JP7653408B2 - 抗ｐｄ－ｌ１抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ｐＨに依存してプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合し、阻害受容体プログラム死１ポリペプチド（ＰＤ－１）及び共刺激分子ＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１結合と競合する抗原結合分子、特に抗体、そのフラグメント及び変異体、並びに癌等の疾患の治療及び／又は予防への上記抗原結合分子の使用に関する。

Ｔ細胞に対する２つの異なるシグナルによる共刺激は、抗原提示細胞による静止Ｔリンパ球の免疫応答活性化を調整し、厳密に調節するのに重要な機構である（非特許文献１）。初期抗原特異的シグナルは、ＭＨＣによって提示される外来ペプチド抗原の認識後にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第２のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される共刺激分子によってＴ細胞に送られ、Ｔ細胞のクローン性増殖、サイトカイン分泌及びエフェクター機能を誘導する（非特許文献２）。共刺激の非存在下では、Ｔ細胞が抗原刺激に対して不応性となる可能性があり、有効な免疫応答を開始せず、枯渇又は外来抗原に対する寛容を引き起こす場合がある。

Ｔ細胞は、正及び負の両方の二次共刺激シグナルを受け取り、かかるシグナルの調節は、免疫寛容を維持し、自己免疫を防止しながら宿主の防御免疫応答を最大化するのに極めて重要である。負の二次シグナルがＴ細胞寛容の誘導に必要とされるようであり、正のシグナルがＴ細胞活性化を促進する。単純な２シグナルモデルが依然としてナイーブリンパ球について妥当な説明を与えるが、宿主の免疫応答は動的プロセスであり、共刺激シグナルが抗原曝露されたＴ細胞にも与えられ得る。

共刺激シグナルの操作が細胞ベースの免疫応答を増強するか又は停止させる手段を与えることが示されているため、共刺激の機構は治療的に重要である。Ｔ細胞機能不全又はアネルギーが阻害受容体プログラム死１ポリペプチド（ＰＤ－１）の誘導及び持続発現と同時に生じることが発見されている。ＰＤ－Ｌ１／Ｂ７Ｈ１／ＣＤ２７４及びＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ／ＣＤ２７３の２つのＰＤ－１リガンドが記載されている。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ及びＴ細胞等の免疫細胞上に低レベルで発現され、活性化後に上方調節される。ＰＤ－Ｌ１は、内皮細胞、心臓、肺、膵臓、筋肉、ケラチノサイト及び胎盤等の非リンパ系器官でも発現される。非リンパ系組織内での発現は、ＰＤ－Ｌ１が末梢組織において自己反応性Ｔ及びＢ細胞並びに骨髄性細胞の機能を調節する可能性があるか、又は標的器官において炎症応答を調節する可能性があることを示唆する。ＰＤ－Ｌ１発現は主に、内皮及び上皮細胞におけるＰＤ－Ｌ１の主要調節因子である１型及び２型インターフェロンによって調節される。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍サンプルにおいて発現され、予後不良と関連する（非特許文献３）。ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ細胞表面発現は、主にマクロファージ及び樹状細胞に限定される。ＰＤ－Ｌ１は、様々なヒト癌において豊富に見られ（非特許文献４）、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の減少、及び癌性細胞による免疫回避をもたらす（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転させることができる（非特許文献８）。ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害は、癌の治療についてＴ細胞免疫を増強することが示されている（非特許文献９）。

チェックポイント阻害剤による免疫療法は現在、増え続ける癌型に対する標準的技法となっている。これまで、１つの抗ＣＴＬＡ－４抗体（イピリムマブ）、２つの抗ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ及びニボルマブ）及び３つの抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブ）が承認されており、多くの臨床試験によって明白な利点を示している。これらの作用物質と関連する免疫性の有害事象は、皮膚、結腸、内分泌腺、肺及び肝臓に影響を及ぼすことが多い。これらの免疫関連有害事象（ＡＥ）は、異なる腫瘍型にわたって生じ、あらゆるグレードの事象が、抗ＣＴＬＡ－４イピリムマブで治療した患者の約９０％及び任意の抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療した患者のおよそ７０％において起こる（非特許文献１０）。併用チェックポイント阻害剤治療については、グレード３～４の免疫関連ＡＥの割合が顕著に高い（非特許文献１１）。

Warburgは、酸素の存在下であっても癌細胞のエネルギー代謝が主に解糖に限られることを初めて報告した（非特許文献１２）。解糖の増加は、ヌクレオシド及びアミノ酸を生成する経路を含む様々な生合成経路への解糖中間体の転用を可能にし、これにより、新生物疾患における新たな細胞の集合及び活発な細胞増殖の支持に必要とされる巨大分子及び細胞小器官の生合成が促進される（非特許文献１３）。乳酸の細胞内産生の増加の結果が細胞外腫瘍アシドーシスである。弱アルカリ性（約ｐＨ７．４）の細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）を維持するために、腫瘍細胞はＮａ^＋／Ｈ^＋交換輸送体、ＨＣＯ_３ ^－輸送体及び炭酸脱水酵素ＩＸ等の幾つかのプロトン放出機構を上方調節する（非特許文献１４）。過剰なプロトンが細胞外基質に排出され、腫瘍微小環境の細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）を酸性にする。或る特定の腫瘍型においては、ｐＨ６～６．５と低いｐＨが測定されている（非特許文献１５、非特許文献１６）。

Mondino and Jenkins, J Leukoc Biol. 1994;55:805-15 Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 1996;14:233 Wang et al. Medicine 2017;96:e6369 Dong et al. Nat. Med 2002;8:787 Dong et al. J. Mol. Med. 2003;81:281 Blank et al. Cancer Immunol. Immunother. 2005;54:307 Konishi et. al. Clin. Cancer Res. 2004;10:5094 Iwai et al. J Biomed. Sci. 2017;24: 26 Alsaab et al. Front. Pharmacol. 2017;8:561 Michot et al. Eur J Cancer 2016;54:139 Wolchok et al. N Engl J Med 2017;377:1345 Warburg Science 1956;123:309 Heiden et al. Science 2009;324:1029 Gillies et al. J Magnetic Resonance Imaging 2002;16:430 Gatenby and Gillies Nature Rev. Cancer 2004;4:891 Muller-Klieser and Vaupel Adv. Physiol. Sci. 1981 25:253

本発明者らは、腫瘍中和を増強しながら上記のような末梢チェックポイント阻害剤治療毒性を低減するために、７．４の生理的ｐＨで活性が低下し、腫瘍の酸性ｐＨであるｐＨ６～６．５で最大活性を有する抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂを生成した。本発明は、肺実質の炎症として広く定義され、単独又は組合せでの抗ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１療法を受けている患者において記載されており、肺癌の患者においてより一般に見られる肺臓炎の低減に特に有用である（Brahmer J et al. N Engl J Med 2015; 373: 123-135、Rivzi NA et al. J Clin Oncol 2015; 33: 15s）。

本発明の抗原結合分子は、生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）と比較して酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）でＰＤ－Ｌ１に対して顕著に高い親和性を示した。これは、ｐＨ特異的結合を示さず、多くは実際にｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０で低い親和性を示す、当該技術分野で既知の他のＰＤ－Ｌ１結合分子とは対照的である。

したがって、本発明の抗原結合分子は、当該技術分野で既知のＰＤ－Ｌ１抗体よりもはるかに低い末梢毒性を有する。このことは、腫瘍細胞死滅戦略（Ｆｃ媒介性又は毒性薬物コンジュゲート）が、健常な細胞を破壊することなく、腫瘍陽性ＰＤ－Ｌ１細胞のみに対して用いられ得ることを意味する。これにより重大な副作用及び末梢チェックポイント阻害剤治療毒性が低減する。

これらの抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂは、単剤又は他の関連の癌若しくは免疫腫瘍学標的との二重特異性フォーマットとしてフォーマッティングすることができる。幾つかの実施の形態においては、抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１結合について一価である。

ＰＤ－Ｌ１抗体又は組成物は、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、及び癌療法のための緩和ケアからなる群から選択される従来の療法を更に含む治療レジメンと組み合わせることができる。化学療法治療がゲムシタビン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンからなる群から選択することができる。

本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合分子を特定した。

一態様においては、本発明は、配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を提供する。

更なる態様においては、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、本発明の抗原結合分子へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する抗原結合分子を提供する。

更なる態様においては、本発明は、ヒトＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子であって、エピトープが配列番号１９で構成される、抗原結合分子を提供する。

更なる態様においては、本発明は、カニクイザルＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子を提供する。

更なる態様においては、本発明は、抗体２Ａ０９の親和性成熟突然変異体である、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を提供する。

また更なる態様においては、本発明は、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。

更なる態様においては、本発明は、本発明の抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を含み、付加的な治療的活性剤を更に含むキットを提供する。

更なる態様においては、本発明は、癌の治療又は予防に使用される、本発明の抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を提供する。

また更なる態様においては、本発明は、被験体に本発明の抗原結合分子又は医薬組成物を投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は障害が癌である、方法を提供する。

更なる態様においては、本発明は、ヒトＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１発現細胞と本発明の抗原結合分子とを接触させることを含む、ＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのヒトＰＤ－Ｌ１の結合、又はＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１発現細胞の結合を阻害する方法を提供する。

更なる態様においては、本発明は、本発明の抗原結合分子をコードする核酸を提供する。

本発明の更なる態様においては、本発明の抗原結合分子をコードする核酸を含むベクター又はプラスミドが提供される。

本発明の更なる態様においては、本発明の抗原結合分子をコードする核酸を含むベクター又はプラスミドを含む宿主細胞が提供される。

更なる態様においては、本発明は、細胞に本発明の核酸を含むプラスミド又はベクターをトランスフェクトすることを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を発現する細胞を作製する方法を提供する。

更なる態様においては、本発明は、本発明による宿主細胞を細胞培養培地においてプラスミド又はベクターのコード化核酸配列を細胞内で発現させる条件下で培養することを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を作製する方法を提供する。

３つのリードｍＡｂである１Ａ０６、１Ｅ０８及び２Ａ０９のＰＤ－Ｌ１中和ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。抗ＨＥＬ ｍＡｂを陰性対照として使用した。 ３つのリードｍＡｂである１Ａ０６、１Ｅ０８及び２Ａ０９のＣＤ８０中和ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂのＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示す図である。ｍＡｂである２Ａ０９、１Ａ０６及び１Ｅ０８のｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃに対する結合のＫｄ（１／ｓ）。 クレブスバッファー中にてｐＨ７．４、６．５及び６．０でのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への２Ａ０９ ｍＡｂ及びＦａｂの結合を示す図である。 ＥＬＩＳＡによるＫＲＢバッファー中にてｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＰＤ－Ｌ１への親和性成熟抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ結合を示す図である。 ＥＬＩＳＡによるＫＲＢバッファー中にてｐＨ７．４、６．５及び６．０でのＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１結合の親和性成熟抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ阻害を示す図である。ＯＤを陰性対照Ｆａｂ ２Ａ１１（抗ＨＥＬ）に対して正規化した。 クレブスバッファー中にてｐＨ７．４、６．５及び６．０のｍＡｂでのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への親和性成熟抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ結合を示す図である。抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴを陽性対照として使用した。 本発明の幾つかの抗原結合分子の重鎖及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲを示す図である。

本明細書において使用される場合、「抗原結合分子」は、互いに結合特異性を有する分子対のメンバーである。抗原結合対のメンバーは、天然由来であっても、又は完全若しくは部分的に合成にて作製されてもよい。分子対の一方のメンバーは、分子対のもう一方のメンバーの特定の空間的及び極性構成に特異的に結合し、したがって相補的である、突起又は空洞であり得る領域を表面上に有する。このため、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。抗原結合対のタイプの例は、抗原－抗体、ビオチン－アビジン、ホルモン－ホルモン受容体、受容体－リガンド及び酵素－基質である。本発明は概して、抗原－抗体タイプの相互作用に関する。本発明において使用される抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ１のエピトープ、ｈＰＤ－Ｌ１のエピトープ又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１のエピトープに対して他の分子よりも大きな親和性で結合し、すなわち、ＰＤ－Ｌ１、ｈＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ１のエピトープ、ｈＰＤ－Ｌ１のエピトープ及び／又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する。ＰＤ－Ｌ１、ｈＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ１のエピトープ、ｈＰＤ－Ｌ１のエピトープ又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１のエピトープに対する抗原結合分子の結合親和性は、解離定数（Ｋ_Ｄ）を用いて測定することができる。ＰＤ－Ｌ１、ｈＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ１のエピトープ、ｈＰＤ－Ｌ１のエピトープ又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１のエピトープに対する抗原結合分子の結合親和性は、会合定数（Ｋａ）を用いて測定することもできる。本明細書に記載されるＰＤ－Ｌ１に対する抗原結合分子のＫ_Ｄ値は、非ＰＤ－Ｌ１に対する抗原結合分子のＫ_Ｄ値よりも低い。

ＰＤ－Ｌ１及び／又はｈＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合分子には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる。本発明において使用される抗原結合分子は通例、抗体（そのフラグメントを含む）である。

本明細書において使用される場合、ＰＤ－Ｌ１は、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１を指す場合がある。

「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、天然であるか、又は部分的若しくは完全に合成にて作製されるかに関わらず、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。この用語は、抗体結合ドメインであるか又はそれと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。これらは、天然源に由来していても、又は部分的若しくは完全に合成にて作製されてもよい。抗体は、通例、２つの同一の重鎖と、重鎖よりも小さな２つの同一の軽鎖とを含有するポリペプチドである。哺乳動物においては、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と呼ばれる２つのタイプの軽鎖が存在する。重鎖のそれぞれ及び軽鎖のそれぞれが可変領域及び定常領域から構成される。重鎖可変領域がＶＨ領域と称され、軽鎖可変領域がＶＬ領域と称される。カッパ軽鎖については、ＶＬ領域がＶＫ領域と称される場合もある。軽鎖及び重鎖の可変領域のそれぞれがＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。これらは、それぞれＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３と名付けられている。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）及びそれらのアイソタイプサブクラスであり、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ等の抗原結合ドメインを含むフラグメント、及びダイアボディも本発明において企図される。

本発明の抗原結合分子は、典型的には抗体、より典型的にはモノクローナル抗体である。好ましい実施形態においては、抗体は、ヒト定常領域が用いられる完全ヒトモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。

モノクローナル抗体を作製する方法は、例えばFrenzel et al., "Expression of Recombinant Antibodies", Front Immunol, 2013, 4:217（その内容が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように当業者に既知である。

本発明のモノクローナル抗体は、抗体のアミノ酸配列を修飾することによってヒト化することができる。本発明の抗原結合分子の免疫原性を低下させる方法としては、好適な抗体フレームワーク足場へのＣＤＲグラフティング、又は例えば部位特異的突然変異誘発若しくは他の一般に用いられる分子生物学的手法による可変表面残基リモデリングが挙げられる（Roguska et al Protein Eng. 9 895-904 (1996)）。

適用可能な他の方法としては、分子内の潜在的Ｔ細胞エピトープの特定、及びその後の、例えば部位特異的突然変異誘発によるこれらの除去（脱免疫化）を挙げることができる。抗原結合分子のヒト化は、分子を治療剤として使用する場合に所望される可能性がある。ＣＤＲ領域又は周囲のフレームワーク配列のヒト化を所望に応じて行うことができる。

モノクローナル抗体及び他の抗体を用い、組換えＤＮＡ技術の手法を用いて、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。かかる手法は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含み得る。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子突然変異又は他の変化を受ける可能性があり、これにより産生される抗体の結合特異性が変化する場合も又は変化しない場合もある。

一実施形態においては、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域は、少なくとも８５％ヒト化、少なくとも９０％ヒト化、少なくとも９５％ヒト化、少なくとも９６％ヒト化、少なくとも９７％ヒト化、少なくとも９８％ヒト化又は少なくとも９９％ヒト化されている。幾つかの実施形態においては、抗体は、例えばより良好な抗原結合を保持するように保存的にヒト化される。かかる保存的にヒト化された抗体においては、ヒト化抗体と比較してより少ない抗体置換が行われ得る。

本発明の抗原結合分子は、幾つかの実施形態においては、例えばJones et al., "Deimmunization of monoclonal antibodies", Methods Mol Biol, 2009, 525:405-23（その内容が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される方法を用いて脱免疫化される。脱免疫化により、免疫学的及び分子生物学的手法の組合せを用いてＴ細胞エピトープが配列から除去される。

したがって、本発明の幾つかの実施形態においては、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体の６つのＣＤＲ領域の脱免疫化変異体を含む、脱免疫化抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子又はその抗原結合フラグメントが提供される。本発明の更なる実施形態においては、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体に由来するＶＨ及び／又はＶＬ配列の脱免疫化変異体を含む、脱免疫化抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子又はその抗原結合フラグメントが提供される。本発明のまた更なる実施形態においては、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体の脱免疫化変異体である脱免疫化抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。

抗原結合分子及びその抗原結合フラグメントは、１つの親抗体２Ａ０９をベースとする。本発明は、親抗体に加えて、親抗体の親和性成熟変異体に特に関する。本発明はまた、本発明の抗体に由来する１つ以上の抗原結合ドメインを含む抗体フラグメント、並びに１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する抗原結合ドメインを有する抗体又はその抗原結合フラグメント等の更なる変異体をベースとする。一実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１個～１０個の保存的アミノ酸置換を有する抗原結合ドメインを有する。一実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ～５つの保存的アミノ酸置換を有する抗原結合ドメインを有する。一実施形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ又は２つの保存的アミノ酸置換を有する抗原結合ドメインを有する。本発明の抗原結合分子は全て、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。

本発明の抗原結合分子、特に抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＹを含む任意の好適なタイプとすることができるが、ＩｇＧが好ましい可能性がある。ＩｇＧ１骨格が最も好ましい可能性がある。関連の実施形態においては、本発明の抗体の定常領域を有利な効果、例えば安定性の増大及びＦｃγ受容体相互作用の低減のために修飾することができる。

かかる有利な修飾としては、Ｆｃ領域における修飾又は置換、例えばエフェクター細胞死滅機能を増強するものが挙げられる。エフェクター細胞死滅機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を指す。

一実施形態においては、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ活性を増強するように修飾される。増強は、修飾前の抗体と比較して強いＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ活性を指す。

一実施形態においては、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ活性を増強するようにタンパク質工学によって修飾される。一実施形態においては、Ｆｃ受容体親和性は、Ｃ１ｑに対する親和性を高めるアミノ酸突然変異によって高めることができ、これによりＣＤＣが増強する。

別の実施形態においては、Ｆｃ受容体親和性は、Ｆｃ領域のグリコシル化プロファイルを変化させることによって高めることができる。一実施形態においては、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ活性を高めるように脱フコシル化又は低フコシル化（under fucosylation）によって修飾される。

抗体及び抗原結合分子のフラグメント
本発明の抗原結合分子は、抗体のフラグメント、具体的には抗体の抗原結合フラグメントとすることができる。抗原結合フラグメントは、１つ以上の抗原結合領域を含む。全抗体のフラグメントが抗原に結合する機能を果たし得ることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)）、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｖｉｉ）２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによってＶＨドメイン及びＶＬドメインが連結した一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al., Science 242:423-426 (1988)、Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号）、並びに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築される多価又は多重特異性フラグメントである「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号、P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)）。通例、フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはＦｖフラグメント又はｓｃＦｖ分子である。幾つかの実施形態においては、フラグメントは、Ｆａｂフラグメントであってもよい。

