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JP7658896B2 - 凍結保存腫瘍サンプルからのｔｉｌの拡大培養 - Google Patents
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JP7658896B2 - 凍結保存腫瘍サンプルからのｔｉｌの拡大培養 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
[001] この国際ＰＣＴ出願は、２０１８年９月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７３３，９３７号及び２０１９年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８７９，８８１号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
[002] 本明細書に記載の本発明は、一般にリンパ球の拡大培養に関連し、より具体的には、限定的ではないが、凍結保存された腫瘍組織からのリンパ球の拡大培養に関連する。
発明の背景
[003] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移植を用いた抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者を処置する強力なアプローチとなる可能性がある。Gattinoni, et al., Nat.Rev. Immunol.2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、したがって、製造及び商業化に向けてロバストで信頼性のあるプロセスが求められている。商業化のためのこのスケーリングは、細胞拡大培養に関する多数の技術上、物流上、及び規制上の問題のために、深刻な課題となっている。ＩＬ－２ベースのＴＩＬ拡大培養と、それに続く「急速拡大培養プロセス」（ＲＥＰ：rapid expansion process）が、その効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42。ＲＥＰは１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それにはフィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの、大過剰の（例えば２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核球（ＭＮＣ）としても知られる）、並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ－２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰ手順を経たＴＩＬは、一部の黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功を生み出している。
[004] 現在のＴＩＬ製造プロセスは、期間、経費、無菌性の懸念、及び本明細書中に記載される他の要因によって制限されるため、そのようなプロセスを商業化する可能性は大幅に制限される。現在のプロセスの多くの制限の中には、製造を開始するための新鮮腫瘍組織への依存がある。これは、新鮮な腫瘍を長距離輸送することが難しいため、しばしば高価で高コストな現地の製造施設を必要とする。新鮮腫瘍組織に依存せず、商業規模の製造に適し、地理的に広く分散したヒト患者における使用のための規制当局の承認に適した、ＴＩＬ製造プロセス及び療法を提供することが至急に必要とされている。
発明の概要
[005] 一実施形態において、本発明は、治療用ＴＩＬ集団を産生するための出発ＴＩＬ原料として凍結腫瘍組織を利用するＴＩＬ拡大培養の方法を提供する。
[006] 一実施形態において、本発明は、
（ｉ）腫瘍組織を断片化すること；
（ｉｉ）断片を凍結保存培地中でインキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）断片を凍結することであって、凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための腫瘍組織を凍結保存するための方法を提供する。
[007] 一実施形態において、本発明は、
（ｉ）腫瘍サンプルを断片化するステップ；
（ｉｉ）断片を凍結保存培地中でインキュベートするステップ；及び
（ｉｉｉ）断片を凍結するステップであって、凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であるステップ
を含むプロセスによって調製された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための凍結保存された腫瘍断片を提供する。
[008] 一実施形態において、本発明は、
（ｉ）腫瘍サンプルを断片化するステップ；
（ｉｉ）約１０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシドを含む凍結保存培地中で、約２℃～約８℃の範囲の温度で約２０分間～約７０分間にわたって断片をインキュベートするステップ；及び
（ｉｉｉ）断片を凍結するステップであって、凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であるステップ
を含むプロセスによって調製された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための凍結保存された腫瘍断片を提供する。
[009] ある実施形態において、本発明は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、凍結前に、腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間インキュベートすることを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[0010] ある実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間インキュベートすること；
（ｃ）腫瘍組織を凍結すること；
（ｄ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵すること；
（ｂ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[0011] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、２～１２％ｖ／ｖ（体積：体積）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５～１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、３％ｖ／ｖ、４％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、６％ｖ／ｖ、７％ｖ／ｖ、８％ｖ／ｖ、９％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１１％ｖ／ｖ、１２％ｖ／ｖ、１３％ｖ／ｖ、１４％ｖ／ｖ、及び１５％ｖ／ｖからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、貯蔵培地の残りは水性培地である。
[0012] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、２～１２％ｗ／ｗ（重量：重量）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５～１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１％ｗ／ｗ、２％ｗ／ｗ、３％ｗ／ｗ、４％ｗ／ｗ、５％ｗ／ｗ、６％ｗ／ｗ、７％ｗ／ｗ、８％ｗ／ｗ、９％ｗ／ｗ、１０％ｗ／ｗ、１１％ｗ／ｗ、１２％ｗ／ｗ、１３％ｗ／ｗ、１４％ｗ／ｗ、及び１５％ｗ／ｗからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、貯蔵培地の残りは水性培地である。
[0013] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約４５分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で６０分間インキュベートされる。
[0014] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、約５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、貯蔵培地は、約１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間～約６０分間インキュベートされる。
[0015] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること
を含むこと；
（ｂ）容器を解凍すること；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[0016] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｂ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｃ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｄ）容器を冷凍すること；
（ｅ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること；
（ｄ）容器を解凍すること；
（ｆ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｇ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｈ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[0017] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、直径１．５ｍｍ～６ｍｍ、且つ厚さ１．５ｍｍ～６ｍｍでトリミングされる。さらに他の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、約６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍにトリミングされる。
[0018] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、抗菌剤をさらに含む。一部の実施形態において、抗菌剤はゲンタマイシンである。一部の実施形態において、貯蔵培地は、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、抗菌剤、抗真菌剤、及びそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、抗真菌剤は、アンホテリシンＢであり、約０．２５μｇ／ｍＬ～約２．５μｇ／ｍＬ存在する。一部の実施形態において、抗真菌剤は、ファンギン（fungin）であり、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ存在する。
[0019] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、方法の凍結ステップを実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）又は別の適切な培地若しくは溶液で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、少なくとも３回の連続洗浄を含み、ＨＢＳＳは、各洗浄後に交換される。
[0020] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[0021] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃の温度で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[0022] 一部の実施形態において、方法は、ヒト対象からの新鮮な腫瘍サンプルを用いて実施される。
[0023] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[0024] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養ステップ（ｃ）と第２の拡大培養ステップ（ｅ）との間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、ステップ（ｃ）から（ｅ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、ステップ（ｃ）から（ｅ）は２１日で完了し；一部の実施形態において、ステップ（ｃ）から（ｅ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、ステップ（ｃ）から（ｅ）は、約１６日で完了する。
[0025] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）液体窒素の気相を使用して容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
を含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｃ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｄ）ＩＬ－２を有する細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｆ）ステップ（ｆ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ）ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｈ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｇ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｉ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。
[0026] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を液体窒素の気相を使用して冷凍すること；
（ｆ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること；
（ｇ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｈ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｉ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｊ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｉ）からステップ（ｊ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｋ）ステップ（ｊ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｊ）からステップ（ｋ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｌ）ステップ（ｋ）で回収した治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｋ）から（ｌ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｍ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｌ）からの治療用ＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｎ）ステップ（ｍ）における輸注バッグから治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。
[0027] 一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、黒色腫、抵抗性黒色腫、転移性黒色腫、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[0028] 本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、凍結前に、腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約３０分間インキュベートすることを含むこと；
（ｃ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｄ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３抗体を含む第１の細胞培養培地で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｅ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｆ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[0029] 本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約３０分間インキュベートすること；
（ｃ）腫瘍組織を凍結すること；
（ｄ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵すること；
（ｅ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｆ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３抗体を含む第１の細胞培養培地で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｇ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｈ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[0030] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること
を含むこと；
（ｃ）容器を解凍すること；
（ｄ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｅ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｆ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[0031] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、方法の凍結ステップを実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、少なくとも３回の連続洗浄を含み、ＨＢＳＳは、各洗浄後に交換される。
[0032] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[0033] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃の温度で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[0034] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[0035] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップと第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｉ）から（ｋ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｉ）から（ｋ）は、約２１日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｉ）から（ｋ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｉ）から（ｋ）は、約１６日で完了する。
[0036] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）液体窒素の気相を使用して容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
を含むこと；
（ｃ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｄ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｅ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｇ）ステップ（ｆ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｈ）ステップ（ｇ）から回収した治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｉ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｈ）からの治療用ＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）における輸注バッグから治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。
[0037] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、方法の凍結ステップを実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、少なくとも３回の連続洗浄を含み、ＨＢＳＳは、各洗浄後に交換される。
[0038] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[0039] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃の温度で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[0040] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[0041] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養ステップと第２の拡大培養ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養ステップは約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は約２１日で完了し；一部の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は、約１６日で完了する。
[0042] 一部の実施形態において、本発明による拡大培養方法は、約１６日で完了する。一部の実施形態において、拡大培養方法は、第１の拡大培養ステップ（プレＲＥＰステップ）及び第２の拡大培養ステップ（ＲＥＰステップ）を含む。一実施形態において、第１の拡大培養ステップは、約３日から約５日である。別の実施形態において、第１の拡大培養ステップは、約３日である。別の実施形態において、第１の拡大培養ステップは、約５日である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、約１１日から約１３日である。別の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、約１１日である。別の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、約１３日である。一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップは約５日であり、第２の拡大培養ステップは約１１日である。一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップは約３日であり、第２の拡大培養ステップは約１３日である。
[0043] 一部の実施形態において、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップ中に、追加の容器に分割される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップの５日目に分割される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップの６日目に分割される。一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは約１１日であり、ＴＩＬは第２の拡大培養ステップの５日目に分割される。一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは約１３日であり、ＴＩＬは第２の拡大培養ステップの６日目に分割される。
[0044] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップは３日であり、第２の拡大培養ステップは１３日であり、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップの６日目（全プロセスの９日目）に分割される。一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップは５日であり、第２の拡大培養ステップは１１日であり、ＴＩＬは、第２の拡大培養ステップの５日目（全プロセスの１０日目）に分割される。
[0045] 一部の実施形態において、フィーダー細胞が第２の拡大培養ステップ中に使用される。一実施形態において、１／１００スケールプロセスでは、約２～５０×１０６個のフィーダー細胞が、第２の拡大培養ステップ中に使用される。別の実施形態において、約２５×１０６個のフィーダー細胞が使用される。別の実施形態において、約５０×１０６個のフィーダー細胞が使用される。一部の実施形態において、フルスケールプロセスでは、約２～５０×１０９個のフィーダー細胞が使用される。一部の実施形態において、フルスケールプロセスでは、約２．５×１０９個又は約５×１０９個のフィーダー細胞が使用される。一部の実施形態において、フィーダー細胞はＰＢＭＣである。
[0046] 一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、約５×１０６～約２００×１０６個のＴＩＬが播種される。一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、第１の拡大培養ステップからの約５％～約２５％のＴＩＬが播種される。一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、第１の拡大培養ステップからの約１０％～約２０％のＴＩＬが播種される。一部の実施形態において、第２の拡大培養ステップは、第１の拡大培養ステップからの約１０％のＴＩＬが播種される。
[0047] 他の実施形態は、これらの組成物及び方法の組み合わせ及び変形を含む。
図面の簡単な説明
[0048] 前述の概要、及び以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。
[0049]任意選択による、ステップＢの断片化の後の新鮮腫瘍組織の凍結保存を含む、２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。第１の拡大培養の開始からステップＥの終了までの合計時間は約２２日である。 [0050]パネルＡ～Ｃは、ＴＩＬ製造プロセスの実施形態の様々なステップを示す。これには、プレＲＥＰ培養を後で開始できるようにする新鮮腫瘍断片の凍結保存が含まれる。 [0050]パネルＡ～Ｃは、ＴＩＬ製造プロセスの実施形態の様々なステップを示す。これには、プレＲＥＰ培養を後で開始できるようにする新鮮腫瘍断片の凍結保存が含まれる。 [0050]パネルＡ～Ｃは、ＴＩＬ製造プロセスの実施形態の様々なステップを示す。これには、プレＲＥＰ培養を後で開始できるようにする新鮮腫瘍断片の凍結保存が含まれる。 [0051]後にプレＲＥＰ培養を開始するために使用される新鮮腫瘍断片の凍結保存を含む、ＴＩＬ製造の実施形態を示す。 [0052]後にプレＲＥＰ培養を開始するために使用される新鮮腫瘍断片の凍結保存を含む、ＴＩＬ製造の実施形態を示す。 [0053]一般に、プロセス１Ｃの実施形態をプロセス２Ａの例示的な実施形態と比較する。プロセス２Ａは、新鮮腫瘍組織断片又は解凍された凍結保存腫瘍組織断片のいずれかからのプレＲＥＰ培養の開始を企図している。 [0054]さらに、プロセス１Ｃの実施形態をプロセス２Ａの実施形態と比較する。 [0055]ＲＥＰが「早期」に開始される２Ａプロセスの実施形態を示す。 [0056]Ｇｅｎ２Ａプロセス及び「Ｇｅｎ２．２」と呼ばれる改変Ｇｅｎ２Ａプロセスに由来する生細胞の総数を比較し、ここで、プレＲＥＰ培養は、新鮮、瞬間冷凍、又は２℃～８℃の貯蔵培地で３０分若しくは６０分のインキュベーション後の冷凍で開始しされる。細胞カウントはプレＲＥＰ培養の終了時のものである。 [0057]Ｇｅｎ２Ａプロセス及び「Ｇｅｎ２．２」と呼ばれる改変Ｇｅｎ２Ａプロセスに由来する生細胞の総数を比較し、ここで、プレＲＥＰ培養は、新鮮、瞬間冷凍、又は２℃～８℃の貯蔵培地で３０分若しくは６０分のインキュベーション後の冷凍で開始しされる。細胞数はＲＥＰ培養の終了時のものである。 [0058]Ｇｅｎ２Ａプロセス及び「Ｇｅｎ２．２」と呼ばれる改変Ｇｅｎ２Ａプロセスに由来する細胞によって産生されたＩＦＮ－γを比較し、ここで、プレＲＥＰ培養は、新鮮、瞬間冷凍、又は２℃～８℃の貯蔵培地で３０分若しくは６０分のインキュベーション後の冷凍で開始しされる。 [0059]Ｇｅｎ２．２の実施形態の主要ステップと比較した、Ｇｅｎ２の実施形態の主要なステップを示す。 [0060]１／１００スケールのＴＩＬ産生プロセスの主要なステップを示す。 [0061]図１３Ａ～１３Ｅは、５人の異なる患者から処理され、プレＲＥＰに収集された腫瘍サンプルの総生細胞（ＴＶＣ）を示す。ＴＶＣは、新鮮な（Ｇｅｎ２対照）及び凍結した腫瘍サンプルを使用して測定した。ＴＶＣは、新鮮腫瘍サンプルの場合は１１日目に、凍結腫瘍サンプルの場合は７日目に記録された。図１３Ａ（患者Ｍ１１２５）は、その腫瘍サンプルが異なる凍結方法：液体窒素の気相での瞬間冷凍、及び液体窒素の気相での瞬間冷凍前に２～８℃で３０分間又は６０分間のインキュベーション、に供された唯一の患者を示す。残りの患者Ｓ１３０１８、ＯＶ８０２２、Ｔ６０４２、及びＯ８０２６（それぞれ、図１３Ｂ～１３Ｅ）について、腫瘍サンプルは、瞬間冷凍の前に、２～８°で６０分間インキュベートされた。各患者について、腫瘍サンプルを直径３ｍｍの断片に切断し、４～６個の断片を培養に使用した。グラフの各バーは、フルスケール（１０を掛けたもの）に外挿されたＴＶＣを表す。図１３Ａでは、凍結された早期プレＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約１％のＴＶＣ、図１３Ｂでは、新鮮なものに対して約２５％のＴＶＣ、図１３Ｃでは、新鮮なものに対して約２００％、図１３Ｄでは、新鮮なものに対して約９６％、図１３Ｅでは、新鮮なものに対して約３％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからのＴＶＣが１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0061]図１３Ａ～１３Ｅは、５人の異なる患者から処理され、プレＲＥＰに収集された腫瘍サンプルの総生細胞（ＴＶＣ）を示す。ＴＶＣは、新鮮な（Ｇｅｎ２対照）及び凍結した腫瘍サンプルを使用して測定した。ＴＶＣは、新鮮腫瘍サンプルの場合は１１日目に、凍結腫瘍サンプルの場合は７日目に記録された。図１３Ａ（患者Ｍ１１２５）は、その腫瘍サンプルが異なる凍結方法：液体窒素の気相での瞬間冷凍、及び液体窒素の気相での瞬間冷凍前に２～８℃で３０分間又は６０分間のインキュベーション、に供された唯一の患者を示す。残りの患者Ｓ１３０１８、ＯＶ８０２２、Ｔ６０４２、及びＯ８０２６（それぞれ、図１３Ｂ～１３Ｅ）について、腫瘍サンプルは、瞬間冷凍の前に、２～８°で６０分間インキュベートされた。各患者について、腫瘍サンプルを直径３ｍｍの断片に切断し、４～６個の断片を培養に使用した。グラフの各バーは、フルスケール（１０を掛けたもの）に外挿されたＴＶＣを表す。図１３Ａでは、凍結された早期プレＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約１％のＴＶＣ、図１３Ｂでは、新鮮なものに対して約２５％のＴＶＣ、図１３Ｃでは、新鮮なものに対して約２００％、図１３Ｄでは、新鮮なものに対して約９６％、図１３Ｅでは、新鮮なものに対して約３％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからのＴＶＣが１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0061]図１３Ａ～１３Ｅは、５人の異なる患者から処理され、プレＲＥＰに収集された腫瘍サンプルの総生細胞（ＴＶＣ）を示す。ＴＶＣは、新鮮な（Ｇｅｎ２対照）及び凍結した腫瘍サンプルを使用して測定した。ＴＶＣは、新鮮腫瘍サンプルの場合は１１日目に、凍結腫瘍サンプルの場合は７日目に記録された。図１３Ａ（患者Ｍ１１２５）は、その腫瘍サンプルが異なる凍結方法：液体窒素の気相での瞬間冷凍、及び液体窒素の気相での瞬間冷凍前に２～８℃で３０分間又は６０分間のインキュベーション、に供された唯一の患者を示す。残りの患者Ｓ１３０１８、ＯＶ８０２２、Ｔ６０４２、及びＯ８０２６（それぞれ、図１３Ｂ～１３Ｅ）について、腫瘍サンプルは、瞬間冷凍の前に、２～８°で６０分間インキュベートされた。各患者について、腫瘍サンプルを直径３ｍｍの断片に切断し、４～６個の断片を培養に使用した。グラフの各バーは、フルスケール（１０を掛けたもの）に外挿されたＴＶＣを表す。図１３Ａでは、凍結された早期プレＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約１％のＴＶＣ、図１３Ｂでは、新鮮なものに対して約２５％のＴＶＣ、図１３Ｃでは、新鮮なものに対して約２００％、図１３Ｄでは、新鮮なものに対して約９６％、図１３Ｅでは、新鮮なものに対して約３％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからのＴＶＣが１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0061]図１３Ａ～１３Ｅは、５人の異なる患者から処理され、プレＲＥＰに収集された腫瘍サンプルの総生細胞（ＴＶＣ）を示す。ＴＶＣは、新鮮な（Ｇｅｎ２対照）及び凍結した腫瘍サンプルを使用して測定した。ＴＶＣは、新鮮腫瘍サンプルの場合は１１日目に、凍結腫瘍サンプルの場合は７日目に記録された。図１３Ａ（患者Ｍ１１２５）は、その腫瘍サンプルが異なる凍結方法：液体窒素の気相での瞬間冷凍、及び液体窒素の気相での瞬間冷凍前に２～８℃で３０分間又は６０分間のインキュベーション、に供された唯一の患者を示す。残りの患者Ｓ１３０１８、ＯＶ８０２２、Ｔ６０４２、及びＯ８０２６（それぞれ、図１３Ｂ～１３Ｅ）について、腫瘍サンプルは、瞬間冷凍の前に、２～８°で６０分間インキュベートされた。各患者について、腫瘍サンプルを直径３ｍｍの断片に切断し、４～６個の断片を培養に使用した。グラフの各バーは、フルスケール（１０を掛けたもの）に外挿されたＴＶＣを表す。図１３Ａでは、凍結された早期プレＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約１％のＴＶＣ、図１３Ｂでは、新鮮なものに対して約２５％のＴＶＣ、図１３Ｃでは、新鮮なものに対して約２００％、図１３Ｄでは、新鮮なものに対して約９６％、図１３Ｅでは、新鮮なものに対して約３％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからのＴＶＣが１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0061]図１３Ａ～１３Ｅは、５人の異なる患者から処理され、プレＲＥＰに収集された腫瘍サンプルの総生細胞（ＴＶＣ）を示す。ＴＶＣは、新鮮な（Ｇｅｎ２対照）及び凍結した腫瘍サンプルを使用して測定した。ＴＶＣは、新鮮腫瘍サンプルの場合は１１日目に、凍結腫瘍サンプルの場合は７日目に記録された。図１３Ａ（患者Ｍ１１２５）は、その腫瘍サンプルが異なる凍結方法：液体窒素の気相での瞬間冷凍、及び液体窒素の気相での瞬間冷凍前に２～８℃で３０分間又は６０分間のインキュベーション、に供された唯一の患者を示す。残りの患者Ｓ１３０１８、ＯＶ８０２２、Ｔ６０４２、及びＯ８０２６（それぞれ、図１３Ｂ～１３Ｅ）について、腫瘍サンプルは、瞬間冷凍の前に、２～８°で６０分間インキュベートされた。各患者について、腫瘍サンプルを直径３ｍｍの断片に切断し、４～６個の断片を培養に使用した。グラフの各バーは、フルスケール（１０を掛けたもの）に外挿されたＴＶＣを表す。図１３Ａでは、凍結された早期プレＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約１％のＴＶＣ、図１３Ｂでは、新鮮なものに対して約２５％のＴＶＣ、図１３Ｃでは、新鮮なものに対して約２００％、図１３Ｄでは、新鮮なものに対して約９６％、図１３Ｅでは、新鮮なものに対して約３％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからのＴＶＣが１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0062]図１４Ａ～１４Ｅは、早期ＲＥＰ中に収集された図１３と同じ５人の患者からの腫瘍サンプルのＴＶＣを示す。図１３に示すように、１１日目（新鮮）と７日目（凍結）に細胞を回収した。図１４Ａでは、凍結された早期ＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約８６％のＴＶＣ、図１４Ｂでは、新鮮なものに対して約９８％のＴＶＣ、図１４Ｃでは、新鮮なものに対して約１２４％、図１４Ｄでは、新鮮なものに対して約２８６％、図１４Ｅでは、新鮮なものに対して約１６７％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからの収量全体（ＴＶＣとして測定される）が早期ＲＥＰ中１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0062]図１４Ａ～１４Ｅは、早期ＲＥＰ中に収集された図１３と同じ５人の患者からの腫瘍サンプルのＴＶＣを示す。図１３に示すように、１１日目（新鮮）と７日目（凍結）に細胞を回収した。図１４Ａでは、凍結された早期ＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約８６％のＴＶＣ、図１４Ｂでは、新鮮なものに対して約９８％のＴＶＣ、図１４Ｃでは、新鮮なものに対して約１２４％、図１４Ｄでは、新鮮なものに対して約２８６％、図１４Ｅでは、新鮮なものに対して約１６７％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからの収量全体（ＴＶＣとして測定される）が早期ＲＥＰ中１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0062]図１４Ａ～１４Ｅは、早期ＲＥＰ中に収集された図１３と同じ５人の患者からの腫瘍サンプルのＴＶＣを示す。図１３に示すように、１１日目（新鮮）と７日目（凍結）に細胞を回収した。図１４Ａでは、凍結された早期ＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約８６％のＴＶＣ、図１４Ｂでは、新鮮なものに対して約９８％のＴＶＣ、図１４Ｃでは、新鮮なものに対して約１２４％、図１４Ｄでは、新鮮なものに対して約２８６％、図１４Ｅでは、新鮮なものに対して約１６７％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからの収量全体（ＴＶＣとして測定される）が早期ＲＥＰ中１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0062]図１４Ａ～１４Ｅは、早期ＲＥＰ中に収集された図１３と同じ５人の患者からの腫瘍サンプルのＴＶＣを示す。図１３に示すように、１１日目（新鮮）と７日目（凍結）に細胞を回収した。図１４Ａでは、凍結された早期ＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約８６％のＴＶＣ、図１４Ｂでは、新鮮なものに対して約９８％のＴＶＣ、図１４Ｃでは、新鮮なものに対して約１２４％、図１４Ｄでは、新鮮なものに対して約２８６％、図１４Ｅでは、新鮮なものに対して約１６７％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからの収量全体（ＴＶＣとして測定される）が早期ＲＥＰ中１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0062]図１４Ａ～１４Ｅは、早期ＲＥＰ中に収集された図１３と同じ５人の患者からの腫瘍サンプルのＴＶＣを示す。図１３に示すように、１１日目（新鮮）と７日目（凍結）に細胞を回収した。図１４Ａでは、凍結された早期ＲＥＰ培養は、新鮮なものに対して約８６％のＴＶＣ、図１４Ｂでは、新鮮なものに対して約９８％のＴＶＣ、図１４Ｃでは、新鮮なものに対して約１２４％、図１４Ｄでは、新鮮なものに対して約２８６％、図１４Ｅでは、新鮮なものに対して約１６７％を得た。データは、７日目の冷凍腫瘍サンプルからの収量全体（ＴＶＣとして測定される）が早期ＲＥＰ中１１日目の新鮮腫瘍サンプルからと同等であることを示す。 [0063]図１５は、４人の患者からの新鮮な腫瘍サンプルと凍結した腫瘍サンプルのＣＤ８／ＣＤ４比を示す。新鮮又は凍結ＲＥＰ ＴＩＬサンプルをフローサイトメトリー抗体（CD3-BUV395、CD62LBV421、CD57-PB、CD11c-BV711、CD28-BB515、CD19-BUV563、CCR7-PE、CD123-BV605、CD27PE-CF594、CD14-BV-650、TCRg/d-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD45RA-A700、CD56-BUV737、CD8-BV786、CD4-PE-Cy7AND CD16-APC-Vio770）で染色した。ＴＩＬの同一性は、ＴＣＲａ／ｂ＋又はｇ／ｄ＋、単球（ＣＤ１４＋）、ＮＫ（ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋及びＢ細胞（ＣＤ１９＋））に基づいて決定され、純度はＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞に基づいて決定された。患者Ｍ１１２５及びＴ６０４２は高いＣＤ８発現を示したが、全体としてＣＤ８／ＣＤ４比は新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等である。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0064]図１６Ａ～１６Ｈは、図１５と同じ４人の患者におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋の発現及び他のマーカーの発現を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは患者Ｍ１１２５のデータを示す。図１６Ｃ及び１６Ｄは患者Ｓ１３０１８のデータを示す。図１６Ｅ及び１６Ｆは患者ＯＶ８０２２のデータを示す。図１６Ｇ及び１６Ｈは患者Ｔ６０４２のデータを示す。データは、ＴＩＬの純度が新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0065]図１７Ａ～１７Ｃは、新鮮及び凍結腫瘍サンプルからのＣＤ４又はＣＤ８を発現する細胞におけるＣＤ２８、ＣＤ２７、及びＣＤ５７の発現を示す。図１７Ａは患者Ｍ１１２５に関する。 図１７Ｂは患者Ｓ１３０１８に関する。 図１７Ｃは患者Ｔ６０４２に関する。データは、新鮮な腫瘍サンプルと凍結した腫瘍サンプルの間の分化状態が同等であることを示す。 [0066]図１８Ａ～１８Ｃは、ＣＤ４又はＣＤ８を発現している細胞の新鮮腫瘍サンプル及び凍結腫瘍サンプルのメモリー状態を示す。図１８Ａは患者Ｍ１１２５に関する。 図１８Ｂは患者Ｓ１３０１８に関する。 図１８Ｃは患者Ｔ６０４２に関する。データは、新鮮な腫瘍サンプルと凍結した腫瘍サンプルの間のメモリー状態が同等であることを示す。ＴＮ：ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、ＴＣＭ：セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋）、ＴＥＭ：エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－）、ＴＥＭＲＡ／ＴＥＦＦ：ＲＡ＋エフェクターメモリー／エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７）、セントラルメモリー／活性化細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）。示された棒グラフは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋でゲーティングされた場合の陽性ＣＤ４５＋／－又はＣＣＲ７＋／－又はＣＤ６２Ｌ＋／－のパーセンテージである。 [0067]図１９Ａ～１９Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図１９Ａ）；Ｓ１３０１８（図１９Ｂ）；及びＴ６０４２（図１９Ｃ）における、ＣＤ４（上パネル）又はＣＤ８（下パネル）を発現する細胞における新鮮及び凍結腫瘍サンプル中の活性化／枯渇マーカーを示す。ＲＥＰ ＴＩＬの活性化と枯渇は、マルチカラーフローサイトメトリーによって決定された。腫瘍組織を抗体（CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle 594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780）で染色し、フローサイトメトリーを使用して発現を測定した。全体として、ＴＩＬの活性化／枯渇状態は、新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等である。 [0067]図１９Ａ～１９Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図１９Ａ）；Ｓ１３０１８（図１９Ｂ）；及びＴ６０４２（図１９Ｃ）における、ＣＤ４（上パネル）又はＣＤ８（下パネル）を発現する細胞における新鮮及び凍結腫瘍サンプル中の活性化／枯渇マーカーを示す。ＲＥＰ ＴＩＬの活性化と枯渇は、マルチカラーフローサイトメトリーによって決定された。腫瘍組織を抗体（CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle 594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780）で染色し、フローサイトメトリーを使用して発現を測定した。全体として、ＴＩＬの活性化／枯渇状態は、新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等である。 [0067]図１９Ａ～１９Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図１９Ａ）；Ｓ１３０１８（図１９Ｂ）；及びＴ６０４２（図１９Ｃ）における、ＣＤ４（上パネル）又はＣＤ８（下パネル）を発現する細胞における新鮮及び凍結腫瘍サンプル中の活性化／枯渇マーカーを示す。ＲＥＰ ＴＩＬの活性化と枯渇は、マルチカラーフローサイトメトリーによって決定された。腫瘍組織を抗体（CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle 594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780）で染色し、フローサイトメトリーを使用して発現を測定した。全体として、ＴＩＬの活性化／枯渇状態は、新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルの間で同等である。 [0068]図２０Ａ～２０Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２０Ａ）；Ｓ１３０１８（図２０Ｂ）；及びＴ６０４２（図２０Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるＩＦＮγ機能を示す。１×１０５個のＲＥＰ ＴＩＬを抗ＣＤ３プレートに２４時間プレーティングした。培養上清を収集し、IFNγ Qantikine ELISAキットを使用してＩＦＮγサイトカインを測定した。ここに示される棒グラフは、３回の測定の平均＋ＳＤである。スチューデントの「ｔ」検定を使用して、統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全体として、データは、ＩＦＮγ機能が凍結腫瘍サンプルにおいて、より高いことを示す。 [0068]図２０Ａ～２０Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２０Ａ）；Ｓ１３０１８（図２０Ｂ）；及びＴ６０４２（図２０Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるＩＦＮγ機能を示す。１×１０５個のＲＥＰ ＴＩＬを抗ＣＤ３プレートに２４時間プレーティングした。培養上清を収集し、IFNγ Qantikine ELISAキットを使用してＩＦＮγサイトカインを測定した。ここに示される棒グラフは、３回の測定の平均＋ＳＤである。スチューデントの「ｔ」検定を使用して、統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全体として、データは、ＩＦＮγ機能が凍結腫瘍サンプルにおいて、より高いことを示す。 [0068]図２０Ａ～２０Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２０Ａ）；Ｓ１３０１８（図２０Ｂ）；及びＴ６０４２（図２０Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるＩＦＮγ機能を示す。１×１０５個のＲＥＰ ＴＩＬを抗ＣＤ３プレートに２４時間プレーティングした。培養上清を収集し、IFNγ Qantikine ELISAキットを使用してＩＦＮγサイトカインを測定した。ここに示される棒グラフは、３回の測定の平均＋ＳＤである。スチューデントの「ｔ」検定を使用して、統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全体として、データは、ＩＦＮγ機能が凍結腫瘍サンプルにおいて、より高いことを示す。 [0069]図２１Ａ～２１Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２１Ａ）；Ｓ１３０１８（図２１Ｂ）；及びＴ６０４２（図２１Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）機能を示す。１×１０５個のＲＥＰ ＴＩＬを抗ＣＤ３プレートに２４時間プレーティングした。培養上清を収集し、DuoセットELISAキットを使用してグランザイムＢについて測定した。ここに示される棒グラフは、３回の測定の平均＋ＳＤである。スチューデントの「ｔ」検定を使用して、統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全体として、データは、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）機能が凍結腫瘍サンプルにおいて、同等／より高いことを示す。 [0069]図２１Ａ～２１Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２１Ａ）；Ｓ１３０１８（図２１Ｂ）；及びＴ６０４２（図２１Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）機能を示す。１×１０５個のＲＥＰ ＴＩＬを抗ＣＤ３プレートに２４時間プレーティングした。培養上清を収集し、DuoセットELISAキットを使用してグランザイムＢについて測定した。ここに示される棒グラフは、３回の測定の平均＋ＳＤである。スチューデントの「ｔ」検定を使用して、統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全体として、データは、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）機能が凍結腫瘍サンプルにおいて、同等／より高いことを示す。 [0069]図２１Ａ～２１Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２１Ａ）；Ｓ１３０１８（図２１Ｂ）；及びＴ６０４２（図２１Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）機能を示す。１×１０５個のＲＥＰ ＴＩＬを抗ＣＤ３プレートに２４時間プレーティングした。培養上清を収集し、DuoセットELISAキットを使用してグランザイムＢについて測定した。ここに示される棒グラフは、３回の測定の平均＋ＳＤである。スチューデントの「ｔ」検定を使用して、統計的有意性を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全体として、データは、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）機能が凍結腫瘍サンプルにおいて、同等／より高いことを示す。 [0070]図２２Ａ～２２Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２２Ａ）；Ｓ１３０１８（図２２Ｂ）；及びＴ６０４２（図２２Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるＣＤ１０７Ａ発現を示す。２×１０５ＲＥＰ ＴＩＬは、ＰＭＡ／ＩＯの刺激を伴い又は伴わず２時間刺激され、ＣＤ１０７Ａ－ＡＰＣ７００で染色され、フローサイトメトリーで分析された。棒グラフは、ＣＤ８又はＣＤ４でゲーティングされたＣＤ１０７Ａ陽性細胞を表す。全体として、データはＣＤ１０７Ａ発現が新鮮な腫瘍サンプルと凍結した腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0070]図２２Ａ～２２Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２２Ａ）；Ｓ１３０１８（図２２Ｂ）；及びＴ６０４２（図２２Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるＣＤ１０７Ａ発現を示す。２×１０５ＲＥＰ ＴＩＬは、ＰＭＡ／ＩＯの刺激を伴い又は伴わず２時間刺激され、ＣＤ１０７Ａ－ＡＰＣ７００で染色され、フローサイトメトリーで分析された。棒グラフは、ＣＤ８又はＣＤ４でゲーティングされたＣＤ１０７Ａ陽性細胞を表す。全体として、データはＣＤ１０７Ａ発現が新鮮な腫瘍サンプルと凍結した腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0070]図２２Ａ～２２Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２２Ａ）；Ｓ１３０１８（図２２Ｂ）；及びＴ６０４２（図２２Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおけるＣＤ１０７Ａ発現を示す。２×１０５ＲＥＰ ＴＩＬは、ＰＭＡ／ＩＯの刺激を伴い又は伴わず２時間刺激され、ＣＤ１０７Ａ－ＡＰＣ７００で染色され、フローサイトメトリーで分析された。棒グラフは、ＣＤ８又はＣＤ４でゲーティングされたＣＤ１０７Ａ陽性細胞を表す。全体として、データはＣＤ１０７Ａ発現が新鮮な腫瘍サンプルと凍結した腫瘍サンプルの間で同等であることを示す。 [0071]図２３Ａ～２３Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２３Ａ）；Ｓ１３０１８（図２３Ｂ）；及びＴ６０４２（図２３Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおける１３０１細胞に対するテロメア長を示す。Dako/Agilent Pathology Solutions（フローサイトメトリー用テロメアＰＮＡ Ｋｉｔ／ＦＩＴＣ）キットを使用してフローＦＩＳＨを実施し、製造者の指示に従ってテロメア反復の平均長を測定した。１３０１Ｔ細胞白血病細胞株（SigmaAldrich、St. Louis, MO）を各アッセイの内部参照標準として使用した。個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１細胞と混合した。２×１０６ＴＩＬを２×１０６１３０１細胞と混合し、ＦＩＴＣコンジュゲート・テロメアＰＮＡプローブ（ＦＩＴＣ－００－ＣＣＣＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ）を使用してin situハイブリダイゼーションを実施し、フローサイトメトリー（BD canto II）を使用して分析した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１細胞の幾何平均蛍光（ｆｌ）のパーセンテージとして表された。相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×１３０１細胞のＤＮＡ指標×１００］／［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／プローブ－平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／ｏプローブ）×試験細胞のＤＮＡ指標。データは、テロメア長が新鮮腫瘍サンプルよりも凍結腫瘍サンプルで同等であるか又はそれを超えることを示す。 [0071]図２３Ａ～２３Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２３Ａ）；Ｓ１３０１８（図２３Ｂ）；及びＴ６０４２（図２３Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおける１３０１細胞に対するテロメア長を示す。Dako/Agilent Pathology Solutions（フローサイトメトリー用テロメアＰＮＡ Ｋｉｔ／ＦＩＴＣ）キットを使用してフローＦＩＳＨを実施し、製造者の指示に従ってテロメア反復の平均長を測定した。１３０１Ｔ細胞白血病細胞株（SigmaAldrich、St. Louis, MO）を各アッセイの内部参照標準として使用した。個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１細胞と混合した。２×１０６ＴＩＬを２×１０６１３０１細胞と混合し、ＦＩＴＣコンジュゲート・テロメアＰＮＡプローブ（ＦＩＴＣ－００－ＣＣＣＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ）を使用してin situハイブリダイゼーションを実施し、フローサイトメトリー（BD canto II）を使用して分析した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１細胞の幾何平均蛍光（ｆｌ）のパーセンテージとして表された。相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×１３０１細胞のＤＮＡ指標×１００］／［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／プローブ－平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／ｏプローブ）×試験細胞のＤＮＡ指標。データは、テロメア長が新鮮腫瘍サンプルよりも凍結腫瘍サンプルで同等であるか又はそれを超えることを示す。 [0071]図２３Ａ～２３Ｃは、３人の患者：Ｍ１１２５（図２３Ａ）；Ｓ１３０１８（図２３Ｂ）；及びＴ６０４２（図２３Ｃ）の新鮮及び凍結腫瘍サンプルにおける１３０１細胞に対するテロメア長を示す。Dako/Agilent Pathology Solutions（フローサイトメトリー用テロメアＰＮＡ Ｋｉｔ／ＦＩＴＣ）キットを使用してフローＦＩＳＨを実施し、製造者の指示に従ってテロメア反復の平均長を測定した。１３０１Ｔ細胞白血病細胞株（SigmaAldrich、St. Louis, MO）を各アッセイの内部参照標準として使用した。個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１細胞と混合した。２×１０６ＴＩＬを２×１０６１３０１細胞と混合し、ＦＩＴＣコンジュゲート・テロメアＰＮＡプローブ（ＦＩＴＣ－００－ＣＣＣＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ－ＣＣＣ－ＴＡＡ）を使用してin situハイブリダイゼーションを実施し、フローサイトメトリー（BD canto II）を使用して分析した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１細胞の幾何平均蛍光（ｆｌ）のパーセンテージとして表された。相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ平均ＦＩＴＣ ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×１３０１細胞のＤＮＡ指標×１００］／［（平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／プローブ－平均ＦＩＴＣ ｆｌ １３０１細胞ｗ／ｏプローブ）×試験細胞のＤＮＡ指標。データは、テロメア長が新鮮腫瘍サンプルよりも凍結腫瘍サンプルで同等であるか又はそれを超えることを示す。 [0072]図２４は、新鮮及び凍結腫瘍断片からのＴＩＬの拡大培養プロセス：新鮮方法（「ＧＥＮ２」）、早期ＲＥＰ方法１（「ＥＲ－１」）、及び早期ＲＥＰ方法２（「ＥＲ－２」）、の特定の実施形態を示すフローチャートである。 [0073]図２５は、例えば４－１ＢＢＬ、又は４－１ＢＢに結合する抗体に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、折り畳まれて三価（triavelent）タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さな細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する、構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂを示す。
