24ウェルプレートの培養上清を全て除き，PBSで洗浄後20 μLのTrypLE TM（トリプシン様活性を有する酵素溶液：Thermo Fisher Scientific社）を添加して37℃で2分間静置した。その後，1 mLのPBSで再び懸濁し，このうち65 μLを用いてMOXI-GO II（ORFLO社）でGFP陽性細胞の割合を測定した。 After 3 days, all the culture supernatant was removed from the 24-well plate, and the plate was washed with PBS. Then, 20 μL of TrypLE ™ (an enzyme solution with trypsin-like activity: Thermo Fisher Scientific) was added and the plate was left to stand for 2 minutes at 37°C. The plate was then resuspended in 1 mL of PBS, and 65 μL of the suspension was used to measure the percentage of GFP-positive cells using MOXI-GO II (ORFLO).

〔実施例２２〕Transducing Unitの算出
Transducing Unitを以下の計算式で算出した。ここでTransducing Unitは，細胞溶解物溶液の全量を用いて宿主細胞を感染させたときに得られる，GFP陽性細胞数（rAAVビリオンで感染した細胞数）を意味する。（[ウェル内の総細胞数]×[GFP陽性細胞の割合(%)]/100）×（[rAAVビリオンサンプル総量(mL)]/[各ウェルに投入したrAAVビリオンサンプル量(mL)]） [Example 22] Calculation of Transducing Unit
The Transducing Unit was calculated using the following formula. Here, the Transducing Unit means the number of GFP-positive cells (the number of cells infected with rAAV virions) obtained when the entire volume of the cell lysate solution is used to infect host cells. ([Total number of cells in the well] x [Percentage of GFP-positive cells (%)]/100) x ([Total amount of rAAV virion sample (mL)]/[Amount of rAAV virion sample added to each well (mL)])

〔実施例２３〕結果（培養上清中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定）
実施例１５で得た培養上清中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果を図１２に黒バーで示す。，図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は，それぞれ2.6×1011 vg，7.2×1011 vg，11.1×1011 vgであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は15.6×1011 vgであった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は35.0×1011 vgであった。 [Example 23] Results (measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in culture supernatant)
The measurement results of the amount of rAAV genome contained in the culture supernatant obtained in Example 15 are shown by black bars in Figure 12. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the amount of rAAV genome was 2.6 x 1011 vg, 7.2 x 1011 vg, and 11.1 x 1011 vg, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the amount of rAAV genome was 15.6 x 1011 vg. In contrast, (4) shows the results when the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the rAAV genome amount was 35.0 × 10 11 vg.

また，総カプシド量の測定結果を図１２に白バーで示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，総カプシド量はそれぞれ2.6×1012 capsids，5.6×1012 capsids，5.9×1012 capsidsであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，総カプシド量は3.6×1012 capsidsであった。これに対して(4)%はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，総カプシド量は6.6×1012 capsidsであった。rAAVゲノム量と総カプシド量のいずれの結果も，統合rAAVプラスミド，すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した時に最も発現量が高い結果となった（図１２）。 The results of measuring the total capsid amount are shown by white bars in Figure 12. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the total capsid amount was 2.6× 1012 capsids, 5.6× 1012 capsids, and 5.9× 1012 capsids, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the total capsid amount was 3.6× 1012 capsids. In contrast, (4)% represents the result when the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the total capsid amount was 6.6 × 1012 capsids. The results for both the rAAV genome amount and the total capsid amount showed that the expression level was highest when the integrated rAAV plasmid, i.e., the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector, was introduced (Figure 12).

〔実施例２４〕結果（細胞溶解物溶液中に含まれるrAAV量の測定）
実施例１７で調製した細胞溶解物溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果を図１３に黒バーで示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量はそれぞれ2.5×1011 vg，23.1×1011 vg，22.0×1011 vgであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は6.8×1011 vgであった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は29.7×1011 vgであった（図１３）。 [Example 24] Results (measurement of the amount of rAAV contained in the cell lysate solution)
The results of measuring the amount of rAAV genome contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 are shown by black bars in Figure 13. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the rAAV genome amounts were 2.5 x 1011 vg, 23.1 x 1011 vg, and 22.0 x 1011 vg, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the rAAV genome amount was 6.8 x 1011 vg. In contrast, (4) shows the results when the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the rAAV genome amount was 29.7×10 11 vg (FIG. 13).

また，総カプシド量の測定結果を図１３に白バーで示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，総カプシド量はそれぞれ3.3×1012 capsids，5.3×1012 capsids，5.3×1012 capsidsであった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は3.8×1012 capsidsであった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，rAAVゲノム量は6.1×1012 capsidsであった。rAAVゲノム量と総カプシド量のいずれの結果も統合rAAVプラスミド，すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した時に最も発現量が高い結果となった（図１３）。 The results of measuring the total capsid amount are shown by white bars in Figure 13. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the total capsid amount was 3.3 x 1012 capsids, 5.3 x 1012 capsids, and 5.3 x 1012 capsids, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the rAAV genome amount was 3.8 x 1012 capsids. In contrast, (4) shows the results when the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the rAAV genome amount was 6.1 × 1012 capsids. Both the rAAV genome amount and the total capsid amount showed the highest expression level when the integrated rAAV plasmid, i.e., the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector, was introduced (Figure 13).

〔実施例２５〕結果（rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率）
実施例１７で算出した細胞溶解物溶液のrAAVゲノム量と総カプシド量から求めた，理論上，空カプシドが存在せず，全てのカプシドがrAAVを含むrAAVビリオンである場合，rAAVゲノム量と総カプシド量の存在比率は1:1となる。rAAVビリオン（rAAVビリオン）の総カプシド中における存在比率を図１４に示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，存在比率はそれぞれ7.5%，43.5%，41.5%であった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，存在比率は17.8%であった。これに対して，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，存在比率は48.6%であった（図１４）。この結果より，pHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合と，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合に，空カプシドの割合が少ないことが示された。 [Example 25] Results (abundance ratio in total capsids of rAAV virions)
Theoretically, when there are no empty capsids and all capsids are rAAV virions containing rAAV, the ratio of the rAAV genome amount to the total capsid amount is 1:1, as calculated from the rAAV genome amount and total capsid amount in the cell lysate solution calculated in Example 17. The ratio of the rAAV genome amount to the total capsid amount is shown in Figure 14. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the ratios were 7.5%, 43.5%, and 41.5%, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the proportion of empty capsids was 17.8%. In contrast, (4) shows the results when the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the proportion of empty capsids was 48.6% (Figure 14). These results show that the proportion of empty capsids was low when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and when the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced.

〔実施例２６〕結果（細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定）
実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定結果を図１５に示す。図中黒バーは2×108 個のrAAV6ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)は，pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合はそれぞれ1.5%，9.3%，5%であった。(5)はpHelperベクター，pAAV-CMV-GFPベクター及びpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は0.6%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合の結果を示しGFP陽性細胞の割合は11.2%であった。 [Example 26] Results (measurement of infectivity of rAAV6 virions contained in cell lysate solution)
The results of measuring the infectivity of rAAV6 virions contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 are shown in FIG. 15. The black bars in the figure show the results when 2×10 8 rAAV6 virions were infected. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pRC6 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 1.5%, 9.3%, and 5%, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 0.6%, and (4) shows the results when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector was introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 11.2%.

