JP7664913B2 - 免疫のための増強されたキメラ抗原受容体エフェクター細胞操作およびその使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，４６８号、及び２０２０年１０月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／５４６０１の優先権を主張し、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された配列表への参照
本出願は、参照により、本出願とともに提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）を組み込んでおり、０５６９３２－５３０００１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題する、２０２０年１０月１９日に作成され、サイズは９２，８８３バイトである。

本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関係している。より具体的には、本開示は、インビボで治療的に関連する特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関係している。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処している。

養子細胞療法の分野は現在、患者由来およびドナー由来の細胞の使用に重点が置かれているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成し、利益を得る可能性のあるすべての患者に治療を提供することが特に困難である。患者の良好な転帰を促進するために、養子移入されたリンパ球の有効性および持続性を改善する必要もある。Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫および獲得免疫において重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためのこれらの免疫細胞の使用は依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞およびＮＫ細胞、または他の免疫エフェクター細胞の可能性を最大限に利用する重要な機会が残っている。

応答率、細胞枯渇、輸血された細胞の喪失（生存および／または持続性）、標的喪失または系譜転換による腫瘍エスケープ、腫瘍標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果から、固形腫瘍に対する有効性、すなわち、腫瘍微小環境および関連する免疫抑制、動員、輸送、および浸潤に及ぶ問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。

本発明の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成するための方法および組成物を提供することであり、ｉＰＳＣはそのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子改変を含む。当該１つまたはいくつかの遺伝子改変には、ＤＮＡの挿入、欠失、および置換が含まれ、これらの改変は、分化、拡大、継代、および／または移植後の、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。

本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞には、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ならびに一次ＮＫ、Ｔ、および／またはＮＫＴ細胞に存在する１つ以上の機能的特性を有する免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同じ遺伝子改変を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子改変を含む。遺伝子操作された派生細胞を得るための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、および操作されたモダリティが派生細胞で意図したとおりに機能することも必要である。さらに、この戦略は、末梢血から得られたＴ細胞またはＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。さらに、この戦略は、最初は不均一な一次細胞源を使用して別の方法で得られる不均一なエフェクター細胞集団の生成を回避する。

本発明のいくつかの態様は、それぞれ、再プログラミングプロセスの後、それと同時、およびその前のゲノム操作の戦略を反映する、（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を含む方法を使用して得られたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する。
（Ｉ）：ｉＰＳＣを（ｉ）および（ｉｉ）のうちの一方または両方を任意の順序で遺伝子操作する：（ｉ）１つ以上の構築物をｉＰＳＣに導入して、選択した部位で標的化組み込みを可能にする、（ｉｉ）（ａ）選択された部位の認識が可能な１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位に１つ以上の二本鎖切断をｉＰＳＣに導入する、（ｂ）ステップ（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養し、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位で標的化されたイン／デルを生成できるようにする、それにより、部分的または完全に分化した細胞への分化が可能なゲノム操作されたｉＰＳＣを得る。
（ＩＩ）：再プログラミング非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたｉＰＳＣを得る：これには、（ｉ）非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択的に、非多能性細胞の再プログラミングを開始するためのＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させることと、（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）（ｉ）の再プログラミング非多能性細胞に、（ａ）および（ｂ）：（ａ）選択された部位での標的化された組み込みを可能にする１つ以上の構築物、（ｂ）選択された部位認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断、の一方または両方を任意の順序で導入し、次いで、ステップ（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位に標的化されたイン／デルを生成することができるようにすることと、が含まれ、したがって、得られるゲノム操作されたｉＰＳＣは少なくとも１つの機能的な標的化されたゲノム編集を含み、当該ゲノム操作されたｉＰＳＣは部分的または完全に分化した細胞に分化することができる。
（ＩＩＩ）：再プログラミングするために非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたｉＰＳＣを得る：これには、（ｉ）非多能性細胞に、（ａ）および（ｂ）：（ａ）選択された部位での標的化された組み込みを可能にする１つ以上の構築物、（ｂ）選択された部位認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位での１つ以上の二本鎖切断、の一方または両方を任意の順序で導入する（ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）（ｂ）の細胞を培養して、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位に標的化されたイン／デルを生成することができるようにする）ことと、（ｉｉ）ステップ（ＩＩＩ）（ｉ）の細胞を、１つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択的に、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位に標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、の（ｉ）および（ｉｉ）が含まれ、それにより、少なくとも１つの機能的な標的化されたゲノム編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得、当該ゲノム操作されたｉＰＳＣは、部分的に分化した細胞または完全に分化した細胞に分化することができる。

上述の方法の一実施形態では、１つ以上の選択された部位での少なくとも１つの標的化されたゲノム編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、あるいは、ゲノム操作されたｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入のための外因性ポリヌクレオチドは、（１）ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、または他の構成的、誘導性、一過性、組織特異性、または細胞型特異性プロモーターを含む１つ以上の外因性プロモーター；あるいは（２）ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む選択した部位に含まれる１つ以上の内因性プロモーターへと作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、上述の方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変されたＥＧＦＲ、またはＢ細胞ＣＤ２０を含むタンパク質をコードする１つ以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ゲノム操作されたｉＰＳＣが２つ以上の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、またはＲＵＮＸ１を含む異なるセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらのそれぞれの受容体の部分的または完全なペプチドは、融合タンパク質の形態である。

いくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節および調整、あるいはｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存を抑制するタンパク質に関連する１つ以上の内因性遺伝子におけるイン／デルを含む。いくつかの実施形態では、破壊のための内因性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。

さらにいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成されたゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするカスパーゼ、およびＨ１１遺伝子座に外因性ポリヌクレオチドをコードするチミジンキナーゼを含む。

またいくつかの他の実施形態では、アプローチ（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）は、ゲノム操作されたｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、ゲノム操作されたｉＰＳＣの多能性を維持する。一実施形態では、少なくとも１つの標的化されたゲノム編集を含む、得られたゲノム操作されたｉＰＳＣは、機能的であり、分化能があり、同じ機能的なゲノム編集を含む非多能性細胞に分化することができる。

本出願の一態様は、少なくとも１つの抗原認識ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、Ｔおよび／またはＮＫ細胞の活性化または機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来し得、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む場合、キメラ抗原受容体は、所望の派生エフェクター細胞に向けられたｉＰＳＣの分化を促進し、ｉＰＳＣから分化したｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られた一次免疫細胞と比較して、（ｉ）改善された持続性および／または生存、（ｉｉ）改善された細胞増殖、（ｉｉｉ）増加された細胞毒性、（ｉｖ）増加されたアロ拒絶反応に対する耐性、（ｖ）改善された腫瘍浸潤、（ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走させる、および／または活性化もしくは動員する増強された能力、ならびに（ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低減させる増強された能力、を含むが、これらに限定されない、特徴のうちの少なくとも１つを有する。様々な実施形態では、（ａ）シグナル伝達タンパク質は、２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通型および免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナルトランスデューサー）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－ＤタイプＩＩインテグラルメンブレンタンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞毒性誘発受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞毒性誘発受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞毒性誘発受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、およびＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つを含む、ならびに／または（ｂ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、それぞれ、（ａ）配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８；及び／又は（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１の、細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、もしくはＣＤ８の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該細胞質ドメインの部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、ＹｘｘＭモチーフ、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフ、ＦｃＲγ、ヘミＩＴＡＭ、および／またはＩＴＴ様モチーフを含む。

様々な実施形態では、エンドドメインは、第１のシグナル伝達ドメイン、第２のシグナル伝達ドメイン、および任意選択的に第３のシグナル伝達ドメインを含み、第１、第２、および第３のシグナル伝達ドメインは、異なる。エンドドメインが、第２のシグナル伝達ドメイン、および任意選択的に第３のシグナル伝達ドメインを含むこれらの実施形態のうちのいくつかでは、第２または第３のシグナル伝達ドメインは、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、もしくはＣＤ８の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、エンドドメインは、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、当該エンドドメインドメインは、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、およびＮＫｐ４６－２Ｂ４を含むが、これらに限定されない、形態のうちのいずれか１つにおける融合細胞質ドメインまたはその一部を含む。様々な実施形態では、エンドドメインは、３つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、当該エンドドメインドメインは、２Ｂ４－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＩＬ２１Ｒ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－４１ＢＢ－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０、およびＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸから選択される形態のうちのいずれか１つにおける融合細胞質ドメインまたはその一部をさらに含む。

いくつかの実施形態では、エンドドメインは、１つのシグナル伝達ドメインのみを含み、エンドドメインは、ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８Ｈ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＤＡＰ１２、またはＤＡＰ１０の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

キメラ抗原受容体の様々な実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、またはＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域もしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、膜貫通ドメインは、それぞれ、（ａ）配列番号１～２０、５３、および５５によって表される、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８；又は（ｂ）ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２８Ｈ、及びＤＮＡＭ１の膜貫通領域もしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、膜貫通ドメインおよびその直接連結されたシグナル伝達ドメインは、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来する。

キメラ抗原受容体の様々な実施形態では、キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン（ＴＭ－（エンドドメイン））を含み、キメラ抗原受容体は、


（ｉ）ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ）、ＣＤ８－（４１ＢＢ－ ＣＤ３ ζ１ＸＸ）、ＣＤ２８－（ＣＤ２８－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＳ１）、ＤＡＰ１０－（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－ＣＤ２－ＤＡＰ１０）、ＣＤ２－（ＣＤ２－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＦｃＥＲＩｇ）、ＣＳ１－（ＣＳ１－ＣＤ３ζ）、ＮＫＧ２Ｄ－（ＣＳ１）、ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＣＳ１）、及びＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＣＳ１－ＣＤ３ζ）の形態のうちの１つ、または
（ｉｉ）ＤＡＰ１０－（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＦｃＥＲＩｇ）、ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＣＳ１）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、及びＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＳ１）の形態のうちの１つ、または
（ｉｉｉ）配列番号５７～７４の各々によって表される配列に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

キメラ抗原受容体の様々な実施形態では、抗原認識ドメインは、疾患、病原体、液体腫瘍、または固形腫瘍に関連する抗原と特異的に結合する。様々な実施形態では、抗原認識ドメインは、（ｉ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちのいずれか１つ、または（ｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的であり得る。

キメラ抗原受容体の様々な実施形態では、エクトドメインは、（ｉ）２つの抗原認識ドメイン、（ｉｉ）シグナルペプチド、および／または（ｉｉｉ）スペーサー／ヒンジのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全長ペプチドを共発現するバイシストロン性構築物に含まれ得、外因性サイトカインまたはその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、およびそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つ、または（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを用いることによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）切断されたまたは排除されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣは、天然であるか、もしくは改変されている、融合タンパク質、ならびに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含む。

キメラ抗原受容体が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に含まれ、所望の派生エフェクター細胞に向けられたｉＰＳＣの分化を促進するこれらの実施形態のいくつかでは、ｉＰＳＣ分化からの派生エフェクター細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、または派生免疫エフェクター細胞のうちの１つ以上を含む。様々な実施形態では、ｉＰＳＣ由来免疫エフェクター細胞は、当該キメラ抗原受容体を発現し、ｉＰＳＣ由来免疫エフェクター細胞は、一次Ｔ、ＮＫ、および／またはＮＫＴ細胞には存在しない少なくとも１つの機能的特性を含む。

別の態様では、本発明は、細胞またはその集団を提供し、（ｉ）細胞は、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ、またはｉＰＳ細胞株細胞であり得るか、または細胞は、ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり得、（ｉｉ）細胞は、本明細書で提供される少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。様々な実施形態では、細胞は、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）その対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍヌルまたは低、任意選択的にＣＩＩＴＡヌルまたは低、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの導入された発現、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方もしくは両方のノックアウト、（ｉｖ）ＣＤ１６またはそのバリアント、（ｖ）異なるターゲティング特異性を有する第２のＣＡＲ、（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカインおよび／またはその受容体の部分または完全ペプチド、（ｖｉｉ）表２に列挙されている遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）その対応する一次細胞と比較して、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失または低減された発現、あるいは（ｉｘ）その対応する細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、およびアゴニストと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたまたは増加した発現、のうちの１つ以上をさらに含む。

様々な実施形態では、細胞は、高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアントをさらに含む。高親和性の切断不可能なＣＤ１６またはそのバリアントのいくつかの実施形態は、（ａ）ＣＤ１６のエクトドメインドメインにおけるＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐ、（ｂ）ＣＤ６４に由来する完全または部分的なエクトドメイン、（ｃ）非天然（または非ＣＤ１６）膜貫通ドメイン、（ｄ）非天然（または非ＣＤ１６）細胞内ドメイン、（ｅ）非天然（または非ＣＤ１６）シグナル伝達ドメイン、（ｆ）非天然刺激ドメイン、ならびに（ｇ）ＣＤ１６に由来せず、同じまたは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、（ａ）非天然膜貫通ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドに由来し得、（ｂ）非天然刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来し得、（ｃ）非天然シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来し得るか、または（ｄ）非天然膜貫通ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに由来し得、非天然刺激ドメインは、２Ｂ４に由来し得、非天然シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来し得る。

様々な実施形態では、細胞は、第２のＣＡＲをさらに含み、第２のＣＡＲは、（ｉ）Ｔ細胞特異的もしくはＮＫ細胞特異的、（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、（ｖ）分割ＣＡＲ、（ｖｉ）多鎖ＣＡＲ、（ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲ、（ｖｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカインおよび／もしくはその受容体の部分的もしくは完全なペプチドと、任意選択的に別個の構築物もしくはバイシストロン性構築物において共発現され、（ｘｉ）チェックポイント阻害剤と、任意選択的に別個の構築物もしくはバイシストロン性構築物において共発現され、（ｘｉｉ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つに特異的であり、ならびに／または（ｘｉｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的である。

様々な実施形態では、細胞は、細胞表面発現の外因性サイトカインおよび／またはその受容体の部分的もしくは完全なペプチドを含み、外因性サイトカインまたはその受容体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、およびそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含むか、または（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを使用することによってＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）切断されたまたは排除されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか、もしくは改変されている、融合タンパク質ならびに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つは、別個の構築物で、またはバイシストロン性構築物において、ＣＡＲと共発現され得、任意選択的に、（ｃ）一過性発現される。

細胞またはその集団が派生エフェクター細胞であるいくつかの実施形態では、派生エフェクター細胞は、造血細胞であり得、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られる対応する一次細胞と比較してより長いテロメアを含むか、または、ＣＡＲは、以下の特徴：（ｉ）ＴもしくはＮＫ細胞に特異的であること、（ｉｉ）抗原結合において二重特異性であること、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲであること、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲであること、（ｖ）分割ＣＡＲであること、（ｖｉ）多鎖ＣＡＲであること、（ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲであること、および（ｖｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴの遺伝子遺伝子座のうちの１つに挿入されることであって、挿入が遺伝子座の遺伝子の発現をノックアウトするもしくは低減する、挿入されること、のうちの少なくとも１つを有する。様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員および／または遊走させることができ得、派生エフェクター細胞は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍の免疫抑制を低減させることができ得る。様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、または派生免疫エフェクター細胞を含む。

細胞細胞がチェックポイント阻害剤と共発現される第２のＣＡＲをさらに含む、または派生エフェクター細胞が１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減させることができるこれらの実施形態のいくつかでは、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲを含む１つ以上のチェックポイント分子に対するアンタゴニストであり得る。様々な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ａ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体もしくは機能的同等物のうちの１つ以上、または（ｂ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペムブロリズマブのうちの少なくとも１つを含む。

細胞またはその集団のこれらの実施形態のいくつかでは、派生エフェクター細胞は、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られたその対応する一次細胞と比較して、（ｉ）改善された持続性および／もしくは生存、（ｉｉ）増加されたアロ反応性レシピエント免疫細胞に対する耐性、（ｉｉｉ）増加された細胞毒性、（ｉｖ）改善された腫瘍湿潤、（ｖ）増強または獲得されたＡＤＣＣ、（ｖｉ）バイスタンダー免疫細胞を腫瘍部位に遊走させる、および／または活性化もしくは動員する増強された能力、（ｖｉｉ）腫瘍免疫抑制を低減させる増強された能力、（ｖｉｉｉ）腫瘍抗原逃避の救済における改善した能力、（ｉｘ）腫瘍抗原を安定化する能力、ならびに（ｘ）フラトリサイドを回避する能力、の特徴のうちの少なくとも１つを有する。

細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座または選択された遺伝子座に組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）異なるセーフハーバー遺伝子座または２つを超える選択された遺伝子座に組み込まれた２つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、またはＲＵＮＸ１のうちの少なくとも１つを含み得、選択された遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴのうちの１つであり得、外因性ポリヌクレオチドの組み込みは、遺伝子座における遺伝子の発現をノックアウトする。遺伝子座がＴＣＲである実施形態では、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータの定常領域であり得る。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞またはその集団を含む組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、本明細書で提供される派生エフェクター細胞、および１つ以上の治療薬を含む治療用途のための組成物を提供する。様々な実施形態では、１つ以上の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の１つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体またはその機能的バリアントもしくは断片、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。組成物がチェックポイント阻害剤を含むこれらの実施形態のいくつかにおいて、チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、または阻害性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの１つ以上、または（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、およびペムブロリズマブの少なくとも１つを含み得るか、または、１つ以上の治療薬は、ベネトクラクス、アザシチジン、およびポマリドマイドのうちの１つ以上を含む。組成物が抗体を含むこれらの実施形態のいくつかでは、抗体は、（ａ）抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＧＤ２、抗ＰＤＬ１、および／または抗ＣＤ３８抗体、（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セルツキシマブ（ｃｅｒｔｕｘｉｍａｂ）、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、およびそれらのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアントもしくは断片、ならびにそれらの機能的同等物およびバイオシミラーのうちの１つ以上、または（ｃ）ダラツムマブ、およびＣＤ３８ノックアウトを含む派生エフェクター細胞、ならびに任意選択的にＣＤ１６またはそのバリアントの発現を含み得る。

別の態様では、本発明は、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによる、本明細書で提供される組成物の治療用途を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、またはウイルス感染を有する。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＣＡＲを含む派生エフェクター細胞を製造する方法を提供し、この方法は、遺伝子操作されたｉＰＳＣを分化させることを含み、ｉＰＳＣは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択的に、１つ以上の編集により、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、（ｉｉ）その対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍヌルまたは低、任意選択的にＣＩＩＴＡヌルまたは低、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの導入された発現、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方もしくは両方のノックアウト、（ｉｖ）ＣＤ１６またはそのバリアント、（ｖ）異なるターゲティング特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、（ｖｉ）細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分または完全ペプチド、（ｖｉｉ）表２に列挙されている遺伝子型のうちの少なくとも１つ、（ｖｉｉｉ）その対応する一次細胞と比較して、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴのうちの少なくとも１つにおける欠失または低減された発現、ならびに／あるいは（ｉｘ）その対応する一次細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重もしくは多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたまたは増加した発現、をもたらす。様々な実施形態では、この方法は、クローンｉＰＳＣをゲノム操作して、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをノックインすること、ならびに任意選択的に、（ｉ）ＣＤ３８をノックアウトすること、（ｉｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡをノックアウトすること、（ｉｉｉ）ＣＤ５８およびＣＤ５４の一方または両方をノックアウトすること、ならびに／または（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇ、高親和性の切断不可能なＣＤ１６もしくはそのバリアント、第２のＣＡＲ、および／または細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分的もしくは完全なペプチドの発現を導入すること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作は、標的化された編集を含む。特定の実施形態では、標的化された編集は、欠失、挿入、またはイン／デルを含み、標的化された編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、またはこれらの方法の任意の他の機能的変形によって実施され得る。

さらに別の態様では、本発明は、クローンｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ媒介編集を提供し、編集は、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのノックインを含む。様々な実施形態では、クローンｉＰＳＣの編集は、ＣＤ３８をノックアウトすることをさらに含み、ＣＡＲは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む遺伝子遺伝子座のうちの１つに挿入され得、挿入は、遺伝子座の遺伝子の発現をノックアウトする。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＣＡＲを含む細胞を、治療を必要とする対象に投与することを含む、疾患または状態を治療する方法を提供する。様々な実施形態では、細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、ＣＤ１６またはそのバリアントを含む派生エフェクター細胞を含み、任意選択的に、（ｉ）Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡノックアウト、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇもしくは切断不可能なＨＬＡ－Ｇの導入された発現、またはＣＤ５８およびＣＤ５４の一方または両方のノックアウト、（ｉｉｉ）第２のＣＡＲの導入された発現、および／または細胞表面発現外因性サイトカインもしくはその受容体の部分もしくは完全ペプチド、ならびに／または（ｉｉｉ）表２に列挙されている遺伝子型の少なくとも１つ、を含み得る。様々な実施形態では、細胞の投与は、本明細書に記載のＣＡＲなしでエフェクター細胞を使用する治療と比較して、（ｉ）ＭＩＣＡ／Ｂ抗原の腫瘍細胞表面シェディングを低減すること、（ｉｉ）腫瘍細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂ密度を増加すること、（ｉｉｉ）腫瘍抗原逃避を防ぐこと、（ｉｖ）腫瘍微小環境抑制を克服すること、（ｖ）エフェクター細胞の活性化および殺滅機能を増強すること、ならびに（ｖｉ）インビボ腫瘍進行制御、腫瘍細胞負荷の低減、腫瘍クリアランス、および／または改善された生存率、のうちの１つ以上をもたらす。