配列表の簡単な説明
[0074] 配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[0075] 配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[0076] 配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
[0077] 配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[0078] 配列番号５は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
[0079] 配列番号６は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
[0080] 配列番号７は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[0081] 配列番号８は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。
[0082] 配列番号９は、ヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
[0083] 配列番号１０は、マウス４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
[0084] 配列番号１１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖である。
[0085] 配列番号１２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖である。
[0086] 配列番号１３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[0087] 配列番号１４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[0088] 配列番号１５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。
[0089] 配列番号１６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。
[0090] 配列番号１７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。
[0091] 配列番号１８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[0092] 配列番号１９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[0093] 配列番号２０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[0094] 配列番号２１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖である。
[0095] 配列番号２２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖である。
[0096] 配列番号２３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[0097] 配列番号２４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[0098] 配列番号２５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。
[0099] 配列番号２６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00100] 配列番号２７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00101] 配列番号２８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00102] 配列番号２９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00103] 配列番号３０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00104] 配列番号３１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00105] 配列番号３２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00106] 配列番号３３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00107] 配列番号３４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00108] 配列番号３５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00109] 配列番号３６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00110] 配列番号３７は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00111] 配列番号３８は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00112] 配列番号３９は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00113] 配列番号４０は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00114] 配列番号４１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00115] 配列番号４２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00116] 配列番号４３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00117] 配列番号４４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00118] 配列番号４５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00119] 配列番号４６は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。
[00120] 配列番号４７は、４－１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。
[00121] 配列番号４８は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00122] 配列番号４９は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00123] 配列番号５０は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00124] 配列番号５１は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00125] 配列番号５２は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00126] 配列番号５３は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00127] 配列番号５４は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00128] 配列番号５５は、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00129] 配列番号５６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖である。
[00130] 配列番号５７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖である。
[00131] 配列番号５８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00132] 配列番号５９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00133] 配列番号６０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00134] 配列番号６１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00135] 配列番号６２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00136] 配列番号６３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00137] 配列番号６４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00138] 配列番号６５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00139] 配列番号６６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖である。
[00140] 配列番号６７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖である。
[00141] 配列番号６８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00142] 配列番号６９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00143] 配列番号７０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ１である。
[00144] 配列番号７１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２である。
[00145] 配列番号７２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３である。
[00146] 配列番号７３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00147] 配列番号７４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00148] 配列番号７５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00149] 配列番号７６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖である。
[00150] 配列番号７７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖である。
[00151] 配列番号７８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00152] 配列番号７９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00153] 配列番号８０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ１である。
[00154] 配列番号８１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ２である。
[00155] 配列番号８２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ３である。
[00156] 配列番号８３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00157] 配列番号８４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00158] 配列番号８５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00159] 配列番号８６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00160] 配列番号８７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00161] 配列番号８８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00162] 配列番号８９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00163] 配列番号９０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00164] 配列番号９１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00165] 配列番号９２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00166] 配列番号９３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00167] 配列番号９４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00168] 配列番号９５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00169] 配列番号９６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00170] 配列番号９７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00171] 配列番号９８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00172] 配列番号９９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00173] 配列番号１００は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00174] 配列番号１０１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00175] 配列番号１０２は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）アミノ酸配列である。
[00176] 配列番号１０３は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの可溶性部分である。
[00177] 配列番号１０４は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00178] 配列番号１０５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00179] 配列番号１０６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00180] 配列番号１０７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00181] 配列番号１０８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00182] 配列番号１０９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00183] 配列番号１１０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00184] 配列番号１１１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00185] 配列番号１１２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00186] 配列番号１１３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00187] 配列番号１１４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00188] 配列番号１１５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00189] 配列番号１１６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00190] 配列番号１１７は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00191] 配列番号１１８は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00192] 配列番号１１９は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00193] 配列番号１２０は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00194] 配列番号１２１は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00195] 配列番号１２２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00196] 配列番号１２３は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00197] 配列番号１２４は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00198] 配列番号１２５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00199] 配列番号１２６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00200] 配列番号１２７は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖アミノ酸配列である。
[00201] 配列番号１２８は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖アミノ酸配列である。
[00202] 配列番号１２９は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
[00203] 配列番号１３０は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
[00204] 配列番号１３１は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00205] 配列番号１３２は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00206] 配列番号１３３は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00207] 配列番号１３４は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00208] 配列番号１３５は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00209] 配列番号１３６は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00210] 配列番号１３７は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの重鎖アミノ酸配列である。
[00211] 配列番号１３８は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの軽鎖アミノ酸配列である。
[00212] 配列番号１３９は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
[00213] 配列番号１４０は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
[00214] 配列番号１４１は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00215] 配列番号１４２は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00216] 配列番号１４３は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00217] 配列番号１４４は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00218] 配列番号１４５は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00219] 配列番号１４６は、ＰＤ－１阻害剤ペンブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00220] 配列番号１４７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖アミノ酸配列である。
[00221] 配列番号１４８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖アミノ酸配列である。
[00222] 配列番号１４９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
[00223] 配列番号１５０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
[00224] 配列番号１５１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00225] 配列番号１５２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00226] 配列番号１５３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00227] 配列番号１５４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00228] 配列番号１５５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00229] 配列番号１５６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00230] 配列番号１５７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖アミノ酸配列である。
[00231] 配列番号１５８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖アミノ酸配列である。
[00232] 配列番号１５９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
[00233] 配列番号１６０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
[00234] 配列番号１６１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00235] 配列番号１６２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00236] 配列番号１６３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00237] 配列番号１６４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00238] 配列番号１６５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00239] 配列番号１６６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00240] 配列番号１６７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖アミノ酸配列である。
[00241] 配列番号１６８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖アミノ酸配列である。
[00242] 配列番号１６９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列である。
[00243] 配列番号１７０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列である。
[00244] 配列番号１７１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00245] 配列番号１７２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00246] 配列番号１７３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
[00247] 配列番号１７４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。
[00248] 配列番号１７５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。
[00249] 配列番号１７６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
[00250] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
[00251] 「凍結」という用語は、組織、細胞組成物、又は他の組成物が、低温にさらされた結果として硬化又は剛体化したことを意味する。本明細書で使用される用語は、貯蔵された細胞、組織などがそれらの生存能力を維持する非常に低い温度で細胞、組織などを貯蔵するプロセスである、凍結保存の概念を包含する。
[00252] 「凍結貯蔵」という用語は、貯蔵された細胞、組織などがそれらの生存能力を維持する、非常に低い温度で、すでに凍結された組成物を維持することを意味する。
[00253] 「瞬間冷凍（flash freezing）」、「瞬間冷凍（snap freezing）」、「瞬間凍結（flash frozen）」、及び「瞬間凍結（snap frozen）」という用語は、非限定的な例として、約２分未満で非常に急速に凍結させることを意味する。
[00254] 「LOVO細胞処理システム」及び「LOVO」という用語は、Fresenius Kabi USA, LLCによって製造された細胞処理システムを指す。これらの２つの用語はまた、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された任意の機器又は装置も指す。一部の実施形態において、そのようなセルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00255] 「ファンギン」という用語は、InvitroGen, San Diego, CA, USA（カタログ番号ant-fn-1及びant-fn-2）によって販売されている抗真菌試薬Fungin（商標）を指す。ファンギン(Fungin)は、ピマリシンの可溶性製剤、ＣＡＳ７６８１－９３－８である。本明細書で使用される場合、「ファンギン」は、ピマリシン又はナタマイシンの任意の市販製剤を包含する。
[00256] 「ファンギゾン」という用語は、E. R.Squibb and Sons, LLCの商標であり、抗真菌性アムホテリシンＢ、ＣＡＳ１３９７－８９－３を指す。アンホテリシンＢは、例えば、SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO, USAから市販されている（カタログ番号Ａ２９４２、脱イオン水中の２５０μｇ／ｍＬ溶液として）。本明細書で使用される場合、「ファンギゾン」は、アムホテリシンＢの任意の市販製剤を包含する。
[00257] 「生理緩衝等張食塩水」という用語は、溶液が生理学的ｐＨ及び等張塩濃度で作製される、当業者に公知の多くの塩溶液のいずれか１つを意味する。当技術分野では、これらは一般に平衡塩類溶液と称される。限定されないが、そのような生理緩衝等張食塩水は、ハンクス平衡塩類溶液（「ＨＢＳＳ」）、トリス緩衝生理食塩水（「ＴＢＳ」）、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）、又はダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（「ＤＰＢＳ」又は「ｄＰＢＳ」）を含み得る。
[00258] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
[00259] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
[00260] 用語「エキソビボ」は、対象の体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の体に戻され得る。
[00261] 用語「急速拡大培養」は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍）、より好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、又は９０倍）、又は最も好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。複数の急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
[00262] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、及び拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」）を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。
[00263] 本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６～１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９～１．５×１０１０個の注入用の細胞集団が提供されるように行われる。
[00264] 本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク、又は拡大培養（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約－１５０℃～－６０℃の範囲の温度で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法はまた、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確さ及び虚偽防止のために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。
[00265] 本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
[00266] ＴＩＬは一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に、定義することができる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーのうちの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
[00267] 用語「凍結保存培地（cryopreservation media）」又は「凍結保存培地（cryopreservation medium）」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、５％のｖ／ｖＤＭＳＯ～１０％のｖ／ｖＤＭＳＯを含む培地が含まれ得、７％のｖ／ｖＤＭＳＯ～１０％のｖ／ｖＤＭＳＯを含む培地も含まれ得る。例示的培地には、CryoStor CS10、Hyperthermasol、及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「ＣＳ１０」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０倍地は、商品名「CryoStor（登録商標）CS10」と称される場合がある。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清、無動物成分培地である。
[00268] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトにおいてはリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
[00269] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後に、インターフェロン－γ、ＩＬ－４、及びＩＬ－５を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトにおいては肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。
[00270] 用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
[00271] 腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」、及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割、及び細切、並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
[00272] 用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である。
[00273] 用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。
[00274] 用語「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマもまた、European Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
Figure 0007658896000001
Figure 0007658896000002
[00275] 用語「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２を含む。ＩＬ－２は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）、並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）から市販で供給される組換えＩＬ－２の形態、及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのＩＬ－２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、分子量およそ１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ－２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ－２という用語はまた、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含む、ペグ化形態のＩＬ－２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00276] 用語「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これはＴｈ２ Ｔ細胞によって、並びに好酸球、好塩基球、及び肥満細胞によって産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ－４によって活性化されると、Ｔｈ２ Ｔ細胞は続いてポジティブフィードバックループにおいて、更なるＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４はまた、Ｂ細胞拡大培養及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
[00277] 用語「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞、並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発生を刺激することができる。ＩＬ－７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ－７受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
[00278] 用語「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
[00279] 用語「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン－２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ－２１を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc.,13:379-95(2014)に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、分子量１５．４ｋＤａの１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
[00280] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患処置を含むがこれに限定されない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、当業者により容易に決定され得る意図される用途（インビトロ、インビボ及びエクスビボ）、又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度、又は投与方法その他によって変動し得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
[00281] 「治療効果」は、その用語が本明細書で使用される場合、治療上の利益及び／又は予防上の利益を包含する。予防効果は、疾患又は状態の出現を遅らせるか又は排除すること、疾患又は状態の症状の発症を遅らせるか又は排除すること、疾患又は状態の進行を遅らせること、停止させること、又は逆行させること、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
[00282] 「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分もまた、記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
[00283] 範囲が、例えば、分子量又は化学式などの物理的又は化学的特性を説明するために本明細書で使用される場合、範囲の全ての組み合わせ及び部分的組み合わせ、並びにその中の特定の実施形態が含まれることが意図される。数値又は数値範囲を指す場合に「約」という用語を使用することは、参照される数値又は数値範囲が実験変動内（又は統計的実験誤差内）の近似値であり、したがって数値又は数値範囲が変動し得ることを意味する。変動は、典型的には、記載された数値又は数値範囲の０％から１５％、好ましくは０％から１０％、より好ましくは０％から５％である。「含んでいる（comprising）」という用語（及び「含む（comprise）」又は「含む（comprises）」又は「有する（having）」又は「含んでいる（including）」などの関連用語）は、例えば、記載される特性「からなる」又は「から本質的になる」物質、方法又はプロセスの任意の組成物の実施形態などの、実施形態を含む。
[00284] 本発明の化合物はまた、抗体を含む。「抗体（antibody）」及びその複数形の「抗体（antibodies）」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）又はそれらの単鎖を指す。「抗体」はさらに、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬで構成される。抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と称され、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）に分散することができる、超可変性を有する領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
[00285] 本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（又は単に「抗体部分」）という用語は、特異的に抗原に結合する能力を保持する抗体（例えば、ＩＬ－３３、ＳＴ２、ＣＤ２０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２）の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなり得る、ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., Nature, 1989, 341, 544-546）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域ペアが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として、それらが作製されることを可能にする、合成リンカーによって連結され得る；例えば、Bird et al., Science 1988, 242, 423-426；及びHuston et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988, 85, 5879-5883を参照）。そのようなｓｃＦｖ抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語内に包含されることを意図している。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して入手され、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
[00286] 本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
[00287] 「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから入手され、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、ハイブリドーマによって産生される。
[00288] 本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくはトランス染色体である動物（例えば、マウス）、又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明する）から分離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）、から分離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、生成又は分離された抗体、などの、組換え手段によって調製、発現、生成、又は分離された全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列につきトランスジェニックな動物を使用する場合は、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それらに関係している一方、インビボでのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
[00289] 本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。哺乳類には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＥの５つの抗体アイソタイプが存在する。ヒトでは、ＩｇＧアイソタイプにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡアイソタイプにはＩｇＡ１及びＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。
[00290] 「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
[00291] 「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の変異形態、例えば、抗体と別の活性医薬成分又は抗体とのコンジュゲートを指す。「コンジュゲート」、「抗体－薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」、又は「免疫コンジュゲート」という用語は、細菌毒素、細胞毒性薬又は放射性核種含有毒素などの、治療部分にコンジュゲートされた抗体又はその断片を指す。当技術分野で利用可能な方法を使用して、毒性部分を本発明の抗体にコンジュゲートすることができる。
[00292] 「ヒト化抗体」（単数又は複数）、及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図する。ヒトフレームワーク配列内で更なるフレームワーク領域の改変がなされてもよい。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の１５個の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体パフォーマンスをさらに改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部、を含む。更なる詳細については、Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-329；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol 1992, 2, 593-596を参照。
[00293] 「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すことを意図する。
[00294] 「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することによって、そのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を生成することを強いられる。ダイアボディは、例えば、欧州特許４０４，０９７号、国際特許公開第９３／１１１６１号；及びBolliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90, 6444-6448にさらに十分に記載されている。
[00295] 「グリコシル化」という用語は、抗体の改変誘導体を指す。アグリコシル化抗体は、グリコシル化を欠く。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために改変することができる。そのような炭水化物改変は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変えることによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を除去する、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されているように、アグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。追加的又は代替的に、減少したフコシル残基の量を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティング（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などの、グリコシル化の種類が変更された抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体の能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変えて宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が改変された細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているので、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体は、それらの炭水化物上でフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子を標的とした破壊によって生成された（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号又はYamane-Ohnuki et al, Biotechnol.Bioeng., 2004, 87, 614-622を参照）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号には、そのような細胞株で発現される抗体が、アルファ１，６結合関連酵素を減少させる又は排除することにより低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載され、また、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性の低い、又は酵素活性を有しない、細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）も記載される。国際公開第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）が連結した炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、また、その宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす、変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞が記載される（Shields, et al., J. Biol Chem.2002, 277, 26733-26740も参照。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株で発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを発現するよう操作された細胞株（例えば、ベータ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））が記載される（Umana, et al., Nat.Biotech.1999, 17, 176-180も参照）。或いは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断し得る。例えば、フコシダーゼであるアルファ－Ｌ－フコシダーゼは、Tarentino, et al., Biochem.1975, 14, 5516-5523に記載されるように、抗体由来のフコシル残基を除去する。
[00296] 「ペグ化」とは、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合するようになる条件下で、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応する、修飾抗体又はその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－若しくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれも包含することを意図する。ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体であり得る。ペグ化の方法は当技術分野において公知であり、例えば、欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号に記載されているように、本発明の抗体に適用することができる。
[00297] 「バイオシミラー」という用語は、生物学的製剤を意味し、これは、臨床的に不活性な成分におけるわずかな違いにもかかわらず、米国の認可された参照生物学的製剤と高度に類似しており、製品の安全性、純度、及び効力の点で、生物学的製剤と参照製品との間に臨床的に有意義な違いはない。さらに、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。生物学的製剤又は生物学的医薬は、細菌又は酵母などの生物学的供給源によって作製されるか又はそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリン又はエリスロポエチンなどの比較的小さな分子、又はモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照抗ＣＤ２０モノクローナル抗体がリツキシマブである場合、リツキシマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＣＤ２０バイオシミラーモノクローナル抗体は、リツキシマブ「に対するバイオシミラー」であるか、又はリツキシマブの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。欧州における同様の生物学的用途の関連法的根拠は、改正された規則（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）であり、したがって、欧州では、バイオシミラーは、規則（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条の下で認可され得、認可が承認され得、又は認可申請の対象であり得る。欧州では、すでに認可されている元の生物学的医薬品は「参照医薬品」と呼ばれることがある。バイオシミラーと見なされる製品の要件のいくつかは、類似生物学的医薬品（Similar Biological Medicinal Products）におけるCHMPガイドラインに概説されている。さらに、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、ＥＭＡによって製品毎に提供され、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び／又は有効性として、参照医薬品と類似し得る。さらに、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を処置するために使用されるか、又は使用を意図され得る。したがって、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した、又は非常に類似した品質特性を有すると見なし得る。或いは、又はさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した、又は非常に類似した生物学的活性を有すると見なし得る。或いは、又はさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した、又は非常に類似した安全性プロファイルを有すると見なし得る。或いは、又はさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した、又は非常に類似した有効性を有すると見なし得る。本明細書に記載されるように、欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可されている参照医薬品と比較される。しかしながら、一部の場合では、バイオシミラーは、特定の研究において欧州経済地域外で認可されている生物学的医薬品（ＥＥＡ非認可の「コンパレータ」）と比較され得る。そのような試験には、例えば、特定の臨床試験及びインビボ非臨床試験が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語はまた、非ＥＥＡ認可コンパレータと比較された、又は比較され得る、生物学的医薬品に関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意に影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな改変（例えば、アミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、相違が医薬品の安全性及び／又は有効性において変化をもたらさないことを条件として、参照医薬品の翻訳後改変とは異なる１つ以上の翻訳後改変、例えば、限定されるものではないが、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び／又は切断を含んでもよい。バイオシミラーは、参照医薬品と同一又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。排他的ではないが、特に、相違が参照医薬品に関する安全性の懸念に対処するか又は対処することを意図している場合、バイオシミラーは異なるグリコシル化パターンを有し得る。さらに、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれないならば、例えばその強度、医薬形態、製剤、賦形剤及び／又は提示において参照医薬品から逸脱してもよい。バイオシミラーは、例えば、参照医薬品と比較した場合の薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）プロファイルにおける相違を含み得るが、依然として承認されるか又は承認に適していると見なされるために、参照医薬品と十分に類似していると認められる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特性を示し、ここで、異なる結合特性は、ＥＭＡなどの規制当局によって、類似の生物学的製剤としての認可に対する障壁ではないと見なされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。
[00298] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含むがこれらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＳＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00299] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌などの、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00300] 「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。液体腫瘍から得られたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称される。
[00301] 本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形又は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
[00302] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団が提供され得、ここで、患者は、本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７～２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明によるＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
[00303] 実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00304] ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応につき比較し、整合させた場合に（必要であればギャップを導入する）、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00305] 本発明の特定の実施形態は、抗体、例えば、抗ＩＬ－３３又は抗ＳＴ２抗体及び／又は抗ＣＤ２０抗体及び／又は抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１及び／又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体、の変異体を含む。本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失、及び／又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列とは異なる、アミノ酸配列、を含む抗体を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。