また，図１５において，白バーは2×109個のrAAV6ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は，それぞれ23.2%，70.5%，53.6%であった。(5)はpHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は12.6%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は71.1%であった。 In addition, in Fig. 15, the white bars show the results when 2 x 109 rAAV6 virions were infected. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pRC6 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 23.2%, 70.5%, and 53.6%, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 12.6%, and (4) shows the results when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector was introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 71.1%.

これらの結果は，pHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，又はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを用いるか，若しくはpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを用いることにより，高い感染能を有するrAAV6ビリオン溶液を得られることを示す。 These results indicate that a highly infectious rAAV6 virion solution can be obtained by using two types of plasmids, the pHelper-R2(mod)C6 vector and the pAAV-CMV-GFP vector, or the pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and the pHelper vector, or by using the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector.

〔実施例２７〕結果（細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定）
実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定結果を図１６に示す。図中黒バーは2×108個のrAAV9ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は，それぞれ0.8%, 0.3%, 2%であった。(5)pHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は3.5%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は7.3%であった。 [Example 27] Results (measurement of infectivity of rAAV9 virions contained in cell lysate solution)
The results of measuring the infectivity of rAAV9 virions contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 are shown in Figure 16. The black bars in the figure show the results when 2 x 108 rAAV9 virions were infected. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids were introduced, the pHelper-ITR/CMV/GFP vector and the pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids were introduced, the pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and the pHelper vector, and (3) shows the results when two types of plasmids were introduced, the pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and the pHelper vector, and the percentage of GFP-positive cells was 0.8%, 0.3%, and 2%, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 3.5%. (4) shows the results when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 7.3%.

また，図１６において，白バーは2×109個のrAAV9ビリオンを感染させた場合の結果を示す。図中(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は，それぞれ4.6%，1%，11.4%であった。(5)はpHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は21.7%であり，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示し，GFP陽性細胞の割合は50.3%であった。 In addition, in Fig. 16, the white bars show the results when 2 x 109 rAAV9 virions were infected. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 4.6%, 1%, and 11.4%, respectively. (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector, were introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 21.7%, and (4) shows the results when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced, and the percentage of GFP-positive cells was 50.3%.

これらの結果は，pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを用いることにより，高い感染能を有するrAAV9ビリオン溶液を得られることを示す。 These results indicate that the use of the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector makes it possible to obtain a highly infectious rAAV9 virion solution.

〔実施例２８〕結果（Transducing Unitの算出）
実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV6ビリオンの感染能測定結果を図１７に示す。図中(1)は，pHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpRC6ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C6ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C6-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(5)はpHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpRC6ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクターを導入した場合の結果を示す。 [Example 28] Results (Calculation of Transducing Unit)
The results of measuring the infectivity of rAAV6 virions contained in the cell lysate solution prepared in Example 17 are shown in Figure 17. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids, pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pRC6 vector, (2) shows the results when two types of plasmids, pHelper-R2(mod)C6 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids, pR2(mod)C6-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector, were introduced. In addition, (5) shows the results when three types of plasmids, pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pRC6 vector, were introduced. In addition, (4) shows the results when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector was introduced.

実施例１７で調製した細胞溶解物溶液に含まれるrAAV9ビリオンの感染能測定結果を図１８に示す。図中(1)は，(1)はpHelper-ITR/CMV/GFPベクターとpR2(mod)C9ベクター，(2)はpHelper-R2(mod)C9ベクターとpAAV-CMV-GFPベクター，(3)はpR2(mod)C9-ITR/CMV/GFPベクターとpHelperベクターの2種類ずつのプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(5)pHelperベクターとpAAV-CMV-GFPベクターとpR2(mod)C9ベクターの3種類のプラスミドを導入した場合の結果を示す。また，(4)はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを導入した場合の結果を示す。 Figure 18 shows the results of measuring the infectivity of rAAV9 virions contained in the cell lysate solution prepared in Example 17. In the figure, (1) shows the results when two types of plasmids were introduced: pHelper-ITR/CMV/GFP vector and pR2(mod)C9 vector, (2) shows the results when two types of plasmids were introduced: pHelper-R2(mod)C9 vector and pAAV-CMV-GFP vector, and (3) shows the results when two types of plasmids were introduced: pR2(mod)C9-ITR/CMV/GFP vector and pHelper vector. (5) shows the results when three types of plasmids were introduced: pHelper vector, pAAV-CMV-GFP vector, and pR2(mod)C9 vector. (4) shows the results when pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector was introduced.

これらの結果は，統合rAAVプラスミド，すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター又はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターを用いて宿主細胞への導入を行うことにより，より感染能の高いrAAV6ビリオン又はrAAV9ビリオンをそれぞれ製造できることを示す。 These results indicate that the introduction of integrative rAAV plasmids, i.e., pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector or pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector into host cells can produce more infectious rAAV6 virions or rAAV9 virions, respectively.

〔実施例２９〕pAAV-CBA(BAM)-I2Sベクターの構築
実施例２８までのpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター又はpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターの2種類のベクターについての実験結果から，統合rAAVプラスミドを用いることにより感染能の高いrAAV6ビリオン又はrAAV9ビリオンを製造できることがわかった。この統合rAAVプラスミドの感染能の高さは，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率が高いことに起因するものと考えられる。そこで結果を更に検証するために，異なる構造を有する統合rAAVプラスミドを構築して，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率を以下の実験により確認した。 [Example 29] Construction of pAAV-CBA(BAM)-I2S vector From the experimental results of the two types of vectors, pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector and pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector up to Example 28, it was found that highly infectious rAAV6 virions or rAAV9 virions can be produced by using the integrated rAAV plasmid. The high infectiousness of the integrated rAAV plasmid is considered to be due to its high presence in the total capsid of rAAV virions. Therefore, in order to further verify the results, integrated rAAV plasmids with different structures were constructed, and the presence ratio in the total capsid of rAAV virions was confirmed by the following experiment.

5’側より，ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，ヒトI2S遺伝子，及びウシ成長ホルモンpolyA配列を含む配列番号３５で示される塩基配列を含むDNA断片を合成した。このDNA断片を鋳型としてプライマー７（配列番号４８）とプライマー８（配列番号４９）を用いて，PCR反応を行った。実施例２で構築したpAAV-CMV-GFP(mod)ベクターを制限酵素（HindIII / BglII）で消化し,これに上記PCR反応で得られたDNA断片を混合し,両者をin fusion HD cloning Kit(タカラバイオ社)を用いて融合させた。得られたプラスミドをpAAV-CBA(BAM)-I2Sベクターとした（図１９）。ここで，ヒトI2S遺伝子は配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含むヒトIDSをコードする（実施例３０に同じ）。また，ヒトCMVエンハンサーは配列番号３７で示される塩基配列，ニワトリβアクチンプロモーターは配列番号３８で示される塩基配列，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロンは配列番号３９で示される塩基配列，及びウシ成長ホルモンpolyA配列は配列番号４０で示される塩基配列を含む。 A DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 35, including the human CMV enhancer, chicken β-actin promoter, chicken β-actin/MVM chimeric intron, human I2S gene, and bovine growth hormone polyA sequence, was synthesized from the 5' side. PCR was performed using this DNA fragment as a template and primer 7 (SEQ ID NO: 48) and primer 8 (SEQ ID NO: 49). The pAAV-CMV-GFP(mod) vector constructed in Example 2 was digested with restriction enzymes (HindIII/BglII), mixed with the DNA fragment obtained by the PCR reaction, and the two were fused using the in fusion HD cloning Kit (Takara Bio). The resulting plasmid was designated as the pAAV-CBA(BAM)-I2S vector (Figure 19). Here, the human I2S gene encodes a human IDS containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 (same as in Example 30). In addition, the human CMV enhancer includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 37, the chicken β-actin promoter includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 38, the chicken β-actin/MVM chimeric intron includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 39, and the bovine growth hormone polyA sequence includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 40.

