JP7656889B2

JP7656889B2 - 新規リンゴ酸脱水素酵素

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Publication number: JP7656889B2
Application number: JP2020189657A
Authority: JP
Inventors: 恒裕水島; 和也西尾; 周森山
Original assignee: University of Hyogo
Current assignee: University of Hyogo
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2025-04-04
Anticipated expiration: 2040-11-13
Also published as: JP2021078496A

Description

本願は新規リンゴ酸脱水素酵素に関する。

リンゴ酸脱水素酵素(MDH)は、NAD^＋またはNADH存在下でリンゴ酸とオキサロ酢酸を可逆的に変換する。NAD^＋とNADHはそれぞれ異なる波長のUVに吸収ピークを持つことから、MDHの酵素反応は分光光度計により容易に検出できる。そのため、心臓や肝機能の障害を調べる、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)量の検査薬にはMDHが用いられている。これは検体中に存在するASTにより生成されたオキサロ酢酸がMDHによりリンゴ酸に変換される際のNADHとNAD^＋の変換を吸光度変化により検出するものであり、本検出方法はMDH-UV法と呼ばれている。また、AST検査薬に含まれるMDHの活性や安定性は検査薬の品質に関係することから、安定な好熱菌由来MDHや高活性化変異体の研究が行われている（特許文献１、非特許文献１）。

MDHは、真核生物ではTCA回路や植物や酵母に存在するグリオキシル酸回路で働くことが知られており、出芽酵母では3種類のアイソザイム(MDH1～3)が報告されている。出芽酵母において、MDH1はミトコンドリアに、MDH2はサイトゾルに、MDH3はグリオキシソームに局在しており、MDH1はTCA回路、MDH2はグリオキシル酸回路で機能している。一方、MDH3は、脂肪酸のβ－酸化において必要なNADHをNAD⁺に再酸化する役割を担っており、MDH1やMDH2と比較してオキサロ酢酸に対する親和性が低いことが知られている（非特許文献２）。これまでに、サイトゾルやミトコンドリアに局在するMDHでは補酵素や基質との複合体構造が数多く決定され、その反応機構が明らかにされているのに対し（非特許文献３～５）、グリオキシソーム局在のMDHではWatermelon由来MDHのApo型とクエン酸結合型の構造が報告されているだけであった。

特表2013-503631

Nishiyama M et al., Biochem Biophys Res Commun. 1996 Aug 23; 225(3); 844-848 Steffan JS, McAlister-Henn L. J Biol Chem. 1992 Dec 5(34): 267 P. Minarik, N.Tomaskova, Gen Physiol Biophys. 2002 Sep; 21(3): 257-65. Goward CR, Nicholls DJ. Protein Sci. 1994 Oct; 3(10): 1883-8. Bell JK et al., J Biol Chem. 2001 Aug 17; 276(33): 31156-62 Moriyama S, Nishio K and Mizushima T, Acta Cryst. 2018; F74: 617-624

本願は、リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法により得られるリンゴ酸脱水素酵素を提供することを目的とする。

リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法を見出し、本願発明を完成した。本願にて提供される方法は、特定のリンゴ酸脱水素酵素に限らず、多様なリンゴ酸脱水素酵素の高活性化変異体を作製するために利用することができる。すなわち本願は、リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法により得られるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。

出芽酵母MDH1およびMDH2と比較して、出芽酵母MDH3はオキサロ酢酸に対する親和性が低いことが知られている。本願発明者らは、出芽酵母MDH2およびMDH3のリンゴ酸脱水素酵素活性を測定した結果、MDH3がMDH2と比較して非常に高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有することを明らかにした（参考例１、図２参照）。

一般にMDHは、オキサロ酢酸、リンゴ酸、それらに類似したジカルボン酸分子が結合することにより、活性中心ループがオープン状態からクローズ状態となることが報告されている（非特許文献４）。出芽酵母MDH3の活性中心ループはアミノ酸残基Val79-Phe90で構成されており、Arg86-Phe91はαヘリックス構造を形成している。本願発明者らは、出芽酵母MDH3のApo formとNAD^＋/OAA結合状態の構造を決定し、両者を比較したが、活性中心の構造変化は確認できなかった。すなわち出芽酵母MDH3においては活性中心ループがオープン状態のままであることが確認された。

出芽酵母MDH1および2と、出芽酵母MDH3の活性中心ループの配列を比較し、MDH1およびMDH2で保存されているがMDH3においてのみ保存されていない部位として、MDH3のL84（MDH2のM110）を、活性中心ループの構造変化のヒンジに位置し、アミノ酸の相同性が低く、L84と側鎖が近く接触の可能性が予想される部位として、MDH3のM92（MDH2のV118）を同定した。出芽酵母MDH2およびMDH3において、これらの部位を他方の対応するアミノ酸残基に変異させた変異体を作製し、リンゴ酸脱水素酵素活性への影響を検討した。

出芽酵母MDH3 L84M変異体およびMDH3 L84M/M92V変異体の活性を測定した（参考例２、図３参照）。2種類のMDH3変異体の活性は野生型MDH3よりも低く、野生型MDH2の活性に類似していた。次に、出芽酵母MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体の活性を測定した（実施例１、図４参照）。2種類のMDH2変異体の活性は野生型MDH2よりも高く、野生型MDH3の活性に類似していた。

