JP7657626B2

JP7657626B2 - 被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する方法、被検者における血管石灰化を判定する方法、および検査キット

Info

Publication number: JP7657626B2
Application number: JP2021050256A
Authority: JP
Inventors: 真利亜桐山; 瑛弥玉田; エルナズナカーエイ; 真実大西
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2025-04-07
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: EP4063515A1; US12474341B2; US20220308057A1; JP2022148530A; CN115125287A

Description

本発明は、被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する方法、被検者における血管石灰化を判定する方法、および検査キットに関する。

心血管疾患は、加齢、生活習慣、脂質異常症、高血圧、糖尿病等の要因が長期に渡り関与した結果生じる血管石灰化に起因して発症する。血管石灰化は、正常であればカルシウム結晶の沈着を生じないはずの血管組織に生じる異所性石灰化である（非特許文献１）。従来臨床現場での血管石灰化の評価には、ＣＴ画像を用いたCoronary artery calcification score（以下、「CACスコア」または「CAC-S」という）が用いられている。ＣＡＣスコアは心血管イベントの発症率と正の相関を示すことが報告されている。

日腎会誌 2014；56（8）：1196－1200 「生体内の石灰化機構」

ＣＡＣスコアは、臨床現場で利用されているものの、ＣＴ画像を取得しなければならず、簡便な評価方法とは言い難い。

本発明は、血液試料を用いることで、より簡便に被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する方法、および被検者における血管石灰化を判定する方法を提供することを課題とする。また、これらの判定方法に使用するための検査キットを提供することを課題とする。

本発明は、被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞を固相上に捕捉する工程と、前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する工程と、を含み、前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が、前記被検者における心血管疾患の発症リスクの指標となる、被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する方法に関する。

本発明は、被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞を固相上に捕捉する工程と、前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する工程と、を含み、前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が、前記被検者における血管石灰化の指標となる、被検者における血管石灰化を判定する方法に関する。

本発明は、細胞外小胞を固相上に捕捉する捕捉抗体と、前記捕捉抗体を捕捉するための固相とを含む、被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する方法または被検者における血管石灰化を判定する方法に使用するための、検査キットに関する。

血液試料を用いることで、より簡便に被検者における心血管疾患の発症リスク、および／または被検者における血管石灰化を判定することができる。

血管の石灰化部位の模式図である。検査キットの外観を示す図である。購入した正常血漿検体のドナー情報の詳細を示す。購入した心血管疾患 (CVD)既往患者検体のドナー情報の詳細を示す。購入した慢性腎臓病（CKD）患者検体のドナー情報の詳細を示す。購入したCACスコア付き検体のドナー情報の詳細を示す。 ELISAに使用した市販品の試薬を示す。 ELISAに使用した自家調製試薬を示す。誘導２週間後の位相差顕微鏡画像である。左図は、形質転換誘導を行わなかった細胞を示す。右図は、形質転換誘導を行った細胞を示す。誘導２週間後のAlizarin Red染色画像である。左図は、形質転換誘導を行わなかった細胞を示す。右図は、形質転換誘導を行った細胞を示す。カルシウム量を測定した結果を示す。形質転換誘導を行った細胞の培養上清のナノ粒子トラッキング解析の結果を示す。形質転換誘導を行わなかった細胞の培養上清の超遠心後の沈渣と、形質転換誘導を行った細胞の培養上清の超遠心後の沈渣のアルカリフォスファターゼ（ALP）活性を示す。捕捉抗体として抗CD9抗体を用いた場合のアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性と、細胞外小胞の粒子数との間の希釈直線性を示す。添加粒子数はナノ粒子トラッキング解析により測定している。捕捉抗体として抗CD63抗体を用いた場合のアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性と、細胞外小胞の粒子数との間の希釈直線性を示す。添加粒子数はナノ粒子トラッキング解析により測定している。捕捉抗体として抗Pit1抗体を用いた場合のアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性と、細胞外小胞の粒子数との間の希釈直線性を示す。添加粒子数はナノ粒子トラッキング解析により測定している。捕捉抗体として抗Annexin VI抗体を用いた場合のアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性と、細胞外小胞の粒子数との間の希釈直線性を示す。抗CD9抗体-ALP系で測定した健常者の血漿(n=4)とCAC-Sが付与されたCVD患者の血漿(n=5)とのアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性との比較を示す。抗CD9抗体-ALP系で測定した健常者の血漿(n=4)とCVD患者の血漿(n=16)とのアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性の比較を示す。抗CD9抗体-ALP系で測定した健常者の血漿(n=4)とCKD患者の血漿(n=5)とのアルカリフォスファターゼ（ALP）の活性の比較を示す。* p<0.05および** p<0.01は有意差を示す。抗CD63抗体-ALP系で測定した健常者の血漿(n=4)とCAC-Sが付与されたCVD患者の血漿(n=6)とのアルカリフォスファターゼ（ALP）活性の比較を示す。* p<0.05は有意差を示す。抗Annexin VI抗体-ALP系で測定した健常者の血漿(n=4)とCKD患者の血漿(n=5)とのアルカリフォスファターゼ（ALP）活性の比較を示す。* p<0.05は有意差を示す。抗Pit1抗体-ALP系で測定した健常者の血漿(n=4)とCAC-Sが付与されたCVD患者の血漿(n=6)とのアルカリフォスファターゼ（ALP）活性の比較を示す。* p<0.05は有意差を示す。４つの分析系の分析性能比較を示す。抗CD9抗体-ALP系により測定したアルカリフォスファターゼ（ALP）活性とCACスコアの相関を示す。抗CD63抗体-ALP系により測定したアルカリフォスファターゼ（ALP）活性とCACスコアの相関を示す。抗Pit1抗体-ALP系により測定したアルカリフォスファターゼ（ALP）活性とCACスコアの相関を示す。