〔実施例３０〕pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターの構築
5’側より，ITR，ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，ウシ成長ホルモンポリA配列，及びITRを含む配列番号５０で示される塩基配列を有するDNA断片を合成した。このDNA断片をBsiWIとBstZ17Iで消化し，実施例１で構築したpHelper(mod)のBsiWIサイトとBstZ17Iサイトの間に挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CBA(BAM)ベクターとした。 [Example 30] Construction of pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9 vector
A DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO:50, including ITR, human CMV enhancer, chicken β-actin promoter, chicken β-actin/MVM chimeric intron, bovine growth hormone polyA sequence, and ITR from the 5' side, was synthesized. This DNA fragment was digested with BsiWI and BstZ17I and inserted between the BsiWI site and the BstZ17I site of pHelper(mod) constructed in Example 1. The obtained plasmid was designated as pHelper-ITR/CBA(BAM) vector.

pHelper-ITR/CBA(BAM)ベクターをRsrIIで消化し，これに実施例４で構築したpR2(mod)C9をRsrIIで消化して得たAAV9 Cap領域を含むDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CBA(BAM)/-R2(mod)C9ベクターとした。 The pHelper-ITR/CBA(BAM) vector was digested with RsrII, and a DNA fragment containing the AAV9 Cap region obtained by digesting pR2(mod)C9 constructed in Example 4 with RsrII was inserted into it. The resulting plasmid was named the pHelper-ITR/CBA(BAM)/-R2(mod)C9 vector.

ヒトIDS遺伝子を含む配列番号５１で示される塩基配列を有するDNA断片を合成した。このDNA断片をPacIとNotIで消化し，PacIとNotIで消化したpHelper-ITR/CBA(BAM)/-R2(mod)C9ベクターに挿入した。得られたプラスミドをpHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターとした（図２０）。 A DNA fragment containing the human IDS gene and having the base sequence shown in SEQ ID NO:51 was synthesized. This DNA fragment was digested with PacI and NotI and inserted into the pHelper-ITR/CBA(BAM)/-R2(mod)C9 vector digested with PacI and NotI. The resulting plasmid was named pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9 vector (Figure 20).

〔実施例３１〕3種類のプラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生（２）
HEK293T細胞を，2.5×106個/フラスコの濃度でT-25フラスコに播種し，10% FBS含有MEM培地（シグマ社）で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNAとして，pHelperベクター（タカラバイオ社），pAAV-CBA(BAM)-I2Sベクター，及びpR2(mod)C9ベクターを含む溶液を作製した。この溶液は，3種類のプラスミドが等モル濃度で含まれる，DNA濃度が2.9～3.9 μg/mLである溶液となるように調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンを，濃度比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μg)＝1：3となるように添加し，更にMEM培地を加えて液量を5 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。T-25フラスコに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，5 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で5日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。宿主細胞中で産生されたrAAVビリオンは，一部が培養上清中に放出され，一部が宿主細胞内に留まる。実施例３２においても同様である。 [Example 31] Production of rAAV virions by transient expression of three types of plasmids (2)
HEK293T cells were seeded in a T-25 flask at a concentration of 2.5 x 106 cells/flask and cultured in 10% FBS-containing MEM medium (Sigma) at 37°C in the presence of 5% CO2 for 16 hours. A solution containing pHelper vector (Takara Bio), pAAV-CBA(BAM)-I2S vector, and pR2(mod)C9 vector was prepared as DNA for transfection. This solution was prepared so that the DNA concentration was 2.9-3.9 μg/mL, containing three types of plasmids at equimolar concentrations. Polyethylenimine was added to this solution at a concentration ratio of DNA (μg):polyethylenimine (μg) = 1:3, and MEM medium was added to adjust the volume to 5 mL to prepare the transfection solution. After removing all of the culture supernatant from the cells seeded in the T-25 flask, 5 mL of the transfection solution was added in its entirety and cultured at 37°C in the presence of 5% CO2 for 5 days to produce rAAV virions. Some of the rAAV virions produced in the host cells were released into the culture supernatant, and some remained within the host cells. The same applies to Example 32.

〔実施例３２〕統合プラスミドの一過性発現によるrAAVビリオンの産生（２）
HEK293T細胞を，2.5×106 個/フラスコの濃度でT-25フラスコに播種し，10% FBS含有MEM培地（シグマ社）で37℃，5% CO2存在下で16時間培養した。トランスフェクション用のDNAとして，pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターが2.9～3.9 μg/mL含まれる溶液を調製した。この溶液に，ポリエチレンイミンを，濃度比がDNA(μg)：ポリエチレンイミン(μL)＝1：3となるように添加し，更にMEM培地を加えて液量を5 mLに調整したものをトランスフェクション用溶液とした。T-25フラスコに播種した細胞の培養上清を全て除去した後，5 mLのトランスフェクション用溶液を全量添加し，37℃，5% CO2存在下で5日間培養して，rAAVビリオンを産生させた。 [Example 32] Production of rAAV virions by transient expression of integrated plasmid (2)
HEK293T cells were seeded in a T-25 flask at a concentration of 2.5 x 106 cells/flask and cultured in 10% FBS-containing MEM medium (Sigma) at 37°C in the presence of 5% CO2 for 16 hours. A solution containing 2.9 to 3.9 μg/mL of pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9 vector was prepared as DNA for transfection. Polyethylenimine was added to this solution so that the concentration ratio of DNA (μg):polyethylenimine (μL) was 1:3, and MEM medium was added to adjust the liquid volume to 5 mL to prepare the transfection solution. After removing all the culture supernatant from the cells seeded in the T-25 flask, the entire amount of 5 mL of the transfection solution was added and cultured at 37°C in the presence of 5% CO2 for 5 days to produce rAAV virions.

〔実施例３３〕培養上清の回収
実施例３１及び３２の培養終了後，細胞培養液を15 mL遠心チューブに移し，4℃，5800×gで5分間遠心して，培養上清を回収した。 [Example 33] Recovery of culture supernatant After the completion of the culture in Examples 31 and 32, the cell culture medium was transferred to a 15 mL centrifuge tube and centrifuged at 4°C and 5800 xg for 5 minutes to recover the culture supernatant.