二重特異性抗体は、２つの抗原又は２つのエピトープ等の２つの標的分子に同時に結合することができる抗体である。二重特異性抗体は、二重結合抗体と称されることもある。二重特異性抗体フォーマットの例としては、（ｍＡｂ）２、Ｆｃａｂ、Ｆ（ｍＡｂ’）２、クアドローマ、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、ｂｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化抗体）、チャージペア（charge pairs）、タンデム抗体、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ｚｙｂｏｄｙ（zybodies）、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３（ドックアンドロック（dock-and-lock）三価Ｆａｂ）、ｂｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）及びノブインホール（knobs-in-holes）が挙げられるが、これらに限定されない。

ダイアボディは、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、２つのドメインは連結している（例えばペプチドリンカーによる）が、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位は、多量体内の１つのポリペプチドの第１のドメインと多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（国際公開第９４／１３８０４号）。

二重特異性抗体を使用する場合、これらは従来の二重特異性抗体であってもよく、様々な方法で製造することができ（Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)）、例えば化学的に若しくはハイブリッドハイブリドーマから作製しても、又は下記の二重特異性抗体フラグメントのいずれかであってもよい。全抗体ではなく、ｓｃＦｖ二量体又はダイアボディを使用することが好ましい場合がある。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、Ｆｃ領域なしに、可変ドメインのみを用いて構築することができ、抗イディオタイプ反応の影響を低減する可能性がある。二重特異性抗体の他の形態としては、Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991)に記載される一本鎖「ジャヌシン（Janusins）」が挙げられる。

二重特異性ダイアボディはまた、二重特異性全抗体とは対照的に、大腸菌（E. coli）内で容易に構築し、発現させることができるため、有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体フラグメント等の多くの他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号）を用いてライブラリから容易に選択することができる。ダイアボディの或るアームを、例えば抗原Ｘに対する特異性で一定に保つ場合、別のアームを変化させてライブラリを作成し、適切な特異性の抗体を選択することができる。

幾つかの実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対して一価であり、例えば一価抗体フラグメントである。一価抗原結合分子（単量体抗原結合分子としても知られる）は、エピトープ又は抗原に対する結合部位を１つしか有しない抗原結合分子である。例えば、Ｆａｂ、ノブインホール、１アームＩｇＧ、ｓｃＦｖは、一価結合を示し、２つのＦａｂ領域を有する完全モノクローナル抗体は、二価結合を示す。抗原結合分子が一価である場合、抗原結合分子及び抗原は、１：１の比率で結合する。したがって、本発明は、ｐＨに依存してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する一価抗体又は抗体フラグメントを提供する。

幾つかの実施形態においては、抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対して一価である。これは、抗原結合分子がＰＤ－Ｌ１に対して最大で１つの結合部位を有することを意味する。したがって、抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１分子に１：１の比率で結合する。一価抗原結合分子はまた、概して単一特異性である。かかる実施形態においては、一価抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１のみに特異的に結合する。幾つかの実施形態においては、抗体結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に１：１の比率で特異的に結合する一価結合部位と、ＰＤ－Ｌ１とは異なる抗原に特異的に結合する１つ以上の付加的な結合部位とを含み得る。例えば、幾つかの実施形態においては、抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対して一価である（ＰＤ－Ｌ１に１：１の比率で特異的に結合する）第１の結合部位と、第２の異なる抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む二重特異性抗原結合分子である。別の実施形態においては、抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対して一価である（ＰＤ－Ｌ１に１：１の比率で特異的に結合する）第１の結合部位と、第２の異なる抗原に対して一価である（第２の異なる抗原に１：１の比率で特異的に結合する）第２の結合部位とを含む二重特異性抗原結合分子であり得る。かかる実施形態においては、抗原結合分子は、その抗原に１つの抗原結合分子対２つの抗原分子の比率で結合するが、１つの抗原結合分子対１つのＰＤ－Ｌ１分子の比率でも結合する。多重及び二重特異性構成は、他の部分で論考され、本明細書に開示される多重及び二重特異性抗原結合分子がＰＤ－Ｌ１に対して一価であり得る（すなわち、ＰＤ－Ｌ１に１つの二重特異性抗原結合分子対１つのＰＤ－Ｌ１分子の比率で結合する）ことが直接企図される。

幾つかの実施形態においては、本発明の抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１及び別の抗原又はエピトープに対して二重特異性であってもよい。一実施形態においては、他の抗原は、Ｔ細胞共刺激アゴニスト又はＴ細胞共刺激アンタゴニストからなる群から選択することができる。一実施形態においては、他の抗原は、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳ、ＣＤ７０、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＥＧＦＲ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ及びＣＤ４０からなる群から選択することができる。

一実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するとともに、免疫チェックポイント阻害剤に特異的に結合する。更なる実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するとともに、免疫チェックポイント阻害剤に特異的に結合する。更なる実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するとともに、免疫チェックポイント阻害剤に特異的に結合し、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ及びＴＩＧＩＴからなる群から選択される。

一実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するとともに、免疫エフェクターに特異的に結合する。更なる実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するとともに、ＯＸ４０、ＥＧＦＲ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＸＣＲ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ７０、ＣＤ２５、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα及びＣＤ２７からなる群から選択される免疫エフェクターに特異的に結合する。

一実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、また、Ｔ細胞等の他の細胞を動員し、係合するように作用する。二重特異性抗原結合分子又は抗体の二重抗原特異性は、細胞傷害性Ｔ細胞上に存在する抗原とともにＰＤ－Ｌ１特異的抗原に同時に結合することを可能にする。これにより、Ｔ細胞の細胞傷害活性が二重特異性抗原結合分子又は抗体の係合活性によって腫瘍細胞に指向される。更なる実施形態においては、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するとともに、Ｔ細胞リクルーターに特異的に結合する。Ｔ細胞リクルーター分子としては、ＣＤ３及びＣＤ１３７が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗体又は抗原結合分子は、三重特異性であってもよい。本発明の三重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的な結合部位と、Ｔ細胞を動員するための結合部位とを含む。一実施形態においては、かかる抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的な結合部位と、ＣＤ３に特異的な結合部位とを含む。さらに、これらの実施形態においては、三重特異性抗原結合分子又は抗体のＦｃ領域は、アクセサリー細胞上のＦｃ受容体に結合することもできる。単球、マクロファージ、ＮＫ細胞及び／又は樹状細胞等の付加的なアクセサリー細胞の動員は、三重特異性抗体がＴ細胞、アクセサリー細胞及び腫瘍細胞の連結を可能にするため、三重特異性抗原結合分子又は抗体を腫瘍細胞の破壊について他の抗体よりも強力なものとする。一実施形態においては、三重特異性抗原結合分子又は抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的な１つの結合部位と、ＣＤ３に特異的な１つの結合部位と、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞及び樹状細胞上のＦｃ受容体と相互作用し得る無傷Ｆｃ領域とを含む。

本発明の抗体又は抗原結合分子は、薬物、プロドラッグ又は毒性部分等の他の分子にコンジュゲートしてもよい。これは、これらの分子を腫瘍細胞に標的化するのに役立つ。本発明の抗体又は抗原結合分子は、他のＰＤ－Ｌ１抗体よりもはるかに低い末梢毒性を有するため、健常な細胞を破壊することなく、腫瘍陽性ＰＤ－Ｌ１細胞のみに対して腫瘍細胞死滅戦略を用いることができる。一実施形態においては、本発明のＰＤ－Ｌ１特異的抗原結合分子は、細胞毒素（例えばメイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、クリプトフィシン、カリケアマイシン、ズオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン）、タンパク質毒素（例えば緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素、リボソーム不活性化タンパク質）、及び放射性核種（例えば^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ）からなる群から選択される分子にコンジュゲートされる。

同一性及び相同性
当該技術分野で既知の「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味し、場合によっては、かかる配列の文字列間の一致によって決定される。２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する多数の方法があるが、同一性の決定に一般に用いられる方法は、コンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の同一性を決定するのに好ましいコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)）が挙げられるが、これらに限定されない。

アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラム等のプログラムを使用することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、必要に応じていずれかの配列に空白を挿入することによって最適アラインメントを見出すものである。最適アラインメントについてアミノ酸の同一性又は類似性（同一性＋アミノ酸タイプの保存）を算出することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似した配列の最長ストレッチをアラインメントし、適合度に値を割り当てるものである。このため、幾つかの類似性領域が見出され、各々が異なるスコアを有する比較を得ることが可能である。どちらのタイプの同一性分析も本発明において企図される。

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントは、最適比較目的で配列をアラインメントし（例えば、配列との最良アラインメントのために最初の配列にギャップを導入することができる）、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって決定される。「最良アラインメント」は、最高の同一性パーセントをもたらす２つの配列のアラインメントである。同一性パーセントは、比較される配列中の同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数によって決定される（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。概して、本明細書における同一性％への言及は、文脈上他に指定又は示唆されない限り、分子の全長にわたる同一性％を指す。

２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に既知の数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するための数学アルゴリズムの一例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように修正された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムは、かかるアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行い、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行い、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のように用いることができる。代替的には、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの別の例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、かかるアルゴリズムを組み込んでいる。当該技術分野で既知の配列分析のための他のアルゴリズムとしては、Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5に記載されるＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ、並びにPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されるＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡにおいては、ｋｔｕｐが検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。

典型的には、本発明において提供される抗原結合分子のＣＤＲのアミノ酸配列は、例えばＨＧＭＰ（ヒトゲノムマッピングプロジェクト）によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）のデフォルトパラメーターを用いて、下記のＣＤＲのアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。より典型的には、ＣＤＲ配列は、下に示す配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する。通例、本発明において使用される抗原結合分子のＣＤＲ配列の各々が、下記のＣＤＲのアミノ酸配列に対して、このレベルの同一性を有する。代替的には、本発明において使用される抗原結合分子のＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ又は５つが、下記のＣＤＲのアミノ酸配列に対して、このレベルの同一性を有する。

本発明において提供される抗原結合分子のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、例えばＨＧＭＰ（ヒトゲノムマッピングプロジェクト）によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）のデフォルトパラメーターを用いて、下記のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。より典型的には、ＶＨ及びＶＬ領域は、下に示す配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する。通例、本発明において使用される抗原結合分子のＶＨ及びＶＬ領域の各々が、下記のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列に対して、このレベルの同一性を有する。代替的には、本発明において使用される抗原結合分子のＶＨ及びＶＬ領域のいずれか１つが、下記のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列に対して、このレベルの同一性を有する。

同一性は、本明細書において使用される場合、「相同性」及び「類似性」と区別なく用いられ得る。特定の同一性％への言及は、相同性％及び類似性％に等しく当てはまる。相同性及び類似性は、適切なアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ等を用いて決定することができる。これらの分析を行うためのソフトウェアは、公表されている。

変異体
本発明はまた、以下に言及するペプチド配列の変異体にまで及ぶ。本明細書において使用される場合、「変異体」という用語は、同様のアミノ酸配列を有し、及び／又は同じ機能を保持するタンパク質に関する。例えば、「変異体」という用語は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換等を含むタンパク質又はポリペプチドを包含する。本発明の変異体の一例は、１つ以上の他のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換を除いて、以下に定義されるペプチドを含むタンパク質である。アミノ酸置換は例えば、アミノ酸配列における障害を低減又は排除するために行うことができる。代替的には、アミノ酸置換は、必要に応じて抗原親和性を改善するか、又は抗体をヒト化若しくは脱免疫化するために行うことができる。指定の抗体の親和性成熟変異体、ヒト化変異体及び脱免疫化変異体、並びに抗体の配列における任意の障害を低減又は排除するためにアミノ酸置換を含む変異体が、本明細書において提供される。

置換
当業者は、様々なアミノ酸が同様の特性を有することを認識している。物質の１つ以上のかかるアミノ酸は、多くの場合、その物質の所望の活性を排除することなく、１つ以上の他のかかるアミノ酸によって置換され得る。

このため、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、互いに置換され得ることが多い（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換の中でも、グリシン及びアラニンが互いの置換に使用され（比較的短い側鎖を有するため）、バリン、ロイシン及びイソロイシンが互いの置換に使用される（疎水性のより大きな脂肪族側鎖を有するため）ことが好ましい。互いに置換され得ることが多い他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、アスパルテート及びグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）、アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びにシステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。

この種の置換は、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と称されることが多い。

自然発生アミノ酸は、３文字及び１文字のコードを用いて以下のように称され得る：グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）、アラニン（Ａ又はＡｌａ）、バリン（Ｖ又はＶａｌ）、ロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）、イソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）、プロリン（Ｐ又はＰｒｏ）、フェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）、チロシン（Ｙ又はＴｙｒ）、トリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）、リジン（Ｋ又はＬｙｓ）、アルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ又はＨｉｓ）、アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）、アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）、システイン（Ｃ又はＣｙｓ）、メチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）及びトレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸又はアスパラギンであり得る場合、記号Ａｓｘ又はＢを用いることができる。残基がグルタミン酸又はグルタミンであり得る場合、記号Ｇｌｘ又はＺを用いることができる。文脈上他に指定のない限り、アスパラギン酸への言及はアスパルテートを含み、グルタミン酸への言及はグルタメートを含む。

以下に言及する融合タンパク質のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の欠失又は挿入を行うこともできる。このため、例えば、ポリペプチドの活性に実質的な影響を及ぼさないか、又は少なくともかかる活性を排除しないアミノ酸を欠失させることができる。かかる欠失は、活性を保持しながらポリペプチドの全長及び分子量を減少させることができるため、有利であり得る。これにより、特定の目的に必要とされるポリペプチドの量を減少させることが可能であり、例えば投与量レベルを減少させることができる。

このため、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、互いに置換され得ることが多い（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換の中でも、グリシン及びアラニンが互いの置換に使用され（比較的短い側鎖を有するため）、バリン、ロイシン及びイソロイシンが互いの置換に使用される（疎水性のより大きな脂肪族側鎖を有するため）ことが好ましい。互いに置換され得ることが多い他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、アスパルテート及びグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）、アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びにシステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。

幾つかの実施形態においては、以下のアミノ酸を保存的アミノ酸置換のために交換することができる。

したがって、「保存的」アミノ酸置換への言及は、抗体の配列（例えば、ＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬ配列）中のアミノ酸の１つ以上が、上で示したように同じクラスの別のアミノ酸で置換されるアミノ酸置換を指す。保存的アミノ酸置換は、抗体の機能に対する悪影響を最小限に抑えるためにＣＤＲ領域にあるのが好ましい場合がある。しかしながら、保存的アミノ酸置換は、フレームワーク領域に生じてもよい。

下記の配列に対するアミノ酸変化は、任意の好適な手法、例えば部位特異的突然変異誘発又は固相合成を用いて行うことができる。

本発明の範囲内のアミノ酸置換又は挿入は、自然発生又は非自然発生アミノ酸を用いて行うことができるが、自然発生アミノ酸が好ましい場合があることを理解されたい。天然又は合成アミノ酸が使用されるか否かを問わず、Ｌ－アミノ酸のみが存在することが好ましい。

本発明の一実施形態においては、抗体結合ドメイン又は抗原結合ドメインに１個～１０個、好ましくは１個～５個、より好ましくは１又は２個のアミノ酸置換を含む、本発明の抗原結合分子又はその抗原結合フラグメントが提供される。例えば、本発明の一実施形態においては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体の６つのＣＤＲ領域を含み、任意に、抗原結合分子が、そのＣＤＲ領域全体にわたって１個～１０個のアミノ酸置換、好ましくはそのＣＤＲ領域全体にわたって１個～５個のアミノ酸置換を有する。本発明の更なる実施形態においては、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントは、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体のＶＨ及びＶＬ配列を含み、任意に、抗原結合分子が、そのＶＨ及びＶＬ配列にわたって１個～１０個のアミノ酸置換、好ましくはそのＶＨ及びＶＬ配列にわたって１個～５個のアミノ酸置換を有する。本発明のまた更なる実施形態においては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体であり、抗体は１個～１０個のアミノ酸置換、好ましくは１個～５個のアミノ酸置換を有する。置換は当然ながら、出発抗体の元のＣＤＲ又は可変鎖配列を基準にした置換である。

幾つかの実施形態においては、１つ以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲ領域（単数又は複数）にある。他の実施形態においては、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域、すなわち可変重鎖及び軽鎖にあるが、ＣＤＲ領域（単数又は複数）にはない。他の実施形態においては、１つ以上のアミノ酸置換は、可変重領域及び／又は可変軽領域内の任意の位置にあり得る。幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換は、抗体の結合特異性及び／又は親和性に悪影響を及ぼさない。したがって、変異体抗体は、それが由来する抗体と同じか又は優れた機能プロファイルを有し得る。

例えば、幾つかの実施形態においては、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体であり、そのフレームワーク領域全体にわたって１個～１０個のアミノ酸置換、好ましくはそのフレームワーク領域全体にわたって１個～５個のアミノ酸置換を有する（すなわち、置換が参照抗体と比べてフレームワーク領域に見られ、ＣＤＲ配列は変化しない）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。

親和性成熟変異体
本発明の範囲内の他の変異体には、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１のエピトープに対する親和性が増大するように修飾された本発明の抗原結合分子が含まれる。一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、親和性成熟抗体である。一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、完全ヒト親和性成熟抗体である。

任意の既知の方法を用いて本発明の抗原結合分子の親和性を増大させ、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１のエピトープに対する親和性が増大した親和性成熟抗体又は完全ヒト親和性成熟抗体を生成することができる。

本発明は、提供される抗原結合物質の親和性成熟変異体を提供する。親和性成熟変異体は、親抗体よりも大きな親和性でＰＤ－Ｌ１に結合する。作製される抗体は、例えばＫｄによって測定されるように、親抗体がＰＤ－Ｌ１に結合するよりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％大きな親和性でＰＤ－Ｌ１に結合するのが好ましい。

幾つかの実施形態においては、本発明は、本明細書に記載される抗原結合分子（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１結合分子若しくは抗体、又はその抗原結合フラグメント若しくは変異体）を準備することと、抗体を親和性成熟に供することとを含む、本発明の抗原結合分子を作製する方法を提供し、作製される抗体は、親抗体よりも大きな親和性でＰＤ－Ｌ１に結合する。作製される抗体は、例えばＫｄによって測定されるように、親抗体がＰＤ－Ｌ１に結合するよりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％大きな親和性でＰＤ－Ｌ１に結合するのが好ましい。親和性を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、下記実施例に記載される。かかる方法によって作製された親和性成熟抗体は、他の抗ＰＤ－Ｌ１結合分子について本明細書に記載されるように配合及び使用することができる。

親和性成熟は、当業者に既知の任意の好適な方法に従って行うことができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体ディスプレイシステムが高親和性の特異抗体の生成に広く使用されている。これらのシステムにおいては、表現型（すなわち、抗体フラグメント）と遺伝子型（すなわち、抗体遺伝子）とを組み合わせ、抗体の配列を直接決定することが可能である。抗体レパートリーのディスプレイを達成し、その後の結合剤の選択を可能にする幾つかのシステムが開発されており、選択の厳密性を高めることで、更に高い親和性の変異体を選択することが可能である。抗体フラグメントは、酵母、リボソーム、ファージディスプレイ粒子において又はＤＮＡへの直接結合によって発現させることができる。