これらの結果から、出芽酵母MDH2およびMDH3において、上記2つの部位を相互に置換することで他方に類似したリンゴ酸脱水素酵素活性を示すことが分かった。MDH2のM110に対応するアミノ酸は、出芽酵母MDH3を除く非常に多くの種でメチオニンに保存されている。したがって、多様なリンゴ酸脱水素酵素において、該メチオニンをロイシンなどの疎水性アミノ酸に置換することにより高活性化MDHを作製できると予想された。

出芽酵母MDHにおいて同定された2つの残基の性質が出芽酵母以外の種にも保存されているかを明らかにするため、出芽酵母MDH3とのアミノ酸相同性がそれぞれ約25％、約29％および約25％と低いサーモプラズマ・アシッドフィラム（Thermoplasma acidophilum；TA）のMDH(TA-MDH；aa1-325)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus；GS）のMDH(GS-MDH；aa1-312)およびサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus；TT）のMDH(TT-MDH；aa1-327)を用いた。まず、出芽酵母MDH3のL84およびM92に対応するTA-MDHのM92およびK100に変異を導入したTA-MDH M92L/K100M変異体の活性を測定した（実施例２、図５参照）。その結果、TA-MDH M92L/K100M変異体は野生型TA-MDHと比較して2倍以上も高いリンゴ酸脱水素酵素活性を示した。同様に、出芽酵母MDH3のL84およびM92に対応するGS-MDHのM91およびT99に変異を導入したGS-MDH M91L/T99M変異体の活性を測定した（実施例３、図６参照）。その結果、GS-MDH M91L/T99M変異体は野生型GS-MDHと比較して2倍以上も高いリンゴ酸脱水素酵素活性を示した。さらに、出芽酵母MDH3のL84およびM92に対応するTT-MDHのM96およびV104に変異を導入したTT-MDH M96L/V104M変異体の活性を測定した（実施例４、図７参照）。その結果、TT-MDH M96L/V104M変異体は野生型TT-MDHと比較して2倍以上も高いリンゴ酸脱水素酵素活性を示した。以上から、多様なMDHにおいて保存されているメチオニンをロイシンなどの疎水性アミノ酸に変異することにより高活性化MDHを作製できることが示された。

すなわち、本願は以下の発明を包含する。
ある態様において、本願は、
活性中心ループにアミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GX₅X₆RX₇DLX₈（ここで、X₁はV、M、L、IまたはA、X₂はPまたはA、X₃はKまたはR、X₄はP、E、DまたはA、X₅はメチオニン以外の疎水性アミノ酸、X₆はT、E、DまたはS、X₇はD、K、SまたはR、X₈はF、LまたはVである）を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X₅がメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、かつ
配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が90％以下であるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。

別の態様において、本願は、
（１）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列、但し配列中Xaaはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である；
（２）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列において、活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されており、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列：または
（３）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、活性中心ループのアミノ酸配列が同一であり、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列のいずれかを含み、
Xaaがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素より高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素を提供する。

本願は、リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法により得られるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。

各種のリンゴ酸脱水素酵素（MDH）の活性中心ループのアミノ酸配列比較。MDH3、出芽酵母MDH3；Cl_gMDH、Citrullus lanatusのグリオキシソームに局在するMDH；MDH1、出芽酵母MDH1；Cl_mMDH、Citrullus lanatusのミトコンドリアに局在するMDH；Hs_mMDH、ヒトのミトコンドリアに局在するMDH（ヒトMDH2）；Ss_mMDH、Sus scrofaのミトコンドリアに局在するMDH（ブタMDH2）；MDH2、出芽酵母MDH2；Hs_cMDH、ヒトのサイトゾルに局在するMDH（ヒトMDH1）；Ss_cMDH、Sus scrofaのサイトゾルに局在するMDH（ブタMDH1）；Ec_MDH、大腸菌MDH。出芽酵母の野生型MDH2およびMDH3の活性測定の結果。横軸は試料中のOAA濃度、縦軸はΔO.D./minである。エラーバーは標準偏差（±S.D）を示す。出芽酵母MDH3変異体の活性測定の結果。2種類のMDH3変異体の活性は、野生型MDH3よりも低く、野生型MDH2の活性に類似している。横軸は試料中のOAA濃度、縦軸はΔO.D./minである。エラーバーは標準偏差（±S.D）を示す。出芽酵母MDH2変異体の活性測定の結果。2種類のMDH2変異体の活性は、野生型MDH2よりも高く、野生型MDH3の活性に類似している。横軸は試料中のOAA濃度、縦軸はΔO.D./minである。エラーバーは標準偏差（±S.D）を示す。野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の活性測定の結果。TA-MDH変異体の活性は野生型MDHよりも2倍以上高い。横軸は試料中のOAA濃度、縦軸はΔO.D./minである。エラーバーは標準偏差（±S.D）を示す。野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の活性測定の結果。GS-MDH変異体のV_max(ΔO.D./min)は野生型MDHよりも4倍高い。横軸は試料中のOAA濃度、縦軸はΔO.D./minである。エラーバーは標準偏差（±S.D）を示す。野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の活性測定の結果。TT-MDH変異体のV_max(ΔO.D./min)は野生型MDHよりも4倍以上高い。横軸は試料中のOAA濃度、縦軸はΔO.D./minである。エラーバーは標準偏差（±S.D）を示す。

本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約20」は「18～22」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば「約20～30」は「18～33」を含むものとする。