[00306] 疑義を回避するために、本明細書では、本発明の特定の態様、実施形態又は例と併せて記載された特定の特徴（例えば、整数、特性、値、使用、疾患、式、化合物又は基）は、不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は例にも適用可能であると理解されるべきであることを意図する。したがって、そのような特徴は、必要に応じて、本明細書で定義された定義、特許請求の範囲又は実施形態のいずれかと共に使用することができる。本明細書に開示されている全ての特徴（添付の請求項、要約及び図面を含む）、及び／又はそのように開示されている任意の方法若しくはプロセスの全てのステップは、少なくとも一部の特徴及び／又はステップが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせ得る。本発明は、開示された実施形態のいかなる詳細にも限定されるものではない。本発明は、本明細書に開示されている特徴（添付の請求項、要約及び図面を含む）のうち任意の新規なもの、若しくは新規な組み合わせ、又はそのように開示された任意の方法又はプロセスのステップのうち任意の新規なもの、若しくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。
腫瘍凍結保存方法
[00307] 本発明は、
（ｉ）腫瘍組織を断片化すること；
（ｉｉ）断片を凍結保存培地中でインキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）断片を凍結することであって、凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための腫瘍組織を凍結保存するための方法を提供する。
[00308] 一実施形態において、腫瘍組織は、約１．５ｍｍ～約６ｍｍの直径を有する略球形の断片に断片化される。好ましい一実施形態において、略球形の断片は、約６ｍｍの直径を有する。一実施形態において、略球形の断片は、約３ｍｍの直径を有する。
[00309] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、少なくとも１．５ｍｍの最短辺長及び約６ｍｍの最長辺長を有する概ね矩形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍組織は、約１．５ｍｍ～６ｍｍの辺長を有する概ね立方体の断片に断片化される。一実施形態において、概ね立方体の断片は、約６ｍｍの辺長を有する。一実施形態において、概ね立方体の断片は、約３ｍｍの辺長を有する。
[00310] 一部の実施形態において、組織サンプルは、腫瘍組織から非腫瘍組織を分離するためにトリミングされる。
[00311] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、解剖された腫瘍からのものである。一実施形態において、腫瘍組織は腫瘍生検からのものである。一部の実施形態において、腫瘍組織は切開生検からのものである。一部の実施形態において、腫瘍組織は切除生検からのものである。一部の実施形態において、腫瘍組織は、１つ以上のコア針生検からのものであり得る。
[00312] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、断面が約１．５ｍｍ×１．５ｍｍ、約２ｍｍ×２ｍｍ、約２．５ｍｍ×２．５ｍｍ、約３ｍｍ×３ｍｍ、約３．５ｍｍ×３．５ｍｍ、約４ｍｍ×４ｍｍ、約４．５ｍｍ×４．５ｍｍ、約５ｍｍ×５ｍｍ、約５．５ｍｍ×約５．５ｍｍ、又は約６ｍｍ×約６ｍｍの断片にトリミングされる。
[00313] 一実施形態において、腫瘍組織は、１２時間未満が経過したものである。一実施形態において、腫瘍組織は、８時間未満が経過したものである。一実施形態において、腫瘍サンプルは、３時間未満、２時間未満、又は１時間未満が経過したものである。
[00314] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、２～１２％ｖ／ｖ（体積：体積）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５～１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、３％ｖ／ｖ、４％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、６％ｖ／ｖ、７％ｖ／ｖ、８％ｖ／ｖ、９％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１１％ｖ／ｖ、１２％ｖ／ｖ、１３％ｖ／ｖ、１４％ｖ／ｖ、及び１５％ｖ／ｖからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、凍結保存培地の残りは水性培地である。
[00315] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、２～１２％ｗ／ｗ（重量：重量）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５～１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１％ｗ／ｗ、２％ｗ／ｗ、３％ｗ／ｗ、４％ｗ／ｗ、５％ｗ／ｗ、６％ｗ／ｗ、７％ｗ／ｗ、８％ｗ／ｗ、９％ｗ／ｗ、１０％ｗ／ｗ、１１％ｗ／ｗ、１２％ｗ／ｗ、１３％ｗ／ｗ、１４％ｗ／ｗ、及び１５％ｗ／ｗからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、凍結保存培地の残りは水性培地である。
[00316] 一実施形態において、凍結保存培地は、少なくとも１つの抗菌剤を含む。一実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤は、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンである。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤はペニシリンであり；一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤はストレプトマイシンである。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤は抗真菌剤である。一部の実施形態において、抗真菌剤はアムホテリシンＢであり；一部の実施形態において、抗真菌剤はFungin（商標）である。一部の実施形態において、抗菌剤の組み合わせが使用される。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗真菌剤が、１つ以上の抗菌剤と組み合わせて使用される。
[00317] 一部の実施形態において、腫瘍断片は、凍結保存培地中で約２０分間～約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、凍結保存培地中で約３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、インキュベーションは、少なくとも１０分間；少なくとも２０分間；少なくとも２５分間；少なくとも３０分間；少なくとも３５分間；少なくとも４０分間；少なくとも４５分間；少なくとも５０分間；少なくとも５５分間；少なくとも６０分間；又は少なくとも７０分間である。一部の実施形態において、インキュベーションは、約１０分間；約２０分間；約２５分間；約３０分間；約３５分間；約４０分間；約４５分間；約５０分間；約５５分間；約６０分間；又は約７０分間である。一部の実施形態において、インキュベーションは、１０分間未満；２０分間未満；２５分間未満；３０分間未満；３５分間未満；４０分間未満；４５分間未満；５０分間未満；５５分間未満；６０分間未満；又は７０分間未満である。一部の実施形態において、インキュベーション時間は腫瘍断片密度に比例する。一部の実施形態において、インキュベーション時間は、腫瘍断片の表面対体積比に比例する。
[00318] 一部の実施形態において、腫瘍断片は、約２℃～約８℃の温度で、凍結保存培地中でインキュベートされる。
[00319] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、生理緩衝等張食塩水で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、３回の連続洗浄を含み、各連続洗浄の後に生理緩衝等張食塩水が交換される。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、１回の連続洗浄における生理緩衝等張食塩水は、１回以上の他の連続洗浄において使用されるものとは異なる生理緩衝等張食塩水であってもよい。
[00320] 一実施形態において、凍結は、約－１２５℃～約－１９６℃の範囲の温度で行われる。一実施形態において、凍結は、約－１４０℃～約－１８５℃の範囲の温度で行われる。一実施形態において、凍結は、約－１４０℃～約－１７５℃の範囲の温度で行われる。一実施形態において、凍結は約－１４５℃の温度で行われる。一部の実施形態において、凍結は液体窒素の気相で行われる。
[00321] 当技術分野で周知の問題は、凍結プロセス中にそれらを損傷することなく細胞又は組織を凍結保存することである。理論に拘束されるものではないが、凍結中の損傷の１つの原因は、細胞の破裂を引き起こす細胞内の氷核形成である。Muldrew及びMcGannは、“The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury”, Biophysical Journal, 66:532-41 (1994)で、細胞、特に全組織の凍結保存に関するこの周知の広く認識された困難の定量的理論を概説している。Acker及びMcGannは、後の論文“Membrane damage occurs during the formation of intracellular ice,”Cryo Letter, 22:241-54 (2001)で、細胞内氷形成と細胞損傷の基本的なメカニズムをさらに発展させている。
[00322] 解凍時に組織がその生理学的構造を実質的に失ったか、又は組織を含む細胞がその生存能力を実質的に失った、凍結中の損傷が検出される。生存率は、増殖するか又は正常な細胞機能のマーカーを示す細胞の数と比較した、培養培地に導入された細胞の割合によって決定され得る。例えば、限定されないが、トリパンブルー排除などの色素排除試験など、生細胞の画分を同定するための多くの方法が当技術分野で公知である。例えば、https://dx.doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs21で入手可能なStrober, Curr.Protoc.Immunol., 2001, Appendix 3Bを参照されたい。限定されないが、生存率は、ＭＴＴ、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミドが細胞酵素によってホルマザンに代謝される、ＭＴＴアッセイなどの代謝活性アッセイによっても決定され得る。この酵素反応により、黄色のＭＴＴが紫色のホルマザンに変換される。例えば、Berridge et al., Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.Biotechnology Annual Review, 11:127-152 (2005)；Mosmann,“Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays,”J. Immunol.Methods 65 (1-2):55-63 (1983)を参照されたい。
[00323] 理論に拘束されるものではないが、緩徐な冷却は無害な細胞内氷を生成すると仮定されている。Acker及びMcGannの“Protective effect of intracellular ice during freezing?”Cryobiology, 46(2):197-202 (2003)を参照されたい。過度の細胞損傷なしに凍結を達成するため、又は細胞生存率を著しく低下させることなく凍結を達成するための従来的アプローチは、遅い凍結速度を採用することであった。米国特許第５，８９１，６１７号（Watson et al.）は、このアプローチを強調しており、例えば、請求項１のステップ（ｃ）は、非常に遅い冷却速度：「毎分約－０．３℃以下」を教示している。同様に、米国特許第９，９３８，４９５号（Comhaire et al.）は、幹細胞について「ＤＭＳＯを含まない凍結保存培地を使用してゆっくりと凍結することにより、解凍後の高い細胞生存率が得られた」と教示する。
[00324] これらの例示的な教示に基づくと、本開示の方法及び産物は驚くべきものであり、予想外である。さらに、実施例及びそのデータを含む本開示は、治療的使用のための腫瘍浸潤リンパ球の製造における使用のための、腫瘍組織、腫瘍断片、又は腫瘍標本を迅速且つ効率的に凍結保護する問題に対する技術的解決策を示す。
[00325] 一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための腫瘍組織を凍結保存する方法は、凍結断片を少なくとも－１３０℃未満の温度で貯蔵するステップ（ｉｖ）をさらに含む。一部の実施形態において、凍結断片は液体窒素の気相中に貯蔵される。一部の実施形態において、凍結断片は液体窒素内に貯蔵される。一部の実施形態において、凍結保存された断片は、自家療法用途のための後のＴＩＬの製造のために貯蔵される。
[00326] 本発明は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵するステップであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、凍結前に、腫瘍組織を約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で約２０分間～約７０分間インキュベートすることを含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍組織を解凍するステップ；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３抗体を含む第１の細胞培養培地で処置して、ＴＩＬを提供するステップ；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去するステップ；及び
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供するステップ
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00327] 本発明は、
（ａ）腫瘍サンプルを断片化するステップ；
（ｂ）貯蔵培地中で腫瘍断片をインキュベートするステップ；
（ｃ）腫瘍断片を凍結状態で貯蔵するステップ；
（ｄ）腫瘍断片を解凍するステップ；
（ｅ）ガス透過性容器内の腫瘍断片を、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３抗体を含む第１の細胞培養培地で処置して、ＴＩＬを提供するステップ；
（ｆ）少なくとも複数のＴＩＬを除去するステップ；及び
（ｇ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供するステップ
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00328] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、２～１２％ｖ／ｖ（体積：体積又は体積対体積）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５～１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、３％ｖ／ｖ、４％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、６％ｖ／ｖ、７％ｖ／ｖ、８％ｖ／ｖ、９％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１１％ｖ／ｖ、１２％ｖ／ｖ、１３％ｖ／ｖ、１４％ｖ／ｖ、及び１５％ｖ／ｖからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、貯蔵培地の残りは水性培地である。
[00329] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、２～１２％ｗ／ｗ（重量：重量又は重量対重量）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５～１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１％ｗ／ｗ、２％ｗ／ｗ、３％ｗ／ｗ、４％ｗ／ｗ、５％ｗ／ｗ、６％ｗ／ｗ、７％ｗ／ｗ、８％ｗ／ｗ、９％ｗ／ｗ、１０％ｗ／ｗ、１１％ｗ／ｗ、１２％ｗ／ｗ、１３％ｗ／ｗ、１４％ｗ／ｗ、及び１５％ｗ／ｗからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、貯蔵培地の残りは水性培地である。
[00330] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で約２０分間～約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約１５分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約４５分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約７５分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で６０分間インキュベートされる。
[00331] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、約５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、貯蔵培地は、約１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、インキュベーション時間は腫瘍断片密度に比例する。一部の実施形態において、インキュベーション時間は、腫瘍断片の表面対体積比に比例する。
凍結保存された腫瘍断片
[00332] 一部の実施形態において、本発明は、
（ｉ）腫瘍サンプルを断片化するステップ；
（ｉｉ）断片を凍結保存培地中でインキュベートするステップ；及び
（ｉｉｉ）断片を凍結するステップであって、凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であるステップ
を含むプロセスによって調製された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための凍結保存された腫瘍断片を提供する。
[00333] 一部の実施形態において、本発明は、
（ｉ）腫瘍サンプルを断片化するステップ；
（ｉｉ）１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む凍結保存培地中で、約２℃～約８℃の範囲の温度で約２０分間～約７０分間にわたって断片をインキュベートするステップ；及び
（ｉｉｉ）断片を凍結するステップであって、凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であるステップ
を含むプロセスによって調製された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための凍結保存された腫瘍断片を提供する。
[00334] 一実施形態において、腫瘍サンプルは、約１．５ｍｍ～６ｍｍの直径を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、略球形の断片は、約６ｍｍの直径を有する。一実施形態において、略球形の断片は、約３ｍｍの直径を有する。一実施形態において、略球形の断片は、約２０ｍｍ、約１９ｍｍ、約１８ｍｍ、約１７ｍｍ、約１６ｍｍ、約１５ｍｍ、約１４ｍｍ、約１３ｍｍ、約１２ｍｍ、約１１ｍｍ、約１０ｍｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、約６ｍｍ、約５ｍｍ、約４ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、及び約１ｍｍからなる群から選択される直径を有する。
[00335] 一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、少なくとも１．５ｍｍの最短辺長及び約６ｍｍの最長辺を有する概ね矩形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約１．５ｍｍ～６ｍｍの長さの辺を有する概ね立方体の断片に断片化される。一実施形態において、概ね立方体の断片は、約６ｍｍの長さの辺を有する。一実施形態において、概ね立方体の断片は、約３ｍｍの長さの辺を有する。一実施形態において、概ね立方体の断片は、約２０ｍｍ、約１９ｍｍ、約１８ｍｍ、約１７ｍｍ、約１６ｍｍ、約１５ｍｍ、約１４ｍｍ、約１３ｍｍ、約１２ｍｍ、約１１ｍｍ、約１０ｍｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、約６ｍｍ、約５ｍｍ、約４ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、及び約１ｍｍからなる群から選択される辺長を有する。
[00336] 一実施形態において、腫瘍サンプルは、約２ｍｍ３～約２００ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約５ｍｍ３～約１５０ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約２５ｍｍ３～約１５０ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約５０ｍｍ３～約１５０ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約１００ｍｍ３～約１２５ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約５０ｍｍ３～約７５ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約７５ｍｍ３～約１００ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約２００ｍｍ３～約１０００ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、腫瘍サンプルは、約５００ｍｍ３～約８００ｍｍ３の体積を有する略球形の断片に断片化される。一実施形態において、略球形の断片は、約２０ｍｍ、約１９ｍｍ、約１８ｍｍ、約１７ｍｍ、約１６ｍｍ、約１５ｍｍ、約１４ｍｍ、約１３ｍｍ、約１２ｍｍ、約１１ｍｍ、約１０ｍｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、約６ｍｍ、約５ｍｍ、約４ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、及び約１ｍｍからなる群から選択される直径を有する。
[00337] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は断片にトリミングされ、ここで、断片は、約１．５ｍｍ×１．５ｍｍ、約２ｍｍ×２ｍｍ、約２．５ｍｍ×２．５ｍｍ、約３ｍｍ×３ｍｍ、約３．５ｍｍ×３．５ｍｍ、約４ｍｍ×４ｍｍ、約４．５ｍｍ×４．５ｍｍ、約５ｍｍ×５ｍｍ、約５．５ｍｍ×約５．５ｍｍ、約６ｍｍ×６ｍｍ、約６．５ｍｍ×６．５ｍｍ、約７ｍｍ×７ｍｍ、約７．５ｍｍ×７．５ｍｍ、約８ｍｍ×８ｍｍ、約８．５ｍｍ×８．５ｍｍ、約９ｍｍ×９ｍｍ、約９．５ｍｍ×９．５ｍｍ、約１０ｍｍ×１０ｍｍ、約１０．５ｍｍ×１０．５ｍｍ、約１１ｍｍ×１１ｍｍ、約１１．５ｍｍ×１１．５ｍｍ、約１２ｍｍ×１２ｍｍの断面を有する。
[00338] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は断片にトリミングされ、ここで、断片は、約２ｍｍ２～約３ｍｍ２、約３ｍｍ２～約４ｍｍ２、約４ｍｍ２～約５ｍｍ２、約５ｍｍ２～約６ｍｍ２、約６ｍｍ２～約７ｍｍ２、約７ｍｍ２～約８ｍｍ２、約８ｍｍ２～約９ｍｍ２、約９ｍｍ２～約１０ｍｍ２、約１０ｍｍ２～約１１ｍｍ２、約１１ｍｍ２～約１２ｍｍ２、約１２ｍｍ２～約２０ｍｍ２、約２０ｍｍ２～約５０ｍｍ２、約５０ｍｍ２～約１００ｍｍ２、又は約１００ｍｍ２～約５００ｍｍ２の断面積を有する。一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は断片にトリミングされ、ここで、断片は、約１．５ｍｍ２、約２ｍｍ２、約２．５ｍｍ２、約３ｍｍ２、約３．５ｍｍ２、約４ｍｍ２、約４．５ｍｍ２、約５ｍｍ２、約５．５ｍｍ２、約６ｍｍ２、約６．５ｍｍ２、約７ｍｍ２、約７．５ｍｍ２、約８ｍｍ２、約８．５ｍｍ２、約９ｍｍ２、約９．５ｍｍ２、約１０ｍｍ２、約１０．５ｍｍ２、約１１ｍｍ２、約１１．５ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約２５ｍｍ２、約３０ｍｍ２、約４０ｍｍ２、約５０ｍｍ２、約１００ｍｍ２、約２００ｍｍ２、約３００ｍｍ２、約４００ｍｍ２、約５００ｍｍ２、約７５０ｍｍ２、又は約１０００ｍｍ２の断面積を有する。
[00339] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は断片にトリミングされ、ここで、断片は、約２ｍｍ３～約３ｍｍ３、約３ｍｍ３～約４ｍｍ３、約４ｍｍ３～約５ｍｍ３、約５ｍｍ３～約６ｍｍ３、約６ｍｍ３～約７ｍｍ３、約７ｍｍ３～約８ｍｍ３、約８ｍｍ３～約９ｍｍ３、約９ｍｍ３～約１０ｍｍ３、約１０ｍｍ３～約１１ｍｍ３、約１１ｍｍ３～約１２ｍｍ３、及び約１２ｍｍ３～約２０ｍｍ３の体積を有する。一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は断片にトリミングされ、ここで、断片は、約１．５ｍｍ３、約２ｍｍ３、約２．５ｍｍ３、約３ｍｍ３、約３．５ｍｍ３、約４ｍｍ３、約４．５ｍｍ３、約５ｍｍ３、約５．５ｍｍ３、約６ｍｍ３、約６．５ｍｍ３、約７ｍｍ３、約７．５ｍｍ３、約８ｍｍ３、約８．５ｍｍ３、約９ｍｍ３、約９．５ｍｍ３、約１０ｍｍ３、約１０．５ｍｍ３、約１１ｍｍ３、約１１．５ｍｍ３、約１２ｍｍ３、約２０ｍｍ３、約２５ｍｍ３、約３０ｍｍ３、約４０ｍｍ３、約５０ｍｍ３、約１００ｍｍ３、約２００ｍｍ３、約３００ｍｍ３、約４００ｍｍ３、約５００ｍｍ３、約７５０ｍｍ３、又は約１０００ｍｍ３の体積を有する。
[00340] 一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、解剖された腫瘍からのものである。一実施形態において、腫瘍サンプルは腫瘍生検からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは切開生検からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは切除生検からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、１つ以上のコア針生検からのものであり得る。
[00341] 一実施形態において、腫瘍サンプルは、凍結前１２時間未満である。一実施形態において、腫瘍サンプルは、凍結前８時間未満である。一実施形態において、腫瘍サンプルは、凍結前３時間未満、２時間未満、又は１時間未満である。
[00342] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、２～１２％ｖ／ｖ（体積：体積又は体積対体積）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５～１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１％ｖ／ｖ、２％ｖ／ｖ、３％ｖ／ｖ、４％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、６％ｖ／ｖ、７％ｖ／ｖ、８％ｖ／ｖ、９％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１１％ｖ／ｖ、１２％ｖ／ｖ、１３％ｖ／ｖ、１４％ｖ／ｖ、及び１５％ｖ／ｖからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、凍結保存培地の残りは水性培地である。
[00343] 一部の実施形態において、凍結保存培地は、２～１２％ｗ／ｗ（重量：重量又は重量対重量）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、５～１０％ｗ／ｗのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、１％ｗ／ｗ、２％ｗ／ｗ、３％ｗ／ｗ、４％ｗ／ｗ、５％ｗ／ｗ、６％ｗ／ｗ、７％ｗ／ｗ、８％ｗ／ｗ、９％ｗ／ｗ、１０％ｗ／ｗ、１１％ｗ／ｗ、１２％ｗ／ｗ、１３％ｗ／ｗ、１４％ｗ／ｗ、及び１５％ｗ／ｗからなる群から選択されるパーセンテージのＤＭＳＯを含む。前述の実施形態の一部において、凍結保存培地の残りは水性培地である。
[00344] 一実施形態において、凍結保存培地は、少なくとも１つの抗菌剤を含む。一実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤は、少なくとも２０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンである。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤は、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンである。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤はペニシリンであり；一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤はストレプトマイシンである。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤は抗真菌剤である。一部の実施形態において、抗真菌剤はアムホテリシンＢであり；一部の実施形態において、抗真菌剤はFungin（商標）である。一部の実施形態において、抗菌剤の組み合わせが使用される。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗真菌剤が、１つ以上の抗菌剤と組み合わせて使用される。
[00345] 一部の実施形態において、腫瘍断片は、凍結保存培地中で約３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、インキュベーションは、少なくとも１０分間；少なくとも２０分間；少なくとも２５分間；少なくとも３０分間；約３５分間；約４０分間；約４５分間；約５０分間；約５５分間；又は約６０分間である。一部の実施形態において、インキュベーション時間は腫瘍断片密度に比例する。一部の実施形態において、インキュベーション時間は、腫瘍断片の表面対体積比に比例する。
[00346] 一部の実施形態において、腫瘍断片は、約２℃～約８℃の温度で、凍結保存培地中でインキュベートされる。
[00347] 一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、生理緩衝等張食塩水で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、３回の連続洗浄を含み、各連続洗浄の後に生理緩衝等張食塩水が交換される。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、１回の連続洗浄における生理緩衝等張食塩水は、１回以上の他の連続洗浄において使用されるものとは異なる生理緩衝等張食塩水であってもよい。
[00348] 一実施形態において、凍結は、約－１２５℃～約－１８０℃の範囲の温度で行われる。一実施形態において、凍結は、約－１４０℃～約－１７５℃の範囲の温度で行われる。一実施形態において、凍結は約－１４５℃の温度で行われる。一部の実施形態において、凍結は液体窒素の気相で行われる。
[00349] 一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、１つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、２つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、３つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、４つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、５つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、６つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、７つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、８つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、９つである。一実施形態において、上記又は本明細書の実施形態のいずれかに従って使用される腫瘍断片の数は、１０個である。
凍結保存された腫瘍断片からのＴＩＬの製造
[00350] 本発明は、凍結保存された腫瘍断片からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法を提供し、方法は、
（ｉ）凍結保存された腫瘍断片から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｉｉ）ＩＬ－２、及び任意選択によりＯＫＴ－３、を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせるステップ；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせるステップであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍又は１００倍数が多く、及び第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が少なくとも１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団である、ステップ
を含む。
[00351] 本発明は、養子Ｔ細胞療法のために腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するための方法を提供し、方法は、
（ａ）インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３抗体を含む第１の細胞培養培地中で凍結保存した腫瘍断片を培養すること；
（ｂ）照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地中でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること；及び
（ｃ）任意選択により、拡大された数のＴＩＬを凍結保存すること
を含む。
[00352] 本発明は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、凍結前に、腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約３０分間インキュベートすることを含むステップ；
（ｂ）腫瘍組織を解凍するステップ；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供するステップ；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去するステップ；及び
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供するステップ
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00353] 本発明は、
（ａ）腫瘍サンプルを断片化するステップ；
（ｂ）貯蔵培地中の腫瘍断片を約２℃～約８℃の範囲の温度で約３０分間インキュベートするステップ；
（ｃ）腫瘍断片を凍結状態で貯蔵するステップ；
（ｄ）腫瘍断片を解凍するステップ；
（ｅ）ガス透過性容器内の腫瘍断片を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供するステップ；
（ｆ）少なくとも複数のＴＩＬを除去するステップ；及び
（ｇ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供するステップ
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00354] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、２％ｖ／ｖのＤＭＳＯ～１２％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、約５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ～１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む。
[00355] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の温度で、貯蔵培地中で少なくとも３０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約４５分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。
[00356] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結保存培地中で約２０分間～約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、腫瘍組織は、凍結保存培地中で約３０分間～約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、インキュベーションは、少なくとも１０分間；少なくとも２０分間；少なくとも２５分間；少なくとも３０分間；約３５分間；約４０分間；約４５分間；約５０分間；約５５分間；又は約６０分間である。一部の実施形態において、インキュベーション時間は腫瘍断片密度に比例する。一部の実施形態において、インキュベーション時間は、腫瘍断片の表面対体積比に比例する。
[00357] 一部の実施形態において、断面が約１．５ｍｍ×１．５ｍｍの腫瘍断片は、凍結保存培地中で、約２０分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、又は約６０分間未満インキュベートされる。一部の実施形態において、断面が約２ｍｍ×２ｍｍの腫瘍断片は、凍結保存培地中で、約２０分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、又は約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、断面が約３ｍｍ×３ｍｍの腫瘍断片は、凍結保存培地中で、少なくとも２０分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、又は約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、断面が約４ｍｍ×４ｍｍの腫瘍断片は、凍結保存培地中で、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約６０分間、又は約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、断面が約５ｍｍ×５ｍｍの腫瘍断片は、凍結保存培地中で、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約６０分間、又は約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、断面が約６ｍｍ×６ｍｍの腫瘍断片は、凍結保存培地中で、少なくとも２０分間、約３０分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約６０分間、又は約７０分間インキュベートされる。
[00358] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、約５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態において、貯蔵培地は、約１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含み、腫瘍組織は、凍結前に、約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で少なくとも約３０分間～約６０分間インキュベートされる。
[00359] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、ＩＬ－２を含む培養培地中で凍結保存された腫瘍断片をインキュベートすることを含み、ここで、ＴＩＬの数は拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は１００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は１５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は２００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は２５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約３００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約３５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約４００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約４５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約５００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約５５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約６００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約７００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約７５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約８００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約８５０倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約９００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約１０００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約１２００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約１５００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約１６００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約２０００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約２１００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約２２００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は約２５００倍に拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬの数は２５００倍を超えて拡大される。
[00360] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを製造するための方法は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること
を含むこと；
（ｂ）容器を解凍すること；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去するステップ；及び
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00361] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを製造するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を冷凍すること；
（ｆ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること；
（ｇ）容器を解凍すること；
（ｈ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｉ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｊ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00362] 一部の実施形態において、凍結保存された腫瘍断片からＴＩＬを製造する方法は、第１の培養培地へのＯＫＴ－３への添加をさらに含む。
[00363] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、直径１．５ｍｍ～６ｍｍ、且つ厚さ１．５ｍｍ～６ｍｍでトリミングされる。さらに他の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、約６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍにトリミングされる。一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、断面が約１．５ｍｍ×１．５ｍｍ、約２ｍｍ×２ｍｍ、約２．５ｍｍ×２．５ｍｍ、約３ｍｍ×３ｍｍ、約３．５ｍｍ×３．５ｍｍ、約４ｍｍ×４ｍｍ、約４．５ｍｍ×４．５ｍｍ、約５ｍｍ×５ｍｍ、約５．５ｍｍ×約５．５ｍｍ、又は約６ｍｍ×６ｍｍの断片にトリミングされる。
[00364] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、抗菌剤をさらに含む。一部の実施形態において、抗菌剤はゲンタマイシンである。一部の実施形態において、貯蔵培地は、少なくとも２０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、抗菌剤、抗真菌剤、及びそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、抗真菌剤は、アムホテリシンＢであり、約０．２５μｇ／ｍＬから約２．５μｇ／ｍＬまで存在する。一部の実施形態において、抗真菌剤は、Fungin（商標）であり、約５μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬまで存在する。
[00365] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、生理緩衝等張食塩水で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、３回の連続洗浄を含み、各連続洗浄の後に生理緩衝等張食塩水が交換される。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、１回の連続洗浄における生理緩衝等張食塩水は、１回以上の他の連続洗浄において使用されるものとは異なる生理緩衝等張食塩水であってもよい。
[00366] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[00367] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[00368] 一部の実施形態において、方法は、ヒト対象からの新鮮な腫瘍サンプルを用いて実施される。
[00369] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）組織、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[00370] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップと第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は約１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、ステップ（ｃ）から（ｅ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２１日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約１６日で完了する。
[00371] 一部の実施形態において、第１の培養培地は、ＯＫＴ－３を含む。
[00372] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）液体窒素の気相を使用して容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
を含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を解凍するステップ；
（ｃ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｄ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｆ）ステップ（ｆ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ）ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｈ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｇ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｉ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む。
[00373] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を液体窒素の気相を使用して冷凍すること；
（ｆ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること；
（ｇ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｈ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｉ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を閉鎖系で実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｊ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｉ）からステップ（ｊ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｋ）ステップ（ｊ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｊ）からステップ（ｋ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｌ）ステップ（ｋ）で回収した治療用ＴＩＬを輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｋ）から（ｌ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｍ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｌ）からの治療用ＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；
（ｎ）ステップ（ｍ）からの輸注バッグ内の治療用ＴＩＬ集団を解凍すること；及び
（ｏ）ステップ（ｎ）における輸注バッグから治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。
[00374] 一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、黒色腫、抵抗性黒色腫、転移性黒色腫、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00375] 本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、凍結前に、腫瘍組織を２℃～８℃で、貯蔵培地中で３０分間インキュベートすることを含むこと；
（ｃ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｄ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｅ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｆ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00376] 本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）貯蔵培地中で腫瘍組織を２℃～８℃で、貯蔵培地中で３０分間インキュベートすること；
（ｃ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵すること；
（ｄ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｅ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｆ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｇ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00377] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること
を含むこと；
（ｃ）容器を解凍すること；
（ｄ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｅ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｆ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00378] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を冷凍すること；
（ｆ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること；
（ｇ）容器を解凍すること；
（ｈ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｉ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｊ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00379] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、生理緩衝等張食塩水で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、３回の連続洗浄を含み、各連続洗浄の後に生理緩衝等張食塩水が交換される。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、生理緩衝等張食塩水は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む。一部の実施形態において、１回の連続洗浄における生理緩衝等張食塩水は、１回以上の他の連続洗浄において使用されるものとは異なる生理緩衝等張食塩水であってもよい。
[00380] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[00381] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[00382] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）組織、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[00383] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップと第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は約１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２１日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約１６日で完了する。
[00384] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０～約７０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）液体窒素の気相を使用して容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
を含むこと；
（ｃ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｄ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｅ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｇ）ステップ（ｆ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｈ）ステップ（ｇ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行は、系を開放せずに発生すること
（ｉ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｈ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む。
[00385] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０～約７０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を液体窒素の気相を使用して冷凍すること；
（ｆ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること；
（ｇ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｈ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｉ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を閉鎖系で実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｊ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｉ）からステップ（ｊ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｋ）ステップ（ｊ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｊ）からステップ（ｋ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｌ）ステップ（ｋ）で回収した治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｋ）から（ｌ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｍ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｌ）からの治療用ＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；
（ｏ）ステップ（ｍ）からの輸注バッグ内の治療用ＴＩＬ集団を解凍すること；及び
（ｐ）ステップ（ｏ）における輸注バッグから治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む。
[00386] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること
を含むこと；
（ｂ）容器を解凍すること；
（ｃ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｄ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00387] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を冷凍すること；
（ｆ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること；
（ｇ）容器を解凍すること；
（ｈ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｉ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｊ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00388] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、直径１．５ｍｍ～６ｍｍ、且つ厚さ約１．５ｍｍ～約６ｍｍでトリミングされる。さらに他の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、約６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍにトリミングされる。