１．被検者における心血管疾患の発症リスクの判定方法
まず、血管の石灰化について図１を用いて説明する。図１は血管の石灰化部位の模式図である。動脈硬化は、ＬＤＬ－コレステロールが沈着した血管内皮において、プラークが形成されることによって生じる。血管内皮細胞（内膜）と血管平滑筋細胞（中膜）との間にＬＤＬ－コレステロールが入り込み、それを取り込んだマクロファージが血管内皮下で泡沫細胞となり蓄積することでアテロームを形成する。アテローム内では血管中膜に局在する血管平滑筋細胞の内膜への遊走が惹起され、さらに骨芽細胞様細胞への形質転換が誘導される。その結果、ハイドロキシアパタイトを含む石灰化細胞外小胞（calcified EV）が産生され、アテローム形成部位に石灰化を生じる。一般的には、石灰化細胞外小胞は安定しており、アテローム形成部位から離れて血管内に放出されるとは考えられていない。石灰化細胞外小胞は、一般的に細胞外小胞に存在しているとされるタンパク質（たとえば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１など）、石灰化細胞外小胞に特異的なタンパク質（ＡｎｎｅｘｉｎＶＩ、Ｐｉｔ１など）などを含む。さらに、石灰化細胞外小胞は膜型のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を含む。

本発明の実施形態では、被検者から採取された血液試料を用いて、血液試料におけるアルカリフォスファターゼ活性を測定することにより、被検者における心血管疾患の発症リスクが判定される。具体的には、この方法は、被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞を固相上に捕捉する工程（以下、「工程１」と称する場合がある）と、前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する工程（以下、「工程２」と称する場合がある）とを含み、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果は、前記被検者における心血管疾患の発症リスクの指標となる。なお、この判定方法で実施される測定はすべてインビトロで行われる。

（１）工程１
工程１において、被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞が固相上に捕捉される。

被検者は、特に制限されない。例えば、被検者は、動脈硬化の発症リスクがある患者である。具体的には、被検者は、肥満症を有する者、高血圧症を有する者、高脂血症を有する者、糖尿病を有する者、腎機能障害を有する者等を例示することができる。

心血管疾患には、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、および虚血性腸管障害よりなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。虚血性心疾患には、狭心症、心筋梗塞等を含み得る。虚血性脳疾患には、脳梗塞等を含み得る。虚血性腸管障害には、腸梗塞等を含み得る。

血液試料は、例えば、全血、血漿または血清である。血液試料として血漿を用いる場合、採血時に使用される抗凝固剤は、制限されない。ＥＤＴＡカリウム塩、ＥＤＴＡナトリウム塩、クエン酸ナトリウム、ヘパリン塩等を使用することができる。

細胞外小胞（以下、「ＥＶ」ともいう）は、細胞から放出される、リン脂質を主成分とする膜で覆われた粒子であって、数十から数千ｎｍ程度の大きさを有する。細胞外小胞には、エキソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が含まれる。多くの場合、細胞外小胞内または細胞外小胞の膜上には、生体分子が存在している。例えば、エキソソームまたはマイクロベシクルは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーディングＲＮＡ等のＲＮＡ、およびＤＮＡ）などを含む。例えば、アポトーシス小体は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、断片化された核、細胞小器官などを含む。ここで、ポリペプチドは、複数のアミノ酸がペプチド結合で結合した化合物をいい、分子量の比較的大きいタンパク質および分子量の比較的小さいペプチドを含む。