現在の抗体親和性成熟法は、確率的及び非確率的の２つの突然変異誘発カテゴリーに属する。エラープローン（Error-prone）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、突然変異誘発細菌株及び飽和突然変異誘発が確率的突然変異誘発法の典型例である。非確率的手法においては、アラニンスキャニング又は部位特異的突然変異誘発を用いて特定の変異体の限られたコレクションを生成することが多い。加えて、親抗体のシャッフリング変異体を得るシャッフリングアプローチを用いて、抗体の親和性を更に改善することもできる。

したがって、本発明の一実施形態においては、親和性成熟の方法は、確率的突然変異誘発（例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、突然変異誘発細菌株又は飽和突然変異誘発）、非確率的突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング又は部位特異的突然変異誘発）、シャッフリング（例えば、ＤＮＡシャッフリング、鎖シャッフリング又はＣＤＲシャッフリング）、及び修飾を導入するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの使用からなる群から選択される。

親和性成熟方法は例えば、Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(24):8466-71、Steinwand et al., MAbs, 2014, 6(1):204-18、及びHandbook of Therapeutic Antibodies, Wiley, 2014, Chapter 6, Antibody Affinity (pages 115-140)に記載されている。

幾つかの実施形態においては、上記の（すなわち、親和性成熟によって抗体を作製する）方法に従って作製された抗体を準備することと、抗体と少なくとも１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを共配合することとを含む、医薬組成物を調製する方法が提供される。医薬組成物の調製に使用される抗体は、２Ａ０９の親和性成熟変異体であり得る。医薬組成物の調製に使用される抗体は、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６又は８Ｄ０４の親和性成熟変異体であり得る。かかる方法によって作製される医薬組成物は、他の抗ＰＤ－Ｌ１結合分子について本明細書に記載されるように本発明の治療方法に使用することができる。したがって、本発明の抗原結合分子の親和性成熟突然変異体又は変異体である抗原結合分子が提供される。例えば、一実施形態においては、２Ａ０９、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｂ０６及び８Ｄ０４からなる群から選択される抗体の親和性成熟変異体が提供される。概して、親和性成熟突然変異体は、ＰＤ－Ｌ１に対して親抗体（突然変異体が由来する抗体）よりも高い親和性を有する。本発明の抗原結合分子又は抗体の親和性成熟によって得ることができる又は得られる抗原結合分子及び抗体も本発明によって提供される。

製造上の障害
抗体等の治療用タンパク質は、化学修飾及び翻訳後修飾（ＰＴＭ）のために本来的に不均一かつ複雑である。修飾は、宿主細胞系、製造に用いられるプロセス、又は貯蔵若しくは製造時の条件等の多数の要因によって引き起こされる可能性がある。修飾は、分子自体の化学的安定性、又は凝集能、及びこれが抗体の固有の物理的安定性に及ぼす影響に関連する可能性がある。製造又は貯蔵時に自発的な修飾を受ける可能性がある所与の抗体配列中のアミノ酸モチーフ又は残基は、障害と称される。したがって、抗体配列に対して突然変異を行うことで、障害に対処し、修飾及び分解に対する抗体の感受性を低下させることができる。

抗体配列中の障害の結果としてのかかる修飾には、グリコシル化、脱アミド化、酸化、並びにＣ末端及びＮ末端の変異が含まれ得る。かかる修飾は、製造時に生じる可能性がある。或る特定の残基及び構造又は配列モチーフは、或る特定の修飾をより受けやすい。修飾に対するかかる障害の例としては、ＡｓｎのＮ－結合型グリコシル化、Ｓｅｒ／ＴｈｒのＯ－結合型グリコシル化、Ａｓｎの脱アミド化、Ａｓｐの異性化／断片化、Ｌｙｓの糖化、Ｍｅｔ／Ｔｒｐの酸化、遊離チオール基、ピログルタメート、Ｃ末端Ｌｙｓが挙げられる。

当業者は、潜在的に修飾を引き起こし得る構造及び配列の障害を予測及び特定するために計算ツールを用いることができることを認識している。修飾の発生を最小限に抑えるために、製造プロセスを変更することができる。リスクを低下させるためにタンパク質工学を検討してもよい。例えば、これらの障害の選択的突然変異は、抗体の安定性を危うくする修飾のリスクを特定し、低下させるのに役立ち得る。

アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）は、自発的な修飾を受ける可能性がある。Ａｓｐ－Ｇｌｙ配列等のＡｓｐ含有モチーフは、自発的な異性化を受け、イソアスパラギン酸を形成する可能性がある。イソアスパルテートの形成は、抗体の結合を弱体化させるか又は完全に消失させる恐れがある。これは、Ａｓｐ残基が抗体のＣＤＲに見られる場合に更に重要である。

したがって、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）を任意の自然発生アミノ酸で置換し、修飾に対するこの障害を低減することができる。任意に、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）をアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）で置換し、修飾に対するこの障害を低減することができる。異性化を低減するために作製／配合の最適化を調査してもよい。代替的には、Ａｓｐ残基の置換によってではなく、グリシン残基を別の自然発生アミノ酸で置換することによってＡｓｐ－Ｇｌｙモチーフを修飾し、脱アミド化を阻害することもできる。

メチオニン残基（Ｍｅｔ）は、自発的な修飾を受ける可能性がある。特に溶媒に曝露される場合のＣＤＲにおけるメチオニン（Ｍｅｔ）の存在は、メチオニンが酸化され、これが結合を妨げる場合に問題を生じることがある。したがって、メチオニン残基を任意の他の自然発生アミノ酸で置換し、修飾に対するこの障害を低減することができる。メチオニン残基は、好ましくはＡｌａ又はＬｅｕで置換され得る。酸化を低減するために作製／配合の最適化を調査してもよい。

したがって、８Ａ０４、８Ｂ０６、８Ｇ０８、８Ｄ０６、８Ｄ０４及び２Ａ０９のいずれかに由来するが、上に要約した障害の１つ以上に対処するために１つ以上のアミノ置換を含む変異体抗体も本明細書において提供される。

例えば、本明細書の１つ以上のアミノ酸配列によって定義される任意の抗原結合分子について、１つ以上のＭｅｔ残基が存在する場合、１つ以上のＭｅｔ残基は、それぞれ独立してＡｌａ残基又はＬｅｕ残基で置換されていてもよい。１つ以上のＡｓｐ残基が存在する場合、１つ以上のＡｓｐ残基は、それぞれ独立してＡｌａ残基、Ｇｌｎ残基又はＧｌｕ残基で置換されていてもよい。

提供される抗原結合分子の概要
本発明によって提供される抗原結合分子の概要を、添付の配列表において割り当てられる配列番号を特定して下に提示する。その抗原結合変異体、誘導体及びフラグメントも本発明の一部として提供される。

少なくとも以下の変異体を含む変異体も提供される。

例えば、本明細書において提供される８Ｇ０８の変異体には、配列番号３５のＶＬ及び配列番号２６のＶＨ、又は配列番号３６のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は配列番号３７のＶＬ及び配列番号２８のＶＨを有する変異体が含まれる。本明細書において提供される８Ｄ０６の変異体には、配列番号３８のＶＬ及び配列番号２６のＶＨ、又は配列番号３９のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は配列番号４０のＶＬ及び配列番号２８のＶＨを有する変異体が含まれる。本明細書において提供される８Ａ０４の変異体には、配列番号４１のＶＬ及び配列番号２６のＶＨ、又は配列番号４２のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は配列番号４３のＶＬ及び配列番号２８のＶＨを有する変異体が含まれる。本明細書において提供される８Ｂ０６の変異体には、配列番号４７のＶＬ及び配列番号２６のＶＨ、又は配列番号４８のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は配列番号４９のＶＬ及び配列番号２８のＶＨを有する変異体が含まれる。本明細書において提供される８Ａ０４の変異体には、配列番号５０のＶＬ及び配列番号２６のＶＨ、又は配列番号５１のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は配列番号５２のＶＬ及び配列番号２８のＶＨを有する変異体が含まれる。本明細書において提供される２Ａ０９の変異体には、配列番号２０のＶＬ及び配列番号２６のＶＨ、又は配列番号２１のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は配列番号２２のＶＬ及び配列番号２８のＶＨを有する変異体が含まれる。

本明細書において提供される８Ｇ０８の他の変異体としては、
配列番号１０のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２３のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号２９のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３２のＶＨＣＤＲ３、
配列番号１０のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２４のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３０のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３３のＶＨＣＤＲ３、又は、
配列番号１０のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２５のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３１のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３４のＶＨＣＤＲ３を有する変異体が挙げられる。

本明細書において提供される８Ｄ０６の他の変異体としては、
配列番号１２のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２３のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号２９のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３２のＶＨＣＤＲ３、
配列番号１２のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２４のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３０のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３３のＶＨＣＤＲ３、又は、
配列番号１２のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２５のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３１のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３４のＶＨＣＤＲ３を有する変異体が挙げられる。

本明細書において提供される８Ａ０４の他の変異体としては、
配列番号４４のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２３のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号２９のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３２のＶＨＣＤＲ３、
配列番号４５のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２４のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３０のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３３のＶＨＣＤＲ３、又は、
配列番号４６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２５のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３１のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３４のＶＨＣＤＲ３を有する変異体が挙げられる。

本明細書において提供される８Ｂ０６の他の変異体としては、
配列番号１６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２３のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号２９のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３２のＶＨＣＤＲ３、
配列番号１６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２４のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３０のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３３のＶＨＣＤＲ３、又は、
配列番号１６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２５のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３１のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３４のＶＨＣＤＲ３を有する変異体が挙げられる。

本明細書において提供される８Ｄ０４の他の変異体としては、
配列番号１６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２３のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号２９のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３２のＶＨＣＤＲ３、
配列番号１６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２４のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３０のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３３のＶＨＣＤＲ３、又は、
配列番号１６のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２５のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３１のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３４のＶＨＣＤＲ３を有する変異体が挙げられる。

本明細書において提供される２Ａ０９の他の変異体としては、
配列番号２のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２３のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号２９のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３２のＶＨＣＤＲ３、
配列番号２のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２４のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３０のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３３のＶＨＣＤＲ３、又は、
配列番号２のＶＬＣＤＲ１、配列番号３のＶＬＣＤＲ２、配列番号２５のＶＬＣＤＲ３、配列番号６のＶＨＣＤＲ１、配列番号３１のＶＨＣＤＲ２及び配列番号３４のＶＨＣＤＲ３を有する変異体が挙げられる。

ここで、本発明の様々な実施形態について、より詳細に論考する。

ＶＬＣＤＲ１領域を含む抗原結合分子
８Ｂ０６
一実施形態においては、アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。一実施形態においては、アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。特定の実施形態においては、抗原結合分子は、抗体又はそのフラグメント若しくは変異体であり、該抗体又はそのフラグメント若しくは変異体のＶＬＣＤＲ１領域は、ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）である。

幾つかの実施形態においては、少なくとも３０のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｂ０６抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ｂ０６ ＶＬＣＤＲ１領域における障害を低減又は排除するために行ってもよい。

８Ｄ０６
一実施形態においては、アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。一実施形態においては、アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。特定の実施形態においては、抗原結合分子は、抗体又はそのフラグメント若しくは変異体であり、該抗体又はそのフラグメント若しくは変異体のＶＬＣＤＲ１領域は、ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）である。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｄ０６抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ｄ０６ ＶＬＣＤＲ１領域における障害を低減又は排除するために行ってもよい。

８Ｇ０８
一実施形態においては、アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。一実施形態においては、アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。特定の実施形態においては、抗原結合分子は、抗体又はそのフラグメント若しくは変異体であり、該抗体又はそのフラグメント若しくは変異体のＶＬＣＤＲ１領域は、ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）である。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｇ０８抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ｇ０８ ＶＬＣＤＲ１領域における障害を低減又は排除するために行ってもよい。

８Ａ０４
一実施形態においては、アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。一実施形態においては、アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。特定の実施形態においては、抗原結合分子は、抗体又はそのフラグメント若しくは変異体であり、該抗体又はそのフラグメント若しくは変異体のＶＬＣＤＲ１領域は、ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）である。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約３０のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ａ０４抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ａ０４ ＶＬＣＤＲ１領域における障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＸＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号４４）を含むＶＬＣＤＲ１を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、ＸがＭｅｔ、Ａｌａ又はＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸配列ＸＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号４５）を含むＶＬＣＤＲ１を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、ＸがＡｌａ又はＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸配列ＸＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号４６）を含むＶＬＣＤＲ１を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

８Ｄ０４
一実施形態においては、アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。一実施形態においては、アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。特定の実施形態においては、抗原結合分子は、抗体又はそのフラグメント若しくは変異体であり、該抗体又はそのフラグメント若しくは変異体のＶＬＣＤＲ１領域は、ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）である。

アミノ酸置換を、例えば８Ｄ０４ ＶＬＣＤＲ１領域における障害を低減又は排除するために行ってもよい。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｄ０４抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

２Ａ０９＿ＷＴ
一実施形態においては、アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。一実施形態においては、アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。特定の実施形態においては、抗原結合分子は、抗体又はそのフラグメント若しくは変異体であり、該抗体又はそのフラグメント若しくは変異体のＶＬＣＤＲ１領域は、ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）である。

アミノ酸置換を、例えば２Ａ０９＿ＷＴ ＶＬＣＤＲ１領域における障害を低減又は排除するために行ってもよい。

重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ
８Ｂ０６
一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約３０のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｂ０６抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ｂ０６ ＣＤＲにおける障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３２）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３３）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３４）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

８Ｄ０６
一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｄ０６抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ｄ０６ ＣＤＲにおける障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３２）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３３）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３４）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

８Ｇ０８
一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｇ０８抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を８Ｇ０８ ＣＤＲにおける障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３２）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３３）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３４）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

８Ａ０４
一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約３０のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ａ０４抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ａ０４ ＣＤＲにおける障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３２）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＸＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号４４）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３３）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
ＸがＭｅｔ、Ａｌａ又はＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸配列ＸＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号４５）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３４）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
ＸがＡｌａ又はＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸配列ＸＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号４６）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

８Ｄ０４
一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

幾つかの実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有し得る、８Ｄ０４抗体に由来する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば８Ｄ０４ ＣＤＲにおける障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３２）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３３）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３４）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２６）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

２Ａ０９ ＷＴ
一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

アミノ酸置換を、例えば２Ａ０９＿ＷＴ ＣＤＲにおける障害を低減又は排除するために行ってもよい。

例えば、一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号２９）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３２）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
Ｘが任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２３）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３０）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３３）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、
Ｘ_１及びＸ_２が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧ（配列番号３１）を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸＧＭＤＶ（配列番号３４）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
ＸがＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列ＱＳＦＸＳＴＮＰＷＶ（配列番号２５）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、
アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＳＦＤＳＴＮＰＷＶ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

重鎖及び／又は軽鎖可変領域
一実施形態においては、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合分子、特に抗体を提供する。

かかる実施形態においては、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

一実施形態においては、抗体はＰＤ－Ｌ１に結合し、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

一実施形態においては、抗原結合分子、例えば抗体、その変異体又はフラグメントが提供され、抗原結合分子は、以下からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ（又はそれぞれ配列番号５及び配列番号１５に対して少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬ配列を含む）、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ（又はそれぞれ配列番号５及び配列番号１１に対して少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬ配列を含む）、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ（又はそれぞれ配列番号５及び配列番号９に対して少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬ配列を含む）、
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ（又はそれぞれ配列番号５及び配列番号１３に対して少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬ配列を含む）、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ（又はそれぞれ配列番号５及び配列番号１７に対して少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬ配列を含む）、
ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ（又はそれぞれ配列番号５及び配列番号１に対して少なくとも９０％同一のＶＨ及びＶＬ配列を含む）。

一実施形態においては、抗原結合分子、例えば抗体、その変異体又はフラグメントが提供され、抗原結合分子は、以下からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ若しくは配列番号５のＶＨ配列と比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＨ（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ若しくは配列番号１５のＶＬと比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＬ配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ若しくは配列番号５のＶＨ配列と比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＨ（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、及び／又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ若しくは配列番号１１のＶＬと比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＬ配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ若しくは配列番号５のＶＨ配列と比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＨ（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、及び／又は配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ若しくは配列番号９のＶＬと比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＬ配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ若しくは配列番号５のＶＨ配列と比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＨ（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、及び／又は配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ若しくは配列番号１３のＶＬと比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＬ配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ若しくは配列番号５のＶＨ配列と比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＨ（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、及び／又は配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ若しくは配列番号１７のＶＬと比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＬ配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、
ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ若しくは配列番号５のＶＨ配列と比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＨ（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ若しくは配列番号１のＶＬと比較して最大５つのアミノ酸置換を有するＶＬ配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）。

幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換は全て、可変領域のＣＤＲに生じる。幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換は全て、可変領域のフレームワーク領域に生じる。

幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。幾つかの実施形態においては、アミノ酸置換は、配列における１つ以上の潜在的障害に対処するためのものであり得る。幾つかの変異体抗体が１つ以上の障害に対処するための１つ以上のアミノ酸置換を有していてもよく、保存的アミノ酸置換である１つ以上の更なるアミノ酸置換を含んでいてもよい。

一実施形態においては、少なくとも５のｐＨ６．０：７．４ ＥＣ５０比を有する抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供される。

したがって、上記で論考されるように、そのヒト化及び親和性成熟変異体、並びに指定の配列（複数の場合もある）に対してより小さい又はより大きい％同一性又は相同性、例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は相同性を有する変異体を含む変異体も提供される。１つ以上のアミノ酸置換を有する変異体も提供される。

本発明の一実施形態においては、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１に対して少なくとも８９％同一の軽鎖可変領域を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子が提供される。かかる抗原結合分子は、変異体抗原結合分子が由来する抗原結合分子の機能活性（例えば、選択的ｐＨ結合、ＥＣ５０、ＩＣ５０及び／又はＫｄ）を保持し得る。

幾つかの実施形態においては、％配列同一性は、指定の重鎖又は軽鎖可変領域の６つ全てのＣＤＲの配列を含まずに算出される。かかる実施形態においては、配列の変動は、フレームワーク領域にのみ生じる。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子は、配列番号５の可変重鎖領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖領域、及び／又は配列番号１５、１１、９、１３、１７若しくは１の可変軽鎖領域に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖領域を含むことができ、任意のアミノ酸変動が可変重鎖及び軽鎖配列のフレームワーク領域にのみ生じる。かかる実施形態においては、指定の配列同一性を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子は、配列番号５の完全な重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号１５、１１、９、１３、１７又は１の完全な軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列（すなわち、変異体が由来する抗体の完全な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列）を含む。

上述のように、アミノ酸置換は、本発明の抗原結合分子の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域における障害を低減又は排除するために行うことができる。障害を低減又は排除するためのかかる置換は、ＣＤＲに生じ得る。障害を低減又は排除するためのかかる置換は、可変領域のフレームワーク領域に生じ得る。