本開示において、アミノ酸残基は以下の略号で表される。
AlaまたはA：アラニン
ArgまたはR：アルギニン
AsnまたはN：アスパラギン
AspまたはD：アスパラギン酸
CysまたはC：システイン
GlnまたはQ：グルタミン
GluまたはE：グルタミン酸
GlyまたはG：グリシン
HisまたはH：ヒスチジン
IleまたはI：イソロイシン
LeuまたはL：ロイシン
LysまたはK：リジン
MetまたはM：メチオニン
PheまたはF：フェニルアラニン
ProまたはP：プロリン
SerまたはS：セリン
ThrまたはT：スレオニン
TrpまたはW：トリプトファン
TyrまたはY：チロシン
ValまたはV：バリン

本開示において、あるアミノ酸配列を「含む」とは、そのアミノ酸配列のN末端および／またはC末端に1以上のアミノ酸残基が付加されていてもよいことを意味する。例えば、「配列番号Ｘのアミノ酸配列を含むペプチド」には、配列番号Ｘのアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号Ｘのアミノ酸配列のN末端および／またはC末端に1以上のアミノ酸残基が付加されているペプチドが包含される。

リンゴ酸脱水素酵素
本願において、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）は、酵素分類においてEC1.1.1.37に分類され、NAD^＋またはNADHの存在下でリンゴ酸とオキサロ酢酸の相互変換を触媒する酸化還元酵素を意味する。出芽酵母MDH3および出芽酵母MDH2のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。サーモプラズマ・アシッドフィラム（Thermoplasma acidophilum；TA）のMDH(TA-MDH；aa1-325)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus；GS）のMDH(GS-MDH；aa1-312)およびサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus；TT）のMDH(TT-MDH；aa1-327)のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３、１１および１２に示す。