工程１において、細胞外小胞を固相上に捕捉する方法は特に限定されず、公知の手段を用いることができる。例えば、血液試料と、細胞外小胞に結合する捕捉体と、固相とを接触させ、固相上に細胞外小胞と捕捉体とを含む複合体（以下、「捕捉体－EV複合体」とも称する）を形成することができる。好ましくは、固相と捕捉体とは、それぞれ結合物質と結合パートナーとを含む。結合物質としては、アビジン、アビジン様物質（ストレプトアビジン、タマビジン（商標）、ニュートラビジンなど）、結合パートナーに対する抗体などが例示される。結合パートナーは、結合物質に特異的に結合する物質であり、ビオチン、ビオチン類縁体、２，４－ジニトロフェノールなどが例示される。好ましくは、捕捉体は、結合物質と結合パートナーとを介して固相に結合する。捕捉体としては、細胞外小胞に特異的に結合可能な物質であれば特に限定されず、例えば、抗体、アプタマーなどを用いることができる。

工程１において、捕捉体を固定した固相に細胞外小胞を含む血液試料を接触させ固相上で捕捉体－EV複合体を形成することができる。捕捉体と、血液試料と、固相との接触順序は特に限定されない。例えば、固相と血液試料とを先に接触させ、その後捕捉体を添加する。別の態様では、固相と捕捉体とを先に接触させ、その後血液試料を添加する。この場合、好ましくは、固相上に捕捉体を固定した後、B/F分離により未反応の遊離成分を除去し、その後血液試料が添加される。別の態様では、捕捉体と細胞外小胞を含む血液試料とを先に接触させることにより溶液中で捕捉体－EV複合体を形成し、その後固相を添加する。いずれの態様においても、固相上で捕捉体－EV複合体を形成した後、工程２を実施する前にB/F分離を行うことが好ましい。工程１の反応は通常緩衝液中で行われる。緩衝液に含まれる緩衝剤の種類は、反応を阻害する物質でない限り特に限定されず、当業界で公知の物質を用いることができる。また、B/F分離では、緩衝剤、界面活性剤などを含む洗浄液が用いられ得る。緩衝剤や界面活性剤は、B/F分離を適切に行うことができる物質である限り特に限定されず、当業界で公知の物質を用いることができる。反応時間や反応温度などの条件は捕捉体の種類などによって適宜調整することができる。

細胞外小胞を固相上に捕捉する前に、サイズ排除クロマトグラフィー法、超遠心法、アフィニティー精製法、ポリマー沈殿法などによる細胞外小胞の抽出作業を行ってもよいが、本実施形態はこれらの抽出作業を行わなくとも測定可能である。

捕捉体として用いられる抗体（以下、「捕捉抗体」という）は、細胞外小胞を捕捉可能である限り制限されない。好ましくは、捕捉抗体は少なくとも細胞外小胞に存在するタンパク質の一部に結合可能である。また、捕捉抗体は、１種類のみ用いてもよいし、複数種を用いてもよい。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、還元型抗体、二重特異性抗体およびそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、ｓｃＦｖ等であってもよい。

捕捉抗体として、例えば、抗CD9抗体(Clone:H19a, 12A12など)、抗CD63抗体(Clone:H5C6など)、ＣＤ８１(Clone:5A6など)、抗Annexin VI抗体(Clone:E-5など)、抗Pit1抗体/SLC20A1(Clone:6A9-F2など)に対する抗体などが挙げられ、これらのうち少なくとも1種が用いられ得る。これらの抗体については、市販品を用いることができる。

固相として、当業界で公知の固相を用いることができる。固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体（酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど）、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、マイクロプレート、膜、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。

（２）工程２
工程２において、細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性が測定される。具体的には、上記（１）において固相に捕捉された細胞外小胞と、アルカリフォスファターゼの基質とを接触させ、酵素反応により生じた産物が測定される。この産物の測定値は、アルカリフォスファターゼ活性を反映する値である。測定条件は、アルカリフォスファターゼが活性を示す条件である限り制限されない。

アルカリフォスファターゼの基質として、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）（４－クロロ－３－（メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３－（４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５－ブロモ－６－クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ－ニトロフェニルリン酸などの発色基質などが挙げられる。特に好ましくは、化学発光基質であるＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）である。酵素反応により生じた発光は、ルミノメーターで化学発光シグナルを検出することが好ましい。