例えば、一実施形態においては、ＰＤ－Ｌ１に結合し、Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３が各々独立して任意の自然発生アミノ酸であり得るアミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸ_３ＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２６）を有する重鎖可変領域、及び／又は、
ａ）Ｘ_１及びＸ_２が任意の自然発生アミノ酸であり得るＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２０）、
ｂ）Ｘ_１及びＸ_２が各々独立して任意の自然発生アミノ酸であり得るＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号３５）、
ｃ）Ｘ_１及びＸ_２が各々独立して任意の自然発生アミノ酸であり得るＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号３８）、
ｄ）Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３が各々独立して任意の自然発生アミノ酸であり得るＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＸ_２ＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_３ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４１）、
ｅ）Ｘ_１及びＸ_２が各々独立して任意の自然発生アミノ酸であり得るＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４７）、及び、
ｆ）Ｘ_１及びＸ_２が各々独立して任意の自然発生アミノ酸であり得るＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号５０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗原結合分子（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）が提供される。

一実施形態においては、ＰＤ－Ｌ１に結合し、Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３が各々独立してＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸ_３ＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２７）を有する重鎖可変領域、及び／又は、
ａ）Ｘ_１がＭｅｔ又はＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_２がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２１）、
ｂ）Ｘ_１がＭｅｔ又はＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_２がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号３６）、
ｃ）Ｘ_１がＭｅｔ又はＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_２がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号３９）、
ｄ）Ｘ_１がＭｅｔ又はＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_２がＭｅｔ、Ａｌａ及びＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_３がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＸ_２ＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_３ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４２）、
ｅ）Ｘ_１がＭｅｔ又はＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_２がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４８）、及び、
ｆ）Ｘ_１がＭｅｔ又はＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_２がＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗原結合分子（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）が提供される。

一実施形態においては、ＰＤ－Ｌ１に結合し、Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３が各々独立してＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸配列：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸ_３ＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２８）を有する重鎖可変領域、及び／又は、
ａ）Ｘ_１がＬｅｕであり、Ｘ_２がＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２２）、
ｂ）Ｘ_１がＬｅｕであり、Ｘ_２がＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号３７）、
ｃ）Ｘ_１がＬｅｕであり、Ｘ_２がＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４０）、
ｄ）Ｘ_１がＬｅｕであり、Ｘ_２がＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択され、Ｘ_３がＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＸ_２ＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_３ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４３）、
ｅ）Ｘ_１がＬｅｕであり、Ｘ_２がＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４９）、及び、
ｆ）Ｘ_１がＬｅｕであり、Ｘ_２がＧｌｎ、Ｇｌｕ及びＡｌａからなる群から選択されるＮＦＸ_１ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_２ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗原結合分子（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）が提供される。

一実施形態においては、抗原結合分子、例えば抗体、その変異体又はフラグメントが提供され、抗原結合分子は、
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ、
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ、
ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ、
ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ、
からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、任意に、Ｍｅｔ残基が各々独立してＡｌａ及びＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換され、Ａｓｐ残基が各々独立してＡｌａ、Ｇｌｎ及びＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。

１つ以上のアミノ酸置換を有する変異体抗原結合分子は、変異体抗原結合分子が由来する抗原結合分子の機能活性（例えば選択的ｐＨ結合、ＥＣ５０、ＩＣ５０及び／又はＫｄ）を保持し得る。本発明の変異体抗原結合分子は、それらが由来する抗原結合分子について記載したものと同じ方法で使用及び配合することができる。

本発明の他の抗原結合分子
本発明は、以下のＣＤＲＨ及びＣＤＲＬ配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子も提供する。

ここで、Ｘ_１～Ｘ_１６は各々、任意のアミノ酸、好ましくは任意の自然発生アミノ酸であり得る。

好ましい実施形態においては、Ｘ_１～Ｘ_１６は各々独立してＴ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｋ、Ｙ、Ｑからなる群から選択される。

一実施形態においては、
Ｘ_１はＡ、Ｌ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_２はＲ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｇ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_３はＳ、Ｎ、Ｔ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_４はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｇ、Ｅ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_５はＧ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｌ及びＳ、又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_６はＳ、Ｐ、Ｔ、Ｇ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_７はＩ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_８はＡ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｈ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_９はＳ、Ｇ、Ｌ、Ｈ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１０はＮ、Ｈ、Ｋ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１１はＶ、Ｈ、Ｙ、Ｔ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１２はＱ、Ｒ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１３はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１４はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１５はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１６はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択される。

一実施形態においては、
Ｘ_１はＡ、Ｌ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｍ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_２はＲ、Ｓ、Ｌ、Ｅ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_３はＳ、Ｎ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_４はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｇ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ_５はＧ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｌ及びＳからなる群から選択され、
Ｘ_６はＳ、Ｐ、Ｔ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_７はＩ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｒ及びＦからなる群から選択され、
Ｘ_８はＡ、Ｓ、Ｋ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_９はＳ、Ｇ、Ｌ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_１０はＮ、Ｈ及びＫからなる群から選択され、
Ｘ_１１はＶ、Ｈ、Ｙ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_１２はＱ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_１３はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_１４はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_１５はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_１６はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択される。

一実施形態（配列番号５７）においては、
Ｘ_１はＡ、Ｌ、Ｔ、Ｉ、Ｖ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_２はＲ、Ｓ、Ｌ、Ｅ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_３はＳ、Ｎ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_４はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｇ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ_５はＧ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｌ及びＳからなる群から選択され、
Ｘ_６はＳ、Ｐ、Ｔ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_７はＩ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｒ及びＦからなる群から選択され、
Ｘ_８はＡ、Ｓ、Ｋ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_９はＳ、Ｇ、Ｌ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_１０はＮ、Ｈ及びＫからなる群から選択され、
Ｘ_１１はＶ、Ｈ、Ｙ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_１２はＱ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_１３はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_１４はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_１５はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_１６はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択される。

かかる抗体は、好ましくは８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４又は２Ａ０９の１つ以上の機能プロファイルを有し得る。

本発明はまた、以下のＶＨ及びＶＬ配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を提供する：
ＶＨ：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＸ_１ＧＳＮＫＹＹＡＸ_２ＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＸ_３ＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＬ：ＮＦＸ_４ＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４ＹＸ_１５Ｘ_１６ＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＦＸ_１７ＳＴＮＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ここで、Ｘ_１～Ｘ_１７は各々、任意のアミノ酸、好ましくは任意の自然発生アミノ酸であり得る（すなわち、ＶＨ配列が配列番号５３を含み、ＶＬ配列が配列番号５８を含む）。

好ましい実施形態においては、Ｘ_１～Ｘ_１７は各々独立してＴ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｋ、Ｙ、Ｑ（すなわち、ＶＨ配列が配列番号５４を含み、ＶＬ配列が配列番号５９を含む）からなる群から選択される。

一実施形態においては、
Ｘ_１はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_２はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_３はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_４はＭ、Ｌ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_５はＡ、Ｌ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｒ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_６はＲ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｇ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_７はＳ、Ｎ、Ｔ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_８はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｇ、Ｅ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_９はＧ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｌ及びＳ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１０はＳ、Ｐ、Ｔ、Ｇ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１１はＩ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１２はＡ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｈ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１３はＳ、Ｇ、Ｌ、Ｈ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１４はＮ、Ｈ、Ｋ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１５はＶ、Ｈ、Ｙ、Ｔ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１６はＱ、Ｒ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択され、
Ｘ_１７はＤ、Ｑ、Ｅ、Ａ又はその保存的アミノ酸置換からなる群から選択される（すなわち、ＶＨ配列が配列番号５５を含み、ＶＬ配列が配列番号６０を含む）。

一実施形態においては、
Ｘ_１はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_２はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_３はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_４はＭ及びＬからなる群から選択され、
Ｘ_５はＡ、Ｌ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｍ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_６はＲ、Ｓ、Ｌ、Ｅ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_７はＳ、Ｎ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_８はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｇ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ_９はＧ、Ｖ、Ｒ、Ｔ、Ｌ及びＳからなる群から選択され、
Ｘ_１０はＳ、Ｐ、Ｔ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_１１はＩ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｒ及びＦからなる群から選択され、
Ｘ_１２はＡ、Ｓ、Ｋ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_１３はＳ、Ｇ、Ｌ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_１４はＮ、Ｈ及びＫからなる群から選択され、
Ｘ_１５はＶ、Ｈ、Ｙ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_１６はＱ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_１７はＤ、Ｑ、Ｅ及びＡからなる群から選択される（すなわち、ＶＨ配列が配列番号５６を含み、ＶＬ配列が配列番号６１を含む）。

一実施形態においては、
Ｘ_１はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_２はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_３はＱ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ_４はＬであり、
Ｘ_５はＬ、Ｔ、Ｉ、Ｖ、Ｍ及びＲからなる群から選択され、
Ｘ_６はＳ、Ｌ、Ｅ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_７はＮ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_８はＤ、Ｐ、Ｇ及びＥからなる群から選択され、
Ｘ_９はＶ、Ｒ、Ｔ、Ｌ及びＳからなる群から選択され、
Ｘ_１０はＰ、Ｔ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ_１１はＡ、Ｈ、Ｎ、Ｒ及びＦからなる群から選択され、
Ｘ_１２はＳ、Ｋ、Ｒ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_１３はＧ、Ｌ及びＨからなる群から選択され、
Ｘ_１４はＨ及びＫからなる群から選択され、
Ｘ_１５はＨ、Ｙ及びＴからなる群から選択され、
Ｘ_１６はＲであり、
Ｘ_１７はＥ及びＡからなる群から選択される（すなわち、ＶＨ配列が配列番号５７を含み、ＶＬ配列が配列番号６２を含む）。

抗原結合分子をコードする核酸配列
本発明の一態様においては、本発明の抗原結合分子（そのフラグメント及び変異体を含む）をコードする核酸配列が提供される。

一実施形態においては、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合分子をコードするヌクレオチドが提供される。

一実施形態においては、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合分子をコードするヌクレオチドが提供される。

本発明はまた、１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書に開示される変異体抗体配列の全てをコードする核酸分子を提供する。

配列番号１～６２のいずれか１つによるアミノ酸配列をコードする核酸分子も提供される。

本発明の抗原結合分子をコードする核酸配列を含むプラスミド及びベクターも提供される。核酸は発現、特に真核生物発現系、より具体的には哺乳動物細胞株における発現のためにプラスミド又はベクターに組み込んでもよい。したがって、本発明のプラスミド又はベクターをトランスフェクトした宿主細胞、例えばＨＥＫ細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞又はＣＨＯ細胞等も提供される。

本発明の宿主を細胞培養培地においてプラスミド又はベクターのコード化核酸配列を細胞内で発現させる条件下で培養することを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を作製する方法も提供される。方法は、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を細胞培養上清から得ることを更に含み得る。さらに、細胞に本発明のプラスミド又はベクターをトランスフェクトすることを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を発現する細胞を作製する方法が提供される。次いで、抗原結合分子の作製のために上記細胞を培養することができる。

抗原
本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１、特にヒトＰＤ－Ｌ１又はｈＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。本発明の抗原結合分子はまた、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。最も好ましくは、本発明の抗原結合分子は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。

本発明の抗原結合分子は概して、マウスＰＤ－Ｌ１には結合しない。ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）は、阻害受容体ＰＤ－１（プログラム死１ポリペプチド）について記載された２つのリガンドの１つである。ＰＤ－Ｌ１は、適応免疫系の抑制に関与する１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１の上方調節は、癌が免疫系を回避することを可能にし得る。

ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ及びＴ細胞等の免疫細胞上に低レベルで発現され、活性化後に上方調節される。ＰＤ－Ｌ１は、内皮細胞、心臓、肺、膵臓、筋肉、ケラチノサイト及び胎盤等の非リンパ系器官でも発現される。非リンパ系組織内での発現は、ＰＤ－Ｌ１が末梢組織において自己反応性Ｔ及びＢ細胞並びに骨髄性細胞の機能を調節する可能性があるか、又は標的器官において炎症応答を調節する可能性があることを示唆する。ＰＤ－Ｌ１発現は主に、内皮及び上皮細胞におけるＰＤ－Ｌ１の主要調節因子である１型及び２型インターフェロンによって調節される。ＰＤ－Ｌ１は、様々なヒト癌において豊富に見られ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の減少、及び癌性細胞による免疫回避をもたらす。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍サンプルにおいて発現され、予後不良と関連する。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転させることができる。ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害は、癌の治療についてＴ細胞免疫を増強することが示されている。

本発明の抗原結合分子に結合するヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列を以下に提示する。

ヒトＰＤ－Ｌ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５４８６２．１）
アミノ酸配列（配列番号１９）
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET

本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子は、ｐＨに依存してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。

一実施形態においては、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子は、例えば一価フォーマットの場合にｐＨに依存してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。一価フォーマットには、Ｆａｂフラグメント等のフォーマットが含まれる。これは、モノクローナル抗体よりも低い（例えば、およそ１００倍低い）Ｆａｂの親和性、及び／又はＣＤＲにおけるヒスチジン残基の存在のためであり得ると仮定される。

本発明の抗原結合分子は、生理的ｐＨ（約ｐＨ７．４）と比較して酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）でＰＤ－Ｌ１に対して顕著に高い親和性を示した。これは、ｐＨ特異的結合を示さず、多くは実際にｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０で低い親和性を示す、当該技術分野で既知の他のＰＤ－Ｌ１結合分子とは対照的である。

本発明の抗原結合分子はまた、明らかなｐＨ依存性の阻害を示した。本発明の抗原結合分子は、生理的ｐＨ（約ｐＨ７．４）と比較して酸性ｐＨ（約ｐＨ６．０）でＰＤ－Ｌ１に対して顕著に高い阻害活性を有する。ｐＨ７．４では、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対する阻害活性を殆ど有しない。これは、ｐＨ依存性の阻害を示さない当該技術分野で既知の他のＰＤ－Ｌ１結合分子とは対照的である。

腫瘍及びそれらの微小環境が酸性（例えば、約ｐＨ６．０～約ｐＨ６．５）であるため、このｐＨ特異的結合は重要である。したがって、ｐＨ６～６．５（腫瘍の酸性ｐＨ）で最大活性を有し、７．４の生理的ｐＨで活性が低下する抗ＰＤ－Ｌ１結合分子は、末梢チェックポイント阻害剤治療の毒性及び他の副作用を低減することができる。したがって、本発明の抗原結合分子は、潜在的抗癌剤として特に有用である。

したがって、ＰＤ－Ｌ１に結合する本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞にも結合する。

ＥＣ５０
一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１陽性細胞に対してｐＨ６．０で約１５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ６．０で約１．４５ｎＭ～約１５ｎＭのＥＣ５０値を有する。

一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ７．４で少なくとも約１０ｎＭのＥＣ５０値を有する。一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ７．４で約１３．２ｎＭ～約１００ｎＭのＥＣ５０値を有する。

本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に結合する際に酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）で生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）よりも顕著に高い効力（ＥＣ５０）を有する。本発明の抗原結合分子は、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４結合比を有し、すなわち、ｐＨ６．０でのＥＣ５０がｐＨ７．４より少なくとも約５倍低く、抗原結合分子がｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で少なくとも約５倍強力である。

好ましい実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対するｐＨ６．０でのＥＣ５０値が約１５ｎＭ未満であり、ＰＤ－Ｌ１に対するｐＨ７．４でのＥＣ５０値が少なくとも約１０ｎＭであり、抗原結合分子は、少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４結合比を有する。

ＥＣ５０という用語は、当業者に既知であり、薬物若しくは物質の５０％有効濃度、すなわち指定の曝露時間後の最大応答とベースラインとの中間の応答を誘導する、その物質の濃度を指す。ＥＣ５０は、効力の尺度である。ＥＣ５０が低いほど、薬物又は物質の効力が大きい。ＥＣ５０は、当業者に既知の任意の好適な手段によって測定することができる。

細胞結合アッセイにおいては、ＥＣ５０は、０．６０Ｅ０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞との約４℃で約６０分間のインキュベーション後にベースラインと最大値とのほぼ中間の応答を誘導するＦａｂの濃度（ＭＦＩ）を指す場合がある。ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、ＥＣ５０は、約１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質コーティングウェルとの室温（例えば約１５℃～約２５℃）で約２時間のインキュベーション後にベースラインと最大値とのほぼ中間の応答を誘導するＦａｂの濃度（ＯＤ）を指す場合がある。

ＩＣ５０
一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１結合の阻害についてｐＨ６．０で約５０ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ６．０で約１２．１ｎＭ～約４２．３ｎＭのＩＣ５０値を有する。

一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１結合の阻害についてｐＨ７．４で少なくとも約５０ｎＭのＩＣ５０値を有する。一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ７．４で約８１．２ｎＭ～約１００ｎＭのＩＣ５０値を有する。

本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１結合に対して酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）で生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）よりも顕著に高い阻害活性（ＩＣ５０）を有する。本発明の抗原結合分子は、少なくとも２のｐＨ６．０：７．４阻害比を有し、すなわち、ｐＨ６．０でのＩＣ５０がｐＨ７．４より少なくとも２倍低く、抗原結合分子が阻害についてｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で少なくとも５倍強力である。

好ましい実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に対するｐＨ６．０でのＩＣ５０値が約５０ｎＭ未満であり、ＰＤ－Ｌ１に対するｐＨ７．４でのＩＣ５０値が少なくとも約５０ｎＭであり、抗原結合分子は、少なくとも約２のｐＨ６．０：７．４阻害比を有する。

ＩＣ５０という用語は、当業者に既知であり、薬物若しくは物質の５０％阻害濃度、すなわち５０％の阻害を誘導する、その物質の濃度を指す。ＩＣ５０は、特定の生物学的又は生化学的機能の阻害における物質の効力の尺度である。ＩＣ５０が低いほど、阻害剤としての拮抗薬又は物質の効力が大きい。ＩＣ５０は、当業者に既知の任意の好適な手段によって測定することができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１阻害ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＣ５０は、約１μｇ／ｍｌのＰＤ－１－Ｆｃタンパク質でコーティングしたウェルに対する約１μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１ビオチン結合を阻害するＦａｂの５０％阻害濃度であり得る。

当然ながら、抗体の機能的特徴のいずれについても、機能的特徴の比較は、ｐＨの変化の影響を測定することから、ｐＨを除いて実質的に同じ実験条件下で行われる。機能的特徴（ＩＣ５０、ＥＣ５０又はＫ_Ｄ等）を測定するアッセイの他の特徴は、可能な限り同じに保たれる。

本発明の幾つかの実施形態においては、本発明者らは、抗原結合分子が阻害受容体プログラム死１ポリペプチド（ＰＤ－１）及び共刺激分子ＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１結合と競合することを発見した。ＰＤ－Ｌ１が様々なヒト癌において豊富に見られ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用が腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の減少、及び癌性細胞による免疫回避をもたらすことから、この機構は重要である。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転させることができる。ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害は、癌の治療についてＴ細胞免疫を増強することが示されている。本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１及びその受容体の結合を少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも８０％阻害する。

本発明者らはまた、本発明の抗原結合分子がＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１発現細胞の結合を阻害することを見出した。