本明細書で提供される組成物および方法の様々な目的および利点は、例示および例として、本発明のある特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。

ｉＰＳＣ由来細胞における細胞表面発現のサイトカインのためのいくつかの構築物設計の図解である。ＩＬ１５は例示的な例として使用されており、他の望ましいサイトカインに置き換えることができる。 同一のｓｃＦｖおよびＣＤ８ヒンジ領域を有し、エンドドメインを含むシグナル伝達構成要素のみが異なるＣＡＲ構築物を例示する。 同上。 同上。 Ｔｈｙ１．１発現のＦＡＣＳソーティングおよびＣＡＲ抗体染色を用いたレンチウイルス形質導入後、ｉＰＳＣ派生細胞が標的特異的ＣＡＲを安定して発現することを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４ＡはＭＭ．１Ｓ標的細胞に対する、ｉＰＳＣ誘導エフェクター細胞中で構築された種々のＣＡＲ構築物の、多発性骨髄腫抗原特異的細胞障害アッセイを示す図である。図４Ｂは示したＣＡＲの殺滅高率を示す１／ＥＣ５０を示す図である。 フローサイトメトリーにより決定されたテロメア長のグラフ表示であり、これは、ｉＰＳＣ由来の成熟派生ＮＫ細胞が、成体末梢血ＮＫ細胞と比較してより長いテロメアを維持していることを示す。

ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）のゲノム改変には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失、および置換が含まれる。ゲノム操作されたｉＰＳＣにおける外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたｉＰＳＣの長期クローン拡大後、細胞分化後、およびゲノム操作されたｉＰＳＣに由来する細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子発現の低減などの問題に遭遇することが多い。一方、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製および送達に障害をもたらす。本発明は、自殺遺伝子および他の機能的モダリティを含む１つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞毒性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、および／または生存に関する改善された治療的特性を、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞を含むが、これらに限定されないｉＰＳＣ派生細胞にもたらす。

定義
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。

本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって異なり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

代替案（例えば、「または」）の使用は、代替案の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

「および／または」という用語は、代替案の一方または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％まで変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。

本明細書で使用される場合、「実質的に」または「本質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。

本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」および「本質的に含まない」という用語は交換可能に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物を説明するために使用される場合、特定の物質またはその供給源を含まない、例えば、特定の物質またはその供給源を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まないか、または従来の手段によって測定されるとき検出不能である組成物を指す。組成物中のある特定の成分または物質を「含まない」または「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分または物質が、（１）任意の濃度で組成物に含まれない、または（２）機能的に不活性だが、低濃度で組成物に含まれることを意味する。同様の意味は、「不在」という用語に適用することができ、特定の物質または組成物のその供給源が不在であることを指す。

本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を除外することを意味しないと理解される。特定の実施形態では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、「含有する」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義語として使用される。

「からなる」とは、「からなる」という句に続くものを含み、これに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列記された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。

「本質的にからなる」とは、句の後に列記された任意の要素を含むことを意味し、列記される要素の開示において特定された活性または動作に干渉または寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的にからなる」という句は、列記される要素が必要または必須であることを示すが、他の要素は任意選択的ではなく、列記された要素の活性または動作に影響を及ぼすか否かに応じて存在しても存在しなくてもよい。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特色、構造、または特徴は、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれる。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせることができる。

「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の改変を最小限に抑えて、生体外の人工環境の生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、通常は無菌条件下で、典型的には数時間または最大約２４時間（しかしながら、状況に応じて最大４８または７２時間以上を含む）実験装置で培養された生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態では、そのような組織または細胞を収集して凍結し、後にエクスビボ処理のために解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日より長く続く組織培養実験または手順は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。

「インビボ」という用語は、一般に、生体内で行われる活動を指す。

本明細書で使用される場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「分化能の増加」または「発生能の増加」という用語は、細胞の分化能を増加させるか、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、分化能が増加した細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より大きな発生可塑性を有する（つまり、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えれば、再プログラミングされた細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞よりもあまり分化しない状態にある細胞である。

本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない（「コミットしていない」）またはあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞または筋細胞などの特殊化された細胞の特色を獲得するプロセスである。分化したまたは分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化した（「コミットした」）位置をとった細胞である。「コミットした」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下で、特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続ける点まで分化経路を進んでおり、通常の状況下では、異なる細胞型に分化するか、またはあまり分化しない細胞型に戻ることができない細胞を指す。本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、体または体細胞のすべての系統（すなわち、胚そのもの）を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉の３つの胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生み出すことができない不完全または部分的に多能性の細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物（例えば、胚性幹細胞）を生み出すことができるより原始的でより多能性の細胞に及ぶ発生能の連続体である。

本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣという用語は、幹細胞が、誘導または変更された、分化した成人、新生児または胎児細胞から産生された、すなわち、３つのすべての胚葉または真皮層：中胚葉、内胚葉、および外胚葉のすべての組織に分化できる細胞にリプログラミングされたことを意味する。産生されたｉＰＳＣは、自然界に見られる細胞を指さない。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生中に外胚葉、内胚葉および中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体を生じさせる。それらは胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。

本明細書で使用される場合、「多分化能幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の細胞に分化するが、３つすべてにではない発生の可能性を有する細胞を指す。したがって、多分化能細胞は「部分的に分化した細胞」とも呼ばれる。多分化能細胞は当技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多分化能」は、細胞が所与の系統で多くの細胞型を形成する可能性があるが、他の系統の細胞は形成しない可能性があることを示す。例えば、多分化能造血細胞は、多くの異なる血液細胞型（赤、白、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。

多能性は、部分的に、細胞の多能性の特徴を評価することによって決定することができる。多能性の特徴には、（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限の自己再生の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、および／またはＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つすべての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、ならびに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が含まれるが、これらに限定されない。

後期胚盤胞のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した多能性の「プライミング」または「準安定」状態、および初期／着床前胚盤胞の細胞塊に類似した多能性の「ナイーブ」または「グラウンド」状態の２種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態は上述のような特徴を呈するが、ナイーブまたはグラウンド状態はさらに、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の事前不活性化または再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性および生存の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な低減、（ｉｖ）発生制御遺伝子プロモーターへのＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低減、および（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの発現の低減を呈する。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、サイレンシングされるか、または結果として得られる多能性細胞から除去される細胞再プログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有するとみなされる。標準的な多能性細胞培養条件下では、そのような細胞は、グラウンド状態の特徴が観察される外因性導入遺伝子の発現が維持されない限り、プライミング状態のままであり、グラウンド状態の特徴が観察される。

本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特色を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、核と細胞質の比率が高く、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、または他の飼育動物を指す。

「多能性因子」または「再プログラミング因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせてのいずれかで、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子および小分子再プログラミング剤が含まれる。

「培養」または「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、成長、および／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（それぞれの場合において単数の「培地」）、「補充成分」および「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。

「培養する」または「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）細胞培養皿またはフラスコ内で、組織外または体外で細胞を維持、増殖（成長）、および／または分化させることを指す。「培養」または「維持」は、細胞を増殖および／または維持するのに役立つ栄養素、ホルモン、および／または他の因子の供給源として培養培地を利用し得る。

本明細書で使用される場合、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に現れ、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、ならびに他の支持組織および結合組織を含む様々な特殊化した細胞型を生じさせる３つの胚葉のうちの１つを指す。

本明細書で使用される場合、「二次造血内皮細胞」（ＨＥ）または「多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞」（ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞および前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発達は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て二次造血内皮細胞および造血前駆細胞へと順次進行する。

「造血幹細胞および前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、または「造血前駆細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、さらなる造血分化が可能であり、多分化能造血幹細胞（血球芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ系前駆細胞を含む細胞を指す。造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）は、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血液細胞型を生じさせる多分化能幹細胞である。本明細書で使用される「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、およびＢ系統細胞を含む成熟骨髄およびリンパ系細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞には、原始赤血球、巨核球、およびマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットも含まれる。

本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は、交換可能に使用され、胸腺で成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の特定ならびにＭＨＣクラスＩで制限された様式において他の免疫細胞の活性化および非活性化を含む、免疫系において様々な役割を有する主要な型の白血球を指す。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、もしくは培養されたＴ細胞株、例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞などの任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）などを含むが、これらに限定されない、任意の発生段階のものであり得る。追加の型のヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。追加の型のメモリーＴ細胞には、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの遺伝子操作されたＴ細胞を指し得る。Ｔ細胞またはＴ細胞様エフェクター細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化され得る。Ｔ細胞様派生エフェクター細胞は、いくつかの点でＴ細胞系統を有し得るが、同時に、一次Ｔ細胞には存在しない１つまたは複数の機能的特性を有する。

「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、表面にＣＤ４を発現し、細胞媒介性免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは、刺激後の分泌プロファイルを特徴とし、これには、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、およびＩＬ１０などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」は、最初はＴリンパ球上の分化抗原として定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見られる。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ制限免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、それらはヘルパー／インデューサーサブセットを定義する。

「ＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、表面にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限され、細胞毒性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞、ならびに細胞毒性およびサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ制限相互作用における関連認識要素である。

本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用される場合、「適応ＮＫ細胞」および「メモリーＮＫ細胞」という用語は、交換可能であり、表現型的にＣＤ３－およびＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、ならびに任意選択的にＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、

、およびＥＡＴ－２のうちの１つ以上の表現に欠くＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化および阻害性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、ならびに／またはＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、暗いまたは明るい発現であり得る。ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞様エフェクター細胞は、幹細胞または前駆細胞から分化され得る。ＮＫ細胞様派生エフェクター細胞は、いくつかの点でＮＫ細胞系統を有し得るが、同時に、一次ＮＫ細胞には存在しない１つ以上の機能的特性を有する。

本明細書で使用される場合、「ＮＫＴ細胞」または「ナチュラルキラーＴ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的なＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つの型のＮＫＴ細胞が認識されている。インバリアントまたはＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリー、つまり、限られたスペクトルのβ鎖（ヒトではＶβ１１）に関連する標準的なα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的または非インバリアントＩＩ型ＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の２番目の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を示す。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫療法に好適であると考えられる。適応またはインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、以下のマーカー：ＴＣＲ Ｖａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、およびＣＤ５６のうちの少なくとも１つ以上の発現により特定され得る。

本明細書で使用される場合、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境で見出される少なくとも１つの構成要素を実質的に含まない細胞または細胞の集団を指す。この用語には、自然環境で見出される一部またはすべての構成要素から取り出された、例えば、組織や生検試料から単離された細胞が含まれる。この用語はまた、細胞が天然に存在しない環境で見出される、例えば、細胞培養または細胞懸濁液から単離されるため、少なくとも１つ、いくつか、またはすべての構成要素から取り出される細胞を含む。したがって、単離された細胞は、自然界に見られる場合、または天然に存在しない環境で成長するか、保存されるか、もしくは生存する場合、他の物質、細胞、または細胞集団を含む少なくとも１つの構成要素から部分的または完全に分離される。単離された細胞の特定の例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、および天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞またはその集団を環境中の他の物質または細胞から分離することから、または環境から１つ以上の他の細胞集団もしくは亜集団を取り除くことから得ることができる。

本明細書で使用される場合、「精製する」などの用語は、純度を高めることを指す。例えば、純度を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％に増加させることができる。

本明細書で使用される場合、「コード化」という用語は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖との両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。

「構築物」は、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、外来遺伝子材料の標的細胞への送達または移動を指向することができる任意の核酸構築物を指し、標的細胞で複製および／または発現することができる。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状または環状分子であり得る。ベクターは、組み込みまたは非組み込みであり得る。ベクターの主な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

「組み込み」とは、構築物の１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化された組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位または「組み込み部位」で細胞の染色体またはミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用される場合、「組み込み」という用語はさらに、組み込み部位での内因性配列またはヌクレオチドの欠失の有無にかかわらず、構築物の１つ以上の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を伴うプロセスを指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、欠失される内因性配列またはヌクレオチドを１つ以上の挿入されたヌクレオチドに置き換えることをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照される活性が宿主細胞に導入されるか、または宿主細胞に非天然であることを意味することを意図する。分子は、例えば、コード化核酸を宿主の遺伝子材料に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、またはプラスミドなどの非染色体遺伝子材料として導入され得る。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、コード化核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照される分子または活性を指す。同様に、コード化核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード化核酸の発現を指す。

本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドには、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）からのＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、自然界に見られるポリペプチド）またはそれらの断片；バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）またはその断片；操作されたポリペプチドまたはペプチド断片、治療用ペプチドまたはポリペプチド、撮像マーカー、選択可能なマーカーなどをコードし得る。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンに対してウラシル（Ｕ）で構成される。ポリヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、これらの用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称される短い鎖と、当技術分野で一般にポリペプチドまたはタンパク質と称されるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）、コード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で制御配列に作動可能に連結され得る。

本明細書で使用される場合、「遺伝子インプリント」という用語は、供給源細胞またはｉＰＳＣにおける優先的な治療属性に寄与し、供給源細胞由来のｉＰＳＣおよび／またはｉＰＳＣ由来の造血系細胞において保持可能な遺伝的または後成的情報を指す。本明細書で使用される場合、「供給源細胞」は、再プログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、供給源細胞由来のｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型にさらに分化され得る。供給源細胞由来のｉＰＳＣ、およびそれから分化した細胞は、時折、状況に応じて、まとめて「由来」または「派生」細胞と呼ばれる。例えば、本明細書全体を通して使用される派生エフェクター細胞、または派生ＮＫ系統細胞もしくは派生Ｔ系統細胞は、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然源から得られたそれらの対応する一次細胞と比較して、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性を付与する遺伝子インプリントは、ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的な選択された供給源細胞を再プログラミングすることによって、またはゲノム編集を使用して、遺伝子改変されたモダリティをｉＰＳＣに導入することによってのいずれかでｉＰＳＣに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、または治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞の派生細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的またはエピジェネティック改変を含み得る。ドナー特異的、疾患特異的、または治療応答特異的供給源細胞は、ｉＰＳＣおよび由来造血系統細胞において保持可能な遺伝子インプリントを含み得、これらの遺伝子インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞またはインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からの予め配置された単一特異性ＴＣＲ；追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーの高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点変異のためのホモ接合性；所定のＨＬＡ要件、すなわち、集団が増加したハプロタイプを呈する選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性には、由来細胞の改善された生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御および調節、生存、ならびに細胞毒性が含まれる。優先的な治療属性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性にも関係している可能性がある。

本明細書で使用される場合、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な、未改変の、および／または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強、改善、および／または増大された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、免疫応答の制御および調節、生存、ならびに細胞毒性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性は、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、化学療法などの治療に対する耐性よっても示される。

本明細書で使用される場合、「エンゲージャー」という用語は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、および腫瘍細胞間の連結を形成し、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、もしくは多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と適合性のあるユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞毒性応答を誘発または開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体は操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然の受容体および細胞型とは関係なく、エフェクター細胞と特定の標的細胞、例えば、腫瘍細胞との間の二重または多重特異性抗体の結合を容易にする。このアプローチを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、次いでそのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が、細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現および活性化され得、ユニバーサル受容体を発現するすべてのエフェクター細胞が、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャーに結合または連結され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーは、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するために使用される。したがって、１つまたは複数のエフェクター細胞型を使用して、１つの特定の型の腫瘍細胞を殺滅する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺滅する場合もある。表面トリガー受容体は、一般に、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的なエピトープ結合領域とを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端で表面トリガー受容体のエピトープ結合領域に特異的であり、もう一方の端で腫瘍抗原に特異的である。

本明細書で使用される場合、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性またはさもなければ有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。場合によっては、安全スイッチタンパク質の発現は、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をそのゲノムに恒久的に組み込んだ、移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処するために条件付きで制御される。この条件付き制御は可変であってよく、小分子を介した翻訳後活性化ならびに組織特異的および／または一時的な転写制御による制御が含まれ得る。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、成長停止、転写および転写後の遺伝子制御、ならびに／または抗体を介した枯渇を媒介し得る。場合によっては、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシスおよび／または細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変されたＥＧＦＲ、およびそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これに限定されない。この戦略では、有害事象が発生した場合に投与されるプロドラッグは、自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺滅する。

本明細書で使用される場合、「薬学的に活性なタンパク質またはペプチド」という用語は、生物に対して生物学的および／または薬学的効果を達成することができるタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対して治癒的、根治的、または姑息的特性を有し、疾患の重症度を回復させる、緩和する、軽減する、逆転させる、または和らげるために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防的特性を有し、疾患の発症を予防するため、またはそれが出現したときにそのような疾患もしくは病的状態の重症度を和らげるために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、全タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質もしくはペプチドの薬学的に活性な類似体、またはタンパク質もしくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的または相乗的に作用して治療上の利益を提供する複数のタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質またはペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体もしくはその断片、成長因子、および／またはサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調節する、それに関与する、阻害する、活性化する、低減する、または増加させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、最終的に細胞内の生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形態での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当技術分野で周知であり、Ｇタンパク質結合受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、およびＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）独特のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連する場合、抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体または二重特異性エンゲージャーに関連する場合、エンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換された細胞の標的化、ｉｖ）がん幹細胞の標的化、およびｖ）特定の抗原または表面分子の不在下での他の標的化戦略が含まれるがこれらに限定されない抗原および／またはエピトープ特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「特異的」または「特異性」という用語は、非特異的または非選択的結合とは対照的に、分子、例えば、受容体またはエンゲージャーが標的分子に選択的に結合する能力を指すために使用され得る。

本明細書で使用される場合、「養子細胞療法」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子改変されているか否かにかかわらず、注入前にエクスビボで拡大されたＴ細胞またはＢ細胞として特定される、自家または同種異系リンパ球の当該注入に関連する細胞ベースの免疫療法を指す。

本明細書で使用される場合、「治療的に十分な量」は、その意味の範囲内で、非毒性であるが、それが言及する特定の治療および／または薬学的組成物の十分なおよび／または有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要な正確な量は、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、ならびに状態の段階および重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療される対象の疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を回復させる、低減する、および／または改善するのに十分である、および／または効果的である。

多能性幹細胞の分化には、培養培地中の刺激剤または細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要である。最も一般的な戦略は、系統特異的分化を開始するための一般的かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」は、三次元領域内に多数の系統を生じさせるため、胚発生を模倣することが示されている三次元クラスターである。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発する凝集した多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢに発達し、その時点で（典型的には数日から数週間）、さらに処理されて分化を続ける。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を三次元の多層細胞クラスター内で互いに近接させることによって開始され、典型的には、これは多能性細胞を液滴に沈降させ、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させるか、または機械的撹拌などによるものを含む、いくつかの方法のうちの１つによって達成される。多能性培養維持培地中で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの発生を促進するために、多能性幹細胞凝集体はさらなる分化の手掛かりが必要である。したがって、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統に向けて誘発の手掛かりを提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内で中程度の増殖を伴う分化した細胞集団（外胚葉、中胚葉、および内胚葉胚葉）の生成をもたらす。細胞分化を促進することが証明されているが、ＥＢは、三次元構造の細胞が環境からの分化の手掛かりに一貫して曝されていないため、異なる分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、ＥＢは作製および維持が困難である。さらに、ＥＢを介した細胞分化は、適度な細胞拡大を伴い、これも分化効率の低下に寄与する。

対照的に、「ＥＢ形成」とは異なる「凝集体形成」は、多能性幹細胞由来細胞の集団を拡大するために使用することができる。例えば、凝集体ベースの多能性幹細胞の拡大中に、増殖および多能性を維持するための培養培地が選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増加させるために、日常的に機械的または酵素的に小さな凝集体に解離され得る。ＥＢ培養とは異なり、維持培養下の凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するためにさらなる分化の手掛かりを必要とする。

本明細書で使用される場合、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターによる分化とは異なる分化方法、すなわち「ＥＢ形成」を指す用語である。本明細書に開示される他の利点の中でも、単層分化は、分化開始のためのＥＢ形成の必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つすべての胚葉分化と比較して最小限であるとみなされる。

本明細書で使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞から、または表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法によって動物または組織から解離され得る。代替的に、インビトロで凝集する細胞は、クラスターの懸濁液、単一細胞、または単一細胞とクラスターとの混合物への解離などによって、酵素的または機械的に互いに解離することができる。さらに別の代替の実施形態では、付着細胞は、培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基質（例えば、培養表面）との細胞相互作用の破壊、または細胞間のＥＣＭの破壊を伴い得る。

本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、フィーダー細胞が、第２の細胞型を支持するための刺激、成長因子、および栄養素を提供するため、第２の型の細胞が成長、拡大、または分化することができる環境を提供するために第２の型の細胞と共培養される１つの型の細胞を説明する用語である。フィーダー細胞は、任意選択的に、それらが支持する細胞とは異なる種からである。例えば、幹細胞を含むある特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞または形質転換された白血病細胞がナチュラルキラー細胞の拡大および成熟を支持する。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養するときに、それらが支持している細胞よりも成長するのを防ぐために、照射またはマイトマイシンなどの有糸分裂剤アンタゴニストで処理することによって不活化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病細胞を含み得る。前述のことを制限することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）であり得る。一般に、様々なフィーダー細胞を部分的に使用して、多能性を維持し、ある特定の系統への分化を指向し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化された細胞型への成熟を促進することができる。