[00389] 一部の実施形態において、貯蔵培地は、抗菌剤をさらに含む。一部の実施形態において、抗菌剤はゲンタマイシンである。一部の実施形態において、貯蔵培地は、少なくとも２０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含む。一部の実施形態において、貯蔵培地は、抗菌剤、抗真菌剤、及びそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、抗真菌剤は、アムホテリシンＢであり、約０．２５μｇ／ｍＬから約２．５μｇ／ｍＬまで存在する。一部の実施形態において、抗真菌剤は、ファンギン（fungin）であり、約５μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬまで存在する。
[00390] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、方法のトリミングステップを実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、少なくとも３回の連続洗浄を含み、ＨＢＳＳは、各洗浄後に交換される。
[00391] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[00392] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃で冷凍される。
[00393] 一部の実施形態において、方法は、ヒト対象からの新鮮な腫瘍サンプルを用いて実施される。
[00394] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[00395] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップと第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、２１日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｃ）から（ｅ）又はステップ（ｈ）から（ｊ）は、約１６日で完了する。
[00396] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０～約７０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）液体窒素の気相を使用して容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
を含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｃ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｄ）ＩＬ－２を有する細胞培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｆ）ステップ（ｆ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｇ）ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｈ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｇ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｉ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む。
[00397] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手すること；
（ｂ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｃ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｄ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０～約７０分間インキュベートすること；
（ｅ）容器を液体窒素の気相を使用して冷凍すること；
（ｆ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること；
（ｇ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｈ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｉ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｊ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｉ）からステップ（ｊ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｋ）ステップ（ｊ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｊ）からステップ（ｋ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｌ）ステップ（ｋ）で回収した治療用ＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｋ）から（ｌ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｍ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｌ）からの治療用ＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；
（ｎ）ステップ（ｍ）からの輸注バッグ内の治療用ＴＩＬ集団を解凍すること；及び
（ｏ）ステップ（ｎ）における輸注バッグから治療有効投与量の治療用ＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む。
[00398] 一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、黒色腫、抵抗性黒色腫、転移性黒色腫、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00399] 本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、凍結前に、腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約２０～約７０分間インキュベートすることを含むこと；
（ｃ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｄ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｅ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｆ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00400] 本発明は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を約２℃～約８℃の範囲の温度で、貯蔵培地中で約２０～７０分間インキュベートすること；
（ｃ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵すること；
（ｄ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｅ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｆ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｇ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３抗体、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
[00401] 一部の実施形態において、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養するための方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約３０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器が冷凍されたままになるように容器を貯蔵すること
を含むこと；
（ｃ）容器を解凍すること；
（ｄ）ガス透過性容器内の腫瘍組織を第１の細胞培養培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）で処置して、ＴＩＬを提供すること；
（ｅ）少なくとも複数のＴＩＬを除去すること；及び
（ｆ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地でＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
を含む。
[00402] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、組織トリミングステップを実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、少なくとも３回の連続洗浄を含み、ＨＢＳＳは、各洗浄後に交換される。
[00403] 一部の実施形態において、解凍ステップは、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[00404] 一部の実施形態において、凍結ステップは、約－１２５℃～約－１９５℃の温度で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[00405] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[00406] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップと第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２１日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、該当する場合、ステップ（ｄ）から（ｆ）又はステップ（ｅ）から（ｇ）は、約１６日で完了する。
[00407] 一部の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒト対象のための癌を処置する方法を提供し、そのような方法は、
（ａ）対象から腫瘍組織を入手することであって、腫瘍組織は、ＴＩＬを含むこと；
（ｂ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、腫瘍組織を貯蔵する方法が、
（ｉ）腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
（ｉｉ）貯蔵培地を含有する閉鎖可能な容器内に腫瘍組織を置くこと；
（ｉｉｉ）腫瘍組織及び貯蔵培地を含有する容器を、約２℃～約８℃の範囲の温度で、約２０分間～約７０分間インキュベートすること；
（ｉｖ）液体窒素の気相を使用して容器を冷凍すること；及び
（ｖ）容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
を含むこと；
（ｃ）腫瘍組織を解凍すること；
（ｄ）腫瘍組織を閉鎖系に加えること；
（ｅ）ＩＬ－２を有する細胞培地で腫瘍組織からの第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７～１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団と比べてエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加サブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｇ）ステップ（ｆ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｈ）ステップ（ｇ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｇ）から（ｈ）への移行は、系を開放せずに発生すること
（ｉ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｈ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を対象に投与すること
を含む。
[00408] 一部の実施形態において、新鮮な腫瘍組織は、腫瘍組織貯蔵方法のステップ（ｉ）を実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄される。一部の実施形態において、洗浄は、少なくとも各３分、少なくとも３回の連続洗浄を含み、ＨＢＳＳは、各洗浄後に交換される。
[00409] 一部の実施形態において、ステップ（ｃ）は、容器を３７℃の水浴に約５分間浸漬することを含む。
[00410] 一部の実施形態において、腫瘍組織貯蔵方法のステップ（ｉｖ）は、約－１２５℃～約－１９５℃の温度で容器を冷凍することを含む。一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１５０℃の温度で冷凍され；一部の実施形態において、容器は、約－１２５℃～約－１４５℃の温度で冷凍され；さらなる実施形態において、容器は、約－１３５℃の温度で冷凍される。
[00411] 一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、子宮内膜腫瘍組織、甲状腺腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及びＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される。
[00412] 一部の実施形態において、方法は、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップと第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップとの間に分割をさらに含む。一実施形態において、分割は１６日目に行う。一部の実施形態において、第１の培養ステップは約１１日で完了する。他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約７日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約７日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１４日で完了する。一部の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２２日で完了する。さらに他の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は約２１日で完了し；一部の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は、約２０日で完了し；一部の実施形態において、ステップ（ｅ）から（ｇ）は、約１６日で完了する。
[00413] 一部の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約５日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは、約３日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１１日で完了する。さらに他の実施形態において、第１の拡大培養（又は第１の培養）ステップは約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）ステップは約１３日で完了する。任意選択により、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の５日目又は６日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割することができる。
[00414] ＴＩＬを製造又は拡大培養するための上記の方法の一部の実施形態において、ＯＫＴ－３は、０日目から培地中に存在する。
[00415] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了するように、必要に応じて改変された、対象の癌を処置する前述の方法のいずれかを提供する。
[00416] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了するように、必要に応じて改変された、対象の癌を処置する前述の方法のいずれかを提供する。
[00417] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１１日で完了するように、必要に応じて改変された、対象の癌を処置する前述の方法のいずれかを提供する。
[00418] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１１日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の５日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、対象の癌を処置する前述の方法のいずれかを提供する。
[00419] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了するように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00420] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の６日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00421] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了するように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00422] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了するように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00423] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１１日で完了するように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00424] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１１日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の５日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00425] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了するように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00426] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の６日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、凍結腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する前述の方法のいずれかを提供する。
[00427] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了するように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するための前述の方法のいずれかを提供する。
[00428] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の６日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00429] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了するように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00430] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了するように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00431] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１１日で完了するように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00432] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約５日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１１日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の５日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00433] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了するように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00434] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）のステップにおいて、第１の拡大培養（又は第１の培養）は約３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は約１３日で完了し、第２の拡大培養（又は第２の培養）は、第２の拡大培養（又は第２の培養）の６日目又はその前後に２つ以上の培養物に分割されるように、必要に応じて改変された、養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製する前述の方法のいずれかを提供する。
[00435] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）が限定培地で実施されるように適切に改変された前述の方法のいずれかを提供する。
[00436] 一部の実施形態において、本発明は、第２の拡大培養（又は第２の培養）が限定培地で実施されるように適切に改変された前述の方法のいずれかを提供する。
[00437] 一部の実施形態において、本発明は、第１の拡大培養（又は第１の培養）及び第２の拡大培養（又は第２の培養）が同一又は異なる限定培地で実施されるように適切に改変された前述の方法のいずれかを提供する。
ＴＩＬの製造方法
[00438] 当業者に公知のＴＩＬを拡大培養するための様々な方法が存在する。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるJin et al., J. Immunother.35(3):283-292 (2012),“Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes in Gas-permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment,”は、臨床使用のためのＴＩＬを産生する簡易化された方法を教示する。Jin et al.は、第１のＴＩＬ培養とそれに続く急速拡大培養（ＲＥＰ）プロトコルを教示しており、これを組み合わせることにより、当業者は、臨床的に有用な量のＴＩＬを産生することができる。一部の実施形態において、本発明は、腫瘍を凍結保存し、腫瘍を解凍し、Jin et al.に記載されるプロセスを実施するステップを含む、ＴＩＬを製造する方法を提供する。簡潔には、このプロセスには次のプロセスが含まれる。ＴＩＬは、最初に、酵素的腫瘍消化物及び鋭的切開によって得られる腫瘍断片（約１～８ｍｍ３）から培養され得る。腫瘍消化物は、酵素培地（ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって産生する。腫瘍を酵素培地に置いた直後、それを約１分間機械的に分離する。次いで、材料を５％ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートし、次いでおよそ１分間再び機械的に破砕し、５％ＣＯ２中３７℃で３０分間再びインキュベートした。次いで、腫瘍は３回目におよそ１分間、機械的に破砕される。３回目の機械的破砕の後、大きな組織片が存在した場合は、５％ＣＯ２中、３７℃でさらに３０分のインキュベーションを伴い、又は伴わず、１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用し得る。最終インキュベーションの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有していた場合、これらの細胞を除去するためにフィコールを用いた密度勾配分離を行うことができる。ＴＩＬ培養が２４ウェルプレート（Costar２４ウェル細胞培養クラスター、平底；Corning Incorporated, Corning, NY）で開始される場合、各ウェルに、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp., Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化細胞又はおよそ約１～８ｍｍ３のサイズの１つの腫瘍断片が播種される。ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭのヘペス、及び約１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０を含む。４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有するガス透過性フラスコ（G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN）内で培養が開始されるとき、各フラスコには、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中、１０～４０×１０６個の生存可能な腫瘍消化細胞又は５～３０個の腫瘍断片が充填される。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換する。ＴＩＬのＲＥＰは、T-175フラスコとガス透過性バッグ又はガス透過性G-Rexフラスコとを使用して実施される。T-175フラスコ中のＴＩＬ ＲＥＰでは、１５０ｍＬの培地中に懸濁した１×１０６個のＴＩＬを各T-175フラスコに添加した。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充したＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養する。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を用いて交換される。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ－Ｖ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加する。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日で数え、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf）中でのＴＩＬ ＲＥＰについて、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で、５×１０６～１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心分離する。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻す。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される場合、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割し、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用した。５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖを加えた。細胞は培養１４日目に回収される。
[00439] 一部の実施形態において、本発明による拡大培養方法は、凍結腫瘍からの細胞の拡大培養物を調製することを含む。腫瘍サンプルは患者から収集され、本明細書に開示される方法に従って凍結保存される。細胞を拡大培養する準備が整えば、１／１００スケールで実施されるプロセスについて、直径２～３ｍｍの凍結腫瘍断片約６個を、３７℃の水浴を使用して５＋１分間解凍し、ゲンタマイシンを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄する。次いで、６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ１培地又は無血清又は限定培地とともに、断片をG-Rex 10Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）又はその他のガス透過性容器に入れる。これらのプレＲＥＰ（又は第１の拡大培養）培養物は、３７℃のインキュベーター内で５日間インキュベートされる。５日目に、プレＲＥＰ細胞を回収し、ＲＥＰ（又は第２の拡大培養）は、G-Rex 5Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）又はその他のガス透過性容器内の３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含有するＣＭ２培地又は無血清若しくは限定培地中で、プレＲＥＰ ＴＩＬの１０％を２５×１０６又は５０×１０６のＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって開始される。１０日目に、培養物をG-Rex 5Mフラスコ又は１０×１０６個以下の細胞を含有する他のガス透過性容器に分割する。分割培養物を、３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ４培地又は他の無血清若しくは限定培地中でさらに６日間インキュベートする。１６日目に、CryoStor10（Biolife, USA）を使用して細胞を回収し、凍結する。このプロセスは、本明細書において「早期ＲＥＰ方法１」プロセス又は「ＥＲ－１」と称される。
[00440] 一部の実施形態において、本発明による拡大培養方法は、凍結腫瘍からの細胞の拡大培養物を調製することを含む。腫瘍サンプルは患者から収集され、本明細書に開示される方法に従って凍結保存される。細胞を拡大培養する準備が整えば、１／１００スケールで実施されるプロセスについて、直径２～３ｍｍの凍結腫瘍断片約６個を、３７℃の水浴を使用して５＋１分間解凍し、ゲンタマイシンを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄する。次いで、６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ１培地又は約無血清又は限定培地とともに、断片をG-Rex 10Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）又はその他のガス透過性容器に入れる。これらのプレＲＥＰ（又は第１の拡大培養）培養物は、３７℃のインキュベーター内で３日間インキュベートされる。３日目に、プレＲＥＰ細胞を回収し、ＲＥＰ（又は第２の拡大培養）は、G-Rex 5Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）又はその他のガス透過性容器内の３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含有するＣＭ２培地又は無血清若しくは限定培地中で、プレＲＥＰ ＴＩＬの１０％を２５×１０６又は５０×１０６のＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって開始される。９日目に、培養物をG-Rex 5Mフラスコ又は１０×１０６個以下の細胞を含有する他のガス透過性容器に分割する。分割培養物を、３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ４培地又は他の無血清若しくは限定培地中でさらに７日間インキュベートする。１６日目に、CryoStor10（Biolife, USA）を使用して細胞を回収し、凍結する。このプロセスは、本明細書において「早期ＲＥＰ方法２」プロセス又は「ＥＲ－２」と称される。
[00441] 一部の実施形態において、本発明は、腫瘍を凍結保存し、腫瘍を解凍し、以下のプロセスを実施するステップを含む、ＴＩＬを製造する方法を提供する。ＴＩＬは、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又はＩＬ－１５（好ましくはＩＬ－２）などのＴ細胞成長因子の存在下で、任意選択により、ＨＬＡ－Ａ２結合ペプチド、例えば０．３μＭ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐ１００：２０９－２１７（２１０Ｍ）などのベクターから発現させることができる、癌の（１つ以上の、エピトープ又は細胞などのその抗原部分を含む）抗原を用いたインビトロでの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激を使用した急速拡大培養によって産生することができる。インビトロで誘導されたＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養される。或いは、ＴＩＬは、例えば、照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によって再刺激することができる。ＴＩＬは、各腫瘍細胞ゲノムによってコードされる推定１０，０００の遺伝子変異の結果として産生された固有の抗原のいずれかを非常に高活性に認識するために選択できる。しかし、抗原は固有である必要はない。Ｔ細胞は、エピトープなどの１つ以上の抗原の抗原性部分、又は癌の細胞を含む、癌の１つ以上の抗原の非常に高活性な認識のために選択することができる。「癌の抗原」及び「癌の抗原」は、前述の抗原の全てを包含することを意図している。癌が転移性黒色腫などの黒色腫である場合、好ましくは、ＴＩＬは、ＭＡＲＴ－１（ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）など）、ｇｐ１００（ｇｐ１００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など）、又は腫瘍にコードされた突然変異に由来する「固有」の又は患者特異的な抗原の非常に高活性な認識のために選択される。ＴＩＬによる非常に高活性な認識を選択することができる他の適切な黒色腫抗原には、これらに限定されないが、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）１、ＴＲＰ２、及びＭＡＧＥが含まれる。肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌などの処置のために、ＮＹ－ＥＳＯ－１、テロメラーゼ、ｐ５３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、癌胎児性抗原、又は前立腺特異抗原などの抗原を使用して、ＴＩＬによる非常に高活性な認識を選択できる。選択できるＴＩＬには、これらに限定されないが、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質が含まれる。
[00442] ＩＬ－２ベースのＴＩＬ拡大培養と、それに続く「急速拡大培養プロセス」（ＲＥＰ：rapid expansion process）が、その速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42。ＲＥＰは１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それにはフィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの、大過剰の（例えば２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ－２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。凍結保存された腫瘍断片は、治療用又は他の目的のためにＴＩＬを製造するための初期又は第１の培養の適切な出発点である。
[00443] これらの特徴のいくつかを含むプロセス２Ａとして知られるＴＩＬプロセスの例を図１に示す。プロセス１Ｃとして知られる別の例示的なＴＩＬプロセスを説明し、図５及び６のプロセス２Ａと比較する。プロセス２Ａの実施形態を図１に示す。
[00444] 本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、ひいては相対的健康を増加させること、及び前記代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、ＴＩＬは一般的に患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作されてもよい。
[00445] 一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存されそして患者へ投与するために解凍され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激されてもよい。
[00446] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセス及び図１にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、３～１４日に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセス及び図１にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の拡大培養（例えば、図１のステップＢとして記載される拡大培養）は１１日間に短縮され、第２の拡大培養（例えば、図１のステップＤに記載される拡大培養）は１１日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の拡大培養及び第２の拡大培養（例えば、図１のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは２２日間に短縮される。
[00447] 以下の「ステップ」の名称Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図１を参照し、本明細書に記載の特定の実施形態を参照している。以下及び図１におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序、並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し、及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
ステップＡ．患者の腫瘍サンプルを入手
[00448] 一般に、ＴＩＬは、初めは患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00449] 患者腫瘍サンプルは当該技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的切除、針生検又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含むサンプルを入手するための手段によって入手されてもよい。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からであってもよい。腫瘍サンプルはまた、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであってもよい。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
[00450] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌など、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00451] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含むがこれらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00452] 入手後、腫瘍サンプルは一般的に鋭的な切離を用いて１～約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片しか存在しなくなるまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製されてもよい。このプロセスの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなどの、当該技術分野で公知の代替的方法を使用してもよく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
[00453] 一般に、回収された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に回収した」細胞集団と呼ばれる。
[00454] 一部の実施形態において、断片化は、例えば切離並びに消化を含めた物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は切離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
[00455] 一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップＡ（図１に提供される）における腫瘍サンプルの入手後に、腫瘍は物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後に、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に１０、２０、３０、４０個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に３０又は４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３～約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０～約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ～約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
[00456] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的な切離によって入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍は１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。培養の開始前に腫瘍組織が最初に凍結される実施形態において、腫瘍は約６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍである。
[00457] 一部の実施形態において、各断片上の出血、壊死、及び／又は脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。
[00458] 一部の実施形態において、腫瘍の内部構造を維持するために、腫瘍の断片化が実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施することなく実施される。一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃でのさらに３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[00459] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収した」細胞集団と呼ばれる。
[00460] 一部の実施形態において、細胞は、以下にさらに詳細に記載し、図１に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択でサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵されてもよい。
ステップＢ：第１の拡大培養
[00461] 一部の実施形態において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができる幼若ＴＩＬを得ることを提供し、したがって、成熟ＴＩＬ（たとえば、対象／患者への投与前にさらに多くの回数のエクスビボ複製を受けた「成熟ＴＩＬ」）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 （2012）；Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 （2010）、Huang et al., J Immunother, 28（3）:258-267 （2005）、Besser et al., Clin Cancer Res, 19（17）:OF1-OF9 （2013）、Besser et al., J Immunother 32:415-423 （2009）、Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 （2007）、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 （2005）、及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 （2008）であり、これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00462] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収したＴＩＬ及び／又は例えば、図１に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図５及び／又は図６に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収したＴＩＬ及び／又は、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00463] 腫瘍断片の切離又は消化後、例えば、図１のステップＡに記載されたように、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して３～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
[00464] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図１のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、高速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択の凍結保存、及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられてもよい。
[00465] 実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。
[00466] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１０×１０６～４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５～３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換した。
[00467]
[00468] 腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ－２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と共に含む培地中で（又は、ある場合には、本明細書に概説される通り、ａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０～１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養の間の成長培地はＩＬ－２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ－２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は４～８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は５～７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２ストック溶液は実施例Ｅに記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、乃至約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２をさらに含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00469] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[00470] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[00471] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ－３抗体を含まない。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
[00472] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00473] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体をさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00474] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０～４０ｍＬのＩＬ－２含有ＣＭ中の１０×１０６～４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５～３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ－２を補充し、５日目以降は２～３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１である、実施例１を参照。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ－２を含む。
[00475] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば、図４及び５並びに、例えば、図１のステップＢに記載されている実施例を含む実施例で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもある図１のステップＢに記載されるプロセスなどを含み得る）は７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は１０～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば、図１のステップＢに記載されている拡大培養で考察されるように、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00476] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日～１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日間続行され得る。
[00477] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１による、並びに本明細書に記載されている通り、ステップＢプロセス中を含む、第１の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１による、及び本明細書に記載されている通りステップＢプロセス中に含められ得る。
[00478] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称される図１のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は１０～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00479] 一部の実施形態において、第１の拡大培養、例えば、図１によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00480] ある場合には、例えば、図１に示されるように、例えばステップＢから得られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡大培養から得られるバルクＴＩＬ集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存してもよい。或いは、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡大培養から得られたＴＩＬ集団は、第２の拡大培養（ＲＥＰと呼ばれることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存してもよい。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）又は、第２のＴＩＬ集団（一部の実施形態において、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡大培養の前又は、第１の拡大培養の後で第２の拡大培養の前に、適切な処置のために遺伝子修飾に供してもよい。
[00481] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図１に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図１に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、貯蔵されず第２の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日～１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日～１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日～１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約７日～１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約１４日の時点で行われる。
[00482] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日～１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１２日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１３日～１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから２日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日～１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日で行われる。
[00483] 一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の拡大培養の後、第２の拡大培養の前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図１に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の拡大培養に直接進む。
[00484] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、例えば、図１によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
サイトカイン
[00485] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当該技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[00486] 或いは、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することがさらに可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１とＩＬ－２、ＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
ステップＤ：第２の拡大培養
[00487] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図１）に記載の通り、ステップＡ及びステップＢ、並びにステップＣと称される移行後、回収及び初期バルク処理の後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当該技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（ＲＥＰ、並びに図１のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[00488] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図１のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約７日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約８日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約９日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１０日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１１日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１２日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１３日～約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日間続行し得る。
[00489] 一実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと呼ばれる膨張、並びに図１のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）又は、ＵＨＣＴ－１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２又はＩＬ－１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養の間に誘導することにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬはまた、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。或いは、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２によってさらに再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下で、又は照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２とともに第２の拡大培養が発生する。
[00490] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00491] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ－３抗体を含まない。一部の実施形態において、ＯＫＴ－３抗体はムロモナブである。
[00492] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00493] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体をさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00494] 一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１による、並びに本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１による、及び本明細書に記載されている通りステップＤプロセス中に含められ得る。
[00495] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞、及び任意選択によりＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む添加細胞培養培地で実施されてもよい。一部の実施形態において、第２の拡大培養は添加細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、添加細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む細胞培養培地で生じる（即ち、抗原提示細胞）。
[00496] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－１５をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。