本発明の抗原結合分子のｐＨ感受性結合性は、酸性ｐＨ（例えばｐＨ６）で生理的ｐＨ（例えば約ｐＨ７．４）よりも少なくとも５倍高い親和性を有する抗原結合分子をもたらし得る。本発明の抗原結合分子のそのエピトープに対する親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００、GE Healthcare）を使用することができる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、分子相互作用をリアルタイムでモニタリングするために使用され、検出原理は、センサー表面から約１５０ｎｍ以内の屈折率の変化に感受性がある表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく。例えば、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃを表面に付着させることができ、被験抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を、サンプル溶液の連続流中で表面上を通過させることができる。ＳＰＲ応答は、表面近くの質量濃度の変化に正比例し、動態パラメーターをセンサーグラム（sensogram）の結合及び解離相から評価する。

一態様においては、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、例えば抗体、そのフラグメント又は変異体が提供され、抗原結合分子は、上で定義したようにＰＤ－Ｌ１への結合について本発明の抗原結合分子と競合する。

例えば、一実施形態においては、本発明は、ＰＤ－Ｌ１、特にヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１への結合について８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４及び２Ａ０９からなる群から選択される抗体と競合する抗原結合分子（好ましくは抗体）を提供する。ＰＤ－Ｌ１への結合についてそのフラグメント及び変異体と競合する抗原結合分子（例えば、上記の抗体の６つのＣＤＲ領域又はＶＨ及びＶＬ配列を含む抗原結合分子、並びに他の変異体）も提供される。

被験抗体が本発明の抗体が結合するエピトープと同じエピトープへの結合について競合することができるかを決定するために、交差遮断アッセイ、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。例示的な競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのＰＤ－Ｌ１コーティングウェル又はＰＤ－Ｌ１コーティングセファロースビーズを、候補競合抗体とともに又は候補競合抗体なしでプレインキュベートした後、本発明のビオチン標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加する。ウェル内又はビーズ上のＰＤ－Ｌ１抗原に結合した標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲート及び適切な基質を用いて測定することができる。

代替的には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、例えば放射性標識若しくは蛍光標識、又は幾つかの他の検出可能及び測定可能な標識で標識することができる。抗原に結合する標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量は、抗原上の同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗体（被験抗体）の能力と逆相関を有し、すなわち、同じエピトープに対する被験抗体の親和性が高いほど、抗原コーティングウェルに結合する標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体が少なくなる。候補競合抗体が、候補競合抗体の非存在下で（但し、既知の非競合抗体の存在下であってもよい）並行して行われる対照と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０％～５０％、更により好ましくは少なくとも５０％遮断することができる場合、候補競合抗体は、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と同じエピトープに実質的に結合するか、又は同じエピトープへの結合について競合する抗体とみなされる。このアッセイが同じ定量値に至るように様々に行われ得ることが理解される。

ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、本発明の抗原結合分子へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する抗原結合分子も提供される。

例えば、一実施形態においては、抗原結合分子（好ましくは抗体）は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４及び２Ａ０９からなる群から選択される抗体へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する。ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、そのフラグメント及び変異体へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する抗原結合分子（例えば、上記の抗体の６つのＣＤＲ領域又はＶＨ及びＶＬ配列を含む抗原結合分子、並びに他の変異体）も提供される。

本発明の抗原結合分子が結合するＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子も提供される。

例えば、一実施形態においては、本発明は、８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４及び２Ａ０９からなる群から選択される抗体が結合するＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子（好ましくは抗体）を提供する。そのフラグメント及び変異体が結合するＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子（例えば、上記の抗体の６つのＣＤＲ領域又はＶＨ及びＶＬ配列を含む抗原結合分子、並びに他の変異体）も提供される。

組成物
本発明の一態様においては、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物が提供される。

本発明のこの態様による組成物は、任意の簡便な経路で使用するために配合することができる。本発明の医薬組成物は通常、本発明の抗原結合分子に加えて薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、ビヒクル、緩衝剤又は安定剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

医薬組成物は、それを患者に投与する所望の方法に応じて任意の好適な形態であり得る。

本発明の医薬組成物は、１回の投与当たり所定量の各有効成分を含有する単位投与形態にて与えることができる。かかる単位は、０．５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇのいずれかの化合物を与えるように適合することができる。かかる用量は、単回投与にて又は多数の個別の投与として与えることができる。最終用量は、当然ながら治療される病態、投与経路、並びに患者の年齢、体重及び状態によって異なり、医師の判断による。

本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）、直腸、経鼻、局所（口腔内、舌下又は経皮を含む）、膣内、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内又は皮内を含む）経路による投与に適合することができる。ＩＶ投与が好ましい場合がある。かかる製剤は、薬学の技術分野で既知の任意の方法によって、例えば有効成分と担体（複数の場合もある）又は賦形剤（複数の場合もある）とを合わせることによって調製することができる。

経口投与に適した医薬製剤は、カプセル若しくは錠剤；粉末若しくは顆粒；水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液；食用のフォーム若しくはホイップ；又は水中油型液体エマルション若しくは油中水型液体エマルション等の個別の単位として与えることができる。

経皮投与に適した医薬製剤は、長時間にわたってレシピエントの表皮と密接に接触したままであることを意図した個別のパッチとして与えることができる。例えば、有効成分は、Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986)に概して記載されているイオントフォレシスによってパッチから送達され得る。

局所投与に適した医薬製剤は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル又は油として配合することができる。

眼又は他の外部組織、例えば口及び皮膚への適用については、製剤を局所軟膏又はクリームとして適用するのが好ましい。軟膏に配合する場合、有効成分をパラフィン系又は水混和性の軟膏基剤のいずれかとともに用いることができる。代替的には、水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤を用いて有効成分をクリームに配合することができる。

眼への局所投与に適した医薬製剤には、有効成分を好適な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁した点眼剤が含まれる。

口内への局所投与に適した医薬製剤には、トローチ剤、パステル剤及び含嗽剤が含まれる。

直腸投与に適した医薬製剤は、坐剤又は浣腸として与えることができる。

担体が固体である経鼻投与に適した医薬製剤には、嗅ぎたばこを吸う方法、すなわち鼻に近付けて保持した粉末の容器から鼻腔を通して素早く吸入することによって投与される、例えば２０ミクロン～５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末が含まれる。担体が液体である、鼻腔スプレー又は点鼻薬としての投与に適した製剤には、有効成分の水溶液又は油溶液が含まれる。

吸入による投与に適した医薬製剤には、様々なタイプの定量加圧エアロゾル、ネブライザー又は吸入器によって生成され得る微粒子ダスト又はミストが含まれる。

膣内投与に適した医薬製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤として与えることができる。

非経口投与に適した医薬製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、制菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単回投与又は複数回投与用の容器、例えば密閉アンプル及びバイアルに入れて与えることができ、滅菌液体担体、例えば注射用水を使用直前に添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。即時調合注射液及び懸濁液を滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。

本発明の医薬組成物は、本発明の分子に加えて１つ以上の他の治療的活性剤を含有していてもよい。

幾つかの実施形態においては、活性薬物濃縮物の製剤は、薬学的に許容可能な等張化剤、緩衝剤及び薬学的に許容可能な界面活性剤を含み得る。

代替的には、製剤は、有効成分に加えて、任意にｐＨを約６．０～７．０、例えば６．５前後に調整した一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０又はポリソルベート２０（撹拌による凝集のリスクを最小限に抑えるための界面活性剤）及び水（ＵＳＰ／Ｐｈ．Ｅｕｒ）を含み得る。

好ましい単位投与製剤は、有効成分の本明細書において上で列挙した１日用量若しくは部分用量又はその適切な部分を含有するものである。

製剤が、特に上述した成分に加えて、問題の製剤のタイプを考慮して、当該技術分野において常用の他の作用物質を含んでいてもよく、例えば経口投与に適した製剤が着香料を含み得ることを理解されたい。

治療方法
本発明の抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１媒介性障害又は疾患、特に癌の予防及び／又は治療に有用である。したがって、本発明のこの態様は、被験体に本発明の抗原結合分子を投与することを含む、被験体においてＰＤ－Ｌ１媒介性障害又は疾患（癌等）を治療する方法も含む。したがって、本発明は、ＰＤ－Ｌ１媒介性障害又は疾患（癌等）の治療及び／又は予防に使用される薬剤の製造への本発明の抗原結合分子の使用、並びにかかる病態の予防及び／又は治療への本発明の抗原結合分子の使用にも及ぶ。

治療方法は、ヒト又は動物被験体のものとすることができ、本発明は、人間医学及び／又は獣医学の両方における使用に等しく及ぶ。本発明の抗原結合分子は、個体に対して利益を示すのに十分な「治療有効量」にて個体に投与するのが好ましい。本明細書において使用される場合、「治療」は、ヒト又は非ヒト動物、好ましくは哺乳動物に利益をもたらし得る任意のレジームを含む。治療は、既存の病態に関するものであっても、又は予防的なもの（予防治療）であってもよい。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であってもよい。方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ方法であってもよい。

一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合にＴ細胞免疫を増強する。

一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合に免疫抑制を逆転させる。

一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、免疫チェックポイント阻害剤である。

一実施形態においては、本発明の抗原結合分子は、癌の治療又は予防に使用される。本明細書において使用される場合、「癌」は、異常細胞の無制御な分裂によって引き起こされる疾患に関する。これらは心臓の肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、転移性横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺の気管支原性癌（扁平上皮癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；消化管：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、結腸直腸癌；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫（chondromyxofibroma）、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；女性生殖器：子宮（子宮内膜癌）、子宮（頸部の子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌）、顆粒膜卵胞膜細胞腫、セルトリ－ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファローピウス管（癌）、乳癌；血液系：血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑（moles dysplastic nevi）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；並びに副腎：神経芽細胞腫を含む。別の実施形態においては、癌は癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫及び肉腫である。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌及び頭頸部癌が挙げられる。癌の別の具体的な例としては、腎細胞癌が挙げられる。癌の更に別の具体的な例は、非ホジキンリンパ腫又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫である。

特に対象となるのは、黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌の治療又は予防である。

一実施形態においては、癌は、黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌からなる群から選択され得る。

治療される病態に応じて、本発明の抗原結合分子は、同時、別々又は順次の使用のために他の薬学的に活性な成分と組み合わせて使用することができる。例えば、癌を治療又は予防する場合、本発明の抗原結合分子を別の療法又は付加的な治療的活性剤と組み合わせて使用することができる。好適な療法又は付加的な治療的活性剤としては、放射線療法、化学療法治療、標的療法、免疫療法、モノクローナル抗体療法、ホルモン療法、血管新生阻害、癌ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、後成的修飾、改変Ｔ細胞、Ｔ細胞共刺激アゴニスト、チロシンキナーゼ阻害剤、他の抗癌化学物質、癌療法のための緩和ケア、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、免疫調節剤、免疫賦活剤、及び／又は阻害剤、例えばＩＤＯ阻害剤、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＴＧＦＢ阻害剤、Ｔ細胞共刺激アンタゴニスト、Ｔｒｅｇ阻害剤、マクロファージ調節剤、ナチュラルキラー細胞調節剤、及びケモカイン受容体阻害剤が挙げられる。

好適な化学療法治療としては、ゲムシタビン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンが挙げられる。好適なＴ細胞共刺激アゴニストとしては、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ及びＩＣＯＳが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＣＤ７０及びＴＩＧＩＴからなる群のメンバーに作用し得る。

他の療法又は付加的な治療的活性剤は別の抗原結合分子であってもよい。付加的な抗原結合分子は抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、抗ＰＤ－１抗原結合分子、抗ＣＴＬＡ－４抗原結合分子、抗ＯＸ４０抗原結合分子、抗ＩＣＯＳ抗原結合分子、抗ＧＩＴＲ抗原結合分子からなる群から選択され得る。

本発明の医薬組成物は、上に挙げたような１つ以上の追加の薬学的に活性な成分を含むように配合することができる。本発明の抗原結合分子は、キットの一部として提供してもよい。かかるキットは、使用説明書及び／又は追加の薬学的に活性な成分を含み得る。抗原結合分子及び追加の薬学的に活性な成分は、キット内で別個に配置されてもよく、又は幾つかの実施形態においては、抗原結合分子及び追加の薬学的に活性な成分をともに配合してもよい。

本発明の一実施形態においては、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体、特にＦａｂフラグメント等の一価抗体が提供される。抗体は、８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４及び２Ａ０９からなる群から選択される。抗体は、癌の治療又は予防に使用される。

ここで、例示目的で提示され、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない多数の具体的な実施例を参照して本発明を更に説明する。

ヒトナイーブライブラリの構築：
６人の健常ドナーのＰＢＭＣ（０．５Ｌの血液／ドナー）からＲＮＡを抽出した。２４０μｇのＲＮＡを、ランダムプライマーを用いるｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡを、ＦＲ１のＶＨ、Ｖκ及びＶλ並びにヒンジＣＨ１領域にアニーリングする非タグ付きプライマーを用いる一次ＰＣＲ増幅、続いてＶＨ、Ｖλ及びＶκ遺伝子をｐＣＢ３ファージミドベクターにクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する二次ＰＣＲ増幅に使用した。ライブラリをＴＧ１大腸菌細胞にエレクトロポレーションし、ヒトライブラリの細菌グリセロールストックを－８０℃で保管した（ヒトナイーブＦａｂライブラリプールＨ００２κ－Ｈ００７κ及びヒトナイーブＦａｂライブラリプールＨ００２λ－Ｈ００７λ）。

選択：ｐＨ選択的抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ
ヒトナイーブＦａｂライブラリプールＨ００２κ－Ｈ００７κ及びヒトナイーブＦａｂライブラリプールＨ００２λ－Ｈ００７λからのファージ作製を、ヒトＰＤ－Ｌ１を用いた２ラウンド連続のパンニングファージディスプレイ選択、続いてカニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１タンパク質を用いた第３ラウンドのパンニング選択、並びにマウスＰＤ－Ｌ１を用いた第４ラウンドのパンニングに使用し、交差反応性クローンの可能性を高めた（ヒト及びマウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃは、R&D Systemsから入手し、カニクイザルＰＤ－Ｌ１ Ｆｃは、Sino biologicalから入手した）。全ての選択ラウンドを、１０μｇ／ｍｌの組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質を用いてｐＨ６．０で行い（ＣＰＡバッファー；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１１５ｍＭ塩化ナトリウム）、非特異的ファージを洗い流し、続いてトリプシンにより特異的ファージを溶出させた（完全溶出）。溶出ファージの段階希釈を行い、指数関数的に成長するＴＧ１への感染に使用した。感染したＴＧ１をＬＢＣａｒｂ１００Ｇｌｕ２％プレート上にプレーティングし、バックグラウンド（選択に抗原を用いない）に対する富化値を算出した。

ＥＬＩＳＡスクリーニング：
第３及び第４ラウンドのパンニング選択条件のアウトプットからの個々のクローンを９６ウェルマスタープレートに選別し、ファージ及びペリプラズム抽出物（Ｐ．Ｅ．）としてｐＨ６．０対ｐＨ７．４でのヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１への結合について結合ＥＬＩＳＡによって試験した。

ファージ結合ＥＬＩＳＡについては、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、２５０μｌ／ウェルの４％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後に、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、１ウェル当たり９０μｌの１％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）中１０μｌのファージとともに、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、１ウェル当たり１％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）中１００μｌの抗Ｍ１３－ＨＲＰ（GEのカタログ番号２７－９４２１－０１）とともに、振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ、ThermoFisher）を添加し、反応をＨ_２ＳＯ_４（ThermoFisher）で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

ペリプラズム抽出物（Ｐ．Ｅ．）結合ＥＬＩＳＡについては、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、２５０μｌ／ウェルの４％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）又は４％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて室温で１時間ブロッキングした。

ブロッキング後に、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１ウェル当たり２０μｌのＰ．Ｅ＋８０μｌの１％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）又は１％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）とともに、振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。次いで、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１ウェル当たり１％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）又は１％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１００μｌの抗ｃ－Ｍｙｃ－ＨＲＰ（Bethylのカタログ番号Ａ１９０－１０５Ｐ）とともに、振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。次いで、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ溶液）をプレートに添加した。反応をＨ_２ＳＯ_４で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。クローンの殆どについて、両方のｐＨでの結合が観察された。ヒトＰＤ－Ｌ１に対する陽性結合剤をシークエンシングし、クローンを異なるＨＣＤＲ３配列によってファミリー毎に分類した。

ＣＤＲ３にヒスチジンを有するファミリーからのクローンは、ｐＨ６．０でｐＨ７．４よりも高いＯＤ値を示し、ＥＬＩＳＡにおいてヒト、カニクイザル及び／又はマウスＰＤ－Ｌ１に結合するファミリー代表のクローンのパネルをヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３ＦＦ細胞への結合についてスクリーニングするために選択した。

細胞における選択クローンのスクリーニング：
ヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１でのＨＥＫ２９３ＦＦ細胞のトランスフェクション。ＨＥＫ２９３ＦＦ細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地中で培養し、トランスフェクション当日に０．８Ｅ＋０６細胞／ｍｌで播種した。（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００＋ヒト、カニクイザル又はマウスプラスミドのＤＮＡ ７０μｇ）のミックスを調製し、細胞に添加した（哺乳動物発現プラスミドは、Sino Biologicalから入手した）。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートし、ヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１発現についてフローサイトメトリーによってＱＣした。簡潔に述べると、２．０Ｅ＋０５個のＨＥＫ２９３ＦＦ ＷＴ、ヒトＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１及びマウスＰＤ－Ｌ１細胞を２．５μｇ／ｍｌの抗ヒト／マウス／カニクイザル（R&D Systems）ＰＤ－Ｌ１（ヤギＩｇＧ）とともに５０μｌ／ウェルの最終容量にて４℃で３０分間、軽く振盪しながらインキュベートした。細胞を３００ｇで３分間、１５０μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＦＢＳ）で３回洗浄し、二次抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ThermoFisher）とともに５０μｌ／ウェルの最終容量にて４℃で３０分間、軽く振盪しながら暗所でインキュベートした。次いで、細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、ＦＡＣＳ機器（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）のＦＬ－４チャネル（ＡＰＣチャネル）において測定し、１サンプル当たり合計１００００個の細胞を取得した。

ＰＤ－Ｌ１トランスフェクト細胞へのペリプラズム抽出物（Ｐ．Ｅ）の結合：
選択クローンからのペリプラズム抽出物（Ｐ．Ｅ）を、可溶性Ｆａｂに存在するｃ－ｍｙｃタグに特異的な抗ｃ－ｍｙｃ抗体とともに、撹拌しながら室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。ミックス（Ｐ．Ｅ＋抗ｃ－ｍｙｃ抗体）をＷＴ又はヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１ ＨＥＫ２９３ＦＦトランスフェクト細胞に添加し、軽く振盪しながら４℃で６０分間インキュベートした。次いで、細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの二次抗体ヤギ抗マウスＡＰＣ（ThermoFisher）とともに４℃で３０分間、遮光して振盪しながらインキュベートした。細胞を再び洗浄し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーを用いて３回遠心分離した後、７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、ＦＡＣＳ機器（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）のＦＬ－４チャネル（ＡＰＣチャネル）において測定し、１サンプル当たり合計１００００個の細胞を取得した。幾つかのクローンがヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１細胞に結合した。マウスＰＤ－Ｌ１結合剤は見られなかった。

ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１阻害についての選択クローンのスクリーニング：
ＰＤ－Ｌ１細胞結合クローンをｐＨ６．０でのＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１阻害についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－１ Ｆｃタンパク質（R&D Systems）を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、２５０μｌ／ウェルの１％カゼイン／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後に、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、ＣＰＡ／０．１％カゼイン中５０μｌのビオチン化ＰＤ－Ｌ１（２μｇ／ｍｌ、R&D Systems）＋競合のためのＣＰＡ／０．１％カゼイン中５０μｌのＰ．Ｅ（１：２．５）とともに、１００μｌの最終容量にて振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、Ｐ．Ｅの存在下でコーティングＰＤ－１ Ｆｃへのビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１の結合を検出するために、０．１％カゼイン／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）で２０００倍希釈した５０μｌのＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich）をウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ）をプレートに添加し、反応をＨ_２ＳＯ_４で停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するクローンの能力を、関連及び無関連Ｐ．Ｅの存在下でビオチン化ＰＤ－Ｌ１を有するウェルのＯＤ値の比較によって評価した。対照として、またＰ．Ｅ阻害効果の比較のために、中和抗ＰＤ－Ｌ１抗体もアッセイに使用した。１Ｅ０８、１Ａ０６、２Ａ０９及び２Ｃ１１の４つのクローンは、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を４０％～８０％阻害することができた。これらのクローンをＩｇＧフォーマッティング後のｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用した。

ＩｇＧのフォーマッティング、作製及び精製：
ＶＨ、Ｖκ及びＶλ抗体可変ドメインをコードする合成遺伝子をInvitrogenから購入した。各ＤＮＡを製造説明書に従って再構成した。２００ｎｇのＤＮＡを大腸菌ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセルに形質転換した。ＤＮＡ精製を、QIAGENのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて行った。各ＤＮＡ構築物を制限酵素消化し、挿入断片をゲル精製し、各可変ドメイン挿入断片を、ＶＨ挿入断片については抗体重鎖定常ドメイン又はＶκ若しくはＶλ挿入断片については軽鎖定常ドメインを有する哺乳動物発現ベクターとライゲートした。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に製造業者（ThermoFisher）の説明書に従ってクローンをトランスフェクトした。ＶＨ及びＶｋ鎖を有する全ＤＮＡプラスミド構築物４０μｇを、５０ｍＬの細胞の総容量にて４日間～１０日間のタンパク質産生（３２℃、５％ＣＯ_２）に使用した。４日間及び１０日間のタンパク質産生後に、非還元条件では１５０ｋＤａのバンド、還元条件ではＩｇＧ分子量に相当する５０ｋＤａ及び２５ｋＤａのバンドの存在を分析することによってＳＤＳ－Ｐａｇｅによる品質管理を行った。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５システムでＨｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムを用いて抗体を精製した。続いて、０．１Ｍグリシンを用いてｐＨ２．７でＩｇＧを溶出させ、中和のために０．１ｍｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の入ったチューブに１．０ｍｌの画分を収集した。抗体含有画分をプールし、ＡＫＴＡ ＰｕｒｅでＨｉＴｒａｐ脱塩カラムを用いて脱塩を行い、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水）溶液にバッファー交換した。分取サイズ排除クロマトグラフィーを用いてプロテインＡ画分から凝集体を除去した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによってタンパク質濃度を決定した。

ＷＴ、ヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３ＦＦへの精製抗体の結合
ヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ－Ｌ１でのＨＥＫ２９３ＦＦ細胞のトランスフェクションを上記のように行った。簡潔に述べると、２×１０^５個のＨＥＫ２９３ＦＦ ＷＴ、ヒトＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１及びマウスＰＤ－Ｌ１細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＦＢＳ）中の精製抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１クローン（５００ｎＭ～０．６９ｎＭ）とともにインキュベートし、２×１０^５個のＷＴ又はヒト、カニクイザル及びマウスＨＥＫ２９３ＦＦトランスフェクト細胞とともに、１００μｌ／ウェルの最終容量にて軽く振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。特異性の対照として無関連抗体を使用した。インキュベーション後に細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、軽く振盪しながら４℃で１時間、５０μｌ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＦＩＴＣ標識抗体（ThermoFisher）を細胞に添加した。細胞を洗浄した後、７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ機器（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）のＦＬ－１チャネル（ＦＩＴＣチャネル）において測定し、１サンプル当たり合計１００００個の細胞を取得した。

異なるｐＨでのＰＤ－Ｌ１へのＥＬＩＳＡ結合：
精製抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１クローンを、ｐＨ６．０対ｐＨ７．４でのヒトＰＤ－Ｌ１への結合について結合ＥＬＩＳＡによって試験した。ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、２５０μｌ／ウェルの４％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後に、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡ（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製した抗体の段階希釈物（３倍希釈物；１００ｎＭ～０．１３７ｎＭ）１００μｌとともにインキュベートし、振盪しながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡ（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製した１００μｌ／ウェルの二次抗体である抗ヒトＣＨ１特異的ＨＲＰ（BD Pharmingenのカタログ番号５５５７８８）を添加し、振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ）を添加し、反応をＨ_２ＳＯ_４で停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。最終スクリーニングアッセイにおいて、ｐＨ７．４については１ｍＭ乳酸（Sigmaのカタログ番号２５２４７６－５００Ｇ）を含むクレブスリンガー重炭酸バッファー（ＫＲＢ、Amsbioのカタログ番号ＫＲＢ－１０００）、ｐＨ６．５についてはＫＲＢ＋１５ｍＭ乳酸、ｐＨ６．０についてはＫＲＢ＋２０ｍＭ乳酸も使用した。

ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１阻害についての抗体のスクリーニング：
抗体をｐＨ６．０でのＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１阻害についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。

ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－１－Ｆｃタンパク質を４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、２５０μｌ／ウェルの１％カゼイン／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後に、プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、１００ｎＭから開始して０．０５ｎＭまでの抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１クローンの３倍希釈物を１時間（ＲＴ）、０．１％カゼイン／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）中の１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１ビオチンとともに１００μｌ／ウェルの総容量にてインキュベートした。プレートをＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、抗体の存在下でコーティングＰＤ－１－Ｆｃに結合し得るビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１の検出のために０．１％カゼイン／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）中のＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（２０００倍希釈）をウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＣＰＡ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ）を添加し、反応をＨ_２ＳＯ_４で停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する抗体の能力を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体対無関連抗体の存在下でビオチン化ＰＤ－Ｌ１を有するウェルのＯＤ値の比較によって評価した。このアッセイは、上記のバッファー中のＣＰＡをＰＢＳに置き換えてｐＨ６．５及びｐＨ７．４でも行った。最終スクリーニングアッセイにおいて、ｐＨ７．４については１ｍＭ乳酸（Sigmaのカタログ番号２５２４７６－５００Ｇ）を含むクレブスリンガー重炭酸バッファー（ＫＲＢ、Amsbioのカタログ番号ＫＲＢ－１０００）、ｐＨ６．５についてはＫＲＢ＋１５ｍＭ乳酸、ｐＨ６．０についてはＫＲＢ＋２０ｍＭ乳酸も使用した。

ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１阻害についての抗体のスクリーニング
ＥＬＩＳＡアッセイは、コーティング抗原が１μｇ／ｍｌのヒトＢ７－１－Ｆｃ（ＣＤ８０）（R&D Systemsのカタログ番号１４０－Ｂ１）である以外は上記の「ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１阻害についての抗体のスクリーニング」と同じである。

ＢＩＡｃｏｒｅ分析：
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのヒトＰＤ－Ｌ１に対する選択されたＩｇＧフォーマット精製クローンの親和性を評定するために、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質をアミンカップリングによってコーティングした。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００、GE Healthcare）を用いて、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのヒトＰＤ－Ｌ１に対する選択されたＩｇＧフォーマット精製クローンの結合動態を決定した。ｐＨ５．０の酢酸バッファー中５０μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ（R&D Systems）およそ３０００ＲＵを、標準的なアミンカップリング手順を用いてＣＭ５チップに固定化した。ＰＤ－Ｌ１固定化のＱＣを、市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（R&D systemsのカタログ番号ＡＦ１５６）を２．０μｇ／ｍｌで用いて行った。１×ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）又はＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．０）又はＨＢＳ－ＥＰ １０ｎＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．５）又はＨＢＳ－ＥＰ １０ｎＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）を結合動態測定において泳動バッファーとして用いた。抗体の勾配は、適切なｐＨバッファー中で５０ｎＭから開始して０．１３ｎＭまでの３倍希釈からなり、３０μｌ／分の流量で１２０秒間注入した。解離後に、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ表面の再生を１Ｍ ＮａＣｌ中の１０ｍＭ ＮａＯＨ（２０μｌ／分で３０秒間の注入）に続く、２０μｌ／分での１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の３０秒間の単回注入によって達成した。物質移動による１：１結合のフィッティングを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて曲線に適用し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）及び親和性（Ｋ_Ｄ）を含む抗体－抗原相互作用の速度定数を算出した。

親和性成熟ライブラリの生成：
ファージディスプレイライブラリの構築は、遺伝子アセンブリによって生成した。ライブラリ設計において定義される或る特定の位置に特定の突然変異を有する重複オリゴヌクレオチド及び／又は三量体を用い、Ｖ遺伝子をＰＣＲによって合成的に生成した。オリゴヌクレオチドは、完全なＶＨ及びＶλ配列をアセンブルするように設計され、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域に特異的なプライマーは、異なる変異体の構築を可能にするために親ヌクレオチド又は縮重コドンのいずれかを含有していた。クローニング制限部位をＶＨ及びＶλ遺伝子に導入し、ファージミドベクターに更に挿入した。全ての遺伝子アセンブリＰＣＲを、３つの異なるアニーリング温度を用いて行い、異なるアニーリング温度のＰＣＲ産物間で差異が観察されない場合、ＰＣＲ産物をプールした。ゲル精製したＶλ遺伝子を、定常ヒト重及び軽遺伝子（ＣＨ及びＣＬ）並びに親ＶＨ鎖ドメインを有するｐＣＢ１３＿２Ａ０９ＶＨ＿ＷＴファージミドベクターにクローニングし、ＡＦＦ２Ａ０９＿ＬＣＤＲ１、ＡＦＦ２Ａ０９＿ＬＣＤＲ２及びＡＦＦ２Ａ０９＿ＬＣＤＲ３親和性成熟ライブラリを構築した。ゲル精製したＶＨランダム化遺伝子を、ＣＨ及びＣＬヒト定常領域並びに親Ｖλドメインを有するｐＣＢ１３＿２Ａ０９Ｖλ＿ＷＴファージミドベクターにクローニングし、ＡＦＦ２Ａ０９＿ＨＣＤＲ１、ＡＦＦ２Ａ０９＿ＨＣＤＲ２及びＡＦＦ２Ａ０９＿ＨＣＤＲ３親和性成熟ライブラリを構築した。全てのＦａｂファージディスプレイライブラリは、完全Ｆａｂ挿入断片を含有する形質転換体が８０％超となり、ライブラリ１つ当たり４８個の形質転換体をシークエンシングに送り、標的重及び軽ＣＤＲにおけるアミノ酸頻度導入について、親クローン２Ａ０９のＷＴ配列と比較して分析した。

親和性成熟ファージディスプレイ選択：
ラウンドＩ：パンニング選択。ｐＨ６．０でヒトＰＤ－Ｌ１に対するＦａｂを選択するために、２Ａ０９親和性成熟サブライブラリを用いるパンニング選択の第１ラウンドを行った。プレートに１×ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１を１００μｌ／ウェル、Ｏ／Ｎ、４℃でコーティングし、続いて２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中の４％スキムミルク（Marvel、カタログ番号９２８９６４）を用いてＲＴで２時間ブロッキングした。２Ａ０９親和性成熟サブライブラリからのファージを、１選択条件につき４％スキムミルク／ＣＰＡ（ｐＨ６．０）中にてＲＴで３０分間、回転させながらブロッキングした。１選択条件につき４％スキムミルク／１×ＰＢＳ中の親和性成熟サブライブラリからの５０μｌのファージを、抗原でコーティングしたプレートにおいてＲＴで２時間、１００μｌ／ウェルでインキュベートした。インキュベーション後に、ウェルを１×ＣＰＡ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で１５回洗浄し（５回の洗浄毎に５分間の振盪インキュベーションを含む）、更に２５０μｌ／ウェルの１×ＣＰＡ（ｐＨ６．０）で５回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Sigma、カタログ番号Ｔ１４２６－５Ｇ）を用いて、ＰＤ－Ｌ１に結合したファージの完全溶出を行った。１５０μｌ／ウェルのトリプシンを添加し、ＲＴで２０分間インキュベートした。トリプシンプロテアーゼ活性の阻害を、１０μｌのＡＥＢＳＦ（Sigma、カタログ番号Ａ８４５６）を用いて行った。溶出ファージの段階希釈を行い、指数関数的に成長するＴＧ１への感染に使用した。感染したＴＧ１をＬＢＣａｒｂ１００Ｇｌｕ２％プレート上にプレーティングし、抗原選択条件により溶出したファージの数と抗原選択条件なしで溶出したファージの数との比率として富化を算出した。全てのサブライブラリについて良好な富化が観察され、アウトプットを溶液中での第２ラウンドに供した。

ラウンドＩＩ：親和性による溶液中での選択。溶液中の抗原を認識するＰＤ－Ｌ１に対する親和性成熟Ｆａｂの選択のために、ビオチン化ＰＤ－Ｌ１及びストレプトアビジンコーティング磁性ビーズを用いて第２ラウンドを行った。抗原ブロッキング：１０ｎＭ及び１ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を、２％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡバッファー（ｐＨ６．０）を用いてＲＴで３０分間、回転させながらブロッキングした。ファージブロッキング：第１ラウンドから得たアウトプットからの１０μｌのインプットファージを、４％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡバッファー（１条件当たり）を用いてＲＴで回転させながら３０分間ブロッキングした。ファージ＋抗原ミックス：１００μｌのブロッキング抗原（ｂｉｏ－ＰＤ－Ｌ１）＋１００μｌのブロッキングファージ（１条件当たり）を、ＲＴで回転させながら２時間インキュベートした。ビーズ洗浄／ブロッキング：１選択条件当たり３０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標） ＭｙＯｎｅ（商標） Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁性ビーズ（Invitrogen、カタログ番号６５６０１）をＣＰＡバッファー－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で３回洗浄し、２％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡバッファー中で３０分間、ＲＴで回転させながらブロッキングした。ミックスファージ＋抗原ビーズ捕捉：２００μｌのミックス（ファージ＋抗原ｂｉｏ－ＰＤ－Ｌ１）をＲＴで１５分間、回転させながら磁性ビーズに添加した。インキュベーション後に、ビーズをＣＰＡバッファー－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で５回洗浄し、更に１ｍｌのＣＰＡバッファーで２回洗浄した。溶出：ＰＤ－Ｌ１に結合したファージの完全溶出を、１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを２００μｌ／条件で用いて２０分間、ＲＴで回転させながら行った。トリプシンプロテアーゼ活性の阻害を、１０μｌのＡＥＢＳＦを用いて行った。富化：溶出ファージの段階希釈を行い、指数関数的に成長するＴＧ１への感染に使用した。感染したＴＧ１をＬＢＣａｒｂ１００Ｇｌｕ２％プレート上にプレーティングし、抗原選択条件により溶出したファージの数と抗原選択条件なしで溶出したファージの数との比率として組換えタンパク質選択時の富化を算出した。

ラウンド３：２時間又は２０時間のオフレート洗浄を伴う親和性による溶液中での選択。溶液中の抗原を認識するＰＤ－Ｌ１に対して親和性成熟したＦａｂを選択するために、１００倍過剰な非ビオチン化ＰＤ－Ｌ１を用いた２時間又は２０時間のオフレート洗浄を伴うストレプトアビジンコーティング磁性ビーズを用いた第３ラウンドの溶液中の選択を行い、高親和性クローンを選択した。抗原ブロッキング：１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ及び０ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を、２％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡバッファー（ｐＨ６．０）を用いてＲＴで３０分間、回転させながらブロッキングした。ファージブロッキング：第２ラウンドから得たアウトプットからの１０μｌのインプットファージを、４％ＭａｒｖｅｌのＣＰＡバッファー（１条件当たり）を用いてＲＴで回転させながら３０分間ブロッキングした。ファージ＋抗原ミックス：１００μｌのブロッキング抗原（ｂｉｏ－ＰＤ－Ｌ１）＋１００μｌのブロッキングファージ（１条件当たり）を、ＲＴで回転させながら２時間インキュベートした。ビーズ洗浄／ブロッキング：１選択条件当たり３０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標） ＭｙＯｎｅ（商標） Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁性ビーズ（Invitrogen、カタログ番号６５６０１）をＣＰＡバッファー－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で３回洗浄し、２％Ｍａｒｖｅｌ ＣＰＡバッファー中で３０分間、ＲＴで回転させながらブロッキングした。ミックスファージ＋抗原ビーズ捕捉：２００μｌのミックス（ファージ＋抗原ｂｉｏ－ＰＤ－Ｌ１）をＲＴで１５分間、回転させながら磁性ビーズに添加した。インキュベーション後に、ビーズをＣＰＡバッファー－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で５回洗浄し、更にＣＰＡバッファーで２回洗浄した。オフレート洗浄：１００倍過剰な非ビオチン化ＰＤ－Ｌ１（１０ｎＭ、１ｎＭ及び０．１ｎＭ）又はＣＰＡバッファーを選択ウェルに添加し、ＲＴで２時間又は２０時間、回転させながらインキュベートした。溶出：ＰＤ－Ｌ１に結合したファージの完全溶出を、１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを２００μｌ／条件で用いて２０分間、ＲＴで回転させながら行った。トリプシンプロテアーゼ活性の阻害を、１０μｌのＡＥＢＳＦを用いて行った。富化：溶出ファージの段階希釈を行い、指数関数的に成長するＴＧ１への感染に使用した。感染したＴＧ１をＬＢＣａｒｂ１００Ｇｌｕ２％プレート上にプレーティングし、抗原選択条件により溶出したファージの数と抗原選択条件なしで溶出したファージの数との比率として組換えタンパク質選択時の富化を算出した。１ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１及び１００ｎＭのＰＤ－Ｌ１を用いた２時間又は２０時間のオフレート洗浄によって選択したアウトプットを、細胞中でのラウンドＩＶの選択に供した。