〔実施例３４〕培養上清からのrAAVビリオン溶液の調製
実施例３３で回収した培養上清に，エンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼTM（Merck名）を濃度が14 U/mLとなるように添加して混合し，37℃で2時間インキュベートした。AAV9に対し特異的な親和性を有する樹脂が充填されたカラムであるPOROSTM CaptureSelectTM AAV9 Affinity Resin（Thermo Fisher Scientific社）0.15 mLを結合バッファー（20mM Tris-HCl，150mM NaCl及び4 mM MgCl2含有，pH 7.5）で平衡化させ，これにエンドヌクレアーゼ処理した培養上清を負荷した。カラムを結合バッファーで洗浄した後，0.5 mL溶出バッファー（0.1 Mクエン酸含有，pH 2.06）を通じてrAAVビリオンを含む溶液を溶出させた。得られた溶出液を150 mM NaCl及び0.001% F68を含有するPBSで予め平衡化したPD MiniTrapTM G-25（GE Healthcare社）に通じrAAVビリオンをカラムに結合させた。次いで，150 mM NaCl及び0.001% F68を含有する1 mL PBSによりrAAVビリオンを溶出させた。これをビバスピンTM ターボ 15（100K MWCO，PES，Sartorius社）を用いて4℃，2000×gで3分間遠心して濃縮した。得られた溶液をrAAVビリオン溶液とした。 Example 34: Preparation of rAAV virion solution from culture supernatant The culture supernatant collected in Example 33 was mixed with endonuclease Benzonase ™ (Merck) at a concentration of 14 U/mL and incubated at 37°C for 2 hours. 0.15 mL of POROS ™ CaptureSelect ™ AAV9 Affinity Resin (Thermo Fisher Scientific), a column packed with a resin having specific affinity for AAV9, was equilibrated with binding buffer (containing 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl and 4 mM MgCl2 , pH 7.5), and the culture supernatant treated with endonuclease was loaded onto the column. After washing the column with binding buffer, the solution containing rAAV virions was eluted through 0.5 mL of elution buffer (containing 0.1 M citric acid, pH 2.06). The resulting eluate was passed through a PD MiniTrap ™ G-25 (GE Healthcare) pre-equilibrated with PBS containing 150 mM NaCl and 0.001% F68, and the rAAV virions were bound to the column. The rAAV virions were then eluted with 1 mL of PBS containing 150 mM NaCl and 0.001% F68. The eluate was concentrated by centrifugation at 2000×g for 3 minutes at 4°C using a Vivaspin ™ Turbo 15 (100K MWCO, PES, Sartorius). The resulting solution was used as the rAAV virion solution.

〔実施例３５〕rAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定
実施例３４で得られたrAAVビリオン溶液中のウイルスゲノム含有量をAAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (タカラバイオ社)を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法でリアルタイムPCR測定した。実施例３４で調製した2 μLのrAAVビリオン溶液に，2 μLの10×DNaseI Buffer，1 μLのDNaseI，及び15 μLの純水を添加して混合し，37℃で30分間インキュベートした。95℃で10分間熱処理してDNaseIを失活させ，次いで20 μLのLysis Bufferを添加して70℃で10分間熱処理を行った。熱処理後の溶液をEASY Dilution（タカラバイオ社）で50倍希釈したものをリアルタイムPCR用サンプル溶液とした。リアルタイムPCR用サンプル溶液と，2×102～2×107 ゲノムコピー数/μLの濃度にEASY Dilution（タカラバイオ社）で希釈した検量線用Kit control溶液のそれぞれ5 μLに，12.5 μLのTB Green Premix Ex TaqII，0.6 μLの10 μM 順方向プライマー (プライマー１，配列番号３３)，0.6 μLの10 μM 逆方向プライマー(プライマー２，配列番号３４)，0.08 μLのROX Reference Dye II，及び6.5 μLの水を加えた。リアルタイムPCR反応は変性条件（95℃，2分）の後35サイクルの2ステップPCR（95℃，5秒→60℃，30秒）を行った。得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれるrAAVゲノム量（個数）を求めた。このPCRにおいて複製される領域は，ITRの内部領域である。 [Example 35] Measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in rAAV virion solution The viral genome content in the rAAV virion solution obtained in Example 34 was measured by real-time PCR using AAVpro Titration Kit for Real Time PCR Ver.2 (Takara Bio Inc.) in accordance with the protocol attached to the kit, generally by the following method. 2 μL of 10×DNaseI Buffer, 1 μL of DNaseI, and 15 μL of pure water were added to 2 μL of the rAAV virion solution prepared in Example 34, mixed, and incubated at 37°C for 30 minutes. DNaseI was inactivated by heat treatment at 95°C for 10 minutes, and then 20 μL of Lysis Buffer was added and heat treatment was performed at 70°C for 10 minutes. The solution after heat treatment was diluted 50-fold with EASY Dilution (Takara Bio Inc.) to prepare a sample solution for real-time PCR. 12.5 μL of TB Green Premix Ex TaqII, 0.6 μL of 10 μM forward primer (primer 1 , sequence number 33), 0.6 μL of 10 μM reverse primer (primer 2, sequence number 34), 0.08 μL of ROX Reference Dye II, and 6.5 μL of water were added to 5 μL of the sample solution for real-time PCR and the standard curve kit control solution diluted with EASY Dilution (Takara Bio) to a concentration of 2×10 2 to 2×10 7 genome copies/μL. The real-time PCR reaction was performed under denaturing conditions (95°C, 2 minutes) followed by 35 cycles of two-step PCR (95°C, 5 seconds → 60°C, 30 seconds). The measured values of the sample were interpolated into the obtained standard curve to determine the amount (number) of rAAV genomes contained in the sample. The region replicated in this PCR is the internal region of the ITR.

また，上記リアルタイムPCR法に加えて，補助的に，rAAVビリオン溶液中のウイルスゲノム含有量を，ドロップレットデジタルPCR法によっても測定した。rAAVビリオン溶液2 μLに1 μLのDNaseI（タカラバイオ社），2 μLの10× DNaseI Buffer（タカラバイオ社），及び15 μLの0.05% F-68含有水を加え，37℃で30分間インキュベートし，rAAVビリオン外のDNAを消化した。 In addition to the above real-time PCR method, the viral genome content in the rAAV virion solution was also measured by droplet digital PCR. 1 μL of DNase I (Takara Bio), 2 μL of 10× DNase I Buffer (Takara Bio), and 15 μL of water containing 0.05% F-68 were added to 2 μL of the rAAV virion solution, and incubated at 37°C for 30 minutes to digest DNA outside the rAAV virion.

DNaseI処理を行ったrAAVビリオン溶液を0.05% F-68含有TEバッファーを用いて適宜希釈し，ドロップレットデジタルPCR用サンプル溶液を調製した。1.0 μM 順方向プライマー（プライマー３，配列番号４１），1.0 μM 逆方向プライマー（プライマー４，配列番号４２），及び0.25 μM プローブ（プローブ１，配列番号４３の5’末端にレポーター色素としてFAMを，3’末端にクエンチャー色素としてBHQ1を，それぞれ修飾したもの）を含むFAM標識20×プライマー/プローブミックスを調製した。また，1.0 μM 順方向プライマー（プライマー５，配列番号４４），1.0 μM 逆方向プライマー（プライマー６，配列番号４５），及び0.25 μMプローブ（プローブ２，配列番号４６の5’末端にレポーター色素としてHEXを，3’末端にクエンチャー色素としてBHQ1を，それぞれ修飾したもの）を含むHEX標識20×プライマー/プローブミックスを調製した。 The rAAV virion solution treated with DNaseI was appropriately diluted with TE buffer containing 0.05% F-68 to prepare a sample solution for droplet digital PCR. A FAM-labeled 20x primer/probe mix was prepared containing 1.0 μM forward primer (primer 3, sequence number 41), 1.0 μM reverse primer (primer 4, sequence number 42), and 0.25 μM probe (probe 1, sequence number 43, modified with FAM as a reporter dye at the 5' end and BHQ1 as a quencher dye at the 3' end). A HEX-labeled 20x primer/probe mix was also prepared containing 1.0 μM forward primer (primer 5, sequence number 44), 1.0 μM reverse primer (primer 6, sequence number 45), and 0.25 μM probe (probe 2, sequence number 46, modified with HEX as a reporter dye at the 5' end and BHQ1 as a quencher dye at the 3' end).