[00497] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、乃至約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ－２１をさらに含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。
[00498] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０～１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００～１：２００である。
[00499] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下にさらに十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00500] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７～１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00501] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）Ｔ－１７５フラスコ及び気体透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施してもよい。一部の実施形態において、第２の拡大培養（急速拡大培養と称される拡大培養を含む）は、Ｔ－１７５フラスコで実施され、１５０ｍＬの培地に懸濁した約１×１０６個のＴＩＬを各Ｔ－１７５フラスコに加えてもよい。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を添加したＣＭ及びAIM-V培地の１対１の混合物で培養してもよい。Ｔ－１７５フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートしてもよい。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して交換されてもよい。一部の実施形態において、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせることができ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのAIM Vを加えた。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントし、新鮮培地を加えて細胞数を０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
[00502] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図１のステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁してもよく、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割してもよく、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートしてもよく、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。
[00503] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバには、以下にさらに十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00504] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップをさらに含む。当該技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。
[00505] 任意選択で、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態において、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態において、生存率は、標準的なCellometer K2 Image Cytometer自動細胞カウンタープロトコルに従い決定される。
[00506] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、先述の通りＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はＴ－１７５フラスコで実施され、約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各Ｔ－１７５フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとAIM-V培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントしてもよく、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５～約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
[00507] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf）において実施され（図１）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用される。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加える。細胞は培養１４日目に回収される。
[00508] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00509] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下でさらに詳細に考察する通り、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
[00510] 一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、図１によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00511] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図１のステップＤに記載された拡大培養、並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。例えば、https://us.vwr.com/assetsvc/asset/en_US/id/16286835/contentsで入手可能な“Isolation of mononuclear cells:Methodology and Application”, GE Life Sciences technical publication 18-1152-69-AEを参照されたい。
[00512] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[00513] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち、第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
[00514] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち、第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00515] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち、第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。
[00516] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０～１対３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００～１対２００である。
[00517] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。
[00518] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
[00519] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[00520] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として、又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。
サイトカイン
[00521] 本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養方法は、一般に、当該技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。
[00522] 或いは、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することがさらに可能であり、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－２１、ＩＬ－１５とＩＬ－２１とＩＬ－２、ＩＬ－１５とＩＬ－２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
ステップＥ：ＴＩＬを回収する
[00523] 第２の拡大培養ステップの後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１に提供される通り、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップの後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１に提供される通り、２回の拡大培養ステップの後に回収される。
[00524] ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当該技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
[00525] セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer、及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00526] 一部の実施形態において、回収、例えば、図１によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
[00527] 一部の実施形態において、図１によるステップＥは、実施例７に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例７に記載されるような閉鎖系が使用される。
[00528] 一部の実施形態において、実施例７に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書（実施例７では、１１日目のＴＩＬ回収と称される）に記載されるような方法を使用して、１日目～１１日目の間のＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、本明細書（実施例７では、２２日目のＴＩＬ回収と称される）に記載されるような方法を使用して、１２日目～２２日目の間のＴＩＬが回収される。
ステップＦ：最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動
[00529] 図１に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00530] 一実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０～６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内が挙げられる。
任意選択の培地成分である抗ＣＤ３抗体
[00531] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含み、例えば、図１を参照のこと）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ－２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
[00532] 当業者が理解し得る通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体ムロモナブ（表１に示される実施形態を含む）が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
[00533] 一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４－１ＢＢアゴニストは、当該技術分野で公知の任意の４－１ＢＢ結合分子であり得る。４－１ＢＢ結合分子は、ヒト又は哺乳類４－１ＢＢに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語はまた、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片、及び４－１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子、を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための４－１ＢＢアゴニストは、抗４－１ＢＢ抗体、ヒト抗４－１ＢＢ抗体、マウス抗４－１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４－１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４－１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４－１ＢＢ抗体、キメラ抗４－１ＢＢ抗体、抗４－１ＢＢアドネクチン、抗４－１ＢＢドメイン抗体、単鎖抗４－１ＢＢ断片、重鎖抗４－１ＢＢ断片、軽鎖抗４－１ＢＢ断片、抗４－１ＢＢ融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、アゴニスト性、抗４－１ＢＢヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち、単一細胞株に由来する抗体）である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＥＵ－１０１（Eutilex Co. Ltd.）、ウトミルマブ、又はウレルマブ、又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ、又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。
[00534] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト又は４－１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体４－１ＢＢアゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４－１ＢＢアゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４－１ＢＢＬ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上をさらに連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00535] アゴニスト性４－１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で４－１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性４－１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00536] 一部の実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４－１ＢＢ（配列番号９）に結合することを特徴とする。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト４－１ＢＢ（配列番号９）に結合する結合分子である。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、マウス４－１ＢＢ（配列番号１０）に結合する結合分子である。４－１ＢＢアゴニスト又は結合分子が結合する４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表６に概括する。
Figure 0007658896000003
[00537] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00538] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00539] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．１×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．４×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．５×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．６×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約２．７×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．８×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２．９×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00540] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４－１ＢＢに結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。
[00541] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＰＦ－０５０８２５６６又はＭＯＲ－７４８０としても知られるウトミルマブ、又はその断片、誘導体、変異体、若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２－ラムダ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２のグリコシル化部位；位置２２－９６（ＶＨ－ＶＬ）、１４３－１９９（ＣＨ１－ＣＬ）、２５６－３１６（ＣＨ２）及び３６２－４２０（ＣＨ３）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２２’－８７’（ＶＨ－ＶＬ）及び１３６’－１９５’（ＣＨ１－ＣＬ）の軽鎖内ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置２１８－２１８、２１９－２１９、２２２－２２２、及び２２５－２２５、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８－１３０、２１９－２１９、２２２－２２２、及び２２５－２２５、並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１９－１３０（２）、２２２－２２２、及び２２５－２２５の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置１３０－２１３’（２）、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８－２１３’及び１３０－２１３’、並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１８－２１３’（２）の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第８，８２１，８６７号；同第８，３３７，８５０号；及び同第９，４６８，６７８号、並びに国際公開第２０１２／０３２４３３ Ａ１号に記載され、これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother.2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６、及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。
[00542] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号１１で示される重鎖及び配列番号１２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00543] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１３に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１４に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00544] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにそれらの保存的アミノ酸置換を含む。
[00545] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４－１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
Figure 0007658896000004
[00546] 好ましい実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ－６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ、又はその断片、誘導体、変異体、又はバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４－カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウレルマブは、位置２９８（及び２９８’’）のＮ－グリコシル化部位；位置２２－９５（ＶＨ－ＶＬ）、１４８－２０４（ＣＨ１－ＣＬ）、２６２－３２２（ＣＨ２）及び３６８－４２６（ＣＨ３）（並びに位置２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６２’’－３２２’’及び３６８’’－４２６’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’－８８’（ＶＨ－ＶＬ）及び１３６’－１９６’（ＣＨ１－ＣＬ）（並びに位置２３’’’－８８’’’及び１３６’’’－１９６’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２２７－２２７’’及び２３０－２３０’’の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置１３５－２１６’及び１３５’’－２１６’’’の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res.2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２、及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。
[00547] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号２１で示される重鎖及び配列番号２２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00548] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号２３に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号２４に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00549] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00550] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４－１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
Figure 0007658896000005
[00551] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（BioLegend 309809）、Ｈ４－１ＢＢ－Ｍ１２７（BD Pharmingen 552532）、ＢＢＫ２（Thermo Fisher MS621PABX）、１４５５０１（Leinco Technologies B591）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ－１１２４８として寄託され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている細胞株によって産生される抗体、５Ｆ４（BioLegend 31 1503）、Ｃ６５－４８５（BD Pharmingen 559446）、米国特許出願公開第２００５／００９５２４４号に開示されている抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されている抗体（２０Ｈ４．９－ＩｇＧｌ（ＢＭＳ－６６３０３１）など）、同第６，８８７，６７３号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ－５５４２７１など）、同第７，２１４，４９３号に開示されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、同第６，９０５，６８５号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ－５５４２７１など）、同第６，３６２，３２５号に開示されている抗体（１Ｄ８又はＢＭＳ－４６９４９２；３Ｈ３又はＢＭＳ－４６９４９７；又は３Ｅｌなど）、同第６，９７４，８６３号に開示されている抗体（５３Ａ２など）；同第６，２１０，６６９号に開示されている抗体（１Ｄ８、３Ｂ８、又は３Ｅ１など）、同第５，９２８，８９３号に記載されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、国際公開第２０１２／１７７７８８号、同第２０１５／１１９９２３号、及び同第２０１０／０４２４３３号に開示されている抗体、並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、又はバイオシミラー、からなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00552] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、国際公開第２００８／０２５５１６ Ａ１号、同第２００９／００７１２０ Ａ１号、同第２０１０／００３７６６ Ａ１号、同第２０１０／０１００５１ Ａ１号、及び同第２０１０／０７８９６６ Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００２７２１８ Ａ１号、同第２０１５／０１２６７０９ Ａ１号、同第２０１１／０１１１４９４ Ａ１号、同第２０１５／０１１０７３４ Ａ１号、及び同第２０１５／０１２６７１０ Ａ１号；並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されている４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00553] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示される４－１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質、又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。
構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ、又は４－１ＢＢに結合する抗体、に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価（triavelent）タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さな細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列、並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol.2012, 980250；Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208；又は、本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00554] 構造Ｉ－Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７～２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１～１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２～配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。
Figure 0007658896000006
[00555] 構造Ｉ－Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ－ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３～配列番号４５に示される実施形態から選択される。
Figure 0007658896000007
[00556] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表９に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。
[00557] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４６による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４７による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。
[00558] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、表１１に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
Figure 0007658896000008
[00559] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインをさらに含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインをさらに含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性４－１ＢＢドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、４－１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有する。
[00560] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、を含む４－１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有し、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは４－１ＢＢ結合ドメインである。
[00561] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含む４－１ＢＢアゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
[00562] 一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、BPS Bioscience４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７－２であり、これはBPS Bioscience, San Diego, CA, USAから市販されている。一実施形態において、４－１ＢＢアゴニストは、Creative Biolabs４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ－１８１７９であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
任意選択的な培地成分としてのＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
[00563] 一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当該技術分野で公知の任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒト又は哺乳類ＯＸ４０に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語はまた、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片、及びＯＸ４０に結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子、を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、単鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト性、抗ＯＸ４０ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち、単一細胞株に由来する抗体）である。
[00564] 好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。ＯＸ４０Ｌに融合したＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother.2009, 182, 1481-89に記載されている。好ましい実施形態において、三量体又は六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上をさらに連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00565] アゴニスト性ＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘発することが知られている。Curti, et al., Cancer Res.2013, 73, 7189-98。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00566] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合することを特徴とする。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合する結合分子である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０（配列番号５５）に結合する結合分子である。ＯＸ４０アゴニスト又は結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表９に概括する。
Figure 0007658896000009
[00567] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00568] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00569] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．１×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．４×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．５×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．６×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約２．７×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．８×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．９×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00570] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00571] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２又はＭＥＤＩ－０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１－カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１０に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを伴い位置３０１及び３０１’’のＮ－グリコシル化部位；位置２２－９５（ＶＨ－ＶＬ）、１４８－２０４（ＣＨ１－ＣＬ）、２６５－３２５（ＣＨ２）及び３７１－４２９（ＣＨ３）（並びに位置２２’’－９５’’、１４８’’－２０４’’、２６５’’－３２５’’及び３７１’’－４２９’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’－８８’（ＶＨ－ＶＬ）及び１３４’－１９４’（ＣＨ１－ＣＬ）（並びに位置２３’’’－８８’’’及び１３４’’’－１９４’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２３０－２３０’’及び２３３－２３３’’の鎖内重鎖－重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置２２４－２１４’及び２２４’’－２１４’’’の鎖内重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。
[00572] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５６で示される重鎖及び配列番号５７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00573] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号５８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号５９に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00574] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00575] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。
Figure 0007658896000010
[00576] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１１Ｄ４であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１１に示す。
[00577] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号６６で示される重鎖及び配列番号６７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00578] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号６８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号６９に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00579] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号７３、配列番号７４、及び配列番号７５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00580] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。
Figure 0007658896000011
[00581] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１８Ｄ８であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１２に示す。
[00582] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00583] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号７８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号７９に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00584] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８０、配列番号８１、及び配列番号８２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号８５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00585] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。
Figure 0007658896000012
[00586] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１１９－１２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１１９－１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１１９－１２２のアミノ酸配列を表１３に示す。
[00587] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号８６に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号８７に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00588] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８８、配列番号８９、及び配列番号９０に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号９３に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00589] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９－１２２である。
Figure 0007658896000013
[00590] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１０６－２２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１０６－２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１０６－２２２のアミノ酸配列を表１４に示す。
[00591] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号９４に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号９５に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00592] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９６、配列番号９７、及び配列番号９８に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号９９、配列番号１００、及び配列番号１０１に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00593] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６－２２２である。
Figure 0007658896000014
[00594] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体はＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585に記載されているように、Biovest Inc.（Malvern, MA, USA）に寄託された、９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。
[00595] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Pharmingen Product #340420）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。
[00596] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、国際公開第９５／１２６７３号、同第９５／２１９２５号、同第２００６／１２１８１０号、同第２０１２／０２７３２８号、同第２０１３／０２８２３１号、同第２０１３／０３８１９１号、及び同第２０１４／１４８８９５号；欧州特許第０６７２１４１号；米国特許出願公開第２０１０／１３６０３０号、同第２０１４／３７７２８４号、同第２０１５／１９０５０６号、及び同第２０１５／１３２２８８号；並びに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号、及び同第９，１６３，０８５号（２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択され、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00597] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質、又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂの特性は、上記並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。構造Ｉ－Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表６に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７～２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１～１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２～配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造Ｉ－Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表７に示す。構造Ｉ－ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３～配列番号４５に示される実施形態から選択される。
[00598] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９－１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６－２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１９に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
[00599] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０２による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
[00600] 一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ－Ａ又はＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、表１５に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
Figure 0007658896000015
Figure 0007658896000016
[00601] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインをさらに含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインをさらに含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有する。
[00602] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、を含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３～８アミノ酸長を有し、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインはＯＸ４０結合ドメインである。
[00603] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３はＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00604] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含むＯＸ４０アゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
[00605] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Creative BiolabsＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ－１８４５５であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。
[00606] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、BioLegend, Inc., San Diego, CA, USAから市販されているＯＸ４０アゴニスト性抗体クローンＢｅｒ－ＡＣＴ３５である。
任意選択の細胞生存率分析
[00607] 任意選択で、第１の拡大培養（初めのバルク拡大培養と称されることがある）の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00608] 一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などのマーカー、並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。細胞生存率はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１５／８６３，６３４号明細書“Processes for Production of Tumor Infiltrating Lymphocytes and Uses of Same in Immunotherapy”に基づいてアッセイすることができる。
[00609] ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、ＲＥＰに供し、次に凍結保存してもよい。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ ＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供してもよい。
[00610] 本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投与における更なる使用。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltratitng lymphocyte）（ＴＩＬ）のアッセイ方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ－２、及び任意選択によりＯＫＴ－３、を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多いこと；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、及び凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加的な第２の拡大培養を少なくとも３日の追加的拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）にわたって実施することであって、この第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療上有効な投薬量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00611] 一部の実施形態において、ＴＩＬはステップ（ｖｉｉ）の後に生存率に関してアッセイされる。
[00612] 本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日の追加的拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
[00613] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
[00614] 一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態に記載される通りの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することをさらに含む。
[00615] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することをさらに含む。
細胞培養培地
[00616] 一実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、上記で考察され図１で例示されているものを含み、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、又は約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は無血清培地である。一部の実施形態において、第１の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第２の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第１及び第２の拡大培養の培地は双方とも無血清である。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大することは、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00617] 一部の実施形態において、本明細書に開示される拡大培養プロセスで使用される培養培地は、無血清培地又は限定培地である。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、部分的に血清含有培地のロット間の変動に起因する実験的変動を防止及び／又は減少させるために使用される。
[00618] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、基礎細胞培地及び血清補充物及び／又は血清代替物を含む。いくつかの実施形態において、基礎細胞培地は、これらに限定されないが、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）AIM-V培地、CST（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含む。
[00619] 一部の実施形態において、血清補充物又は血清代替物は、これらに限定されないが、１つ以上のCTS（商標）OpTmizerＴ細胞拡大培養血清補充物、CTS（商標）免疫細胞血清代替物、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素を含む。いくつかの実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、並びに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３’’、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又は２－メルカプトエタノールをさらに含む。
[00620] 一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞免疫細胞血清代替物は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ、CTS（商標）AIM-V培地、CST（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、LymphoONE（商標）Ｔ細胞増殖異種フリー培地、ダルベッコ
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地を含むがこれらに限定されない従来の増殖培地とともに使用される。
[00621] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地中の総血清代替物濃度（体積％）は、無血清又は限定培地全体の総体積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％以上である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約３％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約５％である。一部の実施形態において、総血清代替物濃度は、無血清又は限定培地の総体積の約１０％である。
[00622] 一部の実施形態において、無血清又は限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。
[00623] 一部の実施形態において、限定培地は、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）である。CTS（商標）OpTmizer（商標）の任意の製剤は、本発明において有用である。CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、１ＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養基礎培地と２６ｍＬのCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養補充剤を組み合わせたものであり、使用前に混合される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）で補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充される。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンで補充され、さらに、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一部の実施形態において、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭは、約３％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物（ＳＲ）（ThermoFisher Scientific）及び約２ｍＭのグルタミンで補充され、さらに、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00624] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、又は４ｍＭ～約５ｍＭの濃度のグルタミン（すなわち、GlutaMAX（登録商標））が補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、２ｍＭの濃度のグルタミン（すなわち、GlutaMAX（登録商標））が補充される。