ラウンド４：細胞選択。細胞表面に存在するネイティブＰＤ－Ｌ１に対する親和性成熟Ｆａｂを選択するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＰＤ－Ｌ１を発現する内在性細胞）を用いたｐＨ６．０での選択ラウンドを行った。細胞：１サブライブラリ条件につき、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ（ｐＨ６．０）（１Ｍ ＨＣＬで酸性化）中の５．０Ｅ＋０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を使用した。また、細胞を、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０のＦＡＣＳバッファー中で３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭ、１．２３ｎＭ、０ｎＭのｍＡｂ ２Ａ０９又はｍＡｂ １２Ａ４（米国特許第９８５６３２０号による）とともに４℃で１時間、振盪しながらインキュベートすることにより、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ；Jackson ImmunoResearch Laboratoriesのカタログ番号２０９－５４５－０９８）を検出に用いてＰＤ－Ｌ１発現についてＱＣした。ファージブロッキング：１サブライブラリにつき、ラウンド３の選択（１００ｎＭ ＰＤ－Ｌ１で２時間又は２０時間のオフレート洗浄）から得たアウトプットファージをプールし、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ（ｐＨ６．０）を用いて４℃で２０分間、回転させながらブロッキングした。ファージ＋細胞：１条件当たり５Ｅ＋０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をブロッキングファージで再懸濁し、回転させながら４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を１０％ＦＢＳ／ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で４回洗浄し、更に１回の洗浄当たり１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ６．０）で１回洗浄した。溶出：ＰＤ－Ｌ１に結合したファージの完全溶出を１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを２００μｌ／条件で用いてＲＴで２０分間、回転させながら行い、トリプシンプロテアーゼ活性を１０μｌのＡＥＢＳＦで阻害した。富化：溶出ファージの段階希釈を行い、指数関数的に成長するＴＧ１への感染に使用した。感染したＴＧ１をＬＢＣａｒｂ１００Ｇｌｕ２％プレート上にプレーティングし、バックグラウンド（選択に抗原を用いない）に対する富化値を算出した。

ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２ライブラリ並びにＬＣＤＲ３ライブラリは、２Ａ０９ ＷＴと比較して顕著なヒットを生じなかった。ＨＣＤＲ３ライブラリは、１つの主要ヒットを生じ、２Ａ０９と比較して結合が改善された３つの他の特有の配列が単離され、ＬＣＤＲ１ライブラリは、３６個の特有のヒットを生じ、ＬＣＤＲ２ライブラリは、結合が改善された６つの特有のヒットを生じた。

これらのヒットを上記のようにｐＨ６及びｐＨ７．４で細胞結合アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ及びＰＤ－Ｌ１中和アッセイによって更に分析した。

リードＦａｂを上記のように精製ＩｇＧからＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号４４９８５）によって作製した。

腫瘍様バッファー中でのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ又はＦａｂの結合
ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞を用いて酸性腫瘍環境（environment milieu）を模倣するために（The metabolism of tumors in the body, Warburg et al. J Gen Physiol. 1927;8:519-30）、以下のバッファーを用いた：ｐＨ７．４については１ｍＭ乳酸（Sigmaのカタログ番号２５２４７６－５００Ｇ）を含むクレブスリンガー重炭酸バッファー（ＫＲＢ、Amsbioのカタログ番号ＫＲＢ－１０００）、ｐＨ６．５についてはＫＲＢ＋１５ｍＭ乳酸、ｐＨ６．０についてはＫＲＢ＋２０ｍＭ乳酸。Ｆａｂ又はＩｇＧの３倍希釈物（１００ｎＭ～０．０００５ｎＭ；０）をそれぞれのｐＨバッファー中で調製し、０．６０Ｅ０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とともに４℃で６０分間インキュベートした。次いで、細胞をそれぞれのｐＨバッファーで３００ｇにて３分間、３回洗浄した。次いで、細胞を５０μｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）－ＦＩＴＣ（Sigma、カタログ番号Ｆ５５１２－１ＭＬ）とともに、それぞれのｐＨバッファーで１００倍希釈してインキュベートした。ＰＤ－Ｌ１発現細胞へのＩｇＧ又はＦａｂの結合をＦＡＣＳ（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ）によって測定し、１サンプル当たり合計１００００個の細胞を取得した。

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（GraphPad 50 Software, Inc.，La Jolla，CA，USA）をＩＣ５０、ＥＣ５０の分析及び統計分析に用いた。

結果
Ｆａｂライブラリの初期スクリーニングカスケードは、ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に対するｐＨ６でのファージＥＬＩＳＡに続く、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１阻害ＥＬＩＳＡ及びＰＤ－Ｌ１陽性細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）への結合であった。これらのアッセイにより陽性となった異なるファミリーからの２０個のクローンをＰ．Ｅとして再スクリーニングした。ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に対するＥＬＩＳＡにおけるｐＨ６でのＦａｂ作製に続く、ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１阻害ＥＬＩＳＡ及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における細胞結合アッセイ。これらのスクリーニングから、１６個のクローンがファージ及びＰ．Ｅの両方としてヒト及びカニクイザル細胞に結合することが見出され、７つが弱い中和活性を有し、高い中和活性を有する４つのＦａｂを選択した。これらのクローンのうち２つが同一のＣＤＲを有していたため、３つのＦａｂを更なる分析のためにＩｇＧに変換した。ＥＬＩＳＡ（図１Ａ）によると３つ全てのｍＡｂがＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合を阻害し、図１Ａから算出されたＩＣ５０値は、２Ａ０９については０．４ｎＭ、１Ａ０６については０．９ｎＭ、１Ｅ０８については１．１ｎＭであった。図１Ｂに示すようにＥＬＩＳＡによると３つ全てのｍＡｂがＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１結合も阻害し、図１Ｂから算出されたＩＣ５０値は、２Ａ０９については１．２ｎＭ、１Ａ０６については６．３ｎＭ、１Ｅ０８については２．８ｎＭであった。ｍＡｂ ２Ａ０９はまた、ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に対して同等の結合を示した。

２Ａ０９のＦａｂ配列を表４に示す。

ＢＩＡｃｏｒｅによるオフレートの初期分析（図２）により、ｐＨ６と比較してｐＨ７．４での低いＫｄ値によって示されるように、ｍＡｂの２つ（１Ａ０６及び１Ｅ０８）がｐＨ７．４でＰＤ－Ｌ１に対して選択的結合を有することが明らかになった。全く対照的に、ｍＡｂ ２Ａ０９は、ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ６．０でより良好な結合を有し、オフレートはおよそ５倍良好であった。ＢＩＡｃｏｒｅ分析をより広範囲のｐＨで繰り返し、抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ １２Ａ４（米国特許第９８５６３２０号による）と比較し、結果を表５に示した。

ｍＡｂ ２Ａ０９は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ６でおよそ２０倍高い親和性を示したが、これは、ｐＨ特異的結合に選択されず、実際にｐＨ６でｐＨ７．４と比較して低い親和性を示すｍＡｂ １２Ａ４とは全く対照的である。

表５に提示したデータは、結合のｐＨ依存性を反映するが、ＢＩＡｃｏｒｅ表面上でのＰＤ－Ｌ１へのｍＡｂの結合についてアビディティ成分が存在する。この問題を回避し、腫瘍微小環境に似たバッファー中で細胞への２Ａ０９の結合を分析するために、ＰＤ－Ｌ１発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ラクテートを含むクレブスバッファー中にてｐＨ６、６．５及び７．４で２Ａ０９ ｍＡｂ及びＦａｂとともにインキュベートした（図３）。ＰＤ－Ｌ１への２Ａ０９結合のＥＣ５０が図３から算出され、ｐＨ７．４で１６．３ｎＭ、ｐＨ６．６で６．１ｎＭ、ｐＨ６．０で２．４ｎＭであった。これらの条件下では、２Ａ０９のＦａｂは、結合活性を殆ど有しなかった（図３）。

２Ａ０９ Ｆａｂの低い親和性の結果として、このクローンの親和性成熟キャンペーンを行った。２Ａ０９について上に概説したようなスクリーニングキャンペーンを行い、結合のｐＨ依存性及び親２Ａ０９クローンと比べて増大した親和性を示し、ＰＤ－Ｌ１に結合する５つのＦａｂ親和性成熟リードを選択した（表６）。軽鎖のＣＤＲ１における突然変異を包含する５つ全てのリードを選択した。

選択した５つ全てのＦａｂを精製し、初めにＥＬＩＳＡによって調べた（図４）。全てのＦａｂがｐＨ特異的結合を示し、陽性対照の抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ又はｍＡｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴ（国際公開第２０１１０６６３８９号による）は、ｐＨ依存性結合を示さなかった。陰性対照Ｆａｂ（２Ａ１１、抗ＨＥＬ）は、特異的結合を示さなかった。このＥＬＩＳＡによる初期アッセイから、Ｆａｂが調べた濃度にわたってｐＨ６ではるかに大きな親和性（表７）及びｐＨ７．４で弱い非飽和結合を有することが実証された。ＥＣ５０は、ｐＨ７．４ではこの方法論により正確に測定することができなかったが、結合の比率を表７に示し、両方のｐＨ曲線上のＯＤ読取りを比較することで、ＦａｂがｐＨ６で９倍～５３倍良好に結合することが実証された。このアッセイにおいて、ｐＨ６では全てのＦａｂが４ｎＭで結合の飽和に達したが、ｐＨ７．４では５つのＦａｂのいずれも飽和に達しなかった（図４）。

抗ＰＤ－Ｌ１親和性成熟Ｆａｂを、ＰＤ－Ｌ１阻害ＥＬＩＳＡにおいてｐＨ６．０、６．５及び７．４でそれらの阻害活性について試験した（図５）。このアッセイにおいては、抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴを陽性対照として使用し、Ｆａｂ ２Ａ１１を陰性対照として使用した。ＩＣ５０を曲線から算出し、表８に示した。ｐＨ６での抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ ８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｇ０８及び８Ｂ０６によるＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合の阻害のＩＣ５０は、対照Ｆａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴよりもおよそ３倍しか低くない。ｐＨ６、６．５及び７．４では、抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴは、阻害についてｐＨ選好性を示さない。これは、阻害の明らかなｐＨ依存性を示す本発明のＦａｂとは全く対照的である（図５及び表８）。Ｆａｂ ８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｇ０８及び８Ｂ０６は、ｐＨ６と比較してｐＨ６．５でおよそ３倍低い阻害活性を有し、ｐＨ７．４では殆ど活性を有しない。抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ ８Ｄ０４は、このアッセイによるとＦａｂ ８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｇ０８及び８Ｂ０６よりもおよそ３倍効力が低い。１００ｎＭでは、いずれのＦａｂもｐＨ７．４でＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合を完全に阻害せず、およそ６０％の阻害を有するＦａｂ ８Ａ０４が最良であることに留意することが重要である（図５）。

抗ＰＤ－Ｌ１親和性成熟Ｆａｂを、腫瘍微小環境に似たバッファー（クレブス－ラクテート）中にて細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）においてネイティブＰＤ－Ｌ１に結合するそれらの能力について試験した。この場合も、５つ全ての親和性成熟ＦａｂがｐＨ依存性結合を示した（図６及び表９Ａ）。陽性対照である抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴは、ｐＨ結合選好性を示さなかった。ｐＨ結合選好性は、８倍（Ｆａｂ ８Ｇ０８）及び１１倍（Ｆａｂ ８Ｄ０６）から１００倍超（Ｆａｂ ８Ａ０４、８Ｄ０４及び８Ｂ０６）の範囲であった。全てのＦａｂについて、ｐＨ７．４及び１００ｎＭ Ｆａｂでの全結合（ＭＦＩ）がｐＨ６よりもはるかに低く、飽和に達しなかった。また、ＦａｂをＩｇＧ１にフォーマットし、ｐＨ７．４、６．５及び６．０でのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への結合を調査した（表９Ｂ）。驚くべきことに、ｍＡｂは結合のｐＨ依存性を示さなかった（表９Ｂ）。結合のｐＨ依存性は、フォーマット（Ｆａｂ、単量体結合剤）、ＦａｂのＥＣ５０結合がｍＡｂよりもおよそ１００倍低いことから親和性、及びＣＤＲへのヒスチジン残基の導入に関連している（表１０）。

プロトン関連結合事象は、例えばヘモグロビンにおけるボーア効果（Perutz MF et al. J Mol Biol. 1980;138:649-68）、セリンプロテアーゼ阻害剤のｐＨ依存性結合（Ascenzi P. et al. J Mol Recognit. 1991, 4:113-9）、ｐＨ８から６．７への僅かなｐＨの低下により受容体に対する結合親和性の大きな減少を示すことが報告されているヒトプロラクチン（Kulkarni MV et al. J Biol Chem. 2010;285:38524-33）を含む生物学的調節において重要な役割を果たしている。高度にｐＨ依存性の結合事象は、複数のイオン化可能な残基（例えば、ヒスチジン）を必要とするが、これらは、本明細書に記載の方法論に用いられるスクリーニング法によって首尾よく導入することができる。イミダゾールは、ヒスチジンの側鎖を形成し、そのｐＫ（≒６．０）は生理的ｐＨ範囲内であるのに加え、イミダゾールのプロトン化及び非プロトン化形態は、化学的に非常に異なる。非プロトン化形態が疎水性及び芳香族性を有するのに対し、プロトン化形態は親水性であり、正に帯電している。したがって、化学的相互作用は、ｐＫ前後のｐＨで顕著に異なる。ｐＨ７．０では非プロトン化形態が優勢であり、他の疎水性基との相互作用に有利であり、ｐＨ５．０ではイミダゾール基がプロトン化され、親水性環境が好まれる。

５つの親和性成熟抗ＰＤ－Ｌ１ ＦａｂのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列は、野生型２Ａ０９ Ｆａｂと同じである。ＨＣＤＲ３には１つのＨｉｓ残基しか存在せず、これにより、このクローンの低いｐＨ感度が説明され得る。５つの親和性成熟抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂは、ＣＤＲ１配列に１つ又は２つの付加的なＨｉｓ残基を有し（表１０）、ＶＬ及びＶＨ配列を表１１に示す。

付加的なｐＨ特異性及び親和性は、一部には、ＰＤ－Ｌ１エピトープと相互作用し、「ｐＨスイッチ」を生じることができる、ＬＣＤＲ１に付加的なＨｉｓ残基を有するクローンの選択によるものであり得る。

国際公開第２０１４０５５８９７号によるＡｂ－５２及びＡｂ－５５の評価
国際公開第２０１４０５５８９７号（DANA FARBER CANCER INST INC）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒトモノクローナル抗体を開示している。国際公開第２０１４０５５８９７号に開示されているＡｂ－５２及びＡｂ－５５のＶＬ配列は、配列番号２の配列を含む。これらの抗体を評価し、ｐＨ依存性結合の証拠があるかどうかを確かめた。

方法
Ａｂ－５２及びＡｂ－５５の完全長抗ＰＤ－Ｌ１抗体を国際公開第２０１４０５５８９７号の配列から作製した（国際公開第２０１４０５５８９７号の１６頁を参照されたい）。陽性対照の抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂである２．７Ａ０４ＯＰＴは、国際公開第２０１１０６６３８９号によるものであり（国際公開第２０１１０６６３８９号の７１頁を参照されたい）、陰性対照ｍＡｂ（２Ａ１１）は、抗ＨＥＬ（鶏卵リゾチーム）である。

Ｆａｂを無傷ｍＡｂから市販のキットを用いて作製した。

ＰＤ－Ｌ１中和ＥＬＩＳＡ
ｍＡｂ又はＦａｂ（１００ｎＭ～０．１４ｎＭ）を、１μｇ／ｍｌのＰＤ－１でコーティングした９６ウェルプレートに添加し、１μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１－ビオチンの阻害を測定し、各ｍＡｂ又はＦａｂの中和能を決定した。ＰＤ－Ｌ１－ビオチンとのＰＤ－Ｌ１相互作用を、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを用いて検出した。用いたバッファーは、０．１％カゼイン／クレブス／ラクテート（ｐＨ６．０又はｐＨ７．４）であった。

実施したアッセイの完全な方法論は、本願の実施例のセクションに「異なるｐＨでのＰＤ－Ｌ１へのＥＬＩＳＡ結合」及び「ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１阻害についての抗体のスクリーニング」の見出しで提示されている。

結果
第１の実験（図８）においては、Ａｂ－５２及びＡｂ－５５のＦａｂを、ｐＨ６又はｐＨ７．４でＰＤ－Ｌ１を中和するそれらの能力について本発明の５つのＦａｂ（８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４）のそれぞれに対して比較した。国際公開第２０１１０６６３８９号によるＦａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴを陽性対照として使用した。

陽性対照の比較用ｍＡｂである２．７Ａ０４ＯＰＴは、ｐＨ７．４と比較してｐＨ６でＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合を等しく阻害した。

本発明の５つのＦａｂ（８Ｄ０６、８Ａ０４、８Ｇ０８、８Ｄ０４、８Ｂ０６）は、ｐＨ６でＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合を阻害し、予想されるようにｐＨ７．４では阻害が殆ど観察されなかった。対照的に、Ａｂ－５２及びＡｂ－５５のＦａｂでは、いずれのｐＨでも結合の阻害が観察されなかった。これは、図８において使用される他のＦａｂと比較して低いＦａｂ Ａｂ－５２及びＡｂ－５５の中和の親和性に起因し得る。

この理由から、Ａｂ－５２及びＡｂ－５５ ｍＡｂを第２の実験に用い、それらがｐＨ依存性の中和活性を有するかを決定した（図９）。

本発明のＦａｂの２つ（８Ｇ０８及び８Ｂ０６）をこのアッセイに使用し、この場合もｐＨ６及びｐＨ６．５でｐＨ依存性の中和が示され、ｐＨ７．４では活性は殆ど示されなかった。全く対照的に、ｍＡｂ Ａｂ－５２及びＡｂ－５５は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のｐＨ依存性の中和を示さなかった。このデータは、陽性対照のＦａｂ ２．７Ａ０４ＯＰＴと同等である。

したがって、配列の僅かな重複にもかかわらず、Ａｂ－５２及びＡｂ－５５は、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子の新規の特性を共有しない。具体的には、Ａｂ－５２及びＡｂ－５５は、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子が示す、ｐＨ６．０でｐＨ７．４よりも高いＰＤ－Ｌ１に対する親和性を共有しない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目２）
配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１を含む、項目１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目３）
配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、
及び、
配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３、
並びに／或いは、
配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、
及び、
配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む、
項目１又は２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目４）
配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３、並びに／或いは、
配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む、
項目１～３のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目５）
配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域、
及び／又は、
配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７及び配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、
項目１～４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目６）
配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は、
配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７及び配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
項目１～５のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目７）
（ａ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｂ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｅ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｆ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
からなる群から選択される、項目１～６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目８）
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１５に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１１に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号９に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１３に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１７に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、項目１～７のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目９）
８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体である、項目１～８のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目１０）
前記抗体が６つのＣＤＲ領域全体にわたって１個～１０個、１個～５個又は１個～２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目９に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目１１）
ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、項目１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合分子へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目１２）
ヒトＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１への結合について８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体と競合する抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目１３）
前記抗原結合分子が抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体であり、任意に、該抗体フラグメント又は誘導体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ又はダイアボディである、項目１～１２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目１４）
前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が一価である、項目１３に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
（項目１５）
前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が完全にヒトである、項目１４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
（項目１６）
前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ若しくはＩｇＹ抗体、又はそれらの抗原結合フラグメント若しくは誘導体であり、任意に、前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体がＩｇＧ抗体であり、更に任意に、該ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体がＩｇＧ１抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、項目１３～１５のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合フラグメント若しくは誘導体。
（項目１７）
前記抗体が二重特異性抗体又はその二重特異性抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、項目１６に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗体フラグメント。
（項目１８）
ｐＨに依存してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、項目１～１７のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
（項目１９）
ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有する、項目１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
（項目２０）
７．４のｐＨよりもｐＨ６．０でＰＤ－Ｌ１に対して少なくとも約５倍高い親和性を有する、項目１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
（項目２１）
少なくとも５のｐＨ６．０：７．４結合比を有する、項目１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
（項目２２）
ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値がｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い、項目１～２１のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
（項目２３）
ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで投与した場合に、
ａ．免疫抑制を逆転させ、及び／又は、
ｂ．Ｔ細胞免疫を増強する、
項目１～２２のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
（項目２４）
項目１～２３のいずれか一項に記載の抗原結合分子と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目２５）
付加的な治療的活性剤を更に含むか、又は別の療法若しくは付加的な治療的活性剤と組み合わせて使用される、項目２４に記載の医薬組成物。
（項目２６）
医薬に使用される、項目１～２３のいずれか一項に記載の抗原結合分子又は項目２４若しくは２５に記載の医薬組成物。
（項目２７）
癌の治療又は予防に使用される、項目１～２３のいずれか一項に記載の抗原結合分子又は項目２４若しくは２５に記載の医薬組成物。
（項目２８）
前記癌が黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌からなる群から選択される、項目２７に記載の使用のための抗原結合分子又は医薬組成物。