ドロップレットデジタルPCR用サンプル溶液1 μLに，10 μLのddPCR Supermix for probes (no dUTP) （BioRad社），1 μLのFAM標識20×プライマー/プローブミックス，1 μLのHEX標識20×プライマー/プローブミックス，2 μLの5M ベタイン溶液（Sigma社），及び5 μLの0.05% F-68含有水を加え，PCR反応液を調製した。Droplet generator（BioRad社）を用いて，PCR反応液20 μLとDroplet Generator オイル for Probes（BioRad社）70 μLの懸濁液（ドロップレット）を調製した。このドロップレットを用いてPCR反応を行った。PCR反応は変性条件（95℃，10分）の後40サイクルの3ステップPCR（95℃，30秒→60℃，1分→72℃，15秒）を行い，次いでPCR酵素の不活化処理（98℃，10分）を行った。ドロップレットの解析はQX200 Droplet Digital PCRシステム（BioRad社）を用い，FAM/HEXダブルポジティブドロップレットをもとに，rAAVゲノム量（個数）を求めた。このPCRにおいて複製される領域は，ウシ成長ホルモンpolyA，及びITRの内部領域である。 10 μL of ddPCR Supermix for probes (no dUTP) (BioRad), 1 μL of FAM-labeled 20x primer/probe mix, 1 μL of HEX-labeled 20x primer/probe mix, 2 μL of 5M betaine solution (Sigma), and 5 μL of water containing 0.05% F-68 were added to 1 μL of droplet digital PCR sample solution to prepare a PCR reaction solution. A suspension (droplet) of 20 μL of PCR reaction solution and 70 μL of Droplet Generator Oil for Probes (BioRad) was prepared using a droplet generator (BioRad). PCR reaction was performed using these droplets. The PCR reaction was performed under denaturing conditions (95°C, 10 minutes), followed by 40 cycles of 3-step PCR (95°C, 30 seconds → 60°C, 1 minute → 72°C, 15 seconds), followed by inactivation of the PCR enzyme (98°C, 10 minutes). The droplets were analyzed using the QX200 Droplet Digital PCR System (BioRad), and the amount (number) of rAAV genome was determined based on the FAM/HEX double positive droplets. The regions replicated in this PCR were the bovine growth hormone polyA and the internal region of the ITR.

培養上清中の総カプシド量はAAV Titration ELISA Kit（PROGEN社）を用い，キットに添付のプロトコールに準じて，概ね下記の方法で測定した。マウス抗AAV9モノクローナル抗体が固定化されたプレートに1×Assay Bufferで希釈した実施例３４で調製したrAAVビリオン溶液を100 μLずつ添加し，37℃で1時間静置した。1.0×107～1.3×109 カプシド数/mLの濃度に1×Assay Bufferで希釈した既知量のAAV9空カプシドを標準溶液として検体サンプルと同様にプレートに加えて静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，ビオチン標識されたマウス抗AAV9抗体を加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP標識ストレプトアビジンを加え，37℃で1時間静置した。プレートを1×Assay Bufferで3回洗浄後，HRP基質を加え，室温で15分間静置した後，硫酸を加えて反応を停止した。標準溶液の吸光度の測定値から得られた検量線に，検体の測定値を内挿し，検体に含まれる総カプシド量（個数）を求めた。 The total amount of capsids in the culture supernatant was measured using an AAV Titration ELISA Kit (PROGEN) according to the protocol attached to the kit, generally as follows. 100 μL of the rAAV virion solution prepared in Example 34, diluted with 1× Assay Buffer, was added to a plate on which mouse anti-AAV9 monoclonal antibody was immobilized, and the plate was left to stand at 37°C for 1 hour. A known amount of AAV9 empty capsid diluted with 1× Assay Buffer to a concentration of 1.0×10 7 to 1.3×10 9 capsids/mL was added as a standard solution to the plate in the same manner as the specimen sample and left to stand. After washing the plate three times with 1× Assay Buffer, a biotin-labeled mouse anti-AAV9 antibody was added and left to stand at 37°C for 1 hour. After washing the plate three times with 1× Assay Buffer, HRP-labeled streptavidin was added and left to stand at 37°C for 1 hour. After washing the plate three times with 1x Assay Buffer, HRP substrate was added and left to stand at room temperature for 15 minutes, after which sulfuric acid was added to stop the reaction. The measured values of the samples were interpolated into the calibration curve obtained from the absorbance measurements of the standard solutions to determine the total amount (number) of capsids contained in the samples.

〔実施例３６〕結果（rAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量と総カプシド量の測定）
実施例３４で調製したrAAVビリオン溶液中に含まれるrAAVゲノム量の測定結果を表１に示す。 [Example 36] Results (measurement of rAAV genome amount and total capsid amount contained in rAAV virion solution)
The measurement results of the rAAV genome amount contained in the rAAV virion solution prepared in Example 34 are shown in Table 1.

Figure 0007651787000001
Figure 0007651787000001

理論上，空カプシドが存在せず，全てのカプシドがrAAVゲノムを含むrAAVビリオンである場合，rAAVゲノム量と総カプシド量の存在比率は1:1となる。rAAVゲノムが全てカプシドにパッケージングされてビリオンを形成したものとみなして，rAAVゲノム量（vg）をrAAVビリオンの量（個数）とした。（rAAVビリオンの量（個数）／総カプシド量（個数））X100（%）を，rAAVビリオンの総カプシド中における存在比率として，リアルタイムPCR法で求められたrAAVゲノム量を用いて存在比率を算出すると，3種類のプラスミドを用いた場合は12.7%であることころ，統合rAAVプラスミドを用いた場合は62.2%であった。すなわちpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6ベクター及びpHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9ベクターと同様に，pHelper-ITR/CBA(BAM)/I2S-R2(mod)C9ベクターの場合も，統合rAAVプラスミドを用いることによりrAAVビリオンの総カプシド中における存在比率を高めることができることが検証された。また，rAAVビリオンの量（vg）をrAAVビリオンの量（個数）とすると，統合rAAVプラスミドを用いることにより，3種類のプラスミドを用いる場合と比較して，8倍以上のrAAVビリオンが得られることなるので，統合rAAVプラスミドをrAAVビリオンの製造に用いることによりrAAVビリオンの生産量効率を大幅に上昇されることができる。補助的に行ったドロップレットデジタルPCR法によるrAAVゲノム量の定量結果からも同様の結論が得られる。 Theoretically, if there are no empty capsids and all capsids are rAAV virions containing the rAAV genome, the ratio of the amount of rAAV genome to the amount of total capsids is 1:1. Assuming that all rAAV genomes are packaged into capsids to form virions, the amount of rAAV genome (vg) was taken as the amount (number) of rAAV virions. The amount of rAAV genome determined by real-time PCR was used to calculate the ratio of the amount of rAAV virions in the total capsids, which was 12.7% when three types of plasmids were used and 62.2% when the integrated rAAV plasmid was used. That is, it was verified that the use of the integrated rAAV plasmid can increase the ratio of rAAV virions in the total capsids, as in the case of the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C6 vector and the pHelper-ITR/CMV/GFP-R2(mod)C9 vector. In addition, if the amount of rAAV virions (vg) is the amount (number) of rAAV virions, the use of the integrated rAAV plasmid can obtain more than 8 times as many rAAV virions as the case of using three types of plasmids. Therefore, the use of the integrated rAAV plasmid for the production of rAAV virions can significantly increase the production efficiency of rAAV virions. The same conclusion can be obtained from the results of quantifying the amount of rAAV genome by the auxiliary droplet digital PCR method.