（３）心血管疾患の発症リスク判定について
後述の実施例に示される通り、CACスコアの高い被検者は、相対的にCACスコアの低い被検者よりもアルカリフォスファターゼ活性が有意に高く、CACスコアとアルカリフォスファターゼ活性とは相関していた。CACスコアは心血管疾患のリスク予測に有用であることが知られている。よって、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果は、被検者の心血管疾患のリスクの指標として利用することができる。ここで、CACスコアは、冠動脈CTにより石灰化重症度を定量化した数値であり、石灰化の重症度の指標として用いられている。CACスコア0点は石灰化なし(no plaque)、１～１０点は極軽度(small amount of plaque)、１１～１００点は軽度(some plaque)、１０１～４００点は中等度(moderate amount of plaque)、４０１点以上は高度(large amount of plaque)と評価される。

本明細書において、「アルカリフォスファターゼ活性の測定結果」は、アルカリフォスファターゼの活性を反映する値であり得る。当該値は、例えば化学発光強度の測定値である。化学発光強度の測定値は、酵素反応により生じた産物の物質量を反映する値であり、当該値は、アルカリフォスファターゼの活性を反映する。

好ましい実施形態では、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値以上であるとき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクが高いことが示唆される。別の好ましい実施形態では、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値未満であるとき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクが低いことが示唆される。より好ましい実施形態では、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値以上であるとき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクが高いことが示唆され、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値未満であるとき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクが低いことが示唆される。

「所定の閾値」とは、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果の閾値をいう。当該閾値は、CACスコアの低い被検者または健常者のアルカリフォスファターゼ活性の測定結果と、CACスコアの高い被検者のアルカリフォスファターゼ活性の測定結果とに基づいて設定することができる。

例えば、複数の健常者から採取した血液試料を用いてアルカリフォスファターゼ活性の測定結果を取得し、CACスコア401点以上の複数の被検者から採取した血液試料を用いてアルカリフォスファターゼ活性の測定結果を取得する。これらの測定結果に基づいて、健常者と、CACスコア401点以上の被検者とを最も精度よく分類できる値を「閾値」とすることができる。ここで、「最も精度よく分類できる値」は、検査の目的によって感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの指標を考慮して適宜設定することができる。例えばROC解析などに基づいて設定することができる。

複数の健常者におけるアルカリフォスファターゼ活性の測定結果の中で、最も高い測定結果を閾値としてもよい。高額な治療が必要な場合、治療薬の副作用が強い場合など、治療行為による患者の経済的・身体的負担を減らす必要がある場合は、擬陽性をできるだけ低減させるため、当該閾値を好適に用いることができる。

CACスコア401点以上の複数の被検者におけるアルカリフォスファターゼ活性の測定結果の中から、最も低い測定結果を閾値としてもよい。スクリーニング検査のように擬陰性をできるだけ低減させたい場合は、当該閾値を好適に用いることができる。

「アルカリフォスファターゼ活性の測定結果」は、同一被検者における測定結果の経時変化であってもよい。当該経時変化が心血管疾患の発症リスクの指標となる。例えば、特定の一の被検者の第1の時点における測定結果と、第2の時点における測定結果を比較し、その測定結果の変化によって心血管疾患の発症リスクを評価してもよい。なお、第1の時点と第2の時点とは異なる時点である。第2の時点における測定結果を評価するに際して、「閾値」として第1の時点における測定結果が用いてもよい。

本発明の別の実施形態は、上述の工程１、上述の工程２および判定工程を含む、心血管疾患の発症リスクの判定方法である。判定工程は、工程２で得られたアルカリフォスファターゼ活性の測定結果に基づき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する工程である。判定工程では、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果と、閾値とを比較し、比較結果に基づいて発症リスクを判定してもよい。当該比較において、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が閾値以上の場合は、心血管疾患の発症リスクが高いと判定され、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が閾値未満の場合は、心血管疾患の発症リスクが低いと判定され得る。

さらに、発症リスクが高いと判定された被検者に、心血管疾患に対する医学的介入を行う工程を含んでいてもよい。当該工程を含む実施形態は、上記の判定方法によって心血管疾患の発症リスクが高いとされた被検者を治療する方法(以下、「治療方法」ともいう)に関する。医学的介入の例は、降圧療法、心血管疾患や血管石灰化に対応する薬剤の投与などが含まれる。薬剤の例として、リン吸着薬、高コレステロール治療薬、血栓溶解剤、抗血栓薬、抗血小板薬、血管拡張薬などが挙げられる。

２．被検者における血管石灰化の判定方法
被検者における血管石灰化の判定方法は、被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞を固相上に捕捉する工程（以下、「工程Ａ」と称する場合がある）と、前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する工程（以下、「工程Ｂ」と称する場合がある）とを含み、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果は、被検者における血管石灰化の指標となる。なお、この判定方法で実施される測定はすべてインビトロで行われる。工程Ａ及び工程Bは、それぞれ上記工程１および工程２と同様である。