本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境は、フィーダー細胞または間質細胞を本質的に含まない、および／またはフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない培養条件、細胞培養物、または培養培地などの環境を指す。「予め条件付けされた」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも１日などの期間培養された後に採取された培地を指す。予め条件付けされた培地には、培地で培養されたフィーダー細胞によって分泌される成長因子およびサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含む。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞または間質細胞の両方を含まず、またフィーダー細胞の培養によって予め条件付けされていない。

ｉＰＳＣおよびそれから分化した由来非多能性細胞のゲノム編集もしくは改変、または非多能性細胞およびそれから再プログラミングされた由来ｉＰＳＣのゲノム編集または改変の文脈で使用される場合、「機能的」は、（１）直接的なゲノム編集もしくは改変により、または最初にゲノム操作される開始細胞からの分化もしくはその再プログラミングを介した「伝達」により達成される、遺伝子レベルでの良好なノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、トランスジェニックもしくは制御された遺伝子発現、例えば、所望の細胞の発達段階での誘導性もしくは一時的な発現、あるいは（２）（ｉ）直接的なゲノム編集により当該細胞において得られた遺伝子発現の改変、（ｉｉ）最初にゲノム操作される開始細胞からの分化もしくはその再プログラミングを介した「伝達」により当該細胞で維持される遺伝子発現の改変、（ｉｉｉ）当該細胞の初期の発生段階でのみ現れる、または分化または再プログラミングを介して当該細胞を生じさせる開始細胞でのみ現れる遺伝子発現の改変の結果としての当該細胞における下流の遺伝子制御、または（ｉｖ）最初に、ｉＰＳＣ、前駆細胞、もしくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集もしくは改変に由来する、成熟細胞産物内に提示される、増強されたもしくは新たに獲得された細胞機能もしくは属性による、細胞レベルでの良好な細胞機能／特性の除去、追加、または改変を指す。

ＨＬＡクラスＩ欠損、ＨＬＡクラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体および／またはＨＬＡクラスＩＩのヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現が欠如しているか、またはもはや維持されていないか、またはレベルの減少もしくは低減が他の細胞または合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低いようなレベルの低減を有するいずれかの細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化の可能性、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリンまたはパラクリン）、走化性、ならびに細胞毒性に関連するがこれらに限定されないタンパク質、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－ＥおよびＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ζ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１を発現する遺伝子を導入することによってさらに改変されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。

ＦｃＲと略される「Ｆｃ受容体」は、それらが認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体であるＩｇＧに結合するものは、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞）および各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のいくつかのメンバーが含まれ、これらは、分子構造が異なるため抗体親和性が異なる。

ＣＦｃＲと略される「キメラＦｃ受容体」は、天然の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、または非天然の膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を記載するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインの一方または両方が非天然であることに加えて、１つ以上の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発により細胞活性化、拡大、および機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、または抗体のＦｃ領域、またはエンゲージャーもしくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的化された細胞を近接させるかどうかに関係なく細胞を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する、細胞内領域内の選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって生成される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性をさらに改善するために、ＣＤ６４の細胞外ドメインまたはＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインを伴うＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解切断部位が排除されるか、または受容体の細胞外ドメインが切断不可能であるように置き換えられる、すなわち、シェディングの影響を受けず、それにより、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが得られる。

ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームを有することが特定されている。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合して、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を容易にする。本明細書で使用される場合、「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可能なＣＤ１６」、または「高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）」は、ＣＤ１６の天然または非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６ＶおよびＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントである。膜近位領域（１８９～２１２位）における切断部位（１９５～１９８位）が改変または排除されているＣＤ１６バリアントは、シェディングを受けない。切断部位および膜近位領域は、ＷＯ２０１５／１４８９２６に詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６ Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の設計された切断不可能なバージョンである。Ｆ１５８ＶおよびＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは、親和性が高く、切断不可能である。別の例示的な高親和性で切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４外部ドメインの３つのエキソンのうちの１つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。

Ｉ．増強された特性を有する養子細胞療法に有用な細胞および組成物
本明細書で提供されるのは、派生細胞の治療特性を増強しながら、ｉＰＳＣの分化能およびｉＰＳＣおよびその派生細胞の細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンｉＰＳＣの調節回路を体系的に操作する戦略である。派生細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム工学を通じてｉＰＳＣレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。本発明以前は、１つ以上の提供された遺伝子編集を含む改変されたｉＰＳＣが、細胞発生に入る能力、および／または調節された活性を保持しながら機能的分化細胞を成熟および生成する能力を依然として有するかどうかは不明であった。ｉＰＳＣからの指向された細胞分化中の予期せぬ失敗は、発生段階特異的遺伝子発現またはその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、ならびに細胞の表現型および／または機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない態様に起因している。本出願は、本明細書で提供される１つ以上の選択されたゲノム改変がｉＰＳＣ分化能に悪影響を及ぼさないこと、ならびに操作されたｉＰＳＣから派生する機能エフェクター細胞が、ｉＰＳＣ分化後にエフェクター細胞に保持される、個々のまたは組み合わせたゲノム改変に起因する増強および／または獲得した治療特性を有することを示した。

１．新規エンドドメインを有するＣＡＲ
実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインを含む外部ドメインと、１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインとを一般に含む融合タンパク質である。実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびＣＡＲを含むように操作されたｉＰＳＣから分化した派生エフェクター細胞で発現および機能するように設計されている。実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ｉＰＳＣ分化を妨害しないように、および／またはそれが所望のエフェクター細胞型に向けられたｉＰＳＣの分化を促進するように設計されている。実施形態では、ＣＡＲは、エフェクター細胞増殖、持続性、生存、細胞毒性、アロ拒絶反応に対する耐性、腫瘍浸透、遊走、バイスタンダー免疫細胞を活性化および／または動員する能力、ならびに／または腫瘍の抑制を克服する能力を増強する。実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲはまた、細胞株細胞および初代供給源（一次細胞）、すなわち、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然源からの細胞においても直接発現され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、当該ＣＡＲを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞を活性化するのに好適である。ある特定の実施形態では、当該Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来し、派生Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞毒性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、当該ＮＫ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。ある特定の実施形態では、当該ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、Ｔ細胞または他の細胞型にも適している。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、Ｔ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫ細胞または他の細胞型にも適している。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫＴ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞特異的シグナル伝達構成要素を含むＣＡＲは、ＮＫもしくはＴ細胞、または他の細胞型にも適している。

実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、少なくともエクトドメインと、膜貫通ドメインと、エンドドメインと、を含む。ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＡＲを発現する細胞の増殖および機能に影響を及ぼし、抗原結合時にＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化する少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲエンドドメインのいくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激ドメイン（しばしば追加のシグナル伝達ドメインとも呼ばれる）が、細胞の寿命、記憶分化、および代謝特性に影響を及ぼすためにさらに含まれる。ここで、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に特異的なシグナル伝達タンパク質は、ＣＡＲ融合タンパク質の構成要素、例えば、膜貫通ドメインおよびＣＡＲのエンドドメインに含まれる１つ以上のシグナル伝達ドメインを供給するために使用される。ＣＡＲ設計に適している例示的なシグナル伝達タンパク質には、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、およびＣＤ８が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の膜貫通および細胞質配列を含む例示的なシグナル伝達タンパク質の説明を、以下に、さらに表１Ａに提供する。

２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）であるＣＤ４８の受容体である。リガンドが結合すると、２Ｂ４は、多種多様な免疫細胞の活性化および分化を調節するため、自然免疫応答および適応免疫応答の両方の調節および相互接続に関与する。活性化ＮＫ細胞受容体として作用する２Ｂ４は、ＮＫ細胞の細胞毒性、ＩＦＮ－γの産生、および顆粒エキソサイトーシスを刺激する。ＮＫ細胞の最適な増殖および活性化は、隣接するＮＫ細胞で発現するＣＤ４８と２Ｂ４の関与に依存しているようである。２Ｂ４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の調節にも関与している。活性化Ｔ細胞での２Ｂ４の発現およびＣＤ４８へのその結合は、隣接するＴ細胞に共刺激のような機能を提供する。さらに、２Ｂ４は、白血球遊走に関与している。

４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）は、ＴＮＦＳＦ９／４－１ＢＢＬの受容体であり、腫瘍壊死因子を介したシグナル伝達経路を通してＴ細胞の活性化に関与している。

ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）は、ＩｇＧのＦｃ領域の受容体である。それは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）およびその他の抗体依存性応答を媒介し、免疫応答の調節に関与している。

ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）は、リンパ球機能関連抗原ＣＤ５８（ＬＦＡ－３）およびＣＤ４８／ＢＣＭ１と相互作用して、Ｔ細胞と他の細胞型との間の接着を媒介する。ＣＤ２の細胞質ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こすシグナル伝達機能に関与している。ＣＤ２は、白血球遊走、ＮＫ細胞の活性化、Ｔ細胞の分化、ならびにＩＦＮ－γおよびＩＬ８分泌の調節にも関与している。

ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路に関与し、Ｔ細胞の活性化および共刺激、細胞増殖の誘導、サイトカイン産生、およびＴ細胞の生存の促進に影響を及ぼす。ＣＤ２８はまた、制御性Ｔ細胞の分化を調節し、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションおよびＣＤ４０Ｌ共刺激と組み合わせてＴ細胞におけるＩＬ４およびＩＬ１０の産生を増強する。

ＣＤ２８Ｈ（膜貫通および免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）は、免疫応答、細胞間相互作用、細胞遊走、および血管新生において役割を果たす。ＨＨＬＡ２との相互作用を通じて、ＣＤ２８Ｈは、ＴＣＲ媒介性活性化の状況においてＴ細胞を共刺激する。さらに、ＣＤ２８Ｈは、ＡＫＴ依存性シグナル伝達カスケードを介してＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を増強する。

ＣＤ３ζ（またはＣＤ３Ｚ；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）は、適応免疫応答に不可欠な役割を果たすＴリンパ球細胞表面に提示されるＴＣＲ－ＣＤ３複合体の一部である。抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を活性化すると、ＴＣＲ媒介性シグナルがＣＤ３鎖ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、およびＣＤ３Ｚによって細胞膜を越えて伝達される。すべてのＣＤ３鎖は、細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。ＴＣＲが関与すると、これらのモチーフは、リン酸化され、下流のシグナル伝達経路の活性化につながる。ＣＤ３Ｚは、胸腺内Ｔ細胞の分化に重要な役割を果たす。

ＤＡＰ１０（造血細胞シグナルトランスデューサー）は、ＫＬＲＫ１と関連して、リンパ系および骨髄性細胞で活性化受容体ＫＬＲＫ１－ＨＣＳＴを形成する膜貫通アダプタータンパク質である。ＫＬＲＫ１－ＨＣＳＴ受容体は、腫瘍に対する免疫学的監視において役割を果たし、通常、細胞表面リガンド、例えば、ＭＨＣクラスＩ鎖関連ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ、ならびにＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）を発現する腫瘍細胞の細胞崩壊に必要であり、これらのリガンドがウイルス感染および腫瘍の形質転換などの応力条件および病的状態によって上方調節されている。ＮＫ細胞では、ＫＬＲＫ１－ＨＣＳＴシグナル伝達は、細胞毒性を直接誘導し、サイトカイン産生を増強する。Ｔ細胞では、それは、ＴＣＲ誘導シグナルの共刺激を提供する。

ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）は、様々な免疫細胞の表面に見られる受容体の活性化に関連するアダプタータンパク質であり、受容体によるリガンド結合後にシグナル伝達および細胞活性化を媒介する。ＤＡＰ１２は、ＫＩＲ２ＤＳ２およびＫＬＲＤ１／ＫＬＲＣ２ヘテロ二量体などのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体と関連しており、ＮＫ細胞の活性化を媒介する。ＤＡＰ１２はまた、ＮＫ細胞受容体ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、およびＫＩＲ２ＤＳ４の輸送および細胞表面発現を増強し、細胞表面でのそれらの安定性を確保する。さらに、ＤＡＰ１２は、Ｂ細胞の増殖を負に調節する。

ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）は、免疫応答、細胞間接着、リンパ球シグナル伝達、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞によって媒介される細胞毒性およびリンホカイン分泌に関与している。ＤＮＡＭ１はまた、Ｔ細胞受容体シグナル伝達も調節し、ＩＬ２、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３、およびＩＦＮγのものを含むＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を刺激する。

ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）は、様々な免疫受容体からの活性化シグナルを伝達するアダプタータンパク質である。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、免疫グロブリン媒介免疫応答、自然免疫応答、白血球遊走、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＴＮＦ、およびＴ細胞分化の正の調節を介した抗原処理および外因性ペプチド抗原の提示に関与している。

ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）は、ＩＬ２１を媒介したシグナル伝達経路に関与し、ナチュラルキラー細胞の活性化の役割を果たす。

ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）は、インターロイキン２受容体のベータサブユニットであり、ＩＬ１５ＲＡと関連しており、受容体を媒介したエンドサイトーシスに関与し、ＩＬ２のシグナルを形質導入する。ＩＬ－２Ｒβは、アポトーシスプロセスの負の調節を通じて細胞の持続性に影響を及ぼし得る。

ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）は、様々なインターロイキンの受容体に共通のサブユニットであり、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９を媒介したシグナル伝達経路に関与している。

ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）は、インターロイキン７の受容体であり、ＩＬ７媒介性シグナル伝達経路、細胞形態形成、Ｔ細胞分化、細胞数恒常性、細胞増殖、免疫応答、および免疫グロブリン産生に関与している。

ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）は、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の受容体である。ＫＩＲ２ＤＳ２は、ＮＫ細胞の活性を阻害せず、自然免疫応答および免疫応答の調節に関与している。

ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－ＤタイプＩＩ内在性膜タンパク質）は、自己腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の表面に提示される様々な細胞ストレス誘導性リガンドに結合すると、免疫学的監視に関与する活性化および共刺激受容体として機能を果たす。例えば、ＮＫＧ２Ｄは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３（ＵＬＢＰ２＞ＵＬＢＰ１＞ＵＬＢＰ３）、およびＵＬＢＰ４を含むＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質の様々なサブファミリーに属するリガンドに結合する。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞を活性化し、活性化キラー（ＮＫ）細胞に対して刺激性および共刺激性の両方の自然免疫応答を提供し、細胞毒性活性をもたらす。ＮＫＧ２Ｄは、Ｔ細胞の活性化を増幅することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞を媒介した適応免疫応答においてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の共刺激受容体として機能する。ＮＫＧ２Ｄは、リガンド発現腫瘍細胞のパーフォリン媒介性の排出を刺激する。ＮＫＧ２Ｄはまた、カルシウム流入を伴うシグナル伝達に関与し、ＴＮＦ－α発現を最高潮に達し、ＮＫ細胞を媒介した骨髄移植片拒絶反応に関与している。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞の細胞分化および生存においても調節的な役割を果たし得る。

ＮＫｐ３０（天然細胞毒性誘発受容体３）は、ナチュラルキラー細胞の細胞膜受容体であり、ＢＡＧ６およびＮＣＲ３ＬＧ１を含む細胞外リガンドの結合により活性化される。ＮＫｐ３０は、細胞認識、免疫応答、および免疫応答の調節に関与している。さらに、ＮＫｐ３０は、腫瘍細胞を含む隣接細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を刺激し、これらのリガンドを産生する。例えば、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を制御する。

ＮＫｐ４４（天然細胞毒性誘発受容体２）およびＮＫｐ４６（天然細胞毒性誘発受容体１）は、細胞毒性を活性化する受容体であり、腫瘍細胞の溶解を媒介する活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の効率の向上に貢献し得る。ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６はどちらも、細胞防御応答、自然免疫応答、およびそれらの調節に関与している。

ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーの自己リガンド受容体である。ＳＬＡＭ受容体は、多種多様な免疫細胞の活性化を調節し、その分化に機能するため、自然免疫応答および適応免疫応答の両方の調節および相互接続に関与する。ＳＬＡＭ受容体の活性は、小さな細胞質アダプタータンパク質、ＳＨ２Ｄ１Ａ／ＳＡＰ、および／またはＳＨ２Ｄ１Ｂ／ＥＡＴ－２の有無により制御される。ＳＬＡＭ受容体は、リン酸化ＳＨ２Ｄ１Ｂに依存する機構により、ＮＫ細胞の活性化および細胞毒性を正に調節する。ＳＬＡＭ受容体はまた、細胞接着にも関与している。

ＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）は、免疫応答に不可欠な役割を果たし、外部および内部の両方の攻撃に対する応答で複数の機能を果たす内在性膜糖タンパク質である。Ｔ細胞では、ＣＤ８は、主にＭＨＣクラスＩ分子：ペプチド複合体のコレセプターとして機能する。ＮＫ細胞では、細胞表面にＣＤ８Ａホモ二量体の存在は、複数の標的細胞の接合および溶解を可能にする生存機構を提供する。ＣＤ８Ａホモ二量体分子はまた、活性化リンパ球の生存および記憶ＣＤ８Ｔ細胞への分化を促進する。

提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲのエンドドメインは、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、またはＣＤ８の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を有する少なくとも第１のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、またはＣＤ８の細胞質ドメインの一部のみ含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲシグナル伝達ドメインのために選択される細胞質ドメインの一部は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、ＹｘｘＭモチーフ、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフ、ＦｃＲγ、ヘミＩＴＡＭ、および／またはＩＴＴ様モチーフに対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列である。

提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲのエンドドメインは、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、ＣＤ３ζもしくはＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＳ１、またはＣＤ８の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む第２のシグナル伝達ドメインをさらに含み、第２のシグナル伝達ドメインは、第１のシグナル伝達ドメインとは異なる。

提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、第１および第２のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲのエンドドメインは、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、ＣＤ３ζもしくはＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＳ１、またはＣＤ８の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む第３のシグナル伝達ドメインをさらに含み、第３のシグナル伝達ドメインは、第１および第２のシグナル伝達ドメインとは異なる。

１つのシグナル伝達ドメインのみからなるエンドドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、当該エンドドメインは、ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８Ｈ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＤＡＰ１２、またはＤＡＰ１０を含むが、これらに限定されない、タンパク質の細胞質ドメインもしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む。

２つの異なるシグナル伝達ドメインからなるエンドドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、当該エンドドメインは、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、またはＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、またはＮＫｐ４６－２Ｂ４を含むが、これらに限定されない、形態の融合細胞質ドメインまたはその一部を含む。

３つの異なるシグナル伝達ドメインからなるエンドドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、当該エンドドメインは、２Ｂ４－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＩＬ２１Ｒ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－４１ＢＢ－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０、またはＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸを含むが、これらに限定されない、形態の融合細胞質ドメインまたはその一部を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、またはＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域の全長もしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、それぞれ、（ａ）配列番号１～２０、５３、および５５によって表される、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は（ｂ）ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２８Ｈ若しくはＤＮＡＭ１の膜貫通領域の全長もしくはその一部に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよびその直接連結されたシグナル伝達ドメインは、同じタンパク質に由来する。ＣＡＲのいくつかの他の実施形態では、膜貫通ドメインおよび直接連結されたシグナル伝達ドメインは、異なるタンパク質に由来する。

表１Ｂは、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン（ＴＭ－（エンドドメイン）と表示）を含むＣＡＲ構築物の非限定的な例を提供する。一般に、例示されたＣＡＲ構築物は、各々、膜貫通ドメインと、１つ以上のシグナル伝達タンパク質の細胞質領域に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインと、を含む。実施形態では、ＣＡＲエンドドメインに含まれる１つ以上のシグナル伝達ドメインは、ＴＭが由来するのと同じまたは異なるタンパク質に由来する。表１Ｂに示すように、ＣＡＲの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を提示する部分には下線が引かれ、エンドドメインに含まれるドメインは、括弧「（）」で示され、ＴＭおよびシグナル伝達ドメインの各々が、ドメイン配列が由来するシグナル伝達タンパク質の名称により表される。実施形態では、各ＴＭまたはシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、指定されたシグナル伝達タンパク質の対応する膜貫通領域または細胞質領域の全長またはその一部に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性であり得る。本明細書で提供される膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含む例示的なＣＡＲ構築物には、
［配列表２］

が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含む上記の例示的なＣＡＲ構築物の各々は、表１Ｂの配列番号５７～７４の各々によって表される配列に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の同一性のアミノ酸配列を含む。表１Ｂに提供されている各構築物に対する例示的な配列は、配列の左側の図の対応する領域のフォーマット（すなわち、下線、通常、または太字のテキスト）と一致するようにフォーマット済みのテキストを有する。表１Ｂの例示的な構築物のほとんどでは、ＴＭが、第１の配列領域であるが、構築物は、ＴＭに先行する細胞外ドメインを含み得（例えば、構築物６を参照）、ＴＭと同じまたは異なるタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲエンドドメインに含まれる２つ以上のシグナル伝達ドメインは、スペーサーまたはリンカーなどの１つ以上の追加の配列によって分離され得る。