活性中心ループにアミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GMX₆RX₇DLX₈（ここで、X₁はV、M、L、IまたはA、X₂はPまたはA、X₃はKまたはR、X₄はP、E、DまたはA、X₆はT、E、DまたはS、X₇はD、K、SまたはR、X₈はF、LまたはVである）、あるいはこれと類似する配列を有するMDHは、以下のUniprotの登録番号に記載のものが例示される：P58407、B7VID0、B2SMP6、Q5WU94、P17783、Q1QQR2、Q82WB9、B4F2A1、Q1Q932、Q8ZVB2、A1SRP8、Q0BAF9、B5ZSS0、Q9EYJ6、A1KI28、A3MBR2、Q0S365、A3P7Q9、C1B155、Q2J3G8、B9KNB4、A1W9K7、Q42972、B5R0N2、A4FFX3、B5BGR3、Q0HZ38、Q46YU4、B8CSY7、Q8CQ25、C1CY73、A0A0S3QTC6、A1TP96、B1JMK1、B2IG85、B1Y8A3、Q6ZZC6、Q3AS98、B3PHI3、B0T6C1、Q8TSH7、Q9LKA3、Q5NVR2、Q9SML8、Q92IA0、B4TJT3、B2FQL8、A8GRV2、O67581、Q67LB8、P61891、P10584、A7MWD3、C5BF98、Q5NYA9、Q74D53、Q64P62、Q3SVK5、B3Q761、B7UJW8、Q6F7X1、B3CM44、Q7CWK7、B9JCF5、Q87E35、B4U831、A9VJQ4、Q6MAA3、A4SWW0、Q32BA3、Q5SKV7、Q5HBC0、A8ILC6、Q72ZE5、Q4QL89、A6TEQ3、Q6FYD0、A1WV94、Q11CV9、P80039、B3QPY9、Q8EPE2、A1R2B5、P37226、Q3IZ83、Q11QQ3、A9KFT9、Q9FSF0、B7M0U8、A4WF48、B2K2N5、Q8PC25、Q7VFV4、Q9K849、Q2L068、P61975、Q0I491、Q13DR6、B7NKU9、Q5U907、P61889、Q8YJE7、Q6D9D1、A4WNM7、A5UPY6、B7N0M1、Q7MP97、Q73G44、Q1R6A3、A4SIV0、B2SH29、P25077、A4J5N8、Q9ZP05、A7IBL9、Q5WEG2、Q8A0W0、Q7VW97、Q65G89、A0L113、Q59202、Q5R030、A8FG47、C0RFH2、A0PVV1、B3EEE5、B5REV7、Q07YA5、A8LJK6、Q14IT0、B0TCL9、Q89X59、Q97VN4、B8EB55、A9NDV1、Q8PVJ7、Q47C34、Q9K3J3、Q704B2、B7MBZ7、B7LHU4、P61892、Q0BXA0、B5XSQ7、B0BXA8、Q68WZ8、A5G320、B1XHK9、Q0HEW2、P61890、A5FHP3、A4TRK3、A9R584、Q5KWB7、C6E487、Q7VP41、A8G8Y7、Q47VL0、P11386、Q0AFK6、A1SMP3、Q3J7E7、A3PN14、Q6A6Z5、Q3ZZJ7、Q6G1M0、Q051U6、Q255I4、B9MBP0、Q87SU7、B7NDL4、Q7M9A7、Q5PAV3、Q5H496、Q1CEJ3、A1UQV8、Q57AX1、B8GVT2、Q2T7J2、P19446、B3R570、Q83Q04、B1I3T1、Q5X2T6、B0SN74、Q84FY8、Q9PK18、C3M9U0、Q9PE17、P61973、B1ZG93、A9M8R3、Q3B2R4、B3EP06、P50917、B2HRH5、Q3JKE9、A3NM97、Q169U9、Q8Z3E0、A5FS18、A3QB91、Q3Z9A4、O02640、B0CIT1、B2JQD2、P93819、O88989、A6WXE7、Q7MYW9、Q3IFH4、A0QCI6、B1K394、B3PQ91、A1RS58、B2U705、Q393V1、A9AMD5、A2S105、Q62AG8、A1UZ10、P80536、Q13S42、Q7X3X5、Q6L0C3、Q15YH0、A3MWU9、A0AZ43、O33525、C1AMN4、Q7UNC6、B6IYP5、Q2YAQ4、B2T9P8、Q8XXW5、A5WGM2、Q5LXE1、Q8YP78、Q9CN86、Q6AW21、A1VRQ1、Q126N9、A9MNX5、C0PZQ4、Q83C87、Q1LKG0、B1W3N4、C5BU70、Q30RQ5、B8GPC3、B9KZS7、Q2GCH6、Q21K60、Q07UX5、B2J5F8、A7HT37、Q3A5S0、A7NG29、C6DKH1、A8GWI0、A1S3C4、Q7WS85、Q0T052、A0KG16、A9IZV5、B0B7U5、P40926、P40925、Q6PAB3、Q0K8F5、B1KGG7、Q0TCN0、A0Q6K3、B7HFA6、B2GKC8、Q65T37、Q5YTI1、C3PN92、A0LFF8、Q979N9、C5CSI5、A8A545、Q8DEC2、Q2P736、C0R4Y0、B0TZT2、P0C7R5、Q3BWU8、C1EUT6、A0RJJ0、A9W386、B1LZN1、B2S881、P9WK12、A6Q388、A8GN82、B0TUH8、A8FRU0、Q47TT4、A7NC13、Q0VQ52、Q2GK85、O08349、A1K5Q9、A4YAE8、A7MNR3、B2UKY5、B7LRL0、C3L8X1、B7GGT8、B5EIU8、B9J092、Q54D04、P08249、B9LLP6、Q9HJL5、B5YSW2、Q9X4K8、A4IRP9、A0L5T9、Q60B71、Q0AKT3、A8MAC1、Q7YRU4、B4TWK9、Q2S289、B0VQX5、B1IQP3、B1LGK2、Q5GT41、Q2GGI2、Q0RE66、A4G5Z9、P80458、B3QSH8、Q9Y7R8、P0C890、P48364、Q1BM38、Q4FQU7、B4EFB0、Q2K3E9、Q98EC4、P0A5J7、A3D075、Q31WA4、P17505、A3M928、A3N1U6、B9JTS9、Q25QU7、P44427、B0BC10、Q5ZME2、Q2IK16、Q43744、A1RFX8、B2VGW7、B9KIH0、A7FMU2、A8EUE8、A5G3L2、B0UUR6、Q817F9、Q5L5E3、B8GDA2、B7KVX2、A8EZ58、Q2RV34、C4K2E2、A9L340、B2U1U9、Q5HR46、Q1GQY3、Q9ZF99、A7GTN7、A5IEF4、Q04RS5、A5E935、Q1AWH4、Q82HS2、A9BVK0、Q0ABE6、Q3MDN9、B7JRW5、P49814、Q46BQ2、A9N855、Q6AQI3、O82399、B0BQN0、A1AGC9、B6I1V4、Q8PNP8、Q2A3K7、Q8GNM0、Q39VY0、Q28U77、A9IIS3、Q57JA9、B4SLI5、B9DK67、A8H0U0、Q1IWC9、B7GW58、A1WR02、C4ZSX4、B3H269、Q6HCU0、C1DB66、Q2G946、A9A450、A6L903、Q4FP28、P46488、Q7NZ60、P14152、Q9ZDF3、Q2T4T8、K0J107、A6WSM1、Q3YX11、P82177、Q49VN8、B0V6R7、P61977、B2HZ52、Q9KUT3、B7IJZ0、B7HRN2、Q9Z6N1、O84381、P57106、A5VSQ4、Q8FYF4、Q6AW23、B4SFQ8、B1XV63、B4S9F1、Q5E875、B2I8M1、B0SF41、Q2W064、Q7WD94、A2SHT9、Q2YLR9、B8EM38、P46487、B5FGF5、B0U5Q1、B6EL39、B0RU49、B3E9R5、A7Z7J8、A6SY47、Q633K5、A8AQC8、P83778、Q4R568、Q7W5Q8、B8IJB4、B0UCF0、Q9A2B1、A1T9L9、Q822E9、P61976、Q2IIC2、Q54VM2、Q7XDC8、Q9SN86、A1JIV0、Q5L8Z8、B8F5K4、A4YKC5、Q1RIT9、B5FIT7、B5F7L9、B4T769、Q12R11、A5V5U9、A6UDP3、Q4URH2、Q1CBY7、A5UCQ1、C3PAI1、P9WK13、O67655、A4SFT4、P83373、Q9RXI8、Q55383、A7ZSD0、B7I9D2、Q5FGT9、Q3YS64、Q2J7E7、A4IY35、C5D654、Q6HSF4、B9M1D2、Q7NHJ3、A5UIX3、Q5ZT13、Q8F4A2、A5U1T8、P80040、O24047、Q21XH1、Q21CW7、P37228、P00346、A1BHN9、Q9ZP06、F1C7I4、Q04820、Q43743、Q42686、O48905、Q9FJU0、P11708、P04636、Q6DIY9、P22133、Q08062、B6J7Q0、B6IZN7、Q3T145、A4JKE6、Q9XFW3、A4JM71、Q32LG3、およびQ54GE6。