後述の実施例に示される通り、CACスコアの高い被検者は、相対的にCACスコアの低い被検者よりもアルカリフォスファターゼ活性が有意に高く、CACスコアとアルカリフォスファターゼ活性とは相関していた。また、CVD患者やCKD患者では、健常者に比べてアルカリフォスファターゼ活性が有意に高かった。CACスコアは血管石灰化の指標となることが知られており、また、CVD患者やCKD患者では血管石灰化が観察される。即ち、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果は、被検者の血管石灰化の指標として利用することができる。

好適には、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値以上であるとき、前記被検者における血管石灰化の存在、または血管石灰化の亢進が示唆される。また、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値未満であるとき、前記被検者における血管石灰化の不存在、または治療などによる血管石灰化の改善が示唆される。

「所定の閾値」とは、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果の閾値をいう。当該閾値は、CACスコアの低い被検者または健常者のアルカリフォスファターゼ活性の測定結果と、CACスコアの高い被検者、CVD患者またはCKD患者のアルカリフォスファターゼ活性の測定結果とに基づいて設定することができる。

例えば、複数の健常者から採取した血液試料を用いてアルカリフォスファターゼ活性の測定結果を取得し、CACスコア401点以上の複数の被検者から採取した血液試料を用いてのアルカリフォスファターゼ活性の測定結果を取得する。これらの測定結果に基づいて健常者とCACスコア401点以上の被検者とを最も精度よく分類できる値を「閾値」とすることができる。ここで、「最も精度よく分類できる値」は、検査の目的によって感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの指標に基づいて適宜設定することができる。例えば、ROC解析などに基づいて設定することができる。

「アルカリフォスファターゼ活性の測定結果」は、同一被検者における測定結果の経時変化であってもよい。当該経時変化が心血管疾患の発症リスクの指標となる。例えば、特定の一の被検者の第１の時点における測定結果と、第２の時点における測定結果を比較し、その測定結果の変化によって心血管疾患の発症リスクを評価してもよい。なお、第１の時点と第２の時点とは異なる時点である。第２の時点における測定結果を評価するに際して、「閾値」として第1の時点における測定結果を用いてもよい。

本発明の別の実施形態は、上述の工程A、上述の工程Bおよび判定工程を含む、血管石灰化の判定方法である。判定工程は、工程Bで得られたアルカリフォスファターゼ活性の測定結果に基づき、前記被検者における血管石灰化を判定する工程である。判定工程では、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果と、閾値とを比較し、比較結果に基づいて血管石灰化を判定してもよい。当該比較において、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が閾値以上の場合は、血管石灰化が存在すると判定され、アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が閾値未満の場合は、血管石灰化が存在していないと判定され得る。

さらに、血管石灰化が存在すると判定された被検者に、心血管疾患に対する医学的介入を行う工程を含んでいてもよい。当該工程を含む実施形態は、上記の判定方法によって血管石灰化が存在すると判定された被検者を治療する方法(以下、「治療方法」ともいう)に関する。医学的介入の例は、降圧療法、心血管疾患や血管石灰化に対応する薬剤の投与などが含まれる。薬剤の例として、リン吸着薬、高コレステロール治療薬、血栓溶解剤、抗血栓薬、抗血小板薬、血管拡張薬などの投与が挙げられる。

３．検査キット
本発明のある実施形態は、上記１または上記２．で述べた方法に用いられる検査キットに関する。検査キットの一例を図２に示す。検査キット５０には、捕捉体を含む第１の容器５１、固相として複数個の粒子を含む第２の容器５２、及びアルカリフォスファターゼの基質を含む第３の容器５３、当該キットの使用方法等が記載された添付文書５４が含まれる。これらは、梱包箱５５に収容される。捕捉体、固相及びアルカリフォスファターゼの基質に関する説明は、上記１．の説明をここに援用する。図２の例では、固相が粒子の場合を示しているが、第２の容器５２にかえて、固相としてマイクロプレート、膜、マイクロチューブ、試験管等の別の形状の固相が含まれていてもよい。

以下に実施例を示して、本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定して解釈されるものではない。

１．材料と方法
１－１．細胞培養および石灰化誘導、Alizarin Red染色、石灰化細胞外小胞の調製
ヒト骨肉腫由来細胞株Saos-2細胞は理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC）より購入した。細胞はRIKEN BRCの培養方法に従い、15% FBSを添加したMcCoy's 5A培地（シグマアルドリッチ）を用いて、5% CO₂、37℃で培養した。