[00625] 一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、又は約６５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。一部の実施形態において、無血清培地又は限定培地は、５５ｍＭの濃度の２－メルカプトエタノールが補充される。
[00626] 一部の実施形態において、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第１９９８／０３０６７９号に記載されている限定培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養での細胞の増殖をサポートすることができる無血清補充物が補充された基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地補充物は、１つ以上のアルブミン又はアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、又はそれらを組み合わせることによって得られる。一部の実施形態において、限定培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム及び／又はβ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態において、限定培地は、アルブミン又はアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリン又はインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。いくつかの実施形態において、限定培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、並びに微量元素部分Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３’’、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ２＋、Ｐ、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含む化合物からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む。一部の実施形態において、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ増殖培地、イスコーブの改良ダルベッコ培地からなる群から選択される。
[00627] 一部の実施形態において、限定培地中のグリシンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸の濃度は約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（AlbuMAX（登録商標）Iなど）の濃度は約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。
[00628] 一部の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａの「１Ｘ培地中の濃度範囲」という見出しの下の欄に列挙された濃度範囲に存在する。他の実施形態において、限定培地中の非微量元素部分成分は、以下の表Ａの「１Ｘ培地の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙された最終濃度に存在する。他の実施形態において、限定培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態の一部において、無血清補充物は、以下の表Ａの「補充物の好ましい実施形態」という見出しの下の欄に列挙されたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。
Figure 0007658896000017
[00629] 一部の実施形態において、限定培地の容積オスモル濃度は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、容積オスモル濃度は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。一部の実施形態において、限定培地は、最大約３．７ｇ／Ｌ、又は約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムで補充される。限定培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）をさらに補充できる。
[00630] 一部の実施形態において、Smith, et al.,“Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi:10.1038/cti.2014.31)に記載されている限定培地は、本発明において有用である。簡単に説明すると、ＲＰＭＩ又はCTS（商標）OpTmizer（商標）を基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、又は１０％のCTS（商標）免疫細胞血清代替物を補充した。
[00631] 一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ又はβＭＥ、２－メルカプトエタノール、CAS 60-24-2としても知られている）を欠いている。
[00632] 一実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること；腫瘍組織サンプルからＴＩＬを入手すること；細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約７～１４日間、例えば約１１日間拡大することを含む本方法の所要期間。一部の実施形態において、プレＲＥＰは約７～１４日間、例えば、約１１日間である。一部の実施形態において、ＲＥＰは約７～１４日間、例えば、約１１日間である。
[00633] 一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）などの、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、OMNI C3（登録商標）細胞培養バッグ（Lampire Biological Laboratories）などの、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、EXP-PAK（商標）Cell Expansion Bio-Containers（Charter Medical）などの、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬを拡大培養するための細胞拡大培養システムは、各拡大培養ステップに対して同じガス透過性容器を使用する。一実施形態において、ＴＩＬを拡大培養するための細胞拡大培養システムは、各拡大培養ステップに対して異なるガス透過性容器を使用する。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00634] 一実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。一実施形態において、これはフィードを伴わない。一実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィードなしである。一実施形態において、これにフィードはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
任意選択のＴＩＬ遺伝子操作
[00635] 一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子操作される。
ＴＩＬ製造用閉鎖系
[00636] 本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は２つの容器を使用する。
[00637] 閉鎖系は、当該技術分野で公知であり、例えば、http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
[00638] 滅菌接続装置（ＳＴＣＤ：Sterile Connecting Device）は、互換性のある２つの配管の間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。一部の実施形態において、閉鎖系は、例えば実施例４に記載されるようなルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例６に記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例４の「最終的な製剤化及び充填」部分に記載される方法に従って最終産物製剤容器中に製剤化される。
[00639] 一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点からＴＩＬが患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで１つの容器を使用する。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、第１の容器は閉鎖型Ｇコンテナであり、ＴＩＬ集団は遠心され、第１の閉鎖型Ｇコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。閉鎖系又は閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍サンプル及び／又は腫瘍断片が追加されると、系が外側からしっかりと密閉され、細菌、真菌、及び／又はその他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成することを特徴とする。
[00640] 一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約１００％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約９５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％～約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１０％～約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１５％～約８５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％である。
[00641] 閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び／又は大幅に減少させＴＩＬを成長させる。
[00642] さらに、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、たとえ細胞培養に適した培地が流通していても、ＴＩＬ成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培地内のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培地の変化に従ってリアルタイムで調製されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調製することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
[00643] 一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は連続的又は断続的に制御される。つまり、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち、空間が、陽圧状態のＴＩＬの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、ひいては、細胞成長を促進することを確実にする。さらに、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
[00644] 一部の実施形態において、ＴＩＬの成長に最適な培養成分を置換又は追加することができ、ＩＬ－２及び／又はＯＫＴ３などの要因、並びに組み合わせを追加してもよい。
任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00645] 上記で考察し、及び図１に提供されるステップＡ～Ｅにおいて例示した通り、治療用産物の保存のためのＴＩＬ回収後のプロセスの最終段階を含む、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図１のステップＤに従って提供される）第２の拡大培養後の拡大培養されたＴＩＬ集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。溶液中の細胞を超低温バイアルに入れ、任意選択により凍結保存のために気体窒素冷凍庫に移動させて、－８０℃で２４時間貯蔵する。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例６及び７に提供される方法に従い凍結保存される。
[00646] 適切な場合には、細胞を冷凍庫から取り出し、溶液のおよそ４／５が解凍されるまで、３７℃の水浴中で解凍する。細胞は、一般的に、完全培地に再懸濁され、任意選択により、１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当該技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00647] バルクＴＩＬ集団又はＴＩＬの拡大培養集団のいずれかを、必要に応じて凍結保存できる。一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第２の拡大培養後に回収したＴＩＬで生じる。一部の実施形態において、図１の例示的ステップＦのＴＩＬで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、ＴＩＬは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
[00648] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当該技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00649] 好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団はＣＳ１０凍結保存培地（CryoStor 10、BioLife Solutions）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は凍結保存培地（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、約１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用し、さらに追加のＩＬ－２を含んで凍結保存される。
[00650] 上記でステップＡ～Ｅにおいて考察した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、ステップＢに係る第１の拡大培養後のバルクＴＩＬ集団又はステップＤに係る１回以上の第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存されてもよい。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、－８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
[00651] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当該技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00652] ある場合には、ステップＢのＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団にステップＣ及びステップＤを施し、ステップＤ後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬを治療に使用する場合、ステップＢ又はステップＤのＴＩＬ集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン
[00653] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０～６０分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与、及びリンパ管内投与が含まれる。
[00654] 任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、平均が約７．８×１０１０個のＴＩＬである約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、特に、癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約３×１０１０～約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約４×１０１０～約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約５×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約６×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約７×１０１０～約８×１０１０個のＴＩＬである。
[00655] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
[00656] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
[00657] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、又はｖ／ｖより高い。
[00658] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00659] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00660] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、又は０．０００１ｇ以下である。
[00661] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、又は１０ｇ超である。
[00662] 本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重、並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量もまた、適切ならば使用され得る。ＴＩＬの投与量などの、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
[00663] 一部の実施形態において、ＴＩＬは単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回を超えてもよい。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回、又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続し得る。
[00664] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
[00665] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
[00666] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
[00667] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること、又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与されてもよい。
患者の処置方法
[00668] 処置方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。そのような方法については、両方ともに当該技術分野において、例えばJin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292（全体として参照により本明細書に援用される）により記載されている。処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
[00669] 本明細書に記載の方法、例えば上記のステップＡ～Ｆに記載の方法を含む、又は上記のステップＡ～Ｆに記載の方法（また、例えば、図１に示すもの）に従って作製された拡大培養ＴＩＬは、癌患者の処置における特定の使用（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239、並びに補足内容）が見出される。一部の実施形態では、ＴＩＬは、先述の通り転移性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。新鮮腫瘍は無菌条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表試料を収集し得る。２ｍｍ３～３ｍｍ３の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者１人当たり５、１０、１５、２０、２５又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２０、２５、又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２０、２２、２４、２６、又は２８の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人当たり２４の試料を入手する。試料を２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニタリングし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載される通り凍結保存し得る。
[00670] 一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６）のため、増殖に成功したＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であると見なすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、急速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含め、第２の拡大培養（例えば、図１）のステップＤにおいて提供される通りの第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが、追加の第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、図１のステップＤに提供される通りの第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図１のステップＤによる追加の第２の拡大培養に選択される。
[00671] 一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、例えば、一部の実施形態において、腫瘍採取後及び／又は第１の拡大培養後、細胞はすぐには利用されない。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の２日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
[00672] 輸注バッグＴＩＬの凍結保存サンプルの細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（例えば、FlowJo）、並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ－γの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬ及び４ ３ベースラインレベル超（greater than 4 3 baseline levels）と定義した。
[00673] 一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図１に例示される方法により作製されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図１に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図１に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬに比べて臨床有効性が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／又はジェネレーション１（Ｇｅｎ １）と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び／又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図１に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図１に例示される方法以外の、例えばＧｅｎ １プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬと同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
[00674] 一部の実施形態において、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、本発明の方法、例えば、図１に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液、血清、又はＴＩＬエキソビボ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISAキットを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図１に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図１に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、例えば図１に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
[00675] 一部の実施形態において、例えば図１に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば図１に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図１に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
[00676] 有効性の尺度には、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されるように、疾患制御率（ＤＣＲ：Disease Control Rate）並びに全奏効率（ＯＲＲ：Overall Response Rate）が含まれ得る。
癌及びその他の疾患の処置方法
[00677] 本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができる。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらはまた、本明細書及び以下の段落に記載されている通りその他の障害の処置に使用されてもよい。
[00678] 一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[00679] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的許容量まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。
[00680] 示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当該技術分野において公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92；及びFong, et al., J. Ovarian Res.2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol.2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res.2006, 8, 212に記載がある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res.2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009, 2, 55-60；及びSano, Head Neck Oncol.2009, 1, 32に記載がある。
[00681] 一部の実施形態において、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、過剰成長性傷害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、本発明の方法、例えば、図１に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図５及び／又は図６に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された対象と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ－γの増加をもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISAキットを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γはQuantikine ELISAキットを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者からのＴＩＬエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ－γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血清において測定される。
[00682] 一部の実施形態において、例えば図１に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば図１に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図１に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書に提供されるもの以外の方法、例えば、図１で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
[00683] 一部の実施形態において、本発明は、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養する前述の方法のいずれかを使用して調製された治療有効投与量のＴＩＬを患者に投与することを含む、患者の癌を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、癌は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は血液悪性腫瘍である。一部の実施形態において、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[00684] 一部の実施形態において、本発明は、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養する前述の方法のいずれかを使用して調製されたＴＩＬ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
[00685] 一部の実施形態において、本発明は、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養する前述の方法のいずれかを使用して調製されたＴＩＬ及び薬学的に許容される担体を含む、患者の癌を処置する方法における使用のための医薬組成物を提供し、方法は、治療有効投与量の医薬組成物を患者に投与することを含む。一部の実施形態において、癌は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は血液悪性腫瘍である。一部の実施形態において、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[00686] 一部の実施形態において、本発明は、凍結腫瘍組織からＴＩＬを拡大培養する前述の方法のいずれかを使用して調製されたＴＩＬ及び薬学的に許容される担体を含む、患者の癌を処置する方法における医薬組成物の使用を提供し、方法は、治療有効投与量の医薬組成物を患者に投与することを含む。一部の実施形態において、癌は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は血液悪性腫瘍である。一部の実施形態において、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
共投与方法
[00687] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるように作製されるＴＩＬ（例えば、図１のステップＡ～Ｆに記載される方法から得られたＴＩＬを含む）は、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ－１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ－３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Tesaro，Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（BeiGene）、及び／又は抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Bristol-Myers Squibb）、及び／又はヒト化抗ＰＤ１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合してＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。当業者は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ～Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ－１抗体単独の投与に抵抗性の癌型を有するとき抗ＰＤ－１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が抵抗性黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ－１と併用して投与される。
任意選択での患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00688] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのＴＩＬの集団を含む。ある実施形態において、ＴＩＬの集団は注入による投与用である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示によるＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ－２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態では、ＴＩＬの集団は、ＩＬ－２と組み合わせて癌を処置するのに使用され、ＩＬ－２はＴＩＬの集団の後に投与される。
[00689] 実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、処置有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00690] 一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせの投与を使用して達成される。そのような方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85、Muranski, et al., Nat.Clin.Pract.Oncol., 2006, 3, 668-681、Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239、及びDudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-2357（これらは全て、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
[00691] 一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上にわたり投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間実施される。
[00692] 一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により１μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内（ｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４～５日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４日間実施される。
[00693] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを患者に併せて投与することで実施される。一部の実施形態において、４日間にわたってフルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
[00694] ある実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与と、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与により実施される。
ＩＬ－２レジメン
[00695] ある実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、治療有効部分の投与の翌日から静脈内投与される高用量ＩＬ－２レジメンを含み、治療用ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した１日後から静脈に内投与され始め、高用量ＩＬ－２レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入を使用して、最大１４用量で、０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で投与される。９日間の休息の後、このスケジュールをさらに１４回、合計で最大２８回まで繰り返してもよい。
[00696] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、漸減性ＩＬ－２レジメンを含む。漸減性ＩＬ－２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin.Oncol.1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の６時間にわたる静脈内投与、それに続く１８×１０６ＩＵ／ｍ２の１２時間にわたる静脈内投与、その後１８×１０６ＩＵ／ｍ２の２４時間にわたる静脈内投与、その後４．５×１０６ＩＵ／ｍ２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返してもよい。一実施形態において、漸減性ＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
[00697] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。
養子細胞移入
[00698] 養子細胞移入（ＡＣＴ）は、非常に有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養、及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来してもよい（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴ用のＴＩＬは、腫瘍凍結保存及び解凍ステップを使用することを含む、本明細書のＴＩＬ製造プロセスに記載されているように調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図１に記載される通りの方法により調製される。ＴＩＬはまた、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合には血液から誘導されてもよく、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされてもよく、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされてもよい。注入しようとする癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる）。一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与されてもよい。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回を超えてもよい。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回、又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続されてもよい。
ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１阻害剤との組み合わせ
[00699] プログラム死１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、活性化単球、及び樹状細胞によって発現される２８８アミノ酸膜貫通型免疫チェックポイント受容体タンパク質である。ＣＤ２７９としても知られるＰＤ－１は、ＣＤ２８ファミリーに属し、ヒトでは第２染色体上のＰｄｃｄ１遺伝子によってコードされている。ＰＤ－１は、１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリードメイン、膜貫通領域、並びに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する細胞内ドメインから構成される。ＰＤ－１及びそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、Keir, et al., Annu.Rev. Immunol.2008, 26:677-704に記載されるように、免疫寛容において重要な役割を果たすことが知られている。ＰＤ－１は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する阻害シグナルを提供する。ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１又はＣＤ２７４としても知られる）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ又はＣＤ２７３としても知られる）は、腫瘍細胞及び間質細胞で発現され、これは、ＰＤ－１を発現する活性化Ｔ細胞が遭遇し得、Ｔ細胞の免疫抑制をもたらす。ＰＤ－Ｌ１は、ヒト９番染色体上のＣｄ２７４遺伝子によってコードされる２９０アミノ酸の膜貫通タンパク質である。Topalian, et al., N. Eng.J. Med.2012, 366:2443-54などに記載のものなどの最近の臨床研究で示されているように、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤の使用により、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断すると、免疫抵抗性を克服できる。ＰＤ－Ｌ１は多くの腫瘍細胞株に発現している一方、ＰＤ－Ｌ２は主に樹状細胞及びいくつかの腫瘍株に発現している。Ｔ細胞（活性化後にＰＤ－１を誘導的に発現する）に加えて、ＰＤ－１は、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、活性化単球、及び樹状細胞にも発現する。
[00700] 本明細書に記載のＴＩＬ及びＴＮＦＲＳＦアゴニストの方法、組成物、及び組み合わせはまた、プログラム死－１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、及び／又はプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）結合抗体、アンタゴニスト、又は阻害剤（即ち、遮断剤）とさらに組み合わせられ得る。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＴＩＬ拡大培養のプレＲＥＰ又はＲＥＰ段階中に、本明細書に記載のＴＮＦＲＳＦアゴニストと併せて細胞培養で使用され得る。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤はまた、腫瘍の外科的切除前、又はＴＩＬの注入中又は注入後に、ＴＮＦＲＳＦアゴニストと併せて使用され得る。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト及びＧＩＴＲアゴニストを含むアゴニスト性ＧＩＴＲ抗体及び組成物と併せてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤を使用する適切な方法は、国際公開第２０１５／０２６６８４ Ａ１号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00701] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、当技術分野で公知の任意のＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－１遮断剤であり得る。特に、それは、以下の段落でより詳細に記載されるＰＤ－１阻害剤又は遮断剤の１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、ＰＤ－１阻害剤に関して本明細書において互換的に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＰＤ－１阻害剤への本明細書における言及は、化合物又はその抗原結合フラグメント、変異体、コンジュゲート、又はバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、本明細書におけるＰＤ－１阻害剤への言及はまた、小分子化合物又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、又はプロドラッグを指し得る。
[00702] 一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物及び方法は、ＰＤ－１阻害剤を含む。一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は小分子である。好ましい実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、抗体（即ち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、又はその単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤はポリクローナル抗体である。好ましい実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１との結合について競合し、及び／又はＰＤ－１上のエピトープに結合する。一実施形態において、抗体は、ＰＤ－１との結合について競合し、及び／又はＰＤ－１上のエピトープに結合する。
[00703] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約３０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約２０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、約１０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約１ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、ＰＤ－１阻害剤を含む。
[00704] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合する、ＰＤ－１阻害剤を含む。
[00705] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．１×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．４×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．５×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．６×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約２．７×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．８×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．９×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合する、ＰＤ－１阻害剤を含む。
[00706] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害する、ＰＤ－１阻害剤を含む。
[00707] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブ（Bristol-Myers Squibb Co.からオプジーボ（OPDIVO）として市販されている）、又はそのバイオシミラー、抗原結合フラグメント、コンジュゲート、又は変異体である。ニボルマブは、ＰＤ－１受容体を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、免疫グロブリンＧ４カッパ、抗（ヒトＣＤ２７４）抗体である。ニボルマブにはChemical Abstracts Service（ＣＡＳ）登録番号９４６４１４－９４－４が割り当てられており、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、及びＯＮＯ－４５３８としても知られる。ニボルマブの調製及び特性は、米国特許第８，００８，４４９号、及び国際公開第２００６／１２１１６８号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。様々な形態の癌におけるニボルマブの臨床的安全性及び有効性は、Wang, et al., Cancer Immunol Res.2014, 2:846-56；Page, et al., Ann.Rev. Med., 2014, 65, 185-202；及びWeber, et al., J. Clin.Oncology, 2013, 31:4311-4318に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ニボルマブのアミノ酸配列を表１６に示す。ニボルマブは、２２－９６，１４０－１９６、２５４－３１４、３６０－４１８、２２’’－９６’’、１４０’’－１９６’’、２５４’’－３１４’’、及び３６０’’－４１８’’の重鎖内ジスルフィド結合；２３’－８８’、１３４’－１９４’、２３’’’－８８’’’、及び１３４’’’－１９４’’’の軽鎖内ジスルフィド結合；１２７－２１４’、１２７’’－２１４’’’の重－軽鎖間ジスルフィド結合、２１９－２１９’’及び２２２－２２２’’の重－重鎖間ジスルフィド結合；及び２９０、２９０’’のＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ ８４．４）を有する。
[00708] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、配列番号１２７で示される重鎖及び配列番号１２８で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00709] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１２９に示される配列を含み、ＰＤ－１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１３０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00710] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３１、配列番号１３２、及び配列番号１３３に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１３４、配列番号１３５、及び配列番号１３６に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、前述の抗体のいずれかと同じＰＤ－１上のエピトープとの結合について競合し、及び／又はそれに結合する。
[00711] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－１バイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーは、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む抗ＰＤ－１抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はニボルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された抗ＰＤ－１抗体であり、抗ＰＤ－１抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はニボルマブである。抗ＰＤ－１抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はニボルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はニボルマブである。
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[00712] 別の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ペンブロリズマブ（Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USAからKEYTRUDAとして市販されている）、又はその抗原結合フラグメント、コンジュゲート、若しくは変異体を含む。ペンブロリズマブにはＣＡＳ登録番号１３７４８５３－９１－４が割り当てられ、ラムブロリズマブ、ＭＫ－３４７５、及びＳＣＨ－９００４７５としても知られる。ペンブロリズマブは、免疫グロブリンＧ４、抗（ヒトタンパク質ＰＤＣＤ１（プログラム細胞死１））（ヒト－マウス（Mus musculus）モノクローナル重鎖）、ヒト－マウス（Mus musculus）モノクローナル軽鎖、二量体構造のジスルフィドを有する。ペンブロリズマブの構造は、免疫グロブリンＧ４、抗（ヒトプログラム細胞死１）；ヒト化マウスモノクローナルκ軽鎖二量体（２２６－２２６’’：２２９－２２９’’）－ビスジスルフィドを伴うヒト化マウスモノクローナル［２２８－Ｌ－プロリン（Ｈ１０－Ｓ＞Ｐ）］γ４重鎖（１３４－２１８’）－ジスルフィドとも記載され得る。ペンブロリズマブの特性、使用、及び調製は、国際公開第２００８／１５６７１２ Ａ１号、米国特許第８，３５４，５０９号、及び米国特許出願公開第２０１０／０２６６６１７ Ａ１号、同第２０１３／０１０８６５１ Ａ１号、及び同第２０１３／０１０９８４３ Ａ２号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。様々な形態の癌におけるペンブロリズマブの臨床的安全性及び有効性は、Fuerst, Oncology Times, 2014, 36:35-36；Robert, et al., Lancet, 2014, 384:1109-17；及びThomas, et al., Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14:1061-1064に記載される。ペンブロリズマブのアミノ酸配列を表２１に示す。ペンブロリズマブには、以下のジスルフィド架橋：２２－９６、２２’’－９６’’、２３’－９２’、２３’’’－９２’’’、１３４－２１８’、１３４’’－２１８’’’、１３８’－１９８’、１３８’’’－１９８’’’、１４７－２０３、１４７’’－２０３’’、２２６－２２６’’、２２９－２２９’’、２６１－３２１、２６１’’－３２１’’、３６７－４２５、及び３６７’’－４２５’’、並びに以下のグリコシル化部位（Ｎ）：Ａｓｎ－２９７及びＡｓｎ－２９７’’が含まれる。ペンブロリズマブはＦｃ領域に安定化Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４／カッパアイソタイプであり、この変異をＩｇＧ４ヒンジ領域に挿入すると、ＩｇＧ４抗体で典型的に観察される半分子の形成が防止される。ペンブロリズマブは各重鎖のＦｃドメイン内のＡｓｎ２９７で不均一にグリコシル化されており、無傷の抗体の分子量はおよそ１４９ｋＤａである。ペンブロリズマブの主要なグリコフォームは、フコシル化アガラクト二分岐グリカン型（Ｇ０Ｆ）である。
[00713] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、配列番号１３７で示される重鎖及び配列番号１３８で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１３８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１３８に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１３８に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１３８に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１３８に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３７及び配列番号１３８に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。代表的な配列を表１７に示す。
[00714] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ペンブロリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１３９に示される配列を含み、ＰＤ－１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１４０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３９及び配列番号１４０に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３９及び配列番号１４０に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３９及び配列番号１４０に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３９及び配列番号１４０に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１３９及び配列番号１４０に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00715] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ配列番号１４１、配列番号１４２、及び配列番号１４３に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１４４、配列番号１４５、及び配列番号１４６に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、前述の抗体のいずれかと同じＰＤ－１上のエピトープとの結合について競合し、及び／又はそれに結合する。
[00716] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ペンブロリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－１バイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーは、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む抗ＰＤ－１抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はペンブロリズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された抗ＰＤ－１抗体であり、抗ＰＤ－１抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はペンブロリズマブである。抗ＰＤ－１抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はペンブロリズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はペンブロリズマブである。
Figure 0007658896000019