本願のリンゴ酸脱水素酵素
本願は、活性中心ループにアミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GX₅X₆RX₇DLX₈（ここで、X₁はV、M、L、IまたはA、X₂はPまたはA、X₃はKまたはR、X₄はP、E、DまたはA、X₅はメチオニン以外の疎水性アミノ酸、X₆はT、E、DまたはS、X₇はD、K、SまたはR、X₈はF、LまたはVである）を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X₅がメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、かつ
配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が90％以下であるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。

本願のMDHは、活性中心ループにアミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GX₅X₆RX₇DLX₈を有する。活性中心ループとは、MDHの活性部位に存在するループ構造を意味し、配列番号２の104位～116位に相当するアミノ酸配列である。すなわち、本願のMDHは、配列番号２の104位～116位に相当するアミノ酸配列において、アミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GX₅X₆RX₇DLX₈を有する。

本明細書において、あるアミノ酸配列の所定の位置に「相当する位置」とは、あるアミノ酸配列と他のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、あるアミノ酸配列の所定の位置に相当する他のアミノ酸配列の位置を意味する。アラインメントは、例えば公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して実施できる。具体的な遺伝子解析ソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASIS、ゼネティックス製のGENETYX、DDBJが公開しているFASTA、BLAST、ClustalWなどが挙げられる。

アミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GX₅X₆RX₇DLX₈は、X₁がV、M、L、IまたはA、X₂がPまたはA、X₃がKまたはR、X₄がP、E、DまたはA、X₅がメチオニン以外の疎水性アミノ酸、X₆がT、E、DまたはS、X₇がD、K、SまたはR、X₈がF、LまたはVである限り、特に限定されない。「疎水性アミノ酸」とは、疎水性側鎖を持つアミノ酸を意味し、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンなどが含まれる。ある実施態様において、メチオニン以外の疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり得、例えばロイシンである。

本願のMDHは、上記のUniprotの登録番号で示されるMDHにおいて、配列番号２の110位に相当するメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸に置換し、必要に応じて他のアミノ酸残基を本願で特定される範囲のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。好ましくは、活性中心ループにアミノ酸配列X₁X₂RX₃X₄GMX₆RX₇DLX₈を有するMDHのGとX₆の間のメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸に置換したMDHである。より好ましくは、活性中心ループにVPRKPGXTRDDLF（配列番号４）、MPRREGXERKDLL（配列番号５）、MPRRDGXERKDLL（配列番号６）、VARKPGXDRSDLF（配列番号７）、LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）（ここで、各配列のXはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である）を有するMDHであり得、例えばVPRKPGXTRDDLF（配列番号４）、MPRRDGXERKDLL（配列番号６）、LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）を有するMDHである。ここで、配列番号４は、出芽酵母MDH1、出芽酵母MDH2、ヒトMDH2およびブタMDH2の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号５は、ヒトMDH1の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号６は、ブタMDH1の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号７は、大腸菌MDHの活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号８は、好熱菌サーモプラズマ・アシッドフィラムのMDH（TA-MDH）の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号１３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのMDH（GS-MDH）の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号１４は、サーマス・サーモフィルスのMDH（TT-MDH）の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。

ある実施態様において、本願のMDHは、配列番号２のアミノ酸配列の118位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンであってもよい。

また、本願のMDHは、活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X₅またはXがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する。リンゴ酸脱水素酵素活性は、例えばオキサロ酢酸（OAA）またはリンゴ酸が酵素1mg、1分間あたり何μmol生産または消費されるかを示す比活性(unit/mg)(unit=μmol/min)により定義される。例えば、本願のMDHは、活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X₅またはXがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して、約1.2倍以上、約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、または約4倍以上高いリンゴ酸脱水素酵素の比活性を有する。リンゴ酸脱水素酵素活性はまた、例えば定められた条件下で毎分基質1μmolの変化を触媒する酵素量を1単位とするunitにより定義される。例えば、本願のMDHは、活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X₅またはXがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して、約1.2倍以上、約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、または約4倍以上高いリンゴ酸脱水素酵素のunitを有する。

リンゴ酸脱水素酵素活性を測定する方法としては、公知の方法が使用できる。例えば、MDHおよび基質であるオキサロ酢酸を含む溶液にNADHを添加し、NADHの減少速度を測定することにより酵素活性を測定してもよい。NADHの減少速度は、例えばNADHの吸収波長である340nmの吸光度を分光光度計などを用いてモニターすることにより測定できる。また、NADHの減少速度は、NADHとNAD^＋の蛍光の差に基づき蛍光法（例えば励起波長340nm、蛍光波長460nm）により測定することもできる。

さらに、本願のMDHは、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が98％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、または55％以下であり得、例えば90％以下である。

本明細書における、核酸配列またはアミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態に（一致が最大となる状態に）アラインメントされた2つの配列間で一致する塩基またはアミノ酸残基の割合を意味する。ここで、比較対象の配列は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。