石灰化誘導用のSaos-2細胞は、10% FBSを添加したαMEM (GIBCO)でコンフルエントになるまで培養後、石灰化誘導用培地 (10% FBS、10 mM HEPES (ナカライテスク)、50 ug/mL ascorbate 2-phosphate（シグマアルドリッチ）および1.8 mM potassium di-hydrogen phosphate（富士フィルム和光純薬）を含むαMEM)に交換して14日間培養を継続した。石灰化誘導用培地に交換してから10日目まで培地は2-3日に1回交換し、10日目から14日目まで同一培地で培養し培養液を回収した。回収後のSaos-2細胞は、4% PFAを用いて10分間4℃で固定しPBSで3回洗浄し、50 mM Alizarin Red (pH 4.2)を用いて室温で10分間、Alizarin Red染色を行った。

培養液を300gで10分間さらに2,000gで10分間遠心し、上清を超遠心チューブに移し100,000g (50,000 rpm)、28分間の超遠心を行った。超遠心チューブ内の沈殿を採取し、5 mMリン酸バッファーまたは1% BSAを含む5 mMリン酸バッファーで再懸濁することにより、石灰化細胞外小胞を調製した。

１－２．購入検体および石灰化細胞外小胞除去正常ヒトプール血漿検体の作製
正常ヒトプール血漿および正常ヒトシングルドナー血漿検体（抗凝固剤：全てEDTA-2K）は、各々コージンバイオ (Product# 12271430)およびコスモバイオ (Product# 12271420)より購入した。そのドナー情報は図３Ａに示す通りである。これらの健常者血漿にはCACスコアは付与されていなかったが、通常、健常者ではCACスコアは０点または極めて低いスコアであるため、本実施例においては健常者血漿のCACスコアは０点とみなして以下の評価を行った。心血管疾患 (CVD)既往患者検体 (全16検体、抗凝固剤：EDTA-2K、除外基準は慢性腎不全と透析患者)はPromedex社より購入した。そのドナー情報は図３Ｂに示す通りである。慢性腎臓病 (CKD)検体 (全5検体)およびCACスコア付き検体 (全6検体、除外基準は慢性腎不全と透析患者)は、それぞれReprocell社およびBioIVT社より購入した (抗凝固剤：全てEDTA-2K)。そのドナー情報は図３Ｃおよび図３Ｄに示す通りである。図３Ｄに示される通り、CACスコア付き検体は、いずれもCACスコアが４００点を超えており、石灰化重症度が「高度」と評価される検体である。

石灰化細胞外小胞除去正常ヒトプール血漿検体は次のようにして調製された。購入した正常ヒトプール血漿検体を300g、10分間、及び2,000g、10分間遠心し、その上清を超遠心チューブに移した。これを100,000g (50,000 rpm)、28分間超遠心を実施し、細胞外小胞を沈殿させた。上清を検体として回収した。

１－３.アルカリフォスファターゼ活性測定
ELISAに使用した各試薬は、図４Ａおよび図４Ｂに示す。
また、検体として、上記１－１においてインビトロで誘導した石灰化細胞外小胞を含む試料、および上記１－２．において調製した検体を使用した。

96ウェルプレート (Nunc, high binding ELISA plate, #436110)を50 mM Tris-HCl (pH 7.5)で2回洗浄した。図４Ａに示す各抗体を、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)で5 μg/mLの濃度に調整し、各抗体の抗体溶液を用意した。各抗体溶液を96ウェルプレートの各ウェルに50 μL/wellずつ添加した。ウェル中の溶液を捨て、5 mMリン酸バッファーで3回洗浄後、Blocking Buffer Iを200 μL/wellずつ添加し、室温で2時間30分間、600 rpmのシェーカーで撹拌しながらインキュベートした。固相抗体が抗CD63抗体の場合のみ、インキュベート時間を1時間にした。検体として、固相抗体が抗CD63抗体または抗Pit1抗体の場合は希釈無しの血漿検体、抗CD9抗体の場合は等量のcEV sample dilution bufferで希釈した50% 血漿、抗Annexin VI抗体の場合は等量の2.6 mM CaCl₂を含むcEV sample dilution bufferで希釈した50% 血漿/1.3 mM CaCl₂を用意した。Blocking Buffer Iを廃棄後、各検体を100 μL/wellずつ添加し、室温で2時間30分間、600 rpmのシェーカーでインキュベートした。固相抗体が抗CD63抗体の場合のみ、インキュベート時間を1時間にした。ウェル中の溶液を廃棄後、固相抗体が抗CD63抗体、抗CD9抗体または抗Pit1抗体の場合はHISCL洗浄液を300 μL/well、抗Annexin VI抗体の場合は1.3 mM CaCl₂を含むHISCL洗浄液を300 μL/well用いて、各ウェルを6回洗浄した。