上記に提供されるＴＭ－（エンドドメイン）のうちのいずれかを含むＣＡＲは、ＣＡＲのエクトドメインに含まれる抗原結合ドメインによって決定される少なくとも１つの抗原を特異的に標的とするように構築され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、疾患または病原体に関連する抗原を特異的に標的とし得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原を特異的に標的とし得、腫瘍は、液性または固形腫瘍であり得る。ＣＡＲのエクトドメインは、抗原特異的結合のための１つ以上の抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチドもしくはリーダー配列、および／またはスペーサーをさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、提供されたＣＡＲのエクトドメインは、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはその抗体断片を含む抗原認識ドメインを含む。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、抗原結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）_２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられる。

遺伝子操作されたｉＰＳＣおよび派生エフェクター細胞に含まれるＣＡＲによって標的とされ得る抗原の非限定的な例としては、ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、メラノーマ抗原ファミリーＡ １（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および当該技術分野で既知の様々な病原体抗原が挙げられる。病原体の非限定的な例としては、病気を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌、寄生虫、および原生動物が挙げられる。

いくつかの実施形態では、提供されるＣＡＲのエクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含む。シグナルペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを小胞体（ＥＲ）に誘導し、適切なグリコシル化およびプラムサ膜への固定を行う。一般に、分泌タンパク質をＥＲ経路に標的化する任意の真核生物シグナル配列を使用することができる。例示的な適切なシグナルペプチドには、ＩＬ－２シグナル配列、カッパリーダー配列、ＣＤ８αリーダー配列、アルブミンシグナル配列、プロラクチンシグナル配列、およびＩｇＧシグナルペプチド、およびＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、提供されたＣＡＲのエクトドメインは、任意に、抗原認識ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間の柔軟性を提供するために、ヒンジ（スペーサーとも呼ばれる）領域を含み得る。いくつかの例示的かつ非限定的な実施形態では、ＣＡＲのヒンジは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＮＫＧＤ２、ＩｇＧ１、または免疫グロブリンのＣＨ_２／ＣＨ_３ドメイン、またはそれらの組み合わせなどの既知のポリペプチドのヒンジ領域に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、提供されたＣＡＲのヒンジ領域は、免疫グロブリンのＣＨ_２／ＣＨ_３ドメインに対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一性であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、提供される１つ以上のＣＡＲを含むエフェクター細胞は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、またはＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染症を治療するために使用され得る。血液悪性腫瘍の例には、急性および慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、および食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス関連障害）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の一態様は、本明細書で提供されるエンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、ｉＰＳＣおよびそれから分化した派生エフェクター細胞を提供する。当該ＣＡＲの一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的である。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ特異的である。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ特異的である。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８特異的である。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、ＨＥＲ２特異的である。他の１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＭＳＬＮ特異的である。さらに、別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＭＡ特異的である。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＥＧＦ－Ｒ２特異的である。

本発明の別の態様では、提供されるエンドドメインのうちの１つを含む第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、ｉＰＳＣおよびそれから分化した派生エフェクター細胞は、異なる抗原特異性を有する第２のＣＡＲをさらに含み得る。第２のＣＡＲのエンドドメインは、第１のＣＡＲのエンドドメインと同じであっても同じでなくてもよい。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲのエンドドメインとは異なるエンドドメインを含み、本明細書で提供されるエンドドメインのうちの１つである。いくつかの他の実施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲのエンドドメインとは異なるエンドドメインを含み、本明細書で提供されるエンドドメインのうちの１つではない。

非限定的なＣＡＲ戦略には、一対の細胞内ドメインの二量体化を介したヘテロ二量体の条件付き活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９，５８７，０２０号を参照されたい）；ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ、およびエンドドメインの相同組換えである分割ＣＡＲ（例えば、米国公開第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい）；抗原結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインにそれぞれ接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多鎖ＣＡＲ（例えば、米国公開第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）；二重特異性抗原結合ドメインを有する（例えば、米国特許第９，４４７，１９４号を参照されたい）か、または同じもしくは異なる抗原もしくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有する（例えば、米国特許第８，４０９，５７７号を参照されたい）ＣＡＲ、またはタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２を参照されたい）；誘導性ＣＡＲ（例えば、米国公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、同第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）；切り替え可能なＣＡＲ（例えば、米国公開第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）；および当技術分野で既知の任意の他の設計が含まれる。

本明細書で提供される１つ以上のＣＡＲの挿入に好適なゲノム遺伝子座には、ゲノムセーフハーバーの基準を満たす遺伝子座、および／または挿入の結果として選択された遺伝子座での遺伝子のノックダウンまたはノックアウトが望まれる遺伝子座が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ挿入のための好適なゲノム遺伝子座としては、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαまたはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴを含むが、これらに限定されない。

一実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＴＣＲ定常領域（ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）に挿入され、ＴＣＲノックアウトをもたらし、任意選択的にＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモーターの制御下に置く。ＴＣＲヌルおよび提供されるエンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣ派生細胞の１つの特定の実施形態では、当該派生細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＮＫＧ２Ａ遺伝子座またはＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入されたＣＡＲを有し、ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、任意選択的にＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｄプロモーターの制御下に置く。ＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２ＤヌルおよびＣＡＲを含むｉＰＳＣ派生細胞の１つの特定の実施形態では、当該派生細胞は、ＮＫ細胞である。さらなる別の実施形態では、ＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ３８コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ３８ノックアウトをもたらし、任意選択的にＣＡＲ発現を内因性ＣＤ３８プロモーターの制御下に置く。ＣＤ３８ヌルおよび提供されるエンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲを含む細胞の一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８に特異的である。一実施形態では、提供されるエンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５８コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ５８ノックアウトをもたらす。一実施形態では、エンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５４コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＤ５４ノックアウトをもたらす。一実施形態では、エンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＩＳ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＩＳノックアウトをもたらす。一実施形態では、エンドドメインのうちの１つを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＢＬ－Ｂ（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＣＢＬ－Ｂ）コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＣＢＬ－Ｂノックアウトをもたらす。一実施形態では、提供されるＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＳＯＣＳ２コード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＳＯＣＳ２ノックアウトをもたらす。一実施形態では、提供されるＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）コード領域に挿入されたＣＡＲを有する。別の実施形態では、提供されるＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３のうちのいずれか１つのコード領域に挿入されたＣＡＲを有し、挿入部位でのチェックポイント受容体のノックアウトまたはノックダウンをもたらす。さらなる実施形態では、提供されるＣＡＲを含むｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＴＩＧＩＴのコード領域に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＩＧＩＴノックアウトをもたらす。

本明細書でさらに詳しく説明されるように、さらに提供される実施形態は、ゲノム的に操作されたｉＰＳＣを分化することから得られた派生エフェクター細胞を含み、ｉＰＳＣおよび派生細胞は、本明細書で記載されるＣＡＲを含み、ｉＰＳＣおよび派生細胞は、ＣＤ３８ノックアウト、ＣＤ３８－ＣＡＲ、ｈｎＣＤ１６、外因性サイトカインおよび／またはそのシグナル伝達構成要素、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＨＬＡ－Ｇの過剰発現ならびにＣＤ５８およびＣＤ５４のうちの１つまたはその両方のノックアウト、ＴＣＲヌル、ＣＤ３を提示する表面、抗原特異的ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ１０／１２、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）を含むが、これらに限定されない、１つ以上の追加の改変されたモダリティをさらに含む。

２．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫およびＣＤ２０陰性Ｂ細胞悪性腫瘍を含む、リンパ系統および骨髄系統の両方に由来する複数の血液悪性腫瘍において高度に上方制御されており、がん細胞を枯渇させる抗体療法の魅力的な標的となっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導と、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性毒性）などの免疫エフェクター機構の活性化との組み合わせに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と協調する免疫エフェクター機構には、食作用（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）も含まれる場合がある。

悪性細胞上で高度に発現する以外に、ＣＤ３８は、形質細胞およびＮＫ細胞、ならびに活性化Ｔ細胞およびＢ細胞でも発現される。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４^＋幹細胞、ならびにリンパ系、赤血球、および骨髄の系統にコミットした前駆細胞で、形質細胞段階まで続く成熟の最終段階中に発現される。ＣＤ３８は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質として、ヌクレオチド代謝物の産生に関与する受容体および多機能酵素の両方として細胞機能を実行する。酵素として、ＣＤ３８は、ＮＡＤ^＋からＡＤＰ－リボースへの反応の合成および加水分解を触媒し、それにより細胞接着のプロセス（このプロセスはカルシウム依存である）に重要な小胞体およびリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーＣＡＤＰＲおよびＮＡＡＤＰを産生する。受容体として、ＣＤ３８は、ＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞におけるサイトカイン放出および細胞毒性を制御する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ^２＋フラックスを制御し、リンパ系および骨髄系細胞におけるシグナル伝達を媒介することも報告されている。

悪性腫瘍治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体を形質導入したＴ細胞を全身使用すると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞のＣＤ３８＋画分が溶解し、レシピエント免疫エフェクター細胞機能障害のため、治療応答が不完全になり、有効性が低減または排除されることが示されている。加えて、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄および末梢血の両方でＮＫ細胞の低減が観察されたが、Ｔ細胞およびＢ細胞などの他の免疫細胞型は、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。理論に制限されることなく、提供されるＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲを含むＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ＣＤ３８を介したフラトリサイドを克服し、特定の抗体および／またはＣＤ３８抗原結合ドメインによって誘導されるエフェクター細胞の枯渇または低減を回避できる。さらに、ＣＤ３８はＴ細胞またはＢ細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、ダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体を使用して、ＣＤ３８ヌルである提供される適応性同種異系エフェクター細胞のレシピエントにおいて活性化リンパ球を排除するか、またはこれらのリンパ球の活性化を抑制することができ、その結果、これらのエフェクター細胞に対する宿主リンパ球によるアロ拒絶を低減および／または防止することができ、リンパ球枯渇に使用されるＣＤ３８抗体の存在にもかかわらず、これらのエフェクター細胞の生存および持続性を増加させることができる。このように、本出願はまた、エフェクター細胞の持続性および／または生存を増強しつつ、レシピエントＴ細胞およびＢ細胞の活性化に対する、および／または活性化したレシピエントＴ細胞およびＢ細胞を排除する、ＣＤ３８特異的抗体、分泌型ＣＤ３８特異的エンゲージャーまたはＣＤ３８ ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を使用することによる同種拒絶反応の低減または防止をする戦略を提供する。

本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣにおけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。本明細書に開示されるように、提供されるＣＤ３８ヌルｉＰＳＣは、指示された分化をして、決定的なヘモジェニック内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、一般的な骨髄性前駆細胞、一般的なリンパ前駆細胞、赤血球、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、ならびに一次ＮＫ、Ｔ、および／またはＮＫＴ細胞に存在しない１つ以上の機能的特性を有する派生免疫エフェクター細胞を含むが、これらに限定されない、機能的派生エフェクター細胞を生成するために分化することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８抗体を使用してＡＤＣＣを誘導するか、またはＣＤ３８－ＣＡＲを標的化細胞殺滅に使用する場合、ＣＤ３８^－／－ｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞は当該ＣＤ３８抗体またはＣＤ３８ ＣＡＲによって排除されず、これにより、そのような治療薬の存在下および／または曝露後のｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、そのような治療薬の存在下で、および／または曝露後の、インビボでの持続性および／または生存を増加させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルエフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８ヌルｉＰＳＣおよび派生細胞は、ｈｎＣＤ１６発現、ＣＡＲ発現、サイトカイン／サイトカイン受容体発現、ＨＬＡ Ｉおよび／またはＨＬＡＩＩノックアウト、ならびに本明細書で提供される追加のモダリティを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つ以上の追加のゲノム編集を含む。

別の実施形態では、ＣＤ３８の選択された位置に本明細書で提供される１つ以上の導入遺伝子を挿入すると同時にＣＤ３８をノックアウトすることは、例えば、ＣＤ３８を標的とするノックイン／ノックアウト（ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ）構築物によって達成することができる。当該構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、ＣＤ３８遺伝子座内の位置選択的挿入のための一対のＣＤ３８標的化相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、事前に選択された標的化部位は、ＣＤ３８のエキソン内にある。本明細書で提供されるＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物は、導入遺伝子が、ＣＤ３８内因性プロモーター下または構築物に含まれる外因性プロモーター下のいずれかで発現することを可能にする。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２ＡリンカーまたはＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、およびＴａＶから派生する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」とも称される）をコードし、単一の翻訳から別個のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子および／または外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物に含まれる外因性プロモーターは、ＣＡＧ、またはＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、およびＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターであり得る。

３．ＣＤ１６ノックイン
ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）の２つのアイソフォームとして特定されている。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合して、ＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を容易にする。ＣＤ１６ｂはヒト好中球によって排他的に発現される。本明細書で使用される場合、「高親和性ＣＤ１６」、「切断不可能なＣＤ１６」、または「高親和性の切断不可能なＣＤ１６」は、様々なＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞の活性化により白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングを受ける。Ｆ１７６Ｖ（一部の出版物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれる）は、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、遺伝子操作された例示的な切断不可能なバージョンのＣＤ１６である。Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、親和性が高く、切断不可能であり、これは、ＷＯ２０１５／１４８９２６により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＣＤ１６の外部ドメインが本質的にＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体はまた、ＡＤＣＣを実施することが可能なＣＤ１６受容体の所望の高親和性および切断不可能な特色を達成することができる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換外部ドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４またはそのアイソフォームもしくは多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、およびＥＣ３エキソンのうちの１つ以上を含む。

したがって、いくつかの実施形態では、高親和性の切断不可能なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）は、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が排除されている。いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、それぞれ、ＣＤ６４エクトドメインの少なくとも一部を含む、例示的な配列の配列番号４２、４３、および４４のうちのいずれかと比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。配列番号４２、４３および４４は、配列番号４５～４７を例示することによってそれぞれコードされる。本明細書および本出願全体を通して使用される場合、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
［配列表３］

［配列表４］

［配列表５］

［配列表６］

［配列表７］

［配列表８］

したがって、本明細書で企図および記載される他の編集の中でも、高親和性の切断不可能なＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）を含むように遺伝子操作されたクローンｉＰＳＣが本明細書で提供され、遺伝子操作されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入されたｈｎＣＤ１６を含むエフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む由来エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６を含む由来エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。ｉＰＳＣまたはその派生細胞で発現する外因性ｈｎＣＤ１６は、ＡＤＣＣ抗体またはその断片だけでなく、当該ｈｎＣＤ１６のＣＤ１６またはＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーへの結合にも高い親和性を示す。二重特異性、三重特異性、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーについては、本出願で以下にさらに記載される（下を参照されたい）。このように、本出願は、以下のセクションでさらに詳述する状態、疾患、または感染症の治療における治療用途に十分な量で、派生エフェクター細胞上で発現するｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインとの高親和性結合を介して１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生エフェクター細胞またはその細胞集団を提供し、当該ｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４の、またはＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。

いくつかの他の実施形態では、ｈｎＣＤ１６の天然のＣＤ１６膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインは、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）が非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン、および／または非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生されるように、さらに改変または置き換えられる。本明細書で使用される場合、「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。ここの図では、ＣＤ１６またはそのバリアントに基づくＣＦｃＲは、ＣＤ１６に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインを有さない。いくつかの実施形態では、外因性ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ４、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然シグナル伝達ドメインを含む。ｈｎＣＤ１６の一実施形態では、提供されるキメラ受容体は、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、両方ともＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、およびＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちの１つに由来する。ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の１つの特定の実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。

上述のｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、高親和性で抗体もしくはその断片のＦｃ領域に、または二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーもしくはバインダーのＦｃ領域に結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化およびサイトカイン分泌、ならびに抗体、または腫瘍抗原結合構成要素ならびにＦｃ領域を有する当該二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性エンゲージャーもしくはバインダーによって標的とされる腫瘍細胞の殺滅を可能にする。理論に制限されることなく、ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の非天然の膜貫通、刺激および／またはシグナル伝達ドメインを通じて、または外部ドメインへのエンゲージャーの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺滅能力に寄与し、エフェクター細胞の増殖および／または増殖の可能性を増加させる。抗体およびエンゲージャーは、抗原を発現する腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を近接させることができ、これも腫瘍細胞の殺滅の増強に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーの例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、およびＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーには、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ、およびＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。

ＮＫ細胞の活性化後に細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６受容体とは異なり、派生ＮＫにおけるＣＤ１６の様々な切断不可能なバージョンは、ＣＤ１６のシェディングを回避し、一定の発現を維持する。派生ＮＫ細胞では、切断不可能なＣＤ１６は、改善された細胞機能を示すＴＮＦαおよびＣＤ１０７ａの発現を増加させる。切断不可能なＣＤ１６は、抗体依存性細胞媒介性毒性（ＡＤＣＣ）、および二重特異性、三重特異性、または多重特異性エンゲージャーの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介溶解機構である。由来ＮＫ細胞における導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性の特徴により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＮＫ細胞へのＡＤＣＣ抗体のインビトロ充填も可能となる。提供されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含み得るか、または配列番号４２、４３、もしくは４４によって例示されるようにＣＤ６４に由来する完全または部分的なエクトドメインを含み得るか、または非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。開示されるように、本出願はまた、以下のセクションで詳しく説明するように、状態、疾患、または感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生ＮＫまたはその細胞集団を提供する。

初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然／天然源）からの成熟Ｔ細胞は、ＣＤ１６を発現しない。発現された外因性の切断不可能なＣＤ１６を含むｉＰＳＣがＴ細胞の発生生物学を損なわず、外因性のＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得ＡＤＣＣ機構を介して機能を実行することができる機能的派生Ｔ細胞に分化することができることは予想外であった。派生Ｔ細胞におけるこの獲得ＡＤＣＣは、追加的に、二重標的化のためのアプローチとして、および／またはＣＡＲ－Ｔ標的化された抗原の発現低減もしくは喪失、またはＣＡＲ（キメラ抗原受容体）による認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再発する、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法でしばしば発生する抗原逃避を救済するためのアプローチとして使用できる。当該派生Ｔ細胞が外因性ＣＤ１６発現を介した獲得ＡＤＣＣを含む場合、および抗体がＣＡＲによって標的とされるものとは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用して、ＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的化された腫瘍の再発生または再発を低減または防止することができる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減および／または防止するそのような戦略は、１つ以上のＣＡＲを発現するＮＫ細胞にも同様に適用される。この抗原逃避の低減および防止戦略で使用することができる様々なＣＡＲは、本出願で記載のＣＡＲを含む。

したがって、実施形態では、本発明は、提供される少なくとも１つのＣＡＲに加えて、外因性ＣＤ１６を含む派生Ｔ細胞を提供する。さらに提供される実施形態では、本明細書で得された派生Ｔ細胞は、ｈｎＣＤ１６およびＣＡＲの発現に加えて、ＣＤ３８ノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、派生Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐを含む。いくつかの他の実施形態では、派生Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、配列番号４２、４３、または４４によって例示されるようにＣＤ６４に由来する完全または部分的なエクトドメインを含むか、または非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。説明されるように、そのような派生Ｔ細胞は、抗体の治療効果を増強するためにＡＤＣＣによって瞑想されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得機構を有する。開示されるように、本出願はまた、以下のセクションでさらに詳述されるように、状態、疾患、または感染の治療における治療用途に十分な量で、１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体で予め充填された派生Ｔ細胞またはその細胞集団を提供する。いくつかの他の実施形態では、提供されるｈｎＣＤ１６およびＣＡＲを発現する派生Ｔ細胞はまた、ＣＤ３８ヌルであり、その結果、細胞は、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する治療薬の存在下にあるときに排除されることを回避できる。一実施形態では、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的化する当該治療薬はＣＤ３８抗体である。別の実施形態では、腫瘍抗原ＣＤ３８を標的とする当該治療薬は、本明細書に記載されるようなエンドドメインを含むＣＤ３８－ＣＡＲである。

４．外因的に導入されたサイトカインおよび／またはサイトカインシグナル伝達
臨床的に関連するサイトカインの全身的な高用量投与を回避することにより、そのような実践による用量制限毒性のリスクが低減される一方で、サイトカインを介した細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、および／またはそれらの対応する受容体のうちの１つ以上の部分的または完全なペプチドが細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現を伴ってまたは伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それによってサイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、および／またはエフェクター機能を維持または改善する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカインおよび／またはそのそれぞれの天然または改変された受容体が、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および／または一時的である。

図１は、ＩＬ１５を例として使用したいくつかの構成設計を示す。図１の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に対して天然であり得るか、または、任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変または置換されている。

設計１：ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、ＩＬ１５のシス提示を排除することなく共発現される。

設計２：ＩＬ１５Ｒαはリンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合されており、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を確保する。

設計３：切断型細胞内ドメインを持つＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を維持し、シス提示および／またはその細胞内ドメインを介した正常ＩＬ１５Ｒによって媒介される任意の他の潜在的なシグナル伝達経路を排除する。ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインは、受容体がＩＬ１５応答細胞で発現し、応答細胞が拡大し、機能するために重要であると考えられている。そのような切断型構築物は、配列番号４８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号４９によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの一実施形態では、構築物は、配列番号４８の最後４つのアミノ酸「ＫＳＲＱ」を含まず、配列番号５０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。
［配列表９］