具体的なリンゴ酸脱水素酵素の例として本願は、
（１）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列、但し配列中Xaaはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である；
（２）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列において、活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されており、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列：または
（３）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、活性中心ループのアミノ酸配列が同一であり、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列のいずれかを含み、
Xaaがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素より高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素を提供する。

配列番号９は、出芽酵母MDH2のアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。配列番号１０はTA-MDHのアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。配列番号１５はGS-MDHのアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。配列番号１６はTT-MDHのアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。

ある態様において、本願のMDHは、（１）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列（但し配列中Xaaはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である）を含み得る。

別の態様において、本願のMDHは、（２）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列において、活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～10個、1～15個、1～20個、1～25個、1～30個、1～40個または1～50個、例えば1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されており、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を含み得る。

さらに別の態様において、本願のMDHは、（３）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％、例えば少なくとも90％の配列同一性を有し、活性中心ループのアミノ酸配列が同一であり、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を含み得る。

これらの態様のMDHは、配列番号９の110位に相当するアミノ酸（Xaa）がメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHより高いリンゴ酸脱水素活性を有する。例えば、Xaaがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して、約1.2倍以上、約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、または約4倍以上高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する。リンゴ酸脱水素酵素活性を測定する方法は上述の通りである。

本願のリンゴ酸脱水素酵素の作製方法
本願のMDHは、例えば本願のMDHのアミノ酸配列をコードするDNAを調製し、これを発現ベクターに連結し、発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、異種あるいは同種タンパク質として生産し、単離および精製することで製造できる。

本願のMDHをコードするDNAの調製方法としては、従来公知の手法を用いることができる。例えば、遺伝子合成により目的のアミノ酸配列をコードするDNAを全合成する方法、上述の多様な種由来の野生型MDHをコードするDNAに対して、部位特異的変異導入法により所定の部位に変異を導入する方法等が挙げられる。部位特異的変異導入法としては、従来公知の手法を用いることができ、例えばインバースPCR法が使用できる。インバースPCR法を使用する場合、市販のキットを用いてもよく、例えばKOD-Plus-Mutagenesis Kit、Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England BioLabs)およびQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent)などが使用できる。

本願のMDHをコードするDNAを、制限酵素およびDNAリガーゼを用いて、適切な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより、該DNAを含む発現ベクターを製造できる。

発現ベクターとしては、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ファージDNA（ラムダファージなど）、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV40の誘導体などが挙げられるが、宿主細胞において複製および生存可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。例えば、宿主が大腸菌である場合、pET、pCold、pUC、pBADなどを例示することができる。

プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合、lacプロモーター、T7プロモーター、Trpプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどが挙げられる。

本明細書において、宿主は、上記発現ベクターを導入することにより目的のMDHを発現できる限り、特に限定されない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。

細菌を宿主とする場合、宿主は例えば大腸菌である。大腸菌としては、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるBL21株、JM109株、XL1-Blue株などを挙げることができる。これら菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ATCC）などから容易に入手可能である。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属、トルロプシス属、またはピキア属等が使用できる。例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

目的とするリンゴ酸脱水素酵素が細胞外に排出される場合には培地から直接に、また細胞内に存在する場合には、超音波破砕や機械的破砕などの物理的手段もしくは細胞溶解剤などの化学的手段によって細胞を破壊した後にリンゴ酸脱水素酵素を精製する。具体的には、リンゴ酸脱水素酵素は、組換え細胞の培地から、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール(PEG)もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動などの技術を組み合わせて、部分的にまたは完全に精製することができる。

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定用組成物
本願はまた、本願のリンゴ酸脱水素酵素を含むアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）測定用組成物を提供する。

ASTはα－ケトグルタール酸のα－ケト基とL－アスパラギン酸のアミノ基の転移反応を触媒して、オキサロ酢酸とグルタミン酸を生成する。この反応に共役して、MDHは生成したオキサロ酢酸の存在下でNADHをNADに変換する。この時のNADHの減少速度を測定することにより、AST活性値を算出することができる。NADHの減少速度を測定する方法は上述の通りである。

本願のAST測定用組成物は、本願のMDHを含み、測定試料中のASTの量を測定するために使用される組成物である。測定試料はASTを含む限り特に限定されないが、例えば血漿または血清などの生体試料である。

本願のAST測定用組成物において、本願のMDHの濃度はASTを測定できる限り特に限定されないが、例えば測定時において0.1U/mL～100U/mL、1U/mL～10U/mL、または1U/mL～5U/mLである。

本願のAST測定用組成物は、本願のMDHに加えて反応の基質としてα－ケトグルタール酸、アスパラギン酸およびNADHを含んでいてもよい。各基質の濃度はASTを測定できる限り特に限定されない。

本願のAST測定用組成物はさらに、緩衝剤、保存剤、pH調整剤および／または抗酸化剤などを含んでいてもよい。緩衝剤としては公知の緩衝剤が使用できるが、例えば、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。

以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。

［材料と方法］
野生型MDH3およびMDH3変異体の作製
His-SUMO1-MDH3 cDNA、His-SUMO1-MDH3 L84M cDNAまたはHis-SUMO1-MDH3 L84M/M92V cDNAをpColdベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。37℃で培養を行い、600nmでの吸光度（OD600）が0.5～0.6に達した際にisopropyl β-d-1 thiogalactopyranoside（IPTG）を終濃度0.1mMとなるように添加し、MDH3遺伝子の発現を誘導した。その後、16℃でさらに24時間インキュベートした。