[00717] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、抗ｍ－ＰＤ－１クローンＪ４３（カタログ番号ＢＥ００３３－２）及びＲＭＰ１－１４（カタログ番号ＢＥ０１４６）（Bio X Cell, Inc., West Lebanon, NH, USA）などの市販の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体である。多くの市販の抗ＰＤ－１抗体が当業者に公知である。
[00718] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，３５４，５０９号又は米国特許出願公開第２０１０／０２６６６１７ Ａ１号、同第２０１３／０１０８６５１ Ａ１号、同第２０１３／０１０９８４３ Ａ２号に開示される抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，２８７，８５６号、同第８，５８０，２４７号及び同第８，１６８，７５７号並びに米国特許出願公開第２００９／００２８８５７ Ａ１号、同第２０１０／０２８５０１３ Ａ１号、同第２０１３／００２２６００ Ａ１号、及び同第２０１１／０００８３６９ Ａ１号に記載のＰＤ－１抗体であり、これらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，７３５，５５３ Ｂ１号に記載の抗ＰＤ－１抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ＣＴ－０１１としても知られるピジリズマブであり、これは米国特許第８，６８６，１１９号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00719] 一実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，９０７，０５３号、同第９，０９６，６４２号、及び同第９，０４４，４４２号、並びに米国特許出願公開第２０１５／００８７５８１号に記載されているものなどの、小分子又はペプチド、又はペプチド誘導体；米国特許出願公開第２０１５／００７３０２４号に記載されているものなどの、１，２，４－オキサジアゾール化合物及び誘導体；米国特許出願公開第２０１５／００７３０４２号に記載されているものなどの、環状ペプチド模倣化合物及び誘導体；米国特許出願公開第２０１５／０１２５４９１号に記載されているものなどの、環状化合物及び誘導体；国際公開第２０１５／０３３３０１号に記載されているものなどの、１，３，４－オキサジアゾール及び１，３，４－チアジアゾール化合物及び誘導体；国際公開第２０１５／０３６９２７号及び同第２０１５／０４４９０号に記載されているものなどの、ペプチドベースの化合物及び誘導体；又は米国特許出願公開第２０１４／０２９４８９８号に記載されているものなどの、大環状ペプチドベースの化合物及び誘導体であり得、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00720] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、当技術分野で公知の任意のＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２阻害剤、アンタゴニスト、又は遮断剤であり得る。特に、それは、以下の段落でより詳細に記載されるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤、アンタゴニスト又は遮断剤の１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤に関して本明細書において互換的に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤への本明細書における言及は、化合物又はその抗原結合フラグメント、変異体、コンジュゲート、又はバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、本明細書におけるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤への言及は、化合物又はその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、又はプロドラッグを指し得る。
[00721] 一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物、プロセス、及び方法は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は小分子である。好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、抗体（即ち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、又はその単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤はポリクローナル抗体である。好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合し、及び／又はＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。一実施形態において、抗体は、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合し、及び／又はＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。
[00722] 一部の実施形態において、本明細書で提供されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、化合物がＰＤ－Ｌ２受容体を含む他の受容体と結合又は相互作用するよりも実質的に低い濃度で化合物がＰＤ－Ｌ１と結合又は相互作用する点で、ＰＤ－Ｌ１に対して選択的である。特定の実施形態において、化合物は、ＰＤ－Ｌ２受容体に対するよりも少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、又は約５００倍高い濃度の結合定数で、ＰＤ－Ｌ１受容体に結合する。
[00723] 一部の実施形態において、本明細書で提供されるＰＤ－Ｌ２阻害剤は、化合物がＰＤ－Ｌ１受容体を含む他の受容体と結合又は相互作用するよりも実質的に低い濃度で化合物がＰＤ－Ｌ２と結合又は相互作用する点で、ＰＤ－Ｌ２に対して選択的である。特定の実施形態において、化合物は、ＰＤ－Ｌ１受容体に対するよりも少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、又は約５００倍高い濃度の結合定数で、ＰＤ－Ｌ２受容体に結合する。
[00724] 特定の理論に拘束されるものではないが、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、Ｔ細胞はＰＤ－１を発現すると考えられている。しかしながら、腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１発現は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の阻害剤又は遮断剤の有効性には必要とされない。一実施形態において、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現する。別の実施形態において、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現しない。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、ＴＩＬと組み合わせた、本明細書に記載されるものなどの、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせを含む。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体及びＴＩＬの組み合わせの投与は、同時又は逐次的であり得る。
[00725] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤ、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合する、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。
[00726] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合する、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。
[00727] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、約２．１×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．２×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．４×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．５×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、約２．６×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－１に結合するか、又は約２．７×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に結合するか、又は約３×１０－５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒトＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２に結合する、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。
[00728] 一部の実施形態において、記載される組成物及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断又は阻害するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒトＰＤ－１を阻害するか又はヒトＰＤ－Ｌ１若しくはヒトＰＤ－Ｌ２のヒトＰＤ－１への結合を遮断する、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。
[00729] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＥＤＩ４７３６（AstraZeneca plc.の子会社、Medimmune, LLC、Gaithersburg、Marylandから市販されている）としても知られるデュルバルマブ、又はその抗原結合断片、コンジュゲート、若しくは変異体である。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許８，７７９，１０８号又は米国特許出願公開第２０１３／００３４５５９号に開示される抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。デュルバルマブの臨床的有効性は、Page, et al., Ann.Rev. Med., 2014, 65:185-202；Brahmer, et al., J. Clin. Oncol. 2014, 32:5s (補足、要約8021)；及びMcDermott, et al., Cancer Treatment Rev., 2014, 40:1056-64.に記載される。デュルバルマブの調製及び特性は、米国特許第８，７７９，１０８号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。デュルバルマブのアミノ酸配列を表１８に示す。デュルバルマブモノクローナル抗体は、２２－９６、２２’’－９６’’、２３’－８９’、２３’’’－８９’’’、１３５’－１９５’、１３５’’’－１９５’’’、１４８－２０４、１４８’’－２０４’’、２１５’－２２４、２１５’’’－２２４’’、２３０－２３０’’、２３３－２３３’’、２６５－３２５、２６５’’－３２５’’、３７１－４２９、及び３７１’’－４２９’でのジスルフィド結合；並びにＡｓｎ－３０１及びＡｓｎ－３０１’’におけるＮ－グリコシル化部位を含む。
[00730] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１４７で示される重鎖及び配列番号１４８で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00731] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１４９に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１５０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４９及び配列番号１５０に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４９及び配列番号１５０に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４９及び配列番号１５０に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４９及び配列番号１５０に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１４９及び配列番号１５０に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00732] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、前述の抗体のいずれかと同じＰＤ－Ｌ１上のエピトープとの結合について競合し、及び／又はそれに結合する。
[00733] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーは、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はデュルバルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はデュルバルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はデュルバルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はデュルバルマブである。
Figure 0007658896000020
[00734] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Merck KGaA/EMD Seronoから市販されている）としても知られるアベルマブ、又はその抗原結合フラグメント、コンジュゲート、若しくは変異体である。アベルマブの調製及び特性は、米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７ Ａ１号に記載され、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。アベルマブのアミノ酸配列を表１９に示す。アベルマブは、２２－９６、１４７－２０３、２６４－３２４、３７０－４２８、２２’’－９６’’、１４７’’－２０３’’、２６４’’－３２４’’、及び３７０’’－４２８’’の重鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２２’－９０’、１３８’－１９７’、２２’’’－９０’’’、及び１３８’’’－１９７’’’の軽鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２２３－２１５’及び２２３’’－２１５’’’の重－軽鎖内ジスルフィド結合（ｈ５－ＣＬ１２６）；２２９－２２９’及び２３２－２３２’’の重－重鎖内ジスルフィド結合（ｈ１１、ｈ１４）；３００、３００’’のＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ Ｎ８４．４）；フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカン；並びに４５０及び４５０’のＨ ＣＨＳ Ｋ２ Ｃ末端リジンクリッピングを有する。
[00735] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１５７で示される重鎖及び配列番号１５８で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５７及び配列番号１５８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５７及び配列番号１５８に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５７及び配列番号１５８に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５７及び配列番号１５８に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５７及び配列番号１５８に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５７及び配列番号１５８に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00736] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アベルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１５９に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１６０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５９及び配列番号１６０に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６０及び配列番号１６０に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５９及び配列番号１６０に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５９及び配列番号１６０に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１５９及び配列番号１６０に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00737] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６１、配列番号１６２、及び配列番号１６３に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１６４、配列番号１６５、及び配列番号１６６に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、前述の抗体のいずれかと同じＰＤ－Ｌ１上のエピトープとの結合について競合し、及び／又はそれに結合する。
[00738] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アベルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーは、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアベルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアベルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアベルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアベルマブである。
Figure 0007658896000021
[00739] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ又はＲＧ７４４６（Roche Holding AG, Basel, Switzerlandの子会社、Genentech, Inc.からTECENTRIQとして市販されている）としても知られるアテゾリズマブ、又はその抗原結合フラグメント、コンジュゲート、若しくは変異体である。別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許第８，２１７，１４９号に記載の抗体であり、その開示は本明細書における参照により具体的に組み込まれる。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６ Ａ１号、同第２０１３／００４５２００ Ａ１号、同第２０１３／００４５２０１ Ａ１号、同第２０１３／００４５２０２ Ａ１号、又は同第２０１４／００６５１３５ Ａ１号に記載の抗体であり、その開示は本明細書における参照により具体的に組み込まれる。アテゾリズマブの調製及び特性は、米国特許第８，２１７，１４９号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。アテゾリズマブのアミノ酸配列を表２０に示す。アテゾリズマブは、２２－９６、１４５－２０１、２６２－３２２、３６８－４２６、２２’’－９６’’、１４５’’－２０１’’、２６２’’－３２２’’、及び３６８’’－４２６’’の重鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２３’－８８’、１３４’－１９４’、２３’’’－８８’’’、及び１３４’’’－１９４’’’の軽鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３－Ｃ１０４）；２２１－２１４’及び２２１’’－２１４’’’の重－軽鎖内ジスルフィド結合（ｈ５－ＣＬ１２６）；２２７－２２７’’及び２３０－２３０’’の重－重鎖内ジスルフィド結合（ｈ１１、ｈ１４）；及び２９８及び２９８’のＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ Ｎ８４．４＞Ａ）を有する。
[00740] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１６７で示される重鎖及び配列番号１６８で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６７及び配列番号１６８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６７及び配列番号１６８に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６７及び配列番号１６８に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６７及び配列番号１６８に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６７及び配列番号１６８に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６７及び配列番号１６８に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00741] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１６９に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１７０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６９及び配列番号１７０に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６９及び配列番号１７０に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６９及び配列番号１７０に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６９及び配列番号１７０に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１６９及び配列番号１７０に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00742] 一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ配列番号１７１、配列番号１７２、及び配列番号１７３に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１７４、配列番号１７５、及び配列番号１７６に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、前述の抗体のいずれかと同じＰＤ－Ｌ１上のエピトープとの結合について競合し、及び／又はそれに結合する。
[00743] 一実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーは、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアテゾリズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアテゾリズマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアテゾリズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はアテゾリズマブである。
Figure 0007658896000022
[00744] 本明細書では本発明の好ましい実施形態が示され説明されるが、そのような実施形態は例としてのみ提供されており、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。本発明の実施において、本発明の記載された実施形態に対する様々な代替が採用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲は、本明細書に含まれる好ましいバージョンの説明に限定されるべきではない。
[00745] 読者の注意は、本明細書と同時に提出され、本明細書と共に公衆の閲覧に供される全ての書類及び文書、及び参照により本明細書に組み込まれる全ての書面及び文書の内容に向けられる。本明細書に開示されている全ての特徴（添付の特許請求の範囲、要約、及び図面をいずれも含む）は、特に明記されていない限り、同じ、同等、又は同様の目的に役立つ代替的な特徴に置換され得る。したがって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、同等又は類似の特徴の一般的なシリーズの一例にすぎない。
実施例
[00746] 本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
プレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス用の培地調製
[00747] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌、及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用することができる。
ＣＭ１の調製
[00748] 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：（ＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、２００ｍＭＬ－グルタミン）。以下の表２１に従い、ろ過される容積に適切な０．２μｍフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。４℃で保管。
Figure 0007658896000023
[00749] 使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で予め加温し、６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した。
[00750] 追加的な補充－必要があれば表２２に準じる。
Figure 0007658896000024
ＣＭ２の調製
[00751] 冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出した、又は上記に従い新鮮ＣＭ１を調製する。AIM-V（登録商標）を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合することにより、必要な量のＣＭ２を調製した。使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を加えた。使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２含有ＣＭ２を作成した。ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。
ＣＭ３の調製
[00752] 使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ－２ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２」の表示を付す。過剰なＣＭ３がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日、及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。ＩＬ－２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
ＣＭ４の調製
[00753] ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。１ＬのＣＭ３につき１０ｍｌの２００ｍＭ GlutaMAX（商標）を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ－２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＬ／ｍＬ ＩＬ－２及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なＣＭ４がある場合、これを培地名「G1utaMAX」、及び有効期限（調製後７日）とボトルにラベル付けし、４℃で貯蔵した。ＩＬ－２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
実施例２：ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１サイトカインカクテルの使用。
[00754] この実施例では、追加のＴ細胞成長因子として機能するＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１サイトカインの使用を、腫瘍組織又は腫瘍断片の凍結保存を包含する実施例及び実施形態を含む、本明細書の実施例又は実施形態のいずれかのＴＩＬプロセスと組み合わせて説明する。
[00755] 本明細書のプロセスを使用して、実験の片腕で、ＩＬ－２の存在下で、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、もう一方で、培養の開始時にＩＬ－２の代わりにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせで、ＴＩＬを成長させた。プレＲＥＰの完了時に、培養物の拡大培養、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ－γ）及びＴＣＲ Ｖβレパートリーを評価した。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されている通り、ＩＬ－２１は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性Ｔ細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 11:37（2013）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/にて入手可能。
[00756] 結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理した条件のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で、ＩＬ－２のみの条件と比較して複数の組織でＴＩＬ拡大培養の増強（＞２０％）が観察されたことを示した。ＩＬ－２のみの培養物に比べて、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理した培養物から得られたＴＩＬには、偏ったＴＣＲ Ｖβレパートリーを含むＣＤ８＋集団が主に偏っていた。ＩＦＮ－γ及びＣＤ１０７Ａは、ＩＬ－２のみで処理したＴＩＬと比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理したＴＩＬで上昇した。
ＩＬ－２ストック溶液の調製
[00757] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン－２を、ｒｈＩＬ－２の使用を含むものを含む本願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
手順
[00758] ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。１ｍＬの１Ｎ（１ノーマル）酢酸を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。チューブを２～３回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用してろ過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した。
[00759] ＰＢＳ中で１％ＨＳＡを調製した。１５０ｍＬ滅菌フィルターユニット内の９６ｍＬ ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。溶液をろ過した。４℃で貯蔵。調製したｒｈＩＬ－２の各バイアルについて、書式に記入した。
[00760] ｒｈＩＬ－２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した。ｒｈＩＬ－２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：１）バイアル当たりのｒｈＩＬ－２の質量（ｍｇ）、２）ｒｈＩＬ－２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）及び３）推奨０．２％ＨＡｃ再構成容量（ｍＬ）
[00761] ｒｈＩＬ－２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した：
Figure 0007658896000025
[00762] 例えば、CellGenixのｒｈＩＬ－２ロット１０２００１２１ ＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ｌＵ／ｍｇである。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ－２を再構成することが推奨されている。
Figure 0007658896000026
[00763] ＩＬ－２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
[00764] ｒｈＩＬ－２溶液の貯蔵。短期貯蔵（＜７２時間）の場合、バイアルを４℃で貯蔵した。長期貯蔵（＞７２時間）については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで－２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後に期限切れとした。ｒｈ－ＩＬ－２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
実施例４．ＴＩＬ凍結保存プロセス
[00765] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454（Thermo Scientific）を使用して、実施例５で説明した短縮閉鎖手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。
[00766] 使用した機器は、アルミニウム製カセットホルダーラック（ＣＳ７５０冷凍バッグと互換性あり）、７５０ｍＬバッグ用の低温保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグ用のリボンタイプ）、及びCryoStore ＣＳ７５０凍結バッグ（OriGen Scientific）である。
[00767] 凍結プロセスは、核形成から－２０℃まで０．５℃の速度及び最終温度－８０℃まで１分間に１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメータ、ステップ１ー４℃で待機；ステップ２：１．０℃／分（サンプル温度）から－４℃；ステップ３：２０．０℃／分（チャンバ温度）から－４５℃；ステップ４：１０．０℃ ／分（チャンバ温度）から－１０．０℃；ステップ５：０．５℃／分（チャンバ温度）から－２０℃；及びステップ６：１．０℃／分（サンプル温度）－８０℃まで、である。
実施例５．クローズドシステムを使用した凍結保存ＴＩＬ細胞療法の生産。
[00768] この例は、現在の優良組織基準（Good Tissue Practices）及び現行の優良製造基準（Good Manufacturing Practices）に従った、G-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corp., New Brighton, MN, USA）などのガス透過性容器でのＴＩＬ細胞療法プロセスのｃＧＭＰ製造の手順を説明する。この資料は、米国ＦＤＡ医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準（２１ ＣＦＲ Ｐａｒｔ ２１０、２１１、１２７０、及び１２７１）、並びにフェーズＩから商用資料まで適用されるＩＣＨ Ｑ７基準に基づいて製造される。この方法は、本明細書に記載の腫瘍凍結保存及び解凍プロセスと組み合わせてもよい。
[00769] プロセスの概要を以下の表２３に示す。
Figure 0007658896000027
[00770] 指定がない限り、この実施例全般的に１．０ｍＬ／Ｌ＝１．０ｇ／ｋｇを前提としている。開封後、２℃～８℃で次の期限が適用される：ヒト血清、タイプＡＢ（ＨＩ）ジェミニ、１か月；２－メルカプトエタノール、１か月。硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ原料は、室温で１か月間保管し得る。１０ＬのAIM-V培地を含む袋は、使用前に最大２４時間、１度だけ室温で温め得る。２２日目の回収中に、G-Rex500MCSフラスコからＴＩＬを回収するために２つのGatherexTMポンプを使用し得る。
０日目－ＣＭ１培地の調製
[00771] ＲＰＭＩ１６４０培地を調製する。ＢＳＣにて、適切なサイズのピペットを使用して、１０００ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地から１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れる。
[00772] ＢＳＣにて、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに試薬を追加する。表に２１示すように、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに次の試薬を追加する。追加した容積を記録する。ボトル毎の追加量：熱不活性化ヒトＡＢ血清（１００．０ｍＬ）；GlutaMax（１０．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）；２－メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）。
[00773] 試薬が完全に混合されるように、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルにキャップを付け、ボトルを回転させる。１Ｌ ０．２２－ミクロンフィルターユニットを通してＲＰＭＩ１６４０培地をろ過する。ろ過された培地をラベル付けする。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、ラベル付けする。
[00774] 全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬ ＩＬ－２アリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍する。ＩＬ－２原料溶液を培地に移す。ＢＳＣにて、１．０ｍＬのＩＬ－２原料溶液を、上記で調製したＣＭ１ ０日目培地ボトルに移す。ＣＭ１ ０日目培地１ボトル及びＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）１．０ｍＬを追加する。ＩＬ－２を含む培地を混合するために、ボトルに蓋をして回転する。「完了ＣＭ１ ０日目培地（Complete CM1 Day 0 Media）」というラベルが付けられた。
[00775] 適切なサイズのピペットを使用して２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。ＢＳＣにて、「完了ＣＭ１ ０日目培地」と表示された２５．０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに移す。チューブに「組織片」とラベル付けする。G-Rex100MCS（Ｗ３０１３１３０）を無菌的にＢＳＣに入れる。ＢＳＣにて、ベントフィルタークランプを開いたままにしG-Rex100MCSの全てのクランプを閉じた。ルアー接続を介して、G-Rex100MCSフラスコの赤い線をリピーターポンプ流体移送セット（Ｗ３００９４９７）の長径端に接続する。ＢＳＣに隣接しているＢａｘａポンプを実行する。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付ける。ＢＳＣ内で、ポンプ式溶液分注システム（ＰＬＤＳ）（Ｗ３０１２７２０）からシリンジを取り外し、廃棄する。
[00776] ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「完了ＣＭ１ ０日目培地」にピペットチップを取り付ける。培地とG-Rex100MCSの間の全てのクランプを開ける。完了ＣＭ１培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込む。ポンプ速度を「高」及び「９」に設定し、全ての完了ＣＭ１ ０日目培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込む。全ての培地が送り込まれた時点で、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。
[00777] フラスコからポンプを取り外す。ベントフィルターを除き、フラスコの全てのクランプが閉じていることを確認する。赤い培地ラインからリピーターポンプ流体移送セットを取り外し、赤い培地ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付ける。ＢＳＣからG-Rex100MCSフラスコを取り除きターミナルルアー近くの赤いラインから赤いキャップをヒートシールする。インキュベーターパラメータ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
[00778] ３０分以上の加温のために、インキュベーターに５０ｍＬコニカルチューブを設置する。
０日目－腫瘍洗浄培地の調製
[00779] ゲンタマイシンをＨＢＳＳに追加する。ＢＳＣにて、５．０ｍＬのゲンタマイシン（Ｗ３００９８３２又はＷ３０１２７３５）を１×５００ｍＬ ＨＢＳＳ培地（Ｗ３０１３１２８）ボトルに追加する。容積を記録する。ボトル毎の追加量：ＨＢＳＳ（５００．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ（５．０ｍＬ）。試薬を完全に混合する。ゲンタマイシンを含むＨＢＳＳを１Ｌ ０．２２ミクロン（０．２２μｍ）フィルターユニット（Ｗ１２１８８１０）でろ過する。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
０日目－腫瘍処置
[00780] 腫瘍標本（凍結保存腫瘍から）を入手し、腫瘍情報を処理及び記録するために直ちに２℃～８℃の部屋に移す。
[00781] 腫瘍標本を２℃～８℃で３回洗浄し、各洗浄につき少なくとも３分間穏やかに撹拌する。洗浄液は、各洗浄後に除去され、新しい溶液と交換される。
[00782] 移送ピペットを使用して、コニカルから腫瘍洗浄培地を４滴ずつ、６ウェルプレートの裏返した蓋のそれぞれの６つの円に入れる（２つの蓋）。２つの円に追加で滴下し、合計で５０滴入れる。
[00783] 腫瘍洗浄３：鉗子を使用し、「洗浄２」皿から腫瘍を取り出し、「洗浄３」皿に移す。鉗子を使用し、静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後３分以上静置する。時間を記録する。
[00784] １５０ｍｍ皿の蓋の下に定規を置く。鉗子を使用して、無菌的に腫瘍標本を１５０ｍｍ解剖皿の蓋に移す。腫瘍標本の全ての断片を端から端まで配置し、おおよその全長と断片の数を記録した。壊死／脂肪組織の腫瘍を評価する。腫瘍領域全体の３０％超が壊死及び／又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価する。はいの場合、腫瘍が適切な大きさであることを確認し、その場合、続行する。腫瘍領域全体の３０％未満が壊死組織又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価する。はいの場合、続行する。
[00785] 切離の処理。腫瘍が大きく、組織外部の３０％超が壊死／脂肪質であることが観察された場合、メス及び／又は鉗子の組み合わせを用いて、腫瘍の内部構造を維持しつつ、壊死／脂肪組織を取り除くことにより「切離の処理」が行われた。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
[00786] メス及び／又は鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍標本を均一で適切なサイズの断片（最大６個の中間断片）に切断する。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。再びメスによる鋸引き運動での切断はしない。解剖されていない中間断片を「腫瘍洗浄培地」に完全に浸したままにする。各中間断片を「保持」皿に移す。
[00787] 一度に１つの中間断片を操作し、解剖皿の腫瘍中間断片をおよそ３×３×３ｍｍのサイズの断片に切離し、各断片の出血、壊死、及び／又は脂肪組織の量を最小限にした。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。再びメスによる鋸引き運動での切断はしない。
[00788] 出血、壊死、及び／又は脂肪組織のない最大８個の腫瘍片を選択する。参考として、定規を使用した。８個の良好な断片を得られるまで、又は中間断片全体が切離されるまで解剖を続ける。選択した各断片を「腫瘍洗浄培地」の１滴に移した。
[00789] 中間断片から最大８個を選択した後、中間断片の残りを「良好な中間断片」の６ウェルプレートの新しいシングルウェルに入れる。
[00790] 望ましい組織が残っている場合、最大５０断片を滴下で充填するために、「良好な中間断片」の６ウェルプレートから追加の好ましい腫瘍片を選択した。作成された切離断片の総数を記録した。
[00791] インキュベーターから「組織片」５０ｍＬコニカルチューブを取り出す。コニカルチューブを３０分以上温めること。「組織片」５０ｍＬコニカルをＢＳＣに入れ、オープン処理表面の無菌性を損なわないようにする。
[00792] 移送ピペット、メス、鉗子、又は組み合わせを使用して、良好な皿の蓋から選択された５０個の最良の腫瘍断片を「組織片」５０ｍＬコニカルチューブに移す。移動中に腫瘍片を落とし、望ましい組織が残っている場合、好ましい腫瘍中間断片ウェルから追加の断片が加えられた。断片数を記録した。
[00793] インキュベーターから培地を含むG-Rex100MCSを取り出す。G-Rex100MCSフラスコを無菌的にＢＳＣに入れた。フラスコを移す時、蓋又は容器の底から手に持たない。両サイドから手に持ち容器を移動する。ＢＳＣでは、G-Rex100MCSフラスコキャップを持ち上げて、チューブ内部の無菌性が維持されるようにした。懸濁するために腫瘍片の入ったコニカルチューブを攪拌し、内容物を素早くG-Rex100MCSフラスコに注ぐ。腫瘍片がフラスコの膜全体に均一に分布するように確認する。必要に応じてフラスコを前後に静かに傾けて、腫瘍片を均等に分散させた。容器の底膜の腫瘍断片の数及び容器内に確認できる浮遊物の数を記録する。注記：播種された断片の数が収集された数と同等でない場合は、エリア管理に連絡し、セクション１０．０の文書を作成する。
[00794] 以下のパラメータでG-Rex100MCSをインキュベートする：G-Rexフラスコをインキュベートする：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２ パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ２。インキュベーション１１日目にG-Rex100MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行する。計算：インキュベーション時間；下限＝インキュベーション時間＋２５２時間；上限＝インキュベーション時間＋２７６時間。
１１日目－培地の調製
[00795] インキュベーターをモニターする。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ:５．０±１．５％ ＣＯ２。インキュベーターで３０分以上温める１０００ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｗ３０１３１１２）ボトル３本及び１０００ｍＬ AIM-V（Ｗ３００９５０１）ボトル３本。時間を記録した。培地：ＲＰＭＩ１６４０及びAIM-V。後で使用するために、AIM-V培地（Ｗ３００９５０１）の追加の１×１０００ｍＬボトルを室温で配置した。
[00796] 時間に達した時にＲＰＭＩ１６４０培地を取り出す。前のステップでインキュベーション終了時間を記録した。培地が３０分以上温められていることを確認する。ＢＳＣで、３本のあらかじめ温めておいた１０００ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルのそれぞれから１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」というラベルが付いた適切なサイズの容器に入れる。ＢＳＣで、３本のＲＰＭＩ１６４０培地ボトルそれぞれに以下の試薬を加え、各ボトルに加えた容積を記録した。GemCellヒト血清熱不活性化タイプAB（１００．０ｍＬ）、GlutaMax（１０．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン５０μｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）、２－メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）。
[00797] 試薬が完全に混合されるように、ボトルに蓋をし、回転させる。培地の各ボトルを個別の１Ｌ ０．２２ミクロンフィルターユニットでろ過した。ろ過した培地を、無菌的に蓋をし、各ボトルにＣＭ１ １１日目培地ラベル付けする。全ての氷が溶けるまでＩＬ－２の３×１．１ｍＬアリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍し、ＩＬ２ロット番号と有効期限日／時間を記録した。
[00798] インキュベーターから３本のAIM-V培地を取り出す。インキュベーション終了時間を記録する。３０分以上培地を温めたか確認する。マイクロピペットを使用して、解凍したＩＬ－２ ３．０ｍＬを事前に温めたAIM-V培地の１Ｌボトル１本に加える。ＩＬ－２を分注した後、マイクロピペットチップを培地で洗浄する。各アリコートに新しい滅菌マイクロピペットチップを使用する。追加された総量を記録する。「ＩＬ－２を含むAIM-V」とボトルにラベルを付ける。１０ＬのLabtainerバッグとリピーターポンプ移送セットをＢＳＣに無菌的に移す。１０ＬのLabtainerバッグの全てのラインを閉じた。ルアーロック接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径のチューブの端を１０ＬのLabtainerバッグの中央メスポートに取り付ける。
[00799] ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行する。移送セットチュービングをBaxaポンプに通す。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。Pumpmatic Liquid-Dispensing System（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにする。
[00800] ルアー接続を介してＰＬＤＳピペットをリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のためＩＬ－２ボトルを含むAIM-V培地にピペットの先端を入れる。培地ボトルと１０ＬのLabtainer間の全てのクランプを開いた。
[00801] ＰＬＤＳを使用して、調製したＩＬ－２を含むあらかじめ温めておいたAIM-V培地を２本の追加のAIM-Vボトルと同様に１０ＬのLabtainerバッグに移す。ろ過されたＣＭ１ １１日目培地の３本のボトルを追加する。最終ボトルの追加後、バッグのラインをクリアにする。培地の各ボトルの追加の間にポンプを停止する。移送セットからＰＬＤＳを取り出し、ＢＳＣのラインのルアーに赤いキャップを取り付ける。バッグを優しく揉み混合した次に記載する情報で培地バックにラベル付けする。有効期限は調製日から２４時間である。
[00802] 「完了ＣＭ２ １１日目培地（Complete CM2 Day 11 Media）」バッグの利用可能なメスポートに６０ｍＬシリンジを取り付ける。２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。「完了ＣＭ２ １１日目培地」バッグのメスポートに赤いキャップを取り付ける。テスト用に提出するまで、培地参考サンプルを２℃～８℃でラベル付けし保存した。移送セットラインの赤いキャップを、赤いキャップの近くでヒートシールした移送セットをバッグに接続したままにする。
[00803] ＢＳＣで、「細胞数希釈用」とロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加する。ロット番号とチューブ番号（１～４）をチューブにラベル付けする。４つのクライオバイアル「フィーダー」とバイアル番号（１～４）とラベル付けした。残りの２－メルカプトエタノール、GlutaMax、及びヒト血清をＢＳＣから２℃～８℃に移す。
[00804] ＢＳＣの外側で、調製した「ＣＭ２ １１日目培地」バッグに取り付けられた移送セットに１Ｌ移送パックを溶接した。「フィーダー細胞ＣＭ２」及びロット番号を移送パックにラベル付けした。バッグから数インチ離れた場所に１Ｌの移送パックチューブのチューブに、マークを付ける。チューブがマークの位置までスケール上にあるように、空の移送パックをスケールの上に置く。スケールを風袋引きし、スケールに空の移送パックを置く。
[00805] Baxaポンプを「中」及び「４」に設定する。「完了ＣＭ２ １１日目」培地５００．０±５．０ｍＬを細胞ＣＭ２培地移送パックに注入する。重量で測定し、移送パックに追加された完了ＣＭ２培地の容積を記録する。
[00806] 充填したら、ラインをヒートシールする。フィーダーセル培地移送パックから移送セット付きのＣＭ２ １１日目の培地バッグを離し、１Ｌ移送パックに溶接したままにした。調製した「完了ＣＭ２ １１日目培地」を使用するまでインキュベーターに入れる。
１１日目－ＴＩＬ回収
[00807] インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ２。G-Rex100MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータが満たされていることを確認するためのチェックを実行した。下限は上記と同じである。
[00808] インキュベーターからの取り出し時間を記録する。インキュベーターからG-Rex100MCSを慎重に取り外し、大きなフィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。処理開始時間が記録される。
[00809] ３００ｍＬ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付ける。重力血液フィルターのＴＩＬ懸濁液移送（単線）を滅菌溶接する。３００ｍＬ移送パックをはかりに置き、乾燥重量を記録した。１Ｌ移送パックに「上清（Supernatant）」とラベル付けした。
[00810] G-Rex100MCSからの赤い培地除去ラインを「上清」移送パックに滅菌溶接する。「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに接続された血液フィルターの上部の２つのスパイクラインのうちの１つにG-Rex100MCSからの透明細胞除去ラインを滅菌溶接する。G-Rex100MCSをGatheRexの左側に配置し、「上清」及び「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを右側に配置する。
[00811] G Rex100MCSから赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付ける。G-Rex100MCSからのクリアハーベストラインをGatheRexのクランプ底部（青い線でマーク）及びチューブガイドに取り付ける。GatheRexからG-Rex100MCSフラスコの滅菌フィルターにガスラインを取り付ける。G-Rex100MCSフラスコから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認する。G-Rex100MCSから１Ｌ移送パックに約９００ｍＬの培地上清を移す。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex100MCSフラスコを目視で検査する。
[00812] 上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じる。
[00813] フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させるために培地を攪拌する。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施する。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍片を縁に沿って沈降させる。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾ける。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くだけで十分である。
[00814] ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放する。GatheRexを使用して、血液フィルターから細胞懸濁液を３００ｍＬ移送パックに移す。全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続ける。付着した細胞について膜を検査する。G-Rex100MCSの底をすすぐ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆う。全てのクランプが閉じていることを確認する。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ懸濁液移送パックをヒートシールする。「上清」トランスファパックをヒートシールした。溶接のための十分なラインを維持する。ＴＩＬ懸濁液移送パックの質量記録し、細胞懸濁液の容積を計算する。
[00815] ４インチプラズマ移送セットを「上清」移送パックに溶接し、４インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移す。４インチプラズマ移送セットを３００ｍＬ「ＴＩＬ懸濁」移送パックに溶接し、４インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移す。
[00816] １Ｌの「上清」移送パックから約２０．０ｍＬの上清を吸い上げ、「Bac-T」とラベル付けした滅菌５０ｍＬコニカルチューブに分注する。適切なサイズのシリンジを使用して、BacTとラベル付けされた５０ｍＬのコニカルから１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種する。
[00817] バイアル番号（１～４）と４つのクライオバイアルにラベル付けする。別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用してＴＩＬ懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞カウントサンプルを引き出し、それぞれのクライオバイアルに入れる。ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。必要になるまで、ＴＩＬ移送パックをインキュベーターに入れる。細胞計数及び計算を実行した。希釈していない初期細胞計数を実行した。希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。
[00818] 細胞計数とＴＩＬ数を記録した。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６未満の場合、「１１日目のG-Rexの充填及び播種（Fill and Seed）」に進めた。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６を超える場合は、「フローサイトメトリーで計算」に進む。