［配列表１０］

［配列表１１］

当業者は、上記のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示的であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に好適なそれらの変形を決して制限しないことを理解するであろう。当業者に既知であり、利用可能な多くの好適なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび／またはリンカー配列が、シグナルペプチドによってもたらされるか、またはリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を改変することなく、別の配列で置換してもよいことを理解する。

設計４：設計３の構築物はエフェクター細胞の生存と増殖の促進に機能することが示されているため、ＩＬ１５Ｒαの細胞質ドメインは、このような設計でＩＬ１５を備えたエフェクター細胞の自律機能に悪影響を与えずに省略できることを示しており、設計４は、設計３の別の機能する代替案を提供する構築物であり、Ｓｕｓｈｉドメインを除いて、本質的にＩＬ１５Ｒα全体が削除され、一方の端でＩＬ１５と、もう一方の膜貫通ドメイン融合し（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）と、必要に応じて、Ｓｕｓｈｉドメインと膜貫通ドメインの間のリンカーを含む。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、任意の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。設計４などの構築物では、ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含むＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達は排除される。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む構成要素は、配列番号５１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号５２によって表される例示的な核酸配列によってコードされ得る。
［配列表１２］

［配列表１３］

当業者は、上記のシグナルペプチドおよびリンカー配列が例示的であり、シグナルペプチドまたはリンカーとしての使用に好適なそれらの変形を決して制限しないことを理解するであろう。当業者に既知であり、利用可能な多くの好適なシグナルペプチドまたはリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチドおよび／またはリンカー配列が、シグナルペプチドによってもたらされるか、またはリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を改変することなく、別の配列で置換してもよいことを理解する。

設計５：天然または改変されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５膜結合およびトランス提示を維持する。

設計６：天然または改変された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達および膜結合トランス提示のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣは、共通ガンマ鎖またはＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマまたはＩＬ２ＲＧとしても知られる。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、およびＩＬ２１受容体を含むがこれらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。

設計７：ＩＬ１５の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。

いくつかの実施形態では、サイトカインＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８およびＩＬ２１、および／またはそれらの受容体の１つ以上は、図１の設計の１つ以上を使用してｉＰＳＣ、およびｉＰＳＣ分化時のその派生細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２またはＩＬ１５細胞表面の発現およびシグナル伝達は、設計１～７のうちのいずれか１つにおける図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、またはＩＬ２１細胞表面の発現およびシグナル伝達は、共通の受容体またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用することにより、設計５、６、または７に図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ７表面発現およびシグナル伝達は、共通の受容体またはサイトカイン特異的受容体（ＩＬ４受容体など）のいずれかを使用することにより、設計５、６、または７に図示される構築物を介する。図１の設計のいずれかの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、対応するサイトカイン受容体に対して天然であり得るか、または、任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変または置換されている。

ＣＡＲおよび外因性サイトカインおよび／またはサイトカイン受容体シグナル伝達の両方を含むｉＰＳＣおよびそれからの派生細胞において、ＣＡＲおよびＩＬは、別個の構築物で発現され得るか、またはＣＡＲおよびＩＬの両方を含むバイシストロン性構築物において共発現され得る。いくつかのさらなる実施形態では、図１の構築物設計のいずれかによって表される形態のＩＬ１５は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現構築物の５’または３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、ＩＬ１５およびＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。一実施形態では、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲ構築物は、図１の設計３のＩＬ１５を含む。別の実施形態では、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲ構築物は、図１の設計３のＩＬ１５を含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲ構築物は、図１の設計７のＩＬ１５を含む。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲが発現すると、自己切断２Ａペプチドにより、発現されたＣＡＲおよびＩＬ１５が解離し、解離したＩＬ１５が細胞表面に提示される。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲバイシストロン設計により、タイミングおよび量の両方で、および例えば、単一ＯＲＦの表現のための誘導性プロモーターを組み込むために選択され得る同じ制御機構の下で、協調されたＣＡＲおよびＩＬ１５の発現が可能になる。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、およびブタテシオウイルス－１（ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）、Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））などの口蹄疫ウイルス、ならびにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）および脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルスのメンバーにおいて見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、およびＴａＶに由来する２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」と称されることもある。

ＩＬ１５について本明細書に開示されるバイシストロン性ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１５またはＩＬ１５－２Ａ－ＣＡＲの実施形態はまた、本明細書で提供される任意の他のサイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２１の発現も企図する。いくつかの実施形態では、ＩＬ２細胞表面発現およびシグナル伝達は、設計１～７のいずれかに図示される構築物を介する。いくつかの実施形態では、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、またはＩＬ２１細胞表面の発現およびシグナル伝達は、共通の受容体および／またはサイトカイン特異的受容体のいずれかを使用して、設計５、６、または７に図示される構築物を介する。

５．ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損
しばしば、同種異系拒絶反応の問題を回避するために、同種異系レシピエントの組織適合性について、複数のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質を一致させる必要がある。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩタンパク質の両方の発現が排除または実質的に低減したｉＰＳＣ細胞株およびそれから分化したその派生細胞が本明細書で提供される。ＨＬＡクラスＩ欠損症は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、またはベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、およびタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失もしくは発現レベルの低減によって達成できる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、すべてのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍヌル細胞はＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または低減によって達成できる。ＣＩＩＴＡは転写コアクチベーターであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を介して機能する。ＣＩＩＴＡヌル細胞はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。例えば、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ発現の両方を欠くためのＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損の両方を有するｉＰＳＣおよびその派生細胞が本明細書で提供され、得られた派生エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）一致の必要性を排除することによって同種異系細胞療法を可能にし、宿主（同種異系）Ｔ細胞による認識および殺滅を回避する。

しかしながら、一部の細胞型では、クラスＩの発現の欠如は、ＮＫ細胞による溶解をもたらす。この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｇを任意選択的にノックインして、操作されたｉＰＳＣに由来するＨＬＡ－Ｉ欠損エフェクター細胞のＮＫ細胞の認識および殺滅を回避することができる。一実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇノックインをさらに含む。代替的に、一実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣおよびその派生細胞は、ＣＤ５８ノックアウトおよびＣＤ５４ノックアウトの一方または両方をさらに含む。ＣＤ５８（またはＬＦＡ－３）およびＣＤ５４（またはＩＣＡＭ－１）は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む細胞の遊走を容易にする接着タンパク質である。ｉＰＳＣにおけるＣＤ５８および／またはＣＤ５４の破壊が、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む機能的免疫エフェクター細胞へと誘導されるｉＰＳＣ分化における多能性細胞および発生生物学に影響を与えるかどうか、およびどのように影響するかは、以前は不明であった。また、ＣＤ５８および／またはＣＤ５４ノックアウトがＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ由来のエフェクター細胞の同種異系ＮＫ細胞殺滅に対する感受性を効果的および／または十分に低減させることができるかどうかも、以前は不明であった。ここでは、ＣＤ５８ノックアウトはＣＤ５４ノックアウトよりも同種異系ＮＫ細胞の活性化を低減する効率が高い一方で、ＣＤ５８およびＣＤ５４の両方をダブルノックアウトすると、ＮＫ細胞の活性化の低減が最も増強されることが示された。いくつかの観察では、ＣＤ５８およびＣＤ５４ダブルノックアウトは、「自己喪失」効果を克服する上で、ＨＬＡ－Ｉ欠損細胞に対するＨＬＡ－Ｇ過剰発現よりもさらに効果的である。

上記に提供されるように、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＣＤ５８ヌルである。いくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＣＤ５４ヌルである。さらにいくつかの他の実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣならびにその派生細胞は、ＣＤ５８ヌルおよびＣＤ５４ヌルである。

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ欠損症のための工学は、アロ拒絶反応を回避するために活性化レシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とする不活性化ＣＡＲを発現することによってバイパスされ得るか、または無傷に保たれ得る。いくつかの実施形態では、活性化されたレシピエント免疫細胞における当該上方制御された表面タンパク質には、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ４４が含まれるが、これらに限定されない。細胞がそのような不活化ＣＡＲを発現する場合、細胞は、ＣＡＲによって標的とされる同じ表面タンパク質を発現しないか、またはノックアウトしていないことが好ましい。

６．本明細書で提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣおよび派生細胞
上記に照らして、本出願は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、またはそれらの集団、および当該ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞を提供し、各々の細胞は、本明細書に記載されるようにエンドドメインを有する少なくともＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、派生エフェクター細胞は、決定的なヘモジェニック内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、一般的な骨髄性前駆細胞、一般的なリンパ前駆細胞、赤血球、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、ならびに一次ＮＫ、Ｔ、および／またはＮＫＴ細胞に存在しない１つ以上の機能的特性を有する派生免疫エフェクター細胞を含むが、これらに限定されない。

また、ＣＤ３８－／－（本明細書では「ＣＤ３８ヌル」またはＣＤ３８ノックアウトとも称される）をさらに含むＣＡＲが、本明細書で提供され、細胞は、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、またはｉＰＳＣ分化から得られたＣＡＲおよびＣＤ３８ノックアウトを含む派生機能エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、派生エフェクター細胞は、決定的なヘモジェニック内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、一般的な骨髄性前駆細胞、一般的なリンパ前駆細胞、赤血球、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、ならびに一次ＮＫ、Ｔ、および／またはＮＫＴ細胞に存在しない１つ以上の機能的特性を有する派生免疫エフェクター細胞を含むが、これらに限定されない。

ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、および高親和性の切断不可能なＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣが、本明細書でさらに提供され、ｉＰＳＣは、機能的な派生造血細胞を生成するために分化することができる。ＣＡＲおよびｈｎＣＤ１６の両方を含む細胞は、ＣＡＲ結合およびＣＤ１６を媒介したＡＤＣＣによる二重標的化に好適であり、腫瘍標的化の精度を高め、腫瘍の殺滅を促進し、腫瘍抗原逃避の影響を最小限に抑える。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるエンドドメインを有するＣＤ３８－ＣＡＲおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞はまた、ＣＤ３８ヌルであり、その結果、ＣＤ３８抗体を使用してｈｎＣＤ１６媒介増強ＡＤＣＣを誘導する場合、ＣＤ３８ノックアウト、ＣＤ３８－ＣＡＲ、およびｈｎＣＤ１６－ＣＤ３８を含むｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞は、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなく、それによってｉＰＳＣとそのエフェクター細胞の持続性および／または生存を増加させ、ＣＤ３８発現（腫瘍）細胞および／またはアロ再活性化レシピエント細胞を標的化することができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ＮＫ細胞を含む。ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、およびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＴ細胞またはＮＫ細胞は、ＣＤ３８抗体またはＣＤ３８ ＣＡＲの存在下で細胞枯渇の低減を経験し、ＡＤＣＣ（Ｔ細胞の場合、ＡＤＣＣを獲得した）を有し、細胞の持続性が改善されつつ、腫瘍殺滅のさらなる多重機構をもたらす。

本明細書で提供される第１のＣＡＲを含むｉＰＳＣは、第１のＣＡＲ以外の標的特異性を有する第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含み得、ｉＰＳＣは、２つの異なる腫瘍抗原を標的とする２つのＣＡＲを有する機能的派生エフェクター細胞を生成するために分化することができる。一実施形態では、ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞に含まれるＣＡＲによって標的とされる２つの異なる抗原には、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ｉＰＳＣおよび／またはその派生エフェクター細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ４４を標的とするＣＡＲを有し、当該細胞はまた、標的とされたタンパク質中のヌルである。

本明細書で提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ならびに細胞の生存率、持続性、および／または増殖に寄与するサイトカインシグナル伝達を可能にする少なくとも１つの外因性サイトカインおよび／またはその受容体（ＩＬ）をコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣが、さらに提供され、ｉＰＳＣは、生存率、持続性、増殖、およびエフェクター細胞機能が改善された機能的派生エフェクター細胞を生成するために分化することができる。外因的に導入されたサイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のいずれか１つ、または２つ以上のシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための、サイトカインの導入された部分的または完全なペプチドおよび／またはそのそれぞれの受容体は、細胞表面で発現される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は、構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、誘導性である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性および／または一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン／サイトカイン受容体の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡを介する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲに含まれるｉＰＳＣまたはその派生細胞を含有する外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ７のシグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲに含まれるｉＰＳＣまたはその派生細胞を含有する外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ１０のシグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲに含まれるｉＰＳＣまたはその派生細胞を含有する外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、ＩＬ１５のシグナル伝達を可能にする。当該ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＩＬ１５発現は、図１の構築物３によるものである。当該ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣのいくつかの実施形態では、ＩＬ１５発現は、図１の構築物４によるものである。上述の実施形態の当該ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣおよびその派生細胞は、インビトロまたはインビボで追加的に供給される可溶性サイトカインに接触することなく、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、および／またはエフェクター機能を自律的に維持または改善することができる。ＣＡＲ ＩＬ ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞のいくつかの実施形態では、当該細胞はＣＤ３８ヌルであり、ＣＤ３８抗体とともに使用して、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導し、それによりｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存を相乗的に増加させることができる。

提供されるＣＡＲ、Ｂ２Ｍノックアウト、およびＣＩＩＴＡノックアウト、ならびに任意選択的にＨＬＡ－Ｇ過剰発現、ＣＤ５８ノックアウト、およびＣＤ５４ノックアウトのうちの１つを含むｉＰＳＣも提供され、ｉＰＳＣは、機能的な派生造血細胞を生成するために分化することができる。当該ＣＡＲ Ｂ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞は、ＨＬＡ－ＩとＨＬＡ－ＩＩの両方が欠損している。さらなる実施形態では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ欠損ＣＡＲ ｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞もまた、ＣＤ３８ヌルであり、エフェクター細胞の排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導し、それによりｉＰＳＣおよびそのエフェクター細胞の持続性および／または生存を増加させるＣＤ３８抗体とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、増加したインビボでの持続性および／または生存を有する。

上述の観点から、本明細書で提供されるのは、ＣＡＲ、ならびに任意選択的にＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ、外因性サイトカイン／受容体、およびＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含むｉＰＳＣを含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８およびＣＤ５４ノックアウトのうちの少なくとも１つが任意に導入され、ｉＰＳＣは、機能的な派生造血細胞を生成するために分化することができる。本出願において、ＣＡＲ、ならびに任意選択的にＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、および外因性サイトカイン／受容体のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含む機能的なｉＰＳＣ派生エフェクター細胞も含まれ、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、または、ＣＤ５８およびＣＤ５４ノックアウトのうちの少なくとも１つが任意に導入され、派生エフェクター細胞には、決定的な造血性内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血細胞幹細胞および前駆細胞、造血系多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、一般的な骨髄性前駆細胞、一般的なリンパ前駆細胞、赤血球、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、ならびに一次ＮＫ、Ｔ、および／またはＮＫＴ細胞に存在しない１つ以上の機能的特性を有する派生免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で提供される別の態様は、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの切断型融合タンパク質を含むｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来細胞を含み、融合タンパク質は細胞内ドメインを含まない。図１に「ＩＬ１５Ｒα（ΔＩＣＤ）融合」および「ＩＬ５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ」として示されるように、これらの実施形態は、本出願全体を通してさらに集合的にＩＬ１５Δと略され、表３に示される「ＩＬ」の実施形態のうちの１つである。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号４８、５１、または５０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性のアミノ酸配列を含む。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。「ＩＬ」のいくつかの実施形態では、細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。細胞内ドメインを欠く切断型ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質（ＩＬ１５Δ）を含むｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来細胞のいくつかの実施形態では、当該細胞は、ＣＡＲ、ならびに任意選択的に、ＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ、外因性サイトカイン／受容体、およびＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトのうちの１つ以上をさらに含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされると、ＨＬＡ－ＧをコードするポリヌクレオチドまたはＣＤ５８およびＣＤ５４ノックアウトのうちの１つが任意に導入され、ｉＰＳＣは、機能的な派生エフェクター細胞を生成するために分化することができ、派生エフェクター細胞には、決定的な造血性内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血細胞幹細胞および前駆細胞、造血系多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、一般的な骨髄性前駆細胞、一般的なリンパ前駆細胞、赤血球、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、マクロファージ、ならびに一次ＮＫ、Ｔ、および／またはＮＫＴ細胞に存在しない１つ以上の機能的特性を有する派生免疫エフェクター細胞が含まれるが、これらに限定されない。

したがって、本出願は、表２の以下の遺伝子型のうちのいずれか１つを含む、ｉＰＳＣおよびその機能的な派生造血細胞を提供する。本出願の表２に提供される「ＣＡＲ^（第２）」は、第１のＣＡＲとは異なる標的特異性を有するＣＡＲを表し、非限定な例としては、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的とするＣＡＲが挙げられる。表２に提供されるように、「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のうちの１つを表す。さらに、「ＩＬ」はまた、ＩＬ１５Δの実施形態も包含し、これは、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαの切断型融合タンパク質として上に詳述されているが、細胞内ドメインを含まない。さらに、ｉＰＳＣおよびその機能的派生造血細胞が、ＣＡＲ（第１のＣＡＲまたは第２のＣＡＲ）とＩＬとの両方を含む遺伝子型を有する場合、当該細胞の一実施形態では、ＣＡＲおよびＩＬは、２Ａ配列を含むバイシストロ性発現カセットに含まれる。比較として、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲおよびＩＬは、ｉＰＳＣおよびその機能的な派生造血細胞に含まれる別個の発現カセットにある。特定の一実施形態では、ＣＡＲとＩＬとの両方を発現するｉＰＳＣおよびその機能的派生エフェクター細胞に含まれるのは、図１の構築物３または４におけるＩＬ１５であり、ＩＬ１５構築物は、ＣＡＲとともに、またはそれと別個に発現カセットに含まれる。

７．追加の改変
いくつかの実施形態では、表２の遺伝子型のうちのいずれか１つを含むｉＰＳＣおよびその派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは発現低減をさらに含み得るか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含み得る。

二重特異性または多重特異性エンゲージャーは、異なる抗体の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であり、少なくとも１つのｓｃＦｖがエフェクター細胞表面分子に結合し、少なくとも別の１つが腫瘍特異的表面分子を介して腫瘍細胞に結合する。二重特異性もしくは多重特異性エンゲージャー認識、または結合に使用できる例示的なエフェクター細胞表面分子または表面トリガー受容体には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、および本明細書に開示されるキメラＦｃ受容体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるＣＤ１６は、セクションＩ．２に記載される、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖおよび任意選択的にＳ１９７Ｐを含む）またはＣＤ６４細胞外ドメイン、ならびに天然または非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー認識のためにエフェクター細胞の表面で発現されるＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ｈｎＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の完全長または部分配列の細胞外ドメインに由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖおよび任意選択的にＳ１９７Ｐを含む。二重特異性または多重特異性エンゲージャー認識の例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ１９である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０またはＣＤ６４－ＣＤ３０である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡまたはＣＤ６４－ＢＣＭＡである。また別の実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ３－ＣＤ３３である。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体はさらに、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインの間にリンカー、例えば、エフェクター細胞増殖を促進するエフェクターＮＫ細胞のリンカーとしての改変されたＩＬ１５（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、または三重特異性キラーエンゲージャーと呼ばれる）を含む。一実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭまたはＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭである。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥは、ＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３またはＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。さらに別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）である。

いくつかの実施形態では、二重特異性または多重特異性のエンゲージャーのための表面トリガー受容体は、時には細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。他のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、すなわち、表２に列記された遺伝子型を含むｉＰＳＣをさらに操作し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含む任意の他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示し、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。

８．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、または適応症に関連する抗原を標的とする抗体または抗体断片を含む追加の治療薬を、組み合わせ療法でこれらのエフェクター細胞とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療薬として、組み合わせ治療に好適な抗体としては、ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、パーツズマブ）、ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）、ＥＧＦＲ抗体（セルツキシマブ）、ＧＤ２抗体（ジヌツキシマブ）、ＰＤＬ１抗体（アベルマブ）、ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、ＣＤ１２３抗体（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、およびそれらのヒト化またはＦｃ改変されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表２に列記される遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表２に列記される遺伝子型を含むＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表２に列記される遺伝子型を含むＴ細胞を含む。

液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、提供されるエンドドメインを有する少なくともＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞と、を含む。液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、少なくともｈｎＣＤ１６および提供されるエンドドメインを有するＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞と、を含む。液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、予め選択されたモノクローナル抗体と、少なくともｈｎＣＤ１６および提供されるエンドドメインを含むＣＡＲを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞と、を含む。理論に制限されることなく、ｈｎＣＤ１６は、モノクローナル抗体の増強されたＡＤＣＣを提供するが、ＣＡＲは特定の腫瘍抗原を標的とするだけでなく、異なる腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体と組み合わせた二重標的戦略を使用して腫瘍抗原逃避を防ぐ。液体腫瘍または固形腫瘍の治療に有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、本明細書で提供されるエンドドメインを含む少なくともＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌルを含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞またはＴ細胞、およびＣＤ３８抗体を含む。一実施形態では、組み合わせは、本明細書で提供されるエンドドメインを含む少なくともＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌルおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞、ならびにＣＤ３８抗体であるダラツムマブ、イサツキシマブ、およびＭＯＲ２０２のうちの１つを含む。一実施形態では、組み合わせは、本明細書で提供されるエンドドメインを含むＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌルおよびｈｎＣＤ１６を含むｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞、ならびにダラツムマブを含む。いくつかのさらなる実施形態では、ダラツムマブとの組み合わせに含まれるｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、ＩＬ１５、ならびにＭＩＣＡ／ＢまたはＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的とするＣＡＲを含み、ＩＬ１５は、ＣＡＲと共発現または別個に発現され、ＩＬ１５は、図１の構築物１～７に提示される形態のうちのいずれか１つである。いくつかの特定の実施形態では、ＩＬ１５は、ＣＡＲと同時または別個に発現される場合、構築物３、４、または７の形態である。