5053gで15分間遠心分離することにより細胞を回収し、溶解用緩衝液（20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl）に再懸濁し、超音波破砕により溶解させた。細胞溶解液をNi²⁺ Sepharoseカラム（GE Healthcare）に添加し、結合したタンパク質を溶出用緩衝液（300mM imidazole、500mM NaCl、20mM Tris-HCl pH7.5）を用いてカラムから溶出した。ユビキチン様特異的プロテアーゼ（Ulp1）を添加して4℃で一晩インキュベートすることにより、タグを切断した。ゲル濾過用緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、150mM NaCl）を満たしたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。

野生型MDH2の作製
GST-MDH2 cDNAをpet28aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った。

細胞溶解液をGlutathione Sepharose 4Bカラム（GE Healthcare）に添加し、結合したタンパク質を溶出用緩衝液（20mM glutathione、50mM Tris-HCl pH7.5）を用いてカラムから溶出した。3C proteaseを添加して4℃で一晩インキュベートすることにより、GSTタグを切断した。試料を再度Glutathione Sepharoseカラムに吸着させ、非吸着画分を回収することにより試料をさらに精製した。

MDH2変異体の作製
His-SUMO1-MDH2 M110L cDNAまたはHis-SUMO1-MDH2 M110L/V1184M cDNAをpColdベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、HiLoad Superdex 75カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーまでを行い、MDH2変異体を精製した。

その後、HiTrap QHP(GE Healthcare)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料をさらに精製した。緩衝液A（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol）および緩衝液B（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、2M NaCl）を用いた直線濃度勾配条件で溶出を行った。

野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の作製
His-SUMO1-TA-MDH cDNAまたはHis-SUMO1-TA-MDH M92L/K100M cDNAをpet28aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、Ni²⁺ Sepharoseカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーまでを行った。ユビキチン様特異的プロテアーゼ（Ulp1）を添加して4℃で一晩インキュベートすることにより、タグを切断した。その後、HiTrap QHP(GE Healthcare)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料をさらに精製した。緩衝液A（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol）および緩衝液B（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、2M NaCl）を用いた直線濃度勾配条件で溶出を行った。

野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の作製
GS-MDH cDNAまたはGS-MDH M91L/T99M cDNAをpet21aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、70℃で約10分熱処理を行った。その後、ゲル濾過用緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、150mM NaCl）を満たしたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。

野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の作製
TT-MDH cDNAまたはTT-MDH M96L/V104M cDNAをpet21aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、70℃で約10分熱処理を行った。その後、ゲル濾過用緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、150mM NaCl）を満たしたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。

活性測定

試料（45mM カリウムリン酸緩衝液（KPB）、オキサロ酢酸（OAA）、各MDH）にNADHを加え、NADHの吸収波長である340nmの吸光度を分光光度計（Smart Spec Plus、Bio-Rad）で測定することによりΔO.D./minを得た。MDH2、MDH3およびTA-MDHの活性測定では、OAAの濃度範囲を0.01～4mMとし、各MDHの濃度を0.02μg/mlとした。GS-MDHおよびTT-MDHの活性測定では、OAAの濃度範囲を0.002～0.3ｍMとし、各MDHの濃度を0.002μg/mlとした。各濃度のOAAについて、それぞれΔO.D./minを得た。各条件につき3回ずつ測定を行った。

各濃度のOAAにおけるΔO.D./minに基づき、Excelのアドインプログラムのソルバを用いてミカエリス＝メンテン式の誤差が最小になるようにMDHとOAAの解離定数K_m(mM)値および反応速度の最大値V_max(μM/min)を算出した。340nmにおけるNADHのモル分子吸光係数を6.3×10³l/(mol・cm)とした。これらの値から、定められた条件下で毎分基質1μmolの変化を触媒する酵素量を1単位とするunit(μmol/min)、酵素蛋白質1mgあたりの酵素活性である比活性(unit/mg)、各活性部位が単位時間ごとに触媒する反応過程の回転(回転数)を表すK_cat、異なる酵素の触媒効率を比較する際のパラメータであるK_cat/K_mを算出した。

［結果］
参考例１：出芽酵母の野生型MDH2および野生型MDH3の活性測定
出芽酵母の野生型MDH2および野生型MDH3の活性測定の結果を図２に示す。図２のグラフからミカエリス＝メンテン式の誤差が最小になるようにK_m(mM)値およびV_max(μM/min)を算出した。これらの値から、unit(μmol/min)、比活性(unit/mg)、K_cat、K_cat/K_mを算出した（表１）。
表１．出芽酵母の野生型MDH2および野生型MDH3の各種パラメータ

測定の結果、MDH3の比活性は639unit/mgであり、MDH2の比活性（151unit/mg）に比べて4倍以上も高い値であった。また、MDH3のOAAに対するK_m値は0.138mMであり、MDH2のK_m値（0.040mM）に比べて3倍以上も高い値であった。さらに、MDH3のV_maxは0.080(ΔO.D./min)であり、MDH2のV_max（0.019ΔO.D./min）に比べて4倍以上も高い値であった。以上から、MDH3はMDH2に比べ非常に高い活性を持つ酵素であることが明らかになった。

参考例２：出芽酵母のMDH3変異体の活性測定
出芽酵母のMDH3変異体の活性測定の結果を図３に示す。野生型MDH2およびMDH3の活性測定と同様に、各種パラメータを算出した（表２）。
表２．出芽酵母のMDH3変異体の各種パラメータ