本発明の一実施形態によれば，遺伝子治療等に使用できる，外来の蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸配列がパッケージされたrAAVビリオンを効率よく生産することができるので，かかるrAAVビリオンを医療機関に安定的に供給することができる。 According to one embodiment of the present invention, rAAV virions packaged with a nucleic acid sequence including a base sequence encoding a foreign protein that can be used in gene therapy, etc. can be efficiently produced, and such rAAV virions can be stably supplied to medical institutions.

配列番号１：血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列，野生型
配列番号２：血清型2のAAVのRep68のアミノ酸配列，野生型
配列番号３：血清型2のAAVのRep78のアミノ酸配列，野生型
配列番号４：血清型2のAAVのRep蛋白質をコードする塩基配列の好ましい一例，合成配列
配列番号５：血清型6のAAVのVP1をコードする塩基配列，野生型
配列番号６：血清型6のAAVのVP1のアミノ酸配列，野生型
配列番号７：血清型9のAAVのVP1をコードする塩基配列，野生型
配列番号８：血清型9のAAVのVP1のアミノ酸配列，野生型
配列番号９：血清型2のAAVの第一の逆方向末端反復（第一のITR）の塩基配列，野生型
配列番号１０：血清型2のAAVの第一の逆方向末端反復（第二のITR）の塩基配列，野生型
配列番号１１：第一の逆方向末端反復（第一のITR）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１２：第二の逆方向末端反復（第二のITR）の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１５：E4領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１７：ヘルパー領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号１９：第１の遺伝子発現制御部に含まれる塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２０：Rep領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２１：Cap領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２２：Rep-Cap領域の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２３：Rep-Cap領域の塩基配列の好適な一例（２），合成配列
配列番号２４：組換えAAVビリオンを作製するために使用される核酸分子の塩基配列の好適な一例，合成配列
配列番号２５：合成ヒトβグロビンイントロンの塩基配列，合成配列
配列番号２６：合成ポリアデニレーションシグナル配列の塩基配列，合成配列
配列番号２７：SalIサイト，RsrIIサイト，ColE1 ori，アンピシリン耐性遺伝子，BsiWIサイト，BstZ17Iサイト，及びBsrGIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号２８：EcoRIサイト，MluIサイト，GFP遺伝子，NotIサイト，及びBamHIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号２９：マルチクローニングサイト１の塩基配列，合成配列
配列番号３０：マルチクローニングサイト２の塩基配列，合成配列
配列番号３１：AfeIサイト，RsrIIサイト，BsrGIサイト，AvrIIサイト，アンピシリン耐性遺伝子，ColE1 ori，RsrIIサイト，血清型2の Rep領域の5’部分（p5プロモーターを含む），及びSacIIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号３２：HindIIIサイト，血清型2のAAVのRep領域の3’部分，血清型9のCap領域，p5プロモーター，RsrIIサイト，及びBsrGIサイトを含む塩基配列，合成配列
配列番号３３：順方向プライマー，プライマー１の塩基配列，合成配列
配列番号３４：逆方向プライマー，プライマー２の塩基配列，合成配列
配列番号３５：ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，ヒトI2S遺伝子，及びウシ成長ホルモンpolyA配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号３６：ヒトIDSのアミノ酸配列
配列番号３７：ヒトCMVエンハンサーの塩基配列
配列番号３８：ニワトリβアクチンプロモーターの塩基配列
配列番号３９：ニワトリβアクチン/MVMキメライントロンの塩基配列，合成配列
配列番号４０：ウシ成長ホルモンpolyA配列の塩基配列
配列番号４１：プライマー３の塩基配列，合成配列
配列番号４２：プライマー４の塩基配列，合成配列
配列番号４３：プローブ１の塩基配列，合成配列
配列番号４４：プライマー５の塩基配列，合成配列
配列番号４５：プライマー６の塩基配列，合成配列
配列番号４６：プローブ２の塩基配列，合成配列
配列番号４７：ヒトCMVエンハンサー及びニワトリβアクチンプロモーターを含む塩基配列，合成配列
配列番号４８：プライマー７の塩基配列，合成配列
配列番号４９：プライマー８の塩基配列，合成配列
配列番号５０：ヒトCMVエンハンサー，ニワトリβアクチンプロモーター，ニワトリβアクチン/MVMキメライントロン，及びウシ成長ホルモンポリA配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号５１：ヒトIDS遺伝子を含む塩基配列，合成配列 SEQ ID NO: 1: Nucleotide sequence encoding the Rep protein of AAV of serotype 2, wild-type SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of Rep68 of AAV of serotype 2, wild-type SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of Rep78 of AAV of serotype 2, wild-type SEQ ID NO: 4: A preferred example of a nucleotide sequence encoding the Rep protein of AAV of serotype 2, synthetic SEQ ID NO: 5: Nucleotide sequence encoding VP1 of AAV of serotype 6, wild-type SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of VP1 of AAV of serotype 6, wild-type SEQ ID NO: 7: Nucleotide sequence encoding VP1 of AAV of serotype 9, wild-type SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of VP1 of AAV of serotype 9, wild-type SEQ ID NO: 9: Nucleotide sequence of the first inverted terminal repeat (first ITR) of AAV of serotype 2, wild-type SEQ ID NO: 10: Nucleotide sequence of the first inverted terminal repeat (second ITR) of AAV of serotype 2, wild-type SEQ ID NO: 11: A preferred example of a nucleotide sequence of the first inverted terminal repeat (first ITR), synthetic SEQ ID NO: 12: A preferred example of a nucleotide sequence of a second inverted terminal repeat (second ITR), synthetic sequence SEQ ID NO: 15: a preferred example of a nucleotide sequence of an E4 region, synthetic sequence SEQ ID NO: 17: a preferred example of a nucleotide sequence of a helper region, synthetic sequence SEQ ID NO: 19: a preferred example of a nucleotide sequence included in a first gene expression control unit, synthetic sequence SEQ ID NO: 20: a preferred example of a nucleotide sequence of a Rep region, synthetic sequence SEQ ID NO: 21: a preferred example of a nucleotide sequence of a Cap region, synthetic sequence SEQ ID NO: 22: a preferred example of a nucleotide sequence of a Rep-Cap region, synthetic sequence SEQ ID NO: 23: a preferred example of a nucleotide sequence of a Rep-Cap region (2), synthetic sequence SEQ ID NO: 24: a preferred example of a nucleotide sequence of a nucleic acid molecule used to prepare a recombinant AAV virion, synthetic sequence SEQ ID NO: 25: a nucleotide sequence of a synthetic human β-globin intron, synthetic sequence SEQ ID NO: 26: a nucleotide sequence of a synthetic polyadenylation signal sequence, synthetic sequence SEQ ID NO: 27: a SalI site, an RsrII site, ColE1 SEQ ID NO:28: Nucleotide sequence including EcoRI site, MluI site, GFP gene, NotI site, and BamHI site, synthetic sequence SEQ ID NO:29: Nucleotide sequence of multicloning site 1, synthetic sequence SEQ ID NO:30: Nucleotide sequence of multicloning site 2, synthetic sequence SEQ ID NO:31: AfeI site, RsrII site, BsrGI site, AvrII site, ampicillin resistance gene, ColE1 ori, RsrII site, serotype 2 SEQ ID NO:32: A nucleotide sequence including the 5' part of the Rep region (including the p5 promoter) and the SacII site, synthetic sequence SEQ ID NO:33: A nucleotide sequence including the HindIII site, the 3' part of the Rep region of AAV of serotype 2, the Cap region of AAV of serotype 9, the p5 promoter, the RsrII site, and the BsrGI site, synthetic sequence SEQ ID NO:34: A nucleotide sequence including the reverse primer, the primer 2, synthetic sequence SEQ ID NO:35: A nucleotide sequence including the human CMV enhancer, the chicken β-actin promoter, the chicken β-actin/MVM chimeric intron, the human I2S gene, and the bovine growth hormone polyA sequence, synthetic sequence SEQ ID NO:36: Amino acid sequence of human IDS SEQ ID NO:37: A nucleotide sequence of the human CMV enhancer SEQ ID NO:38: A nucleotide sequence of the chicken β-actin promoter SEQ ID NO:39: A nucleotide sequence including the chicken β-actin/MVM chimeric intron SEQ ID NO:40: Nucleotide sequence of bovine growth hormone polyA sequence SEQ ID NO:41: Nucleotide sequence of primer 3, synthetic sequence SEQ ID NO:42: Nucleotide sequence of primer 4, synthetic sequence SEQ ID NO:43: Nucleotide sequence of probe 1, synthetic sequence SEQ ID NO:44: Nucleotide sequence of primer 5, synthetic sequence SEQ ID NO:45: Nucleotide sequence of primer 6, synthetic sequence SEQ ID NO:46: Nucleotide sequence of probe 2, synthetic sequence SEQ ID NO:47: Nucleotide sequence including human CMV enhancer and chicken β-actin promoter, synthetic sequence SEQ ID NO:48: Nucleotide sequence of primer 7, synthetic sequence SEQ ID NO:49: Nucleotide sequence of primer 8, synthetic sequence SEQ ID NO:50: Nucleotide sequence including human CMV enhancer, chicken β-actin promoter, chicken β-actin/MVM chimeric intron, and bovine growth hormone polyA sequence, synthetic sequence SEQ ID NO:51: Nucleotide sequence including human IDS gene, synthetic sequence