洗浄後、100 μL/wellのHISCL R5試薬を添加し、室温で20分間インキュベートしてからplate reader (TECAN, Infinite Pro200)で化学発光を検出し、ALP活性測定を行った。

２．結果
２－１．誘導した石灰化細胞外小胞の評価
上記１－１．に記載の方法によって、骨肉腫細胞株Saos-2細胞から形質転換を誘導した骨芽様細胞における石灰化を評価した。その結果を図５Ａから図５Ｅに示す。図５Ａは、誘導２週間後の位相差顕微鏡画像であり、図５Ｂは、Alizarin Red染色画像である。図５Ａおよび図５Ｂの左図は、形質転換誘導を行わなかった細胞であり、図５Ａおよび図５Ｂの右図は、形質転換誘導を行った細胞である。形質転換誘導を行った細胞において、石灰化が確認できた。図５Ｃは、形質転換誘導を行わなかった細胞、および形質転換誘導を行った細胞について、15 cmプレート一枚分から細胞を回収し、o-Cresolphtalein Complexone法によりカルシウム量を測定した結果を示す。形質転換誘導を行った細胞を含むプレートは、形質転換誘導を行わなかった細胞を含むプレートよりもカルシウム量が127倍高かった。図５Ｄは、形質転換誘導を行った細胞の培養上清について、ナノ粒子トラッキング解析法により解析した粒子数および粒子サイズの分布を示す。測定は、１つの上清に対して3回行い、各回で5回連続測定を行った。粒子サイズの平均値は246.7 +/- 3.7 nmであり、粒子濃度の平均値は1.92×10¹⁰(particles)/mLであった。また、形質転換誘導を行わなかった細胞の培養上清と形質転換誘導を行った細胞の培養上清に対して上記１－１．に示す条件で超遠心を行い、沈渣を、透過電子顕微鏡を用いて観察した。この観察において、形質転換誘導を行わなかった細胞の培養上清の沈渣には細胞外小胞は認められなかった。一方、形質転換誘導を行った細胞の培養上清の沈渣には細胞外小胞が認められた。図５Eは、形質転換誘導を行わなかった細胞の培養上清の超遠心後の沈渣と、形質転換誘導を行った細胞の培養上清の超遠心後の沈渣のALP活性を示す。ALP活性は、超遠心法で回収した沈渣試料 (1 μg/well)にHISCL R5試薬を加え測定した。それぞれの沈渣試料から３つの測定サンプルを採取し、測定を行った。測定は2回実施された。形質転換誘導を行わなかった細胞の培養上清の超遠心後の沈渣ではALP活性はほとんど認められなかったが、形質転換誘導を行った細胞の培養上清の超遠心後の沈渣は、高いALP活性を示した。

次に、石灰化細胞外小胞を段階的に希釈した希釈系列を使用し、細胞外小胞の粒子数と、ALPの活性との間の希釈直線性を検討した。粒子数はナノ粒子トラッキング解析により測定した。捕捉抗体（固相抗体）として、抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗Pit1抗体、および抗Annexin VI抗体を使用し、ALP活性と粒子数とを比較し、希釈直線性を検討した。その結果、図６に示すように、いずれの捕捉抗体を用いても、良好な直線性が得られた。

２－２．血液試料を用いた効果の検証
検体として、健常者血漿、CACスコア（CAC-S）付与者血漿、CKD患者血漿、およびCVD既往患者血漿を用いて、分析性能を検討した。

（１）抗CD9抗体-ALP系
捕捉抗体として抗CD9抗体を使用した場合の結果を図７Ａから図７Ｃに示す。図７Ａは健常者の血漿(n=4)とCAC-Sが付与された患者の血漿(n=6)とのALP活性の比較を示す。図７Ｂは健常者の血漿(n=4)とCVD患者の血漿(n=16)とのALP活性の比較を示す。図７Ｃは健常者の血漿(n=4)とCKD患者の血漿(n=5)とのALP活性の比較を示す。* p<0.05および** p<0.01は有意差を示す。健常者血漿の細胞外小胞のALP活性は、患者の細胞外小胞のALP活性よりも有意に低かった。

（２）抗CD63抗体-ALP系
捕捉抗体として抗CD63抗体を使用した場合の結果を図８に示す。健常者の血漿(n=4)とCAC-Sが付与された患者の血漿(n=5)とのALP活性を比較した。* p<0.05は有意差を示す。健常者血漿の細胞外小胞のALP活性は、患者の細胞外小胞のALP活性よりも有意に低かった。