本発明の実施形態
本発明は少なくとも、番号付きの項目として列挙される以下の実施形態を提供する：
１． 配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
２． 配列番号１６、１２、１０、１４、１８及び２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１を含む、項目１の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３． 配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１を含む、項目１の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
４． 配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、及び、
配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３、及び／又は、
配列番号１６、１２、１０、１４、１８及び２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、
配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む、項目１～３のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
５． 配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ２、及び、
配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＨＣＤＲ３、及び／又は、
配列番号１６、１２、１０、１４、１８及び２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ２、及び、
配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するＶＬＣＤＲ３を含む、項目１～４のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
６． 配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、及び、
配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３、及び／又は、
配列番号１６、１２、１０、１４、１８又は２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む、項目１～５のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
７． 配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は、
配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、項目１～６のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
８． 配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する重鎖可変領域、及び／又は、
配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む、項目１～７のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
９． 配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は、
配列番号１５、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７及び配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１～８のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１０． （ａ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＲＥＴＥＬＳＲＲＬＨＹＶＲ（配列番号１６）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｂ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＶＬＳＰＲＴＨＡＧＨＹＹＲ（配列番号１２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｃ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＩＳＮＤＶＰＡＳＧＨＹＨＲ（配列番号１０）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｄ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＭＲＴＧＴＧＮＫＧＨＹＴＲ（配列番号１４）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｅ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＲＧＴＧＳＳＦＨＨＫＹＶＲ（配列番号１８）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、
（ｆ）アミノ酸配列ＳＹＧＭＹ（配列番号６）を含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＧＡＬＴＨＷＧＶＶＩＧＤＧＭＤＶ（配列番号８）を含むＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号２）を含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＤＤＱＲＰＳ（配列番号３）を含むＶＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＮＶＬＴＴＰＷＴ（配列番号４）を含むＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むか、
又はそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子からなる群から選択される、上記いずれかの項目の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１１． （ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１５に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１１に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号９に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１３に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１７に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号５及び配列番号１に対してそれぞれ少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一のＶＨ及びＶＬ配列からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、上記いずれかの項目の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１２． ８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体である、上記いずれかの項目の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１３． 抗体が６つのＣＤＲ領域全体にわたって１個～１０個、１個～５個又は１個若しくは２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目１２の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１４． 抗体が可変重領域及び可変軽領域の一方又は両方に１個～１０個、１個～５個又は１個若しくは２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目１２の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１５． 抗体がフレームワーク領域に１個～１０個、１個～５個又は１個若しくは２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目１２の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
１６． ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、項目１～１５のいずれか一項の抗原結合分子へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する抗原結合分子。
１７． ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する、項目１６の抗原結合分子。
１８． 項目１～１５のいずれか一項の抗原結合分子が結合するＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子。
１９． ８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体が結合するＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する、項目１８の抗原結合分子。
２０． ヒトＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子であって、エピトープが配列番号１９で構成される、抗原結合分子。
２１． カニクイザルＰＤ－Ｌ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合分子。
２２． ８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９、並びにそれらのフラグメント及び変異体からなる群から選択される、項目２０の抗原結合分子。
２３． ８Ｂ０６である、項目２０の抗原結合分子。
２４． ８Ａ０４である、項目２０の抗原結合分子。
２５． ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１への結合について項目１～１５のいずれか一項の抗原結合分子と競合する抗原結合分子。
２６． ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１への結合について８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体と競合する、項目２５の抗原結合分子。
２７． 指定の配列（単数又は複数）に１個～１０個のアミノ酸置換を含む、項目１～１５のいずれか一項による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
２８． 指定の配列（単数又は複数）に１個～５個のアミノ酸置換を含む、項目２７による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
２９． 指定の配列（単数又は複数）に１個若しくは２個のアミノ酸置換を含む、項目２７による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３０． １個～１０個、１個～５個又は１個若しくは２個のアミノ酸置換が抗原結合分子のＣＤＲ領域（単数又は複数）にある、項目２７～２９のいずれか一項による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３１． １個～１０個、１個～５個又は１個若しくは２個のアミノ酸置換が抗原結合分子の可変領域の一方又は両方にある、項目２７～２９のいずれか一項による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３２． １個～１０個、１個～５個又は１個若しくは２個のアミノ酸置換が抗原結合分子のフレームワーク領域にある、項目２７～２９のいずれか一項による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３３． ８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４、８Ｄ０４、２Ａ０９からなる群から選択される抗体に由来する変異体である、項目２７～２９のいずれか一項による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３４． アミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、項目１３～１５又は２７～２９のいずれか一項による抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３５． 抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、上記いずれかの項目の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３６． 抗原結合抗体フラグメント又は誘導体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ又はダイアボディである、項目３５の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３７． 抗原結合抗体フラグメントがＦａｂである、項目３５の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３８． 抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が一価である、項目３５の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
３９． 抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が完全にヒトである、項目３５の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
４０． ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ若しくはＩｇＹ抗体、又はそれらの抗原結合抗体フラグメント若しくは誘導体である、項目３５～３９のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合抗体フラグメント若しくは誘導体。
４１． 抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、項目３５～３９のいずれか一項の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗体フラグメント。
４２． ＩｇＧ抗体又は抗原結合抗体フラグメント若しくは誘導体が、ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合抗体フラグメント若しくは誘導体である、項目４１の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合抗体フラグメント若しくは誘導体。
４３． 抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子であって、抗体２Ａ０９の親和性成熟突然変異体である、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
４４． 親和性成熟突然変異体が８Ｂ０６、８Ｄ０６、８Ｇ０８、８Ａ０４及び８Ｄ０４からなる群から選択される、項目４３の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
４５． ヒト又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
４６． ｐＨに依存してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
４７． 酸性ｐＨでＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
４８． 約ｐＨ６～約ｐＨ６．５のｐＨでＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
４９． 生理的ｐＨよりも酸性ｐＨでＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５０． 約ｐＨ７．４よりも約ｐＨ６．０でＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５１． 酸性ｐＨが約ｐＨ６．５以下である、項目４９の抗原結合分子。
５２． 生理的ｐＨが約ｐＨ７．４である、項目４９の抗原結合分子。
５３． 約７．４のｐＨよりも約ｐＨ６．０でＰＤ－Ｌ１に対して少なくとも約５倍高い親和性を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５４． ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ６．０で約１５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５５． ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ６．０で約１．４５ｎＭ～約１５ｎＭのＥＣ５０値を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５６． ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ７．４で少なくとも約１０ｎＭのＥＣ５０値を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５７． ＰＤ－Ｌ１に対してｐＨ７．４で約１３．２ｎＭ～約１００ｎＭのＥＣ５０値を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５８． 少なくとも約５のｐＨ６．０：７．４結合比を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
５９． ｐＨ６．０で約１５ｎＭ未満のＰＤ－Ｌ１に対するＥＣ５０値及びｐＨ７．４で少なくとも約１０ｎＭのＰＤ－Ｌ１に対するＥＣ５０値を有し、少なくとも５のｐＨ６．０：７．４結合比を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６０． ＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１の結合、又はＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１発現細胞の結合を阻害する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６１． 結合を少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又は少なくとも約８０％阻害する、項目６０の抗原結合分子。
６２． ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が約ｐＨ６．０よりも約ｐＨ７．４で高い、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６３． 約ｐＨ６．０でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が約１２．１ｎＭ～約４２．３ｎＭである、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６４． 約ｐＨ６．０でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が約５０ｎＭ未満である、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６５． 約ｐＨ７．４でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が約８１．２ｎＭ～約１００ｎＭである、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６６． ｐＨ７．４でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が少なくとも５０ｎＭである、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６７． ｐＨ７．４でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が少なくとも８０ｎＭである、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６８． 少なくとも約２のｐＨ６．０：７．４阻害比を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
６９． ｐＨ６．０でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が約５０ｎＭ未満であり、ｐＨ７．４でのＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値が少なくとも約８０ｎＭであり、抗原結合分子が少なくとも約２のｐＨ６．０：７．４阻害比を有する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
７０． ＰＤ－Ｌ１がヒトＰＤ－Ｌ１又はカニクイザルＰＤ－Ｌ１である、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
７１． ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで投与した場合に免疫抑制を逆転させる、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
７２． ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで投与した場合にＴ細胞免疫を増強する、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
７３． 免疫チェックポイント阻害剤である、上記いずれかの項目の抗原結合分子。
７４． 上記いずれかの項目の抗原結合分子を含み、任意に１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む医薬組成物。
７５． 付加的な治療的活性剤を更に含むか、又は別の療法若しくは付加的な治療的活性剤と組み合わせて使用される、項目７４の医薬組成物。
７６． 他の療法又は付加的な治療的活性剤が放射線療法、化学療法治療、標的療法、免疫療法、モノクローナル抗体療法、ホルモン療法、血管新生阻害、癌ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、後成的修飾、改変Ｔ細胞、Ｔ細胞共刺激アゴニスト、チロシンキナーゼ阻害剤、他の抗癌化学物質、癌療法のための緩和ケア、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、免疫調節剤、免疫賦活剤、及び／又は阻害剤、例えばＩＤＯ阻害剤、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＴＧＦＢ阻害剤、Ｔ細胞共刺激アンタゴニスト、Ｔｒｅｇ阻害剤、マクロファージ調節剤、ナチュラルキラー細胞調節剤、又はケモカイン受容体阻害剤からなる群から選択される、項目７５の医薬組成物。
７７． 化学療法治療がゲムシタビン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンからなる群から選択される、項目７６の医薬組成物。
７８． Ｔ細胞共刺激アゴニストが４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＣＤ７０及びＩＣＯＳからなる群から選択される、項目７６の医薬組成物。
７９． 免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ及びＴＩＧＩＴからなる群のメンバーに作用する、項目７６の医薬組成物。
８０． 他の療法又は付加的な治療的活性剤が別の抗原結合分子である、項目７５の医薬組成物。
８１． 付加的な抗原結合分子が抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子、抗ＰＤ－１抗原結合分子、抗ＣＴＬＡ－４抗原結合分子、抗ＯＸ４０抗原結合分子、抗ＩＣＯＳ抗原結合分子、抗ＧＩＴＲ抗原結合分子からなる群から選択され、任意に、付加的な抗原結合分子が抗体である、項目８０の医薬組成物。
８２． 項目１～７３のいずれか一項の抗原結合分子又は項目７４～８１のいずれか一項による医薬組成物を含み、付加的な治療的活性剤を更に含むキット。
８３． 使用説明書を更に含む、項目８２のキット。
８４． 医薬成分がキット内で別個に配置される、項目８２又は８３のキット。
８５． 付加的な治療的活性剤が免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、免疫調節剤、免疫賦活剤、及び／又は阻害剤、例えばＩＤＯ阻害剤、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＴＧＦＢ阻害剤、Ｔ細胞共刺激アンタゴニスト、Ｔｒｅｇ阻害剤、マクロファージ調節剤、ナチュラルキラー細胞調節剤、又はケモカイン受容体阻害剤からなるリストから選択される、項目８２～８４のいずれかのキット。
８６． 付加的な治療的活性剤が免疫チェックポイント阻害剤である、項目８２～８４のいずれかのキット。
８７． 抗原結合分子又は医薬組成物及び付加的な治療的活性剤が別々、順次又は同時の投与のためのものである、項目８２～８６のいずれかのキット。
８８． 医学に使用される、項目１～７３のいずれか一項の抗原結合分子又は項目７４～８１のいずれか一項の医薬組成物。
８９． 癌の治療又は予防に使用される、項目１～７３のいずれか一項の抗原結合分子又は項目７８～８１のいずれか一項の医薬組成物。
９０． 癌が心臓の肉腫、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、転移性横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺の気管支原性癌、扁平上皮癌、未分化小細胞癌、非小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；消化管：食道の扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃（stomach）の癌、リンパ腫、平滑筋肉腫、頭頸部、胃（gastric）、膵臓の管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ、小腸の腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸の腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫、結腸直腸癌；尿生殖路：腎臓の腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病、膀胱及び尿道の扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、尿路上皮癌、前立腺の腺癌、肉腫、精巣の精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫；肝臓の肝癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋骨の骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜の髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳の星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫；女性生殖器：子宮の子宮内膜癌、子宮頸部の子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部異形成、卵巣の卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌、顆粒膜卵胞膜細胞腫、セルトリ－ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰部の扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣の明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファローピウス管癌、乳癌；血液系：血液の骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキンリンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；並びに副腎：神経芽細胞腫からなる群から選択される、項目８９のような使用のための抗原結合分子又は医薬組成物。
９１． 癌が癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫及び肉腫からなる群から選択される、項目８９又は９０のような使用のための抗原結合分子、親和性成熟突然変異体又は医薬組成物。
９２． 癌が黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌からなる群から選択される、項目８９～９１のいずれか一項の使用のための抗原結合分子又は医薬組成物。
９３． 癌の治療に使用される薬剤の製造における項目１～７３のいずれか一項の抗原結合分子の使用。
９４． 癌が心臓の肉腫、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、転移性横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺の気管支原性癌、扁平上皮癌、未分化小細胞癌、非小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；消化管：食道の扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃の癌、リンパ腫、平滑筋肉腫、頭頸部、胃、膵臓の管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ、小腸の腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸の腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫、結腸直腸癌；尿生殖路：腎臓の腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病、膀胱及び尿道の扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、尿路上皮癌、前立腺の腺癌、肉腫、精巣の精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫；肝臓の肝癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋骨の骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜の髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳の星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫；女性生殖器：子宮の子宮内膜癌、子宮頸部の子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部異形成、卵巣の卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌、顆粒膜卵胞膜細胞腫、セルトリ－ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰部の扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣の明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファローピウス管癌、乳癌；血液系：血液の骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキンリンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；並びに副腎：神経芽細胞腫からなる群から選択される、項目９３による抗原結合分子の使用。
９５． 癌が黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌からなる群から選択される、項目９３による抗原結合分子の使用。
９６． 被験体に項目１～７３のいずれか一項の抗原結合分子又は項目７４～８１のいずれか一項による医薬組成物を投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は障害を治療又は予防する方法。
９７． ＰＤ－Ｌ１媒介性疾患又は障害が癌である、項目９６の方法。
９８． 癌が心臓の肉腫、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、転移性横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺の気管支原性癌、扁平上皮癌、未分化小細胞癌、非小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；消化管：食道の扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃の癌、リンパ腫、平滑筋肉腫、頭頸部、胃、膵臓の管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ、小腸の腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸の腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫、結腸直腸癌；尿生殖路：腎臓の腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病、膀胱及び尿道の扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、尿路上皮癌、前立腺の腺癌、肉腫、精巣の精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫；肝臓の肝癌、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋骨の骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜の髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳の星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫；女性生殖器：子宮の子宮内膜癌、子宮頸部の子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部異形成、卵巣の卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌、顆粒膜卵胞膜細胞腫、セルトリ－ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰部の扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣の明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファローピウス管癌、乳癌；血液系：血液の骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキンリンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；並びに副腎：神経芽細胞腫である、項目９７の治療方法。
９９． 癌が黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌からなる群から選択される、項目９７の治療方法。
１００． ヒトＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１発現細胞と項目１～７３のいずれか一項による抗原結合分子とを接触させることを含む、ＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのヒトＰＤ－Ｌ１の結合、又はＰＤ－１及び／又はＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１発現細胞の結合を阻害する方法。
１０１． ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である、項目１００の方法。
１０２． ｉｎ ｖｉｖｏ方法である、項目１００の方法。
１０３． 項目１～７３のいずれか一項の抗原結合分子をコードする核酸。
１０４． 項目１０３の核酸を含むプラスミド。
１０５． 項目１０３の核酸を含むベクター。
１０６． 項目１０４又は項目１０５によるプラスミド又はベクターを含む宿主細胞。
１０７． 細胞に項目１０４又は１０５によるプラスミド又はベクターをトランスフェクトすることを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を発現する細胞を作製する方法。
１０８． 項目１０６による宿主細胞を細胞培養培地においてプラスミド又はベクターのコード化核酸配列を細胞内で発現させる条件下で培養することを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を作製する方法。
１０９． 抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を細胞培養上清から得ることを更に含む、項目１０８の方法。
１１０． 得られた抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子を１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とともに医薬組成物に配合することを更に含む、項目１０９の方法。

Claims (17)

1. 抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子であって、以下：
   （ａ）重鎖可変（ＶＨ）領域であって、以下：
   （ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨＣＤＲ１）、
   （ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨＣＤＲ２）、
   及び、
   （ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨＣＤＲ３）、
   を含む、ＶＨ領域、
   並びに
   （ｂ）軽鎖可変（ＶＬ）領域であって、以下：
   （ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬＣＤＲ１）、
   （ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬＣＤＲ２）、
   及び、
   （ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬＣＤＲ３）、
   を含む、ＶＬ領域、
   を含み、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有する、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
2. 前記ＶＨ領域が、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   前記ＶＬ領域が、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
   請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
3. 前記ＶＨ領域が、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、
   請求項１又は２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
4. 前記ＶＨ領域が、配列番号５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
5. 前記抗原結合分子が、抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体であり、そして、該抗体フラグメント又は誘導体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ又はダイアボディである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
6. 前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が、一価である、請求項５に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
7. 前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が完全にヒトのものである、請求項５または６に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
8. 前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ若しくはＩｇＹ抗体、又はそれらの抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、請求項５～７のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
9. 前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、請求項８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
10. 前記ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が、ＩｇＧ１抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項９に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
11. 前記抗体又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体が、二重特異性抗体又はその二重特異性抗原結合フラグメント若しくは誘導体である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
12. ７．４のｐＨよりもｐＨ６．０でＰＤ－Ｌ１に対して少なくとも５倍高い親和性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
13. 少なくとも５のｐＨ６．０：７．４結合比を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
14. ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合のＩＣ５０阻害値がｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合分子と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
16. 付加的な治療的活性剤を更に含むか、又は別の療法若しくは付加的な治療的活性剤と組み合わせて使用される、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 癌の治療又は予防のための、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物であって、ここで、前記癌が黒色腫、転移性癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌及び膀胱癌からなる群から選択される、医薬組成物。

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