[00819] 総生存ＴＩＬセル数が４．０×１０７以上の場合、フローサイトメトリーのサンプル用に１．０×１０７個の細胞を得るために容積を計算した。フローサイトメトリーに必要な総生細胞：１．０×１０７細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の容積：生細胞濃度を１．０×１０７細胞で割った値。
[00820] 該当する場合：総生細胞及び容積のフローを再計算する。以下のサイトメトリーのサンプルを除去した後の残りの総生細胞と残りの容積を計算する。
[00821] 該当する場合：凍結保存のための体積の計算。凍結保存用に１×１０７個の細胞を得るために必要な細胞の体積を計算した。
Figure 0007658896000028
[00822] 該当する場合：凍結保存用のサンプルを取り除く。ＴＩＬ懸濁液移送パックから計算された容積を取り出す。適切なサイズのコニカルチューブに入れ、「凍結保存サンプル１×１０７細胞」、日付及びロット番号をラベル付けした。ＴＩＬ懸濁液移送パックに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付ける。
[00823] 次のパラメータに従って「凍結保存サンプル１×１０７細胞」を遠心分離する。速度：３５０×ｇ、時間：１０：００分、温度：外気温度、ブレーキ：フル（９）；加速：フル（９）。
[00824] ＣＳ－１０を追加する。ＢＳＣにて、無菌的に上清を吸引した。チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。ＣＳ－１０を追加した。０．５ｍＬのＣＳ１０をゆっくりと添加した。追加された容積を記録する。凍結保存サンプルバイアルは、約０．５ｍＬで満たされた。
１１日目－フィーダー細胞
[00825] ＬＮ２フリーザーから少なくとも２つの異なるロット番号を持つフィーダー細胞のバッグを３つ入手する。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置く。フィーダー細胞情報を記録する。少なくとも２つの異なるロット番号のフィーダー細胞が得られたことを確認する。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃の水浴若しくはサイトサーモを約３～５分又は氷が消えるまで解凍した。
[00826] フィーダー細胞ハーネスの準備。４Ｓ－４Ｍ６０をＣＣ２セルコネクト（Ｗ３０１２８２０）に溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを４Ｓ－４Ｍ６０マニホールドの４スパイク端に置き換えた。必要に応じて溶接する。
[00827] 「フィーダー細胞ＣＭ２ 培地（Feeder Cell CM2 Media）」移送パックに溶接された培地移送パックをＣＣ２ルアーに接続する。バッグは、ニードレスインジェクションポートでハーネスの側面に取り付けられた。完了ＣＭ２ １１日目培地を含む部品をＢＳＣに移した。
[00828] 解凍したフィーダー細胞を貯めるＢＳＣ内で、１００ｍＬシリンジに１０ｍＬの空気を引き込む。これを使用して、ＣＣ２の６０ｍＬシリンジを交換した。カバーを取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭く。ＣＣ２の３つのスパイクを使用して、３つのフィーダーバッグをスパイクする。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにする。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードレスインジェクションポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに入れた。３つのバッグは全て一度に排水された。シリンジの圧力を維持しながら、フィーダー細胞バッグから排水した時点で、フィーダー細胞バッグのラインを遮断する。下のシリンジ、シリンジからハーネスを取り外してはならない。シリンジ内のフィーダー細胞の総量を記録する。
[00829] 移送パックにフィーダー細胞を追加する。活栓を回し、フィーダー細胞バッグのラインを閉じ、培地移送パックのラインを開ける。培地移送パックへのラインがクランプ解除されていることを確認する。フィーダー細胞をシリンジから「フィーダー細胞ＣＭ２培地」移送パックに分注する。フィーダー細胞を含む移送パックのラインのクランプを開放し、シリンジはハーネスに取り付けたままにした。移送パックの貯められたフィーダー細胞を混合するためにバッグをマッサージする。「フィーダー細胞懸濁液」とバッグにラベル付けした。
[00830] フィーダー細胞懸濁液の総量を計算した。細胞計数サンプルを取り除く。各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用し、ニードレスインジェクションポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞数サンプルを引き出した。各サンプルをラベル付きクライオバイアルに分注する。
[00831] ＮＣ－２００及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞数及び計算を実行する。０．５ｍＬの細胞懸濁液を、ロット番号及び「細胞数希釈用（For Cell Count Dilutions）」でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地に加えることにより、細胞数サンプルを希釈する。これにより１：１０希釈となる。
[00832] 細胞数及びサンプル量を記録する。総生細胞が５×１０９未満の場合は、続行する。総生細胞が５×１０９以上の場合、細胞数を増やすために上記のように進める。必要に応じて追加のフィーダー細胞を得て、先に述べたように移送パックに追加した。生存可能な５×１０９のフィーダー細胞を得るために必要なフィーダー細胞懸濁液の容積を計算する。除去する過剰分のフィーダー細胞の容積を計算する。最も近い整数に切り捨て。
[00833] 余分なフィーダー細胞を除去する。新しい１００ｍＬシリンジで、１０ｍＬの空気を吸い上げ、シリンジをハーネスに取り付けた。「フィーダー細胞懸濁液（Feeder Cell Suspension）」移送パックへのラインを開く。シリンジを使用して、計算されたフィーダー細胞の容積と移送パックからの追加の１０．０ｍＬを１００ｍＬシリンジに入れた。フィーダー細胞の容積を取り除いたら、フィーダー細胞懸濁液移送パックのラインを閉じる。最終シリンジは取り外してはならない。シリンジが満たされたら、新しいシリンジと交換する。複数のシリンジを使用して、総量を取り除いた。新しいシリンジ毎に、１０ｍＬの空気を引き込む。除去されたフィーダー細胞の総量（追加の１０ｍＬを含む）を記録する。
[00834] ＯＫＴ３を加えたＢＳＣで、１．０ｍＬシリンジと１６ゲージ（１６Ｇ又は１６Ｇａ）針を使用して、０．１５ｍＬのＯＫＴ３を吸い上げた。シリンジから針を無菌的に取り外し、シリンジをニードルレスインジェクションポートに取り付ける。ＯＫＴ３を注入した「フィーダー細胞懸濁液（Feeder Cell Suspension）」移送パックの活栓を開き、事前に取り出したフィーダー細胞１０ｍＬを追加して、ラインを通してＯＫＴ３を洗い流した。シリンジを逆さまにして、空気を押し通してフィーダー細胞懸濁液移送パックへのラインをクリアにした。残りのフィーダー細胞懸濁液をシリンジに残す。全てのクランプを閉じ、ハーネスをＢＳＣから取り外した。溶接に十分なチューブを残し、フィーダー細胞懸濁液移送パックをヒートシールする。
１１日目－G-Rexの充填及び播種
[00835] G-Rex500MCSのセットアップ。梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂やチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖がしっかりしていることを確認する。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じた。マーカーを使用して、４．５Ｌグラデーションで線を引いた。インキュベーターから「完了ＣＭ２ １１日目培地」を取り出した。
[00836] 培地を汲み上げる準備。G-Rex500MCSの赤い線を、完了ＣＭ２ １１日目培地に接続されたリピーターポンプ移送セットに溶接する。「完了ＣＭ２ １１日目培地」バッグをIVポールに掛ける。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。G-Rex500MCSに培地を注入する。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。G-Rex500MCSに４．５Ｌの培地を注入し、４．５Ｌグラデーションでフラスコに印を付けた線まで満たした。溶接部の近くでG-Rex500MCSの赤い線をヒートシールする。フラスコに「１１日目」とラベル付けをする。フィーダー細胞の溶接：懸濁液移送パックをフラスコへ。G-Rex500MCSの赤い線を「フィーダー細胞懸濁液（Feeder Cell Suspension）」移送パックに滅菌溶接する。
[00837] フィーダー細胞をG-Rex500MCSに加える。フィーダー細胞懸濁液とG-Rex500MCSの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにフィーダー細胞懸濁液を追加した。溶接部近くの赤い線をヒートシールする。ＴＩＬ懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。G-Rex500MCSの赤い線を「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
[00838] ＴＩＬをG-Rex500MCSに追加する。ＴＩＬ懸濁液とG-Rex500MCSの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにＴＩＬ懸濁液を追加した。ＴＩＬ懸濁液バッグを取り外すために、溶接部近くの赤い線をヒートシールする。
[00839] G-Rex500MCSをインキュベートする。大きなフィルターラインを除き、G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認し、インキュベーターに置いた。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％ ＣＯ２。
[00840] インキュベーションウィンドウを計算する。インキュベーション１６日目にG-Rex500MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行する。下限：インキュベーション時間＋１０８時間。上限：インキュベーション時間＋１３２時間。
１１日目－過剰ＴＩＬ凍結保存
[00841] 過剰なＴＩＬバイアルを冷凍する。制御速度冷凍庫（Control Rate Freezer（ＣＲＦ））に入れられたバイアルの総数を記録及び検証する。冷却が完了したら、バイアルをＣＲＦから適切な保管容器に移す。
１６日目－培地の調製
[00842] AIM-V培地を事前に温める。使用の少なくとも１２時間前までに２℃～８℃から３つのＣＴＳ AIM V １０Ｌ培地バッグを取り外し、遮光して室温に置いた。各バッグにラベルを付ける。温め開始時刻と日付の記録。全てのバッグが１２～２４時間温められていることを確認する。
[00843] ルアー接続を使用して、１０ＬのLabtainerバッグのメスポートの１つに、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を接続する。「上清」として上清のラベルを１０ＬのLabtainerに準備した。上清用に１０ＬのLabtainerを準備した。ＢＳＣから取り外す前に、全てのクランプが閉じられていることを確認すること。
[00844] 全ての氷が溶けるまで、ＣＴＳ AIM V培地の１袋当たりＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）の５×１．１ｍＬアリコートを解凍する。Glutamax１００．０ｍＬを適切なサイズのレシーバーに分注する。各Glutamaxレシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax」とラベル付けした。
[00845] ＩＬ－２をGlutaMaxに追加する。マイクロピペットを使用して、各GlutaMaxレシーバーに５．０ｍＬのＩＬ－２を追加する。プロセス毎にチップをすすぎ、追加した各ｍＬに新しいピペットチップを使用する。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax＋ＩＬ－２」とレシーバー番号をラベル付けした。
[00846] 製剤用にＣＴＳ AIM V培地バッグを準備する。ＣＴＳ AIM V １０Ｌ培地バッグ（Ｗ３０１２７１７）が室温で温められ、使用前に１２～２４時間遮光されていることを確認する。インキュベーション終了時間を記録する。ＢＳＣで、４インチプラズマ移送セットのクランプを閉じ、スパイクポートを使用しバッグと接続した。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにすること。ルアーを通じて、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を４インチプラズマ移送セットに接続する。
[00847] ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。
[00848] 製剤用培地を準備する。ＢＳＣ内で、ポンプ式溶液分注システム（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにすること。ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「GlutaMax＋ＩＬ－２」にピペットチップを取付けた。レシーバー及び１０Ｌバッグの間の全てのクランプを開く。
[00849] GlutaMax＋ＩＬ－２をバッグに注入する。ポンプ速度を「中」と「３」に設定し、全ての「GlutaMax＋ＩＬ－２」を１０Ｌ ＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ培地バッグに送った。溶液が残っていない場合、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。以下の各Aim Vバッグに追加されたＩＬ－２を含むGlutaMaxの容積を記録する。
[00850] ＰＬＤＳを取り外す。全てのクランプが閉じていることを確認し、リピーターポンプ流体移送セットからＰＬＤＳピペットを取り外した。リピーターポンプ流体移送セットを取り外し、４インチのプラズマ移送セットに赤いキャップを付けた。
[00851] 調製済み「完全ＣＭ４ １６日目培地（Complete CM4 Day 16 media）」と各バッグにラベル付けする。
[00852] サンプルプラン毎の培地参考品を除去する。３０ｍＬシリンジを使用して、シリンジを４インチプラズマ移送セットに取り付けて２０．０ｍＬの「完全ＣＭ４ １６日目培地」取り出し、５０ｍＬコニカルチューブにサンプルを分注した。シリンジを取り外した後、４インチプラズマ移送セットが固定されているか又は赤いキャップが付いているか確認する。
[00853] 新しいリピーターポンプ流体移送セットを取り付ける。「完全ＣＭ４ １６日目培地」バッグに接続された４インチプラズマ移送セットに新しいリ流体ポンプ移送セットの長径端を取り付ける。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、テスト用に提出するまで、培地参考品サンプルを２～８℃で保存した。
[00854] インキュベーターをモニターした。該当する場合、準備された追加のバッグを監視する。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％ ＣＯ２。
[00855] 完全ＣＭ４ １６日目培地を温めた。インキュベーター内の完全ＣＭ４ １６日目培地の最初のバッグを、使用準備が整うまで３０分以上温める。該当する場合、追加のバッグを温める。
[00856] 希釈の準備をした。ＢＳＣで、「細胞数希釈用」とラベル付けされたAIM-V培地の４．５ｍＬを各４つ、１５ｍＬコニカルチューブに加えた。コニカルチューブにラベルを付ける。４つのクライオバイアルにラベルを付けた。
１６日目－ＲＥＰ流出
[00857] インキュベーターをモニターする。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０ ℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ２。
[00858] インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出す。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータ上限、下限、除去時間が満たされていることを確認するためのチェックを実行する。インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出す。
[00859] 約１２インチのラインを残し、１Ｌの移送パック（Ｗ３００６６４５）をヒートシールする。１Ｌ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付ける。ライン全体を含む１Ｌの移送パックをはかりの上に置き、乾燥重量を記録した。
[00860] GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤色の培地除去ラインを、上記で調製した１０ＬのLabtainerバッグ「上清」のリピーターポンプ移送セットに滅菌溶接する。G-Rex500MCSからクリア細胞除去ラインを、上記で準備したＴＩＬ懸濁液移送パックに滅菌溶接する。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置する。上清Labtainerバッグを置き、その右側にＴＩＬ懸濁液移送パックを配置する。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付ける。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付ける。GatheRexからガスラインをG-Rex500MCSの滅菌フィルターに取り付ける。G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認する。
[00861] G-Rex500MCSの容積削減。ＳＯＰ－０１７７７に従って、G-Rex500MCSから１０ＬのLabtainerに約４．５Ｌの培養上清を移す。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSフラスコを目視で検査した。
[00862] ＴＩＬ回収用にフラスコを準備する。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じる。
[00863] ＴＩＬ回収の開始。ＴＩＬ回収開始時間を記録する。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施する。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くだけで十分である。
[00864] ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放する。GatheRexを使用して、細胞懸濁液をＴＩＬ懸濁液移送パックに移す。全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けることを確認する。付着した細胞について膜を検査する。
[00865] フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆う。G-Rex500MCSのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[00866] チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ懸濁液移送パックをヒートシールする。上清を含む１０ＬのLabtainerをヒートシールし、サンプル収集のためにＢＳＣに通した。
[00867] 細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。サンプル除去用の移送パックを準備する。４インチプラズマ移送セットを上からＴＩＬ懸濁液移送パックに溶接し、できるだけバッグの近くにメスルアーの端に取り付けたままにした。
[00868] 細胞上清からテストサンプルを取り除く。ＢＳＣで、メスのルアーポートと適切なサイズのシリンジを使用して、１０ＬのLabtainerから１０．０ｍＬの上清を取り除く。１５ｍＬのコニカルチューブに入れて「BacT」とラベルを付け、BacTサンプル用にチューブを保持した。別のシリンジを使用して、１０．０ｍＬの上清を取り出し、１５ｍＬコニカルチューブに入れた。テスト用にマイコプラズマサンプル用のチューブを保持した。「マイコプラズマ希釈剤」としてチューブにラベル付けする。上清バッグを閉じた。ルアーポートに赤いキャップを付けてバッグを閉じ、ＢＳＣから外した。
[00869] 細胞カウントサンプルを取り出す。ＢＳＣで、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用し「ＴＩＬ懸濁液」移送パックから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。上記で準備したクライオバイアルにサンプルを入れる。
[00870] マイコプラズマサンプルを取り出す。３ｍＬシリンジを使用し、ＴＩＬ懸濁液移送パックから１．０ｍＬ取り出し、上記で調製した「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けした１５ｍＬコニカルに入れた。テスト用に提出するまで、マイコプラズマサンプルを２～８℃でラベル付けし保存した。
[00871] 播種用の移送パックを準備する。ＢＳＣで、リピーターポンプ流体移送セットの長径チューブ端を、ＴＩＬを含む移送パックのルアーアダプターに取り付ける。止血鉗子を使用して、移送パックの近くのラインを遮断する。移送セットの端に赤いキャップをする。
[00872] ＴＩＬをインキュベーターに入れる。ＢＳＣから細胞懸濁液を取り除き、必要になるまでインキュベーターに入れた。時間を記録する。
[00873] ＮＣ－２００使用して、細胞カウント及び計算を実行する。０．５ｍＬの細胞懸濁液を上記で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
[00874] 継代培養用のフラスコを計算する。播種に必要なフラスコの総数を計算する。G-Rex500MCSフラスコの数を四捨五入して、近い整数に表示した。
実施例６．凍結保存された腫瘍組織からのＴＩＬの小規模生産。
[00875] 凍結のための腫瘍組織の調製：腫瘍を無菌的に収集し、滅菌ピンセット及びメス及び／又ははさみを使用してトリミングして、無関係の非腫瘍又は壊死組織を除去した。直径１．５ｃｍの最小サイズの腫瘍はさらに６ｍｍサイズの断片に断片化された。腫瘍を凍結するために、直径６ｍｍの断片を最大１０個、１０ｍＬのCryoStor10（Biolife, USA）貯蔵培地を含有する単一の１５ｍＬクライオバイアル（Thermo, USA）に入れた。直径６ｍｍの断片が１０断片を超えた場合は、追加のクライオバイアルを使用した。クライオバイアルの蓋はしっかりとねじ込み、次いで、クライオバイアルを少なくとも３回から最大約５回まで繰り返し反転させることにより、腫瘍断片を貯蔵培地と穏やかに混合した。次に、クライオバイアルを冷蔵庫内で、２℃～８℃で１５～６０分間インキュベートした。インキュベーション後、クライオバイアルをクライオシッパースリーブに挿入した。
[00876] 腫瘍組織の凍結：クライオバイアルを含むクライオシッパースリーブを液体窒素乾燥クライオシッパーに入れ、それにより、ＬＮ２が充填され温度平衡化された乾燥ＬＮ２クライオシッパー内の気相液体窒素温度を使用してバイアルの内容物を瞬間冷凍した。短期間の貯蔵又は輸送のために、バイアルはクライオシッパーに残した。長期貯蔵のために、バイアルを移し、液体窒素冷凍庫内で、液体窒素温度で貯蔵した。
[00877] 貯蔵した腫瘍組織の解凍：凍結した腫瘍サンプルは、クライオバイアルを３７℃の水浴に５±１分間沈めることによって解凍した。鉗子を使用して、直径６ｍｍの断片を取り除き、ゲンタマイシン（Gibco, USA）を含む滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Gibco, USA）で３回洗浄した。ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬでＨＢＳＳに添加した。直径６ｍｍの各断片を、およそ８個の別個の直径１～３ｍｍの断片へ解剖した。典型的な腫瘍断片は、直径約１～３ｍｍ、厚さ約１～３ｍｍであった。
[00878] １／１００スケール手順を使用したＴＩＬ拡大培養：この手順は、フルスケールプロセス２ＡのＴＩＬ製造方法を１／１００スケールで再現する。研究の範囲は、G-Rex 10M及びG-Rex 5Mフラスコを使用した小型化された２Ａプロセスの説明を行うことである。プレＲＥＰ培養は、フルスケールプレＲＥＰプロセスの１：１０のG-Rex 10Mフラスコを使用して開始された。ＲＥＰは、フルスケールＲＥＰプロセスの１：１０に相当する、G-Rex 5M中のプレＲＥＰ産物の１０％を使用して開始された。これにより、残りの実験で１：１００スケールが維持された。
[00879] プレＲＥＰは腫瘍プロセシングで開始され、４つの断片が個々のG-Rex 10Mフラスコに入れられ、１１日目までＣＭ１＋ＩＬ－２とともに培養された。ＲＥＰは、１１日目にプレＲＥＰ ＴＩＬ（プレＲＥＰ産物の１０％）、ＰＢＭＣフィーダー、ＯＫＴ３、及びＩＬ－２をG-Rex 5Mに使用して開始された。１６日目は適切な量のＴＩＬを保持し、増倍係数を使用してフルスケールプロセスを推定する。図７に、この実験規模のＴＩＬ産生に採用された手順を概括する。
[00880] 表２５に、この実験規模のＴＩＬ産生に使用される機器を示す。
Figure 0007658896000029
[00881] 表２６に、この実験規模のＴＩＬ産生に使用されるソフトウェアを示す。
Figure 0007658896000030
[00882] 表２７に、この実験規模のＴＩＬ産生に使用される材料を示す。
Figure 0007658896000031
[00883] 表２８には、使用した追加の材料及び試薬が列挙される。
Figure 0007658896000032
[00884] 表２９に、様々なマーカーの発現を特徴づけるために細胞のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析に使用される試薬を示す。
Figure 0007658896000033
[00885] 表３０には、細胞培養培地に使用される試薬が列挙される。
Figure 0007658896000034
ミニスケールＴＩＬ拡大培養の手順（１／１００スケール２Ａプロセス）
０日目
[00886] 培地の調製、必要に応じて、ＩＬ－２を調製する。G-Rex 10Mフラスコ３つ毎に３５０ｍＬのＣＭ１を調製する。ＣＭ１に６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加する。腫瘍をプロセシングしながら３７℃の水浴で温める。
[00887] 腫瘍プロセス：１００ｍＬの培地及びＩＬ－２を各G-Rex 10Mフラスコに加え、各フラスコに４つの断片を無作為に加える。結果の不均一性を高めるために、必ず断片を無作為化すること。３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーターに１１日間置く。
１１日目
[00888] 培地の調製、必要に応じて、ＩＬ－２を調製する。G-Rex 5Mフラスコ３つ毎に３００ｍＬのＣＭ２を調製する。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をＣＭ２に添加し、３７℃の水浴で温める。
[00889] 第１の培養物からＴＩＬを調製する：細胞を乱さずに、各G-Rex 10Mフラスコをインキュベーターから慎重に取り出す。培地を吸引し、１０ｍＬピペットを使用して、穏やかに上下に混合し、細胞を膜から遊離させる。培養物をゆっくりと引き上げ、各フラスコからの体積を記録し、５０ｍＬコニカルバイアルに移す。
[00890] 細胞カウントのために２００μＬのアリコートを得、次いで、３つのバイアルに緩く蓋をして、フラスコに播種する準備ができるまで３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに入れる。ＴＩＬをカウントし、細胞カウントワークシートに記録する。
[00891] フィーダー細胞を調製する：適切な数のフィーダー（５０×１０６細胞／フラスコ）を入手し；フィーダー細胞を３７℃の水浴で２分間解凍し、次いで、ＣＭ２＋ＩＬ－２でフィーダー細胞を１：１０に希釈する。細胞カウントのために２００μＬのアリコートを取り出す。バイアルに緩く蓋をして、フラスコに播種する準備ができるまで３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに入れる。２０ｕＬのＰＢＭＣフィーダー細胞を１：１０に希釈し、ＰＢＭＣフィーダーをカウントする。細胞カウントワークシートに記録する。カウントに基づいて、フィーダーをＣＭ２＋ＩＬ－２中で１０×１０６細胞／ｍＬに希釈し、次いで、５ｍＬの溶液を各フラスコにつき５０ｍＬコニカルチューブに入れる。各フラスコにつき、１．５ｍＬの１：１０００希釈ストックＯＫＴ－３を５ｍＬのフィーダーに添加し、１５分間インキュベートする。
[00892] ＴＩＬ、ＰＢＭＣフィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及び培地を各フラスコに添加してフラスコに播種する。ＴＩＬの場合、プレＲＥＰ産物の約１０％を添加し、通常、フラスコあたり最大約２×１０６個の細胞を添加する。ＰＢＭＣフィーダーは、上記のように５ｍＬの調製物を添加し、合計５０×１０６個の細胞を含む。１．５ｍＬの１：１０００希釈ＯＫＴ－３ストックを添加し、次いで、ＣＭ２培地を上に乗せて最終容量を５０ｍＬにする。
１６日目
[00893] 分割用の培地調製：必要に応じて、ＩＬ－２を調製し；次いで、フラスコ３つ毎に１５０ｍＬのＣＭ４を準備する。次に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を培地に添加する。必要になるまで３７℃の水浴に入れる。
[00894] 分割：細胞を乱さないようにインキュベーターからG-Rex 5Mフラスコを注意深く取り出し、細胞を吸引しないように注意して約４０ｍＬの培地を吸引する。１０ｍＬピペットを使用して、穏やかに上下に混合し、細胞を膜から遊離させ、次いで、培養物をゆっくりと引き上げ、各フラスコからの体積を記録し、５０ｍＬコニカルバイアルに移す。細胞カウントのために２００μＬのアリコートを取り、次いで、３つのバイアルに緩く蓋をして、フラスコに播種する準備ができるまでそれらを３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに入れる。ＴＩＬをカウントし、細胞カウントワークシートに記録する。G-Rex 5Mフラスコの底から残りの液体を吸引して、フラスコ内に余分なＴＩＬが残っていないことを確認する。
[00895] 各フラスコにつき娘フラスコの数を計算し（ＴＶＣ／１０６）、切り上げる（最大５）。ＴＶＣを娘フラスコの数で分割し、フラスコを計算された量に調整する。一部の実験では、１つのフラスコのみを継続でき得る。これも回収の終了時に推定され、説明される。フラスコにＣＭ４＋ＩＬ２で５０ｍＬまで充填し、次いで、３７℃／５％ＣＯ２中にフラスコを置く。
２２日目
[00896] 回収：細胞を乱さないようにインキュベーターからG-Rex 5Mフラスコを注意深く取り出し、代謝物分析に必要な場合は上清を取り除く。培地を吸引し、１０ｍＬピペットを使用して、穏やかに上下に混合し、細胞を膜から遊離させる。培養物をゆっくりと引き上げ、各フラスコからの体積を記録し、次いで、５０ｍＬコニカルバイアルに移す。細胞カウントのために２００μＬのアリコートを取り出し；３つのバイアルに緩く蓋をして、フラスコに播種する準備ができるまで３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに入れる。
[00897] 細胞カウントワークシートでＴＩＬ記録をカウントする。理論上のフルスケール収量（ＴＶＣ＊１００）を外挿して記録する。フラスコを１つだけ分割して続ける場合は、上記で計算したフラスコの数も掛ける。次いで、表３１に列挙されるアッセイに細胞を割り当てる。
Figure 0007658896000035
[00898] １％ＨＳＡ／ＰＬ－Ａの１：１０希釈液で残りの細胞を２回洗浄する。他の研究のために、CS10（３０×１０６細胞／ｍＬ／バイアル）と１：１製剤で、断熱容器（Mr. Frosty容器など）又はＣＲＦ中で残りの細胞を凍結する。
[00899] 表３２に、ＴＩＬ産生プロセスの重要なプロセスパラメーターを概括する。
Figure 0007658896000036
実施例７．凍結腫瘍組織ＴＩＬによる早期ＲＥＰ。
[00900] このデータは、実施例５で詳述されているＴＩＬ製造プロトコルの改変バージョンを使用して生成された。実施例５とは異なる実験方法の側面が強調されている。
[00901] 腫瘍組織の準備：必要に応じてハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を組織に添加して腫瘍を湿潤状態に保ち、滴下によって湿潤状態に保つことに注意を払った。滅菌ピンセット、メス、及びはさみを使用して、腫瘍をトリミングして、無関係の非腫瘍組織を除去した。直径１．５ｃｍの最小サイズの腫瘍断片はさらに６ｍｍ直径片に断片化された。各断片の理想的な厚さは約６ｍｍであった。
[00902] 腫瘍組織の凍結：最大１０個の腫瘍断片（公称サイズ６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍ）を各クライオバイアルに入れた。１５ｍＬのクライオバイアル（Thermo, USA）を使用した。１０ｍＬのCryoStor10（Biolife, USA）を各チューブに加えた。クライオバイアルの蓋をしっかりとねじ込み、チューブを５回反転させて、クライオバイアルの内容物を穏やかに混合した。次いで、クライオバイアルを冷蔵庫内で２℃～８℃で１５分間、３０分間、又は６０分間インキュベートした。貯蔵培地での冷蔵インキュベーション後、クライオバイアルをスリーブに詰め、適切に充填され平衡化された乾燥液体窒素シッパー（Cryoport）で液体窒素（ＬＮ２）の気相を使用して瞬間冷凍した。貯蔵のために、完全に凍結されたクライオバイアルを液体窒素細胞貯蔵冷凍庫に移し、凍結腫瘍組織を液体窒素温度に維持した。
[00903] 腫瘍の解凍：ＴＩＬ製造プロセスの０日目に、腫瘍組織断片を含むクライオバイアルをスリーブから取り出し、密封可能なビニール袋に入れ、密封した袋を３７℃の水浴に５±１分間沈めて解凍した。
[00904] 鉗子を使用して、腫瘍断片を滅菌ＨＢＳＳ（Gibco, USA）＋ゲンタマイシン（Gibco, USA）中に注意深く取り出し、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＨＢＳＳで３回、各洗浄で３分以上連続洗浄した。全ての寸法でおよそ５～６ｍｍの別個の断片を元の腫瘍サンプルから切り取り、新しい滅菌プラスチック表面にＨＢＳＳの別個の液滴でステージングした。
[00905] これらの断片のうち最大６０個を、６０００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２を補充した１Ｌの細胞培養培地１（ＣＭ１）を含むG-Rex 100MCSフラスコに入れ、フラスコを加湿インキュベーター（ターゲット３７℃、空気中５％ＣＯ２）に入れて、プレ急速拡大培養段階（プレＲＥＰ）のユニット操作を開始する。
[00906] ＴＩＬ製造の概要：プレＲＥＰ及びＲＥＰ。小規模のＧｅｎ２プロセス（１／１００スケール）を使用して、「新鮮」対照といくつかの凍結腫瘍の状態を試験した。プレＲＥＰ培養は、フルスケールプレＲＥＰプロセスの１：１０スケールで、G-Rex 10Mフラスコを使用して開始された。ＲＥＰは、フルスケールＲＥＰプロセスの１：１００に相当する、G-Rex 5M中のプレＲＥＰ産物の１０％を使用して開始された。
[00907] 「新鮮」対照プロセスでは、新鮮な腫瘍を無菌のＨＢＳＳ＋ゲンタマイシンで洗浄し、公称６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍの断片に切断した。６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ１培地とともに、約４断片をG-Rex 10Mフラスコに入れた。G-Rex培養物を３７℃のインキュベーター内で１１日間インキュベートした。培養１１日目に、プレＲＥＰ細胞を回収し、ＲＥＰは、G-Rex 5Mフラスコ内の３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含有するＣＭ２培地中で、プレＲＥＰ ＴＩＬの１０％を５０×１０６のＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって開始した。共培養の１６日目に、培養物を１０×１０６個以下の細胞を含有するG-Rex 5Mフラスコに分割した。分割された「娘」フラスコの数の計算は、以下のように実施された。ＴＶＣ／１０６＝娘フラスコの数（切り上げ）。
[00908] 分割培養物を、３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ４培地中でさらに６日間インキュベートした。２２日目に、CryoStor10（Biolife, USA）を使用して細胞を回収し、凍結した。
[00909] 凍結腫瘍拡大培養プロセスでは、上記で説明したように、公称６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍの断片が２ｍｍ～３ｍｍの小さな断片に処理された。プレＲＥＰセットアップ、ＲＥＰ開始、分割プロセス、及び凍結腫瘍の拡大培養に使用される試薬は、次の例外を除いて、「新鮮」対照プロセスとまったく同じように実施された。
[00910] プレＲＥＰ培養の期間は７日間であった（「新鮮」対照の場合は１１日間）
[00911] ＲＥＰ培養の期間は、７日目に分割した場合は１４日間であった（「新鮮」対照の場合は５日目に分割した場合は１１日間）。したがって、凍結腫瘍の合計期間は２１日間であったが、「新鮮」対照では２２日間であった。
[00912] 特徴付け又はＲＥＰ ＴＩＬ：ＴＩＬは各腫瘍プロセシング条件（新鮮、貯蔵培地中、０、３０分、又は６０分の冷蔵培養で凍結）から生成された。ＴＩＬの純度、同一性、メモリーサブセット、活性化、及び枯渇マーカーを特徴づけるために、フローサイトメトリーを次の抗体で実行した：CD3-BUV395、CD62LBV421、CD57-PB、CD11c-BV711、CD28-BB515、CD19-BUV563、CCR7-PE、CD123-BV605、CD27PE-CF594、CD14-BV-650、TCRγ/δ-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD45RA-A700、CD56-BUV737、CD8-BV786、CD4-PE-Cy7AND CD16-APC-Vio770)及びTIL-2panel(CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780。ＴＩＬ機能は、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、ＣＤ１０７Ａの分泌に基づいてさらに決定された。簡潔には、約１０５個の細胞を抗ＣＤ３コーティングプレートで２４時間刺激した。培養上清を収集し、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢにつきＥＬＩＳＡを使用して試験した。ＣＤ１０７Ａレベルにつき、ＴＩＬは、ＰＭＡ／ＩＯの刺激を伴い又は伴わず２時間刺激され、ＣＤ１０７Ａ－ＡＰＣ７００で染色され、フローサイトメトリーでさらに分析された。
[00913] Dako/Agilent Pathology Solutions Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometryキットを使用してフローＦＩＳＨを実施して、製造者の指示に従ってテロメア長を決定した。１３０１Ｔ細胞白血病細胞株（Sigma-Aldrich）を内部参照標準として使用した。
結果
[00914] 図８は、腫瘍組織の凍結手順に基づくプレＲＥＰの全生細胞（ＴＶＣ）を示す。冷蔵条件下（２℃～８℃）で約３０分間、貯蔵培地中でインキュベーションすると、即時の瞬間冷凍、及び凍結前のより長時間のインキュベーションの両方と比較して、最も生存率の高い細胞が得られた。図９は、２１日目のＲＥＰ ＴＶＣの結果を示す。凍結プロトコルは、プレＲＥＰ培養の初期の生存率に影響を与える。さらなる機能は、ＩＦＮ－γ分泌を測定することによって評価され、図１０に概括される。貯蔵培地中で最初に３０分間インキュベートした凍結腫瘍組織から拡大培養したＴＩＬは、最高レベルのＩＦＮ－γを発現した。細胞表現型パネルで評価された全てのマーカー（表２９を参照）は、凍結腫瘍組織から産生したＴＩＬが新鮮腫瘍組織から産生したＴＩＬと同様の表現型を有することを示す。
[00915] 図１１及び１２は、主要なステップの概要を示し、この例示的な実験で比較した細胞集団間の違いを強調している。
[00916] 図１３～２３は、３～５人の患者における新鮮腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルのＴＩＬ表現型の特性評価の結果を示す。患者Ｍ１１２５は、液体窒素の気相で凍結する前に、瞬間冷凍及び２℃～８℃で３０分及び６０分のインキュベーションで試験し、他の全ての患者は、液体窒素の気相で凍結する前に、２℃～８℃で６０分のインキュベーションで試験した。全体として、凍結腫瘍サンプルは、新鮮腫瘍サンプルと同等又はそれを超えるパフォーマンスを示した。
実施例８．腫瘍凍結保存プロセス。
[00917] 腫瘍は、以下のプロセスに従って、本発明の例示的な実施形態において凍結保存されてもよい。腫瘍組織は無菌的に取り扱われ、プロセシングを通して汚染のない状態が維持されなければならない。
[00918] 組織を患者から取り出した後、必要に応じて、ホールピペットでの滴下によってハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を組織に添加して湿潤状態に保たなければならない。腫瘍は無菌的に蓋付きの滅菌検体容器に入れられ、切除のために病理に送られる場合は、手術室の無菌表面又は層流フードに移される。滅菌ピンセット及び滅菌メス又ははさみを使用して、各現場で指定された切除医又は経験のある病理医が腫瘍をトリミングして、無関係の非腫瘍組織又は壊死組織を除去する必要がある。出血性、液性及び壊死性の組織は、可能な限り排除すべきである。医師又は病理医は、組織が生存可能で、非出血性で、壊死がなく、最小サイズの仕様が満たされていることを確認するために、切除された標本を評価する必要がある。可能であれば、組織は色素の不均一性を有するべきである。
[00919] 腫瘍が少なくとも１．５ｃｍの直径を有する場合、それを半分に切断して、比較のために凍結標本と新鮮標本の両方を提供してもよい。トリミングされた腫瘍の半分を、ゲンタマイシン及びアンホテリシンを加えて４～８℃に維持されたHypothermosolの滅菌ボトルに入れる。蓋はしっかりとねじ込まなければならない。これにより、新鮮な検体が提供される。
[00920] 腫瘍の残りの半分は１０×６ｍｍの断片に断片化され、１０ｍＬの滅菌CryoStor（登録商標）10を含有する準備された滅菌１５ｍＬクライオバイアルに入れられる。６ｍｍの断片が１０個を超えて得られる場合は、１０ｍＬの滅菌CryoStor 10を含む追加の１５ｍＬクライオバイアルを使用する。蓋をしっかりとねじ込み、冷凍した検体容器を４℃で１時間置いてから、液体窒素で瞬間冷凍する。これにより、凍結検体が提供される。
[00921] 凍結腫瘍標本は、クライオシッパーの指示に従ってクライオシッパー内に梱包しなければならない。
実施例９．卵巣癌腫瘍からの１６日間の凍結腫瘍拡大培養プロセス。
[00922] 小規模のＴＩＬ拡大培養プロセス（１／１００スケール）を使用して、「新鮮」対照腫瘍サンプルと凍結腫瘍サンプルを試験した。凍結腫瘍サンプルは、上記の実施例７及び８で論じられた凍結保存プロセスに従って凍結された。プレＲＥＰは、１：１０のフルスケールプレＲＥＰプロセスにG-Rex 10Mフラスコを使用して開始された。ＲＥＰは、フルスケールＲＥＰプロセスの約１：１００に相当する、G-Rex 5Mフラスコ中のプレＲＥＰ産物の１０％を使用して開始された。この実施例では、卵巣腫瘍サンプルを使用した。
[00923] 新鮮腫瘍の準備。直径３ｍｍの新鮮な腫瘍断片６個を、ゲンタマイシンを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。約６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ１培地とともに、断片をG-Rex 10Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）に入れた。これらの培養物を３７℃のインキュベーター内で１１日間インキュベートした。１１日目に、プレＲＥＰ細胞を回収し、ＲＥＰは、G-Rex 5Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）内の３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含有するＣＭ２培地中で、プレＲＥＰ ＴＩＬの１０％を５０×１０６のＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって開始した。１６日目に、培養物を１０×１０６個以下の細胞を含有するG-Rex 5Mフラスコに分割した。分割培養物を、３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ４培地中でさらに６日間インキュベートした。２２日目に、CryoStor10（Biolife, USA）を使用して細胞を回収し、凍結した。
[00924] 凍結腫瘍の調製－早期ＲＥＰ方法１（「ＥＲ－１」）。直径２～３ｍｍの凍結腫瘍断片６個を解凍し、ゲンタマイシンを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。約６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ１培地とともに、断片をG-Rex 10Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）に入れた。これらの培養物を３７℃のインキュベーター内で５日間インキュベートした。５日目に、プレＲＥＰ細胞を回収し、ＲＥＰは、G-Rex 5Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）内の３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含有するＣＭ２培地中で、プレＲＥＰ ＴＩＬの１０％を２５×１０６又は５０×１０６のＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって開始した。１０日目に、培養物を１０×１０６個以下の細胞を含有するG-Rex 5Mフラスコに分割した。分割培養物を、３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ４培地中でさらに６日間インキュベートした。１６日目に、CryoStor10（Biolife, USA）を使用して細胞を回収し、凍結した。
[00925] 凍結腫瘍の調製－早期ＲＥＰ方法２（「ＥＲ－２」）。直径２～３ｍｍの凍結腫瘍断片６個を解凍し、ゲンタマイシンを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。約６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ１培地とともに、断片をG-Rex 10Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）に入れた。これらの培養物を３７℃のインキュベーター内で３日間インキュベートした。３日目に、プレＲＥＰ細胞を回収し、ＲＥＰは、G-Rex 5Mフラスコ（Wilson Wolf Mfg., New Brighton, MN）内の３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含有するＣＭ２培地中で、プレＲＥＰ ＴＩＬの１０％を２５×１０６又は５０×１０６のＰＢＭＣフィーダー細胞と共培養することによって開始した。９日目に、培養物を１０×１０６個以下の細胞を含有するG-Rex 5Mフラスコに分割した。分割培養物を、３，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有するＣＭ４培地中でさらに７日間インキュベートした。１６日目に、CryoStor10（Biolife, USA）を使用して細胞を回収し、凍結した。
[00926] 図２４に、これら３つの拡大培養方法を比較したフローチャートを示す。結果を以下の表３３に示す。ＥＲ－１及びＥＲ－２方法の両方を使用したＴＩＬの拡大培養は、新鮮腫瘍サンプル方法ＧＥＮ２を使用した場合と比較して、はるかに大きなＲＥＰの拡大倍数をもたらした。
Figure 0007658896000037
[00927] 実施例１０：他の腫瘍タイプによる１６日間の凍結腫瘍拡大培養プロセス。
[00928] 実施例９に開示されるプロセスは、以下の癌タイプ：黒色腫、肺、子宮頸部、及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、の少なくとも２人の患者から収集された腫瘍サンプルを用いて実施される。拡大培養プロセスは、ＥＲ－１及びＥＲ－２方法について上記で説明したのと実質的に同じ方法で、各癌タイプに対して実施される。データは上記のように収集される。
[00929] 実施例１１：限定培地を使用した１６日間の凍結（Frozer）腫瘍拡大培養プロセス。
[00930] 実施例９に開示されるプロセスは、以下の癌タイプ：黒色腫、肺、子宮頸部、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び卵巣、の少なくとも２人の患者から収集された腫瘍サンプルを用いて実施されるが、ＣＭ１及びＣＭ２培地を、本発明による限定培地（例えば、３％CTS（商標）細胞血清代替物を含むCTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ（ThermoFisher Scientific）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノール）で置き換える。
[00931] 実施例１２：OMNI C3（商標）培養バッグ及びEXP-PAK（登録商標）バイオ容器を使用した１６日間の凍結腫瘍拡大培養プロセス。
[00932] 実施例９に開示されるプロセスは、以下の癌タイプ：黒色腫、肺、子宮頸部、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び卵巣、の少なくとも２人の患者から収集された腫瘍サンプルを用いて実施されるが、GRexガス透過性容器をOMNI C3（商標）培養バッグ（Lampire Biological Laboratories）又はEXP-PAK（登録商標）細胞拡大培養バイオ容器（Charter Medical）のいずれかで置き換える。OMNI C3（商標）培養バッグはプレＲＥＰ／第１の拡大培養段階で代用され、EXP-PAK（登録商標）バイオ容器はＲＥＰ／第２の拡大培養段階で代用される。
[00933] 実施例１３：限定培地、OMNI C3（商標）培養バッグ及びEXP-PAK（登録商標）バイオ容器を使用した１６日間の凍結腫瘍拡大培養プロセス。
[00934] 実施例９に開示されるプロセスは、以下の癌タイプ：黒色腫、肺、子宮頸部、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び卵巣、の少なくとも２人の患者から収集された腫瘍サンプルを用いて実施されるが、ＣＭ１及びＣＭ２培地を、本発明による限定培地（例えば、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞拡大培養ＳＦＭ、ThermoFisher）で置き換え、GRexガス透過性容器をOMNI C3（商標）培養バッグ（Lampire Biological Laboratories）又はEXP-PAK（登録商標）細胞拡大培養バイオ容器（Charter Medical）のいずれかで置き換える。OMNI C3（商標）培養バッグはプレＲＥＰ／第１の拡大培養段階で代用され、EXP-PAK（登録商標）バイオ容器はＲＥＰ／第２の拡大培養段階で代用される。

Claims (44)

  1. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造のための腫瘍組織を凍結保存する方法であって、
    （ｉ）前記腫瘍組織を断片化すること；
    （ｉｉ）前記断片を凍結保存培地中でインキュベートすること；及び
    （ｉｉｉ）前記断片を凍結することであって、前記凍結が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であること
    を含む、方法。
  2. 前記腫瘍組織が、１．５ｍｍ～６ｍｍの直径を有する略球形の断片に断片化される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記略球形の断片が、６ｍｍの直径を有する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記略球形の断片が、３ｍｍの直径を有する、請求項２に記載の方法。
  5. 前記腫瘍組織が、少なくとも１．５ｍｍの最短辺長及び６ｍｍの最長辺長を有する概ね矩形の断片に断片化される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記腫瘍組織が、１．５ｍｍ～６ｍｍの辺長を有する概ね立方体の断片に断片化される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記概ね立方体の断片が、６ｍｍの辺長を有する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記概ね立方体の断片が、３ｍｍの辺長を有する、請求項６に記載の方法。
  9. 前記腫瘍組織が、解剖された腫瘍からのものである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記解剖された腫瘍組織は、８時間未満が経過したものである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記凍結保存培地が、２％ｖ／ｖ～１５％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記凍結保存培地が、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記凍結保存培地が、少なくとも１つの抗菌剤を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つの抗菌剤が、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記腫瘍断片が、前記凍結保存培地中で３０分間～８０分間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
  16. 前記腫瘍断片が、２℃～８℃の温度で、前記凍結保存培地中でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
  17. 前記腫瘍組織が、インキュベーション前に生理緩衝等張食塩水で洗浄される、請求項１に記載の方法。
  18. 前記洗浄が、少なくとも各３分、３回の連続洗浄を含み、各連続洗浄の後に前記生理緩衝等張食塩水が交換される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記凍結が、－１２５℃～－１９６℃の範囲の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
  20. 前記凍結が、－１４０℃～－１７５℃の温度で行われる、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記凍結が、－１４５℃の温度で行われる、請求項２０に記載の方法。
  22. （ｉｖ）前記凍結断片を少なくとも－１３０℃未満の温度で貯蔵するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  23. 前記凍結断片が、液体窒素の気相中に貯蔵される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記凍結断片が、液体窒素内に沈めて貯蔵される、請求項２２に記載の方法。
  25. 養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するための方法であって、
    （ａ）腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、前記腫瘍組織を貯蔵する方法が、
    （ｉ）前記腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
    （ｉｉ）凍結保存培地を含有する閉鎖可能な容器内に前記腫瘍組織を置くこと；
    （ｉｉｉ）前記腫瘍組織及び前記凍結保存培地を含有する前記容器を、２～８℃の温度で、３０分間～６０分間インキュベートすること；
    （ｉｖ）前記容器を冷凍することであって、前記冷凍が液体窒素の気相を使用した瞬間冷凍であること；及び
    （ｖ）前記容器を－１３０℃以下で貯蔵すること
    を含むこと；
    （ｂ）前記容器を解凍すること；
    （ｃ）ガス透過性容器内の前記腫瘍組織を、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３を含む第１の細胞培養培地で処置して、ＴＩＬを提供すること；
    （ｄ）細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地を使用して、ガス透過性容器内で、前記ＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
    を含む、方法。
  26. ステップ（ｉ）の前記腫瘍組織が、直径１．５ｍｍ～６ｍｍにトリミングされる、請求項２５に記載の方法。
  27. ステップ（ｉ）の前記腫瘍組織が、６ｍｍ×６ｍｍ×６ｍｍにトリミングされる、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記凍結保存培地が、抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記凍結保存培地が、２％ｖ／ｖ～１２％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記凍結保存培地が、１０％のＤＭＳＯを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記凍結保存培地が、少なくとも５０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記腫瘍組織が、ステップ（ｉ）を実施する前に、最初にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄される、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記洗浄が、少なくとも各３分、３回の連続洗浄を含み、各連続洗浄の後に前記ＨＢＳＳが交換される、請求項３２に記載の方法。
  34. ステップ（ｂ）が、前記容器を３７℃の温度の水浴に５分間浸漬することを含む、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記腫瘍組織が、黒色腫腫瘍組織、頭頸部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、神経膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、卵巣腫瘍組織、又はＨＰＶ陽性腫瘍組織からなる群から選択される、請求項１又は請求項２５に記載の方法。
  36. 前記方法が、前記第１の拡大培養ステップ（ｃ）と前記第２の拡大培養ステップ（ｅ）との間に分割をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  37. 前記分割が、ステップ（ｃ）開始の１６日後に行われる、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第１の培養ステップが、１１日間である、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ステップ（ｃ）から（ｅ）が、２２日間の期間にわたって実施される、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. ステップ（ｃ）から（ｅ）が、２０日間未満の期間にわたって実施される、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. ステップ（ｉｖ）が、－１２５℃～－１５０℃で前記容器を冷凍することを含む、請求項２５に記載の方法。
  42. ステップ（ｖ）が、少なくとも－１３０℃未満で前記容器を貯蔵することを含む、請求項２５に記載の方法。
  43. ステップ（ｖ）が、液体窒素内に前記容器を沈めて貯蔵することを含む、請求項２５に記載の方法。
  44. 養子Ｔ細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調製するための方法であって、
    （ａ）前記腫瘍組織を凍結状態で貯蔵することであって、前記腫瘍組織を貯蔵する方法が、
    （ｉ）前記腫瘍組織をトリミングして過剰の非腫瘍組織を除去すること；
    （ｉｉ）凍結保存培地を含有する閉鎖可能な容器内に前記腫瘍組織を置くこと；
    （ｉｉｉ）前記腫瘍組織及び前記凍結保存培地を含有する前記容器を、２～８℃で、３０分間インキュベートすること；
    （ｉｖ）液体窒素の気相を使用して前記容器を冷凍すること；及び
    （ｖ）前記容器を液体窒素温度の気相で貯蔵すること
    を含むこと；
    （ｂ）前記容器を解凍すること；
    （ｃ）ガス透過性容器内の前記腫瘍組織を、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び任意選択によりＯＫＴ－３を含む第１の細胞培養培地で処置して、ＴＩＬを提供すること；
    （ｄ）少なくとも複数の前記ＴＩＬを除去すること；
    （ｅ）ガス透過性容器内で、細胞培養培地、照射フィーダー細胞、ＯＫＴ－３、及びＩＬ－２を含む第２の細胞培養培地で前記ＴＩＬを拡大培養して、拡大された数のＴＩＬを提供すること
    を含む、方法。
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