MDH3 L84M変異体およびL84M/M92V変異体の比活性はそれぞれ284unit/mgおよび193unit/mgであり、野生型MDH3の比活性(639unit/mg)に比べ非常に低い値であり、MDH2の比活性(151unit/mg)に近い値であった。また、MDH3 L84M変異体およびL84M/M92V変異体のK_m値はそれぞれ0.026mMおよび0.023mMであり、野生型MDH3のK_m値(0.138mM)に比べ非常に低い値であり、MDH2のK_m値(0.04mM)に近い値であった。さらに、MDH3 L84M変異体およびL84M/M92V変異体のV_maxはそれぞれ0.035(ΔO.D./min)、0.024(ΔO.D./min)であり、野生型MDH3のV_max(0.080ΔO.D./min)に比べて低く、MDH2のV_max(0.019ΔO.D./min)に近い値であった。

実施例１：出芽酵母のMDH2変異体の活性測定
出芽酵母のMDH2変異体の活性測定の結果を図４に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表３）。
表３．出芽酵母のMDH2変異体の各種パラメータ

MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体の比活性はそれぞれ664unit/mg、653unit/mgであり、野生型MDH2の比活性(151unit/mg)に比べ高く、MDH3の比活性(639unit/mg)に近い値であった。また、MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体のOAAに対するK_m値はそれぞれ0.156mM、0.329mMであり、野生型MDH2のK_m値(0.040mM)に比べ高く、MDH3のK_m値(0.138mM)に近い値であった。さらに、MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体のV_maxはそれぞれ0.083(ΔO.D./min)および0.081(ΔO.D./min)であり、野生型MDH2のV_max(0.019ΔO.D./min)に比べて高く、MDH3のV_max(0.080ΔO.D./min)に近い値であった。

実施例２：野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の活性測定
野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の活性測定の結果を図５に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表４）。
表４．野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の各種パラメータ

野生型TA-MDHとTA-MDH M92L/K100M変異体の比活性はそれぞれ152unit/mg、339unit/mgであり、変異体は野生型よりも2倍以上高い比活性を示した。また、野生型TA-MDHとTA-MDH M92L/K100M変異体のK_m値はそれぞれ0.007mM、0.018mMであり、変異体は野生型よりも2倍以上高いK_mを示した。さらに、V_maxはそれぞれ0.019(ΔO.D./min)、0.042(ΔO.D./min)であり、変異体は野生型よりも2倍以上高い活性を示した。

実施例３：野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の活性測定
野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の活性測定の結果を図６に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表５）。
表５．野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の各種パラメータ

野生型GS-MDHとGS-MDH M91L/T99M変異体の比活性はそれぞれ863unit/mg、3516unit/mgであり、変異体は野生型よりも4倍以上高い比活性を示した。また、野生型GS-MDHとGS-MDH M91L/T99M変異体のK_m値はそれぞれ0.001mM、0.017mMであり、変異体は野生型よりも15倍以上高いK_mを示した。さらに、V_maxはそれぞれ0.011(ΔO.D./min)、0.044(ΔO.D./min)であり、変異体は野生型よりも4倍も高い活性を示した。

実施例４：野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の活性測定
野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の活性測定の結果を図７に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表６）。
表６．野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の各種パラメータ

野生型TT-MDHとTT-MDH M96L/V104M変異体の比活性はそれぞれ519unit/mg、2441unit/mgであり、変異体は野生型よりも4倍以上高い比活性を示した。また、野生型TT-MDHとTT-MDH M96L/V104M変異体のK_m値はそれぞれ0.003mM、0.016mMであり、変異体は野生型よりも5倍以上高いK_mを示した。さらに、V_maxはそれぞれ0.034(ΔO.D./min)、0.158(ΔO.D./min)であり、変異体は野生型よりも4倍以上高い活性を示した。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が９０％以下であり、下記（１）～（３）のうちのいずれかのアミノ酸配列：
（１）配列番号１０、１５または１６のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶ、ＬまたはＩである）；
（２）配列番号１０、１５または１６のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶ、ＬまたはＩである）、においてアミノ酸配列LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）、またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）（ここでＸはＶ、ＫまたはＩである)である活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されている；
（３）配列番号１０、１５または１６のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶ、ＬまたはＩである）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつアミノ酸配列LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）、またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）（ここでＸはＶ、ＫまたはＩである)である活性中心ループを有する、
を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
Ｘａａがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素。
配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が９０％以下であり、下記（１）～（３）のうちのいずれかのアミノ酸配列：
（１）配列番号９のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶまたはＬである）；
（２）配列番号９のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶまたはＬである）、において、アミノ酸配列VPRKPGXTRDDLF（配列番号４）（ここでＸはＶまたはＬである）である活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されている；
（３）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつアミノ酸配列VPRKPGXTRDDLF（配列番号４）（ここでＸはＶまたはＬである）の活性中心ループを有する、
を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
Ｘａａがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素。
XまたはXaaがロイシンである、請求項１または２に記載のリンゴ酸脱水素酵素。
配列番号２のアミノ酸配列の118位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンである、請求項１～３のいずれかに記載のリンゴ酸脱水素酵素。
請求項１～４のいずれかに記載のリンゴ酸脱水素酵素をコードするDNA。
請求項５記載のDNAを含む発現ベクター。
請求項１～４のいずれかに記載のリンゴ酸脱水素酵素を含む、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定用組成物。