（３）抗Annexin VI抗体-ALP系
捕捉抗体として抗Annexin VI抗体を使用した場合の結果を図９に示す。健常者の血漿(n=4)とCKD患者の血漿(n=5)とのALP活性を比較した。* p<0.05は有意差を示す。健常者血漿の細胞外小胞のALP活性は、患者の細胞外小胞のALP活性よりも有意に低かった。

（４）抗Pit1抗体-ALP系
捕捉抗体として抗Pit1抗体を使用した場合の結果を図１０に示す。健常者の血漿(n=4)とCAC-Sが付与された患者の血漿(n=6)とのALP活性を比較した。* p<0.05は有意差を示す。健常者血漿の細胞外小胞のALP活性は、患者の細胞外小胞のALP活性よりも有意に低かった。

（５）測定系間の比較
図１１に上記（１）から（４）に示す測定計間の分析性能の比較を示す。抗CD9抗体および抗Annexin VI抗体を用いた測定系では、全ての健常者血漿において最低検出感度以上で測定できた。抗CD63抗体と抗CD9抗体を用いた測定系では、健常者血漿群と比較して検討した３つの患者血漿群はALP活性が高い傾向を示した。石灰化細胞外小胞に特異的な抗体である抗Annexin VI抗体で捕捉した場合、CAC-S患者血漿群とCKD血漿群に関し、健常者血漿群と比較してALP活性が高い傾向を示した。最低検出感度 (LOD)、Dynamic range、同時再現性、測定者間再現性の全体を考慮すると、抗CD9抗体を用いた測定系の検出性能が最も高かった。

２－３．CACスコアとALP活性と相関
抗CD9抗体-ALP系と抗Pit1抗体-ALP系により測定したALP活性とCACスコアの相関を求めた。結果を図１２Ａから図１２Ｃに示す。図１２Ａは、抗CD9抗体-ALP系によって測定されたALP活性とCACスコアとの相関を示し、相関係数は0.84であった。図１２Ｂは、抗CD63抗体-ALP系によって測定されたALP活性とCACスコアとの相関を示し、相関係数は0.87であった。図１２Ｃは、抗Pit1抗体-ALP系によって測定されたALP活性とCACスコアとの相関を示し、相関係数は0.85であった。いずれも高い相関を示した。

３．心血管疾患発症リスクおよび血管石灰化の評価について
上述の通り、CACスコアは血管石灰化の重症度を示す指標として用いられ、心血管疾患のリスク予測に利用できることが知られている。本実施例で測定したALP活性はCACスコアとよく相関し、血管石灰化を伴うCKD患者やCVD患者において有意に高値であった。この結果から、血中石灰化細胞外小胞のALP活性が、血管石灰化の重症度を示す指標として利用可能であり、また心血管疾患の発症リスク判定のための指標としても利用可能であることが示唆された。

５０検査キット

Claims

被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞を固相上に捕捉する工程と、
前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する工程と、を含み、
前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が、前記被検者における心血管疾患の発症リスクの指標となり、
前記被検者は、慢性腎不全患者および透析患者ではない、
前記被検者における心血管疾患の発症リスクを判定するための方法。
前記血液試料が、全血、血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
前記捕捉工程が、前記被検者の血液試料と、前記固相と、前記細胞外小胞を捕捉可能な捕捉抗体とを接触させることにより、前記細胞外小胞と前記捕捉抗体との複合体を前記固相上に形成することを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記捕捉抗体が、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＡｎｎｅｘｉｎＶＩ抗体、および抗Ｐｉｔ１抗体よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３に記載の方法。
前記測定工程が、前記固相に固定された前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼに発光基質を接触させて、それにより生じる化学発光シグナルを検出することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値以上であるとき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクが高いことが示唆される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値未満であるとき、前記被検者における心血管疾患の発症リスクが低いことが示唆される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記心血管疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、および虚血性腸管障害よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
被検者から採取された血液試料に由来する細胞外小胞を固相上に捕捉する工程と、
前記細胞外小胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する工程と、を含み、
前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が、前記被検者における血管石灰化の指標となり、
前記被検者は、慢性腎不全患者および透析患者ではない、
前記被検者における血管石灰化を判定するための方法。
前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値以上であるとき、前記被検者における血管石灰化の存在が示唆される、請求項９に記載の方法。
前記アルカリフォスファターゼ活性の測定結果が所定の閾値未満であるとき、前記被検者における血管石灰化の不存在が示唆される、請求項９または１０に記載の方法。
細胞外小胞を固相上に捕捉する捕捉抗体と、前記捕捉抗体を捕捉するための固相とを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法に使用するための、検査キット。
さらにアルカリフォスファターゼに対する基質を含む、請求項１２に記載の検査キット。