９．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。腫瘍がある特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主要機構として利用していることが今では明らかになっている。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させ、それによって阻害チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１またはＣＴＬＡ４を標的とするチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発生は依然として重大な懸念事項である。本出願の一態様は、ＣＩとの組み合わせ療法で提供されるようにゲノム操作された機能的派生細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供する。組み合わせ療法の一実施形態では、派生細胞はＮＫ細胞である。組み合わせ療法の別の実施形態では、派生細胞はＴ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を呈することに加えて、本明細書で提供される派生ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でＴ細胞の活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、当該ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。

一実施形態では、チェックポイント阻害剤の組み合わせ療法のための派生ＮＫ細胞は、本明細書で提供されるエンドドメインを含むＣＡＲ、ならびに任意選択的にＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、ならびに外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８もしくはＣＤ５４ノックアウトのうちの少なくとも１つが、任意選択的に含まれる。いくつかの実施形態では、派生ＮＫ細胞は、表２に列記される遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の派生ＮＫ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含む。

別の実施形態では、チェックポイント阻害剤の組み合わせ療法のための派生Ｔ細胞は、本明細書で提供されるエンドドメインを含むＣＡＲ、ならびに任意選択的にＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、ならびに外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体発現のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８もしくはＣＤ５４ノックアウトのうちの１つが、任意選択的に含まれる。いくつかの実施形態では、派生Ｔ細胞は、表２に列記される遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、上述の派生Ｔ細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含む。

上述の当該派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞は、本明細書で提供されるエンドドメインを含むＣＡＲ、ならびに任意選択的に、ＣＤ３８ノックアウト、ｈｎＣＤ１６発現、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウト、第２のＣＡＲ、ならびに外因性細胞表面サイトカイン発現のうちの１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得られ、Ｂ２Ｍがノックアウトされる場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ５８およびＣＤ５４ノックアウトのうちの少なくとも１つが、任意選択的に導入される。いくつかの実施形態では、上述の当該ｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の少なくとも１つにおける欠失もしくは低減された発現をさらに含むか、またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異性、多重特異性もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入されたもしくは増加した発現をさらに含む。

本明細書で提供される派生ＮＫ細胞またはＴ細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、および３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、または全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、または３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、アベルマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、デュルバルマブ（ＰＤＬ１ ｍＡｂ）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（ＫＩＲ抗体）、ＩＰＨ４３（ＭＩＣＡ抗体）、ＩＰＨ３３（ＴＬＲ３抗体）、リリムマブ（ＫＩＲ抗体）、モナリズマブ（ＮＫＧ２Ａ抗体）、ニボルマブ（ＰＤ１ ｍＡｂ）、ペムブロリズマブ（ＰＤ１ ｍＡｂ）、およびそれらの誘導体、機能的同等物、またはバイオシミラーのうちの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する制御因子として見出されるため、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニストｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、およびｍｉＲ－２９ｃが含まれるが、これらに限定されない。

提供される派生ＮＫ細胞または派生Ｔ細胞との組み合わせ療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的とする少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、派生細胞は表２に列記される遺伝子型を有する。提供される派生ＮＫ細胞またはＴ細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも１つのチェックポイント阻害剤および表２に列記された遺伝子型を有する派生細胞を含む組み合わせ療法のいくつかの実施形態では、当該チェックポイント阻害剤は、抗体、またはヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーであり、当該チェックポイント阻害剤は、当該抗体、またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、派生細胞により生成される。いくつかの実施形態では、チェックポイントを阻害する抗体またはその断片もしくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列は、別個の構築物、またはＣＡＲおよび抗体もしくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性構築物のいずれかにおいて、ＣＡＲと共発現される。いくつかのさらなる実施形態では、抗体またはその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩまたはＣＩ－２Ａ－ＣＡＲとして図示される自己切断２Ａコード配列を介して、ＣＡＲ発現構築物の５’または３’末端のいずれかに連結され得る。そのため、チェックポイント阻害剤およびＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。チェックポイント阻害剤が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に浸潤することが可能な派生エフェクター細胞によってペイロードとして送達、発現、分泌される場合、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を相殺し、ＣＡＲまたは活性化受容体などのモダリティを活性化することによってエフェクター細胞の活性化を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子：ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表２に列記される遺伝子型を有する派生細胞においてＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ならびにそれらのヒト化またはＦｃ改変されたバリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現されるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアント、断片、またはそれらの機能的同等物もしくはバイオシミラーである。

本明細書で提供される派生細胞およびチェックポイント分子を阻害する少なくとも１つの抗体を含む組み合わせ療法のいくつかの他の実施形態では、当該抗体は、派生細胞によって、または派生細胞内で産生されず、表２に列記されている遺伝子型を持つ派生細胞の投与の前、それと同時、またはその後にさらに投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生ＮＫ細胞またはＴ細胞との併用療法における１つ、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時または連続的である。表２に列記される遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む併用治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ならびにそれらのヒト化またはＦｃ改変されたバリアント、断片、およびそれらの機能的同等物またはバイオシミラーのうちの１つ以上である。表２に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、またはそのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアント、断片、およびその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表２に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、あるいはそのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアント、断片、またはその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。表２に列記される遺伝子型を有する由来ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む併用治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、あるいはそのヒト化もしくはＦｃ改変されたバリアント、断片、またはその機能的同等物もしくはバイオシミラーである。

ＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座での標的化されたゲノム編集の方法
本明細書で交換可能に使用されるゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、またはゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子編集は、標的化された細胞のゲノムにおいてＤＮＡが挿入される、欠失される、および／または置き換えられる遺伝子操作の一種である。標的化されたゲノム編集（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）（「標的化されたゲノム編集（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ）」または「標的化された遺伝子編集」と交換可能）により、ゲノム内の予め選択された部位での挿入、欠失、および／または置換が可能となる。標的化された編集中に挿入部位で内因性配列が欠失されると、影響を受ける配列を含む内因性遺伝子が、配列の欠失によりノックアウトまたはノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化された編集を使用して、内因性遺伝子の発現を正確に妨害することもできる。「標的化された組み込み」という用語は、本明細書で同様に使用され、挿入部位での内因性配列の欠失の有無にかかわらず、１つ以上の外因性配列の挿入を伴うプロセスを指す。比較すると、ランダムに組み込まれた遺伝子は、位置効果およびサイレンシングを受け、それらの発現は信頼性がなく、予測できない。例えば、セントロメアおよびサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に、新たに組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響を及ぼし、細胞の挙動を改変するか、または細胞の形質転換を支持する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）などの予め選択された遺伝子座に外因性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、および信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。代替的に、外因性ＤＮＡは、遺伝子座でのノックダウンおよびノックアウトを含む遺伝子発現の破壊が意図されている、予め選択された遺伝子座に挿入され得る。

標的化された編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、またはヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって達成され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化された編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。

代替的に、特定のレアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を介して、より高い頻度で標的化された編集を達成することができる。そのようなヌクレアーゼに依存する標的化された編集は、ＤＳＢに応答して起こる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復機構を利用する。外因性遺伝子材料を含むドナーベクターがないと、ＮＨＥＪは、多くの場合、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（イン／デル）をもたらす。比較すると、一対の相同性アームに隣接する外因性遺伝子材料を含むドナーベクターが存在する場合、外因性遺伝子材料は、相同組換えによる相同性指向修復（ＨＤＲ）中にゲノムに導入され、「標的化された組み込み」をもたらし得る。場合によっては、標的化された組み込み部位が選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図されているため、標的化された組み込みが遺伝子発現を妨害し、１回の編集ステップでノックインおよびノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）を同時にもたらすことができる。

目的の遺伝子座（ＧＯＩ）の選択された位置に１つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることが達成され得る。同時ノックインおよびノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）に好適な遺伝子座には、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαまたはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴが含まれるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化相同性アームにより、導入遺伝子が、その部位の内因性プロモーターの下、または構築物に含まれる外因性プロモーターの下のいずれかで発現することを可能にする。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２ＡリンカーまたはＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、およびＴａＶから派生する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、および「Ｔ２Ａ」とも称される）をコードし、単一の翻訳から別個のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、インスレーターは、導入遺伝子および／または外因性プロモーターサイレンシングのリスクを低減するために構築物に含まれる。外因性プロモーターは、ＣＡＧ、またはＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、およびＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的プロモーターであり得る。

特定のおよび標的化されたＤＳＢを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の回文配列リピート）系が含まれるが、これらに限定されない。加えて、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）系も、標的化された組み込みのための有望なツールである。

ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」または「ＺＦＢＤ」とは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガーは、ジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインであり、その構造は亜鉛イオンの配位により安定化される。ジンクフィンガーの例には、Ｃ_２Ｈ_２ジンクフィンガー、Ｃ_３Ｈジンクフィンガー、およびＣ_４ジンクフィンガーが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガードメインは、その設計／組成が主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計の情報と結合データを格納するデータベースの情報を処理するための置換規則およびコンピューター化されたアルゴリズムの適用から生じる、自然界では存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、また、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガードメインは、自然界では見られないドメインであり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号および米国特許第７，９７２，８５４号により詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。

ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化されたヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体から分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、ＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列に結合し、それらのトランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、リピート可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択リピート位置で多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記載されている。当技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへの融合ポリペプチドである。

主題の方法で使用が見出される標的化されたヌクレアーゼの別の例は、標的化されたＳｐｏ１１ヌクレアーゼであり、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。

本発明に好適な標的化されたヌクレアーゼの追加の例には、個々にまたは組み合わせて使用されるかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、およびＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が含まれるが、これらに限定されない。

標的化されたヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼおよび組換えヌクレアーゼ；ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリーからのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ；メガヌクレアーゼ；ホーミングエンドヌクレアーゼなどが含まれる。

例としてＣａｓ９を使用すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な構成要素：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を必要とする。共発現されると、２つの構成要素は複合体を形成し、ＰＡＭおよびＰＡＭ近くのシーディング領域を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、Ｃａｓ９を誘導して選択された配列を標的とすることができる。これらの２つの構成要素は、トランスフェクションまたは形質導入を介して哺乳類細胞に送達され得る。

ＤＩＣＥを介した挿入では、一対のリコンビナーゼ、例えば、ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂ１を使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢおよびａｔｔＰ認識部位に厳密に制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的ａｔｔ部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位でゲノムに導入する必要がある。例えば、米国公開第２０１５／０１４０６６５号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームをさらに含み、標的化された組み込み方法は、細胞に構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮを介した挿入を可能にすることとを含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることとを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセットを導入することと、所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９を介した挿入を可能にすることとを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を細胞の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含む。

標的化された組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞または生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるか、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質または非コードＲＮＡの所望のレベルを得るのに十分な導入遺伝子の発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換させやすくしてはならず、また細胞機能を改変してはならない。組み込み部位が可能性のあるセーフハーバー遺伝子座となるために、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断される制御要素もしくは遺伝子の破壊がない；遺伝子の密集した領域内の遺伝子間領域であるか、または反対方向に転写された２つの遺伝子間の収束位置である；ベクターにコードされた転写活性化因子と隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子およびマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモーターとの間の長距離にわたる相互作用の可能性を最小限に抑えるために距離を保つ；かつユビキタスな転写活性を示す広範な空間的および時間的発現配列タグ（ＥＳＴ）発現パターンに反映されるように、明らかにユビキタスな転写活性を有する。この後者の特徴は、分化中にクロマチンリモデリングが、典型的にはいくつかの遺伝子座のサイレンシングおよび他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす幹細胞において特に重要である。外因性挿入に好適な領域内で、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素および保存された配列を欠き、相同アーム増幅のためのプライマーを容易に設計することができるはずである。

ヒトゲノム編集、または具体的には標的化された組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、およびマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログもまた、本明細書に開示される組成物および標的化された組み込み方法を使用する挿入に好適な部位であり得る。さらに、コラーゲンおよびＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化された組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択された各部位の検証は、特に特定の組み込み事象のための幹細胞で必要であることが示されており、プロモーターの選択、外因性遺伝子の配列および配置、ならびに構築物の設計を含む挿入戦略の最適化がしばしば必要である。

標的化されたイン／デルの場合、編集部位は、その発現および／または機能が妨害されることを意図している内因性遺伝子に含まれることが多い。一実施形態では、標的化されたイン／デルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の制御および調節に関連している。いくつかの他の実施形態では、標的化されたイン／デルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答制御および調節、または幹細胞および／もしくは前駆細胞、ならびにその由来細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および／または生存を抑制するタンパク質に関連する。

したがって、本発明の一態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、またはＲＵＮＸ１などの連続的または一時的な遺伝子発現に安全であり、十分に制御されていることが既知のまたは証明されている予め選択された遺伝子座、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座における標的化された組み込み方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的化された組み込みは、組み込みの結果としての遺伝子のノックダウンまたはノックアウトが所望される遺伝子座のうちの１つにあり、そのような遺伝子座としては、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαまたはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームおよび１つ以上の外因性配列を含む構築物を導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。

別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。さらに別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ発現カセットおよび所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを介した挿入を可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。また別の実施形態では、細胞における標的化された組み込み方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を、細胞の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥを介した標的化された組み込みを可能にすることとを含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む。

さらに、本明細書で提供されるように、セーフハーバーにおける標的化された組み込みのための上記の方法は、目的の任意のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、ならびに幹細胞および／または前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物は、１つ以上のマーカー遺伝子をさらに含む。一実施形態では、本発明の構築物における外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死に好適な自殺遺伝子系には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３もしくは７）およびＡＰ１９０３；チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびガンシクロビル（ＧＣＶ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）および５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０でのＴリンパ球の遺伝子改変により、ｍＡｂリツキシマブの投与によりそれらを排除することができる。さらに、セツキシマブによって認識される改変されたＥＧＦＲ含有エピトープは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変されたＥＧＦＲ、およびＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上の自殺遺伝子の標的化された組み込み方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって組み込まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化された組み込みのための構築物に含まれる作動可能に連結された外因性プロモーターによって駆動される。プロモーターは、誘導性または構成的であってもよく、時間特異的、組織特異的、または細胞型特異的であってもよい。本発明の方法に好適な構築的プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）、およびユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモーターはＣＡＧである。

本明細書の方法によって組み込まれる外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位で、宿主ゲノムの内因性プロモーターによって駆動され得る。一実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＡＡＶＳ１遺伝子座での１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＨ１１遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモーターによって駆動される。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのコラーゲン遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモーターによって駆動される。また別の実施形態では、本発明の方法は、細胞のゲノムのＨＴＲＰ遺伝子座での標的化された組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモーターによって駆動される。理論的には、所望の位置への正しい挿入のみが、内因性プロモーターによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。

いくつかの実施形態では、標的化された組み込み方法のための構築物に含まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、構築物は、部分間の物理的分離を広げ、酵素機構へのアクセスを最大にするために、同じプロモーターによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列のリンカーペプチドは、部分（外因性ポリヌクレオチド、および／またはそれからコードされるタンパク質またはペプチド）間の物理的分離を、関連する機能に応じてより柔軟にまたはより堅固にするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、別個の部分を生じさせるために、プロテアーゼによって切断可能であるか、または化学的に切断可能であり得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、およびトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって自然に産生されるか、または外因的に導入されるものである。代替的に、リンカーにおける切断部位は、選択された化学物質、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、または低ｐＨへの曝露時に切断が可能な部位であり得る。任意選択のリンカー配列は、切断部位を提供する以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接する部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間の立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であり得る。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない、翻訳後改変を提供し得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体構造に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主に構成され得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０または９０パーセント以上は、グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシングドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。好適なリンカー配列は、経験的に容易に特定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズおよび配列もまた、従来のコンピューターモデリング技法によって決定することができる。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。

標的化された組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入する方法は、それ自体が知られている細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡｌ－１１、ｐＸＴｌ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などに送達および／または発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を遺伝子操作のために使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、または置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、はるかに高い割合で相同性指向遺伝子標的化を媒介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６またはＡＡＶ２ベクターは、ｉＰＳＣのゲノムの標的部位に挿入、欠失または置換を導入するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム改変されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。

ＩＩＩ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを得て維持する方法
本発明は、１つ以上の所望の部位で１つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得て維持する方法を提供し、標的化された編集は、拡大されたゲノム操作されたｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷および機能的であり続ける。標的化された編集は、ｉＰＳＣおよびそれからの派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、および／または置換、すなわち、選択した部位での標標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを導入する。患者由来の末梢血由来の一次エフェクター細胞を直接操作する場合と比較して、ここで提供されるようにｉＰＳＣを編集および分化させることによりゲノム操作された派生細胞を得ることの多くの利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない：設計されたエフェクター細胞の無制限のソース；特に複数の設計されたモダリティが含まれる場合、エフェクター細胞を繰り返し操作する必要がない；取得されたエフェクター細胞は、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っている；主に本明細書で提供される操作されたｉＰＳＣでのクローン選択が可能であることに起因して、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、および対立遺伝子変形、無作為変異、発現多様性がないという点で均一である。

特定の実施形態では、１つ以上の選択された部位での１つ以上の標的化された編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、運命維持培地（ＦＭＭ）として表３に示される細胞培養培地において、単一細胞として長期間維持、継代、および拡大され、ｉＰＳＣは、選択された部位で標的化された編集および機能的改変を保持する。培地の組成は、表３に示される最適範囲内の量で培地中に存在し得る。ＦＭＭで培養されたｉＰＳＣは、未分化で、基底またはナイーブなプロファイル、培養物を洗浄または選択する必要なくゲノム安定性を維持し続けることが示されており、３つすべての体細胞系統、胚様体または単層（胚様体の形成なし）を介したインビトロ分化、および奇形腫形成によるインビボ分化を容易に生じさせる。例えば、国際公開第ＷＯ２０１５／１３４６５２号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、または本質的に含まない培地中で維持、継代、拡大され、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化された編集を保持する。

本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化された編集を通じて、または最初に標的化された編集によりゲノム操作された非多能性細胞を生成し、次に選択／単離されたゲノム操作された非多能性細胞を再プログラミングして、非多能性細胞と同じ標的化された編集を含むｉＰＳＣを得ることを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、標的化された組み込みおよび／または標的化されたイン／デルを細胞に導入することによって同時に再プログラミングを受けているゲノム操作された非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞は再プログラミングに十分な条件下にあり、再プログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子および小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作および再プログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子および任意選択的に小分子と接触させることにより再プログラミングを開始する前に、または本質的に同時に、標的化された組み込みおよび／または標的化されたイン／デルを非多能性細胞に導入することができる。

いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作および再プログラミングするために、標的化された組み込みおよび／またはイン／デルはまた、非多能性細胞を１つ以上の再プログラミング因子および小分子と接触させることによって再プログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入されてもよく、再プログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１、およびＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、構築物を担持するベクターが導入される。

いくつかの実施形態では、再プログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つの再プログラミング因子、ならびに任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ；表３）と接触させることによって開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物（ＦＭＭ；表３）を使用してさらに維持および拡大される。

ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを導入することによりｉＰＳＣをゲノム操作し、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ以上の標的化された編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含むゲノム操作された非多能性細胞を得ることと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を、１つ以上の再プログラミング因子、ならびに任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、および任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）１つ以上の標的化組み込みおよび／またはイン／デルを、ゲノム操作のためのリプログラミング非多能性細胞に導入することと、（ｃ）選択された部位で標的化組み込みおよび／またはイン／デルを含む、クローンゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。

再プログラミング因子は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１８８０１およびＰＣＴ／ＵＳ１６／５７１３６に開示される（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。１つ以上の再プログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。再プログラミング因子はまた、ポリヌクレオチドの形態であり得るため、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、およびミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入される。特定の実施形態では、少なくとも１つの再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、様々な再プログラミング因子の化学量論考慮に入れたプラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、国際公開第ＷＯ２０１９／０７５０５７号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同じまたは異なる選択された部位での標的化された組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含む複数の構築物で移入される。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、または標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、またはｉＰＳＣもしくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、および組織または細胞型特異的プロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモーターを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、または特定の分化した細胞型において発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣおよび／またはｉＰＳＣから分化した細胞において発現される。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧによって駆動されるカパーゼ－９によって駆動される。異なる外因性ポリヌクレオチドおよび／または異なるプロモーターを含むこれらの構築物は、同時にまたは連続してのいずれかで非多能性細胞に移入することができる。複数の構築物の標的化された組み込みに供される非多能性細胞は、１つ以上の再プログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時に再プログラミングを開始でき、それにより、同じ細胞のプールにおいて複数の標的化された組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることができる。このように、この堅牢な方法により、同時再プログラミングおよび操作戦略が、１つ以上の選択された標的部位に組み込まれた複数のモダリティを有するクローンゲノム操作されたｈｉＰＳＣを導くことを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム改変されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。

ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることおよびｉＰＳＣ分化プラットフォームを使用したＣＡＲエンドドメインスクリーニングにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を得る方法
本発明のさらなる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのインビボでの分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、所望の部位で標的化された組み込みおよび／またはイン／デルを含む無傷で機能的な標的化された編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで派生した分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、もしくはＲＵＮＸ１、またはゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、または幹細胞および／または前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己複製、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫を介してゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するインビボ分化細胞は、免疫応答の制御および媒介に関連する内因性遺伝子の１つ以上のイン／デルをさらに含む。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、主要組織適合遺伝子複合体に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、イン／デルは、Ｂ２Ｍ、ＰＤ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＣＲ遺伝子を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、選択された部位に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、Ｂ２Ｍ（ベータ－２－ミクログロブリン）をコードする遺伝子における標的化された編集をさらに含む。

特定の実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の遺伝子改変を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを使用して、インビトロで造血細胞系統または任意の他の特定の細胞型を導き、由来非多能性細胞は、選択された部位で標的化された編集を含む機能的遺伝子改変を保持する。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞には、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、一般的な骨髄性前駆細胞、一般的なリンパ前駆細胞、赤血球、骨髄性細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むが、これらに限定されず、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するこれらの細胞は、所望の部位で標的化された編集を含む機能的な遺伝子改変を保持する。

ｉＰＳＣ由来の造血細胞系統を得るための適用される分化方法および組成物には、例えば、国際公開第ＷＯ２０１７／０７８８０７号に示されているものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。提供されるように、造血細胞系統を生成するための方法および組成物は、無血清、フィーダーフリー、および／または間質を含まない条件下で、またスケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｈｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する二次造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞にコミットされた前駆細胞、ならびに多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多分化能幹細胞または前駆細胞から、最終分化細胞、および介在するすべての造血細胞系統にまで及ぶ。

単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化および拡大する方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、および任意選択的にｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞は、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく得られ、拡大される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＷＮＴ経路活性化因子と接触させて、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、二次造血性内皮（ＨＥ）の可能性を有する拡大された中胚葉細胞を得る。その後のｂＦＧＦ、ならびに任意選択的にＲＯＣＫ阻害剤および／またはＷＮＴ経路活性化因子との接触により、二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞は、二次ＨＥ細胞に分化し、これも分化中に拡大される。

造血系統の細胞を得るために本明細書で提供される方法は、ＥＢ形成が中程度から最小の細胞拡大をもたらし、均質な拡大を必要とする多くの用途に重要である単層培養、および集団内の細胞の均質な分化を可能にせず、困難で、効率が低いため、ＥＢを介した多能性幹細胞分化よりも優れている。

提供される単層分化プラットフォームは、造血幹細胞およびＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞などの分化した子孫の派生をもたらす、二次造血内皮への分化を容易にする。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な拡大を組み合わせて、様々な治療用途のための多能性幹細胞由来エフェクター細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。さらに、本明細書で提供される方法を使用する単層培養は、インビトロ分化、エクスビボ調節、ならびにインビボ長期造血自己再生、再構成、および生着の全範囲を可能にする機能的な造血系統細胞をもたらす。提供されるように、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞には、二次造血内皮、造血多分化能前駆細胞、造血幹細胞および前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ならびに好中球が含まれるが、これらに限定されない。

多能性幹細胞の二次造血系統の細胞への分化を指向する方法であって、方法は、（ｉ）多能性幹細胞をＢＭＰ活性化因子および任意選択的にｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞から中胚葉細胞の分化および拡大を開始することと、（ｉｉ）中胚葉細胞をＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含む組成物（組成物は、任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、中胚葉細胞から二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞の分化および拡大を開始することと、（ｉｉｉ）二次ＨＥの可能性を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤；ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択的にＷｎｔ経路活性化因子を含む組成物（組成物は、任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、二次造血内皮の可能性を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞から二次造血内皮の分化および拡大を開始することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物（組成物はＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない）と接触させて、多能性幹細胞を播種および拡大することをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、またはナイーブｉＰＳＣ、または１つ以上の遺伝子インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝子インプリントは、それから分化したエフェクター細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向する方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成を欠き、単層培養形態である。

上記の方法のいくつかの実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、得られた二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ９３－である。いくつかの実施形態では、二次造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９３－である。

上記の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン；ならびに任意選択的にＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレＴ細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択的に、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆細胞のＴ細胞前駆細胞またはＴ細胞への分化を開始することとをさらに含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。

多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指向するための上記の方法のさらにいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、二次造血内皮のプレＮＫ細胞前駆細胞への分化を開始することと、任意選択的に、（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む組成物（培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない）と接触させて、プレＮＫ細胞前駆細胞のＮＫ細胞前駆細胞またはＮＫ細胞への分化を開始することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、任意選択的に、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋、およびＣＤ１６＋によってさらに定義される。

したがって、上記の分化方法を使用して、以下のｉＰＳＣ由来の造血細胞のうちの１つ以上の集団を得ることができる：（ｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用したＣＤ３４＋ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、（ｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用した二次造血内皮（ｉＨＥ）、（ｉｉｉ）ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ２、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用した二次ＨＳＣ、（ｉｖ）ｉＭＰＰ－Ａを使用した多分化能前駆細胞（ｉＭＰＰ）、（ｖ）ｉＴＣ－Ａ２およびｉＴＣ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用したＴ系統細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－Ｔ）、（ｖｉ）ｉＴＣ－Ｂ２を使用したＴ系統細胞（ｉＴＣ）、（ｖｉｉ）ｉＮＫ－Ａ２およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される１つ以上の培養培地を使用したＮＫ系統細胞前駆細胞（ｉｐｒｏ－ＮＫ）、ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ系統細胞（ｉＮＫ）、およびｉＮＫ－Ｂ２。いくつかの実施形態では、培地は以下である：
ａ．ｉＣＤ３４－Ｃは、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＧＦ、およびＥＰＯからなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択的にＷｎｔ経路活性化因子を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、
ｂ．ｉＭＰＰ－Ａは、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む；
ｃ．ｉＴＣ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカイン、ならびに任意選択的に、ＢＭＰ活性化因子を含む、
ｄ．ｉＴＣ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む；
ｅ．ｉＮＫ－Ａ２は、ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む；ならびに
ｆ．ｉＮＫ－Ｂ２は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含む。

いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作ｉＰＳＣ派生細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを含む１つ以上の所望の組み込み部位で組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または幹細胞および／もしくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能、自己再生、持続性、および／または生存を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、およびＭＨＣクラスＩ抑制遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答の制御および媒介に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる１つ以上のイン／デルをさらに含む。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にイン／デルをさらに含み、Ｂ２Ｍはノックアウトされている。

加えて、第１の運命のゲノム操作された造血細胞から第２の運命のゲノム操作された造血細胞を得るための適用される脱分化方法および組成物は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１／１５９７２６号に示されるものを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。その中で提供される方法および組成物は、再プログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的に再プログラミングし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供することを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法および組成物を使用して得られたゲノム改変されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表２に列記される少なくとも１つの遺伝子型を含む。

Ｖ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化された外因性機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療用途
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法および組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団または亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ派生免疫細胞に保持可能な１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、細胞ベースの養子療法に好適である。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ｐｒｏＴまたはＴ系統細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来ｐｒｏＮＫまたはＮＫ系統細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来免疫制御細胞または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療可能性のためにエクスビボでさらに調節される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、および／またはセントラルメモリーＴ細胞の数または比率の増加を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数または比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団または亜集団は、適応ＮＫ細胞の数または比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団または亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＭＤＳＣの単離された集団または亜集団は、自家性である。

いくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含むが、但し、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、当該ｉＰＳＣに由来する分化したエフェクター細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝子インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣに再プログラミングする間もしくはその後に多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失、もしくは置換により得られる１つ以上の遺伝子改変されたモダリティ、または（ｉｉ）ドナー特異的、疾患特異的、もしくは治療応答特異的である供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞が供給源特異的免疫細胞から再プログラミングされ、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞にも含まれる供給源の治療属性を保持する。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、あるいは、ｉＰＳＣまたはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と調整、および／または生存を促進するタンパク質の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、表２に列記された遺伝子型を含む。他のいくつかの実施形態では、表２に列記された遺伝子型を含む遺伝子改変されたｉＰＳＣおよびその派生細胞は、（１）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の１つ以上の欠失または発現低減、ならびに（２）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、または二重特異性または多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体の導入されたまたは増加した発現を含む追加の遺伝子改変されたモダリティをさらに含む。

またいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、（ｉ）１つ以上の抗原標的化受容体の発現、（ｉｉ）改変されたＨＬＡ、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞の動員および免疫調節、（ｉｖ）腫瘍外効果の低減による改善された標的特異性、および（ｖ）改善されたホーミング、持続性、細胞毒性、または抗原エスケープ救済、のうちの少なくとも２つの組み合わせに関する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む。

いくつかの実施形態では、表２に列記された遺伝子型を含むｉＰＳＣ派生エフェクター細胞、および当該細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、またはＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカインおよび／もしくはその受容体、またはその任意の改変されたタンパク質を発現し、少なくともＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインおよびＣＡＲの操作された発現は、ＮＫ細胞特異的である。いくつかの他の実施形態では、サイトカインおよびＣＡＲの操作された発現は、Ｔ細胞特異的である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ派生造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液性腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。いくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ派生造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。

養子細胞療法に好適な対象に本発明の免疫細胞を導入することにより、様々な疾患を回復させることができる。いくつかの実施形態では、提供されるｉＰＳＣ派生エフェクター細胞は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態では、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することによって、上記の治療組成物の治療用途を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、もしくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染を有する。血液悪性腫瘍の例には、急性および慢性白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、および食道のがんが含まれるが、これらに限定されない。様々な自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつかの形態、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス関連障害）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を使用する治療は、症状に応じて、または再発生防止のために実施され得る。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用される場合「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、または疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療薬または組成物は、疾患または傷害の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減する進行中の疾患の治療もまた、特に関心がある。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法によって少なくとも１つの関連する症状を抑制し、回復させ、かつ／または改善することができる疾患、状態、および／または傷害を有する。ある特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄または幹細胞移植の候補、化学療法または放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害またはがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害もしくはがんを有するかまたはそのリスクがある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するかまたはそれを発達させるリスクがある対象、ウイルス感染またはウイルス感染に関連する疾患を有するかまたはそのリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。

本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価する場合、応答は、臨床的有益率、死亡までの生存、病理学的完全応答、病理学的応答の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、およびＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準のうちの少なくとも１つを含む基準によって測定され得る。

開示される由来造血系統細胞を含む治療組成物は、他の治療の前、治療中、および／または治療後に対象に投与され得る。したがって、組み合わせ療法の方法は、追加の治療薬の使用前、使用中、および／または使用後に、ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与または調製を伴い得る。上記に提供されるように、１つ以上の追加の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、小ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞構成要素もしくはその置換因子、目的の１つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤もしくは放射性部分、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与は、追加の治療薬の投与から、時間、日、さらには週単位の時間で分離することができる。加えて、または代替的に、投与は、限定されないが、抗腫瘍剤、外科手術などの非薬物療法などの他の生物学的に活性な薬剤またはモダリティと組み合わせることができる。

組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞と、抗体または抗体断片である追加の治療薬とを含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺滅能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞に対する追加の治療薬として、組み合わせ治療に好適な抗体としては、ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、パーツズマブ）、ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、ＥＧＦＲ抗体（例えば、セルツキシマブ）、ＧＤ２抗体（例えば、ジヌツキシマブ）、ＰＤＬ１抗体（例えば、アベルマブ）、ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、ＣＤ１２３抗体（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、およびそれらのヒト化またはＦｃ改変されたバリアントもしくは断片、またはそれらの機能的同等物およびバイオシミラーが挙げられるがそれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合、免疫応答を抑制または下方制御することができる細胞分子、多くの場合細胞表面分子である。チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遺伝子発現または遺伝子産物を低減するか、またはチェックポイント分子の活性を減少させることができるアンタゴニストである。本明細書で提供される、ＮＫ細胞またはＴ細胞を含む派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（Ｌａｇ３、ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（Ｃｔｌａ４、ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ａＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、および阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、および３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。

提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的とする少なくとも１つの阻害剤をさらに含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される併用療法のためのエフェクター細胞は、提供される派生ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される併用療法のためのエフェクター細胞は、派生Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生ＮＫ細胞またはＴ細胞は、本明細書に提供されるように機能的に増強される。いくつかの実施形態では、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与とともに、投与前、または投与後に併用療法で投与され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、または一度に１つ（連続的に）投与される。

いくつかの実施形態では、上記のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、Ｉｇ ＮＡＲ、キメラ抗体、組換え抗体、またはそれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、および全抗体の結合特異性を維持する他の抗体断片が挙げられ、これらは、産生するのに費用対効果が高いか、使用がより容易であるか、または全抗体よりも感度が高い可能性がある。いくつかの実施形態では、１つ、または２つ、または３つ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびそれらの誘導体または機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。

派生エフェクター細胞と、１つ以上のチェック阻害剤とを含む併用療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉腫、パジェット細網症、セザリー症候群、肉芽腫性弛緩性皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状ひこう疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫（ＨＬ）、頭頸部腫瘍、扁平上皮がん、横紋筋肉腫、ルイス肺がん（ＬＬＣ）、非小細胞肺がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳がん、胃がん、前立腺小細胞神経内分泌がん（ＳＣＮＣ）、肝臓がん、神経膠芽腫、肝臓がん、口腔扁平上皮がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、肝内胆管細胞がん、肝細胞がん、骨がん、転移、および鼻咽頭がんを含むがこれらに限定されない液性および固形がんの治療に適用される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される派生エフェクター細胞以外に、治療用途の組み合わせは、化学療法剤または放射性部分を含む１つ以上の追加の治療薬を含む。化学療法剤とは、細胞毒性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺滅するか、急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、または幹がん細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の成長を防止または低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性または細胞毒性の薬物または薬剤と称されることもあり、当技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、およびインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロランブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、アニメタボライト（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、およびテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビサントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、およびグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、およびアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、およびゾレドロネートが含まれる。他の好適な薬剤は、化学療法剤または放射線療法剤として承認され、当技術分野で知られているものを含む、ヒトでの使用が承認されている薬剤である。そのような薬剤は、いくつかの標準的な医師および腫瘍学者の参考文献のいずれか（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）を通じて参照することができ、両方とも随時更新される。

サリドマイド、レナリドマイド、およびポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、がん治療のためのｉＰＳＣ由来の治療用免疫細胞とともに使用され得る。

治療組成物に含まれるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の単離された集団以外に、患者への投与に好適な組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／もしくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される培地、例えば、細胞培養培地）、または他の薬学的に許容される構成要素をさらに含み得る。薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、ならびに治療組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の治療組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈ ｅｄ．１９８５を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＴ細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＨＳＣを含む。一実施形態では、治療組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＭＤＳＣを含む。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の集団を含む治療組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、または気管投与法によって別個に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を及ぼすことができる。

これらの薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、治療組成物のｐＨを約３～約１０の間に維持するのに十分な量で存在することができる。したがって、緩衝剤は、全組成物の重量対重量ベースで約５％ほどであり得る。限定されないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどでの電解質もまた、治療組成物に含まれ得る。一態様では、治療組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。代替的に、治療組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、または約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療組成物は、当該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態では、治療組成物は、約７．４のｐＨを有する。

本発明はまた、部分的に、本発明の特定の組成物および／または培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来免疫細胞の維持、成長、および／または健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清および／またはフィーダーフリー培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物質を含まず、任意選択的にタンパク質を含まなくてもよい。任意選択的に、培地は、生物学的製剤に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物質を含まない培地とは、構成要素が動物以外の供給源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地で天然の動物性タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、タンパク質を含まない培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上記の培地の例が例示的であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して制限するものではなく、当業者に既知の利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。

単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞、または間葉系間質細胞を有し得る。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物などの、精製されたＴ細胞またはＮＫ細胞を有する治療組成物を提供する。

一実施形態では、組み合わせ細胞療法は、治療用タンパク質またはペプチド、および表２に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞は、提供されるエンドドメインを有するＣＡＲを含む。別の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、抗原特異的な治療用タンパク質またはペプチド、および表２に列記される遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＴ細胞の集団を含み、派生Ｔ細胞は、ＣＤ３８ヌルおよび提供されるエンドドメインを有するＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、および表２に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞またはＴ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞またはＴ細胞は、提供されるエンドドメインを有するＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、およびｈｎＣＤ１６を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、および表２に列記された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞またはＴ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞またはＴ細胞は、提供されるエンドドメインを有する第１のＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、および第２のＣＡＲを含み、第１および／または第２のＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちの少なくとも１つを標的とし、第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原を標的とする。さらにいくつかの追加の実施形態では、組み合わせ細胞療法は、ダラツムマブ、イサツキシマブ、またはＭＯＲ２０２、および表２に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞またはＴ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞またはＴ細胞は、提供されるエンドドメインを有する第１のＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ、および１つ以上の外因性のサイトカインを含む。さらに別の一実施形態では、組み合わせ細胞療法は、治療用タンパク質またはペプチド、および表２に列挙された遺伝子型を含むゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞の集団を含み、派生ＮＫ細胞は、提供されるエンドドメインを有する第１のＣＡＲ、ＣＤ３８ヌル、ｈｎＣＤ１６、第２のＣＡＲ、および１つ以上の外因性のサイトカイン、ならびにＨＬＡ－Ｇ過剰発現またはＣＤ５８ノックアウトおよびＣＤ５４ノックアウトのうちの少なくとも１つを含むＢ２Ｍ^－／－ＣＩＩＴＡ^－／－を含む。

当業者が理解するように、本明細書の方法および組成に基づいてｉＰＳＣに由来する自家および同種異系の造血系統細胞の両方を、上述の細胞治療に使用することができる。自家移植の場合、由来造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全または部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、由来造血系統細胞は、対象とＨＬＡが一致せず、由来造血系統細胞は、ＨＬＡ ＩおよびＨＬＡ ＩＩヌルを有するＮＫ細胞またはＴ細胞である。

いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり少なくとも０．１×１０^５細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも５×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも５×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、または少なくとも５×１０^９細胞である。いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量当たり約０．１×１０^５細胞～約１×１０^６細胞、用量当たり約０．５×１０^６細胞～約１×１０^７細胞、用量当たり約０．５×１０^７細胞～約１×１０^８細胞、用量当たり約０．５×１０^８細胞～約１×１０^９細胞、用量当たり約１×１０^９細胞～約５×１０^９細胞、用量当たり約０．５×１０^９細胞～約８×１０^９細胞、用量当たり約３×１０^９細胞～約３×１０^１０細胞、またはその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１×１０^８細胞／用量は、１．６７×１０^６細胞／ｋｇに変換される。

一実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、血液の部分的または単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、または少なくとも０．１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０^６細胞／ｋｇ体重、１×１０^８細胞／ｋｇ体重、５×１０^８細胞／ｋｇ体重、または１×１０^９細胞／ｋｇ体重である。

一実施形態では、ある用量の由来造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０^６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在するすべての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約６×１０^６細胞／ｋｇ、約７×１０^６細胞／ｋｇ、約８×１０^６細胞／ｋｇ、約９×１０^６細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇ（介在するすべての細胞用量を含む）である。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、または６×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ（介在するすべての細胞用量を含む）である。

いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療用途は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療用途は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、もしくは５０日ごと、またはその間の任意の日数に１回の投与である。

本発明の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者への投与に好適であり、投与の準備ができている（すなわち、さらに処理することなく投与することができる）。投与の準備ができている細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植または投与の前に、任意のさらなる処理または操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤を投与する前に拡大および／または調節される、由来造血系統細胞の単離された集団を提供する。組換えＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞の場合、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号に記載される方法を使用して、細胞を活性化および拡大することができる。

ある特定の実施形態では、由来造血系統細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合され得る。表面に結合される場合、薬剤は同じ表面（つまり、「シス」形成で）、または別個の表面に（つまり、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、もう一方の薬剤を溶液中に存在させることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合され得、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合される。ある特定の実施形態では、両方の薬剤は、溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、または本発明の実施形態においてＴリンパ球を活性化および拡大する際に使用することが企図されている人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号および同第２００６／００３４８１０号などに開示される薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋され得る。

投与量、頻度、およびプロトコルのある程度の変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量、頻度、およびプロトコルを決定する。

以下の実施例は、例示ために提供され、限定のためではない。

実施例１－材料および方法
様々なプロモーターの制御下で、異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて自殺系を効果的に選択し、試験するために、単一細胞の継代および高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリー選別を可能にする、出願人独自のｈｉＰＳＣプラットフォームを使用し、単一または複数の遺伝子調節によるクローンｈｉＰＳＣの誘導を可能にする。

小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：培養のコンフルエンシーが７５％～９０％に達すると、ｈｉＰＳＣが単一細胞として日常的に継代された。単一細胞の解離では、ｈｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７℃で３～５分間処理した後、ピペッティングして単一細胞の解離を確実にした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と等量で混合し、２２５×ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面にプレーティングした。継代は、典型的には、１：６～１：８で、３７℃で２～４時間、マトリゲルで前もってコーティングした組織培養プレートに移し、２～３日ごとにＦＭＭを供給した。細胞培養は、３７℃および５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベーターで維持された。

ＺＦＮによるヒトのｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化された編集のためのＣＲＩＳＰＲ：例としてＲＯＳＡ２６標的化された挿入を使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、ＡＡＶＳ１標的化された挿入のために、２．５ｕｇのＺＦＮ－Ｌ（ＦＴＶ８９３）、２．５ｕｇのＺＦＮ－Ｒ（ＦＴＶ８９４）、および５ｕｇのドナー構築物の混合物を２００万個のｉＰＳＣにトランスフェクトした。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、ＲＯＳＡ２６標的化された挿入のために、５ｕｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（ＦＴＶ９２２）および５ｕｇのドナー構築物の混合物を２００万個のｉＰＳＣにトランスフェクトした。トランスフェクションは、パラメーター１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用して、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われた。トランスフェクション後の２日目または３日目に、プラスミドに人工プロモータードライバーＧＦＰおよび／またはＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション後の４日目に、ピューロマイシンを最初の７日間は０．１ｕｇ／ｍｌの濃度で、７日後は０．２ｕｇ／ｍｌの濃度で培地に添加して、標的化された細胞を選択した。ピューロマイシンの選択中、細胞は１０日目にマトリゲルでコーティングされた新しいウェルに継代された。ピューロマイシン選択の１６日目以降に、生存細胞をＧＦＰ＋ｉＰＳ細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。

ゲノム編集されたｉＰＳＣのバルク選別およびクローン選別：ＺＦＮまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化された編集を伴うｉＰＳＣは、ピューロマイシン選択の２０日後に、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣのバルク選別およびクローン選別された。単一細胞で解離した標的化されたｉＰＳＣプールを、最適な性能のために新しく作製された、ハンクス平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％ウシ胎仔児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む冷却染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む、コンジュゲートされた一次抗体を細胞溶液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。すべての抗体は、１００万個の細胞当たり１００μＬの染色緩衝液に７μＬで使用された。溶液を染色緩衝液で１回洗浄し、２２５ｇで４分間スピンダウンし、１０μＭのチアゾビブンを含む染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー選別のために氷上で維持した。フローサイトメトリー選別は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。バルク選別では、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋細胞をゲーティングし、７ｍｌのＦＭＭで満たされた１５ｍｌの標準チューブに選別した。クローン選別では、選別された細胞を、ウェル当たり３イベントの濃度で、１００μＭのノズルを使用して９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンおよび１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充した２００μＬのＦＭＭを予め充填し、５ｘマトリゲルで前もって一晩コーティングした。５ｘマトリゲルプレコーティングには、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に添加し、次いで、適切な再懸濁を可能にするために４℃で一晩インキュベートし、最後にウェル当たり５０μＬで９６ウェルプレートに添加した後、３７℃で一晩インキュベートすることが含まれる。５ｘマトリゲルは、各ウェルに培地を添加する直前に吸引される。選別が完了したら、インキュベーションの前に、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離した。プレートを７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭと交換した。選別後１０日目に、ウェルに追加の１００μＬのＦＭＭを再供給した。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーは選別後７～１０日で拡大した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで、３７℃で約１０分間解離させた。アキュターゼ処理の延長の必要性は、長期間培養でアイドリング状態にあったコロニーのコンパクトさを反映している。細胞が解離していることが認められた後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに添加し、数回ピペッティングしてコロニーを破壊する。解離したコロニーを、５ｘマトリゲルで前もってコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移し、次いでインキュベーション前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１：１の継代は、拡大する前に初期のコロニーを広げるために行われる。その後の継代は、３～５分間のアキュターゼ処理、およびＦＭＭ中の１ｘマトリゲルで前もってコーティングされたより大きなウェルへの７５～９０％のコンフルエンシーでの１：４～１：８の拡大で日常的に行われた。各クローン細胞株は、ＧＦＰ蛍光レベルおよびＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析された。１００％に近いＧＦＰ＋およびＴＲＡ１－８１＋のクローン株を、さらなるＰＣＲスクリーニングおよび分析のために選択した。フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で行われ、Ｆｌｏｗｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して分析された。

実施例２－ＣＡＲ候補の機能プロファイリング、および新規エンドドメインを含むＣＡＲを発現する派生ＮＫまたはＴ細胞
機能的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をスクリーニングするために、同じ抗原特異性を有するが、それらのエンドドメインおよび／または膜貫通ドメインが異なる候補ＣＡＲ（ＣＡＲ^ネオ）の一群を、各々、細胞特異的表面発現プロフィールを調べるために、初代ＮＫ細胞およびＴ細胞で発現させる。図２Ａ～Ｃに示されるように、これらの２９の構築物は、同一のｓｃＦｖおよびＣＤ８ヒンジ領域を有し、エンドドメインを含むシグナル伝達構成要素のみが異なる。同じ特定の抗原を標的とするこれらの２９の異なるＣＡＲ構築物の発現プロファイルを比較することにより、このアッセイを実施して、どの構築物、より具体的には、どのエンドドメイン構成要素が細胞表面で効率的かつ検出可能なＣＡＲ発現を与えるかを判定した。一例では、すべての候補ＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂに特異的であるように構築されている。同様に、機能スクリーニングはまた、例えば、ＣＡＲ特異性のためにＣＤ１９ ｓｃＦＶを利用することもできる。派生ＮＫ系統細胞は、それぞれのＣＡＲ構築物を運ぶレンチウイルスで形質導入された。図２Ａ～Ｃの各ＣＡＲ構築物は、Ｃ末端にＴｈｙ１．１マーカーを含み、これは、Ｐ２Ａペプチド（図示せず）によって構築物から分離されている。形質導入から約１０日後、形質導入された細胞を、ＦＡＣＳによってＣＡＲおよびＴｈｙ１．１発現についてアッセイした。首尾よく形質導入された細胞は、Ｔｈｙ１．１の発現に基づいて選別されるが、ＣＡＲ染色は、ＣＡＲのｓｃＦｖ領域に特異的な抗体を使用して行われた。図３Ａ～Ｉに示されるように、結果は、アッセイの時点で明確であるが変化するＣＡＲ発現パターンを示し、ある特定の膜貫通領域（すなわち、ＣＤ２８、ＣＤ８）は、増強されたＣＡＲ発現を一見与える。しかしながら、構築物３および２３は、その時点で細胞表面で検出できず、これは、構築物の細胞段階および／または生物学に起因し得る。

ＣＡＲ候補によって媒介される抗原特異的殺傷を示すために、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオＮＫまたはＴ細胞は、ＭＩＣＡ／Ｂを発現するか、ＭＩＣＡ／Ｂがヌルまたは低である腫瘍細胞と共培養される。ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ１ＸＸＣＡＲを発現するＴ細胞およびＭＩＣＡ／Ｂ－ＮＫＧ２Ｄ－２Ｂ４－ＣＤ３ｚ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞、ならびにＣＡＲを含まないＴ細胞およびＮＫ細胞は、陽性および陰性対照として使用される。次いで、特定の殺滅能力を示す各ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオが、ｉＰＳＣに形質導入される。すべてのＣＡＲ^ネオ－ｉＰＳＣ株は、ＣＡＲの発現、核型の異常、およびゲノムの安定性について検査される。ｉＰＳＣでの発現の有無にかかわらず、各ＣＡＲ^ネオ－ｉＰＳＣ株は、本明細書に記載の方法に従って、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方の分化のために継続される。１０日目、２０日目の中間細胞、および分化中の他の時点の細胞は、マーカー発現プロファイルおよび細胞増殖について特徴付けられる。重要な時点および分化プロセスの終了時の細胞増殖も評価される。

ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオ候補者を発現する派生ＮＫまたはＴ細胞の機能プロファイルを決定するために、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオによる細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂの安定化が、検査される。

ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオを発現するｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞（ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ）およびＭＩＣＡ／Ｂを発現する腫瘍細胞株細胞（標的細胞）を含む共培養システムを使用する。結果として生じるＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫの活性化および機能の増強も、この共培養システムを使用して試験される。ＭＩＣＡ／Ｂ陽性腫瘍とＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫの共培養は、ＥＬＩＳＡを使用して培養上清に放出された可溶性ＭＩＣＡ／Ｂのレベルについて調べられる。未改変ＮＫ細胞との共培養と比較して、標的細胞をＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫと共培養すると、培養上清に放出される可溶性ＭＩＣＡ／Ｂの低減は、腫瘍細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂ安定化の発見を裏付ける。この試験の陽性対照は、標的細胞とｍＡｂ７Ｃ６の共培養を使用する。

同じ共培養条件下で、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ細胞の活性化は、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生、表面ＣＤ１０７ａの評価による脱顆粒、およびカスパーゼベースのフローアッセイを使用した標的細胞株の直接殺滅によって調べられる。ＭＩＣＡ／Ｂ陰性と共培養した場合の活性の観察された違いはないことと比較して、サイトカインおよび脱顆粒のレベルの増加、およびＭＩＣＡ／Ｂ陽性標的細胞に応答した未改変ＮＫ細胞に対するＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ細胞による直接殺滅の増加は、ＭＩＣＡ／Ｂ細胞表面抗原の存在下でＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ細胞の活性化を示す。

ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオの発現が標的細胞株上のＭＩＣＡ／Ｂの表面密度を増加させるかどうかを調べるために、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオは、標的細胞を殺滅することができない非ＮＫ細胞株で発現され、結果として生じる細胞はＭＩＣＡ／Ｂ陽性標的と共培養された。共培養後、標的細胞上のＭＩＣＡ／Ｂのレベルをフローサイトメトリーで評価する。非改変ＮＫ細胞との共培養と比較して、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオを発現する非ＮＫ細胞との共培養後の標的細胞におけるＭＩＣＡ／Ｂのレベルの増加は、提供されたＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオの標的細胞株におけるＭＩＣＡ／Ｂの表面密度に対する肯定的な影響を示す。

表面ＭＩＣＡ／Ｂのレベルの増加に応じたＮＫ細胞活性に関連する遺伝子発現のレベルの増加は、ＭＩＣＡ／Ｂ陽性標的細胞とＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫとのインビトロ共培養、またはインビボ実験、スフェロイド、オルガノイド、または３Ｄ共培養実験に由来する組織サンプルのいずれかに由来する、サンプルＮＫ細胞の一細胞ＲＮＡ配列決定によって試験される。当該共培養または組織に由来するサンプルにおける、パーフォリン、グランザイムＡおよびＢの上昇制御、ならびにＣＤ６２Ｌなどの未成熟マーカーの下方制御は、細胞のＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオ発現に関連するＮＫ細胞活性の増加を示す。

ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオのインビボ機能は、腫瘍細胞標的としてヒトＭＩＣＡを発現するマウス黒色腫細胞を使用して、または内因性ＭＩＣＡ／Ｂを発現するヒト細胞株を使用して評価される。インビボ評価では、マウスまたはヒトのＴ細胞にＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオを形質導入し、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞（ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ）に加えてエフェクターとして使用する。

ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオの有効性は、マウス黒色腫モデルで評価される。マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０にヒトＭＩＣＡ（Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ）を形質導入し、これらの細胞を免疫コンピテントなＣ５７ＢＬ／６または免疫無防備状態のＮＳＧマウスに静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）で移植する。Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍細胞の静脈内注射は、Ｃ５７ＢＬ／６で肺転移を引き起こし、ＮＳＧマウスで肺と肝臓の転移を引き起こし、皮下移植は両方のマウス系統で単一の固形腫瘍を引き起こす。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、Ｂ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞のＩＶ移植後に肺腫瘍結節（転移）が計数される。腫瘍移植後のＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオ－Ｔ細胞の養子移入は、これらの動物で発生する腫瘍結節の数を低減するこれらの細胞の能力を評価するために実行される。腫瘍結節は、組織切片の顕肉眼的形態および微鏡検査によってさらに評価される。皮下Ｂ１６－Ｆ１０－ＭＩＣＡモデルでは、腫瘍の進行は腫瘍サイズのキャリパー測定によってモニターされる。模擬形質導入Ｔ細胞によるマウス治療と比較した肺の腫瘍結節数および／またはサイズの低減は、マウスＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオ－Ｔ細胞を使用してＢ１６Ｆ１０－ＭＩＣＡ細胞をＩＶ移植したＣ５７ＢＬ／６マウスの治療の存在する腫瘍結節の数を低減する有効性を反映する。同様に、Ｂ１６－Ｆ１０－ＭＩＣＡ腫瘍増殖のＳＣモデルでは、腫瘍の進行を遅らせ、生存を延長し、腫瘍の退縮を誘発するか、または上記の組み合わせも、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオ－Ｔ細胞治療の有効性を示す。

ＮＳＧマウスでは、肺腫瘍結節と肝臓腫瘍結節の両方がカウントされ、模擬形質導入Ｔ細胞で治療されたマウスは、各臓器の結節数を低減する能力についてＭＩＣＡ／Ｂ^ネオ－ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と比較される。マウスとヒトの両方のＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオＴ細胞を、ＮＳＧマウスにおいて腫瘍増殖を制御する能力について評価する。ヒトまたはマウスのいずれかの供給源からのＭＩＣＡ／Ｂ ＣＡＲ^ネオ－Ｔ細胞をＩＶ移植したＮＳＧマウスの肺および肝臓における腫瘍結節の数およびサイズの低減は、治療の有効性を反映し、マウスの生存期間の延長と相関する。同様の試験が、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ細胞を用いたＢ１６－Ｆ１０－ＭＩＣＡ担がんＮＳＧマウスを使用して実施される。

ヒト腫瘍細胞株に対するＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオの機能も評価される。Ａ２０５８、Ｕ２６６、およびＡ３７５を含むＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢを発現するヒト細胞株を、免疫無防備状態のＮＳＧマウスに移植する。ヒトＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオ－Ｔ細胞またはＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲ^ネオｉＮＫ細胞のいずれかを使用して、これらの腫瘍タイプのいずれかを担持するＮＳＧマウスの治療において、腫瘍進行の遅延、腫瘍退縮の誘発、および生存期間の延長を評価する。

機能的なＣＡＲ^ネオ候補は、例示として本明細書に記載されているもの以外の他の任意の抗原特異性を使用して確認することができる。図４Ａ及び図４Ｂに示されるとおり、多発性骨髄腫抗原に対する結合ドメインを含む、示される各CAR構築物に対する抗原特異的細胞障害アッセイを行い、各CARを含むCAR-iNK細胞の機能的能力を調査した。Rd2D7において、Thy1.1-富化iNK細胞を、標識化腫瘍抗原発現MM.1S標的細胞と、示したE:T比(.5:1から8:1)で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーションの最後に、カスパーゼ3/7活性をサイトフローメトリーにより検出した。これは標的細胞の特異的殺滅を示す。細胞障害性曲線は、全ての試験したCARにおいて、E:T比（図４Ａ）が高くなるほどMM.1S標的細胞の増大した殺滅を示している。1/EC50値をプロットした（図４Ｂ）。この値が高いほど、MM.1S標的細胞を効率的に殺滅する構築物であることを示しており、全ての示したCAR構築物は、抗原特異的標的殺滅力を有していた。これらのデータにより、開示したCAR構築物が機能的CARシグナル伝達及び標的細胞の特異的殺滅をもたらすことが確認された。残るCARもまた、抗原特異的腫瘍細胞殺滅及び1/EC50値を調べるために同じアッセイを行った。

加えて、テロメアの短縮は細胞の老化とともに起こり、幹細胞の機能不全および細胞老化に関連している。ここでは、成熟ｉＮＫ細胞が、成体末梢血ＮＫ細胞と比較してより長いテロメアを維持することが示される。テロメアの長さは、１３０１ Ｔ細胞白血病株を対照（１００％）として使用し、Ｇ_０／１細胞のＤＮＡインデックスを補正して、フローサイトメトリーにより、ｉＰＳＣ、成体末梢血ＮＫ細胞、およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞ついて決定された。図５に示すように、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、成体末梢血ＮＫ細胞と比較して有意に長いテロメア長を維持し（ｐ＝０．１０５、ＡＮＯＶＡ）、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞における増殖、生存、および持続の可能性が高いことを示す。

当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、および産生物が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本開示に対して様々な置換および修正を行うことができることは当業者には容易に明らかであろう。

本明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本開示が属する当業者のレベルを示している。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に例示的に記載されている本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、制限がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「含む」、「本質的にからなる」、および「からなる」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において、示され説明された特色またはその一部の同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特色によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正および変形は、当業者によって想到され得、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。

Claims (19)

1. キメラ抗原受容体であって、少なくとも１つの抗原認識ドメインを含むエクトドメインと、膜貫通ドメインと、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインと、を含み、
   前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、Ｔおよび／またはＮＫ細胞の活性化または機能に特異的なシグナル伝達タンパク質の細胞質ドメインに由来し、
   前記キメラ抗原受容体が、該キメラ抗原受容体を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化された派生エフェクター細胞に含まれる場合、末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から得られた一次免疫細胞と比較して、増加された細胞毒性を有し、
   前記キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと、以下の形態：ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＳ１）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＣＳ１）及びＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＣＳ１－ＣＤ３ζ）のいずれかを含むエンドドメイン（ＴＭ－（エンドドメイン））を含む、キメラ抗原受容体。
2. （ａ）前記シグナル伝達タンパク質が、２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通型および免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナルトランスデューサー）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５ＲＢ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－ＤタイプＩＩインテグラルメンブレンタンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞毒性誘発受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞毒性誘発受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞毒性誘発受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、およびＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つを含み、ならびに／あるいは
   （ｂ）前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、もしくはＣＤ８の細胞質ドメインに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは
   （ｃ）前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、2B4, CD28H, CD3ζ, DAP10, FcERIγ, KIR2DS2, NKG2D, CD3ζ, CD3ζ1XX, DNAM1, CS1, 若しくはこれらの組合せの細胞質ドメインに対して９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
3. 前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、もしくはＣＤ８の細胞質ドメインに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記細胞質ドメインが、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）、ＹｘｘＭモチーフ、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフ、ＦｃＲγ、ヘミＩＴＡＭ、および／またはＩＴＴ様モチーフを含む、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
4. 前記エンドドメインが、第１のシグナル伝達ドメイン及び第２のシグナル伝達ドメインを含み、前記第１及び第２のシグナル伝達ドメインが、異なる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
5. (a)前記第２のシグナル伝達ドメインが、それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、もしくはＣＤ８の細胞質ドメインに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は
   (b) それぞれ、配列番号２１～４１、５４、および５６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、もしくはＣＤ８の細胞質ドメインに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第３のシグナル伝達ドメインを含む、
   請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
6. 前記エンドドメインが、１つのシグナル伝達ドメインのみを含み、前記エンドドメインが、ＣＳ１の細胞質ドメインに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
7. 前記エンドドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、前記エンドドメインが、ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４、ＤＮＡＭ１－ＣＳ１及び２Ｂ４－ＣＳ１の形態のうちのいずれか１つにおける融合細胞質ドメインを含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
8. 前記エンドドメインが、３つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、前記エンドドメインが、ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ及び２Ｂ４－ＣＳ１－ＣＤ３ζの形態のうちのいずれか１つにおける融合細胞質ドメインを含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
9. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８Ｈ、ＫＩＲ２ＤＳ２又はＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
10. 前記膜貫通ドメインが、それぞれ、配列番号６、１０、１６及び１７によってそれぞれ表される、ＣＤ２８Ｈ、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２又はＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
11. 前記キメラ抗原受容体が、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン（ＴＭ－（エンドドメイン））を含み、前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＳ１）、ＤＡＰ１０－（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）及びＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＣＳ１）の形態のうちの１つを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
12. 前記抗原認識ドメインが、疾患、病原体、液体腫瘍、または固形腫瘍に関連する抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
13. 前記抗原認識ドメインが、
    （ｉ）ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、およびＰＤＬ１のうちのいずれか１つ、または
    （ｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
14. 前記エクトドメインが、
    （ｉ）２つの抗原認識ドメイン、
    （ｉｉ）シグナルペプチド、および／または
    （ｉｉｉ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
15. 前記キメラ抗原受容体が、細胞表面発現外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または全長ペプチドを共発現するバイシストロン性構築物に含まれ、前記外因性サイトカインまたはその受容体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、およびそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つ、または
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを使用することによるＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）切断されたもしくは排除されたＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインを有するＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか、もしくは改変されている、融合タンパク質、ならびに
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
16. ｉＰＳＣ分化からの前記派生エフェクター細胞が、派生ＣＤ３４細胞、派生造血幹細胞および前駆細胞、派生造血多分化能前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆細胞、派生ＮＫ細胞前駆細胞、派生Ｔ細胞、派生ＮＫＴ細胞、派生ＮＫ細胞、派生Ｂ細胞、または派生免疫エフェクター細胞のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
17. 前記ｉＰＳＣ派生エフェクター細胞が、前記キメラ抗原受容体を発現し、一次Ｔ、ＮＫ、および／またはＮＫＴ細胞には存在しない少なくとも１つの機能的特性を含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体。
18. 細胞またはその集団であって、
    （ｉ）前記細胞が、免疫細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ、もしくはｉＰＳ細胞株細胞であるか、または前記細胞が、前記ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、
    （ｉｉ）前記細胞が、請求項１～１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、細胞またはその集団。
19. 請求項１８に記載の派生エフェクター細胞を含む組成物の、医薬の製造のための使用。