Claims (24)

少なくとも以下の塩基配列を含む核酸分子；
アデノ随伴ウイルスのＰ５プロモーターを含む塩基配列，アデノ随伴ウイルス血清型２のＲｅｐ蛋白質をコードする塩基配列，アデノ随伴ウイルスのＰ４０プロモーターを含む塩基配列，アデノ随伴ウイルス血清型９のＣａｐ蛋白質をコードする塩基配列，Ｒｅｐ蛋白質及びＣａｐ蛋白質の発現量を高めるエンハンサー機能を有する塩基配列，第一のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（第一のＩＴＲ）を含む塩基配列，外来の蛋白質の発現を制御する遺伝子発現制御部位を含む塩基配列，該外来の蛋白質をコードする塩基配列，及び第二のアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（第二のＩＴＲ）を含む塩基配列を，上流から下流にこの順で含む塩基配列，及び
アデノウイルスのＥ２Ａ領域を含む塩基配列，アデノウイルスのＥ４領域を含む塩基配列，及びアデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡ領域を含む塩基配列を，上流から下流にこの順で含む塩基配列。 A nucleic acid molecule comprising at least the following base sequence:
A base sequence including, from upstream to downstream, a base sequence including a P5 promoter of the adeno-associated virus, a base sequence encoding a Rep protein of adeno-associated virus serotype 2, a base sequence including a P40 promoter of the adeno-associated virus, a base sequence encoding a Cap protein of adeno-associated virus serotype 9, a base sequence having an enhancer function for increasing the expression levels of the Rep protein and the Cap protein, a base sequence including a first ITR of the adeno-associated virus, a base sequence including a gene expression control site for controlling the expression of a foreign protein, a base sequence encoding the foreign protein, and a base sequence including a second ITR of the adeno-associated virus, and a base sequence including, from upstream to downstream, a base sequence including an E2A region of the adenovirus, a base sequence including an E4 region of the adenovirus, and a base sequence including an VA1 RNA region of the adenovirus, in this order. 薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を更に含むものである，請求項１の核酸分子。 The nucleic acid molecule of claim 1, further comprising a base sequence including a drug resistance gene. 薬剤耐性遺伝子を含む塩基配列を，該Ｃａｐ蛋白質をコードする塩基配列の下流であって，該第一のＩＴＲを含む塩基配列の上流に含むものである，請求項２の核酸分子。 The nucleic acid molecule of claim 2, which contains a base sequence containing a drug resistance gene downstream of the base sequence encoding the Cap protein and upstream of the base sequence containing the first ITR. 該Ｒｅｐ蛋白質が，Ｒｅｐ６８又は／及びＲｅｐ７８を含むものである，請求項１～３のいずれかの核酸分子。 The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 3 , wherein the Rep protein comprises Rep68 or/and Rep78. 該Ｃａｐ蛋白質が，ＶＰ１を含むものである，請求項１～４のいずれかの核酸分子。 The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 4 , wherein the Cap protein comprises VP1. 該第一のＩＴＲ及び該第二のＩＴＲのアデノ随伴ウイルス血清型が２である，請求項１～５の何れかの核酸分子。 The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 5 , wherein the adeno-associated virus serotype of said first ITR and said second ITR is 2. 該薬剤耐性遺伝子が，該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤への耐性を，原核細胞に付与するものである，請求項２～６の何れかの核酸分子。 The nucleic acid molecule of any one of claims 2 to 6 , wherein the drug resistance gene confers resistance to a drug corresponding to the drug resistance gene to a prokaryotic cell. 該遺伝子発現制御部位が，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター，β-アクチンプロモーター，配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーター，及び配列番号４７で示される塩基配列を含むプロモーターの下流に配列番号３９で示される塩基配列を含むもの，からなる群から選択されるものである，
請求項１～７の何れかの核酸分子。 the gene expression control site is selected from the group consisting of a promoter derived from a cytomegalovirus, an SV40 early promoter, a human elongation factor-1 alpha (EF-1α) promoter, a human ubiquitin C promoter, a β-actin promoter, a promoter comprising the base sequence shown in SEQ ID NO:47, and a promoter comprising the base sequence shown in SEQ ID NO:39 downstream of the promoter comprising the base sequence shown in SEQ ID NO:47,
A nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 7 . 該エンハンサー機能を有する塩基配列が，アデノ随伴ウイルスのＰ５プロモーター又はその機能的等価物である，請求項１～８の何れかの核酸分子。 The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 8 , wherein the base sequence having an enhancer function is a P5 promoter of an adeno-associated virus or a functional equivalent thereof. 該外来の蛋白質がヒトのものである，請求項１～９の何れかの核酸分子。 10. The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 9 , wherein the foreign protein is human. 該外来の蛋白質が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものである，請求項１～９の何れかの核酸分子。 10. The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 9 , wherein the foreign protein is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody. 該外来の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，ソマトメジン，インスリン，グルカゴン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ），ゴナドトロピン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），ベータアミロイドを分解する活性を有する酵素，エタネルセプト，ペグビソマント，メトレレプチン，アバタセプト，アスホターゼ，及びＧＬＰ－１受容体アゴニストからなる群から選択されるものである，
請求項１～１０の何れかの核酸分子。 The foreign protein may be growth hormone, lysosomal enzyme, somatomedin, insulin, glucagon, lysosomal enzyme, cytokine, lymphokine, blood coagulation factor, antibody, fusion protein of antibody and other protein, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), erythropoietin, darbepoetin, tissue plasminogen activator (t-PA), thrombomodulin, follicle stimulating hormone (FSH), gonadotropin releasing hormone (GnRH), gonadotropin, DNase, thyroid stimulating hormone (TSH), nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF). , glial cell line neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor alpha receptor (TNF-alpha receptor), an enzyme having activity of degrading beta-amyloid, etanercept, pegvisomant, metreleptin, abatacept, asfotase, and GLP-1 receptor agonist,
A nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 10 . 該外来の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，
請求項１～１０の何れかの核酸分子。 The foreign protein is a lysosomal enzyme, and the lysosomal enzyme is selected from the group consisting of α-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, GM2 activator protein, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, α-mannosidase, β-mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyelinase, and α-galactosidase. A, β-glucuronidase, heparan N-sulfatase, α-N-acetylglucosaminidase, acetyl-CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, acid ceramidase, amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1, and CLN2,
A nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 10 . 該外来の蛋白質が，抗ＩＬ－６抗体，抗ベータアミロイド抗体，抗ＢＡＣＥ抗体，抗ＥＧＦＲ抗体，抗ＰＤ－１抗体，抗ＰＤ－Ｌ１抗体，抗ＨＥＲ２抗体，抗ＰＣＳＫ９抗体，抗ＴＮＦ-α抗体，及び血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有する抗体からなる群から選択されるものである，請求項１～１１の何れかの核酸分子。 The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 11, wherein the foreign protein is selected from the group consisting of an anti-IL-6 antibody, an anti-beta amyloid antibody, an anti-BACE antibody, an anti-EGFR antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD- L1 antibody, an anti-HER2 antibody, an anti-PCSK9 antibody, an anti-TNF-α antibody, and an antibody having affinity for a protein present on the surface of a vascular endothelial cell. 該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，請求項１４の核酸分子。 The nucleic acid molecule of claim 14, wherein the protein present on the surface of the vascular endothelial cell is selected from the group consisting of transferrin receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transporter 1, organic anion transporter, monocarboxylate transporter, low-density lipoprotein receptor-related protein 1, low-density lipoprotein receptor-related protein 8 , and membrane-bound precursor of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor. 該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，
該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び
該他の蛋白質が，成長ホルモン，リソソーム酵素，サイトカイン，リンホカイン，血液凝固因子，抗体，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ），エリスロポエチン，ダルベポエチン，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-PA），トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），グリア細胞株神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，ＰＤ－１，ＰＤ－１リガンド，腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦ-α受容体），及びベータアミロイドを分解する活性を有する酵素からなる群から選択されるものである，
請求項１～９の何れかの核酸分子。 the foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein,
The antibody is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody, and the other protein is a growth hormone, a lysosomal enzyme, a cytokine, a lymphokine, a blood coagulation factor, an antibody, a fusion protein of an antibody and another protein, a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), a granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF), a macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF), an erythropoietin, a darbepoietin, a tissue plasminogen activator (t-PA), a thrombomodulin, a follicle-stimulating hormone, a DNaseI, a thyroid-stimulating hormone (TSH), a nerve growth factor (NGF), a ciliary neurotrophic factor (CNTF), a glial cell the said polypeptide is selected from the group consisting of: global dendritic cell lineage neurotrophic factor (GDNF), neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, neurotrophin 6, neuregulin 1, activin, basic fibroblast growth factor (bFGF), fibroblast growth factor 2 (FGF2), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin 6, PD-1, PD-1 ligand, tumor necrosis factor alpha receptor (TNF-alpha receptor), and an enzyme having an activity of degrading beta amyloid,
A nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 9 . 該外来の蛋白質が，抗体と他の蛋白質との融合蛋白質であり，
該抗体が，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，及びヒト抗体からなる群から選択されるものであり，及び
他の蛋白質がリソソーム酵素であり，該リソソーム酵素が，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼ Ａ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１，トリペプチジルペプチダーゼ－１，ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１及びＣＬＮ２からなる群から選択されるものである，
請求項１～９の何れかの核酸分子。 the foreign protein is a fusion protein of an antibody and another protein,
The antibody is selected from the group consisting of a mouse antibody, a humanized antibody, a human-mouse chimeric antibody, and a human antibody, and the other protein is a lysosomal enzyme, and the lysosomal enzyme is selected from the group consisting of α-L-iduronidase, iduronate-2-sulfatase, glucocerebrosidase, β-galactosidase, GM2 activator protein, β-hexosaminidase A, β-hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, α-mannosidase, β-mannosidase, galactosylceramidase, saposin C, arylsulfatase A, α-L-fucosidase, aspartylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyelinase, and α-galactosidase. A, β-glucuronidase, heparan N-sulfatase, α-N-acetylglucosaminidase, acetyl-CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase, acid ceramidase, amylo-1,6-glucosidase, sialidase, palmitoyl protein thioesterase-1, tripeptidyl peptidase-1, hyaluronidase-1, CLN1, and CLN2,
A nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 9 . 該他の蛋白質が，ヒトのものである，請求項１６又は１７の核酸分子。 18. The nucleic acid molecule of claim 16 or 17 , wherein the other protein is human. 該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質に対して親和性を有するものである，
請求項１６～１８の何れかの核酸分子。 The antibody has affinity for a protein present on the surface of a vascular endothelial cell.
A nucleic acid molecule according to any one of claims 16 to 18 . 該血管内皮細胞の表面に存在する蛋白質が，トランスフェリン受容体，インスリン受容体，レプチン受容体，インスリン様成長因子I受容体，インスリン様成長因子II受容体，リポ蛋白質受容体，ブドウ糖輸送担体１，有機アニオントランスポーター，モノカルボン酸トランスポーター，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質１，低密度リポ蛋白質受容体関連蛋白質８，及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子の膜結合型前駆体からなる群から選択されるものである，請求項１９の核酸分子。 The nucleic acid molecule of claim 19, wherein the protein present on the surface of the vascular endothelial cell is selected from the group consisting of transferrin receptor, insulin receptor, leptin receptor, insulin-like growth factor I receptor, insulin-like growth factor II receptor, lipoprotein receptor, glucose transporter 1, organic anion transporter, monocarboxylate transporter, low-density lipoprotein receptor-related protein 1, low-density lipoprotein receptor-related protein 8 , and membrane-bound precursor of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor. 環状プラスミドである，請求項１～２０の何れかの核酸分子。 21. The nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 20 , which is a circular plasmid. 請求項１～２１の何れかの核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含む，組換えＡＡＶ粒子の製造方法。 A method for producing recombinant AAV particles, comprising the step of introducing a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 21 into a host cell. 該宿主細胞のゲノムが，アデノウイルスのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域を含む塩基配列を含むものである，請求項２２の製造方法。 The method of claim 22 , wherein the genome of the host cell comprises a base sequence including the E1A and E1B regions of an adenovirus. 該宿主細胞が，ＨＥＫ２９３細胞である，請求項２３の製造方法。 The method of claim 23 , wherein the host cell is a HEK293 cell.
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